BR112012003802B1

BR112012003802B1 - Método para remover um vírus sem envelope lipídico de uma solução

Info

Publication number: BR112012003802B1
Application number: BR112012003802-8A
Authority: BR
Inventors: Artur Mitterer; Meinhard Hasslacher; Christa Mayer
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2009-08-20
Filing date: 2010-08-20
Publication date: 2022-10-25
Also published as: EP2467399A1; CN102482341A; US20110092681A1; HUE026907T2; AU2010284116A1; NZ598249A; EP2467399B2; WO2011022657A1; AU2010284116B9; SG178478A1; KR101894600B1; JP5838159B2; BR112012003802A2; ES2562256T5; CN106008697A; PT2467399E; SG10201408106WA; IN2012DN01849A; EP2467399B1; DK2467399T3

Abstract

MÉTODO PARA REMOVER UM VÍRUS ENVELOPADO COM NÃO LIPÍDIO DE UMA SOLUÇÃO. A presente invenção fornece métodos para purificar fator Von. Willebrand (VWF) para remoção elevada de vírus envelopados com não lipídio.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade de acordo com 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido Provisório US 61/235.570, depositado em 20 de agosto de 2009, cuja revelação é incorporada neste documento como referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] De forma geral, a invenção refere-se a métodos de purificação de VWF para remoção aumentada de vírus sem envelope lipídico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O fator de von Willebrand (VWF) é uma glicoproteína circulante no plasma como uma série de multímeros que variam em tamanho de cerca de 500 a 20.000 kD. Formas multiméricas do VWF são compostas por subunidades polipeptídicas de 250 kD ligadas juntas por ligações dissulfeto. O VWF medeia adesão plaquetária inicial ao subendotélio da parede do vaso danificado. Apenas os multímeros maiores apresentam atividade hemostática. Supõe-se que células endoteliais secretem grandes formas poliméricas de VWF e essas formas de VWF que têm um baixo peso molecular (VWF de baixo peso molecular) surgem de clivagens proteolíticas. Os multímeros tendo grandes massas moleculares são armazenados nos corpos de Weibel-Pallade de células endoteliais e liberados mediante estimulação.

[004] O VWF é sintetizado por células endoteliais e megacariócitos como prepro-VWF que consiste em grande extensão em domínios repetidos. Após a clivagem do peptídeo sinal, pro-VWF dimeriza através de ligações dissulfeto na sua região C-terminal. Os dímeros servem como protômeros para multimerização que é regida por ligações dissulfeto entre a terminação de extremidade livre. A montagem para multímeros é seguida pela remoção proteolítica da sequência propeptídeo (Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261).

[005] O produto de tradução primária previsto a partir do cDNA clonado do VWF é um polipeptídeo precursor com 2813 resíduos (prepro-VWF). O Prepro-VWF consiste em um peptídeo sinal de 22 aminoácidos e um propeptídeo de 741 aminoácidos, com o VWF maduro compreendendo 2050 aminoácidos (Ruggeri Z.A., and Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993)).

[006] Defeitos no VWF são causadores da doença de Von Willebrand (VWD), que é caracterizada por um fenótipo de sangramento de maior ou menor pronunciamento. VWD tipo 3 é a forma mais grave na qual o VWF está completamente ausente, e tipo VWD 1 refere-se a uma perda quantitativa de VWF e seu fenótipo pode ser muito brando. VWD tipo 2 refere-se a defeitos qualitativos do VWF e pode ser tão grave como VWD tipo 3. A VWD tipo 2 tem muitas subformas, algumas sendo associadas com a perda ou a redução de multímeros de alto peso molecular. A síndrome de Von Willebrand tipo 2a (VWS-2A) é caracterizada por uma perda de ambos os multímeros intermediários e grandes. A VWS-2B é caracterizada por uma perda dos multímeros com o peso molecular mais elevado. Outras doenças e distúrbios relacionados ao VWF são conhecidos na técnica.

[007] A remoção ou inativação dos vírus sem envelope lipídico das soluções de proteínas terapêuticas tem sido tradicionalmente conseguida pelo tratamento com métodos físicos como a alta temperatura (por exemplo, calor seco, calor de vapor, pasteurização), irradiação com raios de alta energia (por exemplo, raios ultravioleta (UV) ou radiação beta), baixo pH, nanofiltração ou por procedimentos cromatográficos, em particular cromatografia de afinidade. No entanto, estes procedimentos são muitas vezes ineficazes na purificação de uma proteína de alto peso molecular como o VWF que não passa por uma nanofiltração e/ou perde sua potência ou integridade molecular após tratamento com calor ou radiação.

[008] As diretrizes regulatórias atuais solicitam que os fabricantes abordem a questão da redução e/ou inativação de ambos os vírus envelopados lipídicos e não lipídicos para produtos farmacêuticos recombinantes. O ICH “Guideline on Viral Safety Evaluations of Biotechnology Products” (Federal Register, 1998, 63(185): 51074- 51084) confere flexibilidade aos fabricantes de como solucionar problemas virais tendo em conta o tipo de produto, o processo de produção e o risco de potencial contaminação com vírus. Estas diretrizes salientam que o risco de contaminação viral é uma característica comum a todos os produtos biotecnológicos derivados de linhagens de células. Dita contaminação pode ter graves consequências clínicas e pode originar-se da contaminação das próprias linhagens celulares fontes (substratos de células) ou da introdução acidental de vírus durante a produção.

[009] Enquanto a inativação dos vírus envelopados lipídicos pode ser realizada de forma muito efetiva por uma abordagem de tratamento solvente/detergente (S/D), a inativação ou remoção de modelos de vírus sem envelope lipídico (NLEV) pode ser um desafio devido ao seu pequeno tamanho e estabilidade física.

[010] Assim, existe uma necessidade técnica de desenvolver métodos para inativar de forma eficiente ou remover vírus sem envelope lipídico durante a purificação do VWF.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011] A presente invenção fornece um método eficiente para purificar VWF para remoção aumentada de vírus sem envelope lipídico. A presente invenção fornece um novo método para purificação do VWF para remoção aumentada de NLEV's realizando a etapa de carregamento do produto e a etapa de lavagem do processo de purificação em pH elevado.

[012] Um método conhecido na técnica para purificação de polipeptídeos de NLEV's envolve o uso de nanofiltração. O princípio por trás da separação eficiente de proteínas e vírus utilizando nanofiltração explora a diferença de tamanho entre o polipeptídeo e o vírus; a separação eficiente requer que o polipeptídeo tenha um tamanho efetivamente menor do que o vírus, o que permite que o polipeptídeo passe através dos poros do nanofiltro enquanto o vírus é retido. Se o polipeptídeo e o vírus possuem tamanhos comparáveis em um relação ao outro, no entanto, a separação é problemática porque tanto o polipeptídeo quanto o vírus passam ou não através dos poros do nanofiltro. Os métodos revelados neste documento superam esse problema pelo uso de uma resina de troca catiônica, em vez de nanofiltração e o carregamento e/ou lavagem da resina em um pH suficientemente elevado para separar o polipeptídeo do vírus.

[013] Sem estarem vinculados pela teoria, os métodos revelados neste documento são úteis para a remoção aumentada de NLEV das soluções de polipeptídeos onde o polipeptídeo é de um determinado tamanho e/ou conformação. É provável que um polipeptídeo de tamanho suficientemente grande tenha características localizadas de carga acima ou no ponto isoelétrico do polipeptídeo, ou seja, regiões do polipeptídeo podem manter cargas positivas ou negativas localizadas, permitindo assim que o polipeptídeo seja adsorvido pela resina da coluna, enquanto o vírus passa. Esta distribuição de carga desigual ao longo da extensão de um polipeptídeo permite que o polipeptídeo fique ligado à resina apesar do carregamento e/ou lavagem da resina em pH elevado.

[014] A invenção fornece um método para remover um vírus envelopado não lipídico de uma solução contendo proteína compreendendo carregar uma proteína na solução em uma resina de troca catiônica, e lavar a resina com um tampão em um pH maior do que o ponto isoelétrico da proteína para eluir o vírus. Em um aspecto, a proteína é carregada na resina em um tampão em um pH maior do que o ponto isoelétrico da proteína para eluir o vírus. Em outro aspecto, a proteína é carregada na resina em um tampão que não seja o tampão usado na etapa de lavagem, e a resina é posteriormente lavada com o tampão que está em um pH maior do que o ponto isoelétrico da proteína.

[015] Em uma modalidade, um método para remover um vírus envelopado não lipídico de uma solução contendo proteína é fornecido compreendendo aplicar a solução a uma resina de troca catiônica em um pH maior do que o ponto isoelétrico da proteína, e lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem para formar um eluato, dito primeiro tampão de lavagem contendo um pH que é igual a ou menor do que a solução aplicada à resina de troca catiônica.

[016] Em um aspecto, o pH da solução é cerca de 1 unidade de pH acima do ponto isoelétrico da proteína. Em outros aspectos, o pH da solução é cerca de 1,1, ou cerca de 1,2, ou cerca de 1,3, ou cerca de 1,4, ou cerca de 1,5, ou cerca de 1,6, ou cerca de 1,7, ou cerca de 1,8, ou cerca de 1,9, ou cerca de 2,0, ou cerca de 2,1, ou cerca de 2,2, ou cerca de 2,3, ou cerca de 2,4, ou cerca de 2,5, ou cerca de 2,6, ou cerca de 2,7, ou cerca de 2,8, ou cerca de 2,9, ou cerca de 3,0, ou cerca de 3,1, ou cerca de 3,2, ou cerca de 3,3, ou cerca de 3,4, ou cerca de 3,5, ou cerca de 3,6, ou cerca de 3,7, ou cerca de 3,8, ou cerca de 3,9, ou cerca de 4,0, ou cerca de 4,1, ou cerca de 4,2, ou cerca de 4,3, ou cerca de 4,4, ou cerca de 4,5, ou cerca de 4,6, ou cerca de 4,7, ou cerca de 4,8, ou cerca de 4,9, ou cerca de 5,0, ou cerca de 5,1, ou cerca de 5,2, ou cerca de 5,3, ou cerca de 5,4, ou cerca de 5,5, ou cerca de 5,6, ou cerca de 5,7, ou cerca de 5,8, ou cerca de 5,9, ou cerca de 6,0 ou mais unidades de pH ou mais acima do ponto isoelétrico da proteína. Nessas modalidades, o pH é maior do que cerca de 7. Em um aspecto relacionado, o pH da solução contendo a proteína é cerca de 7,0. Em outros aspectos, o pH da solução contendo a proteína é cerca de 7,1, ou cerca de 7,2, ou cerca de 7,3, ou cerca de 7,4, ou cerca de 7,5, ou cerca de 7,6, ou cerca de 7,7, ou cerca de 7,8, ou cerca de 7,9, ou cerca de 8,0, ou cerca de 8,1, ou cerca de 8,2, ou cerca de 8,3, ou cerca de 8,4, ou cerca de 8,5, ou cerca de 8,6, ou cerca de 8,7, ou cerca de 8,8, ou cerca de 8,9, ou cerca de 9,0, ou cerca de 9,1, ou cerca de 9,2, ou cerca de 9,3, ou cerca de 9,4, ou cerca de 9,5, ou cerca de 9,6, ou cerca de 9,7, ou cerca de 9,8, ou cerca de 9,9, ou cerca de 10,0, ou cerca de 10,1, ou cerca de 10,2, ou cerca de 10,3, ou cerca de 10,4, ou cerca de 10,5, ou cerca de 10,6, ou cerca de 10,7, ou cerca de 10,8, ou cerca de 10,9, ou cerca de 11,0, ou cerca de 11,1, ou cerca de 11,2, ou cerca de 11,3, ou cerca de 11,4, ou cerca de 11,5, ou cerca de 11,6, ou cerca de 11,7, ou cerca de 11,8, ou cerca de 11,9, ou cerca de 12,0, ou cerca de 12,1, ou cerca de 12,2, ou cerca de 12,3, ou cerca de 12,4, ou cerca de 12,5, ou cerca de 12,6, ou cerca de 12,7, ou cerca de 12,8, ou cerca de 12,9, ou cerca de 13,0 ou superior.

[017] Em outra modalidade, um método é fornecido para remover um vírus envelopado não lipídico de uma solução contendo proteína compreendendo aplicar a solução a uma resina de troca catiônica, lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem em um pH maior do que o pH de uma solução aplicada à resina de troca catiônica, e lavar a resina de troca catiônica com um segundo tampão de lavagem para formar um eluato, dito primeiro eluente contendo um pH que é igual a ou menor do que o primeiro tampão de lavagem. Em um aspecto, o pH primeiro tampão de lavagem é cerca de 1 unidade de pH acima do pH de uma solução aplicada à resina de troca catiônica. Em outros aspectos, o pH do primeiro tampão de lavagem é cerca de 0,1, ou cerca de 0,2, ou cerca de 0,3, ou cerca de 0,4, ou cerca de 0,5, ou cerca de 0,6, ou cerca de 0,7, ou cerca de 0,8, ou cerca de 0,9, ou cerca de 1,1, ou cerca de 1,2, ou cerca de 1,3, ou cerca de 1,4, ou cerca de 1,5, ou cerca de 1,6, ou cerca de 1,7, ou cerca de 1,8, ou cerca de 1,9, ou cerca de 2,0, ou cerca de 2,1, ou cerca de 2,2, ou cerca de 2,3, ou cerca de 2,4, ou cerca de 2,5, ou cerca de 2,6, ou cerca de 2,7, ou cerca de 2,8, ou cerca de 2,9, ou cerca de 3,0, ou cerca de 3,1, ou cerca de 3,2, ou cerca de 3,3, ou cerca de 3.4, ou cerca de 3,5, ou cerca de 3,6, ou cerca de 3,7, ou cerca de 3,8, ou cerca de 3,9, ou cerca de 4,0, ou cerca de 4,1, ou cerca de 4,2, ou cerca de 4,3, ou cerca de 4,4, ou cerca de 4,5, ou cerca de 4,6, ou cerca de 4,7, ou cerca de 4,8, ou cerca de 4,9, ou cerca de 5,0, ou cerca de 5,1, ou cerca de 5,2, ou cerca de 5,3, ou cerca de 5,4, ou cerca de 5,5, ou cerca de 5,6, ou cerca de 5,7, ou cerca de 5,8, ou cerca de 5,9, ou cerca de 6,0, ou cerca de 6,1, ou cerca de 6,2, ou cerca de 6,3, ou cerca de 6,4, ou cerca de 6,5, ou cerca de 6,6, ou cerca de 6,7, ou cerca de 6,8, ou cerca de 6,9, ou cerca de 7,0, ou cerca de 7,1, ou cerca de 7,2, ou cerca de 7,3, ou cerca de 7,4, ou cerca de 7,5, ou cerca de 7,6, ou cerca de 7,7, ou cerca de 7,8, ou cerca de 7,9, ou cerca de 8 ou cerca de 8,1, ou cerca de 8,2, ou cerca de 8,3, ou cerca de 8,4, ou cerca de 8,5, ou cerca de 8,6, ou cerca de 8,7, ou cerca de 8,8, ou cerca de 8,9, ou cerca de 9, ou cerca de 9,1, ou cerca de 9,2, ou cerca de 9,3, ou cerca de 9,4, ou cerca de 9,5, ou cerca de 9,6, ou cerca de 9,7, ou cerca de 9,8, ou cerca de 9,9, ou cerca de 10 ou mais unidades de pH ou mais acima do ponto isoelétrico da proteína. Nestas modalidades, o pH do primeiro tampão de lavagem é maior do que cerca de 7. Em outros aspectos, o pH do primeiro tampão de lavagem é cerca de 7,1, ou cerca de 7,2, ou cerca de 7,3, ou cerca de 7,4, ou cerca de 7,5, ou cerca de 7,6, ou cerca de 7,7, ou cerca de 7,8, ou cerca de 7,9, ou cerca de 8,0, ou cerca de 8,1, ou cerca de 8,2, ou cerca de 8,3, ou cerca de 8,4, ou cerca de 8,5, ou cerca de 8,6, ou cerca de 8,7, ou cerca de 8,8, ou cerca de 8,9, ou cerca de 9,0, ou cerca de 9,1, ou cerca de 9,2, ou cerca de 9,3, ou cerca de 9,4, ou cerca de 9,5, ou cerca de 9,6, ou cerca de 9,7, ou cerca de 9,8, ou cerca de 9,9, ou cerca de 10,0, ou cerca de 10,1, ou cerca de 10,2, ou cerca de 10,3, ou cerca de 10,4, ou cerca de 10,5, ou cerca de 10,6, ou cerca de 10,7, ou cerca de 10,8, ou cerca de 10,9, ou cerca de 11,0 ou superior.

[018] Em uma modalidade, a proteína na solução é um polipeptídeo com uma massa molecular de pelo menos cerca de 150 kilodaltons. Em vários aspectos, a proteína na solução é um polipeptídeo tendo uma massa molecular de pelo menos cerca de 175 kilodaltons, ou cerca de 180 kilodaltons, ou cerca de 190 kilodaltons, ou cerca de 200 kilodaltons, ou cerca de 210 kilodaltons, ou cerca de 220 kilodaltons, ou cerca de 230 kilodaltons, ou cerca de 240 kilodaltons, ou cerca de 250 kilodaltons, ou cerca de 260 kilodaltons, ou cerca de 270 kilodaltons, ou cerca de 280 kilodaltons, ou cerca de 290 kilodaltons, ou cerca de 300 kilodaltons, ou cerca de 310 kilodaltons, ou cerca de 320 kilodaltons, ou cerca de 330 kilodaltons, ou cerca de 340 kilodaltons, ou cerca de 350 kilodaltons, ou cerca de 360 kilodaltons, ou cerca de 370 kilodaltons, ou cerca de 380 kilodaltons, ou cerca de 390 kilodaltons, ou cerca de 400 kilodaltons, ou cerca de 410 kilodaltons, ou cerca de 420 kilodaltons, ou cerca de 430 kilodaltons, ou cerca de 440 kilodaltons, ou cerca de 450 kilodaltons, ou cerca de 460 kilodaltons, ou cerca de 470 kilodaltons, ou cerca de 480 kilodaltons, ou cerca de 490 kilodaltons, ou cerca de 500 kilodaltons ou mais. Conforme descrito aqui, polipeptídeos também compreendem estruturas multiméricas e ditas estruturas multiméricas, em vários aspectos, têm uma massa molecular de pelo menos cerca de 500 kilodaltons. Em aspectos relacionados, as estruturas multiméricas têm uma massa molecular de pelo menos cerca de 510, ou cerca de 520, ou cerca de 530, ou cerca de 540, ou cerca de 550, ou cerca de 560, ou cerca de 570, ou cerca de 580, ou cerca de 590, ou cerca de 600, ou cerca de 610, ou cerca de 620, ou cerca de 630, ou cerca de 640, ou cerca de 650, ou cerca de 660, ou cerca de 670, ou cerca de 680, ou cerca de 690, ou cerca de 700, ou cerca de 710, ou cerca de 720, ou cerca de 730, ou cerca de 740, ou cerca de 750, ou cerca de 760, ou cerca de 770, ou cerca de 780, ou cerca de 790, ou cerca de 800, ou cerca de 810, ou cerca de 820, ou cerca de 830, ou cerca de 840, ou cerca de 850, ou cerca de 860, ou cerca de 870, ou cerca de 880, ou cerca de 890, ou cerca de 900, ou cerca de 910, ou cerca de 920, ou cerca de 930, ou cerca de 940, ou cerca de 950, ou cerca de 960, ou cerca de 970, ou cerca de 980, ou cerca de 990 kilodaltons, ou cerca de 1 megadalton, ou cerca de 1,1 megadaltons, ou cerca de 1,2 megadaltons, ou cerca de 1,3 megadaltons, ou cerca de 1,4 megadaltons, ou cerca de 1,5 megadaltons, ou cerca de 1,6 megadaltons, ou cerca de 1,7 megadaltons, ou cerca de 1,8 megadaltons, ou cerca de 1,9 megadaltons, ou cerca de 2,0 megadaltons, ou cerca de 2,1 megadaltons, ou cerca de 2,2 megadaltons, ou cerca de 2,3 megadaltons, ou cerca de 2,4 megadaltons, ou cerca de 2,5 megadaltons, ou cerca de 2,6 megadaltons, ou cerca de 2,7 megadaltons, ou cerca de 2,8 megadaltons, ou cerca de 2,9 megadaltons, ou cerca de 3,0 megadaltons, ou cerca de 3,1 megadaltons, ou cerca de 3,2 megadaltons, ou cerca de 3,3 megadaltons, ou cerca de 3,4 megadaltons, ou cerca de 3,5 megadaltons, ou cerca de 3,6 megadaltons, ou cerca de 3,7 megadaltons, ou cerca de 3,8 megadaltons, ou cerca de 3,9 megadaltons, ou cerca de 4,0 megadaltons, ou cerca de 4,1 megadaltons, ou cerca de 4,2 megadaltons, ou cerca de 4,3 megadaltons, ou cerca de 4,4 megadaltons, ou cerca de 4,5 megadaltons, ou cerca de 4,6 megadaltons, ou cerca de 4,7 megadaltons, ou cerca de 4,8 megadaltons, ou cerca de 4,9 megadaltons, ou cerca de 5,0 megadaltons ou mais.

[019] Em algumas modalidades, a resina de troca catiônica tem um grupo carregado negativamente selecionado do grupo constituído por carboximetil (CM), sulfoalquil (SP, SE), sulfato e metilsulfonato (S), bem como qualquer outro ligante carregado negativamente.

[020] Em outra modalidade, a proteína é uma proteína de coagulação sanguínea. Em vários aspectos, a proteína de coagulação sanguínea é selecionada a partir do grupo constituído por Fator VIII, fator de von Willebrand, FI (Fibrinogênio), FV (Proacelerina), FXI (antecedente de tromboplastina plasmática) e FXIII (fator de estabilização da fibrina).

[021] Em uma modalidade, um método para remover um vírus envelopado não lipídico de uma solução contendo von Willebrand (VWF) é fornecido compreendendo aplicar a solução a uma resina de troca catiônica em um pH maior do que o ponto isoelétrico da proteína e lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem para formar um eluato, dito primeiro tampão de lavagem contendo um pH que é igual a ou menor do que a solução aplicada à resina de troca catiônica.

[022] Em outra modalidade, é fornecido um método para remover um vírus envelopado não lipídico de uma solução contendo VWF compreendendo aplicar a solução a uma resina de troca catiônica, lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem em um pH maior do que o pH de uma solução aplicada à resina de troca catiônica, e lavar a resina de troca catiônica com um segundo tampão de lavagem para formar um eluato, dito primeiro eluente contendo um pH que é igual a ou menor do que o primeiro tampão de lavagem.

[023] Em outra modalidade, um método para remover um vírus envelopado não lipídico de uma solução contendo VWF compreendendo aplicar a solução a uma resina de troca catiônica em um pH maior do que o ponto isoelétrico da proteína e lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem em um pH maior do que o ponto isoelétrico da proteína aplicado à resina de troca catiônica; e lavar a resina de troca catiônica com um segundo tampão de lavagem para formar um eluato, dito primeiro eluente contendo um pH que é igual a ou menor do que o primeiro tampão de lavagem.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[024] A Figura 1 mostra o resultado de uma separação por SDS-PAGE seguida pela coloração por prata (A) e análise por Western Blot (B) para rFVIII residual.

[025] A Figura 2 mostra o gel corado das passagens de UNO S com amostras inoculadas de vírus MMV e REO.

[026] A Figura 3 mostra o gel corado das passagens de UNO S com amostras inoculadas de vírus MMV e REO.

[027] A Figura 4 mostra os resultados da submissão das preparações purificadas de rVWF obtidas pelos processos variantes à digestão proteolítica por proteases V8 no estado nativo e separação dos peptídeos resultantes por RP-HPLC.

[028] A Figura 5 mostra os resultados da submissão das preparações purificadas do rVWF obtidas pelos processos variantes à tripsina no estado desnaturado e separação dos peptídeos resultantes por RP-HPLC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[029] A presente invenção refere-se a um método para purificação do VWF com remoção aumentada de vírus sem envelope lipídico. Os métodos da invenção são aplicáveis em coluna (ou seja, cromatografia), bem como no modo batelada (ou seja, sem equipamento de coluna).

[030] O método da presente invenção utiliza um método de purificação em uma resina de troca catiônica para a remoção aumentada de vírus sem envelope lipídico. Métodos anteriores de purificação do VWF usando a cromatografia de troca catiônica foram realizados em pH neutro. Esses métodos permitiram a produção do VWF purificado com bom rendimento e pureza, mas surpreendentemente o processo não tinha capacidade para remover vírus sem envelope lipídico.

Definição dos termos

[031] Salvo definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado do comumente entendido por um especialista na técnica a qual esta invenção pertence. As referências a seguir fornecem para um especialista uma definição geral de muitos dos termos utilizados nesta invenção: Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

[032] Cada publicação, pedido de patente, patente e outras referências citadas neste documento são incorporados como referência em sua totalidade, na medida em que não for incompatível com a presente revelação.

[033] É notório aqui que, como utilizado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plural a menos que o contexto claramente indique de outra forma.

[034] Conforme usado aqui, os seguintes termos têm os significados atribuídos a eles a menos que especificado de outra forma.

[035] Conforme usado aqui os termos “expresso”, “expressando” e “expressão” significam permitir ou fazer com que a informação em um gene ou uma sequência de DNA se manifeste, por exemplo, para produzir uma proteína pela ativação das funções celulares envolvidas na transcrição e tradução de um gene correspondente ou sequência de DNA. Uma sequência de DNA é expressa em ou por uma célula para formar um “produto de expressão” como uma proteína. O próprio produto de expressão, por exemplo, a proteína resultante, também pode ser dita como sendo “expressa”. Um produto de expressão pode ser caracterizado como intracelular, extracelular ou secretado. O termo “intracelular” significa dentro da célula. O termo “extracelular” indica fora da célula, por exemplo, certos tipos de proteínas transmembranares. Uma substância é “secretada” por uma célula se ela aparecer em uma quantidade significativa fora da célula, de algum lugar ou dentro da célula.

[036] Conforme usado aqui um “polipeptídeo” refere-se a um polímero constituído por resíduos de aminoácidos, variantes estruturais, variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas, e análogos sintéticos de ocorrência não natural dos mesmos ligados através de ligações peptídicas. Polipeptídeos sintéticos podem ser preparados, por exemplo, usando um sintetizador de polipeptídeo automatizado. O termo “proteína” normalmente se refere a polipeptídeos grandes. O termo “peptídeo” tipicamente se refere a polipeptídeos pequenos. O termo “polipeptídeo” também inclui estruturas poliméricas. Portanto, um “polipeptídeo” pode ser um monômero, dímero, trímero ou uma estrutura multimérica maior. Estas estruturas multiméricas podem ter até 5 megadaltons ou mais.

[037] Conforme usado aqui, o “ponto isoelétrico” é o valor de pH em que a carga elétrica líquida de um polipeptídeo numa solução aquosa é zero.

[038] Conforme usado aqui um “fragmento” de um polipeptídeo significa qualquer porção de um polipeptídeo ou proteína menor do que o polipeptídeo de comprimento total ou um produto de expressão da proteína.

[039] Conforme usado aqui um “análogo” refere-se a qualquer dois ou mais polipeptídeos substancialmente semelhantes em estrutura e possuindo a mesma atividade biológica, mas podendo ter vários graus de atividade, tanto a molécula inteira quanto um fragmento. Análogos diferem na composição de suas sequências de aminoácidos com base em uma ou mais mutações envolvendo a substituição de um ou mais aminoácidos por outros aminoácidos. As substituições podem ser conservadoras ou não conservadoras baseadas no parentesco físico-químico ou funcional do aminoácido que está sendo substituído e o aminoácido que está substituindo.

[040] Conforme usado aqui uma “variante” refere-se a um polipeptídeo, proteína ou análogo do mesmo que é modificado para incluir frações químicas adicionais que normalmente não são parte da molécula. Ditas frações podem modular a solubilidade da molécula, absorção, meia-vida biológica, etc. As frações podem alternativamente diminuir a toxicidade da molécula e eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejável da molécula, etc. Frações capazes de mediar ditos efeitos são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Procedimentos para acoplamento de ditas frações a uma molécula são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser um fator de coagulação sanguínea com uma modificação química que confere uma maior meia-vida in vivo para a proteína. Em vários aspectos, os polipeptídeos são modificados por glicosilação, peguilação e/ou polisialização.

VWF recombinante

[041] As sequências de polinucleotídeos e aminoácidos de prepro-VWF constam nas SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente, e estão disponíveis no GenBank com Nos. de acessão NM_000552 e NP_000543, respectivamente. A sequência de aminoácidos correspondente à proteína VWF madura consta na SEQ ID NO: 3 (correspondendo aos aminoácidos 764-2813 da sequência de aminoácido prepro-VWF de comprimento total).

[042] Uma forma do rVWF útil tem pelo menos a propriedade de estabilização in vivo, por exemplo, ligando em pelo menos uma molécula de Fator VIII (FVIII) e tendo opcionalmente um padrão de glicosilação farmacologicamente aceitável. Exemplos específicos dos mesmos incluem VWF sem domínio A2, portanto, resistente à proteólise (Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77:1008-1013, 1997), e o fragmento VWF da Val 449 até a Asn 730 incluindo o domínio de ligação da glicoproteína lb e sítios de ligação para o colágeno e a heparina (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989). A determinação da capacidade do VWF em estabilizar, pelo menos, uma molécula de FVIII pode ser conduzida em mamíferos com deficiência de VWF de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[043] O rVWF da presente invenção pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica. Um exemplo específico é revelado em WO86/06096 publicada em 23 de Outubro de 1986 e no Pedido de Patente US 07/559, 509, depositado em 23 de julho de 1990, que é incorporado como referência neste documento com relação aos métodos de produção de VWF recombinante. Assim, métodos são conhecidos na técnica para (i) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, por exemplo, através da transcrição reversa do RNA e/ou amplificação do DNA, (ii) introduzindo DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas por transfecção, por exemplo, através da eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivando ditas células transformadas, por exemplo, de forma contínua ou batelada, (iv) expressando VWF, por exemplo, constitutivamente ou indutivamente, e (v) isolando dito VWF, por exemplo, do meio de cultura ou por coleta de células transformadas, a fim de (vi) obter rVWF purificado, por exemplo, através de cromatografia de troca aniônica ou cromatografia de afinidade. Um VWF recombinante pode ser produzido em células hospedeiras transformadas usando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica. Por exemplo, sequências de codificação para o polipeptídeo poderiam ser retiradas do DNA usando enzimas de restrição adequadas.

[044] Alternativamente, a molécula de DNA poderia ser sintetizada utilizando técnicas de síntese química, tais como o método do fosforamidato. Além disso, uma combinação dessas técnicas poderia ser utilizada.

[045] A invenção também fornece vetores que codificam polipeptídeos da invenção em um hospedeiro apropriado. O vetor compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo operativamente ligado às sequências de controle de expressão apropriadas. Métodos para efetuar estas ligações operativas antes ou após o polinucleotídeo ser inserido no vetor são bem conhecidos. Sequências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, potencializadores, operadores, sítios de ligação ribossomais, sinais de início, sinais de parada, sinais cap, sinais de poliadenilação e outros sinais envolvidos no controle da transcrição ou tradução. O vetor resultante possuindo o polinucleotídeo é usado para transformar um hospedeiro adequado. Essa transformação pode ser executada usando métodos bem conhecidos na técnica.

[046] Qualquer uma do grande número de células hospedeiras disponíveis e bem conhecidas pode ser utilizada na prática desta invenção. A seleção de um hospedeiro particular é dependente de vários fatores reconhecidos pela técnica, incluindo, por exemplo, compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, toxicidade dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, taxa de transformação, facilidade de recuperação dos peptídeos, características de expressão, biossegurança e custos. Um equilíbrio destes fatores deve ser alcançado com a compreensão de que nem todas as células hospedeiras são igualmente eficazes para a expressão de uma determinada sequência de DNA. Dentro destas orientações gerais, células hospedeiras microbianas úteis incluem bactérias, leveduras e outros fungos, insetos, plantas, células de mamíferos (incluindo humanas) em cultura, ou outros hospedeiros conhecidos na técnica.

[047] Em seguida, o hospedeiro transformado é cultivado e purificado. Células do hospedeiro podem ser cultivadas sob condições de fermentação convencionais para que os compostos desejados sejam expressos. Ditas condições de fermentação são bem conhecidas na técnica. Finalmente, os polipeptídeos são purificados da cultura através de métodos bem conhecidos na técnica.

[048] Dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar um composto da invenção, grupos de carboidrato (oligossacarídeo) podem convenientemente ser associados a sítios que são conhecidos como sendo sítios de glicosilação em proteínas. Em geral, oligossacarídeos O- ligados se ligam a resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto oligossacarídeos N-ligados se ligam aos resíduos de asparagina (Asn) quando eles são parte da sequência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. X é preferencialmente um dos 19 aminoácidos de ocorrência natural sem contar com a prolina. As estruturas de oligossacarídeos N-ligados e O-ligados e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é comumente encontrado em ambos é o ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico). O ácido siálico normalmente é o resíduo terminal de ambos os oligossacarídeos N-ligados e O-ligados e, em virtude de sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas ao composto glicosilado. Ditos sítios podem ser incorporados no ligante do composto desta invenção e são preferencialmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos polipeptídicos (por exemplo, em células de mamíferos, como CHO, BHK, COS). No entanto, ditos sítios podem ainda ser mais glicosilados por procedimentos sintéticos ou semissintéticos conhecidos na técnica.

[049] De forma alternativa, os compostos podem ser preparados por métodos sintéticos. Por exemplo, técnicas sintéticas de fase sólida podem ser utilizadas. Técnicas apropriadas são bem conhecidas e incluem as descritas em Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; and Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2:257-527. A síntese de fase sólida é a técnica preferida para produção de peptídeos individuais, uma vez que é o método mais custo- efetivo para produção de pequenos peptídeos.

Fragmentos, variantes e análogos de VWF

[050] Métodos para a preparação de fragmentos de polipeptídeo, variantes ou análogos são bem conhecidos na técnica.

[051] Fragmentos de um polipeptídeo são preparados usando, sem limitação, clivagem enzimática (por exemplo, tripsina, quimiotripsina) e também usando meios recombinantes para gerar um fragmento de polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido específica. Fragmentos de polipeptídeos podem ser gerados compreendendo uma região da proteína tendo uma atividade específica, como um domínio de multimerização ou qualquer outro domínio do VWF identificável conhecido na técnica.

[052] Variantes de um polipeptídeo são previstas para incluir formas humanas e não humanas do VWF (por exemplo, VWF murino). Também previsto pelos métodos deste documento são os polipeptídeos quiméricos compreendendo, por exemplo, um polipeptídeo de fusão camundongo/humano.

[053] Métodos para produção de análogos de polipeptídeos também são bem conhecidos. Análogos da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo podem ser análogos de substituição, inserção, adição ou deleção. Análogos de deleção, incluindo fragmentos de um polipeptídeo, não possuem um ou mais resíduos da proteína nativa que não são essenciais para a função ou atividade imunogênica. Análogos de inserção envolvem a adição de, por exemplo, aminoácidos em um ponto não terminal do polipeptídeo. Este análogo pode incluir a inserção de um epítopo imunorreativo ou simplesmente um único resíduo. Análogos de adição, incluindo fragmentos de um polipeptídeo, incluem a adição de um ou mais aminoácidos a qualquer uma das duas terminações de uma proteína e incluem, por exemplo, proteínas de fusão.

[054] Análogos de substituição normalmente trocam um aminoácido do tipo selvagem por outro em um ou mais sítios na proteína, e podem ser projetados para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo sem a perda de outras funções ou propriedades. Em um aspecto, as substituições são substituições conservadoras. Por “substituição de aminoácido conservadora” entende-se a substituição de um aminoácido por um aminoácido com uma cadeia lateral com característica química semelhante. Aminoácidos semelhantes para realizar substituições conservadoras incluem aqueles que tenham uma cadeia lateral ácida (ácido glutâmico, ácido aspártico); uma cadeia lateral básica (arginina, lisina, histidina); uma cadeia lateral de amida polar (glutamina, asparagina); uma cadeia lateral hidrofóbica, alifática (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); uma cadeia lateral aromática (fenilalanina, triptofano, tirosina); uma cadeia lateral pequena (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); ou uma cadeia lateral alifática com hidroxila (serina, treonina).

[055] Análogos podem ser substancialmente homólogos ou substancialmente idênticos ao VWF recombinante do qual eles são derivados. Análogos preferenciais são aqueles que mantêm pelo menos algumas das atividades biológicas de polipeptídeo do tipo selvagem, por exemplo, atividade de coagulação sanguínea.

[056] Variantes de polipeptídeo contemplados incluem polipeptídeos quimicamente modificados por ditas técnicas como ubiquitinação, glicosilação, incluindo polisialação, conjugação com agentes terapêuticos ou de diagnóstico, marcação, ligação de polímeros covalentes como peguilação (derivatização com polietilenoglicol), introdução de ligações não hidrolisáveis, e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos como a ornitina, que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. Variantes retêm as mesmas ou essencialmente as mesmas propriedades de ligação de moléculas não modificadas da invenção. Dita modificação química pode incluir ligação direta ou indireta (por exemplo, via um ligante) de um agente a um polipeptídeo VWF. No caso de ligação indireta, está contemplado que o ligante pode ser hidrolisável ou não hidrolisável.

[057] A preparação de análogos de polipeptídeo peguilados geralmente compreenderá as etapas de (a) reagir o polipeptídeo com polietilenoglicol (como um éster reativo ou derivado aldeído de PEG) nas condições em que o polipeptídeo de construção da ligação se liga a um ou mais grupos PEG e (b) obter os produtos de reação. Em geral, as condições de reação ideais para as reações de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e o resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a proporção de PEG: proteína, maior o percentual do produto de polipeguilado. Em algumas modalidades, a construção da ligação terá um único grupo PEG no N-terminal. Polietilenoglicol (PEG) pode ser ligado ao fator de coagulação sanguínea para fornecer uma meia-vida mais longa in vivo. O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio do PEG varia de aproximadamente 2 kiloDalton (“kD”) a cerca de 100 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, ou de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Os grupos PEG estão ligados ao fator de coagulação sanguínea via acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo natural ou projetado no grupo PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reativo no fator de coagulação sanguínea (por exemplo, um grupo aldeído, amino, ou éster) ou por qualquer outra técnica conhecida.

[058] Métodos para a preparação de polipeptídeo polisializado são descritos na Publicação de Patente dos Estados Unidos 20060160948, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 2634, 1997, and Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006. Resumidamente, uma solução de ácido colomínico contendo 0,1 M de NaIO4 é agitada no escuro em temperatura ambiente para oxidar o CA. A solução de CA ativada é dialisada com, por exemplo, tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,2 no escuro e essa solução é adicionada a uma solução do rVWF e incubada durante 18 horas em temperatura ambiente no escuro sob agitação suave. Reagentes livres podem, em seguida, ser separados do conjugado rVWF- ácido polisiálico por ultrafiltração/diafiltração. A conjugação do rVWF com ácido polisiálico também pode ser conseguida usando glutaraldeído como reagente de ligação cruzada (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004).

[059] Ainda é contemplado que um polipeptídeo da invenção pode ser uma proteína de fusão com um segundo agente que é um polipeptídeo. Em uma modalidade, o segundo agente que é um polipeptídeo, sem limitação, é uma enzima, um fator de crescimento, um anticorpo, uma citocina, uma quimiocina, um receptor de superfície celular, o domínio extracelular de um receptor de superfície celular, uma molécula de adesão celular, ou fragmento ou domínio ativo de uma proteína descrita acima. Em uma modalidade relacionada, o segundo agente é um fator de coagulação sanguínea como Fator VIII, Fator VII, Fator IX. A proteína de fusão prevista é feita através de técnicas químicas ou recombinantes bem conhecidas.

[060] Também é previsto que polipeptídeos prepro-VWF e pro-VWF podem fornecer um benefício terapêutico nas formulações da presente invenção. Por exemplo, a Patente US 7.005.502 descreve uma preparação farmacêutica compreendendo quantidades substanciais de pro- VWF que induz a geração de trombina na presença de plaquetas in vitro. Em adição aos recombinantes, fragmentos biologicamente ativos, variantes ou análogos do VWF maduro com ocorrência natural, a presente invenção prevê o uso de fragmentos biologicamente ativos recombinantes, variantes ou análogos do prepro-VWF (estabelecidos em SEQ ID NO:2) ou polipeptídeos pro-VWF (resíduos de aminoácido 23 a 764 SEQ ID NO: 2) nas formulações descritas aqui.

[061] Fragmentos que codificam polinucleotídeos, variantes e análogos podem ser facilmente gerados por um especialista para codificar fragmentos biologicamente ativos, variantes ou análogos da molécula de ocorrência natural que possui atividade biológica igual ou semelhante à molécula de ocorrência natural. Estes polinucleotídeos podem ser preparados utilizando técnicas de PCR, digestão/ligação da molécula que codifica DNA e semelhantes. Assim, um especialista na técnica será capaz de gerar mudanças únicas na cadeia de DNA para resultar em um códon alterado e uma mutação mis-senso, usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, entre outros, mutagênese sítio-específica. Conforme usado aqui, a frase “condições de hibridização moderadamente severas” significa, por exemplo, hibridização a 42°C em formamida 50% e lavagem a 60° C em 0,1 x SSC, 0,1% SDS. É entendido pelos especialistas na técnica que variações nestas condições ocorrem com base no comprimento e no conteúdo de nucleotídeo GC da sequência a ser hibridizada. Fórmulas padrão na técnica são apropriadas para determinar as condições de hibridação exatas. Vide Sambrook et al., 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Métodos para produção de VWF

[062] Industrialmente, VWF, em particular VWF humano recombinante (rVWF), é sintetizado e expresso juntamente com rFVIII em uma linhagem celular CHO geneticamente modificada. A função do rVWF coexpresso é de estabilizar o rFVIII no processo de cultura celular. rVWF é sintetizado na célula na sua pró-forma, contendo um grande propeptídeo ligado ao N-terminal. Após a maturação no retículo endoplasmático e complexo de Golgi, o propeptídeo é clivado pela ação da protease celular furina e é secretado como um homopolímero de subunidades idênticas, constituído por dímeros da proteína expressa.

Purificação do VWF

[063] É fornecido aqui um método para remover um vírus envelopado não lipídico de uma solução contendo proteína compreendendo aplicar a solução a uma resina de troca catiônica em um pH maior do que o ponto isoelétrico da proteína, e lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem para formar um eluato, dito primeiro tampão de lavagem contendo um pH que é igual a ou menor do que a solução aplicada à resina de troca catiônica.

[064] Em um aspecto, o pH da solução é cerca de 1 unidade de pH acima do ponto isoelétrico da proteína. Em outros aspectos, o pH da solução é cerca de 1,2, ou cerca de 1,4, ou cerca de 1,6, ou cerca de 1,8, ou cerca de 2,0, ou cerca de 2,2, ou cerca de 2,4, ou cerca de 2,6, ou cerca de 2,8, ou cerca de 3,0, ou cerca de 3,2, ou cerca de 3,4, ou cerca de 3,6, ou cerca de 3,8, ou cerca de 4,0, ou cerca de 4,2, ou cerca de 4,4, ou cerca de 4,6, ou cerca de 4,8, ou cerca de 5,0, ou cerca de 5,5, ou cerca de 6,0 unidades de pH ou mais acima do ponto isoelétrico da proteína.

[065] Nestas modalidades, o pH é maior do que cerca de 7. Em outros aspectos, o pH é cerca de 7,1, ou cerca de 7,2, ou cerca de 7,3, ou cerca de 7,4, ou cerca de 7,5, ou cerca de 7,6, ou cerca de 7,7, ou cerca de 7,8, ou cerca de 7,9, ou cerca de 8,0, ou cerca de 8,1, ou cerca de 8,2, ou cerca de 8,3, ou cerca de 8,4, ou cerca de 8,5, ou cerca de 8,6, ou cerca de 8,7, ou cerca de 8,8, ou cerca de 8,9, ou cerca de 9,0, ou cerca de 9,1, ou cerca de 9,2, ou cerca de 9,3, ou cerca de 9,4, ou cerca de 9,5, ou cerca de 9,6, ou cerca de 9,7, ou cerca de 9,8, ou cerca de 9,9, ou cerca de 10,0, ou cerca de 10,1, ou cerca de 10,2, ou cerca de 10,3, ou cerca de 10,4, ou cerca de 10,5, ou cerca de 10,6, ou cerca de 10,7, ou cerca de 10,8, ou cerca de 10,9, ou cerca de 11,0, ou cerca de 11,1, ou cerca de 11,2, ou cerca de 11,3, ou cerca de 11,4, ou cerca de 11,5, ou cerca de 11,6, ou cerca de 11,7, ou cerca de 11,8, ou cerca de 11,9, ou cerca de 12,0, ou cerca de 12,1, ou cerca de 12,2, ou cerca de 12,3, ou cerca de 12,4, ou cerca de 12,5, ou cerca de 12,6, ou cerca de 12,7, ou cerca de 12,8, ou cerca de 12,9, ou cerca de 13,0 ou superior.

[066] Em outra modalidade, um método é fornecido para remover um vírus envelopado não lipídico de uma solução contendo proteína compreendendo aplicar a solução a uma resina de troca catiônica, lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem em um pH maior do que o pH de uma solução aplicada à resina de troca catiônica, e lavar a resina de troca catiônica com um segundo tampão de lavagem para formar um eluato, dito segundo tampão de lavagem contendo um pH que é igual a ou menor do que o primeiro tampão de lavagem. Em um aspecto, o pH primeiro tampão de lavagem é cerca de 1 unidade de pH acima do pH de uma solução aplicada à resina de troca catiônica. Para esta etapa é previsto que os meio de troca iônica é UNOsphere ™ S (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA), mas outros sistemas de troca catiônica podem ser usados na prática dos métodos. Estes sistemas de troca catiônica são conhecidos pelos especialistas na técnica.

[067] Em outros aspectos, o pH do primeiro tampão de lavagem é cerca de 1,1, ou cerca de 1,2, ou cerca de 1,3, ou cerca de 1,4, ou cerca de 1,5, ou cerca de 1,6, ou cerca de 1,7, ou cerca de 1,8, ou cerca de 1,9, ou cerca de 2,0, ou cerca de 2,1, ou cerca de 2,2, ou cerca de 2,3, ou cerca de 2,4, ou cerca de 2,5, ou cerca de 2,6, ou cerca de 2,7, ou cerca de 2,8, ou cerca de 2,9, ou cerca de 3,0, ou cerca de 3,1, ou cerca de 3,2, ou cerca de 3,3, ou cerca de 3,4, ou cerca de 3,5, ou cerca de 3,6, ou cerca de 3,7, ou cerca de 3,8, ou cerca de 3,9, ou cerca de 4,0, ou cerca de 4,1, ou cerca de 4,2, ou cerca de 4,3, ou cerca de 4,4, ou cerca de 4,5, ou cerca de 4,6, ou cerca de 4,7, ou cerca de 4,8, ou cerca de 4,9, ou cerca de 5,0, ou cerca de 5,1, ou cerca de 5,2, ou cerca de 5,3, ou cerca de 5,4, ou cerca de 5,5, ou cerca de 5,6, ou cerca de 5,7, ou cerca de 5,8, ou cerca de 5,9, ou cerca de 6,0 unidades de pH ou mais acima do ponto isoelétrico da proteína. Nestas modalidades, o pH do primeiro tampão de lavagem é maior do que cerca de 7. Em outros aspectos, o pH do primeiro tampão de lavagem é cerca de 7,1, ou cerca de 7,2, ou cerca de 7,3, ou cerca de 7,4, ou cerca de 7,5, ou cerca de 7,6, ou cerca de 7,7, ou cerca de 7,8, ou cerca de 7,9, ou cerca de 8,0, ou cerca de 8,1, ou cerca de 8,2, ou cerca de 8,3, ou cerca de 8,4, ou cerca de 8,5, ou cerca de 8,6, ou cerca de 8,7, ou cerca de 8,8, ou cerca de 8,9, ou cerca de 9,0, ou cerca de 9,1, ou cerca de 9,2, ou cerca de 9,3, ou cerca de 9,4, ou cerca de 9,5, ou cerca de 9,6, ou cerca de 9.7, ou cerca de 9,8, ou cerca de 9,9, ou cerca de 10,0, ou cerca de 10,1, ou cerca de 10,2, ou cerca de 10,3, ou cerca de 10,4, ou cerca de 10,5, ou cerca de 10,6, ou cerca de 10,7, ou cerca de 10,8, ou cerca de 10,9, ou cerca de 11,0, ou cerca de 11,1, ou cerca de 11,2, ou cerca de 11,3, ou cerca de 11,4, ou cerca de 11,5, ou cerca de 11,6, ou cerca de 11,7, ou cerca de 11,8, ou cerca de 11,9, ou cerca de 12,0, ou cerca de 12,1, ou cerca de 12,2, ou cerca de 12,3, ou cerca de 12,4, ou cerca de 12,5, ou cerca de 12,6, ou cerca de 12,7, ou cerca de 12,8, ou cerca de 12,9, ou cerca de 13,0 ou superior.

[068] Os exemplos a seguir não se destinam a ser limitantes, mas apenas exemplares de modalidades específicas da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1

[069] Vírus e células utilizados nos ensaios descritos abaixo são os seguintes.

[070] REO-3 (Família Reoviridae; vírus não envelopado dsRNA), Cepa Dearing (ATCC VR-824) foi obtida a partir de ATCC. O vírus foi propagado e titulado em células Vero obtidas a partir de ECACC (84113001). MMV (Família Parvoviridae; vírus não envelopado ssDNA), cepa protótipo (ATCC VR-1346), foi obtida a partir de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. O vírus foi propagado e titulado em células A9 (ATCC CCL-1.4). PPV (Família Parvoviridae; vírus não envelopado ssDNA), cepa Tennessee (BRFF #PP951024), foi obtido a partir de Biological Research Faculty & Facility, Ijamsville, Maryland. O vírus foi propagado e titulado em células PK-13 (ATCC CRL-6489). EMCV (Família Picornaviridae; não envelopados ssRNA) (ATCC #VR-129B) foi obtida a partir de American Type Culture Collection. O vírus foi propagado e titulado em células Vero (European Collection of Cell Cultures, ECACC, #84113001). HadV (Família Adenoviridae; não envelopados dsDNA), cepa Adenoid 75 (ATCC VR-5), foi obtida a partir de American Type Culture Collection. O vírus foi propagado e titulado em células HeLa (ATCC CCL-2).

[071] As etapas envolvidas em um processo de purificação do VWF exemplar compreendem: Cromatografia de afinidade imune do sobrenadante da cultura de células Fração de fluxo direto Troca aniônica (por exemplo, coluna de troca aniônica trimetilaminoetil) Filtração (0,45/0,2 μm) Troca aniônica (por exemplo, Mustang Q (Pall Corporation)) Inativação viral (por exemplo, usando o tratamento solvente/detergente) Filtração (0,8/0,65 μm) Troca catiônica (por exemplo, coluna UNO S) Ultrafiltração/Concentração Filtração (0,45/0,2 μm) Filtração em gel (Superose 6 prep grau (GE Life Sciences))

[072] Otimização da etapa UNO S. Durante a etapa de UNO S, rVWF está ligado a uma forte resina de troca catiônica enquanto algumas das impurezas passam. Após a lavagem da coluna com tampões de maior condutividade, o rVWF ligado é liberado da coluna com uma etapa de sal. Durante os estudos de remoção viral iniciais, esta etapa mostrou, pelo menos, uma taxa de remoção significativa para o modelo de vírus REO. As condições dos parâmetros aplicados e os resultados correspondentes estão listados na Tabela 1, abaixo. Tabela 1

pH/carga/lavagem 6,5 9,0 2,0, 2,11, 2,12 e 2,12 pH/carga/lavagem 6,5 9,0 2,12 para vírus REO *TQA Tampão: Tris, NaAc, mM NaCl em WFI pH 6,3 a 6,7 em 20 - 25°C

[073] Como pode ser visto na Tabela 1 as alterações moderadas nos parâmetros de processo (modificação de condutividade, pH 8,0 e aditivos para os tampões de lavagem) não resultaram em uma melhora significativa nas taxas de remoção de MMV. O aumento do pH para 9,0 resultou de forma reprodutível em uma taxa de remoção significativa de mais de 2 logs para MMV, bem como para o vírus REO. Esta mudança de processo é tecnicamente fácil de implementar e a exposição do rVWF ao ambiente de pH elevado pode ser mantida de forma relativamente curta (máx. 6 horas). A eluição do rVWF ligado é executada sob condições neutras.

[074] A análise da capacidade de inativação viral dos processos foi realizada de acordo com as recomendações do guia CEF 268/95, usando a seguinte fórmula:

onde R = fator de redução viral V1 = volume de material de partida [ml] T1 = concentração do vírus no material de partida [TCID50/ml] V2 = volume do material após a etapa [ml] T2 = concentração do vírus após a etapa [TCID50/ml]

[075] Os volumes e os títulos de cada amostra inoculada antes e após o tratamento foram utilizados para calcular R. Sempre que o vírus foi indetectável, o limite de detecção foi tomado como o título do vírus para o cálculo. Cálculos foram efetuados com títulos de vírus (log10 [TCID50/ml] dado para duas casas decimais e apenas os resultados finais, ou seja, fatores de redução (R), foram arredondados para a primeira casa decimal.

Exemplo 2

[076] O eluato UNO S foi concentrado até aproximadamente 800 μg do antígeno rVWF/ml por ultrafiltração usando membranas de celulose modificada de corte 30 kDa para facilitar a análise de rastreamento das impurezas e variantes do produto.

Teste de rVWF

[077] Atividade de Ristocetina. A Atividade do Cofator Ristocetina é determinada por um analisador turbidimétrico usando um reagente de von Willebrand contendo trombócitos estabilizados e o antibiótico “ristocetina”. O fator de von Willebrand contido na amostra (= Cofator Ristocetina) provoca a aglutinação de trombócitos estabilizados na presença da ristocetina. A aglutinação reduz a turbidez da preparação dos reagentes e a mudança na densidade ótica é medida pelo analisador turbidimétrico. A calibração é realizada pelo concentrado da WHO de referência padrão #00/514.

[078] Antígeno VWF. VWF - amostras são testadas por seus conteúdos do antígeno-vWF em um ensaio de ELISA - sistema de duplo sanduíche com dois anticorpos policlonais. A medição da cor das reações nas placas de microtítulo é executada com um fotômetro a 490 nm. A concentração de cada amostra é calculada em relação à curva padrão com um Programa ELISAAnalysis (algoritmo da curva: regressão cúbica) suportado por um computador. Todas as leituras foram corrigidas em relação ao branco.

[079] Atividade de Ligação do FVIII. A ligação FVIII do rVWF em condições estáticas foi determinada por um ensaio cromogênico ELISA (ECA), incubando uma quantidade constante de rFVIII com uma amostra diluída contendo VWF. O complexo VWF- FVIII formado, em seguida, foi transferido para uma placa de microtitulação revestida com um anticorpo policlonal de coelho anti VWF humano comercialmente disponível. Após a incubação, o FVIII que não ligou foi removido por uma etapa de lavagem subsequente. O FVIII ligado foi quantificado por um ensaio cromogênico de FVIII comercialmente disponível (Technochrom FVIII: C reagent kit, Technoclone, Austria). As densidades óticas corrigidas pelo branco (em mOD/min a 405 nm) foram plotadas contra as concentrações de VWF:Ag em escala logarítmica.

[080] Análise SDS-PAGE. A análise de SDS-PAGE 8% convencional sob condições de redução e coloração dos géis com Azul Coomassie e Coloração de Prata pode fornecer o conhecimento da composição proteica do rVWF. Após a transferência das bandas de proteínas separadas para uma membrana de nitrocelulose e coloração imunológica da proteína com anticorpos apropriados contra VWF, FVIII e Furina respectivamente, uma comparação das proteínas relacionadas ao VWF com as proteínas totais pode ser feita.

[081] Análise de Multímeros. A estrutura multimérica do VWF é analisada pela eletroforese em gel de agarose SDS com alta densidade horizontal. De forma breve, amostras são diluídas na mesma concentração no intervalo de 0,3-1,0 IU/ml VWF:Ag, incubadas com tampão Tris-EDTA-SDS e os multímeros separados sob condições não redutoras em um gel de agarose. Multímeros do VWF foram visualizados pela imunocoloração em gel com um anticorpo policlonal de coelho anti VWF humano, seguido de anti-IgG de coelho conjugada com fosfatase alcalina (ALP) de cabra utilizando o kit de desenvolvimento de cor ALP. Como alternativa, géis de agarose foram aplicados em uma membrana de blotting e a coloração foi realizada por um anticorpo policlonal de coelho anti-VWF humano seguido de anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de rábano. Para visualização, eletroquimioluminiscência foi usada que aumenta a sensibilidade de detecção para VWF em menos duas magnitudes. Condições de baixa (1% agarose) e alta resolução (2,5% agarose) foram utilizadas para analisar a distribuição de tamanho dos multímeros do VWF e estrutura multimérica, respectivamente.

[082] Análise HPLC. VWF recombinante pode ser clivado por GluC (V8 protease) em condições nativas para gerar dois fragmentos principais (fragmento homodímero N-terminal e C-terminal), que são separados em uma coluna-C4 de HPLC de fase reversa. Os fragmentos são detectados pelo monitoramento da absorção UV em 280 nm.

[083] Mapeamento de peptídeo. A estrutura primária do rVWF foi investigada usando uma abordagem de mapeamento de peptídeo. Amostras do rVWF purificado foram reduzidas com ditiotreitol (DTT) e os grupos sulfidrila livres foram bloqueados com 4-vinilpiridina. A tripsina grau de sequenciamento foi adicionada ao rVWF e deixou-se reagir durante 18 horas. A mistura de peptídeo resultante foi separada por cromatografia em fase reversa. Peptídeos eluídos foram detectados por detecção UV on-line em 214 nm e espectrometria de massa por ionização com eletrospray on-line.

[084] Teste para rVWF desamidado. O método analítico para detecção de iso-aspartato (um produto de reação proveniente da deamidação da asparagina) emprega digestão tríptica, seguida pela reação enzimática Proteína Isoaspartil Metiltransferase (PIMT) usando o Kit de Detecção IsoAspartate ISOQUANTA fornecido por Promega. PIMT catalisa a transferência de um grupo metil do substrato S-adenosil-L metionina (SAM) para IsoAsp na posição carboxila, gerando S-adenosil homocisteína (SAH). A liberação estequiométrica de SAH é detectada em um comprimento de onda de 260 nm por um método de RP HPLC.

[085] Os dados analíticos para o produto obtido por diferentes processos estão resumidos na Tabela 2. Tabela 2: Dados Analíticos para pH 9 e Corridas Controle

[086] Como pode ser visto na Tabela 2 as propriedades bioquímicas do rVWF purificado por diferentes variantes do processo são comparáveis.

[087] A banda principal da proteína rVWF é muito semelhante em todos os produtos, enquanto o grau de impurezas é menor na amostra #1 (denominada como VWF#07 na Figura 1) por ambas as análises com coloração por prata e western blot para rFVIII residual. O padrão de banda do rFVIII é comparável entre todos os lotes o que sugere que não ocorreu degradação devido à condição de pH 9,0.

[088] Eletroforese em gel de agarose de baixa e alta resolução revelou a alta similaridade das preparações rVWF. Nenhuma diferença na composição multimérica por análise de multímero de baixa resolução pode ser vista. A Figura 2 mostra o gel corado do UNO S executado com amostras inoculadas de vírus MMV e REO. A análise multimérica de alta resolução também revelou o padrão multimérico intacto sugerindo que nenhum dano aos multímeros do rVWF ocorreu devido às condições de pH 9,0. A Figura 3 mostra o gel corado do UNO S executado com amostras inoculadas de vírus MMV e REO.

[089] Com o ensaio Isoquant nenhum aumento na deamidação pode ser detectado devido à permanência do rVWF em pH 9,0. Geralmente a porcentagem molar do rVWF deamidado é muito baixa. A submissão das preparações purificadas do rVWF obtidas por variantes do processo de digestão proteolítica pela protease V8 no estado nativo (ver Figura 4) ou tripsina (ver Figura 5) no estado desnaturado e a separação dos peptídeos resultantes por RP-HPLC resultou em cromatogramas semelhantes para todas as amostras.

[090] Pequenas diferenças nos padrões de pico são devido à presença de diferentes quantidades de impurezas (principalmente o propeptídeo rVWF residual como pode ser visto na Figura 1) nas preparações, o que foi confirmado por espectrometria de massa ou análise de sequência N- terminal.

Exemplo 3

[091] Purificação do rVWF por cromatografia de Troca Catiônica em pH elevado com inóculo MMV.

[092] Uma resina UNOsphere S empacotada em uma coluna foi ativada com 1 CV de NaCl 2 M e equilibrada com 25 CV de um tampão de equilíbrio (pH=9,0). Depois disso, uma solução contendo rVWF ajustada a uma condutividade de 15 mS/cm e um pH de 9,0 e inoculada com o vírus minuto do camundongo (MMV) foi carregada na coluna a uma taxa de fluxo linear de cerca de 10,0 cm/h. A coluna, em seguida, foi lavada com 10 CV de tampão de equilíbrio (pH=9,0) e o produto foi eluído com 3,5 CV do tampão de eluição (pH=7,5) a uma taxa de fluxo linear de 65 cm/h. O pH aumentado durante a fase de lavagem e carregamento reduziu significativamente a ligação das partículas virais à resina mas manteve a ligação completa do produto VWF. Como resultado, a maioria das partículas virais carregadas foram encontradas não ligadas (no fluxo) e na fração de lavagem separadas do produto que foi recuperado no pool eluído em rendimentos elevados. Os resultados na Tabela 3 mostram que aplicando esse procedimento, uma capacidade de remoção de vírus de 2 logs poderia ser obtida com o modelo não envelopado de vírus minuto de camundongo (MMV).

[093] O ensaio TCID50 foi realizado da seguinte forma. Resumidamente, diluições seriais de 1/2log das amostras foram preparadas em meio de cultura de tecido apropriado e 100 μl de cada diluição foram adicionados em cada um dos 8 poços de uma placa de microtitulação inoculado com a linhagem celular indicada. As células foram então incubadas durante 7 dias em 36°C ± 2°C antes o efeito citopatogênico foi avaliado por inspeção visual das células ao microscópio. A dose infectante em cultura de tecido mediana (TCID50) foi calculada de acordo com a distribuição de Poisson e expressa como log10 [TCID50/ml]. Tabela 3: Purificação do rVWF em UNOsphere S

[094] A purificação foi realizada usando uma coluna com 15 mm de diâmetro e uma altura do leito de 14 cm. Os dados mostrados são títulos de vírus minuto de camundongo ativo.

Exemplo 4

[095] Purificação do rVWF por cromatografia de Troca Catiônica em alto pH com inóculo de vírus Reo Tipo 3.

[096] Uma resina UNOsphere S empacotada em uma coluna foi ativada com 1 CV de NaCl 2 M e equilibrada com 25 CV de um tampão de equilíbrio (pH=9,0). Depois disso, uma solução contendo rVWF ajustada a uma condutividade de 15 mS/cm e um pH de 9,0 e inoculada com diversos vírus não envelopados foi carregada na coluna a uma taxa de fluxo linear de cerca de 100 cm/h. A coluna, em seguida, foi lavada com 10 CV de tampão de equilíbrio (pH=9,0) e o produto foi eluído com 3,5 CV do tampão de eluição (pH=7,5) a uma taxa de fluxo linear de 65 cm/h. O pH aumentado durante a fase de lavagem e carregamento reduziu significativamente a ligação das partículas virais à resina mas manteve a ligação completa do produto VWF. Como resultado, a maioria das partículas virais carregadas foram encontradas não ligadas (no fluxo) e na fração de lavagem separadas do produto que foi recuperado no pool eluído em rendimentos elevados. Os resultados na Tabela 4 mostram que aplicando esse procedimento, uma capacidade de remoção de vírus de 2 logs poderia ser obtida com o modelo não envelopado de vírus de camundongo Reo Tipo 3 (REO-III). Tabela 4: Purificação do rVWF em UNOsphere S

[097] A purificação foi realizada usando uma coluna com 15 mm de diâmetro e uma altura do leito de 14 cm. Os dados mostrados são títulos do Reovirus Tipo III (REO-III) de camundongo ativo.

Exemplo 5

[098] Purificação do rVWF em UNOsphere S de acordo com o procedimento padrão (pH neutro).

[099] Uma resina UNOsphere S empacotada em uma coluna foi ativada com 1 CV de NaCl 2 M e equilibrada com 25 CV de um tampão de equilíbrio (pH=6,5). Depois disso, uma solução contendo rVWF ajustada a uma condutividade de 15 mS/cm e um pH de 6,5 e inoculada com diversos vírus não envelopados foi carregada na coluna a uma taxa de fluxo linear de cerca de 100 cm/h. A coluna, em seguida, foi lavada com 10 CV de tampão de equilíbrio (pH=6,5) e o produto foi eluído com 3,5 CV do tampão de eluição (pH=7,5) a uma taxa de fluxo linear de 65 cm/h. O título viral de diversos vírus testados foram avaliados em diferentes frações cromatográficas (carga, fluxo de coluna, eluato, pós eluato) e os fatores de redução foram calculados. Os resultados na Tabela 5 mostram que pela aplicação do procedimento de purificação padrão para VWF em UNOsphere S a capacidade de remoção de vírus não envelopados era insuficiente para os diferentes modelos de vírus testados para reivindicar uma etapa cromatográfica robusta para remoção dos vírus sem envelope lipídico. Tabela 5: Purificação do VWF de acordo com o procedimento padrão e as capacidades de redução correspondentes para vírus não envelopados.

[0100] A taxa de redução é calculada como a carga de vírus total na fração de carga dividida pela carga total de vírus na fração eluída expressa em valores logarítmicos.

Claims

1. Método para remover um vírus sem envelope lipídico de uma solução contendo proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar a solução contendo proteína, tendo um pH superior ao ponto isoelétrico da proteína na solução contendo proteína, a uma resina de troca catiônica adsorvendo assim a proteína à referida resina de troca catiônica, em que a proteína na solução contendo proteína é um polipeptídeo com uma massa molecular de pelo menos 150 quilodaltons; e lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem tendo um pH mais alto do que o ponto isoelétrico da proteína aplicada à resina de troca catiônica; e lavar a resina de troca catiônica com um segundo tampão de lavagem formando um eluato compreendendo a proteína, em que o vírus sem envelope lipídico é encontrado em frações de fluxo e lavagem separadas do eluato.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução aplicada à resina de troca catiônica está pelo menos 1 unidade de pH acima do ponto isoelétrico da proteína.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pH é maior do que 7,0.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a resina de troca catiônica tem um grupo carregado negativamente selecionado do grupo que consiste em carboximetil (CM), sulfoalquil (SP, SE), ésteres sulfatados de celulose, heparina e metilsulfonato (S).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína de coagulação sanguínea.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína de coagulação sanguínea é selecionada do grupo que consiste em Fator VIII e fator de von Willebrand (VWF).

7. Método para remover um vírus sem envelope lipídico de uma solução contendo VWF, caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar a solução contendo VWF, tendo um pH superior ao ponto isoelétrico de VWF na solução contendo VWF, a uma resina de troca catiônica absorvendo assim o VWF para a referida resina de troca catiônica; e lavar a resina de troca catiônica com um primeiro tampão de lavagem em um pH mais alto do que o ponto isoelétrico do VWF na solução contendo VWF aplicada à resina de troca catiônica; e lavar a resina de troca catiônica com um segundo tampão de lavagem para formar um eluato compreendendo VWF, em que o vírus sem envelope lipídico é encontrado em frações de fluxo e lavagem separadas do eluato.