PT2349314E - Formulações de vwf recombinante liofilizado - Google Patents

Description

ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

DESCRIÇÃO

"Formulações de VWF recombinante liofilizado" CAMPO DA INVENÇÃO

Genericamente, a invenção refere-se a formulações de VWF recombinante liofilizado e métodos para a preparação de uma composição liofilizada compreendendo VWF recombinante.

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO 0 factor de von Willebrand (VWF) é uma glicoproteina que circula no plasma na forma de uma série de multimeros que variam em tamanho de cerca de 500 a 20 000 kD. As formas multiméricas de VWF são compostas por subunidades polipeptidicas de 250 kD ligadas por ligações de dissulfureto. 0 VWF medeia a adesão inicial das plaquetas ao sub-endotélio da parede danificada de vasos. Apenas os multimeros maiores exibem actividade hemostática. Assume-se que as células endoteliais segregam formas poliméricas grandes de VWF e que as formas de VWF que possuem um baixo peso molecular (VWF de baixo peso molecular) surgem de clivagem proteolitica. Os multimeros possuindo grandes massas moleculares são armazenados nos corpos de Weibel-Pallade das células endoteliais e libertados por estimulação. O VWF é sintetizado por células endoteliais e megacariócitos na forma prépró-VWF que consiste numa grande extensão de domínios repetidos. Por clivagem do péptido de sinal, o pró-VWF dimeriza através de ligações de dissulfureto na sua região C-terminal. Os dímeros servem de protómeros para multimerização, que é governada por ligações de dissulfureto entre os terminais das extremidades livres. A montagem em multimeros é seguida pela remoção proteolitica da sequência do pró-péptido (Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261). O produto primário da tradução previsto a partir do ADNc clonado de VWF é um polipéptido precursor de 2813 resíduos (prépró-VWF). O prépró-VWF consiste num péptido de sinal de 22 aminoácidos e um pró-péptido de 741 aminoácidos, 2 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ compreendendo ο VWF maduro 2050 aminoácidos (Ruggeri Z.A., e Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993)).

Defeitos no VWF são causais da doença de Von Willebrand (DvW), que é caracterizada por um fenótipo de hemorragia mais ou menos pronunciado. A DvW do tipo 3 é a forma mais grave em que o VWF está completamente ausente, e a DvW do tipo 1 refere-se a uma perda quantitativa de VWF e o seu fenótipo pode ser muito moderado. A DvW do tipo 2 refere-se a defeitos qualitativos do VWF e pode ser tão grave como a DvW do tipo 3. A DvW do tipo 2 tem muitas subformas, estando algumas delas associadas à perda ou diminuição de multimeros de elevado peso molecular. A sindrome de von Willebrand do tipo 2a (VWS-2A) é caracterizada por uma perda tanto de multimeros grandes como intermédios. A VWS-2B é caracterizada por uma perda de multimeros com o maior peso molecular. São conhecidas na especialidade outras doenças e desordens relacionadas com o VWF.

As Patentes US 6,531,577, 7,166,709, e a Patente Europeia EP 152 312, descrevem formulações de VWF derivado do plasma. Contudo, para além de problemas relacionados com a quantidade e a pureza, com o VWF derivado de plasma existe também um risco de transmissão de patogénios veiculados pelo sangue (e.g., vírus e Variante da doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ-v). Adicionalmente, sabe-se que o VWF forma agregados durante condições de stress.

Assim, existe uma necessidade na especialidade de desenvolvimento de uma formulação farmacêutica estável compreendendo VWF recombinante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona formulações úteis para liofilização de VWF recombinante, que resultam numa composição farmacêutica altamente estável. A composição farmacêutica estável é útil como agente terapêutico no tratamento de indivíduos que sofrem de desordens ou condições que podem beneficiar da administração de VWF recombinante. 3 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Numa concretização, é proporcionada uma formulação farmacêutica liofilizada estável de um Factor de von Willebrand recombinante (rVWF) de acordo com a reivindicação 1.

Em outra concretização, o rVWF compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3. Em ainda outra concretização, o agente tamponante é seleccionado do grupo que consiste em citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris e combinações destes agentes. Em ainda outra concretização, o agente tamponante é citrato. Em várias concretizações, o pH está na gama de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, cerca de 6,5 a cerca de 7,5, ou cerca de 7,3. Em outra concretização, o pH é de cerca de 7,3.

Em outra concretização, o supramencionado aminoácido é seleccionado do grupo que consiste em glicina, histidina, prolina, serina, alanina e arginina. Em outra concretização, o aminoácido está numa gama de concentrações de cerca de 0,5 mM a cerca de 300 mM. Em ainda outra concretização, o aminoácido é glicina numa concentração de cerca de 15 mM.

Numa concretização da invenção, o rVWF compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3; em que o agente tamponante é citrato e o pH é cerca de 7,3; e em que o aminoácido é glicina numa concentração de cerca de 15 mM.

Em ainda outra concretização da invenção, os supramencionados um ou mais agentes estabilizantes são seleccionados do grupo que consiste em manitol, lactose, sorbitol, xilitol, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glucose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glucosamina, frutose e combinações destes agentes estabilizantes. Numa concretização, os agentes estabilizantes são trealose numa concentração de cerca de 10 g/L mM e manitol numa concentração de cerca de 20 g/L.

Em ainda outra concretização da invenção, o supramencionado tensioactivo é seleccionado do grupo que consiste em digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 e combinações destes tensioactivos. Em ainda outra concretização, o tensioactivo é TWEEN-80 a cerca de 0,01 g/L. 4 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Em outra concretização da invenção, o rVWF compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3; em que o agente tamponante é citrato numa concentração de cerca de 15 mM a cerca de pH 7,3; em que o aminoácido é glicina numa concentração de cerca de 15 mM; em que os agentes estabilizantes são trealose numa concentração de cerca de 10 g/L e manitol numa concentração de cerca de 20 g/L; e em que o tensioactivo é TWEEN-80 a cerca de 0,1 g/L.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a análise ANCOVA de actividade de VWFrRCo agrupada em lotes avaliados quanto à estabilidade (armazenados a 5°C ± 3°C). A Figura 2 mostra o aumento na humidade residual em PFF de rVWF armazenadas a 5°C ± 3°C. A Figura 3 mostra o aumento na humidade residual em PFF de rVWF armazenadas a 40°C ± 2°C. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definição de termos A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é normalmente entendido por uma pessoa competente na matéria à que pertence a presente invenção. As referências que se seguem proporcionam a um perito uma definição geral de muitos dos termos utilizados na presente invenção: Singleton, et ãl., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale e Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991) .

Cada publicação, pedido de patente, patente, e outra referência aqui citados, estão incorporados por referência na sua totalidade na extensão em que não são inconsistentes com a presente divulgação. 5 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Note-se aqui que, como utilizado na presente descrição e nas reivindicações anexas, as formas singulares "o", "a", "um" e "uma" incluem as referências no plural a menos que o contexto dite claramente de outro modo.

Como aqui se utilizam, os termos que se seguem têm os significados que lhes são atribuídos a menos que especificado de outro modo. 0 termo "compreendendo", em relação a um composto peptídico, significa que um composto pode incluir aminoácidos adicionais em cada um ou em ambos os terminais amino e carboxi de uma determinada sequência. É evidente que estes aminoácidos adicionais não deverão interferir significativamente com a actividade do composto. Em relação a uma composição da presente invenção, o termo "compreendendo" significa que uma composição pode incluir componentes adicionais. Estes componentes adicionais não deverão interferir significativamente com a actividade da composição. A expressão "farmacologicamente activo" significa que se determinou que uma substância assim descrita possui actividade que afecta um parâmetro médico (e.g., mas não se lhes limitando, pressão sanguínea, contagem de células sanguíneas, nível de colesterol) ou estado de doença (e.g., mas não se lhes limitando, cancro, desordens auto-imunitárias).

Como aqui se utilizam, os termos "expresso", "expressando" e "expressão" significam permitir ou provocar que a informação num gene ou numa sequência de ADN se manifeste, por exemplo, produzir uma proteína por activação das funções celulares envolvidas em transcrição e tradução de um gene ou sequência de ADN correspondentes. Uma sequência de ADN é expressa em, ou por, uma célula para formar um "produto de expressão" tal como uma proteína. 0 produto de expressão em si, e.g. a proteína resultante, pode também ser considerada "expressa". Um produto de expressão pode ser caracterizado como intracelular, extracelular ou segregado. 0 termo "intracelular" significa no interior de uma célula. 0 termo "extracelular" significa fora de uma célula, tal como uma proteína transmembranar. Uma substância é "segregada" por uma 6 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ célula se surgir em medida significativa fora da célula, proveniente de algum local na, ou dentro da célula.

Como aqui se utiliza, um "polipéptido" refere-se a um polímero composto por resíduos de aminoácido, variantes estruturais, variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas, e seus análogos sintéticos que não são de ocorrência natural ligados através de ligações peptídicas. Os polipéptidos sintéticos são preparados, por exemplo, utilizando um sintetizador automático de polipéptidos. 0 termo "proteína" refere-se tipicamente a polipéptidos grandes. 0 termo "péptido" refere-se tipicamente a polipéptidos curtos.

Como aqui se utiliza, um "fragmento" de um polipéptido pretende significar qualquer porção de um polipéptido ou de uma proteína menor do que o produto de expressão polipéptido ou proteína de comprimento completo.

Como aqui se utiliza, um "análogo" refere-se a qualquer de dois ou mais polipéptidos substancialmente similares em estrutura e possuindo a mesma actividade biológica, mas que podem ter vários graus de actividade, seja a molécula completa ou um seu fragmento. Os análogos diferem na composição das suas sequências de aminoácidos com base em uma ou mais mutações envolvendo substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos, por outros aminoácidos. As substituições podem ser conservativas ou não conservativas com base nas relações físico-químicas ou funcionais entre o aminoácido que está a ser substituído e o aminoácido que o substitui.

Como aqui se utiliza, uma "variante" refere-se a um polipéptido, uma proteína ou seu análogo, que são modificados para compreender porções químicas adicionais que normalmente não fazem parte da molécula. Estas porções podem modular a solubilidade, a absorção, a semivida biológica, etc., da molécula. As porções podem alternativamente diminuir a toxicidade da molécula e eliminar ou atenuar qualquer efeito secundário indesejável da molécula, etc. As porções capazes de mediar estes efeitos são divulgadas em Remington 's Pharmaceutical Sciences (1980). Os procedimentos para acoplamento destas porções a uma molécula são bem conhecidos 7 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ na especialidade. Por exemplo, e sem limitação, num aspecto, a variante é um factor da coagulação sanguínea possuindo uma modificação química que confere uma semivida mais longa in vivo à proteína. Em vários aspectos, os polipéptidos são modificados por glicosilação, peguilação e/ou poli-sialilação. VWF recombinante

As sequências do polinucleótido e de aminoácidos de prépró-VWF estão estabelecidas em SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, e estão disponíveis em GenBank com os n.°s de acesso NM_000552 e NP_000543, respectivamente. A sequência de aminoácidos correspondente à proteína VWF madura está estabelecida em SEQ ID N0:3 (correspondente aos aminoácidos 764-2813 da sequência de aminoácidos de comprimento completo de prépró-VWF).

Uma forma de rVWF útil tem pelo menos a propriedade de estabilização in vivo, e.g. ligação, de pelo menos uma molécula de Factor VIII (FVIII) e possui opcionalmente um padrão de glicosilação que é farmacologicamente aceitável. Os seus exemplos específicos incluem VWF sem o domínio A2, e portanto resistente a proteólise (Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997), e um fragmento de VWF desde Vai 449 até Asn 730, incluindo o domínio de ligação à glicoproteina lb e locais de ligação para colagénio e heparina (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989). A determinação da capacidade de um VWF estabilizar pelo menos uma molécula de FVIII é, num aspecto, realizada em mamíferos deficientes em VWF de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica. 0 rVWF da presente invenção é produzido por qualquer método conhecido na especialidade. Um exemplo específico está divulgado em W086/06096 publicado em 23 de Out., 1986, e no pedido de Patente U.S. 07/559,509, apresentado em 23 de Julho, 1990, que é aqui incorporado por referência em relação aos métodos de produção de VWF recombinante. Assim, são conhecidos na especialidade métodos para (i) produção de ADN recombinante por engenharia genética, e.g. por transcrição inversa de ARN e/ou amplificação de ADN, (ii) introdução de ADN recombinante em células procariotas ou eucariotas por transfecção, e.g. por electroporação ou micro-injecção, (iii) cultivo das células 8 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ transformadas, e.g. num modo contínuo ou descontínuo, (iv) expressão de VWF, e.g. constitutivamente ou por indução, e (v) isolamento do VWF, e.g. a partir do meio de cultura ou por colheita das células transformadas, de modo a (vi) obter rVWF purificado, e.g. por cromatografia de permuta aniónica ou cromatografia de afinidade. Um VWF recombinante é, num aspecto, preparado em células hospedeiras transformadas utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na especialidade. Por exemplo, sequências que codificam para o polipéptido podem ser excisadas a partir do ADN utilizando enzimas de restrição adequadas. Alternativamente, a molécula de ADN é, noutro aspecto, sintetizada utilizando técnicas de síntese química, tais como o método do fosforamidato. Também, ainda em outro aspecto, é utilizada uma combinação destas técnicas. A invenção também proporciona vectores que codificam polipéptidos da invenção num hospedeiro apropriado. O vector compreende o polinucleótido que codifica o polipéptido operativamente ligado a sequências de controlo da expressão apropriadas. Os métodos para efectuar esta ligação operativa, quer antes, quer depois do polinucleótido ser inserido no vector, são bem conhecidas. As sequências de controlo da expressão incluem promotores, activadores, potenciadores, operadores, locais de ligação ao ribossoma, sinais de iniciação, sinais de paragem, sinais de remate, sinais de poliadenilação, e outros sinais envolvidos no controlo da transcrição ou da tradução. 0 vector resultante possuindo o polinucleótido é utilizado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada utilizando métodos bem conhecidos na especialidade.

Qualquer de um grande número de células hospedeiras disponíveis e bem conhecidas é utilizada na prática da presente invenção. A selecção de um hospedeiro particular depende de vários factores reconhecidos na especialidade, incluindo, por exemplo, compatibilidade com o vector de expressão escolhido, toxicidade dos péptidos codificados pela molécula de ADN, taxa de transformação, facilidade de recuperação dos péptidos, características de expressão, biossegurança e custos. Tem que ser atingido um equilíbrio destes factores com o entendimento de que nem todas as células 9 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ hospedeiras são igualmente eficazes para a expressão de uma sequência de ADN particular. Dentro destas orientações gerais, as células hospedeiras microbianas úteis incluem, sem limitação, células de bactérias, leveduras e outros fungos, insectos, plantas, mamíferos (incluindo os ser humano) em cultura, ou outros hospedeiros conhecidos na especialidade.

As células hospedeiras transformadas são cultivadas sob condições convencionais de fermentação de modo a que sejam expressos os compostos desejados. Estas condições de fermentação são bem conhecidas na especialidade. Finalmente, os polipéptidos são purificados a partir dos meios de cultura ou das próprias células hospedeiras por métodos bem conhecidos na especialidade.

Dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar um composto da invenção, grupos hidrato de carbono (oligossacáridos) são opcionalmente ligados em locais que se sabe serem locais de glicosilação em proteínas. Geralmente, os oligossacáridos ligados a 0 são ligados a resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto os oligossacáridos ligados a N são ligados a resíduos de asparagina (Asn) quando estes fazem parte da sequência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido excepto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos de ocorrência natural excepto prolina. As estruturas de oligossacáridos ligados a N e ligados a 0 e os resíduos de açúcares encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é comummente encontrado tanto em oligossacáridos ligados a N como ligados a 0 é o ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico). 0 ácido siálico é usualmente o resíduo terminal de oligossacáridos tanto ligados a N como ligados a 0 e, em virtude da sua carga negativa, num aspecto, confere propriedades ácidas ao composto glicosilado. Este(s) local(ais) pode(m) ser incorporado(s) no ligante dos compostos da presente invenção e são preferivelmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos polipeptídicos (e.g., em células de mamífero tais como CHO, BHK, COS) . Em outros aspectos, estes locais são glicosilados por procedimentos sintéticos ou semi-sintéticos conhecidos na especialidade. 10 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Alternativamente, os compostos são preparados por métodos sintéticos utilizando, por exemplo, técnicas de síntese em fase sólida. As técnicas adequadas são bem conhecidas na especialidade, e incluem as descritas em Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis e Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart e Young (1969),

Solid Phase Peptide Synthesis; Pat. U.S. 3,941, 763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; e Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. A síntese em fase sólida é a técnica preferida para a preparação de péptidos individuais pois é o método mais económico para a preparação de péptidos pequenos.

Fragmentos, variantes e análogos de VWF

Os métodos para a preparação de fragmentos, variantes ou análogos polipeptídicos são bem conhecidos na especialidade.

Os fragmentos de um polipéptido são preparados utilizando, sem limitação, clivagem enzimática (e.g., tripsina, quimiotripsina) e também utilizando meios recombinantes para gerar fragmentos polipeptídicos possuindo uma sequência de aminoácidos específica. Os fragmentos polipeptídicos podem ser gerados compreendendo uma região da proteína possuindo uma actividade particular, tal como um domínio de multimerização ou qualquer outro domínio de VWF identificável conhecido na especialidade.

Os métodos para preparação de análogos polipeptídicos são também bem conhecidos. Os análogos de sequências de aminoácidos de um polipéptido podem ser análogos de substituição, inserção, adição ou deleção. Os análogos de deleção, incluindo fragmentos de um polipéptido, não possuem um ou mais resíduos da proteína nativa que não são essenciais para a função ou para a actividade imunogénica. Os análogos de inserção envolvem a adição de, e.g., aminoácido(s) num ponto não terminal do polipéptido. Este análogo pode incluir, por exemplo e sem limitação, inserção de um epítopo imunorreactivo ou simplesmente de um resíduo individual. Os análogos de adição, incluindo fragmentos de um polipéptido, incluem a adição de um ou mais aminoácidos em um ou em ambos os terminais de uma proteína e incluem, por exemplo, proteínas de 11 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ fusão. Estão também contempladas combinações dos análogos supramencionados.

Os análogos de substituição tipicamente trocam um aminoácido do tipo selvagem por outro em um ou mais locais no interior da proteína, e podem ser desenhados para modular uma ou mais propriedades do polipéptido sem a perda completa de outras funções ou propriedades. Num aspecto, as substituições são substituições conservativas. A "substituição conservativa de aminoácidos" é a substituição de um aminoácido por um aminoácido possuindo uma cadeia lateral ou um carácter químico similares. Os aminoácidos similares para efectuar substituições conservativas incluem os que possuem uma cadeia lateral ácida (ácido glutâmico, ácido aspártico); uma cadeia lateral básica (arginina, lisina, histidina); uma cadeia lateral de amida polar (glutamina, asparagina); uma cadeia lateral alifática, hidrófoba (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); uma cadeia lateral aromática (fenilalanina, triptofano, tirosina); uma cadeia lateral pequena (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); ou uma cadeia lateral de hidroxilo alifática (serina, treonina).

Num aspecto, os análogos são substancialmente homólogos ou substancialmente idênticos ao VWF recombinante do qual são derivados. Os análogos incluem aqueles que retêm pelo menos alguma da actividade biológica do polipéptido do tipo selvagem, e.g. actividade de coagulação sanguínea.

As variantes polipeptídicas contempladas incluem, sem limitação, polipéptidos quimicamente modificados por técnicas como ubiquitinação, glicosilação, incluindo poli-sialação, conjugação com agentes terapêuticos ou de diagnóstico, marcação, ligação de polímeros covalentes tal como peguilação (derivatização com polietilenoglicol) , introdução de ligações não hidrolisáveis, e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos tais como ornitina, que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. As variantes retêm as mesmas, ou essencialmente as mesmas propriedades de ligação das moléculas não modificadas da invenção. Esta modificação química pode incluir ligação directa ou indirecta (e.g., através de um ligante) de um agente ao polipéptido de VWF. No caso de 12 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ ligação indirecta, está contemplado que o ligante possa ser hidrolisável ou não hidrolisável. A preparação de análogos polipeptídicos peguilados compreenderá, num aspecto, os passos de (a) reacção do polipéptido com polietilenoglicol (tal como um derivado éster ou aldeído reactivo de PEG) sob condições nas quais o polipéptido da construção de ligação fica ligado a um ou mais grupos PEG, e (b) obtenção do(s) produto(s) de reacção. Em geral, as condições óptimas de reacção para as reacções de acilação são determinadas com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a razão PEG: proteína, maior a percentagem de produto poli-peguilado. Em algumas concretizações, a construção de ligação possui uma única porção PEG no terminal N. 0 polietilenoglicol (PEG) pode ser ligado ao factor da coagulação sanguínea para, por exemplo, proporcionar uma semivida in vivo mais longa. 0 grupo PEG pode ter qualquer peso molecular conveniente e é linear ou ramificado. 0 peso molecular médio do PEG varia de cerca de 2 quiloDalton ("kD") até cerca de 100 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, ou de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Em certos aspectos, os grupos PEG são ligados ao factor da coagulação sanguínea através de acilação ou alquilação redutora através de um grupo reactivo natural ou manipulado na porção PEG (e.g., um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reactivo no factor da coagulação sanguínea (e.g., um grupo aldeído, amino ou éster) ou por qualquer outra técnica conhecida na especialidade.

Os métodos para a preparação de polipéptidos poli-sialilados estão descritos na Publicação da Patente dos Estados Unidos 20060160948, Fernandes e Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, e Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006. Resumidamente, uma solução de ácido colomínico (CA) contendo NaI04 0,1 M é agitada no escuro à temperatura ambiente para oxidar o CA. A solução de CA activado é dialisada contra, e.g., tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,2 no escuro e esta solução foi adicionada a uma solução de rVWF e incubada durante 18 h à temperatura ambiente no escuro sob agitação suave. Os reagentes livres são opcionalmente separados do conjugado rVWF-poliácido siálico, por exemplo, por ultrafiltração/diafiltração. A conjugação de 13 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ rVWF com poliácido siálico é conseguida utilizando glutaraldeído como reagente de reticulação (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004).

Está ainda contemplado noutro aspecto que um polipéptido da invenção seja uma proteína de fusão com um segundo agente que é um polipéptido. Numa concretização, o segundo agente que é um polipéptido, sem limitação, é uma enzima, um factor de crescimento, um anticorpo, uma citoquina, uma quimioquina, um receptor da superfície celular, o domínio extracelular de um receptor da superfície celular, uma molécula de adesão celular, ou um fragmento ou domínio activo de uma proteína descrita acima. Numa concretização relacionada, o segundo agente é um factor da coagulação sanguínea tal como o Factor VIII, o Factor VII, o Factor IX. A proteína de fusão contemplada é preparada por técnicas químicas ou recombinantes bem conhecidas na especialidade.

Está também contemplado noutro aspecto que polipéptidos prépró-VWF e pró-VWF vão proporcionar um benefício terapêutico nas formulações da presente invenção. Por exemplo, a Patente US 7,005,502 descreve uma preparação farmacêutica compreendendo quantidades substanciais de pró-VWF que induzem a geração de trombina in vitro. Em adição a fragmentos variantes, ou outros análogos biologicamente activos, recombinantes, do VWF maduro de ocorrência natural, a presente invenção contempla a utilização de fragmentos, variantes ou análogos biologicamente activos, recombinantes, dos polipéptidos prépró-VWF (estabelecido em SEQ ID NO:2) ou pró-VWF (resíduos de aminoácido 23 a 764 de SEQ ID NO: 2) nas formulações aqui descritas.

Polinucleótidos que codificam fragmentos, variantes e análogos podem ser prontamente gerados por um trabalhador especialista para codificar fragmentos, variantes ou análogos biologicamente activos da molécula de ocorrência natural que possuem a mesma actividade biológica ou similar que a molécula de ocorrência natural. Em vários aspectos, estes polinucleótidos são preparados utilizando técnicas de PCR, digestão/ligação de ADN que codifica a molécula, e similares. Assim, um perito na especialidade será capaz de gerar alterações de bases únicas na cadeia de ADN que resultam num 14 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ codão alterado e numa mutação sem sentido ("missense") , utilizando qualquer método conhecido na especialidade, incluindo, mas não se lhes limitando, mutagénese especifica do local. Como aqui se utiliza, a frase "condições de hibridação moderadamente rigorosas" significa, por exemplo, hibridação a 42°C em formamida a 50% e lavagem a 60°C com SSC 0,1 x, SDS a 0,1%. É entendido pelos peritos na especialidade que a variação destas condições ocorre com base no comprimento e no teor de bases nucleotidicas GC das sequências a hibridar. As fórmulas padrão na especialidade são apropriadas para a determinação das condições de hibridação exactas. Veja-se Sambrook et al., 9.47-9.51 em Molecular Cloning, Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Liofilização

Num aspecto, as formulações compreendendo um polipéptido de VWF da invenção são liofilizadas antes da administração. A liofilização é realizada utilizando técnicas comuns na especialidade e deverá ser optimizada para a composição que se está a desenvolver [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) e Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].

Um ciclo de liofilização é, em um aspecto, composto por três passos: congelação, secagem primária e secagem secundária [A.P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]. No passo de congelação, a solução é arrefecida para iniciar a formação de gelo. Adicionalmente, este passo induz a cristalização do agente avolumante. O gelo sublima no passo de secagem primária, que é conduzido por redução da pressão na câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, utilizando um vácuo e introduzindo calor para promover a sublimação. Finalmente, a água adsorvida ou ligada é removida no passo de secagem secundária sob pressão reduzida na câmara e a uma temperatura de armazenagem elevada. O processo produz um material conhecido como um bolo liofilizado. Posteriormente o bolo pode ser reconstituído com água estéril ou com diluente adequado para injecção. O ciclo de liofilização não só determina o estado físico final dos excipientes como também afecta outros parâmetros tais como tempo de reconstituição, aparência, estabilidade e teor final de humidade. A estrutura da composição no estado 15 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ congelado prossegue através de várias transições (e.g., transições vítreas, molhagens e cristalizações) que ocorrem a temperaturas específicas, e a estrutura pode ser utilizada para entender e optimizar o processo de liofilização. A temperatura de transição vítrea (Tg e/ou Tg') pode proporcionar informação acerca do estado físico de um soluto e pode ser determinada por calorimetria diferencial de varrimento (DSC, do inglês "Differential Scanning

Calorimetry"). A Tg e a Tg' constituem um importante parâmetro que tem que ser tido em conta quando se desenha o ciclo de liofilização. Por exemplo, a Tg' é importante para a secagem primária. Adicionalmente, no estado seco, a temperatura de transição vítrea proporciona informação sobre a temperatura de armazenagem do produto final.

Formulações e excipientes em geral

Os excipientes são aditivos que conferem ou melhoram a estabilidade e a entrega de um produto farmacêutico (e.g., uma proteína). Independentemente da razão para a sua inclusão, os excipientes constituem um componente integrante de uma formulação e portanto têm que ser seguros e bem tolerados pelos pacientes. Para fármacos proteínicos, a escolha dos excipientes é particularmente importante porque podem afectar tanto a eficácia como a imunogenicidade do fármaco. Portanto, as formulações de proteínas têm que ser desenvolvidas com selecção apropriada de excipientes que proporcionam estabilidade, segurança e comerciabilidade adequadas.

Uma formulação liofilizada é, em um aspecto, pelo menos constituída por um ou mais de entre um tampão, um agente avolumante e um estabilizante. Neste aspecto, a utilidade de um tensioactivo é avaliada e seleccionada em casos em que a agregação durante o passo de liofilização ou durante a reconstituição se tornam um problema. E incluído um agente tamponante apropriado para manter a formulação dentro de zonas estáveis de pH durante a liofilização. Uma comparação dos componentes excipientes contemplados para formulações de proteínas líquidas e liofilizadas é proporcionada na Tabela A. 16 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Tabela A: Componentes excipientes de formulações liofilizadas de proteínas

Componente excipiente Função na formulação liofilizada Tampão o Mantém o pH da formulação durante a liofilização e após a reconstituição Agente de Tonicidade / estabilizante o Os estabilizantes incluem crio- e lioprotectores o Os exemplos incluem Polióis, açúcares e polímeros o Os crioprotectores protegem as proteínas dos stresses da congelação o Os lioprotectores estabilizam as proteínas no estado criodessecado Agente avolumante o Utilizado para melhorar a elegância do produto e para prevenir a ruptura o Proporciona resistência estrutural ao "lio-bolo" o Os exemplos incluem manitol e glicina Tensioactivo o Empregue se a agregação durante o processo de liofilização for um problema o Pode servir para reduzir os tempos de reconstituição o Os exemplos incluem polissorbato 20 e 80 Antioxidante o Usualmente não empregue, as reacções moleculares no "lio-bolo" são grandemente retardadas Iões metálicos/agente quelante o Podem ser incluídos se for incluído um ião metálico específico apenas como cofactor ou quando o metal é necessário para a actividade de protease o Os agentes quelantes geralmente não são necessários em lio-formulações Conservante o Para formulações multidoses apenas o Proporciona protecção contra crescimento microbiano na formulação o É usualmente incluído no diluente de reconstituição (e.g. bWFI) 0 principal desafio no desenvolvimento de formulações para proteínas é a estabilização do produto contra os stresses 17 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ de fabrico, transporte e armazenagem. 0 papel dos excipientes de formulação é proporcionar estabilização contra estes stresses. Os excipientes são também empregues para reduzir a viscosidade de formulações de elevada concentração de proteina de modo a permitir a sua entrega e melhorar a conveniência dos pacientes. Em geral, os excipientes podem ser classificados com base nos mecanismos através dos quais estabilizam proteínas contra vários stresses químicos e físicos. Alguns excipientes são utilizados para aliviar os efeitos de um stress específico ou para regular uma susceptibilidade particular de uma proteína específica. Outros excipientes têm efeitos mais gerais sobre as estabilidades físicas e covalentes de proteínas. Os excipientes aqui descritos estão organizados pelo seu tipo químico ou pelo seu papel funcional nas formulações. São proporcionadas breves descrições dos modos de estabilização quando se discutir cada tipo de excipiente.

Dados os ensinamentos e orientações aqui proporcionados, os peritos na especialidade saberão que quantidade ou gama de excipiente podem incluir em qualquer formulação particular para conseguir uma formulação biofarmacêutica da invenção que promova a retenção de estabilidade do produto biofarmacêutico (e.g., uma proteína). Por exemplo, a quantidade e o tipo de um sal a incluir numa formulação biofarmacêutica da invenção são seleccionados com base na osmolalidade desejada (i.e., isotónica, hipotónica ou hipertónica) para a solução final assim como nas quantidades e na osmolalidade de outros componentes a incluir na formulação. A título de exemplo, a inclusão de cerca de 5% de sorbitol pode conseguir a isotonicidade enquanto é necessário cerca de 9% de um excipiente de sacarose para conseguir a isotonicidade. A selecção da quantidade ou da qama de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos numa formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificada acima por referência a sais, polióis e açúcares. Contudo, os peritos na especialidade entenderão que as considerações aqui descritas e adicionalmente exemplificadas por referência a excipientes específicos são igualmente aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes incluindo, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de 18 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ tonicidade, tensioactivos, estabilizantes, agente avolumantes, crioprotectores, lioprotectores, antioxidantes, iões metálicos, agentes quelantes e/ou conservantes.

Adicionalmente, quando um excipiente particular é reportado em concentração molar, os peritos na especialidade reconhecerão que a percentagem equivalente (%) p/v (e.g., (gramas de substância numa amostra de solução/mL de solução) X 100%) de solução está também contemplada.

Evidentemente, uma pessoa competente na matéria reconhecerá que as concentrações dos excipientes aqui descritos partilham uma interdependência dentro de uma formulação particular. A titulo de exemplo, a concentração de um agente avolumante pode ser diminuída quando, e.g., existe uma elevada concentração de proteína ou quando, e.g., existe uma elevada concentração de agente estabilizante. Em adição, uma pessoa competente na matéria reconhecerá que, para manter a isotonicidade de uma formulação particular em que não há agente avolumante, a concentração de um agente estabilizante será ajustada em concordância (i.e., será utilizada uma quantidade "tonificante" de estabilizante). Os excipientes comuns são conhecidos na especialidade e podem ser encontrados em Powell et al., Compendium of Excipients for Parentheral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sei. Technology, 52:238- 311.

Tampões e agente tamponantes

Observa-se usualmente que a estabilidade de uma formulação de proteínas farmacologicamente activas é máxima numa gama estreita de valores de pH. Esta gama de pH de estabilidade óptima tem que ser identificada logo durante os estudos de pré-formulação. São úteis para este fim várias abordagens, tais como estudos de estabilidade acelerados e estudos de rastreio calorimétricos, (Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Uma vez finalizada uma formulação, a proteína tem que ser fabricada e mantida ao longo de toda a sua vida de armazém. Portanto, são quase sempre empregues agentes tamponantes para controlar o pH na formulação. 19 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ A capacidade tampão das espécies tamponantes é máxima a um pH igual ao pKa e diminui à medida que o pH aumenta ou diminui afastando-se deste valor. Noventa porcento da capacidade tamponante existe num intervalo de uma unidade de pH centrado no seu pKa. A capacidade do tampão também aumenta proporcionalmente com o aumento da concentração de tampão.

Têm que ser considerados vários factores quando se escolhe um tampão. Primeiro, e acima de tudo, a espécie tampão e a sua concentração têm que ser definidas com base no seu pKa e no pH desejado para a formulação. É igualmente importante assegurar que o tampão é compatível com a proteína e os outros excipientes da formulação, e que não catalisa nenhumas reacções de degradação. Um terceiro aspecto importante a considerar é a sensação de ardor e irritação que o tampão pode induzir aquando da administração. Por exemplo, sabe-se que o citrato causa ardor aquando da injecção (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). O potencial para ardor e irritação é maior para fármacos que são administrados pelas vias subcutânea (SC) ou intramuscular (IM), onde a solução de fármaco permanece no local durante um periodo de tempo relativamente mais longo do que quando é administrado pela via IV onde a formulação é rapidamente diluída no sanque após a administração. Para formulações que são administradas por infusão IV directa, a quantidade total de tampão (e de qualquer outro componente da formulação) tem que ser monitorada. Tem que haver um cuidado particular com os iões de potássio administrados na forma do tampão de fosfato de potássio, que podem induzir efeitos cardiovasculares num paciente (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73 (2) : 283-90 (2006)) .

Os tampões para formulações liofilizadas requerem consideração adicional. Alguns tampões como o fosfato de sódio podem cristalizar fora da fase amorfa da proteína durante a congelação resultando em desvios no pH. Outros tampões comuns como o acetato e o imidazole podem sublimar ou evaporar durante o processo de liofilização, desse modo desviando o pH da formulação durante a liofilização ou após a reconstituição.

O sistema tampão presente nas composições é seleccionado para ser fisiologicamente compatível e para manter um pH 20 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ desejado da formulação farmacêutica. Numa concretização, o pH da solução está entre pH 2,0 e pH 12,0. Por exemplo, o pH da solução pode ser 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4.3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7.3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10.3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 ou 12,0, O composto tamponante do pH pode estar presente em qualquer quantidade adequada para manter o pH da formulação a um nivel predeterminado. Numa concretização, a concentração do tamponante do pH está entre 0,1 mM e 500 mM (1 M) . Por exemplo, está contemplado que o aqente tamponante do pH seja pelo menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 ou 500 mM.

Os agentes tamponantes do pH exemplificativos utilizados para tamponar a formulação como aqui estabelecido incluem, mas não se lhes limitando, ácidos orgânicos, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato, citrato, Tris, HEPES, e aminoácidos ou misturas de aminoácidos, incluindo, mas não se lhes limitando, aspartato, histidina e glicina. Numa concretização da presente invenção, o agente tamponante é citrato.

Agentes estabilizantes e avolumantes

Num aspecto das presentes formulações farmacêuticas, é adicionado um estabilizante (ou uma combinação de estabilizantes) para prevenir ou reduzir a agregação e degradação química induzidas pela armazenagem. Uma solução nebulosa ou turva após reconstituição indica que a proteína precipitou ou pelo menos agregou-se. O termo "estabilizante" significa um excipiente capaz de prevenir a agregação ou a degradação física, incluindo degradação química (por exemplo, autólise, desamidação, oxidação, etc.) num estado aquoso. Os estabilizantes contemplados incluem, mas não se lhes limitando, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glucose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glucosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCL, compostos poli-hidroxi, incluindo polissacáridos tais como dextrano, amido, hidroxietil-amido, ciclodextrinas, N-metilpirolideno, celulose e ácido hialurónico, cloreto de 21 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ sódio, [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]. Nas presentes formulações, o estabilizante é incorporado numa concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 ou 1000 mM. Numa concretização da presente invenção, utilizam-se manitol e trealose como agentes estabilizantes.

Se desejado, as formulações também incluem quantidades apropriadas de agentes avolumantes e reguladores da osmolaridade. Os agente avolumantes incluem, por exemplo e sem limitação, manitol, glicina, sacarose, polímeros tais como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol. Numa concretização, o agente avolumante é manitol. O agente avolumante é incorporado numa concentr ação de cerca de 0,1, 0, 5, 0 ,7, 0, 8 0,9 , i,o, 1,2 1,5, 1, 7 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, . 16 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 , 200, 500 700, 900 ou 1000 mM.

Tensioactivos

As proteínas têm uma elevada propensão para interactuar com superfícies o que as torna susceptíveis a adsorção e desnaturação nas interfaces ar-líquido, frasco-líquido e líquido-líquido (óleo de silicone). Observou-se que esta via de degradação é inversamente dependente da concentração de proteína e resulta quer na formação de agregados de proteína solúveis e insolúveis quer na perda de proteína da solução por via de adsorção nas superfícies. Em adição à adsorção na superfície do recipiente, a degradação induzida pela superfície é exacerbada com a agitação física, como acontecerá durante o transporte e manuseamento do produto.

Os tensioactivos são vulgarmente utilizados em formulações de proteínas para prevenir a degradação induzida pelas superfícies. Os tensioactivos são moléculas anfipáticas com a capacidade de competir com as proteínas por posições interfaciais. As porções hidrófobas das moléculas de tensioactivos ocupam posições interfaciais (e.g., ar/líquido), enquanto as porções hidrófilas das moléculas permanecem orientadas para o seio do solvente. Em concentrações 22 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ suficientes (tipicamente próximas da concentração micelar critica do detergente), uma camada da superfície das moléculas de tensioactivo serve para impedir que as moléculas de proteína sejam adsorvidas na interface. Desse modo, a degradação induzida pela superfície é minimizada. Os tensioactivos aqui contemplados incluem, sem limitação, ésteres de sorbitano de ácidos gordos polietoxilados, i.e. polissorbato 20 e polissorbato 80. Os dois diferem apenas no comprimento da cadeia alifática que confere o carácter hidrófobo às moléculas, C-12 e C-18, respectivamente. Desse modo, o polissorbato-80 é mais superficialmente activo e possui uma concentração micelar crítica menor do que o polissorbato-20.

Os detergentes podem também afectar a estabilidade conformacional termodinâmica das proteínas. Aqui, novamente, os efeitos de um determinado excipiente detergente serão específicos da proteína. Por exemplo, mostrou-se que os polissorbatos reduzem a estabilidade de algumas proteínas e aumentam a estabilidade de outras. A desestabilização de proteínas pelos detergentes pode ser racionalizada em termos das caudas hidrófobas das moléculas de detergente que podem enveredar em ligações específicas com estados de proteínas parcial ou completamente não dobrados. Estes tipos de interacções podem causar um desvio no equilíbrio conformacional no sentido dos estados mais expandidos da proteína (i.e. aumentando a exposição de porções hidrófobas da molécula da proteína em complemento à ligação de polissorbato). Alternativamente, se o estado nativo da proteína exibe algumas superfícies hidrófobas, a ligação do detergente ao estado nativo pode estabilizar essa conformação.

Outro aspecto dos polissorbatos é que são inerentemente susceptíveis a degradação oxidativa. Frequentemente, como matérias-primas, contêm quantidades suficientes de peróxidos para provocar a oxidação de cadeias laterais de resíduos da proteína, especialmente metionina. O potencial para danos oxidativos proveniente da adição de estabilizantes enfatiza o ponto de que deverão ser utilizadas nas formulações as menores concentrações eficazes de excipientes. Para os tensioactivos, a concentração eficaz para uma determinada proteína dependerá do mecanismo de estabilização. 23 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Os tensioactivos são também adicionados em quantidades apropriadas para prevenir o fenómeno de agregação relacionado com a superfície durante a congelação e a secagem [Chang, B., J. Pharm. Sei. 85:1325, (1996)]. Assim, os tensioactivos exemplificativos incluem, sem limitação, tensioactivos aniónicos, catiónicos, não iónicos, zwiteriónicos e anfotéricos incluindo tensioactivos derivados de aminoácidos de ocorrência natural. Os tensioactivos aniónicos incluem, mas não se lhes limitando, laurilsulfato de sódio, dioctilsulfossuccinato de sódio e dioctilsulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal de sódio de N-lauroílsarcosina, dodecilsulfato de lítio, sal de sódio do ácido 1-octanossulfónico, hidrato-colato de sódio, desoxicolato de sódio, e sal de sódio do ácido glicodesoxicólico. Os tensioactivos catiónicos incluem, mas não se lhes limitando, cloreto de benzalcónio ou cloreto de benzetónio, mono-hidrato de cloreto de cetilpiridínio e brometo de hexadeciltrimetilamónio. Os tensioactivos zwiteriónicos incluem, mas não se lhes limitando, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 e SB3-12. Os tensioactivos não iónicos incluem, mas não se lhes limitando, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20 e TWEEN-80. Os tensioactivos também incluem, mas não se lhes limitando, lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, óleo de rícino hidrogenado polioxietilenado 10, 40, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja e outros fosfolípidos tais como dioleilfosfatidileolina (DOPC), dimiristoílfosfatidilglicerol (DMPG), dimiristoílfosfatidileolina (DMPC) e (dioleilfosfatidilglicerol) DOPG; éster de sacarose de ácidos gordos, metilcelulose e carboximetilcelulose. São portanto adicionalmente proporcionadas composições compreendendo estes tensioactivos, seja individualmente ou na forma de uma mistura em diferente proporções. Numa concretização da presente invenção, o tensioactivo é TWEEN-80. Nas presentes formulações, o tensioactivo é incorporado numa concentração de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 g/L. Em formulações proporcionadas, a concentração de tensioactivo é 0,005, 0,01, 0, 02, 0,03, 0,05, 0,06, 0, 07, 0, 08, 0, 09, 0, 1, 0,2, 0,3, 0, 4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 g/L. 24 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Sais São frequentemente adicionados sais para aumentar a força iónica da formulação, que pode ser importante para a solubilidade, a estabilidade física e a isotonicidade das proteínas. Os sais podem afectar a estabilidade física de proteínas de variadas maneiras. Iões podem estabilizar o estado nativo de proteínas por ligação a resíduos carregados na superfície da proteína. Alternativamente, os sais podem estabilizar o estado desnaturado por ligação a grupos peptídicos ao longo do esqueleto da proteína (-CONH-). Os sais podem também estabilizar a conformação nativa da proteína escudando interacções electrostáticas repulsivas entre resíduos no interior de uma molécula de proteína. Os sais em formulações de proteínas podem também escudar interacções electrostáticas atractivas entre as moléculas de proteína que podem conduzir a agregação e insolubilidade da proteína. Em formulações proporcionadas, a concentração de sal está entre 0, 1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, e 500 mM.

Outros componentes excipientes comuns .Aminoácidos

Os aminoácidos encontraram uma utilização versátil em formulações de proteínas como tampões, agentes avolumantes, estabilizantes e antioxidantes. Assim, num aspecto, empregam-se histidina e ácido glutâmico para tamponar formulações de proteínas na gama de pH de 5,5 - 6,5 e 4,0 -5,5 respectivamente. O grupo imidazole da histidina possui um pKa = 6,0 e o grupo carboxilo da cadeia lateral do ácido glutâmico possui um pKa de 4,3 o que torna estes aminoácidos adequados para tamponamento nas suas respectivas gamas de pH. O ácido glutâmico é particularmente útil nestes casos. A histidina é vulgarmente encontrada em formulações de proteínas comercializadas, e este aminoácido proporciona uma alternativa ao citrato, um tampão que é conhecido por provocar ardor na injecção. De forma interessante, foi também relatado que a histidina possui um efeito estabilizante em relação à agregação quando utilizada em concentrações elevadas tanto em apresentações líquidas como liofilizadas (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). Foi também observado por 25 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ outros que a histidina reduz a viscosidade de uma formulação de proteína em concentração elevada. Contudo, no mesmo estudo, os autores observaram uma agregação aumentada e descoloração em formulações contendo histidina durante estudos de congelação-descongelação do anticorpo em recipientes de aço inoxidável. Outra questão a ter em conta com a histidina é o facto de esta sofrer foto-oxidação na presença de iões metálicos (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). A utilização de metionina como antioxidante em formulações parece promissora; observou-se que é eficaz contra vários stresses oxidativos (Lam XM, et al., J. Pharm. Sei., 86 (11) : 1250-5 (1997)) .

Em vários aspectos, são proporcionadas formulações que incluem um ou mais dos aminoácidos glicina, prolina, serina, arginina e alanina que se mostrou estabilizarem proteínas pelo mecanismo de exclusão preferencial. A glicina é também um agente avolumante vulgarmente utilizado em formulações liofilizadas. Mostrou-se que a arginina é um agente eficaz na inibição da agregação e tem sido utilizada tanto em formulações líquidas como liofilizadas.

Em formulações proporcionadas, a concentração de aminoácido está entre 0, 1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 e 500 mM. Numa concretização da presente invenção, o aminoácido é glicina.

Antioxidantes A oxidação de resíduos de proteínas surge de várias fontes diferentes. Para além da adição de antioxidantes específicos, a prevenção de danos oxidativos nas proteínas envolve o cuidadoso controlo de vários factores ao longo de todo o processo de fabrico e armazenagem do produto, tais como o oxigénio atmosférico, a temperatura, a exposição à luz e a contaminação química. A invenção contempla portanto a utilização dos antioxidantes farmacêuticos incluindo, sem limitação, agentes redutores, sequestrantes de oxigénio/radicais livres, ou agentes quelantes. Os antioxidantes em formulações terapêuticas de proteínas são, em um aspecto, solúveis em água e permanecem activos ao longo de toda a vida de prateleira do produto. Os agentes redutores e os sequestrantes de oxigénio/radicais livres funcionam por 26 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ ablação de espécies de oxigénio activo em solução. Os agentes quelantes como o EDTA são eficazes por ligação de contaminantes metálicos vestigiais que promovem a formação de radicais livres. Por exemplo, o EDTA foi utilizado na formulação liquida de factor de crescimento de fibroblastos ácido para inibir a oxidação catalisada por iões metálicos de residuos de cisteina.

Em adição à eficácia de vários excipientes a prevenir a oxidação das proteínas, o potencial para os próprios antioxidantes induzirem outras alterações covalentes ou físicas na proteína é uma preocupação. Por exemplo, os agentes redutores podem causar a ruptura de ligações de dissulfureto intramoleculares, o que pode conduzir a baralhamento de dissulfureto. Na presença de transição de iões metálicos, mostrou-se que ácido ascórbico e EDTA promovem a oxidação de metionina em várias proteínas e péptidos (Akers MJ, e Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. Em: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor e Francis, UK (1999)); Fransson J.R., J. Pharm. Sei. 86 (9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Foi reportado que o tiossulfato de sódio reduz os níveis de oxidação de metionina induzida pela luz e pela temperatura em rhuMab HER2; contudo, a formação de um aducto tiossulfato-proteína foi também reportada neste estudo (Lam XM, Yang JY, et al., J. Pharm. Sei. 86(11): 1250-5 (1997)). A selecção de um antioxidante apropriado é feita de acordo com os stresses e sensibilidades específicos da proteína. Os antioxidantes contemplados em certos aspectos incluem, sem limitação, agentes redutores e sequestrantes de oxigénio/radicais livres, EDTA e tiossulfato de sódio. Iões metálicos

Em geral, os iões de metais de transição são indesejados em formulações de proteínas porque podem catalisar reacções de degradação física e química em proteínas. Contudo, iões metálicos específicos são incluídos em formulações quando são cofactores para proteínas e em formulações de proteínas em suspensão quando formam complexos de coordenação (e.g., suspensão em zinco de insulina). Recentemente, a utilização de 27 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ iões de magnésio (10 -120 mM) foi proposta para inibir a isomerização de ácido aspártico em ácido isoaspártico (WO 2004039337).

Dois exemplos em que iões metálicos conferem estabilidade ou actividade aumentada em proteínas são a desoxirribonuclease humana (rhDNase, Pulmozyme®), e o Factor VIII. No caso da rhDNase, iões Ca+2 (até 100 mM) aumentaram a estabilidade da enzima através de um local de ligação específica (Chen B, et al., J Pharm Sei., 88 (4): 477-82 (1999)). De facto, a remoção de iões de cálcio da solução com EGTA causou um aumento na desamidação e na agregação. Contudo, este efeito foi observado apenas com iões Ca+2; observou-se que outros catiões bivalentes Mg+2, Mn+2 e Zn+2 desestabilizam a rhDNase. Foram observados efeitos similares no Factor VIII. Os iões Ca+2 e Sr+2 estabilizaram a proteína enquanto outros, como Mg+2, Mn+2 e Zn+2, Cu+2 e Fe+2, desestabilizaram a enzima (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). Num estudo separado com Factor VIII, foi observado um aumento significativo na taxa de agregação na presença de iões Al+3 (Derrick TS, et al., J. Pharm. Sei., 93(10): 2549-57 (2004)). Os autores fazem notar que outros excipientes, como sais tampão, estão frequentemente contaminados com iões Al+3 e ilustram a necessidade de utilizar excipientes de qualidade apropriada em produtos formulados.

Conservantes

Os conservantes são necessários quando se desenvolvem formulações parentéricas multiuso que envolvem mais do que uma extraeção do mesmo recipiente. A sua principal função é inibir o crescimento microbiano e assegurar a esterilidade do produto ao longo de toda a vida de prateleira ou prazo de validade do produto farmacêutico. Os conservantes vulgarmente utilizados incluem, sem limitação, álcool benzílico, fenol e m-cresol. Embora os conservantes tenham um longo historial de utilização, o desenvolvimento de formulações de proteínas que incluem conservantes pode ser desafiador. Os conservantes quase sempre possuem um efeito desestabilizante (agregação) nas proteínas, e isto tornou-se um factor importante na limitação da sua utilização em formulações de proteínas de multidoses (Roy S, et al., J Pharm Sei., 94 (2) : 382-96 (2005)) . 28 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Até à data, a maioria dos fármacos proteínicos tem sido formulada para apenas uma única utilização. Contudo, quando são possíveis formulações de multidoses, estas têm a vantagem acrescida de permitirem a conveniência do paciente, e melhor potencial de comercialização. Um bom exemplo é o da hormona de crescimento humana (hGH) em que o desenvolvimento de formulações conservadas conduziu à comercialização de apresentações para injecção em "caneta" multiusos, mais convenientes. Pelo menos quatro destes dispositivos "caneta" contendo formulações conservadas de hGH estão presentemente disponíveis no mercado. 0 Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), o Nutropin AQ® (líquido, Genentech) & o Genotropin (liofilizado - cartucho de câmara dupla, Pharmacia & Upjohn) contêm fenol enquanto o Somatrope® (Eli Lilly) é formulado com m-cresol. Vários aspectos requerem consideração durante o desenvolvimento da formulação de formas de dosagem conservadas. A concentração eficaz do conservante no produto farmacêutico tem que ser optimizada. Isto requer o teste de um determinado conservante na forma de dosagem com gamas de concentração que conferem eficácia antimicrobiana sem comprometer a estabilidade da proteína. Por exemplo, foram investigados com sucesso três conservantes no desenvolvimento de uma formulação líquida para o receptor de interleucina-1 (Tipo I), utilizando calorimetria diferencial de varrimento (DSC). Os conservantes foram ordenados com base no seu impacto sobre a estabilidade em concentrações vulgarmente utilizadas em produtos comercializados (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15 (2) : 200-8 (1998)) . O desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes é mais desafiador do que de formulações liofilizadas. Os produtos criodessecados podem ser liofilizados sem o conservante e reconstituídos com um diluente contendo conservante no momento da utilização. Isto encurta o tempo durante o qual um conservante está em contacto com a proteína, minimizando significativamente os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, a eficácia e a estabilidade do conservante têm que ser mantidas ao longo de toda a vida de prateleira do produto (~18 - 24 meses) . Um 29 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ ponto importante a notar é que a eficácia do conservante tem que ser demonstrada na formulação final contendo o fármaco activo e todos os componentes excipientes.

Alguns conservantes podem provocar reacções no local da injecção, o que constitui outro factor que requer consideração quando se escolhe um conservante. Em ensaios clínicos que se focaram na avaliação de conservantes e tampões em Norditropin, observou-se que a percepção de dor era inferior em formulações contendo fenol e álcool benzílico em comparação com uma formulação contendo m-cresol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). É interessante que, entre os conservantes vulgarmente utilizados, o álcool benzílico possui propriedades anestésicas (Minogue SC, e Sun DA., Anesth Analg.r 100(3): 683-6 (2005)). Em vários aspectos a utilização de conservantes proporciona um benefício que se sobrepõe a quaisquer efeitos secundários. Métodos de Preparação A presente invenção contempla ainda métodos para a preparação de formulações farmacêuticas.

Os presentes métodos compreendem adicionalmente um ou mais dos seguintes passos: adição de um agente estabilizante como aqui descrito à referida mistura antes da liofilização, adição de pelo menos um agente seleccionado entre um agente avolumante, um agente regulador da osmolaridade e um tensioactivo, cada um como aqui descrito, à referida mistura antes da liofilização. A prática padrão da reconstituição para material liofilizado é voltar a adicionar um volume de água pura ou água estéril para injecção (WFI) (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam por vezes utilizadas na produção de fármacos para administração parentérica [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Consequentemente, são proporcionados métodos para a preparação de composições de rVWF reconstituídas compreendendo o passo de adição de um diluente a uma composição de rVWF liofilizado da invenção. 30 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ Ο material liofilizado pode ser reconstituído na forma de uma solução aquosa. Uma variedade de transportadores aquosos, e.g., água estéril for injecção, água com conservantes para utilização em multidoses, ou água com quantidades apropriadas de tensioactivos (por exemplo, uma suspensão aquosa que contém o composto activo misturado com excipientes adequados para o fabrico de suspensões aquosas). Em vários aspectos, estes excipientes são agentes de suspensão, por exemplo e sem limitação, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma adragante e goma-arábica; agentes dispersantes ou molhantes são um fosfatido de ocorrência natural, por exemplo e sem limitação, lecitina, ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos gordos, por exemplo e sem limitação, estearato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo e sem limitação, heptadecaetileno-oxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e um hexitol tal como monooleato de sorbitol-polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo e sem limitação, polietileno-monooleato de sorbitano. Em vários aspectos, as suspensões aquosas também contêm um ou mais conservantes, por exemplo e sem limitação, ρ-hidroxibenzoato de etilo, ou n-propilo.

Administração

Para administrar composições a seres humanos ou animais de teste, num aspecto, as composições compreendem um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases "farmaceuticamente" ou "farmacologicamente" aceitável referem-se a entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem a degradação de proteínas tal como produtos de agregação e de clivagem, e em adição não produzem reacções alérgicas ou outras reacções adversas quando administrados utilizando vias bem conhecidas na especialidade, como descrito adiante. Os "transportadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção e similares, clinicamente úteis, incluindo os agentes divulgados acima. 31 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

As formulações farmacêuticas são administradas por via oral, tópica, transdérmica, parentérica, por inalação de spray, vaginal, rectal ou por injecção intracraniana. 0 termo "parentérico", como aqui se utiliza, inclui injecções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injecção intracisterna, ou técnicas de infusão. A administração por injecção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica num local particular estão também contempladas. Geralmente, as composições são essencialmente isentas de pirogénios, assim como de outras impurezas que podem ser prejudiciais para o beneficiário.

Administrações únicas ou múltiplas das composições são realizadas com niveis de doses e padrões seleccionados pelo médico assistente. Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem apropriada depende do tipo de doença a tratar, como definido acima, da gravidade e decurso da doença, se o fármaco é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, do historial clinico do paciente e da resposta ao fármaco, e da discrição do médico assistente.

Kits

Como aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem uma ou mais composições liofilizadas embaladas de uma maneira que facilite a sua utilização para administração a indivíduos. Numa concretização, este kit inclui a formulação farmacêutica aqui descrita (e.g., uma composição compreendendo uma proteína ou um péptido terapêuticos), embalada num recipiente tal como um frasco ou vaso selados, com um rótulo afixado ao recipiente ou incluso na embalagem, que descreve a utilização do composto ou da composição na prática do método. Numa concretização, a formulação farmacêutica é embalada no recipiente de maneira a que a quantidade de espaço vazio no recipiente (e.g., a quantidade de ar entre a formulação líquida e o topo do recipiente) seja muito pequena. Preferivelmente, a quantidade de espaço vazio é desprezável (i.e., quase nula). Numa concretização, o kit contém um primeiro recipiente possuindo uma composição da proteína ou do péptido terapêuticos e um segundo recipiente possuindo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a 32 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ composição. Num aspecto, a formulação farmacêutica é embalada numa forma de dosagem unitária. 0 kit pode ainda incluir um dispositivo adequado para administração da formulação farmacêutica de cordo com uma via de administração especifica. Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve a utilização das formulações farmacêuticas.

Dosagens 0 regime de dosagem envolvido num método para o tratamento de uma condição aqui descrita será determinado pelo médico assistente, considerando vários factores que modificam a acção dos fármacos, e.g. a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a gravidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros factores clínicos. A título de exemplo, uma dose típica de um VWF recombinante da presente invenção é de aproximadamente 50 U/kg, igual a 500 pg/kg.

Num aspecto, as formulações da invenção são administradas num bolus inicial seguido de uma infusão contínua para manter os níveis terapêuticos do produto farmacêutico na circulação. Como outro exemplo, o composto da invenção é administrado numa dose de uma só vez. As pessoas competentes na matéria irão prontamente optimizar as dosagens eficazes e os regimes de administração como determinado pelas boas práticas médicas e pela condição clinica do paciente individual. A frequência da dosagem depende dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e da via de administração. A formulação farmacêutica óptima é determinada por um perito na especialidade dependendo da via de administração e da dosagem pretendida. Veja-se, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990,

Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. Estas formulações influenciam o estado físico, a estabilidade, a taxa de libertação in vivo, e a taxa de depuração in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, uma dose adequada é calculada de acordo com o peso corporal, a área da superfície corporal ou a dimensão dos órgãos. As dosagens apropriadas podem ser determinadas através da utilização de ensaios estabelecidos para a determinação de dosagens no nível sanguíneo em conjunto com dados de resposta à dose apropriados. O regime final de dosagem é determinado pelo médico assistente, considerando vários factores que 33 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ modificam a acção de fármacos, e.g. a actividade especifica do fármaco, a gravidade do dano e a responsividade do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a gravidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros factores clínicos. À medida que são realizados estudos, mais informação irá emergir relativamente aos níveis de dosagem apropriados e à duração do tratamento para várias doenças e condições.

Os exemplos que se seguem não se pretendem limitantes mas apenas exemplificativos de concretizações específicas da invenção.

Exemplo 1

Experiências de agitação

Para determinar a quantidade de precipitação de rVWF em várias formulações, testou-se a extensão da agregação de rVWF após agitação turbulenta sob uma variedade de condições.

Como mostrado na Tabela 1 adiante, avaliaram-se várias formulações de rVWF num tampão de citrato 20 mM, pH 7,3. As experiências de agitação foram desenhadas para simular condições de stress mecânico. Agitaram-se 1-2 ml de cada formulação com um agitador laboratorial durante 10 minutos a 1200 rpm. 34 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ TABELA 1

Lyo 25 Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG 1500 Tween 80 Sacarose Trealose Rafinose 18 30mM 5g/L 19 30mM 5g/L 20 30mM 5g/L 21 30mM 5g/L 22 30mM 5g/L 23 30mM 5g/L 24 30mM 5g/L 25 30mM 5g/L 26 30mM 0,lg/L 27 30mM 0,lg/L 28 30mM 0, IgL 29 30mM 0,lg/L 30 30mM 5g/L 5g/L 31 30mM 5g/L 5g/L 32 30mM 5g/L 5g/L 33 30mM 5g/L 5g/L 34 30mM 5g/L 0,lg/L 35 30mM 5g/L 0,lg/L 36 30mM 5g/L 0,lg/L 37 30mM 5g/L 0,lg/L 38 30mM 5g/L 5g/L 0,lg/L 39 30mM 5g/L 5g/L 0,lg/L 40 30mM 5g/L 5g/L 0,lg/L 41 30mM 5g/L 5g/L 0,lg/L 42 5g/L 43 5g/L 44 5g/L 45 5g/L 46 5g/L 5g/L 47 5g/L 5g/L 48 5g/L 5g/L 49 5g/L 5g/L 50 5g/L 0,lg/L 51 0,lg/L 5g/L 52 0,lg/L 5g/L 53 0,lg/L 5g/L A avaliação dos de acordo com o visíveis", na maioria dimensões variando de agregados visíveis de VWF foi realizada esquema mostrado adiante. "Agregados dos casos, são fibras gelatinosas com cerca de 100 nm a 1-2 cm. 35 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

ESQUEMA

Partículas A sem partículas B várias partículas, raramente visíveis (pontos) BI muitas partículas, raramente visíveis (pontos) C várias partículas, facilmente visíveis (fibras) D muitas partículas, facilmente visíveis (fibras) E partículas visíveis (fibras >lmm) EI precipitado branco fofo (bóia na superfície) E2 gelatinoso ("jellyfish")

Os resultados das experiências de agitação estão apresentados na Tabela 2, adiante. TABELA 2

Amostras Lyo 25 Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG 1500 Tween 80 Agitaçao de l-2mL 1200rpm 30min 18 3 OrrM 5g/L EI 19 3 0rrM 5g/L EI 20 3 OmM 5g/L EI 21 3 0rrM 5g/L EI 22 3 0rrM 5g/L EI 23 3 0mM. 5g/L EI 24 3 OrrM 5g/L EI 25 3 OmM 5g/L EI 26 3 OrrM. 0,Ig/L E2 grande 27 3 OmM 0,Ig/L E2 grande 28 3 0rrM 0,Ig/L E2 -6mm 29 3 OrrM 0,Ig/L E2 -3mm 30 3 0rrM 5g/L 5g/L EI 31 3 0rrM 5g/L 5g/L EI 32 3 0rrM 5g/L 5g/L EI 33 3 OrrM 5g/L 5g/L EI 34 3 0rrM 5g/L 0,Ig/L BI 35 3 OmM 5g/L 0,Ig/L B 36 3 0rrM 5g/L 0,Ig/L E2 grande 37 3 OrrM 5g/L 0,Ig/L E2 grande 38 3 OrrM 5g/L 5g/L 0,Ig/L D 39 3 0rrM 5g/L 5g/L 0,Ig/L D 40 3 0rrM 5g/L 5g/L 0,Ig/L B 41 3 OmM 5g/L 5g/L 0,Ig/L B

Em resumo, as experiências de agitaçao acima descritas indicam que as formulações contendo Tween-80 e Manitol 36 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ proporcionam os melhores resultados (i.e., a menor quantidade de agregação).

Exemplo 2

Experiências de congelação-descongelação

As experiências de congelação-descongelação foram desenhadas para avaliar o impacto do stress causado por congelação e descongelação repetidas. Em adição às formulações descritas acima para as experiências de agitação (Tabela 1), avaliaram-se as seguintes formulações (Tabela 3 e Tabela 4): TABELA 3

Amostras Lyo 25 Manitol PEG 1500 Tween 80 Sacarose Trealose Rafinose 42 5g/L 43 5g/L 44 5g/L 45 5g/L 46 5g/L 5g/L 47 5g/L 48 5g/L 49 5g/L 50 5g/L 0,lg/L 51 0,lg/L 5g/L 52 0,lg/L 5g/L 53 0,lg/L 5g/L 37 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ TABELA 4

Amostras Lyo 25 Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG 1500 Tween-80 Sacarose Trealose Rafinose 76 20g/L 0,2g/L 20g/L 77 20g/L 0,2g/L 10g/L 78 20g/L 0,2g/L 10g/L 79 15mM 20g/L 0,2g/L 20g/L 80 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 81 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 82 15mM 15mM 20g/L 0,2g/L 20g/L 83 15mM 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 84 15mM 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 85 15mM 15mM 20g/L 5g/L 0,2g/L 86 15mM 15mM 20g/L 5g/L 0,2g/L lOg/L 87 15mM 15mM 20g/L 15g/L 0,2g/L lOg/L 88 15mM 15mM 20g/L 0,2g/L 5g/L 89 15mM 15mM 20g/L 0,2g/L 15g/L 90 15mM 20g/L 0,2g/L 15g/L 92 15mM 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 93 30mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 94 30mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 95 30mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 96 30mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 97 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 98 15mM 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 99 15mM 15mM 20g/L 0,2g/L 5g/L 100 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L 15mM 20g/L 0,2g/L lOg/L

Todas as formulações foram congeladas a -20°C num congelador durante aproximadamente 1 hora e depois descongeladas à temperatura ambiente. Os resultados estão apresentados na Tabela 5 adiante. 38 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ TABELA 5

Amostras Lyo 25 Lisina Histidina Glicina Serina Manitol PEG 1500 Tween-80 Sacarose Trealose Rafinose Congelação/ Descongelação (4 vezes) Congelação/ Descongelação (~10 vezes) 18 3 OmM 5g/L EI 15 19 3 OmM 5g/L EI 19 20 3 OmM 5g/L C 20 21 3 Om 5g/L C 21 M 22 3 OmM 5g/L C 22 23 3 OmM 5g/L C/Bl 23 24 3 OmM 5g/L C 24 25 3 Om 5g/L C 25 M 26 3 OmM 0,lg/L B 26 27 3 OmM 0,lg/L B-Bl 27 28 3 OmM 0,lg/L B 28 29 3 Om 0,lg/L E 29 M 30 3 OmM 5g/L 5g/L E 30 31 3 OmM 5g/L 5g/L D 31 32 3 OmM 5g/L 5g/L Bl-C 32 33 3 Om 5g/L 5g/L C/D 33 M 34 3 OmM 5g/L 0,lg/L E2 (rest B) 34 35 3 OmM 5g/L 0,lg/L E 35 36 3 OmM 5g/L 0,lg/L E 36 37 3 Om 5g/L 0,lg/L B 37 M 38 3 OmM 5g/L 5g/L 0,lg/L B 38 39 3 OmM 5g/L 5g/L 0,lg/L B 39 40 3 OmM 5g/L 5g/L 0,lg/L B 40 41 3 Om 5g/L 5g/L 0,lg/L A 41 M 42 5g/L D 42 43 5g/L D 43 44 5g/L EI 44 45 5g/L EI 45 46 5g/L 5g/L D 46 47 5g/L 5g/L D 47 48 5g/L 5g/L D-E 48 49 5g/L 5g/L E 49 50 5g/L 0,lg/L BI 50 51 0,lg/L 5g/L C-D 51 52 0,lg/L 5g/L BI 52 53 0,lg/L 5g/L BI 53

Como mostrado resultados (i.e., acima, a Trealose proporcionou os melhores quantidade de agregação) . a menor 39 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Exemplo 3

Experiências de liofilização

As experiências de liofilização foram desenhadas para avaliar a capacidade de várias formulações para permitirem a formação de um bolo de liofilização ("lio-bolo") que se dissolve em menos de 10 minutos e resulta numa solução límpida. Foi também realizado um estudo de estabilidade acelerado para demonstrar que não havia perda siqnificativa de actividade biolóqica.

As formulações mostradas na Tabela 6 adiante foram liofilizadas com um liofilizador de azoto TS20002 de acordo com as instruções do fabricante. O tempo total da liofilização foi de aproximadamente 72 horas. Cada uma das formulações adiante também continha 20 g/L de Manitol e 0,1 g/L de Tween-80. TABELA 6

Lyo 26 Citrato HEPES Glicina Histidina Acetato Tris Fosfato Lisina Histidina Glicina Trealose Rafinose 1 15rrM lOg/L 2 15mM 15mM lOg/L 3 15mM 15mM lOg/L 4 15mM 15mM lOg/L 5 15mM 15mM 15mM lOg/L 6 15mM 3 OrrM lOg/L 7 15mM lOg/L 8 15mM 15mM lOg/L 9 15mM lOg/L 10 15mM 15mM lOg/L 11 15mM 15mM lOg/L 12 15mM 15mM 10g/L 13 15mM 15mM 15mM lOg/L 14 15mM 15rrM 15mM lOg/L 15 15mM lOg/L 16 15mM 15mM lOg/L 17 15mM lOg/L 18 15rrM 15rrM lOg/L 19 15mM 15mM 15mM lOg/L 20 15mjy 15mM 15mM lOg/L 21 15mM 15mM 15mM lOg/L

Os resultados das experiências de liofilização estão apresentados na Tabela 7 adiante. 40 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ TABELA 7

Tampão Excipientes - - - Lyo 26 Citrato HEPES Glicina Histidina Acetato Tris Fosfato Lisina Histidina Glicina Trealose Rafinose 1 15mM 10g/L 2 15rrM 15mM lOg/L 3 15mM 15mM lOg/L 4 15mM 15mM lOg/L 5 15mM 15mM 15mM lOg/L 6 15mM 30mM lOg/L 7 15rrM 10g/L 8 15mM 15mM lOg/L 9 15rrM lOg/L 10 15mM 15mM lOg/L 11 15mM 15mM lOg/L 12 15mM 15mM lOg/L 13 15mM 15mM 15mM lOg/L 14 15mM 15mM 15mM lOg/L 15 15mM lOg/L 16 15mM 15mM lOg/L 17 15mM lOg/L 18 15mM 15mM lOg/L 19 15mM 15mM 15mM lOg/L 20 15mM 15mM 15mM lOg/L 21 15mM 15mM 15mM lOg/L

Como mostrado acima, quer um tampão de Citrato quer o HEPES em combinação com um aminoácido proporcionaram a solução mais limpida.

Para avaliar a estabilidade do rVWF liofilizado reconstituído, realizaram-se testes de VWF:Ag e VWF:RCo. 0 VWF:Ag corresponde à quantidade de VWF que pode ser detectada num ELISA específico para VWF utilizando anticorpo policlonal anti-VWF, enquanto o VWF:RCo corresponde à quantidade de VWF que causa a aglutinação de plaquetas estabilizadas na presença de ristocetina. As amostras foram armazenadas a 40°C. Assumindo a aplicabilidade da equação de Arrhenius, um mês de estabilidade a 40 °C é equivalente a aproximadamente um ano a 4°C. Os resultados das experiências de estabilidade estão apresentados na Tabela 8 e na Tabela 9 adiante. 41 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ TABELA δ

Semanas a 40° rVWF:Ag formulação 0 4 5 8 1 121, 1 89,8 113,0 106,6 2 121, 8 102,0 114, 0 112,8 3 119, 9 102,0 105,,0 112, 7 4 117, 3 100,0 108,0 114, 4 5 121,2 98,2 117, 0 114, 9 6 123, 8 9 6,6 107, 0 - 7 135, 2 9 6,6 112, 0 112,4 8 130,6 82,2 108,0 115, 7 9 112, 0 89,5 109,0 107, 0 10 122, 4 87,1 106,0 107, 7 11 119,3 97,5 115, 0 114,2 12 124, 2 109,0 109,0 103,4 13 110,2 92,3 106,0 112,4 14 108, 9 107, 0 103,0 109,0 TABELA 9

Semanas a 40° rVWF:RCo formulação 0 4 5 8 1 86 102 97, 0 93,0 2 84 97 88,0 O 05 00 3 85 100 87, 0 93,0 4 102 81,0 O 00 05 5 85 89 88,0 O 00 05 6 83 102 88,0 7 92 97, 0 95, 0 8 88 94 90,0 104, 0 9 93 91 97, 0 100,0 10 95 87 87, 0 co -J > o 11 86 93 89,0 99,0 12 84 91 89,0 95, 0 13 88 87 96,0 O 05 00 14 90 91 86,0 92,0 42 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ Ο desvio padrão para ο ELISA está na gama de 10-20%. Os resultados acima indicam que todas as formulações testadas proporcionam boa estabilidade ao longo de 8 semanas a 40°C.

Realizaram-se experiências de estabilidade adicionais em que se utilizaram diferentes aminoácidos nas formulações (e.g.f glicina, lisina ou histidina a 15 mM ou 20 m), e em que o tampão de citrato foi variado (e.g., 15, 20 ou 25 mM) . Como descrito acima, a estabilidade do rVWF foi monitorada

utilizando o ensaio de actividade VWF:RCo. Mesmo após 13 meses não se observaram diferenças significativas para os valores de actividade VWF:RCo de amostras de estabilidade de rVWF armazenadas a 40°C. A significância das medições foi testada com um Teste t. A precisão intermédia do ensaio foi determinada calculando o Coeficiente de Variância. Em toda a série dos dados de estabilidade o CV foi inferior a 20% e cumpria os critérios de validação de um CV<20%. Com base no anterior, pode-se concluir que o rVWF é estável em todos os sistemas tampão de citrato testados, independentemente da molaridade do tampão e dos aminoácidos adicionados. O rVWF permanece estável durante pelo menos 13 meses mesmo quando armazenado a 40°C. A determinação da potência utilizando o ensaio de actividade VWF:RCo mostra boa precisão intermédia com valores de CV inferiores a 20%.

Assim, tendo em conta os dados aqui apresentados, foi proposta uma formulação para o rVWF incluindo citrato 15 mM (NasCitrato x 2 H20) , glicina 15 mM, Trealose a 10 g/L,

Manitol a 20 g/L, Tween-80 a 0,1 g/L, pH 7,3.

Exemplo 4

Estabilidade a longo prazo

Testes de estabilidade acelerados e de longo prazo

Realizaram-se estudos para avaliar a estabilidade do produto farmacêutico final (PFF) de rVWF armazenado tanto nas condições de armazenagem recomendadas como elevadas. Os dados das condições de armazenagem elevada proporcionam uma segurança de que desvios na temperatura não irão ter impacto sobre a qualidade do PFF de rVWF e serão utilizados para extrapolar a condição de expiração aceitável do material na 43 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ ausência de dados de estabilidade em condições reais, em tempo real. A especificação corrente é d 3,0% de humidade residual (como determinada utilizando o Método de Karl Fischer). Os lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC e rVWFF#7FC foram liberados com níveis de humidade de 1,2%, 1,3%, 1,2% e 1,5%, respectivamente. Com base na experiência anterior com outros produtos com configurações de frascos e rolhas similares, é expectável que quaisquer lotes de rVWF liberados com aproximadamente 1,3% de humidade residual cumprirão o limite da especificação de ^3,0% no final do tempo de prateleira proposto (i.e. 24 meses à temperatura de armazenagem pretendida de 5°C ± 3°C).

Os estudos de estabilidade de longo prazo nas condições de armazenagem recomendadas (i.e. 5°C ± 3°C) e a temperaturas elevadas (i.e. 40°C ± 2°C) foram conduzidos com quatro lotes de PFF de rVWF que foram fabricados. Estes estudos proporcionaram suficientes dados para se comparar o comportamento em termos de estabilidade dos lotes clínicos individuais. O protocolo de estabilidade, incluindo uma descrição dos ensaios indicadores de estabilidade e os critérios de aceitação de estabilidade, pode ser encontrado na Tabela 10 que também contém informação relativa aos lotes de PFF de rVWF avaliados nos estudos de estabilidade. 44 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ 44 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ Tabela 10 Condições de Arma z enagem (0 C) Número do lote Intervalos de teste completados Propostos) (e (_n O O 1+ CO 0 O rVWF#lFC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18, 24 meses CO o 0 O rVWF#lFC o, 1, 3, 6 meses (_n o O 1+ CO 0 O rVWF#2FC 0 1 , 2 3, 6, meses <_n 0 O 1+ CO 0 O rVWF#3FC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18, 24 meses CO o 0 O rVWF#3FC 0, D.5 , i 2, 3, 6 meses 0^ o 0 O rVWF#3FC 0, 0 5, 1, 2, 3 meses 5 °C ± 3 °C rVWF#4FC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18, 24, (30) meses 0^ o 0 O rVWF#4FC 0, 1, 2, 3, 6, 9 meses 5 °C ± 3 °C rVWF#5FC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18, (24, 30) meses O O O rVWF#5FC 0, 1, 2, 3 6, 9 meses 5 °C ± 3 °C rVWF#6FC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, (18, 24, 30) meses O O O rVWF#6FC 0, 1, 2, 3, 6, 9 meses 5 °C ± 3 °C rVWF#7FC 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, (18, 24, 30) meses O O O rVWF#7FC 0, 1, 2, 3, 6, 9 meses

Sumário e discussão de estabilidade global (24 Meses)

Os dados de estabilidade de PFF de rVWF apresentados são constituídos pelo seguinte: 1. dados de 24 meses de estudos de longo prazo a 5°C ± 3°C (testes completos) e dados intermédios de 6 meses a 30°C ± 2°C (testes completos) para o lote rVWF#lFC; 2. dados de 6 meses a 5°C ± 3°C (testes completos) para o lote rVWF#2FC; 3. dados de 24 meses de estudos de longo prazo a 2-8° (testes completos), dados de 6 meses a 30°C ± 2°C e 3 meses dados a 40°C ± 2°C (testes completos) para o lote rVWF#3FC; 4. dados de estabilidade de 24 meses a 5°C ± 3°C e dados de 9 meses a 40°C ± 2°C para o lote rVWFF#4FC; 5. dados de estabilidade de 24 meses a 5°C ± 3°C e dados de 9 meses a 40°C ± 2°C para o lote rVWFF#5FC; 3°C e dados de 6. dados de estabilidade de 12 meses a 5°C ± 9 meses a 40°C ± 2°C para o lote rVWFF#6FC; e 45 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

7. dados de estabilidade de 12 meses a 5°C ± 3°C e dados de 9 meses a 40°C + 2°C para o lote rVWFF#7FC A variação observada na humidade residual para os lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC e rVWFF#7FC permaneceu bem abaixo do critério de aceitação < 3%, e não teve impacto sobre a actividade funcional (VWF:RCo). Não houve alteração observável nos resultados de estabilidade para técnicas analíticas qualitativas (i.e. aparência, análise SDS-PAGE, etc.) para os lotes fabricados para serem adequados para utilização nos estudos clínicos e não clínicos. Similarmente, não houve tendência para diminuição da estabilidade para a análise de proteína total, a análise VWF:Ag ou o número observado de multímeros de VWF durante a armazenagem. A variação na proporção entre actividade VWF:RCo e actividade VWF:Ag e nos dados de VWF:RCo apresentados para os lotes rVWF#lFC, rVWF#2FC e rVWF#3FC foi provavelmente o resultado da variação do método de teste, o facto de os resultados do teste de estabilidade VWF:RCo individual consistirem em dados de uma única determinação de uma amostra de estabilidade, e/ou de os dados não estarem conforme a metodologia de ensaio de métodos da Ph. Eur. Todos os pontos temporais dos testes para os lotes não clínicos subsequentes à modificação da metodologia de ensaio para o ensaio conforme a Ph.Eur. foram testados utilizando tanto a metodologia de ensaio original como a nova. 0 PFF de rVWF fabricado em larga escala exibiu características de estabilidade similares aos lotes de PFF de rVWF fabricados a uma escala experimental. Estes lotes de PFF de rVWF mantinham a actividade VWF:RCo durante até 24 meses de armazenagem a 5°C ± 3°C. Não houve alteração no padrão de multímeros de VWF em amostras dos lotes de larga escala presentemente em estabilidade, mesmo após 6 meses de armazenagem a 30°C ± 2°C ou 9 meses de armazenagem a 40°C ± 2°C. A Tabela 11 mostra os resultados para VWF:RCo, VWF:Ag e padrão de multímeros de VWF dos lotes rVWF#4FC, rVWF#5FC, rVWF#6FC e rVWF#7FC armazenados sob condição de stress a 40°C ± 2°C. Os resultados indicam estabilidade em condições de armazenagem a temperatura elevada durante 9 meses que pode ser 46 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ extrapolada para uma vida de prateleira de mais de 3 anos a temperaturas ambientes ou ainda mais sob condições refrigeradas.

Tabela 11

Dados de Estabilidade para rVWF#4FC a 40°C ± 2°C Atributo Especificação Resultados no Tempo (Meses) 0 1 2 3 6 9 Actividade VWF:RCo [U/ml11 70-150 130 117 118 127 132 142 ELISA VWF:Ag (U/ml) resultado reportado 86 87 79 81 79 86 análise de multímeros de VWF resultado reportado 21 20 20 20 21 18 Dados de Estabilidade para rVWF#5FC a 40°C ± 2°C Atributo Especificação Resultados no Tempo (Meses) 0 1 2 3 6 9 Actividade VWFrRCo [U/ml]11 70-150 107 119 120 116 132 134 ELISA VWF:Ag (U/ml) resultado reportado 94 86 84 91 90 79 análise de multímeros de VWF resultado reportado 20 20 18 19 20 19 Dados de Estabilidade para rVWF#6FC a 40°C ± 2°C Atributo Especificação Resultados no Tempo (Meses) 0 1 2 3 6 9 Actividade VWF:RCo [U/ml]11 70-150 118 111 126 129 130 119 ELISA VWF:Ag (U/ml) Resultados reportados 85 95 86,3 73,5 80,8 70,3 análise de multímeros de VWF Resultado reportado 20 19 20 20 20 n. t. Dados de Estabilidad e para rVWF#7FC a 40°C ± 2°C Atributo Especificação Resultados no Tempo (Meses) 0 1 2 3 6 9 Actividade VWF:RCo [U/ml] 11 70-150 111 115 122 105 99 112 ELISA VWF:Ag (U/ml) Resultado reportado 87,3 85,3 77, 5 68,8 75 73, 8 análise de multímeros de VWF Resultado reportado 21 20 20 19 19 19 47 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Uma análise de covariância (análise ANCOVA) demonstrou que a diferença nos declives das linhas de regressão (lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC e rVWFF#7FC armazenados a 5°C ± 3°C) não é significativa (p=0,906), permitindo que os dados da actividade VWF:RCo fossem reunidos como descrito em ICH Q1A (R2) . A diferença na elevação das linhas de tendência dos lotes individuais também não é significativa. A extrapolação do declive do pior caso reunido, como mostra a Figura 1, mostra que os intervalos de confiança estão bem dentro dos critérios de aceitação para um mínimo de 24 meses. 0 menor intervalo de confiança para a curva média diminui para 80% da actividade inicial aos 51 meses (80% é também a diferença máxima entre potência estimada e potência declarada para o Factor de von Willebrand Humano na Ph.Eur). O declive do pior caso reunido mostra uma diminuição de 0,0344 U de VWF:RCo por mês. Esta comparação mostra que as características de estabilidade do PFF de rVWF, especificamente a actividade VWF:RCo, não se altera em resultado das alterações no processo de produção. A extrapolação acima suporta a extensão da vida de prateleira provisória de PFF de rVWF para 24 meses quando armazenado à temperatura de armazenagem recomendada. A transferência de humidade da rolha para o produto liofilizado depende do material da rolha e é influenciada pela humidade residual da rolha após a esterilização, pela humidade à qual a amostra é armazenada e pela taxa de transferência de humidade intrínseca da rolha. A humidade residual nos lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC e rVWFF#7FC armazenados a 5°C ± 3°C era comparável (a diferença na comparação de declives não era significativa, com p=0,734), como mostrado na Figura 2. Os lotes armazenados nas condições de temperatura elevada de 40°C ± 2°C também mostraram um aumento comparável na humidade residual ao longo de 9 meses (Figura 3). A análise ANCOVA demonstra aqui que a diferença no declive das linhas de regressão é comparável (p = 0,546). A Figura 3 mostra a extrapolação do declive do pior caso reunido até 24 meses.

Estes dados são suficientes para suportar a utilização dos lotes rVWFF#6FC e rVWFF#7FC para a duração do período de expiração descrito de 24 meses quando armazenados a 5°C ± 3°C. 48 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Condições de Armazenagem e Vida de Prateleira Propostas A condição de armazenagem recomendada para o PFF de rVWF é de 5°C ± 3°C. Uma vida de prateleira provisória de 24 meses para o PFF de rVWF é portanto proposta quando armazenado nas condições de armazenagem recomendadas. A vida de prateleira para os lotes de PFF de rVWF poderá provavelmente ser mais estendida com base em dados adicionais gerados para períodos de armazenagem mais longos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Schnecker, et al.

<120> FORMULAÇÕES DE VWF RECOMBINANTE LIOFILIZADO

<130> 31315/44042A <150> US-61/107, 273 <151> 2008-10-21 <160> 3 <170> Patentln version 3.5

<210> 1 <211> 8833 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 agctcacagc tatcgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt 60 tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg 120 gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg 180 gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt 240 gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt 300 gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct 360 tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg 420 cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca 480 gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt 540 tgtcaatggt accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg 600 gctgtatcta gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt 660 ggccaggatc gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa 720 gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga 780 agggaccttg acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga 840 acagtggtgt gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat 900 49 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ gcagaagggc ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg 960 ccaccctctg gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg 1020 tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca 1080 ggagggaatg gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc 1140 tggtatggag tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat 1200 caatgaaatg tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct 1260 ggatgaaggc ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta 1320 ccctcccggc acctcectct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg 1380 gatctgcagc aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa 1440 gagctttgac aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga 1500 ttgccaggac cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga 1560 cgctgtgtgc acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa 1620 actgaagcat ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa 1680 aggtgacctc cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga 1740 cctgcagatg gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc 1800 cgggaagacc tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac 1860 cccctctggg ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg 1920 ggactgccag gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccetcaacc cgcgoatgac 1980 caggttctcc gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg 2040 tgccgtcagc ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga 2100 cggccgcgag tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cgygçagâgg 2160 cgtgcgcgtc gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt 2220 gtacctgcag tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga 2280 ggaatgcaat gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga 2340 gaggggggac tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca 2400 gccagaagac atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca 2460 ctgtaccatg agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct 2520 gtctcatcgc agcaaaagga gcctateetg tcggececcc atggtcaagc tggtgtgtcc 2580 cgctgacaac ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct 2640 ggagtgcatg agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtceggca 2700 tgagaacaga tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc 2760 ccctggagaa acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa 2820 ctgcacagac catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac 2880 cttcgacggg ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta 2940 ctgcggcagt aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc 3000 ctcagtgaaa tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt 3060 50 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ tgacggggag gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga 3120 gtctggccgg tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca 3160 cctgagcatc tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg 3240 gaattttgat ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga 3300 ccctgtggac tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt 3360 gcctctggac tcatcccctg ccacctgcca taacaaeatc atgaagcaga cgatggtgga 3420 ttcctcctgt agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc 3480 cgagccatat ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg 3540 cgcctgcttc tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt 3600 ggtgacctgg aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga 3660 gaacgggtat gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg 3720 tcagcaccct gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg 3780 ccctccaggg aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc 3840 agtgtgtgag gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag 3900 tgaccctgag cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg 3960 ccaggagccg ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct 4020 gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga 4080 cctggtcttc ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa 4140 ggcctttgtg gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc 4200 cgtggtggag taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc 4260 gtcagagctg cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac 4320 cagcgaggtc ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc 4380 ctcccgcatc accctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt 4440 tgtccgctac gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg 4500 gccccatgcc aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc 4560 cttcgtgctg agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct 4620 ctgtgacctt gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac 4630 tgtgggcccg gggctcttgg gggtttcgac cctggggcec aagaggaact ccatggttct 4740 ggatgtggcg ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag 4800 caaggagttc atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt 4860 51 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ cacggtgctg cagtactcct acatggtgac tgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc 4920 caaaggggac atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa 4 980 cactgggctg gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg 5040 ggagcaggcg cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa 5100 gaggctgcct ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca 5160 ggagctggag aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct 5220 cccccgagag gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat 5280 ccccaccctc tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga 5340 tggctcctcc agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt 5400 catttcaaaa gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag 5460 catcaccacc attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct 5520 tgtggacgtc atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc 5580 tgtgcgatac ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt 5640 catcctggtc acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc 5700 caacagagtg acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg 5760 gatcttggca ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct 5820 ccctaccatg gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag 5880 gatttgcatg gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga 5940 ccagtgccac accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt 6000 caactgtgac cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga 6060 agagacctgt ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca 6120 catcgtgacc tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt 6180 tcaaaacaag gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc 6240 aaggcagggc tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca 6300 cagtgacatg gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa 6360 catggaagtc aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca 6420 catcttcaca ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt 6480 tgcttcaaag acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat 6540 gctgagggat ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca 6600 gcggccaggg cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc 6660 ccactgccag gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc 6720 52 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ cacattctat gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat 6780 cgcctcttat gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga 6840 tttctgtgct atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc 6900 ccggcactgt gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg 6960 ccctccagat aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg 7020 cattggtgag gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagce 7080 ctgtcagatc tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc 7140 cacggccaaa gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga 7200 ccagtgctgc cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt 7260 gcctcactgt gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa 7320 cttcacctgc gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc 7380 gcaccgtttg cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa 7440 ctgtgtcaac tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaactg ccaccaatga 7500 ctgtggctgt accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat 7560 ctaccctgtg ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga 7620 ggatgccgtg atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg 7680 tcggtcgggc ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc 7740 tgcctgtgag gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt 7800 cggctcccag tgçgcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa 7860 ggaggaggtc tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg 7920 cccctcgggc tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaaget gtcgctgtga 7930 gcgcatggag gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat 8040 cgatgtgtgc acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct 8100 ggagtgcagg aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac 8160 aggtgaatgt tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca 8220 gatcatgaca ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa 8280 ggtcaatgag agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga 8340 tgaacacaag tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga 8400 cacatgtgag gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg 8460 aagctgtaag tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgceagcaa 8520 agccatgtac tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccaç tgctcctgct gctctccgac 8580 acggacggag cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga 8640 ggttctcaat gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt gaggctgctg 8700 cagctgcatg ggtgcctgct gctgcctgcc ttggcctgat ggccaggcca gagtgctgcc 8760 agtcctctgc atgttctgct cttgtgccct tctgagccca caataaaggc tgagctctta 8820 tcttgcaaaa ggc 8833 53 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

<210> 2 <211> 2783 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Leu Ile Leu Pro Gly 1 5 10 15 Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr Ala Arg Cys 20 25 30 Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly Ser Met Tyr 35 40 45 Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly Cys Gin Lys 50 55 60 Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gin Asn Gly Lys Arg Val Ser 55 70 75 80 Leu Ser Vai Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu Phe Val Asn 85 90 95 Gly Thr Vai Thr Gin Gly Asp Gin Arg Val Ser Met Pro Tyr Ala Ser 100 105 110 Lys Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys Leu Ser Gly Glu Ala Tyr 115 120 125 Gly Phe Vai Ala Arg ile Asp Gly Ser Gly Asn Phe Gin Val Leu Leu 130 135 140 Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asn 145 150 155 160 Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gin Glu Gly Thr Leu Thr Ser 165 170 175 Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala Leu Ser Ser Gly Glu Gin iao 185 190 Trp Cys Glu Arg Pro Ser Ser Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met 195 200 205 Gin Lys Gly Leu Trp Glu Gin Cys Gin Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val 210 215 220 Phe Ala Arg Cys His Pro Leu Val Asp Pro Glu Pro Phe Cys Glu Lys 225 230 235 240 Thr Leu Cys Glu Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu 245 250 255 54 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Leu Glu Tyr Ala Arg Thr Cys Ala Gin Glu Gly Met Vai Leu Tyr Gly 260 265 270

Trp Thr Asp His Ser Ala Cys Ser Pro Vai Cys Pro Ala Gly Met Glu 275 230 285

Tyr Arg Gin Cys Vai Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gin Ser Leu His 290 295 300

Ile Asn Glu Met Cys Gin Glu Arg Cys Vai Asp Gly Cys Ser Cys Pro 305 310 315 320

Glu Gly Gin Leu Leu Asp Glu Gly Leu Cys Vai Glu Ser Thr Glu Cys 325 330 335

Pro Cys Val His Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser 340 345 350

Arg Asp Cys Asn Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gin Trp Ile Cys Ser 355 360 365

Asn Glu Glu Cys Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gin Ser His Phe 370 375 380

Lys Ser Phe Asp Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gin Tyr 385 390 395 400

Leu Leu Ala Arg Asp Cys Gin Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu 405 410 415

Thr Val Gin Cys Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val 420 425 430 Thr Val Arg Leu Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His 435 440 445 Gly Ala Gly Val Ala Met Asp Gly Gin Asp Val Gin Leu Pro Leu Leu 450 455 460 Lys Gly Asp Leu Arg ile Gin His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu 465 470 475 480 Ser Tyr Gly Glu Asp Leu Gin Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu 485 4 90 495 Leu Val Lys Leu Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys 500 505 510 Gly Asn Tyr Asn Gly Asn Gin Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly 515 520 525 Leu Ala Glu Pro Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His 530 535 54 0 55 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Gly Asp Cys Gin Aap Leu Gin Lys Gin His Ser Asp Pro Cys Ala Leu 545 550 555 560

Asn Pro Arg Met Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Vai Leu Thr 565 570 575

Ser Pro Thr Phe Glu Ala Cys His Arg Ala Vai Ser Pro Leu Pro Tyr 580 585 590

Leu Arg Asn Cys Arg Tyr Asp Vai Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu 595 600 605

Cys Leu Cys Gly Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Vai Arg 610 613 620

Vai Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly 635 640 625 630

Gin Vai Tyr Leu Gin Cys Gly Thr 645 Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys 660 Phe Cys Pro Pro Met Asp Glu Arg 675 680 Cya Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu 690 695 Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr 705 710 Thr Met Ser Gly Vai Pro Gly Ser 725 Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys 740 Met Vai Lys Leu Vai Cys Pro Ala 755 760 Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gin Asn 770 775 Gly Cys Vai Ser Gly Cys Leu Cys 785 7 90 Asn Arg Cys Glu Arg Cys Pro Cys 805

Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser 650 655

Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys 665 670

Gly Asp Cys Vai Pro Lys Ala Gin 685

Ile Phe Gin Pro Glu Asp Ile Phe 700

Cys Glu Asp Gly Phe Met His Cys 715 720

Leu Leu Pro Asp Ala Vai Leu Ser 730 735

Arg Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro 745 750

Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu 765

Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met 780

Pro Pro Gly Met Vai Arg His Glu 795 800

Phe His Gin Gly Lys Glu Tyr Ala 810 815

Pro Gly Glu Thr Vai Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Vai Cys Arg Asp 820 825 830 56 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Vai Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr 835 840 845

Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe 850 855 860

Pro Gly Glu Cys Gin Tyr Vai Leu Vai Gin Asp Tyr Cys Gly Ser Asn 865 870 875 880

Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Vai Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro 885 890 895

Ser Vai Lys Cys Lys Lys Arg Vai Thr Ile Leu Vai Glu Gly Gly Glu 900 905 910

Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Vai Asn Vai Lys Arg Pro Met Lys Asp 915 920 925

Glu Thr His Phe Glu Vai Vai Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu 930 935 940

Leu Gly Lys Ala Leu Ser Vai Vai Trp Asp Arg His Leu Ser lie Ser 945 950 955 960

Vai Val Leu Lys Gin Thr Tyr Gin Glu Lys Vai Cys Gly Leu Cys Gly 965 970 975

Asn Phe Asp Gly Ile Gin Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gin 980 985 990

Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser 995 1000 1005

Gin Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala 1010 1015 1020

Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gin Thr Met Val Asp Ser Ser 1025 1030 1035

Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gin Asp Cys Asn Lys Leu 1040 1045 1050

Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys 1055 1060 1065

Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys Phe Cys Asp Thr Ile 1070 1075 1080

Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gin His Gly Lys Val Val Thr 1085 1090 1095 57 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gin Ser Cys Glu Glu Arg Asn 1100 1105 1110

Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys 1115 1120 1125

Ala Pro Ala Cys Gin Vai Thr Cys Gin His Pro Glu Pro Leu Ala 1130 1135 1140

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Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gin Thr Cys Vai Asp Pro Glu 1160 1165 1170

Asp Cys Pro Vai Cys Glu Vai Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly 1175 1180 1185

Lys Lys Vai Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gin Ile 1190 1195 1200

Cys His Cys Asp Vai Vai Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gin Glu 1205 1210 1215

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Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Vai Phe Leu Leu Asp Gly 1250 1255 1260

Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Vai Leu Lys Ala Phe 1265 1270 1275

Vai Vai Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gin Lys Trp Vai 1280 1285 1290

Arg Vai Ala Vai Vai Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile 1295 1300 1305

Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala 1310 1315 1320

Ser Gin Vai Lys Tyr Ala Gly Ser Gin Vai Ala Ser Thr Ser Glu 1325 1330 1335

Vai Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gin Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg 1340 1345 1350

Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser Gin Glu 1355 1360 1365 58 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

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Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gin Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg 1625 1630 1635

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Leu Gin Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gin Pro 1655 1660 1665

Leu Asp Vai Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala 1670 1675 1680

Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser 1685 1690 1695

Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr Gin Vai Ser Vai Leu Gin 1700 1705 1710

Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Vai Pro Trp Asn Vai Vai Pro 1715 1720 1725

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Gly Gly Pro Ser Gin Ile Gly Asp Ala Leu Gly Phe Ala Vai Arg 1745 1750 1755

Tyr Leu Thr Ser Glu Met His 1760 1765

Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys 1770

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Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro 1790 1795 1800

Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Gin Leu Arg Ile Leu 1805 1810 1815 60 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

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Glu Vai Ala Arg Leu Arg Gin Asn Ala Asp Gin Cys Cys Pro Glu 2285 2290 2295

Tyr Glu Cys Vai Cys Asp Pro Vai Ser Cys Asp Leu Pro Pro Vai 2300 2305 2310

Pro His Cys Glu Arg Gly Leu Gin Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly 2315 2320 2325

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Lys Arg Vai Ser Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr 2345 2350 2355

Leu Arg Lys Thr Gin Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn 2360 2365 2370

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Thr Ala Thr Asn Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro 2390 2395 2400

Asp Lys Vai Cys Vai His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Vai Gly Gin 2405 2410 2415

Phe Trp Glu Glu Gly Cys Asp Vai Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu 2420 2425 2430

Asp Ala Vai Met Gly Leu Arg Vai Ala Gin Cys Ser Gin Lys Pro 2435 2440 2445

Cys Glu Asp Ser Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Vai Leu His Glu 2450 2455 2460

Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Vai Vai 2465 2470 2475

Thr Gly Ser Pro Arg Gly Asp Ser Gin Ser Ser Trp Lys Ser Vai 2480 2485 2490

Gly Ser Gin Trp Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Vai Arg 2495 2500 2505 63 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Vai Lys Glu Glu Vai Phe Ile Gin 2510 2515

Gin Arg Asn Vai Ser Cys Pro 2520

Gin Leu Glu Vai Pro Vai Cys Pro 2525 2530

Ser Gly Phe Gin Leu Ser Cys 2535

Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser 2540 2545

Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu 2550

Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr Vai 2555 2560

Ile Gly Pro Gly Lys Thr Vai 2565

Met Ile Asp Vai Cys Thr Thr Cys 2570 2575

Arg Cys Met Vai Gin Vai Gly 2580

Vai Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu 2585 2590

Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn 2595

Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu 2600 2605

Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys 2610

Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala 2615 2620

Cys Thr Ile Gin Leu Arg Gly 2625

Gly Gin Ile Met Thr Leu Lys Arg 2630 2635

Asp Glu Thr Leu Gin Asp Gly 2640

Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Vai 2645 2650

Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe 2655

Trp Glu Lys Arg Vai Thr Gly Cys 2660 2665

Pro Pro Phe Asp Glu His Lys 2670

Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile 2675 2680

Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys 2685

Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu 2690 2695

Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg 2700

Leu Gin Tyr Vai Lys Vai Gly Ser 2705 2710

Cys Lys Ser Glu Vai Glu Vai 2715

Asp Ile His Tyr Cys Gin Gly lys 2720 2725 Ser Ile Asp Ile Asn Asp Vai Gin 2735 2740

Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr 2730

Asp Gin Cys Ser Cys Cys Ser 2745

Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gin 2750 2755

His Cys Thr Asn Gly Ser Vai 2760

Vai Tyr His Glu Vai Leu Asn Ala 2765 2770

Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro 2775

Arg Lys Cys Ser Lys 2780 64 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

<210> 3 <211> 2050 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Vai Lys Leu Vai Cys Pro Ala Asp 15 10 15

Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gin Asn Tyr 20 25 30

Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Vai Ser Gly Cys Leu Cys Pro 35 40 45

Pro Gly Met Vai Arg His Glu Asn Arg Cys Vai Ala Leu Glu Arg Cys 50 55 60

Pro Cys Phe His Gin Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Vai Lys 65 70 75 80

Ile Gly Cys Asn Thr Cys Vai Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr 85 90 95

Asp His Vai Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr 100 105 110

Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gin Tyr 115 120 125

Vai Leu Vai Gin Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile 130 135 140

Leu Vai Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Vai Lys Cys Lys Lys 145 150 155 160 65 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Arg Val Thr Ile Leu val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly 165 170 175 Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val 180 185 190 Vai Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser 195 200 205 Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gin Thr 210 215 220 Tyr Gin Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gin 225 230 235 240 Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gin Val Glu Glu Asp Pro Val 245 250 255 Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gin Cys Ala Asp Thr Arg 260 265 270 Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met 275 280 285 Lys Gin Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val 290 295 300 Phe Gin Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 305 310 315 320 Cys He Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys 325 330 335 Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gin His Gly 340 345 350 Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gin Ser Cys Glu 355 360 365 Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn 370 375 380 Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gin Val Thr Cys Gin His Pro Glu Pro Leu 385 390 395 400 66 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Ala Cys Pro Vai Gin Cys Vai Glu 405

Gly Lys lie Leu Asp Glu Leu Leu 420

Cys Pro Vai Cys Glu Vai Ala Gly 435 440

Vai Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro 450 455

Asp Vai Vai Asn Leu Thr Cys Glu 465 470

Vai Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro 485

Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu 500

Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp 515 520

Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe 530 535

Arg Ile Ser Gin Lys Trp Val Arg 545 550

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu 565

Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gin Val 580

Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr 595 600

Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg 610 615

Gin Glu Pro Gin Arg Met Ser Arg 625 630

Gly Cys His Ala HÍS Cys Pro Pro 410 415 Gin Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp 425 430 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys 445 Glu His Cys Gin Ile Cys His Cys 460 Ala Cys Gin Glu Pro Gly Gly Leu 475 480 Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val 4 90 495 His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu 505 510 Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala 525 Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu 540 Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 555 560 Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu 570 57 5 Lys Tyr Ala Gly Ser Gin Val Ala 585 590 Thr Leu Phe Gin Ile Phe Ser Lys 605 Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser 620 Asn Phe Val Arg Tyr Val Gin Gly 635 640 67 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Leu Lys Lys Lys Lys Vai Ile Vai Ile Pro Vai Gly Ile Gly Pro His 645 650 655

Ala Asn Leu Lys Gin Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gin Ala Pro Glu Asn 660 665 670

Lys Ala Phe Vai Leu Ser Ser Vai Asp Glu Leu Glu Gin Gin Arg Asp 675 680 685

Glu Ile Vai Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro 690 695 700

Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gin Vai Thr Vai Gly Pro Gly Leu Leu 705 710 715 720

Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Vai Leu Asp Vai 725 730 735

Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn 740 745 750

Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gin Arg Met Asp Val Gly 755 760 765

Gin Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gin Tyr Ser Tyr Met Val Thr 770 775 780

Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gin Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gin 785 790 795 800

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gin Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly 805 810 815

Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gin Gly 820 825 830

Asp Arg Glu Gin Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro 835 840 845

Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gin Val Val Pro 850 855 860

Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gin Glu Leu Glu Arg Ile Gly 865 870 875 880

Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gin Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg 885 890 895

Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gin Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu 900 905 910 68 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Gin Ila Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gin Pro Leu Asp 915 920 925

Vai Ils Leu Lau Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe 930 935 940

Asp Glu Met Lys Ser Phe Àla Lys Ala Ehe Ile Ser Lys Ala Asn Ile 345 S5Q 955 960

Gly Pro Arg Leu Thr Gin Vai Ser Vai Leu 965 370

Gin Tyr Giy Ser

Ile Thr 375 ,ys Ala Ris Leu Leu 990

Thr lie Asp Vai Pro Trp Asn Vai Vai Pro Glu 9S0 9S5

Ser Leu Vai Asp Vai Met Gin Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gin Ile Gly 995 1000 ' 1005

Asp Ala Leu Gly Phe Ala Vai Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met Bis 1010 1015 1020

Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Vai Vai Ile Leu Vai Thr 1025 2030 1035

Asp Vai Ser Vai Asp Ser Vai Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg 1040 1045 1050

Ser Asn Arg Vai Thr vai Phe Pro ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr 1055 1060 1065

Asp Ala Ala Gin Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser 1070 1075 1080

Asn Vai Vai Lys Leu Gin Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Vai 1085 1090 1095

Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His 1100 31C5

Lys Leu Cys

Ser Gly Phe Vai 1110

Arg lie Cys Ket Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp 1115 1120 1125 69 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

His Thr Vai Thr Cys Gin Pro 1140

Vai Trp Thr Leu Pro Asp Gin Cys 1130 1135

Asp Gly Gin Thr Leu Leu Lys 1145 1150

Ser Hís Arg Vai Asn Cys Asp Arg 1155

Gly Leu Arg Pro Ser Cys 1160

Pro Asn Ser Gin Ser Pro Vai Lys Vai 1165 1170

Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg 1175 1180

Trp Thr Cys Pro Cys Vai Cys Thr 1185

Gly Ser Ser Thr Arg His 1190

Ile Vai Thr Phe Asp Gly Gin Asn Phe 1195 1200

Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Vai Leu Phe Gin Asn Lys Glu 1205 1210 1215

Gin Asp Leu Glu Vai Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly 1220 1225 1230

Ala Arg Gin Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Vai Lys His Ser Ala 1235 1240 1245

Leu Ser Vai Glu Leu His Ser Asp Met Glu Vai Thr Vai Asn Gly 1250 1255 1260

Tyr Vai 1270

Arg Leu Vai Ser Vai Pro 1265

Gly Gly Asn Met Glu Vai Asn 1275

Vai Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Vai Arg Phe Asn His Leu Gly 1280 1285 1290

His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gin Asn Asn Glu Phe Gin Leu Gin 1295 1300 1305

Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly 1310 1315 1320

Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly 1325 1330 1335

Thr Vai Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Vai Gin Glu Trp Thr Vai 1340 1345 1350 70 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Gin Arg 1355 Pro Gly Gin Thr Cys 1360 Gin Pro Ile Leu Glu 1365 Glu Gin Cys Leu Vai 1370 Pro Asp Ser Ser His 1375 Cys Gin Vai Leu Leu 1380 Leu Pro Leu Phe Ala 1385 Glu Cys His Lys Vai 1390 Leu Ala Pro Ala Thr 1395 Phe Tyr Ala lie Cys 1400 Gin Gin Asp Ser Cys 1405 His Gin Glu Gin Vai 1410 Cys Glu Vai Ile Ala 1415 Ser Tyr Ala His Leu 1420 Cys Arg Thr Asn Gly 1425 Vai Cys Vai Asp Trp 1430 Arg Thr Pro Asp Phe 1435 Cys Ala Met Ser Cys 1440 Pro Pro Ser Leu Vai 1445 Tyr Asn His Cys Glu 1450 His Gly Cys Pro Arg 1455 His Cys Asp Gly Asn 1460 Vai Ser Ser Cys Gly 1465 Asp His Pro Ser Glu 1470 Gly Cys Phe Cys Pro 1475 Pro Asp Lys Vai Met 1480 Leu Glu Gly Ser Cys 1465 Vai Pro Glu Glu Ala 1490 Cys Thr Gin Cys Ile 1495 Gly Glu Asp Gly Vai 1500 Gin His Gin Phe Leu 1505 Glu Ala Trp Vai Pro 1510 Asp His Gin Pro Cys 1515 Gin Ile Cys Thr Cys 1520 Leu Ser Gly Arg Lys 1525 Vai Asn Cys Thr Thr 1530 Gin Pro Cys Pro Thr 1535 Ala Lys Ala Pro Thr 1540 Cys Gly Leu Cys Glu 1545 Vai Ala Arg Leu Arg 1550 Gin Asn Ala Asp Gin 1555 Cys Cys Pro Glu Tyr 1560 Glu Cys Vai Cys Asp 1565 Pro Vai Ser Cys Asp 1570 Leu Pro Pro Vai Pro 1575 His Cys Glu 71 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ

Arg Gly 1580 Leu Gin Pro Thr Leu 1585 Thr Asn Pro Gly Glu 1590 Cys Arg Pro Asn Phe 1595 Thr Cys Ala Cys Arg 1600 Lys Glu Glu Cys Lys 1605 Arg Vai Ser Pro Pro 1610 Ser Cys Pro Pro His 1615 Arg Leu Pro Thr Leu 1620 Arg Lys Thr Gin Cys 1625 Cys Asp Glu Tyr Glu 1630 Cys Ala Cys Asn Cys 1635 Vai Asn Ser Thr Vai 1640 Ser Cys Pro Leu Gly 1645 Tyr Leu Ala Ser Thr 1650 Ala Thr Asn Asp Cys 1655 Gly Cys Thr Thr Thr 1660 Thr Cys Leu Pro Asp 1665 Lys Vai Cys Vai His 1670 Arg Ser Thr Ile Tyr 1675 Pro Vai Gly Gin Phe 1680 Trp Glu Glu Gly Cys 1685 Asp Vai Cys Thr Cys 1690 Thr Asp Met Glu Asp 1695 Ala Vai Met Gly Leu 1700 Arg Vai Ala Gin Cys 1705 Ser Gin Lys Pro Cys 1710 Glu Asp Ser Cys Arg 1715 Ser Gly Phe Thr Tyr 1720 Vai Leu His Glu Gly 1725 Glu Cys Cys Gly Arg 1730 Cys Leu Pro Ser Ala 1735 Cys Glu Vai Vai Thr 1740 Gly Ser Pro Arg Gly 1745 Asp Ser Gin Ser Ser 1750 Trp Lys Ser Vai Gly 1755 Ser Gin Trp Ala Ser 1760 Pro Glu Asn Pro Cys 1765 Leu Ile Asn Glu Cys 1770 Vai Arg Vai Lys Glu 1775 Glu Vai Phe Ile Gin 1780 Gin Arg Asn Vai Ser 1785 Cys Pro Gin Leu Glu 1790 Vai Pro Vai Cys Pro 1795 Ser Gly Phe Gin Leu 1800 Ser Cys Lys Thr Ser 1805 Ala Cys Cys Pro Ser 1810 Cys Arg Cys Glu Arg 1815 Met Glu Ala Cys Met 1820 Leu Asn Gly Thr Vai 1825 Ile Gly Pro Gly Lys 1830 Thr Vai 1 Met 72 ΕΡ 2 349 314/ΡΤ 1.1 a Asp Vai Cys Thr Thr Cys ftrg Cys Met vai Gin Vai Gly Vai 1835 1840 ' 1845

Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg- Lys Thr Thf Cys Asn Pró: 1850 1855 1860

Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys 1865 187C 1875

Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr He Gin Leu Arg Gly Gly 1880 1885 1800

Gin He Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gin Asp Gly Cys 189S 1900 1905

Asp Thr His Phe Cys Lys Vai Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp 1910 1915 1920

Glu Lys Arg Vai Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His i.ys Cys 1925 1930 1935

Leu Ala Glu Gly Gly Lys lie Met Lys 11a Pro Gly Thr Cys Cys 1940 1945 19S0

Asp Thr Cys Glu Glu Pró Glu Cys Asn Asp 11«. Thr Ala Arg Léu 1955 1960 1965 G.ln Tyr Vai Lys Vai Gly Ser Cys Lys Ser Glu Vai Glu Vai Asp 1970 1975 1980

He His Tyr Cys Gin Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser 1985 1990 1995

Ile Asp Ile Asn. Asp Vai Gin Asp Glu Cys Ser Cys Cys Ser Pro 2000 2005 2010

Thr Arg Thr Glu Pro Met Gin Vai Ala Leu His Cys Thr Asn Gly 2015 2020 2025

Ser Vai Vai Tyr His Glu Vai Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys 2030 2035 2040

Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys 2045 2050

Lisboa, 2013-05-21

Claims (14)

1. ΕΡ 2 349 314/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação farmacêutica liofilizada estável de um Factor de von Willebrand recombinante (rVWF) compreendendo: (a) um rVWF; (b) um ou mais agentes tamponantes; (c) um ou mais aminoácidos; (d) um ou mais agentes estabilizantes; e (e) um ou mais tensioactivos; em que a formulação é preparada por liofilização de uma solução compreendendo: (a) o referido rVWF compreendendo um polipéptido seleccionado do grupo que consiste em: a) a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3; b) um análogo, fragmento ou variante de a) que é susceptivel de causar aglutinação de plaquetas estabilizadas na presença de ristocetina, ou de se ligar ao Factor VIII; c) um polipéptido codificado pelo polinucleótido estabelecido em SEQ ID NO: 1; d) um análogo, fragmento ou variante de c) que é susceptivel de causar aglutinação de plaquetas estabilizadas na presença de ristocetina, ou de se ligar ao Factor VIII; e e) um polipéptido codificado por um polinucleótido que híbrida com o polinucleótido estabelecido em SEQ ID N0:1 sob condições de hibridação moderadamente rigorosas; (b) o referido tampão compreendendo um agente tamponante do pH numa gama de cerca de 0,1 mM a cerca de 500 mM e possuindo um pH numa gama de cerca de 2,0 a cerca de 12,0; (c) o referido aminoácido numa concentração de cerca de 1 a cerca de 500 mM; (d) o referido agente estabilizante numa concentração de cerca de 0,1 a cerca de 1000 mM; e (e) o referido tensioactivo numa concentração de cerca de 0,01 g/L a cerca de 0,5 g/L.
2. 2. Formulação da reivindicação 1 em que o rVWF compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 3. ΕΡ 2 349 314/ΡΤ 2/3
3. 3. Formulação da reivindicação 1 em que o agente tamponante é seleccionado do grupo que consiste em citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris e combinações destes agentes.
4. 4. Formulação da reivindicação 1 em que o pH da solução está na gama de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, por exemplo de cerca de 6,5 a cerca de 7,5, tal como cerca de 7,3.
5. 5. Formulação da reivindicação 1 em que o agente tamponante da solução é citrato e o pH é de cerca de 7,3.
6. 6. Formulação da reivindicação 1 em que o aminoácido é seleccionado do grupo que consiste em glicina, histidina, prolina, serina, alanina e arginina.
7. 7. Formulação da reivindicação 6 em que o aminoácido está numa gama de concentrações de cerca de 0,5 mM a cerca de 300 mM na solução.
8. 8. Formulação da reivindicação 7 em que o aminoácido é glicina numa concentração de cerca de 15 mM na solução.
9. 9. Formulação da reivindicação 1 em que o rVWF compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3; em que o agente tamponante da solução é citrato e o pH é de cerca de 7,3; e em que o aminoácido é glicina numa concentração de cerca de 15 mM na solução.
10. 10. Formulação da reivindicação 1 em que o um ou mais agentes estabilizantes são seleccionados do grupo que consiste em manitol, lactose, sorbitol, xilitol, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glucose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glucosamina, frutose e combinações destes agentes estabilizantes.
11. 11. Formulação da reivindicação 10 em que os agentes estabilizantes são trealose numa concentração de cerca de 10 g/L na solução e manitol numa concentração de cerca de 20 g/L na solução.
12. 12. Formulação da reivindicação 1 em que o tensioactivo é seleccionado do grupo que consiste em digitonina, ΕΡ 2 349 314/ΡΤ 3/3 Triton Χ-100, Triton Χ-114, TWEEN-20, TWEEN-80 e combinações destes tensioactivos.
13. 13. Formulação da reivindicação 12 em que o tensioactivo é TWEEN-80 a cerca de 0,01 g/L na solução.
14. 14. Formulação da reivindicação 1 em que o rVWF compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3; em que o agente tamponante é citrato numa concentração na solução de cerca de 15 mM a cerca de pH 7,3; em que o aminoácido é glicina numa concentração na solução de cerca de 15 mM; em que os agentes estabilizantes são trealose numa concentração na solução de cerca de 10 g/L e manitol numa concentração na solução de cerca de 20 g/L; e em que o tensioactivo é TWEEN-80 a cerca de 0,1 g/L na solução. Lisboa, 2013-05-21