KR101953494B1 - 동결건조된 재조합 ｖｗｆ 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동결건조된 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 장기간 안정한 제약 제제, 및 상기 제제를 제조하는 방법 및 투여하는 방법을 제공한다.

Description

동결건조된 재조합 ＶＷＦ 제제{LYOPHILIZED RECOMBINANT VWF FORMULATIONS}

일반적으로, 본 발명은 동결건조된 재조합 VWF 제제, 및 재조합 VWF를 포함하는 동결건조된 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

폰 빌레브란트 인자 (VWF)는 크기가 약 500 내지 20,000 kD 범위인 일련의 다량체로서 혈장 중에서 순환하는 당단백질이다. 다량체 형태의 VWF는 이황화 결합에 의해 함께 연결되어 있는 250 kD의 폴리펩티드 서브유니트로 구성되어 있다. VWF는 초기에 일어나는 혈소판의 손상된 혈관벽의 내피하층에의 부착을 매개한다. 오직 대형 다량체만이 지혈 활성을 나타낸다. 내피 세포가 대형 중합체 형태의 VWF를 분비하고, 분자량이 낮은 형태의 VWF (저분자 VWF)는 단백질분해성 절단으로부터 생성되는 것으로 추정된다. 분자량이 큰 다량체는 내피 세포의 바이벨펠라드 소체(Weibel-Pallade body)에 저장이 되며, 자극을 받았을 때에 유리된다.

VWF는 상당 범위가 반복된 도메인으로 구성된 것인 프리프로-VWF로서 내피 세포 및 거핵세포에 의해 합성된다. 신호 펩티드가 절단되면, 프로-VWF는 그의 C-말단 영역에서의 이황화 결합을 통해 이량체화된다. 이량체는, 유리 종단 말단들 사이의 이황화 결합에 의해 좌우되는 다량체화를 위한 프로모터로서의 역할을 한다. 다량체로 조립된 후, 프로펩티드 서열의 단백질분해성 제거가 이루어진다 (문헌 [Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261]).

VWF의 클로닝된 cDNA로부터 예측되는 1차 번역 생성물은 2813-잔기 전구체 폴리펩티드 (프리프로-VWF)이다. 프리프로-VWF는 22개의 아미노산 신호 펩티드 및 741개의 아미노산 프로펩티드로 구성되고, 성숙 VWF는 2050개의 아미노산을 포함한다 (문헌 [Ruggeri Z.A., and Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993)]).

VWF의 결함은 폰 빌레브란트병 (VWD)의 원인이 되는데, 상기 질환은 다소 뚜렷한 출혈성 표현형을 특징으로 한다. VWD 3형이 가장 중증인 형태로서, VWF가 완전하게 결손된 형태이며, VWD 1형은 VWF의 정량적 손실과 관련이 있으며, 이러한 형태의 표현형은 매우 경미한 것일 수 있다. VWD 2형은 VWF의 정성적 결함과 관련이 있으며, 이러한 형태는 VWD 3형만큼 중증일 수 있다. VWD 2형에는 하위형태가 다수 존재하며, 이중 일부는 고분자 다량체의 손실 또는 감소와 관련이 있다. 폰 빌레브란트 증후군 2a형 (VWS-2A)은 중간 및 대형 다량체, 둘 모두가 손실된 것을 특징으로 한다. VWS-2B는 분자량이 가장 큰 다량체가 손실된 것을 특징으로 한다. VWF와 관련된 다른 질환 및 질병이 당업계에 공지되어 있다.

미국 특허 번호 제6,531,577호, 제7,166,709호, 및 유럽 특허 출원 번호 제04380188.5호에는 혈장 유래의 VWF 제제가 기술되어 있다. 그러나, 혈장 유래의 VWF와 관련된 양 및 순도 문제 이외에도, 혈액 매개 병원체 (예컨대, 바이러스) 및 변이체 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD)의 위험 또한 존재한다. 추가로, VWF는 스트레스 조건하에서 응집체를 형성하는 것으로 공지되어 있다.

따라서, 당업계에서는 재조합 VWF를 포함하는 안정한 제약 제제의 개발을 필요로 하고 있다.

발명의 요약

본 발명은 고도로 안정한 제약 조성물을 생성할 수 있는, 재조합 VWF의 동결건조에 유용한 제제를 제공한다. 안정한 제약 조성물은 재조합 VWF 투여가 도움이 될 수 있는 질병 또는 병증을 앓는 개체의 치료에서 치료제로서 유용하다.

한 실시양태에서, (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하되; 상기 rVWF는 a) 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열; b) 생물학적 활성인 a)의 유사체, 단편, 또는 변이체; c) 서열 1에 기재되어 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드; d) 생물학적 활성인 c)의 유사체, 단편, 또는 변이체; 및 e) 적절히 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1에 기재되어 있는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것이며; 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 500 mM 범위의 pH 완충제를 포함하고 있고, pH 범위는 약 2.0 내지 약 12.0이고; 아미노산 농도는 약 1 내지 약 500 mM이며; 안정화제 농도는 약 0.1 내지 약 1000 mM이고; 계면활성제 농도는 약 0.01 g/L 내지 약 0.5 g/L인, 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, rVWF는 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 시트레이트, 글리신, 히스티딘, HEPES, 트리스(Tris) 및 이들 제제의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 시트레이트이다. 다양한 실시양태에서, pH 범위는 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 또는 약 7.3이다. 또 다른 실시양태에서, pH 는 약 7.3이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 언급한 아미노산은 글리신, 히스티딘, 프롤린, 세린, 알라닌 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 농도는 약 0.5 mM 내지 약 300 mM이다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산은 농도가 약 15 mM인 글리신이다.

본 발명의 한 실시양태에서, rVWF는 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열이고; 완충제는 시트레이트이고, pH는 약 7.3이며; 여기서, 아미노산은 농도가 약 15 mM인 글리신이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 언급한 하나 이상의 안정화제는 만니톨, 락토스, 소르비톨, 크실리톨, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프럭토스 및 이들 안정화제의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 안정화제는 농도가 약 10 g/L mM인 트레할로스, 및 농도가 약 20 g/L인 만니톨이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 언급한 계면활성제는 디기토닌, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 트윈(TWEEN)-20, 트윈-80 및 이들 계면활성제의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.01 g/L의 트윈-80이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, rVWF는 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열이고; 완충제는 pH 약 7.3의, 농도가 약 15 mM인 시트레이트이고; 아미노산은 농도가 약 15 mM인 글리신이고; 안정화제는 농도가 약 10 g/L인 트레할로스, 및 농도가 약 20 g/L인 만니톨이고; 계면활성제는 약 0.1 g/L의 트윈-80이다.

도 1은 (5℃±3℃에서 저장함으로써) 안정성에 대하여 평가가 이루어진 로트에서의 풀링된 VWF:RCo 활성에 관한 ANCOVA 분석을 나타낸다.
도 2는 5℃±3℃에서 저장된 rVWF FDP의 잔류 함수율 증가를 나타낸다.
도 3은 40℃±2℃에서 저장된 rVWF FDP의 잔류 함수율 증가를 나타낸다.

용어의 정의

달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 숙련인에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 하기 참고문헌들은 당업자에게 본 발명에 사용된 많은 용어들의 일반적인 정의를 제공한다: 문헌 [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994)]; [THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988)]; [THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].

본원에 인용된 각 공개공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 본 개시내용과 상반되지 않는 범위에서 그 전문이 참고로 포함된다.

본원에서 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수 형태 "하나", "한" 및 "그"라는 것은 내용이 명확하게 달리 규정되지 않는 한, 복수의 참조를 포함한다는 것에 주의한다.

본원에서 사용되는 하기의 용어들은 달리 명시되지 않은 한, 그들에게 주어진 의미를 갖는다.

펩티드 화합물과 관련하여 "포함하는"이라는 용어는 화합물이 주어진 서열의 아미노 및 카르복시 말단 중 하나 또는 둘 모두에 추가의 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 물론, 이들 추가적인 아미노산은 본 화합물의 활성을 현저하게 방해해서는 안된다. 본 발명의 조성물과 관련하여 "포함하는"이라는 용어는 조성물이 추가의 성분을 포함할 수 있음을 의미한다. 이들 추가적인 성분은 조성물의 활성을 현저하게 방해해서는 안된다.

"약리적으로 활성인"이라는 용어는 그렇게 기술된 물질이 의학적 파라미터 (예컨대, 비제한적으로, 혈압, 혈구수, 콜레스테롤 수치) 또는 질환 상태 (예컨대, 비제한적으로 암, 자기면역 장애)에 영향을 주는 활성을 가지는 것으로 측정됨을 의미한다.

본원에서 사용되는 "발현된다", "발현되는" 및 "발현"이라는 용어는 유전자 또는 DNA 서열 내의 정보가 드러날 수 있도록 허용하거나, 유도하는 것, 예를 들어, 상응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역에 관여하는 세포 기능을 활성화시킴으로써 단백질을 생산하는 것을 의미한다. DNA 서열은 세포 내에서 또는 세포에 의해서 발현되어 "발현 생성물," 예컨대, 단백질을 형성한다. 발현 생성물 자체, 예컨대, 생성된 단백질 또한 "발현되었다"고 언급할 수 있다. 발현 생성물은 세포내인 것, 세포외인 것 또는 분비된 것을 특징으로 할 수 있다. "세포내"라는 용어는 세포 내부에 있음을 의미한다. "세포외"라는 용어는 예컨대, 막통과 단백질과 같이 세포 외부에 있음을 의미한다. 물질은 그것이 세포 바깥에서 현저한 양으로 나타난다면, 세포에 의해 세포의 표면이나 내부의 어딘가로부터 "분비된" 것이다.

본원에서 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기, 그의 구조적 변이체, 관련된 천연적으로 발생된 구조적 변이체 및 합성 비천연적으로 발생된 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어, 자동화된 폴리펩티드 합성기를 사용해 제조할 수 있다. "단백질"이라는 용어는 전형적으로 큰 폴리펩티드를 지칭한다. "펩티드"라는 용어는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용되는 폴리펩티드의 "단편"은 전장의 폴리펩티드 또는 단백질 발현 생성물보다 작은 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 부분을 지칭함을 의도한다.

본원에서 사용되는 "유사체"는 분자 전체에 대해 또는 그의 단편에 대해, 구조상 실질적으로 유사하고 생물학적 활성이 유사하지만, 다양한 활성도를 가질 수 있는 임의의 2 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 유사체는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산을 대신하는 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 비롯한, 하나 이상의 아미노산의 돌연변이에 기초하여 그의 아미노산 서열 조성이 상이하다. 치환은 대체되는 아미노산 및 그를 대체하는 아미노산의 물리화학적 또는 기능적 관련성에 기초해 보전적 또는 비보전적 치환일 수 있다.

본원에서 사용되는 "변이체"는 정상적으로 분자의 일부분이 아닌 추가의 화학적 부분(moiety)을 포함하도록 변형된 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 유사체를 지칭한다. 그러한 부분은 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 변화시킬 수 있다. 별법으로, 그러한 부분은 분자의 독성을 감소시키고 분자의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시키는 등을 할 수 있다. 그러한 효과를 매개하게 할 수 있는 부분들은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)]에 개시되어 있다. 그러한 부분을 분자에 커플링시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 비제한적으로 한 측면에서 변이체는 단백질에 더 긴 생체내 반감기를 부여하는 화학적 변형을 갖는 혈액 응고 인자일 수 있다. 다양한 측면에서, 폴리펩티드는 글리코실화, 페길화 및/또는 폴리시알릴화에 의해 변형된다.

재조합 VWF

프리프로-VWF의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 1 및 서열 2에 기재되어 있고, 각각 진뱅크 수탁 번호(GenBank Accession No.) NM_000552 및 NP_000543으로 이용가능하다. 성숙한 VWF 단백질에 상응하는 아미노산 서열은 서열 3 (이는 전장의 프리프로-VWF 아미노산 서열의 아미노산 764-2813에 상응한다)에 기재되어 있다.

유용한 rVWF의 한 형태는 적어도, 적어도 하나의 인자 VIII (FVIII) 분자의 생체내 안정화, 예를 들어, 결합이라는 특성을 갖고, 임의로는 약리학상 허용되는 글리코실화 패턴을 갖는다. 그의 구체적인 예로는 A2 도메인을 갖지 않음으로써 단백질분해에 대해 내성을 띠는 VWF (문헌 [Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997]) 및 콜라겐 및 헤파린에 대한 결합 부위 및 당단백질 1b-결합 도메인을 포함하는 Val 449에서부터 Asn 730까지의 VWF 단편 (문헌 [Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989])을 포함한다. 한 측면에서, 적어도 하나의 FVIII 분자를 안정화시킬 수 있는 VWF의 능력을 측정하는 것은 당업계에 공지되어 있는 현 방법에 따라 VWF-결핍 포유동물에서 수행될 수 있다.

본 발명의 rVWF는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 재조합 VWF를 제조하는 방법과 관련된 한 구체적인 예는 1986년 10월 23일 공개된 WO86/06096 및 1990년 7월 23일 출원된 미국 특허 출원 번호 제07/559,509호에 개시되어 있고, 이들 문헌은 본원에서 참고로 포함된다. 그에 따라 (i) 유전 공학에 의한, 예컨대, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통한 재조합 DNA의 생산, (ii) 형질감염에 의한, 예컨대, 전기천공 또는 미세주입을 통한 재조합 DNA의 원핵 또는 진핵 세포로의 도입, (iii) 상기 형질전환된 세포를 예컨대, 연속적으로 또는 배치식 방식으로 배양, (iv) VWF를 예컨대, 구조적으로 또는 유도에 의해 발현, 및 (v) 상기 VWF를 예컨대, 배양 배지로부터 단리 또는 형질전환된 세포를 수확하여 (vi) 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 rVWF를 수득하는 것에 대한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 한 측면에서, 당업계에 주지된 재조합 DNA 기법을 사용하여 형질전환된 숙주 세포 내에서 재조합 VWF를 생산할 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 적합한 제한 효소를 사용하여 DNA로부터 절제할 수 있다. 별법으로, 화학적 합성 기법, 예컨대, 포스포르아미데이트법을 사용하여 DNA 분자를 합성할 수 있다. 또한, 또 다른 측면에서, 이들 기법의 조합도 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 적절한 숙주 내에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 제공한다. 벡터는 적절한 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 벡터 내로 삽입하기기 이전 또는 이후에 상기와 같이 작동적으로 연결시키는 방법은 주지되어 있다. 발현 제어 서열은 프로모터, 활성인자, 인핸서, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 출발 신호, 종결 신호, 캡 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 전사 또는 번역을 제어하는 데 관여하는 다른 신호를 포함한다. 그 안에 폴리뉴클레오티드를 갖는 생성된 벡터는 적절한 숙주를 형질전환시키는 데 사용된다. 당업계에 주지된 방법을 사용하여 이러한 형질 전환을 수행할 수 있다.

이용가능하고 주지된 수많은 숙주 세포 중 임의의 것이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 특정한 숙주를 선택하는 것은 예를 들어, 선택된 발현 벡터와의 화합성, DNA 분자에 의해 코딩되는 펩티드의 독성, 형질전환 속도, 펩티드 회수의 용이성, 발현 특징, 생체 안전성 및 비용을 비롯한, 당업계에서 인식되는 많은 인자들에 따라 달라진다. 모든 숙주 세포가 특정 DNA 서열의 발현에 동일하게 효과적이지는 않다는 것에 관한 이해와 함께 이들 인자들의 균형이 맞춰져야 한다. 이러한 일반적인 가이드라인 내에서, 유용한 미생물 숙주 세포는 제한없이, 세균, 효모 및 다른 진균, 곤충, 식물, 배양 중의 포유동물 (인간 포함) 세포 또는 당업계에 공지된 다른 숙주를 포함한다.

원하는 화합물이 발현될 수 있도록 하는 종래 발현 조건하에서 형질전환된 숙주를 배양한다. 그러한 발효 조건은 당업계에 주지되어 있다. 최종적으로, 당업계에 주지된 방법에 의해 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 그 자체로부터 폴리펩티드를 정제한다.

본 발명의 화합물을 발현하는데 사용되는 숙주 세포에 따라, 단백질 내의 글리코실화 부위로 알려진 부위에 당질 (올리고당) 기를 임의로 부착시킬 수 있다. 일반적으로, O-연결된 올리고당 및 N-연결된 올리고당이 서열 Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다)의 일부일 때, O-연결된 올리고당은 세린 (Ser) 또는 트레오닌 (Thr) 잔기에 부착되는 반면, N-연결된 올리고당은 아스파라긴(Asn) 잔기에 부착된다. X는 바람직하게 프롤린을 제외한 19개의 천연적으로 발생된 아미노산 중 하나이다. N-연결된 및 O-연결된 올리고당 및 각 유형에서 발견되는 당 잔기의 구조는 상이하다. N-연결된 및 O-연결된 올리고당, 이둘 모두에서 공통적으로 발견되는 당의 한 유형은 N-아세틸뉴라민산 (시알산으로 지칭된다)이다. 시알산은 보통 N-연결된 및 O-연결된 올리고당, 이둘 모두의 말단 잔기이고, 한 측면에서는, 그의 음전하에 의해 글리코실화된 화합물에 산성의 특성을 부여할 수 있다. 그러한 부위(들)는 본 발명의 화합물의 링커에 도입될 수 있고, 바람직하게는 폴리펩티드 화합물이 (포유동물 세포, 예컨대, CHO, BHK, COS에서) 재조합적으로 생산되는 동안 글리코실화된다. 다른 측면에서, 그러한 부위는 당업계에 공지된 합성 또는 반합성 방법에 의해 글리코실화될 수 있다.

별법으로, 화합물은 예를 들어, 고체상 합성 기법과 같은 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 적합한 기법은 당업계에 주지되어 있고, 이는 문헌 ([Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.)]; [Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149]; [Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414]; [Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis]; 미국 특허 번호 제3,941,763호; [Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253]; 및 [Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527])에 기재되어 있는 방법을 포함한다. 고체상 합성의 경우, 이는 소형 펩티드를 제조하는 데 있어 비용면에서 가장 효율적인 방법이기 때문에 개개의 펩티드를 제조하는 데 있어 바람직한 기법이다.

VWF의 단편, 변이체 및 유사체

폴리펩티드의 단편, 변이체 또는 유사체를 제조하는 방법은 당업계에 주지되어 있다.

폴리펩티드의 단편은 제한 없이, 효소 (예컨대, 트립신, 키모트립신)적 절단을 사용하고 재조합 수단 또한 사용함으로써 특정한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 단편을 생성함으로써 제조된다. 폴리펩티드 단편은 특정한 활성을 갖는 단백질 영역, 예컨대, 다량체화 도메인 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 식별가능한 VWF 도메인을 포함하도록 생성될 수 있다.

폴리펩티드 유사체를 제조하는 방법 또한 주지되어 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 유사체는 치환형, 삽입형, 부가형 또는 결실형 유사체일 수 있다. 폴리펩티드의 단편을 포함하는 결실형 유사체에는 본래의 단백질 중, 기능 또는 면역 활성에 필수적이지 않은 하나 이상의 잔기가 포함되어 있지 않다. 삽입형 유사체는 폴리펩티드의 비-말단 지점에 예컨대, 아미노산(들)이 부가되어 있는 것을 포함한다. 이러한 유사체는 예를 들어, 제한없이, 면역반응성 에피토프 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 단편을 포함한 부가형 유사체는 단백질의 말단들 중 하나 또는 둘 모두에 하나 이상의 아미노산이 부가되어 있는 것을 포함하여, 예를 들어, 융합 단백질을 포함한다. 상기 언급한 유사체의 조합 또한 고려된다.

치환형 유사체에서는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 야생형의 한 아미노산이 또 다른 것으로 교환되며, 다른 기능 또는 특성이 손실되지 않고 폴리펩티드의 하나 이상의 특성이 조정될 수 있도록 디자인될 수 있다. 한 측면에서, 치환은 보존형 치환이다. "보존형 아미노산 치환"은 유사한 화학적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산으로의 아미노산의 치환을 의미한다. 보존형 치환을 만들기 위한 유사한 아미노산은 산성 측쇄 (글루탐산, 아스파르트산); 염기성 측쇄 (아르기닌, 리신, 히스티딘); 극성 아미드 측쇄 (글루타민, 아스파라긴); 소수성, 지방족 측쇄 (류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 글리신); 방향족 측쇄 (페닐알라닌, 트립토판, 티로신); 작은 측쇄 (글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌); 또는 지방족 히드록실 측쇄 (세린, 트레오닌)를 갖는 것들을 포함한다.

한 측면에서, 유사체는 그들이 유도된 재조합 VWF와 실질적으로 상동성이거나, 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 유사체는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예컨대, 혈액 응고 활성의 적어도 일부를 보유하는 것을 포함한다.

고려되는 폴리펩티드 변이체로는 제한없이, 유비퀴틴화, 폴리시알릴화를 비롯한 글리코실화, 치료 또는 진단용 제제에의 결합, 표지, 페길화 (폴리에틸렌 글리콜으로의 유도체화)와 같은 공유 중합체 부착, 가수분해가 불가능한 결합의 도입, 및 오르니틴과 같이 인간 단백질에서 정상적으로 나타나지 않는 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기법에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 본 발명의 비변형된 분자의 결합 성질과 동일한 또는 본질적으로 동일한 성질을 보유한다. 그러한 화학적 변형은 제제를 VWF 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 (예컨대, 링커를 통해) 부착하는 것을 포함할 수 있다. 간접 부착의 경우, 링커는 가수분해 가능한 것이거나, 또는 가수분해가 불가능한 것일 수 있다고 사료된다.

한 측면에서, 페길화된 폴리펩티드 유사체를 제조하는 것은 (a) 결합 구조체 폴리펩티드가 하나 이상의 PEG 기에 부착될 수 있도록 하는 조건하에서 폴리펩티드를 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응시키는 단계 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건은 공지된 파라미터 및 바람직한 결과에 기초해 결정될 것이다. 예를 들어, PEG:단백질의 비가 크면 클수록 폴리-페길화된 생성물의 비율이 커진다. 일부 실시양태에서, 결합 구조체는 N-말단에 단일 PEG 부분을 가질 것이다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 혈액 응고 인자에 부착됨으로써, 예를 들면, 더욱 장기간의 생체내 반감기를 제공할 수 있다. PEG 기는 임의의 알맞은 분자량일 수 있고 선형 또는 분지형일 수 있다. PEG의 평균 분자량 범위는 약 2 킬로달튼 ("kD") 내지 약 100 kDa, 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa이다. 특정 측면에서, PEG 기는 PEG 부분 상의 천연 또는 가공처리된 반응기 (예컨대, 알데히드, 아미노, 티올 또는 에스테르 기)를 통한 혈액 응고 인자 상의 반응기 (예컨대, 알데히드, 아미노 또는 에스테르 기)에의 아실화 또는 환원성 알킬화를 통해 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 기술에 의해 혈액 응고 인자에 부착된다.

폴리시알릴화된 폴리펩티드를 제조하는 방법은 문헌 (미국 특허 공보 20060160948, [Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341:26-34, 1997] 및 [Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006])에 기재되어 있다. 간략하면, 0.1 M NaIO4를 함유하는 콜로민산 (CA) 용액을 암실 실온에서 교반하여 CA를 산화시킨다. 활성화된 CA 용액을 암실에서 예컨대, 0.05 M 인산 나트륨 완충액 (pH 7.2)에 대해 투석하고, 이 용액을 rVWF 용액에 첨가하고, 완만하게 진탕시키면서 18h 동안 암실 실온에서 인큐베이션시켰다. 임의로, 예를 들어, 한외여과/투석여과에 의해 rVWF-폴리시알산 접합체로부터 유리 시약을 분리할 수 있다. 가교제로서 글루타르알데히드를 사용하여 rVWF를 폴리시알산과 접합시킨다 (문헌 [Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004]).

추가로, 또 다른 측면에서는 본 발명의 폴리펩티드가, 폴리펩티드인 제2 제제와 융합된 융합 단백질인 것으로 사료된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드인 제2 제제는, 제한없이, 효소, 성장 인자, 항체, 사이토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체, 세포 표면 수용체의 세포외 도메인, 세포 부착 분자 또는 상기 기술된 단백질의 단편 또는 활성 도메인이다. 관련된 실시양태에서, 제2 제제는 혈액 응고 인자, 예컨대, 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX이다. 고려되는 융합 단백질은 당업계에 주지된 화학적 또는 재조합 기법에 의해 제조된다.

또한, 또 다른 측면에서, 프리프로-VWF 및 프로-VWF 폴리펩티드가 본 발명의 제제 내에서 치료적 이점을 제공할 수 있을 것으로 사료된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,005,502호에는 시험관내 트롬빈 생성을 유도하는 프로-VWF를 상당량 포함하는 제약 제제가 기술되어 있다. 천연적으로 발생된 성숙 VWF의 재조합, 생물학적 활성인 단편, 변이체 또는 다른 유사체 이외에도, 본 발명은 본원에 기술되어 있는 제제 중의 프리프로-VWF (서열 2에 기재) 또는 프로-VWF 폴리펩티드 (서열 2의 아미노산 잔기 23 내지 764)의 재조합 생물학적 활성인 단편, 변이체 또는 유사체의 용도도 고려한다.

단편, 변이체 및 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당업자에 의해 쉽게 천연적으로 발생된 분자와 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 천연적으로 발생된 분자의 생물학적 활성인 단편, 변이체 또는 유사체를 코딩하도록 생성될 수 있다. 다양한 측면에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 PCR 기법, DNA 코딩 분자의 분해/결찰 등을 사용해 제조된다. 따라서, 당업자는 부위-특이적 돌연변이유발법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 DNA 스트랜드에 단일 염기 변이를 생성함으로써 코돈을 변경시키고 미스센스 돌연변이를 일으킬 수 있을 것이다. 본원에서 사용되는 어구 "적절히 엄격한 혼성화 조건"은 예를 들어, 42℃에서 50%의 포름아미드 중에서 혼성화시키고, 60℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS 중에서 세척하는 것을 의미한다. 혼성화될 서열의 길이 및 GC 뉴클레오티드 염기 함량에 기초하여 상기 조건이 변경될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 정확한 혼성화 조건을 결정하기 위해서는 당업계의 표준 공식들이 적절하다. 문헌 [Sambrook et al., 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]을 참조한다.

동결건조

한 측면에서, 본 발명의 VWF 폴리펩티드를 포함하는 제제를 투여 전 동결건조시킨다. 동결건조는 당업계의 일반적인 기법을 사용함으로써 수행되고, 개발되는 조성물에 최적화되어야 한다 (문헌 [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004)] 및 문헌 [Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)]).

한 측면에서, 동결건조 주기는 3 단계로 구성된다: 냉동, 1차 건조 및 2차 건조 (문헌 [A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]). 냉동 단계에서, 용액을 냉각시켜 얼음 형성이 개시될 수 있도록 한다. 추가로, 상기 단계는 벌크화제의 결정화를 유도한다. 1차 건조 단계에서 얼음이 승화되는데, 이는 진공을 이용해 챔버 압력을 얼음의 증기압 아래로 강하시키고 열을 가해 승화를 촉진시킴으로써 수행된다. 최종적으로, 2차 건조 단계에서 강하된 챔버 압력 및 증가된 저장 온도하에서 흡착되거나 결합된 물을 제거한다. 본 공정을 통해 동결건조된 케이크로 알려진 물질이 생산된다. 이후, 주입을 위해 케이크를 멸균수 또는 적절한 희석제로 재구성할 수 있다.

동결건조 주기는 부형제의 최종적인 물리적 상태를 결정할 뿐만 아니라, 다른 파라미터, 예컨대, 재구성 시간, 외형, 안정성 및 최종 수분 함량에도 영향을 준다. 냉동 상태의 조성물 구조는 특정한 온도에서 일어나는 몇 번의 전이 (예컨대, 유리 전이, 습윤 및 결정화)를 겪게 되고, 상기 구조를 사용함으로써 동결건조 공정을 이해하고 최적화시킬 수 있다. 유리 전이 온도 (Tg 및/또는 Tg')는 용질의 물리적 상태에 관한 정보를 제공할 수 있고, 시차 주사 열량법 (DSC)으로 측정될 수 있다. Tg 및 Tg'는 동결건조 주기를 디자인할 때 반드시 고려되어야 하는 중요한 파라미터이다. 예를 들어, Tg'는 1차 건조에 중요하다. 추가로, 건조된 상태에서, 유리 전이 온도는 최종 제품의 저장 온도에 관한 정보를 제공한다.

일반적인 제제 및 부형제

부형제는 약물 제품 (예컨대, 단백질)의 안정성 및 전달을 전달하거나 증진시키는 첨가제이다. 부형제를 포함하는 이유와는 상관없이, 부형제는 제제의 절대 필요한 성분이며, 그에 따라 안전해야 하며 환자에게 우수하게 용인되어야 한다. 단백질 약물의 경우, 부형제가 약물의 효능 및 면역원성, 둘 모두에 영향을 줄 수 있기 때문에 부형제를 선택하는 것은 특히 중요하다. 따라서, 단백질 제제는 적합한 안정성, 안전성 및 시장성을 제공하는 부형제를 적절히 선택하여 개발되어야 한다.

한 측면에서, 동결건조된 제제는 적어도, 완충액, 벌크화제, 및 안정화제 중 하나 이상으로 구성된다. 이러한 측면에서, 동결건조 단계 동안, 또는 재구성시에 응집이 문제가 될 경우에 계면활성제의 유용성이 평가되며, 선택되게 된다. 동결건조시에 안정한 pH 영역 내에서 제제가 유지될 수 있도록 하기 위해 적절한 완충제를 포함한다. 액체 및 동결건조된 단백질 제제에 대해 고려되는 부형제 성분에 관한 비교 내용을 하기 표 A에서 제공한다.

<표 A>

치료 단백질용 제제를 개발하는데 주요한 도전 과제는 제품을 제조, 운송 및 저장의 스트레스에 대해 안정화시키는 것이다. 제제 부형제의 역할은 이러한 스트레스에 대해 안정화시키는 것이다. 부형제는 또한 단백질 제제가 전달될 수 있도록 하고, 환자의 편의를 강화하기 위해 고농도 단백질 제제의 점도를 감소시키기 위해 사용될 수도 있다. 일반적으로, 부형제는 그가 다양한 화학적 및 물리적 스트레스에 대해 단백질을 안정화하는 기전에 기초하여 분류될 수 있다. 일부 부형제는 특정한 스트레스의 효과를 경감시키기 위해 또는 특정한 단백질의 특정 감수성을 규제하기 위해 사용된다. 다른 부형제는 단백질의 물리적 및 공유 안정성에 대해 더 많은 일반적인 효과를 발휘한다. 본원에 기술된 부형제는 그의 화학적 유형 또는 제제 내에서의 그의 기능적 역할에 의해 체계화된다. 각 부형제 유형에 대해 논의할 때 안정화 방식에 관한 간단한 설명을 제공한다.

본원에서 제공된 교시 및 가이던스가 주어지면, 당업자는 생물제약 (예컨대, 단백질)의 안정성의 유지를 촉진시키는 본 발명의 생물제약 제제를 얻기 위해 임의의 특정한 제제 내에 어떤 양 또는 범위의 부형제가 포함될 수 있는지 알 것이다. 예를 들어, 본 발명의 생물제약 제제에 포함되는 염의 양 및 유형은 최종 용액의 바람직한 오스몰 농도 (즉, 등장성, 저장성 또는 고장성)와 제제 내에 포함되는 다른 성분의 양 및 오스몰 농도에 기초하여 선택될 수 있다.

일례로, 등장성을 달성하기 위해서는 약 9%의 수크로스 부형제가 필요한 반면, 약 5%의 소르비톨을 포함할 경우에도 등장성을 달성할 수 있다. 본 발명의 생물제약 제제 내에 포함될 수 있는 하나 이상의 부형제의 양 또는 농도 범위를 선택하는 것은 염, 폴리올 및 당과 관련하여 상기에 예시되어 있다. 그러나, 본원에 기술되어 있고, 특정한 부형제를 참고로 하여 추가로 예시된 고려 사항들이 예를 들어, 염, 아미노산, 다른 등장화제, 계면활성제, 안정제, 벌크화제, 냉동보호제, 동결건조보호제, 항산화제, 금속 이온, 킬레이트제 및/또는 보존제를 포함하는 부형제들의 모든 유형 및 조합에 동일하게 적용가능하다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

추가로, 특정한 부형제가 몰 농도로 보고된 경우, 당업자는 용액의 등가의 백분율 (%) w/v (예컨대, (용액 샘플 내의 물질의 g 수/용액의 mL) X 100%) 또한 고려됨을 알 것이다.

물론, 당업계의 숙련인은 본원에 기술된 부형제의 농도들이 특정한 제제 내에서 상호 의존성을 공유한다는 것을 이해할 것이다. 일례로, 예컨대, 단백질 농도가 높은 경우 또는 예컨대 안정화제 농도가 높은 경우 벌크화제 농도는 낮아질 수 있다. 추가로, 당업계의 숙련인은 벌크화제가 없는 특정한 제제의 등장성을 유지하기 위해서는, 안정화제의 농도가 적절히 조절될 수 있음 (즉, "등장화" 양의 안정화제가 사용될 수 있음)을 알 것이다. 통상적인 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311]에서 살펴볼 수 있다.

완충액 및 완충제

약리학상 활성인 단백질 제제의 안정성은 보통 좁은 pH 범위 내에서 최대인 것으로 관찰된다. 최적의 안정성을 보이는 이러한 pH 범위는 사전-제제 연구 중 조기에 확인되어야 한다. 몇몇 접근법, 예컨대, 가속화된 안정성 연구 및 열량 측정 스크리닝 연구가 이 시도에 유용하다 (문헌 [Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)]). 일단 제제가 완성되면, 단백질은 그의 저장 기간 동안에 걸쳐 제조되고 유지되어야 한다. 따라서, 제제의 pH를 조절하기 위해 완충제가 거의 항상 사용된다.

완충액 종의 완충 용량은 pKa와 동일한 pH에서 최대이고, pH가 증가함에 따라 감소하거나 이 값으로부터 멀어질 때 감소한다. 완충 용량의 90%가 그의 pKa의 1 pH 단위 내에 존재한다. 완충 용량은 또한 증가하는 완충액 농도와 비례해 증가한다.

완충액을 선택할 시에는 몇몇 요소들을 고려하여야 한다. 우선, 완충액 종 및 그의 농도를 그의 pKa 및 바람직한 제제 pH에 기초해 한정하여야 한다. 완충액이 단백질 및 다른 제제 부형제와 혼화될 수 있으며, 임의의 분해 반응을 촉매하지 않는지 분명히 하는 것도 동일하게 중요하다. 고려되는 세번째 중요한 측면은 완충액 투여시 유발될 수 있는 따가운 느낌 및 자극이다. 예를 들어, 시트레이트는 주사시 따가운 고통을 유발하는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006))]). 찌르는 고통 및 자극의 가능성은, 투여시 제제가 빠르게 혈액 내로 희석되는 IV 경로에 의해 투여될 때보다 상대적으로 더욱 장기간 동안 약물 용액이 그 부위에 남아있는 것인 피하 (SC) 또는 근육내 (IM) 경로를 통해 투여되는 약물의 경우에 더 크다. 직접적인 IV 주입에 의해 투여되는 제제의 경우, 완충액 (및 임의의 다른 제제 성분)의 총 량은 모니터링되어야 한다. 칼륨 이온은 환자에게 심혈관계 효과를 유발할 수 있는 바, 인산 칼륨 완충액의 형태로 투여되는 칼륨 이온에 대해 특히 유의해야 한다 (문헌 [Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam . Physician., 73(2): 283-90 (2006)]).

동결건조된 제제용의 완충액은 추가의 고려 사항을 필요로 한다. 인산나트륨과 같은 일부 완충액은 냉동시에 단백질 무정형 상으로부터 결정화됨으로써 pH를 변동시킬 수 있다. 다른 일반 완충액, 예컨대, 아세테이트 및 이미다졸은 동결건조 공정시에 승화 또는 기화됨으로써 동결건조시에 또는 재구성 이후에 제제의 pH를 변동시킬 수 있다.

본 조성물 중에 존재하는 완충액 시스템은 생리학상 화합성이고 제약 제제의 바람직한 pH를 유지할 수 있도록 선택된다. 한 실시양태에서, 용액의 pH는 pH 2.0 내지 pH 12.0이다. 예를 들어, 용액의 pH는 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7, 또는 12.0일 수 있다.

pH 완충 화합물은 제제의 pH를 소정의 수준으로 유지하는데 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, pH 완충 농도는 0.1 mM 내지 500 mM (1 M)이다. 예를 들어, pH 완충제는 적어도 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 또는 500 mM인 것으로 사료된다.

본원에서 기술된 바와 같은 제제를 완충시키기 위해 사용되는 예시적인 pH 완충제로는 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스, HEPES, 및 아미노산, 또는 아스파테이트, 히스티딘 및 글리신을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아미노산의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 완충제는 시트레이트이다.

안정화제 및 벌크화제

본 제약 제제의 한 측면에서, 저장으로 인해 유발된 응집 및 화학적 분해를 방지 또는 감소시키기 위해 안정화제 (또는 안정화제들의 조합물)를 첨가할 수 있다. 재구성시 흐리거나 혼탁한 용액은 단백질이 침전되었거나 또는 적어도 응집되었음을 나타낸다. "안정화제"라는 용어는 수용액 상태에서 응집, 또는 화학적 분해 (예컨대, 자기분해, 탈아미드화, 산화 등)를 비롯한 다른 물리적 분해를 방지할 수 있는 부형제를 의미한다. 고려되는 안정화제로는 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프럭토스, 만니톨, 소르비톨, 글리신, 아르기닌 HCL, 다당류, 예컨대, 덱스트란, 전분, 히드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, N-메틸 피롤리덴, 셀룰로스 및 히알루론산을 비롯한 폴리-히드록시 화합물, 염화나트륨을 포함하나, 이에 한정되지 않는다 (문헌 [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]). 본 제제에서, 안정화제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, 또는 1000 mM의 농도로 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 만니톨 및 트레할로스가 안정화제로서 사용된다.

원하는 경우, 제제는 또한 적절한 양의 벌크화제 및 오스몰 농도 조절제를 포함할 수 있다. 벌크화제는 예를 들어 제한없이, 만니톨, 글리신, 수크로스, 중합체, 예컨대, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스, 락토스, 소르비톨, 트레할로스 또는 크실리톨을 포함한다. 한 실시양태에서, 벌크화제는 만니톨이다. 벌크화제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, 또는 1000 mM의 농도로 포함된다.

계면활성제

단백질은 표면과 상호작용하는 경향이 높으며, 이를 통해 단백질은 기체-액체, 바이알-액체 및 액체-액체 (실리콘 기름) 계면에서 흡착 및 변성에 민감한 성향을 띠게 된다. 이러한 분해 경로는 단백질 농도에 역으로 의존하는 것으로 관찰되었으며, 가용성 및 불용성 단백질 응집체의 형성 또는 표면에의 흡착에 의한 용액으로부터의 단백질의 손실을 불러온다. 용기 표면 흡착 이외에도, 표면-유도성분해는 제품의 운송 및 취급 중 경험할 수 있는 바와 같이, 물리적 교반으로 악화된다.

표면-유도성 분해를 방지하기 위해 계면활성제가 통상적으로 단백질 제제에 사용된다. 계면활성제는 계면 부위에 대해 단백질을 이길 수 있는 능력을 가진 양친성 분자이다. 계면활성제 분자의 소수성 부분은 계면 부위 (예컨대, 기체/액체)를 차지하는 반면, 분자의 친수성 부분은 벌크 용매 쪽을 향해 배열된 상태로 남아있다. 충분한 농도에서 (전형적으로 세정제의 한계 미셀 농도 근처), 계면활성제 분자의 표면층은 단백질 분자가 계면에서 흡착되는 것을 방지하는 역할을 한다. 이로써 표면-유도성 분해가 최소화된다. 본원에서 고려되는 계면활성제로는 제한없이, 소르비탄 폴리에톡실레이트의 지방산 에스테르, 즉, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80이다. 이 둘은 각각 C-12 및 C-18인, 분자에 소수성 특징을 부여하는 지방족 쇄의 길이에 있어서만 차이를 보인다. 따라서, 폴리소르베이트 80이 폴리소르베이트 20보다 더 표면-활성적이고 더 낮은 한계 미셀 농도를 갖는다.

세정제는 또한 단백질의 열역학적 입체형태 안정성에 영향을 줄 수 있다. 또한, 주어진 세정제 부형제의 효과는 단백질 특이적일 것이다. 예를 들어, 폴리소르베이트는 일부 단백질의 안정성을 감소시키고, 다른 것들의 안정성은 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 단백질의 세정제 불안정화는 부분적으로 또는 완전히 언폴딩된 단백질 상태와 특이적 결합을 할 수 있는 세정제 분자의 소수성 꼬리로 설명될 수 있다. 이러한 유형의 상호작용은 입체형태 평형이 더 확장된 단백질 상태로 이동할 수 있도록 한다 (즉, 결합하는 폴리소르베이트를 보완하여 단백질 분자의 소수성 부분의 노출을 증가시킨다). 별법으로, 단백질의 원 상태가 일부 소수성 표면을 보이는 경우, 원 상태에 결합하는 세정제는 그 입체형태를 안정화시킬 수 있다.

폴리소르베이트의 또 다른 측면은 그들이 본질적으로 산화 분해에 민감하다는 것이다. 종종, 원료로서, 폴리소르베이트는 단백질 잔기 측쇄, 특히, 메티오닌의 산화를 야기하기에 충분한 양의 과산화물을 함유한다. 안정제의 첨가로 야기되는 산화적 손상의 가능성은 제제 중에서 가장 낮은 유효 농도의 부형제가 사용되어야 한다는 점을 강조한다. 계면활성제의 경우, 주어진 단백질에 대한 유효 농도는 안정화 기전에 의존할 것이다.

냉동 및 건조 중 표면과 관계된 응집 현상을 방지하기 위해 적절한 양의 계면활성제를 첨가할 수도 있다 (문헌 [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)]). 따라서, 예시적인 계면활성제로는 제한없이, 천연적으로 발생된 아미노산으로부터 유도된 계면활성제를 비롯한, 음이온성, 양이온성, 비이온성, 쯔비터 이온성 및 양쪽성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제로는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트, 키노데옥시콜린산, N-라우로일사르코신 나트륨 염, 리튬 도데실 술페이트, 1-옥탄술폰산 나트륨 염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트 및 글리코데옥시콜린산 나트륨 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 양이온성 계면활성제로는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 일수화물 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 쯔비터 이온 계면활성제로는 CHAPS, CHAPSO, SB3-10 및 SB3-12를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비이온성 계면활성제는 디기토닌, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈-20 및 트윈-80을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 계면활성제는 또한 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 40, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 대두 레시틴 및 다른 인지질, 예컨대, 디올레일 포스파티딜 콜린 (DOPC), 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 (DMPG), 디미리스토일포스파티딜 콜린 (DMPC) 및 (디올레일 포스파티딜 글리세롤) DOPG; 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복실메틸 셀룰로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 이러한 계면활성제를 포함하는 조성물은 개별적으로 또는 상이한 비율의 혼합물들로서 추가로 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 계면활성제는 트윈-80이다. 본 제제에서, 계면활성제는 약 0.01 내지 약 0.5 g/L의 농도로 포함된다. 제공하는 제제에서, 계면활성제 농도는 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 g/L이다.

염

단백질 용해도, 물리적 안정성 및 등장성에 중요한 것일 수 있는 제제의 이온 강도를 증가시키기 위해 종종 염이 첨가된다. 염은 다양한 방법으로 단백질의 물리적 안정성에 영향을 줄 수 있다. 이온은 단백질 표면 상의 하전된 잔기에의 결합에 의해 단백질의 원 상태를 안정화시킬 수 있다. 별법으로, 염은 단백질 골격 (-CONH-)에 따라 진행되는 펩티드 기에의 결합에 의해 변성된 상태를 안정화시킬 수 있다. 염은 또한 단백질 분자 내의 잔기 사이의 척력 정전기 상호작용을 차폐시킴으로써 단백질 원 입체형태를 안정화시킬 수 있다. 단백질 제제 내의 염은 또한 단백질 응집 및 불용성을 야기할 수 있는 단백질 분자들 사이의 인력 정전기 상호작용을 차폐할 수도 있다. 제공하는 제제에서, 염 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 및 500 mM 사이이다.

다른 일반적인 부형제 성분

아미노산

아미노산은 단백질 제제 중에서 완충액, 벌크화제, 안정제 및 항산화제로서다양한 용도를 갖는다. 따라서, 한 측면에서, 히스티딘 및 글루탐산은 각각 5.5-6.5 및 4.0-5.5의 pH 범위에서 단백질 제제를 완충처리하기 위해 사용된다. 히스티딘의 이미다졸 기는 pKa=6.0을 갖고, 글루탐산 측쇄의 카르복실 기는 pKa=4.3을 갖는데, 이를 통해 상기 아미노산은 그들 각각의 pH 범위에서 완충처리를 위한 것으로 적합화된다. 이와 같은 경우 글루탐산이 특히 유용하다. 히스티딘은 시판되는 단백질 제제에서 보편적으로 발견되며, 이 아미노산은 주입시 따갑다고 알려져 있는 완충액인 시트레이트에 대한 대체물로서 제공된다. 흥미롭게도, 히스티딘은 또한 액체 및 동결건조된 형태, 둘 모두에서 고농도로 사용될 때의 응집과 관련하여 안정화 효과도 갖는다고 보고되어 있다 (문헌 [Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)]). 히스티딘은 또한 고농도 단백질 제제의 점성을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 그러나, 동일한 연구에서 저자들은 스텐레스 강 용기 내에서의 항체의 냉동-해동 연구 중 히스티딘 함유 제제에서 응집 및 변색이 증가된 것으로 관찰되었다. 히스티딘의 또 다른 주의할 점은 히스티딘이 금속 이온의 존재하에서 광-산화된다는 점이다 (문헌 [Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)]). 제제 중 항산화제로서 메티오닌을 사용하는 것이 유망한 것으로 보인다; 이는 다수의 산화성 스트레스에 대해 효과적인 것으로 관찰되었다 (문헌 [Lam XM, et al., J Pharm Sci, 86(11): 1250-5 (1997)]).

다양한 측면에서, 우선 배제의 기전에 의해 단백질을 안정화시키는 것으로 밝혀진 아미노산 글리신, 프롤린, 세린, 아르기닌 및 알라닌 중 하나 이상을 포함하는 제제를 제공한다. 글리신은 또한 동결건조된 제제 중에서 통상적으로 사용되는 벌크화제이다. 아르기닌은 응집을 억제하는데 효과적인 제제인 것으로 밝혀졌으며, 액체 및 동결건조된 제제 둘 모두에서 사용되었다.

제공하는 제제에서, 아미노산 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, 및 500 mM 사이이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 아미노산은 글리신이다.

항산화제

단백질 잔기의 산화는 수많은 상이한 원인으로부터 일어난다. 특정한 항산화제를 첨가하는 것 이외에도, 산화성 단백질 손상을 방지하는 것은 제품의 제조 과정 및 저장 중 수많은 인자, 예컨대, 대기중 산소, 온도, 빛 노출 및 화학적 오염을 주의하여 제어하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명에서는 제한없이, 환원제, 산소/자유-라디칼 제거제 또는 킬레이트제를 비롯한, 제약용 항산화제를 사용하는 것이 고려된다. 한 측면에서, 치료학적 단백질 제제 중의 항산화제는 수용성이며, 제품 저장 기간 동안 활성이 유지된다. 환원제 및 산소/자유-라디칼 제거제는 용액 중의 활성 산소종을 제거함으로써 작용한다. 킬레이트제, 예컨대, EDTA는 자유 라디칼 형성을 촉진시키는 미량의 금속 오염 물질에 결합함으로써 효과를 발휘한다. 예를 들어, 시스테인 잔기의 금속 이온으로 촉매화되는 산화를 방지하기 위해 EDTA가 산성 섬유아세포 성장 인자의 액체 제제에서 사용되었다.

다양한 부형제의 단백질 산화를 방지하는 효능 이외에도, 항산화제 그 자체가 단백질에의 다른 공유 또는 물리적 변화를 유발할 수 있는 가능성도 관심의 대상이 된다. 예를 들어, 환원제는 분자내 이황화 결합을 파괴시킬 수 있으며, 이는 이황화 셔플링을 일으킬 수 있다. 전이 금속 이온의 존재하에서 아스코르브산 및 EDTA는 수많은 단백질 및 펩티드에서의 메티오닌 산화를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Akers MJ, and Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)]; [Fransson J.R., J. Pharm . Sci. 86(9): 4046-1050 (1997)]; [Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)]). 티오황산나트륨이 rhuMab HER2에서 빛 및 온도 유도성 메티오닌 산화의 수준을 감소시키는 것으로 보고된 바 있지만; 그러나, 본 연구에서는 티오황산-단백질 부가 생성물의 형성 또한 보고되었다 (문헌 [Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)]). 단백질의 특정한 스트레스 및 감도에 따라 적절한 항산화제를 선택한다. 특정 측면에서 고려되는 항산화제로는 제한없이, 환원제 및 산소/자유-라디칼 제거제, EDTA, 및 티오황산나트륨을 포함한다.

금속 이온

일반적으로, 전이 금속 이온은 단백질 내의 물리적 및 화학적 분해 반응을 촉매할 수 있기 때문에 단백질 제제에서는 바람직하지 않다. 그러나, 특정한 금속 이온은 그가 단백질에 대해 보조인자인 경우에는 제제 중에 포함되고, 그가 배위 착물을 형성하는 경우에는 단백질의 현탁액 제제 중에 포함된다 (예컨대, 인슐린의 아연 현탁액). 최근, 아스파르트산이 이소아스파르트산으로 이성질화되는 것을 억제시키기 위해 마그네슘 이온 (10-120 mM)을 사용하는 것이 제안되었다 (WO 2004039337).

금속 이온이 단백질에서 안정성을 부여하거나, 또는 활성을 증가시키는 2가지 예는 인간 데옥시리보뉴클레아제 (rhDNase, 풀모자임(Pulmozyme)®) 및 인자 VIII이다. rhDNase의 경우, Ca^{+ 2} 이온 (100 mM까지)은 특이적 결합 부위를 통해 효소의 안정성을 증가시켰다 (문헌 [Chen B, et al., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)]). 실제로, EGTA를 사용하여 용액으로부터 칼슘 이온을 제거하자 탈아미드화 및 응집은 증가하였다. 그러나, 이러한 효과는 Ca⁺² 이온에 대해서만 관찰되었고; 다른 2가 양이온 Mg⁺², Mn⁺² 및 Zn⁺²는 rhDNase를 불안정화시키는 것으로 관찰되었다. 인자 VIII에서 유사한 효과가 관찰되었다. Ca⁺² 및 Sr⁺² 이온은 단백질을 안정화시키는 반면, 다른 것들, 예컨대, Mg⁺², Mn⁺² 및 Zn⁺², Cu⁺² 및 Fe⁺²는 효소를 불안정화시켰다 (문헌 [Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997)]). 인자 VIII을 사용한 별도의 연구에서, Al^{+ 3} 이온 존재시 응집율이 현저히 증가한 것으로 관찰되었다 (문헌 [Derrick TS, et al., J. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)]). 저자들은 완충액 염과 같은 다른 부형제들이 종종 Al⁺³ 이온으로 오염된다는 것을 알았으며, 제조된 생성물 중 적절한 품질의 부형제가 사용되어야 한다고 설명했다.

보존제

동일 용기로부터의 1 초과의 추출을 포함하는 다회 사용 비경구 제제의 개발시 보존제가 필수적이다. 보존제의 주요한 역할은 약물 제품의 저장 기간 또는 사용 기간 동안 미생물 성장의 억제 및 제품 무균성의 보장이다. 보편적으로 사용되는 보존제로는 벤질 알콜, 페놀 및 m-크레졸을 포함한다. 보존제가 오랫동안 사용되어 왔지만, 보존제를 포함하는 단백질 제제의 개발은 도전 과제일 수 있다. 보존제는 거의 항상 단백질에 대해 불안정화 효과 (응집)를 가지고 있으며, 이는 다회 투약용 단백질 제제에서 그의 사용을 제한하는 중요한 인자가 되었다 (문헌 [Roy S, et al., J Pharm Sci., 94(2): 382-96 (2005)]).

현재까지, 대부분의 단백질 약물들은 1회용으로만 제제화되었다. 그러나, 다회 투약용 제제가 가능한 경우, 이는 환자의 편의를 도모하고, 시장성을 증가시킨다는 추가된 이점을 갖게 된다. 좋은 예는 보존형 제제의 개발이 더 편리한, 다회 투약용의 주사용 펜 형태의 상업화를 불러온 인간 성장 호르몬 (hGH)의 보존형 제제이다. 적어도 4개의, hGH의 보존형 제제를 함유하는 상기와 같은 펜 기기가 현재 시판되고 있다. 노르디트로핀(Norditropin)® (액체, 노보 노르디스크(Novo Nordisk)), 누트로핀 (Nutropin) AQ® (액체, 제넨테크 (Genentech)) & 게노트로핀(Genotropin)® (동결건조된 2중 챔버 카트리지, 파마시아 & 업존(Pharmacia & Upjohn))은 페놀을 함유하는 반면, 소마트로프(Somatrope)® (엘리 릴리 (Eli Lilly))는 m-크레졸과 함께 제제화된 것이다.

보존형 제형의 제제를 개발하는 동안에는 몇몇 측면이 고려될 필요가 있다. 약물 제품 중의 보존제의 유효 농도는 최적화되어야 한다. 이는 단백질 안정성은 손상시키지 않으면서 항미생물 효과를 부여하는 농도 범위를 사용하여 제형 중의 주어진 보존제를 시험하는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 시차 주사 열량법 (DSC)을 사용하여 이루어진 인터루킨-1 수용체 (1형)용 액체 제제의 개발에서 3가지 보존제가 성공적으로 스크리닝되었다. 보존제는 시판되는 제품에 통상적으로 사용되는 농도에서 그가 안정성에 미치는 영향에 기초하여 순위 등급을 받았다 (문헌 [Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)]).

보존제를 함유하는 액체 제제를 개발한다는 것이 동결건조된 제제보다도 더 큰 도전 과제가 된다. 냉동-건조된 생성물을 보존제없이 동결건조시킬 수 있고, 사용시 희석제를 함유하는 보존제로 재구성할 수 있다. 이는 보존제가 단백질과 접촉할 수 있는 시간을 단축시켜 줌으로써, 보존제와 관련된 안정성에 관한 위험을 현저하게 최소화시킨다. 액체 제제의 경우, 전체 제품의 저장 기간 (~18-24개월) 동안에 걸쳐 보존제의 효능과 안정성은 유지되어야 한다. 보존제의 효능은 활성 약물과 모든 부형제 성분을 함유하는 최종 제제 중에서 입증되어야 한다는 것이 주목해야 할 중요 내용이다.

몇몇 보존제들은 주사 부위에서 반응을 야기할 수 있는데, 이는 보존제를 선택할 때 고려해야 할 또 다른 인자가 된다. 노르디트로핀 중의 보존제 및 완충액에 대한 평가에 초점을 둔 임상 실험에서, m-크레졸을 함유하는 제제에 비해 페놀 및 벤질 알콜을 함유하는 제제에서 통증 인식이 더 낮은 것으로 관찰되었다 (문헌 [Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)]). 흥미롭게도, 통상적으로 사용되는 보존제들 중, 벤질 알콜은 마취성을 갖는다 (문헌 [Minogue SC, and Sun DA., Anesth Analg ., 100(3): 683-6 (2005)]). 다양한 측면에서, 보존제를 사용할 경우, 임의의 부작용을 능가하는 이점을 제공받을 수 있다.

제조 방법

본 발명은 추가로 제약 제제의 제조 방법에 주시한다.

본 방법은 추가로 하기 단계: 본원에 기술된 바와 같은 안정화제를 동결건조 이전에 상기 혼합물에 첨가하는 단계, 각각 본원에 기술되어 있는 것과 같은 벌크화제, 오스몰 농도 조절제, 및 계면활성제로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 동결건조 이전에 상기 혼합물에 첨가하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.

비록 비경구 투여용 제제의 생산에서는 항균제 희석액이 때때로 사용되기도 하지만, 동결건조된 물질에 대한 표준 재구성 실시 방법은 (전형적으로는 동결건조 중에 제거하는 부피와 등가인) 일정 부피의 순수한 물 또는 주사용 멸균수 (WFI)를 추가로 첨가하는 것이다 (문헌 [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]). 따라서, 본 발명의 동결건조된 rVWF 조성물에 희석제를 첨가하는 단게를 포함하는, 재구성된 rVWF 조성물 제조 방법을 제공한다.

동결건조된 물질은 수용액으로서 재구성될 수 있다. 다양한 수성 담체로는 예컨대, 주사용 멸균수, 다회 투약용을 위한 보존제를 포함하는 물, 또는 적절한 양의 계면활성제를 함유하는 물이 있다 (예를 들어, 수성 현탁액은 수성 현탁액 제조에 적합한 부형제와 함께 혼합된 활성 화합물을 함유한다). 각종 측면에서, 상기와 같은 부형제로는 현탁제, 예를 들어, 제한없이, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 분산제 또는 습윤제는 천연적으로 발생된 포스파티드, 예를 들어, 제한없이, 레시틴 또는 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어, 제한없이, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 또는 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예를 들어, 제한없이, 헵타데카에틸렌옥시세탄올 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어, 제한없이, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 각종 측면에서, 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 제한없이, 에틸 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트를 함유할 수도 있다.

투여

한 측면에서, 조성물을 인간 또는 시험 동물에게 투여하기 위해, 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. "제약상" 또는 "약리학상" 허용되는이라는 어구는 하기 기술하는 바와 같이, 당업계에 주지된 경로를 사용해 투여되었을 때, 안정하고, 단백질 분해, 예컨대, 응집 및 절단 생성물을 억제하며, 추가로 알레르기성 또는 다른 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. "제약상 허용되는 담체"는 상기에서 논의된 약제를 비롯한, 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

제약 제제는 경구로, 국부적으로, 경피적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 질내로, 직장으로, 또는 두개내 주사에 의해 투여된다. 본원에서 사용되는 비경구적이라는 용어는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 수조내 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 정맥내, 진피내, 근육내, 유방내, 복막내, 경막내, 안구후, 폐내 주입 및 또는 특정 부위에서의 외과적 이식에 의한 투여 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물은 본질적으로 발열원 뿐만 아니라, 수용자에게 유해할 수 있는 다른 불순물을 포함하지 않는다.

주치의에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴을 사용하여 조성물을 단일 또는 다중 투여할 수 있다. 질환의 예방 또는 치료를 위해 적절한 용량은 상기 정의한 바와 같이 치료하고자 하는 질환의 유형, 상기 질환의 중증도 및 경과 상태, 약물이 예방용 또는 치료용의 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 병력 및 약물에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다.

키트

추가적인 한 측면으로서, 본 발명은 대상체에게 투여하기 위해 사용하는 것을 용이하게 하는 방식으로 포장된 하나 이상의 동결건조된 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기와 같은 키트는 본 방법을 실시할 때 화합물 또는 조성물의 용도에 관해 기술하는 라벨이 용기에 부착되어 있거나, 또는 포장에 포함되어 있는 것인 라벨과 함께, 용기, 예컨대, 밀봉된 병 또는 베쓸 중에 포장되어 있는, 본원에 기술되어 있는 제약 제제 (예컨대, 치료학적 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조성물)을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 용기의 빈 공간 부분의 크기 (예컨대, 액체 제제와 용기 최상부 사이 공기의 양)가 매우 작도록 용기 내에 포장된다. 바람직하게, 빈 공간 부분의 크기는 무시할 수 있다 (즉, 거의 없다). 한 실시양태에서, 키트는 치료용 단백질 또는 펩티드 조성물을 갖는 제1 용기 및 조성물용의 생리학상 허용되는 재구성 용액을 갖는 제2 용기를 포함한다. 한 측면에서, 제약 제제는 단일 제형으로 포장된다. 키트는 추가로 특정 투여 경로를 따라 제약 제제를 투여하는 데 적합한 기기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 키트는 제약 제제의 용도를 기술하는 라벨을 포함한다.

용량

본원에 기술된 병증을 치료하는 방법에 수반되는 투여 요법은 약물의 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예컨대, 환자의 연령, 증상, 체중, 성별 및 식단, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상적 인자들을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 일례로, 본 발명의 재조합 VWF의 전형적인 투여량은 500 μg/kg과 등가인, 대략 50 U/kg이다.

한 측면에서, 본 발명의 제제는 처음 볼루스에 의해 투여된 후, 약물 제품의 치료학적 순환 수준을 유지시키기 위해 연속적인 주입으로 투여된다. 또 다른 예로서, 본 발명의 화합물은 1회 투여량으로 투여될 수 있다. 당업계의 숙련인은 우수한 의학 실험 및 개별 환자의 임상적 병증에 의해 결정된 바와 같은 유효 용량 및 투여 요법을 쉽게 최적화할 수 있을 것이다. 투약 빈도는 약제의 약동학적 파라미터 및 투여의 경로에 따라 달라질 것이다. 최적의 제약 제제는 투여 경로 및 바람직한 용량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712]를 참조할 수 있으며, 상기 문헌의 개시내용이 본원에 참고로 포함된다. 상기 제제는 투여되는 약제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출율 및 생체내 제거율에 영향을 줄 수 있다. 적절한 투여량은 투여 경로에 의존하여, 체중, 체표면적 또는 장기 크기에 따라 계산될 수 있다. 적절한 투여량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 용량을 측정하는 확립된 분석법을 사용함으로써 적절한 용량을 확인할 수 있다. 최종 투여 요법은 약물의 작용을 변형시키는 다양한 인자들, 예컨대, 약물의 특이 활성, 손상의 중증도 및 환자의 반응, 환자의 연령, 증상, 체중, 성별 및 식단, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상적 인자들을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 연구가 수행됨에 따라, 각종 질환 및 병증에 대한 적절한 용량 수준 및 치료의 기간과 관련된 추가 정보를 알게 될 것이다.

하기 실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니며, 단지 본 발명의 구체적 실시양태를 예시하고자 하는 것이다.

실시예 1

진탕 실험

다양한 제제 중 rVWF의 침전량을 측정하기 위해, 다양한 조건하에서 와류 진탕시킨 후 rVWF의 응집 정도를 시험하였다.

하기 표 1에 제시되어 있는 바와 같이, 20 mM 시트레이트 완충액 (pH 7.3) 에서 각종 rVWF 제제를 평가하였다. 기계적 스트레스 조건을 모의하는 진탕 실험을 디자인하였다. 1-2 ml의 각각의 제제를 실험실용 진탕기를 사용하여 1200 rpm으로 10분 동안 진탕시켰다.

하기 제시하는 분류표에 따라 육안으로 볼 수 있는 VWF 응집체를 평가하였다. 대부분의 경우에서 "육안으로 볼 수 있는 응집체"는 그 크기가 약 100 nm 내지 1-2 cm 범위이며, 젤라틴성 섬유였다.

진탕 실험 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

요약하면, 상기 기술된 진탕 실험은, 트윈-80 및 만니톨을 함유하는 제제가 최상의 결과 (즉, 응집량이 최소)를 제공한다는 것을 시사한다.

실시예 2

냉동-해동 실험

냉동과 해동을 반복함으로써 유발되는 스트레스의 영향을 평가하기 위해 냉동-해동 실험을 디자인하였다. 상기 진탕 실험을 위해 기술된 제제 (표 1) 이외에도, 하기 제제들을 평가하였다 (표 3 및 표 4):

모든 제제를 대략 1시간 동안 -20℃ 냉동기에서 냉동시킨 후, 실온에서 해동시켰다. 결과를 하기 표 5에 나타낸다.

상기 제시한 바와 같이, 트레할로스가 최상의 결과 (즉, 응집량이 최소)를 나타내었다.

실시예 3

동결건조 실험

10분 안에 용해되어 투명한 용액이 되는 동결건조-케이크(lyo-cake)가 형성될 수 있도록 하는 각종 제제의 능력을 평가하기 위해 동결건조 실험을 디자인하였다. 생물학적 활성에 대한 유의적인 손실은 없다는 것을 입증하기 위해 가속화된 안정성 연구 또한 수행하였다.

질소 동결건조기 TS 20002를 사용하여 제조사의 설명에 따라 하기 표 6에 제시한 제제를 동결건조시켰다. 총 동결건조 시간은 대략 72시간이었다. 하기의 각각의 제제들은 20 g/L 만니톨 및 0.1 g/L 트윈-80을 함유하였다.

동결건조 시험 결과를 하기 표 7에 나타낸다.

상기 나타낸 바와 같이, 아미노산과 조합된 시트레이트 또는 HEPES 완충액을 사용한 경우, 가장 투명한 용액을 수득하였다.

재구성된 동결건조된 rVWF의 안정성을 평가하기 위해, VWF:Ag 및 VWF:RCo 시험을 수행하였다. VWF:Ag는 폴리클로날 항-VWF 항체를 사용하여 VWF-특이적 ELISA로 검출될 수 있는 VWF의 양에 상응하는 것인 반면, VWF:RCo는 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기하는 VWF의 양에 상응하는 것이다. 샘플을 40℃에서 저장하였다. 아레니우스 식(Arrhenius equation)을 적용할 수 있다고 가정하면, 40℃에서 1개월간의 안정성은 4℃에서 대략 1년간의 안정성과 같다. 안정성 실험 결과를 하기 표 8 및 표 9에 나타낸다.

ELISA에 대한 표준 편차는 10-20% 범위이다. 상기 결과는, 시험 제제 모두가 8주간에 걸쳐 40℃에서 우수한 안정성을 제공하였다는 것을 시사한다.

제제 중에 상이한 아미노산 (예컨대, 15 mM 또는 20 m의 글리신, 리신 또는 히스티딘)이 사용되었고, 시트레이트 완충액이 다양화된 (예컨대, 15 , 20 또는 25 mM), 추가의 안정성 실험을 수행하였다. 상기 기술된 바와 같이, VWF:RCo 활성 분석법을 사용하여 rVWF의 안정성을 모니터링하였다. 40℃에서 저장된 샘플의 rVWF 안정성에 대한 VWF:RCo 활성 값에서는 심지어 13개월이 경과한 후에도 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다. 측정값에 대한 유의성을 t-검정으로 검정하였다. 변동 계수를 계산하여 분석의 실험실내 정밀성(intermediate precision)을 측정하였다. 일련의 모든 안정성 데이터에서, CV는 20% 아래였고, CV<20%라는 검증 기준을 충족시켰다. 상기 내용에 기초하면, rVWF는 완충액의 몰농도 및 첨가된 아미노산과는 상관없이, 시험된 모든 시트레이트 완충액 시스템 중에서 안정하다고 결론지을 수 있다. rVWF는 심지어 40℃에서 저장된 경우에도 적어도 13개월 동안 안정성을 유지한다. VWF:RCo 활성 분석법을 사용한 효능 측정시 CV 값이 20% 아래인 우수한 실험실내 정밀성을 나타내었다.

따라서, 본원에서 제시하는 데이터를 참작하면, rVWF에 대해 15 mM 시트레이트 (Na₃시트레이트 x 2 H₂O), 15 mM 글리신, 10 g/L 트레할로스, 20 g/L 만니톨, 0.1 g/L 트윈-80 (pH 7.3)을 포함하는 제제가 제안되었다.

실시예 4

장기간 안정성

가속화된 장기간 안정성 시험

권장 저장 조건 및 승온 저장 조건, 이 둘 모두에서 저장된 rVWF 최종 약물 제품 (FDP)의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 승온 저장 조건으로부터 얻은 데이터를 통해 온도 편차가 rVWF FDP의 품질에는 영향을 미치지 않을 것이라는 것을 확인하였고, 이러한 데이터를 사용하여 실시간의 실제 조건하의 안정성 데이터가 없는 경우에 물질의 허용되는 유효 조건을 외삽하여 추정할 수 있을 것이다.

현행 규격은 ≤ 3.0% 잔류 함수율(칼 피셔(Karl Fischer) 방법을 사용하여 측정)이다. 함수율 수준이 각각 1.2%, 1.3%, 1.2%, 및 1.5%인 로트 rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC 및 rVWFF#7FC를 방출하였다. 바이알과 마개 구조가 유사한 다른 제품을 사용하여 이루어진 이전 경험에 기초하면, 대략 1.3%의 잔류 함수율을 갖는, 방출된 임의의 rVWF 로트는 제안된 저장 수명 (즉, 5℃±3℃의 의도된 저장 온도에서 24개월) 종결시 ≤ 3.0%의 규격 한계를 충족시킬 것으로 기대된다.

제조된 4개의 rVWF FDP 로트를 사용하여 권장 저장 조건 (즉, 5℃±3℃) 및 승온된 온도 (즉, 40℃±2℃)에서의 장기간 안정성 연구를 수행하였다. 이러한 연구는 개개의 임상 로트의 안정성 반응을 비교하기에 충분한 데이터를 제공하였다.

안정성-지표 분석법 및 안정성-허용 기준에 관한 설명을 포함하는 안정성 프로토콜은 하기 표 10에서 살펴볼 수 있으며, 이러한 표는 또한 안정성 연구에서 평가된 rVWF FDP 로트와 관련된 정보도 포함한다.

전반적인 안정성에 관한 요약 및 논의 (24개월)

제시하는 rVWF FDP의 안정성 데이터는 하기로 구성된다:

1. 로트 rVWF#1FC의 경우, 5℃±3℃에서 장기간 연구된 24개월간의 데이터 (완전 시험) 및 30℃±2℃에서의 6개월간의 중간 데이터 (완전 시험);

2. 로트 rVWF#2FC의 경우, 5℃±3℃에서의 6개월간의 데이터 (완전 시험);

3. 로트 rVWF#3FC의 경우, 2-8℃에서 장기간 연구된 24개월간의 데이터 (완전 시험), 30℃±2℃에서의 6개월간의 데이터 및 40℃±2℃에서의 3개월간의 데이터 (완전 시험);

4. 로트 rVWFF#4FC의 경우, 5℃±3℃에서의 24개월 안정성 데이터, 및 40℃±2℃에서의 9개월간의 데이터;

5. 로트 rVWFF#5FC의 경우, 5℃±3℃에서의 24개월 안정성 데이터, 및 40℃±2℃에서의 9개월간의 데이터;

6. 로트 rVWFF#6FC의 경우, 5℃±3℃에서의 12개월 안정성 데이터, 및 40℃±2℃에서의 9개월간의 데이터; 및

7. 로트 rVWFF#7FC의 경우, 5℃±3℃에서의 12개월 안정성 데이터, 및 40℃±2℃에서의 9개월간의 데이터.

로트 rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC 및 rVWFF#7FC에 대해 관찰된 잔류 함수율에서의 변동은 허용 기준 ≤3% 아래로 잘 유지된 것으로 나타났고, 기능 활성 (VWF:RCo)에 어떤 영향도 미치지 않았다. 비임상 및 임상 연구용으로 적합하도록 제조된 로트에 대한 정성 분석 기법 (즉, 외형, SDS-PAGE 분석 등)으로 수행된 안정성에 관한 결과에서는 어떤 변화도 관찰되지 않았다. 유사하게, 전체 단백질 분석, VWF:Ag 분석 또는 저장시 관찰된 VWF 다량체의 수에서도 안정성이 감소하는 경향은 없었다.

로트 rVWF#1FC, rVWF#2FC 및 rVWF#3FC에 대해 제시된 VWF:RCo 활성 대 VWF:Ag 활성의 비, 및 VWF:RCo 데이터, 둘 모두에서의 변동은, 개개의 VWF:RCo 안정성 시험 결과가 하나의 안정성 샘플에 대한 단일 측정으로부터 얻은 데이터, 및/또는 비-유럽 약전 충족 방법 분석 방법으로부터 얻은 데이터로 구성되었다는 사실, 즉, 시험 방법의 변동에 따른 결과일 수 있다. 분석 방법을 유럽 약전 충족 분석법으로 변경한 후, 비임상적 로트에 대한 모든 시험 시점에서 원래의 방법과 새로운 분석 방법, 둘 모두를 사용하여 시험하였다.

대규모로 제조된 rVWF FDP는 실험용 규모로 제조된 rVWF FDP 로트와 유사한 안정성 특징을 보였다. 이러한 rVWF FDP 로트는 5℃±3℃에서 저장되었을 때 24개월까지도 VWF:RCo 활성을 유지하였다. 심지어 30℃±2℃에서 6개월간 저장된 후에도, 또는 40℃±2℃에서 9개월간 저장된 후에도 현 안정성과 관련하여 대규모 로트로 이루어진 샘플에서의 VWF 다량체 패턴에서는 어떤 변화도 없었다. 표 11은 40℃±2℃에서의 스트레스 조건하에서 저장된 배치 rVWF#4FC, rVWF#5FC, rVWF#6FC 및 rVWF#7FC의 VWF:RCo, VWF:Ag 및 VWF 다량체 패턴에 대한 결과를 나타낸다. 본 결과는, 주변 온도, 또는 심지어는 냉장 조건하에서도 3년 초과인 저장 수명으로 외삽하여 추정될 수 있는 기간인 9개월간의 승온 저장 조건하에서의 안정성을 나타낸다.

공변량 분석 (ANCOVA 분석)을 통해, 회귀선의 기울기 상의 차이 (5℃±3℃에서 저장된 로트 rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC 및 rVWFF#7FC)는 유의적이지 않으며 (p=0.906), VWF:RCo 활성 데이터는 ICH Q1A (R2)에 기술되어 있는 바와 같이 풀링될 수 있다는 것이 입증되었다. 각 로트의 추세선의 고도 상의 차이 또한 유의적이지 않다. 도 1에 제시되어 있는 바와 같이, 풀링된 저조한 사례(worse case)의 기울기를 외삽하여 추정한 결과, 신뢰 구간은 최소 24개월 동안 허용 기준 내에 포함되어 있는 것으로 나타났다. 평균 곡선에 대한 하한 신뢰 구간은 51개월째에 초기 활성의 80%로 감소하였다 (80%는 또한 유럽 약전에서 인간 폰 빌레브란트 인자에 대한 예측된 효능과 확인된 효능 사이의 최대 차이이기도 하다). 풀링된 저조한 사례의 기울기는 1개월당 0.0344 U VWF:RCo로 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 비교를 통해, rVWF FDP의 안정성에 관한 특징, 구체적으로 VWF:RCo 활성은 생산 공정에서의 변화로도 변경되지 않는 것으로 나타났다. 상기와 같은 외삽에 의한 추정은, rVWF FDP가 권장 저장 온도에서 저장되었을 때, 그의 잠정적 저장 수명이 24개월로 연장된다는 것을 입증한다.

마개로부터 동결건조된 생성물로 수분이 전달되는 것은 마개를 이루는 재료에 따라 달라지며, 살균 소독 후 마개의 잔류 함수율, 샘플 저장시의 습도, 및 마개의 내인성 수분 전달율에 영향을 받는다. 5℃±3℃에서 저장된 로트 rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC 및 rVWFF#7FC의 잔류 함수율은 도 2에 나타낸 바와 같이 유사하였다 (기울기 비교시 나타나는 차이는 유의적이지 않았다 (p=0.734)). 승온 조건 40℃±2℃에서 저장된 로트는 또한 9개월간에 걸쳐 잔류 함수율이 유사하게 증가한 것으로 나타났다 (도 3). 본원 ANCOVA 분석을 통해 회귀선 기울기 상의 차이는 유사한 것으로 입증되었다 (p = 0.546). 도 3은 풀링된 저조한 사례의 기울기를 24개월까지 외삽하여 추정한 것을 나타낸다.

이는, 로트 rVWFF#6FC 및 rVWFF#7FC는 5℃±3℃에서 저장되었을 때, 기술된 24개월간의 유효 기간 동안 사용할 수 있다는 것을 입증하는 충분한 데이터가 된다.

제안된 저장 조건 및 저장 수명

rVWF FDP에 대해 권장 저장 조건은 5℃±3℃이다. 따라서, 권장 저장 조건에서 저장될 때의 rVWF FDP에 대한 잠정적 저장 수명은 24개월인 것으로 제안된다. 가능하게는 추가의 데이터에 기초하여 rVWF FDP 로트에 대한 저장 수명이 추가로 연장될 수 있으며, 이로써, 저장 기간은 더욱 장기화될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Schnecker, et al. <120> LYOPHILIZED RECOMBINANT VWF FORMULATIONS <130> 31315/44042A <150> US-61/107,273 <151> 2008-10-21 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8833 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agctcacagc tattgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt 60 tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg 120 gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg 180 gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt 240 gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt 300 gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct 360 tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg 420 cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca 480 gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt 540 tgtcaatggt accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg 600 gctgtatcta gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt 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Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala 515 520 525 Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu 530 535 540 Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 545 550 555 560 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu 565 570 575 Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala 580 585 590 Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys 595 600 605 Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser 610 615 620 Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly 625 630 635 640 Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His 645 650 655 Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn 660 665 670 Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp 675 680 685 Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro 690 695 700 Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu 705 710 715 720 Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val 725 730 735 Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn 740 745 750 Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly 755 760 765 Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr 770 775 780 Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 785 790 795 800 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly 805 810 815 Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly 820 825 830 Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro 835 840 845 Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro 850 855 860 Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly 865 870 875 880 Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg 885 890 895 Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu 900 905 910 Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp 915 920 925 Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe 930 935 940 Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile 945 950 955 960 Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr 965 970 975 Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu 980 985 990 Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly 995 1000 1005 Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His 1010 1015 1020 Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr 1025 1030 1035 Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg 1040 1045 1050 Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr 1055 1060 1065 Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser 1070 1075 1080 Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val 1085 1090 1095 Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val 1100 1105 1110 Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp 1115 1120 1125 Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro 1130 1135 1140 Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg 1145 1150 1155 Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val 1160 1165 1170 Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr 1175 1180 1185 Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe 1190 1195 1200 Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu 1205 1210 1215 Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly 1220 1225 1230 Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala 1235 1240 1245 Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly 1250 1255 1260 Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn 1265 1270 1275 Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly 1280 1285 1290 His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln 1295 1300 1305 Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly 1310 1315 1320 Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly 1325 1330 1335 Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val 1340 1345 1350 Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys 1355 1360 1365 Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu 1370 1375 1380 Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala 1385 1390 1395 Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val 1400 1405 1410 Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val 1415 1420 1425 Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser 1430 1435 1440 Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp 1445 1450 1455 Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe 1460 1465 1470 Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu 1475 1480 1485 Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln 1490 1495 1500 Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys 1505 1510 1515 Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys 1520 1525 1530 Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg 1535 1540 1545 Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val 1550 1555 1560 Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu 1565 1570 1575 Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro 1580 1585 1590 Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser 1595 1600 1605 Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr 1610 1615 1620 Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser 1625 1630 1635 Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn 1640 1645 1650 Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys 1655 1660 1665 Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu 1670 1675 1680 Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met 1685 1690 1695 Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser 1700 1705 1710 Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys 1715 1720 1725 Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro 1730 1735 1740 Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp 1745 1750 1755 Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val 1760 1765 1770 Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln 1775 1780 1785 Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys 1790 1795 1800 Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala 1805 1810 1815 Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met 1820 1825 1830 Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val 1835 1840 1845 Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro 1850 1855 1860 Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys 1865 1870 1875 Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly 1880 1885 1890 Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys 1895 1900 1905 Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp 1910 1915 1920 Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys 1925 1930 1935 Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys 1940 1945 1950 Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu 1955 1960 1965 Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp 1970 1975 1980 Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser 1985 1990 1995 Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro 2000 2005 2010 Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly 2015 2020 2025 Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys 2030 2035 2040 Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys 2045 2050

Claims (33)

1. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하고;
   (a) 상기 rVWF는
   (1) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열; 및
   (2) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 1에 기재되어 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
   로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하고;
   (b) 상기 완충제는 15 mM의 시트레이트 및 HEPES로 이루어진 군으로부터 선택되는 pH 완충제를 포함하고, 상기 pH 범위는 2.0 내지 12.0이고;
   (c) 상기 아미노산은 1 내지 500 mM의 농도의 글리신, 라이신, 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   (d) 상기 안정화제 농도는 0.1 내지 1000 mM이고; 및
   (e) 상기 계면활성제 농도는 0.01 g/L 내지 0.5 g/L인,
   재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제.
2. 제1항에 있어서, rVWF가 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 제제.
3. 제2항에 있어서, 완충제가 시트레이트인 제제.
4. 제1항에 있어서, pH 범위가 6.0 내지 8.0인 제제.
5. 제1항에 있어서, pH 범위가 6.5 내지 7.5인 제제.
6. 제1항에 있어서, pH가 7.3인 제제.
7. 제1항에 있어서, 완충제가 시트레이트이고, pH가 7.3인 제제.
8. 제1항에 있어서, 아미노산 농도 범위가 1 mM 내지 300 mM인 제제.
9. 제8항에 있어서, 아미노산이 15 mM 농도의 글리신인 제제.
10. 제1항에 있어서, rVWF가 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하고; 완충제가 시트레이트이고, pH가 7.3이고; 아미노산이 15 mM 농도의 글리신인 제제.
11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 안정화제가 만니톨, 락토스, 소르비톨, 크실리톨, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프럭토스 및 이들 안정화제의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제.
12. 제11항에 있어서, 안정화제가 10 g/L 농도의 트레할로스 및 20 g/L 농도의 만니톨인 제제.
13. 제1항에 있어서, 계면활성제가 디기토닌, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈-20, 트윈-80 및 이들 계면활성제의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제.
14. 제13항에 있어서, 계면활성제가 0.01 g/L 농도의 트윈-80인 제제.
15. 제1항에 있어서, rVWF가 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하고; 완충제가 pH 7.3 및 15 mM의 농도의 시트레이트이고; 아미노산이 15 mM의 농도의 글리신이고; 안정화제가 10 g/L의 농도의 트레할로스 및 20 g/L의 농도의 만니톨이고; 계면활성제가 0.1 g/L의 트윈-80인 제제.
16. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하고;
    (a) (1) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열; 및
    (2) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 1에 기재되어 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 rVWF;
    (b) 0.1 mM 내지 500 mM의 범위의 pH 완충제를 포함하고, pH 범위가 2.0 내지 12.0이고, 시트레이트인 완충제;
    (c) 농도가 1 내지 500 mM이고, 글리신인 아미노산;
    (d) 농도가 0.1 내지 1000 mM이고, 하나 이상의 안정화제가 만니톨 및 트레할로스인 안정화제; 및
    (e) 농도가 0.01 g/L 내지 0.5 g/L이고, 트윈-80인 계면활성제
    를 포함하는 용액을 동결건조하여 제조되는,
    재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제.
17. 제16항에 있어서, rVWF가 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 제제.
18. 제16항에 있어서, 용액의 pH가 6.0 내지 8.0의 범위인 제제.
19. 제16항에 있어서, 완충제가 시트레이트이고, pH가 7.3인 제제.
20. 제16항에 있어서, 용액 중 아미노산 농도 범위가 0.5 mM 내지 300 mM인 제제.
21. 제20항에 있어서, 아미노산이 용액 중 15 mM 농도의 글리신인 제제.
22. 제16항에 있어서, rVWF가 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하고; 용액의 완충제가 시트레이트이고, pH가 7.3이고; 아미노산이 용액 중 15 mM 농도의 글리신인 제제.
23. 제16항에 있어서, 안정화제가 용액 중 10 g/L의 농도의 트레할로스 및 용액 중 20 g/L의 농도의 만니톨인 제제.
24. 제16항에 있어서, 계면활성제가 용액 중 0.01 g/L의 트윈-80인 제제.
25. 제16항에 있어서, rVWF가 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하고; 용액의 완충제가 pH 7.3 및 용액 중 15 mM 농도인 시트레이트이고; 아미노산이 용액 중 15 mM 농도의 글리신이고; 안정화제가 용액 중 10 g/L의 농도의 트레할로스 및 용액 중 20 g/L의 농도의 만니톨이고; 계면활성제가 용액 중 0.1 g/L의 트윈-80인 제제.
26. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하고;
    (a) (1) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열; 및
    (2) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 1에 기재되어 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 rVWF;
    (b) 0.1 mM 내지 500 mM의 범위의 pH 완충제를 포함하고, pH 범위가 6.5 내지 7.5이고, 시트레이트인 완충제;
    (c) 농도가 1 내지 500 mM이고, 글리신인 아미노산;
    (d) 농도가 0.1 내지 1000 mM이고, 하나 이상의 안정화제가 만니톨 및 트레할로스인 안정화제; 및
    (e) 농도가 0.01 g/L 내지 0.5 g/L이고, 트윈-80인 계면활성제
    를 포함하는 용액을 동결건조하여 제조되는,
    재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제.
27. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하고;
    (a) (1) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열; 및
    (2) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 1에 기재되어 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 rVWF;
    (b) 0.1 mM 내지 500 mM의 범위의 pH 완충제를 포함하고, pH 범위가 6.5 내지 7.5이고, 시트레이트인 완충제;
    (c) 농도가 1 내지 500 mM이고, 글리신인 아미노산;
    (d) 농도가 0.1 내지 1000 mM이고, 하나 이상의 안정화제가 만니톨 및 트레할로스인 안정화제; 및
    (e) 농도가 0.01 g/L 내지 0.5 g/L이고, 정맥내 투여용 용액 중 트윈-80인 계면활성제
    를 포함하는 용액을 동결건조하여 제조되는,
    재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제.
28. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하고;
    (a) (1) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열; 및
    (2) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 1에 기재되어 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 rVWF;
    (b) 15 mM의 농도의 시트레이트이고, pH가 7.3인 용액의 완충제;
    (c) 용액 중 15 mM의 농도의 글리신인 아미노산;
    (d) 용액 중 10 g/L의 농도의 트레할로스와 용액 중 20 g/L의 농도의 만니톨인 안정화제; 및
    (e) 용액 중 0.1 g/L의 농도의 트윈-80인 계면활성제
    를 포함하는 용액을 동결건조하여 제조되는,
    재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제.
29. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하고;
    (a) (1) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열; 및
    (2) 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 1에 기재되어 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 rVWF;
    (b) 15 mM의 농도의 시트레이트이고, pH가 7.3인 용액의 완충제;
    (c) 용액 중 15 mM의 농도의 글리신인 아미노산;
    (d) 용액 중 10 g/L의 농도의 트레할로스와 용액 중 20 g/L의 농도의 만니톨인 안정화제; 및
    (e) 정맥내 투여용 용액 중 0.1 g/L의 농도의 트윈-80인 계면활성제
    를 포함하는 용액을 동결건조하여 제조되는,
    재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제.
30. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제로 이루어진 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제로서,
    제제는 용액을 동결건조하여 제조되고;
    rVWF가, 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하고; 완충제가 pH 7.3 및 용액 중 15 mM 농도의 시트레이트이고; 아미노산이 용액 중 15 mM 농도의 글리신이고; 안정화제가 용액 중 10 g/L의 농도의 트레할로스 및 용액 중 20 g/L의 농도의 만니톨이고; 계면활성제가 용액 중 0.1 g/L의 트윈-80인 제제.
31. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제로 이루어진 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제로서,
    제제는 용액을 동결건조하여 제조되고;
    rVWF가, 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하고; 완충제가 pH 7.3 및 용액 중 15 mM 농도의 시트레이트이고; 아미노산이 용액 중 15 mM 농도의 글리신이고; 안정화제가 용액 중 10 g/L의 농도의 트레할로스 및 용액 중 20 g/L의 농도의 만니톨이고; 계면활성제가 정맥내 투여용 용액 중 0.1 g/L의 트윈-80인 제제.
32. (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 아미노산; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하는, 폰 빌레브란트병의 치료 방법에 사용하기 위한, 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)의 안정한 동결건조된 제약 제제로서,
    제제는 용액을 동결건조하여 제조되고;
    rVWF가, 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 응집을 야기할 수 있거나 인자 VIII와 결합할 수 있는, 서열 3에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하고; 완충제가 pH 7.3 및 용액 중 15 mM 농도의 시트레이트이고; 아미노산이 용액 중 15 mM 농도의 글리신이고; 안정화제가 용액 중 10 g/L의 농도의 트레할로스 및 용액 중 20 g/L의 농도의 만니톨이고; 계면활성제가 용액 중 0.1 g/L의 트윈-80인 제제.
33. 제16항에 있어서, 용액의 pH가 6.5 내지 7.5의 범위인 제제.

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