CN110997015A - 用于von Willebrand因子的病毒过滤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种过滤包含von Willebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括(a)提供包含VWF和碱性氨基酸的溶液；和(b)使所述步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。

Description

用于von Willebrand因子的病毒过滤的方法
本发明涉及一种过滤包含von Willebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括(a)提供包含VWF和碱性氨基酸的溶液；和(b)使步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器(filter)的病毒过滤。
背景技术
存在由凝血因子缺乏引起的各种出血障碍。最常见的障碍是分别由凝血因子VIII(FVIII)和IX缺乏引起的血友病A和B。另一种已知的出血障碍是von Willebrand病(VWD)。在血浆中，FVIII主要以与von Willebrand因子(VWF)的非共价复合物形式存在，其凝血功能是促进依赖于因子IXa的因子X向Xa的转化。
VWF(在不同形式的von Willebrand病(VWD)中是缺失的、功能缺陷的或仅以减少量而可获得)是存在于哺乳动物血浆中的一种多聚体粘附糖蛋白，具有多种生理功能。在初次止血过程中，VWF充当血小板表面特定受体与细胞外基质成分(如胶原蛋白)之间的介体。此外，VWF充当前凝血素FVIII的载体和稳定蛋白。VWF作为2813个氨基酸的前体分子在内皮细胞和巨核细胞中合成。前体多肽、pre-pro-VWF由以下组成：N-末端的22个残基信号肽，随后是741-残基前肽和2050-残基的多肽，其被发现在成熟血浆VWF中(Fischer等，FEBS Lett351：345-348，1994)。在内质网状组织中的信号肽裂解后，在VWF的两个单体之间形成了C端二硫键。在通过分泌途径的进一步运输过程中，添加了12个N-连接和10个O-连接的碳水化合物侧链。更重要的是，在晚期高尔基体中，VWF二聚体通过N-末端二硫键(bridges)进行多聚，并且长741个氨基酸的前肽被酶PACE/弗林蛋白酶切割掉。
一旦被分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13可以在VWF的A1结构域内裂解高分子量VWF多聚体。因此血浆VWF由全范围多聚体组成，范围从500kDa的单二聚体到由至多超过20个分子量超过10,000kDa的二聚体组成的多聚体。从而VWF高分子量多聚体(HMWM)具有最强的止血活性，这可以通过利托菌素辅因子活性(VWF:RCo)进行测量。VWF:RCo/VWF抗原的比率越高，高分子量多聚体的相对量越高。
例如在US5854403，EP0411810A1，EP0639203或Ristol P.等人，Sangre(1996)41：125-130中描述了多种纯化VWF或FVIII/VWF复合物的方法。
VWF的纯化需要用于去除潜在存在的病原体(例如病毒)的一个或多个步骤。一种对消除病毒非常有效的方法是通过孔径能够阻止病毒颗粒的过滤器进行过滤(病毒过滤)。该方法的功效取决于所用过滤器的孔径。
存在具有不同的孔径、通常在15到75纳米(nm)之间的纳米过滤器，较小的孔径在保留病原体方面产生更好的效果。孔径小于35nm，优选在15到20nm之间的纳米过滤器能够去除甚至很小的病毒，例如红病毒属B19或甲型肝炎病毒。但是如果高分子量的蛋白质也应通过过滤器，则通过具有小孔径的纳米过滤器进行过滤是有问题的(WO2005/040214A1)。通常，VWF或FVIII/VWF复合物似乎不适合通过孔径小于35nm的纳米过滤器进行有效过滤，特别是如果VWF溶液包含较高分子量VWF的多聚体形式(EP1632501)。
EP1348445A1描述了一种通过纳米过滤从包含纤维蛋白原的溶液中分离病毒的方法，其中在纳米过滤之前将促溶剂添加到纤维蛋白原溶液中。然而，EP1348445A1没有提及VWF。
EP2078730A1描述了一种方法，其中如果存在钙离子，可以通过标称孔径小于35nm甚至20nm的纳米过滤器过滤含有VWF或FVIII/VWF复合物的溶液(请参阅EP2078730A1的第[0033]段)。
WO2015/188224A1描述了一种制备重组VWF的方法，所述方法包括将VWF的多聚体分离成富含VWF的低分子量多聚体的渗透物级分和富含VWF的HMWM的渗透物级分。然而，过滤器的孔径相对较大(0.05μm至1μm)。
就滤液中VWF的收率而言，现有技术的方法仍不能令人满意。
因此，持续需要用于VWF病毒过滤的改进方法，特别是提供VWF的良好收率的方法。
发明内容
本申请的发明人发现，如果在至少150mM精氨酸的存在下进行病毒过滤，则在对VWF溶液进行病毒过滤时，在滤液中可获得令人惊讶的高收率的VWF抗原和VWF活性。进一步发现，用赖氨酸和组氨酸获得相似的结果。因此，本发明尤其涉及在下文的项[1]至[64]中定义的方面和实施方案。
[1]过滤包含von Willebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含VWF和至少一种浓度为至少150mM的碱性氨基酸的溶液；
(b)使步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。
[2]项[1]的方法，其中在步骤(a)的溶液中的所述VWF包含VWF的高分子量多聚体(HMWM)。
[3]根据项[1]或[2]的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤期间的压力低于0.5巴。
[4]项[3]的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤期间的压力为0.1至0.4巴。
[5]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的pH为5.0至9.0。
[6]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的pH为6.0至8.0。
[7]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的pH为6.5至7.5。
[8]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤在15至30℃之间的温度下进行。
[9]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤在18至28℃之间的温度下进行。
[10]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少300mM。
[11]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少350mM。
[12]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少400mM。
[13]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少450mM。
[14]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少500mM。
[15]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于1000mM。
[16]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于900mM。
[17]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于800mM。
[18]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于750mM。
[19]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少50mM的钙离子。
[20]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少100mM的钙离子。
[21]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少200mM的钙离子。
[22]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少300mM的钙离子。
[23]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少350mM的钙离子。
[24]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径小于或等于35nm。
[25]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径小于或等于25nm。
[26]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径小于或等于20nm。
[27]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径在13nm至35nm之间。
[28]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径在13nm至25nm之间。
[29]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径在18nm至22nm之间。
[30]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径在13nm至17nm之间。
[31]根据前述项中任一项的方法，其中VWF是源自血浆的VWF。
[32]根据项[1]至[30]中任一项的方法，其中VWF是重组获得的VWF。
[33]项[32]的方法，其中VWF包含半衰期延长部分(half-life extendingmoiety)。
[34]项[33]的方法，其中所述半衰期延长部分是与VWF氨基酸序列融合的异源氨基酸序列。
[35]项[33]的方法，其中所述异源氨基酸序列包含选自以下的多肽或由其组成：免疫球蛋白恒定区及其部分，例如Fc片段，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的C端肽，称为XTEN的具有大流体动力学体积的溶剂化随机链，同型氨基酸重复序列(homo-amioacid repeats)(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，白蛋白，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，在生理条件下能够结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。
[36]项[33]的方法，其中将所述半衰期延长部分缀合至多肽。
[37]项[36]的方法，其中所述半衰期延长部分选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，多唾液酸(PSA)，弹性蛋白样多肽，肝素前体(heparosan)聚合物，透明质酸和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链，及其组合。
[38]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为至少0.75。
[39]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为至少0.8。
[40]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为至少0.9。
[41]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为至少1.0。
[42]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为至少1.1。
[43]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为至少1.2。
[44]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为在步骤(a)中提供的溶液中比率RCo VWF/Ag VWF的至少75％。
[45]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的VWF:Ag收率为至少50％。
[46]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的VWF:Ag收率为至少60％。
[47]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的VWF:Ag收率为至少70％。
[48]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的VWF:Ag收率为至少75％。
[49]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的RCo VWF收率为至少40％。
[50]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的RCo VWF收率为至少45％。
[51]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的RCo VWF收率为至少50％。
[52]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的RCo VWF收率为至少55％。
[53]根据前述项中任一项的方法，其中当通过多聚体电泳分析时，步骤(a)中提供的溶液以及步骤(b)中获得的滤液包括VWF的低多聚体(1-5个条带)、中等多聚体(6-10个条带)和大的多聚体(HMWM，高分子量多聚体，高于11个条带)，条件是在与步骤(a)中提供的溶液和步骤(b)中获得的滤液中的总VWF含量相比时，步骤(b)中获得的滤液中的大的多聚体的相对量分别为至少70％。
[54]项[53]的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量为至少75％。
[55]项[53]的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量为至少80％。
[56]项[53]的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量为至少85％。
[57]根据前述项中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸及其组合。
[58]根据前述项中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸是精氨酸。
[59]根据项[1]至[57]中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸为赖氨酸。
[60]根据项[1]至[57]中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸为组氨酸。
[61]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液除VWF外还包含因子VIII(FVIII)，其中步骤(a)中提供的溶液可优选包含VWF和FVIII的复合物。
[62]可通过根据前述项中任一项的方法获得的VWF的经过滤的溶液。
[63]一种组合物，其包含通过根据前述项中任一项的方法可获得的VWF。
[64]一种纯化VWF的方法，其包括项[1]至[61]中任一项的方法。
发明详述
在第一方面，本发明涉及一种过滤包含VWF的溶液的方法。所述方法包括(a)提供包含VWF和至少150mM碱性氨基酸的溶液；和(b)使步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。
von Willebrand因子
如本文所用，术语“von Willebrand因子”或“VWF”是指具有野生型VWF的生物活性或VWF的至少部分生物活性的任何多肽。
“生物活性”(VWF的可测量功能)是指VWF在施用于人时也在体内进行的功能。如本文所用，术语“功能”和“功能的”等是指VWF的生物学的、酶的或治疗的功能。VWF的生物活性可以例如由技术人员使用确定利托菌素辅助因子活性(VWF:RCoF)(Federici AB等2004.Haematologica 89：77-85)，VWF对血小板糖蛋白复合物Ib-V-IX的GP 1b的结合(Sucker等人2006.Clin Appl Thromb Hemost.12：305-310)的方法，胶原结合测定(Kallas&Talpsep.2001.Annals of Hematology 80：466-471)或FVIII结合测定来确定。FVIII结合可以例如通过Biacore分析来确定。
术语“von Willebrand因子”(VWF)包括天然存在的(天然)VWF，以及具有天然存在的VWF的至少一部分生物活性的变体，例如其中一个或多个残基已被插入、缺失或取代的序列变体。编码野生型VWF的基因被转录成9kb mRNA，该mRNA被翻译成2813个氨基酸的前多肽原(pre-propolypeptide)，其估计分子量为310,000Da。该前多肽原由2813个氨基酸组成，包含22个氨基酸信号肽，741个氨基酸的多肽原和成熟的亚基。从N-末端切下741个氨基酸的多肽原，形成由2050个氨基酸组成的成熟VWF。野生型pre-pro-VWF的cDNA序列示于SEQID NO:1。野生型pre-pro-VWF的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。除非另有说明，否则本文所用的术语“VWF”是指VWF的成熟形式。
优选地，野生型VWF包含野生型VWF的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示。还包括的是VWF的添加、插入、N-末端、C-末端或内部缺失，只要保留VWF的至少部分生物活性即可。
在优选的实施方案中，VWF是源自血浆的VWF，更优选人源自血浆的VWF。
在本发明方法的某些实施方案中，VWF是重组产生的野生型VWF，例如在WO2010/048275A2中所述，或其变体，例如其中一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代已经引入以增加或降低蛋白质的至少一种生物活性。
因此，某些实施方案可以使用这些VWF相关序列中的任何一个或多个，包括其组合和变体。还包括来自其他生物体，例如本文所述和本领域已知的其他哺乳动物的VWF相关序列。
在某些实施方案中，术语“VWF”包括VWF的融合蛋白，优选VWF蛋白和异源融合伴侣的融合蛋白。还包括融合蛋白或修饰的蛋白，其包含异源融合伴侣或异源序列和VWF蛋白的至少一个最小片段或部分。
如本文所用，“融合蛋白”包括与另一(例如，不同的)VWF蛋白(例如，以产生多个片段)，与非VWF蛋白或两者连接的VWF蛋白或其片段。“非-VWF蛋白”是指具有对应于与野生型VWF蛋白不同的且可以源自相同或不同的生物体的蛋白的氨基酸序列的“异源多肽”。融合蛋白的VWF部分可以对应于生物活性VWF蛋白氨基酸序列的全部或片段。在某些实施方案中，VWF融合蛋白包括VWF蛋白的至少一个(或两个、三个等)生物活性部分。
更一般地，与异源序列例如白蛋白或免疫球蛋白或衍生自没有抗原结合结构域的免疫球蛋白的片段如Fc片段的融合可用于去除VWF的不需要的特征或改善VWF的所需特征(例如药代动力学性质)。例如，与异源序列的融合可以增加化学稳定性，降低免疫原性，改善体内靶向和/或增加VWF蛋白循环的半衰期。
可以与VWF序列融合的合适的异源序列包括但不限于免疫球蛋白恒定区和其部分，例如Fc片段，转铁蛋白和其片段，人绒毛膜促性腺激素的C-末端肽，被称为XTEN的具有大流体动力学体积的溶剂化随机链，同型氨基酸重复序列(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，白蛋白，afamin，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，在生理条件下能够结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。
如本文所用，“白蛋白”包括白蛋白家族蛋白的多肽，例如人血清白蛋白和牛血清白蛋白，包括其变体和衍生物，例如基因工程或化学修饰的白蛋白变体和白蛋白蛋白的片段。融合蛋白的白蛋白部分可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人，牛，绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于雌禽(hen)和鲑鱼。与白蛋白连接的多肽的白蛋白部分可以来自与融合蛋白的VWF蛋白部分所来自的不同的动物。优选的是，白蛋白是人血清白蛋白。
本文所用的术语“白蛋白”中包括的蛋白白蛋白家族包括进化相关的血清转运蛋白，例如白蛋白，甲胎蛋白(AFP；Beattie&Dugaiczyk，Gene.20：415-422，1982)，afamin(AFM；Lichenstein等，J.Biol.Chem.269：18149-18154，1994)和维生素D结合蛋白(DBP；Cooke&David，J.Clin.Invest.76：2420-2424，1985)。据称甲胎蛋白可延长附着的治疗性多肽的半衰期(参见WO2005/024044A2)。它们的基因代表了一个多基因簇，其结构和功能相似性映射到人、小鼠和大鼠的同一染色体区域。因此，本发明的一些实施方案可以使用本文定义的这种白蛋白家族成员或其片段和变体作为融合蛋白的一部分。本发明的治疗性融合蛋白的白蛋白家族成员还可包括AFP，AFM和DBP的天然存在的多态性变体。
VWF蛋白或其片段或变体可以与人血清白蛋白多肽或其片段或变体融合(参见例如WO2009/156137A1)。人血清白蛋白(HSA或HA)是成熟形式的585个氨基酸的蛋白质，负责相当大比率的血清渗透压，并也作为内源性和外源性配体的载体发挥功能。在其他益处中，与HSA或其片段或变体的融合可以增加本文所述的VWF蛋白的保存期限，血清半衰期和/或治疗活性。
优选的是，融合蛋白包含白蛋白作为C-末端部分和VWF蛋白作为N-末端部分。在其他实施方案中，融合蛋白具有与白蛋白的N-末端和C-末端都融合的VWF蛋白。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的VWF是WO2009/156137A1中公开的VWF-白蛋白融合蛋白。
可以使用肽接头序列来分离融合蛋白的组分。例如，肽接头可以以足以确保每种多肽折叠成其二级和三级结构的距离分开组分。可以使用本文描述的和本领域熟知的标准技术将这种肽接头序列并入融合蛋白中。可以基于以下因素选择合适的肽接头序列：(1)它们采用柔性延伸构象的能力；(2)它们不能采用可以与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可能与多肽功能性表位反应的疏水或带电残基。可有用地用作接头的氨基酸序列包括Maratea等人，Gene 40：39-46，1985；Murphy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258-8262，1986；US4935233和US4751180中公开的那些。
一个或多个非肽或肽接头是任选的。例如，在第一和第二多肽具有可用于分离功能结构域并防止空间干扰的非必需的N-末端和/或C-末端氨基酸区域的融合蛋白中，可能不需要接头序列。
如本文所述，本发明的某些实施方案还考虑使用修饰的VWF蛋白，包括改善该蛋白所需特性的修饰，如本文所述。VWF蛋白的修饰包括在一个或多个组成氨基酸上的化学和/或酶衍生，包括侧链修饰，主链修饰以及N-和C-末端修饰，包括乙酰化，羟基化，甲基化，酰胺化，以及碳水化合物或脂质部分、辅因子等的附着。示例性修饰还包括VWF蛋白的PEG化(参见，例如，Veronese和Harris，Advanced Drug Delivery Reviews 54：453-456，2002，通过引用并入本文)。化学缀合至生物学可接受的聚合物的VWF变体描述于例如WO2006/071801A2中。
在某些实施方案中，半衰期延长部分与多肽的VWF部分缀合。合适的半衰期延长部分包括但不限于羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、多唾液酸(PSA)、弹性蛋白样多肽、肝素前体聚合物、透明质酸和白蛋白结合配体(例如脂肪酸链)及其组合。
本发明还可以与VWF蛋白的“变体”一起使用。术语“蛋白变体”包括通过添加、缺失和/或取代至少一个氨基酸残基而与SEQ ID NO:2相区别的、并且通常保留参考序列的一种或多种活性的蛋白。鉴定适合于取代的氨基酸并设计相对于参考序列具有基本上未改变、改善或降低的活性的变体在本领域技术人员的技术范围内。
如本文所述和本领域已知的，蛋白质变体可以通过一个或多个取代而与参考序列区分开，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，蛋白质变体包括保守的取代，就此而言，在本领域中众所周知的是，某些氨基酸可以被改变为具有大致相似性质的其他氨基酸，而不改变蛋白质活性的性质。
如上所述，与参考残基相比，生物活性的变体蛋白可在沿着其序列的各个位置包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的氨基酸。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其通常可分为以下亚类：
酸性的：由于在生理pH下H离子的丢失，残基具有负电荷，并且残基被水溶液吸引，从而寻找肽的构象的表面位置，在所述位置中，在肽处于生理pH水性介质中时残基被包含。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
碱性的：由于在生理pH或在其一个或两个pH单位内与H离子缔合，残基具有正电荷(例如，组氨酸)，并且残基被水溶液吸引，从而寻找肽的构象的表面位置，在所述位置中，当肽在生理pH值的水性介质中时残基被包含。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
带电的：残基在生理pH下带电，因此包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。
疏水性的：残基在生理pH值下不带电，并且残基被水溶液排斥，从而寻找肽的构象中的内部位置，在所述位置中，当肽在水性介质中时残基被包含。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
中性/极性的：残基在生理pH下不带电荷，但是残基不能被水溶液充分排斥，因此寻找肽的构象中的内部位置，在所述位置中，当肽在水性介质中时残基被包含。具有中性/极性的侧链的酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
该描述还将某些氨基酸表征为“小”，因为即使没有极性基团，它们的侧链也不足够大以赋予疏水性。脯氨酸除外，“小”氨基酸是当侧链上有至少一个极性基团时具有四个或更少碳以及当侧链上没有极性基团时具有三个或更少碳的氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸脯氨酸是一种特殊情况，因为它对肽链的二级构象具有已知作用。脯氨酸的结构与所有其他天然存在的氨基酸的不同之处在于其侧链与α-氨基的氮以及α-碳键合。为了本发明的目的，脯氨酸被分类为“小”氨基酸。
分类为极性或非极性所需的吸引或排斥的程度是任意的，因此，本发明具体考虑的氨基酸已被分类为一种或另一种。可以根据已知行为对大多数未特别命名的氨基酸进行分类。
根据残基的侧链取代基(且无论大小)，氨基酸残基可进一步分为以下亚类：环状或非环状以及芳香族或非芳香族的不言自明的分类。如果在存在一个额外的极性取代基的情况下残基总共包含四个或更少碳(包括羧基碳)，则残基被认为是小的；如果在没有额外的极性取代基的情况下残基总共包含三个或更少碳，则残基被认为是小的。当然，小残基始终是非芳香族的。取决于它们的结构性质，氨基酸残基可以分为两类或更多类。对于天然存在的蛋白质氨基酸，根据该方案的亚分类列于下表1中。
表1：氨基酸亚分类
Figure BDA0002388488250000151
保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，可以合理地预期将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸，将天冬氨酸替换为谷氨酸，将苏氨酸替换为丝氨酸，或将氨基酸用结构上相关的氨基酸类似地替换，不会对所得变体多肽的特性产生重大影响。如本文所述，生物活性蛋白中氨基酸变化可以通过测定其生色和/或凝血活性而容易地确定。
VWF溶液
在本发明的方法的步骤(a)中提及的溶液包含VWF和至少150mM的碱性氨基酸或碱性氨基酸的组合。
待过滤的溶液中的VWF优选包含VWF的高分子量多聚体(HMWM)。
术语“高分子量VWF多聚体”或“HMW VWF多聚体”或“VWF的HMWM”同义使用，并表示对应于根据Ott等人(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)在光密度(densidometric)VWF分析中的11个条带及更高的条带，其中“更高”表示11个条带和所有较大的VWF多聚物。
术语“低分子量VWF多聚体”或“低多聚体”或“VWF的LMWM”同义使用，并且意味着对应于根据Ott等人(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)的光密度VWF分析中的1至5个条带。
术语“中等分子量VWF多聚体”或“中等多聚体”或“VWF的IMWM”是同义词，并且意味着对应于根据Ott等人(Am J Clin Pathol 2010；133：322-330)光密度VWF分析中的6-10个条带。
待过滤的溶液中的VWF浓度(Ag VWF)可以为0.1至30IU/ml，优选为1至25，或3至20，或5至15IU/ml。
待过滤的溶液中的VWF浓度(RCo VWF)可以为0.1至30IU/ml，优选为1至25，或3至20，或5至15IU/ml。
待过滤的溶液中的比率RCo VWF/Ag VWF优选为至少0.75，或至少0.8，或至少0.9，或至少1.0，或至少1.1，或至少1.2。典型的是，待过滤的溶液中的比率RCo VWF/Ag VWF为0.5至2，优选0.75至1.8，或0.8至1.6。
待过滤的VWF溶液也可以包含因子VIII(FVIII)。待过滤的溶液中的FVIII浓度可以为约0.1IU/ml至约20IU/ml，或约1IU/ml至约10IU/ml。FVIII可能以作为与VWF的复合物存在。
碱性氨基酸
如本文所用，术语“碱性氨基酸”是指等电点大于7的氨基酸。
待过滤的VWF溶液可包含浓度为至少150mM的一种碱性氨基酸，或碱性氨基酸的组合，其中VWF溶液中所有碱性氨基酸的总浓度为至少150mM。例如，所述VWF溶液可以包含150mM的精氨酸，或者可以包含75mM的精氨酸和75mM的赖氨酸，使得碱性氨基酸的总浓度为150mM。这两个实施方案都在本发明的范围内。
优选的是，碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸及其组合。更优选的是，碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其组合。
在一个优选的实施方案中，碱性氨基酸是精氨酸。更优选的是，精氨酸是待过滤的VWF溶液中唯一碱性氨基酸。
在另一个实施方案中，碱性氨基酸是赖氨酸。优选的是，赖氨酸是待过滤的VWF溶液中唯一碱性氨基酸。
在另一个实施方案中，碱性氨基酸是组氨酸。优选的是，赖氨酸是待过滤的VWF溶液中唯一碱性氨基酸。
在另一个实施方案中，碱性氨基酸是精氨酸和赖氨酸的组合。
在另一个实施方案中，碱性氨基酸是精氨酸和组氨酸的组合。
在另一个实施方案中，碱性氨基酸是组氨酸和赖氨酸的组合。
在另一个实施方案中，碱性氨基酸是精氨酸、赖氨酸和组氨酸的组合。
待过滤的溶液中至少一种碱性氨基酸的浓度优选为至少200mM，或至少250mM，或至少300mM，或至少350mM，或至少400mM，或至少450mM，或至少500mM。进一步优选的是，待过滤的溶液中的至少一种碱性氨基酸的浓度小于1000mM，或小于950mM，或小于900mM，或小于850mM，或小于800mM，或小于750mM，或小于700mM。在其他实施方案中，待过滤的溶液中至少一种碱性氨基酸的浓度范围为150mM至1000mM，或200mM至950mM，或250mM至900mM，或300mM至850mM，或350mM至800mM。最优选的是，待过滤的溶液中至少一种碱性氨基酸的浓度范围为400mM至800mM，例如450mM至750mM，或500mM至700mM。特别合适的浓度包括约400mM，约450mM，约500mM，约550mM，约600mM，约650mM，约700mM和约750mM。
待过滤的溶液除了VWF和至少一种碱性氨基酸外，还可以包含其他化合物。在一个优选的实施方案中，待过滤的溶液还包含钙离子(Ca2+)。待过滤的溶液中钙离子的浓度优选为至少50mM，或至少100mM，或至少150mM，或至少200mM，或至少250mM，或至少300mM，或至少350mM。优选的是，待过滤的溶液中钙离子的浓度范围为50mM至800mM，或100mM至750mM，或150mM至700mM，或200mM至650mM，或250mM至600mM，或300mM到550mM，或者350mM到500mM。
待过滤的VWF溶液可以包括其他化合物，其包括但不限于碱金属盐、氨基酸和缓冲物质。优选的其他化合物包括氯化钠(NaCl)、对羟苯基甘氨酸(glycin)、组氨酸、柠檬酸钠、MES和HEPES。
最优选的是，待过滤的溶液包含VWF、400mM至800mM的精氨酸和300mM至500mM的CaCl2。
待过滤的溶液通常具有范围为6.0至8.0的pH。优选的是，溶液的pH为6.1至7.8，或6.2至7.6，或6.3至7.4，或6.4至7.2。更优选的是，溶液的pH为6.5至7.1。最优选的是，pH为6.6至7.0，或6.7至6.9，例如约6.8。可通过使用合适的缓冲物质例如MES或HEPES来调节和维持pH。
待过滤的溶液中的蛋白质浓度范围通常为约0.01mg/ml至约1mg/ml，优选约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选约0.1mg/ml至约0.5mg/ml。
过滤器
在本发明的方法中使用的过滤器的标称孔径为35nm或更小。优选的是，过滤器的标称孔径为25nm或更小。更优选的是，过滤器的标称孔径为22nm或更低。最优选的是，过滤器的标称孔径为20nm或更小，例如15nm，16nm，17nm，18nm或19nm。本发明的方法中使用的过滤器的标称孔径优选在15nm至35nm，或16nm至30nm，或17nm至25nm，或18nm至22nm的范围内。
在本发明的方法中使用的过滤器的中值孔径为35nm或更小。优选的是，过滤器的中值孔径为25nm或更小。更优选的是，过滤器的中值孔径为22nm或更低。最优选的是，过滤器的中值孔径为20nm或更小，例如15nm，16nm，17nm，18nm或19nm。在本发明的方法中使用的过滤器的中值孔径优选在15nm至35nm，或16nm至30nm，或17nm至25nm，或18nm至22nm的范围内。
过滤器的膜可以由不同的材料制成。优选地，该膜包含或基本上由聚醚砜(例如，Sartorius
Figure BDA0002388488250000201
CPV)，亲水性、任选改性的聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride)(例如，Pall PegasusTM SV4)或纤维素，例如铜铵再生纤维素(例如AsahiKasei Planova 20N)组成。
合适的过滤器包括但不限于
Figure BDA0002388488250000202
Pall PegasusTMSV4和AsahiKasei Planova 20N。下表2总结了几种合适的过滤器。
表2.细小病毒级过滤器
Figure BDA0002388488250000203
Figure BDA0002388488250000211
滤膜的有效表面的范围可以为约0.001m2至约10m2，或约0.01m2至约4m2，或约0.1m2至约1m2。
过滤工艺(process)
通常，根据本发明的方法的过滤以死端(dead-end)过滤方式进行。待过滤的溶液的体积范围可以为10mL至100L，或100mL至10L或0.5L至0.5L。
在过滤开始时以及在过滤工艺过程中，待过滤的溶液的温度可以在约10℃至约30℃的范围内。优选的是，在过滤开始时以及在过滤工艺过程中待过滤的溶液的温度为15℃至29℃，或18℃至28℃，例如约19℃，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃，约25℃，约26℃或约27℃。
过滤通常在小于1巴的压力下进行。优选的是，过滤在小于0.75巴的压力下进行。更优选的是，过滤在小于0.5巴的压力下进行。最优选的是，过滤在0.1巴至0.45巴，或0.2巴至0.4巴，例如约0.3巴的压力下进行。
过滤流量可以在约1L/小时/m2至约30L/小时/m2的范围内。优选的是，过滤是约5L/小时/m2至约25L/小时/m2，更优选的是，过滤流量范围可以为约10L/小时/m2至约20L/小时/m2。
滤液
本发明的过滤工艺得到包含具有高生物活性的VWF的滤液。
在本发明的方法中过滤后的VWF:Ag收率通常为至少50％，优选至少60％，或至少70％或至少75％。
在本发明的方法中过滤后的RCo VWF收率通常为至少40％，优选至少45％，至少50％或至少55％。
在本发明方法的步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为至少0.75，至少0.8，至少0.9，至少1.0，至少1.1或至少1.2。
在另一个实施方案中，步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为步骤(a)中提供的溶液中的比率RCo VWF/Ag VWF的至少75％。比率RCo VWF/Ag VWF由于过滤而降低小于25％，优选降低小于20％，或小于15％，或小于10％或小于5％。更优选的是，比率RCoVWF/Ag VWF中没有由于VWF溶液的过滤所致的降低。最优选的是，比率RCo VWF/Ag VWF中存在由于VWF溶液的过滤所致的增加。
在另一个实施方案中，当通过多聚体电泳分析时，步骤(b)中获得的滤液包括VWF的低多聚体(1-5个条带)，中等多聚体(6-10个条带)和大的多聚体(HMWM，高分子量多聚体，高于11个条带。如果没有另外说明，则在本文同义使用术语“大的多聚体”和“高分子量的多聚体”。优选的是，当与滤液中的总VWF含量相比时，步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量分别为至少70％，至少75％，至少80％或至少85％。
在又一个实施方案中，当通过多聚体电泳分析时，步骤(a)中提供的溶液以及步骤(b)中获得的滤液包括VWF的低多聚体(1-5个条带)，中等多聚体(6-10个条带)和大的多聚体(HMWM，高分子量多聚体，高于11条带)。优选的是，根据该实施方案，当与步骤(a)中提供的溶液和步骤(b)中获得的滤液中的总VWF含量相比时，步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量分别为至少70％，至少75％，至少80％，至少85％。在又另一个优选实施方案中，步骤(b)获得的滤液中的大的多聚体的相对量基本上与步骤(a)提供的溶液中的大的多聚体的相对量相同。
在另一方面，本发明是可通过本文描述的工艺获得的包含VWF的经过滤的溶液。经过滤的溶液通常具有关于VWF Ag活性、VWF RCo活性和多聚体含量的上述一种或多种性质。
在另一方面，本发明涉及包含VWF和浓度为400mM至800mM的精氨酸的溶液。在本发明的溶液中优选的精氨酸浓度对应于如上所述待过滤的溶液中的优选的精氨酸浓度。优选的是，溶液还包含浓度为至少100mM的钙离子。本发明溶液中的优选钙离子浓度对应于如上所述待过滤的溶液中的优选钙离子浓度。在其他实施方案中，本发明的溶液可包含一种或多种其他化合物，它们是如上文所述待过滤的溶液的任选组分。
本发明的另一方面是可通过本文所述的方法获得的包含VWF的组合物。
在另一方面，本发明涉及纯化VWF的工艺，其包括上文所述的方法。
待纯化的VWF可以是源自血浆的VWF或重组产生的VWF。
重组VWF或其变体可使用标准方案方便地制备。作为一个一般实例，重组VWF可通过包括以下一个或多个步骤的操作制备：(a)制备包含编码蛋白质和与至少一个调控元件可操作地连接的多核苷酸序列的构建体；(b)将构建体引入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达多肽，和(d)从宿主细胞中收集或分离多肽。为了表达VWF，可以将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的表达载体，即，含有用于转录和翻译所插入的编码序列的必需元件的载体。可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建表达载体，其包含编码VWF的序列以及适当的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组，并且是本领域已知的。
可以根据本领域已知的多种技术来纯化和表征VWF。用于进行蛋白质纯化和分析蛋白质纯度的示例系统包括快速蛋白质液相色谱法(FPLC)(例如，AKTA和Bio-Rad FPLC系统)，疏水相互作用色谱法和高压液相色谱法(HPLC)。纯化的示例化学方法包括离子交换色谱法(例如Q、S)，尺寸排阻色谱法，盐梯度，亲和纯化(例如Ni、Co、FLAG、麦芽糖、谷胱甘肽、蛋白质A/G)，凝胶过滤，反相，陶瓷
Figure BDA0002388488250000241
离子交换色谱和疏水作用色谱柱(HIC)等，是本领域已知的。还包括分析方法例如SDS-PAGE(例如考马斯(Coomassie)、银染)，制备等电聚焦(IEF)，免疫印迹，布拉德福德(Bradford)，差示溶解度(differential solubility)(例如硫酸铵沉淀)和ELISA，其可在生产或纯化工艺的任何步骤的过程中使用，通常用于测量蛋白质组成的纯度。
在某些方面，VWF可以经历多个色谱纯化步骤，包括以下的的任意组合：亲和色谱法，离子交换色谱法，疏水相互作用色谱法，染料色谱法，羟基磷灰石色谱法，尺寸排阻色谱法和优选免疫亲和色谱法，主要用于浓缩所需蛋白质并去除可能在生产、储存和/或使用过程中引起重组蛋白质断裂、活化和/或降解的物质。优选通过纯化去除的此类物质的示例包括其他蛋白质污染物，例如修饰酶，如PACE/弗林蛋白酶(furin)，VKOR和VKGC；蛋白质，例如宿主细胞蛋白质，在重组蛋白质生产过程中从生产细胞释放到组织培养基中；非蛋白质污染物，例如脂质；以及蛋白质和非蛋白质污染物，例如脂蛋白的混合物。VWF蛋白的纯化操作是本领域已知的(参见例如WO2011/022657A1)。
为了使理论上的病毒污染风险最小化，可在该工艺中包括其他步骤以允许有效地灭活或消除病毒。这样的步骤包括例如，以液态或固态进行热处理，使用溶剂和/或去污剂进行处理，可见光谱或UV光谱中的辐射，伽玛辐射和病毒过滤。
除本发明的方法外，纯化VWF的工艺可以包括以下步骤中的一个或多个：冷冻沉淀，Al(OH)3吸附，甘氨酸沉淀，盐沉淀，巴氏灭菌，透析，超速离心，无菌过滤，稀释，冻干及其组合。
可以将通过本发明的方法和工艺获得的VWF配制成药物组合物。合适的制剂描述在WO2015/188224A1和WO2010/048275A2中。
表3：序列表中序列的概述
SEQ ID NO: 描述
1 人pre-pro-VWF的cDNA序列
2 pre-pro-VWF的人氨基酸序列
实施例
实施例1
对分别命名为“A”和“B”的两种不同的rVWF溶液进行病毒过滤。rVWF是VWF-白蛋白融合体，因此其氨基酸序列已在WO2009/156137A1中进行了描述。
溶液“A”或“B”包含重组表达的VWF，并从室内细胞培养系统获得，并单独纯化。
过滤前加入不同量的精氨酸，得到表4所示的最终浓度。
所有VWF溶液在进行病毒过滤时的pH值为6.8±0.1。所有后续步骤均在23±5℃的室温下进行。病毒过滤作为死端过滤进行。将用于病毒过滤的起始中间体(30-50ml)装入压力容器中，然后在0.3巴(在预过滤器之前测量的输入压力)的低输入压力下依次通过0.2/0.1μm预过滤器和20nm过滤器(20N Planova；0.001m2)进行过滤。从压缩空气中获得压力。将20N滤液收集于级分、随后的后洗级分(postwash fraction)。滤液级分和后洗液的等分试样与原始级分体积成比例地合并，以代表过滤研究最终的样品“制备物”，其被分析。该研究在通过使用前泄漏测试以及通过使用后泄漏测试和金颗粒测试的过滤后完整性测试后才有效。
表4.
Figure BDA0002388488250000261
*过滤前
从表4可以看出，rVWF溶液中精氨酸的存在导致vWF:Ag和或VWF:RCo的收率增加。
将来自制备物No.1和2的滤液在聚丙烯酰胺凝胶上分离并用考马斯亮蓝染色。扫描凝胶，并根据制造商的说明使用ImageQuant软件评估条带。结果汇总于表5。
表5.
Figure BDA0002388488250000271
可以看出，具有精氨酸的物质的滤液包含高比例的高分子量多聚体，而没有精氨酸的样品具有较少的HMWM。
实施例2
据报道，在使VWF经历病毒过滤(VF)时，钙离子具有积极作用。因此，研究了精氨酸是否也可以在钙离子存在的情况下改善VWF收率。
除了研究溶液C之外，过滤条件如实施例1所述。
溶液“C”包含源自血浆的VWF，且它从血浆蛋白制造工艺中获得的。
过滤前加入不同量的CaCl2和精氨酸，得到表6所示的最终浓度。
每种制备物中的过滤体积为36ml。
结果总结在表6中。
表6
Figure BDA0002388488250000281
*加入赖氨酸代替精氨酸
**加入组氨酸代替精氨酸
表6中的No.5制备物表明，与没有钙离子的溶液相比，在400mM CaCl2存在下，VWF的收率更高(例如，以上表4中的No.3制备物)。然而，表6中的其他制备物显示，精氨酸在存在钙离子的情况下在病毒过滤中进一步改善了VWF收率。
进一步表明，通过添加赖氨酸或组氨酸代替精氨酸，也可以实现VWF收率的改善。
序列表
<110> CSL Behring GmbH
<120> 用于von Willebrand因子的病毒过滤的方法
<130> A234
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(8442)
<400> 1
atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac atc cat ttg 288
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
tat gcc tcc aaa ggg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg atc gat ggc agc ggc 432
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
aac ttt caa gtc ctg ctg tca gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
ctg tgt ggc aac ttt aac atc ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
gaa ggg acc ttg acc tcg gac cct tat gac ttt gcc aac tca tgg gct 576
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
ctg agc agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tct cct ccc agc agc 624
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
tca tgc aac atc tcc tct ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
tgc cag ctt ctg aag agc acc tcg gtg ttt gcc cgc tgc cac cct ctg 720
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
gtg gac ccc gag cct ttt gtg gcc ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gcc tgc cct gcc ctc ctg gag tac gcc 816
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
cgg acc tgt gcc cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cac 864
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
agc gcg tgc agc cca gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
gtg tcc cct tgc gcc agg acc tgc cag agc ctg cac atc aat gaa atg 960
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc agc tgc cct gag gga cag ctc 1008
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
ctg gat gaa ggc ctc tgc gtg gag agc acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc ctc tct cga gac tgc aac 1104
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
acc tgc att tgc cga aac agc cag tgg atc tgc agc aat gaa gaa tgt 1152
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
cca ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tca cac ttc aag agc ttt gac 1200
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
aac aga tac ttc acc ttc agt ggg atc tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
gat tgc cag gac cac tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
cct ggc ctg cac aac agc ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
gcc atg gat ggc cag gac gtc cag ctc ccc ctc ctg aaa ggt gac ctc 1440
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
cgc atc cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc ctc agc tac ggg gag 1488
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tct ggg ctg gcg gag ccc 1632
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
atc tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gcc gtg gtg gag tac cac gac 3969
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
ggc tcc cac gcc tac atc ggg ctc aag gac cgg aag cga ccg tca 4014
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
gag ctg cgg cgc att gcc agc cag gtg aag tat gcg ggc agc cag 4059
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
gtg gcc tcc acc agc gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa atc 4104
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
ttc agc aag atc gac cgc cct gaa gcc tcc cgc atc gcc ctg ctc 4149
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
ctg atg gcc agc cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg atc ccg 4239
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
gtg ggc att ggg ccc cat gcc aac ctc aag cag atc cgc ctc atc 4284
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
gag aag cag gcc cct gag aac aag gcc ttc gtg ctg agc agt gtg 4329
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
gat gag ctg gag cag caa agg gac gag atc gtt agc tac ctc tgt 4374
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
gac ctt gcc cct gaa gcc cct cct cct act ctg ccc ccc cac atg 4419
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
1460 1465 1470
gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg ctc ttg ggg gtt tcg acc ctg 4464
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
gaa gga tcg gac aaa att ggt gaa gcc gac ttc aac agg agc aag 4554
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
agc atc cac gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
gag tac ccc ttc agc gag gca cag tcc aaa ggg gac atc ctg cag 4689
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
cgg gtg cga gag atc cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
ggg ctg gcc ctg cgg tac ctc tct gac cac agc ttc ttg gtc agc 4779
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
gga aat cct gcc tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat ata ggg cct cgt ctc act 5184
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
cag gtg tca gtg ctg cag tat gga agc atc acc acc att gac gtg 5229
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
cca tgg aac gtg gtc ccg gag aaa gcc cat ttg ctg agc ctt gtg 5274
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
gac gtc atg cag cgg gag gga ggc ccc agc caa atc ggg gat gcc 5319
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
ttg ggc ttt gct gtg cga tac ttg act tca gaa atg cat ggg gcg 5364
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
cgc ccg gga gcc tca aag gcg gtg gtc atc ctg gtc acg gac gtc 5409
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
tct gtg gat tca gtg gat gca gca gct gat gcc gcc agg tcc aac 5454
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
aga gtg aca gtg ttc cct att gga att gga gat cgc tac gat gca 5499
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
gcc cag cta cgg atc ttg gca ggc cca gca ggc gac tcc aac gtg 5544
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
gtg aag ctc cag cga atc gaa gac ctc cct acc atg gtc acc ttg 5589
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
ggc aat tcc ttc ctc cac aaa ctg tgc tct gga ttt gtt agg att 5634
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
tgc atg gat gag gat ggg aat gag aag agg ccc ggg gac gtc tgg 5679
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
acc ttg cca gac cag tgc cac acc gtg act tgc cag cca gat ggc 5724
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
cag acc ttg ctg aag agt cat cgg gtc aac tgt gac cgg ggg ctg 5769
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
agg cct tcg tgc cct aac agc cag tcc cct gtt aaa gtg gaa gag 5814
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
acc tgt ggc tgc cgc tgg acc tgc ccc tgc gtg tgc aca ggc agc 5859
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
tcc act cgg cac atc gtg acc ttt gat ggg cag aat ttc aag ctg 5904
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
act ggc agc tgt tct tat gtc cta ttt caa aac aag gag cag gac 5949
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
ctg gag gtg att ctc cat aat ggt gcc tgc agc cct gga gca agg 5994
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
cag ggc tgc atg aaa tcc atc gag gtg aag cac agt gcc ctc tcc 6039
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
gtc gag ctg cac agt gac atg gag gtg acg gtg aat ggg aga ctg 6084
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
gtc tct gtt cct tac gtg ggt ggg aac atg gaa gtc aac gtt tat 6129
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
ggt gcc atc atg cat gag gtc aga ttc aat cac ctt ggt cac atc 6174
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
ttc aca ttc act cca caa aac aat gag ttc caa ctg cag ctc agc 6219
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
ccc aag act ttt gct tca aag acg tat ggt ctg tgt ggg atc tgt 6264
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
gat gag aac gga gcc aat gac ttc atg ctg agg gat ggc aca gtc 6309
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
acc aca gac tgg aaa aca ctt gtt cag gaa tgg act gtg cag cgg 6354
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
cca ggg cag acg tgc cag ccc atc ctg gag gag cag tgt ctt gtc 6399
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
ccc gac agc tcc cac tgc cag gtc ctc ctc tta cca ctg ttt gct 6444
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
gaa tgc cac aag gtc ctg gct cca gcc aca ttc tat gcc atc tgc 6489
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
cag cag gac agt tgc cac cag gag caa gtg tgt gag gtg atc gcc 6534
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
tct tat gcc cac ctc tgt cgg acc aac ggg gtc tgc gtt gac tgg 6579
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
agg aca cct gat ttc tgt gct atg tca tgc cca cca tct ctg gtt 6624
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
tat aac cac tgt gag cat ggc tgt ccc cgg cac tgt gat ggc aac 6669
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
gtg agc tcc tgt ggg gac cat ccc tcc gaa ggc tgt ttc tgc cct 6714
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
cca gat aaa gtc atg ttg gaa ggc agc tgt gtc cct gaa gag gcc 6759
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
tgc act cag tgc att ggt gag gat gga gtc cag cac cag ttc ctg 6804
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
gaa gcc tgg gtc ccg gac cac cag ccc tgt cag atc tgc aca tgc 6849
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
ctc agc ggg cgg aag gtc aac tgc aca acg cag ccc tgc ccc acg 6894
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
gcc aaa gct ccc acg tgt ggc ctg tgt gaa gta gcc cgc ctc cgc 6939
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
cag aat gca gac cag tgc tgc ccc gag tat gag tgt gtg tgt gac 6984
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
cca gtg agc tgt gac ctg ccc cca gtg cct cac tgt gaa cgt ggc 7029
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
ctc cag ccc aca ctg acc aac cct ggc gag tgc aga ccc aac ttc 7074
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
acc tgc gcc tgc agg aag gag gag tgc aaa aga gtg tcc cca ccc 7119
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
tcc tgc ccc ccg cac cgt ttg ccc acc ctt cgg aag acc cag tgc 7164
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
tgt gat gag tat gag tgt gcc tgc aac tgt gtc aac tcc aca gtg 7209
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
agc tgt ccc ctt ggg tac ttg gcc tca acc gcc acc aat gac tgt 7254
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
ggc tgt acc aca acc acc tgc ctt ccc gac aag gtg tgt gtc cac 7299
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
cga agc acc atc tac cct gtg ggc cag ttc tgg gag gag ggc tgc 7344
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
gat gtg tgc acc tgc acc gac atg gag gat gcc gtg atg ggc ctc 7389
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
cgc gtg gcc cag tgc tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
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Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
agg aag tgc agc aag tga 8442
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 2
<211> 2813
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
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1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
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Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
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1535 1540 1545
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1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
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1580 1585 1590
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1640 1645 1650
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1655 1660 1665
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1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
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2105 2110 2115
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2120 2125 2130
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
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Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
Arg Lys Cys Ser Lys
2810

Claims (21)

1.过滤包含von Willebrand因子(VWF)的溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含VWF和至少一种碱性氨基酸的溶液，其中所述溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少150mM；
(b)使所述步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)的溶液中的所述VWF包括VWF的高分子量多聚体(HMWM)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(b)中的病毒过滤期间的压力低于0.5巴。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液的pH为5.0至9.0，特别是6.0至8.0。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)中的病毒过滤是在15至30℃，特别是18至28℃的温度下进行的。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少450mM或至少500mM。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于1,000mM、小于950mM、小于900mM、小于850mM、小于800mM或小于750mM。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少50mM、至少100mM、至少200mM、至少300mM或至少350mM的钙离子。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器的孔径小于或等于25nm或小于或等于20nm。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述过滤器的孔径为13nm至35nm、13nm至25nm、18nm至22nm或13nm至17nm。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述VWF是源自血浆的VWF或重组获得的VWF。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)中获得的所述滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF为至少0.75、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1或至少1.2。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述步骤(b)中获得的滤液中的比率RCo VWF/Ag VWF是在所述步骤(a)中提供的溶液中的比率RCo VWF/Ag VWF的至少75％。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中过滤后的VWF:Ag收率为至少50％、至少60％、至少70％或至少75％。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中过滤后的RCo VWF收率为至少40％、至少45％、至少50％或至少55％。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其示当通过多聚体电泳分析时，所述步骤(a)中提供的溶液以及所述步骤(b)中获得的滤液包括VWF的低多聚体(1-5个条带)、中等多聚体(6-10个条带)和大的多聚体(HMWM，高分子量多聚体，高于11个条带)，条件是在与所述步骤(a)中提供的溶液和所述步骤(b)中获得的滤液中的总VWF含量相比时，所述步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量分别为至少70％、至少75％、至少80％或至少85％。
17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸及其组合，优选其中碱性氨基酸为精氨酸。
18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(a)中提供的溶液除VWF外还包含因子VIII(FVIII)。
19.可通过前述权利要求中任一项的方法获得的VWF的经过滤的溶液。
20.包含可通过前述权利要求中任一项的方法获得的VWF的组合物。
21.纯化VWF的工艺，其包括权利要求1至18中任一项的方法。
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