JP2023522810A - 等電点電気泳動サンプルマトリックス - Google Patents
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Abstract
本開示は、実際のコンジュゲート状態にあるＰＥＧ化タンパク質のｉｃＩＥＦ分析を可能にするｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを提供する。本開示のサンプルマトリックスは、グリシンを含むことができ、これにより、共移動したＰＥＧ化タンパク質電荷変異体の分離が可能になる。サンプルマトリックスにはタウリンを含めることもできる。これにより、マトリックスによるベースライン干渉が減少し、ｉｃＩＥＦアッセイがさらに改善される。したがって、グリシンおよびタウリンの組み合わせを含む本開示のサンプルマトリックスは、ＰＥＧ化タンパク質の主要ピークからの酸性および塩基性種のｉｃＩＥＦ分離を可能にし、別個のＰＥＧ化タンパク質種の同定／分離、特徴付けおよび定量化を可能にする。本開示のサンプルマトリックスを使用して、ｉｃＩＥＦによってＰＥＧ化タンパク質を特徴付けることによって、再現性、直線性、精度、サンプル安定性、および方法のロバスト性が達成される。
Description
本開示は、ＰＥＧ化タンパク質およびペプチドの画像化キャピラリー等電点電気泳動分析の分解能を高めるための組成物および方法を提供する。
ＰＥＧ化（ペグ化）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖がタンパク質または他の分子に結合するプロセスである(Veronese & Mero (2008) BioDrugs 22:315-329)。ＰＥＧ化は、治療用タンパク質の薬物動態特性を高める (Holm et al. (2015) PloS One 10(7): e0133584; Jevsevar et al. (2010) Biotechnol.J.5:113-128; Harris & Chess (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2:214-221)、ならびに免疫原性および毒性を低減する(Nucciら(1991)Advanced Drug Delivery Reviews 6:133-151;Veronese & Pasut(2005)Drug Discov.Today 10:1451-1458) 戦略として使用されている。これらは治療に関連するタンパク質の魅力的な属性である。
ＰＥＧ-タンパク質結合は、化学反応または酵素反応 (Basle et al. (2010) Chemistry & Biology 17:213-227; O'Hare et al. (2007) Current Opinion in Structural Biology 17:488-494) によって、および発現タンパク質ライゲーションなどの半合成法 (Muir (2003) Annual Review of Biochemistry 72:249-289) によって、形成される。あるいは、非天然アミノ酸は、ポリエチレングリコールの結合のための化学ハンドルとして組換えタンパク質に組み込まれている(Liu & Schultz (2010) Annual Review of Biochemistry 79:413-444)。
画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）は、タンパク質の等電点（ｐＩ）および電荷種の相対定量を決定するための現在の業界標準である(Sosic et al. (2008) Electrophoresis 29:4368-4376; Cousteils et al. (2019) Chromatography Today, Feb. 26)。しかし、ＰＥＧ化タンパク質のｉｃＩＥＦ分離は困難である。ＰＥＧ化タンパク質のｉｃＩＥＦ分離では、比較的ブロードで歪んだピーク形状が観察される。ＰＥＧ化タンパク質の電荷変異体は、等電点電気泳動中に１つの広いピークに融合する。これは、囲まれたポリエチレングリコール鎖によるタンパク質のマスキングと、流体力学的体積の増加による可能性が最も高い (Molineux (2002) Cancer Treat Rev. 28:13-16)。例えば、キャリア両性電解質の含有量、メチルセルロース濃度、タンパク質濃度、集束時間、および他の添加剤の追加などの変更では、妥当なピーク形状を得ることができなかった (Li et al. (2007) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43:963-972)。
したがって、ＰＥＧ化タンパク質の電荷変異体の識別を可能にする新しいicIEF方法が必要とされている。
本開示は、グリシンおよび／またはタウリンを含む画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）サンプルマトリックスを提供する。いくつかの局面において、グリシンは、約１ｍＭ～約２００ｍＭの間の濃度である。
ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスのいくつかの局面では、グリシンは、約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度である。
ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスのいくつかの局面では、グリシンは、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、または約１２０ｍＭの濃度である。いくつかの局面において、グリシンは、約３０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度である。いくつかの局面において、グリシンは、約３６ｍＭ～約４４ｍＭの濃度である。いくつかの局面において、グリシンは、約４０ｍＭの濃度である。
ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスのいくつかの側面では、タウリンは１ｍＭ～２００ｍＭの間の濃度である。いくつかの局面では、タウリンは、約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭとｄ約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度である。
ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスのいくつかの局面では、タウリンは、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、または約１２０ｍＭの濃度である。いくつかの局面において、タウリンは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの間の濃度である。いくつかの局面において、タウリンは、約４５ｍＭ～約５５ｍＭの間の濃度である。いくつかの局面において、タウリンは、約５０ｍＭの濃度である。
いくつかの局面において、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、キャリア両性電解質をさらに含む。いくつかの局面では、キャリア両性電解質はＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）である。いくつかの局面において、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）はＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質は、約２％～約６％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面において、キャリア両性電解質は、約３．６％～約４．４％の濃度である。いくつかの局面において、キャリア両性電解質は、約４％（ｖ：ｖ）の濃度である。
いくつかの局面において、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、メチルセルロースをさらに含む。いくつかの局面において、メチルセルロースは、約０．３５％（ｗ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４０ｍＭのグリシンおよび約５０ｍＭのタウリンを含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、約０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、約４０ｍＭのグリシン、および約５０ｍＭのタウリンを含む。
本開示はまた、ｉｃＩＥＦ中に本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを使用することを含む、マトリックス誘導ベースライン干渉を低減する方法を提供する。いくつかの局面では、干渉は基本領域干渉である。いくつかの局面では、ベースライン干渉は、タウリンを含まない参照サンプルマトリックスを使用した場合に観察されるベースライン干渉と比較して減少する。いくつかの局面において、タウリンを含まない参照サンプルマトリックスは、尿素含有マトリックスである。
本開示はまた、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスおよびＰＥＧ化タンパク質を含むサンプルをｉｃＩＥＦに供することを含む、ＰＥＧ化タンパク質の等電点（ｐＩ）を測定する方法を提供する。本開示はまた、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスおよびＰＥＧ化タンパク質を含むサンプルをｉｃＩＥＦに供することを含む、ｉｃＩＥＦ中のＰＥＧ化タンパク質の共移動ピークの分離を高める方法を提供する。いくつかの局面では、ＰＥＧ化タンパク質は、約０．２５ｍｇ／ｍＬ～約０．７５ｍｇ／ｍＬの間の濃度である。いくつかの局面において、ＰＥＧ化タンパク質は、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度である。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、ｉｃＩＥＦは、（ｉ）キャリア両性電解質がキャピラリー内でｐＨ勾配を形成するように、第１の所定の期間、第１の電圧を印加すること、（ｉｉ）変異体の全体の電荷が中性になるように、キャピラリー内のタンパク質の電荷変異体の移動をフォーカス（集中）させるために、第２の所定の期間、第２の電圧を印加する。いくつかの局面では、第１の電圧は約１５００Ｖであり、第１の所定の期間は約１分である。いくつかの局面では、第２の電圧は約３０００Ｖであり、第２の所定の期間は約８分である。
本開示はまた、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを使用することを含む、ＰＥＧ化タンパク質の安定性を決定する方法を提供する。いくつかの局面において、安定性は熱安定性である。いくつかの局面において、熱安定性は、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、または５０℃でのＰＥＧ化タンパク質のインキュベーション後に決定される。いくつかの局面において、ＰＥＧ化タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間インキュベートされる。いくつかの局面において、安定性の決定は定量的である。
図１は、２Ｍ尿素を含むＰＥＧ化タンパク質Ａのエレクトロフェログラムを示している。３０ｋＤａの単一直鎖メトキシポリエチレングリコール鎖は、非天然アミノ酸を介してタンパク質Ａに結合された。サンプルマトリックスには、４％（ｖ：ｖ）ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）メチルセルロース、および２Ｍ尿素が含まれている。ＰＥＧ化タンパク質Ａを脱イオン水で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
図２は、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）４－６．５とＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）５－８の混合物中のＰＥＧ化タンパク質Ａのエレクトロフェログラムオーバーレイを示している。サンプルマトリックスは、２％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）４－６．５および２％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）５－８、および０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロースを含んでいた。ＰＥＧ化タンパク質Ａを脱イオン水で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
図３は、添加剤としてグリシンとタウリンの両方を含むサンプルマトリックスと、唯一の添加剤としてグリシンを含むサンプルマトリックスを比較したＰＥＧ化タンパク質Ａのエレクトロフェログラムオーバーレイを示している。サンプルマトリックスは、４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロースおよび４０ｍＭのグリシン（または４０ｍＭのグリシンおよび５０ｍＭのタウリン）を含んでいた。ＰＥＧ化タンパク質Ａを脱イオン水で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
図４は、添加剤としてグリシンとタウリンを含むサンプルマトリックス中のＰＥＧ化タンパク質Ａのエレクトロフェログラムを示している。サンプルマトリックスは、４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、４０ｍＭのグリシンおよび５０ｍＭのタウリンを含んでいた。ＰＥＧ化タンパク質Ａを脱イオン水で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
図５は、１０℃に設定されたオートサンプラーでの０時間および２４時間でのグリシンおよびタウリンを含むサンプルマトリックス中のＰＥＧ化タンパク質Ａのエレクトロフェログラムを示している。サンプルマトリックスは、４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、４０ｍＭのグリシンおよび５０ｍＭのタウリンを含んでいた。ＰＥＧ化タンパク質Ａを脱イオン水で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
図６は、ＪＭＰの望ましさのプロファイリングプロットを示している。表４に列挙されたＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、グリシン、およびタウリンの濃度はＸ変数であり、酸性、主要、および塩基性基について得られたパーセンテージピーク面積はＹ反応である。
図７は、添加剤として尿素を含むサンプルマトリックスと比較して、添加剤としてグリシンおよびタウリンを含むサンプルマトリックス中のＰＥＧ化抗体Ｂのエレクトロフェログラムを示す。サンプルマトリックスは、４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、４０ｍＭのグリシンおよび５０ｍＭのタウリン（または２Ｍの尿素）を含んでいた。ＰＥＧ化抗体Ｂを脱イオン水で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
図８は、（ｉ）コントロールのＰＥＧ化タンパク質Ａサンプル、および（ｉｉ）４０℃で７日間強制分解したＰＥＧ化タンパク質Ａサンプルのエレクトロフェログラムを示している。サンプルマトリックスは、４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、４０ｍＭのグリシンおよび５０ｍＭのタウリンを含んでいた。ＰＥＧ化タンパク質Ａサンプルを脱イオン水で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルを１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間集束した。
図９は、（ｉ）コントロールＰＥＧ化タンパク質Ａサンプル、および（ｉｉ）アスパラギン脱アミド化ＰＥＧ化タンパク質ＡでスパイクされたＰＥＧ化タンパク質Ａサンプル（図８の約ｐＨ５．２５のピーク）のエレクトロフェログラムをＡＥＸ ＨＰＬＣで収集したものを示している。サンプルマトリックスは、４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、４０ｍＭのグリシンおよび５０ｍＭのタウリンを含んでいた。ＰＥＧ化タンパク質Ａサンプルを脱イオン水で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
ＰＥＧ化は、製薬業界で治療用タンパク質の薬物動態特性を高めるための戦略として使用されてきた。画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）は、タンパク質および抗体の等電点（ｐＩ）測定および電荷変異体の定量化のための現在の業界標準技術である。ただし、ＰＥＧ化タンパク質の電荷変異体に対応する個別のピークを解決することは依然として困難である。本開示は、ＰＥＧ化タンパク質における電荷変異体の分離を有意に改善する添加剤グリシンおよびタウリンの組み合わせを含むサンプルの新規マトリックス処方を提供する。その結果、ＰＥＧ化前のタンパク質の等電点収束を行う必要がなくなり、ＰＥＧ化および精製工程による変化が反映されなくなった。したがって、本明細書に開示されるサンプルマトリックスは、実際の結合状態にあるＰＥＧ化タンパク質のｉｃＩＥＦ分析を可能にする。
本開示のサンプルマトリックスは、グリシンを含むことができ、これにより、共移動したＰＥＧ化タンパク質電荷変異体の分離が可能になる。サンプルマトリックスには、タンパク質製剤で一般的に使用される非必須アミノ酸であるタウリンも含まれる場合があり (Brosnan & Brosnan (2006) J Nutr. 136:1636-1640; Amino Acids: Chemistry, Biology and Medicine.Lubec & Rosenthal編。Springer Science & Business Media, 2012)、これはマトリックスによるベースライン干渉を少なくすることにより、ｉｃＩＥＦアッセイをさらに改善する。したがって、グリシンおよびタウリンの組み合わせを含む本開示のサンプルマトリックスは、ＰＥＧ化タンパク質の主要ピークからの酸性および塩基性種のｉｃＩＥＦ分離を可能にし、別個のＰＥＧ化タンパク質種の同定／分離、特徴付けおよび定量化を可能にする。本開示のサンプルマトリックスを使用して、ｉｃＩＥＦによってＰＥＧ化タンパク質を特徴付けることによって、再現性、直線性、精度、サンプル安定性、および方法のロバスト性が達成される。
本開示をより詳細に説明する前に、本開示は、記載された特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、もちろん変化し得ることを理解されたい。この開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載され図示された個々の局面のそれぞれは、逸脱することなく他のいくつかの局面のいずれかの特徴から容易に分離または組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。本開示の範囲または精神から。列挙された任意の方法は、列挙されたイベントの順序で、または論理的に可能な他の順序で実行できる。
本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって定義できる本開示のさまざまな局面を限定するものではない。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は特定の局面のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。
＜用語＞
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用されるように、本明細書で明示的に別段の定めがある場合を除き、以下の用語のそれぞれは、以下に示す意味を有するものとする。追加の定義は、本出願全体に記載されている。
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用されるように、本明細書で明示的に別段の定めがある場合を除き、以下の用語のそれぞれは、以下に示す意味を有するものとする。追加の定義は、本出願全体に記載されている。
本開示は、グループの正確に１人のメンバーが所与の製品またはプロセスに存在する、使用される、またはそうでなければ関連する局面を含む。本開示は、複数の、またはすべてのグループメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、使用される、またはそうでなければ関連する局面を含む。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示で使用される多くの用語の一般辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ （ＳＩ）で承認された形式で示される。数値範囲には、範囲を定義する数値が含まれる。本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって得られる本開示のさまざまな局面の限定ではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。「１つの」（または「１つの」）という用語、ならびに「１つまたは複数」および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では交換可能に使用できる。特定の局面において、用語「ａ」または「ａｎ」は「単一」を意味する。いくつかの局面において、用語「ａ」または「ａｎ」は、「２つ以上」または「複数」を含む。例えば、キャリア両性電解質への言及は、単一キャリア両性電解質混合物またはそれらの組み合わせを包含する。
本明細書で使用される「約」という用語は、値または組成がどのように測定されるかに部分的に依存する、当業者によって決定される特定の値または組成の許容誤差範囲内にある値または組成に対して使用されるまたは測定システムの制限を決定する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例により、１または１を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は最大２０％の範囲を意味する場合がある。
出願および特許請求の範囲で特定の値または組成が提供される場合、特に明記しない限り、「約」の意味は、その特定の値または組成の許容誤差範囲内であると想定されるべきである。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、記載された数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を修正する。したがって、「約１０－２０」は「約１０～約２０」を意味する。一般に、「約」という用語は、記載された値の上下の数値を、例えば１０パーセントの変動で上または下（より高いまたはより低い）に修正できる。
「および／または」は、本明細書で使用される場合、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示として解釈されるべきであり、他のものを伴うまたは伴わない。したがって、本明細書の「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、以下の側面のそれぞれを包含することを意図している。Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡとＣ；ＡとＢ；ＢとＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
本明細書で使用される「およそ」という用語は、１つまたは複数の対象値に適用される場合、記載された参照値に類似する値を指す。特定の局面では、「およそ」という用語は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の値の範囲を指す別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）。
局面が本明細書で「含む」という言葉で記載されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」において記載される類似の局面も提供されることを理解されたい。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは修飾アミノ酸を含むことができる。この用語はまた、自然にまたは介入によって改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などの他の操作または修飾が挙げられる。また、定義内には、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体を含むポリペプチド（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、およびクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む）も含まれる。当技術分野で知られている他の変更として。本開示の特定の局面では、ポリペプチドはＰＥＧ化ポリペプチドである。
本明細書で使用される用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、断片および他の同等物、変異体、および前述のものの類似体が含まれる。ポリペプチドは、単一のポリペプチドであってもよいし、二量体、三量体または四量体などの多分子複合体であってもよい。それらはまた、単鎖または多重鎖ポリペプチドを含むことができる。最も一般的なジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用できる。いくつかの局面において、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
本開示の特定の局面では、ポリペプチドは、例えば血漿半減期などのポリペプチド特性を増強できる水溶性ポリマーを組み込むために、例えば化学的に誘導体化されている。いくつかの局面において、ポリペプチドはＰＥＧ化されている、すなわち、ポリペプチド鎖に共有結合された少なくとも１つのＰＥＧを含む。
本明細書に記載されているように、特に断りのない限り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術によって産生されたポリペプチドまたはタンパク質を指す。遺伝子操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で発現される組み換えにより産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組み換えポリペプチドと同様に、本開示の目的のために単離されたとみなされる。本開示のいくつかの局面において、組換えポリペプチドは抗体であり得る。本明細書に開示される抗体、例えば「抗体Ｂ」は、当技術分野で知られている方法を使用して組み換えにより生成できる。本明細書に開示されるタンパク質（例えば、「タンパク質Ａ」または「抗体Ｂ」）は、化学的に合成することもできる。
＜ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスと使用方法＞
本開示は、高分子親水性部分で誘導体化されたタンパク質またはペプチド、例えば、ＰＥＧ化タンパク質、の主ピークから酸性種および塩基性種を効果的に分離できる、等電点電気泳動、例えば、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）または撮像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）のためのサンプルマトリックスを提供する。
本開示は、高分子親水性部分で誘導体化されたタンパク質またはペプチド、例えば、ＰＥＧ化タンパク質、の主ピークから酸性種および塩基性種を効果的に分離できる、等電点電気泳動、例えば、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）または撮像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）のためのサンプルマトリックスを提供する。
等電点電気泳動は、分子の等電点（ｐＩ）、つまり正味ゼロ電荷を持つｐＨの違いによって分子を分離するための技術である。ｉｃＩＥＦは、両性電解質（両性電解質）溶液を使用して、分離電圧が印加される分離チャネル（つまり、正電極と負電極を接続する流体チャネル、たとえばキャピラリー）内にｐＨ勾配を生成することを伴う。負に帯電した分子は媒体中のｐＨ勾配を通って正の電極に向かって移動し、正に帯電した分子は負の電極に向かって移動する。等電点（ｐＩ）より低いｐＨ領域にある検体（例えば、タンパク質またはその他の分子）は正に帯電し、カソード（すなわち、負に帯電した電極）に向かって移動する。タンパク質全体の正味の電荷は、ｐＩに対応するｐＨ領域に到達するまで（例えば、カルボキシル基またはその他の負に帯電した官能基のプロトン化により）ｐＨが上昇する勾配を移動するにつれて減少する。そのポイントには正味の電荷がないため、移動は停止する。逆に、等電点（ｐＩ）を超えるｐＨ領域にある検体は負に帯電し、陽極（正に帯電した電極）に向かって移動する。その結果、分析対象物（例えば、タンパク質）の混合物は、酸性および塩基性アミノ酸残基、ＮおよびＣ末端電荷、または分析対象物に結合した異種部分に存在するその他の電荷（例えば、ＰＥＧ化タンパク質中のＰＥＧ）に原因して相対電荷含量に基づいて分離する。ｉｃＩＥＦランの最後に、分析物中の異なる種は、そのｐＩに対応するｐＨ勾配のポイントに配置された各分析物種（例えば、ＰＥＧ化タンパク質の電荷変異体）とともにシャープな固定バンドにフォーカスする。この技術は、非常に高い解像度を提供できる。つまり、単一の電荷が異なるタンパク質を区別でき、これらは別々のバンドに分画される。ｃＩＥＦはゲルＩＥＦよりもはるかに高速であるが、ピークがプッシュされている間に分離の分解能が損なわれる可能性がある。画像化ｃＩＥＦ（ｉｃＩＥＦ）装置およびカートリッジは、ｃＩＥＦプロセスをリアルタイムで画像化できる全列画像検出（ＷＣＩＤ）技術を採用している。このように、ｉｃＩＥＦ分離は移動を必要としないので、単一点検出を使用する従来のｃＩＥＦと比較すると、サンプル分析はより高速で正確である。ｃＩＥＦを実施するための一般的な方法は、例えば、by Kilar, F., "Isoelectric Focusing in Capillaries," in CRC Handbook on Capillary Electrophoresis: A Practical Approach, CRC Press, Inc., chapter 4, pp. 95-109 (1994); and Schwartz, H., and T. Pritchett, "Separation of Proteins and Peptides by Capillary Electrophoresis: Application to Analytical Biotechnology," Part No. 266923 (Beckman-Coulter, Fullerton, Calif., 1994); Wehr, T., Rodriquez-Diaz, R., and Zhu, M., "Capillary Electrophoresis of Proteins," (Marcel Dekker, NY, 1999) に記載されており、これらを全体において参照として本明細書に組み込む。
本開示は、グリシンおよび／またはタウリンを含む画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）サンプルマトリックスを提供する。本明細書で使用される場合、「ｉｃＩＥＦサンプルマトリックス」および「サンプルマトリックス」という用語は、混合物をｉｃＩＥＦに供する前に分析物（例えば、ＰＥＧ化タンパク質）と混合できる試薬の組み合わせを指すために交換可能に使用される。ｉｃＩＥＦのサンプルマトリックスには、両性電解質と１つまたは複数の添加剤が含まれる。例えば、サンプルマトリックスは、電解質、例えばメチルセルロースまたはグリセロールの粘度を増加させることにより、電気浸透流を減少させ、より良好なタンパク質可溶化を可能にし、流体チャネルのキャピラリー内の拡散を制限する添加剤を含むことができる。サンプルマトリックスは、タンパク質凝集を減らし、サンプルマトリックス中のタンパク質を可溶化し、したがって、尿素、ホルムアミド、またはスクロースなどのアッセイの再現性を改善するための安定化添加剤も含むことができる。さらに、サンプルマトリックスはｐＩ参照標準を含むことができる。
いくつかの局面では、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約１ｍＭ～約２００ｍＭの間の濃度でグリシンを含有する。いくつかの局面では、グリシンは、約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭとｄ約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度である。
ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスのいくつかの局面では、グリシンは、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、または約１２０ｍＭの濃度である。いくつかの局面において、グリシンは、約３０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度である。いくつかの局面において、グリシンは、約３６ｍＭ～約４４ｍＭの濃度である。いくつかの局面において、グリシンは、約４０ｍＭの濃度である。一般に、グリシンの濃度は、例えば、使用する器具の特定の特性、使用するキャピラリーのタイプ、または使用するタンパク質サンプルに応じて、タンパク質電荷変異体間、例えば異なるＰＥＧ化タンパク質電荷間の最適な分離を達成するために調整できる。
ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスのいくつかの局面において、タウリンは、約１ｍＭ～約２００ｍＭの間の濃度である。いくつかの局面では、タウリンは、約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度である。
ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスのいくつかの局面では、タウリンは、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、または約１２０ｍＭの濃度である。いくつかの局面において、タウリンは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの間の濃度である。いくつかの局面において、タウリンは、約４５ｍＭ～約５５ｍＭの間の濃度である。いくつかの局面において、タウリンは、約５０ｍＭの濃度である。一般に、タウリンの濃度は、サンプルマトリックスに誘発されるベースライン干渉、例えばサンプルマトリックス中のグリシンの存在によるベースライン干渉を最適に除去または低減するために、例えば使用する装置の特定の特性、使用するキャピラリーの種類、またはタンパク質サンプルの使用に応じて調整することができる。
いくつかの局面において、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、グリシンおよびタウリンの両方を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、（ｉ）約１ｍＭ～約２００ｍＭの間の濃度のグリシン、および（ｉｉ）約１ｍＭ～約２００ｍＭの間の濃度のタウリンを含む。
いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、
（ｉ）約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度のグリシン、および
（ｉｉ）約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭの間の濃度で、ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度のタウリンを含む。
（ｉ）約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度のグリシン、および
（ｉｉ）約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭの間の濃度で、ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度のタウリンを含む。
いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、（ｉ）約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約３０ｍＭ、５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、または約１２０ｍＭの濃度のグリシン、および（ｉｉ）約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、または約１２０ｍＭの濃度のタウリンを含む。
いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、（ｉ）約３０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度のグリシン、および（ｉｉ）約４０ｍＭ～約６０ｍＭの間の濃度のタウリンを含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、（ｉ）約３６ｍＭ～約４４ｍＭの濃度のグリシン、および（ｉｉ）約４５ｍＭ～約５５ｍＭの濃度のタウリンを含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、（ｉ）約４０ｍＭの濃度のグリシン、および（ｉｉ）約５０ｍＭの濃度のタウリンを含む。
いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、（ｉ）タンパク質電荷変異体、例えばＰＥＧ化タンパク質電荷変異体間の最適な分離を達成できるグリシンの濃度、および（ｉｉ）サンプルの最適な枯渇または減少を達成できるタウリンの濃度を含む。マトリックスによって引き起こされるベースライン干渉、たとえば、サンプルマトリックス中のグリシンの存在によるベースライン干渉。
いくつかの局面において、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、キャリア両性電解質をさらに含む。「キャリア両性電解質」および「両性電解質」という用語は互換的に使用され、酸性基と塩基性基の両方を含み、特定の範囲のｐＨ値で主に両性イオンとして存在する両性分子を指す。両性電解質は、ｉｃＩＥＦなどの等電点電気泳動法で使用する安定したｐＨ勾配を確立するために使用される。電場が印加されると、キャリア両性電解質は、陽極から陰極に向かって直線的に増加する滑らかなｐＨ勾配に分割される。平均電荷がゼロになるｐＨは、分子の等電点（ｐＩ）として知られている。いくつかの局面では、キャリア両性電解質は、近接したｐＩ値および良好な緩衝能を有する複数の脂肪族アミノ基およびカルボキシレート基を含有する小分子（例えば、約３００～１，０００Ｄａ）の混合物を含む。いくつかの局面では、両性電解質は、ｐＨ単位当たりの高い緩衝能力、直線的なｐＨ勾配、および両性電解質を横切る伝導性さえも有する。
多数の市販の両性電解質溶液を含む、多数の異なる両性電解質を利用して、ｐＨ勾配を生成できる。両性電解質の選択と両性電解質勾配の幅は、ｉｃＩＥＦによって達成される解像度に影響を与える可能性がある。たとえば、狭い両性電解質グラジエント（勾配）は、分離における理論段数を増加させ、狭いｐＩ範囲での高分解能分離に有益である。
当業者に知られている様々な両性電解質のいずれも、リン酸／水酸化ナトリウム、グルタミン酸／リジン、ギ酸／ジメチルアミン、または市販のキャリア両性電解質の混合物を含む（しかし、これらに限定されない）開示された組成物および方法で使用できる。
市販のキャリア両性電解質の４つのファミリーが一般にｉｃＩＥＦで使用されている：ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）（GE Healthcare, Pittsburgh, PA），ＢＩＯ－ＬＹＴＥ（登録商標）（BioRad, Hercules, CA），ＳＥＲＶＡＬＹＴＥ（登録商標）（Biophoretics, Reno, NV）およびＡＭＰＨＯＬＩＮＥ（登録商標）（GE Healthcare, Pittsburgh, PA）。いくつかの局面では、本開示のｉｃＩＥＦサンプルマトリックスで使用される両性電解質は、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、ＢＩＯＬＹＴＥ（登録商標）、ＳＥＲＶＡＬＹＴ（登録商標）、ＡＭＰＨＯＬＩＮＥ（登録商標）、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの局面において、キャリア両性電解質は、広いｐＨ範囲のキャリア両性電解質である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質は狭いｐＨ範囲のキャリア両性電解質である。
ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質は、広いｐＨ範囲内（例えば、約ｐＨ３～約ｐＨ１０まで）、および／または狭いｐＨ範囲内（例えば、約２．５～約５の間、約４～約６．５の間、約５～約８の間、約８～約１０．５の間、約４．２～約４．９の間、約４．５～約５．４の間、約５～約６の間、または約６．７～約７．７の間）で実施されるｉｃＩＥＦに使用される。
現在のほとんどすべてのｃＩＥＦ検出は、２８０ｎｍでのＵＶ検出を使用して行われている。ｃＩＥＦでは、オンラインＵＶ検出が一般的に使用される。ｉｃＩＥＦでは、ＣＣＤカメラを使用してリアルタイムのモニタリングが行われる。ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質は、バックグラウンドＵＶ吸収が低いキャリア両性電解質を使用することが望ましい場合に特に使用される。ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質は、ｐＨ勾配全体にわたってバックグラウンドＵＶ吸収が低いからである。
ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質の商品名は、対象となるｐＨ範囲を示している。例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－５キャリア両性電解質は、３～５のｐＨ範囲をカバーする。いくつかの局面では、キャリア両性電解質は、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－４、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－５、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－６、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－７、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－８、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）４－７、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）４－８、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）５－８、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）５－９、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）５－１０、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）６－８、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）６－９、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）６－１０、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）７－９、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）７－１０、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）８－１０、またはそれらの任意の組み合わせである。
ＢＩＯＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質は、広いｐＨ範囲の分離（例えば、約３．５～約９．５の間）および狭いｐＨ範囲の分離（例えば、約３～約５の間、約４～約６の間、約５～約７の間、約５～約８の間、約６～約８の間、約７～約９の間、または約８～約１０の間）にも使用できる。
また、ＳＥＲＶＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質は、広いｐＨ範囲の分離（例えば、約２～約９の間；約２～約１１の間；約３～約７の間；約３～約１０の間；約４～約９の間；または約５～約９の間）および狭いｐＨ範囲の分離（例えば、約２～約４の間；約３～約４の間；約３～約５の間；約３～約６の間；約４～約５の間；約４～約６の間；約４～約７の間；約５～約６の間；約５～約７の間；約５～約８の間；約６～約７の間；約６～約８の間；約６～約９の間；約７～約９の間；または約９～約１１の間）にも使用できる。
いくつかの局面では、キャリア両性電解質は、１つ以上のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、１つ以上のＢＩＯＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質、１つ以上のＳＥＲＶＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの局面では、キャリア両性電解質の組み合わせは、広い範囲にわたるカバレッジ（適用範囲）を提供する相補的な範囲、例えば、ｐＨ２～ｐＨ４をカバーするキャリア両性電解質、ｐＨ４～ｐＨ８をカバーする第２のキャリア両性電解質、およびｐＨ８～ｐＨ１１をカバーする第３のキャリア両性電解質を含むことができる。いくつかの局面において、キャリア両性電解質の組み合わせは、狭いｐＨ範囲または範囲内で、特に高い分解能を提供するように設計でき、例えば、８～９の間のｐＩを有する電荷種を特に分解するように選択された混合物は、ｐＨ２～ｐＨ８をカバーする第１のキャリア両性電解質、およびｐＨ８～ｐＨ９までをカバーする第２のキャリア両性電解質を含むことができる。
当業者は、特定のキャリア両性電解質の選択が、分析物の電荷、および例えばゲルＩＥＦを使用して得られた予備データによって決定できることを理解するであろう。したがって、例えば任意のＩＥＦ技術を使用して決定され、続いて特定のＰＥＧで誘導体化された約６のｐＩを有するタンパク質は、ｉｃＩＥＦ、およびタンパク質の非誘導体化形態のｐＨを包含するｐＨ範囲をカバーするキャリア両性電解質、例えばＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）４－８を使用して分析できる。
いくつかの特定の局面では、本明細書に開示されるサンプルマトリックスは、広いｐＨ範囲をカバーするキャリア両性電解質を含むことができ、これは、高度に酸性または高度に塩基性の検体（例えば、高度に酸性または高度に塩基性のタンパク質）を含むものを除いて、ほとんどの分離に適している。したがって、いくつかの局面では、本開示のサンプルマトリックスは、例えば、ｐＨ２～ｐＨ１１（例えば、ＳＥＲＶＡＬＹＴＥ（登録商標）２－１１）またはｐＨ３～ｐＨ１０（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）をカバーする広いｐＨ範囲のキャリア両性電解質を含む。特定の局面では、広いｐＨ範囲のキャリア両性電解質はＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質である。より特定の局面では、広ｐＨ範囲キャリア両性電解質はＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０である。
いくつかの局面では、キャリア両性電解質（またはその組み合わせ）は、約１％（ｖ：ｖ）～約１０％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質（またはその組み合わせ）は、１％（ｖ：ｖ）～約２％（ｖ：ｖ）の間、約２％（ｖ：ｖ）～約３％（ｖ：ｖ）の間、約３％（ｖ：ｖ）～約４％（ｖ：ｖ）の間、約４％（ｖ：ｖ）～約５％（ｖ：ｖ）の間、約５％（ｖ：ｖ）の間～約６％（ｖ：ｖ）、約６％（ｖ：ｖ）～約７％（ｖ：ｖ）の間、約７％（ｖ：ｖ）～約８％（ｖ：ｖ）の間、約６％（ｖ：ｖ）の間、８％（ｖ：ｖ）～約９％（ｖ：ｖ）、または約９％（ｖ：ｖ）～約１０％（ｖ：ｖ）の間の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質（またはその組み合わせ）は、約２％（ｖ：ｖ）～約９％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質（またはその組み合わせ）は、約３％（ｖ：ｖ）～約８％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質（またはその組み合わせ）は、約２％（ｖ：ｖ）～約７％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質（またはその組み合わせ）は、約３％（ｖ：ｖ）～約６％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質（またはその組み合わせ）は、約２％（ｖ：ｖ）～約５％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質（またはその組み合わせ）は、約３％（ｖ：ｖ）～約５％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質は、約１％（ｖ：ｖ）、約２％（ｖ：ｖ）、約３％（ｖ：ｖ）、約４％（ｖ：ｖ）、約５％（ｖ：ｖ）、約６％（ｖ：ｖ）、約７％（ｖ：ｖ）、約８％（ｖ：ｖ）、約９％（ｖ：ｖ）、または約１０％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質は、約３．６％（ｖ：ｖ）～４．４％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、キャリア両性電解質は、約３．６％（ｖ：ｖ）、約３．７％（ｖ：ｖ）、約３．８％（ｖ：ｖ）、約３．９％（ｖ：ｖ）、約４％（ｖ：ｖ）、約４．１％（ｖ：ｖ）、約４．２％（ｖ：ｖ）、約４．３％（ｖ：ｖ）、または約４．４％（ｖ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面において、キャリア両性電解質は、約４％（ｖ：ｖ）の濃度である。
いくつかの局面において、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、その粘度を増加させる化合物、例えば、メチルセルロースまたはその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）をさらに含む。必要に応じて、サンプルマトリックス中のメチルセルロースなどの増粘化合物の使用は、キャピラリーコーティング、例えば、ｉｃＩＥＦキャピラリーの表面上のアクリルアミド誘導体コーティングの使用によって回避できる。
いくつかの局面では、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、メチルセルロースを約０．０１％（ｗ：ｖ）～約１％（ｗ：ｖ）の濃度で含む。いくつかの局面では、メチルセルロースは、約０．０１％（ｗ：ｖ）、約０．０５％（ｗ：ｖ）、約０．１％（ｗ：ｖ）、約０．１５％（ｗ：ｖ）、約０．２％（ｗ：ｖ）、約０．２５％（ｗ：ｖ）、約０．３％（ｗ：ｖ）、約０．３５％（ｗ：ｖ）、約０．４％（ｗ：ｖ）、約０．４５％（ｗ：ｖ）、約０．５％（ｗ：ｖ）、約０．６％（ｗ：ｖ）、約０．７％（ｗ：ｖ）、約０．８％（ｗ：ｖ）、約０．９％（ｗ：ｖ）または約１％（ｗ：ｖ）の濃度である。いくつかの局面では、メチルセルロースは、約０．０１（ｗ：ｖ）～約０．１％（ｗ：ｖ）の間、約０．１％（ｗ：ｖ）～約０．２％（ｗ：ｖ）の間、約０．２％（ｗ：ｖ）～約０．３％（ｗ：ｖ）の間、約０．３％（ｗ：ｖ）～約０．４％（ｗ：ｖ）の間、約０．４％（ｗ：ｖ）～約０．５％（ｗ：ｖ）の間、約０．５％（ｗ：ｖ）～約０．６％（ｗ：ｖ）の間、約０．６％（ｗ：ｖ）～約０．７％（ｗ：ｖ）の間、約０．７％（ｗ：ｖ）の間）～約０．８％（ｗ：ｖ）の間、約０．８％（ｗ：ｖ）～約０．９％（ｗ：ｖ）の間、または約０．９％（ｗ：ｖ）～約１％（ｗ：ｖ）の間の濃度である。いくつかの特定の局面において、メチルセルロースは、約０．３５％（ｗ：ｖ）の濃度である。
いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、およびグリシン（例えば、約４０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、メチルセルロース、およびグリシン（例えば、約４０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、メチルセルロース、およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、メチルセルロース、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）、およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。
いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、約０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、および約４０ｍＭのグリシンを含む。いくつかの局面において、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、約０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、および約５０ｍＭのタウリンを含む。いくつかの局面において、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、約０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、約４０ｍＭのグリシンおよび約５０ｍＭのタウリンを含む。
いくつかの局面において、本開示のｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、分離の性能を評価するために、１つまたは複数の既知のｐＩ標準でスパイクできる。したがって、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスのいずれも、一連のｐＩ標準を含むことができる。適切な画像化技術を使用して視覚化できるという条件で、分離された分析物ピークの等電点を計算するための開示された方法および装置において、当技術分野で知られている様々なｐＩ標準のいずれも使用できる。一般に、ｉｃＩＥＦアプリケーションで使用されるｐＩマーカーには、タンパク質ｐＩマーカーと合成小分子ｐＩマーカーの２種類がある。タンパク質ｐＩマーカーは、一般的に受け入れられているｐＩ値を持つ特定のタンパク質に基づいている。それらは一般に、厳しい保管条件の採用を必要とし、安定性が低く、ＣＩＥＦに複数のピークが生じる可能性がある。合成小分子（酵素分離に使用できるように非ペプチド分子が望ましい）は、一般に保存中により安定しており、ｉｃＩＥＦの単一ピークにフォーカスする。様々なタンパク質ｐＩマーカーまたは合成小分子ｐＩマーカーが入手可能であり、例えば、Advanced Electrophoresis Solutions,Ltd.(Cambridge,Ontario,Canada)から入手可能な小分子ｐＩマーカーがある。
いくつかの局面において、ｉｃＩＥＦは、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスおよび分析物（または２つ以上の分析物）を含む混合物に対して行われる。いくつかの局面において、分析物は、タンパク質、ペプチド、または水溶性ポリマー部分、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセロール（ＰＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミン－、ヒドロキシ－、チオール－、カルボン酸、カルボン酸アミド、スルホン酸またはスルホンアミド官能基置換基群から独立して選択される官能基を含むＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０アルキル基、またはヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ビニルアルコール（ＶＡ）、ビニルピロリドン（ＶＰ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）および／またはＰＥＧメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）（ｎおよびｍは独立して３～２００の値を有する）のいずれかの複数のモノマーを含むポリマーまたはコポリマーを含む薬物－タンパク質コンジュゲートを含む。特定の局面では、分析物はＰＥＧ化抗体である。
したがって、いくつかの局面において、本開示はまた、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスおよび本明細書に開示される分析物、例えばＰＥＧ化タンパク質またはペプチドを含む組成物を提供する。ＰＰＧはＰＥＧよりも毒性が低いため、多くの生物学的製品は現在、ＰＥＧの代わりにＰＰＧを使用して製造されている。
いくつかの局面では、ＰＥＧは、式Ｒ３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－または式Ｒ３－（０－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－によって特徴付けられ、Ｒ３は水素、メチルまたはエチルであり、ｎは２～２００の値を有する。いくつかの局面において、ＰＥＧは式：
（式Ｉ）
（ここで、ｎは１～１０００である。）
を有する。いくつかの局面では、式Ｉの－ＯＨ基を－Ｏ－ＣＨ３（メトキシ）に置き換えることができる。したがって、ＰＥＧに関する以下の開示は、メトキシＰＥＧなどのＰＥＧ誘導体に等しく適用可能である。
（ここで、ｎは１～１０００である。）
を有する。いくつかの局面では、式Ｉの－ＯＨ基を－Ｏ－ＣＨ３（メトキシ）に置き換えることができる。したがって、ＰＥＧに関する以下の開示は、メトキシＰＥＧなどのＰＥＧ誘導体に等しく適用可能である。
いくつかの局面では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。
いくつかの局面では、ｎは、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約６７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、少なくとも約６００、少なくとも約６１０、少なくとも約６２０、少なくとも約６３０、少なくとも約６４０、少なくとも約６５０、少なくとも約６６０、少なくとも約６７０、少なくとも約６８０、少なくとも約６９０、少なくとも約７００、少なくとも約７１０、少なくとも約７２０、少なくとも約７３０、少なくとも約７４０、少なくとも約７５０、少なくとも約７６０、少なくとも約７７０、少なくとも約７８０、少なくとも約７９０、少なくとも約８００、少なくとも約８１０、少なくとも約８２０、少なくとも約８３０、少なくとも約８４０、少なくとも約８５０、少なくとも約８６０、少なくとも約８７０、少なくとも約８８０、少なくとも約８９０、少なくとも約９００、少なくとも約９１０、少なくとも約９２０、少なくとも約９３０、少なくとも約９４０、少なくとも約９５０、少なくとも約９６０、少なくとも約９７０、少なくとも約９８０、少なくとも約９９０、または約１０００である。
いくつかの局面では、ｎは、約５０～約１００の間、約１００～約１５０の間、約１５０～約２００の間、約２００～約２５０の間、約２５０～約３００の間、約３００～約３５０の間、約３００～約３５０の間、３５０～約４００の間、約４００～約４５０の間、約４５０～約５００の間、約５００～約５５０の間、約５５０～約６００の間、約６００～約６５０の間、約６５０～約７００の間、約７００～約７５０の間、約７５０～約８００の間、約８００～約８５０の間、約８５０～約９００の間、約９００～約９５０の間、または約９５０～約１０００の間である。
いくつかの局面では、ｎは、少なくとも約８０、少なくとも約８１、少なくとも約８２、少なくとも約８３、少なくとも約８４、少なくとも約８５、少なくとも約８６、少なくとも約８７、少なくとも約８８である。、少なくとも約８９、少なくとも約９０、少なくとも約９１、少なくとも約９２、少なくとも約９３、少なくとも約９４、少なくとも約９５、少なくとも約９６、少なくとも約９７、少なくとも約９８、少なくとも約９９、少なくとも約１００、少なくとも約１０１、少なくとも約１０２、少なくとも約１０３、少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、少なくとも１１０、少なくとも約１１１、少なくとも約１１２、少なくとも約１１３、少なくとも約１１４、少なくとも約１１５、少なくとも約１１６、少なくとも約１１７、少なくとも約１１８、少なくとも約１１９、少なくとも約１２０、少なくとも約１２１、少なくとも約１２２、少なくとも約１２３、少なくとも約１２４、少なくとも約１２５、少なくとも約１２６、少なくとも約１２７、少なくとも約１２８、少なくとも約１２９、少なくとも約１３０、少なくとも約１３１、少なくとも約１３２、少なくとも約１３３、少なくとも約１３４、少なくとも約１３５、少なくとも約１３６、少なくとも約１３７、少なくとも約１３８、少なくとも約１３９、少なくとも約１４０、少なくとも約１４１、少なくとも約１４２、少なくとも約１４３、少なくとも約１４４、少なくとも約１４５、少なくとも約１４６、少なくとも約１４７、少なくとも約１４８、少なくとも約１４９、少なくとも約１５０、少なくとも約１５１、少なくとも約１５２、少なくとも約１５３、少なくとも約１５４、少なくとも約１５５、少なくとも約１５６、少なくとも約１５７、少なくとも約１５８、少なくとも約１５９、または少なくとも約１６０である。
いくつかの局面では、ｎは、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約８５～約９５、約９５～約１０５、約１０５～約１１５、約１１５～約１２５、約１２５～約１３５、約１３５～約１４５、約１４５～約１５５、約１５５～約１６５、約８０～約１００、約１００～約１２０、約１２０～約１４０、約１４０～約１６０、約８５～約１０５、約１０５～約１２５、約１２５～約１４５、約１４５～約１６５である。
いくつかの局面では、ｎは、２～１０の間、１０～２０の間、２０～３０の間、３０～４０の間、４０～５０の間、５０～６０の間、６０～７０の間、７０～８０の間、８０～９０の間、９０～１００の間、１００～１１０の間、１１０～１２０の間、１２０～１３０の間、１３０～１４０の間、１４０～１５０の間、１５０～１６０の間、１６０～１７０の間、１７０～１８０の間、１８０～１９０の間、または１９０～２００の間である。いくつかの特定の局面では、ｎは、３～２００、３～２０、１０～３０、または９～４５の値を有する。
いくつかの局面において、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧには、中央のコア基から発する３～１０個のＰＥＧ鎖がある。特定の局面において、ＰＥＧ部分は単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈において、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＥＧ）は、単一の定義された鎖長および分子量を有するＰＥＧである。ｍｄＰＥＧは、典型的には、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離によって生成される。特定の式では、単分散ＰＥＧ部分には略語ｍｄＰＥＧが割り当てられる。いくつかの局面において、ＰＥＧはスターＰＥＧである。スターＰＥＧは、中央のコアグループから発する１０～１００個のＰＥＧ鎖を持っている。いくつかの局面において、ＰＥＧはＣｏｍｂ ＰＥＧである。Ｃｏｍｂ ＰＥＧには、通常、ポリマー主鎖に複数のＰＥＧ鎖がグラフトされている。
特定の局面では、ＰＥＧは、１００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの間、より具体的には１００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。特定の局面では、ＰＥＧは、２００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの間、特に３００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの間、より具体的には４００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌの間のモル質量を有する。特定の局面では、ＰＥＧは、約１０００ｇ／ｍｏｌ～約２０００ｇ／ｍｏｌの間、約２０００ｇ／ｍｏｌ～約３０００ｇ／ｍｏｌの間、約３０００ｇ／ｍｏｌ～約４０００ｇ／ｍｏｌの間、約４０００ｇ／ｍｏｌ～約５０００ｇ／ｍｏｌの間、約５０００ｇ／ｍｏｌ～約６０００ｇ／ｍｏｌの間、約６０００ｇ／ｍｏｌ～約７０００ｇ／ｍｏｌの間、または７０００ｇ／ｍｏｌ～約８０００ｇ／ｍｏｌの間のモル質量を有する。
いくつかの局面では、ＰＥＧは、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ７００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ９００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、またはＰＥＧ３０００ ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３１００、ＰＥＧ３２００、ＰＥＧ３３００、ＰＥＧ３４００、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３６００、ＰＥＧ３７００、ＰＥＧ３８００、ＰＥＧ３９００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４１００、ＰＥＧ４２００、ＰＥＧ４３００、ＰＥＧ４４００、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４６００、ＰＥＧ４７００、ＰＥＧ４８００、ＰＥＧ４９００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ５１００、ＰＥＧ５２００、ＰＥＧ５３００、ＰＥＧ５４００、ＰＥＧ５５００、ＰＥＧ５６００、ＰＥＧ５７００、ＰＥＧ５８００、ＰＥＧ５９００、ＰＥＧ６１００、ＰＥＧ６２００、ＰＥＧ６３００、ＰＥＧ６４００、ＰＥＧ６５００、ＰＥＧ６６００、ＰＥＧ６７００、ＰＥＧ６８００、ＰＥＧ６９００、ＰＥＧ７０００、ＰＥＧ７１００、ＰＥＧ７２００、ＰＥＧ７３００、ＰＥＧ７４００、ＰＥＧ７５００、ＰＥＧ７６００、ＰＥＧ７７００、ＰＥＧ７８００、ＰＥＧ７９００、またはＰＥＧ８０００である。
いくつかの局面では、ＰＥＧは単分散であり、例えば、ｍＰＥＧ１００、ｍＰＥＧ２００、ｍＰＥＧ３００、ｍＰＥＧ４００、ｍＰＥＧ５００、ｍＰＥＧ６００、ｍＰＥＧ７００、ｍＰＥＧ８００、ｍＰＥＧ９００、ｍＰＥＧ１０００、ｍＰＥＧ１１００、ｍＰＥＧ１２００、ｍＰＥＧ１３００、ｍＰＥＧ１４００、ｍＰＥＧ１５００、ｍＰＥＧ１６００、ｍＰＥＧ１７００、ｍＰＥＧ１８００、ｍＰＥＧ１９００、ｍＰＥＧ２０００、ｍＰＥＧ２１００、ｍＰＥＧ２２００、ｍＰＥＧ２３００、ｍＰＥＧ２４００、ｍＰＥＧ２５００、ｍＰＥＧ１６００、ｍＰＥＧ１７００、ｍＰＥＧ１８００、ｍＰＥＧ１９００、ｍＰＥＧ２１００、ｍＰＥＧ２２００、ｍＰＥＧ２３００、ｍＰＥＧ２４００、ｍＰＥＧ２５００、ｍＰＥＧ２６００、ｍＰＥＧ２７００、ｍＰＥＧ２８００、ｍＰＥＧ２９００、ｍＰＥＧ３０００、ｍＰＥＧ３１００、ｍＰＥＧ３２００、ｍＰＥＧ３３００、ｍＰＥＧ３４００、ｍＰＥＧ３５００、ｍＰＥＧ３６００、ｍＰＥＧ３７００、ｍＰＥＧ３８００、ｍＰＥＧ３９００、ｍＰＥＧ４０００、ｍＰＥＧ４１００、ｍＰＥＧ４２００、ｍＰＥＧ４３００、ｍＰＥＧ４４００、ｍＰＥＧ４５００、ｍＰＥＧ４６００、ｍＰＥＧ４７００、ｍＰＥＧ４８００、ｍＰＥＧ４９００、ｍＰＥＧ５０００、ｍＰＥＧ５1００、ｍＰＥＧ５２００、ｍＰＥＧ５３００、ｍＰＥＧ５４００、ｍＰＥＧ５５００、ｍＰＥＧ５６００、ｍＰＥＧ５７００、ｍＰＥＧ５８００、ｍＰＥＧ５９００、ｍＰＥＧ６０００、ｍＰＥＧ６１００、ｍＰＥＧ６２００、ｍＰＥＧ６３００、ｍＰＥＧ６４００、ｍＰＥＧ６５００、ｍＰＥＧ６６００、ｍＰＥＧ６７００、ｍＰＥＧ６８００、ｍＰＥＧ６９００、ｍＰＥＧ７０００、ｍＰＥＧ７１００、ｍＰＥＧ７２００、ｍＰＥＧ７３００、ｍＰＥＧ７４００、ｍＰＥＧ７５００、ｍＰＥＧ７６００、ｍＰＥＧ７７００、ｍＰＥＧ７８００、ｍＰＥＧ７９００、またはｍＰＥＧ８０００である。
いくつかの局面において、分析物（例えば、抗体などのタンパク質）は、単一のＰＥＧを含む。いくつかの局面では、分析物（例えば、抗体などのタンパク質）は、すべてのＰＥＧが同じであるか、または少なくとも１つが他のＰＥＧとは異なる、２つ以上のＰＥＧを含むことができる。いくつかの局面において、ＰＥＧは線状ＰＥＧである。いくつかの局面において、ＰＥＧは線状メトキシＰＥＧである。いくつかの局面では、ＰＥＧは約３０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの局面では、ＰＥＧ（例えば、直鎖メトキシＰＥＧ）は、化学的または酵素的結合によってタンパク質（例えば、抗体）に結合される。いくつかの局面において、コンジュゲーションは、非天然アミノ酸を介する。
いくつかの局面では、ポリグリセロール（ＰＧ）は式（（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２Ｏ）ｎ－））によって表され、Ｒ３は水素、メチルまたはエチルであり、ｎは３～２００の値を有する。いくつかの局面において、ｎは３～２０の値を有する。いくつかの局面において、ｎは１０～３０の値を有する。これらの側面のいくつかの代替案では、ｎは９～４５の値を持つ。いくつかの局面では、ＰＧは、式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ５－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって表される分岐ポリグリセロールであり、Ｒ５は水素であるか、または式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって表される直鎖グリセロール鎖であり、ここで、Ｒ３は水素、メチルまたはエチルである。
いくつかの局面では、ＰＧは、式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ５－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって表される超分岐ポリグリセロールであり、ここで、Ｒ５は水素であるか、または式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ６－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって表されるグリセロール鎖であり、ここで、Ｒ６は水素または式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ７－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって表されるグリセロール鎖であり、ここで、Ｒ７は水素または式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって表される直鎖グリセロール鎖であり、ここで、Ｒ３は水素、メチルまたはエチルである。超分岐グリセロールおよびその合成方法は、Oudshorn et al. (2006) Biomaterials 27:5471-5479; Wilms et al. (20100 Acc. Chem. Res. 43, 129-41およびそこで引用された参考文献に記載されている。
特定の局面では、ＰＧは、１００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの間、より具体的には約１００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌの間のモル質量を有する。特定の局面では、ＰＧは、２００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌの間、特に３００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌの間、より具体的には約４００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌの間のモル質量を有する。特定の局面では、ＰＧは、約１０００ｇ／ｍｏｌ～約２０００ｇ／ｍｏｌの間、約２０００ｇ／ｍｏｌ～約３０００ｇ／ｍｏｌの間、約３０００ｇ／ｍｏｌ～約４０００ｇ／ｍｏｌの間、約４０００ｇ／ｍｏｌ～約５０００ｇ／ｍｏｌの間、約５０００ｇ／ｍｏｌ～約６０００ｇ／ｍｏｌの間、約６０００ｇ／ｍｏｌ～約７０００ｇ／ｍｏｌの間、または７０００ｇ／ｍｏｌ～約８０００ｇ／ｍｏｌの間のモル質量を有する。
いくつかの局面では、ＰＧは、ＰＧ１００、ＰＧ２００、ＰＧ３００、ＰＧ４００、ＰＧ５００、ＰＧ６００、ＰＧ７００、ＰＧ８００、ＰＧ９００、ＰＧ１０００、ＰＧ１１００、ＰＧ１２００、ＰＧ１３００、ＰＧ１４００、ＰＧ１５００、ＰＧ１６００、ＰＧ１７００、ＰＧ１８００、ＰＧ１９００、ＰＧ２０００、ＰＧ２１００、ＰＧ２２００、ＰＧ２３００、ＰＧ２４００、ＰＧ２５００、ＰＧ１６００、ＰＧ１７００、ＰＧ１８００、ＰＧ１９００、ＰＧ２０００、ＰＧ２１００、ＰＧ２２００、ＰＧ２３００、ＰＧ２４００、ＰＧ２５００、ＰＧ２６００、ＰＧ２７００、ＰＧ２８００、ＰＧ２９００、ＰＧ３０００、ＰＧ３１００、ＰＧ３２００、ＰＧ３３００、ＰＧ３４００、ＰＧ３５００、ＰＧ３６００、ＰＧ３７００、ＰＧ３８００、ＰＧ３９００、ＰＧ４０００、ＰＧ４１００、ＰＧ４２００、ＰＧ４３００、ＰＧ４４００、ＰＧ４５００、ＰＧ４６００、ＰＧ４７００、ＰＧ４８００、ＰＧ４９００、ＰＧ５０００、ＰＧ５１００、ＰＧ５２００、ＰＧ５３００、ＰＧ５４００、ＰＧ５５００、ＰＧ５６００、ＰＧ５７００、ＰＧ５８００、ＰＧ５９００、ＰＧ６０００、ＰＧ６１００、ＰＧ６２００、ＰＧ６３００、ＰＧ６４００、ＰＧ６５００、ＰＧ６６００、ＰＧ６７００、ＰＧ６８００、ＰＧ６９００、ＰＧ７０００、ＰＧ７１００、ＰＧ７２００、ＰＧ７３００、ＰＧ７４００、ＰＧ７５００、ＰＧ７６００、ＰＧ７７００、ＰＧ７８００、ＰＧ７９００、またはＰＧ８０００である。
いくつかの局面では、ＰＧは単分散であり、例えば、ｍＰＧ１００、ｍＰＧ２００、ｍＰＧ３００、ｍＰＧ４００、ｍＰＧ５００、ｍＰＧ６００、ｍＰＧ７００、ｍＰＧ８００、ｍＰＧ９００、ｍＰＧ１０００、ｍＰＧ１１００、ｍＰＧ１２００、ｍＰＧ１３００、ｍＰＧ１４００、ｍＰＧ１５００、ｍＰＧ１６００、ｍＰＧ１７００、ｍＰＧ１８００、ｍＰＧ１９００、ｍＰＧ２０００、ｍＰＧ２１００、ｍＰＧ２２００、ｍＰＧ２３００、ｍＰＧ２４００、ｍＰＧ２５００、ｍＰＧ１６００、ｍＰＧ１７００、ｍＰＧ１８００、ｍＰＧ１９００、ｍＰＧ２１００、ｍＰＧ２２００、ｍＰＧ２３００、ｍＰＧ２４００、ｍＰＧ２５００、ｍＰＧ２６００、ｍＰＧ２７００、ｍＰＧ２８００、ｍＰＧ２９００、ｍＰＧ３０００、ｍＰＧ３１００、ｍＰＧ３２００、ｍＰＧ３３００、ｍＰＧ３４００、ｍＰＧ３５００、ｍＰＧ３６００、ｍＰＧ３７００、ｍＰＧ３８００、ｍＰＧ３９００、ｍＰＧ４０００、ｍＰＧ４１００、ｍＰＧ４２００、ｍＰＧ４３００、ｍＰＧ４４００、ｍＰＧ４５００、ｍＰＧ４６００、ｍＰＧ４７００、ｍＰＧ４８００、ｍＰＧ４９００、ｍＰＧ５０００、ｍＰＧ５１００、ｍＰＧ５２００、ｍＰＧ５３００、ｍＰＧ５４００、ｍＰＧ５５００、ｍＰＧ５６００、ｍＰＧ５７００、ｍＰＧ５８００、ｍＰＧ５９００、ｍＰＧ６０００、ｍＰＧ６１００、ｍＰＧ６２００、ｍＰＧ６３００、ｍＰＧ６４００、ｍＰＧ６５００、ｍＰＧ６６００、ｍＰＧ６７００、ｍＰＧ６８００、ｍＰＧ６９００、ｍＰＧ７０００、ｍＰＧ７１００、ｍＰＧ７２００、ｍＰＧ７３００、ｍＰＧ７４００、ｍＰＧ７５００、ｍＰＧ７６００、ｍＰＧ７７００、ｍＰＧ７８００、ｍＰＧ７９００、またはｍＰＧ８０００である。
いくつかの局面において、水溶性バイオポリマーは、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）を含む。いくつかの局面では、ＰＰＧは、ｎが１～１０００の値を有する以下の式によって特徴付けられる。
（式ＩＩ）
いくつかの局面では、ＰＰＧのｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。
いくつかの局面では、ＰＰＧのｎは、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２８０、少なくとも約２９０、少なくとも約３００、少なくとも約３１０、少なくとも約３２０、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５１０、少なくとも約５２０、少なくとも約５３０、少なくとも約５４０、少なくとも約５５０、少なくとも約５６０、少なくとも約６７０、少なくとも約５８０、少なくとも約５９０、少なくとも約６００、少なくとも約６１０、少なくとも約６２０、少なくとも約６３０、少なくとも約６４０、少なくとも約６５０、少なくとも約６６０、少なくとも約６７０、少なくとも約６８０、少なくとも約６９０、少なくとも約７００、少なくとも約７１０、少なくとも約７２０、少なくとも約７３０、少なくとも約７４０、少なくとも約７５０、少なくとも約７６０、少なくとも約７７０、少なくとも約７８０、少なくとも約７９０、少なくとも約８００、少なくとも約８１０、少なくとも約８２０、少なくとも約８３０、少なくとも約８４０、少なくとも約８５０、少なくとも約８６０、少なくとも約８７０、少なくとも約８８０、少なくとも約８９０、少なくとも約９００、少なくとも約９１０、少なくとも約９２０、少なくとも約９３０、少なくとも約９４０、少なくとも約９５０、少なくとも約９６０、少なくとも約９７０、少なくとも約９８０、少なくとも約９９０、または約１０００である。
いくつかの局面では、ＰＰＧのｎは、約５０～約１００の間、約１００～約１５０の間、約１５０～約２００の間、約２００～約２５０の間、約２５０～約３００の間、約３００～約３００の間である。３５０、約３５０～約４００の間、約４００～約４５０の間、約４５０～約５００の間、約５００～約５５０の間、約５５０～約６００の間、約６００～約６５０の間、約６５０～約７００の間、約７００～約７５０の間、約７５０～約８００の間、約８００～約８５０の間、約８５０～約９００の間、約９００～約９５０の間、または約９５０～約１０００の間である。
いくつかの局面では、ＰＰＧのｎは、少なくとも約８０、少なくとも約８１、少なくとも約８２、少なくとも約８３、少なくとも約８４、少なくとも約８５、少なくとも約８６、少なくとも約８７、少なくとも約８８、少なくとも約８９、少なくとも約９０、少なくとも約９１、少なくとも約９２、少なくとも約９３、少なくとも約９４、少なくとも約９５、少なくとも約９６、少なくとも約９７、少なくとも約９８、少なくとも約９９、少なくとも約１００、少なくとも約１０１、少なくとも約１０２、少なくとも約１０３、少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、少なくとも約１１０、少なくとも約１１１、少なくとも約１１２、少なくとも約１１３、少なくとも約１１４、少なくとも約１１５、少なくとも約１１６、少なくとも約１１７、少なくとも約１１８、少なくとも約１１９、少なくとも約１２０、少なくとも約１２１、少なくとも約１２２、少なくとも約１２３、少なくとも約１２４、少なくとも約１２５、少なくとも約１２６、少なくとも約１２７、少なくとも約１２８、少なくとも約１２９、少なくとも約１３０、少なくとも約１３１、少なくとも約１３２、少なくとも約１３３、少なくとも約１３４、少なくとも約１３５、少なくとも約１３６、少なくとも約１３７、少なくとも約１３８、少なくとも約１３９、少なくとも約１４０、少なくとも約１４１、少なくとも約１４２、少なくとも約１４３、少なくとも約１４４、少なくとも約１４５、少なくとも約１４６、少なくとも約１４７、少なくとも約１４８、少なくとも約１４９、少なくとも約１５０、少なくとも約１５１、少なくとも約１５２、少なくとも約１５３、少なくとも約１５４、少なくとも約１５５、少なくとも約１５６、少なくとも約１５７、少なくとも約１５８、少なくとも約１５９、または少なくとも約１６０である。
いくつかの局面では、ＰＰＧのｎは、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約である。約１５０、約１５０～約１６０、約８５～約９５、約９５～約１０５、約１０５～約１１５、約１１５～約１２５、約１２５～約１３５、約１３５～約１４５、約１４５～約１５５、約１５５～約１６５、約８０～約１００、約１００～約１２０、約１２０～約１４０、約１４０～約１６０、約８５～約１０５、約１０５～約１２５、約１２５～約１４５、または約１４５～約１６５である。
したがって、いくつかの側面では、ＰＰＧは分岐ＰＰＧである。分岐したＰＰＧには、中央のコア基から発する３～１０個のＰＰＧ鎖がある。特定の局面において、ＰＰＧ部分は単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈において、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＰＧ）は、単一の定義された鎖長および分子量を有するＰＰＧである。ｍｄＰＥＧは、典型的には、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離によって生成される。特定の式では、単分散ＰＰＧ部分には略語ｍｄＰＰＧが割り当てられる。
いくつかの局面では、ＰＰＧはスターＰＰＧである。スターＰＰＧには、中央のコア基から発する１０～１００個のＰＰＧ鎖がある。いくつかの局面において、ＰＰＧはＣｏｍｂ ＰＰＧである。Ｃｏｍｂ ＰＰＧには、通常、ポリマー主鎖にグラフトされた複数のＰＰＧ鎖がある。
特定の局面では、ＰＰＧは、約１０００ｇ／ｍｏｌ～約２０００ｇ／ｍｏｌの間、約２０００ｇ／ｍｏｌ～約３０００ｇ／ｍｏｌの間、約３０００ｇ／ｍｏｌ～約４０００ｇ／ｍｏｌの間、約４０００ｇ／ｍｏｌ～約５０００ｇ／ｍｏｌの間、約５０００ｇ／ｍｏｌ～約６０００ｇ／ｍｏｌの間、約６０００ｇ／ｍｏｌ～約７０００ｇ／ｍｏｌの間、または７０００ｇ／ｍｏｌ～約８０００ｇ／ｍｏｌの間であるモル質量を有する。
いくつかの局面では、ＰＰＧは、ＰＰＧ１００、ＰＰＧ２００、ＰＰＧ３００、ＰＰＧ４００、ＰＰＧ５００、ＰＰＧ６００、ＰＰＧ７００、ＰＰＧ８００、ＰＰＧ９００、ＰＰＧ１０００、ＰＰＧ１１００、ＰＰＧ１２００、ＰＰＧ１３００、ＰＰＧ１４００、ＰＰＧ１５００、ＰＰＧ１６００、ＰＰＧ１７００、ＰＰＧ１８００、ＰＰＧ１９００、ＰＰＧ２０００、ＰＰＧ２１００、ＰＰＧ２２００、ＰＰＧ２３００、ＰＰＧ２４００、ＰＰＧ２５００、ＰＰＧ１６００、ＰＰＧ１７００、ＰＰＧ１８００、ＰＰＧ１９００、ＰＰＧ２０００、ＰＰＧ２１００、ＰＰＧ２２００、ＰＰＧ２３００、ＰＰＧ２４００、ＰＰＧ２５００、ＰＰＧ２６００、ＰＰＧ２７００、ＰＰＧ２８００、ＰＰＧ２９００、ＰＰＧ３０００、ＰＰＧ３１００、ＰＰＧ３２００、ＰＰＧ３３００、ＰＰＧ３４００、ＰＰＧ３５００、ＰＰＧ３６００、ＰＰＧ３７００、ＰＰＧ３８００、ＰＰＧ３９００、ＰＰＧ４０００、ＰＰＧ４１００、ＰＰＧ４２００、ＰＰＧ４３００、ＰＰＧ４４００、ＰＰＧ４５００、ＰＰＧ４６００、ＰＰＧ４７００、ＰＰＧ４８００、ＰＰＧ４９００、ＰＰＧ５０００、ＰＰＧ５１００、ＰＰＧ５２００、ＰＰＧ５３００、ＰＰＧ５４００、ＰＰＧ５５００、ＰＰＧ５６００、ＰＰＧ５７００、ＰＰＧ５８００、ＰＰＧ５９００、ＰＰＧ６０００、ＰＰＧ６１００、ＰＰＧ６２００、ＰＰＧ６３００、ＰＰＧ６４００、ＰＰＧ６５００、ＰＰＧ６６００、ＰＰＧ６７００、ＰＰＧ６８００、ＰＰＧ６９００、ＰＰＧ７０００、ＰＰＧ７１００、ＰＰＧ７２００、ＰＰＧ７３００、ＰＰＧ７４００、ＰＰＧ７５００、ＰＰＧ７６００、ＰＰＧ７７００、ＰＰＧ７８００、ＰＰＧ７９００、またはＰＰＧ８０００である。いくつかの局面では、ＰＰＧはＰＰＧ５０００である。いくつかの局面では、ＰＰＧはＰＰＧ６０００である。いくつかの局面では、ＰＰＧはＰＰＧ４０００である。
いくつかの局面では、ＰＰＧは単分散であり、例えば、ｍＰＰＧ１００、ｍＰＰＧ２００、ｍＰＰＧ３００、ｍＰＰＧ４００、ｍＰＰＧ５００、ｍＰＰＧ６００、ｍＰＰＧ７００、ｍＰＰＧ８００、ｍＰＰＧ９００、ｍＰＰＧ１０００、ｍＰＰＧ１１００、ｍＰＰＧ１２００、ｍＰＰＧ１３００、ｍＰＰＧ１４００、ｍＰＰＧ１５００、ｍＰＰＧ１６００、ｍＰＰＧ１７００、ｍＰＰＧ１８００、ｍＰＰＧ１９００、ｍＰＰＧ２０００、ｍＰＰＧ２１００、ｍＰＰＧ２２００、ｍＰＰＧ２３００、ｍＰＰＧ２４００、ｍＰＰＧ２５００、ｍＰＰＧ１６００、ｍＰＰＧ１７００、ｍＰＰＧ１８００、ｍＰＰＧ１９００、ｍＰＰＧ２０００、ｍＰＰＧ２１００、ｍＰＰＧ２２００、ｍＰＰＧ２３００、ｍＰＰＧ２４００、ｍＰＰＧ２５００、ｍＰＰＧ２６００、ｍＰＰＧ２７００、ｍＰＰＧ２８００、ｍＰＰＧ２９００、ｍＰＰＧ３０００、ｍＰＰＧ３１００、ｍＰＰＧ３２００、ｍＰＰＧ３３００、ｍＰＰＧ３４００、ｍＰＰＧ３５００、ｍＰＰＧ３６００、ｍＰＰＧ３７００、ｍＰＰＧ３８００、ｍＰＰＧ３９００、ｍＰＰＧ４０００、ｍＰＰＧ４１００、ｍＰＰＧ４２００、ｍＰＰＧ４３００、ｍＰＰＧ４４００、ｍＰＰＧ４５００、ｍＰＰＧ４６００、ｍＰＰＧ４７００、ｍＰＰＧ４８００、ｍＰＰＧ４９００、ｍＰＰＧ５０００、ｍＰＰＧ５１００、ｍＰＰＧ５２００、ｍＰＰＧ５４００、ｍＰＰＧ５５００、ｍＰＰＧ５６００、ｍＰＰＧ５７００、ｍＰＰＧ５８００、ｍＰＰＧ５９００、ｍＰＰＧ６０００、ｍＰＰＧ６１００、ｍＰＰＧ６２００、ｍＰＰＧ６３００、ｍＰＰＧ６４００、ｍＰＰＧ６５００、ｍＰＰＧ６６００、ｍＰＰＧ６７００、ｍＰＰＧ６８００、ｍＰＰＧ６９００、ｍＰＰＧ７０００、ｍＰＰＧ７１００、ｍＰＰＧ７２００、ｍＰＰＧ７３００、ｍＰＰＧ７４００、ｍＰＰＧ７５００、ｍＰＰＧ７６００、ｍＰＰＧ７７００、ｍＰＰＧ７８００、ｍＰＰＧ７９００、またはｍＰＰＧ８０００である。
ｉｃＩＥＦサンプル内で使用される分析物（分析対象物）（例えば、ＰＥＧ化タンパク質）の量は変動する可能性があり、使用されるキャピラリーのサイズに部分的に依存する。一般に、ｉｃＩＥＦキャピラリーには、約０．１ｍｇ～約５ｍｇの全タンパク質が装填される。いくつかの局面では、本明細書に開示される組成物（例えば、本開示のｉｃＩＥＦサンプルマトリックスおよびＰＥＧ化タンパク質を含む混合物）中のタンパク質分析物の量は、全タンパク質で約０．１ｍｇ～約５ｍｇの間、例えば、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．５ｍｇ、または約５ｍｇである。
いくつかの局面において、ＰＥＧ化タンパク質は、複数の電荷変異体を含むＰＥＧ化タンパク質組成物である。したがって、いくつかの局面において、ＰＥＧ化タンパク質は、主要種または優占種を含む種の集団であり、それらのそれぞれの電荷に関して優勢種とは異なる他の種である。したがって、ＰＥＧ化タンパク質組成物は、主要なまたは主要な種よりも酸性であるか、または塩基性である電荷変異体種を含むことができる。
いくつかの局面では、分析物、例えばＰＥＧ化タンパク質は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度である。いくつかの局面において、分析物、例えばＰＥＧ化タンパク質は、約０．２５ｍｇ／ｍＬ～約０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの局面において、例えばＰＥＧ化タンパク質などの分析物は、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの局面では、分析物、例えばＰＥＧ化タンパク質は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬの濃度である。
いくつかの局面では、本開示は、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックス用のキットを提供する。いくつかの局面において、キットは、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを含む。いくつかの局面では、キットは、両性電解質、グリシンおよび／またはタウリン、および必要に応じて、本明細書に開示される方法に従って使用するための説明書を含む。いくつかの局面では、両性電解質、グリシンおよび／またはタウリンは、同じバイアルまたは異なるバイアルに入れることができる。いくつかの局面において、キットは、乾燥形態の１つまたは複数の成分、および再構成用の溶媒を含む１つまたは複数のバイアルを含むことができる。
本開示はまた、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスおよびＰＥＧ化タンパク質を含むサンプルをｉｃＩＥＦに供することを含む、ＰＥＧ化タンパク質などの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧを含む分析物の等電点（ｐＩ）を測定する方法を提供する。
検体の電荷変異体の集団の等電点（ｐＩ）を測定する方法であって、検体が水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物などのＰＥＧを含有する方法も提供され、この方法は、（ｉ）本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックス、および（ｉｉ）電荷変異体の集団を含む分析物、を含むサンプルをｉｃＩＥＦに付すことを含む。
水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ化タンパク質組成物などのＰＥＧを含有する検体の電荷変異体の集団をそれらのそれぞれの等電点（ｐＩ）に従って分離する方法もまた提供され、この方法は、（ｉ）本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックス、および（ｉｉ）電荷変異体の集団を含む分析物、を含むサンプルをｉｃＩＥＦに付すことを含む。
上に開示したように、いくつかの局面では、分析物、例えば組換えタンパク質をＰＥＧ化した後に得られるＰＥＧ化タンパク質組成物は、組成物において、複数の電荷変異体種、例えば支配的な種（主な種）に対してより酸性またはより塩基性の種である種を含む。本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、検体濃度（例えば、複数の電荷変異体種を含むＰＥＧ化タンパク質組成物中の総タンパク質濃度）は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬの間である。いくつかの局面において、分析物濃度（例えば、ＰＥＧ化タンパク質またはＰＥＧ化タンパク質組成物）は、約０．２５ｍｇ／ｍＬ～約０．７５ｍｇ／ｍＬの間である。いくつかの局面において、分析物濃度（例えば、ＰＥＧ化タンパク質またはＰＥＧ化タンパク質組成物）は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬである。いくつかの局面において、分析物は、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＥＧ化タンパク質である。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、ｉｃＩＥＦは、（ｉ）キャリア両性電解質がキャピラリー内でｐＨ勾配を形成するように、第１の所定の期間、第１の電圧を印加すること、（ｉｉ）変異体の全体の電荷が中性になるように、キャピラリー内のタンパク質の電荷変異体の移動をフォーカスさせるために、第２の所定の期間、第２の電圧を印加する。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、第１の電圧は約１Ｖ～約３０００Ｖの間である。例えば、第１の電圧は、約１Ｖ、約１００Ｖ、約２５０Ｖ、約５００Ｖ、約７５０Ｖ、約１０００Ｖ、約１２５０Ｖ、約１５００Ｖ、約１７５０Ｖ、約２０００Ｖ、約２２５０Ｖ、約２５００Ｖ、約２７５０Ｖ、または約３０００Ｖであり得る。いくつかの局面では、第１の電圧は、約１Ｖ～約１００Ｖの間、約１００Ｖ～約２００Ｖの間、約２００Ｖ～約３００Ｖの間、約３００Ｖ～約４００Ｖの間、約４００Ｖ～約５００Ｖの間、約５００Ｖ～約６００Ｖの間、約６００Ｖ～約７００Ｖの間、約７００Ｖ～約８００Ｖの間、約８００Ｖ～約９００Ｖの間、約９００Ｖ～約１０００Ｖの間、約１０００Ｖ～約１１００Ｖの間、約１１００Ｖ～約１２００Ｖの間、約１２００Ｖ～約１３００Ｖの間、約１３００Ｖ～約１４００Ｖの間、約１４００Ｖ～約１５００Ｖの間、約１５００Ｖ～約１６００Ｖの間、約１６００Ｖ～約１７００Ｖの間、約１７００Ｖ～約１８００Ｖの間、約１８００Ｖ～約１９００Ｖの間、約１９００Ｖ～約２０００Ｖの間、約２０００Ｖ～約２１００Ｖの間、約２１００Ｖ～約２２００Ｖの間、約２２００Ｖ～約２３００Ｖの間、約２３００Ｖ～約２４００Ｖの間、約２４００Ｖ～約２４００Ｖの間２５００Ｖ、約２５００Ｖ～約２６００Ｖの間、約２６００Ｖ～約２７００Ｖの間、約２７００Ｖ～約２８００Ｖの間、約２８００Ｖ～約２９００Ｖの間、または約２９００Ｖ～約３０００Ｖの間である。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、第１の電圧は、約１００Ｖ～約２９００Ｖの間、約２００Ｖ～約２８００Ｖの間、約３００Ｖ～約２７００Ｖの間、約４００Ｖ～約２６００Ｖの間、約５００Ｖ～約２５００Ｖの間、約６００Ｖ～約２４００Ｖの間、約７００Ｖ～約２３００Ｖの間、約８００Ｖ～約２２００Ｖの間、約９００Ｖ～約２１００Ｖの間、約１０００Ｖ～約２０００Ｖの間、約１１００Ｖ～約１９００Ｖの間、約１２００Ｖ～約１８００Ｖの間、約１３００Ｖ～約１７００Ｖの間、または約１４００Ｖ～約１６００Ｖの間である。いくつかの特定の局面では、第１の電圧は約１５００Ｖである。
本明細書で開示される方法のいくつかの局面では、第２の電圧は約１Ｖ～約６０００Ｖの間である。例えば、第２の電圧は、約１Ｖ、約１００Ｖ、約２５０Ｖ、約５００Ｖ、約７５０Ｖ、約１０００Ｖ、約１２５０Ｖ、約１５００Ｖ、約１７５０Ｖ、約２０００Ｖ、約２２５０Ｖ、約２５００Ｖ、約２７５０、約３０００Ｖ、約３２５０Ｖ、約３５００Ｖ、約３７５０Ｖ、約４０００Ｖ、約４２５０Ｖ、約４５００Ｖ、約４７５０Ｖ、約５０００Ｖ、約５２５０Ｖ、約５５００Ｖ、約５７５０Ｖ、または約６０００Ｖであり得る。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、第２の電圧は、約１Ｖ～約１００Ｖの間、約１００Ｖ～約２００Ｖの間、約２００Ｖ～約３００Ｖの間、約３００Ｖ～約４００Ｖの間、約３００Ｖ～約４００Ｖの間、約４００Ｖ～約５００Ｖの間、約５００Ｖ～約６００Ｖの間、約６００Ｖ～約７００Ｖの間、約７００Ｖ～約８００Ｖの間、約８００Ｖ～約９００Ｖの間、約９００Ｖ～約９００Ｖの間１０００Ｖ、約１０００Ｖ～約１１００Ｖの間、約１１００Ｖ～約１２００Ｖの間、約１２００Ｖ～約１３００Ｖの間、約１３００Ｖ～約１４００Ｖの間、約１４００Ｖ～約１５００Ｖの間、約１４００Ｖ～約１５００Ｖの間約１５００Ｖ～約１６００Ｖ、約１６００Ｖ～約１７００Ｖの間、約１７００Ｖ～約１８００Ｖの間、約１８００Ｖ～約１９００Ｖの間、約１９００Ｖ～約２０００Ｖの間、約２０００Ｖ～約２１００Ｖの間Ｖ、約２１００Ｖ～約２２００Ｖの間、約２２００Ｖ～約２３００Ｖの間、約２３００Ｖ～約２４００Ｖの間、約２４００Ｖ～約２５００Ｖの間、約２５００Ｖ～約２６００Ｖの間、約２６００Ｖ～約２７００Ｖの間、約２７００Ｖ～約２８００Ｖの間、約２８００Ｖ～約２９００Ｖの間、約２９００Ｖ～約３０００Ｖの間、約３１００Ｖ～約３２００Ｖの間、約３２００Ｖ～約３３００Ｖの間、約３３００Ｖ～約３４００Ｖの間、約３４００Ｖ～約３５００Ｖの間、約３５００Ｖ～約３６００Ｖの間、約３６００Ｖ～約３７００Ｖの間、約３７００Ｖ～約３８００Ｖの間、約３８００Ｖ～約３９００Ｖの間、約３９００Ｖ～約４０００Ｖの間、約４０００Ｖ～約４１００Ｖの間、約４１００Ｖ～約４２００Ｖの間、約４２００Ｖ～約４３００Ｖの間、約４３００Ｖ～約４４００Ｖの間、約４４００Ｖ～約４５００Ｖの間、約４５００Ｖ～約４６００Ｖの間、約４６００Ｖ～約４７００Ｖの間、約４７００Ｖの間約４８００Ｖ、約４８００Ｖ～約４９００の間、約４９００Ｖ～約５０００Ｖの間、約５０００Ｖ～約５１００Ｖの間、約５１００Ｖ～約５２００Ｖの間、約５２００Ｖ～約５３００Ｖの間、約５３００Ｖ～約５４００Ｖの間、約５４００Ｖ～約５５００Ｖの間、約５５００Ｖ～約５６００Ｖの間、約５６００Ｖ～約５７００Ｖの間、約５７００Ｖ～約５８００Ｖの間、約５８００Ｖ～約５９００Ｖの間、または約５９００Ｖ～約６０００Ｖの間である。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、第２の電圧は、約１００Ｖ～約５９００Ｖの間、約２００Ｖ～約５８００Ｖの間、約３００Ｖ～５７００Ｖの間、約４００Ｖ～約５６００Ｖの間、約５００Ｖの間である。約５５００Ｖ、約６００Ｖ～約５４００Ｖの間、約７００Ｖ～約５３００Ｖの間、約８００Ｖ～約５２００Ｖの間、約９００Ｖ～約５１００Ｖの間、約１０００Ｖ～約５０００Ｖの間、約１１００Ｖ～約４９００Ｖの間、約１２００Ｖ～約４８００Ｖの間、約１３００Ｖ～約４７００Ｖの間、約１４００Ｖ～約４６００Ｖの間、約１５００Ｖ～約４５００Ｖの間、約１６００Ｖ～約１６００Ｖの間、約４４００Ｖ、約１７００Ｖ～約４３００Ｖの間、約１８００Ｖ～約４２００Ｖの間、約１９００Ｖ～約４１００Ｖの間、約２０００Ｖ～約４０００Ｖの間、約２１００Ｖ～約３９００Ｖの間、約２２００Ｖ～約３８００Ｖの間、約２３００Ｖ～約３７００Ｖの間、約２４００Ｖ～約３６００Ｖの間、約２５００Ｖ～約３５００Ｖの間、約２６００Ｖ～約３４００Ｖの間、約２７００Ｖ～約３３００Ｖの間、約２８００Ｖ～約３２００Ｖの間、または約２９００Ｖ～約３１００Ｖの間である。いくつかの特定の局面では、第２の電圧は約３０００Ｖである。
本明細書で開示される方法のいくつかの局面では、第１の所定の期間は、約１秒～約５分の間である。例えば、第１の所定の時間は、約１秒、約１０秒、約２０秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約１分（６０秒）、約１．５分（９０秒）、約２分（１２０秒）、約２．５分（１５０秒）、約３分（１８０秒）、約３．５分（２１０秒）、約４分（２４０秒）、約４．５分（２７０秒）、または約５分（３００秒）であってよい。本明細書で開示される方法のいくつかの局面では、第１の所定の期間は、約１０秒～約２０秒の間、約２０秒～約３０秒の間、約３０秒～約４０秒の間、約４０秒～約５０秒の間、約５０秒～約６０秒の間、約６０秒～約７０秒の間、約７０秒～約８０秒の間、約８０秒～約９０秒の間、約９０秒～約１００秒の間、約１００秒の間そして約１１０秒、または約１１０秒～約１２０秒の間である。本明細書で開示される方法のいくつかの局面では、第１の所定の期間は、１０秒～１１０秒の間、約２０秒～約１００秒の間、約３０秒～約９０秒の間、約４０秒～約８０秒の間、または約５０秒～約７０秒の間である。いくつかの特定の局面では、第１の所定の期間は約６０秒（１分）である。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、第２の所定の期間は、約１分～約１５分の間である。例えば、第２の所定の時間は、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、または約１５分であってよい。いくつかの局面では、第２の所定の時間は、約１分～約２分の間、約２分～約３分の間、約３分～約４分の間、約４分～約５分の間、約５分～約６分の間、約６分～約７分の間、約７分～約８分の間、約８分～約９分の間、約９分～約１０分の間、約１０分～約１１分の間、約１１分～約１２分の間、約１２分～約１３分の間、約１３分～約１４分の間、または約１４分～約１５分の間である。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、第２の所定の期間は、約２分～約１４分の間、約３分～約１３分の間、約４分～約１２分の間、約５分～約１１分の間、約６分～約１０分の間、約６分～約９分の間、または７分～約９分の間である。本明細書で開示される方法のいくつかの特定の局面では、第２の所定の期間は約８分である。
本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、第１の電圧は約１５００Ｖであり、第１の所定の期間は約１分である。いくつかの局面では、第２の電圧は約３０００Ｖであり、第２の所定の期間は約８分である。本明細書に開示される方法のいくつかの局面では、（ｉ）第１の電圧は約１５００Ｖであり、第１の所定の期間は約１分であり、（ｉｉ）第２の電圧は約３０００Ｖであり、第２の所定の期間は約８分である。
いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦは約１０℃で実施される。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦは、約９℃～約１１℃の間、約８℃～約１２℃の間、約７℃～約１３℃の間、約６℃～約１４℃の間、または約５℃～約１５℃の間の温度で行われる。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦは、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、または約１５℃の温度で実施される。
本開示はまた、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物などのＰＥＧを含有する検体の電荷変異体の共移動集団の分離を促進する方法を提供し、この方法は、（ｉ）本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックス、および（ｉｉ）電荷変異体の集団を含む分析物、を含むサンプルをｉｃＩＥＦに付すことを含む。いくつかの局面では、ＰＥＧ化タンパク質はＰＥＧ化抗体である。
いくつかの局面において、方法は、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを使用することを含み、サンプルマトリックスはグリシンを含むが、タウリンを含まない。いくつかの局面において、方法は、グリシンおよびタウリンも含むサンプルマトリックスを使用することを含み、タウリンは、サンプルマトリックス中のグリシンの存在によって引き起こされるベースライン干渉を低減する。分析物の電荷変異体（例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物中のＰＥＧ化タンパク質の異なる電荷変異体）の共移動は、単一の広いピークまたはいくつかの分解能の低いピークの存在としてエレクトロフェログラムで視覚化される。すなわち、ピークは一緒に移動する。したがって、サンプルマトリックス中のグリシンの存在は、ピーク間の分離を高めることができ、各ピークは、別個の電荷変異体または電荷変異体の部分集団に対応する。したがって、本開示は、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを含むサンプルを供することを含む、分析物の電荷変異体（例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物中のＰＥＧ化タンパク質の異なる電荷変異体）に対応する共移動ピークの分離を強化する方法を提供する。ここで、サンプルマトリックスはグリシンを含む。特定の局面において、グリシンは、約４０ｍＭの濃度、または上記で開示された任意の他の濃度でサンプルマトリックス中に存在する。
ピーク間の分離（すなわち、電荷変異体間の分離）の向上は、定量的または定性的に決定できるｉｃＩＥＦ分解能の向上である。例えば、試料マトリックス中のグリシンの存在によるｉｃＩＲＦ分解能の向上は、エレクトロフェログラム中のピークの数の増加（すなわち、観察される電荷変化種の数の増加）、エレクトロフェログラム中のピーク間の分離の増加、エレクトロフェログラム中のピーク間の重なりの減少、またはそれらの任意の組み合わせとして定量化することが可能である。
サンプルマトリックス中のグリシンの存在によるエレクトロフェログラムのピーク間の分離の向上、または一般にｉｃＩＥＦ分解能の向上は、参照に対して決定できる。いくつかの局面において、参照は、同じサンプルマトリックスを使用するがグリシンなしで得られるｉｃＩＥＦエレクトロフェログラムである。いくつかの局面において、参照は、従来のサンプルマトリックス、例えばグリシンの代わりに尿素を添加剤として使用するサンプルマトリックスを使用して得られたエレクトロフェログラム（電気泳動図）である。
特定の局面では、本開示は、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスおよびＰＥＧ化タンパク質を含むサンプルをｉｃＩＥＦに供することを含む、ｉｃＩＥＦ中のＰＥＧ化タンパク質の共移動ピークの分離を高める方法を提供する。いくつかの局面では、共移動ピークの分離を高めるために（または、一般に、ｉｃＩＥＦの解像度を上げるために）使用されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）およびグリシン（例えば、約４０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、メチルセルロース、およびグリシン（例えば、約４０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、メチルセルロース、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）、およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、約０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、および約４０ｍＭのグリシンを含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、約０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、約４０ｍＭのグリシン、および約５０ｍＭのタウリンを含む。
本開示はまた、ｉｃＩＥＦ中に本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを使用することを含む、マトリックス誘発ベースライン干渉を低減する方法を提供し、ここで、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスはタウリンを含む。いくつかの局面では、干渉は、基本領域干渉、すなわち、ｉｃＩＥＦエレクトロフェログラムの基本領域における干渉（例えば、波状のベースライン）である。いくつかの局面では、干渉は、サンプルマトリックス中の添加剤の存在によって、例えば、グリシンの存在によって引き起こされる可能性がある。
いくつかの局面では、ベースライン干渉の低減は、干渉剤、例えばグリシン、及びタウリンを含むｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを用いて得られたｉｃＩＥＦエレクトロフェログラムにおけるベースラインを、同じサンプルマトリックス（すなわち、干渉剤、例えばグリシンを含む）であってタウリンを含まない（すなわち、参照サンプルマトリックス）参照ｉｃＩＥＦエレクトロフェログラムにおいて観測されるベースラインと比較することによって決定することができる。いくつかの局面において、参照サンプルマトリックスは、グリシンおよび／またはタウリンを含まないサンプルマトリックスである。
ベースライン干渉の減少は、定量的または定性的に判断できる。例えば、ベースライン干渉の減少は、ベースラインにおける波または摂動の数の減少、またはそれらの振幅の減少として測定できる。一般に、ベースラインの干渉が減少すると、ベースラインの直線性が向上する。
いくつかの局面では、マトリックス誘発ベースライン干渉を低減するために使用されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、メチルセルロース、およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、メチルセルロース、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）、およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、約０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、および約５０ｍＭのタウリンを含む。いくつかの局面では、ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、約４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、約０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、約４０ｍＭのグリシン、および約５０ｍＭのタウリンを含む。
本開示は、また、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックス、例えば、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）及びタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含むｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを用いることからなるｉｃＩＥＦによって分離した分析物（例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物）の電荷変異体の定量精度を高める方法をも提供する。また、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックス、例えば、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）及びタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含むｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを使用してなるｉｃＩＥＦによって分離される分析対象（例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物）の電荷変異体の分離の再現性を向上する方法が提供される。本開示はまた、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックス、例えば、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）及びタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含むｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを使用してなるｉｃＩＥＦによって分離された分析物（例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物）の電荷変異体の回収率を高める方法を提供する。
また、分析物、例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物の熱安定性をモニターする方法であって、分析物を熱ストレスにさらすこと、次いで分析物の電荷変異体（例えば、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）及びタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含むｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを用いることからなるｉｃＩＥＦによって、分析物の電荷変異体（例えば、ＰＥＧ化タンパク質上のフラグメント又はアンフォールド形態に対応するもの）を分離することを含む。いくつかの態様において、熱安定性またはその欠如は、エレクトロフェログラムにおけるピークの不在、存在、または形状、またはそれらの組み合わせの関数として測定することができる。例えば、熱安定性の喪失は、ピークの広がり、主要ピーク面積の減少、酸性または塩基性電荷変種に対応するピークの数または面積の増加、またはそれらの任意の組み合わせとして可視化することができる。いくつかの態様において、熱応力は、例えば、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、または約５０℃への温度上昇を含んでなる。いくつかの態様において、熱ストレスは、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、又は約１０日間適用することができる。特定の態様において、被分析物は、約４０℃の温度に約１週間さらされる。
いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、分析物、例えば、ＰＥＧ化タンパク質組成物の熱安定性を監視するために用いることができ、分析物を熱ストレス、例えば、４０℃でのインキュベーション、例えば、７日間、に付すこと、及びその後、分析物の電荷変異体を（例えば。本明細書に開示されるｉｃＩＥＦサンプルマトリックス、例えば、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）及びタウリン（例えば、約５０ｍＭ）を含むｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを用いることからなるｉｃＩＥＦによる、分析対象物の電荷変異体（例えば、ＰＥＧ化タンパク質上のフラグメント又はアンフォールド形態に相当）を分離することである。いくつかの局面において、本明細書に開示された方法は、分析物、例えばＰＥＧ化タンパク質組成物の脱アミド化生成物、例えばアスパラギン脱アミド化生成物の生成、存在、または不在をモニタリングするために使用することができる。いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、分析物、例えばＰＥＧ化タンパク質組成物のアスパラギン脱アミド化生成物などの分解生成物、例えば脱アミド化生成物のレベルを定量化するために使用することができる。したがって、本明細書に開示される方法は、最適な条件、例えば、生産（例えば、目的のタンパク質へのＰＥＧのコンジュゲーション中の収率、安定性、純度、または分解生成物の存在／不在を測定するため）、精製（例えば、ＰＥＧ化タンパク質の精製中の収量、安定性、純度、または分解生成物の存在／不在を測定するため）、製剤化（例えば、ＰＥＧ化タンパク質の製剤化中またはその後の安定性、または分解生成物の存在／不在を測定するため）、保存（例えば、ＰＥＧ化タンパク質、または粗抽出物もしくは部分精製ＰＥＧ化タンパク質、精製ＰＥＧ化タンパク質、または製剤化タンパク質などのそのようなタンパク質を含む組成物の貯蔵中もしくはその後の安定性、または分解生成物の存在／不在を測定するため）、または分析物、例えばＰＥＧ化タンパク質組成物の投与（例えば、対象へのＰＥＧ化タンパク質の投与前または投与中の安定性、または分解生成物の存在／不在を測定するため）について、最適条件を求めるために使用できる。
いくつかの局面では、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦ法の定量限界（ＬＯＱ）、すなわち、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）は、約０．０２８ｍｇ／ｍＬである。いくつかの局面では、本明細書に開示されるｉｃＩＥＦ法の検出限界（ＬＯＤ）、すなわち、少なくとも１つのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）キャリア両性電解質（例えば、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０）、グリシン（例えば、約４０ｍＭ）およびタウリン（例えば、約５０ｍＭ）は、約０．００８ｍｇ／ｍＬである。
例１
改善されたｉｃＩＥＦサンプルマトリックスの設計と特性評価
Ｉ．物質
０．５％メチルセルロース溶液、１％メチルセルロース溶液、ｉＣＥ電解質キット、ｐＩマーカー４．６５、ｐＩマーカー６．６１、Ａｌｃｏｔｔ ７２０ＮＶオートサンプラー付きｉＣＥ３装置を用い、およびＦＣ（フルオロカーボン）カートリッジはＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅから購入した。ＦＣカートリッジは、５０ｍｍで、１００μｍ（内径）であり、フルオロカーボンでコーティングされたキャピラリーと内蔵の電解質タンクを備えていた。尿素粉末とホルムアミドはＪＴＢａｋｅｒから購入した。ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）４－６．５およびＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）５－８はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。グリシンとタウリンはＳｉｇｍａから購入した。脱イオン水はＶＷＲから購入した。すべてのタンパク質サンプルは低塩バッファーで培養、精製、および調合されており、ｉｃＩＥＦアッセイにはそれ以上の脱塩ステップは必要なかった。
改善されたｉｃＩＥＦサンプルマトリックスの設計と特性評価
Ｉ．物質
０．５％メチルセルロース溶液、１％メチルセルロース溶液、ｉＣＥ電解質キット、ｐＩマーカー４．６５、ｐＩマーカー６．６１、Ａｌｃｏｔｔ ７２０ＮＶオートサンプラー付きｉＣＥ３装置を用い、およびＦＣ（フルオロカーボン）カートリッジはＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅから購入した。ＦＣカートリッジは、５０ｍｍで、１００μｍ（内径）であり、フルオロカーボンでコーティングされたキャピラリーと内蔵の電解質タンクを備えていた。尿素粉末とホルムアミドはＪＴＢａｋｅｒから購入した。ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）４－６．５およびＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）５－８はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。グリシンとタウリンはＳｉｇｍａから購入した。脱イオン水はＶＷＲから購入した。すべてのタンパク質サンプルは低塩バッファーで培養、精製、および調合されており、ｉｃＩＥＦアッセイにはそれ以上の脱塩ステップは必要なかった。
ＩＩ．方法
（ａ） ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスの調製
ｉｃＩＥＦサンプルは、次の最終濃度になるように試薬を組み合わせて調製した： メチルセルロース０．３５％（ｗ：ｖ、すなわち重量対体積）、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０ ４％（ｖ：ｖ、すなわち体積対体積）、グリシン４０ｍＭ、タウリン５０ｍＭ、ｐＩマーカー４．６５ ０．５％（ｖ：ｖ）、ｐＩマーカー６．６１ ０．５％（ｖ：ｖ）。
分析物（タンパク質）を試薬混合物（サンプルマトリックス）に添加して、最終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬにした。調製したサンプルをボルテックスミキサーで穏やかに混合した。
（ａ） ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスの調製
ｉｃＩＥＦサンプルは、次の最終濃度になるように試薬を組み合わせて調製した： メチルセルロース０．３５％（ｗ：ｖ、すなわち重量対体積）、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０ ４％（ｖ：ｖ、すなわち体積対体積）、グリシン４０ｍＭ、タウリン５０ｍＭ、ｐＩマーカー４．６５ ０．５％（ｖ：ｖ）、ｐＩマーカー６．６１ ０．５％（ｖ：ｖ）。
分析物（タンパク質）を試薬混合物（サンプルマトリックス）に添加して、最終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬにした。調製したサンプルをボルテックスミキサーで穏やかに混合した。
遠心機は１０℃に設定した。調製したサンプルを１０，６２１ｒｃｆで３分間遠心分離した。遠心分離後、１６０μＬの調製済みサンプルを３００μＬバイアルに移した。バイアルを、装置のサンプルコンパートメントに配置した。
（ｂ） ｉＣＥ３機器パラメータ
ｉＣＥ３装置を準備し、ベンダーからの装置ガイドラインに従ってＦＣカートリッジを取り付けた。使用したｉＣＥ３機器パラメーターは次の通りである。フォーカス電圧： ３０００Ｖ；オートサンプラー温度： １０℃±１℃；検出： ＵＶ ２８０ｎｍ；サンプル注入圧力： ２０００ｍｂａｒ；事前フォーカス時間： １分、フォーカス時間： ８分。
（ｃ）ソフトウェア
データ取得にはｉＣＥ ＣＦＲソフトウェアを使用し、データ解析のためにエレクトロフェログラムをＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアにインポートした。
ｉＣＥ３装置を準備し、ベンダーからの装置ガイドラインに従ってＦＣカートリッジを取り付けた。使用したｉＣＥ３機器パラメーターは次の通りである。フォーカス電圧： ３０００Ｖ；オートサンプラー温度： １０℃±１℃；検出： ＵＶ ２８０ｎｍ；サンプル注入圧力： ２０００ｍｂａｒ；事前フォーカス時間： １分、フォーカス時間： ８分。
（ｃ）ソフトウェア
データ取得にはｉＣＥ ＣＦＲソフトウェアを使用し、データ解析のためにエレクトロフェログラムをＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアにインポートした。
ＩＩＩ．結果と考察：
一般的なｉｃＩＥＦマトリックスでは、ＰＥＧ化タンパク質Ａの主要ピークから酸性変異体と塩基性変異体を分離できなかったため、等電点電気泳動で１つのピークがマージされた（図１）。ｉｃＩＥＦアッセイでは、ピークは通常、最大のピーク高さを示す主要ピークに対するｐＩ値に基づいてグループ化される。主要ピークの前のピークは酸性基を表し、後のピークは塩基性基を表す。主要なピークと塩基性のピークは、共通の添加尿素の存在下であっても、ＰＥＧ化タンパク質Ａの等電点電気泳動中に共移動した。酸性ピークも主ピークからほとんど分離されなかった（図１）。
一般的なｉｃＩＥＦマトリックスでは、ＰＥＧ化タンパク質Ａの主要ピークから酸性変異体と塩基性変異体を分離できなかったため、等電点電気泳動で１つのピークがマージされた（図１）。ｉｃＩＥＦアッセイでは、ピークは通常、最大のピーク高さを示す主要ピークに対するｐＩ値に基づいてグループ化される。主要ピークの前のピークは酸性基を表し、後のピークは塩基性基を表す。主要なピークと塩基性のピークは、共通の添加尿素の存在下であっても、ＰＥＧ化タンパク質Ａの等電点電気泳動中に共移動した。酸性ピークも主ピークからほとんど分離されなかった（図１）。
別のｉｃＩＥＦ適合性変性剤であるホルムアミド（Zhang et al. (2017) Analytical Biochemistry 521:1-7）を使用して実験を繰り返したところ、尿素を使用した場合と同様の電荷プロファイルが得られた。高濃度の尿素とホルムアミドを使用して実験を繰り返すと、電荷プロファイルの再現性が悪化した（データは示していない）。
幅の狭い両性電解質、つまり狭いｐＨ範囲をカバーするキャリア両性電解質は、通常、ピーク分解能を高め（Righetti et al. (2007) Electrophoresis 28:3799-3810）、電荷変異体をより適切に分離できる。狭い両性電解質を使用してＰＥＧ化タンパク質Ａサンプルに存在するさまざまな種を分離しようとした場合、わずかに良好な分離が観察された。したがって、幅の狭い両性電解質ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）４－６．５およびＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）５－８を追加すると、分離がわずかに改善されたが、幅の広い共移動ピークを解決するには不十分であった（図２）。
グリシンは、ドデシル硫酸ナトリウム キャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）のバッファー成分として報告されており、ＰＥＧ化タンパク質のサイズに基づく分離を強化できる(Molek & Zydney (2008) Capillary electrophoresis of PEGylated proteins. In AIChE100 - 2008 AIChE Annual Meeting, Conference Proceedings (AIChE Annual Meeting, Conference Proceedings))。分析対象物のサイズに基づく分離では、グリシンは、サイズ変異体に対応する２つの既に十分に分離されたピークの分解能を向上させることができる： ＰＥＧ化部分と非ＰＥＧ化部分。ただし、等電点電気泳動法におけるＰＥＧ化タンパク質の電荷変異体の共移動ピークの潜在的な分離に関する以前の報告はない。
したがって、ＰＥＧ化タンパク質Ａの画像化キャピラリー等電点電気泳動にグリシンを使用した。実験結果は、グリシンがＰＥＧ化タンパク質Ａの電荷変異体の分離を強化し（図３）、主要ピークと塩基性ピークの共移動が起こらないことを示した。より長く観察される。分解能の大幅な向上につながるメカニズムは、タンパク質吸着の減少と過剰なジュール熱の減少による可能性がある。これは、双性イオンを使用したタンパク質の分離サイズベースのキャピラリー電気泳動中に観察されるものと同様である(Bushey & Jorgenson (1989) Journal of Chromatography A 480:301-310;Bushey&Jorgenson(1989)Journal of Chromatography A 480:301-310)。
サンプルマトリックスにグリシンが存在することによる分解能の増加が観察されたが、ｉｃＩＥＦマトリックスにグリシンを含めると、基本領域に大きなベースライン波が発生し、積分と定量が大幅に妨げられた（図３）。したがって、グリシンによって引き起こされる悪影響を補うための解決策を特定する必要があった。
アッセイをさらに最適化するために、タウリンを導入した。タンパク質に組み込まれない硫黄含有アミノ酸の1つであるタウリンは、タンパク質製剤の賦形剤として安全に使用できる(Arakawa et al. (2007) Amino Acids 33:587-605)。サンプルマトリックスへのタウリンの添加により、グリシンによって引き起こされる基本領域のベースライン干渉がうまく排除され（図３）、基本的な電荷変異体の正確な積分と定量が可能になった。
以前に報告されたいくつかの両性イオンと同様に、グリシンはキャピラリー表面に動的コーティングを形成する可能性があり(Gong & Ho (1997) Electrophoresis 18:732-735)、これがベースライン干渉の最も可能性の高い原因である。コーティングされていないシリカキャピラリーの代わりに、FCコーティングされたキャピラリーが使用された。動的コーティングは、コーティングされていないシリカ キャピラリーとコーティング済みのキャピラリーの両方を使用して可能である(Nowak et al. (2017) Anal Bioanal. Chem. 409:1493-1501)。我々の考察では、グリシンがＦＣコーティングキャピラリーを動的にコーティングし、ベースライン干渉を引き起こしている可能性が高く、タウリンは両性イオンとしてグリシンと競合し、グリシンがキャピラリー壁に付着するのを防ぎ、結果としてサンプルマトリックス中のグリシンの存在によって引き起こされるマトリックスによるベースライン干渉を低減していることが示唆された。
タウリンを含む場合と含まない場合のエレクトロフェログラムは、再現性が高いことがわかった。ｐＩ ５．８６付近のマイナーな塩基性ピークは、タウリンの添加後に隣接する塩基性ピークにマージされる可能性が最も高いが（図３）、塩基性基の合計パーセンテージは非常に類似したままであった。ｉｃＩＥＦアッセイは、通常、製品の品質管理の一環として、酸性基、主要基、および塩基性基の合計パーセンテージを監視するために使用されるため、マイナーな塩基性ピークのマージは、塩基性基の合計パーセンテージの定量化にほとんどまたはまったく影響しない。一方、タウリンの非存在下での有意なベースライン波は、塩基性基と主要ピークに少なくとも１０％の変動を加え、アッセイの定量と検出限界を低下させた。したがって、ベースライン波の除去により、酸性基、主要基、および塩基性基の正確な定量化が保証された。
グリシンとタウリンは、最適な条件を見つけるために方法開発中に滴定した。０ｍＭ～２００ｍＭの一連のグリシン濃度を試験したところ、４０ｍＭグリシンで十分な分離能が得られ、主要なピークから酸性種と塩基性種を分離できた。さらに、得られた電荷プロファイルは、タンパク質の特性評価の結果と一致していた。タウリンは０ｍＭ～２００ｍＭで滴定され、ベースライン波を除去するには５０ｍＭタウリンで十分であり、全体的な電荷プロファイルへの影響は最小限であった。
方法の精度は、新しいグリシン－タウリン（ＧＬＹ－Ｔ）サンプルマトリックスを使用したＰＥＧ化タンパク質Ａの複数回の注入と複数回のサンプル前処理によって確認され、図４のｅ－ｇｒａｍ（エレクトロフェログラム）オーバーレイによって示されるように、電荷プロファイルは一貫して再現可能だった。
また、多重サンプル調製の精度は、３つのピーク群のピーク面積の割合の標準偏差で評価し、標準偏差は酸性基、主要基、塩基性基でそれぞれ０．３％、０．５％、０．３％であった（表１）。
ＧＬＹ－Ｔサンプルマトリックスを使用してアッセイの品質を保証するために、直線性と精度の検討、および機器のオートサンプラーでのサンプル安定性試験を行った。線形性は、公称濃度の５０％、７５％、１００％、１２５％、および１５０％のＰＥＧ化タンパク質Ａを３回調製することによって確認した。次に、ピーク面積をタンパク質濃度の線形関数として分析した。Ｒ２はすべての線形曲線で０．９８より大きく、すべての線形曲線の残差プロットはかなりランダムなパターンを示し、線形モデルに適切に適合していることを示していた。
精度は、ブランクマトリックス（製剤バッファー）にＰＥＧ化タンパク質Ａをスパイクすることによって分析した。スパイクしたサンプルは、ターゲット濃度の５０％～１５０％の直線範囲で５つのレベルで３重で調製した。次に、方法の精度を評価するために回収率％を計算した。回収率％は、酸性基、主ピーク、および塩基性基について、それぞれ９３．２％～１０９．９％、９８．０％～１０１．９％、および９４．６％～１０７．３％の範囲内であった（表２）。
直線性と精度の検討結果はＩＣＨガイドライン(ICH Guideline Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, November 2005)に準拠している。サンプルは装置のオートサンプラーで２４時間安定であり、０時間と２４時間でのＰＥＧ化タンパク質Ａのｅ－ｇｒａｍオーバーレイに明らかな変化は観察されなかった（図５）。
安定性の検討を、温度ストレスを受けたＰＥＧ化タンパク質Ａを使用して行った。ＰＥＧ化タンパク質Ａは、穏やかな熱ストレス条件（４０℃で１週間）で処理した。新しいＧＬＹ－Ｔサンプルマトリックスを使用すると、熱ストレスを受けたサンプルでは、主要ピーク面積が減少し、酸性種と塩基性種が増加した。
定量限界（ＬＯＱ）は、０．００２ｍｇ／ｍＬ～０．０３２ｍｇ／ｍＬの低いタンパク質濃度値を使用して線形回帰によって決定した。実験を３回繰り返し、各濃度で３回注入した。ＬＯＱは、線形曲線の勾配に対するｙ切片の標準偏差の１０倍として計算した(Shrivastava & Gupta (2011) Chron. Young Sci. 2:21-25)。
検出限界（ＬＯＤ）は、ＬＯＤ＝３ｘＬＯＱ／１０ (Shrivastava & Gupta (2011) Chron. Young Sci. 2:21-25)を用いて、ＬＯＱから評価した。その後、新しいｉｃＩＥＦアッセイのＬＯＱとＬＯＤを決定し、約０．０２８ｍｇ／ｍＬと０．００８ｍｇ／ｍＬであることを確認した。
堅牢性の検討を、ｉｃＩＥＦとＧＬＹ－Ｔサンプルマトリックスを使用して行った。まず、オートサンプラーの温度と集束時間が新しいアッセイの堅牢性にどのように影響するかを評価した。電荷分布は、オートサンプラーで±１℃以内、フォーカシング中は±０．５分間でほぼ一定であった（表３）。
メチルセルロース、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、グリシン、タウリンなどのすべての重要な試薬を評価するために、別の堅牢性検討を行った。各試薬は公称濃度の９０％と１１０％でテストされ、結果として得られた３つのピークグループの％ピーク面積が公称条件のものと比較された。結果は、一般的な機器誤差範囲(Salas-Solano et al. (2012) J. Sep. Sci. 35:3124-3129)内で、さまざまな条件と公称条件の間で非常に類似していた（表３）。
最後に、重要な試薬の組み合わせの影響を評価して、最悪のシナリオを見つけた。この検討には、３つの独立変数（ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）の濃度、グリシンの濃度、およびタウリンの濃度）と各変数の２つのレベル（ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、グリシン、およびタウリンの公称濃度の９０％および１１０％）が含まれていた。３通で８（２３＝８）の可能な組み合わせ、したがって２４の条件を評価した。結果は、最悪のシナリオでも％ピーク面積の変化が非常に小さいことを示した（表４）。
ａ）「－」の記号は、変数の表示濃度に「－１０％」が適用されることを示す。「＋」の記号は、変数の表示濃度に「＋１０％」が適用されることを示す。
ｂ）表に示すように、次の順序を使用して組み合わせを割り当てる。ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、グリシン、タウリン。例えば、「－＋－」の組み合わせは、「ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）－１０％、グリシン＋１０％、タウリン－１０％」の状態を表す。
ｂ）表に示すように、次の順序を使用して組み合わせを割り当てる。ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、グリシン、タウリン。例えば、「－＋－」の組み合わせは、「ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）－１０％、グリシン＋１０％、タウリン－１０％」の状態を表す。
また、表４の結果は、ＪＭＰソフトウェアの望ましさプロファイリング機能を使用して統計的に評価した。ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、グリシン、およびタウリンの濃度はＸ変数であり、酸性、主および塩基性基について得られたパーセンテージピーク面積はＹ応答であった。図６に示すように、プロットマトリックスの一番下の行には、各Ｘ変数の望ましさのトレースを示すプロットがあった。３つのＸ変数すべての全体的な望ましさの尺度は、０から１のスケールで表した（図６）。ソフトウェアは各応答の望ましさ関数を指定し、すべての応答の全体的な望ましさは、個々の応答の望ましさ関数の幾何平均として定義した(Derringer & Ronald, S. (1980) Journal of Quality Technology 12:214-219)。３つのＸ変数（ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、グリシン、およびタウリン）が公称濃度にある場合、すべての応答の全体的な望ましさは０．９９７というほぼ完璧なスコアに達し（図６）、ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、グリシン、およびタウリンの公称濃度がさらに確認された。ＧＬＹ－Ｔサンプルマトリックス中、すなわち、４％ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）、４０ｍＭグリシン、および５０ｍＭタウリンが最適であった。
非ＰＥＧ化タンパク質Ａの電荷変異体は、一般的なｉｃＩＥＦアッセイ条件を使用して分離できる。ただし、ｉｃＩＥＦと一般的に使用されるサンプルマトリックス（尿素やホルムアミドなどの添加剤を含む）を使用すると、ＰＥＧ化とその後の精製プロセスによる変化を捉えることができない。このように、新しく開発したＧＬＹ－Ｔサンプルマトリックスにより、ＰＥＧ化タンパク質Ａとその異なる電荷変異体を分析し、ＰＥＧ化およびその後の精製過程で生じる変化を捉えることが可能となった。
ＧＬＹ－Ｔサンプルマトリックスを使用して、他のいくつかのＰＥＧ化タンパク質と抗体をさらに試験した。一般的な尿素含有サンプルマトリックスをＧＬＹ－Ｔサンプルマトリックスに置き換えた場合、それらのすべてがより良い分離を示した。一例として、ＰＥＧ化抗体Ｂは、ＧＬＹ－Ｔマトリックスを使用して電荷変異体をより良好に分離することを示した（図７）。
結論として、新たに開発されたＧＬＹ－Ｔサンプルマトリックスにより、ＰＥＧ化タンパク質のｉｃＩＥＦ分離が可能になり、再現性、直線性、精度、サンプルの安定性、および方法の堅牢性が達成された。その結果、ＰＥＧ化前のタンパク質の分析など、ＰＥＧ化および精製プロセス中に加えられた変化を捉えることができない、ＰＥＧ化タンパク質の電荷変異体を分析するための間接的な方法を実装する必要がなくなった。我々の観察は、ＧＬＹ－Ｔ ｉｃＩＥＦサンプルマトリックスが、実際の結合状態のＰＥＧ化タンパク質の電荷変異体の分析に優れた解決を提供し、現在使用されている従来の方法よりもＰＥＧ化タンパク質の電荷変異体に関するより正確な定量的および定性的な情報を提供することを示している。．
例２
ＰＥＧ化タンパク質Ａの熱分解の定量化
ＰＥＧ化タンパク質Ａについて、４０℃で７日間のインキュベーションによる強制分解を行った。ＰＥＧ化タンパク質Ａとその熱分解生成物は、上記の実験条件を使用して分離した。サンプルマトリックスは、４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、４０ｍＭのグリシンおよび５０ｍＭのタウリンを含んでいた。ＰＥＧ化タンパク質Ａサンプルを脱イオン水で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
ＰＥＧ化タンパク質Ａの熱分解の定量化
ＰＥＧ化タンパク質Ａについて、４０℃で７日間のインキュベーションによる強制分解を行った。ＰＥＧ化タンパク質Ａとその熱分解生成物は、上記の実験条件を使用して分離した。サンプルマトリックスは、４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、４０ｍＭのグリシンおよび５０ｍＭのタウリンを含んでいた。ＰＥＧ化タンパク質Ａサンプルを脱イオン水で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、サンプルマトリックスでさらに０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。サンプルは１５００Ｖで１分間、次に３０００Ｖで８分間フォーカスした。
ＰＥＧ化タンパク質Ａの強制分解（図８）により、主要ピークが減少し、主要ピークより酸性（約ｐＨ５．２６）および塩基性（約ｐＨ５．５４）のピーク領域が増加した。これは、実験で使用された改善されたｉｃＩＥＦサンプルマトリックスが、主要ピークの無傷のＰＥＧ化タンパク質Ａから酸性および塩基性ピークの分解生成物を良好に分離できることを示している。
酸性ピークにおける分解されたタンパク質を、上記のように陰イオン交換ＨＰＬＣ（ＡＥＸ ＨＰＬＣ）によって精製した。収集された酸ピークタンパク質はＬＣ－ＭＳペプチドイメージング（画像化）によって分析し、アスパラギン脱アミド化ＰＥＧ化タンパク質Ａがサンプル中の主な分解生成物として同定された。精製された酸性形態を使用してＰＥＧ化タンパク質Ａサンプルをスパイクし、スパイクされたサンプルをｃｉＩＥＦにかけた（図９）。ｃｉＩＥＦは、スパイクされたサンプルでアスパラギン脱アミド化フォームの増加を検出した。
アスパラギンの脱アミド化は、ｉｃＩＥＦの酸性ピークの一般的な原因である。したがって、本開示のｉｃＩＥＦサンプルマトリックスは、アスパラギン脱アミド化成分がＰＥＧ化タンパク質Ａにスパイクされたとき、酸性ピークの増加を首尾よく捕捉した。
したがって、本開示のｉｃＩＥＦマトリックスは、ＰＥＧ化タンパク質の精製に有用であるだけではない。さらに、ｉｃＩＥＦマトリックスを使用して、分解、例えば熱分解、および分解生成物、例えばアスパラギン脱アミド化生成物の出現を検出した。さらに、アスパラギン脱アミド化産物に対応するピーク面積の増加、および他のピークに変化がないことは、開示された方法を使用してＰＥＧ化タンパク質分解を定量化できることを示している。
詳細な説明セクションは、要約セクションおよび要約セクションではなく、請求項を解釈するために使用されることを意図していることを理解されたい。概要および要約のセクションは、発明者によって考えられるように、本発明のすべてではないが１つまたは複数の例示的な実施形態を記載することがあり、したがって、本発明および添付の特許請求の範囲を決して限定することを意図するものではない。
以上、本発明を、指定された機能およびその関係の実装を示す機能的な構成要素の助けを借りて説明した。これらの機能構成要素の境界は、本明細書において、説明の便宜のために任意に定義されている。指定された機能及びその関係が適切に実行される限り、代替的な境界を定義することができる。
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにするので、他の人は、当業者の範囲内の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく、逸脱することなく、特定の実施形態などの様々な用途に容易に修正および／または適合させることができる。本発明の一般的な概念から。したがって、そのような適応および修正は、本明細書で提示される教示およびガイダンスに基づいて、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書の用語または用語は、本明細書の用語または用語が教示およびガイダンスに照らして当業者によって解釈されるように、限定ではなく説明を目的としていることが理解されるべきである。
本発明の広さおよび範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、特許請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
本出願を通じて引用される可能性のあるすべての引用文献（参考文献、特許、特許出願、およびウェブサイトを含む）の内容は、その中で引用されている参考文献と同様に、いかなる目的のためにも参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
Claims (39)
- グリシンおよび／またはタウリンを含む画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）サンプルマトリックス。
- グリシンが約１ｍＭ～約２００ｍＭの間の濃度である、請求項１に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- グリシンが、約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度である、請求項２に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- グリシンが、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、または約１２０ｍＭの濃度である、請求項２に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- グリシンが約３０ｍＭ～約５０ｍＭの間の濃度である、請求項２に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- グリシンが約３６ｍＭ～約４４ｍＭの間の濃度である、請求項２に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- グリシンが約４０ｍＭの濃度である、請求項２に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- タウリンが約１ｍＭ～約２００ｍＭの間の濃度である、請求項１～７のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- タウリンが、約１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約９０ｍＭ、約１ｍＭ～約８０ｍＭ、約１ｍＭ～約７０ｍＭ、約１ｍＭ～約６０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２０ｍＭ～約８０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約２０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約３０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約６０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約４０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度である、請求項８に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- タウリンが、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、または約１２０ｍＭの濃度である、請求項８に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- タウリンが約４０ｍＭ～約６０ｍＭの間の濃度である、請求項８に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- タウリンが約４５ｍＭ～約５５ｍＭの間の濃度である、請求項８に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- タウリンが約５０ｍＭの濃度である、請求項８に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- キャリア両性電解質をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- キャリア両性電解質がＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）である、請求項１４に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- ＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）がＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０である、請求項１４に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- キャリア両性電解質が約２％～約６％（ｖ：ｖ）の濃度である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- キャリア両性電解質が約３．６％～４．４％の濃度である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- キャリア両性電解質が約４％（ｖ：ｖ）の濃度である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- メチルセルロースをさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- メチルセルロースが約０．３５％（ｗ：ｖ）の濃度である、請求項１９に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- 約４０ｍＭのグリシンおよび約５０ｍＭのタウリンを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- ４％（ｖ：ｖ）のＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥ（登録商標）３－１０、０．３５％（ｗ：ｖ）のメチルセルロース、約４０ｍＭのグリシンおよび約５０ｍＭのタウリンを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックス。
- ｉｃＩＥＦ中に請求項１～２３のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを使用することを含む、マトリックス誘発ベースライン干渉を低減する方法。
- 前記干渉は基本領域干渉である、請求項２４に記載の方法。
- ベースライン干渉が、タウリンを含まない参照サンプルマトリックスを使用した場合に観察されるベースライン干渉と比較して減少する、請求項２４または２５に記載の方法。
- タウリンを含まない参照サンプルマトリックスが尿素含有マトリックスである、請求項２６に記載の方法。
- 請求項１～２３のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを含むサンプルおよびＰＥＧ化タンパク質をｉｃＩＥＦに供することを含む、ＰＥＧ化タンパク質の等電点（ｐＩ）を測定する方法。
- 請求項１～２３のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックスおよびＰＥＧ化タンパク質を含むサンプルをｉｃＩＥＦに供することを含む、ｉｃＩＥＦ中のＰＥＧ化タンパク質の共移動ピークの分離を高める方法。
- ＰＥＧ化タンパク質が約０．２５ｍｇ／ｍＬ～約０．７５ｍｇ／ｍＬの間の濃度である、請求項２８または２９に記載の方法。
- ＰＥＧ化タンパク質が約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
- ｉｃＩＥＦが、（ｉ）キャリア両性電解質がキャピラリー内でｐＨ勾配を形成するように、第１の所定の期間、第１の電圧を印加すること、および（ｉｉ）変異体の全体の電荷が中性になるように、キャピラリー内のタンパク質の電荷変異体の移動をフォーカスさせるために、第２の所定の期間で第２の電圧を印加することを含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の電圧が約１５００Ｖであり、前記第１の所定の時間が約１分である、請求項３２に記載の方法。
- 前記第２の電圧が約３０００Ｖであり、前記第２の所定の時間が約８分である、請求項３２または３３に記載の方法。
- ｉｃＩＥＦ中に請求項１～２３のいずれか一項に記載のｉｃＩＥＦサンプルマトリックスを使用することを含む、ＰＥＧ化タンパク質の安定性を決定する方法。
- 安定性が熱安定性である、請求項３５に記載の方法。
- 熱安定性を、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃または５０℃でＰＥＧ化タンパク質のインキュベーションに続いて決定する、請求項３６に記載の方法。
- ＰＥＧ化タンパク質を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間インキュベートする、請求項３７に記載の方法。
- 安定性の決定は定量的である、請求項３５に記載の方法。
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