KR20160091434A - 재조합 vwf 제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)의 장기간 안정한 제약 제제 및 상기 제제의 제조 및 투여 방법을 제공한다.
Description
본 출원은 각각 여기서 전체가 참조로 도입된 2007년 12월 28일 출원된 미국 가출원 제61/017,418호 및 2007년 12월 31일 출원된 미국 가출원 제61/017,881호의 우선권을 주장한다.
<기술 분야>
전체적으로, 본 발명은 재조합 VWF의 제제 및 재조합 VWF를 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
폰 빌레브란트 인자(VWF)는 약 500 내지 20,000 kD 크기 범위의 일련의 다량체로서 혈장 속에서 순환하는 글리코단백질이다. VWF의 다량체 형태는 이황화물 결합으로 함께 연결된 250 kD 폴리펩티드 아단위로 구성된다. VWF는 손상된 혈관 벽의 내피밑층에의 초기 혈소판 부착을 매개한다. 더 큰 다량체만이 지혈 활성을 보인다. 내피 세포들이 VWF의 큰 중합체 형태를 분비하고 낮은 분자량을 갖는 VWF(저 분자량 VWF)의 형태가 단백분해성 분할로 생성되는 것으로 생각된다. 큰 분자량을 갖는 다량체들은 내피 세포의 바이벨-펠라드 소체 내에 저장되고 자극에 의해 유리된다.
VWF는 내피 세포 및 거대 핵세포에 의해 대부분이 반복되는 영역들로 구성되는 프레프로-VWF로 합성된다. 신호 펩티드의 분할로, 프로-VWF는 그것의 C-말단 영역의 이황화물 연결을 통해 이량체화된다. 이량체는 다량체화의 촉진제로서 기능하고, 다량체화는 자유 단부 말단들 사이의 이황화물 연결에 의해 조절된다. 다량체로의 결합 후 폴리펩티드 서열이 단백분해성으로 제거된다(문헌 [Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261]).
VWF의 클로닝된 cDNA로부터 예상되는 주된 번역 생산물은 2813-잔기 전구체 폴리펩티드(프레프로-VWF)이다. 프레프로-VWF는 22 아미노산 신호 펩티드 및 741 아미노산 프로펩티드로 구성되며, 성숙한 VWF는 2050개의 아미노산을 포함한다(문헌 [Ruggeri Z. A., and Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993)]).
VWF의 결함은 폰 빌레브란트병(VWD)의 원인이며, 이는 어느 정도 밝혀진 출혈 표현형으로 특징지어진다. VWD 유형 3은 VWF가 완전히 결손되는 가장 심각한 형태이며, VWD 유형 1은 VWF의 양적인 손실과 관계되며 그것의 표현형은 매우 가벼울 수 있다. VWD 유형 2는 VWF의 질적인 결함과 관계되며 VWD 유형 3 만큼 심각할 수 있다. VWD 유형 2는 다양한 하위 형태를 갖고, 일부는 고분자량 다량체의 손실 또는 감소와 관계된다. 폰 빌레브란트 증후군 유형 2a(VWS-2A)는 중간체 및 큰 다량체 둘 다의 손실로 특징지어진다. VWS-2B는 최고분자량 다량체의 손실로 특징지어진다. VWF와 관련된 다른 병 및 장애가 해당 분야에 공지되어있다.
미국 특허 제6,531,577호, 제7,166,709호 및 유럽 특허 출원 제04380188.5호는 혈장-유래 VWF 제제를 기술한다. 그러나, 혈장-유래 VWF에 대한 양 및 순도 문제 외에, 혈액에서 기인하는 병원체(예컨대, 바이러스) 및 변종 크로이츠펠트 야콥병(vCJD)의 위험성도 있다.
따라서 재조합 VWF를 포함하는 안정한 제약 제제를 개발할 필요성이 해당 분야에 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 재조합 VWF를 포함하는 조성물에 유용한 제제를 제공하고, 매우 안정한 제약 조성물을 생성한다. 안정한 제약 조성물은 재조합 VWF의 투여로 이득을 볼 수 있는 장애 또는 증상을 앓는 개인의 치료에서 치료제로서 유용하다.
일 실시예에서, 본 발명은 (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF); (b) 완충화제; (c) 1 이상의 염; (d) 임의로 안정화제; 및 (e) 임의로 계면활성제를 포함하고 상기 rVWF가 a) 서열 식별 번호: 3에 제시된 아미노산 서열; b) a)의 생물학적으로 활성인 유사체, 단편 또는 변이체; c)서열 식별 번호: 1에 제시된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; d) c)의 생물학적으로 활성인 유사체, 단편 또는 변이체; 및 e) 적절히 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 식별 번호: 1에 제시된 폴리뉴클레오티드로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드를 포함하며; 상기 완충액이 약 0.1 mM 내지 약 500 mM 범위의 pH 완충화제로 구성되고 상기 pH가 약 2.0 내지 약 12.0 범위이며; 상기 염이 약 1 내지 500 mM의 농도이고; 상기 안정화제가 약 0.1 내지 1000 mM 농도이며; 상기 계면활성제가 약 0.01 g/L 내지 0.5 g/L 농도인, rVWF의 안정한 액체 제약 제제를 제공한다.
다른 실시예에서, rVWF가 서열 식별 번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 완충화제가 구연산 나트륨, 글리신, 히스티딘, 트리스(Tris) 및 이들 약제의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 완충화제가 시트레이트인 상기한 제제가 제공된다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, pH가 6.0 내지 8.0 또는 6.5 내지 7.3 범위인 상기한 제제가 제공된다. 관련된 실시예에서, pH가 7.0인 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 완충화제가 시트레이트이고 pH가 7.0인 상기한 제제가 제공된다.
또 다른 실시예에서, 염이 염화칼슘, 염화나트륨 및 염화마그네슘으로 구성된 군에서 선택된 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 염이 0.5 내지 300 mM 범위 농도인 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 염이 10 mM 농도의 염화칼슘인 상기한 제제가 제공된다.
또 다른 실시예에서, rVWF가 서열 식별 번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 완충화제가 시트레이트이고 pH는 7.0이며; 염이 10 mM 농도의 염화칼슘인 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, rVWF가 서열 식별 번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 완충화제가 구연산 나트륨이고 pH는 7.0이며; 염이 10 mM 농도의 염화칼슘 및 100 mM 농도의 NaCl인 상기한 제제가 제공된다.
다른 제제들 또한 당해 발명으로 고려될 수 있다. 예컨대, 일 실시예에서, 1 이상의 완충화제가 각각 3.3 mM 농도의 히스티딘 및 트리스인 상기한 제제가 제공된다. 다른 실시예에서, pH가 7.0인 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 제1 염이 30 mM 농도의 염화나트륨이고 제2 염이 0.56 mM 농도의 염화칼슘인 상기한 제제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 안정화제가 만니톨, 락토스, 소르비톨, 크실리톨, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프럭토스 및 이들 안정화제들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 안정화제가 7.8 mM 농도의 트레할로스 및 58.6 mM 농도의 만니톨인 상기한 제제가 제공된다.
또 다른 실시예에서, 계면활성제가 디기토닌(digitonin), 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 트윈(TWEEN)-20, 트윈-80 및 이들 계면활성제들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 상기한 제제가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 계면활성제가 0.03 g/L의 트윈-80인 상기한 제제가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에서, rVWF가 서열 식별 번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 완충화제가 pH 7.0의 3.3 mM 농도의 히스티딘 및 3.3 mM 농도의 트리스이고; 제1 염이 30 mM 농도의 염화나트륨이고 제2 염이 0.56 mM 농도의 염화칼슘이며; 안정화제가 7.8 mM 농도의 트레할로스 및 58.6 mM 농도의 만니톨이고; 계면활성제가 0.03 g/L의 트윈-80인 상기한 제제가 제공된다.
본 발명은 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF)의 장기간 안정한 제약 제제 및 상기 제제의 제조 및 투여 방법을 제공한다.
도 1은 rVWF가 글루타티온의 존재로 인해 애드베이트(Advate) 완충액 내에서 26 주 후 안정하지 않다는 것을 보여준다.
도 2는 rVWF가 4 ℃에서 애드베이트 1:3 완충액 내에서 12 주까지 안정하다는 것을 보여준다.
도 3은 시트레이트계 제제의 안정성이 0.1 M 글루타티온을 함유하는 애드베이트 1:3 완충액 제제보다 우수함을 보여준다.
도 4는 rVWF 농도가 애드베이트 완충액 내에서 26 주 동안 안정함을 보여준다.
도 5는 rVWF 농도가 애드베이트 1:3 완충액 내에서 시간이 지남에 따라 안정적임을 보여준다.
도 6은 rVWF 농도가 시트레이트계 완충액 내에서 시간이 지남에 따라 안정적임을 보여준다.
도 7은 대부분의 부형제가 rVWF의 언폴딩 온도를 약 1 또는 2 ℃ 증가시킴을 보여준다.
도 8은 10 mM CaCl2가 rVWF의 언폴딩 온도를 약 8 ℃ 내지 약 67 ℃ 증가시킴을 보여준다.
도 9는 CaCl2의 효과가 pH 7.3 및 pH 6.5에서 유사함을 보여준다.
도 2는 rVWF가 4 ℃에서 애드베이트 1:3 완충액 내에서 12 주까지 안정하다는 것을 보여준다.
도 3은 시트레이트계 제제의 안정성이 0.1 M 글루타티온을 함유하는 애드베이트 1:3 완충액 제제보다 우수함을 보여준다.
도 4는 rVWF 농도가 애드베이트 완충액 내에서 26 주 동안 안정함을 보여준다.
도 5는 rVWF 농도가 애드베이트 1:3 완충액 내에서 시간이 지남에 따라 안정적임을 보여준다.
도 6은 rVWF 농도가 시트레이트계 완충액 내에서 시간이 지남에 따라 안정적임을 보여준다.
도 7은 대부분의 부형제가 rVWF의 언폴딩 온도를 약 1 또는 2 ℃ 증가시킴을 보여준다.
도 8은 10 mM CaCl2가 rVWF의 언폴딩 온도를 약 8 ℃ 내지 약 67 ℃ 증가시킴을 보여준다.
도 9는 CaCl2의 효과가 pH 7.3 및 pH 6.5에서 유사함을 보여준다.
달리 정의되지 않은 이상, 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 아래의 참고문헌들은 당업자에게 본 발명에 사용된 많은 용어들의 일반적인 정의를 제공한다: 문헌 [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2nd ed. 1994)]; 문헌 [THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988)]; 문헌 [THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 문헌 [Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].
여기에 인용된 각 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 본 개시내용과 상반되지 않는 범위에서 전체로서 참조로 도입된다.
여기서, 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "한" 및 "그"는 내용이 명확하게 달리 규정하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다는 것이 인식된다.
여기서 사용된 바와 같이, 아래의 용어들은 달리 명시되지 않은 한 그들에게 주어진 의미를 갖는다.
펩티드 화합물에 대해 용어 "포함하는"은 화합물이 주어진 서열의 아미노 및 카르복시 말단 중 하나 또는 둘 다에 추가의 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 물론, 이들 추가적인 아미노산은 화합물의 활성을 현저하게 방해해서는 안된다. 당해 발명의 조성물에 대해서, 용어 "포함하는"은 조성물이 추가의 성분을 포함할 수 있음을 의미한다. 이들 추가적인 성분은 조성물의 활성을 현저하게 방해해서는 안된다.
용어 "약리적으로 활성인"은 그렇게 기술된 물질이 의학적 지표(예컨대, 비제한적으로, 혈압, 혈구수, 콜레스테롤 수준) 또는 질병 상태(예컨대, 비제한적으로 암, 자기면역 장애)에 영향을 주는 활성을 가지는 것으로 측정됨을 의미한다.
여기서 사용된 바와 같이 용어 "발현된다", "발현되는" 및 "발현"은 유전자 또는 DNA 서열 내의 정보가 드러나게 되도록 하거나 유도하는 것, 예컨대 상응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역에 관계되는 세포 기능을 활성화함으로써 단백질을 생산하는 것을 의미한다. DNA 서열은 세포 내에서 또는 세포에 의해서 발현되어 단백질과 같은 "발현 생성물"을 형성한다. 발현 생성물 자체, 예컨대 결과로 얻은 단백질은 또한 "발현되었다"고 말해질 수 있다. 발현 생성물은 세포 내, 세포 외 또는 분비되는 것으로 특징지어질 수 있다. 용어 "세포 내"는 세포 내부에 있음을 의미한다. 용어 "세포 외"는 막통과 단백질과 같이 세포 외부에 있음을 의미한다. 물질은 그것이 세포 바깥에서 현저한 양으로 나타난다면, 세포에 의해 세포의 어떤 곳 위 또는 내부로부터 "분비된"것이다.
여기서 사용된 바와 같이 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기, 그들의 구조적 변이체, 관련된 자연 발생 구조적 변이체 및 합성 비자연 발생 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. 합성 폴리펩티드는 예컨대, 자동화된 폴리펩티드 합성기를 사용해 제조할 수 있다. 용어 "단백질"은 통상적으로 큰 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "펩티드"는 통상적으로 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.
여기서 사용된 바와 같이 폴리펩티드의 "단편"은 전체 길이 폴리펩티드 또는 단백질 발현 생성물보다 작은 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 부분을 지칭함을 의도한다.
여기서 사용된 바와 같이 "유사체"는 분자 전체에 대해 또는 그들의 단편에 대해, 구조에서 실질적으로 유사하고 동일한 생물학적 활성을 가지나, 다양한 활성의 정도를 가질 수 있는 임의의 2 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 유사체는 1 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 수반하는 1 이상의 돌연변이에 의해그들의 아미노산 서열의 조성에 있어 상이하다. 치환은 대체되는 아미노산 및 그것을 대체하는 아미노산의 물리화학적 또는 기능적 관련성에 기초해 보전적 또는 비보전적일 수 있다.
여기서 사용된 바와 같이 "변이체"는 정상적으로 분자의 일 부분이 아닌 추가의 화학적 잔기를 포함하도록 변형된 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 유사체를 지칭한다. 이와 같은 잔기는 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 변화시킬 수 있다. 대안으로서 잔기는 분자의 독성을 감소시키고 분자의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 감쇠시키는 등을 할 수 있다. 이와 같은 효과를 가능하게 할 수 있는 잔기들은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)]에 개시된다. 이와 같은 잔기들을 분자로 결합시키는 과정은 해당 분야에 주지되어 있다. 예컨대, 변이체는 단백질에 더 긴 생체 내 반감기를 부과하는 화학적 변형을 갖는 혈액 응고 인자일 수 있다. 다양한 태양에서, 폴리펩티드는 글리코실화, 페길화 및/또는 폴리시알릴화로 변형된다.
재조합 VWF
프레프로-VWF의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 식별 번호: 1 및 서열 식별 번호: 2에 제시되고, 각각 유전자 은행 수탁 번호 제NM 000552호 및 제NP 000543호에서 입수가능하다. 성숙한 VWF 단백질에 상응하는 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 3에 제시된다(전체 길이 프레프로-VWF 아미노산 서열의 아미노산 764-2813에 상응한다).
유용한 rVWF의 일 형태는 적어도, 1 이상의 인자 VIII(FVIII) 분자의 생체 내-안정화, 예를 들어 결합 성질을 갖고, 임의로 약리적으로 허용가능한 글리코실화 패턴을 갖는다. 그의 특정한 예는 A2 영역을 갖지 않고 그에 따라 단백질분해에 대해 내성인 VWF(문헌 [Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997]) 및 콜라겐 및 헤파린에 대한 당단백질 lb-결합 영역 및 결합 위치를 포함하는 Val 449로 부터 Asn 730까지의 VWF 단편(문헌 [Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989])을 포함한다. 1 이상의 FVIII 분자를 안정화하는 VWF의 능력의 측정은, 해당 분야에 공지된 방법에 따라 VWF-결함 포유동물에서 수행될 수 있다.
본 발명의 rVWF는 해당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 재조합 VWF를 제조하는 방법에 대해 여기에 참조로 도입된 1986년 10월 23일 공개된 WO86/06096 및 1990년 7월 23일 출원된 미국 특허 출원 제07/559,509호에 일 특정예가 개시된다. 그에 따라 (i) 유전 공학에 의한, 예컨대 RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통한 재조합 DNA의 생산, (ii) 형질 감염에 의한, 예컨대 전기천공 또는 미세주입을 통한 재조합 DNA의 원핵 또는 진핵 세포에의 도입, (iii) 상기 형질 전환된 세포를 예컨대, 연속적으로 또는 배치식 방식으로 배양, (iv) VWF를 예컨대, 구조적으로 또는 유도에 의해 발현 및 (v) 상기 VWF를 예컨대, 배양 배지로부터 단리 또는 형질 전환된 세포의 포집에 의해 (vi) 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 rVWF를 획득하는 것에 대한 방법이 해당 분야에 공지되어 있다. 해당 분야에 주지된 재조합 DNA 기술을 사용해 형질 전환된 숙주 세포 내에서 재조합 VWF를 생산할 수 있다. 예컨대, 적절한 제한 효소를 사용해 DNA로부터 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 절제할 수 있다.
대안으로서, 포스포르아미데이트법과 같은 화학적 합성 기술을 사용해 DNA 분자를 합성할 수 있다. 이들 기술들의 조합도 이용할 수 있다.
발명은 또한 적절한 숙주 내에서 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 제공한다. 벡터는 적절한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 벡터 내로 삽입되기 전 또는 후에 이 작동성 연결을 수행하는 방법은 주지되어 있다. 발현 조절 서열은 프로모터, 활성제, 증강 인자, 작동자, 리보솜 결합 위치, 시작 신호, 정지 신호, 캡 신호, 폴리아데닐화 신호 및 전사 또는 번역의 조절에 관련되는 다른 신호를 포함한다. 내부에 폴리뉴클레오티드를 갖는 결과로 얻은 벡터는 적절한 숙주를 형질 전환시키는데 사용된다. 해당 분야에 주지된 방법을 사용하여 이 형질 전환을 수행할 수 있다.
많은 수의 이용가능하고 주지된 숙주 세포 중 임의의 것이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 특정한 숙주의 선택은 예컨대, 선택된 발현 벡터와의 적합성, DNA 분자에 의해 암호화되는 펩티드의 독성, 형질 전환의 속도, 펩티드 회복의 용이성, 발현 특성, 생 안전성 및 비용을 포함한 해당 업계에 인식된 많은 요소들에 의존한다. 이들 요소들의 균형은 모든 숙주 세포들이 특정 DNA 서열의 발현에 동일하게 효과적이지 않음의 이해와 합치되어야 한다. 이 일반적인 가이드라인 내에서, 유용한 미생물 숙주 세포는 박테리아, 효모 및 다른 진균, 곤충, 식물, 배양중의 포유 동물(인간 포함) 세포 또는 해당 분야에 공지된 다른 숙주를 포함한다.
다음으로, 형질 전환된 숙주를 배양하고 정제한다. 바람직한 화합물이 발현되도록 숙주 세포를 종래의 발효 조건 하에서 배양할 수 있다. 그러한 발효 조건은 해당 분야에 주지되어 있다. 최종적으로, 해당 분야에 주지된 방법에 의해 배지로부터 폴리펩티드를 정제한다.
본 발명의 화합물을 발현하는데 사용된 숙주 세포에 따라, 단백질 내의 글리코실화 위치로 알려진 위치에 탄수화물(올리고당)기가 알맞게 부착될 수 있다. 일반적으로, O-연결된 올리고당 및 N-연결된 올리고당이 X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있는 서열 Asn-X-Ser/Thr의 일부일 때, O-연결된 올리고당은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기에 부착되고 N-연결된 올리고당은 아스파라긴(Asn) 잔기에 부착된다. X는 바람직하게 프롤린을 제외한 19 개의 자연 발생 아미노산 중 하나이다. N-연결된 및 O-연결된 올리고당 및 각 유형에서 발견되는 당 잔기의 구조는 상이하다. 둘 다에서 공통적으로 발견되는 일 유형의 당은 N-아세틸뉴라민산(시알산으로 지칭됨)이다. 시알산은 통상적으로 N-연결된 및 O-연결된 올리고당 둘 다의 말단 잔기이고, 그것의 음전하에 의해 글리코실화된 화합물에 산성을 부과할 수 있다. 이와 같은 위치(들)은 본 발명의 화합물의 연결자에 도입될 수 있고 바람직하게 폴리펩티드 화합물의 재조합 제조 중 세포(예컨대, CHO, BHK, COS와 같은 포유 동물 세포)에 의해 글리코실화된다. 그러나, 이와 같은 위치들은 해당 분야에 공지된 합성 또는 반합성 공정에 의해 추가로 글리코실화될 수 있다.
대안으로서, 화합물은 합성법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 고체상 합성 기술이 사용될 수 있다. 적절한 기술은 해당 분야에 주지되어 있고 문헌 [Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.)]; 문헌 [Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394- 414]; 문헌 [Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis]; 미국 특허 제3,941,763호; 문헌 [Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253]; 및 문헌 [Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257- 527]에 기술된 것들을 포함한다. 고체상 합성은 그것이 작은 펩티드를 제조하는데 가장 비용-효과적인 방법이기 때문에 개별적인 펩티드를 제조하는데 선호되는 기술이다.
VWF의 단편, 변이체 및 유사체
폴리펩티드의 단편, 변이체 또는 유사체를 제조하는 방법은 해당 분야에 주지되어 있다.
폴리펩티드의 단편은 제한 없이, 효소(예컨대, 트립신, 키모트립신)적 절단을 사용하고 재조합 수단 또한 사용해 특정한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 단편을 생성함으로써 제조된다. 폴리펩티드 단편은 특정한 활성을 갖는 단백질의 일 구역, 예컨대 다량체화 영역 또는 해당 분야에 공지된 임의의 다른 식별가능한 VWF 영역을 포함하도록 생성될 수 있다.
폴리펩티드 유사체를 제조하는 방법 역시 주지되어 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 유사체는 치환형, 삽입형, 추가형 또는 삭제형 유사체일 수 있다. 폴리펩티드의 단편을 포함한 삭제형 유사체는 기능 또는 면역 활성에 필수적이지 않은 원 단백질의 1 이상의 잔기가 결여된다. 삽입형 유사체는 폴리펩티드의 비 말단 지점에 예컨대, 아미노산(들)의 추가를 수반한다. 이 유사체는 면역반응성 에피토프 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 단편을 포함한 추가형 유사체는 단백질의 말단들 중 하나 또는 둘 다에 1 이상의 아미노산의 추가를 포함하며 예컨대, 융합 단백질을 포함한다.
치환형 유사체는 통상적으로 단백질 내의 1 이상의 위치에서 야생형의 하나의 아미노산이 다른 것으로 교환되며, 다른 기능 또는 성질의 손실 없이 폴리펩티드의 1 이상의 성질을 조절하도록 설계될 수 있다. 일 태양에서, 치환은 보존형 치환이다. "보존형 아미노산 치환"은 유사한 화학적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산으로의 아미노산의 치환을 의미한다. 보존형 치환을 만들기 위한 유사한 아미노산은 산성 측쇄(글루탐산, 아스파르트산); 염기성 측쇄(아르기닌, 리신, 히스티딘); 극성 아미드 측쇄(글루타민, 아스파라긴); 소수성, 지방족 측쇄(류신, 이소류신, 발린, 알라닌, 글리신); 방향족 측쇄(페닐알라닌, 트립토판, 티로신); 작은 측쇄(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌); 또는 지방족 히드록실 측쇄(세린, 트레오닌)을 갖는 것들을 포함한다.
유사체는 그들이 유도된 재조합 VWF와 실질적으로 상동이거나 실질적으로 동일할 수 있다. 바람직한 유사체는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예컨대 혈액 응고 활성의 적어도 일부를 보유하는 것들이다.
고려되는 폴리펩티드 변이체는 유비큐틴화, 폴리시알릴화를 포함한 글리코실화, 치료 또는 진단용 약제에의 결합, 표지, 페길화(폴리에틸렌 글리콜으로의 유도체화)와 같은 공유 중합체 부착, 가수분해 불가한 결합의 도입 및 화학적 합성에 의한, 인간 단백질에서 정상적으로 나타나지 않는 오르니틴과 같은 아미노산의 삽입 또는 치환과 같은 기술로 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 본 발명의 비 변형된 분자의 결합 성질을 보유한다. 이와 같은 화학적 변형은 약제의 VWF 폴리펩티드에의 직접 또는 간접(예컨대, 연결자를 통한) 부착을 포함할 수 있다. 간접 부착의 경우, 연결자가 가수분해 가능 또는 가수분해 불가능할 수 있다고 생각된다.
페길화된 폴리펩티드 유사체의 제조는 일반적으로 (a) 결합 구조체 폴리펩티드가 1 이상의 PEG기에 부착되게 되는 조건 하에서 폴리펩티드를 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응시키는 단계 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건은 알려진 지표 및 바람직한 결과에 기초해 결정될 것이다. 예컨대, PEG:단백질의 비가 클수록 폴리-페길화된 생성물의 백분율이 커진다. 일부 실시예에서, 결합 구조체는 N-말단에 단일 PEG 잔기를 가질 것이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 혈액 응고 인자에 부착되 더 긴 생체 내 반감기를 제공할 수 있다. PEG기는 임의의 알맞은 분자량일 수 있고 직선 또는 분지형일 수 있다. PEG의 평균 분자량은 약 2 킬로달튼("kD") 내지 약 100 kDa, 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa 범위이다. PEG기는 PEG 잔기 상의 자연 또는 가공된 반응성기(예컨대, 알데히드, 아미노, 티올 또는 에스테르기)를 통한 혈액 응고 인자 상의 반응성기(예컨대, 알데히드, 아미노 또는 에스테르기)에의 아실화 또는 환원성 알킬화를 통해 또는 해당 분야에 공지된 임의의 다른 기술에 의해 혈액 응고 인자에 부착된다.
폴리시알릴화된 폴리펩티드의 제조 방법은 미국 특허 공개 제20060160948호, 문헌 [Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341 : 26-34,1997] 및 문헌 [Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006]에 기술된다. 간단하게, 0.1 M NaIO4를 함유하는 콜로민산의 용액을 어둠 하에 실온에서 교반하여 CA를 산화시킨다. 활성화된 CA 용액을 어둠 하에 예컨대, pH 7.2의 0.05 M 인산 나트륨 완충액에 대해 투석하고 이 용액을 rVWF 용액에 첨가하여 18 시간 동안 상온에서 어둠 하에 부드럽게 흔들면서 인큐베이션한다. 그 후 한외여과/투석여과에 의해 rVWF-폴리시알산 접합체로부터 자유 시약을 분리할 수 있다. 글루타르알데히드를 가교제로 사용해서 rVWF의 폴리시알산과의 접합을 달성할 수도 있다(문헌 [Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004]).
추가로 본 발명의 폴리펩티드가 폴리펩티드인 제2 약제를 갖는 융합 단백질 일 수 있다고 생각된다. 일 실시예에서, 폴리펩티드인 제2 약제는, 제한 없이, 효소, 성장 인자, 항체, 사이토킨, 케모킨, 세포 표면 수용체, 세포 표면 수용체의 세포 외 영역, 세포 부착 분자 또는 상기한 단백질의 단편 또는 활성 영역이다. 관련된 실시예에서, 제2 약제는 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX와 같은 혈액 응고 인자이다. 고려되는 융합 단백질은 해당 분야에 주지된 화학적 또는 재조합 기술로 제조된다.
또한, 프레프로-VWF 및 프로-VWF 폴리펩티드가 본 발명의 제제 내에서 치료적 이점을 제공할 수 있다고 생각된다. 예컨대, 미국 특허 제7,005,502호는 시험관 내 트롬빈 생성을 유도하는 프로-VWF를 상당량 포함하는 제약 제제를 기술한다. 자연 발생 성숙 VWF의 재조합, 생물학적으로 활성인 단편, 변이체 또는 유사체 외에, 본 발명은 여기서 기술된 제제 내에 프레프로-VWF(서열 식별 번호: 2에 제시) 또는 프로-VWF 폴리펩티드(서열 식별 번호: 2의 아미노산 잔기 23 내지 764)의 재조합 생물학적 활성 단편, 변이체 또는 유사체의 사용을 고려한다.
단편, 변이체 및 유사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업자에 의해 쉽게 자연 발생 분자와 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 자연 발생 분자의 생물학적으로 활성인 단편, 변이체 또는 유사체를 암호화하도록 생성될 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술, DNA 암호화 분자의 소화/결합 등을 사용해 제조할 수 있다. 따라서, 당업자는 위치 특이적 돌연변이 유발을 포함하는, 그러나 여기에 제한되지 않는 해당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용해 변성된 코돈 및 미스센스 돌연변이를 불러오는 DNA 가닥 내의 단일 염기 변화를 생성할 수 있을 것이다. 여기서 사용된 바와 같이, 구 "적절히 엄격한 혼성화 조건"은 예컨대, 42 ℃에서 50 %의 포름아미드 내에서 혼성화 및 60 ℃에서 0.1 x SSC, 0.1 % SDS 내에서 세척을 의미한다. 당업자에게 혼성화될 서열의 길이 및 GC 뉴클레오티드 염기 함량에 기초해 이 조건의 변경이 일어날 수 있음이 이해된다. 정확한 혼성화 조건을 결정하기 위해 해당 분야에 표준인 공식들이 적절하다. 문헌 [Sambrook et al., 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]을 참조하라.
전반적인 제제 및 부형제
부형제는 그들이 약물 제품의 안정성 및 전달을 부과 또는 강화하기 때문에 제제 내에 포함되는 첨가제이다. 그들의 포함 이유에 관계없이, 부형제는 약물 제품의 일체적 성분이고 그에 따라 안전해야 하며 환자에게 우수하게 용인되어야 한다. 단백질 약물에 대해, 부형제의 선택은 그들이 약물의 효능 및 면역원성 둘 다에 영향을 줄 수 있기 때문에 특히 중요하다. 따라서, 단백질 제제는 적절한 안정성, 안전성 및 시장성을 제공하는 부형제를 적절히 선택하여 개발되어야 한다.
치료 단백질용 제제를 개발하는데 주요한 어려움은 제품을 제조, 운송 및 저장의 스트레스에 대해 안정화시키는 것이다. 제제 부형제의 역할은 이들 스트레스에 대해 안정화를 제공하는 것이다. 부형제는 전달을 가능하게 하고 환자의 편의를 강화하기 위해 고농도 단백질 제제의 점도를 감소시키는데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 부형제는 그들이 다양한 화학적 및 물리적 스트레스에 대해 단백질을 안정화하는 기전에 기초해 분류될 수 있다. 일부 부형제는 특정한 스트레스의 효과를 경감시키기 위해 또는 특정한 단백질의 특정 감수성을 규제하기 위해 사용된다. 다른 부형제는 단백질의 물리적 및 공유 안정성에 더 일반적인 효과를 갖는다. 여기에 기술된 부형제는 그들의 화학적 유형 또는 제제 내에서 그들의 기능적 역할에 의해 체계화된다. 각 부형제 유형에 대해 논할 때 안정화 방식의 간단한 설명을 제공한다.
여기서 제공된 교시 및 제시가 주어지면, 당업자는 생제약(예컨대, 폴리펩티드)의 안정성의 유지를 돕는 본 발명의 생제약 제제를 얻기 위해 임의의 특정한 제제 내에 어떤 양 또는 범위의 부형제가 포함될 수 있는지 알 것이다. 예컨대, 본 발명의 생제약 제제에 포함될 염의 양 및 유형은 최종 용액의 바람직한 오스몰 농도(즉, 등장성, 저장성 또는 고장성)와 제제 내에 포함될 다른 성분의 양 및 오스몰 농도에 기초해 선택될 수 있다. 유사하게, 제제 내에 포함되는 폴리올 또는 당의 유형을 참조한 예시에 의해, 그와 같은 부형제의 양은 그것의 오스몰 농도에 의존할 것이다.
예시의 방법으로, 약 5 % 소르비톨의 포함이 등장성을 달성할 수 있는 반면 등장성을 달성하기 위해 수크로스 부형제는 약 9 %가 필요하다. 본 발명의 생제약 제제 내에 포함될 수 있는 1 이상의 부형제의 양 또는 농도 범위의 선택은 염, 폴리올 및 당에 대해 상기에 예시하였다. 그러나, 당업자는 특정한 부형제를 참조해 여기서 기술되고 추가로 예시되는 고려 사항들이 예컨대, 염, 아미노산, 다른 등장화제, 계면활성제, 안정제, 벌크화제, 동결보호제, 동결건조보호제, 항산화제, 금속 이온, 킬레이트약 및/또는 보존제를 포함하는 부형제들의 모든 유형 및 조합에 동일하게 적용가능함을 이해할 것이다.
추가로, 특정한 부형제가 몰 농도로 보고된 경우, 당업자는 용액의 등가의 백분율(%) w/v(예컨대, (용액 샘플 내의 물질의 g수/용액의 mL) X 100%) 또한 고려됨을 알 것이다.
물론, 당업자는 여기서 기술된 부형제의 농도들이 특정한 제제 내에서 상호 의존성을 공유함을 알 것이다. 예시의 방법으로, 예컨대, 폴리펩티드 농도가 높은 경우 또는 예컨대 안정화제 농도가 높은 경우 벌크화제 농도는 낮아질 수 있다. 추가로, 당업자는 벌크화제가 없는 특정한 제제의 등장성을 유지하기 위해서는, 안정화제의 농도가 적절히 조절될 수 있음(즉, "등장화"량의 안정화제가 사용될 수 있다)을 알 것이다. 통상적인 부형제는 해당 분야에 공지되어 있고 문헌 [Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311]에서 찾을 수 있다.
완충액 및 완충화제
약리적으로 활성인 폴리펩티드 제제의 안정성은 일반적으로 좁은 pH 범위 내에서 최대인 것으로 관찰된다. 이 최적의 안정성의 pH 범위는 사전-제제 연구 중 조기에 확인되어야 한다. 몇몇 시도, 예컨대 가속화된 안정성 연구 및 열량계 선별 연구는 이 시도에 유용한 것으로 증명되었다(문헌 [Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)]). 일단 제제가 완성되면, 약물 생성물은 그것의 저장 기간 동안 제조되고 유지되어야 한다. 따라서, 제제 내의 pH를 조절하기 위해 완충화제가 거의 항상 사용된다.
유기산, 포스페이트 및 트리스가 단백질 제제 내에 완충액으로서 상용적으로 사용되었다. 완충종의 완충 용량은 pKa와 동일한 pH에서 최대이고 pH가 증가함에 따라 감소하거나 이 값으로부터 멀어질 때 감소한다. 완충 용량의 90 %가 그것의 pKa의 1 pH 단위 내에 존재한다. 완충 용량은 또한 증가하는 완충액 농도와 비례해 증가한다.
완충액을 선택할 시에는 몇몇 요소들을 고려해야 한다. 맨 먼저, 완충종 및 그것의 농도를 그것의 pKa 및 바람직한 제제 pH에 기초해 한정해야 한다. 동일하게 중요한 것은 완충액이 폴리펩티드 및 다른 제제 부형제와 혼화될 수 있으며 임의의 분해 반응을 촉매하지 않는지 분명히 하는 것이다. 고려되는 세 번째 중요한 점은 완충액이 투여시 유발할 수 있는 따가운 느낌 및 자극이다. 예컨대, 시트레이트는 주입시 따가운 고통을 불러온다고 알려져 있다(문헌 [Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)]). 찌르는 고통 및 자극의 가능성은 피하(SC) 또는 근육 내(IM) 경로를 통해 투여되는 약물에서 더 크며, 여기서는 투여시 제제가 빠르게 혈액 내로 희석되는 IV 경로로 투여될 때보다 상대적으로 더 긴 시간 기간 동안 약물 용액이 그 부위에 머문다. 직접적인 IV 주입에 의해 투여되는 제제에 대해, 완충액(및 임의의 다른 제제 성분)의 총 량이 감시되어야 한다. 인산 칼륨 완충액의 형태로 투여되는 칼륨 이온에 대해 특히 유의해야 하며, 칼륨 이온은 환자에게 심혈관계 효과를 유발할 수 있다(문헌 [Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)]).
본 조성물 내에 존재하는 완충액 시스템은 생리학적으로 적합하고 제약 제제의 바람직한 pH를 유지하도록 선택된다. 일 실시예에서, 용액의 pH는 pH 2.0 내지 pH 12.0이다. 예컨대, 용액의 pH는 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7 또는 12.0일 수 있다.
pH 완충 화합물은 제제의 pH를 소정의 수준으로 유지하는데 적절한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 일 실시예에서, pH 완충 농도는 0.1 mM 내지 500 mM(1 M)이다. 예컨대, pH 완충제는 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 mM 이상이라고 생각된다.
여기서 제시된 바와 같은 제제를 완충하기 위해 사용되는 예시적인 pH 완충제는 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스 및 아미노산 또는 아미노산의 혼합물을 포함하나 여기에 제한되지 않고, 아스파테이트, 히스티딘 및 글리신을 포함하나 여기에 제한되지 않는다.
염
제제의 이온 강도를 증가시키기 위해 염이 종종 첨가되고, 이는 단백질 용해도, 물리적 안정성 및 등장성에 중요할 수 있다. 염은 다양한 방법으로 단백질의 물리적 안정성에 영향을 줄 수 있다. 이온은 단백질 표면 위의 대전된 잔기에 결합해 단백질의 원 상태를 안정화시킬 수 있다. 대안으로서, 염은 단백질 주쇄(-CONH-)를 따라 펩티드기에 결합해 변성된 상태를 안정화시킬 수 있다. 염은 또한 단백질 분자 내의 잔기 사이의 밀어내는 정전기 상호작용을 차폐해 단백질 원 배좌를 안정화시킬 수 있다. 단백질 제제 내의 염은 단백질 응집 및 불용성을 야기할 수 있는 단백질 분자들 사이의 끌어당기는 정전기 상호작용을 차폐할 수도 있다. 주어진 제제 내에서, 염 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 내지 50O mM이다.
안정화제 및 벌크화제
본 제약 제제에서, 저장-유발된 응집 및 화학적 분해를 방지 또는 감소시키기 위해 안정화제(또는 안정화제들의 조합)를 첨가할 수 있다. 재구성시 흐리거나 혼탁한 용액은 단백질이 침전되거나 적어도 응집되었음을 나타낸다. 용어 "안정화제"는 수용액 상태에서 응집 또는 다른 물리적 분해와 화학적 분해(예컨대, 자기분해, 탈아미드화, 산화 등)를 방지할 수 있는 부형제를 의미한다. 제약 조성물에서 통상적으로 사용되는 안정화제는 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프럭토스, 만니톨, 소르비톨, 글리신, 아르기닌 HCL, 덱스트란, 전분, 히드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, N-메틸 피롤리덴, 셀룰로스 및 히알루론산과 같은 다당류를 포함한 폴리-히드록시 화합물, 염화 나트륨을 포함하나 여기에 제한되지 않는다(문헌 [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]). 본 제제에서, 안정화제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 또는 1000 mM의 농도로 도입된다.
바람직할 경우, 제제는 적절한 양의 벌크화 및 오스몰 농도 조절제를 포함할 수도 있다. 벌크화제는 예컨대, 만니톨, 글리신, 수크로스, 중합체, 예컨대 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스, 락토스, 소르비톨, 트레할로스 또는 크실리톨을 포함한다. 일 실시예에서, 벌크화제는 만니톨이다. 벌크화제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 또는 1000 mM의 농도로 도입된다.
계면활성제
단백질 분자는 표면과 상호작용하는 높은 경향을 가지며 이는 그들을 기체-액체, 바이알-액체 및 액체-액체(실리콘 기름) 계면에서 흡착 및 변성에 민감하게 만든다. 이 분해 경로는 단백질 농도에 역으로 의존하는 것으로 관찰되었으며 가용성 및 불용성 단백질 응집물의 형성 또는 표면에의 흡착에 의한 용액으로부터의 단백질의 손실을 불러온다. 용기 표면 흡착 외에, 표면-유도된 분해는 제품의 운송 및 취급 중 경험할 수 있는 바와 같이 물리적 교반으로 심화된다.
표면-유도된 분해를 방지하기 위해 계면활성제가 통상적으로 단백질 제제에 사용된다. 계면활성제는 계면 부위에 대해 단백질을 이길 수 있는 양친성 분자이다. 계면활성제 분자의 소수성 부분은 계면 부위(예컨대, 기체/액체)를 차지하는 반면 분자의 친수성 부분은 벌크 용액을 향해 배열되어 유지된다. 충분한 농도에서(통상적으로 세정제의 한계 미셀 농도 근처), 계면활성제 분자의 표면층은 단백질 분자가 계면에서 흡착되는 것을 방지하는 역할을 한다. 그로써, 표면-유도된 분해가 최소화된다. 가장 통상적으로 사용되는 계면활성제는 소르비탄 폴리에톡실레이트의 지방산 에스테르, 즉 폴리소르베이트(polysorbate) 20 및 폴리소르베이트 80이다. 이 둘은 각각 C-12 및 C-18인, 분자에 소수성 특징을 부여하는 지방족 사슬의 길이에 있어서만 다르다. 따라서, 폴리소르베이트 80이 폴리소르베이트 20보다 더 표면-활성적이고 더 낮은 한계 미셀 농도를 갖는다.
세정제는 또한 단백질의 열역학적 배좌 안정성에 영향을 줄 수 있다. 여기서 다시, 주어진 세정제 부형제의 효과는 단백질 특이적일 것이다. 예컨대, 폴리소르베이트는 일부 단백질의 안정성을 감소시키고 다른 것들의 안정성은 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 단백질의 세정제 불안정화는 부분적으로 또는 완전히 언폴딩된 단백질 상태와 특이적 결합을 할 수 있는 세정제 분자의 소수성 꼬리로 설명될 수 있다. 이들 유형의 상호작용은 배좌 평형이 더 확장된 단백질 상태로 옮겨지는 것을 야기할 수 있다(즉, 결합하는 폴리소르베이트를 보완하여 단백질 분자의 소수성 부분의 노출을 증가시킨다). 대안으로서, 단백질 원 상태가 일부 소수성 표면을 보이는 경우, 원 상태에 결합하는 세정제는 그 배좌를 안정화시킬 수 있다.
폴리소르베이트의 또 다른 특징은 그들이 본질적으로 산화 분해에 민감하다는 것이다. 종종, 원료로서, 그들은 단백질 잔기 측쇄, 특히 메티오닌의 산화를 야기하기에 충분한 양의 과산화물을 함유한다. 안정제의 첨가로 야기되는 산화성 손상의 가능성은 제제 내에 가장 낮은 유효 농도의 부형제가 사용되어야 할 지점을 강조한다. 계면활성제에서, 주어진 단백질에 대한 유효 농도는 안정화 기전에 의존할 것이다. 계면활성제 안정화의 기전이 표면-변성의 방지와 관련된 경우 유효 농도는 세정제의 한계 미셀 농도 근처일 것이라고 추정된다. 역으로, 안정화의 기전이 특이적 단백질-세정제 상호작용과 관련된 경우, 유효 계면활성제 농도는 단백질 농도 및 상호작용의 화학양론에 관계될 것이다(문헌 [Randolph T. W., et al., Pharm Biotechnol, 13: 159-75 (2002)]).
냉동 및 건조 중 표면과 관계된 응집 현상을 방지하기 위해 적절한 양의 계면활성제를 첨가할 수도 있다(문헌 [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85: 1325, (1996)]). 예시적인 계면활성제는 자연 발생 아미노산으로부터 유도된 계면활성제를 포함한 음이온성, 양이온성, 비이온성, 쯔비터 이온성 및 양성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면활성제는 소듐 라우릴 술페이트, 디옥틸 소듐 술포숙시네이트 및 디옥틸 소듐 술포네이트, 키노데옥시콜린산, N-라우로일사르코신 소듐염, 리튬 도데실 술페이트, 1-옥탄술폰산 소듐염, 소듐 콜레이트 수화물, 소듐 데옥시콜레이트 및 글리코데옥시콜린산 소듐염을 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 양이온성 계면활성제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 일수화물 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 쯔비터 이온 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO, SB3-10 및 SB3-12를 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 비이온성 계면활성제는 디기토닌, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈-20 및 트윈-80을 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 계면활성제는 또한 라우로매크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥실(polyoxyl) 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 40, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 대두 레시틴 및 다른 인지질, 예컨대 디올레일 포스파티딜 콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜 글리세롤(DMPG), 디미리스토일포스파티딜 콜린(DMPC) 및 (디올레일 포스파티딜 글리세롤) DOPG; 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복실메틸 셀룰로스도 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 따라서 이들 계면활성제를 포함하는 조성물은 개별적으로 또는 상이한 비율의 혼합물들로서 추가로 제공된다. 본 제제에서, 계면활성제는 약 0.01 내지 약 0.5 g/L의 농도로 도입된다.
다른 일반적인 부형제 성분
아미노산
아미노산은 단백질 제제 내에서 완충액, 벌크화제, 안정제 및 항산화제로서다양한 용도를 갖는다. 히스티딘 및 글루탐산은 각각 5.5-6.5 및 4.0-5.5의 pH 범위 내의 완충액 단백질 제제에 사용된다. 히스티딘의 이미다졸기는 pKa=6.0를 갖고 글루탐산 측쇄의 카르복실기는 4.3의 pKa를 가지며, 이는 이들 아미노산을 그들 각각의 pH 범위 내에서 완충에 적절하게 만든다. 이와 같은 경우 글루탐산(예컨대, 스템젠(Stemgen)®)이 특히 유용하다. 히스티딘은 판매되는 단백질 제제(예컨대, 졸레어(Xolair)®, 헤르셉틴(Herceptin)®, 리콤비네이트(Recombinate)®)에서 통상적으로 발견되며 이 아미노산은 주입시 따갑다고 알려진 시트레이트의 대체물을 제공한다. 흥미롭게도, 히스티딘은 ABX-IL8(IgG2 항체)를 가진 제제 내에서 관찰되는 바와 같이, 액체 및 동결건조된 형태 둘 다에서 고농도로 사용될 시의 응집에 대해 안정화 효과도 갖는다고 보고되었다(문헌 [Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)]). 히스티딘(60 mM 까지)은 또한 이 항체의 고농도 제제의 점성을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 그러나, 동일한 연구에서, 저자들은 스텐레스강 용기 내 항체의 냉동-해동 연구 중 히스티딘 함유 제제에서 증가된 응집 및 변색을 관찰했다. 저자들은 이것이 강 용기의 부식에서 침출된 철 이온의 효과 때문이라고 생각했다. 히스티딘의 다른 주의할 점은 그것이 금속 이온 존재 하에 광-산화된다는 것이다(문헌 [Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)]). 제제 내에 항산화제로서 메티오닌의 사용이 바람직해 보인다; 그것은 수많은 산화성 스트레스에 효과적인 것으로 관찰되었다(문헌 [Lam XM, et al., J Pharm Sci, 86(11): 1250-5 (1997)]).
아미노산 글리신, 프롤린, 세린 및 알라닌은 우선 배제의 기전에 의해 단백질을 안정화하는 것으로 밝혀졌다. 글리신은 또한 동결건조된 제제(예컨대, 뉴메가(Neumega)®, 제노트로핀(Genotropin)®, 휴마트로프(Humatrope)®) 내에 통상적으로 사용되는 벌크화제이다. 아르기닌은 응집을 억제하는데 효과적인 약제임이 밝혀졌고 액체 및 동결건조된 제제(예컨대, 액티베이스(Activase)®, 아보넥스(Avonex)®, 엔브렐(Enbrel)® 액체) 둘 다내에 사용되었다. 추가로, 아르기닌 존재 하의 특정한 단백질의 증강된 재절첩 효율은 그것의 재절첩 중 경쟁 응집 반응의 억제에 기인한다.
항산화제
단백질 잔기의 산화는 수많은 상이한 원인에 의한다. 특정한 항산화제의 첨가 이외에, 산화성 단백질 손상의 방지는 제품의 제조 공정 및 저장 중의 수많은 요소, 예컨대 대기중 산소, 온도, 빛 노출 및 화학적 오염의 세심한 조절을 수반한다. 가장 통상적으로 사용되는 제약용 항산화제는 환원제, 산소/자유-라디칼 제거제 또는 킬레이트약이다. 치료용 단백질 제제 내의 항산화제는 수용성이며 제품 저장기간 동안 활성이 유지된다. 환원제 및 산소/자유-라디칼 제거제는 용액 내의 활성 산소종을 제거함으로써 작용한다. EDTA와 같은 킬레이트약은 자유 라디칼 형성을 촉진하는 미량의 금속 오염물질에 결합함으로써 효과적이다. 예컨대, EDTA는 산성 섬유모세포 성장 인자의 액체 제제에 사용되어 시스테인 잔기의 금속 이온 촉매된 산화를 방지하였다. EDTA는 키네렛(Kineret)® 및 온탁(Ontak)®과 같은 판매되는 제품에 사용되었다.
단백질 산화를 방지하는 다양한 부형제의 효능 외에, 항산화제 그 자체가 단백질에 다른 공유 또는 물리적 변화를 유발할 수 있는 가능성도 고려된다. 예컨대, 환원제는 분자 내 이황화물 결합의 파괴를 야기할 수 있고, 이는 이황화물 전가를 불러올 수 있다. 전이 금속 이온 존재 하에, 아스코르브산 및 EDTA가 수많은 단백질 및 펩티드에서 메티오닌 산화를 촉진함이 밝혀졌다(문헌 [Akers MJ, and Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions], 문헌 [Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors], 문헌 [Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)]); 문헌 [Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): 4046- 1050 (1997)]; 문헌 [Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)]. 티오황산 나트륨이 rhuMab HER2에서 빛 및 온도 유발된 메티오닌 산화의 수준을 감소시킨다고 보고되었으나; 이 연구에서 티오황산-단백질 첨가물의 생성 역시 보고되었다(문헌 [Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)]). 특정한 스트레스 및 단백질의 민감성에 따라 적절한 항산화제를 선택한다.
금속 이온
일반적으로, 전이 금속 이온은 그들이 단백질 내의 물리적 및 화학적 분해 반응을 촉매할 수 있기 때문에 단백질 제제에서 바람직하지 않다. 그러나, 특정한 금속 이온들은 그들이 단백질의 보조인자인 경우 제제 내에 및 그들이 배위 착물을 형성하는 단백질의 현탁액 제제 내에 포함된다(예컨대, 인슐린의 아연 현탁액). 최근, 아스파르트산의 이소아스파르트산으로의 이성질화를 억제하는데 마그네슘 이온(10-120 mM)의 사용이 제안되었다(WO 2004039337).
금속 이온이 단백질에 안정성 또는 증가된 활성을 부과하는 두 예는 인간 데옥시리보뉴클레아제(rhDNase, 풀모자임(Pulmozyme)®) 및 인자 VIII이다. rhDNase의 경우, Ca+2 이온(100 mM 까지)이 특이적 결합 부위를 통해 효소의 안정성을 증가시킨다(문헌 [Chen B, et al., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)]). 사실, EGTA를 갖는 용액으로부터 칼슘 이온의 제거는 탈아미드화 및 응집의 증가를 야기했다. 그러나, 이 효과는 Ca+2 이온에 대해서만 관찰되었고; 다른 2가 양이온 Mg+2, Mn+2 및 Zn+2는 rhDNase를 불안정화시키는 것으로 관찰되었다. 인자 VIII에서 유사한 효과가 관찰되었다. Ca+2 및 Sr+2 이온은 단백질을 안정화하는 반면 다른 것들, 예컨대 Mg+2, Mn+2 및 Zn+2, Cu+2 및 Fe+2는 효소를 불안정화시켰다(문헌 [Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997)]). 인자 VIII로의 별도의 연구에서, Al+ 3 이온 존재시 응집률의 상당한 증가가 관찰되었다(문헌 [Derrick TS, et al., J. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)]). 저자들은 완충액 염과 같은 다른 부형제들이 종종 Al+3 이온으로 오염됨을 알았으며 제제 생성물 내에 적절한 품질의 부형제 사용의 필요성을 설명했다.
보존제
동일 용기로부터의 1 회 이상의 추출을 수반하는 다회 사용 비경구 제제의 개발시 보존제가 필수적이다. 그들의 주요한 역할은 약물 제품의 저장 기간 또는 사용 기간 동안 미생물 성장의 억제 및 제품 무균성의 보장이다. 통상적으로 사용되는 보존제는 벤질 알콜, 페놀 및 m-크레졸을 포함한다. 보존제가 오랜 사용의 역사를 가지지만, 보존제를 포함하는 단백질 제제의 개발은 어려울 수 있다. 보존제는 거의 항상 단백질에 대해 불안정화 효과(응집)를 가지며 이것은 다수회 복용 단백질 제제에 그들의 사용을 제한하는데 중요한 요소가 되었다(문헌 [Roy S, et al, J Pharm Sci, 94(2): 382-96 (2005)]).
현재까지, 대부분의 단백질 약물들은 1 회 사용용으로만 제제화되었다. 그러나, 다수회 복용 제제가 가능한 경우, 그들은 환자의 편의의 허용 및 증가된 시장성의 추가의 장점을 갖는다. 좋은 예는 보존된 제제의 개발이 더 편리한, 다수회 사용 주입 펜 형태의 상업화를 불러온 인간 성장 호르몬(hGH)의 그것이다. hGH의 보존된 제제를 함유하는 4 개 이상의 이와 같은 펜 기기가 현재 시장에서 입수가능하다. 노르디트로핀(Norditropin)®(액체, 노보 노르디스크(Novo Nordisk)), 누트로핀(Nutropin) AQ®(액체, 제넨테크(Genentech)) 및 게노트로핀(Genotropin)(동결건조된 2 중 챔버 카트리지, 파마시아 & 업존(Pharmacia & Upjohn))은 페놀을 함유하는 반면 소마트로프(Somatrope)®(엘리 릴리(Eli Lilly))는 m-크레졸로 제제화된다.
몇몇 측면이 보존된 투여 형태 제제 개발 중 고려되어야 한다. 약물 제품 내의 유효 보존제 농도는 최적화되어야 한다. 이것은 투여 형태 내의 주어진 보존제를 단백질 안정성을 악화시킴이 없이 향균 효과를 부과하는 농도 범위에서 시험하는 것을 필요로 한다. 예컨대, 시차 주사 열량법(DSC)을 사용해 인터루킨-1 수용체(유형 I)용 액체 제제의 개발에 3 개의 보존제를 성공적으로 선별했다. 보존제는 판매되는 제품에 통상적으로 사용되는 농도에서 그들의 안정성에의 영향에 기초해 순위 매겨졌다(문헌 [Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)]).
몇몇 보존제들은 주입 위치 반응을 야기할 수 있고, 이는 보존제를 선택할 때 고려해야 할 또 다른 요소이다. 노르디트로핀 내의 보존제 및 완충액의 평가에 초점을 둔 임상 실험에서, m-크레졸을 함유하는 제제에 비해 페놀 및 벤질 알콜을 함유하는 제제에서 통증 인식이 더 낮아지는 것으로 관찰되었다(문헌 [Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)]). 흥미롭게도, 통상적으로 사용되는 보존제들 중, 벤질 알콜은 마취성을 갖는다(문헌 [Minogue SC, and Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)]).
동결건조
또한 본 발명의 VWF 폴리펩티드를 포함하는 제제가 투여 전 동결건조 될 수 있음이 고려된다. 동결건조는 해당 분야에 일반적인 기술을 사용해 수행되고 개발되는 조성물에 최적화되어야 한다(문헌 [Tang et al., Pharm Res. 21 : 191-200, (2004)] 및 문헌 [Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)]).
동결건조 주기는, 일 태양에서, 세 단계로 구성된다: 냉동, 1차 건조 및 2차 건조(문헌 [A.P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278: 167 (1977)]). 냉동 단계에서, 용액은 얼음 형성이 시작되도록 냉각된다. 추가로, 이 단계는 벌크화제의 결정화를 유도한다. 1차 건조 단계에서 얼음이 승화되며, 이는 진공을 이용해 챔버 압력을 얼음의 증기압 미만으로 감소시키고 열을 가해 승화를 촉진시킴으로써 수행한다. 최종적으로, 2차 건조 단계에서 감소된 챔버 압력 및 증가된 선반 온도하에 흡착 또는 결합된 물을 제거한다. 공정은 동결건조된 케이크로 알려진 물질을 생성한다. 그 후 주입을 위해 케이크를 멸균수 또는 적절한 희석제로 재구성할 수 있다.
동결건조 주기는 부형제의 최종적인 물리적 상태를 결정할 뿐 아니라 재구성 시간, 외형, 안정성 및 최종 수분 함량과 같은 다른 지표에도 영향을 준다. 냉동 상태의 조성물 구조는 특정한 온도에서 일어나는 몇 번의 전이(예컨대, 유리 전이, 습윤 및 결정화)를 겪으며 동결건조 공정을 이해하고 최적화하는데 사용될 수 있다. 유리 전이 온도(Tg 및/또는 Tg')는 용질의 물리적 상태에 관한 정보를 제공할 수 있고 시차 주사 열량법(DSC)으로 측정될 수 있다. Tg 및 Tg'는 동결건조 주기를 설계할 때 반드시 고려해야 하는 중요한 지표이다. 예컨대, Tg'는 1차 건조에 중요하다. 추가로, 건조된 상태에서, 유리 전이 온도는 최종 제품의 저장 온도에 대한 정보를 제공한다.
제조 방법
본 발명은 추가로 제약 제제의 제조 방법을 고려한다. 다양한 수성 담체, 예컨대, 주입용 멸균수, 다수 복용량 사용을 위해 보존제를 갖는 물 또는 적절한 양의 계면활성제를 갖는 물(예컨대, 폴리소르베이트-20), 0.4 % 식염수, 0.3 % 글리신 또는 수성 현탁액은 수성 현탁액 제조에 적절한 부형제와의 혼합물 내에 활성 화합물을 함유할 수 있다. 다양한 태양에서, 이와 같은 부형제는 현탁제, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 분산 또는 습윤제는 자연 발생 인지질, 예컨대 레시틴 또는 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 또는 에틸렌 옥시드와 긴 사슬 지방족 알콜의 축합 생성물, 예컨대 헵타데카에틸렌옥시세탄올 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분적인 에스테르의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분적인 에스테르의 축합 생성물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 수성 현탁액은 1 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트를 함유할 수도 있다.
투여
조성물을 인간 또는 시험 동물에게 투여하기 위해, 일 태양에서, 조성물은 1 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 용어 "제약학적으로" 또는 "약리적으로" 허용된다는 것은 하기한 바와 같이, 해당 분야에 주지된 경로를 사용해 투여될 시 안정하고, 단백질 분해, 예컨대 응집 및 절단 생성물을 억제하며 추가로 알레르기성 또는 다른 부작용을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. "제약학적으로 허용되는 담체"는 위에서 개시된 약제를 포함한 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
제약 제제는 경구로, 국부적으로, 경피적으로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 질내로, 직장으로 또는 두개 주입에 의해 투여될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같은 용어 비경구는 피하 주입, 정맥 내, 근육 내, 대조 내 주입 또는 침제법을 포함한다. 정맥 내, 진피 내, 근육 내, 유방 내, 복막 내, 수막강 내, 구후로, 폐 내 주입 및 또는 특정 부위에서의 외과적 이식에 의한 투여 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물은 실질적으로 발열인자와 수용자에게 유해할 수 있는 다른 불순물을 갖지 않는다.
치료하는 의사에 의해 선택되는 복용량 수준 및 패턴으로 조성물의 단일 회 또는 다수 회 투여를 수행할 수 있다. 병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 용량은 상기 정의한 바와 같이 치료되는 병의 유형, 중증도 및 병의 경로, 약물이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 환자의 병력과 약물에 대한 반응 및 주치의의 재량에 의존할 것이다.
키트
추가적인 태양으로, 발명은 대상에 투여를 위한 사용을 용이하게 하는 방식으로 포장된 1 이상의 제약 제제를 포함하는 키트를 포함한다. 일 실시예에서, 이와 같은 키트는 실시 방법에서 화합물 또는 조성물의 용도를 기술하는, 포장에 포함된 또는 용기에 부착된 라벨을 갖는 밀봉된 병 또는 통과 같은 용기 내에 포장된 여기서 기술된 제약 제제(예컨대, 치료용 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조성물)를 포함한다. 일 실시예에서, 제약 제제는 용기의 빈 공간 부분의 크기(예컨대, 액체 제제와 용기 최상부 사이 공기의 양)가 매우 적도록 용기 내에 포장된다. 바람직하게, 빈 공간 부분의 크기는 무시할 수 있다(즉, 거의 없다). 일 실시예에서, 키트는 치료용 단백질 또는 펩티드 조성물을 갖는 제1 용기 및 조성물용의 생리학적으로 허용가능한 재구성 용액을 갖는 제2 용기를 수용한다. 일 태양에서, 제약 제제는 단일 용량 형태로 포장된다. 키트는 추가로 특정한 투여 경로를 따라 제약 제제를 투여하는데 적절한 기기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 키트는 제약 제제의 용도를 기술하는 라벨을 갖는다.
용량
여기에 기술된 증상을 치료하는 방법에 수반되는 투여 요법은 주치의에 의해, 약물의 작용을 변형시키는 다양한 요소, 예컨대 환자의 나이, 증상, 몸무게, 성별 및 식단, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상적 요소들을 고려해 결정될 것이다. 예시의 방법으로, 본 발명의 재조합 VWF의 통상적인 투여량은 대략 500 μg/kg과 동일한 50 U/kg이다.
본 발명의 제제는 최초의 1 회 후 약물 제품의 치료적 순환 수준의 유지를 위한 연속적인 주입에 의해 투여될 수 있다. 또 다른 예로서, 발명의 화합물은 1 회 투여량으로 투여될 수 있다. 해당 분야의 당업자는 우수한 의학 실험 및 개별적인 환자의 임상적 증상에 의해 결정된 바와 같은 유효 용량 및 투여 요법을 쉽게 최적화할 수 있을 것이다. 투약의 빈도는 약제의 약동학적 지표 및 투여의 경로에 의존할 것이다. 최적의 제약 제제는 당업자에 의해 투여의 경로 및 바람직한 용량에 따라 결정될 것이다. 예를 들면, 개시내용이 여기에 참조로 도입된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712]을 참조. 이와 같은 제제는 투여된 약제의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출률 및 생체 내 클리어런스율에 영향을 줄 수 있다. 투여 경로에 따라, 몸무게, 몸 표면적 또는 장기 크기에 따라 적절한 투여량을 계산할 수 있다. 적절한 투여량-반응 자료와 혈액 수준 용량 측정용 확립된 검정법의 사용을 통해 적절한 용량을 확인할 수 있다. 최종 투여 요법은 주치의에 의해, 약물의 작용을 변형시키는 다양한 요소들, 예컨대 약물의 특이적 활성, 손상의 중증도 및 환자의 반응, 환자의 나이, 증상, 몸무게, 성별 및 식단, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상적 요소들을 고려해 결정될 것이다. 연구들이 수행되면서, 다양한 병 및 증상에 대한 적절한 용량 수준 및 치료의 기간에 관한 추가의 정보가 생겨날 것이다.
아래의 예들은 제한을 의도한 것이 아니라, 발명의 특정예의 예시일 뿐이다.
예 1
진탕 실험
다양한 제제 내에서 rVWF의 침전량을 측정하기 위해, 와류 진탕 후 rVWF의 %회수율을 다양한 조건 하에서 시험했다.
애드베이트 완충액(90 mM NaCl, 1.68 mM CaCl2, 10 mM L-히스티딘, 10 mM 트리스, 0.26 mM 글루타티온, 23.4 mM 트레할로스, 175.7 mM 만니톨 및 0.1g/L 트윈-80, pH 7.0) 또는 애드베이트 1:3 완충액(물에 3 배로 희석된 애드베이트 완충액)을 실온(RT)에서 0 분, 1 분, 2.5 시간 또는 4 일 동안 진탕기 위에서 와류 진탕하였고 진탕 전 출발 물질에 대해 rVWF의 %회복률을 측정하였다. 표 1에 나타냈듯이, 애드베이트 완충액에서 약 40-80 %의 손실이 관찰된 반면, 애드베이트 1:3 완충액에서는 약 20-30 %의 손실이 관찰되었다. VWF 항원 VWF:Ag는 다중클론 안티-VWF 항원을 사용하는 VWF-특이적 엘리사(ELISA)에서 검출될 수 있는 VWF의 양과 상응했으나, VWF:RCo는 리스토세틴 존재시 안정화된 혈소판의 교착을 야기하는 VWF의 양과 상응했다. 두 경우 모두에서, 현행 WHO 표준에 대해 검량된 인간 기준 혈장을 표준으로 사용했다(기준 혈장 1 ml는 통상적으로 IU VWF를 함유한다).
진탕 실험에서 냉동/해동 및 동결건조의 효과 또한 시험했다. -20 ℃의 냉각실 또는 드라이 아이스 위에서 -20 ℃에서 냉동을 수행했고, 두 경우 모두 RT에서 해동했으며 두 경우 모두 액체 제제에서 시작하였다. 동결건조에 대해, 여기서 기술된 제제화된 VWF 샘플을 <=-40 ℃에서 파일럿 규모 동결건조기 내에서 냉동시켰고 표준 료(lyo) 프로그램을 사용해 동결건조했다. 액체 제제(5 ml 바이알 내 2 ml)로 직접 진탕을 수행했다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 애드베이트 완충액에 비해 애드베이트 1:3 완충액에서 rVWF의 %회수율이 더 높았다.
또한 진탕 실험에서 빈 공간 부분을 갖는 또는 빈 공간 부분을 갖지 않는, 주사기 내에 저장되는 rVWF로 %회수율을 측정했다. 흥미롭게도, rVWF가 빈 공간 부분 없이 주사기 내에 저장되고 상기한 바와 같이 진탕될 시, rVWF 침전이 관찰되지 않았다. 반면, rVWF가 빈 공간 부분을 갖도록 주사기 내에 저장된 경우, 어느 정도의 침전이 관찰되었다.
요약하면, 와류 진탕은 애드베이트 완충액 또는 애드베이트 1:3 완충액 내에서 30 % 이상의 rVWF 손실을 야기했고, 애드베이트 완충액이 애드베이트 1:3 완충액에 비해 더 높은 회수율 손실을 보였다. 흥미롭게도, 와류 진탕 실험에서 관찰되는 동일한 침전이 rVWF가 저장 및 자동차 안에서 ~5000 km 이송되었을 때(이송 중 예상되는 진탕을 나타낸다)에는 관찰되지 않았다. rVWF의 침전은 빈 공간 부분 없이 주사기 내에 저장됨으로써 제거될 수 있다.
예 2
재조합 VWF의 안정성
다양한 제제 내에 존재하는 rVWF의 활성 수준을 평가함으로써 rVWF의 안정성을 시험했다.
도 1에 도시된 바와 같이, rVWF는 0.3 mM 글루타티온의 존재 때문에 애드베이트 완충액 내에서 26 주 후 안정하지 않았다. 그러나 도 2에 도시된 바와 같이, rVWF는 애드베이트 1:3 완충액 내에서 더 안정했다(예컨대, 4 ℃에서 12 주까지).
도 3에 도시된 바와 같이, 시트레이트계 제제(15 mM 구연산 나트륨, 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl, pH 7.0)의 안정성은 0.1 M 글루타티온을 함유하는 애드베이트 1:3 완충액보다 더 우수했다.
유사하게, 다양한 완충액 내에서 rVWF의 농도를 시간에 따라 측정하였다. 도4, 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, rVWF의 농도는 각각 애드베이트 완충액, 애드베이트 1:3 완충액 및 시트레이트계 완충액에서 시간이 지남에 따라 안정했다.
예 4
액체 제제의 성상 확인
다양한 완충액 내의 단백질(rVWF) 언폴딩 정도를 평가하기 위해 시차 주사 열량법(DSC)을 사용했다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 애드베이트 완충액 pH 7.0이 안정화에 최적이었다.
DSC는 샘플과 기준의 온도를 증가시키기 위해 요구되는 열의 양 차이를 온도의 함수로 측정하는 열분석학적 기술이다. DSC 실험의 결과는 열 유동 대 온도 또는 시간의 곡선이다.
시차 주사 열량계는 가열하고 냉각하면서 일정 범위의 온도에서 주사할 수 있으며, 설정 온도에 달하기 위해 필요한 열의 양을 측정함으로써 상 전이, 즉 용융, 결정화 또는 유리 전이를 결정한다. 공지된 열용량 Cp 및 융점을 갖는 일련의 순수 금속(아연, 인듐 및 주석)으로 열량계를 검량했다. 각각의 기준 완충액을 기준 모세관 내에 위치시켰고 rVWF 샘플을 기기의 샘플 모세관 내에 위치시켰다.
추가로, 도 7에 도시된 바와 같이, 대부분의 제제 부형제들은 언폴딩 온도를 약 1-2 ℃ 증가시켰다. 도 8은 10 mM CaCl2가 언폴딩 온도를 ~8 ℃ 내지 ~67 ℃, 애드베이트 완충액에 의해서도 달성될 수 있는 언폴딩 온도로 증가시킴을 보여준다. 도 9에 도시된 바와 같이 CaCl2의 이 효과는 pH 7.3 및 6.5에서 유사하다. 최종적으로, 트레할로스 및 수크로스의 효과를 언폴딩 온도에 대해 분석했다. 시트레이트 단독에 비해, 트레할로스 또는 수크로스는 rVWF의 언폴딩 온도를 증가시키지 않았다. 다양한 부형제 존재 시의 rVWF에 대한 언폴딩 온도(Tmax) 자료의 요약을 표 4에 제시했다.
다양한 완충액 외에, 애드베이트 완충액 내의 다양한 pH 값에서 rVWF의 언폴딩 온도를 평가하는데에 DSC를 사용했다. 결과를 아래 표 5에 나타냈다. 애드베이트 완충액 pH 7.0이 rVWF의 안정화에 최적(즉, 가장 높은 언폴딩 온도; 피크 1)이었다.
다양한 기간 동안 다양한 온도에서 저장 후 애드베이트 완충액 및 애드베이트 1:3 완충액 내 rVWF의 형광 스펙트럼을 평가했다. 애드베이트 또는 애드베이트 1:3 완충액에서 0 내지 28 일간 40 ℃에서 저장 후 형광 스펙트럼의 변화가 관찰되지 않았다(또는 약간만 관찰되었다). 다른 온도에서 차이가 관찰되지 않았다.
유사하게, 겔여과(수퍼로즈(Superose) 6)를 사용해 rVWF의 분해를 평가했다. 애드베이트 완충액에서 4 ℃에서 26 주 후 약간의 분해가 관찰되었으나, 애드베이트 1:3 완충액에서 4 ℃에서 26 주 후 거의 분해가 관찰되지 않았다. 40 ℃에서, 글루타티온은 (비록 애드베이트 1:3 완충액에서 더 느린 정도에도 불구하고) 시간에 따른 분해의 양을 증가시켰다.
상기 예에 기초해, 애드베이트 1:3 완충액은 희석되지 않은 애드베이트 완충액에 비해 냉동/해동 및 동결건조 후 회수율에 있어서 이점을 제공한다. 또한, 애드베이트 1:3 완충액은 애드베이트 완충액보다 40 ℃에서 인큐베이션 중 rVWF 활성을 더 잘 안정화(예컨대, 생물학적 활성을 유지)시킬 수 있다. 애드베이트 1:3 완충액 내의 rVWF는 4 ℃에서 4 주간 인큐베이션할 동안 안정하다. 최종적으로, DSC는 pH 7.0이 rVWF의 분해를 억제하는데 최적(즉, 가장 높은 언폴딩을 보였다)임을 증명했다.
따라서, 여기에 도시된 자료의 관점에서, NaCl에 의해 바람직한 오스몰 농도로 조절된, pH 6.5-7.3의 15 mM 시트레이트(또는 글리신 또는 히스티딘), 10 mM CaCl2를 포함하는 제제가 rVWF에 대해 제안되었다. 예컨대, 일 실시예에서, 시트레이트계 제제는 15 mM 구연산 나트륨, 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl, pH 7.0이었다.
대안으로서, 글루타티온을 갖지 않는 애드베이트 또는 애드베이트 1:3 완충액 또한 고려된다: 애드베이트: 9O mM NaCl, 1.68 mM CaCl2, 1O mM L-히스티딘, 1O mM 트리스, 0.26 mM 글루타티온, 23.4 mM 트레할로스, 175.7 mM 만니톨 및 O.l g/L 트윈-80, pH 7.0; 애드베이트 1:3: 30 mM NaCl, 0.56 mM CaCl2, 3.3 mM L-히스티딘, 3.3 mM 트리스, 7.8 mM 트레할로스, 58.6 mM 만니톨 및 0.03g/L 트윈-80, pH 7.0.
SEQUENCE LISTING
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> prepro-vWF
<400> 1
agctcacagc tattgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt 60
tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg 120
gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg 180
gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt 240
gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt 300
gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct 360
tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg 420
cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca 480
gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt 540
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gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga 780
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gcagaagggc ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg 960
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tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca 1080
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ccctgtggac tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt 3360
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gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga 4080
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ggcctttgtg gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc 4200
cgtggtggag taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc 4260
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ggatgtggcg ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag 4800
caaggagttc atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt 4860
cacggtgctg cagtactcct acatggtgac tgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc 4920
caaaggggac atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa 4980
cactgggctg gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg 5040
ggagcaggcg cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa 5100
gaggctgcct ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca 5160
ggagctggag aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct 5220
cccccgagag gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat 5280
ccccaccctc tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga 5340
tggctcctcc agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt 5400
catttcaaaa gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag 5460
catcaccacc attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct 5520
tgtggacgtc atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc 5580
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catcctggtc acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc 5700
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ccctaccatg gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag 5880
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caactgtgac cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga 6060
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cagtgacatg gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa 6360
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cccctcgggc tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga 7980
gcgcatggag gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat 8040
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tcttgcaaaa ggc 8833
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<211> 2783
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<223> Synthetic Polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> prepro-vWF
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Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Leu Ile Leu Pro Gly
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Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly Ser Met Tyr
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Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly Cys Gln Lys
50 55 60
Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys Arg Val Ser
65 70 75 80
Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu Phe Val Asn
85 90 95
Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro Tyr Ala Ser
100 105 110
Lys Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys Leu Ser Gly Glu Ala Tyr
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Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly Asn Phe Gln Val Leu Leu
130 135 140
Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asn
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Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln Glu Gly Thr Leu Thr Ser
165 170 175
Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala Leu Ser Ser Gly Glu Gln
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Trp Cys Glu Arg Pro Ser Ser Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met
195 200 205
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Phe Ala Arg Cys His Pro Leu Val Asp Pro Glu Pro Phe Cys Glu Lys
225 230 235 240
Thr Leu Cys Glu Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu
245 250 255
Leu Glu Tyr Ala Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly
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Trp Thr Asp His Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu
275 280 285
Tyr Arg Gln Cys Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His
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Ile Asn Glu Met Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro
305 310 315 320
Glu Gly Gln Leu Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys
325 330 335
Pro Cys Val His Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser
340 345 350
Arg Asp Cys Asn Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser
355 360 365
Asn Glu Glu Cys Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe
370 375 380
Lys Ser Phe Asp Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr
385 390 395 400
Leu Leu Ala Arg Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu
405 410 415
Thr Val Gln Cys Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val
420 425 430
Thr Val Arg Leu Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His
435 440 445
Gly Ala Gly Val Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu
450 455 460
Lys Gly Asp Leu Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu
465 470 475 480
Ser Tyr Gly Glu Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu
485 490 495
Leu Val Lys Leu Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys
500 505 510
Gly Asn Tyr Asn Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly
515 520 525
Leu Ala Glu Pro Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His
530 535 540
Gly Asp Cys Gln Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu
545 550 555 560
Asn Pro Arg Met Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr
565 570 575
Ser Pro Thr Phe Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr
580 585 590
Leu Arg Asn Cys Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu
595 600 605
Cys Leu Cys Gly Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg
610 615 620
Val Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly
625 630 635 640
Gln Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser
645 650 655
Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys
660 665 670
Phe Cys Pro Pro Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys Ala Gln
675 680 685
Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp Ile Phe
690 695 700
Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met His Cys
705 710 715 720
Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val Leu Ser
725 730 735
Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro
740 745 750
Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu
755 760 765
Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met
770 775 780
Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu
785 790 795 800
Asn Arg Cys Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala
805 810 815
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820 825 830
Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr
835 840 845
Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe
850 855 860
Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn
865 870 875 880
Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro
885 890 895
Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu
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Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp
915 920 925
Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu
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Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser
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Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly
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Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln
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Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser
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Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala
1010 1015 1020
Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser
1025 1030 1035
Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu
1040 1045 1050
Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys
1055 1060 1065
Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys Phe Cys Asp Thr Ile
1070 1075 1080
Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr
1085 1090 1095
Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn
1100 1105 1110
Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys
1115 1120 1125
Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala
1130 1135 1140
Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
1145 1150 1155
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu
1160 1165 1170
Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly
1175 1180 1185
Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile
1190 1195 1200
Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu
1205 1210 1215
Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro
1220 1225 1230
Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp
1235 1240 1245
Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly
1250 1255 1260
Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe
1265 1270 1275
Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val
1280 1285 1290
Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile
1295 1300 1305
Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala
1310 1315 1320
Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu
1325 1330 1335
Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg
1340 1345 1350
Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu
1355 1360 1365
Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu
1370 1375 1380
Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His
1385 1390 1395
Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu
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Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln
1415 1420 1425
Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala
1430 1435 1440
Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly
1445 1450 1455
Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser
1460 1465 1470
Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile
1475 1480 1485
Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val
1490 1495 1500
Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val
1505 1510 1515
Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu
1520 1525 1530
Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg
1535 1540 1545
Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly Leu Ala Leu Arg Tyr
1550 1555 1560
Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly Asp Arg Glu Gln
1565 1570 1575
Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser Asp
1580 1585 1590
Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro Ile Gly
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Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly Trp
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Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg
1625 1630 1635
Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly
1640 1645 1650
Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro
1655 1660 1665
Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala
1670 1675 1680
Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser
1685 1690 1695
Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln
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Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro
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Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu
1730 1735 1740
Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg
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Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys
1760 1765 1770
Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp
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Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro
1790 1795 1800
Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu
1805 1810 1815
Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile
1820 1825 1830
Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His
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Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly
1850 1855 1860
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His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn
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Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp
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Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val
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Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr
1940 1945 1950
Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His
1955 1960 1965
Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser
1970 1975 1980
Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp
1985 1990 1995
Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val
2000 2005 2010
Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu
2015 2020 2025
Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln
2030 2035 2040
Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser
2045 2050 2055
Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn
2060 2065 2070
Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr
2075 2080 2085
Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln
2090 2095 2100
Pro Glu Gln Cys Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu
2105 2110 2115
Leu Leu Pro Leu Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala
2120 2125 2130
Thr Phe Tyr Ala Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln
2135 2140 2145
Val Cys Glu Val Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn
2150 2155 2160
Gly Val Cys Val Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser
2165 2170 2175
Cys Pro Pro Ser Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro
2180 2185 2190
Arg His Cys Asp Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser
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Glu Gly Cys Phe Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser
2210 2215 2220
Cys Val Pro Glu Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly
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Val Gln His Gln Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro
2240 2245 2250
Cys Gln Ile Cys Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr
2255 2260 2265
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Glu Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu
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Tyr Glu Cys Val Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val
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Pro His Cys Glu Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly
2315 2320 2325
Glu Cys Arg Pro Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys
2330 2335 2340
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Leu Arg Lys Thr Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn
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Cys Val Asn Ser Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser
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Asp Lys Val Cys Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln
2405 2410 2415
Phe Trp Glu Glu Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu
2420 2425 2430
Asp Ala Val Met Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro
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Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val
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Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu
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Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly
2615 2620 2625
Gly Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly
2630 2635 2640
Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe
2645 2650 2655
Trp Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys
2660 2665 2670
Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys
2675 2680 2685
Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg
2690 2695 2700
Leu Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val
2705 2710 2715
Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr
2720 2725 2730
Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser
2735 2740 2745
Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2750 2755 2760
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2765 2770 2775
Arg Lys Cys Ser Lys
2780
<210> 3
<211> 2050
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mature vWF
<400> 3
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu
465 470 475 480
Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val
485 490 495
Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu
500 505 510
Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala
515 520 525
Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu
530 535 540
Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
545 550 555 560
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu
565 570 575
Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala
580 585 590
Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys
595 600 605
Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser
610 615 620
Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly
625 630 635 640
Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His
645 650 655
Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn
660 665 670
Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp
675 680 685
Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro
690 695 700
Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu
705 710 715 720
Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val
725 730 735
Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn
740 745 750
Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly
755 760 765
Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr
770 775 780
Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
785 790 795 800
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly
805 810 815
Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly
820 825 830
Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro
835 840 845
Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro
850 855 860
Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly
865 870 875 880
Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg
885 890 895
Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu
900 905 910
Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp
915 920 925
Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe
930 935 940
Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile
945 950 955 960
Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr
965 970 975
Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu
980 985 990
Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly
995 1000 1005
Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His
1010 1015 1020
Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr
1025 1030 1035
Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg
1040 1045 1050
Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr
1055 1060 1065
Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser
1070 1075 1080
Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val
1085 1090 1095
Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val
1100 1105 1110
Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp
1115 1120 1125
Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg
1145 1150 1155
Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val
1160 1165 1170
Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr
1175 1180 1185
Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe
1190 1195 1200
Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu
1205 1210 1215
Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly
1220 1225 1230
Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala
1235 1240 1245
Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly
1250 1255 1260
Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn
1265 1270 1275
Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly
1280 1285 1290
His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln
1295 1300 1305
Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly
1310 1315 1320
Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly
1325 1330 1335
Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val
1340 1345 1350
Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys
1355 1360 1365
Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu
1370 1375 1380
Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala
1385 1390 1395
Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val
1400 1405 1410
Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val
1415 1420 1425
Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser
1430 1435 1440
Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp
1445 1450 1455
Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe
1460 1465 1470
Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu
1475 1480 1485
Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln
1490 1495 1500
Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys
1505 1510 1515
Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys
1520 1525 1530
Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg
1535 1540 1545
Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val
1550 1555 1560
Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu
1565 1570 1575
Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro
1580 1585 1590
Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser
1595 1600 1605
Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr
1610 1615 1620
Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser
1625 1630 1635
Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn
1640 1645 1650
Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys
1655 1660 1665
Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu
1670 1675 1680
Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met
1685 1690 1695
Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser
1700 1705 1710
Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys
1715 1720 1725
Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro
1730 1735 1740
Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp
1745 1750 1755
Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val
1760 1765 1770
Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln
1775 1780 1785
Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys
1790 1795 1800
Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala
1805 1810 1815
Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met
1820 1825 1830
Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val
1835 1840 1845
Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro
1850 1855 1860
Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys
1865 1870 1875
Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly
1880 1885 1890
Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys
1895 1900 1905
Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp
1910 1915 1920
Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys
1925 1930 1935
Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys
1940 1945 1950
Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu
1955 1960 1965
Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp
1970 1975 1980
Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser
1985 1990 1995
Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro
2000 2005 2010
Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly
2015 2020 2025
Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys
2030 2035 2040
Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys
2045 2050
Claims (1)
- (a) 재조합 폰 빌레브란트 인자(rVWF); (b) 완충화제; (c) 1 이상의 염; (d) 임의로 안정화제; 및 (e) 임의로 계면활성제를 포함하고
상기 rVWF가
a) 서열 식별 번호: 3에 제시된 아미노산 서열;
b) a)의 생물학적으로 활성인 유사체, 단편 또는 변이체;
c) 서열 식별 번호: 1에 제시된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드;
d) c)의 생물학적으로 활성인 유사체, 단편 또는 변이체; 및
e) 적절히 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 식별 번호: 1에 제시된 폴리뉴클레오티드로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드를 포함하며;
상기 완충액이 약 0.1 mM 내지 약 500 mM 범위의 pH 완충화제로 구성되고 상기 pH가 약 2.0 내지 약 12.0 범위이며;
상기 염이 약 1 내지 500 mM의 농도이고;
상기 안정화제가 약 0.1 내지 1000 mM 농도이며;
상기 계면활성제가 약 0.01 g/L 내지 0.5 g/L 농도인, rVWF의 안정한 액체 제약 제제.
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