KR20120065342A - 비-지질 외피 바이러스의 증가된 제거를 위한 ｖｗｆ의 정제 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 비-지질 외피 바이러스의 증가된 제거를 위하여 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 정제하는 방법을 제시한다.

Description

비-지질 외피 바이러스의 증가된 제거를 위한 ＶＷＦ의 정제{PURIFICATION OF VWF FOR INCREASED REMOVAL OF NON-LIPID ENVELOPED VIRUSES}

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에, 2009년 8월 20일 제출된 U.S. 특허가출원 No. 61/235,570에 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

본 발명의 기술 분야

일반적으로, 본 발명은 비-지질 외피 바이러스의 증가된 제거를 위하여 VWF를 정제하는 방법에 관계한다.

본 발명의 배경 기술

폰 빌레브란트 인자 (Von Willebrand factor, VWF)는 혈장 내에서, 대략 500 내지 20,000 kD 범위의 크기를 갖는 일련의 다합체로서 순환하는 당단백질이다. VWF의 다합체성 형태는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 250 kD 폴리펩티드 아단위로 구성된다. VWF는 손상된 혈관 벽의 하위-내피 (sub-endothelium)에 초기 혈소판 부착 (platelet adhesion)을 매개한다. 단지, 대형 다합체만 지혈 활성 (hemostatic activity)을 나타낸다. 내피 세포는 대형 중합성 형태의 VWF를 분비하고, 그리고 낮은 분자량을 갖는 형태의 VWF (낮은 분자량 VWF)는 단백분해 절단 (proteolytic cleavage)으로부터 발생하는 것으로 추정된다. 큰 분자 질량 (molecular mass)을 갖는 다합체는 내피 세포의 바이벨-펠라드 소체 (Weibel-Pallade body) 내에 보관되고 자극 시에 유리된다.

VWF는 내피 세포 및 거대핵세포 (megakaryocyte)에 의해, 상당한 정도의 반복 도메인으로 구성되는 프리프로 (prepro)-VWF로서 합성된다. 신호 펩티드의 절단 시에, 프로-VWF는 C-말단 영역에서 이황화 연쇄 (disulfide linkage)를 통해 이합체화 (multimerization)된다. 이들 이합체는 유리 단부 말단 간에 이황화 연쇄에 의해 지배되는 다합체화를 위한 프로토머 (protomer)로서 기능한다. 다합체로의 조립 이후에, 프로펩티드 서열의 단백 제거가 일어난다 (Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261).

VWF의 클로닝된 cDNA로부터 예측되는 일차 번역 산물은 2813-잔기 전구체 폴리펩티드 (prepro-VWF)이다. 이러한 프리프로-VWF는 22개 아미노산 신호 펩티드 및 741개 아미노산 프로펩티드로 구성되고, 그리고 성숙 VWF는 2050개 아미노산을 포함한다 (Ruggeri Z.A., 그리고 Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993)).

VWF에서 결함은 폰 빌레브란트 질환 (VWD)의 원인이 되는데, 상기 질환은 다소간 현저한 출혈 표현형 (bleeding phenotype)으로 특징된다. VWD 타입 3은 VWF가 완전하게 없는 가장 심각한 형태이고, 그리고 VWD 타입 1은 VWF의 정량적 상실에 관계하고 이의 표현형은 매우 경미할 수 있다. VWD 타입 2는 VWF의 정성적 결함에 관계하고 VWD 타입 3만큼 심각할 수 있다. VWD 타입 2는 많은 하위 형태 (sub form)를 갖는데, 일부는 고분자량 다합체의 상실 또는 감소와 연관된다. 폰 빌레브란트 증후군 타입 2a (VWS-2A)는 중간 및 대형 다합체 둘 모두의 상실로 특징된다. VWS-2B는 최대 분자량 다합체의 상실로 특징된다. VWF에 관련된 기타 질환과 장애는 당분야에 공지되어 있다.

치료적 단백질 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스의 제거 또는 불활성화는 전통적으로, 높은 온도 (가령, 건열, 증열, 저온 살균), 높은 에너지 광선으로 조사 (irradiation) (가령, 자외선 (UV) 또는 핵 방사), 낮은 pH, 나노여과 또는 크로마토그래피적 절차, 특히 친화성 크로마토그래피와 같은 물리적 방법으로 처리에 의해 달성되었다. 하지만, 이들 절차는 나노필터를 통과하지 못하고 및/또는 열 또는 방사로 처리 시에 효능 또는 분자 완전성 (molecular integrity)을 상실하는 고분자량 단백질, 예를 들면, VWF를 정제할 때 종종 무효하다.

현재의 규제 가이드라인은 재조합 제약학적 제품에 대한 지질 외피 및 비-지질 외피 바이러스 둘 모두의 감소 및/또는 불활성화의 문제를 해결할 것을 제조업자에게 요구한다. ICH "Guideline on Viral Safety Evaluations of Biotechnology Products" (Federal Register, 1998, 63(185): 51074- 51084)에서는 제품의 유형, 생산 공정 및 잠재적으로 오염 바이러스의 위험을 고려한 바이러스 문제의 해결 방법에 관한 융통성을 제조업자에게 제공한다. 이들 가이드라인은 바이러스 오염의 위험이 세포주로부터 유래된 모든 생물공학 제품에 공통된 특징임을 지적한다. 이런 오염은 심각한 임상적 결과를 유발할 수 있고, 그리고 원천 세포주 자체 (세포 기질)의 오염 또는 생산 동안 바이러스의 우발적인 이입으로부터 발생할 수 있다.

지질-외피 바이러스의 불활성화는 용매/세제 (S/D) 처리 접근법에 의해 매우 효과적으로 수행될 수 있는 반면, 비-지질-외피 모형 바이러스 (NLEV)의 불활성화 또는 제거는 그들의 작은 크기와 물리적 안정성으로 인하여 어려울 수 있다.

따라서 VWF의 정제 동안 비-지질 외피 바이러스를 효과적으로 비활성화시키거나 제거하는 방법을 개발하는 것이 당분야에서 요구된다.

본 발명의 요약

본 발명에서는 비-지질 외피 바이러스의 증가된 제거를 위하여 VWF를 정제하는 효과적인 방법을 제시한다. 본 발명에서는 높은 pH에서 정제 공정의 산물 적하 단계 및 세척 단계를 수행함으로써 NLEV의 증가된 제거를 위하여 VWF를 정제하는 신규한 방법을 제시한다.

NLEV로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 당분야에 공지된 한 가지 방법은 나노여과의 이용을 필요로 한다. 나노여과를 이용한 단백질과 바이러스의 효과적인 분리의 배경 원리는 폴리펩티드와 바이러스 사이에 크기 차이를 이용한다; 효과적인 분리를 위하여 폴리펩티드는 바이러스보다 작은 유효 크기를 가져야 하고, 따라서 폴리펩티드는 나노필터의 구멍을 통과하는 반면 바이러스는 남게 된다. 하지만, 폴리펩티드와 바이러스가 서로에 대하여 필적하는 크기를 가지면, 분리는 문제가 될 수 있는데, 그 이유는 폴리펩티드와 바이러스 둘 모두 나노필터 구멍을 통과하거나, 또는 둘 모두 통과하지 못하기 때문이다. 본 발명에서 개시된 방법은 폴리펩티드를 바이러스로부터 분리하기 위하여, 나노여과보다는 양이온 교환 수지를 이용하고 충분히 높은 pH에서 상기 수지를 적하 및/또는 세척함으로써 이러한 문제점을 극복한다.

이론에 한정됨 없이, 본 발명에서 개시된 방법은 폴리펩티드 용액으로부터 NLEV의 향상된 제거에 유용하고, 여기서 폴리펩티드는 일정한 크기 및/또는 형태 (conformation)를 갖는다. 크기가 충분히 큰 폴리펩티드는 폴리펩티드의 등전점에서 또는 이를 초과하여 국지적인 전하 특징을 가질 것으로 생각된다, 다시 말하면, 상기 폴리펩티드의 영역은 국지적인 양성 또는 음성 전하를 지속할 수 있고, 따라서 상기 폴리펩티드는 칼럼 수지에 흡수되는 반면, 바이러스는 관류될 수 있다. 폴리펩티드의 길이에서 이러한 균일하지 않은 전하 분포 (charge distribution)는 높은 pH에서 수지의 적하 및/또는 세척에도 불구하고, 폴리펩티드가 수지에 부착된 상태로 남아있을 수 있도록 한다.

본 발명에서는 단백질-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 용액 내에 단백질을 양이온 교환 수지 상에 적하하고, 그리고 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 수지를 완충액으로 세척하여 바이러스를 용리하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 단백질은 바이러스를 용리하기 위하여 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 완충액 내에 수지 상에 적하된다. 다른 측면에서, 단백질은 세척 단계에서 이용된 완충액이 아닌 완충액 내에 수지 상에 적하되고, 그리고 상기 수지는 단백질의 등전점보다 높은 pH를 갖는 완충액으로 차후에 세척된다.

한 구체예에서, 단백질-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계, 그리고 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 제1 세척 완충액은 양이온 교환 수지에 적용되는 용액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.

한 측면에서, 용액의 pH는 단백질의 등전점보다 대략 1 pH 단위 높다. 다른 측면에서, 용액의 pH는 단백질의 등전점보다 대략 1.1, 또는 대략 1.2, 또는 대략 1.3, 또는 대략 1.4, 또는 대략 1.5, 또는 대략 1.6, 또는 대략 1.7, 또는 대략 1.8, 또는 대략 1.9, 또는 대략 2.0, 또는 대략 2.1, 또는 대략 2.2, 또는 대략 2.3, 또는 대략 2.4, 또는 대략 2.5, 또는 대략 2.6, 또는 대략 2.7, 또는 대략 2.8, 또는 대략 2.9, 또는 대략 3.0, 또는 대략 3.1, 또는 대략 3.2, 또는 대략 3.3, 또는 대략 3.4, 또는 대략 3.5, 또는 대략 3.6, 또는 대략 3.7, 또는 대략 3.8, 또는 대략 3.9, 또는 대략 4.0, 또는 대략 4.1, 또는 대략 4.2, 또는 대략 4.3, 또는 대략 4.4, 또는 대략 4.5, 또는 대략 4.6, 또는 대략 4.7, 또는 대략 4.8, 또는 대략 4.9, 또는 대략 5.0, 또는 대략 5.1, 또는 대략 5.2, 또는 대략 5.3, 또는 대략 5.4, 또는 대략 5.5, 또는 대략 5.6, 또는 대략 5.7, 또는 대략 5.8, 또는 대략 5.9, 또는 대략 6.0 pH 단위 또는 그 이상 높다. 이들 구체예에서, pH는 대략 7보다 크다. 관련된 측면에서, 단백질-내포 용액의 pH는 대략 7.0이다. 다른 측면에서, 단백질-내포 용액의 pH는 대략 7.1, 또는 대략 7.2, 또는 대략 7.3, 또는 대략 7.4, 또는 대략 7.5, 또는 대략 7.6, 또는 대략 7.7, 또는 대략 7.8, 또는 대략 7.9, 또는 대략 8.0, 또는 대략 8.1, 또는 대략 8.2, 또는 대략 8.3, 또는 대략 8.4, 또는 대략 8.5, 또는 대략 8.6, 또는 대략 8.7, 또는 대략 8.8, 또는 대략 8.9, 또는 대략 9.0, 또는 대략 9.1, 또는 대략 9.2, 또는 대략 9.3, 또는 대략 9.4, 또는 대략 9.5, 또는 대략 9.6, 또는 대략 9.7, 또는 대략 9.8, 또는 대략 9.9, 또는 대략 10.0, 또는 대략 10.1, 또는 대략 10.2, 또는 대략 10.3, 또는 대략 10.4, 또는 대략 10.5, 또는 대략 10.6, 또는 대략 10.7, 또는 대략 10.8, 또는 대략 10.9, 또는 대략 11.0, 또는 대략 11.1, 또는 대략 11.2, 또는 대략 11.3, 또는 대략 11.4, 또는 대략 11.5, 또는 대략 11.6, 또는 대략 11.7, 또는 대략 11.8, 또는 대략 11.9, 또는 대략 12.0, 또는 대략 12.1, 또는 대략 12.2, 또는 대략 12.3, 또는 대략 12.4, 또는 대략 12.5, 또는 대략 12.6, 또는 대략 12.7, 또는 대략 12.8, 또는 대략 12.9, 또는 대략 13.0 또는 그 이상이다.

다른 구체예에서, 단백질-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계, 양이온 교환 수지에 적용되는 용액의 pH보다 높은 pH에서 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계, 그리고 양이온 교환 수지를 제2 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 첫 번째 용리액은 제1 세척 완충액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다. 한 측면에서, 제1 세척 완충액의 pH는 양이온 교환 수지에 적용되는 용액의 pH보다 대략 1 pH 단위 높다. 다른 측면에서, 제1 세척 완충액의 pH는 단백질의 등전점보다 대략 0.1, 또는 대략 0.2, 또는 대략 0.3, 또는 대략 0.4, 또는 대략 0.5, 또는 대략 0.6, 또는 대략 0.7, 또는 대략 0.8, 또는 대략 0.9, 또는 대략 1.1, 또는 대략 1.2, 또는 대략 1.3, 또는 대략 1.4, 또는 대략 1.5, 또는 대략 1.6, 또는 대략 1.7, 또는 대략 1.8, 또는 대략 1.9, 또는 대략 2.0, 또는 대략 2.1, 또는 대략 2.2, 또는 대략 2.3, 또는 대략 2.4, 또는 대략 2.5, 또는 대략 2.6, 또는 대략 2.7, 또는 대략 2.8, 또는 대략 2.9, 또는 대략 3.0, 또는 대략 3.1, 또는 대략 3.2, 또는 대략 3.3, 또는 대략 3.4, 또는 대략 3.5, 또는 대략 3.6, 또는 대략 3.7, 또는 대략 3.8, 또는 대략 3.9, 또는 대략 4.0, 또는 대략 4.1, 또는 대략 4.2, 또는 대략 4.3, 또는 대략 4.4, 또는 대략 4.5, 또는 대략 4.6, 또는 대략 4.7, 또는 대략 4.8, 또는 대략 4.9, 또는 대략 5.0, 또는 대략 5.1, 또는 대략 5.2, 또는 대략 5.3, 또는 대략 5.4, 또는 대략 5.5, 또는 대략 5.6, 또는 대략 5.7, 또는 대략 5.8, 또는 대략 5.9, 또는 대략 6.0, 또는 대략 6.1, 또는 대략 6.2, 또는 대략 6.3, 또는 대략 6.4, 또는 대략 6.5, 또는 대략 6.6, 또는 대략 6.7, 또는 대략 6.8. 또는 대략 6.9, 또는 대략 7.0, 또는 대략 7.1, 또는 대략 7.2, 또는 대략 7.3, 또는 대략 7.4, 또는 대략 7.5, 또는 대략 7.6, 또는 대략 7.7, 또는 대략 7.8, 또는 대략 7.9, 또는 대략 8 또는 대략 8.1, 또는 대략 8.2, 또는 대략 8.3, 또는 대략 8.4, 또는 대략 8.5, 또는 대략 8.6, 또는 대략 8.7, 또는 대략 8.8, 또는 대략 8.9, 또는 대략 9, 또는 대략 9.1, 또는 대략 9.2, 또는 대략 9.3, 또는 대략 9.4, 또는 대략 9.5, 또는 대략 9.6, 또는 대략 9.7, 또는 대략 9.8, 또는 대략 9.9, 또는 대략 10 pH 단위 또는 그 이상 높다. 이들 구체예에서, 제1 세척 완충액의 pH는 대략 7보다 크다. 다른 측면에서, 제1 세척 완충액의 pH는 대략 7.1, 또는 대략 7.2, 또는 대략 7.3, 또는 대략 7.4, 또는 대략 7.5, 또는 대략 7.6, 또는 대략 7.7, 또는 대략 7.8, 또는 대략 7.9, 또는 대략 8.0, 또는 대략 8.1, 또는 대략 8.2, 또는 대략 8.3, 또는 대략 8.4, 또는 대략 8.5, 또는 대략 8.6, 또는 대략 8.7, 또는 대략 8.8, 또는 대략 8.9, 또는 대략 9.0, 또는 대략 9.1, 또는 대략 9.2, 또는 대략 9.3, 또는 대략 9.4, 또는 대략 9.5, 또는 대략 9.6, 또는 대략 9.7, 또는 대략 9.8, 또는 대략 9.9, 또는 대략 10.0, 또는 대략 10.1, 또는 대략 10.2, 또는 대략 10.3, 또는 대략 10.4, 또는 대략 10.5, 또는 대략 10.6, 또는 대략 10.7, 또는 대략 10.8, 또는 대략 10.9, 또는 대략 11.0 또는 그 이상이다.

한 구체예에서, 용액 내에 단백질은 적어도 대략 150 킬로달톤의 분자 질량을 갖는 폴리펩티드이다. 다양한 측면에서, 용액 내에 단백질은 적어도 대략 175 킬로달톤, 또는 대략 180 킬로달톤, 또는 대략 190 킬로달톤, 또는 대략 200 킬로달톤, 또는 대략 210 킬로달톤, 또는 대략 220 킬로달톤, 또는 대략 230 킬로달톤, 또는 대략 240 킬로달톤, 또는 대략 250 킬로달톤, 또는 대략 260 킬로달톤, 또는 대략 270 킬로달톤, 또는 대략 280 킬로달톤, 또는 대략 290 킬로달톤, 또는 대략 300 킬로달톤, 또는 대략 310 킬로달톤, 또는 대략 320 킬로달톤, 또는 대략 330 킬로달톤, 또는 대략 340 킬로달톤, 또는 대략 350 킬로달톤, 또는 대략 360 킬로달톤, 또는 대략 370 킬로달톤, 또는 대략 380 킬로달톤, 또는 대략 390 킬로달톤, 또는 대략 400 킬로달톤, 또는 대략 410 킬로달톤, 또는 대략 420 킬로달톤, 또는 대략 430 킬로달톤, 또는 대략 440 킬로달톤, 또는 대략 450 킬로달톤, 또는 대략 460 킬로달톤, 또는 대략 470 킬로달톤, 또는 대략 480 킬로달톤, 또는 대략 490 킬로달톤, 또는 대략 500 킬로달톤 또는 그 이상의 분자 질량을 갖는 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 폴리펩티드는 또한, 다합체성 구조를 포함하고, 그리고 이런 다합체성 구조는 다양한 측면에서, 적어도 대략 500 킬로달톤의 분자 질량을 갖는다. 관련된 측면에서, 다합체성 구조는 적어도 대략 510, 또는 대략 520, 또는 대략 530, 또는 대략 540, 또는 대략 550, 또는 대략 560, 또는 대략 570, 또는 대략 580, 또는 대략 590, 또는 대략 600, 또는 대략 610, 또는 대략 620, 또는 대략 630, 또는 대략 640, 또는 대략 650, 또는 대략 660, 또는 대략 670, 또는 대략 680, 또는 대략 690, 또는 대략 700, 또는 대략 710, 또는 대략 720, 또는 대략 730, 또는 대략 740, 또는 대략 750, 또는 대략 760, 또는 대략 770, 또는 대략 780, 또는 대략 790, 또는 대략 800, 또는 대략 810, 또는 대략 820, 또는 대략 830, 또는 대략 840, 또는 대략 850, 또는 대략 860, 또는 대략 870, 또는 대략 880, 또는 대략 890, 또는 대략 900, 또는 대략 910, 또는 대략 920, 또는 대략 930, 또는 대략 940, 또는 대략 950, 또는 대략 960, 또는 대략 970, 또는 대략 980, 또는 대략 990 킬로달톤, 또는 대략 1 메가달톤, 또는 대략 1.1 메가달톤, 또는 대략 1.2 메가달톤, 또는 대략 1.3 메가달톤, 또는 대략 1.4 메가달톤, 또는 대략 1.5 메가달톤, 또는 대략 1.6 메가달톤, 또는 대략 1.7 메가달톤, 또는 대략 1.8 메가달톤, 또는 대략 1.9 메가달톤, 또는 대략 2.0 메가달톤, 또는 대략 2.1 메가달톤, 또는 대략 2.2 메가달톤, 또는 대략 2.3 메가달톤, 또는 대략 2.4 메가달톤, 또는 대략 2.5 메가달톤, 또는 대략 2.6 메가달톤, 또는 대략 2.7 메가달톤, 또는 대략 2.8 메가달톤, 또는 대략 2.9 메가달톤, 또는 대략 3.0 메가달톤, 또는 대략 3.1 메가달톤, 또는 대략 3.2 메가달톤, 또는 대략 3.3 메가달톤, 또는 대략 3.4 메가달톤, 또는 대략 3.5 메가달톤, 또는 대략 3.6 메가달톤, 또는 대략 3.7 메가달톤, 또는 대략 3.8 메가달톤, 또는 대략 3.9 메가달톤, 또는 대략 4.0 메가달톤, 또는 대략 4.1 메가달톤, 또는 대략 4.2 메가달톤, 또는 대략 4.3 메가달톤, 또는 대략 4.4 메가달톤, 또는 대략 4.5 메가달톤, 또는 대략 4.6 메가달톤, 또는 대략 4.7 메가달톤, 또는 대략 4.8 메가달톤, 또는 대략 4.9 메가달톤, 또는 대략 5.0 메가달톤 또는 그 이상의 분자 질량을 갖는다.

일부 구체예에서, 양이온 교환 수지는 카르복시메틸 (CM), 설포알킬 (SP, SE), 설페이트 및 메틸설포네이트 (S), 그리고 임의의 다른 음으로 하전된 리간드로 구성된 군에서 선택되는 음으로 하전된 기를 갖는다.

추가의 구체예에서, 단백질은 혈액 응고 단백질이다. 다양한 측면에서, 혈액 응고 단백질은 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자, FI (피브리노겐), FV (프로악셀레린), FXI (혈장-트롬보플라스틴 선조), 그리고 FXIII (섬유소 안정화 인자)로 구성된 군에서 선택된다.

한 구체예에서, 폰 빌레브란트 (VWF)-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계, 그리고 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 제1 세척 완충액은 양이온 교환 수지에 적용되는 용액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.

다른 구체예에서, VWF-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계, 양이온 교환 수지에 적용되는 용액의 pH보다 높은 pH에서 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계, 그리고 양이온 교환 수지를 제2 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 첫 번째 용리액은 제1 세척 완충액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.

추가의 구체예에서, VWF-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계, 양이온 교환 수지에 적용되는 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계, 그리고 양이온 교환 수지를 제2 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 첫 번째 용리액은 제1 세척 완충액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 비-지질 외피 바이러스의 증가된 제거로 VWF를 정제하는 방법에 관계한다. 본 발명의 방법은 배치 (batch) (즉, 칼럼 기기 없음) 양식뿐만 아니라 칼럼 (즉, 크로마토그래피) 양식에도 적용될 수 있다.

본 발명의 방법은 비-지질 외피 바이러스의 증가된 제거를 위하여 양이온 교환 수지 상에서 정제 방법을 이용한다. 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 VWF의 기존 정제 방법은 중성 pH에서 수행되었다. 이들 방법은 우수한 수율과 순도의 정제된 VWF의 제조가 가능하긴 했지만, 놀랍게도 이러한 공정은 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 능력이 없었다.

용어의 정의

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 당업자에게 본 발명에 이용되는 다수 용어의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 그리고 Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

본 명세서에서 인용된 각 간행물, 특허 출원, 특허, 그리고 기타 참고문헌은 본 발명의 내용과 모순되지 않는 정도로 순전히 참조로서 편입된다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 명백하게 달리 지시되지 않으면, 복수 참고대상을 포함한다.

본 명세서에서, 하기 용어는 달리 명시되지 않으면, 그들에게 부여된 의미를 갖는다.

본 명세서에서, 용어 "발현한다", "발현하는" 및 "발현"은 유전자 또는 DNA 서열 내에 정보가 명백해지도록 허용하거나 유발하는 것을 의미한다, 가령, 상응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사와 번역에 관련된 세포 기능을 활성화시킴으로써 단백질을 생산하는 것을 의미한다. DNA 서열은 "발현 산물", 예를 들면, 단백질을 형성하기 위하여 세포 내에서 또는 세포에 의해 발현된다. 발현 산물 자체, 예를 들면, 결과의 단백질 역시 "발현"되는 것으로 일컬어질 수 있다. 발현 산물은 세포내, 세포외 또는 분비된 것으로 특징될 수 있다. 용어 "세포내"는 세포 내부를 의미한다. 용어 "세포외"는 세포 외부, 예를 들면, 일정한 유형의 막통과 단백질을 의미한다. 물질은 세포 상에서 또는 세포 내부에 어딘가로부터 세포 외부로 상당한 양으로 나타나면, 세포에 의해 "분비"된다.

본 명세서에서, "폴리펩티드"는 아미노산 잔기, 구조 변이체, 관련된 자연-발생 구조 변이체, 그리고 펩티드 결합을 통해 연결된 이들의 합성 비-자연 발생 유사체로 구성되는 중합체를 지칭한다. 합성 폴리펩티드는 예로써, 자동화 폴리펩티드 합성기를 이용하여 제조될 수 있다. 용어 "단백질"은 전형적으로, 큰 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "펩티드"는 전형적으로, 짧은 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 중합성 구조를 포함한다. 이런 이유로, "폴리펩티드"는 단위체 (monomer), 이합체 (dimer), 삼합체 (trimer), 또는 더욱 큰 다합체성 구조일 수 있다. 이들 다합체성 구조는 최대 5 메가달톤 또는 그 이상일 수 있다.

본 명세서에서, "등전점 (isoelectric point)"은 수성 용액 내에 폴리펩티드의 총 전하 (net electric charge)가 0 (zero)인 pH 값이다.

본 명세서에서, 폴리펩티드의 "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 단백질 발현 산물보다 작은 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 일부분을 지칭하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서, "유사체"는 전체 분자, 또는 이들의 단편과 구조에서 실질적으로 유사하고, 그리고 동일하지만 다양한 정도의 생물학적 활성을 갖는 2개 또는 그 이상 폴리펩티드 중에서 임의의 한 가지를 지칭한다. 유사체는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 수반하는 하나 또는 그 이상의 돌연변이에 기초하여 그들의 아미노산 서열의 조성에서 상이하다. 치환은 대체되는 아미노산 및 이를 대체하는 아미노산의 물리화학적 또는 기능적 관련성에 기초하여 보존성 또는 비-보존성일 수 있다.

본 명세서에서, "변이체"는 정상적으로 분자의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티 (chemical moiety)를 포함하도록 변형되는 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 유사체를 지칭한다. 이런 모이어티는 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 조절할 수 있다. 이들 모이어티는 대안적으로, 분자의 독성을 감소시키고, 그리고 분자의 임의의 바람직하지 않은 부작용 등을 제거하거나 약화시킬 수 있다. 이런 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)에서 개시된다. 이런 모이어티를 분자에 결합시키는 절차는 당분야에 널리 공지되어 있다. 가령, 변이체는 생체내에서 더욱 긴 반감기를 단백질에 공여하는 화학적 변형을 갖는 혈액 응고 인자일 수 있다. 다양한 관점에서, 폴리펩티드는 당화 (glycosylation), 페길화 (pegylation), 및/또는 폴리시알릴화 (polysialylation)에 의해 변형된다.

재조합 VWF

프리프로-VWF의 폴리뉴클레오티드와 아미노산 서열은 각각, 서열 번호:1과 서열 번호:2에서 기재되고, 그리고 각각, GenBank Accession No. NM_000552와 NP_000543으로 가용하다. 성숙 VWF 단백질에 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호: 3 (전장 프리프로-VWF 아미노산 서열의 아미노산 764-2813에 상응함)에서 기재된다.

유용한 rVWF의 한 가지 형태는 적어도 하나의 인자 VIII (FVIII) 분자의 생체내 안정화 특성, 예를 들면, 결합 특성을 적어도 갖고, 그리고 선택적으로, 약리학적으로 허용되는 당화 패턴을 갖는다. 이의 특정 실례에는 A2 도메인이 없어 단백분해 (proteolysis)에 저항하는 VWF (Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997), 그리고 당단백질 1b-결합 도메인 및 콜라겐과 헤파린에 대한 결합 부위를 포함하는 Val 449 내지 Asn 730의 VWF 단편 (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989)이 포함된다. 적어도 하나의 FVIII 분자를 안정화시키는 VWF의 능력의 결정은 당분야에 공지된 방법에 따라 VWF-결함성 포유동물에서 수행될 수 있다.

본 발명의 rVWF는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 한 가지 특정 실례는 재조합 VWF를 생산하는 방법과 관련하여 본 발명에 참조로서 편입되는, 1986년 10월 23일 공개된 WO86/06096 및 1990년 7월 23일 제출된 U.S. Patent Application No. 07/559,509에서 개시된다. 따라서 (i) 예로써, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통한 유전자 조작에 의해 재조합 DNA를 생산하고, (ii) 예로써, 전기천공 (electroporation) 또는 미세주입 (microinjection)을 통한 형질감염 (transfection)에 의해 재조합 DNA를 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입하고, (iii) 이들 형질전환된 세포를 예로써, 연속 또는 회분 (batchwise) 방식으로 배양하고, (iv) VWF를 예로써, 구성적으로 또는 유도 시에 발현하고, 그리고 (v) 상기 VWF를 예로써, 배양 배지로부터 분리하거나, 또는 형질전환된 세포를 수확하여, (vi) 예로써, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피를 통해 정제된 rVWF를 획득하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 재조합 VWF는 당분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여, 형질전환된 숙주 세포에서 만들어질 수 있다. 가령, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 적절한 제한 효소 (restriction enzyme)를 이용하여 DNA로부터 절제될 수 있다.

대안으로, DNA 분자는 화학적 합성 기술, 예를 들면, 포스포라미데이트 (phosphoramidate) 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 또한, 이들 기술의 조합이 이용될 수 있다.

본 발명에서는 또한, 적절한 숙주 내에서 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터를 제시한다. 이들 벡터는 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 벡터 내로 삽입되기 이전에 또는 삽입된 이후에, 이러한 작동가능한 연결을 달성하는 방법은 널리 공지되어 있다. 발현 제어 서열에는 프로모터, 활성자, 인핸서, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 출발 신호, 종결 신호, 캡 신호, 폴리아데닐화 신호, 그리고 전사 또는 번역의 제어와 관련된 기타 신호가 포함된다. 그 내부에 이러한 폴리뉴클레오티드를 갖는 결과의 벡터는 적절한 숙주를 형질전환시키는데 이용된다. 이러한 형질전환은 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

다수의 가용하고 널리 공지된 숙주 세포 중에서 임의의 세포가 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 특정 숙주의 선택은 예로써, 선택된 발현 벡터와의 융화성 (compatibility), DNA 분자에 의해 인코딩된 펩티드의 독성, 형질전환의 비율, 펩티드의 회수 용이성, 발현 특징, 생물학적 안정성 (bio-safety) 및 비용을 비롯하여, 당분야에서 인정되는 다수의 인자에 좌우된다. 이들 인자의 균형은 모든 숙주 세포가 특정 DNA 서열의 발현에 동등하게 효과적이지는 않다는 이해와 합치되어야 한다. 이들 일반적인 가이드라인 내에서, 유용한 미생물 숙주 세포에는 배양 중인 세균, 효모와 기타 균류, 곤충, 식물, 포유동물 (인간 포함) 세포, 또는 당분야에 공지된 기타 숙주가 포함된다.

그 다음, 형질전환된 숙주는 배양되고 정제된다. 숙주 세포는 원하는 화합물이 발현되도록 하기 위하여 전통적인 발효 조건 하에 배양될 수 있다. 이런 발효 조건은 당분야에 널리 공지되어 있다. 최종적으로, 이들 폴리펩티드는 당분야에 널리 공지된 방법에 의해 배양으로부터 정제된다.

본 발명의 화합물을 발현하는데 이용되는 숙주 세포에 따라, 탄수화물 (올리고당) 기는 단백질 내에서 당화 부위인 것으로 알려져 있는 부위에 편의하게 부착될 수 있다. 일반적으로, O-연결된 올리고당은 세린 (Ser) 또는 트레오닌 (Thr) 잔기에 부착되는 반면, N-연결된 올리고당은 그들이 서열 Asn-X-Ser/Thr의 일부일 때 아스파라긴 (Asn) 잔기에 부착되고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. X는 바람직하게는, 프롤린을 제외한 19개 자연 발생 아미노산 중에서 한 가지이다. N-연결된 올리고당과 O-연결된 올리고당의 구조, 그리고 각 유형에서 관찰되는 당 잔기는 상이하다. 양쪽에서 공통적으로 관찰되는 당의 한 가지 유형은 N-아세틸뉴라민산 (시알산으로 지칭됨)이다. 시알산은 일반적으로, N-연결된 올리고당과 O-연결된 올리고당 둘 모두의 말단 잔기이고, 그리고 음전하로 인해, 당화된 화합물에 산성을 공여할 수 있다. 이런 부위(들)는 본 발명의 화합물의 링커 내에 통합될 수 있고, 그리고 바람직하게는, 이들 폴리펩티드 화합물의 재조합 생산 (가령, 포유동물 세포, 예를 들면, CHO, BHK, COS 내에서) 동안 세포에 의해 당화된다. 하지만, 이들 부위는 당분야에 공지된 합성 또는 반-합성 절차에 의해 더욱 당화될 수 있다.

대안으로, 이들 화합물은 합성 방법에 의해 만들어질 수 있다. 가령, 고형상 (solid phase) 합성 기술이 이용될 수 있다. 적절한 기술은 당분야에 널리 공지되어 있고, 그리고 Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; 그리고 Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527에서 기술된 것들을 포함한다. 고형상 합성은 개별 펩티드를 만드는데 선호되는 기술인데, 그 이유는 고형상 합성이 작은 펩티드를 만드는 가장 비용-효과적인 방법이기 때문이다.

VWF의 단편, 변이체 및 유사체

폴리펩티드 단편, 변이체 또는 유사체를 제조하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.

폴리펩티드의 단편은 제한 없이, 효소 절단 (가령, 트립신, 키모트립신)을 이용하고, 또한 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 단편을 산출하는 재조합 수단을 이용하여 제조된다. 특정 활성을 갖는 단백질의 영역, 예를 들면, 다합체화 도메인 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 확인가능 VWF 도메인을 포함하는 폴리펩티드 단편이 산출될 수 있다. 인간과 비-인간 형태의 VWF (가령, 뮤린 VWF)를 포함하는 폴리펩티드의 변이체가 예기된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해, 예로써 생쥐/인간 융합 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드가 예기된다.

폴리펩티드 유사체를 만드는 방법 역시 널리 공지되어 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 유사체는 치환, 삽입, 부가 또는 결실 유사체일 수 있다. 폴리펩티드의 단편을 비롯한 결실 유사체는 기능 또는 면역원성 활성에 필수적이지 않은, 고유 단백질의 하나 또는 그 이상의 잔기가 없다. 삽입 유사체는 예로써, 폴리펩티드 내에 비-말단 지점에서 아미노산(들)의 추가를 필요로 한다. 이러한 유사체는 면역반응성 에피토프 또는 단순히, 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 단편을 비롯한 추가의 유사체는 단백질의 양쪽 말단 중에서 어느 한쪽에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 추가를 포함하고, 여기에는 예로써, 융합 단백질이 포함된다.

치환 유사체는 전형적으로, 단백질 내에 하나 또는 그 이상의 부위에서 야생형 아미노산을 다른 아미노산으로 교체하고, 그리고 기타 기능 또는 특성의 상실 없이 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 특성을 조절하도록 설계될 수 있다. 한 측면에서, 치환은 보존성 치환이다. "보존성 아미노산 치환"은 유사한 화학적 성질의 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 아미노산의 치환을 의미한다. 보존성 치환을 만들기 위한 유사한 아미노산에는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (글루탐산, 아스파르트산); 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (아르기닌, 리신, 히스티딘); 극성 아미드 측쇄를 갖는 아미노산 (글루타민, 아스파라긴); 소수성 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 (류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 글리신); 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판, 티로신); 소형 측쇄를 갖는 아미노산 (글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌); 또는 지방족 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 (세린, 트레오닌)이 포함된다.

유사체는 그들이 유래되는 재조합 VWF에 실질적으로 상동하거나, 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 바람직한 유사체는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 활성 중에서 적어도 일부, 예를 들면, 혈액 응고 활성을 유지하는 것들이다.

예기되는 폴리펩티드 변이체에는 유비퀴틴화 (ubiquitination), 폴리시알릴화를 비롯한 당화, 치료제 또는 진단제에 접합 (conjugation), 표지화 (labeling), 공유 중합체 부착, 예를 들면, 페길화 (폴리에틸렌 글리콜로 유도체화), 비-가수분해성 결합의 도입, 그리고 인간 단백질에서 정상적으로 나타나지 않는 아미노산, 예를 들면, 오르니틴의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩티드가 포함된다. 변이체는 본 발명의 비-변형된 분자의 동일한 또는 본질적으로 동일한 결합 특성을 유지한다. 이런 화학적 변형에는 VWF 폴리펩티드에 작용제의 직접적인 또는 간접적인 (가령, 링커를 통한) 부착이 포함될 수 있다. 간접적 부착의 경우에, 링커는 가수분해성 또는 비-가수분해성인 것으로 예기된다.

페길화된 폴리펩티드 유사체를 제조하는 것은 일반적으로, (a) 결합 구조체 폴리펩티드가 하나 또는 그 이상의 PEG 기에 부착되도록 하는 조건 하에 폴리펩티드를 폴리에틸렌 글리콜 (가령, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응시키는 단계, 그리고 (b) 반응 산물(들)을 획득하는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적 반응 조건은 공지된 파라미터 및 원하는 결과에 기초하여 결정될 것이다. 가령, PEG: 단백질의 비율이 높을수록, 폴리-페길화된 산물의 백분율이 높다. 일부 구체예에서, 결합 구조체는 N-말단에서 단일 PEG 모이어티를 가질 것이다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 생체내에서 더욱 긴 반감기를 제공하기 위하여 혈액 응고 인자에 부착될 수 있다. PEG 기는 임의의 편의한 분자량을 가질 수 있고, 그리고 선형 또는 가지형일 수 있다. PEG의 평균 분자량은 대략 2 킬로달톤 ("kD") 내지 대략 100 kDa, 대략 5 kDa 내지 대략 50 kDa, 또는 대략 5 kDa 내지 대략 10 kDa의 범위에서 변한다. PEG 기는 혈액 응고 인자 상에서 반응성 기 (가령, 알데히드, 아미노, 또는 에스테르 기)에 대한, PEG 모이어티 상에서 자연 또는 조작된 반응 기 (가령, 알데히드, 아미노, 티올, 또는 에스테르 기)를 통한 아실화 또는 환원성 알킬화에 의해, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 기술에 의해 혈액 응고 인자에 부착된다.

폴리시알릴화된 폴리펩티드를 제조하는 방법은 United States Patent Publication 20060160948, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, 그리고 Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006에서 기술된다. 간단히 말하면, 0.1 M NaIO₄를 내포하는 콜로민산 (colominic acid)의 용액은 CA를 산화시키기 위하여 어둠 속에서 실온에서 교반된다. 활성화된 CA 용액은 어둠 속에서 예로써, 0.05 M 인산나트륨 완충액, pH 7.2에 대하여 투석되고, 그리고 상기 용액은 rVWF 용액에 첨가되고 부드러운 교반 하에 어둠 속에서 실온에서 18 시간 동안 항온처리되었다. 유리 시약은 이후, 한외여과/정용여과에 의해 rVWF-폴리시알산 접합체로부터 분리될 수 있다. rVWF와 폴리시알산의 접합은 또한, 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 가교-연결 시약으로서 이용하여 달성될 수 있다 (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004).

게다가, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드인 두 번째 작용제와의 융합 단백질인 것으로 예기된다. 한 구체예에서, 폴리펩티드인 두 번째 작용제는 제한 없이, 효소, 성장 인자, 항체, 사이토킨, 케모킨, 세포-표면 수용체, 세포 표면 수용체의 세포외 도메인, 세포 부착 분자, 또는 앞서 기술된 단백질의 단편 또는 활성 도메인이다. 관련된 구체예에서, 두 번째 작용제는 혈액 응고 인자, 예를 들면, 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX이다. 예기되는 융합 단백질은 당분야에 널리 공지된 화학적 기술 또는 재조합 기술에 의해 만들어진다.

또한, 프리프로-VWF 및 프로-VWF 폴리펩티드는 본 발명의 제제에서 치료적 이점을 제공하는 것으로 예기된다. 가령, US Patent No. 7,005,502에서는 시험관내에서 혈소판의 존재에서 트롬빈 발생을 유도하는 실질적인 양의 프로-VWF를 포함하는 제약학적 제조물을 기술한다. 자연-발생 성숙 VWF의 재조합, 생물학적 활성 단편, 변이체, 또는 유사체 이외에, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 제제에서 프리프로-VWF (서열 번호:2에서 기재됨) 또는 프로-VWF 폴리펩티드 (서열 번호: 2의 아미노산 잔기 23 내지 764)의 재조합 생물학적 활성 단편, 변이체, 또는 유사체의 용도를 예기한다.

단편, 변이체 및 유사체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자연-발생 분자와 동일한 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 자연-발생 분자의 생물학적 활성 단편, 변이체, 또는 유사체를 인코딩하는 기술의 숙련자에 의해 쉽게 산출될 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술, DNA 인코딩 분자의 절단/결찰 등을 이용하여 제조될 수 있다. 따라서 당업자는 특정 부위 돌연변이유발 (site-specific mutagenesis)이 포함되지만 이에 국한되지 않는 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여, 변경된 코돈 및 미스센스 (missense) 돌연변이를 유발하는, DNA 가닥 내에 단일 염기 변화를 산출할 수 있을 것이다. 본 명세서에서, 구(句) "중간 정도로 엄밀한 혼성화 조건"은 예로써, 42℃에서 50% 포름아미드에서 혼성화 및 60℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 세척을 의미한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이들 조건에서 변동은 혼성화되는 서열의 길이와 GC 뉴클레오티드 염기 함량에 기초하여 일어난다. 당분야에서 제조 기준 (formula standard)은 정확한 혼성화 조건을 결정하는데 적합하다 (참조: Sambrook et al., 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)).

VWF를 생산하는 방법

산업적으로, VWF, 특히 인간 재조합 VWF (rVWF)는 유전자 조작된 CHO 세포주에서 rFVIII과 함께 합성되고 발현된다. 공동-발현된 rVWF의 기능은 세포 배양 과정에서 rFVIII을 안정화시키는 것이다. rVWF는 세포 내에서 프로-형태로서 합성되고, N-말단에 부착된 대형 프로-펩티드를 내포한다. 소포체 (endoplasmic reticulum) 및 골지체 (Golgi apparatus) 내에서 성숙 시에, 프로-펩티드는 세포 프로테아제 푸린 (furin)의 작용에 의해 절단되고, 그리고 발현된 단백질의 이합체로 구성되는 동일한 아단위의 동종중합체 (homopolymer)로서 분비된다.

VWF의 정제

본 발명에서는 단백질-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계, 그리고 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 제1 세척 완충액은 양이온 교환 수지에 적용되는 용액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.

한 측면에서, 용액의 pH는 단백질의 등전점보다 대략 1 pH 단위 높다. 다른 측면에서, 용액의 pH는 단백질의 등전점보다 대략 1.2, 또는 대략 1.4, 또는 대략 1.6, 또는 대략 1.8, 또는 대략 2.0, 또는 대략 2.2, 또는 대략 2.4, 또는 대략 2.6, 또는 대략 2.8, 또는 대략 3.0, 또는 대략 3.2, 또는 대략 3.4, 또는 대략 3.6, 또는 대략 3.8, 또는 대략 4.0, 또는 대략 4.2, 또는 대략 4.4, 또는 대략 4.6, 또는 대략 4.8, 또는 대략 5.0, 또는 대략 5.5, 또는 대략 6.0 pH 단위 또는 그 이상 높다.

이들 구체예에서, pH는 대략 7보다 크다. 다른 측면에서, pH는 대략 7.1, 또는 대략 7.2, 또는 대략 7.3, 또는 대략 7.4, 또는 대략 7.5, 또는 대략 7.6, 또는 대략 7.7, 또는 대략 7.8, 또는 대략 7.9, 또는 대략 8.0, 또는 대략 8.1, 또는 대략 8.2, 또는 대략 8.3, 또는 대략 8.4, 또는 대략 8.5, 또는 대략 8.6, 또는 대략 8.7, 또는 대략 8.8, 또는 대략 8.9, 또는 대략 9.0, 또는 대략 9.1, 또는 대략 9.2, 또는 대략 9.3, 또는 대략 9.4, 또는 대략 9.5, 또는 대략 9.6, 또는 대략 9.7, 또는 대략 9.8, 또는 대략 9.9, 또는 대략 10.0, 또는 대략 10.1, 또는 대략 10.2, 또는 대략 10.3, 또는 대략 10.4, 또는 대략 10.5, 또는 대략 10.6, 또는 대략 10.7, 또는 대략 10.8, 또는 대략 10.9, 또는 대략 11.0, 또는 대략 11.1, 또는 대략 11.2, 또는 대략 11.3, 또는 대략 11.4, 또는 대략 11.5, 또는 대략 11.6, 또는 대략 11.7, 또는 대략 11.8, 또는 대략 11.9, 또는 대략 12.0, 또는 대략 12.1, 또는 대략 12.2, 또는 대략 12.3, 또는 대략 12.4, 또는 대략 12.5, 또는 대략 12.6, 또는 대략 12.7, 또는 대략 12.8, 또는 대략 12.9, 또는 대략 13.0 또는 그 이상이다.

다른 구체예에서, 단백질-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계, 양이온 교환 수지에 적용되는 용액의 pH보다 높은 pH에서 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계, 그리고 양이온 교환 수지를 제2 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 제2 세척 완충액은 제1 세척 완충액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다. 한 측면에서, 제1 세척 완충액의 pH는 양이온 교환 수지에 적용되는 용액의 pH보다 대략 1 pH 단위 높다. 이러한 단계에서, 이온 교환 매체는 UNOsphere™ S (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA)이지만, 다른 양이온 교환 시스템이 이들 방법의 실시에 이용될 수 있는 것으로 예기된다. 이들 양이온 교환 시스템은 당업자에게 공지되어 있다.

다른 측면에서, 제1 세척 완충액의 pH는 단백질의 등전점보다 대략 1.1, 또는 대략 1.2, 또는 대략 1.3, 또는 대략 1.4, 또는 대략 1.5, 또는 대략 1.6, 또는 대략 1.7, 또는 대략 1.8, 또는 대략 1.9, 또는 대략 2.0, 또는 대략 2.1, 또는 대략 2.2, 또는 대략 2.3, 또는 대략 2.4, 또는 대략 2.5, 또는 대략 2.6, 또는 대략 2.7, 또는 대략 2.8, 또는 대략 2.9, 또는 대략 3.0, 또는 대략 3.1, 또는 대략 3.2, 또는 대략 3.3, 또는 대략 3.4, 또는 대략 3.5, 또는 대략 3.6, 또는 대략 3.7, 또는 대략 3.8, 또는 대략 3.9, 또는 대략 4.0, 또는 대략 4.1, 또는 대략 4.2, 또는 대략 4.3, 또는 대략 4.4, 또는 대략 4.5, 또는 대략 4.6, 또는 대략 4.7, 또는 대략 4.8, 또는 대략 4.9, 또는 대략 5.0, 또는 대략 5.1, 또는 대략 5.2, 또는 대략 5.3, 또는 대략 5.4, 또는 대략 5.5, 또는 대략 5.6, 또는 대략 5.7, 또는 대략 5.8, 또는 대략 5.9, 또는 대략 6.0 pH 단위 또는 그 이상 높다. 이들 구체예에서, 제1 세척 완충액의 pH는 대략 7보다 크다. 다른 측면에서, 제1 세척 완충액의 pH는 대략 7.1, 또는 대략 7.2, 또는 대략 7.3, 또는 대략 7.4, 또는 대략 7.5, 또는 대략 7.6, 또는 대략 7.7, 또는 대략 7.8, 또는 대략 7.9, 또는 대략 8.0, 또는 대략 8.1, 또는 대략 8.2, 또는 대략 8.3, 또는 대략 8.4, 또는 대략 8.5, 또는 대략 8.6, 또는 대략 8.7, 또는 대략 8.8, 또는 대략 8.9, 또는 대략 9.0, 또는 대략 9.1, 또는 대략 9.2, 또는 대략 9.3, 또는 대략 9.4, 또는 대략 9.5, 또는 대략 9.6, 또는 대략 9.7, 또는 대략 9.8, 또는 대략 9.9, 또는 대략 10.0, 또는 대략 10.1, 또는 대략 10.2, 또는 대략 10.3, 또는 대략 10.4, 또는 대략 10.5, 또는 대략 10.6, 또는 대략 10.7, 또는 대략 10.8, 또는 대략 10.9, 또는 대략 11.0, 또는 대략 11.1, 또는 대략 11.2, 또는 대략 11.3, 또는 대략 11.4, 또는 대략 11.5, 또는 대략 11.6, 또는 대략 11.7, 또는 대략 11.8, 또는 대략 11.9, 또는 대략 12.0, 또는 대략 12.1, 또는 대략 12.2, 또는 대략 12.3, 또는 대략 12.4, 또는 대략 12.5, 또는 대략 12.6, 또는 대략 12.7, 또는 대략 12.8, 또는 대략 12.9, 또는 대략 13.0 또는 그 이상이다.

도면의 간단한 설명
도 1에서는 SDS-PAGE 분리, 그 이후에 잔여 rFVIII에 대한 은 염색 (A) 및 웨스턴 블롯 (B) 분석의 결과를 도시한다.
도 2에서는 MMV와 레오바이러스 첨가 (spiking)된 샘플을 이용한 UNO S 작업의 염색된 겔을 도시한다.
도 3에서는 MMV와 레오바이러스 첨가 (spiking)된 샘플을 이용한 UNO S 작업의 염색된 겔을 도시한다.
도 4에서는 공정 변형에 의해 획득된 rVWF의 정제된 제조물을 고유 상태에서 V8 프로테아제에 의한 단백분해 절단 (proteolytic digestion)에 종속시키고, 그리고 결과의 펩티드를 RP-HPLC로 분리한 결과를 도시한다.
도 5에서는 공정 변형에 의해 획득된 rVWF의 정제된 제조물을 변성된 상태에서 트립신에 종속시키고, 그리고 결과의 펩티드를 RP-HPLC로 분리한 결과를 도시한다.

하기 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 예시할 뿐이며 이를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1

하기에 기술된 검사에 이용되는 바이러스와 세포는 아래와 같다.

REO-3 (레오바이러스과; 비-외피 dsRNA 바이러스), Strain Dearing (ATCC VR-824)은 ATCC로부터 획득되었다. 상기 바이러스는 ECACC (84113001)로부터 획득된 Vero 세포 상에서 증식되고 적정되었다. MMV (파보바이러스과; 비-외피 ssDNA 바이러스), 원형 계통 (ATCC VR-1346)은 American Type Culture Collection (Rockville, Maryland)로부터 획득되었다. 상기 바이러스는 A9 세포 (ATCC CCL-1 .4) 상에서 증식되고 적정되었다. PPV (파보바이러스과; 비-외피 ssDNA 바이러스), Tennessee 계통 (BRFF #PP951024)은 Biological Research Faculty & Facility (Ijamsville, Maryland)로부터 획득되었다. 상기 바이러스는 PK-13 세포 (ATCC CRL-6489) 상에서 증식되고 적정되었다. EMCV (피코르나바이러스과; 비-외피 ssRNA) (ATCC #VR-129B)는 American Type Culture Collection로부터 획득되었다. 상기 바이러스는 Vero 세포 (European Collection of Cell Cultures, ECACC, #84113001) 상에서 증식되고 적정되었다. HadV (아데노바이러스과; 비-외피 dsDNA), Adenoid 75 계통 (ATCC VR-5)은 American Type Culture Collection로부터 획득되었다. 상기 바이러스는 HeLa 세포 (ATCC CCL-2) 상에서 증식되고 적정되었다.

예시적인 VWF 정제 공정에 수반되는 단계는 하기를 포함한다:

- 세포 배양 상층액의 면역 친화성 크로마토그래피

- 관류 분별 (flow-through fraction)

- 음이온 교환 (가령, 트리메틸아미노에틸 음이온 교환 칼럼)

- 여과 (0.45/0.2 ㎛)

- 음이온 교환 (가령, Mustang Q (Pall Corporation))

- 바이러스 불활성화 (가령, 용매/세제 처리 이용)

- 여과 (0.8/0.65 ㎛)

- 양이온 교환 (가령, UNO S 칼럼)

- 한외여과/농축

- 여과 (0.45/0.2 ㎛)

- 겔 여과 (Superose 6 제조 등급 (prep grade) (GE Life Sciences))

UNO S 단계의 최적화. UNO S 단계 동안, rVWF는 강한 양이온 교환 수지에 결합하는 반면, 약간의 불순물은 통과한다. 칼럼을 증가된 전도도 완충액으로 세척후, 결합된 rVWF는 염 단계에서 칼럼으로부터 방출된다. 초기 바이러스 제거 연구 동안, 이러한 단계는 모형 레오바이러스에 대한 적어도 유의미한 제거 속도를 보였다. 적용된 파라미터의 조건 및 상응하는 결과는 하기 표 1에서 제시된다.

표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 공정 파라미터에서 온건한 변화 (전도도의 변경, pH 8.0 및 세척 완충액에 첨가물)는 MMV 제거 속도의 유의미한 향상을 유발하지 못하였다. pH를 9.0으로 더욱 증가시키면, 레오바이러스뿐만 아니라 MMV에 대한 2 로그 (log) 이상의 유의미한 제거 속도가 재현가능하게 유발되었다. 이러한 공정 변화는 실행이 기술적으로 용이하고, 그리고 높은 pH 환경에 rVWF의 노출은 상대적으로 짧게 (최대 6 시간) 유지될 수 있다. 결합된 rVWF의 용리는 중성 조건 하에 수행된다.

이들 공정의 바이러스 불활성화 능력에 관한 분석은 CPMP 가이드라인 268/95의 권고에 따라, 하기 공식을 이용하여 수행되었다:

여기서

R = 바이러스 감소 인자

V1 = 출발 물질의 체적 [ml]

T1 = 출발 물질에서 바이러스의 농도 [TCID50/ml]

V2 = 단계후 물질의 체적 [ml]

T2 = 단계후 바이러스의 농도 [TCID50/ml]

처리 전후에 각 첨가 (spiking)된 샘플의 체적과 역가는 R을 계산하는데 이용된다. 바이러스가 검출되지 않을 때는 언제든지, 검출 한계 (detection limit)가 계산을 위한 바이러스 역가로서 간주되었다. 계산은 소수점 둘째 자리까지 제공된 바이러스 역가 (log₁₀[TCID50/ml]로 수행되고, 그리고 단지 최종 결과, 다시 말하면, 감소 인자 (R)만 소수점 첫째 자리로 반올림되었다.

실시예 2

UNO S 용출액은 불순물과 산물 변이체의 추적 분석 (trace analysis)을 용이하게 하기 위하여 30 kDa 컷오프 변형된 셀룰로오스 막을 이용한 한외여과에 의해 거의 800 ㎍ rVWF 항원/ml로 농축되었다.

rVWF의 검사

리스토세틴 활성. 리스토세틴 여인자 활성은 안정화된 혈소판을 내포하는 폰 빌레브란트 시약 및 항생제 "리스토세틴"을 이용한 비탁 분석기 (turbidimetric analyzer)에 의해 결정된다. 샘플 내에 포함된 폰 빌레브란트 인자 (= 리스토세틴 여인자)는 리스토세틴의 존재에서, 안정화된 혈소판의 응집을 유발한다. 이러한 응집은 시약 제조물의 탁도 (turbidity)를 감소시키고, 그리고 광학 밀도 (optical density)에서 변화는 비탁 분석기에 의해 측정된다. 보정 (calibration)은 WHO 농축물 참고 기준 #00/514에 의해 수행된다.

VWF 항원. VWF-샘플은 ELISA 검사 - 2개의 다중클론 항체를 갖는 이중 샌드위치 시스템에서 그들의 vWF-항원 함량에 대해 조사된다. 마이크로역가 평판 상에서 발색 반응 (color reaction)의 측정은 490 nm에서 광도계로 수행된다. 각 샘플의 농도는 컴퓨터 보조된 ELISA분석 프로그램 (곡선 알고리즘 : 3차 회귀 (cubic regression))으로 기준 곡선 (standard curve)을 향하여 계산된다. 모든 시도 (reading)는 블랭크 (blank)에 대비하여 보정된다.

FVIII 결합 활성. 정적 조건 하에 rVWF의 FVIII 결합은 일정한 양의 rFVIII를 희석된 VWF-내포 샘플과 함께 항온처리함으로써 ELISA 색소생산 검사법 (ECA)에 의해 결정되었다. 형성된 VWF-FVIII-복합체는 이후, 상업적으로 구입가능한 다중클론 토끼 항-인간 VWF 항체로 코팅된 마이크로역가 평판으로 이전되었다. 항온처리후, 결합되지 않은 FVIII은 차후 세척 단계에 의해 제거되었다. 결합된 FVIII은 상업적으로 구입가능한 FVIII 색소생산 검사법 (Technochrom FVIII : C 시약 키트, Technoclone, Austria)에 의해 정량되었다. 블랭크 보정된 광학 밀도 (405 nm에서 mOD/min)는 대수 계산자 (logarithmic scale)에서 VWF:Ag 농도에 대비하여 플롯팅 (plotting)되었다.

SDS-PAGE 분석. 환원 조건 하에 전통적인 8% SDS-PAGE 분석 및 Coomassie Blue와 Silver Stain으로 겔의 염색은 rVWF의 단백질 조성에 통찰력을 제공할 수 있다. 니트로셀룰로오스 막에 분리된 단백질 띠의 이전 및 각각, VWF, FVIII과 푸린에 대한 적절한 항체로 단백질의 면역학적 염색 이후에, 전체 단백질에 대한 VWF 관련된 단백질의 비교가 수행될 수 있다.

다합체 분석. VWF의 다합체성 구조는 고-밀도 수평 SDS 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석된다. 간단히 말하면, 샘플은 0.3-1.0 IU/ml VWF:Ag의 범위 내에서 동일한 농도로 희석되고, Tris-EDTA-SDS 완충액과 함께 항온처리되고, 그리고 아가로오스 겔 상에서 비-환원 조건 하에 다합체가 분리된다. VWF 다합체는 ALP 발색 키트를 이용하여, 다중클론 토끼 항-인간 VWF 항체, 그 이후 알칼리 포스파타아제 (ALP) 접합된 염소 항-토끼 IgG로 인-겔 면역염색 (in-gel immunostaining)에 의해 명시화된다. 대안으로, 아가로오스 겔은 블롯팅 (blotting) 막 상에 블롯팅되고, 그리고 염색은 다중클론 토끼 항-인간 VWF 항체, 그 이후 양고추냉이 과산화효소 접합된 항-토끼 IgG에 의해 수행되었다. 명시화를 위하여, VWF에 대한 검출 감도를 적어도 2 크기 (magnitude) 증가시키는 전기화학발광 (electro-chemi-luminescence)이 이용되었다. 각각, VWF 다합체 및 다합체성 구조의 크기 분포를 분석하기 위하여 낮은 분할 (1 % 아가로오스) 및 높은 분할 (2.5 % 아가로오스) 조건이 이용되었다.

HPLC 분석. 재조합 VWF는 2가지 주요 단편 (N-말단과 C-말단 동종이합체 단편)을 제공하는 고유 조건 하에 GluC (V8 프로테아제)에 의해 절단될 수 있고, 이들 단편은 역상 HPLC C4-칼럼 상에서 분리된다. 이들 단편은 280 nm에서 UV 흡광도를 모니터링함으로써 검출된다.

펩티드 맵핑 (mapping). rVWF의 일차 구조는 펩티드 맵핑 접근법을 이용하여 조사되었다. 정제된 rVWF의 샘플은 디티오트레이톨 (DTT)로 환원되고, 그리고 유리 설피드릴계 기는 4-비닐피리딘으로 차단되었다. 염기서열분석 등급 트립신이 rVWF에 첨가되고 18 시간 동안 반응되었다. 결과의 펩티드 혼합물은 역상 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 용리 펩티드는 214 nm에서 온-라인 UV 검출 및 온-라인 전기분무 질량분석법에 의해 검출되었다.

탈아미드화된 rVWF에 대한 검사. 이소-아스파르트산염 (아스파라긴의 탈아미드화로부터 발생하는 한 가지 반응 산물)의 검출을 위한 분석 방법은 트립신 절단 (tryptic digestion), 그 이후 Promega에 의해 공급된 ISOQUANT 이소아스파르트산염 검출 키트를 이용한 단백질 이소아스파르틸 메틸전달효소 (PIMT) 효소적 반응을 이용한다. PIMT는 기질 S-아데노실-L 메티오닌 (SAM)으로부터 카르복실 위치에서 IsoAsp로의 메틸 기 이전을 촉진하여 S-아데노실 호모시스테인 (SAH)을 발생시킨다. 세포조직생리학적으로 방출된 SAH는 RP HPLC 방법에 의해 260 nm의 파장에서 검출된다.

상이한 공정에 의해 획득된 산물에 대한 분석 데이터는 표 2에 요약된다.

표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상이한 공정 변형에 의해 정제된 rVWF의 생화학적 특성은 필적한다.

rVWF 단백질의 주요 띠는 모든 산물에서 매우 유사한 반면, 불순물의 정도는 잔여 rFVIII에 대한 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석 둘 모두에 의해 샘플 #1 (도 1에서 VWF#07로 명명됨)에서 더욱 낮다. rFVIII에 대한 띠 패턴은 모든 배치 (batch) 간에 필적하는데, 이는 pH 9.0 조건에 기인한 변성이 발생하지 않았다는 것을 암시한다.

낮은 및 높은 분할 아가로오스 겔 전기영동은 rVWF 제조물의 높은 유사성을 드러냈다. 낮은 분할 다합체 분석에 의해 다합체 조성에서 차이 없음이 관찰될 수 있었다. 도 2에서는 MMV와 레오바이러스 첨가 (spiking)된 샘플을 이용한 UNO S 작업의 염색된 겔을 도시한다. 또한, 높은 분할 다합체 분석은 본래의 다합체 패턴을 드러내는데, 이는 pH 9.0 조건에 기인한 rVWF 다합체에 대한 손상이 발생하지 않는다는 것을 암시하였다. 도 3에서는 MMV와 레오바이러스 첨가 (spiking)된 샘플을 이용한 UNO S 작업의 염색된 겔을 도시한다.

등량곡선 (isoquant) 검사에 의해, pH 9.0에서 rVWF의 체류 시간 (dwell time)에 기인한 증강된 탈아미드화 없음이 검출될 수 있었다. 일반적으로, 탈아미드화된 rVWF의 몰 백분율 (molar percentage)은 매우 낮다. 공정 변형에 의해 획득된 rVWF의 정제된 제조물을 고유 상태에서 V8 프로테아제 (도 4 참조) 또는 변성된 상태에서 트립신 (도 5 참조)에 의한 단백분해 절단에 종속시키고, 그리고 결과의 펩티드를 RP-HPLC로 분리하는 것은 모든 샘플에 대한 유사한 크로마토그램 (chromatogram)을 산출하였다.

피크 패턴에서 사소한 차이는 질량분석 또는 N-말단 서열 분석에 의해 확증된, 제조물 내에 상이한 양의 불순물 (도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 주로 잔여 rVWF 프로펩티드)의 존재에 기인한다.

실시예 3

MMV 첨가 (spiking) 시에 높은 pH에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 rVWF의 정제.

칼럼 내로 채워진 UNOsphere S 수지는 1 CV의 2 M NaCl로 활성화되고 25 CV의 평형 완충액 (pH=9.0)으로 평형화되었다. 이후, 15 mS/cm의 전도도 및 9.0의 pH로 조정되고 생쥐 미닛 바이러스 (mouse minute virus, MMV)가 첨가 (spiking)된 rVWF 내포 용액은 대략 10.0 cm/h의 선형 유속 (linear flow rate)에서 칼럼 상에 적하되었다. 칼럼은 이후, 10 CV의 평형 완충액 (pH=9.0)으로 세척되고, 그리고 산물은 65 cm/h의 선형 유속에서 3.5 CV의 용리 완충액 (pH=7.5)으로 용리되었다. 적하 및 세척 국면 동안 증가된 pH는 수지에 대한 바이러스 입자의 결합을 유의미하게 감소시키지만 산물 VWF의 완전 결합을 유지시켰다. 결과로써, 대부분의 적하된 바이러스 입자는 높은 수율에서 용출액 풀 (eluate pool)에서 회수되는 산물로부터 분리된 비-결합 (관류) 및 세척 분획물 (fraction)에서 관찰되었다. 표 3에서 결과는 이러한 절차를 적용함으로써, 비-외피 모형 바이러스 생쥐 미닛 바이러스 (MMV)에서 2 로그 (log)의 바이러스 제거 능력이 달성될 수 있다는 것을 증명한다.

TCID50 검사는 하기와 같이 수행되었다. 간단히 말하면, 샘플의 연속 1/2 로그 희석액이 적절한 조직 배양 배지에서 제조되고, 그리고 100 ㎕의 각 희석액이 지시자 세포주로 접종된 마이크로역가 평판의 8개 웰 각각에 첨가되었다. 세포는 이후, 7일 동안 36℃ ± 2℃에서 배양되고, 그 다음 현미경 하에 세포의 시각적 검사에 의해 세포변성 효과 (cytopathic effect)가 평가되었다. 50% 조직 배양 감염량 (median tissue culture infectious dose, TCID50)은 푸아송 분포 (Poisson distribution)에 따라 계산되고 log₁₀[TCID50/ml]로서 표시되었다.

정제는 15 mm 직경 (diameter) 및 14 cm의 층 높이 (bed height)를 갖는 칼럼을 이용하여 수행되었다. 도시된 데이터는 활성 생쥐 미닛 바이러스의 바이러스 역가이다.

실시예 4

Reo 타입 3 바이러스 첨가 (spikeing) 시에 높은 pH에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 rVWF의 정제.

칼럼 내로 채워진 UNOsphere S 수지는 1 CV의 2 M NaCl로 활성화되고 25 CV의 평형 완충액 (pH=9.0)으로 평형화되었다. 이후, 15 mS/cm의 전도도 및 9.0의 pH로 조정되고 다양한 비-외피 바이러스가 첨가 (spiking)된 rVWF 내포 용액은 대략 100 cm/h의 선형 유속 (linear flow rate)에서 칼럼 상에 적하되었다. 칼럼은 이후, 10 CV의 평형 완충액 (pH=9.0)으로 세척되고, 그리고 산물은 65 cm/h의 선형 유속에서 3.5 CV의 용리 완충액 (pH=7.5)으로 용리되었다. 적하 및 세척 국면 동안 증가된 pH는 수지에 대한 바이러스 입자의 결합을 유의미하게 감소시키지만 산물 VWF의 완전 결합을 유지시켰다. 결과로써, 대부분의 적하된 바이러스 입자는 높은 수율에서 용출액 풀 (eluate pool)에서 회수되는 산물로부터 분리된 비-결합 (관류) 및 세척 분획물 (fraction)에서 관찰되었다. 표 4에서 결과는 이러한 절차를 적용함으로써, 비-외피 모형 바이러스 생쥐 레오바이러스 타입 3 (REO-III)에서 2 로그 (log)의 바이러스 제거 능력이 달성될 수 있다는 것을 증명한다.

정제는 15 mm 직경 (diameter) 및 14 cm의 층 높이 (bed height)를 갖는 칼럼을 이용하여 수행되었다. 도시된 데이터는 활성 생쥐 레오바이러스 타입 III (REO-III)의 바이러스 역가이다.

실시예 5

기준 절차 (중성 pH)에 따른 UNOsphere S 상에서 rVWF의 정제

칼럼 내로 채워진 UNOsphere S 수지는 1 CV의 2 M NaCl로 활성화되고 25 CV의 평형 완충액 (pH=6.5)으로 평형화되었다. 이후, 15 mS/cm의 전도도 및 6.5의 pH로 조정되고 다양한 비-외피 바이러스가 첨가 (spiking)된 rVWF 내포 용액은 대략 100 cm/h의 선형 유속 (linear flow rate)에서 칼럼 상에 적하되었다. 칼럼은 이후, 10 CV의 평형 완충액 (pH=6.5)으로 세척되고, 그리고 산물은 65 cm/h의 선형 유속에서 3.5 CV의 용리 완충액 (pH=7.5)으로 용리되었다. 조사된 다양한 바이러스의 바이러스 역가는 상이한 크로마토그래피적 분획물 (적하, 칼럼 관류, 세척, 용출액, 포스트 용출액)에서 평가되고, 그리고 감소 인자가 계산되었다. 표 5에서 결과는 UNOsphere S 상에서 VWF에 대한 기준 정제 절차를 적용하면, 비-지질 외피 바이러스의 제거를 위한 확고한 크로마토그래피적 단계를 주장하기 위해 조사된 이들 상이한 모형 바이러스의 경우에, 비-외피 바이러스에 대한 제거 능력이 불충분하다는 것을 증명한다.

감소 속도는 대수 값 (logarithmic value)으로 표시된 용출액 분획물 내에 총 바이러스 하중 (total virus load)에 의해 나눗셈된, 적하 분획물 내에 총 바이러스 하중으로서 계산된다.

SEQUENCE LISTING <110> Mitterer, et al. <120> PURIFICATION OF VWF FOR INCREASED REMOVAL OF NON-LIPID ENVELOPED VIRUSES <130> 31315/44713A <150> 61/235,570 <151> 2009-08-20 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8833 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agctcacagc tattgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt 60 tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg 120 gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg 180 gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt 240 gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt 300 gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct 360 tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg 420 cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca 480 gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt 540 tgtcaatggt accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg 600 gctgtatcta gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt 660 ggccaggatc gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa 720 gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga 780 agggaccttg acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga 840 acagtggtgt gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat 900 gcagaagggc ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg 960 ccaccctctg gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg 1020 tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca 1080 ggagggaatg gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc 1140 tggtatggag tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat 1200 caatgaaatg tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct 1260 ggatgaaggc ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta 1320 ccctcccggc acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg 1380 gatctgcagc aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa 1440 gagctttgac aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga 1500 ttgccaggac cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga 1560 cgctgtgtgc acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa 1620 actgaagcat ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa 1680 aggtgacctc cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga 1740 cctgcagatg gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc 1800 cgggaagacc tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac 1860 cccctctggg ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg 1920 ggactgccag gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac 1980 caggttctcc gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg 2040 tgccgtcagc ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga 2100 cggccgcgag tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg 2160 cgtgcgcgtc gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt 2220 gtacctgcag tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga 2280 ggaatgcaat gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga 2340 gaggggggac tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca 2400 gccagaagac atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca 2460 ctgtaccatg agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct 2520 gtctcatcgc agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc 2580 cgctgacaac ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct 2640 ggagtgcatg agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca 2700 tgagaacaga tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc 2760 ccctggagaa acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa 2820 ctgcacagac catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac 2880 cttcgacggg ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta 2940 ctgcggcagt aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc 3000 ctcagtgaaa tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt 3060 tgacggggag gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga 3120 gtctggccgg tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca 3180 cctgagcatc tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg 3240 gaattttgat ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga 3300 ccctgtggac tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt 3360 gcctctggac tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga 3420 ttcctcctgt agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc 3480 cgagccatat ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg 3540 cgcctgcttc tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt 3600 ggtgacctgg aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga 3660 gaacgggtat gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg 3720 tcagcaccct gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg 3780 ccctccaggg aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc 3840 agtgtgtgag gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag 3900 tgaccctgag cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg 3960 ccaggagccg ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct 4020 gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga 4080 cctggtcttc ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa 4140 ggcctttgtg gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc 4200 cgtggtggag taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc 4260 gtcagagctg cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac 4320 cagcgaggtc ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc 4380 ctcccgcatc accctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt 4440 tgtccgctac gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg 4500 gccccatgcc aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc 4560 cttcgtgctg agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct 4620 ctgtgacctt gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac 4680 tgtgggcccg gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct 4740 ggatgtggcg ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag 4800 caaggagttc atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt 4860 cacggtgctg cagtactcct acatggtgac tgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc 4920 caaaggggac atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa 4980 cactgggctg gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg 5040 ggagcaggcg cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa 5100 gaggctgcct ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca 5160 ggagctggag aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct 5220 cccccgagag gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat 5280 ccccaccctc tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga 5340 tggctcctcc agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt 5400 catttcaaaa gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag 5460 catcaccacc attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct 5520 tgtggacgtc atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc 5580 tgtgcgatac ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt 5640 catcctggtc acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc 5700 caacagagtg acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg 5760 gatcttggca ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct 5820 ccctaccatg gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag 5880 gatttgcatg gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga 5940 ccagtgccac accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt 6000 caactgtgac cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga 6060 agagacctgt ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca 6120 catcgtgacc tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt 6180 tcaaaacaag gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc 6240 aaggcagggc tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca 6300 cagtgacatg gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa 6360 catggaagtc aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca 6420 catcttcaca ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt 6480 tgcttcaaag acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat 6540 gctgagggat ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca 6600 gcggccaggg cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc 6660 ccactgccag gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc 6720 cacattctat gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat 6780 cgcctcttat gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga 6840 tttctgtgct atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc 6900 ccggcactgt gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg 6960 ccctccagat aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg 7020 cattggtgag gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc 7080 ctgtcagatc tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc 7140 cacggccaaa gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga 7200 ccagtgctgc cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt 7260 gcctcactgt gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa 7320 cttcacctgc gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc 7380 gcaccgtttg cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa 7440 ctgtgtcaac tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaactg ccaccaatga 7500 ctgtggctgt accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat 7560 ctaccctgtg ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga 7620 ggatgccgtg atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg 7680 tcggtcgggc ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc 7740 tgcctgtgag gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt 7800 cggctcccag tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa 7860 ggaggaggtc tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg 7920 cccctcgggc tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga 7980 gcgcatggag gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat 8040 cgatgtgtgc acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct 8100 ggagtgcagg aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac 8160 aggtgaatgt tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca 8220 gatcatgaca ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa 8280 ggtcaatgag agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga 8340 tgaacacaag tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga 8400 cacatgtgag gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg 8460 aagctgtaag tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa 8520 agccatgtac tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac 8580 acggacggag cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga 8640 ggttctcaat gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt gaggctgctg 8700 cagctgcatg ggtgcctgct gctgcctgcc ttggcctgat ggccaggcca gagtgctgcc 8760 agtcctctgc atgttctgct cttgtgccct tctgagccca caataaaggc tgagctctta 8820 tcttgcaaaa ggc 8833 <210> 2 <211> 2813 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg 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Gly 865 870 875 880 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr 1235 1240 1245 Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser 1250 1255 1260 Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu 1265 1270 1275 Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe 1280 1285 1290 Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg 1295 1300 1305 Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 1310 1315 1320 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser 1325 1330 1335 Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln 1340 1345 1350 Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile 1355 1360 1365 Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu 1370 1375 1380 Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val 1385 1390 1395 Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro 1400 1405 1410 Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile 1415 1420 1425 Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val 1430 1435 1440 Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys 1445 1450 1455 Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met 1460 1465 1470 Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu 1475 1480 1485 Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu 1490 1495 1500 Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys 1505 1510 1515 Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp 1520 1525 1530 Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val 1535 1540 1545 Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 1550 1555 1560 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr 1565 1570 1575 Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser 1580 1585 1590 Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr 1595 1600 1605 Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile 1610 1615 1620 Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu 1625 1630 1635 Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp 1640 1645 1650 Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg 1655 1660 1665 Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1670 1675 1680 Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly 1685 1690 1695 Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe 1700 1705 1710 Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr 1715 1720 1725 Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val 1730 1735 1740 Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val 1745 1750 1755 Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala 1760 1765 1770 Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala 1775 1780 1785 Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val 1790 1795 1800 Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn 1805 1810 1815 Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala 1820 1825 1830 Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val 1835 1840 1845 Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu 1850 1855 1860 Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile 1865 1870 1875 Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp 1880 1885 1890 Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly 1895 1900 1905 Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu 1910 1915 1920 Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu 1925 1930 1935 Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser 1940 1945 1950 Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu 1955 1960 1965 Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp 1970 1975 1980 Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg 1985 1990 1995 Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser 2000 2005 2010 Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu 2015 2020 2025 Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr 2030 2035 2040 Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile 2045 2050 2055 Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser 2060 2065 2070 Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys 2075 2080 2085 Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val 2090 2095 2100 Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg 2105 2110 2115 Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val 2120 2125 2130 Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala 2135 2140 2145 Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys 2150 2155 2160 Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala 2165 2170 2175 Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp 2180 2185 2190 Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val 2195 2200 2205 Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn 2210 2215 2220 Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro 2225 2230 2235 Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala 2240 2245 2250 Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu 2255 2260 2265 Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys 2270 2275 2280 Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr 2285 2290 2295 Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg 2300 2305 2310 Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp 2315 2320 2325 Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly 2330 2335 2340 Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe 2345 2350 2355 Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro 2360 2365 2370 Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys 2375 2380 2385 Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val 2390 2395 2400 Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys 2405 2410 2415 Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His 2420 2425 2430 Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys 2435 2440 2445 Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu 2450 2455 2460 Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg 2465 2470 2475 Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2480 2485 2490 Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly 2495 2500 2505 Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser 2510 2515 2520 Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu 2525 2530 2535 Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu 2540 2545 2550 Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser 2555 2560 2565 Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met 2570 2575 2580 Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp 2585 2590 2595 Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser 2600 2605 2610 Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro 2615 2620 2625 Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2630 2635 2640 Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile 2645 2650 2655 Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr 2660 2665 2670 His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys 2675 2680 2685 Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala 2690 2695 2700 Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr 2705 2710 2715 Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr 2720 2725 2730 Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His 2735 2740 2745 Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp 2750 2755 2760 Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg 2765 2770 2775 Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val 2780 2785 2790 Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro 2795 2800 2805 Arg Lys Cys Ser Lys 2810 <210> 3 <211> 2050 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp 1 5 10 15 Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr 20 25 30 Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro 35 40 45 Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys 50 55 60 Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys 65 70 75 80 Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr 85 90 95 Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr 100 105 110 Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr 115 120 125 Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile 130 135 140 Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys 145 150 155 160 Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly 165 170 175 Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val 180 185 190 Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser 195 200 205 Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr 210 215 220 Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln 225 230 235 240 Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val 245 250 255 Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg 260 265 270 Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met 275 280 285 Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val 290 295 300 Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 305 310 315 320 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys 325 330 335 Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly 340 345 350 Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu 355 360 365 Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn 370 375 380 Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu 385 390 395 400 Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro 405 410 415 Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp 420 425 430 Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys 435 440 445 Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys 450 455 460 Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu 465 470 475 480 Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val 485 490 495 Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu 500 505 510 Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala 515 520 525 Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu 530 535 540 Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 545 550 555 560 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu 565 570 575 Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala 580 585 590 Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys 595 600 605 Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser 610 615 620 Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly 625 630 635 640 Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His 645 650 655 Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn 660 665 670 Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp 675 680 685 Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro 690 695 700 Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu 705 710 715 720 Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val 725 730 735 Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn 740 745 750 Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly 755 760 765 Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr 770 775 780 Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 785 790 795 800 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly 805 810 815 Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly 820 825 830 Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro 835 840 845 Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro 850 855 860 Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly 865 870 875 880 Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg 885 890 895 Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu 900 905 910 Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp 915 920 925 Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe 930 935 940 Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile 945 950 955 960 Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr 965 970 975 Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu 980 985 990 Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly 995 1000 1005 Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His 1010 1015 1020 Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr 1025 1030 1035 Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg 1040 1045 1050 Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr 1055 1060 1065 Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser 1070 1075 1080 Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val 1085 1090 1095 Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val 1100 1105 1110 Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp 1115 1120 1125 Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro 1130 1135 1140 Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg 1145 1150 1155 Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val 1160 1165 1170 Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr 1175 1180 1185 Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe 1190 1195 1200 Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu 1205 1210 1215 Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly 1220 1225 1230 Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala 1235 1240 1245 Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly 1250 1255 1260 Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn 1265 1270 1275 Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly 1280 1285 1290 His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln 1295 1300 1305 Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly 1310 1315 1320 Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly 1325 1330 1335 Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val 1340 1345 1350 Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys 1355 1360 1365 Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu 1370 1375 1380 Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala 1385 1390 1395 Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val 1400 1405 1410 Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val 1415 1420 1425 Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser 1430 1435 1440 Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp 1445 1450 1455 Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe 1460 1465 1470 Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu 1475 1480 1485 Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln 1490 1495 1500 Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys 1505 1510 1515 Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys 1520 1525 1530 Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg 1535 1540 1545 Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val 1550 1555 1560 Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu 1565 1570 1575 Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro 1580 1585 1590 Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser 1595 1600 1605 Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr 1610 1615 1620 Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser 1625 1630 1635 Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn 1640 1645 1650 Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys 1655 1660 1665 Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu 1670 1675 1680 Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met 1685 1690 1695 Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser 1700 1705 1710 Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys 1715 1720 1725 Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro 1730 1735 1740 Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp 1745 1750 1755 Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val 1760 1765 1770 Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln 1775 1780 1785 Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys 1790 1795 1800 Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala 1805 1810 1815 Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met 1820 1825 1830 Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val 1835 1840 1845 Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro 1850 1855 1860 Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys 1865 1870 1875 Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly 1880 1885 1890 Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys 1895 1900 1905 Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp 1910 1915 1920 Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys 1925 1930 1935 Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys 1940 1945 1950 Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu 1955 1960 1965 Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp 1970 1975 1980 Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser 1985 1990 1995 Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro 2000 2005 2010 Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly 2015 2020 2025 Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys 2030 2035 2040 Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys 2045 2050

Claims (15)

1. 하기 단계를 포함하는, 단백질-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법:
   단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계; 그리고
   양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계, 상기 제1 세척 완충액은 양이온 교환 수지에 적용되는 용액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.
2. 청구항 1에 있어서, 양이온 교환 수지에 적용되는 용액은 단백질의 등전점 보다 적어도 1 pH 단위 높은 것을 특징으로 하는 방법.
3. 하기 단계를 포함하는, 단백질-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법:
   상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계,
   양이온 교환 수지에 적용되는 용액의 pH보다 높은 pH에서 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; 그리고
   양이온 교환 수지를 제2 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계, 상기 첫 번째 용리액은 제1 세척 완충액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.
4. 청구항 3에 있어서, 제1 세척 완충액의 pH는 양이온 교환 수지에 적용되는 단백질의 등전점 보다 적어도 1 pH 단위 높은 것을 특징으로 하는 방법.
5. 하기 단계를 포함하는, 단백질-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법:
   단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계; 그리고
   양이온 교환 수지에 적용되는 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; 그리고
   양이온 교환 수지를 제2 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계, 상기 첫 번째 용리액은 제1 세척 완충액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.
6. 청구항 5에 있어서, 양이온 교환 수지에 적용되는 용액은 단백질의 등전점 보다 적어도 1 pH 단위 높은 것을 특징으로 하는 방법.
7. 청구항 5에 있어서, 제1 세척 완충액의 pH는 양이온 교환 수지에 적용되는 용액의 pH보다 적어도 1 pH 단위 높은 것을 특징으로 하는 방법.
8. 청구항 2, 4, 6 또는 7에 있어서, pH는 7.0보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
9. 청구항 1 내지 8중 어느 한 항에 있어서, 용액 내에 단백질은 적어도 대략 150 킬로달톤의 분자 질량을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 수지는 카르복시메틸 (CM), 설포알킬 (SP, SE), 셀룰로오스의 황산 에스테르, 헤파린 및 메틸설포네이트 (S)로 구성된 군에서 선택되는 음으로 하전된 기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 1 내지 10중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 혈액 응고 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 혈액 응고 단백질은 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 하기 단계를 포함하는, 폰 빌레브란트 (VWF)-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법:
    단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계; 그리고
    양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계, 상기 제1 세척 완충액은 양이온 교환 수지에 적용되는 용액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.
14. 하기 단계를 포함하는, VWF-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법:
    상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계,
    양이온 교환 수지에 적용되는 용액의 pH보다 높은 pH에서 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; 그리고
    양이온 교환 수지를 제2 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계, 상기 첫 번째 용리액은 제1 세척 완충액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.
15. 하기 단계를 포함하는, VWF-내포 용액으로부터 비-지질 외피 바이러스를 제거하는 방법:
    단백질의 등전점보다 높은 pH에서 상기 용액을 양이온 교환 수지에 적용하는 단계; 그리고
    양이온 교환 수지에 적용되는 단백질의 등전점보다 높은 pH에서 양이온 교환 수지를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; 그리고
    양이온 교환 수지를 제2 세척 완충액으로 세척하여 용출액을 형성하는 단계, 상기 첫 번째 용리액은 제1 세척 완충액과 동등하거나 이보다 낮은 pH를 갖는다.

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