KR20200038309A - 폰 빌레브란트 인자의 바이러스 여과 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 용액을 여과하는 방법으로서, (a) VWF 및 염기성 아미노산을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 용액에 대하여 35 nm 이하의 공극 크기를 갖는 필터를 통한 바이러스 여과를 시행하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

폰 빌레브란트 인자의 바이러스 여과 방법

본 발명은 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 용액을 여과하는 방법으로서, (a) VWF 및 염기성 아미노산을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 용액에 대하여 35 nm 이하의 공극 크기를 갖는 필터를 통한 바이러스 여과를 시행하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

혈액 응고 인자의 결핍이 원인이 되는 다양한 출혈성 질환들이 존재한다. 가장 흔한 질환으로는 각각 혈액 응고 인자 VIII (FVIII) 및 IX의 결핍으로부터 유발되는 A형 및 B형 혈우병을 들 수 있다. 알려진 또 다른 출혈성 질환으로는 폰 빌레브란트병 (VWD)을 들 수 있다. 혈장에서 FVIII은 대개 VWF와의 비공유 복합체로 존재하며, 그의 응고제 기능은 인자 X의 Xa로의 인자 IXa 의존적 전환을 가속화시키는 것이다.

여러가지 형태의 폰 빌레브란트병 (VWD)의 경우에 결핍되거나, 기능적으로 결함이 생기거나, 또는 적은 양으로만 이용가능한 VWF는, 다수의 생리학적 기능들을 보유하는 포유동물의 혈장에 존재하는 점착질의 다량체성 당단백질이다. 1차적 지혈이 이루어지는 동안, VWF는 혈소판 표면 상의 특정 수용체들과 콜라겐 같은 세포외 기질 성분들 간에 매개자로서 작용한다. 또한, VWF는 응혈촉진성 FVIII을 위한 운반체 및 안정화 단백질로서 작용한다. VWF는 내피세포 및 거핵세포 내에서 2813개의 아미노산 전구체 분자로서 합성된다. 전구체 폴리펩타이드인 프리-프로(pre-pro)-VWF는 성숙한 혈장 VWF에서 발견되는 22개의 N-말단 잔기 신호 펩타이드에 이어서, 741개 잔기의 프로펩타이드 및 2050개 잔기의 폴리펩타이드로 이루어진다 (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). 소포체에서 신호 펩타이드가 절단된 후에는, VWF의 두 단량체들 간에 C-말단 이황화 가교가 형성된다. 분비 경로를 통한 추가의 이송 과정 동안에, 12개의 N-결합 및 10개의 O-결합된 탄수화물 측쇄들이 첨가된다. 더욱 중요한 사실은, VWF 이량체들이 N-말단 이황화 가교를 통해 다량체화되고, 741개 아미노산 길이의 프로펩타이드가 후기 골지체에서 효소인 PACE/퓨린에 의해 절단되어 떨어져 나온다는 점이다.

프로테아제인 ADAMTS13이 일단 혈장으로 분비되면, VWF의 A1 도메인 내의 고분자량의 VWF 다량체들을 절단할 수 있다. 따라서, 혈장 VWF는 500 kDa의 단일 이량체에서부터 분자량이 10,000 kDa을 초과하는 최대 20개 이상의 이량체로 이루어진 다량체에 이르기까지 모든 범위의 다량체들로 이루어져 있다. 이러한 이유로, 상기 VWF 고분자량 다량체 (HMWM)는 제일 강한 지혈 활성을 나타내게 되는데, 이는 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)으로 측정될 수 있다. VWF:RCo/VWF 항원의 비율이 높을수록 고분자량 다량체의 상대적인 함량도 높아진다.

VWF 또는 FVIII/VWF 복합체를 정제하는 다양한 방법들에 대해서는, 예를 들어 US5854403호, EP0411810A1호, EP0639203호 또는 문헌 [Ristol P. et al., Sangre (1996) 41:125-130]에 설명되어 있다.

VWF의 정제에는 잠재적으로 존재할 수 있는 병원체, 예컨대 바이러스를 제거하기 위한 하나 이상의 단계가 필요하다. 바이러스를 제거하는데 매우 효과적인 한 가지 방법으로는 바이러스 입자를 저지할 수 있는 공극 크기를 갖는 필터를 통한 여과 (바이러스 여과)를 들 수 있다. 상기 방법의 효과는 사용되는 필터의 공극 크기에 따라 다르다.

통상적으로 15 내지 75 나노미터 (nm)의 서로 다른 공극 크기의 나노필터들이 존재하며, 공극 크기가 작을수록 병원체를 유지하는데 있어서 더 큰 효과를 볼 수 있다. 공극 크기가 35 nm 미만, 바람직하게는 15 내지 20 nm인 나노필터는 매우 작은 바이러스, 예컨대 에리스로바이러스 B19 또는 A형 간염 바이러스를 제거할 수 있다. 그러나, 작은 공극 크기를 갖는 나노필터를 통한 여과는, 고분자량의 단백질도 해당 필터를 통과해야 하는 경우에는 문제가 생긴다 (WO2005/040214A1호). 일반적으로, VWF 또는 FVIII/VWF 복합체는, 특히 VWF 용액이 다량체 형태의 고분자량 VWF를 포함하는 경우 (EP1632501), 공극 크기가 35 nm 미만인 나노필터를 통한 효율적인 여과에는 적합하지 않은 것으로 보인다.

EP1348445A1호는 피브리노겐을 포함하는 용액으로부터 나노여과에 의해 바이러스를 분리하는 방법을 기술하고 있는데, 여기서는 나노여과 전에 카오트로픽제(chaotropic agent)를 상기 피브리노겐 용액에 첨가한다. 그러나, EP1348445A1호는 VWF에 대하여 언급하고 있지 않다.

EP2078730A1호는 VWF 또는 FVIII/VWF 복합체를 함유하는 용액을 명목 공극 크기가 35 nm 미만, 칼슘 이온이 존재하는 경우에는 심지어 20 nm 미만의 나노필터를 통해 여과시킬 수 있는 공정에 대하여 기술하고 있다 (EP2078730A1호의 단락 [0033] 참조).

WO2015/188224A1호는 VWF의 다량체를 저분자량의 VWF 다량체가 풍부한 투과물 분획 및 VWF의 HMWM이 풍부한 농축물 분획으로 분리하는 단계를 포함하는 재조합 VWF의 제조 방법에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 이러한 필터의 공극 크기는 상대적으로 크다 (0.05 μm 내지 1 μm).

종래 기술의 방법들은 여과액에서의 VWF의 수율에 있어서는 여전히 만족스럽지 않다.

따라서, VWF에 대한 개선된 바이러스 여과 방법, 특히 VWF에 대한 우수한 수율을 제공하는 방법이 계속적으로 필요한 실정이다.

놀랍게도, 본 출원의 발명자들은, 적어도 150 mM의 아르기닌의 존재 하에 VWF 용액의 바이러스 여과를 수행하는 경우에 상기 바이러스 여과시 여과액에서 VWF 항원 및 VWF 활성에서 높은 수율을 얻을 수 있다는 사실을 발견하였다. 또한, 라이신 및 히스티딘으로도 유사한 결과들이 얻어진다는 사실도 밝혀냈다. 따라서, 본 발명은 특히 이하의 항목 [1] 내지 [64]에 정의된 측면과 실시양태들에 관한 것이다.

[1] 하기의 단계를 포함하는, 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 용액을 여과하는 방법:

(a) VWF 및 적어도 150 mM 농도의 적어도 하나의 염기성 아미노산을 포함하는 용액을 제공하는 단계;

(b) 단계 (a)의 용액에 대하여 35 nm 이하의 공극 크기를 갖는 필터를 통한 바이러스 여과를 시행하는 단계.

[2] 항목 [1]에 있어서, 상기 단계 (a)의 용액의 VWF가 VWF의 고분자량 다량체 (HMWM)를 포함하는 것인, 방법.

[3] 항목 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 단계 (b)의 바이러스 여과를 시행하는 동안의 압력이 0.5 bar 미만인 것인, 방법.

[4] 항목 [3]에 있어서, 상기 단계 (b)의 바이러스 여과를 시행하는 동안의 압력이 0.1 내지 0.4 bar인 것인, 방법.

[5] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액의 pH가 5.0 내지 9.0인 것인, 방법.

[6] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액의 pH가 6.0 내지 8.0인 것인, 방법.

[7] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액의 pH가 6.5 내지 7.5인 것인, 방법.

[8] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)의 바이러스 여과를 15 내지 30℃의 온도에서 수행하는 것인, 방법.

[9] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)의 바이러스 여과를 18 내지 28℃의 온도에서 수행하는 것인, 방법.

[10] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 적어도 300 mM인 것인, 방법.

[11] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 적어도 350 mM인 것인, 방법.

[12] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 적어도 400 mM인 것인, 방법.

[13] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 적어도 450 mM인 것인, 방법.

[14] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 적어도 500 mM인 것인, 방법.

[15] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 1,000 mM 미만인 것인, 방법.

[16] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 900 mM 미만인 것인, 방법.

[17] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 800 mM 미만인 것인, 방법.

[18] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 750 mM 미만인 것인, 방법.

[19] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 적어도 50 mM 농도의 칼슘 이온을 추가로 포함하는 것인, 방법.

[20] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 적어도 100 mM 농도의 칼슘 이온을 추가로 포함하는 것인, 방법.

[21] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 적어도 200 mM 농도의 칼슘 이온을 추가로 포함하는 것인, 방법.

[22] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 적어도 300 mM 농도의 칼슘 이온을 추가로 포함하는 것인, 방법.

[23] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 적어도 350 mM 농도의 칼슘 이온을 추가로 포함하는 것인, 방법.

[24] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 필터가 35 nm 이하의 중간 공극 크기를 갖는 것인, 방법.

[25] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 필터가 25 nm 이하의 중간 공극 크기를 갖는 것인, 방법.

[26] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 필터가 20 nm 이하의 중간 공극 크기를 갖는 것인, 방법.

[27] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 필터가 13 nm 내지 35 nm의 중간 공극 크기를 갖는 것인, 방법.

[28] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 필터가 13 nm 내지 25 nm의 중간 공극 크기를 갖는 것인, 방법.

[29] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 필터가 18 nm 내지 22 nm의 중간 공극 크기를 갖는 것인, 방법.

[30] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 필터가 13 nm 내지 17 nm의 중간 공극 크기를 갖는 것인, 방법.

[31] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 VWF가 혈장 유래의 VWF인 것인, 방법.

[32] 항목 [1] 내지 [30] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 VWF가 재조합 방법으로 수득된 VWF인 것인, 방법.

[33] 항목 [32]에 있어서, 상기 VWF가 반감기 연장 모이어티를 포함하는 것인, 방법.

[34] 항목 [33]에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 VWF 아미노산 서열에 융합된 이종성 아미노산 서열인 것인, 방법.

[35] 항목 [33]에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 예컨대 Fc 단편, 트랜스페린 및 이의 단편, 인간 융모막 생식선 자극 호르몬의 C-말단 펩타이드, XTEN으로 알려진 큰 유체 역학적 부피를 갖는 용매화된 랜덤 사슬, 동종 아미노산 반복 (HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복 (PAS), 알부민, 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어지는 것인, 방법.

[36] 항목 [33]에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티를 폴리펩타이드에 접합시키는 것인, 방법.

[37] 항목 [36]에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 하이드록시에틸 전분 (HES), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리시알산 (PSA), 엘라스틴 유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체, 히알루론산 및 알부민 결합 리간드, 예컨대 지방산 사슬, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.

[38] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF의 비율이 적어도 0.75인 것인, 방법.

[39] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF의 비율이 적어도 0.8인 것인, 방법.

[40] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF의 비율이 적어도 0.9인 것인, 방법.

[41] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF의 비율이 적어도 1.0인 것인, 방법.

[42] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF의 비율이 적어도 1.1인 것인, 방법.

[43] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF의 비율이 적어도 1.2인 것인, 방법.

[44] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF 비율이 단계 (a)에서 제공된 용액에서의 RCo VWF/Ag VWF 비율의 적어도 75%인 것인, 방법.

[45] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 여과 후의 상기 VWF:Ag 수율이 적어도 50%인 것인, 방법.

[46] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 여과 후의 상기 VWF:Ag 수율이 적어도 60%인 것인, 방법.

[47] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 여과 후의 상기 VWF:Ag 수율이 적어도 70%인 것인, 방법.

[48] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 여과 후의 상기 VWF:Ag 수율이 적어도 75%인 것인, 방법.

[49] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 여과 후의 상기 RCo VWF 수율이 적어도 40%인 것인, 방법.

[50] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 여과 후의 상기 RCo VWF 수율이 적어도 45%인 것인, 방법.

[51] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 여과 후의 상기 RCo VWF 수율이 적어도 50%인 것인, 방법.

[52] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 여과 후의 상기 RCo VWF 수율이 적어도 55%인 것인, 방법.

[53] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 및 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액이, 다량체 전기영동법으로 분석시, VWF의 소형 다량체 (1-5개의 밴드), 중형 다량체 (6-10개의 밴드) 및 대형 다량체 (HMWM, 고분자량 다량체, 11개 이상의 밴드)를 포함하되, 단, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 대형 다량체의 상대적인 양이, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 및 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액 중의 VWF 총함량과 각각 비교하였을 때 적어도 70%인 것인, 방법.

[54] 항목 [53]에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서 대형 다량체의 상대적인 양이 적어도 75%인 것인, 방법.

[55] 항목 [53]에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서 대형 다량체의 상대적인 양이 적어도 80%인 것인, 방법.

[56] 항목 [53]에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서 대형 다량체의 상대적인 양이 적어도 85%인 것인, 방법.

[57] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산이 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.

[58] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산이 아르기닌인 것인, 방법.

[59] 항목 [1] 내지 [57] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산이 리신인 것인, 방법.

[60] 항목 [1] 내지 [57] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산이 히스티딘인 것인, 방법.

[61] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 VWF 이외에 인자 VIII (FVIII)을 포함하고, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 바람직하게는 VWF와 FVIII의 복합체를 포함할 수 있는 것인, 방법.

[62] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 따른 방법에 의해 수득가능한 VWF의 여과액.

[63] 전술한 항목들 중 어느 한 항목에 따른 방법에 의해 수득가능한 VWF를 포함하는 조성물.

[64] 항목 [1] 내지 [61] 중 어느 한 항목의 방법을 포함하는, VWF의 정제 방법.

제1 측면에서, 본 발명은 VWF를 포함하는 용액을 여과하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) VWF 및 적어도 150 mM의 염기성 아미노산을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 용액에 대하여 35 nm 이하의 공극 크기를 갖는 필터를 통한 바이러스 여과를 시행하는 단계를 포함한다.

폰 빌레브란트 인자

본원에 사용된 "폰 빌레브란트 인자" 또는 "VWF"는 야생형 VWF의 생체 활성 또는 VWF의 적어도 부분적인 생체 활성을 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 가리킨다.

"생체 활성"이란 VWF를 인간에게 투여하는 경우에 VWF가 생체 내에서도 수행하는 VWF의 측정가능한 기능을 의미한다. 본원에 사용된 "기능" 및 "기능적"과 같은 용어들은 VWF의 생체적, 효소적 또는 치료적 기능을 지칭한다. VWF의 생체 활성은, 예를 들어 리스토세틴 보조인자 활성 (VWF:RCoF)을 측정하는 방법 (Federici AB et al. 2004. Haematologica 89:77-85), 혈소판 당단백질 복합체 Ib-V-IX의 GP lb에 대한 VWF의 결합을 측정하는 방법 (Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305-310), 콜라겐 결합 분석법 (Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466-471) 또는 FVIII 결합 분석법을 사용하여 당업자에 의해 측정될 수 있다. FVIII 결합은 예를 들어 비아코어(Biacore) 분석에 의해 측정될 수 있다.

"폰 빌레브란트 인자" (VWF)는 자연 발생적인 (천연) VWF 뿐만 아니라 자연 발생적인 VWF의 생체 활성의 적어도 일부를 보유하는 이의 변이체, 예컨대 하나 이상의 잔기들이 삽입되거나, 결실되거나 또는 치환된 서열 변이체를 포함한다. 야생형 VWF를 암호화하는 유전자는 9kb의 mRNA로 전사되며, 이는 310,000 Da으로 추산되는 분자량을 갖는 2813개 아미노산의 프리-프로폴리펩타이드로 해독된다. 프리-프로폴리펩타이드는 2813개의 아미노산으로 이루어지며, 22개의 아미노산 신호 펩타이드, 741개의 아미노산 프로-폴리펩타이드 및 성숙한 서브유닛을 함유한다. N-말단으로부터 741개 아미노산의 프로-폴리펩타이드를 절단하게 되면 2050개의 아미노산으로 이루어진 성숙한 VWF가 생성된다. 야생형 프리-프로-VWF의 cDNA 서열은 서열번호 1로 나타내었다. 야생형 프리-프로-VWF의 아미노산 서열은 서열번호 2로 나타내었다. 본원에서 사용된 "VWF"라는 용어는, 달리 지시하지 않는 한, 성숙한 형태의 VWF를 가리킨다.

바람직하게는, 야생형 VWF는 서열번호 2에 나타낸 야생형 VWF의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, VWF의 적어도 부분적인 생체 활성이 유지되는 한, VWF의 부가, 삽입, N-말단, C-말단 또는 내부 결실도 포함된다.

바람직한 실시양태에서, 상기 VWF는 혈장 유래의 VWF, 보다 바람직하게는 인간 혈장 유래의 VWF이다.

본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, VWF는 예를 들어 WO2010/048275A2호에 기재된 바와 같은 재조합 방법으로 제조된 야생형 VWF이거나, 또는 이의 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 도입하여 해당 단백질의 적어도 하나의 생체 활성을 증가 또는 감소시킨 이의 변이체이다.

따라서, 특정 실시양태는 이러한 VWF 관련 서열들 중 임의의 하나 이상의 서열 (이들의 조합 및 변이체를 포함함)을 이용할 수도 있다. 또한, 다른 유기체들, 예컨대 본원에 기술되고 당업계에 공지된 다른 포유동물의 VWF 관련 서열도 포함된다.

특정 실시양태에서, "VWF"라는 용어는 VWF의 융합 단백질, 바람직하게는 VWF 단백질과 이종성 융합 파트너의 융합 단백질을 포함한다. 또한, 이종성 융합 파트너 또는 이종성 서열 및 VWF 단백질의 적어도 하나의 최소 단편 또는 이의 부분을 포함하는 융합 단백질 또는 변형 단백질도 포함된다.

본원에 사용된 "융합 단백질"에는, 또 다른 (예컨대, 상이한) VWF 단백질 (예컨대, 다수의 단편들을 생성하기 위함)에 결합되거나, 비-VWF 단백질에 결합되거나, 또는 상기 모두에게 결합된, VWF 단백질 또는 이의 단편이 포함된다. "비-VWF 단백질"이라는 말은, 야생형 VWF 단백질과는 다르면서, 동일하거나 서로 다른 유기체로부터 유래될 수 있는 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 "이종성 폴리펩타이드"를 가리킨다. 융합 단백질의 VWF 부분은 생체 활성 VWF 단백질 아미노산 서열의 전부 또는 이의 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, VWF 융합 단백질은 VWF 단백질의 생체 활성 부분(들)을 적어도 하나 (또는 2개, 3개 등) 포함한다.

보다 일반적으로는, 이종성 서열, 예컨대 알부민 또는 면역글로불린 또는 항원 결합 도메인이 없는 면역글로불린으로부터 유래된 단편, 예컨대 Fc 단편에 대한 융합을 이용하여, VWF의 원치않는 특성들을 제거하거나 목적한 특성 (예컨대, 약동학적 특성)을 개선할 수 있다. 예를 들어, 이종 서열에 대한 융합은 VWF 단백질의 순환에 있어서 화학적 안정성을 증가시키고, 면역원성을 감소시키며, 생체내 표적지향성을 개선시키고/개선하거나, 반감기를 증가시킬 수 있다.

VWF 서열과 융합될 수 있는 적절한 이종성 서열로는, 이에 제한되지는 않지만, 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 예컨대 Fc 단편, 트랜스페린 및 이의 단편, 인간 융모막 생식선 자극 호르몬의 C-말단 펩타이드, XTEN으로 알려진 큰 유체 역학적 부피를 갖는 용매화된 랜덤 사슬, 동종 아미노산 반복 (HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복 (PAS), 알부민, 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 및 이들의 조합을 포함한다.

본원에 사용된 "알부민"은 인간 혈청 알부민과 소 혈청 알부민과 같은 알부민 계열의 단백질의 폴리펩타이드 (유전자 조작되거나 화학적으로 변형된 알부민 변이체 및 알부민 단백질의 단편을 포함함)를 포함한다. 융합 단백질의 알부민 부분은 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들어 인간, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 비포유류의 알부민에는 암탉과 연어를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 알부민 결합된 폴리펩타이드의 알부민 부분은 융합 단백질의 VWF 단백질 부분과는 다른 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는 상기 알부민은 인간 혈청 알부민이다.

본원에 사용된 "알부민"이라는 용어에 포함된 알부민 계열의 단백질로는, 진화론상으로 관련이 있는 혈청 수송 단백질, 예를 들어 알부민, 알파-태아단백질 (AFP; Beattie & Dugaiczyk, Gene. 20:415-422, 1982), 아파민 (AFM; Lichenstein et al., J. Biol. Chem. 269:18149-18154, 1994) 및 비타민 D 결합 단백질 (DBP; Cooke & David, J. Clin. Invest. 76:2420-2424, 1985)을 포함한다. 알파-태아단백질에 대해서는 부착된 치료용 폴리펩타이드의 반감기를 향상시키는 것으로 주장되어 왔었다 (WO2005/024044A2호 참조). 이들의 유전자들은 인간, 마우스 및 랫트의 동일한 염색체 영역에 맵핑되는 구조 및 기능적 유사성을 보유하는 다중 유전자군이다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서는 융합 단백질의 일부로서 본원에 정의된 바와 같은 이러한 알부민 계열 구성원 또는 이의 단편 및 변이체를 사용할 수 있다. 본 발명의 치료용 융합 단백질의 알부민 계열 구성원은 AFP, AFM 및 DBP의 자연 발생적인 다형성 변이체들도 포함할 수 있다.

VWF 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 인간 혈청 알부민 폴리펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체에 융합시킬 수 있다 (예컨대, WO2009/156137A1호 참조). 인간 혈청 알부민 (HSA 또는 HA)은 성숙한 형태의 585개 아미노산의 단백질로서, 혈청 삼투압 유지하는데 상당 부분 역할을 담당하며 내인성 및 외인성 리간드 운반체로서도 기능한다. 다른 여러 이점들 중에서도, HSA 또는 이의 단편 또는 변이체에 대한 융합은 본원에 기재된 VWF 단백질의 보존 기간, 혈청 반감기 및/또는 치료 활성을 증가시킬 수 있다.

바람직하게는, 융합 단백질은 C-말단부로서 알부민을, N-말단부로서 VWF 단백질을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 알부민의 N-말단과 C-말단 모두에 융합된 VWF 단백질을 보유한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 VWF는 WO2009/156137A1호에 개시된 바와 같은 VWF-알부민 융합 단백질이다.

펩타이드 링커 서열을 사용하여 융합 단백질의 성분들을 분리할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 링커는 각 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조로의 폴딩을 담보하기에 충분한 거리로 해당 성분들을 분리시킬 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 본원에 기술되고 당업계에 익히 공지된 표준 기법들을 사용하여 융합 단백질에 도입될 수 있다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 아래의 요인들에 기초하여 선택할 수 있다: (1) 유연한 확장형 입체구조를 채용할 수 있는 이들의 능력; (2) 제1 및 제2 폴리펩타이드 상의 기능성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조에 대한 이들의 채용 불가력; 및 (3) 폴리펩타이드 기능성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 결여. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열로는 문헌 [Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985]; [Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986]; US4935233호 및 US4751180호에 개시된 것들을 포함한다.

하나 이상의 비펩타이드 또는 펩타이드 링커는 임의적인 것이다. 예를 들어, 이러한 링커 서열은, 제1 및 제2 폴리펩타이드가 기능성 도메인을 분리하여 입체 장해를 방지하는데 사용될 수 있는 비필수 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 영역들을 보유하고 있는 융합 단백질에서는 필요치 않을 수도 있다.

또한, 본 발명의 특정 실시양태는 변형된 VWF 단백질 (본원에 기술된 바와 같이 단백질의 원하는 특성을 개선시키는 변형을 포함함)의 사용에 대해서도 고려하고 있다. VWF 단백질의 변형으로는, 아세틸화, 하이드록실화, 메틸화, 아미드화 및 탄수화물 또는 지질 모이어티, 보조인자 등의 부착을 비롯한 측쇄 변형, 골격 변형 및 N- 및 C-말단 변형을 포함하는 하나 이상의 구성 아미노산에서의 화학적 및/또는 효소적 유도체화를 들 수 있다. 예시적인 변형에는 VWF 단백질의 페길화도 포함된다 (예컨대, 문헌 [Veronese and Harris, Advanced Drug Delivery Reviews 54:453-456, 2002], 본원에 참고로 포함됨). 생물학적으로 허용가능한 중합체에 화학적으로 접합시킨 VWF 변이체는, 예를 들어 WO2006/071801A2호에 기술되어 있다.

특정 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티를 폴리펩타이드의 VWF 부분에 접합시킨다. 적절한 반감기 연장 모이어티로는, 이에 제한되지는 않지만, 하이드록시에틸 전분 (HES), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리시알산 (PSA), 엘라스틴 유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체, 히알루론산 및 알부민 결합 리간드, 예컨대 지방산 사슬, 및 이들의 조합을 포함한다.

또한, 본 발명에서는 VWF 단백질의 "변이체"를 사용할 수도 있다. 단백질 "변이체"라는 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 서열번호 2와는 구별되며, 기준 단백질의 하나 이상의 활성을 통상적으로 보유하는 단백질을 포함한다. 치환에 적절한 아미노산을 확인하여, 기준 서열과 비교했을 때 실질적으로 변형되지 않거나, 개선되거나, 또는 감소된 활성을 보유하는 변이체를 설계하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 속한다.

단백질 변이체는 하나 이상의 치환으로 기준 서열과 구별될 수 있으며, 상기 치환은 본원에 기술되고 당업계에 공지된 바와 같이 보존적이거나 비보존적 치환일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 단백질 변이체는 보존적 치환을 포함하며, 이와 관련해서는, 일부 아미노산을 해당 단백질의 활성의 성질을 변화시키지 않으면서 대체로 비슷한 특성을 보유하는 다른 아미노산으로 변형시킬 수 있다는 점은 당업계에 주지된 사실이다.

위에서 언급한 바와 같이, 생체 활성 변이체 단백질은 기준 잔기와 비교하였을 때 이들의 서열의 다양한 위치에 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 해당 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 종류가 당업계에 규정되어 있으며, 일반적으로 다음과 같이 세분화될 수 있다:

산성: 본 잔기는 생리학적 환경의 pH에서 H 이온의 손실로 인해 음전하를 띄게 되어, 본 잔기는 펩타이드가 생리학적 환경 pH의 수성 매질 중에 존재하는 경우에 해당 잔기가 포함된 상기 펩타이드의 입체구조에서 표면 위치를 찾기 위해 수용액에 의해 이끌리게 된다. 산성 측쇄를 갖는 아미노산들로는 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다.

염기성: 본 잔기는 생리학적 환경의 pH에서 또는 이의 1개 또는 2개의 pH 단위 내에서 (예컨대, 히스티딘) H 이온과의 회합으로 인해 양전하를 띄게 되어, 본 잔기는 펩타이드가 생리학적 환경 pH의 수성 매질 중에 존재하는 경우에 해당 잔기가 포함된 상기 펩타이드의 입체구조에서 표면 위치를 찾기 위해 수용액에 의해 이끌리게 된다. 염기성 측쇄를 갖는 아미노산들로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다.

하전성: 본 잔기는 생리학적 환경의 pH에서 전하를 띄기 때문에, 산성 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (즉, 글루탐산, 아스파르트산, 아르기닌, 리신 및 히스티딘)을 포함한다.

소수성: 본 잔기는 생리학적 환경의 pH에서 전하를 띄지 않아서, 본 잔기는 펩타이드가 수성 매질 중에 존재하는 경우에 해당 잔기가 포함된 상기 펩타이드의 입체구조에서 내부 위치를 찾기 위해 수용액에 의해 밀려나게 된다. 소수성 측쇄를 갖는 아미노산으로는 티로신, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판을 포함한다.

중성/극성: 본 잔기는 생리학적 환경의 pH에서 전하를 띄지는 않지만, 본 잔기는 펩타이드가 수성 매질 중에 존재하는 경우에 해당 잔기가 포함된 상기 펩타이드의 입체구조에서 내부 위치를 찾기 위해 수용액에 의해 충분히 밀려나지 않는다. 중성/극성 측쇄를 갖는 아미노산으로는 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 히스티딘, 세린 및 트레오닌을 포함한다.

또한, 상기 설명은, 특정 아미노산들의 측쇄가, 극성기가 결여되어 있다고 할지라도, 소수성을 부여하기에 충분히 크지 않기 때문에, 이들 특정 아미노산들이 "작은" 것임도 특징으로 하고 있다. 프롤린을 제외하고는, "작은" 아미노산들이란 적어도 하나의 극성기가 측쇄 상에 존재하는 경우에는 4개 이하의 탄소를 가지며 그렇지 않은 경우에는 3개 이하의 탄소를 갖는 것들을 말한다. 작은 측쇄를 갖는 아미노산들로는 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌을 포함한다. 유전자 암호화된 2차 아미노산 프롤린은 펩타이드 사슬의 입체구조 형태에 대한 공지된 효과로 인해서 특별한 경우에 해당된다. 프롤린의 구조는 측쇄가 α-아미노기의 질소 및 α-탄소에 결합되어 있다는 점에서 다른 모든 자연 발생적인 아미노산들과 차이가 있다. 본 발명의 목적상, 프롤린은 "작은" 아미노산으로 분류된다.

극성 또는 비극성으로 분류하는데 필요한 인력 또는 반발력의 정도는 임의적인 것이므로, 본 발명에 의해 구체적으로 고려되는 아미노산들은 극성 또는 비극성의 양단간으로 분류하였다. 구체적으로 명명되지 않은 대부분의 아미노산들은 공지된 거동에 기초하여 분류될 수 있다.

아미노산 잔기들은 해당 잔기들의 측쇄 치환기와 관련해서 사이클릭 또는 비사이클릭, 및 방향족 또는 비방향족의 자명한 분류로, 그리고 작거나 큰 잔기들로 세분될 수 있다. 해당 잔기가, 추가의 극성 치환기가 존재한다면, 카복실 탄소를 포함하여 총 4개 이하의 탄소 원자를 함유하는 경우에 작은 것으로 간주되고; 그렇지 않은 경우라면 3개 이하의 탄소 원자를 함유하는 경우에 작은 것으로 간주된다. 당연히, 작은 잔기들은 항상 비방향족이다. 아미노산 잔기들은 그 구조적 특성에 따라 2 이상의 클래스에 속할 수 있다. 자연 발생적인 단백질 아미노산에 있어서,이러한 체계에 따른 세분류를 하기 표 1에 나타내었다.

또한, 보존적 아미노산 치환에는 측쇄에 기초한 기들이 포함된다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 기로는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신을 들 수 있고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 기로는 세린 및 트레오닌을 들 수 있으며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 기로는 아스파라긴 및 글루타민을 들 수 있고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 기로는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 들 수 있으며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 기로는 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 들 수 있고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 기로는 시스테인 및 메티오닌을 들 수 있다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로 치환하거나, 아스파르테이트를 글루타메이트로 치환하거나, 트레오닌을 세린으로 치환하거나, 또는 임의의 한 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 이와 유사하게 치환하는 것이, 생성되는 변이체 폴리펩타이드의 특성들에 대하여 큰 영향을 미치지 않을 것으로 보는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 생체 활성 단백질을 만들어 내게 되는지의 여부는 본원에 기술된 그의 발색 활성 및/또는 응고 활성을 분석하여 쉽게 판단할 수 있다.

VWF 용액

본 발명의 방법의 단계 (a)에서 언급된 용액은 VWF 및 적어도 150 mM의 염기성 아미노산 또는 염기성 아미노산들의 조합을 포함한다.

여과시킬 용액 중의 VWF는 바람직하게는 VWF의 고분자량 다량체 (HMWM)를 포함한다.

"고분자량 VWF 다량체"또는 "HMW VWF 다량체"또는 "HWM의 VWF"라는 용어들은 동의어로 사용되고, 오뜨(Ott) 등의 문헌 (Am J Clin Pathol 2010; 133:322-330)에 따른 VWF 밀도 분석에서 밴드 11개 및 그 이상에 해당하는 것을 의미하며, 여기서 "그 이상"이라는 것은 밴드 11개 및 그 이상으로 더 큰 모든 VWF 다량체를 의미한다.

"저분자량 VWF 다량체"또는 "소형 다량체"또는 "LMWM의 VWF"라는 용어들은 동의어로 사용되고, 오뜨 등의 문헌 (Am J Clin Pathol 2010; 133:322-330)에 따른 VWF 밀도 분석에서 밴드 1 내지 5개에 해당하는 것을 의미한다.

"중간분자량 VWF 다량체"또는 "중형 다량체"또는 "IMWM의 VWF"라는 용어들은 동의어로 사용되고, 오뜨 등의 문헌 (Am J Clin Pathol 2010; 133:322-330)에 따른 VWF 밀도 분석에서 밴드 6 내지 10개에 해당하는 것을 의미한다.

여과시킬 용액 중의 VWF 농도 (Ag VWF)는 0.1 내지 30 IU/ml의 범위일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 25, 또는 3 내지 20, 또는 5 내지 15 IU/ml 범위이다.

여과시킬 용액 중의 VWF 농도 (RCo VWF)는 0.1 내지 30 IU/ml의 범위일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 25, 또는 3 내지 20, 또는 5 내지 15 IU/ml 범위이다.

여과시킬 용액 중의 RCo VWF/Ag VWF의 비율은 바람직하게는 적어도 0.75, 또는 적어도 0.8, 또는 적어도 0.9, 또는 적어도 1.0, 적어도 1.1, 또는 1.2이다. 일반적으로, 여과시킬 용액 중의 RCo VWF/Ag VWF의 비율은 0.5 내지 2, 바람직하게는 0.75 내지 1.8, 또는 0.8 내지 1.6 범위이다.

또한, 여과시킬 VWF 용액은 인자 VIII (FVIII)을 포함할 수도 있다. 여과시킬 용액 중의 FVIII 농도는 약 0.1 IU/ml 내지 약 20 IU/ml, 또는 약 1 IU/ml 내지 약 10 IU/ml의 범위일 수 있다. FVIII은 VWF와의 복합체로도 존재할 수 있다.

염기성 아미노산

본원에 사용된 "염기성 아미노산"이라는 용어는 등전점이 7 초과인 아미노산을 지칭한다.

여과시킬 VWF 용액은 적어도 150 mM의 농도의 하나의 염기성 아미노산, 또는 염기성 아미노산의 조합을 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 VWF 용액 중의 모든 염기성 아미노산의 총 농도는 적어도 150 mM이다. 예를 들어, 상기 VWF 용액은 150 mM의 아르기닌을 포함할 수 있거나, 또는 75 mM의 아르기닌과 75 mM의 리신을 포함하여 염기성 아미노산의 총 농도가 150 mM가 되도록 할 수도 있다. 두 실시양태들 모두 본 발명의 범위 내에 속한다.

바람직하게는, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시양태에서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌이다. 보다 바람직하게는, 아르기닌은 여과시킬 VWF 용액 중의 유일한 염기성 아미노산이다.

바람직한 실시양태에서, 상기 염기성 아미노산은 리신이다. 바람직하게는, 리신은 여과시킬 VWF 용액 중의 유일한 염기성 아미노산이다.

바람직한 실시양태에서, 상기 염기성 아미노산은 히스티딘이다. 바람직하게는, 히스티딘은 여과시킬 VWF 용액 중의 유일한 염기성 아미노산이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌과 리신의 조합이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌과 히스티딘의 조합이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 염기성 아미노산은 히스티딘과 리신의 조합이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘의 조합이다.

여과시킬 용액 중의 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도는 바람직하게는 적어도 200 mM, 또는 적어도 250 mM, 또는 적어도 300 mM, 또는 적어도 350 mM, 또는 적어도 400 mM, 또는 적어도 450 mM, 또는 적어도 500 mM이다. 여과시킬 용액 중의 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도는 바람직하게는 1,000 mM 미만, 또는 950 mM 미만, 또는 900 mM 미만, 또는 850 mM 미만, 또는 800 mM 미만, 또는 750 mM 미만, 또는 700 mM 미만인 것이 더욱 바람직하다. 다른 실시양태에서, 여과시킬 용액 중의 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도는 150 mM 내지 1,000 mM, 또는 200 mM 내지 950 mM, 또는 250 mM 내지 900 mM, 또는 300 mM 내지 850 mM, 또는 350 mM 내지 800 mM 범위이다. 가장 바람직하게는, 여과시킬 용액 중의 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도는 400 mM 내지 800 mM, 예컨대 450 mM 내지 750 mM, 또는 500 mM 내지 700 mM 범위이다. 특히 적절한 농도로는 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 600 mM, 약 650 mM, 약 700 mM 및 약 750 mM를 포함한다.

상기 여과시킬 용액은 VWF 및 적어도 하나의 염기성 아미노산 이외에 추가의 화합물들을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 여과될 용액은 칼슘 이온 (Ca²⁺)을 추가로 포함한다. 여과시킬 용액 중의 칼슘 이온의 농도는 바람직하게는 적어도 50 mM, 또는 적어도 100 mM, 또는 적어도 150 mM, 또는 적어도 200 mM, 또는 적어도 250 mM, 또는 적어도 300 mM, 또는 적어도 350 mM이다. 바람직하게는, 여과시킬 용액 중의 칼슘 이온의 농도는 50 mM 내지 800　mM, 또는 100 mM 내지 750 mM, 또는 150 mM 내지 700 mM, 또는 200 mM 내지 650　mM, 또는 250 mM 내지 600 mM, 또는 300 mM 내지 550 mM, 또는 350 mM 내지 500　mM 범위이다.

여과시킬 VWF 용액은 알칼리 금속염, 아미노산 및 완충제 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 화합물들을 포함할 수도 있다. 바람직한 추가 화합물들로는 염화나트륨 (NaCl), 글리신, 히스티딘, 시트르산나트륨, MES 및 HEPES를 포함한다.

가장 바람직하게는, 여과시킬 용액은 VWF, 400 mM 내지 800 mM의 아르기닌 및 300 mM 내지 500 mM의 CaCl₂를 포함한다.

상기 여과될 용액의 pH는 일반적으로 6.0 내지 8.0 범위이다. 바람직하게는, 상기 용액의 pH는 6.1 내지 7.8, 또는 6.2 내지 7.6, 또는 6.3 내지 7.4, 또는 6.4 내지 7.2이다. 가장 바람직하게는, 상기 용액의 pH는 6.5 내지 7.1이다. 가장 바람직하게는, 상기 pH는 6.6 내지 7.0, 또는 6.7 내지 6.9, 예컨대 약 6.8이다. 상기 pH는 적절한 완충제 물질, 예컨대 MES 또는 HEPES를 사용하여 조정 및 유지시킬 수 있다.

여과시킬 용액 중의 단백질 농도는 일반적으로 약 0.01 mg/ml 내지 약 1 mg/ml, 바람직하게는 약 0.05 mg/ml 내지 약 0.8 mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 약 0.5 mg/ml 범위이다.

필터

본 발명의 방법에 사용되는 필터는 명목 공극 크기가 35 nm 이하이다. 바람직하게는, 상기 필터의 명목 공극 크기는 25 nm 이하이다. 가장 바람직하게는, 상기 필터의 명목 공극 크기는 22 nm 이하이다. 가장 바람직하게는, 상기 필터의 명목 공극 크기는 20 nm 이하, 예컨대 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm 또는 19 nm이다. 본 발명의 방법에 사용되는 필터의 명목 공극 크기는 바람직하게는 15 nm 내지 35 nm, 또는 16 nm 내지 30 nm, 또는 17 nm 내지 25 nm, 또는 18 nm 내지 22 nm의 범위이다.

본 발명의 방법에 사용되는 필터는 중간 공극 크기가 35 nm 이하이다. 바람직하게는, 상기 필터의 중간 공극 크기는 25 nm 이하이다. 가장 바람직하게는, 상기 필터의 중간 공극 크기는 22 nm 이하이다. 가장 바람직하게는, 상기 필터의 중간 공극 크기는 20 nm 이하, 예컨대 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm 또는 19 nm이다. 본 발명의 방법에 사용되는 필터의 중간 공극 크기는 바람직하게는 15 nm 내지 35 nm, 또는 16 nm 내지 30 nm, 또는 17 nm 내지 25 nm, 또는 18 nm 내지 22 nm의 범위이다.

상기 필터의 막은 서로 다른 재료들로 만들어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 막은 폴리에테르설폰 (예컨대, 싸토리우스(Sartorius)의 Virosart® CPV), 임의로 변형된 친수성의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (예컨대, 폴(Pall)의 Pegasus™ SV4), 또는 셀룰로오스, 예컨대 구리암모늄 재생형 셀룰로오스 (예컨대, 아사히 카세이(Asahi Kasei)의 Planova 20N)를 포함하거나 또는 실질적으로 이들로 이루어진다.

적절한 필터로는, 이에 제한되지는 않지만, 싸토리우스의 Virosart® CPV, 폴의 Pegasus™ SV4 및 아사히 카세이의 Planova 20N을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 적절한 수개의 필터들을 하기 표 2에 개괄하였다.

상기 필터 막의 유효 표면적은 약 0.001 m² 내지 약 10 m², 또는 약 0.01 m² 내지 약 4 m², 또는 약 0.1 m² 내지 약 1 m²의 범위일 수 있다.

여과 공정

일반적으로, 본 발명의 방법에 따른 여과는 전량 여과(dead-end filtration)로 수행된다. 여과되는 용액의 부피는 10 mL 내지 100 L, 또는 100 ml 내지 10 L 또는 0.5 L 내지 5 L 범위일 수 있다.

여과 시작시 및 여과 공정 동안 여과되는 용액의 온도는 약 10℃ 내지 약 30℃의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 여과 시작시 및 여과 공정 동안 여과되는 용액의 온도는 15℃ 내지 29℃, 또는 18℃ 내지 28℃, 예컨대, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃ 또는 약 27℃이다.

상기 여과는 일반적으로 1 bar 미만의 압력에서 수행한다. 바람직하게는, 상기 여과는 0.75 bar 미만의 압력에서 수행한다. 가장 바람직하게는, 상기 여과는 0.5 bar 미만의 압력에서 수행한다. 가장 바람직하게는, 상기 여과는 0.1 bar 내지 0.45 bar, 또는 0.2 bar 내지 0.4 bar, 예컨대 약 0.3 bar의 압력에서 수행한다.

여과 유속은 약 1 L/시간/m² 내지 약 30 L/시간/m²의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 상기 여과는 약 5 L/시간/m² 내지 약 25 L/시간/m²이고, 보다 바람직하게는 여과 유속은 약 10 L/시간/m² 내지 약 20 L/시간/m²의 범위일 수 있다.

여과액

본 발명의 여과 공정은 생체 활성이 높은 VWF를 포함하는 여과액을 생성한다.

본 발명의 방법에서 여과 후 VWF:Ag 수율은 일반적으로 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 또는 적어도 70% 또는 적어도 75%이다.

본 발명의 방법에서 여과 후 RCo VWF 수율은 일반적으로 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 45%, 또는 적어도 50% 또는 적어도 55%이다.

바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 수득된 여과액 중의 RCo VWF/Ag VWF의 비율은 적어도 0.75, 적어도 0.8, 적어도 0.9, 적어도 1.0, 적어도 1.1 또는 적어도 1.2이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액 중의 RCo VWF/Ag VWF 비율은 단계 (a)에서 제공된 용액 중의 RCo VWF/Ag VWF 비율의 적어도 75%이다. 상기 RCo VWF/Ag VWF의 비율은 여과로 인해 25% 미만 감소하며, 바람직하게는 상기 감소는 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만 또는 5% 미만이다. 보다 바람직하게는, VWF 용액의 여과로 인한 RCo VWF/Ag VWF 비율의 감소는 없다. 가장 바람직하게는, VWF 용액의 여과로 인한 RCo VWF/Ag VWF 비율의 증가는 없다.

다른 실시양태에서, 단계 (b)에서 수득된 여과액은, 다량체 전기영동으로 분석했을 때, VWF의 소형 다량체 (1-5개의 밴드), 중형 다량체 (6-10개의 밴드) 및 대형 다량체 (HMWM, 고분자량 다량체, 11개 이상의 밴드)를 포함한다. "대형 다량체" 및 "고분자량 다량체"라는 용어들은, 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 동의어로 사용된다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 수득된 여과액 중의 대형 다량체의 상대적인 양은 여과액 중의 VWF의 총 함량과 비교했을 때 각각 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 또는 적어도 85%이다.

또 다른 실시양태에서, 단계 (a)에서 제공된 용액 및 단계 (b)에서 수득된 여과액은, 다량체 전기영동으로 분석했을 때, VWF의 소형 다량체 (1-5개의 밴드), 중형 다량체 (6-10개의 밴드) 및 대형 다량체 (HMWM, 고분자량 다량체, 11개 이상의 밴드)를 포함한다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 수득된 여과액 중의 대형 다량체의 상대적인 양은, 각각 상기 실시양태에 따라 단계 (a)에서 제공된 용액 및 단계 (b)에서 수득된 여과액 중의 VWF의 총 함량과 비교했을 때 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)에서 수득된 여과액 중의 상기 대형 다량체의 상대적인 양은, 단계 (a)에서 제공된 용액 중 대형 다량체의 상대적인 양과 본질적으로 동일하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득가능한 VWF를 포함하는 여과된 용액이다. 상기 여과된 용액은 일반적으로 VWF Ag 활성, VWF RCo 활성 및 다량체 함량과 관련하여 상술한 하나 이상의 특성을 보유한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 VWF 및 400 mM 내지 800 mM의 농도의 아르기닌을 포함하는 용액에 관한 것이다. 본 발명의 용액에서 바람직한 아르기닌 농도는 상술한 바와 같은 여과되는 용액 중의 바람직한 아르기닌 농도와 일치한다. 바람직하게는, 상기 용액은 적어도 100 mM의 농도의 칼슘 이온을 추가로 포함한다. 본 발명의 용액에서 바람직한 칼슘 이온 농도는 상술한 바와 같은 여과되는 용액 중의 바람직한 칼슘 이온 농도와 일치한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 용액은 상술한 바와 같이 여과되는 용액의 임의의 성분들인 하나 이상의 추가의 화합물들을 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 방법에 의해 수득가능한 VWF를 포함하는 조성물이다.

본 발명의 또 다른 측면은 전술한 방법을 포함하는 VWF의 정제 방법에 관한 것이다.

정제될 VWF는 혈장 유래의 VWF 또는 재조합 방법으로 생성된 VWF일 수 있다.

재조합 VWF 또는 이의 변이체는 표준 프로토콜을 사용하여 적절히 제조될 수 있다. 일반적인 한가지 예로, 재조합 VWF는 하기 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함하는 절차에 의해 제조될 수 있다: (a) 단백질을 암호화하고 하나 이상의 조절 구성요소에 작동가능하도록 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 작제물을 제조하는 단계; (b) 상기 작제물을 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (c) 상기 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; 및 (d) 상기 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 수집 또는 분리하는 단계. VWF를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적 동등물을 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 암호화 서열의 전사 및 해독에 필요한 구성요소를 함유하는 벡터로 삽입할 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법들을 사용하여 VWF를 암호화하는 서열 및 적절한 전사 및 해독 제어 구성요소를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이러한 방법들로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함하며 이는 당업계에 공지되어 있다.

VWF는 당업계에 공지된 다양한 기법들에 따라 정제하고 특성을 분석할 수 있다. 단백질 정제를 수행하여 단백질 순도를 분석하기 위한 예시적인 시스템으로는, 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) (예컨대, AKTA 및 Bio-Rad FPLC 시스템), 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 포함한다. 정제를 위한 예시적인 화학법으로는, 특히 이온 교환 크로마토그래피 (예컨대, Q, S), 크기 배제 크로마토그래피, 염 구배, 친화도 정제 (예컨대, Ni, Co, FLAG, 말토오스, 글루타티온, 단백질 A/G), 겔 여과, 역상, 세라믹 HyperD® 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 컬럼 (HIC)이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 보통 단백질 조성물의 순도를 측정하기 위한 임의의 제조 또는 정제 공정이 이루어지는 동안에 이용될 수 있는, SDS-PAGE (예컨대, 쿠마시, 은 염색), 대용량 등전점 전기영동 (IEF), 면역블롯, 브래드포드, 시차 용해도 (예컨대, 황산암모늄 침전) 및 ELISA와 같은 분석 방법들도 포함된다.

특정 측면에 있어서, VWF에 대하여 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 염료 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 바람직하게는 면역친화도 크로마토그래피 중 임의의 방법의 조합을 비롯한 복수의 크로마토그래피 정제 단계를 시행하여, 주로 원하는 단백질을 농축하고 제조, 보관 및/또는 사용 동안에 해당 재조합 단백질의 단편화, 활성화 및/또는 분해를 유발할 수 있는 물질들을 제거할 수 있다. 정제에 의해 제거되는 것이 바람직한 이러한 물질들의 예로는 기타 단백질 오염물, 예컨대 PACE/퓨린, VKOR 및 VKGC와 같은 변형 효소; 재조합 단백질 제조를 수행하는 동안에 생산 세포로부터 조직 배양 배지로 방출되는 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질; 지질과 같은 비단백질성 오염물; 및 지질단백질과 같은 단백질 및 비단백질 오염물의 혼합물을 포함한다. VWF 단백질의 정제 절차는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, WO2011/022657A1호 참조).

바이러스 오염의 이론적 위험을 최소화하기 위해, 바이러스의 효과적인 불활성화 또는 제거를 가능케 하는 추가의 단계들을 해당 공정 중에 포함시킬 수 있다. 이러한 단계들로는, 예를 들어 액체 또는 고체 상에서 열처리; 용매 및/또는 계면활성제를 이용한 처리; 가시광선, UV 스펙트럼, 감마선 조사; 또는 나노여과를 포함한다.

VWF를 정제하는 방법은, 본 발명의 방법 이외에도, 저온침전법, Al(OH)₃ 흡착법, 글리신 침전법, 염 침전법, 저온살균법, 투석법, 초원심분리법, 멸균 여과법, 희석법, 동결건조법 및 이들의 조합 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법 및 공정에 의해 수득된 VWF는 약학 조성물로 제제화시킬 수 있다. 적절한 제제에 대해서는 WO2015/188224A1호 및 WO2010/048275A2호에 설명되어 있다.

실 시 예

실시예 1

"A"및 "B"로 각각 명명한 2개의 서로 다른 rVWF 용액에 바이러스 여과를 시행하였다. rVWF는 VWF-알부민 융합물이며, 그 아미노산 서열은 WO2009/156137A1호에 기재되어있다.

용액 "A" 또는 "B"는 재조합 방법으로 발현시킨 VWF를 함유하였고, 본사 세포 배양 시스템으로부터 수득하여 개별적으로 정제하였다.

여과 전에 서로 다른 양의 아르기닌을 첨가하여 표 4에 나타낸 최종 농도를 제공하였다.

바이러스 여과를 시행하는 경우, 모든 VWF 용액의 pH는 6.8 ± 0.1이었다. 모든 후속 단계들은 23 ± 5℃의 실온에서 수행하였다. 바이러스 여과는 전량 여과로 수행하였다. 바이러스 여과를 위한 출발 중간체 (30-50 ml)를 압력 용기에 채운 후, 이를 0.3 bar (프리필터 앞에서 측정된 공급 압력)의 공급 압력에서 직렬로 연결한 0.2/0.1 μm의 프리필터 및 20 nm의 필터 (20N Planova; 0.001 m²)를 통해 여과시켰다. 압축 공기로부터 압력을 수득하였다. 20N 여과액을 분획으로 수집하고 이어서 세척후 분획으로도 수집하였다. 여과액 분획 및 세척후 분획의 분취량을 원래의 분획 부피에 대하여 안분 비례식으로 모아, 분석된 여과 연구의 최종 샘플 ("제제")을 표본으로 하였다. 본 연구는 사용전 누출 시험 뿐만 아니라 사용후 누출 시험에 의한 여과후 무결성 시험 및 금 입자 시험을 통과하였던 경우에 유효하다.

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, rVWF 용액 중의 아르기닌의 존재는 vWF:Ag 및/또는 VWF:RCo의 수율을 증가시키는 결과를 가져왔다.

제조 번호 1 및 2의 여과액을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하여 쿠마시 블루로 염색하였다. 상기 겔을 스캔하여 제조업자의 지침에 따라 ImageQuant 소프트웨어를 이용하여 해당 밴드들을 평가하였다. 그 결과를 표 5에 요약하였다.

보이는 바와 같이, 아르기닌을 함유하는 물질의 여과액은 고분자량 다량체를 높은 비율로 함유하였던 한편, 아르기닌을 함유하지 않았던 샘플은 HMWM을 적게 포함하고 있었다.

실시예 2

VWF를 바이러스 여과(VF)하는 경우에 칼슘 이온이 긍정적인 영향을 미친다는 보고가 있다. 따라서, 아르기닌이 칼슘 이온의 존재 하에서도 VWF 수율을 향상시킬 수 있는지를 조사하였다.

여과 조건은 용액 C를 연구한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 하였다.

용액 "C"는 혈장 유래의 VWF를 함유하였고, 혈장 단백질 제조 공정으로부터 수득하였다.

여과 전에 서로 다른 양의 CaCl₂ 및 아르기닌을 첨가하여 표 6에 나타낸 최종 농도를 제공하였다.

여과된 부피는 각 제조에 있어서 36 ml였다.

그 결과를 표 6에 요약하였다.

표 6의 제조 번호 5는 칼슘 이온을 함유하지 않은 용액 (예컨대, 상기 표 4의 제조 번호 3)과 비교하였을 때 400 mM의 CaCl₂의 존재 하에 VWF 수율이 더 높게 나타났다. 그러나, 표 6의 추가의 제조들에서는 칼슘 이온의 존재 하의 바이러스 여과에 있어서 아르기닌이 VWF 수율을 추가로 개선시켰음이 나타났다.

또한, 아르기닌 대신에 리신 또는 히스티딘을 첨가함으로써 VWF 수율의 개선이 달성될 수도 있음도 나타나 있다.

<110> CSL Behring GmbH <120> Method for Virus Filtration of von Willebrand Factor <130> A234 <150> EP 17187436.5 <151> 2017-08-23 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8442 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(8442) <400> 1 atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt 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Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt 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ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339 Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140 tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 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tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434 Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg 2465 2470 2475 tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479 Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2480 2485 2490 tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524 Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly 2495 2500 2505 gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569 Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser 2510 2515 2520 ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614 Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu 2525 2530 2535 gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659 Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu 2540 2545 2550 gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704 Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser 2555 2560 2565 gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749 Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met 2570 2575 2580 ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794 Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp 2585 2590 2595 gtg tgc acg acc tgc cgc tgc atg gtg cag gtg ggg gtc atc tct 7839 Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser 2600 2605 2610 gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884 Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro 2615 2620 2625 ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929 Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2630 2635 2640 tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974 Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile 2645 2650 2655 atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019 Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr 2660 2665 2670 cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064 His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys 2675 2680 2685 agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109 Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala 2690 2695 2700 gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154 Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr 2705 2710 2715 tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199 Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr 2720 2725 2730 gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244 Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His 2735 2740 2745 tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289 Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp 2750 2755 2760 atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334 Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg 2765 2770 2775 acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379 Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val 2780 2785 2790 gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424 Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro 2795 2800 2805 agg aag tgc agc aag tga 8442 Arg Lys Cys Ser Lys 2810 <210> 2 <211> 2813 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp 850 855 860 Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly 865 870 875 880 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr 1235 1240 1245 Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser 1250 1255 1260 Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu 1265 1270 1275 Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe 1280 1285 1290 Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg 1295 1300 1305 Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 1310 1315 1320 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser 1325 1330 1335 Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln 1340 1345 1350 Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile 1355 1360 1365 Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu 1370 1375 1380 Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val 1385 1390 1395 Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro 1400 1405 1410 Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile 1415 1420 1425 Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val 1430 1435 1440 Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys 1445 1450 1455 Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met 1460 1465 1470 Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu 1475 1480 1485 Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu 1490 1495 1500 Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys 1505 1510 1515 Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp 1520 1525 1530 Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val 1535 1540 1545 Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 1550 1555 1560 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr 1565 1570 1575 Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser 1580 1585 1590 Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr 1595 1600 1605 Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile 1610 1615 1620 Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu 1625 1630 1635 Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp 1640 1645 1650 Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg 1655 1660 1665 Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1670 1675 1680 Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly 1685 1690 1695 Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe 1700 1705 1710 Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr 1715 1720 1725 Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val 1730 1735 1740 Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val 1745 1750 1755 Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala 1760 1765 1770 Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala 1775 1780 1785 Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val 1790 1795 1800 Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn 1805 1810 1815 Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala 1820 1825 1830 Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val 1835 1840 1845 Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu 1850 1855 1860 Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile 1865 1870 1875 Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp 1880 1885 1890 Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly 1895 1900 1905 Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu 1910 1915 1920 Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu 1925 1930 1935 Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser 1940 1945 1950 Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu 1955 1960 1965 Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp 1970 1975 1980 Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg 1985 1990 1995 Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser 2000 2005 2010 Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu 2015 2020 2025 Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr 2030 2035 2040 Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile 2045 2050 2055 Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser 2060 2065 2070 Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys 2075 2080 2085 Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val 2090 2095 2100 Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg 2105 2110 2115 Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val 2120 2125 2130 Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala 2135 2140 2145 Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys 2150 2155 2160 Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala 2165 2170 2175 Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp 2180 2185 2190 Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val 2195 2200 2205 Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn 2210 2215 2220 Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro 2225 2230 2235 Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala 2240 2245 2250 Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu 2255 2260 2265 Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys 2270 2275 2280 Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr 2285 2290 2295 Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg 2300 2305 2310 Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp 2315 2320 2325 Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly 2330 2335 2340 Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe 2345 2350 2355 Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro 2360 2365 2370 Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys 2375 2380 2385 Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val 2390 2395 2400 Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys 2405 2410 2415 Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His 2420 2425 2430 Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys 2435 2440 2445 Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu 2450 2455 2460 Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg 2465 2470 2475 Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2480 2485 2490 Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly 2495 2500 2505 Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser 2510 2515 2520 Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu 2525 2530 2535 Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu 2540 2545 2550 Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser 2555 2560 2565 Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met 2570 2575 2580 Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp 2585 2590 2595 Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser 2600 2605 2610 Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro 2615 2620 2625 Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2630 2635 2640 Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile 2645 2650 2655 Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr 2660 2665 2670 His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys 2675 2680 2685 Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala 2690 2695 2700 Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr 2705 2710 2715 Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr 2720 2725 2730 Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His 2735 2740 2745 Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp 2750 2755 2760 Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg 2765 2770 2775 Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val 2780 2785 2790 Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro 2795 2800 2805 Arg Lys Cys Ser Lys 2810

Claims (21)

1. 하기의 단계를 포함하는, 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 용액을 여과하는 방법:
   (a) VWF 및 적어도 하나의 염기성 아미노산을 포함하는 용액을 제공하는 단계로서, 상기 용액 중의 상기 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 적어도 150 mM인 것인, 단계;
   (b) 단계 (a)의 용액에 대하여 35 nm 이하의 공극 크기를 갖는 필터를 통한 바이러스 여과를 시행하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 용액의 VWF가 VWF의 고분자량 다량체 (HMWM)를 포함하는 것인, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (b)의 바이러스 여과를 시행하는 동안의 압력이 0.5 bar 미만인 것인, 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)에서 제공된 용액의 pH가 5.0 내지 9.0, 특히 6.0 내지 8.0인 것인, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 바이러스 여과를 15 내지 30℃, 특히 18 내지 28℃의 온도에서 수행하는 것인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중의 상기 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 적어도 300 mM, 적어도 350 mM, 적어도 400 mM, 적어도 450 mM 또는 적어도 500 mM인 것인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 중의 상기 적어도 하나의 염기성 아미노산의 농도가 1,000 mM 미만, 950 mM 미만, 900 mM 미만, 850 mM 미만, 800 mM 미만 또는 750 mM 미만인 것인, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 적어도 50　mM, 적어도 100 mM, 적어도 200 mM, 적어도 300 mM 또는 적어도 350 mM 농도의 칼슘 이온을 추가로 포함하는 것인, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터가 25 nm 이하 또는 20 nm 이하의 공극 크기를 갖는 것인, 방법.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터가 13 nm 내지 35 nm, 13 nm 내지 25 nm, 18 nm 내지 22 nm 또는 13 nm 내지 17 nm의 공극 크기를 갖는 것인, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF가 혈장 유래의 VWF이거나, 또는 재조합 방법으로 수득된 VWF인 것인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF 비율이 적어도 0.75, 적어도 0.8, 적어도 0.9, 적어도 1.0, 적어도 1.1 또는 적어도 1.2인 것인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 RCo VWF/Ag VWF 비율이 단계 (a)에서 제공된 용액에서의 RCo VWF/Ag VWF 비율의 적어도 75%인 것인, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 후의 상기 VWF:Ag 수율이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 75%인 것인, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 후의 상기 RCo VWF 수율이 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55%인 것인, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 및 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액이, 다량체 전기영동법으로 분석시, VWF의 소형 다량체 (1-5개의 밴드), 중형 다량체 (6-10개의 밴드) 및 대형 다량체 (HMWM, 고분자량 다량체, 11 개 이상의 밴드)를 포함하되, 단, 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액에서의 대형 다량체의 상대적인 양은, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액 및 상기 단계 (b)에서 수득된 여과액 중의 VWF 총함량과 각각 비교하였을 때 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 또는 적어도 85%인 것인, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산이 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 상기 염기성 아미노산이 아르기닌인 것인, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 제공된 용액이 VWF 이외에 인자 VIII (FVIII)을 포함하는 것인, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 VWF의 여과액.
20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 VWF를 포함하는 조성물.
21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법을 포함하는, VWF의 정제 방법.