MX2012002129A - Purificacion del factor de von willebrand (vwf) para remocion incrementada de virus envueltos sin lipido. - Google Patents
Purificacion del factor de von willebrand (vwf) para remocion incrementada de virus envueltos sin lipido.Info
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Classifications
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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-
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Abstract
La presente invención proporciona métodos para purificar el factor de Von Willebrand (VWF) para la remoción incrementada de virus envueltos sin lípido.
Description
PURIFICACIÓN DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND (VWF) PARA
REMOCIÓN INCREMENTADA DE VIRUS ENVUELTOS SIN LÍPIDO
REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica beneficio de prioridad según el artículo 119(e) del título 35 del Código de los U.S. de la solicitud estadounidense provisional No. 61/235,570, presentada el 20 de agosto de 2009, cuya divulgación se incorpora a la presente en su totalidad! a modo de referencia.
Campo de la invención
Generalmente, la invención se refiere a métodos para purificar VWF para la extracción aumentada de virus con envoltura no lipídica.
Antecedentes de la invención
El factor Von Willebrand (VWF) es una glicoproteína que circula
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en el plasma como una serie de multímeros que tienen un tamaño qüe oscila entre 500 y 20.000 kD. Las formas multiméricas de VWF se componen de subunidades de polipéptido de 250 kD unidos por enlaces de disulfuro. El VWF media la adhesión inicial de plaquetas ;al subendotelio de la pared de vasos dañada. Únicamente los multímeros de mayor tamaño muestran actividad hemostática. Se asume que las células endoteliales secretan grandes formas poliméricas de VWF y dichas formas de VWF que tienen un bajo peso molecular (VWF de bajo i peso molecular) derivan de la escisión proteolítica. Los multímeros que presentan masas moleculares de gran tamaño se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales y se liberan ante estimulación.
El VWF se sintetiza mediante las células endoteliales y los megacariocitos como prepro-VWF, que consiste en una gran extensión de dominios repetidos. Tras la escisión del péptido señal, el pro-VWF se dimeriza a través de enlaces de disulfuro en su región C-terminal. Los dímeros sirven como protómeros para la multimerización, que se encuentra regida por los enlaces de disulfuro entre los terminales de extremo libre. El ensamblaje en multímeros se lleva a cabo mediante extracción proteolítica de la secuencia de propéptidos (Leyte et al. , Biochem . J. 274 (1 991 ) , 257-261 ).
El producto de traducción primaria previsto a partir del cDNA clonado de VWF es un polipéptido precursor de 281 3 residuos (prepro-VWF). El prepro-VWF consiste en un péptido señal de 22 aminoácidos y un propéptido de 741 aminoácidos, en el que VWF maduro comprende 2050 aminoácidos (Ruggeri Z.A. , y Ware, J. , FASEB J. , 308-316 (1993)).
Los defectos en el VWF son la causa de la enfermedad de Vón Willebrand (VWD) , que se caracteriza por un fenotipo sangrante más; o menos pronunciado. La VWD de tipo 3 es la forma más severa, en la cual el VWF se encuentra completamente ausente, y la VWD de tipo 1 se relaciona a una pérdida cuantitativa del VWF y su fenotipo puede ser muy suave. La VWD de tipo 2 se refiere a los defectos cualitativos del VWF y puede ser tan seria como la VWD de tipo 3. La VWD de tipo; 2 tiene muchas subformas, algunas asociadas a la pérdida o la
dism inución de los multímeros de alto peso molecu lar. El síndrome ¿Je Von Willebrand de tipo 2a (VWS-2A) se caracteriza por u na pérd ida de los intermediarios y de los multímeros de gran tamaño. El VWS-2B se caracteriza por una pérdida de los multímeros de mayor peso molecular. Otras enfermedades y trastornos relacionados con el VWF se conocen en la técnica.
La extracción o inactivación de los virus con envoltura no li pídica de las sol uciones de prote ína terapéuticas trad iciona lmente se ha logrado mediante el tratamiento con métodos físicos como la temperatura elevada (por ejemplo , calentamiento seco, calentam iento al vapor, pasteurización), la irrad iación con rayos de energ ía alta (por ejemplo, rayos ultravioletas (UV) o radiación beta), pH bajio, nanofiltración o mediante procedimientos cromatográficos, en particular cromatografía por afinidad . No obstante, estos procedimientos ¡ a menudo son ineficaces cuando se purifica una proteína de alto peso molecular como el VWF q ue no pasa a través del na nofi ltro y/o pierde su potencia o integ ridad molecular tras el tratamiento con calor o radiación .
Las directrices normativas actuales solicitan a los fabricantes que aborden el asunto de la reducción y/o inactivación de los virus con envoltura l ipíd ica y no li pídica para los prod uctos farmacéuticos recombinantes. Las directrices sobre las evaluaciones de seg uridad viral de los productos biotecnológ icos de la Conferencia I nternacional de Armonización (Federal Register, 1 998, 63( 1 85) : 51 074- 51 084) proporcionan a los fabricantes flexibil idad en cuanto a cómo abordar los problemas virales ten iendo en cuenta el tipo de producto, el proceso de producción y el riesgo de virus potencialmente contaminantes. Estas directrices señalan que el riesgo de contaminación viral es una característica común a todos los productos de biotecnolog ía derivados de las líneas celulares. Tal contaminación puede tener consecuencias clínicas graves y puede surgir de la contaminación de. las propias líneas celulares originales en sí mismas (sustratos celulares) o de la introducción adventicia de virus durante la producción.
Aunque la inactivación de los virus con envoltura lipídica puede realizarse de forma muy eficaz mediante el enfoque de tratamiento con un disolvente/detergente (S/D), la inactivación o extracción de los virus modelo con envoltura no lipídica (NLEV) puede ser problemático debido a su tamaño pequeño y su estabilidad física.
Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de desarrollar métodos para inactivar o extraer de forma eficaz los virus con envoltura no lipídica durante la purificación del VWF.
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Breve descripción de la invención
La presente invención proporciona un método eficaz para purificar el VWF con el fin de mejorar la extracción del virus con envoltura no lipídica. La presente invención proporciona un nuevo método para purificar el VWF con el fin de mejorar la extracción de NLEV mediante al realizar la etapa de carga del producto y la etapa de lavado del proceso de purificación a un pH alto.
Un método conocido en la técnica para purificar los polipéptidos a partir de NLEV implica el uso de nanofiltración. El principio detrás de la separación eficaz de proteínas y virus mediante el uso de nanofiltración explota la diferencia de tamaño entre el polipéptido y el virus; la separación eficaz requiere que el polipéptido efectivamente tenga un tamaño menor que el del virus; lo que permite que el polipéptido pase a través de los poros del nanofiltro mientras se retiene el virus. No obstante, si el polipéptido y el virus son de un tamaño comparable recíprocamente, la separación es problemática debido a que tanto el polipéptido como el virus pasan a través de los poros del nanofiltro o ninguno de los dos lo hace. Los métodos divulgados en la presente resuelven este problema mediante el uso de una resina de intercambio de cationes en lugar de la nanofiltración y la carga y/o el lavado de la resina a un pH suficientemente alto para separar el polipéptido del virus.
Sin restringirse a ninguna consideración teórica, los métodos divulgados en la presente son útiles para la extracción de N LEV de las soluciones de polipéptido donde el polipéptido es de un cierto tamaño y/o conformación. Es probable que un polipéptido de un tamaño lo suficientemente grande tenga características de carga localizada en el punto isoeléctrico del polipéptido o superior a este, es decir, las regiones del polipéptido pueden mantener cargas negativas o positivas localizadas, lo que de ese modo permite que el polipéptido se adsorba en la resina de columna mientras que el virus fluye a través de ella. Esta distribución desigual de carga a lo largo de la longitud del polipéptido permite que el polipéptido permanezca unido a la resina a pesar de la carga y/o el lavado de la resina a un pH alto.
La invención proporciona un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene proteínas, que comprende cargar una proteína en la solución sobre una resina de intercambio de cationes y lavar la resina con una solución amortiguadora a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína para eluir el virus. En un aspecto, la proteína se carga a la resina en una solución amortiguadora a un pH superior al del punto isoeléctrico de la proteína para eluir el virus. En otro aspecto, la proteína se carga a la resina en una solución amortiguadora que no es la solución amortiguadora utilizada en la etapa de lavado y a continuación la resina se lava con una solución amortiguadora que se encuentra a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína.
En una modalidad, se proporciona un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene proteínas que comprende aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína y lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicha primera solución amortiguadora de lavado tiene un pH que es igual o menor que el de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes.
En un aspecto, el pH de la solución es de aproximadamente, 1 unidad de pH superior al punto isoeléctrico de la proteína. En otros aspectos, el pH de la solución es de aproximadamente 1,1, o aproximadamente 1,2, o aproximadamentel ,3, o aproximadamente 1,4, o aproximadamente 1,5, o aproximadamente 1,6, o aproximadamente 1,7,
o aproximadamente 1,8, o aproximadamente 1,9, o aproximadamente 2,0, o aproximadamente 2,1, o aproximadamente 2,2, o aproximadamente 2,3, o aproximadamente 2,4, o aproximadamente 2,5, o aproximadamente 2,6, o aproximadamente 2,7, o aproximadamente 2,8, o aproximadamente 2,9, o aproximadamente 3,0, o aproximadamente 3,1, o aproximadamente 3,2, o aproximadamente 3,3, o aproximadamente 3,4, o aproximadamente 3,5, o aproximadamente 3,6, o aproximadamente 3,7, o aproximadamente 3,8, < o aproximadamente 3,9, o aproximadamente 4,0, o aproximadamente 4,1, o aproximadamente 4,2, o aproximadamente 4,3, o aproximadamente
4.4, o aproximadamente 4,5, o aproximadamente 4,6, o aproximadamente 4,7, o aproximadamente 4,8, o aproximadamente 4,9, o aproximadamente 5,0, o aproximadamente 5,1, o aproximadamente 5,2, o aproximadamente 5,3, o aproximadamente 5,4, o aproximadamente 5,5, o aproximadamente 5,6, o aproximadamente 5,7, o aproximadamente 5,8, o aproximadamente 5,9, o aproximadamente 6,0 o más unidades de pH superiores al punto isoeléctrico de la proteína. En estas modalidades el pH es superior a aproximadamente 7. En un aspecto relacionado, el pH de la solución que contiene proteínas es de aproximadamente 7,0. En otros aspectos, el pH de la solución que contiene proteínas es de aproximadamente 7,1, o aproximadamente 7,2, o aproximadamente 7,3, o aproximadamente 7,4, o aproximadamente
7.5, o aproximadamente 7,6, o aproximadamente 7,7, o aproximadamente 7,8, o aproximadamente 7,9, o aproximadamente 8. Ó, o aproximadamente 8.1, o aproximadamente 8,2, o aproximadamente 8.3, o aproximadamente 8.4, o aproximadamente 8,5, o aproximadamente 8,6, o aproximadamente 8,7, o aproximadamente 8,8, o aproximadamente 8,9, o aproximadamente 9,0, o aproximadamente 9,1, o aproximadamente 9,2, o aproximadamente 9,3, o aproximadamente 9,4, o aproximadamente 9,5, o aproximadamente 9,6, o aproximadamente 9,7, o aproximadamente 9,8, o aproximadamente 9,9, o aproximadamente 10,0, o aproximadamente 10,1, o aproximadamente 10,2, o aproximadamente 10,3, o aproximadamente 10,4, o aproximadamente 10,5, o aproximadamente 10,6, o aproximadamente 10..7, o aproximadamente 10,8, o aproximadamente 10,9, o aproximadamente 11,0, o aproximadamente 11,1, o aproximadamente 11,2, o aproximadamente 11,3, o aproximadamente 11,4, o aproximadamente 11,5, o aproximadamente 11,6, o aproximadamente 11,7, o aproximadamente 11,8, o aproximadamente 11,9, o aproximadamente 12,0, o aproximadamente 12,1, o aproximadamente 12,2, o aproximadamente 12,3, o aproximadamente 12,4, o aproximadamente 12,5, o aproximadamente 12,6, o aproximadamente 12,7, o aproximadamente 12,8, o aproximadamente 12,9, o aproximadamente 13,0 o mayor.
En otra modalidad, se proporciona un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene proteínas que comprende aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes, lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado a un pH superior al pH de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes y lavar la resina de intercambio de cationes con una segunda solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, dicho primer eluido tiene un pH que és igual o menor que el de la primera solución amortiguadora de lavado. En un aspecto, el pH de la primera solución amortiguadora de lavado es de aproximadamente una unidad de pH superior al pH de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes. En otros aspectos, el pH de la primera solución amortiguadora de lavado es de aproximadamente 0,1, o aproximadamente 0,2, o aproximadamente 0,3, o aproximadamente 0,4, o aproximadamente 0,5, o aproximadamente 0,6, o aproximadamente 0,7, o aproximadamente 0,8, o aproximadamente 0,9, o aproximadamente 1,1, o aproximadamente 1,2, o aproximadamente 1,3, o aproximadamente 1,4, o aproximadamente 1,5, o aproximadamente 1,6, o aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,8, o aproximadamente 1,9, o aproximadamente 2,0, o aproximadamente 2,1, o aproximadamente 2,2, o aproximadamente 2,3, o aproximadamente 2,4, o aproximadamente 2,5, ¡o aproximadamente 2,6, o aproximadamente 2,7, o aproximadamente 2,8, o aproximadamente 2,9, o aproximadamente 3,0, o aproximadamente 3,1, o aproximadamente 3,2, o aproximadamente 3,3, ¡o aproximadamente 3,4, o aproximadamente 3,5, o aproximadamente 3,6, o aproximadamente 3,7, o aproximadamente 3,8, o aproximadamente 3,9, o aproximadamente 4,0, o aproximadamente 4,1, lo aproximadamente 4,2, o aproximadamente 4,3, o aproximadamente 4,4, o aproximadamente 4,5, o aproximadamente 4,6, o aproximadamente 4,7, o aproximadamente 4,8, o aproximadamente 4,9, ,o
aproximadamente 5,0, o aproximadamente 5,1, o aproximadamente 5,2, o aproximadamente 5,3, o aproximadamente 5,4, o aproximadamente 5,5, o aproximadamente 5,6, o aproximadamente 5,7, o aproximadamente 5,8, o aproximadamente 5,9, o aproximadamente 6,0, o aproximadamente 6,1, o aproximadamente 6,2, o aproximadamente 6,3, o aproximadamente 6,4, o aproximadamente 6,5, o aproximadamente 6,6, o aproximadamente 6,7, o aproximadamente 6,8, o aproximadamente 6,9, o aproximadamente 7,0, o aproximadamente
7.1, o aproximadamente 7,2, o aproximadamente 7,3, o aproximadamente 7,4, o aproximadamente 7,5, o aproximadamente 7,;6, o aproximadamente 7,7, o aproximadamente 7,8, o aproximadamente 7,9, o aproximadamente 8 o aproximadamente 8,1, o aproximadamente
8.2, o aproximadamente 8,3, o aproximadamente 8,4, o aproximadamente 8,5, o aproximadamente 8,6, o aproximadamente 8,7, o aproximadamente 8,8, o aproximadamente 8,9, o aproximadamente 9, o aproximadamente 9,1, o aproximadamente 9,2, o aproximadamente
9.3, o aproximadamente 9,4, o aproximadamente 9,5, o aproximadamente 9,6, o aproximadamente 9,7, o aproximadamente 9,8, o aproximadamente 9,9, o aproximadamente 10 o más unidades de pH superiores al punto isoeléctrico de la proteína. En estas modalidades el pH de la primera solución amortiguadora de lavado es superior a aproximadamente 7. En otros aspectos, el pH de la primera solución amortiguadora de lavado es de aproximadamente 7,1, !o aproximadamente 7,2, o aproximadamente 7,3, o aproximadamente 7,4, o aproximadamente 7,5, o aproximadamente 7,6, o aproximadamente
7,7, o aproximadamente 7,8, o aproximadamente 7,9, 1 o aproximadamente 8,0, o aproximadamente 8,1, o aproximadamente 8,2, o aproximadamente 8,3, o aproximadamente 8,4, o aproximadamente 8,5, o aproximadamente 8,6, o aproximadamente 8,7, ; o aproximadamente 8,8, o aproximadamente 8,9, o aproximadamente 9,0, o aproximadamente 9,1, o aproximadamente 9,2, o aproximadamente 9,3, o aproximadamente 9,4, o aproximadamente 9,5, ¡ o aproximadamente 9,6, o aproximadamente 9,7, o aproximadamente 9,8, o aproximadamente 9,9, o aproximadamente 10,0, o aproximadamente 10,1, o aproximadamente 10,2, o aproximadamente 10,3, o aproximadamente 10,4, o aproximadamente 10,5, o aproximadamente 10,6, o aproximadamente 10,7, o aproximadamente 10,8, o aproximadamente 10,9, o aproximadamente 11,0 o mayor.
En una modalidad, la proteína en la solución es un polipéptido que tiene una masa molecular de al menos aproximadamente 150 kilodaltones. En varios aspectos, la proteína en la solución es ún polipéptido que tiene una masa molecular de al menos aproximadamente 175 kilodaltones, o aproximadamente 180 kilodaltones, \o aproximadamente 190 kilodaltones, o aproximadamente 2Ó0 kilodaltones, o aproximadamente 210 kilodaltones, o aproximadamente 220 kilodaltones, o aproximadamente 230 kilodaltones, ,o aproximadamente 240 kilodaltones, o aproximadamente 250 kilodaltones, o aproximadamente 260 kilodaltones, o aproximadamente 270 kilodaltones, o aproximadamente 280 kilodaltones, ¡o aproximadamente 290 kilodaltones, o aproximadamente 3Ó0
kilodaltones, o aproximadamente 310 kilodaltones, o aproximadamente 320 kilodaltones, o aproximadamente 330 kilodaltones, o aproximadamente 340 kilodaltones, o aproximadamente 350 kilodaltones, o aproximadamente 360 kilodaltones, o aproximadamente 370 kilodaltones, o aproximadamente 380 kilodaltones, ! o aproximadamente 390 kilodaltones, o aproximadamente 400 kilodaltones, o aproximadamente 410 kilodaltones, o aproximadamente 420 kilodaltones, o aproximadamente 430 kilodaltones, < o aproximadamente 440 kilodaltones, o aproximadamente 450 kilodaltones, o aproximadamente 460 kilodaltones, o aproximadamente 470 kilodaltones, o aproximadamente 480 kilodaltones, , o aproximadamente 490 kilodaltones, o aproximadamente 500 kilodaltones o más. Como se describe en la presente, los polipéptidos comprenden asimismo estructuras multiméricas y tales estructuras multiméricas, en varios aspectos, tienen una masa molecular de al menos aproximadamente 500 kilodaltones. En aspectos relacionados, las estructuras multiméricas tienen una masa molecular de al menos aproximadamente 510, o aproximadamente 520, o aproximadamente 530, o aproximadamente 540, o aproximadamente 550, ¡ o aproximadamente 560, o aproximadamente 570, o aproximadamente 580, o aproximadamente 590, o aproximadamente 600, ! o aproximadamente 610, o aproximadamente 620, o aproximadamente 630, o aproximadamente 640, o aproximadamente 650, [o aproximadamente 660, o aproximadamente 670, o aproximadamente 680, o aproximadamente 690, o aproximadamente 700, o
aproximadamente 710, o aproximadamente 720, o aproximadamente 730, o aproximadamente 740, o aproximadamente 750, o aproximadamente 760, o aproximadamente 770, o aproximadamente 780, o aproximadamente 790, o aproximadamente 800, o aproximadamente 81 0, o aproximadamente 820, o aproximadamente 830, o aproximadamente 840, o aproximadamente 850, o aproximadamente 860, o aproximadamente 870, o aproximadamente 880, o aproximadamente 890, o aproximadamente 900, o aproximadamente 91 0, o aproximadamente 920, o aproximadamente 930, o aproximadamente 940, o aproximadamente 950, o aproximadamente 960, o aproximadamente 970, o aproximadamente 980, o aproximadamente 990 kilodaltones, o aproximadamente 1 megadalton, o aproximadamente 1 , 1 megadaltons, o aproximadamente 1 ,2 megadaltons, o aproximadamente 1 ,3 megadaltons, o aproximadamente 1 ,4 megadaltons, o aproximadamente 1 ,5 megadaltons, o aproximadamente 1 ,6 megadaltons, o aproximadamente 1 ,7 megadaltons, o aproximadamente 1 ,8 megadaltons, o aproximadamente 1 ,9 megadaltons, o aproximadamente 2,0 megadaltons, o aproximadamente 2, 1 megadaltons, o aproximadamente 2,2 megadaltons, o aproximadamente 2,3 megadaltons, o aproximadamente 2,4 megadaltons, o aproximadamente 2, 5 megadaltons, o aproximadamente 2,6 megadaltons, o aproximadamente 2,7 megadaltons, o aproximadamente 2,8 megadaltons, o aproximadamente 2,9 megadaltons, o aproximadamente 3,0 megadaltons, o aproximadamente 3, 1 megadaltons, o aproximadamente 3,2 megadaltons, o aproximadamente 3,3 megadaltons, i o aproximadamente 3,4 megadaltons, o aproximadamente 3,5 megadaltons, o aproximadamente 3,6 megadaltons, o aproximadamente 3,7 megadaltons, o aproximadamente 3,8 megadaltons, : o aproximadamente 3,9 megadaltons, o aproximadamente 4,0 megadaltons, o aproximadamente 4,1 megadaltons, o aproximadamente 4,2 megadaltons, o aproximadamente 4,3 megadaltons, o aproximadamente 4,4 megadaltons, o aproximadamente 4;,5 megadaltons, o aproximadamente 4,6 megadaltons, o aproximadamente 4,7 megadaltons, o aproximadamente 4,8 megadaltons, o aproximadamente 4,9 megadaltons, o aproximadamente 5,0 megadaltons o más.
En algunas modalidades, la resina de intercambio de cationes presenta un grupo cargado negativamente que se selecciona del grupo que consiste en carboximetilo (CM), sulfoalquilo (SP, SE), sulfato y metilsulfonato (S) así como cualquier otro ligando cargado negativamente. '
En una modalidad adicional, la proteína es una proteína de coagulación de sangre. En varios aspectos, la proteína de coagulación sanguínea se selecciona del grupo que consiste en el factor VIII, el factor von Willebrand, Fl (Fibrinógeno), FV (Proacelerina), FXl (antecedente de plasma-tromboplastina) y FXIII (factor estabilizador de fibrina).
En una modalidad, se proporciona un método para extraer ün virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene von
Willebrand (VWF) que comprende aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína y lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicha primera solución amortiguadora de lavado tiene un pH que es igual o menor al de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes;.
En otra modalidad, se proporciona un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene VWF que comprende aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes, lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado a un pH superior al pH de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes y lavar la resina de intercambio de cationes con una segunda solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicho primer eluido tiene un pH que es igual; o menor que el de la primera solución amortiguadora de lavado.
En una modalidad adicional, se proporciona un método pa'ra extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene VWF que comprende aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína y lavarla resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína aplicada a la resina de intercambio de cationes y lavar la resina de intercambio de cationes con una segunda solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicho primer eluido tiene un pH que es igual o menor que el de la primera solución amortiguadora de lavadó.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra el resultado de una separación SDS-PAGE, seguida de tinción de plata (A) y análisis Western Blot (B) para el rFVI II residual.
La figura 2 muestra el gel teñido de las ejecuciones UNO S con las muestras inoculadas con los virus MMV y REO.
La figura 3 muestra el gel teñido de las ejecuciones UNO S con las muestras inoculadas con los virus MMV y REO.
La figura 4 muestra los resultados de someter las preparaciones purificadas de rVWF obten idas mediante las variantes de proceso : a digestión proteolítica de la proteasa V8 en el estado nativo y separar los péptidos resultantes mediante RP-HPLC.
La figura 5 muestra los resultados de someter las preparaciones purificadas de rVWF obtenidas mediante las variantes de proceso a tripsina en el estado desnaturalizado y separar los péptidos resultantes mediante RP-HPLC. I
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un método para purificar el VWF con mayor extracción de virus con envoltura no lipídica. Los métodos de la invención son aplicables en columna (es decjr, cromatografía) así como modo de lote (es decir, sin equipo físico de columna).
El método de la presente . invención utiliza un método de purificación en una resina de intercambio de cationes para la extracción aumentada de virus con envoltura no lipídica. Los métodos previos de purificación de VWF mediante el uso de cromatografía de intercambio de cationes se realizaron a un pH neutral. Estos métodos permitieron la fabricación de VWF purificado de buen rendimiento y pureza, pero sorprendentemente el proceso no tuvo la capacidad de extraer los virus con envoltura no lipídica.
Definición de los términos
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen los mismos significados comúnmente utilizados por un entendido en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Las siguientes referencias proporcionan al entendido en la técnica una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton, et al. , DICTIONARY OF MI CROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAM BRI DGE DICTIONARY OF SCI ENCE AN D TECHNOLOGY (Walker ed . , 1 988) ; THE GLOSSARY OF GENETICS, 5a ED. , R. Rieger, et al. (eds. ), Springer Verlag (1 991 ); y Hale y Marham, THE HARPER COLLI NS DI CTIONARY OF BIOLOGY (1991 ).
Cada publicación, solicitud de patente, patente y otras referencias citadas en la presente se incorporan a modo de referencia en su totalidad en la medida que no sean incoherentes con la presente divulgación.
Se observa que tal como se utiliza en la presente especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" , "una" y "el/la", incluyen los referentes plurales a menos que se exprese de otra forma en el contexto.
Como se utiliza en la presente, los siguientes térm inos tienen los significados atribuidos a ellos a menos que se especifique lo contrario.;
Como se utiliza en la presente, los términos "expresa", "que expresa" y "expresión" significan que permite o hace que la información en un gene o una secuencia de DNA se haga manifiesta, por ejemplo que produce una proteína mediante la activación de las funciones celulares implicadas en la trascripción y traducción de un gene o secuencia de DNA correspondiente. La secuencia de DNA se expresa en o mediante una célula para formar un "producto de expresión" como una proteína. Puede asimismo decirse que el producto de expresión en si mismo, por ejemplo la proteína resultante, se encuentra "expresado". El producto de expresión puede caracterizarse como intracelulár, extracelular o secretado. El término "intracelulár" significa dentro de la célula. El término "extracelular" significa fuera de la célula, por ejemplo, ciertos tipos de proteínas transmembranaria. Una sustancia es "secretada" por una célula si aparece en una cantidad significativa fuera de la célula, proveniente de algún lugar sobre o dentro de la célula.
Como se utiliza en la presente un "polipéptido" se refiere a un polímero compuesto por residuos de aminoácidos, variantes estructurales, variantes estructurales naturales relacionadas y análogos sintéticos no naturales de estas mediante enlaces de polipéptidos. Los polipéptidos sintéticos pueden prepararse, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de polipéptidos automatizado. El término "proteínia" generalmente se refiere a polipéptidos grandes. El término "péptido" generalmente se refiere a polipéptidos cortos. El término "polipéptido" asimismo incluye estructuras poliméricas. Por consiguiente, un "polipéptido" puede ser un monómero, dímero, trímero o una estructura multimérica mayor. Estas estructuras multiméricas pueden presentar hasta 5 megadaltons o más.
Como se utiliza en la presente, el "punto isoeléctrico" es el valor de pH en el cual la carga eléctrica neta de un polipéptido en una solución acuosa es cero.
Como se utiliza en la presente, un "fragmento" de un polipéptido pretende referirse a cualquier porción de un polipéptido o proteína menor que el polipéptido o producto de expresión de proteínas en su longitud completa.
Como se utiliza en la presente, un "análogo" se refiere a cualquiera de los dos o más polipéptidos sustanciaimente similares en estructura y que presentan la misma actividad biológica, pero que pueden tener grados variables de actividad, con respecto a la molécula entera o un fragmento de esta. Los análogos difieren en la composición en sus secuencias de aminoácidos basadas en una o más mutaciones que implican la sustitución de uno o más aminoácidos por otros aminoácidos. Las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras basadas en la relevancia físico-química o funcional del aminoácido que se está reemplazando y el aminoácido que lo reemplaza.
Como se utiliza en la presente una "variante" se refiere a un polipéptido, proteína o su análogo que se modifica para comprender porciones químicas adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Tales porciones pueden modular la solubilidad, absorción, vida media biológica etc. de la molécula. Las porciones pueden disminuir de forma alternativa la toxicidad de la molécula y eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Las porciones capaces de mediar tales efectos se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). El procedimiento para acoplar tales porciones a una molécula es conocido en la técnica. Por ejemplo, la variante puede ser un factor de coagulación sanguínea que presenta una modificación química que confiere a la proteína una vida media más extensa in vivo. En varios aspectos, los polipéptidos se modifican mediante glicosilación, pegilación y/o polisialilación.
VWF recombinante
Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de prepro-VWF se exponen en las SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente y se encuentran disponibles en GenBank No. de acceso NM_000552 y NP_000543, respectivamente. La secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína VWF madura se expone en la SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los aminoácidos 764-2813 de la secuencia de aminoácidos de prepro-VWF de longitud completa).
Una forma de rVWF útil presenta al menos la propiedad de estabilización in vivo, por ejemplo, la unión de al menos una molécula del factor VIII (FVIII) y tener opcionalmente un padrón de glicosilación que es farmacológicamente aceptable. Los ejemplos específicos de ¡lo anterior incluyen VWF sin el dominio A2 por tanto resistentes a la proteólisis (Lankhof et al. , Thromb. Haemost. 77: 1 008-1 01 3, 1997), y el fragmento de VWF de Val 449 a Asn 730 que incluye el dominio Ib de unión a la glicoproteína y los sitios de unión para el colágeno y la heparina (Pietu et al . , Biochem . Biophys. Res. Commun. 164: 1 339-1347, 1989) . La determinación de la habilidad del VWF de estabilizar al menos una molécula de FVI I I puede realizarse en mam íferos VWF-deficientes de conformidad con los métodos conocidos en la técnica.
El rVWF de la presente invención puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Un ejemplo específico se divulga en la WO86/06096, publicada el 23 de octubre de 1986 y en la solicitud de patente estadounidense No. 07/559,509, presentada el 23 de julio de 1 990, que se incorpora en la presente a modo de referencia con respecto a los métodos para producir VWF recombinante. Por consiguiente, los métodos conocidos en la técnica para (i) producir DNA recombinante mediante ingeniería genética, por ejemplo, mediante trascripción inversa de RIMA y/o amplificación de DNA, (ii) introducir
DNA recombinante en las células procarióticas o eucarioticas mediante transfección, por ejemplo, mediante electroporación o microinyección, (iii) cultivar dichas células transformadas, por ejemplo, en forma continua o por lotes, (iv) expresar el VWF, por ejemplo, constitutivamente o tras la inducción, y (v) aislar dicho VWF, por ejemplo, a partir del medio de cultivo o mediante el cultivo de las célulás transformadas, para (vi) obtener rVWF purificado, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio de aniones o cromatografía por afinidad. El VWF recombinante puede prepararse en células huésped transformadas mediante el uso de técnicas de DNA recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias que codifican íel polipéptido pueden escindirse del DNA mediante el uso de enzimas de restricción adecuadas.
De forma alternativa, la molécula de DNA puede sintetizarse mediante el uso de técnicas de síntesis qu ímica, como el método de i fosforamidato. Asimismo, puede utilizarse una combinación de estas técnicas.
La invención asimismo proporciona vectores que codifican los polipéptidos de la invención en un huésped adecuado. El vector comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido unido de forrea operativa a secuencias de control de expresión adecuadas. Los métodos para efectuar este enlace operativo, ya sea antes o después de que el polinucleótido se inserte en el vector, son muy conocidos. Las secuencias de control de expresión incluyen promotores, activadores, mejoradores, operadores, sitios de unión ribosómica, señales de inicip, señales de detención , señales de remate, señales de poliadenilación ! y otras señales implicadas en el control de la transcripción o traduccióh. El vector resultante que tiene el polinucleótido se utiliza para transformar un huésped adecuado. Esta transformación puede realizarse mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica.
Puede utilizarse en la práctica de la presente invención cualquiera de una gran cantidad de células huésped disponibles y bién conocidas. La selección de un huésped particular depende de uña variedad de factores reconocidos por la técnica, incluidos, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión , la toxicidad de los péptidbs codificados por la molécula de DNA, la velocidad de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bioseguridad y los costos. Debe encontrarse el equilibrio de estos factores con el entendimiento de que no todas las células huésped son igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de DNA particular. Dentro de estas directrices generales, las células huésped microbianas útiles incluyen bacterias, levadura y otros hongos, insectos, plantas, mam íferos (incl uidos los humanos) , células en cultivo u otros huéspedes conocidos en la técnica.
A continuación , el huésped transformado se cultiva y se purific|a. Las células huésped pueden cultivarse en condiciones de fermentación convencionales de forma tal que se expresan los compuestos deseados. Tales condiciones de fermentación son conocidas en la técnica. Finalmente, los polipéptidos se purifican a partir de métodos de cultivo conocidos en la técnica.
En función de la célula huésped utilizada para expresar ún compuesto de la invención , los g rupos de carbohidratos (oligosacáridos) pueden unirse de forma conveniente a los sitios que se conocen como sitios de glicosilación en las prote ínas. Generalmente, los oligosacáridos enlazados a O se unen a los residuos de serina (Ser) o treonina (Tjr) mientras que los oligosacáridos enlazados a N se unen a los residuos de aspargina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Tr, donde
X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferentemente uno de los 19 aminoácidos naturales sin contar la prolina. Las estructuras de oligosacáridos enlazados a N y enlazados a O y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuram ínico (denominado ácido siálico). El ácido siálico generalmente es el residuo terminal de los oligosacáridos enlazados a N y enlazados a O y en virtud de su carga negativa, pueden conferir propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Tal(es) sitio(s) puede(n) incorporarse en el enlazador de los compuestos de la presente invención y son preferentemente glicosilados por una célula durante la producción recombinante de los compuestos de polipéptido (por ejemplo, en células mam íferas como CHO, BHK, COS). No obstante, tales sitios pueden además glicosilarse mediante procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica.
De forma alternativa, los compuestos pueden prepararse mediante métodos sintéticos. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas de síntesis de fase sólida. Las técnicas adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen aquellas descritas en Merrifield (1 973) , Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds. ); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. ( 1 985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young ( 1969), Solid Phase Peptide Synthesis; La patente de los EE. UU. No. 3, 941 ,763; Finn et al. ( 1976), The Proteins (3a ed.) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3a ed. ) 2: 257-527. La síntesis de fase sólida es la técnica preferida para preparar péptidos individuales debido a que es el método más eficaz desde jel punto de vista de los costos para preparar péptidos pequeños.
Fragmentos, variantes y análogos de VWF
Los métodos para preparar los fragmentos de polipéptidos, variantes o análogos son conocidos en la técnica.
Los fragmentos de un polipéptido se preparan mediante el uso,; a modo no taxativo, de escisión enzimática (por ejemplo, tripsina, quimotripsina) y asimismo con el uso de medios para generar fragmentos de polipéptido que tienen una secuencia de aminoácido específica. Los fragmentos de polipéptidos pueden generarse abarcando una región de la proteína que tiene una actividad particular, como un dominio de multimerizacion o cualquier otro dominio de VWF identificable conocido en la técnica.
Se contemplan las variantes de un polipéptido para incluir formas humanas y no humanas de VWF (por ejemplo, VWF murino) . Los
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métodos en la presente contemplan además los polipéptidos quiméricos que comprenden, por ejemplo, el polipéptido de fusión de ratón/humanó.
Los métodos para preparar análogos de polipéptidos son también conocidos en la técnica. Los análogos de las secuencias de aminoácidos de un polipéptido pueden ser análogos de sustitución, inserción, adición o eliminación. Los análogos de eliminación , incluidos los fragmentos de un polipéptido, carecen de uno o más residuos de la proteína nativa que no son esenciales para la función o actividad inmunogénica. Los análogos de inserción requieren de la adición de, por ejemplo,
aminoácidos en un punto no terminal en el polipéptido. Este análogo puede incluir la inserción de un epítopo inmunoreactivo o simplemente un residuo simple. Los análogos de adición , incluidos los fragmentos de un polipéptido, incluyen la adición de uno o más aminoácidos en cualquiera de los dos extremos de una proteína e incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión.
Los análogos de sustitución generalmente intercambian un aminoácido del tipo salvaje por otro en uno o más sitios dentro de la proteína y pueden designarse para modular una o más propiedades del polipéptido sin la pérdida de otras funciones o propiedades. En un aspecto, las sustituciones son sustituciones conservadoras. La expresión "sustitución de aminoácidos conservadora" significa la sustitución de un aminoácido con un aminoácido que tiene una cadena lateral de carácter químico similar. Los aminoácidos similares para realizar sustituciones conservadoras incluyen aquellos que tienen una cadena lateral ácida (ácido glutám ico, ácido aspártico); una cadena lateral básica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral de amida polar (glutamina, aspargina); una cadena lateral a I if ática , hidrófoba (leucina, isoleucina , valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromática (fenilalanina, triptófano, tirosina); una cadena lateral pequeña (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral de hidroxilo alifático (serina, treonina).
Los análogos pueden ser sustancialmente homólogos o sustancialmente idénticos al VWF recombinante del cual se derivan. Los análogos preferidos son aquellos que retienen al menos alguna actividad biológica del polipéptido de tipo salvaje, por ejemplo, actividad de coagulación sanguínea.
Las variantes de polipéptidos contempladas incluyen polipéptidos modificados químicamente mediante técnicas como ubiquitinación, glicosilación, incluida la polisilación, conjugación con agentes terapéuticos o de diagnóstico, etiquetado, enlace de polímero covalente, como la pegilación (derivación con polietilenglicol), introducción de enlaces no hidrolizables e inserción o sustitución mediante síntesis quím ica de aminoácidos como ornitina, que no se producen normalmente en las proteínas humanas. Las variantes retienen las mismas o esencia lmente las mismas propiedades de un ión que las molécu las de la invención no modificadas. Tal modificación química puede incluir unión directa o indirecta (por ejemplo, mediante un enlazador) de u n agente al polipéptido del VWF. En el caso de la unión indirecta, se contempla que el enlazador puede ser hidrolizable o no hidrolizable.
La preparación de análogos de polipéptido pegilados generalmente comprenderá las siguientes etapas: (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol (como un éster reactivo o un derivado de aldeh ido de PEG) en condiciones por las cuales el polipéptido de construcción de unión se une a uno o más grupos PEG , y (b) obtener los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán en base a parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción de PEG: proteína, mayor será el porcentaje de producto polipegilado. En algunas modalidades, la construcción de unión tendrá una única porción PEG en el extremo N. El polietilenglicol (PEG) puede unirse al factor de coagulación sanguínea para proporcionar una mayor vida media ¡n vivo. El grupo PEG puede tener cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio de PEG oscila entre aproximadamente 2 kilodaltones ("kD") y aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa. Los grupos PEG se unen al factor de coagulación sanguínea mediante acilación o alquilación reductora a través de un grupo reactivo natural o diseñado sobre la porción de PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, arrimo, tiol o éster) al grupo reactivo en el factor de coagulación sanguínea (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o éster) o mediante cualquier otra técnica conocida en la técnica.
Los métodos para preparar polipéptidos polisialilados se describen en la publicación de patente estadounidense 20060160948, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, ly Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006. En resumen, una solución de ácido colomínico que contiene Nal040.1 M se agita en la oscuridad a temperatura ambiente para oxidar el CA. La solución de CA activada se dializa contra, por ejemplo, una solución amortiguadora de fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,2 en la oscuridad y esta solución se agrega a la solución de rVWF y se incuba durante 18 horas a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave. Los reactivos libres puedén separarse del conjugado ácido polisiálico de rVWF mediante ultrafiltración/diafiltración. La conjugación de rVWF con ácido polisiálico puede asimismo lograrse mediante el uso de glutaraldehído como reactivo de reticulación (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004).
Se contempla además que un polipéptido de la invención puede ser una proteína de fusión con un segundo agente que es un polipéptido. En una modalidad, el segundo agente que es un polipéptido, a modo no taxativo, es una enzima, un factor de crecimiento, un anticuerpo, una citocina, una quimiocina, un receptor de superficie celular, el dominio extracelular de un receptor de superficie celular, una molécula de adhesión celular o un fragmento o dominio activo de una proteína descrita anteriormente. En una modalidad relacionada, el segundo agente es un factor de coagulación sanguínea como el Factor VIII, Factor VII, Factor IX. La proteína de fusión contemplada se prepara mediante técnicas químicas o de recombinación bien conocidas en |la técnica.
Se contempla asimismo que los polipéptidos de prepro-VWF \ y pro-VWF pueden proporcionar un beneficio terapéutico en las formulaciones de la presente invención. Por ejemplo, la patente estadounidense No. 7,005,502 describe una preparación farmacéutica que comprende cantidades sustanciales de pro-VWF que induce la generación de trombina en la presencia de plaquetas in vitro. Además de fragmentos biológicamente activos recombinantes, variantes ; 0 análogos del VWF maduro natural, la presente invención contempla el uso de fragmentos biológicamente activos recombinantes, variantes ;o análogos de los polipéptidos de prepro-VWF (expuestos en la SEQ ID NO:2) o pro-VWF (residuos de aminoácidos 23 a 764 de la SEQ I D NO: 2) en las formulaciones descritas en la presente.
Los polinucleótidos que codifican los fragmentos, variantes y análogos pueden generarse fácilmente por un trabajador de la técnica para codificar fragmentos biológicamente activos, variantes o análogos de la molécula natural que posee la misma o similar actividad biológica que la molécula natural. Estos polinucleótidos pueden prepararse mediante el uso de técnicas de PCR, digestión/ligación de la molécula que codifica el DNA y similares. Por consiguiente, el entendido en la técnica podrá generar cambios de base simples en el filamento de DNA para resultar en un codón alterado u una mutación de sentido erróneó, mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica , incluida, a modo no taxativo, la mutagénesis específica de sitio. Como se utiliza én la presente, la expresión "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" significa, por ejemplo, hibridación a 42°C en 50% formamida y lavado a 60°C en 0, 1 x SSC, 0, 1 % SDS. Los entendidos en la técnica entienden que la variación en estas condiciones ocurre en base a la longitud y el contenido de base de nucleótido GC de las secuencias que
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van a hibridarse. Las fórmulas estándares en la técnica son adecuadas para determinar las condiciones de hibridación exacta. Ver Sambrook ét al. , 9.47-9.51 en Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1 989) . ¡
Métodos para producir VWF
Industrialmente, el VWF, en particular el VWF recombinante
humano (rVWF), se sintetiza y se expresa junto con el rFVIII en una línea de células CHO diseñada genéticamente. La función del rVWF coexpresado es estabilizar el rFVIII en el proceso de cultivo celular. Él rVWF se sintetiza en la célula como pro-forma, que contiene un gran pro-péptido unido al extremo N. Tras la maduración en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi, el propéptido se escinde por la acción de la furina de la proteasa celular y se secreta como un homopolímero de subunidades idénticas, que consiste en dímeros de la proteína expresada.
Purificación del VWF
En la presente se proporciona un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene proteínas que comprende aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína y lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, dicha primera solución amortiguadora de lavado tiene un pH que es igual o menor que el de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes.
En un aspecto, el pH de la solución es de aproximadamente 1 unidad de pH superior al punto isoeléctrico de la proteína. En otros aspectos el pH de la solución es de aproximadamente 1,2, o aproximadamente 1,4, o aproximadamente 1,6, o aproximadamente 1,8, o aproximadamente 2,0, o aproximadamente 2,2, o aproximadamente 2,4, o aproximadamente 2,6, o aproximadamente 2,8, jo
aproximadamente 3,0, o aproximadamente 3,2, o aproximadamente 3,4, o aproximadamente 3,6, o aproximadamente 3,8, o aproximadamente 4,0, o aproximadamente 4,2, o aproximadamente 4,4, o aproximadamente 4,6, o aproximadamente 4,8, o aproximadamente 5,0, o aproximadamente 5,5, o aproximadamente 6,0 unidades de pH o más por encima del punto isoeléctrico de la proteína.
En estas modalidades el pH es superior a aproximadamente 7. En otros aspectos, el pH es de aproximadamente 7.1, aproximadamente 7,2, o aproximadamente 7,3, o aproximadamente 7,4, o aproximadamente 7,5, o aproximadamente 7,6, o aproximadamente 7,7, o aproximadamente 7,8, o aproximadamente 7,9, o aproximadamente 8,0, o aproximadamente 8,1, o aproximadamente 8,2, o aproximadamente 8,3, o aproximadamente 8,4, o aproximadamente 8,5, o aproximadamente 8,6, o aproximadamente 8,7, o aproximadamente 8,8, o aproximadamente 8,9, o aproximadamente 9,0, o aproximadamente 9,1, o aproximadamente 9,2, o aproximadamente 9,3, o aproximadamente 9,4, o aproximadamente 9,5, o aproximadamente 9,6, o aproximadamente 9,7, o aproximadamente 9,8, o aproximadamente 9,9, o aproximadamente 10,0, o aproximadamente 10,1, o aproximadamente 10,2, o aproximadamente 10,3, o aproximadamente 10,4, o aproximadamente 10,5, o aproximadamente 10,6, o aproximadamente 10,7, o aproximadamente 10,8, ¡o aproximadamente 10,9, o aproximadamente 11,0, o aproximadamente 11,1, o aproximadamente 11,2, o aproximadamente 11,3, o aproximadamente 11,4, o aproximadamente 11,5, o aproximadamente 1 1 ,6, o aproximadamente 1 1 ,7, o aproximadamente 1 1 ,8, o aproximadamente 1 1 ,9, o aproximadamente 12,0, o aproximadamente 12, 1 , o aproximadamente 12,2, o aproximadamente 12, 3, o aproximadamente 12,4, o aproximadamente 1 2 , 5, o aproxi madamente 12,6, o aproximadamente 12,7, o aproximadamente 12, 8, o aproximadamente 1 2,9, o aproximadamente 1 3, 0 o superior.
En otra modalidad, se proporciona un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene proteínas que comprende aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes, lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado a un pH superior al pH de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes y lavar la resina de intercam bio de cationes con una segunda solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, dicha segunda solución amortiguadora de lavado tiene un pH que es igual o menor que el de la primera solución amortiguadora de lavado. En un aspecto, el pH de la primera solución amortiguadora de lavado es de aproximadamente una unidad de pH superior al pH de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes. Para esta etapa se contempla que el medio de intercambio de iones sea UNOsphere™ S (BioRad Laboratories, I nc. , Hercules, CA), pero pueden utilizarse otros sistemas de intercambio de cationes en la práctica de los métodos. Estos sistemas de intercambio de cationes son conocidos por el entendido en la técnica.
En otros aspectos, el pH de la primera solución amortiguadora de lavado es de aproximadamente 1 , 1 , o aproximadamente 1 ,2, o
aproximadamente 1,3, o aproximadamente 1,4, o aproximadamente 1,5, o aproximadamente 1,6, o aproximadamente 1,7, o aproximadamente 1,8, o aproximadamente 1,9, o aproximadamente 2,0, o aproximadamente 2,1, o aproximadamente 2,2, o aproximadamente 2,3, o aproximadamente 2,4, o aproximadamente 2,5, o aproximadamente 2,6, o aproximadamente 2,7, o aproximadamente 2,8, o aproximadamente 2,9, o aproximadamente 3,0, o aproximadamente 3,1, o aproximadamente 3,2, o aproximadamente 3,3, o aproximadamente 3,4, o aproximadamente 3,5, o aproximadamente 3,6, ;o aproximadamente 3,7, o aproximadamente 3,8, o aproximadamente 3,9, o aproximadamente 4,0, o aproximadamente 4,1, o aproximadamente 4,2, o aproximadamente 4,3, o aproximadamente 4,4, o aproximadamente 4,5, o aproximadamente 4,6, o aproximadamente 4,7, o aproximadamente 4,8, o aproximadamente 4,9, o aproximadamente 5,0, o aproximadamente 5,1, o aproximadamente 5,2, o aproximadamente 5,3, o aproximadamente 5,4, o aproximadamente 5,5, o aproximadamente 5,6, o aproximadamente 5,7, o aproximadamente 5,8, o aproximadamente 5,9, o aproximadamente 6,0 o más unidades de pH superiores al punto isoeléctrico de la proteína. En estas modalidades el pH de la primera solución amortiguadora de lavado es superior a aproximadamente 7. En otros aspectos, el pH de la primera solución amortiguadora de lavado es de aproximadamente 7,1, !o aproximadamente 7,2, o aproximadamente 7,3, o aproximadamente 7,4, o aproximadamente 7,5, o aproximadamente 7,6, o aproximadamente 7,7, o aproximadamente 7,8, o aproximadamente 7,9, o
aproximadamente 8,0, o aproximadamente 8,1, o aproximadamente 8,2, o aproximadamente 8,3, o aproximadamente 8,4, o aproximadamente 8,5, o aproximadamente 8,6, o aproximadamente 8,7, o aproximadamente 8,8, o aproximadamente 8,9, o aproximadamente 9,0, o aproximadamente 9,1, o aproximadamente 9,2, o aproximadamente 9,3, o aproximadamente 9,4, o aproximadamente 9,5, o aproximadamente 9,6, o aproximadamente 9,7, o aproximadamente 9,8, o aproximadamente 9,9, o aproximadamente 10,0, o aproximadamente 10,1, o aproximadamente 10,2, o aproximadamente 10,3, o aproximadamente 10,4, o aproximadamente 10,5, o aproximadamente 10,6, o aproximadamente 10,7, o aproximadamente 10,8, o aproximadamente 10,9, o aproximadamente 11,0, o aproximadamente 11,1, o aproximadamente 11,2, o aproximadamente 11,3, o aproximadamente 11,4, o aproximadamente 11,5, o aproximadamente 11,6, o aproximadamente 11,7, o aproximadamente 11,8, o aproximadamente 11,9, o aproximadamente 12,0, o aproximadamente 12,1, o aproximadamente 12,2, o aproximadamente 12,3, ;o aproximadamente 12,4, o aproximadamente 12,5, o aproximadamente 12,6, o aproximadamente 12,7, o aproximadamente 12,8, o aproximadamente 12,9, o aproximadamente 13,0 o superior.
Los siguientes ejemplos no pretenden ser limitativos sirio únicamente ejemplificativos de las modalidades específicas de la invención.
Ejemplos
Ejem plo 1
Los virus y células utilizados en los ensayos descritos a continuación son los siguientes.
El REO-3 (Familia Reoviridae; virus dsRNA sin envoltura) Strain Dearing (ATCC VR-824) se obtuvo del ATCC. El virus se propagó y se valoró en células Vero obtenidas de ECACC (841 1 3001 ). El MMV (Familia Parvoviridae; virus de ssDNA sin envoltura) , cepa prototipo (ATCC VR-1 346), se obtuvo de la colección estadounidense de cultivos tipo, Rockville , Maryland . El virus se propagó y se valoró en células A9 (ATCC CCL-1 .4) . El PPV (Familia Parvoviridae; virus de ssDNA sin envoltura), cepa Tennessee (BRFF #PP951 024), se obtuvo de Biological Research & Facility, Ijamsville, Maryland . El virus se propagó y se valoró en células PK-1 3 (ATCC CRL-6489) . El EMCV (Familia Picornaviridae; ssRNA sin envoltura) (ATCC #VR-1 29B) se obtuvo de la colección estadounidense de cultivos tipo. El virus se propagó y se valoró en células Vero (colección europea de cultivos celulares, ECACC, #841 1 3001 ). El HadV (Familia Adenoviridae; dsDNA sin envoltura), cepa Adenoid 75 (ATCC VR-5), se obtuvo de la colección estadounidense de cultivos tipo. El virus se propagó y se valoró en células HeLa (ATCC CCL-2).
Las etapas implicaron un proceso de purificación del VWF ejemplar que comprende:
• Cromatografía por afinidad inmune del sobrenadante del cultivo celular
¡. Fracción de flujo
• Intercambio de aniones (por ejemplo, columna de intercambio de aniones de trimetilaminoetilo)
• Filtración (0,45/0,2 µ??)
• Intercambio de aniones (por ejemplo, Mustang Q (Pall Corporation))
• Inactivación de virus (por ejemplo, mediante el uso de tratamiento con disolvente/detergente)
• Filtración (0,8/0,65 pm)
• Intercambio de cationes (por ejemplo, columna UNO S) · Ultrafiltración/Concentración
• Filtración (0,45/0,2 µ??)
• Filtración en gel (Superóse 6 prep grade (GE Life Sciences))
Optimización de la etapa de UNO S. Durante la etapa UNO S él rVWF se une a una fuerte resina de intercambio de cationes mientras que algunas de las impurezas pasan a través de esta. Después de lavar la columna con soluciones amortiguadoras de conductividad aumentada el rVWF unido se libera de la columna con una etapa de sal. Durante los estudios iniciales de extracción de virus, esta etapa mostró al menos una proporción de extracción significativa para el REO virus modelo. Las condiciones de los parámetros aplicados y los resultados correspondientes se enumeran en la tabla 1, a continuación.
Tabla 1
*Solución amortig uadora TQA: Tris, NaAc, m NaCI en WFI
pH 6, 3 - 6 , 7 a 20 - 25°C
Como puede observarse en la Tabla 1 los cambios moderados en los parámetros del proceso (mod ificación de la conductividad , pH 8,0 y aditivos para soluciones amortiguadoras de lavado) no resu ltó en una mejora sign ificativa en las proporciones de extracción del MMV. El aumento del pH a 9, 0 resultó en una proporción de extracción significativa de más de 2 log para MMV as í como para el virus REO. Este cambio en el proceso es técnicamente fácil de implementar y la exposición del rVWF al am biente de pH elevado puede realizarse por u n tiempo relativamente corto (máximo 6 horas). La elución del rVWF unido se realiza en cond iciones neutrales.
El aná lisis de la capacidad de inactivación de virus de los procesos se llevó a cabo de conformidad con las recomendaciones de la directriz C PM P 268/95, med iante el uso de la siguiente fórmula:
Donde
R = factor de reducción de virus
V1 = vol umen del materia l de partida [mi]
T1 = concentración del virus en el material de partida [TCID50/ml]
V2 = volumen del material después de la etapa [mi]
T2 = concentración del virus después de la etapa [TCID50/ml]
Los volúmenes y los valores de cada muestra claveteada antes y después del tratamiento se utilizaron para calcular R. Cuando el virus era indetectable, el límite de detección se tomaba como el valor del virus para el cálculo. Los cálculos se realizaron con los valores diel virus (log 0[TCID50/ml]) con dos lugares decimales y únicamente resultados finales, es decir, los factores reductores (R), se redondearon al primer lugar decimal.
Ejemplo 2
El eluido de UNO S se concentró a aproximadamente 800 pg rVWF antígeno/ml mediante ultrafiltración con el uso de cortes de membranas de celulosa modificadas de 30 kDa para facilitar el análisis de trazas de impurezas y de variantes del producto.
Prueba del rVWF
Actividad de ristocetina. La actividad del cofactor de ristocetina se determinó mediante un analizador turbidimétrico mediante el uso del reactivo de von Willebrand que contenía trombocitos estabilizados y el antibiótico "ristocetina". El factor von Willebrand contenido en la muestra (= cofactor de ristocetina) provoca la aglutinación de los trombocitos estabilizados en la presencia de ristocetina. La aglutinación reduce la turbidez de la preparación de reactivos y el cambio en la densidad óptica se mide mediante el analizador turbidimétrico. La calibración se realiza mediante el estándar de referencia de concentrado WHO #00/514.
Antígeno del VWF. Las muestras del VWF se prueban para verificar su contenido de antígeno de VWF en un ensayo ELISA, sistema de fase doble, con dos anticuerpos policlonales. La medición de las reacciones de color en las placas de microtitulación se realiza con un fotómetro a 490 nm. La concentración de cada muestra se calcula hacia la curva estándar con un programa de análisis ELISA apoyado por computadora (algoritmo de curva: regresión cúbica). Todas las lecturas se corrigen contra el blanco.
Actividad de unión del FVIII. La unión de F VI 11 del rVWF en condiciones estáticas se determinó mediante un ensayo cromogénico ELISA (ECA) mediante la incubación de una cantidad constante de rFVMI con una muestra que contenía VWF diluido. El complejo VWF- FVIII formado a continuación se transfirió a una placa de microtitulación recubierta con un anticuerpo de VWF policlonal antihumano de conejo disponible comercialmente. Después de la incubación, el FVIII sin unir se extrajo mediante una etapa de lavado subsiguiente. El FVIII unido se cuantificó mediante un ensayo cromogénico de FVIII disponible comercialmente (Technochrom FVIII C reagent kit, Technoclone, Austria). Las densidades ópticas corregidas por blanco (en mOD/min'a 405 nm) se graficaron contra las concentraciones de VWF:Ag en escala logarítmica.
Análisis SDS-PAGE. El análisis convencional 8% SDS-PAGE n
condiciones de reducción y tinción de geles con azul de Coomassiej y tinción de plata puede proporcionar una percepción de la composición de la proteína de rVWF. Después de la transferencia de las bandas de proteína separadas a una membrana de nitrocelulosa y de la tinción inmunológica de la proteína con anticuerpos adecuados contra VWF, FVIII y Furina respectivamente, puede realizarse una comparación de las proteínas relacionadas con el VWF con las proteínas totales.
Análisis multimérico. La estructura multimérica del VWF se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa SDS horizontal de alta densidad. En resumen, las muestras se diluyen a la misma concentración en el intervalo de 0,3-1,0 lU/ml VWF:Ag, se incuban cón una solución amortiguadora de Tris-EDTA-SDS y los multímeros se separan en condiciones de no reducción sobre gel de agarosa. Los multímeros de VWF se visualizaron mediante inmunotinción en gel con el anticuerpo policlonal de VWF antihumano de conejo, seguido de IgG cabra anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (ALP) mediante el uso del kit de desarrollo de color ALP. De forma alternativa, los geles de agarosa se transfirieron a una membrana de transferencia y la tinción se realizó mediante un anticuerpo de VWF policlonal antihumano de conejo seguido por IgG anti conejo conjugado por peroxidasa de rábano picante. Para la visualización, se utilizó electroquimiolimuniscencia que aumenta la sensibilidad de detección de VWF en al menos dos magnitudes. Las condiciones de resolución baja (1% agarosa) y alta (2.5 % agarosa) se utilizaron para analizar la distribución de tamaño de los multímeros de VWF y la estructura multimérica, respectivamente.
Análisis de HPLC. El VWF recombinante puede escindirse mediante GluC (V8 proteasa) en condiciones nativas para proporcionar dos fragmentos principales (fragmento de homodímero N-terminal y extermina!) que se separan en una columna C4 de HPLC de fase inversa. Los fragmentos se detectan mediante el control de la absorbancia UV a 280 nm.
Mapeo de péptidos. La estructura primaria del rVWF se investigó mediante el uso de un enfoque de mapeo de péptidos. Las muestras de rVWF purificado se redujeron con d itiotrito I (DTT) y los grupos de sulfhidrilo libres se bloquearon con 4-vinilpiridina. Se agregó tripsina de grado de secuenciación al rVWF y se dejó reaccionar durante 18 horas. La mezcla de péptidos resultante se separó mediante cromatografía de fase inversa. Los péptidos de elución se detectaron mediante detección UV en línea a 214 nm y espectrometría de masas por ionización por electroatomización en línea.
Prueba del rVWF desamidado. El método analítico para la detección de iso-aspartato (un producto de reacción que se origina a partir de la desamidación de aspargina) emplea digestión tríptica, seguida de la reacción enzimática de la proteína isoaspartil metil transferasa (PIMT) mediante el uso del kit de detección de isoaspartato ISOQUANT suministrado por Promega. La PIMT cataliza la transferencia de un grupo metilo del sustrato S-adenosil-L metionina (SAM) al IsoAsp en la posición de carboxilo, lo que genera S-adenosil homocisteína (SAH). La SAH liberada estoiquimétricamente se detecta en una longitud de onda de 260 nm mediante el método de RP HPLC.
Los datos anal íticos para el prod ucto obtenido mediante diferentes procesos se resumen en la tabla 2.
Tabla 2 : Datos analíticos para el pH 9 y ejecuciones de control
Como puede observarse en la tabla 2, las propiedades
I
bioquímicas del rVWF purificado mediante las diferentes variantes de i proceso son comparables. i
La banda fundamental de la proteína del rVWF es muy similar en todos los productos mientras que el grado de impurezas es menor en la muestra #1 (denominada VWF#07 en la figura 1 ) mediante análisis de tinción de plata y western blot para el rFVI I I residual. El patrón de bandas para el rFVI I I es comparable en todos los lotes lo que sugiere que no ocurrió ninguna degradación debido a las condiciones de pH 9,0.
La electroforesis en gel de agarosa de alta resolución reveló ja alta similitud de las preparaciones del rVWF. No se observaron
diferencias en la composición de multímeros mediante el análisis de baja resolución. La figura 2 muestra el gel teñido de las ejecuciones UNO S con las muestras inoculadas con los virus MMV y REO. Asimismo, el análisis de multímeros de alta resolución reveló el patrón intacto de multímeros que sugiere que no se produjo ningún daño de los multímeros del rVWF debido a las condiciones de pH 9,0. La figura 3 muestra el gel teñido de las ejecuciones UNO S con las muestras inoculadas con los virus MMV y REO. ;
Mediante el ensayo Isoquant no se puedo detectar ninguna desamidación mejorada debido al tiempo de residencia del rVWF a pH 9,0. Generalmente el porcentaje molar del rVWF desamidado es muy bajo. El sometimiento de las preparaciones purificadas del rVWF obtenido mediante las variantes de proceso a digestión proteolítica por la proteasa V8 en el estado nativo (ver la figura 4) o tripsina (ver la figura 5) en el estado desnaturalizado y la separación de los péptidos resultantes mediante RP-HPLC resultó en cromatogramas similares para todas las muestras.
Las diferencias menores en los patrones de los picos se deben a la presencia de diferentes cantidades de impurezas (principalmente ;el propéptido de rVWF residual como puede observarse en la figura 1) én las preparaciones lo que se confirmó mediante espectrometría de masas o análisis de la secuencia N- Terminal. ;
Ejemplo 3
Purificación del rVWF mediante cromatografía de intercambio de cationes a pH elevado con enclavamiento de MMV.
La resina UNOsphere S comprimida en una columna se activó con 1 CV de 2 M NaCI y se equilibró con 25 CV de una solución amortiguadora de equilibración (pH=9,0). A partir de entonces \a solución que contenía rVWF ajustada a una conductividad de 15 mS/cm y un pH de 9t0 y enclavada con el virus diminuto de ratón (MMV) se cargó en la columna a una velocidad de flujo lineal de aproximadamente
10,0 cm/h. A continuación la columna se lavó con 10 CV de solución
i amortiguadora de equilibración (pH=9,0) y el producto se eluyó con 3,5 CV de solución amortiguadora de elución (pH=7,5) a una velocidad de flujo lineal de 65cm/h. El aumento de pH durante la fase de cargaj y lavado redujo de forma significativa la unión de las partículas de virusia la resina pero retuvo la unión completa del producto de VWF. Én consecuencia, la mayoría de las partículas de virus cargadas se encontraron libres (fluyendo) y la fracción de lavado se separó d'el producto que se recuperó en el depósito de eluido en altos rendimiento|s. Los resultados en la tabla 3 muestran que mediante la aplicación de este procedimiento se puedo obtener una capacidad de extracción viral
El ensayo de TCID50 se realizó de la siguiente forma. resumen, las diluciones en serie de 1/2 log de las muestras se prepararon en el medio de cultivo de tejido adecuado y se agregaron 100 µ? de cada dilución a cada uno de las 8 cavidades de la placa de microtitulación sembrada con el indicador de células. Las células se incubaron durante 7 días a 36°C ± 2°C antes de que se evaluara ¡el efecto citopatico mediante inspección visual de las células bajo ún microscopio. Las dosis medias infecciosas de cultivo tisular (TCID5p) se calcularon de conformidad con la distribución de Poisson y se
i expresaron como logi0[TCID50/ml]. \
Tabla 3: Purificación de rVWF en UNOsphere S
La purificación se realizó mediante el uso de una columna con 15
I
mm de diámetro y una altura de lecho de 14 cm. Los datos mostraron valores del virus diminuto de ratón activo. ¡
Ejemplo 4 i
Purificación del rVWF mediante cromatografía de intercambio de cationes a pH elevado con enclavamiento del virus Reo de tipo 3.
La resina UNOsphere S comprimida en una columna se activó con 1 CV de NaCI 2 M y se equilibró con 25 CV de una solución amortiguadora de equilibración (pH=9,0). A partir de ese momento la solución que contenía rVWF ajustada a una conductividad de 15 mS/c'm y un pH de 9,0 y enclavada con varios virus sin envoltura se cargó en la columna a una velocidad de flujo lineal de aproximadamente 100 cm/h. La columna a continuación se lavó con 10 CV de solución amortiguadora de equilibración (pH=9,0) y el producto se eluyó con 3,5 CV de solución
j amortiguadora de elución (pH=7,5) a una velocidad de flujo lineal de 65
j cm/h. El aumento de pH durante la fase de carga y lavado redujo de forma significativa la unión de las partículas de virus a la resina pero retuvo la unión completa del producto de VWF. En consecuencia, la mayoría de las partículas de virus cargadas quedaron libres (fluyendo)! y la fracción de lavado se separó del producto que se recuperó en ¡el depósito de eluido en altos rendimientos. Los resultados en la tabla ¡4 muestran que mediante la aplicación de este procedimiento se pudo obtener una capacidad de extracción viral de 2 logs con el modelo de virus sin envoltura, virus Reo de ratón tipo 3 (REO-MI).
Tabla 4: Purificación de rVWF en UNOsphere S
La purificación se realizó mediante el uso de una columna con 15 mm de diámetro y una altura de lecho de 14 cm . Los datos mostrados son los valores del virus Reo de ratón tipo II I activo (REO-I I I).
Ejemplo 5
Purificación del rVWF en UNOsphere S de conformidad con el procedimiento estándar (pH neutral).
La resina UNOsphere S comprimida en una columna se activó con 1 CV de NaCI 2 M y se equilibró con 25 CV de una solución amortiguadora de equilibación (pH=6, 5). A partir de entonces la solución que conten ía rVWF ajustada a una conductividad de 1 5 mS/cm y un pH de 6,5 y enclavada con varios virus sin envoltura se cargó en la columna a una velocidad de flujo lineal de aproximadamente 100 cm/h. La columna a continuación se lavó con 1 0 CV de solución amortiguadora de equilibración (pH=6,5) y el producto se eluyó con 3, 5 CV de solución amortiguadora de elución (pH=7,5) a una velocidad de flujo lineal de 65 cm/h. El valor de los virus de los diversos virus probados se evaluó en diferentes fracciones cromatográficas (carga, flujo de colum na, lavado, eluido, post eluido) y se calcularon los factores de reducción. Los resultados en la tabla 5 muestran que mediante la aplicación del procedimiento de purificación estándar para el VWF en UNOsphere S la capacidad de extracción de los virus sin envoltura fue insuficiente para los diferentes modelos de virus probados para reivindicar una etapa cromatográfica sólida para la extracción de virus con envoltura rio lipídica.
Tabla 5: Pu rificación de VWF de conform idad con el procedimiento estándar y las capacidades de reducción correspondientes para los virus sin envoltura.
La proporción de reducción se calcula como la carga total virus en la fracción de carga divid ida por la carga total de virus en fracción de elu ido expresada en valores logarítm icos .
Claims (15)
1. Un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene proteínas que comprende: j aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes a Un j pH superior al punto isoeléctrico de la proteína; y lavar la resina de intercambio de cationes con una primera i solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicha primera solución amortiguadora de lavado tiene un pH que es igual¡ o menor que el de la solución aplicada a la resina de intercambio ele cationes. !
2. El método de la reivindicación 1 donde la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes es al menos 1 unidad ele pH superior al punto isoeléctrico de la proteína. [
3. Un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene proteínas que comprende: j aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes, j lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado a un pH superior al pH de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes; y lavar la resina de intercambio de cationes con una segunda solución amortiguadora de lavado para formar un eluído, dicho eluido tiene un pH que es igual o menor que la primera solución amortiguadora de lavado. ¡
4. El método de la reivindicación 3 donde el pH de ja primera solución amortiguadora de lavado es al menos 1 unidad de pH superior al punto isoeléctrico de la proteína aplicada a la resina de I intercambio de cationes.
5. Un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene proteínas que comprende: j aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína; y ¡ lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína aplicada a la resina de intercambio de cationes; y lavar la resina de intercambio de cationes con una segunda solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicho eluido tiene un pH que es igual o menor que la primera solución amortiguadora de lavado.
6. El método de la reivindicación 5 donde la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes es al menos 1 unidad de pH superior al punto isoeléctrico de la proteína.
7. El método de la reivindicación 5 donde el pH de primera solución amortiguadora de lavado es al menos 1 unidad de superior al pH de la proteína aplicada a la resina de intercambio cationes.
8. El método de las reivindicaciones 2, 4, 6 o 7 donde el es mayor que 7,0. i
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la proteína en la solución es un polipéptido que tiene una masa molecular de al menos aproximadamente 1 50 kilodaltones.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la resina de intercambio de cationes tiene un grupo cargado negativamente que se selecciona del grupo que consiste én carboximetilo (CM), sulfoalquilo (SP, SE) , esteres sulfatados de celulosa, heparina y metilsulfonato (S).
1 1 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 0 donde la proteína es una proteína de coagulación sangu ínea.
12. El método de la reivindicación 1 1 donde la proteína de coagulación sangu ínea se selecciona del grupo que consiste en el factor VI I I y el factor von Willebrand.
13. Un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene el factor von Willebrand (VWF) que comprende: aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína; y lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicha primera solución amortiguadora de lavado tiene un pH que es igual o menor que el de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes.
14. Un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene VWF que comprende: aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes, lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado a un pH superior al pH de la solución aplicada a la resina de intercambio de cationes; y lavar la resina de intercambio de cationes con una segunda solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicho eluido tiene un pH que es igual o menor que la primera solución amortiguadora de lavado.
15. Un método para extraer un virus con envoltura no lipídica de una solución que contiene VWF que comprende: aplicar la solución a una resina de intercambio de cationes a ün pH superior al punto isoeléctrico de la proteína; y lavar la resina de intercambio de cationes con una primera solución amortiguadora de lavado a un pH superior al punto isoeléctrico de la proteína aplicada a la resina de intercambio de cationes; y lavar la resina de intercambio de cationes con una segunda solución amortiguadora de lavado para formar un eluido, donde dicho primer eluido tiene un pH que es igual o menor que la primera solución amortiguadora de lavado.
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