JPH0368600A - 生理活性ポリペプチドの回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〈産業上の利用分野〉 本発明は生理活性ポリペプチドの陽イオン交換樹脂によ
るＩＷＩｌｌ法に関する。 木用ＩＩＩにおいて、アミノ酸、ポリペプチドはＩＬＪ
ＰＡＣ−ＩＬＩＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された
方法により略記するものとし、たとえば下記の略号を用
いる。 ＡｌａＬ−アラニン Ａｒｃ＋−Ｌ−アルギニン ＡｓｎＬ−アスパラギン ＡＳＩ）Ｌ−アスパラギン酸 ＣＶＳ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｑｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 ＧＩＶ　　グリシン 口ｉｓ　　Ｌ−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン １ｅｕｌ−ロイシン しＶＳ　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　Ｌ−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−プロリン Ｓｅｒ　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｔ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。 Ａ　アデニン〈デオキシアデニル酸を示す。〉Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシアデ
ニル酸を示す。〉さらに、（８２Ｎ）−及び＝−（ＣＯ
ＯＨ）はそれぞれアミノ酸配列のアミン末端側及びカル
ボキシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′
〉はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。 〈従来技術〉 ヒトＴＮＦ！物質のＩＩ！１１法としては特開昭５８１
３８３８３号に限外濾過法、透析法、イオン交換法。 ゲル濾過法、２！気泳動法等を組み合わせた方法の記載
があり、更に効率のいい安価な精製法として、特異抗体
を吸着体としたアフィニティークロマトグラフィー法を
用いることが有効であるとの記載がある。しかし前記の
種々の方法の組み合わせの場合には操作が繁雑であり収
量が低下することは明らかである。また、特異抗体を用
いたアフィニティークロマトグラフィー法を用いる場合
には、抗体の供給や均一なカラムを作製することが難し
いなどの問題点があり、さらにこの方法に広く用いられ
ているＩ）Ｈの低いバッファー中では、ヒトＴＮＦ蛋白
質は安定性が低いなどの問題点もある。 さらにＴａｎらはβインターフェロンの場合に、特異抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により
ｙＩｉ製する際に抗体カラムを固定化させたはずの抗体
成分がはずれてくることを報告している［Ｙ、ロ、Ｔａ
ｎら、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　１９゜３８
３１　（１９８０）　］。このようなことを、吸着した
従来の方法で生理活性ポリペプチドを安定して効率的に
大ｍ供給することは非常に難しい。 〈発明の目的〉 そこで本発明の目的は、前記したような種々の精製法の
組み合わせや、特異抗体を用いたアフィニティークロマ
トグラフィー法を用いないで、アミン末端側において特
定のアミノ酸配列を有する生理活性ポリペプチドを含む
組換え微生物ｍ胞のライゼート等の溶液から該生理活性
ポリペプチドを容易に高回収率で高純度に安定して得る
方法を提供することにある。 本発明の目的は以下の発明から一層明らかとなるであろ
う。 〈発明の構成〉 本発明者らの研究によれば、アミノ末端側において特定
の配列を有する生理活性ポリペプチドは陽イオン交換樹
脂に吸着することが明らかになり、前記本発明の目的は
、該生理活性ポリペプチドを含む組換え微生物細胞のラ
イゼート等の溶液をカルボキシメチル−セフ７０−ス、
ホスホ−セフ７０−ス、スルホブＯビルーセファａ−ス
などの陽イオン交換樹脂に接触させ、該生理活性ポリペ
プチドを吸着させたのち、塩濃度あるいはｐｌ−１を上
げて溶出することによって達成される。 更に、陽イオン交換樹脂を陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーとして用いることは、パイロジエンフリー化
が容易な点、吸着盲爆が大きいという点で工業的スケー
ルでの精製を行なう上でも優れている。 又、本回収法は一段階のみの方法で回収率が高いことを
特徴とする。また操作が容易である。 すなわち、本発明は下記の式、 （Ｈ２Ｎ）　　　ＡＩ’＋ｌ　　ＬＶＳ−ＡｒＯ−Ｘ　
　　−（ＣＯＯＨ〉・・・（Ｉ） またハ（ＨａＮ）　　Ｍｅｔ−Ａｒｇ−ＬＶＳ−Ａｒ（
Ｊ−Ｘ　−−（ＣＯＯＨ）　　　　　　　　　　　　　
・・・（ＩＩ）で表わされる生理活性ポリペプチドを含
有する水性溶液を、 （１）　　陽イオン交換樹脂に接触させ、生理活性ポリ
ペプチドを陽イオン交換樹脂に吸着せしめ、（ｉ）　　
ＩＩられた生理活性ポリペプチドが吸着した陽イオン交
換樹脂を、吸着した生理活性ポリペプチドが実質的に溶
出しない塩溶媒で洗浄し、■　次いで生理活性ポリペプ
チドが吸着した陽イオン交換樹脂を、吸着した生理活性
ポリペプチドが溶出しつる塩溶媒を用いて生理活性ポリ
ペプチドを分離する、 ことを特徴とする該水性溶液から精製された前記式（Ｉ
）または（ＩＩ）で表わされる生理活性ポリペプチドを
回収する方法である。 式（Ｉ）で表わされる生理活性ポリペプチドは第１図に
示される１５７個のヒトＴＮＦのアミノ酸配列のアミノ
末端から７個のアミノ酸を欠失させ、８〜１０番目のＰ
　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　Ｓｔ）をＡ　ｒｇ−Ｌ　ｙ
ｓＡｒｇに置換した生理活性ポリペプチド又はその改変
体を示す。 式（Ｉｆ）で表わされる生理活性ポリペプチドは式（Ｉ
）で表わされる生理活性ポリペプチドのアミノ末端にＭ
ｅｔを付加したものである。このＭｅｔはポリペプチド
を産生させた場合、プラスよドに挿入された開始コドン
に起因して発現されたものである。 式（Ｉ）及び（Ｕ）においてＸの部分は第１図に示され
るヒトＴＮＦのアミノ酸配列のアミノ末端から１１番目
のしｙｓから１５７５７番目ｅｕまでのアミノ酸配列を
示す。 Ｘの一部を生理学的活性をそこなわない程度に行う改変
（Ｍ換又は欠失）として下記のものあるいはそれらの組
合せを挙げることができる。下記左欄のアミノ酸の番号
は第１図〈ヒトＴＮＦのアミノ酸配列を示す〉のアミノ
末端のＭｅｔをＯとしＶａｌを１としＡｒ（ｌを２とい
うようにアミノ末端から順番に番号を付はカルボキシ末
端のｌｅｕを１５７とした場合の各アミノ酸の番号（位
置）を示す。 下記右欄は左欄のアミノ酸を置換するアミノ酸又は欠失
を示す。 アミノＩｌ（番号は位置） しｙｓ　（１１） Ｖａｌ（１３） Ｖａｌ（１６） Ｖａｌ（１７） Ａ　Ｉａ　（１８） 置換又は欠失 欠失 Ａｌａ ｌｅｕ １ｅ ａｌｙ、　　Ｉ　ｌｅ、　Ｓｅｒ。 Ｔｈｒ、　　Ｖａｌ、　　ｌｅｕ又は Ｐｒ。 Ａｌａ（２２） ＧＩＶ（２４） ＡｒＱ（３１） Ａｒｇ（３２） Ａｌａ（３３） Ａｓｎ（３４） Ａｌａ（３５） Ｌｅｕ（３６） Ａ　ｌａ　（３８） Ａｓｎ（３９） Ｖａｌ（４１） Ｇｌｕ（４２） Ａｒｇ（４４） Ｖａｔ（４９） ＣＶＳ（６９） Ｔｈｒ（７２）　〜目１ｓ（７８） ａ Ｇｌｕ Ａｓｎ 口ｉｓ、　Ａ　ｌａ、　Ｇ　ｌｕ又は Ｔｈｒ ｓｐ ＡｒＯ ）１ｉｓ、Ｍｅｊ又はＧｌｎ ｈｅ Ｇｌｎ ｓｐ ｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ しｅｕ Ａｌａ、Ｓｅｒ又はｌｅｕ 口ｉｓ、　Ｔ　ｈｒ、　Ｔ　ｙｒ。 Ｔｙｒ−ロｉＳ１ロ１ｓ− ＴＶｒ、　　Ｔｙｒ−Ｔｈｒ又は Ｔｈｒ−ＴＶｒ Ｌｅｕ（９４）　　　　　　　　　Ｔｈｒ又は欠失３ｅ
ｒ（９５）　　　　　　　　　欠失Ｃｙｓ（１０１）　
　　　　　Ａｌａ、　　Ｓｅｒ又は１−ｅｕＧｌｙ（１
２２）　　　　　　Δｌａ、）Ｉｅ又はｐｒ。 Ａｌａ（３３）　　〜Ｖａｌ（４，９）　　　ＡＳｐ−
ＡｒＯ−Ａｌａ−Ｐ　ｈｅ−Ｌ、ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ− Ａ　Ｓｐ−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｈｅ　− ３ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ− Ａ　ｓｎ−Ａ　ｓｎ−Ｓ　ｅｒ Ｌ　ｅｕ−１ｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ又はＴｒｉｌ ｐｈｅ、Ｔｒｉ）又は１ｅｕ− Ｐｈｅ 本発明の精製法の原料となる、生理活性ポリペプチドを
含有する水性溶液は、生理活性ポリペプチドを産生じて
いる組換え微生物細胞を遠心分離により集めた後、適当
なバッファーに懸濁させ、超音波発生装置を用いて該ａ
胞の破壊を行ない遠心により得られるライゼート、また
は、同様の方１　　ｌｅ　（１５４） Ａ　Ｉａ　（１５６） Ｌ　ｅｕ（１５７） 法にして得られる不溶性画分を適当な方法を用いて可溶
化したサンプルのことである。あるいは、生理活性ポリ
ペプチドを分泌産生じている組換え微生物Ｉ胞の培養液
を適当なバッファーに透析した水溶液も含まれる。 本発明の陽イオン交換樹脂として強酸性あるいは弱酸性
の陽イオン交換樹脂が挙げられる。これらの具体例とし
てスルホプロピル−セフ７０−ス。 カルボキシメヂルーセフ７０−ス、ホスホ−セフ７０−
スなどが挙げられる。 陽イオン交換樹脂は粒状、Ｉｌｌ状状膜状等の通常使用
する形体で使用することができるが、実用上、陽イオン
交換カラムクロマトグラフィーとして使用することが好
適である。 生理活性ポリペプチドを含有する溶液を陽イオン交換樹
脂に接触させることにより、生理活性ポリペプチドは陽
イオン交換樹脂に吸着する。得られた吸着陽イオン交換
樹脂には目的の生理活性ポリペプチド以外の不純物が吸
雪あるいは付着しているため、吸着した生理活性ポリペ
プチドが実質的に溶出しない塩溶媒で洗浄を行う。 該塩溶媒は塩化ナトリウム等の塩で塩濃度を調整したＩ
ＩＩ液が用いられる。緩衝液としては、ｐ目を中性近辺
に調整したリン酸バッファーあるいはトリス塩酸バッフ
ァーを使用することができる。具体的には、２０１１１
Ｍ　　リン酸バッファー（ｐｌ−１７，４）　、、２０
　ｍＭ　　トリス−塩酸バッファー（９口　７．４〉な
どが挙げられる。 塩濃度は０．１Ｍ以上、０．１５　Ｍ未満の範囲で行う
ことが好適である。０．１Ｍ未満では目的の生理活性ポ
リペプチド以外の不純物は完全に洗浄しきれないためで
あり、０．１５　Ｍ以上では目的とする生理活性ポリペ
プチドが溶出されてしまう可能性があるためである。 洗浄後、生理活性ポリペプチドが吸着した陽イオン交換
樹脂を、吸着した生理活性ポリペプチドが溶出しつる塩
溶媒を用いて生理活性ポリペプチドを分離する。 該塩溶媒は塩化ナトリウム等の塩で塩８１度を洗浄液よ
りも高くした緩衝液で行う。！１ＷＩＪ液とじては、ｐ
目を中性に近く調整したリン酸あるいはトリス塩酸バッ
ファーを使用することができる。好ましくは２０１Ｍ　
　リン酸バッファーく　９口　７．４）　。 ２０１Ｍトリス−塩酸バッファー（９口　１．４）など
が挙げられる。 塩溶媒の塩濃度は溶出する生理活性ポリペプチドにより
異なるが０．１５　Ｍ以上であればよく、好ましくは０
．１５〜０．５Ｍの範囲である。０．１５Ｍ〜０．５Ｍ
の範囲であれば、生理活性ポリペプチドが高純度で得ら
れるが０６５Ｍ以上で溶出を行うと不純物が少量である
が溶出されてくる。 （Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノＭ　［Ｄ、　
Ｐｅｎｎ１ｃａら、前出］音指定するいくつかのコドン
の中から適当なものを選び、それを化学合成することに
よって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては
、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが
望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行な
えるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位
を設けることが望ましい。 また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。 ＴＡＧまたはＴ’ＡＡ）を有することが好ましい。 上記ＩＩ訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として
、２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい
。さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子伝子は、その上流及び
下流に作用する制限酵素の切断部位を用いることにより
、適当なベクターへのクローン化が可能になる。このよ
うなヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示し
た。 上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば特開昭６
３−１８８３９６号公報に示されたような何本かのオリ
ゴヌクレオチドに分けて、それらを化学合威し、各々の
オリゴヌクレオチドを連結する方法をとるのが望ましい
。各オリゴヌクレオチドの合成法としてはジエステル法
［１−１、Ｇ　、　Ｋ　ｈｏｒａｎａ、　　“３　ｏｗ
ｅ　ＲｅｃｅｎｔＤｅｖｃｌｏｐａ＋ｅｎｔｓ　ｉｎ　
　Ｃｈｅｍｔｓｔｒｙ　ｏｆ　ＰｈｏｓｐｈａｔｅＥ　
５ｔｅｒｓ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　
Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ”Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　５
ｏｎｓ　、　　Ｉ　ｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９
６１）　］　、　トリエステル法［Ｒ，Ｌ。 Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒら、　　Ｊ、　　ＡＯｌ、　　Ｃ
ｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９゜４８０１　（１９６７）
　］及びホスファイト法［Ｍ、Ｄ。 Ｍ　ａｔｔｅｕｃｃｉら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　
　Ｌｅｔｔ、、　２１゜７１９　（１９８０）　］があ
るが、合成時間、収率、操作の簡便さ等の点を、吸着し
た全自動ＤＮＡ合成機を用いたホスファイト法による合
成が好ましい。 合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラム
による高速液体クロマトグラフィー等を、適宜単独もし
くは組合せて用いることができる。 こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばＤＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡｌｌ１片を連結する
方法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成す
るブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ま
しくはｐＴＮＦＩＢＲ。 りＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。 上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡｌｌｌ１片を連結した後、適
当なプロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列
の下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることが
できる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファ
ン・オペロン・プロモーター（

【「ｐプロモーター）。 ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、Ｐヒプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはＩ）ＹＳ３１Ｎ、又
はｐＡ　Ａ　４１が用いられる。 ざらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターくネーターを付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適であ
り、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましぐはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この発現
型仁トＴＮＦ遺伝子を、たとえばＩ）ＢＲ３２２由来の
ベクターにクローン化することにより、発現型プラスミ
ドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドと
して、好ましくはｐＴＮＦ４０１Ｎ　Ｎ又はｐＴＮＦ　
４０１Ａが用いられる。 （Ｂ）生理活性ポリペプチド遺伝子のクローン化：こう
して得られたヒトＴＮＦｌ伝子発現型プラスミドを適当
な制限酵素で切断し、ヒｈ　Ｔ　Ｎ「遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の生理活性ポリペプチドをコードする遺
伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる。 （Ｃ）発現確認： ヒトＴＮＦ３Ｉｆ伝子及び生理活性ポリペプチド遺伝子
を発現させるための微生物宿主としては、大ＩＩｌ菌、
枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシ
ェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　］が好まし
い。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド及び生理活
性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドは、たとえば公
知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａｒｄら、　Ｇｅｎｅ
　。 ３、　２７９（１９７８）　］を用いて、微生物宿主、
たとえばエシェリヒア・コリ０６００ｒ−１−株（ＡＴ
ＣＣ３３５２５）に導入することができる。 このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉ
ｎｃ＋”　、　Ｐ　４４０．　Ｃ，ｏ（ｄ　　５ｐｒｉ
ｎ。 口ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照】があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、ｔｊ！拌を加えながら、３７℃で２
〜３６時間行なう。また、培！開始時または培養中に、
プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−イ
ンドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。 培養後、たとえば遠心分離にまり組換え微生物細胞を集
め、たとえばクエン酸バッファーに懸濁させ、たとえば
超音波処理にまり組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離
により組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られた
ライゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以
下、ＳＯ８と略すこともある）を含むポリアクリルアミ
ドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白
質を適当な方法を用いて染色する。発現型プラスミドを
含まない微生物細胞のライゼートを対照として泳動パタ
ーンを比較することにより、ヒトＴＮＦ遺伝子または生
理活性ポリペプチド遺伝子の発現を確認する。 （Ｄ）精製及び活性評価； 該生理活性ポリペプチドの大腸菌ライゼートからの分離
、精製には、カルボキシメチル−セフ７０−スなどの陽
イオン交換カラムクロマトグラフィーが有利である。 ｆｉ製した生理活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、
マウスに移植したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見
るｉｎ　ｖｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら、前
出）、マウスＬｌｌ胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
ＶｉｔｒＯ活性測定法［ＲｕＨ、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　］等により行
なえるが測定時間、定量性、測定の簡便さ等の点を、吸
着したｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性測定法による評価が好まし
い。 〈発明の効果〉 かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる該生理活性ポリペプチドを容易に高回収率で
高純度に安定して得る方法を提供することが可能になり
、かくし得られた生理活性ポリペプチドを含有する医薬
組成物を提供することが可能になった。 〈実施例〉 以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 実施例１　（１）ＴＮＦ　４７１の作成）特開昭６３−
１８８３９６号公報に記載された方法で１）ＴＮＦ４７
１を作成した。このプラスくドは第１図に示されるヒト
ＴＮＦのアミノ末端から１〜７個のアミノ酸を欠失させ
、さらに８〜１０番目のｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　
ＳｐをＡ　ｒ！ｌｌ−Ｌ　ＶＳ−Ａ　ｒｇニ２ｉ換した
下記のアミノ酸配列 （口２　Ｎ　＞　　Ａｒ！］　　Ｌｙｓ−ＡｒＯＬｙｓ
　−Ｐ　ｒＯ−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｌａ−口ｉｓ　−Ｖａｌ
　−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ−Ｑ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒｏ　−Ａ　ｒＯ−Ａ　Ｉａ　−
Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｃｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　＋ｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｕ
−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒＱ−Ａ　Ｓｔ）　−Ａ　５ｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ
　−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ
−８ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈ
ｅ−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｙ　−Ｃ
ｙｓ−Ｐｒｏ　−５ｅｒ−Ｔｈｒ　−１」ｉｓ−Ｖａｌ
−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ−口ｉｓ　−Ｔ　
ｈｒ　−１１ｅ　−Ｓ　ｃｒＡ　ｒｌ）　−１１ｅ−Ａ
　Ｉａ−Ｖａｌ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　ＩｎＴ　
ｈｒ−Ｌ　ｙｓ−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｓｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　
ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　ｌａ　−１ｌｅ−ＬＶｓ−８ｅｒ
−Ｐｒｏ−ＣｙＳ−Ｇｌｎ　−Ａ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　
−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ
　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ−Ａ　ｌａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−
Ｔ　ｒｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　１ｕＰｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌ
ｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　ｓ
ｐ−Δｒｇ−１ｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ　−■１
ｅ−Ａｓｎ　−Ａ　ｒｌＪ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　５Ｅ）−Ｔ
　Ｖｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｌｌ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌａ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ
　ａｌ　−Ｔ　ｙｒＰｈｅ−Ｇｌｙ　−１１ｅ　−１１
ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ’） で表わされる生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする生
理活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドである。 一方、上記で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスく
ドｐＴＮＦ　４７１　２０μ９を、特開昭６３−１８８
３９６号公報の実施例４に記載の方法に準じて制限酵素
口ｉｎｄ　ＤＩで切断した後、５０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
　−口Ｃｊ（９０７，４）、１００＋ａＭ　　　Ｎａ　
Ｃ１，１０ｍＭＭＯ８０４水溶液中で制限酵素ＮｃｏＩ
（宝酒造）による切断反応を３７℃で１命間行なう。反
応終了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．７％
）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％
〉を行ない、特開昭６３−１８８３９６号公報の実施例
２に記載の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含
む約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣＯＩ”口１ｎｄｌ）
をポリアクリルアミドゲルて特開昭６３−１８８３９６
号公報の実施例３に記載の方法に準じて、Ｉ）ＴＮＦ４
７１の大部分を含む約３．０Ｋｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｎ
ｃｏＩ＋ｌ−１　ｉｎｄ　ｍ　）をアガロースゲルより
、それぞれ回収した。 ざらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）を５０μ旦の１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ口Ｃｌ　　（　　９０　７．４）、１０　１Ｍ　
　ｖｇ　３０４　　、１ｍＭジチオスレイトール水溶液
に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＡｃｃＩ（宝酒造
）を添加して、３７”Ｃで１時間切断反応を行なった。 反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度８％〉を行ない、特開昭６３−１８８３９６号公報の
実施例２に記載の方法に準じて、ヒトＴＮＦ３１！伝子
の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片−（　ＮｃｏＩ
＋ＡｃｃＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。 また、第２図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、特開昭６３−１８８３９６号公報の実施例２に記
載の方法に準じて、合成，精製した。得られた２本の合
成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μグについて、特
開昭６３−１８８３９６号公報の実施例３に記載の方法
に準じて、末端のリン酸化を行ない、アニーリングを行
なった。 アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３，ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ｌ）及びヒトＴＮＦ遺伝子の一部含む
約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣＯＩＩ−ＩＡＣＣＩ）
と混合し、エタノール沈殿の後、特開昭６３＝１８８３
９６号公報の実施例３に記載の方法に準じて、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。 反応終了後、特開昭６３−１８８３９６号公報の実施例
３に記載の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ　６００
ｒ−１−株に導入し、形質転換株の中より目的のプラス
ミドｌ）ＴＮＦ６１９（約３，２Ｋｂｌ））を有するク
ローンを選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸配
列 （口２　Ｎ）　　Ａｒ９ＬｙＳ−ＡｒＣｌ　　ｃｙｓ　
−Ｐ　ｒｏ　−　Ｖ　ａｌ＝　Ａ　ｌａ−口ｉｓ−　Ｖ
　ａｌ−　Ｖ　ａｌ−Δｌａ−Ａ　ｓｎ　−　Ｐ　ｒｏ
　−　Ｇ　Ｉｎ　−　Ａ　Ｉａ　−　Ｇ　Ｉｕ　−　Ｇ
　ｌｙ　−　Ｇ　Ｉｎ　−ｌ　ｅｕ−ＧＩｎ　−Ｔｒｐ
　−１ｅｕ−Ａｓｎ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　
Ｉａ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉａ−Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　１ａ
−Ａｓｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｖ　ａｌ−Ｑ　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−
Ａ　ｒｇ　−Ａ　Ｓ＋）　−Ａ　ｓｎ　−Ｇｌｎ−Ｌ　
ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＧｌｕＧ　ｌ
ｙ　−１ｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−１ｌｅ　−Ｔｙ
ｒ　−３ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−１ｅｕ−Ｐｈｅ−
Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ＩＶ　−ＣＶＳ−Ｐ
　ｒｏ　−Ｓ　ａｒ　−Ｔ　ｈｒ−ロ１ｓ−Ｖａｌ−１
ｅｕ−１ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ−口＋ｓ　−Ｔ　ｈｒ　−■
Ｉｓ　−Ｓ　ｅｒ　−ＡｒＯｌ１ｅ−Ａｌａ−ｖａｔ−
３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ−３ｅｒＡ　ｌａ−１１ｅ−Ｌ
ｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｒｏ−
Ｇ　Ｉｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｙ−
Δ１ａ−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ
　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｐ　ｒｏ−１
１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｖａｌ−
Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　（３０−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　Ｖ
Ｓ　−Ｇ　＋ｙ−Ａ　Ｓ＋１−Ａ　ｒ（Ｊ−Ｌ　ｅｕ　
−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　！ａ−Ｇ　Ｉｕ−！　Ｉｅ　−Ａ　
５ｎ−Ａ　ｒｇ　−ｐ　ｒ（＋　−Ａ　３＋１−　Ｔ　
ｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｐ　−ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｌ
ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ
−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−１１ｅ−Ｐｈｅ−
１ｅｕ−（ＣＯＯＨ〉 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規生理活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドで
あり、第２図にその作成方法を示した。 又ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４７１　
２０μ９を、特開昭６３−１８８３９６＠公報の実施例
４に記載の方法に準じて制限酵素口ｉｎｄ　ＩＩ［で切
断した後、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−口Ｃ１（’　ｌ１口
　７．４＞　。 １００１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，１０ｍＭ　　ＭＱ　ＳＯ４
水溶液中で制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造）による切断反応
を３７℃で１時間行なう。反応終了後、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度０．７％）及びポリアクリルアミド
ゲル電気泳動くゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦＷ伝子の一部を含む約１４０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ｍ　）をポリ
アクリルアミドゲルより、そして特開昭６３−１８８３
９６号公報の実施例３に記載の方法に準じて、Ｉ）ＴＮ
Ｆ４７１の大部分を含む約３．ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片
（Ｎｃｏ■＋口１ｎｄｌ［［）をアガロースゲルより、
それぞれ回収した。 さらに、上で得られた約１４０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｎ
ｃｏｌ＋口１ｎｄｉｃｔ）を５０μｍの１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−口Ｃｆ　（ρ目７．４）　、　１０■Ｍ　　Ｍ
Ｑ　８０４　、　１１ＩＩＭジチオスレイトール水溶液
に溶解させ、１０ユニツトのＩＩＩ限酵素ＡｃｃＩ（宝
酒造〉を添加して、３１℃で１時間切断反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
１１度８％）を行ない、特開昭６３−１８８３９６号公
報の実施例２に記載された方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約１１０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｎｃｏ
Ｉ”ＡｃｃＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。 また、第３図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、特開昭６３−１８８３９６号公報の実施例２に記
載された方法に準じて、合成、精製した。 １９られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．
５μ９について、特開昭６３−１８８３９６号公報の実
施例３に記載された方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングを行なった。 アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．０Ｋ　ｂ＋１のＤＮＡ断片（Ｎ
ＣＯＩ−口１ｎｄＩ［［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の一部
含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋ＡｃｃＩ）
と混合し、エタノール沈殿の後、特開昭６３＝１８８３
９６号公報の実施例３に記載された方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了
後、特開昭６３−１８８３９６号公報の実施例３に記載
された方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ
−株に導入し、形質転換株の中より目的のプラスミド１
ｌＴＮＦ６１６（約３．２Ｋ　ｂｐ＞を有するクローン
を選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列 （口２　Ｎ　）　　Ａｒ（Ｊ　　ｃｙｓ　　ＡｒＯＬＶ
ｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｖ　ａｌ−Ａ　Ｉａ−口ｉｓ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎＬ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｎ
−Ａ　ｒｏ−Ａ　ｒｏ−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　
ｌａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　
−Ｇ　＋ｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　１ｕ−１ｅｕ−Ａ　ｒｆＪ
−Ａ　Ｓｐ−Ａ　５ｎＧｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａ
ｌ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ−ｒ　Ｉｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ　−
Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−ＣＶｓ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔｈｒ−口ｉｓ−Ｖ　ａｌ　−１
ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ−口ｉｓ　−Ｔ　ｈｒ　
−１１ｅ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｒｇ−１１ｅ−Ａ　Ｉａ
−Ｖ　ａｌ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙ
ｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−８ｅｒ−Ａ
　Ｉａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇ
　Ｉｎ−Ａ　ｒ（＋−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒＯ−
Ｇ　ＩＬＩ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ａ　ｌａ
−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕ−
ｐｒｏ−ｒ　ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ＩＹ−Ｇ　Ｉ
Ｖ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅＵ−Ｇ　ｌｕ
−Ｌ　ＶＳ−Ｇ　＋ｙ−Ａ　Ｓｌ）−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−
８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ　−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｒｇ
　−ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｓｌ）　−Ｔ　ｙｒ−１ｅｕ　−
Ａ　Ｓｌ）　−ｐ　ｈｅ　−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　
ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｙ　−１１ｅ　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−−（
ＣＯＯＨ） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規生理活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドで
あり、第３図にその作成方法を示した。 実施例２（発現の確認） 実施例１で得られた発現型プラス互ドｐＴＮＦ４７１、
生理活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮ
Ｆ６１６またはＥＩＴＮＦ６１９を有するエシェリヒア
−ＤすＣ６００ｒ−１１−株を、３０〜５０μｇ／ｄの
アンピシリン、０．２％のグルコース及び４■／Ｉｄの
カザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％ＮａｚＨＰＯ４−
０，３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣ１０，１％
ＮＨ４Ｃｊ水溶液（０口　７．４〉をオートクレーブ滅
菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭｇ８０４
水溶液及びＣａＣｊｚ水溶液をそれぞれ最終１度２１１
Ｍ及び０．１　ｍＭになるように加える。］２５０−に
接種し、０Ｄ１ｐｔｙが０．７に達するまで、３７℃で
振とう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ／Ｉ
ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加し
、さらに３７℃で１２時時間上う培養を続けた。 遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、５０　ｍＭクエ
ン酸バッフ７−（０口　６．２〉を用いて菌体の洗浄を
行なった。洗浄後の菌体を１０−の５０　ｒａＭクエン
酸バッファー（１）１１６．２）に懸濁させ、超音波発
生装置（久保田、　　２００Ｍ型）を用いて菌体を破壊
した後、遠心分離により菌体残渣の除去を行なった。 得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
口Ｃｆバッファー（０口　６．８）　、　ＳＤＳ、　　
２メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ最
終濃度６０ＱＩＭ、２％、４％、１０％になるように加
え、ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気法ｖＪ［銘木
、遺伝、　３１．４３（１９７７）　］を行なった。 分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。 Ｔｒｉｓ−グリシン系［（Ｊ　、　Ｋ　、　Ｌａｅｍｍ
ｌｉ。 Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、生
理活性ポリペプチド遺伝子の発・現の確認を行なった。 なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｏ
８−９３０型〉にかけて、産生された生理活性ポリペプ
チドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出を行な
った。その結果、発現型プラスミド１）ＴＮＦ４７１を
有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約２０．３％
、生理活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスくドＩ）Ｔ
ＮＦ６１Ｂ及びｐＴＮＦ６１９を有する大腸菌において
は約２４．４％及び約２０．３％の生理活性ポリペプチ
ドの産生がそれぞれ認められた。 実施例３（生理活性ポリペプチドの分離・精製）実施例
２で得られたｐＴ　Ｎ　Ｆ　４７１．　　ｐＴ　Ｎ　Ｆ
６１６、　１）ＴＮＦ　６１９を有する大腸菌のライゼ
ートからの生理活性ポリペプチドの分離、精製は、カル
ボキシメチル−セファロース・カラム・クロマトグラフ
ィー（ファルマシア）を用いて行なった。 まず該樹脂をカラムに詰めた後、５０１１１Ｍクエン酸
バッフ？−（９口６．２〉で十分に平衡化し、次いで実
施例２で得られた生理活性ポリペプチドを含むライゼー
トを該カラムに供する。その後ＰＢＳバッファー［２０
＋＋Ｍリン酸バッファー（０口　７．４）１４０ｎ＋Ｍ
　　Ｎ　ａ　Ｃ１］で十分に洗浄してから４２０１ＭＮ
ａｃ１を含む２０Ｉｌ１Ｍリン酸バッフ７−（＋）口　
７．４）を用いて生理活性ポリペプチドを溶出させた。 溶出した生理活性ポリペプチドを５ＤＳ−ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動（分離用ゲル濃度１５％）にかけ
、電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質のバンドを色素を用
いて染色したところ、それぞれ分子盟約１５，０００〜
１７，０００の位置のみに１本のバンドが観察されそれ
ぞれ９８％程度のＩｌｉ度の生理活性ポリペプチドが得
られたことが確認できた。 実施例４（活性の評価） 生理活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活性測定
は、前記ＲｕＨの方法に準じて行なった。すなわち、実
施例３で精製した生理活性ポリペプチドを順次培地で希
釈した試料１００μ旦と、４　Ｘ　１０５個／！１１１
の濃度のマウスｌ−９２９１１雑芽細胞（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ−９２９）懸濁液１００μ文を、９６穴の組織培養用
マイクロプレート（コースタ−〉内で混合した。なおこ
の際に、最ＵＳ度１μｇ／ＩＩＩ！のアクチノマイシン
Ｄ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。培地とし
ては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含
むイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（日本製薬
）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸ガスを
含む空気中、３１℃で１８〜２０時間培養した後、クリ
スタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）
メタノール水溶液に、０６５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のク
リスタル・バイオレットを溶解させたもの］を用いて生
細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレットを洗
い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレットを
１００μ文の０．５％ＳＯ８水溶液で抽出し、その５９
５ｎｉにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋
測器、ＥＴＹ−９６型〉で測定する。この吸光度は、生
き残った細胞数に比例する。そこで、生理活性ポリペプ
チドの希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％の値に
相当する希釈倍率をグラフ（たとえば第４図）によって
求め、その希釈倍率をユニットと定義する。第４図より
、発現型プラス互ドＩ）ＴＮＦ４７１にコードされる生
理活性ポリペプチド１■は８，３Ｘ　１０８ユニツト程
度の活性を、そして発現型プラスミドｐＴＮＦ　６１６
．　　ＩＩＴＮＦ６１９にコードされる新規生理活性ポ
リペプチド１■は１，２Ｘ　１０９ユニツト、　　１，
６Ｘ　１０９ユニツト程度の活性を、それぞれ有してい
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列及びヒトＴＮＦの
アミノ酸配列を示す。第２図は新規生理活性ポリペプチ
ド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６１６の作成方法を
示したものである。第３図は新規生理活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ６１６の作成方法を
示したものである。 第４図は生理活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌
活性測定結果を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の式、 （Ｈ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｘ−（ＣＯＯ
   Ｈ）・・・（ I ） または（Ｈ＿２Ｎ）−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
   −Ｘ−（ＣＯＯＨ）・・・（II） 〔ＸはヒトＴＮＦの１５７個のアミノ酸配列において、
   アミノ末端から１１番目のＬｙｓから１５７番目のＬｅ
   ｕまでのアミノ酸配列又はその一部を生理学的活性をそ
   こなわない程度に改変したアミノ酸配列を表わす。〕 で表わされる生理活性ポリペプチドを含有する水性溶液
   を、 （ｉ）陽イオン交換樹脂に接触させ、生理活性ポリペプ
   チドを陽イオン交換樹脂に吸着せしめ、（ｉｉ）得られ
   た生理活性ポリペプチドが吸着した陽イオン交換樹脂を
   、吸着した生理活性ポリペプチドが実質的に溶出しない
   塩溶媒で洗浄し、 （ｉｉｉ）次いで生理活性ポリペプチドが吸着した陽イ
   オン交換樹脂から、生理活性ポリペプチドが溶出しうる
   塩溶媒を用いて生理活性ポリペプチドを分離する、 ことを特徴とする該水性溶液から精製された前記式（
   I ）または（II）で表わされる生理活性ポリペプチドを
   回収する方法。