KR20200144547A - 크로마토그래피 방법에 의한 vwf 및 vwf 프로펩타이드의 분리 - Google Patents

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KR20200144547A
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크리스찬 피들러
마인하르트 하슬라커
크리스타 메이어
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박스알타 인코퍼레이티드
박스앨타 게엠베하
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Abstract

본 발명은, 비공유적으로 회합된 mat-VWF 및 VWF-PP의 파괴에 의해 mat-VWF 및 VWF-PP의 해리를 유도하는 단계로서, 여기서, 상기 해리는 (i) 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하거나, (ii) 적어도 7의 pH로 pH를 증가시킴으로써 유도되는, 단계 및 상기 mat-VWF를 수집하여 고순도의 프로펩티드 고갈된 성숙한 VWF (mat-VWF)를 수득하는 단계를 포함하여, 조성물을 항온처리함으로써 폰 빌레브란트 인자 프로-펩티드 (VWF-PP)로부터 성숙한 폰 빌레브란트 인자 (mat-VWF)를 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

크로마토그래피 방법에 의한 VWF 및 VWF 프로펩타이드의 분리
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 3월 21일에 출원된 미국 가출원 제62/646,109호의 우선권을 주장하며, 상기 특허는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 폰 빌레브란트 인자 프로-펩티드 (VWF-PP)로부터 성숙한 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 분리하는 방법에 관한 것이다.
세포 내 단백질 성숙 과정에서, 성숙될 단백질은 해독 후 변형을 거친다. 이러한 변형은 그 중에서도 아세틸화, 메틸화, 글리코실화 및 단백질분해 절단을 포함한다. 이들 변형은 많은 경우에 단백질 기능 및 활성에 필요하고, 이들은 또한 단백질, 특히 효소의 효율에 영향을 미칠 수 있다.
전구단백질 또는 단백질 전구체는 이들 해독 후 변형 중 하나 이상에 의해, 특히, 전구단백질로부터 프로-펩티드의 절단에 의해 활성 형태로 전환되는 불활성 단백질이다.
이들 단백질의 활성 형태는 유용한 치료 및/또는 진단 단백질일 수 있다. 그러나, 활성 단백질은 일반적으로 살아 있는 유기체에서 매우 적은 양으로 이용 가능하다. 이와 같이, 활성 단백질은 바람직하게는 재조합 활성화 효소 (예를 들어, 프로테아제)와 접촉시킴으로써 시험관내에서 활성화되는 전구단백질로부터 재조합적으로 생성된다.
폰 빌레브란트 인자 (VWF)는 약 500 내지 20,000 kD 크기 범위의 일련의 다량체로서 혈장에서 순환하는 당단백질이다. VWF의 cDNA 전장이 클론되었다; 프로폴리펩티드는 전장 프리프로-VWF의 아미노산 잔기 23 내지 764에 해당한다 (Eikenboom et al (1995) Haemophilia, 1, 77-90). VWF의 다량체 형태는 디설파이드 결합에 의해 함께 연결된 250 kD 폴리펩티드 서브유닛으로 구성된다. VWF는 손상된 혈관 벽의 하부-내피로의 초기 혈소판 접착을 매개하며, 이때 더 큰 다량체는 향상된 지혈 활성을 나타낸다. 다량체화된 VWF는 VWF의 A1 도메인에서 상호작용을 통해 혈소판 표면 당단백질 Gp1bα에 결합하여 혈소판 부착을 용이하게 한다. VWF의 다른 부위는 혈관 벽으로의 결합을 매개한다. 따라서, VWF는 높은 전단 응력 조건 하에 혈소판 부착 및 1차 지혈에 필수적인 혈소판과 혈관 벽 사이에 브릿지를 형성한다. 일반적으로, 내피 세포는 큰 중합체 형태의 VWF를 분비하고, 저분자량을 갖는 이러한 형태의 VWF는 단백질분해 절단으로부터 발생한다. 특별히 큰 분자 질량의 다량체는 내피 세포의 바이벨-팔라데 소체 (Weibel-Pallade body)에 저장되고 작용제, 예컨대 트롬빈과 히스타민에 의한 자극시 유리된다.
산업적으로, VWF, 특히 재조합 VWF (rVWF)는 유전자 조작된 세포주, 예컨대 조작된 CHO 세포주에서 rFVIII와 함께 합성되고 발현된다. 공동-발현된 rVWF의 기능은 세포 배양 과정에서 rFVIII을 안정화시키는 것이다. rVWF는 성숙한 VWF (matVWF) 서브유닛의 N-말단에 부착된 큰 프로-펩티드 (VWF-PP)를 함유하는 프리-프로펩티드 VWF (프리프로-VWF)로서 세포에서 합성된다. 소포체 및 골지체 (Golgi apparatus)에서의 성숙시, VWF-PP는 세포 프로테아제 퓨린의 작용에 의해 절단되고, 발현된 단백질의 이량체로 이루어진 동일한 서브유닛의 단일중합체로서 분비된다. 일부 경우에, 퓨린 절단은 VWF 프로-펩티드와 비공유적으로 회합된 성숙한 VWF를 포함하는 이종이량체 복합체를 생성한다.
VWF-PP는 퓨린 또는 퓨린-유사 프로테아제를 사용한 시험관내 처리에 의해 성숙한 VWF로부터 분리될 수 있다 (Schlokat U. et al. (1996) Biotechnol. Appl. Biochem. 24:257-267; Preininger A. et al. (1999) Cytotechnology 30:1-15). 퓨린은 전구단백질 컨버타제 계열에 속하고, Ca2+에 의존한다. 이 효소는 위치 -1 및 -4에서 아르기닌을 포함하는 특정 서열 내에 아르기닌의 C-말단 펩티드 결합을 특이적으로 절단한다. 이 서열은 수많은 인간 단백질에서 발견될 수 있는데, 퓨린이 다수의 인간 프로-펩티드-단백질의 성숙에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 본 발명의 방법에 사용된 퓨린은 바람직하게는 재조합 기원이다. 재조합으로 생성된 프로테아제는 대량으로 생성될 수 있기 때문에 유리하게 사용된다. 일부 구현예에서, 퓨린은 상기 프로테아제 또는 세포 추출물을 분비하는 세포주의 조악한 세포 배양 상등액으로부터 수득된다.
현재의 통상적인 방법은 프리-프로펩티드 VWF를 액상의 프로테아제와 함께 항온처리하여 성숙 자체 (예를 들어, 전구단백질로부터 프로-펩티드의 절단)가 유리 용액에서 결합되지 않은 상태로 발생하거나, 예를 들어, WO2000/049047에 기재된 바와 같이, VWF-PP를 포함하는 제제와 접촉되고 이와 함께 항온처리되는 고체 담체 상에 프로테아제를 고정함으로써 (예를 들어, WO2000/049047 참조) 성숙한 VWF를 생성한다. VWF는, 대부분은 반복 도메인으로 이루어진 프리-프로펩티드 VWF ("프리프로-VWF")로서 내피 세포와 거대 핵세포에 의해 합성된다. 신호 펩티드의 절단시, 프리프로-VWF는 소포체의 카복시-말단 영역에서 디설파이드 연결을 통해 이량체화된다. 추가 디설파이드 연결은 서브유닛의 아미노-말단 근처에 형성되어 골지에서 다량체를 형성한다. 다량체로의 조립에 이어 프로-펩티드 처리 프로테아제 퓨린에 의해 VWF 프로-펩티드의 단백질분해 절단이 뒤따른다. 절단 후에, VWF 프로-펩티드는, 성숙한 VWF/VWF-PP 복합체를 형성하기 위해 VWF 다량체와 비공유적으로 회합된 상태로 남아 있다. 자극시, 복합체는 혈액 내로 분비되고, VWF 프로-펩티드는 VWF 다량체로부터 해리된다. 치료학적으로 유효한 성숙한 VWF 다량체는 포유류 세포주에서 프로-VWF를 재조합적으로 발현하고 일련의 시험관내 절단 및 정제 단계를 통해 프로-VWF 단백질을 성숙한 VWF로 처리함으로써 생성될 수 있다. 그러나, 고순도의 치료학적으로 유효한 성숙한 VWF 다량체 제제 (mat-rVWF)를 생성하기 위한 당업계의 요구가 남아 있고, 본 발명은 고순도의 mat-rVWF 제제를 수득하는 방법을 제공함으로써 이 요구를 충족시키고, 여기서, 상기 방법은 mat-rVWF로부터 VWF-프로펩티드의 분리를 용이하게 하기 위해, 예를 들어, 퓨린 성숙 후에, 킬레이트제를 첨가하고/하거나, 정제 공정 동안 적어도 7의 pH로 pH를 증가시킴을 포함한다.
본 발명은 고순도의 프로펩티드 고갈된 성숙한 재조합 rVWF (mat-rVWF)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF, 및 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액을 제공하는 단계;
b) a)에서 상기 용액 중 상기 mat-rVWF/rVWF-PP 복합체의 mat-rVWF 및 rVWF-PP로의 해리를 유도하고, 여기서, 상기 해리는 비공유적으로 회합된 mat-rVWF 및 rVWF-PP의 파괴에 의해 발생하고, 상기 해리는
i. 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하거나,
ii. 적어도 7의 pH로 pH를 증가시킴으로써 유도되는, 단계; 및
c) 상기 mat-rVWF를 수집하여 고순도의 mat-rVWF 조성물을 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 95%의 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 rVWF-PP를 포함하는, 단계.
일부 구현예에서, 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 96%의 mat-rVWF 및 4% 미만의 rVWF-PP, 적어도 97%의 mat-rVWF 및 3% 미만의 rVWF-PP, 적어도 98%의 mat-rVWF 및 2% 미만의 rVWF-PP, 적어도 99%의 mat-rVWF 및 1% 미만의 rVWF-PP, 또는 적어도 99.5%의 mat-rVWF 및 0.5% 미만의 rVWF-PP, 또는 99.9%의 mat-rVWF 및 0.1% 미만의 rVWF-PP를 포함한다.
일부 구현예에서, 용액은 세포 배양 배지, 항체 컬럼 유체-통과 용액, 및 완충 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 용액은 단계 a) 전에 퓨린으로 처리되었다.
일부 구현예에서, 용액은 항체 컬럼 유체-통과 용액이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제이다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, pH는 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0으로 증가된다. 일부 구현예에서, pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, pH는 염기성 아미노산, 트리스, NaOH, 트리신, 또는 에탄올아민의 첨가에 의해 증가된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법의 단계 b)에서 수집은 하나 이상의 단백질 분리 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 분리 방법은 이온 교환 크로마토그래피 (IEC), 크기-배제-크로마토그래피 (SEC), 막 기술에 의한 물리적 크기 분리, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단백질 분리 방법은 크기-배제-크로마토그래피 (SEC)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 분리 방법은 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)이다. 일부 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)는 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피의 조합이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 분리 방법은 완충액 시스템을 포함하고, 여기서, 상기 완충액 시스템은 하나 이상의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 완충액은 세척 완충액을 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 세척 완충액은 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 세척 완충액을 포함하고, 상기 하나 이상의 완충액이 5개의 세척 완충액을 포함하는 경우, 제1, 제2, 제3 및/또는 제5 세척 완충액은 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖고, 상기 하나 이상의 완충액이 4개의 세척 완충액을 포함하는 경우, 제1, 제2 및/또는 제4 세척 완충액은 제3 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 방법은 제1 세척 완충액 후 바이러스 불활성화 처리 단계를 추가로 포함하고, 임의로 바이러스 불활성화 처리 단계의 pH는 상기 제3 및/또는 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 분리 방법은 완충액 시스템을 포함하고, 여기서, 상기 완충액 시스템은 하나 이상의 로딩 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 로딩 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 로딩 완충액은 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 분리 방법은 완충액 시스템을 포함하고, 여기서, 상기 완충액 시스템은 하나 이상의 로딩, 세척 및/또는 용출 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 로딩, 세척 및/또는 용출 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 로딩, 세척 및/또는 용출 완충액은 적어도 7의 pH를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 로딩, 세척 및/또는 용출 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 완충 시스템은 글리신 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), 히스티딘, 이미다졸, 시트르산 아세테이트, MES, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 완충액은 하나 이상의 1가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 1가 양이온은 Na+, K+, Li+, 및 Cs+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1가 양이온은 Na+이다.
일부 구현예에서, 완충액은 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온은 Cl-, 아세테이트-, SO4 2-, Br-, 및 시트레이트3-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 완충액 시스템은 25℃에서 ≥0.5 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 25℃에서 15.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 완충액은 하나 이상의 비이온성 세제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Triton X100, Tween 80, 및 Tween 20으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 완충액은 비-환원 당, 당 알코올, 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 물질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 고순도의 mat-rVWF 조성물은 ≤ 2.0%의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 고순도의 mat-rVWF 조성물은 ≤ 0.6%의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준을 포함한다.
일부 구현예에서, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF, 및 rVWF-PP를 포함하는 용액은 rVWF에 대한 포획 단계로부터 유도된다.
일부 구현예에서, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF, 및 rVWF-PP를 포함하는 용액은 FVIII 면역친화성 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법으로부터 유도된다.
본 발명은 또한 고순도의 프로펩티드 고갈된 성숙한 재조합 rVWF (고순도의 mat-rVWF)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액을 음이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서, 상기 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF는 상기 음이온 교환 컬럼에 결합되는, 단계;
b) 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 a)에서의 상기 음이온 교환 컬럼을 하나 이상의 세척 완충액으로 세척하는 단계;
c) 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 b)에서의 상기 컬럼을 퓨린으로 처리하는 단계로서, 여기서, 상기 퓨린은 상기 프로-rVWF를 mat-rVWF와 rVWF-PP로 절단하는, 단계;
d) c)에서의 컬럼으로부터 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 용출 완충액을 사용하여 용출시키는 단계로서, 여기서, 상기 용출 완충액은 상기 rVWF-PP와 비공유적으로 회합된 mat-rVWF로부터 상기 rVWF-PP의 해리를 유도하고, 상기 해리는
i. 상기 용출 완충액에 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하거나,
ii. 상기 용출 완충액의 pH를 적어도 7의 pH로 증가시킴으로써 유도되는, 단계; 및
e) 상기 rVWF-PP와 별도로 상기 mat-rVWF를 수집하여 고순도의 mat-rVWF 조성물을 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 95%의 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 rVWF-PP를 포함하는, 단계.
일부 구현예에서, a) 및 b)는 단일 단계로 동시에 발생한다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 완충액은 세척 완충액을 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 세척 완충액은 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 세척 완충액을 포함하고, 상기 하나 이상의 완충액이 5개의 세척 완충액을 포함하는 경우, 제1, 제2, 제3 및/또는 제5 세척 완충액은 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖고, 상기 하나 이상의 완충액이 4개의 세척 완충액을 포함하는 경우, 제1, 제2 및/또는 제4 세척 완충액은 제3 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 방법은 제1 세척 완충액 후 바이러스 불활성화 처리 단계를 추가로 포함하고, 임의로 바이러스 불활성화 처리 단계의 pH는 상기 제3 및/또는 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, a)에서 용액은 모노클로날 항체 컬럼으로부터 유동 통과물을 포함하고, 여기서, 상기 모노클로날 항체는 FVIII 모노클로날 항체이다.
일부 구현예에서, a)에서 용액은 세포 배양 배지, 항체 컬럼 유체-통과 용액, 및 완충 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제이다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, pH는 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가된다. 일부 구현예에서, pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, b)에서 하나 이상의 세척 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, b)에서 하나 이상의 세척 완충액은 적어도 7의 pH를 나타낸다. 일부 구현예에서, b)에서 하나 이상의 세척 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 방법은 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 바이러스 불활성화는 세척 단계 및/또는 용출 단계 전에, 후에, 또는 이와 동시에, 그러나 수집 단계 전에 발생한다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리는 지질 외피 바이러스를 불활성화시킨다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리는 용매 및 세제 (S/D) 처리이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 글리신 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), 히스티딘, 이미다졸, 시트르산 아세테이트, MES, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 1가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 1가 양이온은 Na+, K+, Li+, 및 Cs+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1가 양이온은 Na+이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온은 Cl-, 아세테이트-, SO4 2-, Br-, 및 시트레이트3-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 ≥0.5 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 15.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 비이온성 세제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Triton X100, Tween 80, 및 Tween 20으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 완충액은 비-환원 당, 당 알코올, 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 물질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 고순도의 mat-rVWF 조성물은 ≤ 2.0%의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 고순도의 mat-rVWF 조성물은 ≤ 0.6%의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준을 포함한다.
일부 구현예에서, 고순도의 mat-rVWF 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 사용된다.
본 발명은 추가로 선행 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 고순도의 mat-rVWF 및 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스, 5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl을 포함하고, 여기서, 상기 조성물은 약 pH 7.4의 pH를 갖는다.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 구현예는 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 실시예 1에 나타낸 양이온 교환기에서 성숙된 rVWF의 정제를 나타낸다.
도 2는 정제 결과의 표를 제공한다.
도 3은 실시예 1의 방법에 의한 mat-VWF 및 r-VWF 프로펩티드 (rVWF-PP)의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔 및 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 4는 실시예 2 및 3에 대한 실험 설정의 흐름도를 나타낸다.
도 5는 실시예 2에 대한 크로마토그램 및 실시예 2 및 3에 사용된 크로마토그래피 도식을 나타낸다.
도 6은 실시예 2에 사용된 시약의 표 및 실시예 2에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 7은 실시예 2에 대한 또 다른 크로마토그램 및 실시예 3에 대한 결과의 표를 나타낸다.
도 8은 실시예 2 및 실시예 3의 방법에 의한 mat-rVWF 및 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔을 나타낸다.
도 9는 실시예 2 및 실시예 3의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 10은 실시예 4에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 11은 실시예 4에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 12는 실시예 4의 방법에 의한 mat-rVWF 및 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔 및 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 13은 실시예 5에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 14는 실시예 5에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 15는 실시예 6에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 16은 실시예 6에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 17은 실시예 7에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 18은 실시예 7에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 19는 실시예 8에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 20은 실시예 8에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 21은 실시예 8의 방법에 의한 mat-rVWF 및 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔을 나타낸다.
도 22는 실시예 8의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 1% 아가로즈 겔은 생성물의 다량체 패턴을 나타낸다.
도 23은 실시예 8의 방법에 의한 mat-rVWF 및 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 24는 실시예 9에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 25는 실시예 9에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 26은 실시예 9에 대한 생성물의 표를 제공한다.
도 27은 실시예 9의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔을 나타낸다.
도 28은 실시예 9의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 1% 아가로스 겔은 생성물의 다량체 패턴을 나타낸다.
도 29는 실시예 9의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 30은 실시예 1, 2, 3, 6, 8, 및 9에 사용된 바와 같이 향상된 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 대해 수득된 분획 함유 생성물의 순도를 나타낸다.
도 31은 실시예 1, 2, 3, 6, 8, 및 9에 대한 생성물 관련된 불순물의 고갈 인자를 나타낸다.
도 32는 실시예 4 및 5에 사용된 바와 같이 향상된 크기-배제-크로마토그래피 (SEC)를 위해 수득된 생성물 함유 분획의 순도를 나타낸다.
도 33은 실시예 4 및 5에 대한 생성물 관련된 불순물의 고갈 인자를 나타낸다.
도 34는 TMAE 분리 방법에서 사용된 완충액 제형 및 재료를 나타낸다.
도 35는 퓨린-처리된 성숙한 VWF/VWF-프로펩티드 복합체에 대한 로딩 조건을 나타낸다.
도 36은 크로마토그래피 방법의 완충액, 조건, 매개변수, 및 유량의 세부사항을 나타낸다.
도 37은 퓨린-처리된 성숙한 VWF/VWF-프로펩티드 복합체의 성숙한 VWF 및 VWF-프로펩티드 (VWF-PP)로의 해리의 크로마토그램을 나타낸다. 이는 성숙한 VWF를 함유하는 분획으로부터 VWF-PP의 고갈을 나타낸다.
도 38은 성숙한 VWF 및 VWF-프로펩티드 (VWF-PP)의 분리의 또 다른 크로마토그램을 나타낸다. 이는 성숙한 VWF를 함유하는 분획으로부터 VWF-PP의 고갈을 나타낸다.
도 39a 및 도 39b는 성숙한 VWF 및 VWF-PP의 분리를 포함하는 성숙한 VWF의 정제를 위한 예시적인 방법의 개략도를 제공한다.
도 40은 본원에 기재된 양이온 교환 크로마토그래피 방법의 이점 중 일부를 강조하는 표를 제공한다.
도 41은 SQA 진행 (running) 완충액, 또는 시트레이트를 함유하는 SQC 진행 완충액을 사용하여 본원에 기재된 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 rVWF 프로펩티드의 분리를 나타내는 2개의 크로마토그램의 개략도를 나타낸다. SEC 매개변수 (SEC 완충액)에서의 변화는 잔류 VWF-PP의 증가된 제거/분리 이외에 성숙한 VWF의 정제에서의 변화를 초래하지 않았다.
도 42는 최적화된 SEC 완충액 (SQC 완충액)의 이점 중 일부를 강조하는 표를 제공한다. SQC 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하고, 정제된 성숙한 VWF 분획에서 VWF-PP의 양을 감소시키는 것으로 나타났다.
도 43a 및 43b는 rVWF에 대한 다운스트림 처리 프로토콜의 흐름도를 제공한다. 도 43a는 현재 사용되는 공정을 나타낸다. 도 43b는 개선된 CAT (UNO_S) 단계를 포함하는 본원에 기재된 공정을 나타낸다.
도 44는 제1 생성 (Gen 1) 공정 및 제2 생성 (Gen 2) 공정에서 단계 CAT의 크로마토그래피 하드웨어의 표를 제공한다.
도 45는 Gen 2 공정의 세척 및 용출 조건의 표를 도시한다.
도 46은 UNO_Sphere S에 대한 제1 및 제2 생성 rVWF 소규모 연마 단계(단계 CAT)의 비교 표를 나타낸다.
도 47은 UNO_Sphere S 컬럼에 대한 세척 및 살균 절차의 표를 도시한다.
도 48은 CAT 연마 단계를 위한 완충액의 조성물의 표를 도시한다.
도 49a 및 도 49b는 진행 VW_USS_05의 크로마토그램을 나타낸다. 도 49a는 CIP 절차를 포함하는 전체 크로마토그램을 나타낸다. 도 49b는 36% 완충액 B 세척 및 구배 용출 단계를 도시한다. UV 흡수는 청색 (280 nm)과 마젠타색 (254 nm)으로 나타낸다.
도 50은 SDS-PAGE 은 염색 겔 및 진행 VW_UUS_05의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 51은 진행 VW_UUS_05의 다량체 아가로스 겔을 도시한다.
도 52는 상이한 연구 진행의 rVWF:Ag 데이터를 나타낸다.
도 53은 상이한 연구 진행의 rVWF Risto Co 활성 데이터를 나타낸다.
도 54는 상이한 연구 진행의 프로-펩티드 농도 (프로-펩티드 (μg/mg rVWF:Ag)) 데이터를 나타낸다.
도 55는 상이한 연구 진행의 프로-펩티드 농도 (프로-펩티드 (μg PP/1000 U Risto)) 데이터를 나타낸다.
도 56은 상이한 연구 진행의 용출액 풀 (pool)에서 주요 분석 결과를 나타낸다.
도 57은 성공적인 방법 개발을 위한 표적 CAT-E 기준을 나타낸다.
도 58은 mat-rVWF 및 rVWF-PP의 분리에서 사용을 위한 음이온 교환, 양이온 교환, 및 크기 배제 크로마토그래피 방법의 예시적인 구현예를 제공한다.
도 59는 다양한 VWF 형태: 프로-VWF (프로-rVWF로도 지칭함), matVWF/VWF-PP 복합체 (mat-rVWF/VWF-PP 복합체로도 지칭함), matVWF (mat-rVWF로도 지칭함), 및 VWF-PP (rVWF-PP로도 지칭함)를 나타낸다.
도 60은 VWF 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 61은 분석을 위한 DF3338/042 웨스턴 블롯 및 원 데이터 (raw data)를 나타낸다.
도 62는 분석을 위한 DF3362/023 웨스턴 블롯 및 원 데이터를 나타낸다.
도 63은 도 61 및 도 62로부터 데이터의 비교를 나타낸다.
도 64는 활성 FVIII가 VWF 모티프 (VWF 764 내지 1336 - FVIII 중쇄 24 내지 760 - VWF 2218 내지 2593 - FVIII 경쇄 1333 내지 2351- VWF 2620 내지 2813)에 매립되는 예시적인 VWF - FVIII 융합 단백질에 대한 아미노산 서열을 나타닌다.
도 65는 n-글리코실화 풍부 도메인이 FVIII-B-도메인 (FVIII 중쇄 19 내지 760 - vWF 2218 내지 2593 - FVIII 경쇄 1333 내지 2351)을 대체하는 예시적인 VWF - FVIII 융합 단백질에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 66은 실시예 14에 기재된 변이체 vWF 정제 공정에 사용된 완충액 및 조성물의 표를 도시한다.
도 67은 진행 VW_USS_07의 크로마토그램 및 크로마토그램 개략도를 나타낸다.
도 68은 진행의 주요 분석 결과를 나타낸다.
도 69는 대표적인 진행의 SDS-PAGE 은 염색 겔을 나타낸다. 세척 단계 Wash 1, WSD, 및 Wash 2 동안 rvWF-프로펩티드의 고갈이 관찰되었다.
도 70은 실시예 15에 기재된 변이체 vWF 정제 공정에 사용된 완충액 및 조성물의 표를 도시한다. 이 예는 추가 시알릴화 (sialylation)를 시험하기 위해 퓨린 절단 후 r-VWF 폴리펩티드로부터 r-vWF 프로펩티드의 분리를 위한 대안적인 변형 구현예를 제공한다.
도 71은 진행 VW_USS_06의 크로마토그램 및 크로마토그램 개략도를 나타낸다.
도 72는 진행의 주요 분석 결과를 나타낸다.
도 73은 대표적인 진행의 SDS-PAGE 은 염색 겔을 나타낸다.
도 74는 실시예 16에 기재된 변이체 vWF 정제 공정에 사용된 완충액 및 조성물의 표를 도시한다.
도 75는 진행 VW_USS_08의 크로마토그램 및 크로마토그램 개략도를 나타낸다.
도 76은 수율 시알릴화를 포함하여 진행의 주요 분석 결과를 나타낸다.
도 77은 대표적인 진행의 SDS-PAGE 은 염색 겔 DFM07247을 나타낸다.
도 78은 VW_USS_06 및 VW_USS_08 진행으로부터 용출액의 시알릴화 프로파일을 도시한다.
I. 도입
본원에 기재된 방법은 성숙한 VWF 및 VWF 프로펩티드를 포함하는 비공유적으로 연결된 이종이량체 복합체로부터 해리된 성숙한 VWF 및 VWF 프로펩티드를 분리한다. 이러한 분리는 단백질 분리 방법에 대한 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하고/하거나 성숙한 VWF 및 VWF 프로펩티드를 포함하는 용액의 pH를 적어도 7.0으로 증가시킴으로써 용이하게 된다 (유도된다). 본원에 기재된 바와 같은 모든 향상된 음이온 교환 (AEX), 양이온 교환 (CEX) 및/또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 방법은 임의의 변형으로 조합되어 개선된 성질을 갖는 r-vWF를 수득할 수 있다.
II. 정의 선택
예를 들어, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 관하여 사용될 경우 용어 "재조합"은 이종성 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래된다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 그렇지 않으면 비정상적으로 발현되거나 저발현되거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
본원에 사용된 바와 같이, "재조합 VWF" 또는 "rVWF"는 재조합 DNA 기술을 통해 수득된 VWF를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 rVWF 단백질은, 예를 들어, 재조합 VWF를 생성하는 방법과 관련하여 본원에 참조로 포함된 US 8,597,910에 기재된 바와 같은 작제물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 VWF는 단량체 및 다량체 형태를 포함하는 모든 잠재적 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 조합하여 사용될 상이한 형태의 VWF를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 VWF는 상이한 다량체, 상이한 유도체 및 생물학적 활성 유도체와 생물학적 활성이 아닌 유도체 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 재조합 VWF는, 예를 들어, 포유류, 예컨대 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌, 개, 고양이 및 이의 생물학적 활성 유도체로부터 VWF 계열의 임의의 구성원을 포함한다. VWF 단백질의 기능성 단편 및 융합 단백질과 마찬가지로, 활성을 갖는 돌연변이체 및 변이체 VWF 단백질도 포함된다. 또한, 본 발명의 VWF는 정제, 검출 또는 둘 다를 용이하게 하는 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 VWF는 치료적 모이어티 또는 시험관내 또는 생체내 영상화에 적합한 모이어티로 추가로 변형될 수 있다.
용어 "VWF 다량체"는 적어도 10개 서브유닛, 또는 12, 14, 또는 16개 서브유닛, 내지 약 20, 22, 24 또는 26개 이상의 서브유닛을 포함하는 VWF를 지칭한다. 용어 "서브유닛"은 VWF의 단량체를 지칭한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 일반적으로, VWF의 이량체는 중합되어 더 큰 차수의 다량체를 형성한다 (예를 들어, 모든 목적, 특히 VWF의 다량체 분석에 관한 모든 교시에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost., 2010, 36(5): 510-521 참조)
용어 "프리-프로펩티드 VWF," "프리프로-VWF" 또는 "프로-VWF"는 약 22개 아미노산 잔기의 신호 펩티드, 약 741개 아미노산 잔기의 VWF 프로펩티드, 및 약 2050개 아미노산 잔기의 성숙한 VWF 서브유닛을 포함하는 비-성숙한 VWF 폴리펩티드를 지칭한다. 프로-VWF 서브유닛은 소포체에서 카복실 말단 근처에 디설파이드 결합을 통해 이량체화되어 테일-투-테일 (tail-to tail) 이량체를 형성하고 이어서 골지로 운반된다. 골지에서, 추가 헤드-투-헤드 (head-to-head) 디설파이드 결합은 서브유닛의 아미노-말단 근처에서 형성되어 다량체를 형성한다. VWF 프로펩티드의 단백질분해 절단은 프로테아제 퓨린 처리를 통해 발생하여 성숙한 VWF/VWF-PP 복합체를 생성한다. "r"이 VWF 지정 앞에 포함되는 경우, 이것은 재조합 버전을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 재조합 VWF (rVWF)에 적용된다.
용어 "VWF 복합체" 또는 "mat-VWF/VWF-PP 복합체"는 성숙한 VWF 서브유닛 및 VWF 프로펩티드를 포함하는 비공유적으로 연결된 이종이량체 구조를 지칭한다. VWF 복합체는 프로펩티드 부분과 프리-프로펩티드 VWF의 성숙한 VWF 부분 상이의 퓨린 절단의 생성물로서 생성될 수 있다. "r"이 VWF 지정 앞에 포함되는 경우, 이것은 재조합 버전을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 재조합 VWF (rVWF)에 적용된다.
용어 "성숙한 VWF" 또는 "mat-VWF"는 약 2050개 아미노산 잔기의 성숙한 VWF 서브유닛을 지칭한다. 성숙한 VWF 서브유닛은 프리-프로펩티드 VWF 또는 VWF 복합체의 일부일 수 있다. 성숙한 VWF는 VWF 프로펩티드로부터 분리 (단리)시 "유리 VWF"로 지칭될 수 있다. "r"이 VWF 지정 앞에 포함되는 경우, 이것은 재조합 버전을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 재조합 VWF (rVWF)에 적용된다.
용어 "VWF 프로펩티드" 또는 "VWF-PP"는 약 741개 아미노산 잔기의 VWF 프로펩티드를 지칭한다. VWF 프로펩티드는 프리-프로펩티드 VWF 또는 VWF 복합체의 일부일 수 있다. 예를 들어, VWF 복합체에서, VWF 프로펩티드는 성숙한 VWF 서브유닛과 비공유적으로 회합된다. VWF 프로펩티드는 성숙한 VWF로부터 분리 (단리)시 "유리 VWF 프로펩티드"로 지칭될 수 있다. "r"이 VWF 지정 앞에 포함되는 경우, 이것은 재조합 버전을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 재조합 VWF (rVWF)에 적용된다.
용어 "단리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태에서 발견되는 것과 같이 일반적으로 동반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 부재인 물질을 지칭한다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. VWF는 제제에 존재하는 우세한 종이 실질적으로 정제된다. 일부 구현예에서 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 대역을 생성함을 나타낸다. 다른 구현예에서, 이는 핵산 또는 단백질이 적어도 50% 순수이고, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 순수임을 의미한다. 다른 구현예에서 "정제하다" 또는 "정제"는 정제될 조성물로부터 적어도 하나의 오염물을 제거하는 것을 의미한다. 이러한 의미에서, 정제는 정제된 화합물이 균질할, 예를 들어, 100% 순수일 필요가 없다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 특정 값으로부터 ± 10%의 대략적인 범위를 나타낸다. 예를 들어, "약 20%"라는 용어는 18 내지 22%의 범위를 포함한다.
III. 구현예의 상세한 설명
본 발명은 하기 단계를 포함하여, 유리 성숙한 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 포함하는 고도로 순수한 조성물을 수득하는 방법에 관한 것이다: 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하거나 적어도 7의 pH를 갖는 용액 (예를 들어, 해리 용액)을 사용하여 rVWF 프로-펩티드로부터 성숙한 rVWF를 해리하는 단계; rVWF 프로-펩티드로부터 유리 성숙한 rVWF를 분리하는 단계; 및 적어도 95%의 유리 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 rVWF 프로-펩티드를 포함하는 유리 성숙한 rVWF 조성물을 수집하는 단계.
본 발명의 방법은 VWF 프로펩티드로부터 성숙한 VWF의 시험관내 분리에 특히 적합하다. 일부 구현예에서, 분리는 성숙한 VWF 및 VWF-PP를 포함하는 용액에 하나 이상의 킬레이트제를 첨가하거나, 용액의 pH를 적어도 7.0으로 증가시키거나, 이의 조합에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, pH는 pH 7.0 내지 pH 9.0의 범위로 증가된다.
분리 방법은 VWF-PP로부터 성숙한 VWF를 단리하기 위한 크로마토그래피 방법과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 단백질 분리 방법을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 고순도의 유리 성숙한 rVWF 조성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 유리 성숙한 rVWF 조성물은 적어도 95%의 유리 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 유리 rVWF-PP 및/또는 matVWF/VWF-PP 복합체를 포함한다. 일부 경우에, 유리 성숙한 rVWF 조성물은 적어도 96%의 유리 성숙한 rVWF 및 4% 미만의 유리 rVWF-PP 및/또는 matVWF/VWF-PP 복합체, 적어도 97%의 유리 성숙한 rVWF 및 3% 미만의 유리 rVWF-PP 및/또는 matVWF/VWF-PP 복합체, 적어도 98%의 유리 성숙한 rVWF 및 2% 미만의 유리 rVWF-PP 및/또는 matVWF/VWF-PP 복합체, 적어도 99%의 유리 성숙한 rVWF 및 1% 미만의 유리 rVWF-PP 및/또는 matVWF/VWF-PP 복합체, 적어도 99.5%의 유리 성숙한 rVWF 및 0.5% 미만의 유리 rVWF-PP 및/또는 matVWF/VWF-PP 복합체를 포함한다.
a. 음이온 교환 크로마토그래피 정제
본 방법의 한 양상에서, 성숙한 rVWF (mat-rVWF)는 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피를 사용하여 rVWF-PP로부터 분리된다. 일부 경우에, 잔류 숙주 세포 유래 불순물, 예컨대 CHO 숙주 세포 단백질, 공정 관련된 불순물, 예컨대 재조합 퓨린 및 저분자량 바이러스 불활성화 시약, 배지 화합물, 예컨대 대두 펩톤, 및 기타 생성물 관련된 불순물은 성숙한 VWF로부터 제거된다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 성숙한 rVWF는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 rVWF-PP, 예컨대 잔류 rVWF-PP 또는 유리 rVWF-PP로부터 분리된다. 분리를 위해, 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물은 낮은 pH 및 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있다. 로딩 조성물은 유동 통과물 모드로 작동하는 음이온 교환기에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 로딩 용액은 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온 교환기는 결합 모드로 작동되고, 성숙한 VWF 및 VWF-PP는 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하는 구배 용출 완충액을 사용하여 분리된다. 다른 구현예에서, 구배 용출 완충액은 중성 내지 높은 pH, 예컨대 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 구배 용출 완충액은 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 7.0 이상, 예를 들어, pH 7.0 내지 pH 9.0의 pH를 갖는다. 예를 들어, 구배 용출 완충액은 EDTA를 포함할 수 있고, 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 고순도의 프로펩티드 고갈된 성숙한 재조합 rVWF (고순도의 mat-rVWF)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액을 음이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서, 상기 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF는 상기 음이온 교환 컬럼에 결합되는, 단계; (b) 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 a)에서의 상기 음이온 교환 컬럼을 하나 이상의 세척 완충액으로 세척하는 단계; (c) 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 b)에서의 상기 컬럼을 퓨린으로 처리하는 단계로서, 여기서, 상기 퓨린은 상기 프로-rVWF를 mat-rVWF와 rVWF-PP로 절단하는, 단계; (d) c)에서의 컬럼으로부터 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 용출 완충액을 사용하여 용출시키는 단계로서, 여기서, 상기 용출 완충액은 상기 rVWF-PP와 비공유적으로 회합된 mat-rVWF로부터 상기 rVWF-PP의 해리를 유도하고, 상기 해리는 (i) 상기 용출 완충액에 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하거나, (ii) 상기 용출 완충액의 pH를 적어도 7의 pH로 증가시킴으로써 유도되는, 단계; 및 (e) 상기 rVWF-PP와 별도로 상기 mat-rVWF를 수집하여 고순도의 mat-rVWF 조성물을 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 95%의 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 rVWF-PP를 포함하는, 단계.
일부 구현예에서, a) 및 b)는 단일 단계로 동시에 발생한다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 면역친화성 정제 방법으로부터 유동 통과물을 포함한다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 모노클로날 항체 컬럼으로부터 유동 통과물을 포함하고, 여기서, 상기 모노클로날 항체는 FVIII 모노클로날 항체이다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 세포 배양 배지, 항체 컬럼 유체-통과 용액, 및 완충 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단계 (b)의 일부 구현예에서, 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 a)에서의 상기 음이온 교환 컬럼의 세척은 하나 이상의 세척 완충액을 사용한 세척을 사용하고, 여기서, 하나 이상의 세척 완충액은 1, 2, 3, 4 및/또는 5개의 세척 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 세척 완충액은 바이러스 불활성화를 위한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 4개 또는 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제2 세척 완충액은 바이러스 불활성화를 위한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 4개 또는 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제2 또는 제3 세척 완충액은 바이러스 불활성화 처리를 위한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리는 용매 및 세제 (S/D) 처리이다. 일부 구현예에서, 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 제3 및/또는 제5 세척 완충액은 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 제3 및 제5 세척 완충액은 약 pH 7 내지 pH 8의 pH를 갖고, 제4 세척 완충액은 약 pH 5 내지 6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 제3 및/또는 제5 세척 완충액은 약 pH 7.4 내지 pH 7.5의 pH를 갖고, 제4 세척 완충액은 약 pH 5.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리 단계는 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는 완충액을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 4개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 바이러스 불활성화 처리 단계는 제1 세척 완충액 후에 사용된다. 일부 구현예에서, 4개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 및 제4 세척 완충액은 제3 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리 단계는 제3 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는 완충액을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 단계는 제1, 제2 및/또는 제4 세척 완충액과 동일한 pH를 갖는 완충액을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 4개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 및 제4 세척 완충액은 약 pH 7 내지 약 pH 8의 pH를 갖고, 제3 세척 완충액은 약 pH 5 내지 약 pH 6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 4개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 및 제4 세척 완충액은 약 pH 7.4 내지 pH 7.5의 pH를 갖고, 제3 세척 완충액은 약 pH 5.5의 pH를 갖는다.
음이온 교환 크로마토그래피는 당업자에 의해 인식된 바와 같이 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 음이온 교환기는 STREAMLINE Q XLTM, POROS 50 PITM, Q SEPHAROSETM, EmphaseTM AEX 하이브리드 정제기 (Hybrid Purifier), Nuvia Q, POROS 50 HQ, Capto Q, Capto Q impress, Unosphere Q, Q 세라믹 HYPERD® F, TOYOPEARL® Q, TOYOPEARL® Super Q, 혼합 모드 AEX 수지 (예를 들어, Capto Adhere, Capto adhere impress, 또는 MEP Hypercell)뿐만 아니라 임의의 DEAE, TMAE, 3급 또는 4급 아민, 또는 PEI-기반 수지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 음이온 교환기는 막 음이온 교환기이다. 일부 구현예에서, 막 음이온 교환기는 Sartobind Q®, Sartobind STIC® PA, Mustang Q®, 또는 ChromaSorb®를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 음이온 교환기는 Fractogel TMAE 컬럼 (Merck - Millipore) 또는 이의 등가물이다.
일부 구현예에서, 프로-VWF의 로딩 농도는 약 90 IU/ml 내지 약 270 IU/ml 수지, 예를 들어, 약 90 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 100 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 150 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 200 IU/ml-약 250 IU/ml, 또는 약 250 IU/ml-약 270 IU/ml 수지이다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 방법은 완충액 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 하나 이상의 용출 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 하나 이상의 세척 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 적어도 하나의 용출 완충액 및 적어도 하나의 세척 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 적어도 2개의 용출 완충액 및 적어도 2개의 세척 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 로딩 농도는 약 90 IU/ml 내지 약 270 IU/ml 수지, 예를 들어, 약 90 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 150 IU/m-약 200 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 100 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 150 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 200 IU/ml-약 250 IU/ml, 또는 약 250 IU/ml-약 270 IU/ml 수지이다.
일부 구현예에서, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, 또는 pH 9.0이다.
일부 구현예에서, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다.
일부 구현예에서, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물은 시트르산 나트륨, 예컨대 그러나 이에 제한되지 않는 10 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 55 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨, 65 mM 시트르산 나트륨, 70 mM 시트르산 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, 80 mM 시트르산 나트륨 등을 포함하는 완충액으로 희석된다.
일부 구현예에서, 제1 세척 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하고, 임의로 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 세척 완충액은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖고, 임의로 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 세척 완충액은 pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 세척 완충액은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 세척 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있고, pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖는다. 일 구현예에서, 제2 세척 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 세척 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액은 120 mM 내지 200 mM, 130 mM 내지 200 mM, 140 mM 내지 200 mM, 150 mM 내지 200 mM, 120 mM 내지 190 mM, 130 mM 내지 190 mM, 140 mM 내지 190 mM, 150 mM 내지 190 mM, 120 mM 내지 180 mM, 130 mM 내지 180 mM, 140 mM 내지 180 mM, 150 mM 내지 180 mM, 120 mM, 125 mM, 130 mM, 135 mM, 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM, 또는 200 mM의 NaCl 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 성숙한 VWF 및 VWF-PP를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물을 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하는 완충액과 접촉시키고, 임의로 완충액은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물을 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는 완충액과 접촉시키고, 임의로 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 세척 완충액이다. 일부 구현예에서, 완충액은 용출 완충액이다. 일부 구현예에서, 완충액은 6.0 내지 6.9의 pH를 갖는 세척 완충액이다. 일부 구현예에서, 완충액은 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 용출 완충액이다. 일부 구현예에서, 성숙한 VWF 및 VWF-PP를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물을 첫 번째로 6.0 내지 6.9의 pH를 갖는 세척 완충액과 접촉시키고, 두 번째로 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 적어도 하나의 용출 완충액과 접촉시킨다.
일부 구현예에서, 성숙한 VWF는 하나의 용출 완충액을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 용출된다. 일부 구현예에서, 성숙한 VWF는 하나 초과의 용출 완충액을 포함하는 구배 용출 방법을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 용출된다. 예를 들어, 용출은 2개의 용출 완충액, 예를 들어, 제1 용출 완충액 및 제2 용출 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하고, 임의로 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖고, 임의로 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 용출 완충액은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있고, pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖는다. 일 구현예에서, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 세척 완충액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, pH 9.0이다. 일부 구현예에서, 이는 2개의 용출 완충액, 예를 들어, 제1 및 제2 용출 완충액이 존재하는 경우를 포함한다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 용출 완충액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, pH 9.0이다. 일부 구현예에서, 이는 2개의 용출 완충액, 예를 들어, 제1 및 제2 용출 완충액이 존재하는 경우를 포함한다.
일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 단계 a)에서 출발 용액에 비해 증가되고/되거나, 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우 제1 용출 완충액에 비해 증가되고/되거나, 세척 완충액이 사용되는 경우 세척 완충액에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 하나의 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 나머지 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 및 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 및 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 둘 다는 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 제1 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 세척 완충액 및 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 및/또는 용출 완충액의 pH는 상기 방법의 단계 (a)에서 언급된 바와 같이, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 로딩 용액에 비해 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 단계 (a)에서 용액 중 mat-rVWF/rVWF-PP 복합체의 mat-rVWF 및 rVWF-PP로의 해리를 유도하기 위해, 완충액의 pH는 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가되고, 여기서, 상기 해리는 비공유적으로 회합된 mat-rVWF 및 rVWF-PP의 파괴에 의해 발생한다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액에서의 pH는 적어도 7로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액은 적어도 7의 pH를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액 (세척 및/또는 용출 완충액을 포함함)은 하나 이상의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제이다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 NTA, DTPA, EDDS, EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 NTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 DTPA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EDDS이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EDTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EGTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 CDTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 시트레이트이다. 일부 구현예에서, b)에서 하나 이상의 세척 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액 (세척 및/또는 용출 완충액을 포함함)은 10 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 55 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨, 65 mM 시트르산 나트륨, 70 mM 시트르산 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, 80 mM 시트르산 나트륨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 범위로 시트르산 나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 10 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-50 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-50 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 범위로 시트르산 나트륨을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 용출 완충액은 시트르산 나트륨, 예컨대 그러나 이에 제한되지 않는 10 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-50 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-50 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨 등을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계의 용출 완충액 A 및/또는 용출 완충액 B는 약 0.5 mM 내지 약 20 mM EDTA, 예를 들어, 약 0.5 mM-약 20 mM, 약 1 mM-약 20 mM, 약 1.5 mM-약 20 mM, 약 2 mM-약 20 mM, 약 3 mM-약 20 mM, 약 5 mM-약 20 mM, 약 0.5 mM-약 15 mM, 약 1 mM-약 10 mM, 약 1 mM-약 5 mM, 약 5 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 시트레이트는 음이온 교환 방법을 사용하여 rVWF-프로펩티드를 제거한 후 용리액에서 발견할 수 있다. 일부 구현예에서, 시트레이트는 단계적 음이온 교환 용출 방법을 사용하여 rVWF-프로펩티드를 제거한 후 용리액에서 발견할 수 있다. 일부 구현예에서, 시트레이트는 구배 음이온 교환 용출 방법을 사용하여 rVWF-프로펩티드를 제거한 후 용리액에서 발견할 수 있다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 반대-이온은 시트레이트이다3-.
본원에 기재된 임의의 완충액 (완충액 시스템)은 단일 완충액으로서 또는 2개 이상의 완충액의 조합으로서 글리신, HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), 히스티딘, 이미다졸, 시트르산 아세테이트, 시트레이트, 아세테이트, MES, 포스페이트, 트리스HCl, 비스-트리스 (Bis-Tris), 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌HCl, 리신HCl, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충액은 글리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄)을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 이미다졸을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 시트르산 아세테이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 시트레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아세테이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 MES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 포스페이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 비스-트리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 이미다졸을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌 HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 리신HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 본원에 열거된 완충액 중 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 글리신 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), 히스티딘, 이미다졸, 시트르산 아세테이트, MES, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 ≥0.5 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 20.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 17.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 15.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 12.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 10.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 5.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 25℃에서 2.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법의 하나 이상의 세척 단계의 유량은 약 10 cm/h 내지 약 200 cm/h, 예를 들어, 약 10 cm/h, 약 15 cm/h, 약 20 cm/h, 약 25 cm/h, 약 30 cm/h, 약 35 cm/h, 약 40 cm/h, 약 45 cm/h, 약 50 cm/h, 약 55 cm/h, 약 60 cm/h, 약 65 cm/h, 약 70 cm/h, 약 75 cm/h, 약 80 cm/h, 약 85 cm/h, 약 90 cm/h, 약 95 cm/h, 약 100 cm/h, 약 105 cm/h, 약 110 cm/h, 약 115 cm/h, 약 120 cm/h, 약 125 cm/h, 약 130 cm/h, 약 135 cm/h, 약 140 cm/h, 약 145 cm/h, 약 150 cm/h, 약 155 cm/h, 약 160 cm/h, 약 165 cm/h, 약 170 cm/h, 약 175 cm/h, 약 180 cm/h, 약 185 cm/h, 약 190 cm/h, 약 195 cm/h, 또는 약 200 cm/h이다. 수지에 따라, 일부 구현예에서, 유량은 최대 600 cm/h일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법의 하나 이상의 용출 단계의 유량은 약 10 cm/h 내지 약 200 cm/h, 예를 들어, 약 10 cm/h, 약 15 cm/h, 약 20 cm/h, 약 25 cm/h, 약 30 cm/h, 약 35 cm/h, 약 40 cm/h, 약 45 cm/h, 약 50 cm/h, 약 55 cm/h, 약 60 cm/h, 약 65 cm/h, 약 70 cm/h, 약 75 cm/h, 약 80 cm/h, 약 85 cm/h, 약 90 cm/h, 약 95 cm/h, 약 100 cm/h, 약 105 cm/h, 약 110 cm/h, 약 115 cm/h, 약 120 cm/h, 약 125 cm/h, 약 130 cm/h, 약 135 cm/h, 약 140 cm/h, 약 145 cm/h, 약 150 cm/h, 약 155 cm/h, 약 160 cm/h, 약 165 cm/h, 약 170 cm/h, 약 175 cm/h, 약 180 cm/h, 약 185 cm/h, 약 190 cm/h, 약 195 cm/h, 또는 약 200 cm/h이다. 수지에 따라, 일부 구현예에서, 유량은 최대 600 cm/h일 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 비이온성 세제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Triton X-100, Tween 80, 및 Tween 20으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Triton X-100이다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Tween 80이다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Tween 20이다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 완충액은 비-환원 당, 당 알코올, 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 물질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 비-환원 당을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비-환원 당은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨 및/또는 크실리톨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 당 알코올을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 폴리올을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 당 알코올 또는 폴리올은 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소르비톨 및/또는 글리세롤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 완충액은 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 1,2,3-프로판트리올), 메소-에리트리톨 및/또는 에리트리톨 (메소-1,2,3,4-부탄테트롤)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 완충액은 하나 이상의 1가 양이온을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 1가 양이온은 Na+, K+, Li+, Cs+, 및 NH4 +로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 1가 양이온은 Na+일 수 있다. 다른 구현예에서, 완충액은 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온을 포함한다. 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온은 Cl-, 아세테이트-, SO4 2-, Br-, 시트레이트3-, PO4 3-, 및 BO3 3-으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충액은 비-환원 당 및 당 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 1가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 1가 양이온은 Na+, K+, Li+, 및 Cs+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1가 양이온은 Na+이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온은 Cl-, 아세테이트-, SO4 2-, Br-, 및 시트레이트3-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 완충액의 pH는 아미노산, 트리스, NaOH, 에탄올아민 등을 첨가하여 조정 (증가)될 수 있다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 방법 완충액 킬레이트제 조합은 시트레이트, 말레이트 (말산), 및 타르트레이트 (타르타르산)을 포함한다.
b. 양이온 교환 크로마토그래피 정제
본 방법의 일 양상에서, 성숙한 VWF(matVWF)는 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피를 사용하여 VWF-PP로부터 분리된다. 일부 경우에, 잔류 숙주 세포 유래 불순물, 예컨대 CHO 숙주 세포 단백질, 공정 관련된 불순물, 예컨대 재조합 퓨린 및 저분자량 바이러스 불활성화 시약, 배지 화합물, 예컨대 대두 펩톤, 및 기타 생성물 관련된 불순물은 성숙한 VWF로부터 제거된다.
본 방법의 또 다른 양상에서, 성숙한 VWF는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 VWF-PP, 예컨대 잔류 VWF-PP 또는 유리 VWF-PP로부터 분리된다. 분리를 위해, 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물은 낮은 pH 및 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물은 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온 교환기는 결합 모드로 작동되고, 성숙한 VWF 및 VWF-PP는 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하는 구배 용출 완충액을 사용하여 분리된다. 다른 구현예에서, 구배 용출 완충액은 중성 내지 높은 pH, 예컨대 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 구배 용출 완충액은 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 7.0 이상의 pH, 예를 들어, pH 7.0 내지 pH 9.0을 갖는다. 예를 들어, 구배 용출 완충액은 EDTA를 포함할 수 있고, 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 고순도의 프로펩티드 고갈된 성숙한 재조합 rVWF (고순도의 mat-rVWF)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액을 양이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서, 상기 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF는 상기 양이온 교환 컬럼에 결합되는, 단계; (b) 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 a)에서의 상기 양이온 교환 컬럼을 하나 이상의 세척 완충액으로 세척하는 단계; (c) 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 b)에서의 상기 컬럼을 퓨린으로 처리하는 단계로서, 여기서, 상기 퓨린은 상기 프로-rVWF를 mat-rVWF와 rVWF-PP로 절단하는, 단계; (d) c)에서의 컬럼으로부터 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 용출 완충액을 사용하여 용출시키는 단계로서, 여기서, 상기 용출 완충액은 상기 rVWF-PP와 비공유적으로 회합된 mat-rVWF로부터 상기 rVWF-PP의 해리를 유도하고, 상기 해리는 (i) 상기 용출 완충액에 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하거나, (ii) 상기 용출 완충액의 pH를 적어도 7의 pH로 증가시킴으로써 유도되는, 단계; 및 (e) 상기 rVWF-PP와 별도로 상기 mat-rVWF를 수집하여 고순도의 mat-rVWF 조성물을 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 95%의 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 rVWF-PP를 포함하는, 단계.
일부 구현예에서, a) 및 b)는 단일 단계로 동시에 발생한다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 면역친화성 정제 방법으로부터 유동 통과물을 포함한다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 모노클로날 항체 컬럼으로부터 유동 통과물을 포함하고, 여기서, 상기 모노클로날 항체는 FVIII 모노클로날 항체이다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 세포 배양 배지, 항체 컬럼 유체-통과 용액, 및 완충 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
양이온 교환기는 결합 모드로 작동하여 성숙한 VWF 및 VWF-PP를 분리할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 당업자에 의해 인식된 바와 같이 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온 교환기는 POROS® S (Applied Biosystems), 대류 상호작용 매질 (Convective Interaction Media) (CIM®; BIA 분리), Toyopearl Gigacap S (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA), Toyopearl Gigacap CM (Tosoh), Toyopearl SP (Tosoha), Toyopearl CM (Tosoh), MacroPrep S (Bio-rad, Hercules, CA), UNOsphereS (Bio-rad, Hercules, CA), MacroprepCM ((Bio-rad, Hercules, CA), Fractogel EMD SO3 (Merck), Fractogel EMD COO (Merck), Fractogel EMD SE Hicap (Merck), Cellufine Sulfate (JNC), CM and SP Trisacryl (Pall), CM and S HyperD (Pall), S and CM Sepharose CL (GE Healthcare), S and CM Sepharose FF (GE Healthcare), S and CM CAPTOTM (GE Healthcare), MonoS (GE Healthcare), Source S (GE Healthcare), Nuvia S (Merck), 또는 Cellufine Sulfate (JNC)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 양이온 교환기는 막 양이온 교환기이다. 일부 구현예에서, 막 양이온 교환기는 Mustang S (Pall) 또는 Sartobind® S를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 양이온 교환기는 UNO_Sphere S 컬럼 (Bio-Rad) 또는 이의 등가물이다.
단계 (b)의 일부 구현예에서, 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 a)에서의 상기 음이온 교환 컬럼의 세척은 하나 이상의 세척 완충액을 사용한 세척을 사용하고, 여기서, 하나 이상의 세척 완충액은 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 세척 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 세척 완충액은 바이러스 불활성화를 위한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 4개 또는 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제2 세척 완충액은 바이러스 불활성화를 위한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 4개 또는 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제2 또는 제3 세척 완충액은 바이러스 불활성화 처리를 위한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리는 용매 및 세제 (S/D) 처리이다. 일부 구현예에서, 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 제3 및/또는 제5 세척 완충액은 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 제3, 및 제4 세척 완충액은 약 pH 7 내지 pH 8의 pH를 갖고, 제4 세척 완충액은 약 pH 5 내지 6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 5개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 제3 및/또는 제5 세척 완충액은 약 pH 7.4 내지 pH 7.5의 pH를 갖고, 제4 세척 완충액은 약 pH 5.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리 단계는 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는 완충액을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 4개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 바이러스 불활성화 처리 단계는 제1 세척 완충액 후에 사용된다. 일부 구현예에서, 4개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 및 제4 세척 완충액은 제3 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리 단계는 제3 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는 완충액을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 단계는 제1, 제2 및/또는 제4 세척 완충액과 동일한 pH를 갖는 완충액을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 4개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 및 제4 세척 완충액은 약 pH 7 내지 약 pH 8의 pH를 갖고, 제3 세척 완충액은 약 pH 5 내지 약 pH 6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 4개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1, 제2, 및 제4 세척 완충액은 약 pH 7.4 내지 pH 7.5의 pH를 갖고, 제3 세척 완충액은 약 pH 5.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 프로-VWF의 로딩 농도는 약 90 IU/ml 내지 약 270 IU/ml 수지, 예를 들어, 약 90 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 100 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 150 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 200 IU/ml-약 250 IU/ml, 또는 약 250 IU/ml-약 270 IU/ml 수지이다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 방법은 완충액 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 하나 이상의 용출 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 하나 이상의 세척 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 적어도 하나의 용출 완충액 및 적어도 하나의 세척 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 적어도 2개의 용출 완충액 및 적어도 2개의 세척 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 세척 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하고, 임의로 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 세척 완충액은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖고, 임의로 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 세척 완충액은 pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 세척 완충액은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 세척 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있고, pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖는다. 일 구현예에서, 제2 세척 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액이 사용되는 경우, 제1 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 세척 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액은 120 mM 내지 200 mM, 130 mM 내지 200 mM, 140 mM 내지 200 mM, 150 mM 내지 200 mM, 120 mM 내지 190 mM, 130 mM 내지 190 mM, 140 mM 내지 190 mM, 150 mM 내지 190 mM, 120 mM 내지 180 mM, 130 mM 내지 180 mM, 140 mM 내지 180 mM, 150 mM 내지 180 mM, 120 mM, 125 mM, 130 mM, 135 mM, 140 mM, 145 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 mM, 또는 200 mM의 NaCl 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 성숙한 VWF 및 VWF-PP를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물을 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하는 완충액과 접촉시키고, 임의로 완충액은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물을 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는 완충액과 접촉시키고, 임의로 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 세척 완충액이다. 일부 구현예에서, 완충액은 용출 완충액이다. 일부 구현예에서, 완충액은 6.0 내지 6.9의 pH를 갖는 세척 완충액이다. 일부 구현예에서, 완충액은 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 용출 완충액이다. 일부 구현예에서, 성숙한 VWF 및 VWF-PP를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물을 첫 번째로 6.0 내지 6.9의 pH를 갖는 세척 완충액과 접촉시키고, 두 번째로 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 적어도 하나의 용출 완충액과 접촉시킨다.
일부 구현예에서, 성숙한 VWF는 하나의 용출 완충액을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 용출된다. 일부 구현예에서, 성숙한 VWF는 하나 초과의 용출 완충액을 포함하는 구배 용출 방법을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 용출된다. 예를 들어, 용출은 2개의 용출 완충액, 예를 들어, 제1 용출 완충액 및 제2 용출 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하고, 임의로 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖고, 임의로 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 용출 완충액은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있고, pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖는다. 일 구현예에서, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 세척 완충액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, pH 9.0이다. 일부 구현예에서, 이는 2개의 용출 완충액, 예를 들어, 제1 및 제2 용출 완충액이 존재하는 경우를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 용출 완충액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, pH 9.0이다. 일부 구현예에서, 이는 2개의 용출 완충액, 예를 들어, 제1 및 제2 용출 완충액이 존재하는 경우를 포함한다.
일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 단계 a)에서 출발 용액에 비해 증가되고/되거나, 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우 제1 용출 완충액에 비해 증가되고/되거나, 세척 완충액이 사용되는 경우 세척 완충액에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 하나의 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 나머지 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 및 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 및 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 둘 다는 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 제1 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 세척 완충액 및 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 및/또는 용출 완충액의 pH는 상기 방법의 단계 (a)에서 언급된 바와 같이, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 로딩 용액에 비해 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 단계 (a)에서 용액 중 mat-rVWF/rVWF-PP 복합체의 mat-rVWF 및 rVWF-PP로의 해리를 유도하기 위해, 완충액의 pH는 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가되고, 여기서, 상기 해리는 비공유적으로 회합된 mat-rVWF 및 rVWF-PP의 파괴에 의해 발생한다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 7로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액은 적어도 7의 pH를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 로딩 용액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, 또는 pH 9.0이다.
일부 구현예에서, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다.
일부 구현예에서, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 로딩 용액은 시트르산 나트륨, 예컨대 그러나 이에 제한되지 않는 10 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 55 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨, 65 mM 시트르산 나트륨, 70 mM 시트르산 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, 80 mM 시트르산 나트륨 등을 포함하는 완충액으로 희석된다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 세척 완충액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, 또는 pH 9.0이다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 용출 완충액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, 또는 pH 9.0이다.
일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 단계 a)에서 출발 용액에 비해 증가되고/되거나, 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우 제1 용출 완충액에 비해 증가되고/되거나, 세척 완충액이 사용되는 경우 세척 완충액에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 하나의 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 나머지 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 및 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 및 제1 용출 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 용출 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 세척 완충액 둘 다는 7 미만의 pH를 갖고, 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 세척 완충액 및 2개의 용출 완충액이 사용되는 경우, 제1 세척 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 세척 완충액 및 용출 완충액 둘 다는 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 및/또는 용출 완충액의 pH는 상기 방법의 단계 (a)에서 언급된 바와 같이, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 로딩 용액에 비해 적어도7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 단계 (a)에서 용액 중 mat-rVWF/rVWF-PP 복합체의 mat-rVWF 및 rVWF-PP로의 해리를 유도하기 위해, 완충액의 pH는 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가되고, 여기서, 상기 해리는 비공유적으로 회합된 mat-rVWF 및 rVWF-PP의 파괴에 의해 발생한다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 7로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액은 적어도 7의 pH를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액 (세척 및/또는 용출 완충액을 포함함)은 하나 이상의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제이다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 NTA, DTPA, EDDS, EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 시트레이트, EDTA, DTPA, NTA, 및 EDDS로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 NTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 DTPA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EDDS이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EDTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EGTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 CDTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 시트레이트이다. 일부 구현예에서, b)에서 하나 이상의 세척 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 적어도 7의 pH를 나타낸다.
본원에 기재된 임의의 완충액 (완충액 시스템)은 단일 완충액으로서 또는 2개 이상의 완충액의 조합으로서 글리신, HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), 히스티딘, 이미다졸, 시트르산 아세테이트, 시트레이트, 아세테이트, MES, 포스페이트, 트리스HCl, 비스-트리스, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌HCl, 리신HCl, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 글리신 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), 히스티딘, 이미다졸, 시트르산 아세테이트, MES, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 완충액은 시트레이트, 아세테이트, MES, HEPES, 포스페이트, 트리스HCl 및/또는 비스-트리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 글리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄)을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 이미다졸을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 시트르산 아세테이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 시트레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아세테이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 MES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 HEPES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 포스페이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스-HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 비스-트리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 이미다졸을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌 HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 리신 HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 본원에 열거된 완충액 중 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액 (세척 및/또는 용출 완충액을 포함함)은 10 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-80 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 55 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨, 65 mM 시트르산 나트륨, 70 mM 시트르산 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, 80 mM 시트르산 나트륨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 범위로 시트르산 나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 용출 완충액은 10 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-50 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-50 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 범위로 시트르산 나트륨을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 용출 완충액은 시트르산 나트륨, 예컨대 그러나 이에 제한되지 않는 10 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-50 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-50 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-60 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨 등을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계의 하나 이상의 완충액 (세척 및/또는 용출 완충액을 포함함)은 원하는 rVWF 종이 양이온 교환 수지에 결합된 상태로 있는 한 EDTA를 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계의 하나 이상의 완충액 (세척 및/또는 용출 완충액을 포함함)은 원하는 rVWF 종이 양이온 교환 수지에 결합된 상태로 있는 한 약 0.5 mM 내지 약 20 mM EDTA, 예를 들어, 약 0.5 mM-약 20 mM, 약 1 mM-약 20 mM, 약 1.5 mM-약 20 mM, 약 2 mM-약 20 mM, 약 3 mM-약 20 mM, 약 5 mM-약 20 mM, 약 0.5 mM-약 15 mM, 약 1 mM-약 10 mM, 약 1 mM-약 5 mM, 약 5 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM 등을 포함한다. 일부 구현예에서, EDTA를 포함하는 완충액은 단계적 양이온 교환 용출의 일부로서 사용된다. 일부 구현예에서, EDTA를 포함하는 완충액은 구배 양이온 교환 용출의 일부로서 사용된다. 일부 구현예에서, EDTA가 단계적 양이온 교환 용출에 사용되는 완충액의 일부로서 사용되는 경우, 반대 이온은 Na+이다. 일부 구현예에서, EDTA가 구배 양이온 교환 용출에 사용되는 완충액의 일부로서 사용되는 경우, 반대 이온은 Na+이다.
일부 구현예에서, 시트레이트는 양이온 교환 방법을 사용하여 rVWF-프로펩티드를 제거한 후 용리액에서 발견할 수 있다. 일부 구현예에서, 시트레이트는 단계적 양이온 교환 용출 방법을 사용하여 rVWF-프로펩티드를 제거한 후 용리액에서 발견할 수 있다. 일부 구현예에서, 시트레이트는 구배 양이온 교환 용출 방법을 사용하여 rVWF-프로펩티드를 제거한 후 용리액에서 발견할 수 있다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 반대-이온은 Na+이다.
일부 구현예에서, 완충액 (세척 및/또는 용출 완충액을 포함함)의 전도도는 5 mS/cm 내지 40 mS/cm, 예를 들어, 5 mS/cm-40 mS/cm, 10 mS/cm-40 mS/cm, 15 mS/cm-40 mS/cm, 20 mS/cm-40 mS/cm, 5 mS/cm-15 mS/cm, 10 mS/cm-25 mS/cm, 15 mS/cm-30 mS/cm, 20 mS/cm-30 mS/cm, 또는 30 mS/cm-40 mS/cm의 범위이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 세척 완충액의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 13 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 18 mS/cm-약 40 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 세척 완충액의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 13 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 18 mS/cm-약 40 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 용출 완충액의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 13 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 18 mS/cm-약 40 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 세척 완충액의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 13 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 18 mS/cm-약 40 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다.
일부 구현예에서, 세척 완충액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, pH 9.0이다.
일 양상에서, 본원에 기재된 방법은 구배 용출 단계를 포함한다. 구배 용출 단계는 성숙한 VWF의 수율을 최적화하기 위해 생성물 불순물 및 공정-관련된 불순물을 제거할 수 있다. 일부 경우에, 구배 용출 단계는 선행 기술 방법에 비해 성숙한 VWF로부터 더 높은 백분율의 VWF 프로-펩티드를 분리한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 용출 완충액의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 13 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 18 mS/cm-약 40 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 세척 완충액의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 13 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 18 mS/cm-약 40 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다.
일부 구현예에서, 본 방법의 하나 이상의 세척 단계의 유량은 약 10 cm/h 내지 약 200 cm/h, 예를 들어, 약 10 cm/h, 약 15 cm/h, 약 20 cm/h, 약 25 cm/h, 약 30 cm/h, 약 35 cm/h, 약 40 cm/h, 약 45 cm/h, 약 50 cm/h, 약 55 cm/h, 약 60 cm/h, 약 65 cm/h, 약 70 cm/h, 약 75 cm/h, 약 80 cm/h, 약 85 cm/h, 약 90 cm/h, 약 95 cm/h, 약 100 cm/h, 약 105 cm/h, 약 110 cm/h, 약 115 cm/h, 약 120 cm/h, 약 125 cm/h, 약 130 cm/h, 약 135 cm/h, 약 140 cm/h, 약 145 cm/h, 약 150 cm/h, 약 155 cm/h, 약 160 cm/h, 약 165 cm/h, 약 170 cm/h, 약 175 cm/h, 약 180 cm/h, 약 185 cm/h, 약 190 cm/h, 약 195 cm/h, 또는 약 200 cm/h이다. 수지에 따라, 일부 구현예에서, 유량은 최대 600 cm/h일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법의 하나 이상의 용출 단계의 유량은 약 10 cm/h 내지 약 200 cm/h, 예를 들어, 약 10 cm/h, 약 15 cm/h, 약 20 cm/h, 약 25 cm/h, 약 30 cm/h, 약 35 cm/h, 약 40 cm/h, 약 45 cm/h, 약 50 cm/h, 약 55 cm/h, 약 60 cm/h, 약 65 cm/h, 약 70 cm/h, 약 75 cm/h, 약 80 cm/h, 약 85 cm/h, 약 90 cm/h, 약 95 cm/h, 약 100 cm/h, 약 105 cm/h, 약 110 cm/h, 약 115 cm/h, 약 120 cm/h, 약 125 cm/h, 약 130 cm/h, 약 135 cm/h, 약 140 cm/h, 약 145 cm/h, 약 150 cm/h, 약 155 cm/h, 약 160 cm/h, 약 165 cm/h, 약 170 cm/h, 약 175 cm/h, 약 180 cm/h, 약 185 cm/h, 약 190 cm/h, 약 195 cm/h, 또는 약 200 cm/h이다. 수지에 따라, 일부 구현예에서, 유량은 최대 600 cm/h일 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 비이온성 세제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Triton X-100, Tween 80, 및 Tween 20으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Triton X-100이다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Tween 80이다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Tween 20이다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 완충액은 비-환원 당, 당 알코올, 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 물질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 비-환원 당을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비-환원 당은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨 및/또는 크실리톨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 당 알코올을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 폴리올을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 당 알코올 또는 폴리올은 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소르비톨 및/또는 글리세롤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 완충액은 소르비톨, 만니톨, 크실리톨, 수크로스, 트레할로스, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 1,2,3-프로판트리올, 메소-에리트리톨 및/또는 에리트리톨 (메소-1,2,3,4-부탄테트롤)을 추가로 포함한다.
임의의 완충액의 pH는 아미노산, 트리스, NaOH, 에탄올아민 등을 첨가하여 조정 (증가)될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 완충액 (완충액 시스템)은 단일 완충액으로서 또는 2개 이상의 완충액의 조합으로서 시트레이트, 아세테이트, MES, HEPES, 포스페이트, 트리스HCl, 비스-트리스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충액은 글리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 시트레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아세테이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 MES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 HEPES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 포스페이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 비스-트리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 본원에 열거된 완충액 중 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 방법 완충액 킬레이트제 조합은 시트레이트, 말레이트 (말산), 및 타르트레이트 (타르타르산)를 포함한다.
c. 크기 배제 크로마토그래피 정제
본 발명의 일 양상에서, 성숙한 VWF 및 VWF-PP는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 방식으로 분리된다. 일부 경우에, 잔류 숙주 세포 유래 불순물, 예컨대 CHO 숙주 세포 단백질, 공정 관련된 불순물, 예컨대 재조합 퓨린 및 저분자량 바이러스 불활성화 시약, 배지 화합물, 예컨대 대두 펩톤, 및 기타 생성물 관련된 불순물은 성숙한 VWF로부터 제거된다.
본 방법의 또 다른 양상에서, 성숙한 VWF는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 VWF-PP, 예컨대 잔류 VWF-PP 또는 유리 VWF-PP로부터 분리된다. 분리를 위해, 출발 또는 로딩 조성물은 낮은 pH 및 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 구배 용출 완충액은 중성 내지 높은 pH, 예컨대 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 구배 용출 완충액은 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 7.0 이상의 pH, 예를 들어, pH 7.0 내지 pH 9.0을 갖는다. 예를 들어, 구배 용출 완충액은 EDTA를 포함할 수 있고, 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 고순도의 프로펩티드 고갈된 성숙한 재조합 rVWF (고순도의 mat-rVWF)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액을 크기 배제 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서, 상기 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF는 상기 크기 배제 컬럼에 결합되는, 단계; (b) 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 a)에서의 상기 크기 배제 컬럼을 하나 이상의 세척 완충액으로 세척하는 단계; (c) 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 b)에서의 상기 컬럼을 퓨린으로 처리하는 단계로서, 여기서, 상기 퓨린은 상기 프로-rVWF를 mat-rVWF와 rVWF-PP로 절단하는, 단계; (d) c)에서의 컬럼으로부터 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 용출 완충액을 사용하여 용출시키는 단계로서, 여기서, 상기 용출 완충액은 상기 rVWF-PP와 비공유적으로 회합된 mat-rVWF로부터 상기 rVWF-PP의 해리를 유도하고, 상기 해리는 (i) 상기 용출 완충액에 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하거나, (ii) 상기 용출 완충액의 pH를 적어도 7의 pH로 증가시킴으로써 유도되는, 단계; 및 (e) 상기 rVWF-PP와 별도로 상기 mat-rVWF를 수집하여 고순도의 mat-rVWF 조성물을 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 95%의 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 rVWF-PP를 포함하는, 단계.
일부 구현예에서, a) 및 b)는 단일 단계로 동시에 발생한다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 면역친화성 정제 방법으로부터 유동 통과물을 포함한다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 모노클로날 항체 컬럼으로부터 유동 통과물을 포함하고, 여기서, 상기 모노클로날 항체는 FVIII 모노클로날 항체이다. 일부 구현예에서, a)에서 용액은 세포 배양 배지, 항체 컬럼 유체-통과 용액, 및 완충 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 분리 완충액은 중성 내지 높은 pH를 갖는다. 다른 구현예에서, 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하고, 중성 내지 높은 pH를 갖는다. 예를 들어, 분리 완충액은 킬레이트제를 포함할 수 있고, 6.0 이상의 pH를 갖거나, 일부 경우에, 7.0 이상의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 프로-VWF의 로딩 농도는 약 90 IU/ml 내지 약 270 IU/ml 수지, 예를 들어, 약 90 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 270 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 250 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 110 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 120 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 130 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 140 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 90 IU/ml-약 100 IU/ml, 약 100 IU/ml-약 150 IU/ml, 약 150 IU/ml-약 200 IU/ml, 약 200 IU/ml-약 250 IU/ml, 또는 약 250 IU/ml-약 270 IU/ml 수지이다.
일부 구현예에서, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 출발 조성물, 로딩 용액, 또는 로딩 조성물의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, 또는 pH 9.0이다.
일부 구현예에서, 크기 배제 방법은 완충액 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 하나 이상의 분리 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 적어도 하나의 분리 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 적어도 2개의 분리 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 시스템은 적어도 제1 분리 완충액 및 적어도 제2 분리 완충액을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 분리 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하고, 임의로 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 분리 세척 완충액은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖고, 임의로 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 분리 완충액은 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 분리 완충액은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 분리 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있고, pH 6.0 내지 pH 6.9 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 분리 완충액은 7 미만의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 분리 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 2개의 분리 완충액이 사용되는 경우, 제1 분리 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 분리 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 성숙한 rVWF 및 rVWF-PP를 포함하는 출발 용액을 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하는 분리 완충액과 접촉시키고, 임의로 완충액은 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 출발 용액을 pH 6.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는 완충액과 접촉시키고, 임의로 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 pH 7.0 내지 pH 9.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 6.0 내지 6.9의 pH를 갖는 제1 분리 완충액이다. 일부 구현예에서, 완충액은 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 제2 분리 완충액이다. 일부 구현예에서, 성숙한 rVWF 및 rVWF-PP를 포함하는 출발 용액을 먼저 6.0 내지 6.9의 pH를 갖는 제1 완충액과 접촉시키고 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 제2 분리 완충액과 접촉시킨다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액의 pH는 pH 6.0 내지 pH 9.0, 예를 들어, pH 6.0-pH 9.0, pH 6.3-pH 9.0, pH 6.5-pH 9.0, pH 7.0-pH 9.0, pH 7.5-pH 9.0, pH 7.7.0-pH 9.0, pH 8.0-pH 9.0, pH 6.0-pH 8.5, pH 6.5-pH 8.5, pH 7.0-pH 8.5, pH 7.5-pH 8.5, pH 6.0-pH 8.0, pH 6.5-pH 8.0, pH 7.0-pH 8.0, pH 7.5-pH 8.0, pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3, pH 6.4, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9, pH 8.0, pH 8.1, pH 8.2, pH 8.3, pH 8.4, pH 8.5, pH 8.6, pH 8.7, pH 8.8, pH 8.9, 또는 pH 9.0이다.
일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 단계 a)에서 출발 용액에 비해 증가되고/되거나, 2개의 분리 완충액이 사용되는 경우 제1 분리 완충액에 비해 증가되고/되거나, 제2 분리 완충액이 사용되는 경우 제1 분리 완충액에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 제1 분리 완충액 및 제2 분리 완충액이 사용되는 경우, 제1 분리 완충액은 7 미만의 pH를 갖고, 제2 분리 완충액은 7 초과의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액의 pH는 상기 방법의 단계 (a)에서 언급된 바와 같이, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 로딩 용액과 비교하여 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 방법의 단계 (a)에서 용액 중 mat-rVWF/rVWF-PP 복합체의 mat-rVWF 및 rVWF-PP로의 해리를 유도하기 위해, 완충액의 pH는 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가되고, 여기서, 상기 해리는 비공유적으로 회합된 mat-rVWF 및 rVWF-PP의 파괴에 의해 발생한다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 로딩 용액의 pH는 적어도 7로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 완충액의 pH는 적어도 약 7.6으로 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액의 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액은 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액은 하나 이상의 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제이다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 NTA, DTPA, EDDS, EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 NTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 DTPA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EDDS이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EDTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EGTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 CDTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 시트레이트이다. 일부 구현예에서, b)에서 하나 이상의 세척 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 적어도 7의 pH를 나타낸다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액은 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제일 수 있다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 니트릴로-2,2',2''-트리아세트산 (NTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산; 디에틸렌트리아민-N,N,N',N',N''-펜타아세트산 (DTPA), 에틸렌디아민-N,N'-디석신산 (EDDS), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2가 양이온 킬레이트제는 NTA, DTPA, EDDS, EDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 NTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 DTPA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EDDS이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EDTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 EGTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 CDTA이다. 일부 구현예에서, 킬레이트제는 시트레이트이다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계의 용출 완충액 A 및/또는 용출 완충액 B는 약 0.5 mM 내지 약 20 mM EDTA, 예를 들어, 약 0.5 mM-약 20 mM, 약 1 mM-약 20 mM, 약 1.5 mM-약 20 mM, 약 2 mM-약 20 mM, 약 3 mM-약 20 mM, 약 5 mM-약 20 mM, 약 0.5 mM-약 15 mM, 약 1 mM-약 10 mM, 약 1 mM-약 5 mM, 약 5 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액은 10 mM-500 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-400 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-400 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-350 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-350 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 55 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨, 65 mM 시트르산 나트륨, 70 mM 시트르산 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, 80 mM 시트르산 나트륨, 90 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 시트르산 나트륨, 110 mM 시트르산 나트륨, 120 mM 시트르산 나트륨, 130 mM 시트르산 나트륨, 140 mM 시트르산 나트륨, 150 mM 시트르산 나트륨, 160 mM 시트르산 나트륨, 170 mM 시트르산 나트륨, 180 mM 시트르산 나트륨, 190 mM 시트르산 나트륨, 200 mM 시트르산 나트륨, 210 mM 시트르산 나트륨, 220 mM 시트르산 나트륨, 230 mM 시트르산 나트륨, 240 mM 시트르산 나트륨, 250 mM 시트르산 나트륨, 260 mM 시트르산 나트륨, 270 mM 시트르산 나트륨, 280 mM 시트르산 나트륨, 290 mM 시트르산 나트륨, 300 mM 시트르산 나트륨, 310 mM 시트르산 나트륨, 320 mM 시트르산 나트륨, 330 mM 시트르산 나트륨, 340 mM 시트르산 나트륨, 350 mM 시트르산 나트륨, 360 mM 시트르산 나트륨, 370 mM 시트르산 나트륨, 380 mM 시트르산 나트륨, 390 mM 시트르산 나트륨, 400 mM 시트르산 나트륨, 410 mM 시트르산 나트륨, 420 mM 시트르산 나트륨, 430 mM 시트르산 나트륨, 440 mM 시트르산 나트륨, 450 mM 시트르산 나트륨, 460 mM 시트르산 나트륨, 470 mM 시트르산 나트륨, 480 mM 시트르산 나트륨, 490 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 시트르산 나트륨, 510 mM 시트르산 나트륨, 520 mM 시트르산 나트륨, 530 mM 시트르산 나트륨, 540 mM 시트르산 나트륨, 550 mM 시트르산 나트륨, 560 mM 시트르산 나트륨, 570 mM 시트르산 나트륨, 580 mM 시트르산 나트륨, 590 mM 시트르산 나트륨, 또는 600 mM 시트르산 나트륨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 범위로 시트르산 나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액은 10 mM-500 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-400 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-400 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-350 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-350 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 55 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨, 65 mM 시트르산 나트륨, 70 mM 시트르산 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, 80 mM 시트르산 나트륨, 90 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 시트르산 나트륨, 110 mM 시트르산 나트륨, 120 mM 시트르산 나트륨, 130 mM 시트르산 나트륨, 140 mM 시트르산 나트륨, 150 mM 시트르산 나트륨, 160 mM 시트르산 나트륨, 170 mM 시트르산 나트륨, 180 mM 시트르산 나트륨, 190 mM 시트르산 나트륨, 200 mM 시트르산 나트륨, 210 mM 시트르산 나트륨, 220 mM 시트르산 나트륨, 230 mM 시트르산 나트륨, 240 mM 시트르산 나트륨, 250 mM 시트르산 나트륨, 260 mM 시트르산 나트륨, 270 mM 시트르산 나트륨, 280 mM 시트르산 나트륨, 290 mM 시트르산 나트륨, 300 mM 시트르산 나트륨, 310 mM 시트르산 나트륨, 320 mM 시트르산 나트륨, 330 mM 시트르산 나트륨, 340 mM 시트르산 나트륨, 350 mM 시트르산 나트륨, 360 mM 시트르산 나트륨, 370 mM 시트르산 나트륨, 380 mM 시트르산 나트륨, 390 mM 시트르산 나트륨, 400 mM 시트르산 나트륨, 410 mM 시트르산 나트륨, 420 mM 시트르산 나트륨, 430 mM 시트르산 나트륨, 440 mM 시트르산 나트륨, 450 mM 시트르산 나트륨, 460 mM 시트르산 나트륨, 470 mM 시트르산 나트륨, 480 mM 시트르산 나트륨, 490 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 시트르산 나트륨, 510 mM 시트르산 나트륨, 520 mM 시트르산 나트륨, 530 mM 시트르산 나트륨, 540 mM 시트르산 나트륨, 550 mM 시트르산 나트륨, 560 mM 시트르산 나트륨, 570 mM 시트르산 나트륨, 580 mM 시트르산 나트륨, 590 mM 시트르산 나트륨, 또는 600 mM 시트르산 나트륨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 범위로 시트르산 나트륨을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액은 시트르산 나트륨, 예컨대 그러나 이에 제한되지 않는 10 mM-500 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-400 mM 시트르산 나트륨, 10 mM-400 mM 시트르산 나트륨, 15 mM-350 mM 시트르산 나트륨, 20 mM-350 mM 시트르산 나트륨, 10 mM 시트르산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 시트르산 나트륨, 50 mM 시트르산 나트륨, 55 mM 시트르산 나트륨, 60 mM 시트르산 나트륨, 65 mM 시트르산 나트륨, 70 mM 시트르산 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, 80 mM 시트르산 나트륨, 90 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 시트르산 나트륨, 110 mM 시트르산 나트륨, 120 mM 시트르산 나트륨, 130 mM 시트르산 나트륨, 140 mM 시트르산 나트륨, 150 mM 시트르산 나트륨, 160 mM 시트르산 나트륨, 170 mM 시트르산 나트륨, 180 mM 시트르산 나트륨, 190 mM 시트르산 나트륨, 200 mM 시트르산 나트륨, 210 mM 시트르산 나트륨, 220 mM 시트르산 나트륨, 230 mM 시트르산 나트륨, 240 mM 시트르산 나트륨, 250 mM 시트르산 나트륨, 260 mM 시트르산 나트륨, 270 mM 시트르산 나트륨, 280 mM 시트르산 나트륨, 290 mM 시트르산 나트륨, 300 mM 시트르산 나트륨, 310 mM 시트르산 나트륨, 320 mM 시트르산 나트륨, 330 mM 시트르산 나트륨, 340 mM 시트르산 나트륨, 350 mM 시트르산 나트륨, 360 mM 시트르산 나트륨, 370 mM 시트르산 나트륨, 380 mM 시트르산 나트륨, 390 mM 시트르산 나트륨, 400 mM 시트르산 나트륨, 410 mM 시트르산 나트륨, 420 mM 시트르산 나트륨, 430 mM 시트르산 나트륨, 440 mM 시트르산 나트륨, 450 mM 시트르산 나트륨, 460 mM 시트르산 나트륨, 470 mM 시트르산 나트륨, 480 mM 시트르산 나트륨, 490 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 시트르산 나트륨, 510 mM 시트르산 나트륨, 520 mM 시트르산 나트륨, 530 mM 시트르산 나트륨, 540 mM 시트르산 나트륨, 550 mM 시트르산 나트륨, 560 mM 시트르산 나트륨, 570 mM 시트르산 나트륨, 580 mM 시트르산 나트륨, 590 mM 시트르산 나트륨, 또는 600 mM 시트르산 나트륨 등을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 분리 완충액의 전도도는 약 5 mS/cm 내지 약 40 mS/cm, 예를 들어, 약 5 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 25 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 30 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 40 mS/cm, 약 10 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 13 mS/cm, 약 5 mS/cm-약 15 mS/cm, 약 15 mS/cm-약 30 mS/cm, 약 18 mS/cm-약 40 mS/cm, 또는 약 20 mS/cm-약 40 mS/cm이다.
본원에 기재된 임의의 완충액 (완충액 시스템)은 단일 완충액으로서 또는 2개 이상의 완충액의 조합으로서 시트레이트, 아세테이트, MES, HEPES, 포스페이트, 트리스HCl, 비스-트리스, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌 HCl, 리신 HCl, 글리신, 글리실글리신, 보레이트, MOPS, 비신, 트리신, TAPS, TAPSO, 및 PIPES로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충액은 글리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 시트레이트, 아세테이트, MES, HEPES, 포스페이트, 트리스HCl, 비스-트리스, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌HCl, 리신HCl, 글리신, 글리실글리신, 보레이트, MOPS, 비신, 트리신, TAPS, TAPSO 및/또는 PIPES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 시트레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아세테이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 MES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 HEPES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 포스페이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스-HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 비스-트리스를 포함한다.
일부 구현예에서, 완충액은 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 이미다졸을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌 HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 리신 HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 글리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 글리실글리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 보레이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 MOPS를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 비신을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 TAPS를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 TAPSO를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 PIPES를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 본원에 열거된 완충액 중 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 분리 완충액은 하나 이상의 비이온성 세제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Triton X-100, Tween 80, 및 Tween 20으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Triton X-100이다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Tween 80이다. 일부 구현예에서, 비이온성 세제는 Tween 20이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 분리 완충액 단계 동안 유량 사용은 약 10 cm/h 내지 약 200 cm/h, 예를 들어, 약 10 cm/h, 약 15 cm/h, 약 20 cm/h, 약 25 cm/h, 약 30 cm/h, 약 35 cm/h, 약 40 cm/h, 약 45 cm/h, 약 50 cm/h, 약 55 cm/h, 약 60 cm/h, 약 65 cm/h, 약 70 cm/h, 약 75 cm/h, 약 80 cm/h, 약 85 cm/h, 약 90 cm/h, 약 95 cm/h, 약 100 cm/h, 약 105 cm/h, 약 110 cm/h, 약 115 cm/h, 약 120 cm/h, 약 125 cm/h, 약 130 cm/h, 약 135 cm/h, 약 140 cm/h, 약 145 cm/h, 약 150 cm/h, 약 155 cm/h, 약 160 cm/h, 약 165 cm/h, 약 170 cm/h, 약 175 cm/h, 약 180 cm/h, 약 185 cm/h, 약 190 cm/h, 약 195 cm/h, 또는 약 200 cm/h이다. 수지에 따라, 일부 구현예에서, 유량은 최대 600 cm/h일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 분리 완충액 단계 동안 유량 사용은 약 10 cm/h 내지 약 200 cm/h, 예를 들어, 약 10 cm/h, 약 15 cm/h, 약 20 cm/h, 약 25 cm/h, 약 30 cm/h, 약 35 cm/h, 약 40 cm/h, 약 45 cm/h, 약 50 cm/h, 약 55 cm/h, 약 60 cm/h, 약 65 cm/h, 약 70 cm/h, 약 75 cm/h, 약 80 cm/h, 약 85 cm/h, 약 90 cm/h, 약 95 cm/h, 약 100 cm/h, 약 105 cm/h, 약 110 cm/h, 약 115 cm/h, 약 120 cm/h, 약 125 cm/h, 약 130 cm/h, 약 135 cm/h, 약 140 cm/h, 약 145 cm/h, 약 150 cm/h, 약 155 cm/h, 약 160 cm/h, 약 165 cm/h, 약 170 cm/h, 약 175 cm/h, 약 180 cm/h, 약 185 cm/h, 약 190 cm/h, 약 195 cm/h, 또는 약 200 cm/h이다. 수지에 따라, 일부 구현예에서, 유량은 최대 600 cm/h일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 완충액은 비-환원 당, 당 알코올, 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 물질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 비-환원 당을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비-환원 당은 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨 및/또는 크실리톨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 당 알코올을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 폴리올을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 당 알코올 또는 폴리올은 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소르비톨 및/또는 글리세롤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 완충액은 소르비톨, 만니톨, 크실리톨, 수크로스, 트레할로스, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 1,2,3-프로판트리올, 메소-에리트리톨 및/또는 에리트리톨 (메소-1,2,3,4-부탄테트롤)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피 방법 완충액 킬레이트제 조합은 시트레이트, 말레이트 (말산), 및 타르트레이트 (타르타르산)를 포함한다.
D. 면역친화성 정제
일부 구현예에서, 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액은, 예를 들어, 모노클로날 항체 컬럼을 포함하는 면역친화성 정제 방법으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 모노클로날 항체 컬럼은 FVIII 모노클로날 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 모노클로날 항체 컬럼은 VWF 모노클로날 항체를 포함한다. 그러한 컬럼 및 방법은 당업계에 알려져 있으며, 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 (Zimmerman et al. (미국 특허 번호 제4,361,509호; 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함됨))을 참조하는데, 이에는 인자 VIII를 정제하는 방법이 설명되어 있으며, 여기서, 인자 VIII/VWF 복합체는 모노클로날 항-VWF 항체에 결합되고 인자 VIII는 CaCl2 이온에 의해 복합체로부터 해리된다. vWF가 여전히 흡착된 면역친화성 담체는 카오트로픽제, 특히 NaSCN에 의해 재생되며, vWF/NaSCN 용액은 부산물로 발생되고 폐기된다.
다른 방법은 그 전체가 본원에 참조로 또한 포함되는 미국 특허 번호 제6,579,723호 기재된 것들을 포함하는데, 이에는 면역친화성 크로마토그래피 절차를 사용하여 고도로 정제된 vWF 또는 인자 VIII/vWF-복합체를 회수하는 방법이 설명되어 있다. 그러한 방법은 쯔비터이온성 종을 함유하는 용출제를 사용함으로써 면역친화성 흡착제로부터 VWF의 회수를 사용한다. 쯔비터이온성 종의 존재는 제제 전반에 걸쳐 온화한 조건의 사용을 가능하게 하여, 추가적인 안정화제 또는 방부제 필요 없이도 분자 완전성, 활성을 유지하고 회수된 단백질을 약제학적 제제에 혼입하는 것을 용이하게 한다. 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액을 수득하기 위해, 임의의 그러한 방법이 현재의 정제 방법과 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역친화성 정제는 양이온 교환, 음이온 교환 및/또는 크기 배제 크로마토그래피 절차에 기반한 것을 포함하여, 본원에 기재된 임의의 설명된 정제 절차에서 단계 (a) 전에 임의로 발생한다.
E. 유리 성숙한 VWF
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 2.0 ppm 이하, 예를 들어, 2.0 ppm, 1.9 ppm, 1.8 ppm, 1.7 ppm, 1.6 ppm, 1.5 ppm, 1.4 ppm, .3 ppm, 1.2 ppm, 1.1 ppm, 1.0 ppm, 0.9 ppm, 0.8 ppm, 0.7 ppm, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 0.1 ppm, 0.09 ppm, 0.08 ppm, 0.07 ppm, 0.06 ppm, 0.05 ppm, 0.04 ppm, 0.03 ppm, 0.02 ppm, 0.01 ppm 이하이다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 조성물의 숙주 세포 불순물 수준은 0.6 ppm 이하, 예를 들어, 0.6 ppm, 0.5 ppm, 0.4 ppm, 0.3 ppm, 0.2 ppm, 0.1 ppm, 0.09 ppm, 0.08 ppm, 0.07 ppm, 0.06 ppm, 0.05 ppm, 0.04 ppm, 0.03 ppm, 0.02 ppm, 0.01 ppm 이하이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 5.0% 이하 (예를 들어, ≤5.0%)이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 4.0% 이하 (예를 들어, ≤ 4.0%)이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 3.0% 이하 (예를 들어, ≤ 3.0%)이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 2.0% 이하 (예를 들어, ≤ 1.0%)이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 조성물의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 2.0% 이하 (예를 들어, ≤ 1.0%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.9% 이하 (예를 들어, ≤ 0.9%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.8% 이하 (예를 들어, ≤ 0.8%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.7% 이하 (예를 들어, ≤ 0.7%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.6% 이하 (예를 들어, ≤ 0.6%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.5% 이하 (예를 들어, ≤ 0.5%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.4% 이하 (예를 들어, ≤ 0.4%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.3% 이하 (예를 들어, ≤ 0.3%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.2% 이하 (예를 들어, ≤ 0.2%)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 (HC) 불순물 수준은 0.1% 이하 (예를 들어, ≤ 0.1%)이다.
일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.05% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 15% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 10% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 5% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 4% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 3% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 2% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 1% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 0.5% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 0.4% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 0.3% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 0.2% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, rVWF-PP 불순물은 0.05% 미만이다.
Figure pct00001
F. 재조합 VWF 생성
본 발명의 유리 성숙한 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)는 재조합적으로 생성될 수 있다. 당업자는 숙주 세포에서 재조합 단백질을 발현하기 위한 유용한 방법을 인식한다. 일부 경우에서, 상기 방법은 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포에서 rVWF를 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 단계 및 생성된 숙주 세포를 특정 조건 하에 배양하여 rVWF, 프리프로-VWF, 프로-VWF 등을 생성하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, VWF를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열은 발현 벡터일 수 있다. 벡터는 바이러스에 의해 전달될 수 있거나, 플라스미드일 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 특정 유전자 또는 이의 생물학적 기능성 부분일 수 있다. 일 구현예에서, 단백질은 적어도 VWF의 생물학적 활성 부분이다. 핵산 서열은 당업자에게 일반적으로 알려져 있는, 단백질의 제어된 발현에 적합한 기타 서열, 예컨대 프로모터 서열, 인핸서, TATA 박스, 전사 개시 부위, 폴리링커, 제한 부위, 폴리-A-서열, 단백질 처리 서열, 선택 마커 등을 추가로 포함할 수 있다.
VWF의 발현을 위해 다양한 벡터가 사용될 수 있으며 진핵 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 진핵 발현을 위한 벡터의 예는 다음을 포함한다: (i) 효모에서의 발현을 위해, 프로모터, 예컨대 AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등을 사용하는 벡터, 예컨대 pAO, pPIC, pYES, pMET; (ii) 곤충 세포에서의 발현을 위해, 프로모터, 예컨대 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등을 사용하는 벡터, 예컨대 pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC 등 및 (iii) 포유류 세포에서의 발현을 위해, 프로모터, 예컨대 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 β-액틴을 사용하는 벡터, 예컨대 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등 및 바이러스 시스템, 예컨대 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 등으로부터 유래된 벡터.
일부 양상에서, 본 발명의 방법에 사용된 rVWF는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 포유 동물 세포 배양물에서 발현에 의해 생성된다. 특정 구현예에서, 포유류 배양물은 CHO 세포를 포함한다. 추가의 구현예에서, rVWF는 동일한 배양물에서 재조합 인자 VIII (rFVIII)과 공동-발현된다. 그러한 구현예에서, rVWF 및 rFVIII은 함께 정제되거나 (공동-정제되거나), 당업계에 알려진 방법을 사용하여 개별적으로 정제된다. 다른 구현예에서, rVWF는 rFVIII을 함유하지 않는 배향물에서 발현된다.
일부 구현예에서, rVWF는 적합한 진핵 숙주 시스템으로부터 발현되고 단리된다. 진핵 세포의 예는, 제한 없이, 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, 및 HepG2; 곤충 세포, 예를 들어, SF9 세포, SF21 세포, S2 세포, 및 하이 파이브 세포 (High Five cell); 및 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 또는 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 세포를 포함한다. 일 구현예에서, VWF는 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 포유류 세포 등에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 인간 세포주, 햄스퍼 세포주, 또는 뮤린 세포주에서. 일 특정 구현예에서, 세포주는 CHO, BHK, 또는 HEK 세포주이다. 전형적으로, 연속 세포주로부터 포유류 세포, 예를 들어, CHO 세포는 본 발명의 VWF를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 특정 경우에, VWF 단백질은 CHO 세포 발현 시스템으로부터 발현되고 단리된다.
VWF는 세포 배양 시스템에서 또는 당업자에 의해 인식된 임의의 세포 배양 방법에 따라 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 높은 세포 밀도 및 단백질 발현을 달성하기 위해 높은 부피-특이적 배양 표면적을 제공하기에 적합한 조건 하에 대형 생물반응기 (bioreactor)에서 수행될 수 있다. 그러한 성장 조건을 제공하기 위한 하나의 수단은 교반 탱크 생물반응기에서 세포-배양을 위해 미립담체를 사용하는 것이다. 미립담체에서 세포-성장의 개념은 van Wezel의 문헌 (van Wezel, A. L., Nature, 1967, 216:64-5)에 의해 처음 설명되었고, 성장 배지에 부유하는 작은 고체 입자의 표면 상에 세포 부착을 허용한다. 이들 방법은 높은 표면 대 부피 비율을 제공하여 효율적인 영양소 활용을 허용한다. 또한, 진핵 세포주에서 분비된 단백질의 발현을 위해, 증가된 표면-대-부피 비율은 더 높은 수준의 분비를 허용하여 배양 상등액에서 더 높은 단백질 수율을 허용한다. 마지막으로, 이들 방법은 진핵 발현 배양의 쉬운 스케일-업 (scale-up)을 허용한다.
VWF를 발현하는 세포는 세포 배양 성장 동안 구형 또는 다공성 미립담체에 결합될 수 있다. 미립담체는 Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303)에 기재된 바와 같이 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로오스 등에 기반한 미립담체 군으로부터 선택된 미립담체일 수 있다. 구형 미립담체에서 바이오매스로 세포를 성장시키고 이들이 최종 발효기 바이오매스에 도달하고 다공성 미립담체에서 발현된 단백질을 생성하기 전에 또는 그 반대의 경우 세포를 계대배양하는 것도 가능하다. 적합한 구형 미립담체는 매끄러운 표면 미립담체, 예컨대 CytodexTM 1, CytodexTM 2, 및 CytodexTM 3 (GE Healthcare) 및 거대다공성 미립담체, 예컨대 CytoporeTM 1, CytoporeTM 2, CytolineTM 1, 및 CytolineTM 2 (GE Healthcare)를 포함할 수 있다.
추가의 구현예에서, VWF 프로펩티드는 프로-VWF의 퓨린으로의 노출을 통해 시험관내 미성숙한 VWF로부터 절단된다. 일부 구현예에서, 프로펩티드 절단을 위해 사용된 퓨린은 재조합 퓨린이다.
특정 구현예에서, rVWF는 고분자량 rVWF를 생성하는 세포 배양 배지에서 배양된 세포에서 발현된다. 용어 "세포 배양 용액", "세포 배양 배지 또는 배지들," 및 "세포 배양 상등액"은 당업계에 일반적으로 잘 알려진 세포 배양 공정의 양상을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 세포 배양 용액은 세포 배양 배지 및 세포 배양 상등액을 포함할 수 있다. 세포 배양 배지는, 임의로 보충물과 함께, 외부로부터 세포 배양 용액에 첨가되어, VWF를 발현하는 세포를 배양하기 위한 영양소 및 다른 성분을 제공한다. 세포 배양 상등액은 세포 배양 배지로부터의 영양소 및 다른 성분뿐만 아니라 배양 동안 세포로부터 방출, 대사 및/또는 분비되는 생성물을 포함하는 세포 배양 용액을 지칭한다. 추가의 구현예에서, 배지는 동물성 단백질 부재 (animal protein-free)이고 화학적으로 정의될 수 있다. 동물성 단백질 부재이고 화학적으로 정의된 배양 배지를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있는데, 예를 들어, US 제2006/0094104호, US 제2007/0212770호, 및 US 제2008/0009040호에 알려져 있고, 이들은 모든 목적, 특히 세포 배양 배지와 관련된 모든 교시를 위해 본원에 포함된다. "단백질 부재 (protein free)" 및 관련 용어는 성장 동안 자연적으로 단백질을 배출하는 배양물 내의 세포에 외인성이거나 세포 이외의 공급원으로부터 유래한 단백질을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 배양 배지는 폴리펩티드 부재이다. 또 다른 구현예에서, 배양 배지는 무 혈청이다. 또 다른 구현예에서, 배양 배지는 동물성 단백질 부재이다. 또 다른 구현예에서, 배양 배지는 동물성 성분 부재이다. 또 다른 구현예에서, 배양 배지는 단백질, 예를 들어, 혈청, 예컨대 소 태아 혈청으로부터의 동물성 단백질을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 배양물은 외생적으로 첨가된 재조합 단백질을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 단백질은 인증된 병원균 부재 동물로부터 유래된다. 본원에 사용된 용어 "화학적으로 정의된"이란, 배지가, 예를 들어, 동물성 성분, 기관, 샘 (gland), 식물 또는 효모의 추출물과 같은 임의의 정의되지 않은 보충물을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 화학적으로 정의된 배지의 각 성분이 정확하게 정의된다. 바람직한 구현예에서, 배지는 동물성-성분 부재이고 단백질 부재이다.
특정 구현예에서, VWF를 발현하는 세포의 배양은 적어도 약 7일, 또는 적어도 약 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 약 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 약 2개, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 이상 동안 유지될 수 있다. 재조합 VWF 단백질의 생성을 위해 세포-배양이 유지되는 세포 밀도는 단백질 발현에 사용되는 배양-조건 및 배지에 따라 달라질 것이다. 당업자는 VWF를 생성하는 세포-배양을 위한 최적의 세포 밀도를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 일 구현예에서, 배양은 연장된 기간 동안 약 0.5x106 세포/ml와 4x107 세포/ml 사이의 세포 밀도로 유지된다. 다른 구현예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0x106 세포/ml와 약 1.0x107 세포/ml 사이의 농도로 유지된다. 다른 구현예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0x106 세포/ml와 약 4.0x106 세포/ml 사이의 농도로 유지된다. 다른 구현예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0x106 세포/ml와 약 4.0x106 세포/ml 사이의 농도로 유지된다. 또 다른 구현예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 2.0x106과 약 4.0x106 사이, 또는 약 1.0x106과 약 2.5x106 사이, 또는 약 1.5x106과 약 3.5x106 사이, 또는 임의의 다른 유사한 범위의 농도로 유지될 수 있다. 세포 배양에서 적절한 시간 후에, rVWF는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 발현 시스템으로부터 단리될 수 있다.
특정 구현예에서, rVWF의 생성을 위한 연속 세포 배양의 세포 밀도는 연장된 기간 동안 2.5x106 세포/mL 이하의 농도로 유지된다. 다른 특정 구현예에서, 세포 밀도는 2.0x106 세포/mL 이하, 1.5x106 세포/mL, 1.0x106 세포/mL, 0.5x106 세포/mL 이하로 유지된다. 일 구현예에서, 세포 밀도는 1.5x106 세포/mL와 2.5x106 세포/mL 사이로 유지된다.
상기 기재된 세포 배양의 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 구리를 포함하는 배지 보충물을 포함한다. 그러한 세포 배양 용액은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,852,888호 및 미국 특허 번호 제9,409,971호에 기재되어 있으며, 이들은 모든 목적, 특히 재조합 VWF를 생성하기 위한 세포 배양 방법 및 조성물과 관련된 모든 교시를 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
프리프로-VWF의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되어 있고, 각각 GenBank 기탁 번호 NM_000552 (호모 사피엔스 폰 빌레브란트 인자 (VWF) mRNA) 및 NP_000543으로 입수 가능하다. 성숙한 VWF 단백질에 해당되는 아미노산 서열은 서열번호 3으로 제시되어 있다 (전장 프리프로-VWF 아미노산 서열의 아미노산 764-2813에 해당함). 일부 구현예에서, VWF는 서열번호 3의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 동일성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 mat-rVWF는 서열번호 3의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 동일성을 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,597,910호, 미국 특허 공개 번호 제2016/0129090호뿐만 아니라 도 60도 참조한다.
유용한 rVWF의 한 형태는 적어도, 적어도 하나의 인자 VIII (FVIII) 분자의 생체내-안정화, 예를 들어, 결합의 성질을 가지고, 임의로 약리학적으로 허용되는 글리코실화 패턴을 갖는다. 이의 구체적인 예는 이와 같이 단백질 분해에 내성이 있는 A2 도메인이 없는 VWF (Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997), 및 당단백질 lb-결합 도메인 및 콜라겐 및 헤파린에 대한 결합 부위를 포함하는 Val 449로부터 Asn 730까지의 VWF 단편 (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989)을 포함한다. 일 양상에서, 적어도 하나의 FVIII 분자를 안정화시키는 VWF의 능력의 결정은 최신 기술로 알려진 방법에 따라 VWF-결핍 포유류에서 수행된다.
본 발명의 rVWF는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 하나의 구체적인 예는 1986년 10월 23일에 공개된 제WO86/06096호 및 1990년 7월 23일에 출원된 미국 특허 출원 번호 제07/559,509호에 개시되어 있으며, 이는 재조합 VWF를 생성하는 방법과 관련하여 본원에 참조로 포함된다. 따라서, (i) 예를 들어, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통해 유전공학에 의한 재조합 DNA의 생성을 위해, (ii) 형질감염에 의해, 예를 들어, 전기천공 또는 미세주입을 통해 원핵 또는 진핵 세포에 재조합 DNA를 도입하고, (iii) 예를 들어, 연속 또는 배치 방식으로 형질전환된 세포를 배양하고, (iv) 예를 들어, 구성적으로 또는 유도시 VWF를 발현하고, (v) 예를 들어, 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포를 수확함으로써 VWF를 단리하여, (vi) 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피를 통해 정제된 rVWF를 수득하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 일 양상에서, 재조합 VWF는 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환된 숙주 세포에서 제조된다. 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 적합한 제한 효소를 사용하여 DNA로부터 절제될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 양상에서, DNA 분자는 화학적 합성 기술, 예컨대 포스포라미데이트 방법을 사용하여 합성된다. 또한, 또 다른 양상에서, 이들 기술의 조합이 사용된다.
본 발명은 또한 적절한 숙주에서 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 제공한다. 벡터는 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 폴리 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 벡터에 삽입되기 전에 또는 후에 이러한 작동 연결을 수행하는 방법은 잘 알려져 있다. 발현 조절 서열은 프로모터, 활성인자, 인핸서, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 시작 신호, 정지 신호, 캡 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 전사 또는 해독의 제어와 관련된 기타 신호를 포함한다. 이에 폴리뉴클레오티드를 갖는 생성된 벡터는 적절한 숙주를 형질전환하기 위해 사용된다. 이러한 형질전환은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
임의의 다수의 이용 가능하고 잘 알려진 숙주 세포가 본 발명의 실시에 사용된다. 특정 숙주의 선택은, 예를 들어, 선택된 발현 벡터와의 호환성, DNA 분자에 의해 암호화된 펩티드의 독성, 형질전환 속도, 펩티드의 회수 용이성, 발현 특성, 생물안정성 및 비용을 포함하여 당업계에 인식된 다수의 인자에 따라 달라진다. 모든 숙주 세포가 특정 DNA 서열의 발현에 동등하게 효과적인 것은 아니라는 이해와 함께 이러한 인자의 균형을 맞춰야 한다. 이러한 일반적인 지침 내에, 유용한 미생물 숙주 세포는, 제한 없이, 박테리아, 효모 및 기타 진균, 곤충, 식물, 배양 중인 포유류 (인간 포함) 세포, 또는 당업계에 알려진 다른 숙주를 포함한다.
형질전환된 숙주 세포는 원하는 화합물이 발현되도록 기존의 발효 조건에서 배양된다. 그러한 발효 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 마지막으로, 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 배양 배지 또는 숙주 세포 자체로부터 정제된다.
본 발명의 화합물을 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 따라, 탄수화물 (올리고사카라이드) 군은 단백질에서 글리코실화 부위로 알려진 부위에 임의로 부착된다. 일반적으로, O-연결된 올리고사카라이드는 세린 (Ser) 또는 트레오닌 (Thr) 잔기에 부착되는 반면, N-연결된 올리고사카라이드는 Asn-X-Ser/Thr 서열의 일부인 경우, 아스파라긴 (Asn) 잔기에 부착되고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. X는 바람직하게는 프롤린을 계산하지 않는 19개의 자연 발생 아미노산 중 하나이다. N-연결된 및 O-연결된 올리고사카라이의 구조 및 각 유형에서 발견되는 당 잔기는 상이하다. N-연결된 올리고당과 O-연결된 올리고당 둘 다에서 흔히 발견되는 한 가지 유형의 당은 N-아세틸뉴라민산 (시알산으로 지칭됨)이다. 시알산은 일반적으로 N-연결된 올리고사카라이드와 O-연결된 올리고사카라이드 둘 다의 말단 잔기이고, 음전하로 인해, 일 양상에서, 글리코실화 화합물에 산성 성질을 부여한다. 그러한 부위(들)는 본 발명의 화합물의 링커에 혼입될 수 있고, 바람직하게는 (포유 동물 세포, 예컨대 CHO, BHK, COS에서)폴리펩티드 화합물의 재조합 생성 동안 세포에 의해 글리코실화된다. 다른 양상에서, 그러한 부위는 당업계에 알려진 합성 또는 반합성 절차에 의해 글리코실화된다.
일부 구현예에서, 시알화 (sialysation) (시알릴화 (sialylation)로도 지칭됨)는 (음이온 교환, 양이온 교환, 크기 배제 및/또는 면역친화성 방법을 포함하는) 본원에 기재된 정제 절차의 일부로서 컬럼에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 시알릴화는 시알릴화를 거치지 않은 rVWF에 비해 rVWF의 안정성 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 시알릴화는 시알릴화를 거치지 않은 rVWF에 비해 (예를 들어, 대상체에게 투여 후) 혈액 순환에서 rVWF의 안정성 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 타액분비 rVWF의 증가된 안정성은 시알릴화를 거치지 않은 rVWF에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 시알릴화는 시알릴화를 거치지 않은 rVWF에 비해 rVWF의 반감기 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 시알릴화는 시알릴화를 거치지 않은 rVWF에 비해 (예를 들어, 대상체에게 투여 후) 혈액 순환에서 rVWF에 대한 증가된 반감기를 초래한다. 일부 구현예에서, 시알릴화된 rVWF의 증가된 반감기는 시알릴화를 거치지 않은 rVWF에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 시알릴화된 rVWF의 증가된 반감기는 시알릴화를 거치지 않은 rVWF에 비해 (예를 들어, 대상체에게 투여 후) 혈액 순환에서 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간 이상 동안 안정한 rVWF를 초래한다. 일부 구현예에서, 시알릴화는 2,3 시알릴화 및/또는 2,6 시알릴화의 수를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,3 시알릴트랜스퍼라제 및/또는 2,6 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA (시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,3 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA (시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 2,3 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,3 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA (시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 시알릴화를 증가시키기 위해, 결합된 단백질 (예를 들어, 결합된 rVWF)을 시알리다제 (예를 들어, 뉴라미니다제)로 처리하여 2,3 시알릴화를 제거한 다음, 세척 단계를 적용하여 시알리다제를 제거하고, 2,6 시알릴화를 도입한다. 일부 구현예에서, 2,6 시알릴화는 2,6 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA의 첨가에 의해 도입된다.
일부 구현예에서, 2,6 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,6 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA (시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, 2,3 시알릴화 및/또는 2,6 시알릴화는 추가 완충 단계로서 2,3 시알릴트랜스퍼라제 및/또는 2,6 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA (시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염)의 첨가에 의해 증가된다. 일부 구현예에서, CMP-NANA는 화학적 또는 효소적으로 변형되어 변형된 시알산을 잠재적인 자유 위치로 전달된다. 일부 구현예에서, 시알릴화는 rVWF를 수지 상에 로딩하는 단계, 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 완충액을 세척하여 원치 않는 불순물을 고갈시키는 단계, 추가 시알릴화를 허용하는 조건에서 시알릴트랜스퍼라제 및 CMP-NANA를 함유하는 하나 이상의 완충액을 적용하는 단계, 하나 이상의 완충액으로 세척하여 과량의 시알릴화 시약을 고갈시키는 단계, 및 하나 이상의 완충액으로 향상된 rVWF (예를 들어, 시알릴화가 증가된 rVWF)를 용출시키는 단계에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 시알릴화 공정은 본원에 기재된 바와 같은 양이온 교환 방법, 음이온 교환 방법, 크기 배제 방법, 또는 면역친화성 정제 방법의 일부로서 수행된다.
대안적으로, 화합물은, 예를 들어, 고체 상 (phase) 합성 기술을 사용하는 합성 방법에 의해 제조된다. 적합한 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 하기 문헌에 기재된 것들을 포함한다: Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al.(1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; and Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527'. 고체 상 합성은 작은 펩티드를 제조하는 가장 비용-효율적인 방법이기 때문에 개별 펩티드를 제조하는 바람직한 기술이다.
VWF의 단편, 변이체 및 유사체는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 생성될 수 있다. 폴리펩티드의 단편은, 제한 없이, 효소적 절단 (예를 들어, 트립신, 키모트립신)을 사용하고 또한 특이적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 단편을 생성하기 위한 재조합 수단을 사용하여 제조될 수 있다. 다량체화 도메인 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 동정 가능한 VWF 도메인과 같은 특정 활성을 갖는 단백질의 영역을 포함하는 폴리펩티드 단편이 생성될 수 있다.
폴리펩티드 유사체를 제조하는 방법 또한 잘 알려져 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 유사체는 치환, 삽입, 추가 또는 결실 유사체일 수 있다. 폴리펩티드의 단편을 포함하는 결실 유사체는 기능 또는 면역원성 활성에 필수적이지 않은 천연 단백질의 하나 이상의 잔기가 결여되어 있다. 삽입 유사체는, 예를 들어, 폴리펩티드의 비-말단 지점에서 아미노산(들)의 첨가를 포함한다. 이 유사체는, 예를 들어, 제한 없이, 면역반응성 에피토프 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 단편을 포함하는 부가 유사체는 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 하나 이상의 아미노산의 첨가를 포함하고, 예를 들어, 융합 단백질을 포함한다. 상기 언급된 유사체의 조합도 고려된다.
치환 유사체는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 야생형의 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 교환하고, 다른 기능 또는 성질의 완전한 손실 없이 폴리펩티드의 하나 이상의 성질을 조절하도록 설계될 수 있다. 일 양상에서, 치환은 보존적 치환이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산을 측쇄 또는 유사한 화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것이다. 보존적 치환을 만들기 위한 유사한 아미노산은 산성 측쇄 (글루탐산, 아스파르트산); 염기성 측쇄 (아르기닌, 리신, 히스티딘); 극성 아미드 측쇄 (글루타민, 아스파라긴); 소수성 지방족 측쇄 (류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 글리신); 방향족 측쇄 (페닐알라닌, 트립토판, 티로신); 작은 측쇄 (글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌); 또는 지방족 하이드록실 측쇄 (세린, 트레오닌)를 갖는 것들을 포함한다.
일 양상에서, 유사체는 이들이 유래된 재조합 VWF와 실질적으로 상동성이거나 실질적으로 동일하다. 유사체는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어, 혈액 응고 활성의 적어도 일부를 유지하는 것들을 포함한다.
고려되는 폴리펩티드 변이체는, 제한 없이, 유비퀴틴화, 폴리시알화 (polysialation) (또는 폴리시알릴화 (polysialylation))를 포함하는 글리코실화, 치료제 또는 진단제에 대한 접합, 표지화, 공유 중합체 부착, 예컨대 페길화 (폴리에틸렌 글리콜로 유도체화), 비가수분해성 결합의 도입, 및 인간 단백질에서 일반적으로 발생하지 않는 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 본 발명의 비변형된 분자와 동일하거나 본질적으로 동일한 결합 성질을 유지한다. 그러한 화학적 변형은 VWF 폴리펩티드에 대한 제제의 직접 또는 간접 (예를 들어, 링커를 통한) 부착을 포함할 수 있다. 간접 부착의 경우, 링커는 가수분해 가능하거나 가수분해 가능하지 않을 수 있음이 고려된다.
일 측면에서, 페길화된 폴리펩티드 유사체를 제조하는 것은 (a) 결합 작제물 폴리펩티드가 하나 이상의 PEG 기에 부착되는 조건 하에 폴리펩티드를 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응시키는 단계 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적화 반응 조건은 알려진 매개변수 및 원하는 결과를 기반으로 결정된다. 예를 들어, PEG:단백질의 비율이 클수록 폴리-페길화 생성물의 비율이 커진다. 일부 구현예에서, 결합 작제물은 N-말단에서 단일 PEG 모이어티를 갖는다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 혈액 응고 인자에 부착되어, 예를 들어, 생체 내에서 더 긴 반감기를 제공할 수 있다. PEG 기는 임의의 편리한 분자량을 가질 수 있고 선형 또는 분지형이다. PEG의 평균 분자량은 약 2 킬로돌턴 ("kD") 내지 약 100 kDa, 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위이다. 특정 양상에서, PEG 기는 혈액 응고 인자 (예를 들어, 알데히드, 아미노, 또는 에스테르기) 상의 반응성 기에 대한 PEG 모이어티 (예를 들어, 알데히드, 아미노, 티올, 또는 에스테르기) 상의 천연 또는 조작된 반응성기를 통한 아실화 또는 환원성 알킬화를 통해 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 기술에 의해 혈액 응고 인자에 부착된다.
폴리시알릴화된 폴리펩티드를 제조하는 방법은 다음에 기재되어 있다: 미국 특허 공개 제20060160948호, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, and Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006. 간단히, 0.1 M NaIO4를 함유하는 콜로민산 (CA) 용액을 어두운 곳에서 실온에서 교반하여 CA를 산화시킨다. 활성화된 CA 용액을, 예를 들어, 어두운 곳에서 pH 7.2의 0.05 M 인산 나트륨 완충액에 대해 투석하고, 이 용액을 rVWF 용액에 첨가하고, 온화한 진탕 하에 어두운 곳에서 실온에서 18시간 동안 항온처리하였다. 유리 시약은, 예를 들어, 한외여과/정용 여과에 의해 rVWF-폴리시알산 접합체로부터 임의로 분리된다. rVWF와 폴리시알산의 접합은 가교결합 시약으로서 글루타르알데히드를 사용하여 달성된다 (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004).
본 발명의 폴리펩티드가 폴리펩티드인 제2 제제와의 융합 단백질인 것이 또 다른 양상에서 추가로 고려된다. 일 구현예에서, 폴리펩티드인 제2 제제는, 제한 없이, 효소, 성장 인자, 항체, 사이토카인, 케모카인, 세포-표면 수용체, 세포 표면 수용체의 세포외 도메인, 세포 부착 분자, 또는 상기 기재된 단백질의 단편 또는 활성 도메인이다. 관련된 구현예에서, 제2 제제는 혈액 응고 인자, 예컨대 인자 VIII, 인자 VII 및/또는 인자 IX이다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 융합 단백질이다. 고려되는 융합 단백질은 당업계에 잘 알려진 화학적 또는 재조합 기술에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 rVWF-FVIII 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 rVWF-FVIII 융합 단백질이고, 여기서, 활성 FVIII은 VWF 모티프에 매립된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 rVWF-FVIII 융합 단백질이고, 여기서, 활성 FVIII은 VWF가 전장이도록 VWF 모티프에 매립된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 rVWF-FVIII 융합 단백질이고, 여기서, 활성 FVIII은 VWF 모티프에 매립되고, 여기서, VWF 서열의 일부는 결실되고 FVIII-서열로 대체된다. rVWF-FVIII 융합 단백질의 일부 구현예에서, FVIII은 B-도메인 결실된 FVIII이다. rVWF-FVIII 융합 단백질의 일부 구현예에서, N-글리코실화 풍부 도메인은 FVIII-B-도메인을 대체한다. rVWF-FVIII 융합 단백질의 일부 구현예에서, vWF-N 글리코실화 풍부 도메인은 전장 FVIII 및/또는 이의 절단된 형태에 융합된다.
rVWF-FVIII 융합 단백질의 일부 구현예에서, 융합 단백질은 다음을 포함한다:
ㆍ VWF 펩티드의 위치 764 내지 1336을 포함하는 VWF 펩티드,
ㆍ FVIII 중쇄 펩티드의 위치 24 내지 760을 포함하는 FVIII 펩티드,
ㆍ VWF 펩티드의 위치 2218 내지 2593을 포함하는 VWF 펩티드,
ㆍ FVIII 경쇄 펩티드의 위치 1333 내지 2351을 포함하는 FVIII 펩티드, 및
ㆍ VWF 펩티드의 위치 2620 내지 2813을 포함하는 VWF 펩티드.
rVWF-FVIII 융합 단백질의 이러한 구현예에서, 아미노산의 위치는 프로 및/또는 신호 펩티드를 포함하여 제1 위치로부터 계산된다. rVWF-FVIII 융합 단백질의 제1 구현예에서, VWF의 위치 764는 성숙한 rVWF (mat-rVWF)의 위치 1에 해당하고, FVIII의 위치 20은 성숙한 FVIII 펩티드의 위치 1에 해당한다. rVWF-FVIII 융합 단백질의 일부 구현예에서, 융합 단백질 서열은 도 64에 제공된다.
rVWF-FVIII 융합 단백질의 일부 구현예에서, 융합 단백질은 다음을 포함한다:
ㆍ FVIII 중쇄 펩티드의 위치 FVIII 중쇄 19 내지 760을 포함하는 FVIII 펩티드,
ㆍ VWF 펩티드의 위치 2218 내지 2593을 포함하는 VWF 펩티드, 및
ㆍ FVIII 경쇄 펩티드의 위치 1333 내지 2351을 포함하는 FVIII 펩티드.
rVWF-FVIII 융합 단백질의 이러한 구현예에서, 아미노산의 위치는 프로 및/또는 신호 펩티드를 포함하여 제1 위치로부터 계산된다. rVWF-FVIII 융합 단백질의 이러한 구현예에서, VWF의 위치 764는 성숙한 rVWF (mat-rVWF)의 위치 1에 해당하고, FVIII의 위치 20은 성숙한 FVIII 펩티드의 위치 1에 해당한다. rVWF-FVIII 융합 단백질의 일부 구현예에서, 융합 단백질 서열은 도 65에 제공된다.
또 다른 양상에서, 프리프로-VWF 및 프로-VWF 폴리펩티드가 본 발명의 제형에서 치료적 이점을 제공할 것이라는 것 또한 고려된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,005,502호에는 시험관 내에서 트롬빈 생성을 유도하는 상당한 양의 프로-VWF를 포함하는 약제학적 제제가 기재되어 있다. 자연-발생 성숙한 VWF의 재조합, 생물학적 활성 단편, 변이체, 또는 기타 유사체 이외에, 본 발명은 본원에 기재된 제형에서 프리프로-VWF (서열번호 2로 제시됨) 또는 프로-VWF 폴리펩티드 (서열번호 2의 아미노산 잔기 23 내지 764)의 재조합 생물학적 활성 단편, 변이체, 또는 유사체의 사용을 고려한다.
단편, 변이체 및 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연-발생 분자와 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 자연-발생 분자의 생물학적 활성 단편, 변이체, 또는 유사체를 암호화하기 위해 숙련된 작업자에 의해 쉽게 생성 될 수 있다. 다양한 양상에서, 이들 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술, DNA 암호화 분자의 분해/결찰 등을 사용하여 제조된다. 따라서, 당업자는 부위-특이적 돌연변이 유발을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 DNA 가닥에서 단일 염기 변화를 생성하여 변경된 코돈 및 미스센스 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 문구 "적당히 엄격한 혼성화 조건"은, 예를 들어, 50% 포름아미드에서 42℃에서 혼성화 및 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 60℃에서의 세척을 의미한다. 이들 조건의 변이는 혼성화될 서열의 길이 및 GC 뉴클레오티드 염기 함량에 기반하여 발생한다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 당업계에서 표준 제형은 정확한 혼성화 조건을 결정하는데 적절하다. 예를 들어, 문헌 (Sambrook et al., 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))을 참조한다.
G. 바이러스 불활성화
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함한다. 바이러스 불활성화 단계는 세척 단계 및/또는 용출 단계 전에, 후에, 또는 이와 동시에, 그러나 수집 단계 전에 발생할 수 있다. 바이러스 불활성화 처리는 지질 외피 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리는 용매 및 세제 (S/D) 처리이다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리는 알코올 섹션에서 에틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜 및/또는 하나 이상의 유기 용매(들)의 사용을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스를 불활성화시키는" 또는 "바이러스 불활성화"는 바이러스가 더 이상 세포를 감염시키고, 복제하고, 증식하고, 그 자체로 바이러스를 제거할 수 없는 과정을 지칭한다. 이와 같이, 용어 "바이러스 불활성화"는 일반적으로 본원에 개시된 유체를 감염성 바이러스 오염물이 전혀 없게 만드는 과정을 지칭한다. 본원에 개시된 방법을 사용하는 임의의 바이러스 불활성화 정도가 바람직하다. 그러나, 의약품에 대한 엄격한 안전 지침을 충족하는 데 필요한 바이러스 불활성화 정도를 달성하는 것이 바람직하다. 이러한 지침은 WHO에 의해 제시되고 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에 개시된 방법은 항온처리 후 혼합물로부터 바이러스를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스를 제거하는" 또는 "바이러스 제거"는 바이러스 입자가 혼합물로부터 효과적으로 추출되도록 본원에 개시된 혼합물로부터 바이러스를 고갈시키는 공정을 지칭한다. 바이러스는 실행 가능한 바이러스이거나 불활성화된 바이러스일 수 있다. 제거는 전형적으로 크기 배제 크로마토그래피 또는 양성 흡착 크로마토그래피에 의해 달성되며, 여기서, 관심 단백질이, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지를 포함하는 크로마토그래피 수지에 결합한다. 제거 후에, 잔류 바이러스의 양은, 예를 들어, 인간을 포함하여 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 경우 실질적으로 장기간 또는 영구적인 해로운 영향이 없는 양이다.
일 구현예에서, 바이러스 제거 후 혼합물에는 본질적으로 바이러스 부재이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "본질적으로 바이러스 부재"란, 바이러스의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하기 위해 사용되는 기기 또는 공정에 의해 미량의 바이러스만이 검출 또는 확인될 수 있고 그러한 미량의 바이러스는 인간의 건강에 해롭기에는 불충분하다는 것을 의미한다. 이 구현예의 일 양상에서, 바이러스의 제거 후 혼합물에는 바이러스가 완전히 부재이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스의 완전 부재"란, 바이러스의 존재 또는 활성을 검출 또는 확인하기 위해 사용되는 기기 또는 공정의 검출 범위 내에서 바이러스의 존재가 검출 또는 확인될 수 없다는 것을 의미한다. 바이러스가 본질적으로 부재이거나 완전히 부재인 혼합물 내에 함유된 단백질은, 바이러스가 인간의 건강에 해롭기에는 불충분하기 때문에 인간에게 투여하기에 안전한 약제학적 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 구현예의 다른 양상에서, 바이러스 제거 후 혼합물은 10 PFU/mL 미만의 바이러스, 예를 들어, 1 PFU/mL 미만의 바이러스, 1x10-1 PFU/mL 미만의 바이러스, 1x10-2 PFU/mL 미만의 바이러스, 또는 1x10-3 PFU/mL 미만의 바이러스를 포함한다.
이러한 구현예의 또 다른 양상에서, 바이러스 제거 후의 혼합물은 바이러스에 대해 ID50 미만을 포함하는데, 예를 들어, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 10배 적고, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 100배 적고, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 200배 적고, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 300배 적거나, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 400배 적거나, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 500배 적거나, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 600배 적거나, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 700배 적거나, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 800배 적거나, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 900배 적거나, 바이러스에 대해 ID50보다 적어도 1000배 적다.
바이러스 불활성화는 단백질 정제와 함께 수행되거나 수행되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 지지체 상에 단백질을 고정시키는 단계; 및 고정된 단백질을 비이온성 세제 및 유기 용매를 포함하는 세제-용매 혼합물로 처리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 지지체는 크로마토그래피 수지이다. 특정 구현예에서, 세제-용매 혼합물은 1% Triton X-100, 0.3% 트리-N-부틸포스페이트, 및 0.3% 폴리소르베이트 80 (Tween 80)을 포함한다. 용매-세제 혼합물 처리는 연장된 시간 동안, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 계속될 수 있는 반면, 단백질은 크로마토그래피 수지, 예를 들어, 양이온 교환 수지 상에 고정된 상태로 있고/있거나, 용매-세제 처리는 2℃ 내지 10℃에서 발생할 수 있다. 바이러스 불활성화에 대한 이러한 접근법은 놀랍게도, 단백질이 용액에 고정되지 않은 용매-세제 혼합물을 사용한 처리에 비해 세제-용매 혼합물로의 처리 동안 단백질 응집체의 형성을 상당한 양으로, 예를 들어, 50% 초과로 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스를 함유하는 지질-코트를 불활성화하는 방법은 하기 단계를 포함한다: i) 활성을 갖는 단백질을 포함하는 유체를 제공하는 단계; ii) 유기 용매 및 계면활성제를 상기 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 iii) 상기 혼합물을 약 120분 이하 동안 항온처리하는 단계; 여기서, 단계 (ii) 및 (iii)은 둘 다 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되고; 항온처리 후 혼합물은 본질적으로 생존 가능한 바이러스 함유 지질-코트가 부재이고; 항온처리 후 단백질은 단계 (i)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는다.
다른 구현예에서, 바이러스 함유 지질-코트가 본질적으로 부재인 단백질은 하기 단계를 포함하는 방법으로부터 수득될 수 있다: i) 활성을 갖는 단백질을 포함하는 유체를 제공하는 단계; ii) 유기 용매 및 계면 활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 iii) 상기 혼합물을 약 120분 이하 동안 항온처리하는 단계; 여기서, 단계 (ii) 및 (iii)은 둘 다 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되고; 항온처리 후 혼합물은 본질적으로 생존 가능한 바이러스 함유 지질-코트 가 부재이고; 항온처리 후 단백질은 단계 (i)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 바이러스 함유 지질-코트를 불활성화시키는 방법은 하기 단계를 포함한다: i) 활성을 갖는 혈액 응고 단백질 (예를 들어, VWF)을 포함하는 유체를 제공하는 단계; ii) 유기 용매 및 계면활성제를 유체와 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계; 및 iii) 상기 혼합물을 약 120분 이하 동안 항온처리하는 단계; 여기서, 단계 (ii) 및 (iii)은 둘 다 약 20℃ 이하의 온도에서 수행되고; 항온처리 후 혼합물은 본질적으로 생존 가능한 바이러스 함유 지질-코트가 부재이고; 항온처리 후 인자 VIII은 단계 (i)에서 제공된 활성의 적어도 25%의 활성을 갖는다.
일부 경우에, 유기 용매는 에테르, 알코올, 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트이다. 특정 구현예에서, 에테르는 디메틸 에테르, 디에틸 에테르, 에틸 프로필 에테르, 메틸-부틸 에테르, 메틸 이소프로필 에테르 및/또는 메틸 이소부틸 에테르로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, n-펜탄올 및/또는 이소펜탄올로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 디알킬포스페이트는 디-(n-부틸)포스페이트, 디-(t-부틸)포스페이트, 디-(n-헥실)포스페이트, 디-(2-에틸헥실)포스페이트, 디-(n-데실)포스페이트 및/또는 에틸 디(n-부틸) 포스페이트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 트리알킬포스페이트는 트리-(n-부틸)포스페이트, 트리-(t-부틸)포스페이트, 트리-(n-헥실)포스페이트, 트리-(2-에틸헥실)포스페이트 및/또는 트리-(n-데실)포스페이트로부터 선택된다.
일부 경우에, 유기 용매의 최종 농도는 약 0.1% (v/v) 내지 약 5.0% (v/v), 약 0.1% (v/v) 내지 약 1.0% (v/v), 약 0.2% (v/v) 내지 약 0.5% (v/v), 또는 약 0.2% (v/v) 내지 약 0.4% (v/v), 약 0.3% (v/v)이다.
일부 경우에, 계면활성제는 이온성 계면활성제, 쯔비터이온성 (양쪽이온성) 계면활성제 및/또는 비이온성 계면활성제로부터 선택된다. 이온성 계면활성제는 음이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제일 수 있다.
특정 구현예에서, 음이온성 계면활성제는 알킬 설페이트, 알킬 에테르 설페이트, 도쿠세이트, 설포네이트 플루오로계면활성제, 알킬 벤젠 설포네이트, 알킬 아릴 에테르 포스페이트, 알킬 에테르 포스페이트; 알킬 카복실레이트, 나트륨 라우로일 사르코시네이트 및/또는 카복실레이트 플루오로계면활성제로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 알킬 설페이트는 암모늄 라우릴 설페이트 또는 나트륨 라우릴 설페이트 (SDS)로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 알킬 에테르 설페이트는 나트륨 라우레스 설페이트 및/또는 나트륨 미레스 설페이트이다. 일부 구현예에서, 도쿠세이트는 디옥틸 나트륨 설포석시네이트이다.
일부 구현예에서, 설포네이트 플루오로계면활성제는 퍼플루오로옥탄설포네이트 (PFOS) 및/또는 퍼플루오로부탄설포네이트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 알킬 카복실레이트는 지방산 염 및/또는 스테아르산 나트륨으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 카복실레이트 플루오로계면활성제는 퍼플루오로노나노에이트 및 퍼플루오로옥타노에이트이다. 일부 구현예에서, 양이온성 계면활성제는 알킬트리메틸암모늄 염, 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC), 폴리에톡실화 탈로우 아민 (POEA), 벤잘코늄 클로라이드 (BAC), 벤제토늄 클로라이드 (BZT), 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산, 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드, 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드 (DODAB), pH-의존성 1급 아민, pH-의존성 2급 아민 및/또는 pH-의존성 3급 아민으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 알킬트리메틸암모늄 염은 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 및/또는 세틸 트리메틸암모늄 클로라이드 (CTAC)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1급 아민은 pH < 10에서 양으로 하전되거나, 2급 아민은 pH < 4에서 한정된다.
일부 구현예에서, 양이온성 계면활성제는 옥테니딘 디하이드로클로라이드이다.
일부 구현예에서, 쯔비터이온성 계면활성제는 3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 (CHAPS), 설타인, 베타인 및/또는 레시틴이다. 일부 구현예에서, 설타인은 코카미도프로필 하이드록시설타인이다. 일부 구현예에서, 베타인은 코카미도프로필 베타인이다.
일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르, 폴록사머, 알킬 페놀 폴리글리콜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 2-도데콕시에탄올 (LUBROL®-PX), 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르, 페녹시폴리에톡실에탄올, 글루코시드 알킬 에테르, 말토시드 알킬 에테르, 티오글루코시드 알킬 에테르, 디기토닌, 글리세롤 알킬 에스테르, 알킬 아릴 폴리에테르 설페이트, 알코올 설포네이트, 소르비탄 알킬 에스테르, 코카미드 에탄올아민, 수크로스 모노라우레이트, 도데실 디메틸아민 옥사이드 및/또는 나트륨 콜레이트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르는 폴리소르베이트 20 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN® 20), 폴리소르베이트 40 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN® 40), 폴리소르베이트 60 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN® 60), 폴리소르베이트 61 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN® 61), 폴리소르베이트 65 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN® 65), 폴리소르베이트 80 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN® 80) 및/또는 폴리소르베이트 81 소르비탄 모노올레에이트 (TWEEN® 81)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 124 (PLURONIC® L44), 폴록사머 181 (PLURONIC® L61), 폴록사머 182 (PLURONIC® L62), 폴록사머 184 (PLURONIC® L64), 폴록사머 188 (PLURONIC® F68), 폴록사머 237 (PLURONIC® F87), 폴록사머 338 (PLURONIC® L108) 및/또는 폴록사머 407 (PLURONIC® F127)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르는 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, BRIJ® 30 및/또는 BRIJ® 35로부터 선택된다.
일부 경우에, 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르는 폴리옥시에틸렌 (4-5) p-t-옥틸 페놀 (TRITON® X-45) 및/또는 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르 (TRITON® X-100)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르는 논옥시놀-9이다.
일부 구현예에서, 페녹시폴리에톡실에탄올은 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 및/또는 옥틸 페녹시폴리에톡실에탄올로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 글루코시드 알킬 에테르는 옥틸 글루코피라노시드이다. 일부 구현예에서, 말토시드 알킬 에테르는 도데실 말토피라노시드이다. 일부 구현예에서, 티오글루코시드 알킬 에테르는 헵틸 티오글루코피라노시드이다. 일부 구현예에서, 글리세롤 알킬 에스테르는 글리세릴 라우레이트이다. 일부 구현예에서, 코카미드 에탄올아민은 코카미드 모노에탄올아민 및/또는 코카미드 디에탄올아민으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 계면활성제의 최종 농도는 약 0.1% (v/v) 내지 약 10.0% (v/v), 또는 약 0.5% (v/v) 내지 약 5.0% (v/v)이다. 일부 경우에, 계면활성제는 복수의 계면활성제이다.
바이러스 불활성화를 위한 유용한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,190,609호 및 제9,315,560호 및 미국 출원 공개 번호 제2017/0327559호에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
바이러스 불활성화는 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 용매 트리(n-부틸) 포스페이트 (TNBP) 및 세제, 예컨대, 그러나 이에 제한되지 않은 폴리소르베이트 80 및 triton X-100은 지질 외피 바이러스를 불활성화하는데 효과적이다. 바이러스 불활성화는 실온, 예컨대 14℃ 내지 약 25℃에서 약 1시간 이상 동안 수행될 수 있다. 일부 경우에, 항온처리 시간은 2시간보다 길지 않다.
일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 처리는 시트르산 나트륨 완충액을 포함하는 완충액을 바이러스 불활성화된 물질에 첨가함으로써 중단된다. 일부 경우에, 시트르산 나트륨 완충액은 약 40 mM 내지 약 100 mM 시트르산 나트륨 완충액, 예를 들어, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 또는 약 100 mM 시트르산 나트륨 완충액을 포함한다.
H. VWF 성숙
퓨린은 SPC (서브틸리신-유사 전구단백질 컨버타제), PC (전구단백질 컨버타제) 또는 일부 경우에 PACE (쌍을 이루는 염기성 아미노산 절단 효소)로서 지칭되는 단백질 계열의 일부이다. 퓨린 단백질 계열의 구성원은 퓨린, Kex2, PC2, PC1/PC3, PACE4, PC4, PC5 및/또는 PC7을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일부로서, 방법은 퓨린으로의 처리에 의해 프로-VWF (프로-rVWF)를 mat-VWF/VWF-PP (mat-rVWF/rVWF-PP) 복합체로 성숙시키는 방법을 제공한다. 임의의 이들 퓨린 계열 구성원은 VWF 성숙 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 프로-VWF는 음이온 교환 컬럼 또는 수지 상에서, 양이온 교환 컬럼 또는 수지 상에서, 또는 크기 분리 크로마토그래피 방법의 일부로서 퓨린 성숙된다. 일부 구현예에서, 프로-VWF는 음이온 교환 컬럼 또는 수지 상에서 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 절차의 일부로서 퓨린 성숙된다. 일부 구현예에서, 프로-VWF는 양이온 교환 컬럼 또는 수지 상에서 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피 절차의 일부로서 퓨린 성숙된다. 일부 구현예에서, 프로-VWF는 크기 배제 크로마토그래피 절차의 일부로서 퓨린 성숙된다. 그러한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,058,411호에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
성숙 과정을 용이하게 하고 상승된 농도에서 수지 상에 고정된 프로-VWF를 제공하기 위해, 본 발명의 일부 구현예에서, 크로마토그래피 수지는 크로마토그래피 컬럼에 충전된다. 시험관내 성숙 과정에서 프로-VWF의 농도가 성숙 효율에 영향을 미치기 때문에, 크로마토그래피 수지를 컬럼에 패킹하는 것이 유리하다. 또한, 크로마토그래피 컬럼의 사용은 보다 재현 가능한 방식으로 성숙 매개변수의 효율적인 제어를 허용하며, 이는 시험관내 VWF의 성숙을 더 간단하게 수행할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 퓨린 농도는 VWF:Ag의 IU (10 μg의 프로-rVWF)당 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 4 유닛의 재조합 활성 퓨린이다. 일부 구현예에서, 퓨린 농도는 VWF:Ag의 IU (10 μg의 프로-rVWF)당 약 2-3 유닛의 재조합 활성 퓨린이다. 일부 구현예에서, 퓨린 농도는 VWF:Ag의 IU (10 μg의 프로-rVWF)당 약 1-2 유닛의 재조합 활성 퓨린이다. 일부 구현예에서, 퓨린 농도는 VWF:Ag의 IU (10 μg의 프로-rVWF)당 약 2 단위의 재조합 활성 퓨린이다.
일부 구현예에서, 프로-VWF가 음이온 교환 수지 상에 고정되고 프로-VWF 컨버타제 활성을 나타내는 용액과 함께 항온처리되는 경우, 25℃에서 측정된 전도도는 25 mS/cm 미만이다. 일부 구현예에서, 프로-VWF가 음이온 교환 수지 상에 고정되고 프로-VWF 컨버타제 활성을 나타내는 용액과 함께 항온처리되는 경우, 25℃에서 측정된 전도도는 20 mS/cm 미만이다. 일부 구현예에서, 프로-VWF가 음이온 교환 수지 상에 고정되고 프로-VWF 컨버타제 활성을 나타내는 용액과 함께 항온처리되는 경우, 25℃에서 측정된 전도도는 16 mS/cm 미만이다. 일부 구현예에서, 프로-VWF가 음이온 교환 수지 상에 고정되고 프로-VWF 컨버타제 활성을 나타내는 용액과 함께 항온처리되는 경우, 25℃에서 측정된 전도도는 16 mS/cm와 25 mS/cm 사이이다. 일부 구현예에서, 프로-VWF가 음이온 교환 수지 상에 고정되고 프로-VWF 컨버타제 활성을 나타내는 용액과 함께 항온처리되는 경우, 25℃에서 측정된 전도도는 20 mS/cm과 25 mS/cm 사이이다. mat-rVWF뿐만 아니라 프로-rVWF는 이들 전도도 수준에서 음이온 교환 수지 상에 효율적으로 고정될 수 있다. 결과적으로, 본 방법의 과정에서 적용된 완충액은 전도도 수준을 유지하기 위해 적절하게 조정되어야 한다. 일부 구현예에서, 전도도는 퓨린 및/또는 PACE 효소가 활성 형태이고, 전체 또는 부분적으로 이동상에 존재하도록 한다.
일부 구현예에서, mat-rVWF는 25℃에서 측정될 때 적어도 40 mS/cm의 전도도로 음이온 교환 수지로부터 용출된다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 25℃에서 측정될 때 적어도 60 mS/cm의 전도도로 음이온 교환 수지로부터 용출된다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 25℃에서 측정될 때 적어도 80 mS/cm의 전도도로 음이온 교환 수지로부터 용출된다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 25℃에서 측정될 때 40 mS/cm와 80 mS/cm 사이의 전도도로 음이온 교환 수지로부터 용출된다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 25℃에서 측정될 때 60 mS/cm와 80 mS/cm 사이의 전도도로 음이온 교환 수지로부터 용출된다. 일부 구현예에서, 원하는 rVWF 종은 음이온 교환 수지를 사용하여 (예를 들어 TMAE를 사용하여) 약 12 mS/cm/25℃와 16 mS/cm/25℃ 사이의 전도도로 용출되기 시작한다. 일부 구현예에서, 주요 양 (벌크)의 원하는 rVWF 종은 음이온 교환 수지를 사용하여 55 mS/cm/25℃와 60 mS/cm/25℃ 사이에서 용출되었다. 일부 구현예에서, 원하는 rVWF 종은 양이온 교환 수지를 사용하여 약 18 mS/cm/25℃와 24 mS/cm/25℃ 사이의 전도도로 용출되기 시작한다. 일부 구현예에서, 주요 양 (벌크)의 원하는 rVWF 종은 양이온 교환 수지를 사용하여 약 36 mS/cm/25℃와 42 mS/cm/25℃ 사이에서 용출되었다. 일부 구현예에서, 원하는 rVWF는 성숙한 rVWF (예를 들어, mat-rVWF)이다. 일부 구현예에서, 주요 양 (벌크)은 용출되는 원하는 종의 총량의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 수지로부터 mat-rVWF가 용출되기 전에 추가 세척 단계가 사용된다. 일부 구현예에서, mat-rVWF가 양이온 교환 수지로부터 용출되기 전에 추가 세척 단계가 사용된다.
단백질분해 활성을 위해, 많은 프로테아제는 2가 금속 이온과 같은 보조인자가 필요하다. 퓨린 및 퓨린 단백질 계열 구성원은 활성을 위해 칼슘 이온이 필요하다. 따라서, 퓨린을 사용하여 시험관내 프로-rVWF를 성숙시키는 경우, 칼슘 염이 사용된다. 일부 구현예에서, 칼슘 염은 가용성 칼슘 염이다. 일부 구현예에서, 칼슘 염은 염화칼슘 (CaCl2)이다. 일부 구현예에서, 칼슘 염은 아세트산칼슘이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, Be2+, Ba2+, Mg2+, Mn2+, Sr2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, Cd2+ 및/또는 Cu2+를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 2가 금속 이온이 사용된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 2가 양이온의 조합이 사용된다. 일부 구현예에서, Ca2+ 및 Mg2+는 조합하여 사용된다. 일부 구현예에서, 칼슘 염은 가용성 마그네슘 염이다. 일부 구현예에서, 마그네슘 염은 염화마그네슘 (MgCl2)이다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 0.01 내지 10 mM 농도의 가용성 칼슘 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 0.01 내지 10 mM 농도의 가용성 마그네슘 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 0.01 내지 10 mM 농도의 CaCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 0.01 내지 10 mM 농도의 MgCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 0.1 내지 5 mM 농도의 CaCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 0.1 내지 5 mM 농도의 MgCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 0.2 내지 2 mM 농도의 CaCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 0.2 내지 2 mM 농도의 MgCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 성숙에 사용하기 위한 퓨린 단백질 계열 제형은 퓨린을 포함한다. 일부 구현예에서, 퓨린 농도는 VWF:Ag의 IU (10 μg의 프로-rVWF)당 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 4 유닛의 재조합 활성 퓨린이다. 일부 구현예에서, 퓨린 농도는 VWF:Ag의 IU (10 μg의 프로-rVWF)당 약 2-3 유닛의 재조합 활성 퓨린이다. 일부 구현예에서, 퓨린 농도는 VWF:Ag의 IU (10 μg의 프로-rVWF)당 약 1-2 유닛의 재조합 활성 퓨린이다. 일부 구현예에서, 퓨린 농도는 VWF:Ag의 IU (10 μg의 프로-rVWF)당 약 2 유닛의 재조합 활성 퓨린이다.
고정된 프로-rVWF와 함께 퓨린의 항온처리 시간은 사용되는 시스템에 따라 다를 수 있다. 또한, 온도, 완충액 등과 같은 인자가 성숙 과정의 효율에 영향을 미친다. 일반적으로, 성숙 과정은 48시간 미만에 종료된다. 일부 구현예에서, 성숙 과정은 1분 미만에 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙 과정은 40시간, 36시간, 30시간, 24시간, 20시간, 16시간, 10시간, 5시간, 2시간, 1시간 이하에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로-rVWF 성숙을 위한 항온처리는 1분 미만 내지 48시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 프로-rVWF 성숙을 위한 항온처리는 10분 내지 42시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 프로-rVWF 성숙을 위한 항온처리는 20분 내지 36시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 프로-rVWF 성숙을 위한 항온처리는 30분 내지 24시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 퓨린의 높은 특이성으로 인해, VWF (추가 단백질분해적 분해)의 "과활성화"는 연장된 항온처리 시간 후에도 발생하지 않는다.
일부 구현예에서, 성숙 과정은 또한 항온처리 과정에서 선택된 온도에 따라 달라진다. 퓨린의 최적 효소 활성은 온도에 따라 다양하다.
일부 구현예에서, 프로-rVWF 성숙을 위한 항온처리는 2℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 프로-rVWF 성숙을 위한 항온처리는 4℃ 내지 37℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 프로-rVWF 성숙을 위한 항온처리는 저온, 예컨대 2℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단백질 분해를 피하고/피하거나 예방하기 위해, 사용되는 최대 온도는 50℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 단백질 분해를 피하고/피하거나 예방하기 위해, 사용되는 최대 온도는 45℃ 미만이다.
일부 구현예에서, 프로-VWF (또는 프로-rVWF)는 상기 기재된 바와 같이, 퓨린 또는 퓨린 계열 구성원으로 처리함으로써 mat-VWF (or mat-rVWF)로 전환된다. 일부 구현예에서, 퓨린 처리로 프로-rVWF의 mat-rVWF 및 rVWF-PP로의 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 전환을 초래한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하고/하거나 적어도 7의 pH로 pH를 증가시키는 경우 크기 분리 후, 용출액에 5% 미만의 rVWF-PP, 4% 미만의 rVWF-PP, 3% 미만의 rVWF-PP, 2% 미만의 rVWF-PP, 1% 미만의 rVWF-PP, 0.5% 미만의 rVWF-PP, 0.4% 미만의 rVWF-PP, 0.1% 미만의 rVWF, 또는 0.05% 미만의 rVWF-PP가 존재한다.
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I. VWF 다량체
rVWF 다량체의 수 및 백분율의 평가는, 예를 들어, Cumming 등 (J Clin Pathol., 1993 May; 46(5): 470-473, 이는 모든 목적, 특히 VWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 의해 논의된 바와 같이, VWF 다량체를 크기별로 분리하기 위해, 제한 없이, 전기영동 및 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하는 방법을 포함하는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 그러한 기술은 면역블롯팅 기술 (예컨대 웨스턴 블롯)을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 겔은 VWF에 대한 방사성표지된 항체로 면역블롯팅되고 이어서 화학발광 검출된다 (예를 들어, 문헌 (Wen et al., J. Clin. Lab. Anal., 1993, 7: 317-323) 참조, 이는 모든 목적, 특히 VWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). VWF에 대한 추가 검정은 VWF:항원 (VWF:Ag), VWF:리스토세틴 보조인자 (VWF:RCof), 및 VWF:콜라겐 결합 활성 검정 (VWF:CBA)을 포함하며, 이들은 폰 빌레브란트 질환의 진단 및 분류에 종종 사용된다 (예를 들어, 문헌 (Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341-456; Sadler, JE, Annu Rev Biochem, 1998, 67:395-424; 및 Turecek et al., Semin Thromb Hemost, 2010, 36:510-521) 참조, 이는 모든 목적, 특히 VWF에 대한 검정과 관련된 모든 교시에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, 본 발명을 사용하여 수득된 mat-rVWF는 rVWF의 로딩 샘플에 존재하는 임의의 다량체패턴을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법을 사용하여 수득된 mat-rVWF는 초대형 VWF-다량체 패턴뿐만 아니라 생리학적 발생 다량체 패턴을 포함한다.
J. VWF 검정
1차 지혈에서, VWF는 혈소판과 세포외 기질, 예컨대 콜라겐의 특정 성분 사이의 브릿지 역할을 한다. 이 과정에서 VWF의 생물학적 활성은 상이한 시험관내 검정에 의해 측정될 수 있다 (Turecek et al., Semin Thromb Hemost, 2010, 36: 510-521).
VWF:리스토세틴 보조인자 (VWF:RCof) 검정은 VWF의 존재 하에 항생제 리스토세틴에 의해 유도된 신선한 또는 포르말린-고정된 혈소판의 응집반응에 기반한다. 혈소판 응집반응의 정도는 VWF 농도에 따라 달라지고, 탁도측정 방법에 의해, 예를 들어, 응집계를 사용하여 측정될 수 있다 (Weiss et al., J. Clin. Invest., 1973, 52: 2708-2716; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh., 1975, 34: 306-308). 본원에 제공된 바와 같이, 본 발명의 VWF (VWF:RCo)의 특정 리스토세틴 보조인자 활성은 일반적으로 시험관내 검정을 사용하여 측정된 바와 같이 VWF의 mU/μg으로 기재된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 정제된 mat-rVWF는 적어도 약 20, 22.5, 25, 27,5, 30, 32.5, 35, 37.5, 40, 42.5, 45, 47.5, 50, 52.5, 55, 57.5, 60, 62.5, 65, 67.5, 70, 72.5, 75, 77.5, 80, 82.5, 85, 87.5, 90, 92.5, 95, 97.5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 mU/μg 이상의 비활성 (specific activity)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 mat-rVWF는 20 mU/μg 내지 150 mU/g의 비활성을 갖는다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 30 mU/μg 내지 120 mU/μg의 비활성을 갖는다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 40 mU/μg 내지 90 mU/μg의 비활성을 갖는다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 하기 표 3에서 발견된 변이 1 내지 133으로부터 선택된 비활성을 갖는다.
Figure pct00003
본 발명의 mat-rVWF는 약 10 내지 약 40개의 서브유닛을 포함하는 고도로 다량체이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 다량체 rVWF는 약 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21개의 서브유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, rVWF는 이량체로부터 40개 초과의 서브유닛 (> 1,000만 달톤)의 다량체에 이르기까지 크기가 다양한 다량체로 존재한다. 가장 큰 다량체는 혈소판 수용체 및 손상의 내피하 기질 부위 둘 다와 상호작용할 수 있는 다중 결합 부위를 제공하고, VWF의 가장 지혈에 활성인 형태이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 mat-rVWF는 초대형 다량체 (ULM)를 포함한다. 일반적으로, 고 다량체 및 초대형 다량체는 지혈에 가장 효과적인 것으로 간주된다 (예를 들어, 문헌 (Turecek, P., Hamostaseologie, (Vol. 37): Supplement 1, pages S15-S25 (2017)) 참조). 일부 구현예에서, mat-rVWF는 500 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 임의의 원하는 다량체 패턴은 기재된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 및/또는 양이온 교환 방법이 사용되는 경우, 하나 이상의 세척 단계(들) 또는 구배 완충액에서 완충액의 pH, 전도도 및/또는 반대이온 농도를 조작하여 원하는 다량체 패턴을 수득할 수 있다. 이어서, 일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피 방법이 사용되고, 수집 기준을 사용하여 원하는 다량체 패턴을 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 원하는 다량체 패턴은 초대형 다량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 적어도 10,000 kDa, 적어도 11,000 kDa, 적어도 12,000 kDa, 적어도 13,000 kDa, 적어도 14,000 kDa, 적어도 15,000 kDa, 적어도 16,000 kDa, 적어도 17,000 kDa, 적어도 18,000 kDa, 적어도 19,000 kDa, 적어도 20,000 kDa이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 10,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 11,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 12,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 13,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 14,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 15,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 16,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 17,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 18,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 초대형 다량체는 약 19,000 kDa와 20,000 kDa 사이이다. 일부 구현예에서, 본 발명을 사용하여 수득된 mat-rVWF는 rVWF의 로딩 샘플에 존재하는 임의의 다량체 패턴을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법을 사용하여 수득된 mat-rVWF는 초대형 VWF-다량체 패턴뿐만 아니라 생리학적 발생 다량체 패턴을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 정제 방법에 의해 제조된 mat-rVWF 조성물은 올리고머의 95%가 6개의 서브유닛과 20개의 서브유닛 사이를 갖는 것을 특징으로 하는 rVWF 올리고머의 분포를 갖는다. 일부 구현예에서, mat-rVWF 조성물은 올리고머의 95%가 4에서 발견된 변이 458 내지 641로부터 선택된 서브유닛 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 rVWF 올리고머의 분포를 갖는다.
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 mat-rVWF 조성물은 특정의 더 높은 차수 (higher order)의 mat-rVWF 다량체 또는 더 큰 다량체에 존재하는 mat-rVWF 분자의 백분율에 따라 특성화될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 mat-rVWF 조성물에서 mat-rVWF 분자의 적어도 20%가 적어도 10개의 서브유닛의 올리고머 복합체에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 mat-rVWF 조성물에서 mat-rVWF 분자의 적어도 20%가 적어도 12개의 서브유닛의 올리고머 복합체에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 사용된 mat-rVWF 조성물은 표 5 내지 표 7에서 발견된 변이 134 내지 457 중 임의의 하나에 따라 특정의 더 높은 차수의 mat-rVWF 다량체 또는 더 큰 다량체 (예를 들어, 적어도 Y 서브유닛의 다량체)에 존재하는 mat-rVWF 분자의 최소 백분율 (예를 들어, 적어도 X%를 가짐)을 갖는다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
상기에 따르면, mat-rVWF는 상당향 백분율의 고분자량 (HMW) mat-rVWF 다량체를 포함한다. 추가의 구현예에서, HMW rVWF 다량체 조성물은 적어도 10% - 80% mat-rVWF 십량체 또는 더 높은 차수의 다량체를 포함한다. 추가의 구현예에서, 조성물은 약 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% 십량체 또는 더 높은 차수의 다량체를 포함한다. 추가의 구현예에서, HMW mat-rVWF 다량체 조성물은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 십량체 또는 더 높은 차수의 다량체를 포함한다.
mat-rVWF 다량체의 수 및 백분율의 평가는, 예를 들어, Cumming 등 (J Clin Pathol. 1993 May; 46(5): 470-473, 이는 모든 목적, 특히 mat-rVWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 의해 논의된 바와 같이, mat-rVWF 다량체를 크기별로 분리하기 위해, 제한 없이, 전기영동 및 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하는 방법을 포함하는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 그러한 기술은 면역블롯팅 기술 (예컨대 웨스턴 블롯)을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 겔은 VWF에 대한 방사성표지된 항체로 면역블롯팅되고 이어서 화학발광 검출된다 (예를 들어, 문헌 (Wen et al., (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7: 317-323) 참조, 이는 모든 목적, 특히 mat-rVWF 다량체의 평가와 관련된 모든 교시에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). VWF에 대한 추가 검정은 VWF:항원 (VWF:Ag), VWF:리스토세틴 보조인자 (VWF:RCof), 및 VWF:콜라겐 결합 활성 검정 (VWF:CBA)을 포함하며, 이들은 폰 빌레브란트 질환의 진단 및 분류에 종종 사용된다 (예를 들어, 문헌 (Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341-456) 참조, 이는 모든 목적, 특히 VWF에 대한 검정과 관련된 모든 교시에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 mat-rVWF에 대한 rVWF 리스토세틴 보조인자 활성 (IU rVWF:RCo)에 대한 rFVIII 응고촉진 활성 (procoagulant activity) (IU rFVIII:C)의 비율은 3:1과 1:5 사이이다. 추가의 구현예에서, 상기 비율은 2:1과 1:4 사이이다. 더 추가의 구현예에서, 상기 비율은 5:2와 1:4 사이이다. 추가의 구현예에서, 상기 비율은 3:2와 1:3 사이이다. 더 추가의 구현예에서, 상기 비율은 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 3:1, 3:2, 3:4, 또는 3:5이다. 추가의 구현예에서, 상기 비율은 1:1과 1:2 사이이다. 더 추가의 구현예에서, 상기 비율은 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 또는 2:1이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 유용한 조성물에서 rVWF 리스토세틴 보조인자 활성 (IU rVWF:RCo)에 대한 rFVIII 응고촉진 활성 (IU rFVIII:C)의 비율은 표 8에서 발견된 변이 1988 내지 2140으로부터 선택된다.
Figure pct00009
Figure pct00010
추가의 구현예에서, 본 발명의 더 높은 차수의 mat-rVWF 다량체는 투여 후 약 1 내지 약 90시간 동안 안정하다. 더 추가의 구현예에서, 더 높은 차수의 mat-rVWF 다량체는 투여 후 약 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35시간 동안 안정하다. 더 추가의 구현예에서, 더 높은 차수의 mat-rVWF 다량체는 투여 후 적어도 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72시간 동안 안정하다. 특정 구현예에서, mat-rVWF 다량체의 안정성은 시험관내에서 평가된다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법에 사용되는 더 높은 차수의 mat-rVWF 다량체는 투여 후 적어도 12시간의 반감기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 더 높은 차수의 mat-rVWF 다량체는 투여 후 적어도 24시간의 반감기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 더 높은 차수의 mat-rVWF 다량체는 표 9에서 발견된 변이 642 내지 1045로부터 선택된 반감기를 갖는다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
일부 구현예에서, 프로-VWF 및/또는 본 발명에 따라 정제된, 정제된 mat-rVWF는 어떠한 접합, 해독후 또는 공유 변형으로도 변형되지 않는다. 특정 구현예에서, 프로-VWF 및/또는 본 발명의 정제된 mat-rVWF는, 제한 없이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 폴리시알산, 하이드록실 에틸 전분, 폴리탄수화물 모이어티 등을 포함하는 수용성 중합체로 변형되지 않는다.
일부 구현예에서, 프로-VWF 및/또는 본 발명에 따라 정제된, 정제된 mat-rVWF는, 예를 들어, 유리 설프하이드릴기, 1급 아민, 및 하이드록실기에서 선택된 측쇄의 변형뿐만 아니라 N- 또는 C-말단 잔기의 변형을 포함하여, 접합, 해독후 변형 또는 공유 변형을 통해 변형된다. 일 구현예에서, 수용성 중합체는 리신기 또는 다른 1급 아민에 의해 (직접적으로 또는 링커를 통해) 단백질에 연결된다. 일부 구현예에서, 프로-VWF 및/또는 본 발명의 정제된 mat-rVWF는, 제한 없이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 폴리시알산, 하이드록실 에틸 전분, 폴리탄수화물 모이어티 등을 포함하는 수용성 중합체의 접합에 의해 변형될 수 있다.
프로-VWF 및/또는 정제된 mat-rVWF를 변형시키기 위해 사용될 수 있는 수용성 중합체는 선형 및 분지형 구조를 포함한다. 접합된 중합체는 본 발명의 응고 단백질에 직접적으로 부착될 수 있거나, 대안적으로 연결 모이어티를 통해 부착될 수 있다. 수용성 중합체와의 단백질 접합의 비제한적인 예는 문헌 (Abuchowski and Davis "Enzymes as Drugs," Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), and Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008)뿐만 아니라 미국 특허 번호 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호, 및 제4,179,337호에서 발견할 수 있다.
단백질 접합은 당업계에 잘 알려진 다수의 기술에 의해 수행될 수 있는데, 예를 들어, 문헌 (Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008)을 참조한다. 예는 응고 단백질 또는 수용성 중합체 모이어티 중 하나의 카르복실기와 나머지의 아민기 사이의 펩티드 결합을 통한 연결, 또는 하나의 카복실기와 나머지의 하이드록실기 사이의 에스테르 연결을 포함한다. 본 발명의 응고 단백질이 수용성 중합체 화합물에 접합될 수 있는 또 다른 연결은 과요오드산염 산화에 의해 중합체의 비-환원 말단에서 형성된 알데히드기와 반응하는 중합체 모이어티 상의 유리 아미노기 사이의 시프 염기 (Schiff base)를 통해서이다 (Jennings and Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes and Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). 생성된 시프 염기는 NaCNBH3을 사용한 특정 환원에 의해 안정화되어 2급 아민을 형성할 수 있다. 대안적인 접근법은 사전 산화 후 NH4Cl을 사용한 환원성 아민화에 의해 중합체 상에 말단 유리 아미노기를 생성하는 것이다. 2개의 아미노기 또는 2개의 하이드록실기를 연결하기 위해 이기능성 시약이 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노기를 함유하는 중합체는 BS3 (비스(설포석신이미딜)수베레이트/Pierce, Rockford, Ill.)과 같은 시약을 사용하여 응고 단백질의 아미노기에 결합될 수 있다. 또한, 설포-EMCS (N-ε-말레이미도카프로필옥시)설포석신이미드 에스테르/Pierce)와 같은 이종이기능성 가교결합 시약이, 예를 들어, 아민기와 티올기를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 알데히드 반응성 기, 예컨대 PEG 알콕시드 + 브로모아세트알데히드의 디에틸 아세탈; PEG + DMSO 및 아세트산 무수물, 및 PEG 클로라이드 + 4-하이드록시벤즈알데히드의 페녹사이드, 석신이미딜 활성 에스테르, 활성화된 디티오카보네이트 PEG, 2,4,5-트리클로로페닐클로로포르메이트 및 P-니트로페닐클로로포르메이트 활성화된 PEG는 응고 단백질의 접합에 사용될 수 있다.
VWF의 생물학적 활성을 측정하는 또 다른 방법은 ELISA 기술 (Brown and Bosak, Thromb. Res., 1986, 43:303-311; Favaloro, Thromb. Haemost., 2000, 83 127-135)에 기반한 콜라겐 결합 검정이다. 미세역가 플레이트는 유형 I 또는 III 콜라겐으로 코팅된다. 이어서, VWF는 콜라겐 표면에 결합되고 그 후 효소-표지된 폴리클로날 항체로 검출된다. 마지막 단계는 ELISA 판독기로 측광적으로 (photometrically) 모니터링될 수 있는 기질 반응이다.
폰 빌레브란트 인자 (VWF:Ag)의 면역학적 검정은 혈장에서 VWF 단백질의 농도를 측정하는 면역검정법 (immunoassays)이다. VWF 기능에 대해서는 표시하지 않는다. VWF:Ag를 측정하는 다수의 방법 존재 하고, 이에는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 자동화된 라텍스 면역검정법 (LIA)이 둘 다 포함된다. 현재 많은 실험실에서 완전 자동화된 라텍스 면역검정법을 사용한다. 역사적으로 실험실은 Laurell 전기면역분석법 'Laurell Rockets'를 포함하는 다양한 기술을 사용하였지만 대부분의 실험실에서는 오늘날 거의 사용되지 않는다.
K. VWF 제형/투여
본 방법은 또한 본원에 제공된 정제 방법에 의해 수득된 VWF로부터 제형의 제조를 위해 제공한다. 일부 구현예에서, 고순도의 mat-rVWF 조성물은 약제학적 조성물의 제조를 위해 사용된다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 동결건조된 제형으로 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 VWF 폴리펩티드를 포함하는 제형은 정제 후 그리고 대상체에게 투여하기 전에 동결건조된다. 동결건조는 당업계에 통상적인 기술을 사용하여 수행되고, 개발되는 조성물에 최적화되어야 한다 (Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) and Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)).
일 양상에서, 동결건조 사이클은 동결, 1차 건조, 및 2차 건조의 세 단계로 구성된다 (A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)). 동결 단계에서, 용액을 냉각시켜 얼음 형성을 개시한다. 또한, 이 단계는 증량제 (bulking agent)의 결정화를 유도한다. 얼음은 1차 건조 단계에서 승화되는데, 이는 챔버 압력을 얼음의 증기압 아래로 감소시키고 진공을 사용하고 열을 도입하여 승화를 촉진시킴으로써 수행된다. 마지막으로, 흡착되거나 결합된 물은 챔버 압력을 감소시키고 유통 (shelf) 온도를 상승시키는 2차 건조 단계에서 제거된다. 상기 과정은 동결건조 케이크로서 알려진 재료를 생성한다. 이 후, 케이크는 멸균수 또는 주사에 적합한 희석액으로 재구성될 수 있다.
동결건조 사이클은 부형제의 최종 물리적 상태를 결정할뿐만 아니라 다른 매개변수, 예컨대 재구성 시간, 외관, 안정성 및 최종 수분 함량에도 영향을 미친다. 동결 상태의 조성 구조는 특정 온도에서 발생하는 여러 전이 (예를 들어, 유리 전이, 습윤 및 결정화)를 통해 진행되고, 구조는 동결건조 과정을 이해하고 최적화하는 데 사용될 수 있다. 유리 전이 온도 (Tg 및/또는 Tg')는 용질의 물리적 상태에 대한 정보를 제공할 수 있고, 시차 주사 열량법 (DSC)에 의해 결정될 수 있다. Tg 및 Tg'는 동결건조 사이클을 설계할 때 고려해야 하는 중요한 매개변수이다. 예를 들어, Tg'는 1차 건조에 중요하다. 또한, 건조 상태에서, 유리 전이 온도는 최종 생성물의 저장 온도에 대한 정보를 제공한다.
i. 일반적인 약제학적 제형 및 부형제
부형제는 의약품 (예를 들어, 단백질)의 안정성 및 전달을 부여하거나 향상시키는 첨가제이다. 이들을 포함하는 이유에 상관없이, 부형제는 제형의 필수 성분이므로 환자에게 안전하고 매우 관용성이다. 단백질 약물의 경우, 부형제의 선택은 약물의 효능과 면역원성 둘 다에 영향을 미칠 수 있기 때문에 특히 중요하다. 따라서, 적합한 안정성 (stability), 안전성 (safety) 및 시장성을 제공하는 적절한 부형제를 선택하여 단백질 제형을 개발해야 한다.
일 양상에서, 동결건조된 제형은 적어도 완충액, 증량제, 및 안정화제 중 하나 이상으로 구성된다. 이러한 양상에서, 동결건조 단계 또는 재구성 동안 응집이 문제가 되는 경우, 계면활성제의 유용성을 평가하여 선택한다. 동결건조 동안 안정한 pH 영역 내에서 제형을 유지하기 위해 적절한 완충제가 포함된다. 액체 및 동결건조 된 단백질 제형에 대해 고려되는 부형제 성분의 비교는 표 10에 제공된다.
Figure pct00014
단백질 제형을 개발하는데 있어 주요 과제는 제조, 운송 및 저장 스트레스에 대해 제품을 안정화시키는 것이다. 제형 부형제의 역할은 이들 스트레스에 대해 안정을 제공하는 것이다. 부형제는 또한 전달을 가능하게 하고 환자의 편의를 향상시키기 위해, 고농도 단백질 제형의 점도를 감소시키기 위해 사용된다. 일반적으로, 부형제는 다양한 화학적 및 물리적 스트레스에 대해 단백질을 안정시키는 메커니즘에 기반하여 분류될 수 있다. 일부 부형제는 특정 스트레스의 영향을 완화하거나, 특정 단백질의 특정 감수성을 조절하기 위해 사용된다. 다른 부형제는 단백질의 물리적 및 공유 안정성에 보다 일반적인 영향을 미친다. 본원에 기재된 부형제는 화학적 유형 또는 제형에서의 이들의 기능적 역할에 의해 분류된다. 각 부형제 유형이 논의될 때 안정 모드에 대한 간략한 설명이 제공된다.
본원에 제공된 교시 및 지침을 고려할 때, 당업자는 생물약제학적 (예를 들어, 단백질)의 안정성의 유지를 촉진하는 본 발명의 생물약제학적 제형을 달성하기 위해 임의의 특정 제형에 어느 정도 양 또는 범위의 부형제가 포함될 수 있는지를 알 것이다. 예를 들어, 본 발명의 생물약제학적 제형에 포함될 염의 양 및 유형은 제형에 포함될 다른 성분의 양 및 삼투질 농도 (osmolality)뿐만 아니라 최종 용액의 원하는 삼투질 농도 (예를 들어, 등장성, 저장성 또는 고장성)에 기반하여 선택된다.
예를 들어, 약 5% 소르비톨의 포함은 등장성을 달성할 수 있는 반면, 등장성을 달성하기 위해서는 약 9%의 수크로스 부형제가 필요하다. 본 발명의 생물약제학적 제형 내에 포함될 수 있는 하나 이상의 부형제의 양 또는 농도 범위의 선택은 염, 폴리올 및 당을 참조하여 상기에 예시되었다. 그러나, 당업자는 본원에 기재되고 특정 부형제를 참조하여 추가로 예시된 고려사항이, 예를 들어, 염, 아미노산, 기타 등장화제 (tonicity agent), 계면활성제, 안정화제, 증량제, 동결보호제, 동결방지제, 산화방지제, 금속 이온, 킬레이트제 및/또는 방부제를 포함하는 부형제의 모든 유형 및 조합에 동일하게 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 특정 부형제가 몰 농도로 보고되는 경우, 당업자는 용액의 등가 퍼센트 (%) w/v (예를 들어, 용액 샘플 중 물질의 그램/용액 mL) X 100%)도 고려된다.
물론, 당업자는 본원에 기재된 부형제의 농도가 특정 제형 내에서 상호 의존성을 공유한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 단백질 농도가 높거나, 예를 들어, 안정화제 농도가 높은 경우, 증량제의 농도를 낮출 수 있다. 또한, 당업자는 증량제가 없는 특정 제형의 등장성을 유지하기 위해, 안정화제의 농도가 이에 따라 조정될 것이라는 것을 인식할 것이다 (예를 들어, 안정화제의 "등장화" 양이 사용될 것이다). 통상적인 부형제는 당업계에 알려져 있고, 문헌 (Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311.)에서 발견할 수 있다.
ii. 약제학적 완충액 및 완충제
약리학적 활성 단백질 제형의 안정성은 일반적으로 좁은 pH 범위에서 최대로 관찰된다. 최적 안정성의 이 pH 범위는 사전-제형 연구 동안 조기에 동정되어야 한다. 몇 가지 접근법, 예컨대 가속 안정성 연구 및 열량 스크리닝 연구가 이러한 노력에 유용하다 (Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). 일단 제형이 완성되면, 단백질은 유통 기한 (shelf-life) 내내 제조되고 유지되어야 한다. 따라서, 완충제는 거의 항상 제형에서 pH를 제어하기 위해 사용된다.
완충 종의 완충 용량은 pKa와 동일한 pH에서 최대이고, pH가 이 값으로부터 멀어지면서 증가하거나 감소함에 따라 감소한다. 완충 용량의 90%는 pKa의 하나의 pH 단위 내에 존재한다. 완충 용량은 또한 완충액 농도가 증가함에 따라 비례적으로 증가한다.
완충액을 선택할 때 몇 가지 인자가 고려되어야 한다. 무엇보다도먼저, 완충액 종과 이의 농도는 pKa와 원하는 제형 pH를 기반으로 정의되어야 한다. 마찬가지로 중요한 것은 완충액이 단백질 및 다른 제형 부형제와 상용성이고 임의의 분해 반응을 촉매하지 않는지를 보장하는 것이다. 고려될 세 번째로 중요한 양상은 완충액이 투여시 유발할 수 있는 따끔거림 및 자극의 감각이다. 예를 들어, 시트레이트는 주사시 따끔거림을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). 피하 (SC) 또는 근육내 (IM) 경로를 통해 투여되는 약물의 경우, 따끔거림 및 자극 가능성이 더 크고, 여기서, 약물 용액은 제형이 투여시 혈액 내로 빠르게 희석되는 IV 경로에 의해 투여되는 경우보다 상대적으로 더 긴 기간 동안 그 부위에 남아 있다. 직접 IV 주입에 의해 투여되는 제형의 경우, 완충액 (및 임의의 기타 제형 성분)의 총량을 모니터링 해야 한다. 환자에게 심혈관 효과를 유발할 수 있는 인산칼륨 완충액 형태로 투여되는 칼륨 이온에 대해 특히 주의해야 한다 (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).
동결건조된 제형을 위한 완충액은 추가적인 고려가 필요하다. 인산 나트륨과 같은 일부 완충액은 동결 동안 단백질 무정형 상에서 결정화되어 pH 이동을 초래한다. 다른 일반적인 완충액, 예컨대 아세테이트 및 이미다졸은 동결 건조 과정 동안 승화되거나 증발되어 동결건조 동안 또는 재구성 후에 제형의 pH를 이동시킬 수 있다.
조성물에 존재하는 완충액 시스템은 생리학적으로 상용성이고 약제학적 제형의 원하는 pH를 유지하도록 선택된다. 일 구현예에서, 용액의 pH는 pH 2.0과 pH 12.0 사이이다. 예를 들어, 용액의 pH는 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7, 또는 12.0일 수 있다.
pH 완충 화합물은 제형의 pH를 미리 결정된 수준으로 유지하기에 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, pH 완충 농도는 0.1 mM과 500 mM (1M) 사이이다. 예를 들어, pH 완충제가 적어도 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 또는 500 mM인 것으로 고려된다.
본원에 제시된 바와 같은 제형을 완충하기 위해 사용되는 예시적인 pH 완충제는 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 석시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스, HEPES, 및 아스파르테이트, 히스티딘, 및 글리신을 포함하지만 이에 제한되지 않는 아미노산 또는 아미노산의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서, 완충제는 시트레이트이다.
일부 구현예에서, 제형은 50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스, 5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 및 pH 7.4를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 고순도의 mat-rVWF, 50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스, 5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 및 pH 7.4를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 vWF 및/또는 r-vWF/rFVIII 및 50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스, 5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 및 pH 7.4를 포함한다.
iii. 약제학적 안정화제 및 증량제
본 약제학적 제형의 일 양상에서, 안정화제 (또는 안정화제의 조합)를 첨가하여 저장-유도된 응집 및 화학적 분해를 방지하거나 감소시킨다. 재구성시 흐릿한 또는 탁한 용액은 단백질이 침전되었거나 적어도 응집되었음을 나타낸다. 용어 "안정화제"는 수성 상태에서 화학적 분해 (예를 들어, 자가분해, 탈 아미드화, 산화 등)를 포함하는 응집 또는 물리적 분해를 방지할 수 있는 부형제를 의미한다. 고려되는 안정화제는 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프럭토스, 만니톨, 소르비톨, 글리신, 아르기닌 HCL, 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란, 전분, 하이드록시에틸 전분, 사이클로덱스트린, N-메틸 피롤리덴, 셀룰로오스 및 히알루론산을 포함하는 다가 화합물, 염화나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)). 본 제형에서, 안정화제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, 또는 1000 mM 농도로 혼입된다. 본 발명의 일 구현예에서, 만니톨 및 트레할로스는 안정화제로서 사용된다.
원하는 경우, 제형은 또한 적절한 양의 증량제 및 삼투질 농도 조절제를 포함한다. 증량제는, 예를 들어, 제한 없이, 만니톨, 글리신, 수크로스, 중합체, 예컨대 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로오스, 락토스, 소르비톨, 트레할로스, 또는 크실리톨을 포함한다. 일 구현예에서, 증량제는 만니톨이다. 증량제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, 또는 1000 mM의 농도로 혼입된다.
iv. 약제학적 계면활성제
단백질은 표면과 상호작용하는 경향이 높아서 공기-액체, 바이알-액체 및 액체-액체 (실리콘 오일) 계면에서 흡착 및 변성에 취약하도록 한다. 이 분해 경로는 단백질 농도에 반비례하는 것으로 관찰되어 가용성 및 불용성 단백질 응집체의 형성 또는 표면으로의 흡착을 통해 용액으로부터 단백질 손실을 초래한다. 컨테이너 표면 흡착 이외에도, 제품의 운송 및 취급 동안 경험할 수 있는 물리적 진탕으로 표면-유발 열화가 악화된다.
계면활성제는 통상적으로 표면-유발 분해를 방지하기 위해 단백질 제형에 사용된다. 계면활성제는 계면 위치에 대해 단백질을 능가하는 능력을 가진 양친매성 분자이다. 계면활성제 분자의 소수성 부분은 계면 위치 (예를 들어, 공기/액체)를 차지하는 반면, 분자의 친수성 부분은 벌크 용매 쪽으로 향하도록 남아 있다. 충분한 농도 (전형적으로 세제의 임계 미셀 농도 근처)에서, 계면활성제 분자의 표면 층은 단백질 분자가 계면에서 흡착되는 것을 방지하는 역할을 한다. 따라서, 표면-유발 열화가 최소화된다. 본원에서 고려되는 계면활성제는, 제한 없이, 소르비탄 폴리에톡실레이트의 지방산 에스테르, 예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 포함한다. 상기 2개는 각각 분자 C-12와 C-18에 소수성 특성을 부여하는 지방족 사슬의 길이만 상이하다. 따라서, 폴리소르베이트-80은 표면-활성이 더 높고 폴리소르베이트-20보다 임계 미셀 농도가 더 낮다.
세제는 또한 단백질의 열역학적 입체형태 (conformational) 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 여기서 다시, 주어진 세제 부형제의 효과는 단백질 특이적일 것이다. 예를 들어, 폴리소르베이트는 일부 단백질의 안정성을 감소시키고 다른 단백질의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 단백질의 세제 불안정화는 부분적으로 또는 완전히 펼쳐진 단백질 상태와 특이적 결합에 관여할 수 있는 세제 분자의 소수성 테일 측면에서 합리화될 수 있다. 이러한 유형의 상호작용은 더 확장된 단백질 상태 (예를 들어, 결합 폴리소르베이트에 대한 보완에서 단백질 분자의 소수성 부분의 노출 증가)로 입체형태 평형의 이동을 야기할 수 있다. 대안적으로, 단백질의 천연 상태가 일부 소수성 표면을 나타내는 경우, 천연 상태에 결합하는 세제는 그 입체형태를 안정화시킬 수 있다.
폴리소르베이트의 또 다른 양상은 본질적으로 산화 분해에 취약하다는 것이다. 종종, 원료로서, 이들은 단백질 잔기 측쇄, 특히 메티오닌의 산화를 야기하기에 충분한 양의 과산화물을 함유한다. 안정화제의 첨가로부터 발생하는 산화 손상 가능성은 가장 낮은 유효 농도의 부형제가 제형에 사용되어야 한다는 점을 강조한다. 계면활성제의 경우, 주어진 단백질에 대한 유효 농도는 안정화 메커니즘에 따라 달라질 것이다.
동결 및 건조 동안 표면 관련된 응집 현상을 방지하기 위해 계면활성제 또한 적절한 양으로 첨가된다 (Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)). 따라서, 예시적인 계면활성제는, 제한 없이, 자연-발생 아미노산으로부터 유래된 계면활성제를 포함하는 음이온성, 양이온성, 비이온성, 쯔비터이온성 및 양쪽이온성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제는 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포 석시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트, 케노데옥시콜산, N-라우로일사르코신 나트륨 염, 리튬 도데실 설페이트, 1-옥탄설폰산 나트륨 염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트, 및 글리코데옥시콜산 나트륨 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 양이온성 계면활성제는 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 일수화물, 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 쯔비터이온성 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO, SB3-10, 및 SB3-12를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비이온성 계면활성제는 디기토닌, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, 및 TweeN-80을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 계면활성제는 또한 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 40, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 대두 레시틴 및 다른 인지질, 예컨대 디올레일 포스파티딜 콜린 (DOPC), 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 (DMPG), 디미리스토일포스파티딜 콜린 (DMPC), 및 (디올레일 포스파티딜 글리세롤) DOPG; 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카복시메틸 셀룰로오스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서 개별적으로 또는 상이한 비율의 혼합물로서 이들 계면활성제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 본 발명의 일 구현예에서, 계면활성제는 TWEEN-80이다. 본 제형에서, 계면활성제는 약 0.01 내지 약 0.5 g/L의 농도로 혼입된다. 제공된 제형에서, 계면활성제 농도는 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 g/L이다.
v. 약제학적 염
단백질 용해도, 물리적 안정성, 및 등장성에 중요할 수 있는 제형의 이온 강도를 증가시키 위해 염이 종종 첨가된다. 염은 다양한 방식으로 단백질의 물리적 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이온은 단백질 표면의 하전된 잔기에 결합함으로써 단백질의 본래 상태를 안정화시킬 수 있다. 대안적으로, 염은 단백질 골격 (-CONH-)을 따라 펩티드기에 결합시킴으로써 변성 상태를 안정화시킬 수 있다. 염은 또한 단백질 분자 내에 잔기 사이의 반발성 정전기 상호작용을 차폐함으로써 단백질 천연 입체형태를 안정화시킬 수 있다. 단백질 제형의 염은 또한 단백질 응집 및 불용성을 유발할 수 있는 단백질 분자 사이의 매력적인 정전기 상호작용을 차폐할 수 있다. 제공된 제형에서, 염 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 mM과 500 mM 사이이다.
vi. 다른 통상의 부형제 성분: 약제학적 아미노산
아미노산은 단백질 제형에서 완충액, 증량제, 안정화제 및 산화방지제로서 다용도로 사용되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일 양상에서, 히스티딘 및 글루탐산은 각각 5.5-6.5 및 4.0-5.5의 pH 범위에서 단백질 제형을 완충하기 위해 사용된다. 히스티딘의 이미다졸기는 pKa = 6.0이고, 글루탐산 측쇄의 카복실기는 pKa가 4.3이어서 이들 아미노산을 각각의 pH 범위에서 완충하기에 적합하게 만든다. 글루탐산은 그러한 경우에 특히 유용하다. 히스티딘은 통상적으로, 시판되는 단백질 제형에서 발견되고, 이 아미노산은 주사시 따끔거리는 것으로 알려진 완충액인 시트레이트의 대안을 제공한다. 흥미롭게도, 히스티딘은 액체 및 동결건조된 외형 둘 다에서 고농도로 사용되는 경우 응집과 관련하여 안정화 효과를 갖는 것으로도 보고되었다 (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). 히스티딘은 또한 고 단백질 농도 제형의 점도를 감소시키기 위해 다른 연구에 의해 관찰되었다. 그러나, 동일한 연구에서, 저자들은 스테인리스 강 컨테이너에서 항체의 동결-해동 연구 동안 히스티딘 함유 제형에서 증가된 응집 및 변색을 관찰하였다. 히스티딘에 대한 또 다른 주의사항은 금속 이온의 존재 하에 광-산화를 거친다는 것이다 (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). 제형에서 산화방지제로서의 메티오닌의 사용은 유망해 보인다; 다수의 산화 스트레스에 대해 효과적인 것으로 관찰되었다 (Lam XM, et al., J Pharm ScL, 86(11): 1250-5 (1997)).
다양한 양상에서, 아미노산 글리신, 프롤린, 세린, 아르기닌 및 알라닌 중 하나 이상을 포함하는 제형이 제공되어 우선적 배제 메커니즘에 의해 단백질을 안정화시키는 것으로 나타났다. 글리신은 또한 동결건조된 제형에서 통상적으로 사용되는 증량제이다. 아르기닌은 응집 억제에 효과적인 제제인 것으로 나타났고, 액체 제형과 동결건조된 제형 둘 다에서 사용되었다.
제공된 제형에서, 아미노산 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 mM과 500 mM 사이이다. 본 발명의 일 구현예에서, 아미노산을 글리신이다.
vii. 다른 통상의 부형제 성분: 약제학적 산화방지제
단백질 잔기의 산화는 다수의 상이한 공급원으로부터 발생한다. 특정 산화방지제를 첨가하는 것 이외에도, 산화 단백질 손상의 예방은 생성물의 제조 공정 및 저장 내내 다수의 인자, 예컨대 대기 산소, 온도, 노광 및 화학 오염을 조심스럽게 제어하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은, 제한 없이, 환원제, 산소/유리-라디칼 스캐빈저, 또는 킬레이트제를 포함하는 약제학적 산화방지제의 사용을 고려한다. 일 양상에서, 치료용 단백질 제형의 산화방지제는 수용성이고, 제품 유통 기한 내내 활성 상태로 남아 있다. 환원제 및 산소/유리-라디칼 스캐빈저는 용액에서 활성 산소 종을 제거함으로써 작동한다. 킬레이트제, 예컨대 EDTA는 유리-라디칼 형성을 촉진하는 미량 금속 오염물을 결합시킴으로써 효과적이다. 예를 들어, EDTA는 산성 섬유아세포 성장 인자의 액체 제형에 사용되어 시스테인 잔기의 금속 이온 촉매된 산화를 억제하였다.
단백질 산화를 방지하기 위한 다양한 부형제의 효과 이외에, 산화방지제 자체가 단백질에 대한 다른 공유적 또는 물리적 변화를 유도할 가능성이 우려μ려진다. 예를 들어, 환원제는 분자내 디설파이드 연결의 파괴를 야기할 수 있어 이는 디설파이드 셔플링을 유발할 수 있다. 전이 금속 이온의 존재 하에, 아스코르브산 및 EDTA는 다수의 단백질 및 펩티드에서 메티오닌 산화를 촉진하는 것으로 나타났다 (Akers MJ, and Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)); Fransson J.R.,/. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). 티오황산 나트륨은 rhuMab HER2에서 빛과 온도 유래 메티오닌-산화의 수준을 감소시키는 것으로 보고되었지만, 티오설페이트-단백질 부가물의 형성 또한 이 연구에서 보고되었다 (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). 단백질의 특정 스트레스와 민감도에 따라 적절한 산화방지제를 선택한다. 특정 양상에서 고려되는 산화방지제는, 제한 없이, 환원제 및 산소/유리-라디칼 스캐빈저, EDTA 및 나트륨 티오설페이트를 포함한다.
viii. 다른 통상의 부형제 성분: 약제학적 금속 이온
일반적으로, 전이 금속 이온은 단백질에서 물리적 및 화학적 분해 반응을 촉매할 수 있기 때문에 단백질 제형에서 바람직하지 않다. 그러나, 특정 금속 이온이 단백질에 대한 보조 인자일 경우 제형에 포함되고, 배위 복합체를 형성하는 단백질의 현탁 제형 (예를 들어, 인슐린의 아연 현탁액)에 포함된다. 최근에, 마그네슘 이온 (10-120 mM)의 사용은 아스파르트산의 이소아스파르트산으로의 이성질화를 억제하기 위해 제안되었다 (WO 2004039337).
금속 이온이 단백질에서 안정성 또는 증가된 활성을 부여하는 두 가지 예는 인간 데옥시리보뉴클레아제 (rhDNase, Pulmozyme®) 및 인자 VIII이다. rhDNase의 경우, Ca+2 이온 (최대 100 mM)은 특정 결합 부위를 통해 효소의 안정성을 증가시켰다 (Chen B, et al.,/Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). 사실상, EGTA를 사용하여 용액으로부터 칼슘 이온을 제거하면 탈아미드화 및 응집이 증가하였다. 그러나, 이 효과는 Ca+2 이온에서만 관찰되었다; 다른 2가 양이온 Mg+2, Mn+2 및 Zn+2는 rhDNase를 불안정하게 하는 것으로 관찰되었다. 유사한 효과가 인자 VIII에서도 관찰되었다. Ca+2 및 Sr+2 이온은 단백질을 안정화시킨 반면, Mg+2, Mn+2 및 Zn+2, Cu+2 및 Fe+2와 같은 다른 이온은 효소를 불안정하게 하였다 (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997)). 인자 VIII을 사용한 별도의 연구에서, Al+3 이온의 존재시 응집 속도의 상당한 증가가 관찰되었다 (Derrick TS, et al.,/. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). 저자들은 완충 염과 같은 다른 부형제가 종종 Al+3 이온으로 오염되어 있고 제형화된 생성물의 부절절한 품질의 부형제를 사용할 필요성을 설명한다.
ix. 다른 통상의 부형제 성분: 약제학적 방부제
동일한 컨테이너로부터 하나 초과의 추출을 포함하는 다용도 비경 구 제형을 개발할 때 방부제가 필요하다. 이들의 주요 기능은 의약품의 유통 기한 또는 사용 기간 내내 미생물 성장을 억제하고 제품 무균성을 보장하는 것이다. 통상적으로 사용되는 방부제는, 제한 없이, 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸을 포함한다. 방부제는 오랜 사용 역사를 가지고 있지만, 방부제를 포함하는 단백질 제형의 개발은 힘들 수 있다. 방부제는 거의 항상 단백질에 대한 불안정화 효과 (응집)를 가지고, 이는 다중-용량 단백질 제형에서 사용을 제한하는 주요 인자가 되었다 (Roy S, et al., J Pharm ScL, 94(2): 382-96 (2005)).
현재까지, 대부분의 단백질 약물은 일회용으로만 제형화되었다. 그러나, 다중-용량 제형이 가능할 경우, 이들은 환자 편의성을 가능하게 하고 시장성을 높일 수 있는 추가적 이점이 있다. 우수한 예는 인간 성장 호르몬 (hGH)의 경우로, 보존된 제형의 개발은 보다 편리한 다용도 주입 펜 외형의 상용화를 야기하였다. hGH의 보존된 제형을 함유하는 적어도 4개의 펜 장치가 현재 시장에서 시판되고 있다. Norditropin® (액체, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (액체, Genentech) & Genotropin (동결건조됨 - 이중 챔버 카트리지, Pharmacia & Upjohn)은 페놀을 함유하는 반면, Somatrope® (Eli Lilly)은 m-크레졸로 제형화된다.
보존된 투여 형태의 제형 개발 동안 몇 가지 양상이 고려되어야 한다. 의약품의 효과적인 방부제 농도는 최적화되어야 한다. 이것은 단백질 안정성을 손상시키지 않으면서 항균 효과를 부여하는 농도 범위를 갖는 투여 형태로 주어진 방부제를 시험하는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 3개의 방부제는 시차 주사 열량법 (DSC)을 사용하여 인터루킨-1 수용체 (유형 I)용 액체 제형의 개발에서 성공적으로 스크리닝되었다. 방부제는 시판되는 제품에 통상적으로 사용되는 농도에서 안정성에 미치는 영향에 기반하여 순위가 지정되었다 (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).
방부제를 함유하는 액체 제형의 개발은 동결건조된 제형보다 더 힘들다. 동결-건조된 제품은 방부제 없이 동결건조될 수 있고, 사용 시점에 희석제를 함유하는 방부제로 재구성될 수 있다. 이는 방부제가 단백질과 접촉하는 시간을 단축시켜 관련 안정성 위험을 상당히 최소화한다. 액체 제형을 사용하면, 전체 제품 유통 기한 (-18-24개월)에 걸쳐 방부제 효과와 안정성이 유지되어야 한다. 주목해야 할 중요한 점은 활성 약물과 모든 부형제 성분을 함유하는 최종 제형에서 방부제 효과가 입증되어야 한다는 점이다.
일부 방부제는 주사 부위 반응을 야기할 수 있고, 이는 방부제를 선택할 때 고려해야 할 또 다른 인자이다. 노르디트로핀에서 방부제 및 완충액 평가에 초점을 맞춘 임상 시험에서, 통증 인식은 m-크레졸을 함유하는 제형에 비해 페놀 및 벤질 알코올을 함유하는 제형에서 더 낮은 것으로 관찰되었다 (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). 흥미롭게도, 통상적으로 사용되는 방부제 중, 벤질 알코올은 마취 성질을 가지고 있다 (Minogue SC, and Sun DA., AnesthAnalg., 100(3): 683-6 (2005)). 다양한 양상에서, 방부제의 사용은 임의의 부작용보다 우세한 큰 이점을 제공한다.
x. 약제학적 제형의 제조 방법
본 발명은 약제학적 제형의 제조를 위한 방법을 추가로 고려한다.
본 발명은 하기 단계들 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 동결건조 전에 상기 혼합물에 본원에 기재된 안정화제를 첨가하는 단계, 동결건조 전에 상기 혼합물에, 각각이 본원에 기재된 증량제, 삼투압 조절제 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 첨가하는 단계.
동결건조된 물질에 대한 표준 재구성 실시는, 항균제의 희석 용액이 비경구 투여용 의약품 생산에 때때로 사용되기는 하지만, 순수한 물 또는 주사용 멸균수 (WFI)의 부피 (전형적으로 동결건조 동안 제거된 부피와 동일함)를 다시 추가하는 것이다 (Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)). 따라서, 본 발명의 동결건조된 rVWF 조성물에 희석제를 첨가하는 단계를 포함하는 재구성된 rVWF 조성물의 제조를 위한 방법이 제공된다.
동결건조된 물질은 수용액으로써 재구성될 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 주사용 멸균수, 다중 용량 사용을 위한 방부제를 갖는 물, 또는 적절한 양의 계면활성제를 갖는 물 (예를 들어, 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 화합물을 함유하는 수성 현탁액). 다양한 양상에서, 그러한 부형제는 현탁제, 예를 들어, 제한 없이, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 분산제 또는 습윤제는 자연-발생 포스파티드, 예를 들어, 제한 없이, 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 제한 없이, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알코올과 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 제한 없이, 헵타데카에틸-엔옥시세탄올, 또는 지방산과 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 제한 없이, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 다양한 양상에서, 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 방부제, 예를 들어, 제한 없이, 에틸, 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 함유한다.
xi. 투여를 위한 예시적인 mat-rVWF 제형
일부 구현예에서, 본 발명은 치료를 위해 부피 (100 IU/ml 내지 10000 IU/ml)를 감소시키기 위해, 높은 효능 (높은 mat-rVWF 농도 및 향상된 장기간 안정성)을 갖는 최종 생성물을 허용하는 향상된 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 100 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 500 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 1000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 2000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 3000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 4000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 5000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 6000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 7000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 8000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, 투여용 제형에서 mat-rVWF 농도는 약 9000 IU/ml 내지 10000 IU/ml이다. 일부 구현예에서, mat-rVWF는 재조합 응고 인자 VIII (rFVIII)와 공동 제형화된다. 일부 구현예에서, rFVIII은 전장 FVIII이다. 일부 구현예에서, rFVIII은 전장이고, 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, rFVIII은 B-도메인 대신 FIX-활성화 펩티드를 함유하는 FVIII 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rFVIII은 절단된 글리코실화 풍부 B-도메인을 함유하는 FVIII 하이브리드이다. 일부 구현예에서, FVIII은 FVIII B-도메인-결실 변이체이다. 일부 구현예에서, FVIII은 FVIII B-도메인-결실된 변이체의 화학적으로 변형된 변이체이다. 일부 구현예에서, rFVIII 공동-제형을 가진 mat-rVWF는 동결 건조 또는 충전 완료 단계 전에 제조되고, 시험관내 또는 "온 컬럼" 절차에서 성분을 혼합함으로써 저장된다 (예를 들어, 정제 방법 동안 FVIII을 첨가함).
일부 구현예에서, 투여용 제형은, 예를 들어, 히스티딘, 글리신, 아르기닌과 같은 아미노산을 포함하는 하나 이상의 쯔비터이온성 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은, 예를 들어, 폴리소르베이트 80, 옥틸피라노시드, 디펩티드 및/또는 양친매성 펩티드를 포함하는, 최소 하나의 소수성 및 하나의 친수성 기를 갖는 양친매성 특징을 갖는 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은, 예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 수크로스, 또는 트레할로스를 포함하는 비 환원 당 또는 당 알코올 또는 디사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은 생리학적 삼투질 농도를 초래하는, 예를 들어, 염화나트륨을 포함하는 비독성 수용성 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은 6.0 내지 8.0 범위의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은 약 6.0, 약 6.5, 약 7, 약 7.5 또는 약 8.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은, 예를 들어, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ 및/또는 이들의 조합을 포함하여 rVWF를 안정화하는 하나 이상의 2가 양이온을 포함한다. 일부 구현예에서, pH가 약 7.0이고 투여 시점에서 생리적 삼투압을 갖는 투여용 제형은 약 1 mM 내지 약 50 mM 글리신, 약 1 mM 내지 약 50 mM 히스티딘, 약 0 내지 약 300 mM 염화나트륨 (예를 들어, 300 mM 미만 나트륨), 약 0.01% 내지 약 0.05% 폴리소르베이트 20 (또는 폴리소르베이트 80), 및 약 0.5% 내지 약 20% (w/w) 수크로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 투여용 제형은 동결 건조될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은 안정하고, 약 18℃ 내지 약 25℃에서뿐만 아니라 약 2℃ 내지 약 8℃에서 액체 상태로 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은 안정하고, 약 2℃ 내지 약 8℃에서 액체 상태로 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여용 제형은 안정하고, 약 18℃ 내지 약 25℃에서 액체 상태로 저장될 수 있다.
xii. 투여
인간 또는 시험 동물에게 조성물을 투여하기 위해, 일 양상에서, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 문구 "약제학적으로" 또는 "약리학적으로" 허용되는 이란, 안정하고, 응집 및 절단 생성물과 같은 단백질 분해를 억제하고, 또한 아래에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려진 경로를 사용하여 투여될 때 알레르기 또는 기타 부작용을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 상기에 개시된 것들을 포함하여 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
약제학적 제형은 경구로, 국소로, 경피로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 질내, 직장내, 또는 두개내 주사에 의해 투여된다. 본원에 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 수조내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 특정 부위에 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척수강내, 안구후 (retrobulbar), 폐내 주사 및/또는 외과적 이식에 의하 투여도 고려된다. 일반적으로, 조성물은 본질적으로, 수용자에게 해로울 수 있는 다른 불순물뿐만 아니라 발열원이 부재이다.
조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴으로 수행된다. 질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 용량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 예방 또는 치료 목적으로 약물을 투여하는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 기록 및 약물에 대한 반응, 및 담당의 재량에 따라 달라진다.
xiii. 키트
추가의 양상으로서, 본 발명은 대상체에게 투여하기 위해 이들의 사용을 용이하게 하는 방식으로 패키징된 하나 이상의 동결건조된 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 일 구현예에서, 그러한 키트는 컨테이너에 부착되거나 방법을 실시하는데 화합물 또는 조성물의 사용을 설명하는 패키지에 포함된 라벨을 갖는 컨테이너, 예컨대 밀봉된 병 또는 용기에 패키징된, 본원에 기재된 약제학적 제형 (예를 들어, 치료 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조성물)을 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 제형은 컨테이너 내의 헤드스페이스의 양 (예를 들어, 액체 제형과 컨테이너 상부 사이의 공기의 양)이 매우 적도록 컨테이너에 패키징된다. 바람직하게는, 헤드스페이스의 양은 무시될 수 있다 (예를 들어, 거의 없음). 일 구현예에서, 키트는 치료 단백질 또는 펩티드 조성물을 갖는 제1 컨테이너 및 조성물을 위한 생리학적으로 허용되는 재구성 용액을 갖는 제2 컨테이너를 포함한다. 일 양상에서, 약제학적 제형은 단위 투여 형태로 패키징된다. 키트는 특정 투여 경로에 따라 약제학적 제형을 투여하기에 적합한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 약제학적 제형의 사용을 설명하는 라벨을 포함한다.
xiv. 투여량
본원에 기재된 병태를 치료하는 방법에 포함된 투여량 용법은 약물의 작용을 변형하는 다양한 인자, 예를 들어, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이요법, 임의의 감염 중증도, 투여 시간 및 다른 임상 인자를 고려하여, 담당의에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 VWF의 전형적인 용량은 대략 50 U/kg인데, 이는 500 μg/kg과 동일하다.
일 양상에서, 본 발명의 제형은 의약품의 치료 순환 수준을 유지하기 위해 초기 볼루스에 이어 연속 주입에 의해 투여된다. 또 다른 예로서, 본 발명의 화합물은 1회 용량으로 투여된다. 당업자는 우수한 의료 행위 및 개별 환자의 임상 상태에 의해 결정된 바와 같이 효과적인 투여량 및 투여 용법을 쉽게 최적화할 것이다. 투약 빈도는 제제의 약동학적 매개변수 및 투여 경로에 따라 달라진다. 최적의 약제학적 제형은 투여 경로 및 원하는 투여량에 따라 당업자에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 페이지 1435-1712, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 그러한 제형은 투여되는 제제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 청소율에 영향을 미친다. 투여 경로에 따라, 적합한 용량은 체중, 체표면적 또는 장기 크기에 따라 계산된다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈중 투여량을 결정하기 위해 확립된 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 최종 투용량 용법은 약물의 작용을 변형하는 다양한 인자, 예를 들어, 환자의 약물의 특정 활성, 손상 중증도 및 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이요법, 임의의 감염 중증도, 투여 시간 및 다른 임상 인자를 고려하여, 담당의에 의해 결정된다. 연구가 수행됨에 따라, 다양한 질환 및 병태에 대한 적절한 투여량 수준 및 치료 기간에 대한 추가 정보가 나타날 것이다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 대표적인 구현예의 보다 완전한 이해를 용이하게 하기 위해 예시 목적으로만 제공된다.
이들 실시예는 후천적 및 유전적 폰 빌레브란트 질환을 치료하는 방법에 관한 것들을 포함하여 본 명세서에 기재된 임의의 구현예를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: cVWF 프로펩티드를 성숙한 rVWF로부터 분리하기 위해 양이온 교환기에서 성숙된 rVWF의 정제.
실시예 1은 양이온 교환기 (양이온 교환 (CEX) 수지)에서 성숙된 rVWF의 정제를 나타낸다. rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)는 퓨린 성숙 후 rVWF에 결합된 상태로 남아 있고, CEX 수지에 로딩하기 전에 중성 pH에서 킬레이트제로서 시트르산 나트륨과 해리되었다. 대부분의 rVWF 프로펩티드는 양이온 교환 수지를 통과하였다. 그리고, 잔류 rVWF 프로펩티드는 세척 단계 후에 고갈되었다. 시트르산 나트륨은 완충액 물질의 성분으로서 그리고 킬레이트제로서 사용되었다.
산업적으로, VWF, 특히 재조합 VWF (rVWF)는 유전자 조작된 CHO 세포주에서 rFVIII와 함께 합성되고 발현된다. 공동-발현된 rVWF의 기능은 세포 배양 과정에서 rFVIII을 안정화시키는 것이다. rVWF는 N-말단에 부착된 큰 프로-펩티드를 함유하는 전구 형태로서 세포에서 합성된다. 소포체 및 골지체에서 성숙시, rVWF-PP는 세포 프로테아제 퓨린의 작용에 의해 절단되고, 발현된 단백질의 이량체로 이루어진 동일한 서브유닛의 단일중합체로서 분비된다. 그러나, 성숙이 불완전하여 rVWF-PP와 성숙한 VWF의 혼합물을 포함하는 생성물이 초래된다.
재조합 인자 VIII을 포획하기 위한 모노클로날 항체 단계 후, rVWF (모노클로날 항체 유출물로도 지칭됨)를 함유하는 유동 통과물은 음이온 교환기 (음이온 교환 (AEX) 수지)에 로딩되었다. rVWF는 음이온 교환기에 결합되었고, 칼슘의 존재 하에 퓨린으로 성숙되었다. rVWF는 전도도가 증가하면서 음이온 교환기로부터 용출되었다. 생성물 함유 용출액은 60 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6으로 1:2 희석하여 전도도 13.39 mS/cm 및 pH 7.39로 컨디셔닝되었다. 컨디셔닝된 수성 희석액을 내경이 15 mm이고 베드 높이가 14.0 cm이고 부피가 24.74 ml인 UNOsphereTM S 양이온 교환 매질 (Bio Rad, 카탈로그 번호: 156-0115) 양이온 교환기 컬럼에 유량 100 cm/h로 로딩한 다음, 5 CV의 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2로 세척하여 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 rVWF-PP를 제거하였다. rVWF는 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2로부터 완충액 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2까지 6 CV에서 60 cm/h의 유량으로 선형 구배로 수행된 전도도를 증가시킴으로써 용출되었다. 주요 용출액 피크를 2개 부분으로 분할하여 저분자량 rVWF 다량체와 고분자량 rVWF 다량체로 분리하였다.
도 1은 실시예 1에 나타낸 양이온 교환기에서 성숙된 rrVWF의 정제를 나타낸다.
도 2는 정제 결과의 표를 제공한다.
도 3은 실시예 1에 기재된 방법에 의한 rVWF 및 rVWF-PP의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔 및 웨스턴 블롯을 나타낸다.
실시예 2 및 3: rVWF의 상업적 제조를 위해 실시예 1에 기재된 최적화된 방법.
실시예 2 및 3은 rVWF의 상업적 제조를 위해 실시예 1에 기재된 최적화된 방법을 나타낸다.
실시예 2 및 3의 경우, rVWF 및 rFVIII의 발효를 위한 실험 설정이 확립되었다. 방법은 생화학적 특성화를 위한 고순도 rVWF를 수득하기 위해 단순화된 정제 방법에 사용되었다.
포획 단계는 단일 공정 단계에서 친화성 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피를 결합시킨 직렬형 (tandem) 크로마토그래피에 의해 수행되었다. rFVIII은 면역 친화성 크로마토그래피 기술을 기반으로 2-8℃의 온도에서 항 FVIII-mAb 컬럼에 결합되었다. 이 단계는 rFVIII을 rVWF로부터 분리할 수 있다. rVWF를 함유하는 유체-통과물은 동일한 크로마토그래피 시스템에서 정제수로 온라인 희석하였고 AEX 컬럼에 직접 로딩하였다. AEX 컬럼에서 재조합 퓨린 성숙은 온도를 +15℃ 내지 28℃로 증가시킨 후 수행되었다. 퓨린 성숙된 rVWF는 전도도를 증가시켜 단계 용출로 용출되었다. 연마 단계도 수행되었다. rVWF 함유 AEX 용출액을 10 mM 시트르산 나트륨 완충액, pH 7.6으로 희석하고, 내경이 15 mm이고 베드 높이가 14.0 cm이고 컬럼 부피가 25 ±0.5 ml인 UNOsphereTM S 양이온 교환 매질 (Bio Rad, 카탈로그 번호: 156-0115) 양이온 교환기 컬럼 상에 유량 100 cm/h로 적용하였다. 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, 2 mM 시트르산 pH 7.6±0.2를 사용한 세척 단계 후, rVWF는 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2로부터 완충액 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2까지 6 CV에서 65 cm/h의 유량으로 선형 구배를 사용하여 전도도를 증가시켜 용출되었다. 주요 용출액 피크는 분석을 위해 용출액 (풀링된 용출액)으로서 수집되었다.
최종 실험 설계에서, 피크의 마지막 30 내지 40%를 수집하여 가장 높은 비활성을 갖는 rVWF를 수득하였다.
도 4는 실시예 2 및 3에 대한 실험 설정의 흐름도를 나타낸다.
도 5는 실시예 2에 대한 크로마토그램 및 실시예 2 및 3에 사용된 크로마토그래피 도식을 나타낸다.
도 6은 사용된 시약의 표 및 실시예 2에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 7은 실시예 2에 대한 또 다른 크로마토그램 및 실시예 3에 대한 결과의 표를 나타낸다.
도 8은 실시예 2 및 실시예 3의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔을 나타낸다.
도 9는 실시예 2 및 실시예 3의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
실시예 4: 크기 배제 크로마토그래피에 의한 별도의 rVWF 및 rVWF-PP에 의한 rVWF의 상업적 제조 방법.
실시예 4는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 rVWF 및 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 분리함으로써 rVWF의 상업적 제조를 위한 최적화된 방법을 나타낸다. 시트르산 나트륨은 rVWF 및 rVWF-PP의 효율적인 분할을 제공하기 위해 SEC 진행 완충액에 첨가된다.
rVWF 함유 한외여과된 UNOsphereTM S-용출액을 일련의 2개의 Superose 6 분취용 등급 SEC 컬럼 (GE Healthcare, 카탈로그 번호: 28-9913-16) 어레이 상에 직접 로딩하였고, 두 컬럼은 내경이 각각 16 mm이고 베드 높이가 82.0 cm (2 x 41 cm)이고 두 컬럼의 부피는 대략 165 ml였다. 로딩은 7 cm/h 속도로 적용되었다. 진행 완충액은 20 mM HEPES 유리산, 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 나트륨 이수화물 pH 7.5 ±0.2였다. 크기 배제 크로마토그래피는 12 cm/h의 선형 유량으로 등용매 조건으로 수행되었다.
도 10은 실시예 4에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 11은 실시예 4에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 12는 실시예 4의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔 및 웨스턴 블롯을 나타낸다.
실시예 5: 크기 배제 크로마토그래피에 의한 별도의 rVWF 및 rVWF-PP에 의한 성숙한 rVWF의 상업적 제조를 위한 최적화된 방법.
실시예 5는 pH 컨디셔닝된 rVWF 함유 출발 물질을 크기 배제 크로마토그래피에 적용함으로써 크기 배제 크로마토그래피에 의해 rVWF 및 rVWF-PP를 분리하는 방법을 나타낸다.
rVWF 함유 한외여과된 UNOsphereTM S-용출액을 컬럼에 로딩하기 전에 1 M 글리신 pH 9.0을 사용하여 7.5±0.2의 pH로 컨디셔닝되었다. 이 용액을 일련의 2개의 Superose 6 분취용 등급 SEC 컬럼 (GE Healthcare, 카탈로그 번호: 28-9913-16) 어레이 상에 로딩하였고, 두 컬럼은 내경이 각각 16 mm이고 베드 높이가 82.0 cm (2 x 41 cm)이고 두 컬럼의 부피는 대략 165 ml였다. 로딩은 7 cm/h 유량으로 적용되었다. SEC 진행 완충액은 20 mM HEPES 유리산 및 150 mM NaCl, pH 7.5 ±0.2로 구성되었다. 크기 배제 크로마토그래피는 12 cm/h의 선형 유량으로 등용매 조건으로 수행되었다.
도 13은 실시예 5에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 14는 실시예 5에 대한 결과의 표를 제공한다.
실시예 6: UNOspher TM S에 킬레이트제의 보충 없이 rVWF 프로펩티드로부터 rVWF를 정제하기 위한 CEX 방법.
실시예 6은 한외여과된 UNOsphereTM S에 킬레이트제 보충 없이 CEX 방법을 나타낸다. 이 방법은 rVWF 프로펩티드로부터 성숙한 rVWF를 정제하기 위한 종래 기술의 대표적인 방법이다. 이 방법은 킬레이트제를 포함하는 완충액 및/또는 7.0 이상의 pH를 갖는 완충액을 사용하지 않는다.
재조합 인자 VIII을 포획하기 위한 모노클로날 항체 단계 후, rVWF를 함유하는 유동 통과물을 음이온 교환기에 로딩하였다. rVWF는 음이온 교환기에 결합되었고, 칼슘의 존재 하에 퓨린으로 성숙되었다. rVWF는 전도도가 증가하면서 음이온 교환기로부터 용출되었다. 이어서, 생성물 함유 용출액을 내경이 15 mm이고 베드 높이가 14.2 cm이고 부피가 25.09 ml인 UNOsphereTM S 양이온 교환 매질 (Bio Rad, 카탈로그 번호: 156-0115) 양이온 교환기 컬럼에 유량 100 cm/h로 로딩한 다음, 10 CV의 10 mM 트리스-HCl, 100 mM Na 아세테이트, 85 mM NaCl, pH 6.5 ±0.2로 세척하여 HCP 및 rVWF-프로펩티드를 제거하였다. rVWF는 65 cm/h의 유량으로 100 mM Na 아세테이트, 500 mM NaCl, 100 mM 글리신, 3 mM CaCl2, pH 7.5 ±0.2를 적용함으로써 단일 단계로 용출되었다. 주요 용출액 피크는 생성물 함유 분획으로서 수집되었다.
도 15는 실시예 6에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물 및 조건을 나타낸다.
도 16은 실시예 6에 대한 결과의 표를 제공한다.
실시예 7: 킬레이트제의 사전 보충 또는 상승된 pH 없이 rVWF 프로펩티드로부터 rVWF를 정제하기 위한 SEC 방법.
실시예 7은 킬레이트제의 사전 보충 또는 상승된 pH가 없는 SEC 방법을 나타낸다. 이 방법은 rVWF 프로펩티드로부터 성숙한 rVWF를 정제하기 위한 대표적인 선행 기술 방법이다. SEC 방법은 킬레이트제 및/또는 rVWF 및 잔류 rVWF 프로펩티드를 함유하는 출발 분획 (물질)을 컨디셔닝하기 위해 사용되는 7.0 이상의 pH를 갖는 완충액을 포함하는 완충액을 포함하지 않는다.
재조합 VWF 함유 한외여과된 UNOsphereTM S-용출액을 일련의 2개의 Superose 6 분취 등급 SEC 컬럼 (GE Healthcare, 카탈로그 번호: 28-9913-16)의 어레이 상에 직접 로딩하였는데, 두 컬럼은 각각 내경이 16 mm이고 베드 높이가 82.0 cm (2 x 41 cm)이고 두 컬럼의 부피는 대략 165 ml였다. 로딩은 7 cm/h의 유량으로 적용되었다. 진행 완충액은 20 mM HEPES 유리산, 150 mM NaCl, pH 7.5 ±0.2였다. 크기 배제 크로마토그래피는 12 cm/h의 선형 유량으로 등용매 조건으로 수행되었다.
도 17은 실시예 7에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 18은 실시예 7에 대한 결과의 표를 제공한다.
실시예 8: 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 rVWF 프로펩티드로부터 rVWF의 분리.
실시예 8은 양이온 교환기에서 성숙된 rVWF의 정제를 나타낸다. 출발 물질은 AEX Mustang Q 단계 후에 현재 rVWF 제조 공정으로부터 수득되었다. AEX Mustang Q 단계로부터 rVWF 함유 유체-통과물을 SD/VI 처리하고, 킬레이트제 함유 완충액으로 희석하여 rVW/rVWF-프로펩티드-복합체를 해리하였다. 희석된 물질을 CEX 수지 (Unosphere S)에 적용하였다. 대부분의 rVWF-PP, 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 저분자량 rVWF 다량체는 양이온 교환 수지를 통과한다. 잔류 rVWF-PP는 세척 단계 후에 고갈되었다. 결합된 고분자량 rVWF 다량체는 나트륨 이온에 의해 유발된 전도도를 증가시킴으로써 후속적으로 용출되었다.
산업적으로, VWF, 특히 재조합 VWF (rVWF)는 유전자 조작된 CHO 세포주에서 rFVIII과 함께 합성되고 발현된다. 공동-발현된 rVWF의 기능은 세포 배양 과정에서 rFVIII을 안정화시키는 것이다. rVWF는 N-말단에 부착된 큰 프로-펩티드를 함유하는 전구 형태로서 세포에서 합성된다. 소포체 및 골지체에서 성숙되면, 프로-펩티드는 세포 프로테아제 퓨린의 작용에 의해 절단되고 발현된 단백질의 이량체로 이루어진 동일한 서브유닛의 단일중합체로서 분비된다. 그러나, 성숙이 불완전하여 프로-펩티드와 성숙한 VWF의 혼합물을 포함하는 생성물을 생성한다.
재조합 인자 VIII을 포획하기 위한 모노클로날 항체 단계 후, rVWF를 함유하는 유체-통과물을 Fractogel TMAE 음이온 교환기에 로딩하였다. rVWF는 음이온 교환기에 결합되어 칼슘의 존재 하에 퓨린으로 성숙되었다. rVWF는 전도도가 증가하면서 음이온 교환기로부터 용출되었다. TMAE-용출액은 Mustang Q (MUQ) 필터 장치를 통해 여과하여 CHO-DNA와 필터 막에 결합하는 불순물을 제거하였다. CEX 단계에 대한 로딩 재료는 지질 외피 바이러스를 불활성화하기 위해 용매와 세제로 처리되는 Mustang Q 여과 단계 (MUQ)의 유출물이다. 바이러스 불활성화를 위해, MUQ 유출물은 2개의 세제, 예컨대 Triton-X-100 (1%) 및 폴리소르베이트 80 (0.3%) 및 유기 용매 트리-n-부틸포스페이트 (0.3%)와 혼합물과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 생성물 함유 MUQ_유체-통과물은 60 mM 시트르산 나트륨 pH 7.6으로 1:2로 희석하여 전도도 21.9 mS/cm 및 pH 7.16으로 컨디셔닝되었다. 원하는 고분자량 rVWF 다량체에 대한 수지의 용량을 이용하기 위해 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP) 및 저분자량 rVWF 다량체의 제거를 보장하기 위해 높은 전도도가 선택되었다. 컨디셔닝된 희석액을 내경이 10 mm이고 베드 높이가 14.3 cm이고 부피가 11.23 ml인 UNOsphereTM S 양이온 교환 매질 (Bio Rad, 카탈로그 번호 156-0115) 양이온 교환기 컬럼에 유량 100 cm/h로 로딩하였다. 로딩 후, 5 CV의 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2를 사용하여 1차 세척 (재평형화)을 수행하여 약하게 결합된 HCP 및 rVWF-프로펩티드를 제거하였다.
강하게 결합된 HCP 및 rVWF-프로펩티드를 고갈시키기 위한 2차 세척은 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 40% 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2의 단계로 수행되었습니다 (세척 2).
용출은 두 단계로 수행되었다: (1) 제1 단계는 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 45% 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2 (용출액 1 또는 E1)의 단계를 포함하였고, (2) 제2 단계는 6 컬럼 부피에서 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 45% 내지 100%의 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2의 선형 구배 (용출액 2 또는 E2)를 포함하였다. 65 cm/h 유량으로 구배 종료까지 세척 2를 수행하였다.
도 19는 실시예 8에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 20은 실시예 8에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 21은 실시예 8의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF-프로펩티드의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔을 나타낸다.
도 22는 실시예 8의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF-프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 1% 아가로스 겔은 생성물의 다량체 패턴을 나타낸다.
도 23은 실시예 8의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF-프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
실시예 9: 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 rVWF 프로펩티드로부터 rVWF의 분리.
실시예 9는 양이온 교환기에서 성숙된 rVWF의 최적화된 정제를 나타낸다. 출발 물질은 AEX Mustang Q 단계 후에 현재 r-VWF 제조 공정으로부터 수득되었다. AEX Mustang Q 단계로부터 rVWF 함유 유체-통과물을 SD/VI 처리하고, 킬레이트제 함유 완충액으로 희석하여 rVW/rVWF-프로펩티드-복합체를 해리하였다. 희석된 물질을 CEX 수지 (Unosphere S)에 적용하였다. 대부분의 rVWF-PP, 숙주 세포 단백질 및 저분자량 rVWF 다량체는 양이온 교환 수지를 통과한다. 잔류 rVWF-PP는 세척 단계 후에 고갈되었다. 결합된 고분자량 rVWF 다량체는 나트륨 이온에 의해 유발된 전도도 증가의 구배에 의해 용출되었다.
산업적으로, VWF, 특히 재조합 VWF (rVWF)는 유전자 조작된 CHO 세포주에서 rFVIII과 함께 합성되고 발현된다. 공동-발현된 rVWF의 기능은 세포 배양 과정에서 rFVIII을 안정화시키는 것이다. rVWF는 N-말단에 부착된 큰 프로-펩티드를 함유하는 전구 형태로서 세포에서 합성된다. 소포체 및 골지체에서 성숙되면, 프로-펩티드는 세포 프로테아제 퓨린의 작용에 의해 절단되고 발현된 단백질의 이량체로 이루어진 동일한 서브유닛의 단일중합체로서 분비된다. 그러나, 성숙이 불완전하여 프로-펩티드와 성숙한 VWF의 혼합물을 포함하는 생성물을 생성한다.
재조합 인자 VIII을 포획하기 위한 모노클로날 항체 단계 후, r-VWF를 함유하는 유체-통과물을 Fractogel TMAE 음이온 교환기에 로딩하였다. rVWF는 음이온 교환기에 결합되고 칼슘의 존재 하에 퓨린으로 성숙되었다. rVWF는 전도도가 증가하면서 음이온 교환기로부터 용출되었다. TMAE-용출액은 Mustang Q (MUQ) 필터 장치를 통해 여과하여 CHO-DNA와 필터 막에 결합하는 불순물을 제거하였다. CEX 단계에 대한 로딩 재료는 지질 외피 바이러스를 불활성화하기 위해 용매와 세제로 처리되는 Mustang Q 여과 단계 (MUQ)의 유출물이다.
바이러스 불활성화를 위해, MUQ 유출물은 2개의 세제, 예컨대 Triton-X-100 (1%) 및 폴리소르베이트 80 (0.3%) 및 유기 용매 트리-n-부틸포스페이트 (0.3%)의 혼합물과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 생성물 함유 MUQ_유체-통과물을 60 mM 시트르산 나트륨 pH 7.6으로 1:2로 희석하여 전도도 21.9 mS/cm 및 pH 7.16으로 컨디셔닝되었다. 원하는 고분자량 r-VWF에 대한 수지의 용량을 이용하기 위해 rVWF-프로펩티드 및 저분자량 rVWF의 제거를 보장하기 위해 높은 전도도가 선택된다. 컨디셔닝된 희석액을 내경이 10 mm이고 베드 높이가 141.3 cm이고 부피가 11.23 ml인 UNOsphereTM S 양이온 교환 매질 (Bio Rad, 카탈로그 번호 156-0115) 양이온 교환기 컬럼에 로딩에 유량 100 cm/h에 이어서, 5 CV의 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2로 1차 세척 (재평형화)하여 약하게 결합된 HCP 및 rVWF-프로펩티드를 제거하였다.
강하게 결합된 HCP 및 rVWF-프로펩티드를 고갈시키기 위한 2차 세척 (세척 2)은 5 컬럼 부피에서 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 36% 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2의 단계로 수행되었다.
용출은 8 컬럼 부피에서 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 36% 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2로부터 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 100% 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2로의 구배로 수행되었다. 원하는 생성물을 나타내는 용출액은 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 > 50%의 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 개시하여 10 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2에서 76%의 500 mM NaCl, 30 mM 시트르산 나트륨, pH 7.6±0.2까지 분획의 풀 (pool)을 함유한다. 세척 및 용출은 50 cm/h의 유량으로 수행되었다.
도 24는 실시예 9에 대한 크로마토그램, 크로마토그래피 도식, 및 완충액 조성물을 나타낸다.
도 25는 실시예 9에 대한 결과의 표를 제공한다.
도 26는 실시예 9에 대한 생성물의 표를 제공한다.
도 27은 실시예 9의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF-프로펩티드의 분리를 보여주는 은 염색된 단백질 겔을 나타낸다.
도 28은 실시예 9의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 1% 아가로스 겔은 생성물의 다량체 패턴을 나타낸다.
도 29는 실시예 9의 방법에 의한 rVWF 및 rVWF 프로펩티드의 분리를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
킬레이트제의 존재 및/또는 상승된 pH에서 rVWF 정제 단계는 r-VWF 프로펩티드 및 숙주 세포 단백질의 높은 고갈 속도를 나타냈다. 양이온 교환기에서 r-VWF 프로펩티드의 고갈은 rVWF-PP가 킬레이트제의 존재 및/또는 상승된 pH 조건에서 양이온 교환기에 결합하지 않는다는 사실에 기반한다. 크기 배제 크로마토그래피에서 rVWF 프로펩티드의 고갈은 킬레이트제의 존재 및/또는 상승된 pH에서 효율적인 크기 분리의 사실에 기반한다.
도 30은 실시예 1, 2, 3, 6, 8, 및 9에 사용된 바와 같이 향상된 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 대해 수득된 생성물 함유 분획의 순도를 나타낸다.
도 31은 실시예 1, 2, 3, 6, 8, 및 9에 대한 생성물 관련된 불순물의 고갈 인자를 나타낸다.
도 32는 실시예 4 및 5에 사용된 바와 같이 향상된 크기-배제-크로마토그래피 (SEC)에 대해 수득된 생성물 함유 분획의 순도를 나타낸다.
도 33은 실시예 4 및 5에 대한 생성물 관련된 불순물의 고갈 인자를 나타낸다.
참조문헌
미국 특허 번호 제8,058,411호; VWF 프로-펩티드로부터 성숙한 VWF를 생성하는 방법. 발명자: Wolfgang Mundt, Artur Mitterer, Meinhard Hasslacher, Christa Mayer.
미국 특허 번호 제6,465,624호; 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 폰 빌레브란트 인자의 정제. 발명자: Bernhard Fischer, Oyvind L. Schonberger, Artur Mitterer, Christian Fiedler, Friedrich Dorner, Johann Eibl.
실시예 10: 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 rVWF 프로펩티드로부터 rVWF의 분리.
이 연구는 음이온 교환 크로마토그래피 및 상승된 pH를 갖고 (예를 들어, pH 8.5) 킬레이트제 (EDTA)를 함유하는 용출 완충액을 사용하여 퓨린 처리된 성숙한 VWF/VWF-PP 복합체의 성숙한 VWF 및 VWF-PP로의 해리 (분리)를 설명한다. 분리는 음이온 교환기 (AEX), 특히, Fractogel TMAE 650(M)에서 수행되었다. 바이러스 불활성화를 위한 용매-세제 처리는 또한 약 1시간 동안 컬럼에서 수행되었다. 크로마토그래피 실험의 세부사항은 도 34 내지 36에 제공된다.
도 34는 TMAE 분리 방법에서 사용된 완충액 제형 및 재료를 나타낸다.
도 35는 퓨린-처리된 성숙한 VWF/VWF-프로펩티드 복합체에 대한 로딩 조건을 나타낸다.
도 36은 크로마토그래피 방법의 완충액, 조건, 매개변수, 및 유량의 세부사항을 나타낸다.
도 37은 퓨린-처리된 성숙한 VWF/VWF-프로펩티드 복합체의 성숙한 VWF 및 VWF-프로펩티드 (VWF-PP)로의 해리의 크로마토그램을 나타낸다. 이는 성숙한 VWF를 함유하는 분획으로부터 VWF-PP의 고갈을 나타낸다.
도 38은 성숙한 VWF 및 VWF-프로펩티드 (VWF-PP)의 분리의 또 다른 크로마토그램을 나타낸다. 이는 성숙한 VWF를 함유하는 분획으로부터 VWF-PP의 고갈을 나타낸다.
실시예 11: 성숙한 VWF (matVWF) 및 VWF 프로펩티드 (VWF-PP)의 분리를 위한 상이한 크로마토그래피 방법의 개선.
첫 번째 연구에서는 재조합 성숙한 VWF를 정제하기 위한 두 가지 방법을 비교하였다.
도 39는 성숙한 VWF를 단리하기 위한 두 가지 방법의 개략도를 제공한다. 하나의 방법에서, 다운스트림 처리 단계, 예컨대 mAb 유출물 (MABEffl)을 얻은 후의 단계들, TMAE 음이온 교환 크로마토그래피 및 온-컬럼 성숙 (TMC)의 포획 단계, 및 Mustang Q 음성 음이온 교환 크로마토그래피 단계 (MUQ)는 바이러스 불활성화를 위한 용매-세제 처리 (SDT), 양이온 교환 크로마토그래피 (CAT), 한외여과 농도 (UFA), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 및 투석-한외여과 농도 (DUF)를 포함하여 벌크 약물 물질 (성숙한 VWF)을 생성한다. 나머지 방법에서, 다운스트림 처리 단계는 개선된 양이온 교환 크로마토그래피 (CAT) 단계에 이어서 투석-한외 여과 (DUF) 농축 단계를 포함하여 벌크 약물 물질을 생성하고 SEC는 포함하지 않는다.
도 40은 본원에 기재되고 도 39에 나타낸 개선된 양이온 교환 크로마토그래피 방법 (CAT 2.0)의 이점 중 일부를 강조하는 표를 제공한다. 개선된 CAT 방법은 1000 초과의 감소 인자에 의해 숙주 세포 불순물, 2000 초과의 감소 인자에 의한 VWF-PP, 및 10 미만의 감소 인자에 의한 잔류 FVIII를 제거할 수 있다. CAT 방법을 사용하여 VWF 다량체를 분리하고 풀링할 수 있다. 또한, 방법은 VWF의 활성 분획을 단리하고 잔류 숙주 세포 유래 불순물 및 VWF-PP를 제거하기 위한 연마 단계로서 크기 배제 크로마토그래피를 대체할 수 있다.
두 번째 연구에서는 SEC 공정의 조건은 성숙한 VWF 및 VWF-PP의 분리를 개선하기 위해 다양하였다. 즉, SEC를 위한 변형된 완충액은 VWF-PP의 양을 감소시킴으로써 성숙한 VWF의 순도를 증가시킬 수 있다는 것을 알아냈다.
도 41은 표준 SEC 완충액 (SQA 완충액) 또는 변형된 SEC 완충액 (SQC 완충액)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 r-VWF 프로펩티드의 분리를 나타내는 2개의 크로마토그램의 개략도를 나타낸다. 도 42는 SQC 완충액 사용의 이점 중 일부를 강조하는 표를 제공한다. 예를 들어, SQC 완충액을 사용하는 방법은 약 100 초과의 감소 인자에 의해 숙주 세포 불순물을 제거하고 10 미만의 감소 인자에 의해 잔류 FVIII를 제거할 수 있다. 놀랍게도, 불순물 수준이 2 μg/1000 유닛 미만이 되도록 VWF-PP를 제거할 수 있다.
이와 같이, 본 실시예에는 VWF-PP로부터 성숙한 VWF의 분리를 개선하는 방법이 기재되어 있다.
실시예 12: 개선된 CAT (UNO_S) 단계의 개발.
모노클로날 항체 (MAB) 유동 통과물로부터 시작하는 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF) 제1 생성의 다운스트림 공정은 UNO_Sphere S (UNO_S) 수지에서 양이온 교환 크로마토그래피 (CAT)에 의한 연마 단계를 포함한다. 이 후, UNO_S 용출액은 한외여과에 의해 농축되고, 크기-배제-크로마토그래피 (SEC)에 의해 추가로 처리되어 고분자량 및 저분자량 rVWF 다량체를 분리하고, 다운스트림 공정 과정에서 생성된 관련된 불순물인 유리 rVWF 프로-펩티드를 제거한다. 고분자량 rVWF 하위-분획은 최종 의약품 (FDP)을 수득하기 위해 마지막으로 제형화된 벌크 의약 물질 (BDS)을 나타낸다.
제2 생성 rVWF의 다운스트림 공정을 위해, SEC 단계를 개선된 양이온 교환 크로마토그래피 방법으로 대체하고, 대안적인 양이온 교환 (CAT) 용출 절차 (단계 용출 대신에 구배 용출)에 의한 rVWF 프로-펩티드뿐만 아니라 고분자량 및 저분자량 rVWF 다량체를 분리하는 것이 제안되었다. 이 실시예에서는 제2 생성 rVWF 연마 정제 단계 CAT에 대한 실험이 개략되어 있다. 새로운 공정 매개변수, 예컨대 CAT 로딩 pH 및 전도도, 컬럼 세척 단계의 전도도 및 길이 및 용출액 풀링 기준은 소규모로 탐색되어, 확장 가능하고 강력한 공정 다운스트림 유닛 작동 단계를 얻었다.
1. 목적
제1 생성 rVWF (VONVENDI®)의 다운스트림 공정은 ADVATE® MAB 유동 통과물을 공급물로서 사용하여 TMAE Sepharose (TMC 단계)에서 포획 단계와 함께 시작하고, 이어서 Mustang Q 여과 단계를 거쳐 CHO 숙주 세포 DNA를 제거한다. 다음으로, 용매/세제 (S/D) 단계를 수행하여 잠재적인 지질 외피 바이러스를 불활성화한 다음, 약한 양이온 교환기인 UNO_Sphere S (UNO_S) 수지에서 연마 단계를 수행한다 (CAT 단계). CAT 단계는 바이러스 불활성화 단계 동안 도입된 S/D 화학 물질을 제거하기 위한 것이다. 이 후, UNO_S 용출액은 한외여과에 의해 농축되고, 크기-배제-크로마토그래피 (SEC)에 의해 추가로 처리되어 고분자량 및 저분자량 rVWF 다량체를 분리하고, 다운스트림 공정 과정에서 생성된 생성물 관련된 불순물인 유리 rVWF 프로-펩티드를 제거한다. 고분자량 rVWF 하위-분획은 FDP를 수득하기 위해 마지막으로 제형화된 BDS를 나타낸다.
제2 생성 rVWF의 다운스트림 공정의 경우, SEC 단계를 취소하고 개선된 양이온 교환 크로마토그래피 방법으로 대체하는 것이 제안되었다.
일련의 5개의 실험에서, rVWF 프로-펩티드의 제거뿐만 아니라 저분자량 rVWF 다량체로부터 고분자량 rVWF 다량체의 분리는 구배 CAT 용출 절차에 의해 달성되었다. 새로운 구배 용출 모드는 제1 생성 다운스트림 공정에 적용되는 단계 용출 절차를 대체할 수 있었다. 이 실시예에는 제2 생성 rVWF 연마 정제 단계 CAT에 대한 5개의 실험이 상세히 개략되어 있다. 모든 실험은 본원에 기재된 연구 계획에 따라 수행되었다.
2. 도입 및 배경
현재 보고서에는 현재 제1 생성 (Gen 1) 절차에 적용되는 2개의 VWF 다운스트림 유닛 작동 단계 CAT 및 SEC를 결합시킴으로써 제2 생성 (Gen 2) T 공정의 개발이 기재되어 있다. 일련의 실험에서, 위험 평가에서 확인되었고 크로마토그래피 단계 CAT의 성능에 중요한 것으로 간주되는 공정 매개변수가 탐색되었다. 현재 연구는 현재 rVWF 제조 공정의 규모 축소 모델에 기반한다. 이 공정은 임상 3상 물질의 생산을 위해 Orth에서 안정화되었고, 상업적 생산을 위해 제조 (MFG) 규모로 옮겨졌다 (도 43a). 이 보고서에 기재된 CAT 유닛 작동 단계에 도입된 변화에 대한 이해를 용이하게 하기 위해, 현재 사용된 제1 생성 rVWF 다운스트림 유닛 작동 단계 S/D, CAT 및 SEC에 대한 간단한 공정 설명이 아래에 제공된다.
Gen 1 공정에 사용된 바와 같이, rVWF 연마 단계 CAT는 "강한" 설폰 양이온 교환 리간드를 갖는 거대다공성 아크릴아미도 기반 매질인 UNO_Sphere S에서 크로마토그래피 양이온 교환 공정이다. 연마 단계를 위한 로딩 재료는 지질 외피 바이러스를 불활성화하기 위해 용매 및 세제로 처리되는 음이온 교환 여과 단계 MUQ의 유출물이다. 바이러스 불활성화를 위해, MUQ 유출물은 2개의 세제 Triton-X-100 (1%) 및 폴리소르베이트 80 (0.3%) 및 유기 용매 트리-n-부틸포스페이트 (0.3%)의 혼합물과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 처리 전에, 생성물 용액을 0.2 μm 막 필터를 통해 여과하여 잠재적으로 본재하는 미립자를 제거한다. 바이러스 불활성화 후, 생성물 용액을 대략 1 부피의 물로 희석하여 S/D 시약의 농도를 감소시켜 CAT 컬럼에 대한 로딩 단계에 대한 전도도를 조정한다. pH는 조정되지 않는다. CAT 크로마토그래피 단계의 주요 목적은 S/D 시약을 제거하고, 배지 성분, 예컨대 대두 펩톤 및 기타 불순물, 예컨대 r퓨린, rFVIII 폴리펩티드 및 CHO 유래 단백질 및 DNA를 포함하는 공정 관련된 불순물을 추가로 감소시키는 것이다. 유닛 작동 단계 CAT 이후에, 수득된 생성물 분획 (CAT-E)은 Superose 6 수지에서 크기-배제-크로마토그래피 (SEC)에 의해 추가로 처리된다. 연마 단계 SEC에 대한 로딩 재료는 UNO_Sphere S에서 양이온 교환 연마 단계 CAT의 용출액 풀이다. SEC 컬럼에 대한 로딩 부피는 합리적인 분해능을 얻기 위해 제한되므로, CAT 용출액 풀은 컷-오프가 30 kDa인 셀룰로오스 기반 막 카세트를 사용하여 한외여과에 의해 대략 15배로 농축된다 (단계 UFA). 임상 3상 생산 규모에서, 한외여과 농도 (UFA) 농축물은 SEC 컬럼에서 별도로 처리되는 2개의 분획으로 나뉜다. 이 조치는 SEC 컬럼 부피와 컬럼 직경을 낮게 유지하기 위해 구현되었다. 로딩 재료의 전도도 및 pH뿐만 아니라 완충액 매트릭스는 CAT 용출액 풀에 해당하고, SEC 컬럼에 로딩하기 전에 농축 단계 UFA 후에 조정되지 않는다. 단계 SEC의 목적은 CHO 숙주 세포 단백질에 대한 최종 불순물 제거이고, TMAE Sepharose에서 초기 포획 단계 동안 생성된 생성물 관련된 불순물 rVWF 프로-펩티드에 대한 주요 제거 단계 역할을 한다 (TMC 단계). 또한, 단계 SEC는 크기에 기반하여 rVWF 다량체를 분해하여 생성물의 리스토세틴 보조 인자 활성에 기여하는 고분자량 rVWF 다량체의 농축 (enrichment)를 위한 풀링 스키마 (pooling schema)를 허용한다.
이 보고서에는 MFG (도 43a) 규모에서 수행된 현재 유닛 작동 단계를 개선된 CAT (UNO_S) 단계 (도 43b)로 대체하는 것이 기재되어 있다. CAT 단계 개선은 소규모로 조사되었다. CAT 단계 후의 UDF (농축/투석) 단계도 최적화되어야 한다.
3. 재료 및 방법
샘플림 계획뿐만 아니라 재료 및 방법이 여기에 기재되어 있다.
3.1 rVWF 로딩 재료
모든 실험에 대해, 동결된 MUQ-E 제품이 사용되었다. 재료는 130 mL 분취량으로 ≤-60℃에서 동결 보관되었고 필요에 따라 +2 내지 +8℃ 범위에서 밤새 해동되었다. MUQ - 용출액이 해동되면 S/D 시약을 첨가하고, 혼합물을 Pall로부터의 0.2 μm 필터 KA02EAVP2S®를 통해 여과하였다. 이 후, 여과된 재료는 잠재적인 지질 외피 바이러스를 불활성화/용해시키기 위해 주위 실온 (약 +25℃)에서 60분 동안 적당한 교반 하에 항온처리하였다. S/D 반응은 60 mM 시트르산 나트륨 완충액, pH 7.5로 1:2로 희석하여 중단시켰다. 희석된 재료는 다음 CAT 단계에 대한 공급물로서 사용되었다.
3.2 크로마토그래피 하드웨어
현재 보고서에 기재된 실험에 대해, 소규모 크로마토그래피 시스템
Figure pct00015
KTA pure 25 (GE Healthcare)가 사용되었다. 시스템에는 전자 기록과 함께 UV 흡수, 전도도, 압력, 온도 및 pH를 온-라인 모니터링하기 위한 프로브가 장착되었다. 시스템은 Unicorn 7.0 작동 소프트웨어에 의해 제어되었다. 모든 진행은 주위 실온에서 수행되었다.
Figure pct00016
KTA 시스템 튜빙은 스테인리스 강철 관 (piping)이 있는 Millipore 공정 시스템이 사용되는 대규모와는 상이한 PEEK였다. 하드웨어 구성요소는 모두 적격 R&D 장비이다.
모두 5개의 실험에 사용되었던 실험실-규모 컬럼에는 10 μm PP 프릿이 장착되었다; UNO_Sphere S 수지의 입자 크기는 직경이 약 80 μm였다. 메쉬 크기가 20 μm인 대규모 스테인리스 강철 프릿이 사용된다. 모든 컬럼은 R&D 목적을 위해 설계된 적격 항목이다.
NE에서 현재 GEN 1 MGF 장비와 현재 연구에서 사용되는 소규모 GEN 2 장비 사이의 하드웨어 비교를 도 44에 나타낸다.
3.3 완충액
소규모 정제 진행에 사용된 완충액은 실험실 영역에서 만들었거나, 제조 영역으로부터 받았다. 완충액 제조를 위해, 파일럿 규모의 임상 생산을 위한 완충액의 생성에도 사용되었던 적격 화학 물질이 사용되었다. 완충액은 0.2 μm 여과되었고, 사용 전에 실온에서 백 (bag) 또는 유리 병에 보관되었다. 완충액 조성에 대한 설명은 도 48에 제공된다.
3.4 분석 방법
수행된 rVWF 생화학적 특성화, 효능 및 불순물 검정은 VWF:RistoCo 활성, VWF 항원, VWF-프로펩티드 항원 함량, FVIII 활성 발색 방법, UV 흡수 프로파일 (280 nm, 254 nm), 폴리펩티드 패턴, 예컨대 분해, 다량체 패턴, 및 CHO HCP 함량을 분석하기 위해 검정을 포함한다. 일부 경우에, 다른 분석 시험을 수행하여 예컨대 프로-VWF 항원 함량, FVIII 항원 함량, 퓨린 활성, 퓨린 항원, 총 단백질 (BCA), 유리 설프하이드릴, CHO BIP WB, CHO DNA, 뮤린 모노클로날 항체, 대두 펩톤, Triton X-100, 폴리소르베이트 80, 트리-n-부틸포스페이트, 동적 광 산란 (DLS) (유체역학적 반경), 시알산, n-글리신 함량, VWF 콜라겐 결합, 및 VWF 산화를 결정할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
4 CAT 공정 rVWF 제2 생성 (GEN 2)에서의 변경
제2 생성 rVWF 다운스트림 공정에서 SEC 단계를 대체하기 위해, 아래에 나열된 매개변수가 탐색되었다. 도입된 대부분의 변화는 R&D 실현가능성 연구에 기반한다. 크로마토그래피 수지 유형 (BioRad의 UNO_Sphere S 수지) 및 적용된 완충액의 조성물 (pH 아님)은 변경되지 않았다. 제2 생성 CAT 공정에는 하기 변화가 포함되었다: S/D 처리, 로딩 농도 및 유량, 세척 및 용출 단계.
4.1 S/D 처리
S/D 처리는 S/D 불활성화가 CAT 공급물을 7.5 내지 8.0의 바람직한 pH (pH 시험 범위 6.0-9.0) 및 +25℃에서 10 - 30 mS/cm2의 바람직한 전도도 (전도도 시험 범위 +25℃에서 5-40 mS/cm2)로 설정하는 60 mM 시트르산 나트륨 완충액으로 바이러스 불활성화된 재료를 1:2 희석하여 중단되었다는 것을 제외하고는, GEN 1 공정과 동일한 방식으로 수행되었다. 수행되었던 GEN 1 rVWF CAT 단계에서, CAT 로딩은 8.9-9.2의 pH로 설정되었다. GEN 2 설정에서, 전도도와 pH는 매트릭스에 대한 CHO-HCP, CHO-DNA 및 rVWF 프로-펩티드 결합을 최소화하는 지점으로 설정되었다. 유사하게, 저분자량 (LMW) rVWF 분자는 컬럼 매트릭스에 결합하는 데 방해가 되었지만, 바람직하게는 고분자량 (HMW) rVWF 분자만을 포획하였다. 현재 연구의 하나의 목적은 로딩 단계 동안 전도도를 증가시키고 가능한 한 많은 LMW rVWF, CHO-HCP, CHO-DNA 및 rVWF 프로-펩티드를 공급물로부터 고갈시키는 것이었다.
4.2 로딩 농도 및 유량
로딩 농도 (RU rVWF/mL 수지)는 컬럼 부피를 증가시키지 않으면서 더 높은 생성물 로딩을 가능하게 하기 위한 연구 과정에서 증가되었다. 제조 규모 (MFG)에서는 일반적으로 60-140 RU/ml 수지의 로딩 농도가 적용되지만, 현재 소규모 연구에서는 90-270 IU/ml 수지가 로딩되었다. 제2 생성 CAT 절차의 평형, 로딩 및 재평형 유량은 제1 생성 공정 (100 cm/h)과 동일하였다. 세척 및 용출 유량은 도 45에 나타낸 바와 같이 변경되었다.
4.3 로딩 농도 및 유량
용출 단계 이전의 세척 단계는 공정 및 생성물 관련된 불순물의 제거를 최적화하기 위해 변경되었다. 제1 생성 공정에서 적용된 바와 같은 단계 용출은 구배 용출로 변경되었다. 연구 과정에서 구배 길이가 탐색되었다. 용출 절차의 변화는 저분자량 rVWF 분자가 초기 구배 분획에서 용출되고 고 분자량 rVWF 분자가 후기 구배 분획에서 용출된다는 관찰에 기반하였다 (예를 들어 US 6,465,624 참조).
5. CAT Gen 1 및 Gen 2 공정의 비교
두 절차 모두에서, CAT 공정은 다음 단계를 포함한다: 컬럼 활성화 (양이온성 반대 이온 나트륨으로 음이온성 리간드의 로딩) 및 평형화 (안정한 pH 및 전도도 측면에서 로딩을 위한 컬럼 준비, 컬럼 출구에서 모니터링됨)에 이어서 S/D 처리되고 희석된 MUQ 용출액의 생성물 로딩.
MFG 규모로 로딩하는 동안, 용출액은 S/D 처리 동안 형성될 수 있는 미립자 물질로부터 컬럼을 보호하기 위해 0.2 μm 필터를 통해 온라인으로 여과되었다. 소규모 공정에서는 이 단계가 생략되었다. 용액을 함유하는 생성물을 컬럼에 펌핑한 후, 로딩을 완료하고 컬럼에 펌핑된 저분자량 S/D 시약을 제거하는 세척 단계를 적용함으로써 느슨하게 결합된 불순물을 제거하였다. 세척 단계의 pH 및 전도도는 평형화 및 로딩 단계의 매개변수에 해당한다. 세척 후, 결합된 단백질은 전도도와 반대 이온농도가 증가된 용출 완충액을 사용하는 단계 용출을 적용함으로써 컬럼으로부터 용출되었다. 3.6 CV 이하의 생성물 풀이 수집되었다.
소규모 Gen 2 공정에서, 컬럼으로부터 rVWF 프로-펩티드, 저분자량 rVWF 분자 및 고분자량 분자를 제거하기 위해 대안적인 구배 용출 절차가 사용되었다 (도 45). 용출 이전의 세척 단계는 구배 용출의 시작점과 동일한 pH 및 전도도로 세척 단계로서 수행되었다. 네 가지의 세척 시나리오가 시험되었다: 0% B (10 CV), 55% B (10 CV), 40% B (5 CV) 및 45% B (5 CV) 및 36% B (5 CV). 해당하는 구배 용출 단계는 0-100% B (12 CV), 55-100% B (6 CV), 45-100% B (6C V) 및 36-100% B (6 CV)였다. 용출은 100% B로 2-3 CV 세척에 의해 완료되었다.
용출액은 용출 생성물 관련된 불순물 및 생성물 아종 (sub-species)에 따라 풀링되었다. 생성물 용출 후, 컬럼을 염기성 및 산성 용액으로 세정하고 살균하였다. 이 연마 단계의 주요 목적은 CHO 숙주 세포 단백질, 인간 r퓨린, 배지 화합물, 예컨대 대두 펩톤을 포함하는 공정 관련된 불순물, 생성물 관련된 불순물 (rVWF 프로-펩티드) 및 저분자량 S/D 시약의 추가 제거였다. rFVIII 제거에 단지 약간의 기여가 예상되었다. 개선된 CAT (UNO_S) 단계 이후에, 단백질 농도 및 완충액 교환 단계 (한외/정용여과)가 필요할 수 있다. 그러나, 이 한외/정용여과 단계는 본원에 기재된 연구의 일부가 아니었다. 제1 Gen MFG 규모 공정과 제2 생성 소규모 공정 사이의 크로마토그래피 절차의 차이는 도 46 내지 48에 개략되어 있다.
6. 결과
하기 섹션에서, 현재 연구의 결과가 제시되어 있다. 소규모로 수행된 5개의 실험은 변형된 UNO (CAT) 절차의 도입에 의해 SEC 유닛 작동 단계와 이전 한외여과 (완충액 교환) 단계의 교체가 가능하다는 것을 명백히 나타낸다.
6.1 크로마토그램
상기 개략된 바와 같이, 상이한 세척 및 구배 용출 절차를 갖는 5 개의 실험이 수행되었다. UNO S 단계의 의도는 한편으로 생성물 및 공정 관련된 불순물 제거를 위한 최적의 방법을 발견하고 VWF Ag 및 활성 측면에서 최적의 수율을 달성하는 것이었다. 도 49는 최종 (5번째) 진행 VW_USS_05의 2개의 크로마토그램이 제시된 것을 나타낸다. 도 49의 상부 패널은 컬럼 활성화, 로딩 단계 (높은 UV280nm 흡수는 공급물에 함유된 S/D 화학 물질에 의해 유발됨), 재평형화, 세척, 구배 용출, 2M NaCl 세척 및 CIP 절차를 포함하는 전체 진행을 묘사한다. 크로마토그램은 x-축의 규모를 설명하는 2개의 결과 파일로부터 융합된다 (결과 파일 1: 로딩 끝까지 활성화; 결과 파일 2: 재평형화 시작, 36% B 세척, 구배 용출, CIP). 도 49의 하부 패널은 용출 단계를 상세히 묘사한다 (36% 용출-완충액 B에 이어서, 구배 용출 36% B 내지 100% B 및 100% 용출-완충액 B 단계의 단계 세척).
6.2 SDS-PAGE
적용된 크로마토그래피 조건의 변이 및 최적화 (예를 들어, 세척 전도도, 구배 용출 시작)로, 프로-펩티드 및 성숙한 rVWF의 분리가 개선되었다. 또한, 공정 관련된 불순물의 제거 및 성숙한 rVWF Ag의 수율 및 활성이 향상되었다. 일련의 실험에서 마지막 (5번째) 진행의 SDS-PAGE 결과 (은 염색 및 항 rVWF 웨스턴 블롯)가 도 50에 제시되어 있다.
SDS-PAGE는 환원 조건하에 3-8% 트리스-아세테이트 겔에서 수행되었다. 분리된 폴리펩티드는 은 염색 (상부) 및 웨스턴 블롯 (하부)에 의해 시각화되었다. 로딩 전에, 샘플을 DTT로 환원시키고, 이 후 유리 설프하이드릴기를 요오도 아세트아미드로 차단하였다. 웨스턴 블롯의 경우, 1차 항체는 폴리클로날 토끼 항-인간-VWF 항체 (Dako로부터; 주문 번호 A0082; 희석 1:1000)였고, 2차 항체는 폴리클로날, AP-접합된 염소 항-토끼-IgG 항체 (Sigma로부터; 주문 번호 A-8025; 희석 1:2000)였다. rVWF 대역은 250 kDa 초과에서 진행된다; VWF 프로-펩티드는 약 90 kDa에서 진행된다. 프로-펩티드는 웨스턴 블롯팅에 사용되는 항체에 의해 검출되지 않는다.
진행 VWF_USS_05의 결과는 프로-펩티드와 성숙한 rVWF의 명확한 분리를 나타낸다. 용출액 샘플 (레인 16)과 제1 생성 절차 (레인 18)에 따라 정제된 참조 샘플은 매우 필적할만 하다.
6.3 다량체 분석
고분자량 및 저분자량 rVWF 아종 다량체의 분포를 평가하기 위해, 아가로스 겔 및 웨스턴 블롯에 의한 분석이 수행되었다. 로딩, 유동 통과물 (FT), 세척, 용출 및 고염 세척으로부터의 샘플을 시험하였다 (도 51). LMW rVWF 아종은 유동 통과물 (FT; 유출물 분획) (레인 8) 및 세척/용출 전 (레인 9 및 10)에 포함된다. 용출 및 용출 후 풀 (레인 11 및 12)은 참조 샘플 SEC-F (레인 15)에 필적하는 대역 패턴을 나타낸다. 참조 샘플은 제1 생성 (Gen 1) 공정에 따라 정제되었고, SEC 용출액 풀의 상승 피크에 대략 해당한다. 고 염 세척 (레인 13)은 레인 상단 영역의 얼룩에 의해 보이는 초대형 rVWF 분자를 포함한다.
다량체 분석은 표준 프로토콜에 따라 1% 아가로스 겔에서 수행되었다. 대략 50 ng의 rVWF가 레인당 적용되었고 요소의 존재시 비환원 조건 하에 분리되었다. 분리된 폴리펩티드는 1차 항체 (1:1000 희석)로서 토끼 항-인간 VWF 항체 (Dako)를 사용하고 2차 항체 (1:2000 희석)로서 AP-접합된 염소 항-토끼 IgG 항체 (Sigma)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 시각화되었다.
UNO_S (Gen 2)와 SEC (Gen 1) 진행 사이의 rVWF 다량체 분포를 비교하면 역 분리 효과를 명확하게 볼 수 있다. SEC 절차에서, 초대형 및 대형 분자가 먼저 용출되고 (공극 부피) 이어서 표적 분자와 프로-펩타이드가 용출된다. Gen 2에서, 분리 순서는 단지 반대이다 (소형으로부터 대형까지). 그러나, 두 방법 모두는 용출액 풀에서 동일한 rVWF 다량체 분포를 초래하였다. UNO_S 단계 이후에, UDF (농축/투석) 유닛 작동은 표적 분자를 농축시키고 이를 제형 완충액으로 전달하기 위해 필요하였다.
6.4 분석 결과
분석 결과의 요약은 도 52 내지 도 55에 제공된다. 각 표는 하나의 특정 분석 검정의 결과를 나타내고, 연구 과정에서 수행된 5개의 진행 모두의 데이터를 포함한다. 용출액 결과의 비교 개요도 또한 도 56에 제시되어 있다. rVWF:Ag 및 Risto Co 활성 용출액 수율의 백분율 이외에, 표에는 상이한 진행 설정사이를 직접 비교할 수 있도록 계산된 비율을 포함된다.
6.5 성공 기준에 대한 분석 데이터 일치
변형된 CAT (UNO_S) 유닛 작동 단계로부터 초래된 용출액 (생성물 분획)의 목표 매개변수는 선택된 BDS 생성물 규정을 부분적으로 준수한다. CAT-E 생성물 풀은 BDS 재료를 수득하기 위해 농축되고 투석될 필요가 있기 때문에 개발 목표 (도 57)는 절대 매개변수 농도와 무관한 주로 (계산된) 비율이다.
대부분의 개발 목표가 충족되었거나 거의 도달했다는 사실은 본원에 기재된 제안된 절차의 실현가능성을 입증한다. 모든 분석 검정이 수행되지 않았지만, 주요 결과, 예컨대 rVWF 다량체의 분포뿐만 아니라 rVWF:Ag 및 Risto 수율, CHO HCP 및 프로-펩티드 불순물 제거는 제안된 새로운 CAT 절차 및 이전에 적용된 UNO_S/SEC 조합과 필적할만한 성능을 나타낸다.
7. 논의
5개의 UNO_S 진행은 제2 생성 CAT 절차를 조사하기 위해 본 연구 과정에서 수행되었다. 최적화된 (마지막) 진행의 결과는 Gen 1 절차 (예를 들어, 단계 용출 모드에서 UNO_S + SEC 단계)로 달성된 결과에 필적할 만한 표적 단백질로부터 rVWF 프로-펩티드 및 CHO-HCP 불순물의 제거뿐만 아니라 저분자량 rVWF 다량체로부터 고분자량 rVWF 다량체의 분리를 나타낸다. 전도도가 약 24 mS/cm인 도입된 세척 단계 (36% 용출 완충액 B)에 이어서 약 50 mS/cm로의 구배 용출 단계 (100% 용출 완충액 B)가 이전에 산출된 Gen1 SEC F 풀에 필적할 만한 품질의 CAT 용출액 풀이 생성되었다. CAT 용출액을 농축하고 투석하기 위한 추가 UDF 단계가 사용될 수 있지만, 본원에 기재된 Gen 2 CAT 절차는 BDS 재료를 수득하 위해 Gen 1 다운스트림 공정에 적용된 UDF 및 SEC 유닛 작동 단계를 대체할 수 있는 큰 잠재력을 나타낸다.
실시예 13: DF3338/042 및 DF3362/023 웨스턴블롯 항-VWF의 평가 단량체
이 방법으로부터 수득된 mat-rVWF는 다량체 함량에 대해 분석되었다. 기재된 양이온 교환 (CEX) 방법의 이점은 다음을 포함한다:
ㆍ 유닛 작동 감소 - 1 CEX는 현재 공정의 3-유닛 작동을 대체한다.
ㆍ r-vWF-프로펩티드의 고갈 및 숙주 세포 단백질의 고갈은 친화성 단계와 유사하다.
ㆍ SD-처리 "온 컬럼"을 양이온 교환기에 포함시킴으써 - 4-유닛 작동이 한 단계에 포함된다.
ㆍ SD-처리 "온 컬럼"과 퓨린 성숙을 양이온 교환기에 포함시킴으로써, - 5 유닛 작동이 한 단계에 포함된다.
ㆍ 혈전성 rVWF 생성 위험을 낮추는 감소된 전단 응력 (유닛 작동, 여과 및 현저히 감소된 유지 시간으로 인해).
이러한 분석을 위해, 웨스턴 블롯이 진행되었다. 웨스턴블롯 이미지를 Corel 포토 페인트 소프트웨어로 가져와 16 비트 그레이 스케일 이미지로 변환하였다. 16 비트 그레이 스케일 포맷은 평가를 위한 요건이다. 평가는 Image Quant 1D 소프트웨어로 이루어졌다.
평가를 단순화하기 위해 이미지를 수직으로 뒤집었다 (레인 번호는 동일하게 유지함).
ㆍ 대역 1-6 = 저분자량
ㆍ 대역 7-12 = 중간 분자량
ㆍ 대역 > 12 = 고분자량
3-유닛 작동 공정으로부터 수득한 생성물과 비교하여 본원에 기재된 바와 같이 향상된 CEX로부터 수득된 생성물의 vWF 다량체의 밀도측정 평가.
Figure pct00017
다량체 백분율을 나타내는 원 데이터는 도 61 내지 63에 제공된다.
실시예 14: 변이체 vWF 정제 공정
I. 배경
r-vWF 프로-펩티드는 CHO 세포 유래 r-VWF 생성물의 불순물 관련 생성물이다. 생산 세포주는 약 60%의 프로-r-vWF를 함유하는 r-VWF를 생성한다. r-VWF 프로펩티드는 펩티드 아미드 결합에 의해 r-vWF 폴리펩티드에 공유로 부착되고 2가 양이온에 의해 추가로 비공유로 부착된다. 공유 펩티드 아미드 결합은 r퓨린과의 시험관내 항온처리에 의해 절단된다. 그러나, 절단된 r-VWF 프로펩티드는 VWF 분자에 부착된 채로 남아 있고, 이들 2개의 폴리펩티드의 분리 방법은 본 실시예에 기재되어 있다. rvWF/rvWF_PP 복합체는 2가 양이온 및 낮은 pH에 의해 안정화되는 것으로 밝혀졌다. 적절한 분리 방법과 함께 2가 양이온 또는 높은 pH의 킬레이트제를 적용함으로써 2개 분자를 높은 효율성으로 강력한 방식으로 분리할 수 있다. 킬레이트제로서 낮은 농도의 EDTA 또는 시트레이트가 효과적인 것으로 밝혀졌고, pH 7 이상의 pH도 세척 절차로서 양이온 교환 수지에 적용될 경우 또는 분리 완충액에 적용될 경우 크기 배제 크로마토그래피에 효과적인 것으로 나타났다. 이온 교환, 또는 수지 또는 막 기술에 의한 크기 분리를 포함하는 모든 분리 기술에 동일한 원리를 적용할 수 있어야 한다. rVWF의 현재 생성 공정에서, 단계 SEC는 rVWF 및 rVWF-PP의 분리를 뒷받침하기 위해 시트레이트를 함유하는 진행 완충액으로 수행된다.
1. 예시적인 범위의 설명 - VW_USS_07
1. r-vWF-프로펩티드의 고갈
2. 대안적인 "SD_VI 온 컬럼" 처리에 대한 예
3. rFVIII/r-vWF 복합체 "온 컬럼" 생성
4. 대안적인 제형 완충액 시스템에서 rFVIII/r-vWF 복합체의 용출 동안 온 컬럼 사전-제형화
공정 세부사항:
재조합 인자 VIII을 포획하기 위한 모노클로날 항체 단계 후, r-vWF를 함유하는 유체-통과물은 Fractogel TMAE 음이온 교환기에 로딩되었다. r-vWF는 음이온 교환기에 결합되었고, 칼슘의 존재 하에 퓨린으로 성숙되었다. r-vWF는 전도도가 증가하면서 음이온 교환기로부터 용출되었다. TMAE-용출액을 Mustang Q (Mustang Q, Pall Part Number XT5000MSTGQP1) 필터 장치를 통해 여과하여 CHO-DNA 및 필터 막에 결합하는 불순물을 제거하였다. 생성물 함유 MUQ_유동 통과물은 [60 mM 시트르산 나트륨 pH 7.6]으로 1:2 희석하여 전도도 21.9 mS/cm 및 pH 7.16으로 컨디셔닝되었다. 높은 전도도는 원하는 높은 몰 중량 r-vWF에 대한 수지의 용량을 사용하기 위해 r-vWF 프로펩티드 및 저 몰 중량 r-vWF의 제거를 보장하기 위해 선택되었다. 컨디셔닝된 로딩을 내경이 10 mm이고 베드 높이가 8.8 cm이고 부피가 6.91 ml인 UNOsphere TM S 양이온 교환 매질 (Bio Rad, Art.Nr.: 156-0115)에 유량 100 cm/h로 로딩한 다음, [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]로 2 CV의 1차 세척 (재평형화)으로 강하게 결합된 HCP 및 r-vWF-프로펩티드를 고갈시킨다.
잠재적인 "온 컬럼 처리" (WSD)는 12 컬럼 부피의 [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5 함유 25 g/Kg의 18.0 g 폴리소르베이트 80, 3.5 g 디메틸설폭사이드 DMSO, 3.5 g TnBP의 혼합물]로 대략 1시간의 접촉 시간으로 수행하여 지질 외피 바이러스를 불활성화시켰다. "온 컬럼 처리"의 성분은 10 컬럼 부피의 [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]로 세척 2로 세척하였다. 세척 3을 적용하여 4 컬럼 부피로 [50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 10% 수크로스, 0.1% 폴리소르베이트 80, pH 5.5]를 적용함으로써 완충액을 시트르산 나트륨 완충 시스템으로부터 글리신/타우린 시스템으로 변경하였다. 단계 "FVIII-Con"에서 ADVATE 공정으로부터 유래된 재조합 인간 응고 인자 VIII을 결합된 r-vWF에 10 컬럼 부피로 로딩하였다.
FVIII-Con-완충액은 [218.67 g의 50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스, 5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 및 pH 7.4에 희석된 1.57g rFVIII S2 ADV S17B010901B2]로 이루어진다. 세척 4를 적용하여 결합되지 않은 rFVIII을 세척하고 5 컬럼 부피의 [50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스, 5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl, pH 7.4]를 적용함으로써 사전-제형을 위한 완충액 매트릭스를 준비하였다. r-vWF와 rFVIII 둘 다를 컬럼으로부터 [50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스, 5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, 600 mM NaCl, pH 7.4± 0.2]으로 용출시켜 용출액을 형성하였다. 용출액을 희석하여 [50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스,5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, pH 7.4]를 사용하여 염화나트륨 함량을 대략 150 mM NaCl로 조절하였다.
공정 순서:
이 실시예의 주요 단계의 순서는 하기 단계로 이루어진다 (크로마토그래피 도식에 대해 도 67의 하단을 또한 참조).
1. Mab FVIII 포획 (FT는 r-vWF 함유 분획이다)
2. Fractogel TMAE 포획 + 성숙
3. FT 모드의 Mustang Q
4. 기재된 바와 같은 CEX (VW_USS_07)
결과:
실험은 모두 4개 지점에서 성공적으로 수행되었다:
1. r-vWF-프로펩티드의 고갈이 발생하였다 - 세척 단계 동안 세척 1, WSD (용액 고갈로 세척)(WSD) 및 세척 2 (도 67, 68, 및 69 참조)
2. 단계 WSD에서 대안적인 "SD_VI 온 컬럼 처리"에 대한 예
3. rFVIII/r-vWF 복합체 "온 컬럼" 생성 - 단계 FVIII-Con.
4. 대안적인 제형 완충액 시스템에서 rFVIII/r-vWF 복합체의 용출 동안 온 컬럼 사전-제형화 (도 66, 마지막 행 참조).
실시예 15: 변이체 vWF_정제 공정 - 시알릴화를 위한 시험
I. 배경
r-vWF 프로-펩티드는 CHO 세포 유래 r-VWF 생성물의 불순물 관련 생성물이다. 생산 세포주는 약 60%의 프로-r-vWF를 함유하는 r-VWF를 생성한다. r-vWF 프로펩티드는 펩티드 아미드 결합에 의해 r-VWF 폴리펩티드에 공유로 부착되고 2가 양이온에 의해 추가로 비공유로 부착된다. 공유 펩티드 아미드 결합은 r퓨린과의 시험관내 항온처리에 의해 절단된다. 그러나, 절단된 r-VWF 프로펩티드는 VWF 분자에 부착된 채로 남아 있고, 이들 2개의 폴리펩티드의 분리 방법은 본 실시예에 기재되어 있다. 본 실시예는 추가 시알릴화를 시험하기 위해 퓨린 절단 후 r-VWF 폴리펩티드로부터 r-vWF 프로펩티드의 분리를 위한 대안적인 변형 구현예를 제공한다. 정제 공정의 추가 세부사항 및 결과는 도 70 내지 73 및 78에 도시되어 있다.
1. 실험 번호: VW_USS_06
1. r-vWF-프로펩티드의 고갈
2. r-vWF 상에 추가 2,6 시알릴화 온 컬럼 생성
2. 실험 번호: VW_USS_06
재조합 인자 VIII을 포획하기 위한 모노클로날 항체 단계 후, r-vWF를 함유하는 유체-통과물은 Fractogel TMAE 음이온 교환기에 로딩되었다. r-vWF는 음이온 교환기에 결합되었고, 칼슘의 존재 하에 퓨린으로 성숙되었다. r-vWF는 전도도가 증가하면서 음이온 교환기로부터 용출되었다. TMAE-용출액은 Mustang Q (Mustang Q, Pall Part Number XT5000MSTGQP1) 필터 장치를 통해 여과하여 CHO-DNA와 필터 막에 결합하는 불순물을 제거하였다. 생성물 함유 MUQ_유동 통과물은 [60 mM 시트르산 나트륨 pH 7.6]으로 1:2로 희석하여 전도도 18.39 mS/cm 및 pH 7.33으로 컨디셔닝되었다. 원하는 고 몰 중량 r-vWF에 대한 수지의 용량을 이용하기 위해 r-vWF 프로펩티드 및 저분자량 r-vWF의 제거를 보장하기 위해 높은 전도도가 선택되었다. 컨디셔닝된 로딩을 내경이 10 mm이고 베드 높이가 8.8 cm이고 부피가 6.91 ml인 UNOsphereTM S 양이온 교환 매질 (Bio Rad, Art. Nr.: 156-0115)에 유량 100 cm/h로 로딩하고, 이어서 [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]로 2 CV의 1차 세척 (재평형화)하여 강하게 결합된 HCP 및 r-vWF-프로펩티드를 고갈시켰다. 추가 2,6 시알릴화를 도입하기 위해, [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5] 기반 50% (v/v) CMP-NANA 용액과 [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5] 기반 50% (v/v)의 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제의 혼합물을 온라인 혼합에 의해 10 컬럼 부피 및 25 cm/h 유량으로 컬럼에 적용하였다. CMP-NANA 용액의 조성물은 154.29 g [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]에 용해된 11 mg CMP_NANA C8271-25 mg Lot.Nr.: SLBV 7777이었다. 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제 완충액의 조성은 1 ml의 정제수에 용해된 Photobacterium Damsela로부터의 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제 S2076-1UN SIGMA, Lot.Nr. SLBV0552였고, 0.5 g의 용해된 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제를 152.10 g [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]로 희석하였다. 2 컬럼 부피의 [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]로 추가 세척을 적용하여 과량의 CMP_NANA 및 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제를 제거하였다. 4 컬럼 부피의 [50 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 6.0]를 적용하여 완충액 교환을 제공하였다. 용출은 4 컬럼 부피의 [50 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 7.5]로 수행되었다.
3. 완전한 정제 순서 VW_USS_06
이 실시예의 주요 단계의 순서는 하기 단계로 이루어진다:
1. Mab FVIII 포획 (FT는 r-vWF 함유 분획이다)
2. Fractogel TMAE 포획 + 성숙
3. FT 모드의 Mustang Q
4. 기재된 바와 같은 CEX (VW_USS_06)
결과:
본 실시예의 방법을 사용하여 추가 2,6 시알릴화가 검출되지 않았다. 그러나, r-vWF에 대한 일반적인 시알릴화 패턴인 2,3 시알릴화가 발견되었다.
실시예 16: 변이체 rWF_정제 공정 - 시알릴화를 위한 시험
I. 배경
r-vWF 프로-펩티드는 CHO 세포 유래 r-VWF 생성물의 불순물 관련 생성물이다. 생산 세포주는 약 60%의 프로-r-vWF를 함유하는 r-VWF를 생성한다. r-vWF 프로펩티드는 펩티드 아미드 결합에 의해 r-VWF 폴리펩티드에 공유로 부착되고 2가 양이온에 의해 추가로 비공유로 부착된다. 공유 펩티드 아미드 결합은 r퓨린과의 시험관내 항온처리에 의해 절단된다. 그러나, 절단된 r-VWF 프로펩티드는 VWF 분자에 부착된 채로 남아 있고, 이들 2개의 폴리펩티드의 분리 방법은 본 실시예에 기재되어 있다. 본 실시예는 추가 시알릴화를 시험하기 위해 퓨린 절단 후 r-VWF 폴리펩티드로부터 r-VWF 프로펩티드의 분리를 위한 대안적인 변형 구현예를 제공한다. 정제 공정의 추가 세부사항 및 결과는 도 74 내지 78에 도시되어 있다.
1. 실험 번호: VW_USS_08
1. r-vWF-프로펩티드의 고갈
2. r-vWF 상에 추가 2,6 시알릴화 온 컬럼 생성
2. 실험 번호: VW_USS_08
재조합 인자 VIII을 포획하기 위한 모노클로날 항체 단계 후, r-vWF를 함유하는 유체-통과물은 Fractogel TMAE 음이온 교환기에 로딩되었다. r-vWF는 음이온 교환기에 결합되었고, 칼슘의 존재 하에 퓨린으로 성숙되었다. r-vWF는 전도도가 증가하면서 음이온 교환기로부터 용출되었다. TMAE-용출액은 Mustang Q (Mustang Q, Pall Part Number XT5000MSTGQP1) 필터 장치를 통해 여과하여 CHO-DNA와 필터 막에 결합하는 불순물을 제거하였다. 생성물 함유 MUQ_유동 통과물은 [60 mM 시트르산 나트륨 pH 7.6]으로 1:2로 희석하여 전도도 19.97 mS/cm 및 pH 7.33으로 컨디셔닝되었다. 원하는 고 몰 중량 r-vWF에 대한 수지의 용량을 이용하기 위해 r-vWF 프로펩티드 및 저 몰 중량 r-vWF의 제거를 보장하기 위해 높은 전도도가 선택되었다. 컨디셔닝된 로딩을 내경이 10 mm이고 베드 높이가 8.8 cm이고 부피가 6.91 ml인 UNOsphereTM S 양이온 교환 매질 (Bio Rad, Art. Nr.: 156-0115)에 유량 100 cm/h로 로딩하고, 이어서 [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]로 2CV의 1차 세척 (재평형화)하여 강하게 결합된 HCP 및 r-vWF-프로펩티드를 고갈시켰다. 추가 2,6 시알릴화를 도입하기 위해, [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5] 기반 50% (v/v) CMP-NANA 용액과 [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5] 기반 50% (v/v)의 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제의 혼합물을 온라인 혼합에 의해 10 컬럼 부피 및 25 cm/h 유량으로 컬럼에 적용하였다. CMP-NANA 용액의 조성물은 121,57 g [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]에 용해된 14 mg CMP_NANA C8271-25 mg Lot. Nr.: SLBV 7777이었다. 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제 완충액의 조성은 121.10 g [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]에 용해된 Photobacterium Damsela로부터의 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제 S2076-1UN SIGMA, Lot.Nr. SLBV0552였다. 2 컬럼 부피의 [30 mM 시트르산 나트륨, 180 mM NaCl, pH 7.5]로 추가 세척을 적용하여 과량의 CMP_NANA 및 알파 2,6 시알릴트랜스퍼라제를 제거하였다. 4 컬럼 부피의 [50 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 6.0]를 적용하여 완충액 교환을 제공하였다. 용출은 4 컬럼 부피의 [50 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 7.5]로 수행되었다.
3. 완전한 정제 순서 VW_USS_08
이 실시예의 주요 단계의 순서는 하기 단계로 이루어진다:
1. Mab FVIII 포획 (FT는 r-vWF 함유 분획이다)
2. Fractogel TMAE 포획 + 성숙
3. FT 모드의 Mustang Q
4. 기재된 바와 같은 CEX (VW_USS_08)
결과:
본 실시예의 방법을 사용하여 추가 2,6 시알릴화가 검출되지 않았다. 그러나, r-vWF에 대한 일반적인 시알릴화 패턴인 2,3 시알릴화가 발견되었다.
상기 제시된 실시예는 당업자에게 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법의 구현예를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 제공되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 상술된 모드의 변형은 다음 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속하는 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 이 개시내용에 인용된 모든 참조문헌은 각 참조문헌이 그 전체가 개별적으로 참고로 포함된 것처럼 동일한 정도로 참조로 포함된다.
모든 제목 및 섹션 지정은 명확성과 참조 목적으로만 사용되고, 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 당업자는 본원에 기재된 본 발명의 취지 및 범위에 따라 적절한 상이한 표제 및 섹션으로부터 다양한 양상을 결합하는 유용성을 인식할 것이다.
본원에 인용된 모든 참조문헌은 각각의 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 전체적으로 그리고 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본 출원의 많은 변형 및 변이는 그 취지 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 특정 구현예 및 실시예는 단지 예로 제공되고, 본 출원은 청구항 자격이 되는 등가물의 전체 범위와 함께, 첨부된 청구범위 조건에 의해서만 제한되다.
SEQUENCE LISTING <110> Baxalta Incorporated Baxalta GmbH Fiedler, Christian Hasslacher, Meinhard Mayer, Christa <120> SEPARATION OF VWF AND VWF PROPEPTIDE BY CHROMATOGRAPHIC METHODS <130> 008073-5187-WO <140> WO PCT/US19/23269 <141> 2019-03-20 <150> US 62/646,109 <151> 2018-03-31 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8833 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VWF nucleic acid <400> 1 agctcacagc tattgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt 60 tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg 120 gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg 180 gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt 240 gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt 300 gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct 360 tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg 420 cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca 480 gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta 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1860 Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser 1865 1870 1875 Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile 1880 1885 1890 Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr 1895 1900 1905 Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe 1910 1915 1920 Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg 1925 1930 1935 Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp 1940 1945 1950 Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala 1955 1960 1965 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1970 1975 1980 Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met 1985 1990 1995 Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr 2000 2005 2010 Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser 2015 2020 2025 Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro 2030 2035 2040 Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys 2045 2050 2055 Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu 2060 2065 2070 Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln 2075 2080 2085 Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys 2090 2095 2100 Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser 2105 2110 2115 Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln 2120 2125 2130 Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys 2135 2140 2145 Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 2150

Claims (78)

  1. 고순도의 프로펩티드 고갈된 성숙한 재조합 rVWF (mat-rVWF)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    a) mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF, 및 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액을 제공하는 단계;
    b) a)에서 상기 용액 중 상기 mat-rVWF/rVWF-PP 복합체의 해리를 mat-rVWF 및 rVWF-PP로 유도하고, 여기서, 상기 해리는 비공유적으로 회합된 mat-rVWF 및 rVWF-PP의 파괴에 의해 발생하고, 상기 해리는
    i. 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하거나,
    ii. 적어도 7의 pH로 pH를 증가시킴으로써 유도되는, 단계; 및
    c) 상기 mat-rVWF를 수집하여 고순도의 mat-rVWF 조성물을 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 95%의 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 rVWF-PP를 포함하는, 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 96%의 mat-rVWF 및 4% 미만의 rVWF-PP, 적어도 97%의 mat-rVWF 및 3% 미만의 rVWF-PP, 적어도 98%의 mat-rVWF 및 2% 미만의 rVWF-PP, 적어도 99%의 mat-rVWF 및 1% 미만의 rVWF-PP, 또는 적어도 99.5%의 mat-rVWF 및 0.5% 미만의 rVWF-PP, 또는 99.9%의 mat-rVWF 및 0.1% 미만의 rVWF-PP를 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 용액은 세포 배양 배지, 항체 컬럼 유체-통과 용액 (flow-through solution), 및 완충 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 단계 a) 전에 퓨린으로 처리된, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 항체 컬럼 유체-통과 용액인, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제인, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 2가 양이온 킬레이트제는 EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0으로 증가되는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가되는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 적어도 약 7.6으로 증가되는, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 염기성 아미노산, 트리스, NaOH, 트리신, 또는 에탄올아민의 첨가에 의해 증가되는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1의 단계 b)에서 상기 수집은 하나 이상의 단백질 분리 방법을 포함하는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 분리 방법은 이온 교환 크로마토그래피 (IEC), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 막 기술에 의한 물리적 크기 분리, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 단백질 분리 방법은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)인, 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 분리 방법은 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)인, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)는 양이온 교환 크로마토그래피인, 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)는 음이온 교환 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피의 조합인, 방법.
  18. 청구항 12에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 분리 방법은 완충액 시스템을 포함하고, 여기서, 상기 완충액 시스템은 하나 이상의 완충액을 포함하는, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 세척 완충액을 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 세척 완충액은 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 세척 완충액을 포함하고, 상기 하나 이상의 완충액이 5개의 세척 완충액을 포함하는 경우, 상기 제1, 제2, 제3 및/또는 제5 세척 완충액은 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖고, 상기 하나 이상의 완충액이 4개의 세척 완충액을 포함하는 경우, 상기 제1, 제2 및/또는 제4 세척 완충액은 제3 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 방법은 상기 제1 세척 완충액 후에 바이러스 불활성화 처리 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 바이러스 불활성화 처리 단계의 pH는 상기 제3 및/또는 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는, 방법.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하는, 방법.
  22. 청구항 18에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 적어도 7의 pH를 나타내는, 방법.
  23. 청구항 12에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 분리 방법은 완충액 시스템을 포함하고, 여기서, 상기 완충액 시스템은 하나 이상의 로딩 완충액을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 하나 이상의 로딩 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하는, 방법.
  25. 청구항 23 또는 24에 있어서, 상기 하나 이상의 로딩 완충액은 적어도 7의 pH를 나타내는, 방법.
  26. 청구항 12에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질 분리 방법은 완충액 시스템을 포함하고, 여기서, 상기 완충액 시스템은 하나 이상의 로딩, 세척 및/또는 용출 완충액을 포함하는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 하나 이상의 로딩, 세척 및/또는 용출 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하는, 방법.
  28. 청구항 26 또는 27에 있어서, 상기 하나 이상의 로딩, 세척 및/또는 용출 완충액은 적어도 7의 pH를 나타내는, 방법.
  29. 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 로딩, 세척 및/또는 용출 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 적어도 7의 pH를 나타내는, 방법.
  30. 청구항 18 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 시스템은 글리신 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), 히스티딘, 이미다졸, 시트르산 아세테이트, MES, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 청구항 18 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액은 하나 이상의 1가 양이온을 추가로 포함하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 하나 이상의 1가 양이온은 Na+, K+, Li+, 및 Cs+로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 청구항 31에 있어서, 상기 1가 양이온은 Na+인, 방법.
  34. 청구항 18 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액은 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온을 추가로 포함하는, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온은 Cl-, 아세테이트-, SO4 2-, Br-, 및 시트레이트3-로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 청구항 18 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액 시스템은 25℃에서 ≥0.5 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함하는, 방법.
  37. 청구항 18 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액 시스템은 25℃에서 15.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함하는, 방법.
  38. 청구항 18 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액은 하나 이상의 비이온성 세제를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 비이온성 세제는 Triton X 100, Tween 80, 및 Tween 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  40. 청구항 18 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액은 비-환원 당, 당 알코올, 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 물질을 추가로 포함하는, 방법.
  41. 청구항 1 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 ≤2.0%의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준을 포함하는, 방법.
  42. 청구항 1 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 ≤0.6%의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준을 포함하는, 방법.
  43. 청구항 1 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF, 및 rVWF-PP를 포함하는 상기 용액은 rVWF에 대한 포획 단계로부터 유래되는 것인, 방법.
  44. 청구항 1 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF, 및 rVWF-PP를 포함하는 상기 용액은 FVIII 면역친화성 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법으로부터 유도되는 것인, 방법.
  45. 고순도의 프로펩티드 고갈된 성숙한 재조합 rVWF (고순도의 mat-rVWF)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
    a) 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, mat-rVWF 및/또는 rVWF 프로펩티드 (rVWF-PP)를 포함하는 용액을 음이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계로서, 여기서, 상기 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF는 상기 음이온 교환 컬럼에 결합되는, 단계;
    b) 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 a)에서의 상기 음이온 교환 컬럼을 하나 이상의 세척 완충액으로 세척하는 단계;
    c) 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 포함하는 b)에서의 상기 컬럼을 퓨린으로 처리하는 단계로서, 여기서, 상기 퓨린은 상기 프로-rVWF를 mat-rVWF와 rVWF-PP로 절단하는, 단계;
    d) c)에서의 컬럼으로부터 상기 결합된 프로-rVWF, mat-rVWF/rVWF-PP 복합체, 및 mat-rVWF를 용출 완충액을 사용하여 용출시키는 단계로서, 여기서, 상기 용출 완충액은 상기 rVWF-PP와 비공유적으로 회합된 mat-rVWF로부터 상기 rVWF-PP의 해리를 유도하고, 상기 해리는
    i. 상기 용출 완충액에 적어도 하나의 킬레이트제를 첨가하거나,
    ii. 상기 용출 완충액의 pH를 적어도 7의 pH로 증가시킴으로써 유도되는, 단계; 및
    e) 상기 rVWF-PP와 별도로 상기 mat-rVWF를 수집하여 고순도의 mat-rVWF 조성물을 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 적어도 95%의 성숙한 rVWF 및 5% 미만의 rVWF-PP를 포함하는, 단계.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 세척 완충액을 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 세척 완충액은 1개, 2개, 3개, 4개 및/또는 5개의 세척 완충액을 포함하고, 상기 하나 이상의 완충액이 5개의 세척 완충액을 포함하는 경우, 상기 제1, 제2, 제3 및/또는 제5 세척 완충액은 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖고, 상기 하나 이상의 완충액이 4개의 세척 완충액을 포함하는 경우, 상기 제1, 제2 및/또는 제4 세척 완충액은 제3 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 방법은 상기 제1 세척 완충액 후에 바이러스 불활성화 처리 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 바이러스 불활성화 처리 단계의 pH는 상기 제3 및/또는 제4 세척 완충액보다 더 높은 pH를 갖는, 방법.
  48. 청구항 45 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, a) 및 b)는 단일 단계로 동시에 발생하는, 방법.
  49. 청구항 45 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, a)에서 상기 용액은 모노클로날 항체 컬럼으로부터 유동 통과물 (flow through)을 포함하고, 여기서, 상기 모노클로날 항체는 FVIII 모노클로날 항체인, 방법.
  50. 청구항 45 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, a)에서 상기 용액은 세포 배양 배지, 항체 컬럼 유체-통과 용액, 및 완충 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  51. 청구항 45 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 킬레이트제는 2가 양이온 킬레이트제인, 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 2가 양이온 킬레이트제는 EDTA, EGTA, CDTA, 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  53. 청구항 45 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 적어도 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0으로 증가되는, 방법.
  54. 청구항 45 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 적어도 약 7.2 내지 약 7.8로 증가되는, 방법.
  55. 청구항 45 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 적어도 약 7.6으로 증가되는, 방법.
  56. 청구항 45 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 염기성 아미노산의 첨가에 의해 증가되는, 방법.
  57. 청구항 45 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, b)에서 상기 하나 이상의 세척 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하는, 방법.
  58. 청구항 45 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, b)에서 상기 하나 이상의 세척 완충액은 적어도 7의 pH를 나타내는, 방법.
  59. 청구항 45 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, b)에서 상기 하나 이상의 세척 완충액은 상기 하나 이상의 킬레이트제를 포함하고, 적어도 7의 pH를 나타내는, 방법.
  60. 청구항 45 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 바이러스 불활성화는 상기 세척 단계 및/또는 용출 단계 전에, 후에, 또는 이와 동시에 그러나 상기 수집 단계 전에 발생하는 것인, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 처리는 지질 외피 바이러스를 불활성화시키는, 방법.
  62. 청구항 60 또는 61에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 처리는 S/D 처리인, 방법.
  63. 청구항 45 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 글리신 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 트리스HCl (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄), 히스티딘, 이미다졸, 시트르산 아세테이트, MES, 및 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충액을 포함하는, 방법.
  64. 청구항 45 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 1가 양이온을 추가로 포함하는, 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 하나 이상의 1가 양이온은 Na+, K+, Li+, 및 Cs+로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 1가 양이온은 Na+인, 방법.
  67. 청구항 45 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온을 추가로 포함하는, 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 상기 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 음이온은 Cl-, 아세테이트-, SO4 2-, Br-, 및 시트레이트3-로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  69. 청구항 45 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 25℃에서 ≥0.5 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함하는, 방법.
  70. 청구항 45 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 25℃에서 15.0 ± 0.2 mS/cm의 전도도를 나타내는 적어도 하나의 완충액을 포함하는, 방법.
  71. 청구항 45 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 하나 이상의 비이온성 세제를 추가로 포함하는, 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 비이온성 세제는 Triton X 100, Tween 80, 및 Tween 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  73. 청구항 45 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 완충액은 비-환원 당, 당 알코올, 및 폴리올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 물질을 추가로 포함하는, 방법.
  74. 청구항 45 내지 73 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 ≤2.0%의 숙주 세포 (HC) 불순물 수준을 포함하는, 방법.
  75. 청구항 45 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 ≤0.6%의 숙수 세포 (HC) 불순물 수준을 포함하는, 방법.
  76. 청구항 1 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고순도의 mat-rVWF 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 사용되는, 방법.
  77. 청구항 1 내지 76 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 고순도의 mat-rVWF 및 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 약제학적 조성물.
  78. 청구항 77에 있어서, 상기 조성물은 50 mM 글리신, 10 mM 타우린, 5% (w/w) 수크로스, 5% (w/w) D-만니톨, 0.1% 폴리소르베이트 80, 2 mM CaCl2, 150 mM NaCl을 포함하고, 여기서, 상기 조성물은 약 pH 7.4의 pH를 갖는, 약제학적 조성물.
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