KR20220134595A - 등전 포커싱 샘플 매트릭스 - Google Patents

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KR20220134595A
KR20220134595A KR1020227029585A KR20227029585A KR20220134595A KR 20220134595 A KR20220134595 A KR 20220134595A KR 1020227029585 A KR1020227029585 A KR 1020227029585A KR 20227029585 A KR20227029585 A KR 20227029585A KR 20220134595 A KR20220134595 A KR 20220134595A
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Abstract

본 개시내용은 실제 컨쥬게이션 상태의 PEG화된 단백질의 icIEF 분석을 가능하게 하는 icIEF 샘플 매트릭스를 제공한다. 본 개시내용의 샘플 매트릭스는 공동-이동된 PEG화된 단백질 전하 변이체의 분리를 가능하게 하는 글리신을 포함할 수 있다. 샘플 매트릭스는 또한, 매트릭스 유도 베이스라인 간섭을 고갈시킴으로써 icIEF 검정을 추가로 개선시키는 타우린을 포함할 수 있다. 따라서, 글리신 및 타우린의 조합을 포함하는 본 개시내용의 샘플 매트릭스는 PEG화된 단백질에 대한 주요 피크로부터의 산성 및 염기성 종의 icIEF 분리를 가능하게 하여, 개별 PEG화된 단백질 종의 식별/분리, 특성화 및 정량화가 가능해진다. icIEF에 의한 PEG화된 단백질의 특성화에 본 개시내용의 샘플 매트릭스를 사용함으로써, 반복성, 선형성, 정확성, 샘플 안정성, 및 방법 강건성이 달성된다.

Description

등전 포커싱 샘플 매트릭스
본 개시내용은 PEG화된 단백질 및 펩티드의 이미지화 모세관 등전 포커싱 분석의 분해능을 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
PEG화는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬이 단백질 또는 다른 분자에 컨쥬게이션되는 과정이다 (Veronese & Mero (2008) BioDrugs 22:315-329). PEG화는 치료적 단백질의 약동학적 특성의 향상 (Holm et al. (2015) PloS One 10(7): e0133584; Jevsevar et al. (2010) Biotechnol. J. 5:113-128; Harris & Chess (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2:214-221), 뿐만 아니라 면역원성 및 독성의 감소 (Nucci et al. (1991) Advanced Drug Delivery Reviews 6:133-151; Veronese & Pasut (2005) Drug Discov. Today 10:1451-1458)에 대한 전략으로서 사용되었으며, 이는 치료적으로 관련 있는 단백질의 매력적인 속성이다.
PEG-단백질 컨쥬게이션은 화학 또는 효소 반응에 의해 (Basle et al. (2010) Chemistry & Biology 17:213-227; O'Hare et al. (2007) Current Opinion in Structural Biology 17:488-494), 또한 발현 단백질 결찰 등의 반-합성 방법에 의해 (Muir (2003) Annual Review of Biochemistry 72:249-289) 형성될 수 있다. 대안적으로, 비-천연 아미노산이 폴리에틸렌 글리콜의 컨쥬게이션을 위한 화학적 핸들로서 재조합 단백질에 혼입되었다 (Liu & Schultz (2010) Annual Review of Biochemistry 79:413-444).
이미지화 모세관 등전 포커싱 (icIEF)은 단백질의 등전점 (pI)의 결정 뿐만 아니라 전하 종의 상대적 정량화를 위한 현재의 산업 표준이다 (Sosic et al. (2008) Electrophoresis 29:4368-4376; Cousteils et al. (2019) Chromatography Today, Feb. 26). 그러나, PEG화된 단백질의 icIEF 분리는 어렵다. PEG화된 단백질의 icIEF 분리에서는 상대적으로 넓고 왜곡된 피크 모양이 관찰된다. PEG화된 단백질의 전하 변이체는 등전 포커싱 동안 하나의 넓은 피크로 병합되며, 이는 아마도 둘러싸인 폴리에틸렌 글리콜 사슬에 의한 단백질의 마스킹 뿐만 아니라 증가된 유체역학적 부피에 기인하는 것 같다 (Molineux (2002) Cancer Treat Rev. 28:13-16). 예를 들어, 담체 양성전해질 (ampholyte) 함량, 메틸셀룰로스 농도, 단백질 농도, 포커싱 시간, 및 다른 첨가제의 첨가의 변형으로는 합리적인 피크 형상을 얻을 수 없다 (Li et al. (2007) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43:963-972).
따라서, PEG화된 단백질의 전하 변이체의 구별을 가능하게 하는 새로운 icIEF 방법에 대한 필요성이 존재한다.
간단한 요약
본 개시내용은 글리신 및/또는 타우린을 포함하는 이미지화 모세관 등전 포커싱 (icIEF) 샘플 매트릭스를 제공한다. 일부 측면에서, 글리신은 약 1 mM 내지 약 200 mM의 농도로 존재한다.
icIEF 샘플 매트릭스의 일부 측면에서, 글리신은 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 1 mM 내지 약 70 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 90 mM, 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 200 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 90 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 70 mM, 약 30 mM 내지 약 60 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 40 mM 내지 약 200 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 90 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 70 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다.
icIEF 샘플 매트릭스의 일부 측면에서, 글리신은 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 또는 약 120 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 글리신은 약 30 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 글리신은 약 36 mM 내지 약 44 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 글리신은 약 40 mM의 농도로 존재한다.
icIEF 샘플 매트릭스의 일부 측면에서, 타우린은 1 mM 내지 200 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 타우린은 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 1 mM 내지 약 70 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 90 mM, 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 200 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 90 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 70 mM, 약 30 mM 내지 약 60 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 40 mM 내지 약 200 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 90 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 70 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다.
icIEF 샘플 매트릭스의 일부 측면에서, 타우린은 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 또는 약 120 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 타우린은 약 40 mM 내지 약 60 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 타우린은 약 45 mM 내지 약 55 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 타우린은 약 50 mM의 농도로 존재한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 담체 양성전해질을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 파말라이트(PHARMALYTE)®이다. 일부 측면에서, 파말라이트®는 파말라이트® 3-10이다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 약 2% 내지 약 6% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 약 3.6% 내지 약 4.4%의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 약 4% (v:v)의 농도로 존재한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 메틸 셀룰로스를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 메틸 셀룰로스는 약 0.35% (w:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 40 mM의 글리신 및 약 50 mM 타우린을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 약 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 약 40 mM의 글리신 및 약 50 mM 타우린을 포함한다.
본 개시내용은 또한 icIEF 동안 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는 매트릭스 유도 베이스라인 간섭을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 간섭은 기본 영역 간섭이다. 일부 측면에서, 베이스라인 간섭은 타우린이 없는 참조 샘플 매트릭스 사용시 관찰되는 베이스라인 간섭에 비해 감소된다. 일부 측면에서, 타우린이 없는 참조 샘플 매트릭스는 우레아 함유 매트릭스이다.
본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스 및 PEG화된 단백질을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는 PEG화된 단백질의 등전점 (pI)을 측정하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스 및 PEG화된 단백질을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는 icIEF에서 PEG화된 단백질의 공동-이동 피크의 분리를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, PEG화된 단백질은 약 0.25 mg/mL 내지 약 0.75 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, PEG화된 단백질은 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재한다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, icIEF는 (i) 담체 양성전해질이 모세관 내에 pH 구배를 형성하도록 미리 정해진 제1 기간 동안 제1 전압을 적용하는 단계; 및 (ii) 변이체의 전체 전하가 중성이 되도록 모세관 내에서 단백질의 전하 변이체의 이동을 포커싱하기 위해 미리 정해진 제2 기간 동안 제2 전압을 적용하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 제1 전압은 약 1500 V이고, 미리 정해진 제1 기간은 약 1 분이다. 일부 측면에서, 제2 전압은 약 3000 V이고, 미리 정해진 제2 기간은 약 8분이다.
본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는 PEG화된 단백질의 안정성을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 안정성은 열 안정성이다. 일부 측면에서, 열 안정성은 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 또는 50℃에서의 PEG화된 단백질의 인큐베이션 후에 결정된다. 일부 측면에서, PEG화된 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 인큐베이션된다. 일부 측면에서, 안정성의 결정은 정량적이다.
도 1은 2 M 우레아를 갖는 PEG화된 단백질 A의 전기영동도를 나타낸다. 30 kDa 단일 선형 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 비-천연 아미노산을 통해 단백질 A에 컨쥬게이션하였다. 샘플 매트릭스는 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스 및 2 M 우레아를 함유한다. PEG화된 단백질 A를 탈이온수 중에 2.5 mg/mL로 희석하고, 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.25 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
도 2는 파말라이트® 4-6.5 및 파말라이트® 5-8의 혼합물 중의 PEG화된 단백질 A의 전기영동도 오버레이를 나타낸다. 샘플 매트릭스는 2% (v:v) 파말라이트® 4-6.5 및 2% (v:v) 파말라이트® 5-8, 및 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스를 함유하였다. PEG화된 단백질 A를 탈이온수 중에 2.5 mg/mL로 희석하고, 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.25 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
도 3은 단일 첨가제로서 글리신을 갖는 샘플 매트릭스 대 첨가제로서 글리신 및 타우린 둘 다를 포함하는 샘플 매트릭스를 비교하는 PEG화된 단백질 A의 전기영동도 오버레이를 나타낸다. 샘플 매트릭스는 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스 및 40 mM 글리신 (또는 40 mM 글리신 및 50 mM 타우린)을 함유하였다. PEG화된 단백질 A를 탈이온수 중에 5 mg/mL로 희석하고, 또한 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.5 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
도 4는 첨가제로서 글리신 및 타우린을 포함하는 샘플 매트릭스 중의 PEG화된 단백질 A의 전기영동도를 나타낸다. 샘플 매트릭스는 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 40 mM의 글리신 및 50 mM 타우린을 함유하였다. PEG화된 단백질 A를 탈이온수 중에 5 mg/mL로 희석하고, 또한 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.5 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
도 5는 10℃로 셋팅된 오토-샘플러에서 0시간 및 24시간에서의 글리신 및 타우린을 포함하는 샘플 매트릭스 중의 PEG화된 단백질 A의 전기영동도를 나타낸다. 샘플 매트릭스는 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 40 mM의 글리신 및 50 mM 타우린을 함유하였다. PEG화된 단백질 A를 탈이온수 중에 5 mg/mL로 희석하고, 또한 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.5 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
도 6은 JMP 만족성(desirability) 프로파일링 플롯을 나타낸다. 표 4에 기재된 파말라이트®, 글리신, 및 타우린의 농도는 X 변수이고, 산성, 주요, 및 염기성 그룹에 대한 생성된 백분율 피크 면적은 Y 응답이다.
도 7은 첨가제로서 우레아를 포함하는 샘플 매트릭스와 비교한, 첨가제로서 글리신 및 타우린을 포함하는 샘플 매트릭스 중의 PEG화된 항체 B의 전기영동도를 나타낸다. 샘플 매트릭스는 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 40 mM의 글리신 및 50 mM 타우린 (또는 2 M 우레아)을 함유하였다. PEG화된 항체 B를 탈이온수 중에 2.5 mg/mL로 희석하고, 또한 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.25 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
도 8은 (i) 대조군 PEG화된 단백질 A 샘플 및 (ii) 40℃에서 7일 동안 강제 분해를 겪은 PEG화된 단백질 A 샘플의 전기영동도를 나타낸다. 샘플 매트릭스는 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 40 mM의 글리신 및 50 mM 타우린을 함유하였다. PEG화된 단백질 A 샘플을 탈이온수 중에 5 mg/mL로 희석하고, 또한 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.5 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
도 9는 (i) 대조군 PEG화된 단백질 A 샘플 및 (ii) AEX HPLC에 의해 수집된, 아스파라긴 탈아미드화된 PEG화된 단백질 A (도 8에서 대략 pH 5.25에서 피크)로 스파이킹된 PEG화된 단백질 A 샘플의 전기영동도를 나타낸다. 샘플 매트릭스는 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 40 mM의 글리신 및 50 mM 타우린을 함유하였다. PEG화된 단백질 A 샘플을 탈이온수 중에 5 mg/mL로 희석하고, 또한 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.5 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
상세한 설명
PEG화는 제약 산업에 의해 치료적 단백질의 약동학적 특성을 향상시키기 위한 전략으로 사용되어 왔다. 이미지화 모세관 등전 포커싱 (icIEF)은 단백질 및 항체의 등전점 (pI) 결정 및 전하 변이체 정량화를 위한 현재의 산업 표준이다. 그러나, PEG화된 단백질의 전하 변이체에 상응하는 개별 피크를 분해하는 것은 도전적인 것으로 남아 있다. 본 개시내용은 PEG화된 단백질에서 전하 변이체의 분리를 현저히 개선시키는 첨가제 글리신 및 타우린을 조합하여 포함하는 샘플 신규 매트릭스 포뮬라를 제공한다. 그 결과, PEG화 전의 단백질의 등전 포커싱을 수행하는 것이 더 이상 필수적이 아니며, 이는 PEG화 및 정제 공정에 의해 야기되는 변화를 반영하지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 샘플 매트릭스는 실제 컨쥬게이션 상태의 PEG화된 단백질의 icIEF 분석을 가능하게 한다.
본 개시내용의 샘플 매트릭스는 글리신을 포함할 수 있으며, 이는 공동-이동된 PEG화된 단백질 전하 변이체의 분리를 가능하게 한다. 샘플 매트릭스는 또한, 단백질 제제에서 일반적으로 사용되는 비-필수 아미노산, 타우린을 포함할 수 있으며 (Brosnan & Brosnan (2006) J Nutr. 136:1636-1640; Amino Acids: Chemistry, Biology and Medicine. Lubec & Rosenthal, Eds. Springer Science & Business Media, 2012), 이는 매트릭스 유도 베이스라인 간섭을 고갈시킴으로써 icIEF 검정을 추가로 개선시킨다. 따라서, 글리신 및 타우린의 조합을 포함하는 본 개시내용의 샘플 매트릭스는 PEG화된 단백질에 대한 주요 피크로부터의 산성 및 염기성 종의 icIEF 분리를 가능하게 하여, 개별 PEG화된 단백질 종의 식별/분리, 특성화 및 정량화가 가능해진다. icIEF에 의한 PEG화된 단백질의 특성화에 본 개시내용의 샘플 매트릭스를 사용함으로써, 반복성, 선형성, 정확성, 샘플 안정성, 및 방법 강건성이 달성된다.
본 개시내용을 보다 상세히 기재하기 전에, 본 개시내용은 기재된 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않고, 그에 따라, 물론, 변화될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 개시내용을 읽음에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 되는 바와 같이, 본원에 기재되고 예시된 개개의 측면 각각은, 본 개시내용의 범위 또는 취지로부터 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 측면의 특징과 쉽게 조합되거나 그로부터 분리될 수 있는 개별 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 이벤트의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니며, 이는 전체적으로 본 명세서를 참조하여 정의될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 범위는 단지 첨부된 청구범위에 의해 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 측면의 기재를 위한 것이며, 제한되도록 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
용어
본 개시내용이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어를 정의한다. 달리 명시적으로 본원에 제공되는 경우를 제외하고는, 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어 각각은 하기에 기재되는 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 기재된다.
본 개시내용은, 주어진 생성물 또는 공정에서 그룹 중 정확히 하나의 구성원이 존재하거나, 사용되거나, 또는 다른 방식으로 그와 관련 있는 측면을 포함한다. 본 개시내용은 주어진 생성물 또는 공정에서 그룹 구성원 중 하나 초과, 또는 모두가 존재하거나, 사용되거나, 또는 다른 방식으로 그와 관련 있는 측면을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련되는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 하기 문헌은 본 개시내용에서 사용되는 많은 용어의 일반적 사전을 통상의 기술자에게 제공한다: the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press.
단위, 접두사, 및 기호는 이들의 SI (Syst
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me International de Unites) 허용 형태로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자에 대해 포함적이다. 본원에 제공되는 표제는 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니며, 이는 전체적으로 본 명세서를 참조하여 제공될 수 있다. 따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어는 본 명세서 전체를 참조하여 보다 완전히 정의된다.
단수형 "하나"는 문맥이 달리 명백히 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 용어 "하나", 뿐만 아니라 "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 용어 "하나"는 "단일"을 의미한다. 일부 측면에서, 용어 "하나"는 "둘 이상" 또는 "다수"를 의미한다. 예를 들어, 담체 양성전해질의 언급은 단일 담체 양성전해질 혼합물 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 특정 값 또는 조성에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하는 것으로, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있다.
본 출원 및 청구범위에서 특정 값 또는 조성이 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약"의 의미는 특정 값 또는 조성의 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다. 용어 "약"이 숫자 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 기재된 수치 초과 및 미만으로 경계를 확장시킴으로써 그 범위를 수정한다. 따라서, "약 10-20"은 "약 10 내지 약 20"을 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은, 위 또는 아래 (더 높거나 낮음)로, 예를 들어 10 퍼센트의 분산만큼 언급된 값 초과 및 미만으로 수치를 수정할 수 있다.
"및/또는"은 본원에서 사용되는 경우 다른 것을 갖거나 갖지 않는 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포함하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략"은, 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 측면에서, 용어 "대략"은 문맥으로부터 달리 명백하거나 달리 언급되지 않는 한 언급된 참조 값의 양쪽 방향으로 (그 초과 또는 미만으로) 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 이내에 포함되는 값의 범위를 지칭한다 (이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).
"포함하는"이라는 언어로 본원에 기재되는 모든 측면에서, "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는"으로 기재된 다른 유사 측면이 또한 제공됨을 이해한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 라벨링 성분과의 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비-천연 아미노산, 예컨대 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산, 및 크레아틴)를 함유하는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형 또한 정의 내에 포함된다. 본 개시내용의 특정 측면에서, 폴리펩티드는 PEG화된 폴리펩티드이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어는 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자 생성물, 자연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 동족체, 이종상동체, 상동체(paralog), 단편 및 이들의 다른 등가물, 변이체, 및 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드일 수 있거나 다분자 착물, 예컨대 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 이들은 또한 단일 사슬 또는 다중사슬 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가장 통상적인 디술피드 연결은 다중사슬 폴리펩티드에서 나타난다. 용어 폴리펩티드는 또한, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, "펩티드"는 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다.
본 개시내용의 특정 측면에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 화학적으로, 폴리펩티드 특성, 예를 들어, 혈장 반감기를 향상시킬 수 있는 수용성 중합체를 혼입하도록 유도체화된 것이다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 PEG화되고, 즉, 이는 폴리펩티드 사슬에 공유 부착된 적어도 하나의 PEG를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값, 또한 적절한 경우, 그의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 엔지니어링된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 발현된 재조합 생성된 폴리펩티드 및 단백질은, 임의의 적합한 기술에 의해 분리된, 분별분리된, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 네이티브 또는 재조합 폴리펩티드와 같이, 본 개시내용의 목적상 단리된 것으로 고려된다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 항체일 수 있다. 본원에 개시된 항체, 예를 들어, "항체 B"는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 재조합 생성될 수 있다. 본원에 개시된 단백질 (예를 들어, "단백질 A" 또는 "항체 B")은 또한 화학적으로 합성될 수 있다.
icIEF 샘플 매트릭스 및 사용 방법
본 개시내용은, 중합체 친수성 모이어티로 유도체화된 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, PEG화된 단백질에 대한 주요 피크로부터 산성 및 염기성 종을 효과적으로 분리할 수 있는, 등전 포커싱, 예를 들어, 모세관 등전 포커싱 (cIEF) 또는 이미지화 모세관 등전 포커싱 (icIEF)을 위한 샘플 매트릭스를 제공한다.
등전 포커싱은 분자들을 그들의 등전점 (pI), 즉, 그들이 0의 순 전하를 갖는 pH의 차이에 의해 분리하는 기술이다. icIEF는 분리 전압이 적용되는 분리 채널 (즉, 양극과 음극을 연결하는 유체 채널, 예를 들어 모세관) 내에 pH 구배를 생성하기 위해 양성전해질 (양쪽성 전해질) 용액을 사용하는 것을 수반한다. 음으로 대전된 분자는 양극을 향해 매질 중에서 pH 구배를 통해 이동하지만, 양으로 대전된 분자는 음극을 향해 이동한다. 그의 등전점 (pI) 미만의 pH 영역에 있는 피분석물 (예를 들어, 단백질 또는 다른 분자)은 양으로 대전될 것이고, 따라서 캐소드(cathode) (즉, 음으로 대전된 전극)를 향해 이동할 것이다. 단백질의 전체 순 전하는 이것이 증가하는 pH (예를 들어, 카르복실 기 또는 다른 음으로 대전된 관능기의 양성자화에 기인함)의 구배를 통해 이동함에 따라 이것이 그의 pI (이것이 순 전하를 갖지 않고 그에 따라 이동이 멈춤)에 상응하는 pH 영역에 도달할 때까지 감소할 것이다. 역으로, 그의 등전점 (pI) 초과의 pH 영역에 있는 피분석물은 음으로 대전될 것이고, 따라서 애노드(anode) (즉, 양으로 대전된 전극)를 향해 이동할 것이다. 그 결과, 피분석물 (예를 들어, 단백질)의 혼합물이 산성 및 염기성 아미노산 잔기, N- 및 C- 말단 전하, 또는 피분석물에 부착된 이종 모이어티 (예를 들어, PEG화된 단백질에서의 PEG)에 존재하는 다른 전하로 인한 상대적 전하 함량에 기초하여 분리된다. icIEF 진행 종료시, 피분석물 중의 상이한 종은 그의 pI에 상응하는 pH 구배의 한 지점에 위치한 각각의 피분석물 종 (예를 들어, PEG화된 단백질의 전하 변이체)과 함께 날카로운 고정 밴드에 포커싱된다. 기술은 매우 높은 분해능을 제공할 수 있고, 즉, 단일 전하만큼 상이한 단백질을 구별할 수 있으며, 이들은 별도의 밴드로 분별분리된다. cIEF는 겔 IEF보다 훨씬 더 빠르지만, 피크가 밀려나는 동안 분리 분해능이 손상될 수 있다. 이미지화된 cIEF (icIEF) 기기 및 카트리지는 cIEF 공정이 실시간으로 이미지화될 수 있게 하는 전체-컬럼 이미지화 검출 (WCID) 기술을 사용한다. 따라서, icIEF 분리는 동원을 필요로 하지 않고, 그에 따라 단일-점 검출을 갖는 전형적인 cIEF에 비해, 샘플 분석이 더 빠르고 더 정확하다. cIEF를 수행하는 일반적 방법은, 예를 들어, 하기 문헌에 기재되어 있으며: Kilar, F., "Isoelectric Focusing in Capillaries," in CRC Handbook on Capillary Electrophoresis: A Practical Approach, CRC Press, Inc., chapter 4, pp. 95-109 (1994); and Schwartz, H., and T. Pritchett, "Separation of Proteins and Peptides by Capillary Electrophoresis: Application to Analytical Biotechnology," Part No. 266923 (Beckman-Coulter, Fullerton, Calif., 1994); Wehr, T., Rodriquez-Diaz, R., and Zhu, M., "Capillary Electrophoresis of Proteins," (Marcel Dekker, NY, 1999), 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 글리신 및/또는 타우린을 포함하는 이미지화 모세관 등전 포커싱 (icIEF) 샘플 매트릭스를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "icIEF 샘플 매트릭스" 및 "샘플 매트릭스"는 혼합물을 icIEF에 적용하기 전에 피분석물 (예를 들어, PEG화된 단백질)과 혼합될 수 있는 시약의 조합을 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. icIEF를 위한 샘플 매트릭스는 양성전해질 및 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 예를 들어, 샘플 매트릭스는 전기삼투 유동을 감소시키고, 보다 우수한 단백질 안정화를 가능하게 하고, 전해질의 점도를 증가시킴으로써 유체 채널의 모세관 내부의 확산을 제한하기 위한 첨가제, 예를 들어, 메틸셀룰로스 또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 샘플 매트릭스는 또한, 단백질 응집을 감소시키고, 샘플 매트릭스 중에 단백질을 가용화시키고, 따라서 검정 반복성을 개선시킬 수 있는 안정화 첨가제, 예컨대 우레아, 포름아미드, 또는 수크로스를 포함할 수 있다. 추가로, 샘플 매트릭스는 pI 참조 표준을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스는 글리신을 약 1 mM 내지 약 200 mM의 농도로 함유한다. 일부 측면에서, 글리신은 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 1 mM 내지 약 70 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 90 mM, 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 200 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 90 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 70 mM, 약 30 mM 내지 약 60 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 40 mM 내지 약 200 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 90 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 70 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다.
icIEF 샘플 매트릭스의 일부 측면에서, 글리신은 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 100 mM, 약 105 mM, 약 110 mM, 약 115 mM, 또는 약 120 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 글리신은 약 30 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 글리신은 약 36 mM 내지 약 44 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 글리신은 약 40 mM의 농도로 존재한다. 일반적으로, 글리신의 농도는, 예를 들어, 사용되는 기기의 특정 특징, 사용되는 모세관의 유형, 또는 사용되는 단백질 샘플에 따라, 단백질 전하 변이체, 예를 들어, 상이한 PEG화된 단백질 전하 변이체 사이의 최적 분리를 달성하기 위해, 조정될 수 있다.
icIEF 샘플 매트릭스의 일부 측면에서, 타우린은 약 1 mM 내지 약 200 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 타우린은 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 1 mM 내지 약 70 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 90 mM, 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 200 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 90 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 70 mM, 약 30 mM 내지 약 60 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 40 mM 내지 약 200 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 90 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 70 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다.
icIEF 샘플 매트릭스의 일부 측면에서, 타우린은 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 100 mM, 약 105 mM, 약 110 mM, 약 115 mM, 또는 약 120 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 타우린은 약 40 mM 내지 약 60 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 타우린은 약 45 mM 내지 약 55 mM의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 타우린은 약 50 mM의 농도로 존재한다. 일반적으로, 타우린의 농도는, 예를 들어, 사용되는 기기의 특정 특징, 사용되는 모세관의 유형, 또는 사용되는 단백질 샘플에 따라, 샘플 매트릭스 유도 베이스라인 간섭, 예를 들어, 샘플 매트릭스 중의 글리신의 존재로 인한 베이스라인 간섭의 최적 고갈 또는 감소를 달성하기 위해, 조정될 수 있다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 글리신 및 타우린 둘 다를 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 (i) 약 1 mM 내지 약 200 mM 농도의 글리신, 및 (ii) 약 1 mM 내지 약 200 mM 농도의 타우린을 포함한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 (i) 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 1 mM 내지 약 70 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 90 mM, 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 200 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 90 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 70 mM, 약 30 mM 내지 약 60 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 40 mM 내지 약 200 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 90 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 70 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 50 mM 농도의 글리신, 및 (ii) 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 1 mM 내지 약 70 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 90 mM, 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 200 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 90 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 70 mM, 약 30 mM 내지 약 60 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 40 mM 내지 약 200 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 90 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 70 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 50 mM 농도의 타우린을 포함한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 (i) 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 100 mM, 약 105 mM, 약 110 mM, 약 115 mM, 또는 약 120 mM 농도의 글리신, 및 (ii) 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 100 mM, 약 105 mM, 약 110 mM, 약 115 mM, 또는 약 120 mM 농도의 타우린을 포함한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 (i) 약 30 mM 내지 약 50 mM 농도의 글리신, 및 (ii) 약 40 mM 내지 약 60 mM 농도의 타우린을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 (i) 약 36 mM 내지 약 44 mM 농도의 글리신, 및 (ii) 약 45 mM 내지 약 55 mM 농도의 타우린을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 (i) 약 40 mM 농도의 글리신, 및 (ii) 약 50 mM 농도의 타우린을 포함한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 (i) 단백질 전하 변이체, 예를 들어, PEG화된 단백질 전하 변이체 사이의 최적 분리를 달성할 수 있는 글리신의 농도, 및 (ii) 샘플 매트릭스 유도 베이스라인 간섭, 예를 들어, 샘플 매트릭스 중의 글리신의 존재로 인한 베이스라인 간섭의 최적 고갈 또는 감소를 달성할 수 있는 타우린의 농도를 포함한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 담체 양성전해질을 추가로 포함한다. 용어 "담체 양성전해질" 및 "양성전해질"은 상호교환가능하게 사용되고, 산성 및 염기성 그룹 둘 다를 함유하고 특정 범위의 pH 값에서 대부분 쯔비터이온(zwitterion)으로서 존재할 양쪽성 분자를 지칭한다. 양성전해질은 등전 포커싱 기술, 예를 들어, icIEF에서의 사용을 위한 적합한 pH 구배를 달성하기 위해 사용된다. 적용된 전기장의 존재 하에, 담체 양성전해질은 애노드로부터 캐소드까지 선형으로 증가하는 평활한 pH 구배로 분할된다. 평균 전하가 0인 pH가 분자의 등전점 (pI)으로서 공지되어 있다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 밀접한 간격의 pI 값 및 우수한 완충 능력을 갖는 다수의 지방족 아미노 및 카르복실레이트 기를 함유하는 소분자 (예를 들어, 약 300-1,000 Da)의 혼합물을 포함한다. 일부 측면에서, 양성전해질은 pH 단위 당 높은 완충 능력, 선형 pH 구배, 및 양성전해질에 걸친 균일한 전도도를 포함한다.
수많은 상업적으로 입수가능한 양성전해질 용액을 포함한, 많은 상이한 양성전해질이 pH 구배를 생성하기 위해 활용될 수 있다. 양성전해질 및 양성전해질 구배의 폭의 선택은 icIEF에 의해 달성되는 분해능에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 좁은 양성전해질 구배는 분리에서 이론단의 수를 증가시키고 좁은 pI 범위에 걸쳐 보다 고분해능 분리에 유리할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 양성전해질이 개시된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있고, 이는 인산/수산화나트륨, 글루탐산/리신, 포름산/디메틸아민, 또는 상업적 담체 양성전해질 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상업적으로 입수가능한 담체 양성전해질의 4개 패밀리가 icIEF에서 일반적으로 사용된다: 파말라이트® (지이 헬스케어(GE Healthcare), 미국 펜실바니아주 피츠버그), 바이오-라이트(BIO-LYTE)® (바이오라드(BioRad), 미국 캘리포니아주 에르쿨레스), 서발라이트(SERVALYTE)® (바이오포레틱스(Biophoretics), 네바다주 리노) 및 암폴라인(AMPHOLINE)® (지이 헬스케어, 미국 펜실바니아주 피츠버그). 일부 측면에서, 본 개시내용의 icIEF 샘플 매트릭스에서 사용되는 양성전해질은 파말라이트®, 바이오라이트®, 서발라이트®, 암폴라인®, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 넓은 pH 범위 담체 양성전해질이다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 좁은 pH 범위 담체 양성전해질이다.
파말라이트® 담체 양성전해질은 넓은 pH 범위, 예를 들어, 약 pH 3 내지 약 pH 10 내에서, 및/또는 좁은 pH 범위, 예를 들어, 약 2.5 내지 약 5, 약 4 내지 약 6.5, 약 5 내지 약 8, 약 8 내지 약 10.5, 약 4.2 내지 약 4.9, 약 4.5 내지 약 5.4, 약 5 내지 약 6, 또는 약 6.7 내지 약 7.7 내에서 수행되는 icIEF를 위해 사용된다.
거의 모든 현재의 cIEF 검출은 280 nm에서 UV 검출을 사용하여 수행된다. cIEF에서는, 온-라인 UV 검출이 일반적으로 사용된다. icIEF에서는, CCD 카메라를 사용하여 실시간 모니터링이 수행된다. 파말라이트® 담체 양성전해질은 그의 전체 pH 구배를 따라 낮은 백그라운드 UV 흡수를 갖기 때문에, 낮은 백그라운드 UV 흡수를 갖는 담체 양성전해질을 사용하는 것이 바람직한 경우에는 특히 파말라이트® 담체 양성전해질이 사용된다.
파말라이트® 담체 양성전해질의 상업적 명칭은 커버하는 그의 pH 범위를 나타내며; 예를 들어, 파말라이트® 3-5 담체 양성전해질은 3 내지 5의 pH 범위를 커버한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 파말라이트® 3-10, 파말라이트® 3-4, 파말라이트® 3- 5, 파말라이트® 3-6, 파말라이트® 3-7, 파말라이트® 3-8, 파말라이트® 4-7, 파말라이트® 4-8, 파말라이트® 5-8, 파말라이트® 5-9, 파말라이트® 5-10, 파말라이트® 6-8, 파말라이트® 6-9, 파말라이트® 6- 10, 파말라이트® 7-9, 파말라이트® 7-10, 파말라이트® 8-10, 또는 임의의 이들의 조합이다.
바이오라이트® 담체 양성전해질은 또한 넓은 pH 범위 분리 (예를 들어, 약 3.5 내지 약 9.5)에, 또한 좁은 범위 분리 (예를 들어, 약 3 내지 약 5; 약 4 내지 약 6; 약 5 내지 약 7; 약 5 내지 약 8; 약 6 내지 약 8; 약 7 내지 약 9; 또는 약 8 내지 약 10)에 사용될 수 있다.
서발라이트® 담체 양성전해질 또한 넓은 pH 범위 분리 (예를 들어, 약 2 내지 약 9; 약 2 내지 약 11; 약 3 내지 약 7; 약 3 내지 약 10; 약 4 내지 약 9; 또는 약 5 내지 약 9), 및 좁은 pH 범위 분리 (예를 들어, 약 2 내지 약 4; 약 3 내지 약 4; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 6; 약 4 내지 약 5; 약 4 내지 약 6; 약 4 내지 약 7; 약 5 내지 약 6; 약 5 내지 약 7; 약 5 내지 약 8; 약 6 내지 약 7; 약 6 내지 약 8; 약 6 내지 약 9; 약 7 내지 약 9; 또는 약 9 내지 약 11)에 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 담체 양성전해질은 하나 이상의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 하나 이상의 바이오라이트® 담체 양성전해질, 하나 이상의 서발라이트® 담체 양성전해질, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질의 조합은 넓은 범위에 걸친 커버리지를 제공하는 보완 범위를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 하나의 담체 양성전해질은 pH 2 내지 pH 4를 커버하고, 제2 담체 양성전해질은 pH 4 내지 pH 8을 커버하고, 제3 담체 양성전해질은 pH 8 내지 pH 11을 커버한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질의 조합은 좁은 pH 범위 또는 범위들 내에서 특히 높은 분해능을 제공하도록 디자인될 수 있으며, 예를 들어, 특히 8 내지 9의 pI를 갖는 대전된 종을 분해하기 위해 선택된 혼합물은 pH 2 내지 pH 8을 커버하는 제1 담체 양성전해질, pH 8 내지 pH 9를 커버하는 제2 담체 양성전해질을 포함할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 특정 담체 양성전해질의 선정이, 피분석물의 전하, 및 예를 들어 (예를 들어 겔 IEF를 사용하여) 얻어진 예비 데이터에 의해 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 이후에 특정 PEG로 유도체화된, 임의의 IEF 기술을 사용하여 결정된 대략 6의 pI를 갖는 단백질이, 단백질의 비-유도체화된 형태의 pH를 포함하는 pH 범위를 커버하는 담체 양성전해질, 예를 들어, 파말라이트® 4-8 및 icIEF를 사용하여 분석될 수 있다.
일부 구체적 측면에서, 본원에 개시된 샘플 매트릭스는, 매우 산성 또는 매우 염기성인 피분석물 (예를 들어, 고도 산성 또는 고도 염기성 단백질)을 수반하는 것들을 제외한 대부분의 분리에 적절한, 넓은 pH 범위를 커버하는 담체 양성전해질을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용의 샘플 매트릭스는, 예를 들어, pH 2 내지 pH 11 (예를 들어, 서발라이트® 2-11) 또는 pH 3 내지 pH 10 (예를 들어, 파말라이트® 3-10)을 커버하는, 넓은 pH 범위 담체 양성전해질을 포함한다. 특정 측면에서, 넓은 pH 범위 담체 양성전해질은 파말라이트® 담체 양성전해질이다. 보다 특정 측면에서, 넓은 pH 범위 담체 양성전해질은 파말라이트® 3-10이다.
일부 측면에서, 담체 양성전해질 (또는 이들의 조합)은 약 1% (v:v) 내지 약 10% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질 (또는 이들의 조합)은 1% (v:v) 내지 약 2% (v:v), 약 2% (v:v) 내지 약 3% (v:v), 약 3% (v:v) 내지 약 4% (v:v), 약 4% (v:v) 내지 약 5% (v:v), 약 5% (v:v) 내지 약 6% (v:v), 약 6% (v:v) 내지 약 7% (v:v), 약 7% (v:v) 내지 약 8% (v:v), 약 8% (v:v) 내지 약 9% (v:v), 또는 약 9% (v:v) 내지 약 10% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질 (또는 이들의 조합)은 약 2% (v:v) 내지 약 9% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질 (또는 이들의 조합)은 약 3% (v:v) 내지 약 8% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질 (또는 이들의 조합)은 약 2% (v:v) 내지 약 7% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질 (또는 이들의 조합)은 약 3% (v:v) 내지 약 6% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질 (또는 이들의 조합)은 약 2% (v:v) 내지 약 5% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질 (또는 이들의 조합)은 약 3% (v:v) 내지 약 5% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 약 1% (v:v), 약 2% (v:v), 약 3% (v:v), 약 4% (v:v), 약 5% (v:v), 약 6% (v:v), 약 7% (v:v), 약 8% (v:v), 약 9% (v:v), 또는 약 10% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 약 3.6% (v:v) 내지 4.4% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 약 3.6% (v:v), 약 3.7% (v:v), 약 3.8% (v:v), 약 3.9% (v:v), 약 4% (v:v), 약 4.1% (v:v), 약 4.2% (v:v), 약 4.3% (v:v), 또는 약 4.4% (v:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 담체 양성전해질은 약 4% (v:v)의 농도로 존재한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 그의 점도를 증가시키는 화합물, 예를 들어, 메틸 셀룰로스 또는 그의 유도체 (예를 들어, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스)를 추가로 포함한다. 임의로, 샘플 매트릭스 중의 메틸 셀룰로스와 같은 점도 증가 화합물의 사용은 모세관 코팅, 예를 들어, icIEF 모세관의 표면 상의 아크릴아미드 유도체 코팅의 사용에 의해 제거될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스는 메틸 셀룰로스를 약 0.01% (w:v) 내지 약 1% (w:v)의 농도로 포함한다. 일부 측면에서, 메틸 셀룰로스는 약 0.01% (w:v), 약 0.05% (w:v), 약 0.1% (w:v), 약 0.15% (w:v), 약 0.2% (w:v), 약 0.25% (w:v), 약 0.3% (w:v), 약 0.35% (w:v), 약 0.4% (w:v), 약 0.45% (w:v), 약 0.5% (w:v), 약 0.6% (w:v), 약 0.7% (w:v), 약 0.8% (w:v), 약 0.9% (w:v) 또는 약 1% (w:v)의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 메틸 셀룰로스는 약 0.01 (w:v) 내지 약 0.1% (w:v), 약 0.1% (w:v) 내지 약 0.2% (w:v), 약 0.2% (w:v) 내지 약 0.3% (w:v), 약 0.3% (w:v) 내지 약 0.4% (w:v), 약 0.4% (w:v) 내지 약 0.5% (w:v), 약 0.5% (w:v) 내지 약 0.6% (w:v), 약 0.6% (w:v) 내지 약 0.7% (w:v), 약 0.7% (w:v) 내지 약 0.8% (w:v), 약 0.8% (w:v) 내지 약 0.9% (w:v), 또는 약 0.9% (w:v) 내지 약 1% (w:v)의 농도로 존재한다. 일부 구체적 측면에서, 메틸 셀룰로스는 약 0.35% (w:v)의 농도로 존재한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 및 글리신 (예를 들어, 약 40 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 메틸 셀룰로스, 및 글리신 (예를 들어, 약 40 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 메틸 셀룰로스, 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 메틸 셀룰로스, 글리신 (예를 들어, 약 40 mM), 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다.
일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 약 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 및 약 40 mM 글리신을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 약 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 및 약 50 mM 타우린을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 약 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 약 40 mM 글리신 및 약 50 mM 타우린을 포함한다.
일부 측면에서는, 본 개시내용의 icIEF 샘플 매트릭스를 하나 이상의 공지된 pI 표준으로 스파이킹하여 분리 성능을 평가한다. 따라서, 본원에 개시된 임의의 icIEF 샘플 매트릭스는 일련의 pI 표준을 포함할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 다양한 pI 표준이, 이들이 적절한 이미지화 기술을 사용하여 가시화될 수 있다면, 분리된 피분석물 피크에 대한 등전점 계산을 위해 개시된 방법 및 장치에서 사용될 수 있다. 일반적으로, icIEF 응용에서 사용되는 두 가지 유형의 pI 마커가 존재한다: 단백질 pI 마커 및 합성 소분자 pI 마커. 단백질 pI 마커는 통상적으로 허용되는 pI 값을 갖는 특정 단백질을 기재로 한다. 이들은 일반적으로 엄격한 저장 조건의 채택을 필요로 하고, 불량한 안정성을 나타낼 수 있으며, 따라서 CIEF에서 다수의 피크를 제공할 수 있다. 합성 소분자 (바람직하게는 효소 분리에서 사용될 수 있도록 하는 비-펩티드 분자)는 일반적으로 저장 동안 보다 안정적이고, icIEF에서 단일 피크에 포커싱할 것이다. 다양한 단백질 pI 마커 또는 합성 소분자 pI 마커, 예를 들어, 어드밴스드 일렉트로포레시스 솔루션즈, 리미티드(Advanced Electrophoresis Solutions, Ltd., 캐나다 온타리오주 캠브리지)로부터 입수가능한 소분자 pI 마커가 이용가능하다.
일부 측면에서, icIEF는 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스 및 피분석물 (또는 하나 초과의 피분석물)을 포함하는 혼합물 상에서 수행된다. 일부 측면에서, 피분석물은 수용성 중합체 모이어티, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리글리세롤 (PG), 폴리(프로필렌 글리콜) (PPG), 독립적으로 아민-, 히드록시-, 티올-, 카르복실산, 카르복실산 아미드, 술폰산 또는 술폰아미드 관능기를 포함하는 군으로부터 선택된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환체 관능기를 포함하는 C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 또는 C10 알킬 기, 또는 복수의 임의의 단량체 히드록시프로필 메타크릴레이트 (HPMA), 히드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA), 비닐 알콜 (VA), 비닐 피롤리돈 (VP), N-이소프로필 아크릴아미드 (NIPAM) 및/또는 PEG 메타크릴레이트 (PEGMA) (여기서 n 및 m은 독립적으로 3 내지 200의 값을 가짐) 중 임의의 것을 포함하는 중합체 또는 공중합체를 포함하는 약물-단백질 컨쥬게이트, 단백질, 또는 펩티드를 포함한다. 특정 측면에서, 피분석물은 PEG화된 항체이다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스 및 본원에 개시된 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. PPG는 PEG보다 덜 독성이고, 따라서 많은 생물학적 생성물이 이제 PEG 대신에 PPG를 사용하여 생성된다.
일부 측면에서, PEG는 화학식 R3-(O-CH2-CH2)n- 또는 화학식 R3-(0-CH2-CH2)n-O-를 특징으로 하며, 여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고, n은 2 내지 200의 값을 갖는다. 일부 측면에서, PEG는 화학식:
Figure pct00002
을 갖고, 여기서 n은 1 내지 1000이다. 일부 측면에서 화학식 I의 -O-H 기는 -O-CH3 (메톡시)로 대체될 수 있다. 따라서, PEG에 관한 하기 개시내용은 메톡시 PEG와 같은 PEG 유도체에 동등하게 적용가능하다.
일부 측면에서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 189, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200의 값을 갖는다.
일부 측면에서, n은 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 670, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 적어도 약 600, 적어도 약 610, 적어도 약 620, 적어도 약 630, 적어도 약 640, 적어도 약 650, 적어도 약 660, 적어도 약 670, 적어도 약 680, 적어도 약 690, 적어도 약 700, 적어도 약 710, 적어도 약 720, 적어도 약 730, 적어도 약 740, 적어도 약 750, 적어도 약 760, 적어도 약 770, 적어도 약 780, 적어도 약 790, 적어도 약 800, 적어도 약 810, 적어도 약 820, 적어도 약 830, 적어도 약 840, 적어도 약 850, 적어도 약 860, 적어도 약 870, 적어도 약 880, 적어도 약 890, 적어도 약 900, 적어도 약 910, 적어도 약 920, 적어도 약 930, 적어도 약 940, 적어도 약 950, 적어도 약 960, 적어도 약 970, 적어도 약 980, 적어도 약 990, 또는 약 1000이다.
일부 측면에서, n은 약 50 내지 약 100, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 200, 약 200 내지 약 250, 약 250 내지 약 300, 약 300 내지 약 350, 약 350 내지 약 400, 약 400 내지 약 450, 약 450 내지 약 500, 약 500 내지 약 550, 약 550 내지 약 600, 약 600 내지 약 650, 약 650 내지 약 700, 약 700 내지 약 750, 약 750 내지 약 800, 약 800 내지 약 850, 약 850 내지 약 900, 약 900 내지 약 950, 또는 약 950 내지 약 1000이다.
일부 측면에서, n은 적어도 약 80, 적어도 약 81, 적어도 약 82, 적어도 약 83, 적어도 약 84, 적어도 약 85, 적어도 약 86, 적어도 약 87, 적어도 약 88, 적어도 약 89, 적어도 약 90, 적어도 약 91, 적어도 약 92, 적어도 약 93, 적어도 약 94, 적어도 약 95, 적어도 약 96, 적어도 약 97, 적어도 약 98, 적어도 약 99, 적어도 약 100, 적어도 약 101, 적어도 약 102, 적어도 약 103, 적어도 약 104, 적어도 약 105, 적어도 약 106, 적어도 약 107, 적어도 약 108, 적어도 약 109, 적어도 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 적어도 약 141, 적어도 약 142, 적어도 약 143, 적어도 약 144, 적어도 약 145, 적어도 약 146, 적어도 약 147, 적어도 약 148, 적어도 약 149, 적어도 약 150, 적어도 약 151, 적어도 약 152, 적어도 약 153, 적어도 약 154, 적어도 약 155, 적어도 약 156, 적어도 약 157, 적어도 약 158, 적어도 약 159, 또는 적어도 약 160이다.
일부 측면에서, n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 85 내지 약 95, 약 95 내지 약 105, 약 105 내지 약 115, 약 115 내지 약 125, 약 125 내지 약 135, 약 135 내지 약 145, 약 145 내지 약 155, 약 155 내지 약 165, 약 80 내지 약 100, 약 100 내지 약 120, 약 120 내지 약 140, 약 140 내지 약 160, 약 85 내지 약 105, 약 105 내지 약 125, 약 125 내지 약 145, 약 145 내지 약 165이다.
일부 측면에서, n은 2 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150, 150 내지 160, 160 내지 170, 170 내지 180, 180 내지 190, 또는 190 내지 200이다. 일부 구체적 측면에서, n은 3 내지 200, 3 내지 20, 10 내지 30, 또는 9 내지 45의 값을 갖는다.
일부 측면에서, PEG는 분지화된 PEG이다. 분지화된 PEG는 중심 코어 기로부터 나오는 3 내지 10개의 PEG 사슬을 갖는다. 특정 측면에서, PEG 모이어티는 단분산 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 개시내용과 관련하여, 단분산 폴리에틸렌 글리콜 (mdPEG)은 단일의 정의된 사슬 길이 및 분자량을 갖는 PEG이다. mdPEG는 전형적으로 크로마토그래피에 의한 중합 혼합물로부터의 분리에 의해 생성된다. 특정 화학식에서, 단분산 PEG 모이어티는 약어 mdPEG로 지정된다. 일부 측면에서, PEG는 별형(Star) PEG이다. 별형 PEG는 중심 코어 기로부터 나오는 10 내지 100개의 PEG 사슬을 갖는다. 일부 측면에서, PEG는 빗형(Comb) PEG이다. 빗형 PEG는 통상적으로 중합체 백본 상에 그래프팅된 다수의 PEG 사슬을 갖는다.
특정 측면에서, PEG는 100 g/mol 내지 3000 g/mol, 특히 100 g/mol 내지 2500 g/mol, 보다 특히 대략 100 g/mol 내지 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다. 특정 측면에서, PEG는 200 g/mol 내지 3000 g/mol, 특히 300 g/mol 내지 2500 g/mol, 보다 특히 대략 400 g/mol 내지 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다. 특정 측면에서, PEG는 약 1000 g/mol 내지 약 2000 g/mol, 약 2000 g/mol 내지 약 3000 g/mol, 약 3000 g/mol 내지 약 4000 g/mol, 약 4000 g/mol 내지 약 5000 g/mol, 약 5000 g/mol 내지 약 6000 g/mol, 약 6000 g/mol 내지 약 7000 g/mol, 또는 7000 g/mol 내지 약 8000 g/mol의 몰 질량을 갖는다.
일부 측면에서, PEG는 PEG100, PEG200, PEG300, PEG400, PEG500, PEG600, PEG700, PEG800, PEG900, PEG1000, PEG1100, PEG1200, PEG1300, PEG1400, PEG1500, PEG1600, PEG1700, PEG1800, PEG1900, PEG2000, PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG1600, PEG1700, PEG1800, PEG1900, PEG2000, PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG2600, PEG2700, PEG2800, PEG2900, 또는 PEG3000 PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG2600, PEG2700, PEG2800, PEG2900, PEG3000, PEG3100, PEG3200, PEG3300, PEG3400, PEG3500, PEG3600, PEG3700, PEG3800, PEG3900, PEG4000, PEG4100, PEG4200, PEG4300, PEG4400, PEG4500, PEG4600, PEG4700, PEG4800, PEG4900, PEG5000, PEG5100, PEG5200, PEG5300, PEG5400, PEG5500, PEG5600, PEG5700, PEG5800, PEG5900, PEG6000, PEG6100, PEG6200, PEG6300, PEG6400, PEG6500, PEG6600, PEG6700, PEG6800, PEG6900, PEG7000, PEG7100, PEG7200, PEG7300, PEG7400, PEG7500, PEG7600, PEG7700, PEG7800, PEG7900, 또는 PEG8000이다.
일부 측면에서, PEG는 단분산, 예를 들어, mPEG100, mPEG200, mPEG300, mPEG400, mPEG500, mPEG600, mPEG700, mPEG800, mPEG900, mPEG1000, mPEG1100, mPEG1200, mPEG1300, mPEG1400, mPEG1500, mPEG1600, mPEG1700, mPEG1800, mPEG1900, mPEG2000, mPEG2100, mPEG2200, mPEG2300, mPEG2400, mPEG2500, mPEG1600, mPEG1700, mPEG1800, mPEG1900, mPEG2000, mPEG2100, mPEG2200, mPEG2300, mPEG2400, mPEG2500, mPEG2600, mPEG2700, mPEG2800, mPEG2900, mPEG3000, mPEG3100, mPEG3200, mPEG3300, mPEG3400, mPEG3500, mPEG3600, mPEG3700, mPEG3800, mPEG3900, mPEG4000, mPEG4100, mPEG4200, mPEG4300, mPEG4400, mPEG4500, mPEG4600, mPEG4700, mPEG4800, mPEG4900, mPEG5000, mPEG5100, mPEG5200, mPEG5300, mPEG5400, mPEG5500, mPEG5600, mPEG5700, mPEG5800, mPEG5900, mPEG6000, mPEG6100, mPEG6200, mPEG6300, mPEG6400, mPEG6500, mPEG6600, mPEG6700, mPEG6800, mPEG6900, mPEG7000, mPEG7100, mPEG7200, mPEG7300, mPEG7400, mPEG7500, mPEG7600, mPEG7700, m PEG7800, mPEG7900, 또는 mPEG8000이다.
일부 측면에서, 피분석물 (예를 들어, 항체 등의 단백질)은 단일 PEG를 포함한다. 일부 측면에서, 피분석물 (예를 들어, 항체 등의 단백질)은 하나 초과의 PEG를 포함할 수 있으며, 여기서 모든 PEG는 동일하거나 적어도 하나가 다른 PEG와 상이하다. 일부 측면에서, PEG는 선형 PEG이다. 일부 측면에서, PEG는 선형 메톡시 PEG이다. 일부 측면에서, PEG는 대략 30 kDa의 분자 질량을 갖는다. 일부 측면에서, PEG (예를 들어, 선형 메톡시 PEG)는 화학적 또는 효소적 컨쥬게이션에 의해 단백질 (예를 들어, 항체)에 부착된다. 일부 측면에서, 컨쥬게이션은 비-천연 아미노산을 통한 것이다.
일부 측면에서, 폴리글리세롤 (PG)은 화학식 ((R3-O-(CH2-CHOH-CH2O)n-)으로 기재되며, 여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고, n은 3 내지 200의 값을 갖는다. 일부 측면에서, n은 3 내지 20의 값을 갖는다. 일부 측면에서, n은 10 내지 30의 값을 갖는다. 이들 측면의 일부 대안에서, n은 9 내지 45의 값을 갖는다. 일부 측면에서, PG는 화학식 (R3-O-(CH2-CHOR5-CH2-O)n-)으로 기재되는 분지화된 폴리글리세롤이며, 여기서 R5는 수소 또는 화학식 (R3-O-(CH2-CHOH-CH2-O)n-)으로 기재되는 선형 글리세롤 사슬이고, R3은 수소, 메틸 또는 에틸이다.
일부 측면에서, PG는 화학식 (R3-O-(CH2-CHOR5-CH2-O)n-)로 기재되는 초분지화된 폴리글리세롤이며, 여기서 R5는 수소 또는 화학식 (R3-O-(CH2-CHOR6-CH2-O)n-)로 기재되는 글리세롤 사슬이며, 여기서 R6은 수소 또는 화학식 (R3-O-(CH2-CHOR7-CH2-O)n-)로 기재되는 글리세롤 사슬이며, 여기서 R7은 수소 또는 화학식 (R3-O-(CH2-CHOH-CH2-O)n-)로 기재되는 선형 글리세롤 사슬이며, 여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이다. 초분지화된 글리세롤 및 그의 합성 방법은 하기 문헌 및 그에 인용된 참조문헌에 기재되어 있다: Oudshorn et al. (2006) Biomaterials 27:5471-5479; Wilms et al. (20100 Acc. Chem. Res. 43, 129-41.
특정 측면에서, PG는 100 g/mol 내지 3000 g/mol, 특히 100 g/mol 내지 2500 g/mol, 보다 특히 대략 100 g/mol 내지 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다. 특정 측면에서, PG는 200 g/mol 내지 3000 g/mol, 특히 300 g/mol 내지 2500 g/mol, 보다 특히 대략 400 g/mol 내지 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다. 특정 측면에서, PG는 약 1000 g/mol 내지 약 2000 g/mol, 약 2000 g/mol 내지 약 3000 g/mol, 약 3000 g/mol 내지 약 4000 g/mol, 약 4000 g/mol 내지 약 5000 g/mol, 약 5000 g/mol 내지 약 6000 g/mol, 약 6000 g/mol 내지 약 7000 g/mol, 또는 7000 g/mol 내지 약 8000 g/mol의 몰 질량을 갖는다.
일부 측면에서, PG는 PG100, PG200, PG300, PG400, PG500, PG600, PG700, PG800, PG900, PG1000, PG1100, PG1200, PG1300, PG1400, PG1500, PG1600, PG1700, PG1800, PG1900, PG2000, PG2100, PG2200, PG2300, PG2400, PG2500, PG1600, PG1700, PG1800, PG1900, PG2000, PG2100, PG2200, PG2300, PG2400, PG2500, PG2600, PG2700, PG2800, PG2900, PG3000, PG3100, PG3200, PG3300, PG3400, PG3500, PG3600, PG3700, PG3800, PG3900, PG4000, PG4100, PG4200, PG4300, PG4400, PG4500, PG4600, PG4700, PG4800, PG4900, PG5000, PG5100, PG5200, PG5300, PG5400, PG5500, PG5600, PG5700, PG5800, PG5900, PG6000, PG6100, PG6200, PG6300, PG6400, PG6500, PG6600, PG6700, PG6800, PG6900, PG7000, PG7100, PG7200, PG7300, PG7400, PG7500, PG7600, PG7700, PG7800, PG7900, 또는 PG8000이다.
일부 측면에서, PG는 단분산, 예를 들어, mPG100, mPG200, mPG300, mPG400, mPG500, mPG600, mPG700, mPG800, mPG900, mPG1000, mPG1100, mPG1200, mPG1300, mPG1400, mPG1500, mPG1600, mPG1700, mPG1800, mPG1900, mPG2000, mPG2100, mPG2200, mPG2300, mPG2400, mPG2500, mPG1600, mPG1700, mPG1800, mPG1900, mPG2000, mPG2100, mPG2200, mPG2300, mPG2400, mPG2500, mPG2600, mPG2700, mPG2800, mPG2900, mPG3000, mPG3100, mPG3200, mPG3300, mPG3400, mPG3500, mPG3600, mPG3700, mPG3800, mPG3900, mPG4000, mPG4100, mPG4200, mPG4300, mPG4400, mPG4500, mPG4600, mPG4700, mPG4800, mPG4900, mPG5000, mPG5100, mPG5200, mPG5300, mPG5400, mPG5500, mPG5600, mPG5700, mPG5800, mPG5900, mPG6000, mPG6100, mPG6200, mPG6300, mPG6400, mPG6500, mPG6600, mPG6700, mPG6800, mPG6900, mPG7000, mPG7100, mPG7200, mPG7300, mPG7400, mPG7500, mPG7600, mPG7700, mPG7800, mPG7900, 또는 mPG8000이다.
일부 측면에서, 수용성 생체중합체는 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG")을 포함한다. 일부 측면에서, PPG는 하기 화학식을 특징으로 하며, 여기서 n은 1 내지 1000의 값을 갖는다.
Figure pct00003
일부 측면에서, PPG의 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 189, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200의 값을 갖는다.
일부 측면에서, PPG의 n은 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 670, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 적어도 약 600, 적어도 약 610, 적어도 약 620, 적어도 약 630, 적어도 약 640, 적어도 약 650, 적어도 약 660, 적어도 약 670, 적어도 약 680, 적어도 약 690, 적어도 약 700, 적어도 약 710, 적어도 약 720, 적어도 약 730, 적어도 약 740, 적어도 약 750, 적어도 약 760, 적어도 약 770, 적어도 약 780, 적어도 약 790, 적어도 약 800, 적어도 약 810, 적어도 약 820, 적어도 약 830, 적어도 약 840, 적어도 약 850, 적어도 약 860, 적어도 약 870, 적어도 약 880, 적어도 약 890, 적어도 약 900, 적어도 약 910, 적어도 약 920, 적어도 약 930, 적어도 약 940, 적어도 약 950, 적어도 약 960, 적어도 약 970, 적어도 약 980, 적어도 약 990, 또는 약 1000이다.
일부 측면에서, PPG의 n은 약 50 내지 약 100, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 200, 약 200 내지 약 250, 약 250 내지 약 300, 약 300 내지 약 350, 약 350 내지 약 400, 약 400 내지 약 450, 약 450 내지 약 500, 약 500 내지 약 550, 약 550 내지 약 600, 약 600 내지 약 650, 약 650 내지 약 700, 약 700 내지 약 750, 약 750 내지 약 800, 약 800 내지 약 850, 약 850 내지 약 900, 약 900 내지 약 950, 또는 약 950 내지 약 1000이다.
일부 측면에서, PPG의 n은 적어도 약 80, 적어도 약 81, 적어도 약 82, 적어도 약 83, 적어도 약 84, 적어도 약 85, 적어도 약 86, 적어도 약 87, 적어도 약 88, 적어도 약 89, 적어도 약 90, 적어도 약 91, 적어도 약 92, 적어도 약 93, 적어도 약 94, 적어도 약 95, 적어도 약 96, 적어도 약 97, 적어도 약 98, 적어도 약 99, 적어도 약 100, 적어도 약 101, 적어도 약 102, 적어도 약 103, 적어도 약 104, 적어도 약 105, 적어도 약 106, 적어도 약 107, 적어도 약 108, 적어도 약 109, 적어도 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 적어도 약 141, 적어도 약 142, 적어도 약 143, 적어도 약 144, 적어도 약 145, 적어도 약 146, 적어도 약 147, 적어도 약 148, 적어도 약 149, 적어도 약 150, 적어도 약 151, 적어도 약 152, 적어도 약 153, 적어도 약 154, 적어도 약 155, 적어도 약 156, 적어도 약 157, 적어도 약 158, 적어도 약 159, 또는 적어도 약 160이다.
일부 측면에서, PPG의 n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 85 내지 약 95, 약 95 내지 약 105, 약 105 내지 약 115, 약 115 내지 약 125, 약 125 내지 약 135, 약 135 내지 약 145, 약 145 내지 약 155, 약 155 내지 약 165, 약 80 내지 약 100, 약 100 내지 약 120, 약 120 내지 약 140, 약 140 내지 약 160, 약 85 내지 약 105, 약 105 내지 약 125, 약 125 내지 약 145, 또는 약 145 내지 약 165이다.
따라서, 일부 측면에서, PPG는 분지화된 PPG이다. 분지화된 PPG는 중심 코어 기로부터 나오는 3 내지 10개의 PPG 사슬을 갖는다. 특정 측면에서, PPG 모이어티는 단분산 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 개시내용과 관련하여, 단분산 폴리에틸렌 글리콜 (mdPPG)은 단일의 정의된 사슬 길이 및 분자량을 갖는 PPG이다. mdPEG는 전형적으로 크로마토그래피에 의한 중합 혼합물로부터의 분리에 의해 생성된다. 특정 화학식에서, 단분산 PPG 모이어티는 약어 mdPPG로 지정된다.
일부 측면에서, PPG는 별형 PPG이다. 별형 PPG는 중심 코어 기로부터 나오는 10 내지 100개의 PPG 사슬을 갖는다. 일부 측면에서, PPG는 빗형 PPG이다. 빗형 PPG는 통상적으로 중합체 백본 상에 그래프팅된 다수의 PPG 사슬을 갖는다.
특정 측면에서, PPG는 약 1000 g/mol 내지 약 2000 g/mol, 약 2000 g/mol 내지 약 3000 g/mol, 약 3000 g/mol 내지 약 4000 g/mol, 약 4000 g/mol 내지 약 5000 g/mol, 약 5000 g/mol 내지 약 6000 g/mol, 약 6000 g/mol 내지 약 7000 g/mol, 또는 7000 g/mol 내지 약 8000 g/mol의 몰 질량을 갖는다.
일부 측면에서, PPG는 PPG100, PPG200, PPG300, PPG400, PPG500, PPG600, PPG700, PPG800, PPG900, PPG1000, PPG1100, PPG1200, PPG1300, PPG1400, PPG1500, PPG1600, PPG1700, PPG1800, PPG1900, PPG2000, PPG2100, PPG2200, PPG2300, PPG2400, PPG2500, PPG1600, PPG1700, PPG1800, PPG1900, PPG2000, PPG2100, PPG2200, PPG2300, PPG2400, PPG2500, PPG2600, PPG2700, PPG2800, PPG2900, PPG3000, PPG3100, PPG3200, PPG3300, PPG3400, PPG3500, PPG3600, PPG3700, PPG3800, PPG3900, PPG4000, PPG4100, PPG4200, PPG4300, PPG4400, PPG4500, PPG4600, PPG4700, PPG4800, PPG4900, PPG5000, PPG5100, PPG5200, PPG5300, PPG5400, PPG5500, PPG5600, PPG5700, PPG5800, PPG5900, PPG6000, PPG6100, PPG6200, PPG6300, PPG6400, PPG6500, PPG6600, PPG6700, PPG6800, PPG6900, PPG7000, PPG7100, PPG7200, PPG7300, PPG7400, PPG7500, PPG7600, PPG7700, PPG7800, PPG7900, 또는 PPG8000이다. 일부 측면에서, PPG는 PPG5000이다. 일부 측면에서, PPG는 PPG6000이다. 일부 측면에서, PPG는 PPG4000이다.
일부 측면에서, PPG는 단분산, 예를 들어, mPPG100, mPPG200, mPPG300, mPPG400, mPPG500, mPPG600, mPPG700, mPPG800, mPPG900, mPPG1000, mPPG1100, mPPG1200, mPPG1300, mPPG1400, mPPG1500, mPPG1600, mPPG1700, mPPG1800, mPPG1900, mPPG2000, mPPG2100, mPPG2200, mPPG2300, mPPG2400, mPPG2500, mPPG1600, mPPG1700, mPPG1800, mPPG1900, mPPG2000, mPPG2100, mPPG2200, mPPG2300, mPPG2400, mPPG2500, mPPG2600, mPPG2700, mPPG2800, mPPG2900, mPPG3000, mPPG3100, mPPG3200, mPPG3300, mPPG3400, mPPG3500, mPPG3600, mPPG3700, mPPG3800, mPPG3900, mPPG4000, mPPG4100, mPPG4200, mPPG4300, mPPG4400, mPPG4500, mPPG4600, mPPG4700, mPPG4800, mPPG4900, mPPG5000, mPPG5100, mPPG5200, mPPG5300, mPPG5400, mPPG5500, mPPG5600, mPPG5700, mPPG5800, mPPG5900, mPPG6000, mPPG6100, mPPG6200, mPPG6300, mPPG6400, mPPG6500, mPPG6600, mPPG6700, mPPG6800, mPPG6900, mPPG7000, mPPG7100, mPPG7200, mPPG7300, mPPG7400, mPPG7500, mPPG7600, mPPG7700, mPPG7800, mPPG7900, 또는 mPPG8000이다.
icIEF 샘플 내에서 사용되는 피분석물 (예를 들어, PEG화된 단백질)의 양은 달라질 수 있고, 사용되는 모세관의 크기에 부분적으로 의존한다. 일반적으로, icIEF 모세관은 약 0.1 mg 내지 약 5 mg의 총 단백질로 로딩된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물 (예를 들어, 본 개시내용의 icIEF 샘플 매트릭스 및 PEG화된 단백질을 포함하는 혼합물) 중의 단백질 피분석물의 양은 약 0.1 mg 내지 약 5 mg의 총 단백질, 예를 들어, 약 0.1 mg, 약 0.2 mg, 약 0.3 mg, 약 0.4 mg, 약 0.5 mg, 약 0.6 mg, 약 0.7 mg, 약 0.8 mg, 약 0.9 mg, 약 1 mg, 약 1.5 mg, 약 2 mg, 약 2.5 mg, 약 3 mg, 약 3.5 mg, 약 4 mg, 약 4.5 mg, 또는 약 5 mg이다.
일부 측면에서, PEG화된 단백질은 복수의 전하 변이체를 포함하는 PEG화된 단백질 조성물이다. 따라서, 일부 측면에서, PEG화된 단백질은 주요 또는 우세 종을 포함하는 종의 집단이고, 다른 종은 그들 각각의 전하와 관련하여 우세 종과 상이하다. 따라서, PEG화된 단백질 조성물은 주요 또는 우세 종보다 더 산성인 또는 더 염기성인 전하 변이체 종을 함유할 수 있다.
일부 측면에서, 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질은, 약 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질은, 약 0.25 mg/mL 내지 약 0.75 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질은, 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질은, 약 0.1 mg/mL, 약 0.2 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 약 0.6 mg/mL, 약 0.7 mg/mL, 약 0.8 mg/mL, 약 0.9 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL의 농도로 존재한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 icIEF 샘플 매트릭스를 위한 키트를 제공한다. 일부 측면에서, 키트는 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스를 포함한다. 일부 측면에서, 키트는 양성전해질, 글리신 및/또는 타우린, 및 임의로 본원에 개시된 방법에 따른 사용을 위한 지시를 포함한다. 일부 측면에서, 양성전해질, 글리신 및/또는 타우린은 동일한 바이알 내에 또는 상이한 바이알 내에 존재할 수 있다. 일부 측면에서, 키트는 건조 형태의 하나 이상의 성분 및 재구성을 위한 용매를 포함하는 하나 이상의 바이알을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스 및 PEG화된 단백질을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는, PEG화된 단백질 등의, 수용성 중합체, 예를 들어, PEG를 포함하는 피분석물의 등전점 (pI)을 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 피분석물이 PEG화된 단백질 조성물 등의, 수용성 중합체, 예를 들어, PEG를 함유하는 것인, (i) 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스; 및 (ii) 전하 변이체의 집단을 포함하는 피분석물을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는, 피분석물의 전하 변이체의 집단의 등전점 (pI)을 측정하는 방법이 제공된다.
또한, (i) 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스; 및 (ii) 전하 변이체의 집단을 포함하는 피분석물을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는, 이들 각각의 등전점 (pI)에 따라, PEG화된 단백질 조성물 등의, 수용성 중합체, 예를 들어, PEG를 함유하는 피분석물의 전하 변이체의 집단을 분리하는 방법이 제공된다.
상기에 개시된 바와 같이, 일부 측면에서, 피분석물, 예를 들어, 재조합 단백질의 PEG화 후에 얻어진 PEG화된 단백질 조성물은, 다수의 전하 변이체 종, 예를 들어, 우세 종 (주요 종)에 대하여 더 산성인 또는 더 염기성인 종을 조성물 중에 포함한다. 본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 피분석물 농도 (예를 들어, 다수의 전하 변이체 종을 포함하는 PEG화된 단백질 조성물 중의 총 단백질 농도)는 약 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL이다. 일부 측면에서, 피분석물 농도 (예를 들어, PEG화된 단백질 또는 PEG화된 단백질 조성물)는 약 0.25 mg/mL 내지 약 0.75 mg/mL이다. 일부 측면에서, 피분석물 농도 (예를 들어, PEG화된 단백질 또는 PEG화된 단백질 조성물)는 약 0.1 mg/mL, 약 0.2 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 약 0.6 mg/mL, 약 0.7 mg/mL, 약 0.8 mg/mL, 약 0.9 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL이다. 일부 측면에서, 피분석물은 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는 PEG화된 단백질이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, icIEF는 (i) 담체 양성전해질이 모세관 내에 pH 구배를 형성하도록 미리 정해진 제1 기간 동안 제1 전압을 적용하는 단계; 및 (ii) 변이체의 전체 전하가 중성이 되도록 모세관 내에서 단백질의 전하 변이체의 이동을 포커싱하기 위해 미리 정해진 제2 기간 동안 제2 전압을 적용하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 제1 전압은 약 1 V 내지 약 3000 V이다. 예를 들어, 제1 전압은 약 1 V, 약 100 V, 약 250 V, 약 500 V, 약 750 V, 약 1000 V, 약 1250 V, 약 1500 V, 약 1750 V, 약 2000 V, 약 2250 V, 약 2500 V, 약 2750 V, 또는 약 3000 V일 수 있다. 일부 측면에서, 제1 전압은 약 1 V 내지 약 100 V, 약 100 V 내지 약 200 V, 약 200 V 내지 약 300 V, 약 300 V 내지 약 400 V, 약 400 V 내지 약 500 V, 약 500 V 내지 약 600 V, 약 600 V 내지 약 700 V, 약 700 V 내지 약 800 V, 약 800 V 내지 약 900 V, 약 900 V 내지 약 1000 V, 약 1000 V 내지 약 1100 V, 약 1100 V 내지 약 1200 V, 약 1200 V 내지 약 1300 V, 약 1300 V 내지 약 1400 V, 약 1400 V 내지 약 1500 V, 약 1500 V 내지 약 1600 V, 약 1600 V 내지 약 1700 V, 약 1700 V 내지 약 1800 V, 약 1800 V 내지 약 1900 V, 약 1900 V 내지 약 2000 V, 약 2000 V 내지 약 2100 V, 약 2100 V 내지 약 2200 V, 약 2200 V 내지 약 2300 V, 약 2300 V 내지 약 2400 V, 약 2400 V 내지 약 2500 V, 약 2500 V 내지 약 2600 V, 약 2600 V 내지 약 2700 V, 약 2700 V 내지 약 2800 V, 약 2800 V 내지 약 2900 V, 또는 약 2900 내지 약 3000 V이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 제1 전압은 약 100 V 내지 약 2900 V, 약 200 V 내지 약 2800 V, 약 300 V 내지 약 2700 V, 약 400 V 내지 약 2600 V, 약 500 V 내지 약 2500 V, 약 600 V 내지 약 2400 V, 약 700 V 내지 약 2300 V, 약 800 V 내지 약 2200 V, 약 900 V 내지 약 2100 V, 약 1000 V 내지 약 2000 V, 약 1100 V 내지 약 1900 V, 약 1200 V 내지 약 1800 V, 약 1300 V 내지 약 1700 V, 또는 약 1400 V 내지 약 1600 V이다. 일부 특정 측면에서, 제1 전압은 약 1500 V이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 제2 전압은 약 1 V 내지 약 6000 V이다. 예를 들어, 제2 전압은 약 1 V, 약 100 V, 약 250 V, 약 500 V, 약 750 V, 약 1000 V, 약 1250 V, 약 1500 V, 약 1750 V, 약 2000 V, 약 2250 V, 약 2500 V, 약 2750, 약 3000 V, 약 3250 V, 약 3500 V, 약 3750 V, 약 4000 V, 약 4250 V, 약 4500 V, 약 4750 V, 약 5000 V, 약 5250 V, 약 5500 V, 약 5750 V, 또는 약 6000 V일 수 있다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 제2 전압은 약 1 V 내지 약 100 V, 약 100 V 내지 약 200 V, 약 200 V 내지 약 300 V, 약 300 V 내지 약 400 V, 약 400 V 내지 약 500 V, 약 500 V 내지 약 600 V, 약 600 V 내지 약 700 V, 약 700 V 내지 약 800 V, 약 800 V 내지 약 900 V, 약 900 V 내지 약 1000 V, 약 1000 V 내지 약 1100 V, 약 1100 V 내지 약 1200 V, 약 1200 V 내지 약 1300 V, 약 1300 V 내지 약 1400 V, 약 1400 V 내지 약 1500 V, 약 1500 V 내지 약 1600 V, 약 1600 V 내지 약 1700 V, 약 1700 V 내지 약 1800 V, 약 1800 V 내지 약 1900 V, 약 1900 V 내지 약 2000 V, 약 2000 V 내지 약 2100 V, 약 2100 V 내지 약 2200 V, 약 2200 V 내지 약 2300 V, 약 2300 V 내지 약 2400 V, 약 2400 V 내지 약 2500 V, 약 2500 V 내지 약 2600 V, 약 2600 V 내지 약 2700 V, 약 2700 V 내지 약 2800 V, 약 2800 V 내지 약 2900 V, 약 2900 V 내지 약 3000 V, 약 3100 V 내지 약 3200 V, 약 3200 V 내지 3300 V, 약 3300 V 내지 약 3400 V, 약 3400 V 내지 약 3500 V, 약 3500 V 내지 약 3600 V, 약 3600 V 내지 약 3700 V, 약 3700 V 내지 약 3800 V, 약 3800 V 내지 약 3900 V, 약 3900 V 내지 약 4000 V, 약 4000 V 내지 약 4100 V, 약 4100 V 내지 약 4200 V, 약 4200 V 내지 약 4300 V, 약 4300 V 내지 약 4400 V, 약 4400 V 내지 약 4500 V, 약 4500 V 내지 약 4600 V, 약 4600 V 내지 약 4700 V, 약 4700 V 내지 약 4800 V, 약 4800 V 내지 약 4900, 약 4900 V 내지 약 5000 V, 약 5000 V 내지 약 5100 V, 약 5100 V 내지 5200 V, 약 5200 V 내지 약 5300 V, 약 5300 V 내지 약 5400 V, 약 5400 V 내지 약 5500 V, 약 5500 V 내지 약 5600 V, 약 5600 V 내지 약 5700 V, 약 5700 V 내지 약 5800 V, 약 5800 V 내지 약 5900 V, 또는 약 5900 V 내지 약 6000 V이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 제2 전압은 약 100 V 내지 약 5900 V, 약 200 V 내지 약 5800 V, 약 300 V 내지 5700 V, 약 400 V 내지 약 5600 V, 약 500 V 내지 약 5500 V, 약 600 V 내지 약 5400 V, 약 700 V 내지 약 5300 V, 약 800 V 내지 약 5200 V, 약 900 V 내지 약 5100 V, 약 1000 V 내지 약 5000 V, 약 1100 V 내지 약 4900 V, 약 1200 V 내지 약 4800 V, 약 1300 V 내지 약 4700 V, 약 1400 V 내지 약 4600 V, 약 1500 V 내지 약 4500 V, 약 1600 V 내지 약 4400 V, 약 1700 V 내지 약 4300 V, 약 1800 V 내지 약 4200 V, 약 1900 V 내지 약 4100 V, 약 2000 V 내지 약 4000 V, 약 2100 V 내지 약 3900 V, 약 2200 V 내지 약 3800 V, 약 2300 V 내지 약 3700 V, 약 2400 V 내지 약 3600 V, 약 2500 V 내지 약 3500 V, 약 2600 V 내지 약 3400 V, 약 2700 V 내지 약 3300 V, 약 2800 V 내지 약 3200 V, 또는 약 2900 V 내지 약 3100 V이다. 일부 특정 측면에서, 제2 전압은 약 3000 V이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 미리 정해진 제1 기간은 약 1초 내지 약 5분이다. 예를 들어, 미리 정해진 제1 기간은 약 1초, 약 10초, 약 20초, 약 30초, 약 40초, 약 50초, 약 1분 (60초), 약 1.5분 (90초), 약 2분 (120초), 약 2.5분 (150초), 약 3분 (180초), 약 3.5분 (210초), 약 4분 (240초), 약 4.5분 (270초), 또는 약 5분 (300초)일 수 있다. 본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 미리 정해진 제1 기간은 약 10초 내지 약 20초, 약 20초 내지 약 30초, 약 30초 내지 약 40초, 약 40초 내지 약 50초, 약 50초 약 60초, 약 60초 내지 약 70초, 약 70초 내지 약 80초, 약 80초 내지 약 90초, 약 90초 내지 약 100초, 약 100초 내지 약 110초, 또는 약 110초 내지 약 120초이다. 본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 미리 정해진 제1 기간은 10초 내지 110초, 약 20초 내지 약 100초, 약 30초 내지 약 90초, 약 40초 약 내지 약 80초, 또는 약 50초 내지 약 70초이다. 일부 특정 측면에서, 미리 정해진 제1 기간은 약 60초 (1분)이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 미리 정해진 제2 기간은 약 1분 내지 약 15분이다. 예를 들어, 미리 정해진 제2 기간은 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 6분, 약 7분, 약 8분, 약 9분, 약 10분, 약 11분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 또는 약 15분일 수 있다. 일부 측면에서, 미리 정해진 제2 기간은 약 1분 내지 약 2분, 약 2분 내지 약 3분, 약 3분 내지 약 4분, 약 4분 내지 약 5분, 약 5분 내지 약 6분, 약 6분 내지 약 7분, 약 7분 내지 약 8분, 약 8분 내지 약 9분, 약 9분 내지 약 10분, 약 10분 내지 약 11분, 약 11분 내지 약 12분, 약 12분 내지 약 13분, 약 13분 내지 약 14분, 또는 약 14분 내지 약 15분이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 미리 정해진 제2 기간은 약 2분 내지 약 14분, 약 3분 내지 약 13분, 약 4분 내지 약 12분, 약 5분 내지 약 11분, 약 6분 내지 약 10분, 약 6분 내지 약 9분, 또는 7분 내지 약 9분이다. 본원에 개시된 방법의 일부 구체적 측면에서, 미리 정해진 제2 기간은 약 8분이다.
본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, 제1 전압은 약 1500 V이고, 미리 정해진 제1 기간은 약 1분이다. 일부 측면에서, 제2 전압은 약 3000 V이고, 미리 정해진 제2 기간은 약 8분이다. 본원에 개시된 방법의 일부 측면에서, (i) 제1 전압은 약 1500 V이고, 미리 정해진 제1 기간은 약 1분이고, (ii) 제2 전압은 약 3000 V이고, 미리 정해진 제2 기간은 약 8분이다.
일부 측면에서, icIEF는 대략 10℃에서 수행된다. 일부 측면에서, icIEF는 약 9℃ 내지 약 11℃, 약 8℃ 내지 약 12℃, 약 7℃ 내지 약 13℃, 약 6℃ 내지 약 14℃, 또는 약 5℃ 내지 약 15℃의 온도에서 수행된다. 일부 측면에서, icIEF는 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 또는 약 15℃의 온도에서 수행된다.
본 개시내용은 또한, (i) 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스 및 (ii) 전하 변이체의 집단을 포함하는 피분석물을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는, PEG화된 단백질 조성물 등의, 수용성 중합체, 예를 들어, PEG를 함유하는 피분석물의 전하 변이체의 공동-이동 집단의 분리를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, PEG화된 단백질은 PEG화된 항체이다.
일부 측면에서, 방법은 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스의 사용을 포함하며, 여기서 샘플 매트릭스는 글리신을 포함하지만, 타우린은 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 방법은 글리신 및 또한 타우린을 포함하는 샘플 매트릭스의 사용을 포함하며, 여기서 타우린은 샘플 매트릭스 중의 글리신의 존재에 의해 야기되는 베이스라인 간섭을 감소시킨다. 피분석물의 전하 변이체 (예를 들어, PEG화된 단백질 조성물 중의 PEG화된 단백질의 상이한 전하 변이체)의 공동-이동은 단일의 넓은 피크 또는 낮은 분해능의 여러 피크의 존재로서 전기영동도에서 가시화되며, 즉, 피크가 공동-이동된다. 따라서, 샘플 매트릭스 중의 글리신의 존재는 피크 사이의 분리를 향상시킬 수 있으며, 여기서 각각의 피크는 전하 변이체의 개별 대전된 변이체 또는 부분집단에 상응한다. 따라서, 본 개시내용은, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스 및 피분석물을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하며, 여기서 샘플 매트릭스는 글리신을 포함하는 것인, 피분석물의 전하 변이체 (예를 들어, PEG화된 단백질 조성물 중의 PEG화된 단백질의 상이한 전하 변이체)에 상응하는 공동-이동 피크의 분리를 향상시키는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 글리신은 약 40 mM의 농도, 또는 상기에 개시된 임의의 다른 농도로 샘플 매트릭스 중에 존재한다.
피크 사이의 분리 (즉, 전하 변이체 사이의 분리)의 향상은 정량적으로 또는 정성적으로 결정될 수 있는 icIEF 분해능의 향상이다. 예를 들어, 샘플 매트릭스 중의 글리신의 존재로 인한 icIRF 분해능의 향상은 전기영동도에서 피크의 수 증가 (즉, 관찰된 전하 변이체 종의 수 증가), 전기영동도에서 피크 사이의 분리 증가, 전기영동도에서 피크 사이의 중첩 감소, 또는 임의의 이들의 조합으로서 정량화될 수 있다.
샘플 매트릭스 중의 글리신의 존재로 인한 전기영동도에서 피크 사이의 분리의 향상 또는 일반적으로 icIEF 분해능의 향상은 참조에 대하여 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 참조는 글리신을 갖지 않는 동일한 샘플 매트릭스를 사용하여 얻어진 icIEF 전기영동도이다. 일부 측면에서, 참조는 종래의 샘플 매트릭스, 예를 들어, 글리신 대신에 첨가제로서 우레아를 사용하는 샘플 매트릭스를 사용하여 얻어진 전기영동도이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스 및 PEG화된 단백질을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는, icIEF에서의 PEG화된 단백질의 공동-이동 피크의 분리를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 공동-이동 피크의 분리를 향상시키기 위해 (또는, 일반적으로, icIEF 분해능을 증가시키기 위해) 사용되는 icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 및 글리신 (예를 들어, 약 40 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 메틸 셀룰로스, 및 글리신 (예를 들어, 약 40 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 메틸 셀룰로스, 글리신 (예를 들어, 약 40 mM), 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 약 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 및 약 40 mM 글리신을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 약 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 약 40 mM 글리신 및 약 50 mM 타우린을 포함한다.
본 개시내용은 또한, icIEF 동안 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 icIEF 샘플 매트릭스는 타우린을 포함하는 것인, 매트릭스 유도 베이스라인 간섭을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 간섭은 기본 영역 간섭, 즉, icIEF 전기영동도의 기본 영역에서의 간섭 (예를 들어, 파동 베이스라인)이다. 일부 측면에서, 간섭은 샘플 매트릭스 중의 첨가제의 존재에 의해 야기될 수 있고, 예를 들어, 글리신의 존재에 의해 야기될 수 있다.
일부 측면에서, 베이스라인 간섭의 감소는, 간섭 작용제, 예를 들어, 글리신, 및 타우린을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하여 얻어진 icIEF 전기영동도에서의 베이스라인을, 타우린을 갖지 않는 동일한 샘플 매트릭스 (즉, 간섭 작용제, 예를 들어, 글리신을 포함함) (즉, 참조 샘플 매트릭스)를 포함하는 참조 icIEF 전기영동도에서 관찰된 베이스라인과 비교함으로써 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 타우린을 갖지 않는 참조 샘플 매트릭스는 우레아 함유 매트릭스이다. 일부 측면에서, 참조 샘플 매트릭스는 글리신 및/또는 타우린을 함유하지 않는 샘플 매트릭스이다.
베이스라인 간섭의 감소는 정량적으로 또는 정성적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 베이스라인 간섭의 감소는 베이스라인에서 파동 또는 섭동의 수 감소 또는 이들의 진폭 감소로서 측정될 수 있다. 일반적으로, 베이스라인 간섭의 감소는 베이스라인 선형성의 증가를 제공한다.
일부 측면에서, 매트릭스 유도 베이스라인 간섭을 감소시키기 위해 사용되는 icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 메틸 셀룰로스, 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 메틸 셀룰로스, 글리신 (예를 들어, 약 40 mM), 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 약 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 및 약 50 mM 타우린을 포함한다. 일부 측면에서, icIEF 샘플 매트릭스는 약 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 약 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 약 40 mM 글리신 및 약 50 mM 타우린을 포함한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스, 예를 들어, 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어 약 50 mM)을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는 icIEF에 의해 분리된 피분석물 (예를 들어, PEG화된 단백질 조성물)의 전하 변이체의 정량화의 정확도를 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스, 예를 들어, 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는 icIEF에 의해 분리된 피분석물 (예를 들어, PEG화된 단백질 조성물)의 전하 변이체의 분리의 재현성을 증가시키는 방법이 제공된다. 본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스, 예를 들어, 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는 icIEF에 의해 분리된 피분석물 (예를 들어, PEG화된 단백질 조성물)의 전하 변이체의 회수를 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 피분석물을 열 응력, 그 후, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스, 예를 들어, 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는 icIEF에 의한 피분석물의 전하 변이체 (예를 들어, PEG화된 단백질 상의 단편 또는 폴딩되지 않는 형태에 상응함)의 분리에 적용하는 것을 포함하는, 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질 조성물의 열 안정성을 모니터링하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 열 안정성 또는 그의 부재는 전기영동도에서의 피크의 부재, 존재, 또는 형상, 또는 이들의 조합의 함수로서 측정될 수 있다. 예를 들어, 열 안정성의 손실은 피크의 확장, 주요 피크 면적 감소, 산성 또는 염기성 전하 변이체에 상응하는 피크의 수 또는 면적 증가, 또는 임의의 이들의 조합으로서 가시화될 수 있다. 일부 측면에서, 열 응력은, 예를 들어, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 또는 약 50℃로의 온도 증가를 포함한다. 일부 측면에서, 열 응력은 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 또는 약 10일 동안 적용될 수 있다. 특정 측면에서, 피분석물은 약 40℃의 온도에 약 1주 동안 적용된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은, 본원에 개시된 icIEF 샘플 매트릭스, 예를 들어, 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는 icIEF에 의한 피분석물의 전하 변이체 (예를 들어, PEG화된 단백질 상의 단편 또는 폴딩되지 않는 형태에 상응함)의 분리가 후속되는, 피분석물을 열 응력, 예를 들어, 40℃에서의 인큐베이션에, 예를 들어, 7일 동안 적용하는 것을 포함하는, 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질 조성물의 열 안정성을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은, 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질 조성물의 탈아미드화 생성물, 예를 들어, 아스파라긴 탈아미드화 생성물의 생성, 존재, 또는 부재를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은, 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질 조성물의 분해 생성물, 예를 들어, 탈아미드화 생성물, 예컨대 아스파라긴 탈아미드화 생성물의 수준을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 하기에 대한 최적 조건을 결정하기 위해 사용될 수 있다: 예를 들어, 생성 (예를 들어, 수율, 안정성, 순도, 또는 관심 단백질에 대한 PEG의 컨쥬게이션 동안 분해 생성물의 존재/부재 측정을 위해), 정제 (예를 들어, 수율, 안정성, 순도, 또는 PEG화된 단백질의 정제 동안 분해 생성물 측정을 위해), 제제화 (예를 들어, 안정성, 또는 PEG화된 단백질의 제제화 동안 또는 제제화 후에 분해 생성물의 존재/부재 측정을 위해), 저장 (예를 들어, 안정성, 또는 PEG화된 단백질 또는 조 추출물 또는 부분 정제된 PEG화된 단백질, 정제된 PEG화된 단백질, 또는 제제화된 단백질 등의 이러한 단백질을 포함하는 조성물의 저장 동안 또는 저장 후에 분해 생성물의 존재/부재 측정을 위해), 또는 피분석물, 예를 들어, PEG화된 단백질 조성물의 투여 (예를 들어, 안정성, 또는 대상체에 대한 PEG화된 단백질의 투여 전에 또는 투여 동안 분해 생성물의 존재/부재 측정을 위해).
일부 측면에서, 본원에 개시된 icIEF 방법, 즉, 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어, 약 50 mM)을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스의 사용을 포함하는 방법의 정량화 한계 (LOQ)는 대략 0.028 mg/mL이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 icIEF 방법, 즉, 적어도 하나의 파말라이트® 담체 양성전해질 (예를 들어, 파말라이트® 3-10), 글리신 (예를 들어, 약 40 mM) 및 타우린 (예를 들어 약 50 mM)을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스의 사용을 포함하는 방법의 검출 한계 (LOD)는 대략 0.008 mg/mL이다.
실시예
실시예 1
개선된 icIEF 샘플 매트릭스의 디자인 및 특성화
I. 물질
0.5% 메틸 셀룰로스 용액, 1% 메틸 셀룰로스 용액, iCE 전해질 키트, pI 마커 4.65, pI 마커 6.61, 알코트(Alcott) 720NV 오토-샘플러 및 FC (플루오로카본) 카트리지를 갖는 iCE3 기기를 프로테인심플(ProteinSimple)로부터 구입하였고, FC 카트리지는 50 mm, 100 μm (내경) 플루오로카본-코팅된 모세관 및 내장 전해질 탱크를 가졌다. 우레아 분말 및 포름아미드는 제이.티.베이커(J.T.Baker)로부터 구입하였다. 파말라이트® 3-10, 파말라이트® 4-6.5 및 파말라이트® 5-8은 지이 헬스케어로부터 구입하였다. 글리신 및 타우린은 시그마(Sigma)로부터 구입하였다. 탈이온수는 VWR로부터 구입하였다. 모든 단백질 샘플을 저염 완충제 중에서 배양하고, 정제하고, 제제화하였고, icIEF 검정을 위해 추가의 탈염 단계는 필요하지 않았다.
II. 방법
(a) icIEF 샘플 매트릭스 제조:
하기 최종 농도로 시약들을 배합하여 icIEF 샘플을 제조하였다: 0.35% (w:v, 즉, 중량 대 부피)의 메틸 셀룰로스, 4% (v:v; 즉, 부피 대 부피)의 파말라이트® 3-10, 40 mM의 글리신, 50 mM의 타우린, 0.5% (v:v)의 pI 마커 4.65, 0.5% (v:v)의 pI 마커 6.61. 피분석물 (단백질)을 0.5 mg/mL의 최종 농도로 시약 혼합물 (샘플 매트릭스)에 첨가하였다. 제조된 샘플을 와류 혼합기 상에서 온화하게 혼합하였다.
원심분리를 10℃의 온도로 셋팅하였다. 제조된 샘플을 10,621 rcf로 3분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 160 μL의 제조된 샘플을 300 μL 바이알로 옮겼다. 바이알을 기기 샘플 구획 내에 배치하였다.
(b) iCE3 기기 파라미터:
iCE3 기기를 준비하고, FC 카트리지를 공급업체로부터의 계측 지침에 따라 설치하였다. 사용된 iCE3 기기 파라미터는 하기와 같았다: 프리 포커스 전압: 1500 V; 포커스 전압: 3000 V; 오토-샘플러 온도: 10℃ ± 1℃; 검출: UV 280 nm; 샘플 주입 압력: 2000 mbar; 프리 포커스 시간: 1분; 포커스 시간: 8분.
(c) 소프트웨어: 데이터 획득을 위해 iCE CFR 소프트웨어를 사용하였고, 데이터 분석을 위해 전기영동도를 엠파워(Empower) 소프트웨어로 임포팅하였다.
III. 결과 및 논의:
통상적 icIEF 매트릭스는 PEG화된 단백질 A에 대한 주요 피크로부터 산성 및 염기성 변이체를 분리할 수 없었고, 이는 등전 포커싱에서 하나의 병합된 피크를 생성하였다 (도 1). icIEF 검정에서, 피크는 통상적으로 가장 큰 피크 높이를 나타내는 주요 피크에 대한 이들의 pI 값에 기초하여 그룹화되고; 주요 피크 이전의 피크는 산성 그룹을 나타내고, 이후의 피크는 염기성 그룹을 나타낸다. 주요 피크 및 염기성 피크는 통상적 첨가제 우레아의 존재 하에서도 PEG화된 단백질 A의 등전 포커싱 동안 공동-이동되었다. 산성 피크 또한 주요 피크로부터 거의 분리되지 않았다 (도 1).
본 발명자들은 또 다른 icIEF 상용성 변성제인 포름아미드 (Zhang et al. (2017) Analytical Biochemistry 521:1-7)를 사용하여 실험을 반복하였고, 이는 우레아가 사용되었을 때와 유사한 전하 프로파일을 생성하였다. 보다 높은 농도의 우레아 및 포름아미드를 사용한 반복 실험은 전하 프로파일의 반복성을 악화시켰다 (데이터 나타내지 않음).
보다 좁은 양성전해질, 즉, 좁은 pH 범위를 커버하는 담체 양성전해질은 통상적으로 피크 분해능을 증가시킬 수 있고 (Righetti et al. (2007) Electrophoresis 28:3799-3810) 전하 변이체를 더 잘 분리한다. 보다 좁은 양성전해질을 사용하여 PEG화된 단백질 A 샘플 중에 존재하는 상이한 종을 분리하기 위해 시도한 경우, 약간 우수한 분리가 관찰되었다. 따라서, 보다 좁은 양성전해질 파말라이트® 4-6.5 및 파말라이트® 5-8의 첨가는 분리를 약간 개선시켰지만, 이는 넓은 공동-이동 피크를 분해하기에는 충분하지 않았다 (도 2).
글리신은 PEG화된 단백질의 크기-기반 분리를 향상시킬 수 있는 나트륨 도데실 술페이트 모세관 전기영동 (CE-SDS)에서의 완충제 성분으로서 보고되었다 (Molek & Zydney (2008) Capillary electrophoresis of PEGylated proteins. In AIChE100 - 2008 AIChE Annual Meeting, Conference Proceedings (AIChE Annual Meeting, Conference Proceedings)). 피분석물 크기에 기초한 분리에서, 글리신은 크기 변이체에 상응하는 2개의 이미 잘 분리된 피크: PEG화된 부분 vs. 비-PEG화된 부분의 분해능을 개선시킬 수 있다. 그러나, 임의의 등전 포커싱 방법에서 PEG화된 단백질의 전하 변이체에 대한 공동-이동 피크의 가능한 분리에 관한 이전의 보고는 없었다.
따라서, 본 발명자들은 PEG화된 단백질 A의 이미지화 모세관 등전 포커싱에서 글리신을 사용하였다. 본 발명자들의 실험 결과는, 글리신이 PEG화된 단백질 A의 전하 변이체의 분리를 향상시켰고 (도 3), 주요 피크 및 염기성 피크의 공동-이동이 더 이상 관찰되지 않았음을 보여주었다. 현저히 개선된 분해능을 제공하는 메커니즘은, 쯔비터이온을 사용한 단백질의 분리 크기-기반 모세관 전기영동 동안 관찰되는 것들과 유사한, 단백질 흡착 감소 및 과도한 줄(Joule) 가열 감소에 기인할 수 있다 (Bushey & Jorgenson (1989) Journal of Chromatography A 480:301-310; Bushey & Jorgenson (1989) Journal of Chromatography A 480:301-310).
샘플 매트릭스 중의 글리신의 존재로 인한 분해능 증가 관찰에도 불구하고, icIEF 매트릭스 중의 글리신의 포함은 기본 영역에서의 현저한 베이스라인 파동을 초래하고, 이는 적분 및 정량화를 현저히 방해하였다 (도 3). 따라서, 글리신에 의해 야기되는 부정적 효과를 보상하기 위한 해결을 찾아야 했다.
검정을 추가로 최적화하기 위해 타우린을 도입하였다. 단백질 중에 혼입되지 않는 황-함유 아미노산 중 하나인 타우린은 단백질 제제화를 위한 부형제로서 안전하게 사용될 수 있다 (Arakawa et al. (2007) Amino Acids 33:587-605). 샘플 매트릭스에 대한 타우린의 첨가는 글리신에 의해 야기되는 기본 영역에서의 베이스라인 간섭을 성공적으로 제거하였고 (도 3), 이는 염기성 전하 변이체의 정확한 적분 및 정량화를 가능하게 하였다.
이전에 보고된 몇몇 쯔비터이온과 같이, 글리신은 모세관 표면 상에 동적 코팅을 형성할 수 있고 (Gong & Ho (1997) Electrophoresis 18:732-735), 실험에서 코팅되지 않은 실리카 모세관 대신에 FC 코팅된 모세관을 사용하였다는 사실에도 불구하고, 이는 베이스라인 간섭의 가장 가능성 있는 원인이다. 코팅되지 않은 실리카 모세관 및 예비-코팅된 모세관 둘 다의 사용으로의 동적 코팅이 가능하다 (Nowak et al. (2017) Anal Bioanal. Chem. 409:1493-1501). 본 발명자들의 지시는, 글리신이 FC 코팅된 모세관을 동적으로 코팅하여 베이스라인 간섭을 야기하고, 쯔비터이온으로서의 타우린은 글리신과 경쟁하여 글리신이 모세관 벽에 부착되는 것을 막고 그 결과 샘플 매트릭스 중의 글리신의 존재에 의해 야기되는 매트릭스 유도 베이스라인 간섭을 감소시킬 가능성이 있음을 나타내었다.
타우린의 존재 및 부재 하에서의 전기영동도는 높은 재현성을 갖는 것으로 나타났다. pI 5.86 주위의 작은 염기성 피크는 타우린의 첨가 후 인접한 염기성 피크로 병합되었을 가능성이 가장 높았지만 (도 3), 염기성 그룹의 총 백분율은 매우 유사하게 유지되었다. icIEF 검정은 통상적으로 생성물 품질 제어의 부분으로서 산성, 주요, 및 염기성 그룹의 총 백분율을 모니터링하기 위해 사용되고, 따라서 작은 염기성 피크의 병합은 염기성 그룹의 총 백분율의 정량화에 영향을 주지 않거나 거의 주지 않는다. 다른 한편으로, 타우린의 부재 하에서의 현저한 베이스라인 파동은 염기성 그룹 및 주요 피크에 대한 적어도 10% 변동을 부가하여, 검정 정량화 및 검출 한계를 감소시켰다. 따라서, 베이스라인 파동의 제거는 산성, 주요, 및 염기성 그룹의 정확한 정량화를 보장하였다.
글리신 및 타우린을 방법 개발 동안 적정하여 최적 조건을 확인하였다. 0 mM 내지 200 mM의 일련의 글리신 농도를 시험하였고, 40 mM 글리신은 주요 피크로부터 산성 및 염기성 종을 분리하기에 충분한 분해능을 제공하였다. 추가로, 생성된 전하 프로파일은 단백질 특성화 결과와 일치하였다. 타우린을 0 mM 내지 200 mM에서 적정하였고, 50 mM 타우린이면 베이스라인 파동을 제거하기에 충분하였고, 이는 전체 전하 프로파일에 대해 미미한 영향을 주었다.
새로운 글리신-타우린 (GLY-T) 샘플 매트릭스를 사용하여 PEG화된 단백질 A의 다중 주입 및 다중 샘플 제조에 의해 방법 정밀성을 확인하였고, 전하 프로파일은 도 4의 e-그램 (전기영동도) 오버레이에 의해 입증되는 바와 같이 일관적으로 재현가능하였다.
다중 샘플 제조의 정밀성을 또한 3개 피크 그룹에 대한 백분율 피크 면적의 표준 편차에 의해 평가하였고, 여기서 표준 편차는 산성, 주요 및 염기성 그룹에 대하여 각각 0.3%, 0.5% 및 0.3%였다 (표 1).
표 1: 정밀성 연구에서의 PEG화된 단백질 A에 대한 % 피크 면적의 요약.
Figure pct00004
선형성 및 정확성 연구 뿐만 아니라 기기 오토-샘플러에서의 샘플 안정성 시험을 수행하여 GLY-T 샘플 매트릭스를 사용한 검정 품질을 확인하였다. 선형성은 공칭 농도의 50%, 75%, 100%, 125% 및 150%에서의 PEG화된 단백질 A의 삼중 제조에 의해 확인하였다. 이어서, 피크 면적을 단백질 농도의 선형 함수로서 분석하였다. R2는 모든 선형 곡선에 대해 0.98 초과였고, 모든 선형 곡선에 대한 잔류 플롯은 상당히 무작위 패턴을 나타내었으며, 이는 선형 모델에 대한 우수한 핏을 나타낸다.
블랭크 매트릭스 (제제화 완충제) 중의 PEG화된 단백질 A의 스파이킹에 의해 정확성을 분석하였다. 스파이킹된 샘플을 표적 농도의 50% 내지 150%의 선형 범위에 걸쳐 5개 수준으로 삼중 제조하였다. 이어서 방법의 정확성을 평가하기 위해 퍼센트 회수를 계산하였다. 퍼센트 회수는 산성 그룹, 주요 피크 및 염기성 그룹에 대하여 각각 93.2% 내지 109.9%, 98.0% 내지 101.9%, 및 94.6% 내지 107.3% 내에 있었다 (표 2).
표 2: 정확성 연구에서의 PEG화된 단백질 A에 대한 피크 면적 및 %회수의 요약.
Figure pct00005
선형성 및 정확성 연구 결과는 ICH 지침 (ICH Guideline Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, November 2005)을 준수하였다. 샘플은 기기 오토-샘플러 내에서 24시간 동안 안정적이었고, 0시간 대 24시간에서의 PEG화된 단백질 A의 e-그램 오버레이에서 명백한 변화가 관찰되지 않았다 (도 5).
온도 응력부여된 PEG화된 단백질 A를 사용하여 안정성 연구를 수행하였다. PEG화된 단백질 A를 온화한 열 응력 조건 (40℃에서 1주 동안)에서 처리하였다. 열 응력부여된 샘플은 새로운 GLY-T 샘플 매트릭스 사용시 주요 피크 면적의 감소 및 산성 및 염기성 종의 증가를 나타내었다.
0.002 mg/mL 내지 0.032 mg/mL의 낮은 값의 단백질 농도를 사용하여 선형 회귀에 의해 정량화 한계 (LOQ)를 결정하였다. 실험을 각각의 농도에 대하여 3회 및 3개 주입으로 반복하였다. 이어서 LOQ를 선형 곡선의 기울기에 대한 y 절편의 표준 편차의 10배로서 계산하였다 (Shrivastava & Gupta (2011) Chron. Young Sci. 2:21-25).
검출 한계 (LOD)를 LOD = 3 x LOQ/10의 등식을 사용하여 LOQ로부터 추정하였다 (Shrivastava & Gupta (2011) Chron. Young Sci. 2:21-25). 이어서 새로운 icIEF 검정의 LOQ 및 LOD를 결정하였고, 이는 약 0.028 mg/mL 및 0.008 mg/mL인 것으로 확인되었다.
icIEF 및 GLY-T 샘플 매트릭스를 사용하여 강건성 연구를 수행하였다. 먼저, 본 발명자들은 오토-샘플러 온도 및 포커싱 시간이 새로운 검정의 강건성에 어떻게 영향을 주는지를 평가하였고; 전하 분포는 포커싱 동안 ±0.5 분 및 오토-샘플러에서 ± 1℃ 내에서 대략 일정하였다 (표 3).
표 3: 한번에 하나의 변수 변화로, 중요 파라미터에 변화가 적용되었을 때 PEG화된 단백질 A에 대한 % 피크 면적의 요약. ±1℃ 변화가 공칭 오토 샘플러 온도 (10℃)에 적용되었고; ±0.5분 변화가 공칭 포커싱 시간 (8분)에 적용되었고; ±10% 변화가 파말라이트® (4%), 글리신 (40 mM), 타우린 (50 mM) 및 메틸 셀룰로스 (0.35%)의 공칭 농도에 적용되었다.
Figure pct00006
또 다른 강건성 연구를 수행하여 모든 중요 시약, 예컨대 메틸 셀룰로스, 파말라이트®, 글리신, 및 타우린을 평가하였다. 각각의 시약을 공칭 농도의 90% 및 110%에서 시험하였고, 3개 피크 그룹에 대한 생성된 %피크 면적을 공칭 조건에서의 것들과 비교하였다. 결과는 변화된 및 공칭 조건 사이에서 통상적 기기 오차 범위 내에서 유사하였다 (Salas-Solano et al. (2012) J. Sep. Sci. 35:3124-3129) (표 3).
마지막으로, 최악의 시나리오를 확인하기 위해 중요 시약의 조합 효과를 평가하였다. 연구는 3개의 독립 변수 (파말라이트®의 농도, 글리신의 농도, 및 타우린의 농도) 및 각각의 변수에 대한 2개 수준 (파말라이트®, 글리신, 및 타우린에 대한 공칭 농도의 90% 및 110%)을 포함하였다. 8개 (23 = 8)의 가능한 조합을 삼중으로, 또한 그에 따라 24개 조건을 평가하였다. 결과는, %피크 면적 변화가 최악의 시나리오에서도 매우 미미함을 시사하였다 (표 4).
표 4: 연구에서 다중 변수를 동시에 변화시키며, 중요 파라미터에 변화가 적용되었을 때 PEG화된 단백질 A에 대한 % 피크 면적의 요약. ±10% 변화가 GLY-T 샘플 매트릭스 중의 파말라이트® (4%), 글리신 (40 mM), 및 타우린 (50 mM)의 공칭 농도에 적용되었다.
Figure pct00007
a) "-"의 기호는 "-10%"가 변수의 공칭 농도에 적용됨을 나타내고; "+"의 기호는 "+10%"가 변수의 공칭 농도에 적용됨을 나타낸다.
b) 조합은 표에 나타낸 바와 같이 하기 순서를 사용하여 지정된다: 파말라이트®, 글리신, 타우린; 예를 들어, "-+-"의 조합은 "파말라이트®의 -10%, 글리신의 +10% 및 타우린의 -10%"의 조건을 나타낸다.
JMP 소프트웨어에서 만족성 프로파일링 함수를 사용하여 표 4에서의 결과를 또한 통계적으로 평가하였다. 파말라이트®, 글리신, 및 타우린의 농도는 X 변수였고, 산성, 주요 및 염기성 그룹에 대한 생성된 백분율 피크 면적은 Y 응답이었다. 플롯 매트릭스의 저부 행은 도 6에 예시된 바와 같이 그의 만족성 추적을 나타내는 각각의 X 변수에 대한 플롯을 가졌다. 모든 3개의 X 변수에 대한 전체 만족성 척도는 0 내지 1의 스케일로 표시되었다 (도 6). 소프트웨어는 각각의 응답에 대한 만족성 함수를 특정하였고, 모든 응답에 대한 전체적 만족성은 개개의 응답에 대한 만족성 함수의 기하 평균으로서 정의되었다 (Derringer & Ronald, S. (1980) Journal of Quality Technology 12:214-219). 모든 응답에 대한 전체적 만족성은, 3개의 X 변수 (파말라이트®, 글리신, 및 타우린)가 이들의 공칭 농도에 있을 때 0.997의 거의 완벽한 점수에 도달하였고 (도 6), 이는 GLY-T 샘플 매트릭스 중의 파말라이트®, 글리신 및 타우린의 공칭 농도를 추가로 확인시켜주며, 즉, 4% 파말라이트®, 40 mM 글리신, 및 50 mM 타우린이 최적이었다.
통상적 icIEF 검정 조건을 사용하여 비-PEG화된 단백질 A의 전하 변이체를 분리할 수 있다. 그러나, 통상적으로 사용되는 icIEF 및 샘플 매트릭스 (심지어 우레아 또는 포름아미드 등의 첨가제를 포함함)의 사용은 PEG화 및 이후 정제 공정으로 인한 변화를 포착할 수 없다. 주요 피크 면적의 대략 5.0% 증가가 PEG화된 단백질 A와 비-PEG화된 단백질 A 사이에서 관찰되었다. 따라서, 새로 개발된 GLY-T 샘플 매트릭스는 PEG화된 단백질 A 및 그의 상이한 전하 변이체의 분석 및 PEG화 및 후속 정제 공정 동안 나타난 변화의 포착을 가능하게 하였다.
본 발명자들은 GLY-T 샘플 매트릭스를 사용하여 여러 다른 PEG화된 단백질 및 항체를 추가로 시험하였다. 이들 모두 통상적 우레아 함유 샘플 매트릭스를 GLY-T 샘플 매트릭스로 대체시 더 우수한 분해능을 나타내었다. 예로서, PEG화된 항체 B는, GLY-T 매트릭스 사용시 전하 변이체의 훨씬 더 우수한 분리를 나타내었다 (도 7).
결론적으로, 새로 개발된 GLY-T 샘플 매트릭스는, 반복성, 선형성, 정확성, 샘플 안정성 및 방법 강건성이 달성되면서, PEG화된 단백질의 icIEF 분리를 가능하게 하였다. 그 결과, PEG화 및 정제 공정 동안 이루어진 변화를 포착할 수 없는, PEG화 전의 단백질의 분석과 같은, PEG화된 단백질의 전하 변이체를 분석하기 위한 간접적 방법을 시행할 필요성이 더 이상 존재하지 않는다. 본 발명자들의 관찰은, GLY-T icIEF 샘플 매트릭스가 실제 컨쥬게이션 상태의 PEG화된 단백질의 전하 변이체의 분석에 대한 탁월한 해결을 제공하고, 현재 사용되는 종래의 방법에 비해 PEG화된 단백질의 전하 변이체에 대한 보다 정확한 정량적 및 정성적 정보를 전달함을 보여주었다.
실시예 2
PEG화된 단백질 A 열 분해의 정량화
PEG화된 단백질 A를 40℃에서 7일 동안 인큐베이션을 통해 강제 분해에 적용하였다. PEG화된 단백질 A 및 그의 열 분해 생성물을 상기에 기재된 실험 조건을 사용하여 분리하였다. 샘플 매트릭스는 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 40 mM의 글리신 및 50 mM 타우린을 함유하였다. PEG화된 단백질 A 샘플을 탈이온수 중에 5 mg/mL로 희석하고, 이어서 샘플 매트릭스 중에 0.5 mg/mL로 추가로 희석하였다. 샘플을 1500 V에서 1분 동안, 또한 이어서 3000 V에서 8분 동안 포커싱하였다.
PEG화된 단백질 A의 강제 분해 (도 8)는 주요 피크의 감소, 주요 피크에 비해 보다 산성 (대략 pH 5.26) 및 보다 염기성 (대략 pH 5.54)인 피크의 면적 증가를 제공하였다. 이는, 실험에서 사용된 개선된 icIEF 샘플 매트릭스가 주요 피크에서의 온전한 PEG화된 단백질 A로부터 산성 및 염기성 피크에서의 분해 생성물의 우수한 분리를 제공함을 나타낸다.
산성 피크에서의 분해 단백질을 상기에 기재된 바와 같은 음이온 교환 HPLC (AEX HPLC)에 의해 정제하였다. 수집된 산 피크 단백질을 LC-MS 펩티드 이미지화에 의해 분석하였고, 아스파라긴 탈아미드화된 PEG화된 단백질 A를 샘플에서 주요 분해 생성물로서 식별하였다. 정제된 산성 형태를 사용하여 PEG화된 단백질 A 샘플을 스파이킹하고, 스파이킹된 샘플을 ciIEF에 적용하였다 (도 9). ciIEF는 스파이킹된 샘플에서의 아스파라긴 탈아미드화된 형태의 증가를 검출하였다.
아스파라긴 탈아미드화는 icIEF에서의 산성 피크의 통상적 원인이다. 따라서, 본 개시내용의 icIEF 샘플 매트릭스는, 아스파라긴 탈아미드화 성분이 PEG화된 단백질 A에서 스파이킹되었을 때 산성 피크의 증가를 성공적으로 포착하였다.
따라서, 본 개시내용의 icIEF 매트릭스는 PEG화된 단백질 정제에만 유용한 것이 아니다. 추가로, icIEF 매트릭스는 분해, 예를 들어, 열 분해, 및 분해 생성물, 예를 들어, 아스파라긴 탈아미드화 생성물의 출현을 검출하기 위해 사용되었다. 또한, 아스파라긴 탈아미드화 생성물에 상응하는 피크 면적의 증가, 및 다른 피크에서의 변화 부재는, 개시된 방법이 PEG화된 단백질 분해를 정량화하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
***
요약 및 요약서 섹션이 아닌, 상세한 설명 섹션이 청구범위를 해석하기 위해 사용되도록 의도됨을 인지하여야 한다. 요약 및 요약서 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려되는 본 발명의 모든 예시적 실시양태가 아닌 하나 이상의 예시적 실시양태를 기재할 수 있고, 그에 따라, 어떠한 방식으로든 본 발명 및 첨부된 청구범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
본 발명은 특정된 기능 및 이들의 관계의 실행을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 상기에 기재되었다. 이들 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의상 본원에서 임의적으로 정의되었다. 특정된 기능 및 이들의 관계가 적절히 수행되는 한 대안적 경계가 정의될 수 있다.
구체적 실시양태의 상기 설명은 본 발명의 일반적 성질을 충분히 드러내므로, 다른 이들은, 관련 기술분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써, 과도한 실험 없이, 본 발명의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 이러한 구체적 실시양태를 다양한 응용을 위해 쉽게 변형시키고/거나 적합화할 수 있다. 따라서, 이러한 적합화 및 변형은, 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 실시양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본원의 구문 또는 용어는 제한이 아닌 설명의 목적을 위한 것이며, 그에 따라 본 명세서의 용어 또는 구문은 교시 및 지침에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 해석되어야 함을 이해하여야 한다.
본 발명의 범주 및 범위는 임의의 상기 예시적 실시양태에 의해 제한되어선 안되며, 단지 하기 청구범위 및 그의 등가물에 따라 정의되어야 한다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용 참조문헌 (문헌 참조물, 특허, 특허 출원, 및 웹사이트 포함)은, 그에 인용된 참조문헌과 같이, 임의의 목적상 그 전문이 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.

Claims (39)

  1. 글리신 및/또는 타우린을 포함하는 이미지화 모세관 등전 포커싱 (icIEF) 샘플 매트릭스.
  2. 제1항에 있어서, 글리신이 약 1 mM 내지 약 200 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  3. 제2항에 있어서, 글리신이 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 1 mM 내지 약 70 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 90 mM, 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 200 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 90 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 70 mM, 약 30 mM 내지 약 60 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 40 mM 내지 약 200 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 90 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 70 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  4. 제2항에 있어서, 글리신이 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 또는 약 120 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  5. 제2항에 있어서, 글리신이 약 30 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  6. 제2항에 있어서, 글리신이 약 36 mM 내지 약 44 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  7. 제2항에 있어서, 글리신이 약 40 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 타우린이 약 1 mM 내지 약 200 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  9. 제8항에 있어서, 타우린이 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 90 mM, 약 1 mM 내지 약 80 mM, 약 1 mM 내지 약 70 mM, 약 1 mM 내지 약 60 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 90 mM, 약 10 mM 내지 약 80 mM, 약 10 mM 내지 약 70 mM, 약 10 mM 내지 약 60 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 200 mM, 약 20 mM 내지 약 150 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 90 mM, 약 20 mM 내지 약 80 mM, 약 20 mM 내지 약 70 mM, 약 20 mM 내지 약 60 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 200 mM, 약 30 mM 내지 약 150 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 90 mM, 약 30 mM 내지 약 80 mM, 약 30 mM 내지 약 70 mM, 약 30 mM 내지 약 60 mM, 약 30 mM 내지 약 50 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 약 40 mM 내지 약 200 mM, 약 40 mM 내지 약 150 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 90 mM, 약 40 mM 내지 약 80 mM, 약 40 mM 내지 약 70 mM, 약 40 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  10. 제8항에 있어서, 타우린이 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 또는 약 120 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  11. 제8항에 있어서, 타우린이 약 40 mM 내지 약 60 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  12. 제8항에 있어서, 타우린이 약 45 mM 내지 약 55 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  13. 제8항에 있어서, 타우린이 약 50 mM의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 양성전해질을 추가로 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스.
  15. 제14항에 있어서, 담체 양성전해질이 파말라이트(PHARMALYTE)®인 icIEF 샘플 매트릭스.
  16. 제14항에 있어서, 파말라이트®가 파말라이트® 3-10인 icIEF 샘플 매트릭스.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 양성전해질이 약 2% 내지 약 6% (v:v)의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 양성전해질이 약 3.6% 내지 4.4%의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 양성전해질이 약 4% (v:v)의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸 셀룰로스를 추가로 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스.
  21. 제19항에 있어서, 메틸 셀룰로스가 약 0.35% (w:v)의 농도로 존재하는 것인 icIEF 샘플 매트릭스.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약 40 mM의 글리신 및 약 50 mM 타우린을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 4% (v:v) 파말라이트® 3-10, 0.35% (w:v) 메틸 셀룰로스, 약 40 mM의 글리신 및 약 50 mM 타우린을 포함하는 icIEF 샘플 매트릭스.
  24. icIEF 동안 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는, 매트릭스 유도 베이스라인 간섭을 감소시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 간섭이 기본 영역 간섭인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 베이스라인 간섭이, 타우린이 없는 참조 샘플 매트릭스 사용시 관찰되는 베이스라인 간섭에 비해 감소되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 타우린이 없는 참조 샘플 매트릭스가 우레아 함유 매트릭스인 방법.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 icIEF 샘플 매트릭스 및 PEG화된 단백질을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는, PEG화된 단백질의 등전점 (pI)을 측정하는 방법.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 icIEF 샘플 매트릭스 및 PEG화된 단백질을 포함하는 샘플을 icIEF에 적용하는 것을 포함하는, icIEF에서 PEG화된 단백질의 공동-이동 피크의 분리를 향상시키는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, PEG화된 단백질이 약 0.25 mg/mL 내지 약 0.75 mg/mL의 농도로 존재하는 것인 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화된 단백질이 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는 것인 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, icIEF가 (i) 담체 양성전해질이 모세관 내에 pH 구배를 형성하도록 미리 정해진 제1 기간 동안 제1 전압을 적용하는 단계; 및 (ii) 변이체의 전체 전하가 중성이 되도록 모세관 내에서 단백질의 전하 변이체의 이동을 포커싱하기 위해 미리 정해진 제2 기간 동안 제2 전압을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제1 전압이 약 1500 V이고, 미리 정해진 제1 기간이 약 1 분인 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 제2 전압이 약 3000 V이고, 미리 정해진 제2 기간은 약 8분인 방법.
  35. icIEF 동안 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 icIEF 샘플 매트릭스를 사용하는 것을 포함하는, PEG화된 단백질의 안정성을 결정하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 안정성이 열 안정성인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 열 안정성을 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 또는 50℃에서의 PEG화된 단백질의 인큐베이션 후에 결정하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, PEG화된 단백질을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 안정성의 결정이 정량적인 것인 방법.
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