ES2751607T3 - Producción mejorada de factor de von Willebrand recombinante en un biorreactor - Google Patents

Abstract

Procedimiento de fabricación de un factor de von Willebrand (vWF) recombinante mediante el cultivo de células huésped en un biorreactor en un medio de cultivo celular, en el que las células huésped producen vWF recombinante que es secretado al medio de cultivo celular y en el que el vWF en el medio de cultivo celular comprende multímeros de vWF de diferente tamaño, en el que al menos un componente del medio de cultivo celular es alimentado al medio de cultivo celular y en el que el cultivo celular que comprende las células, el vWF recombinante y el medio de cultivo celular es bombeado sobre un sistema de separación que tiene un tamaño límite de peso molecular de aproximadamente 750.000 Da, y en el que el sistema de separación separa los multímeros de vWF en al menos (i) una fracción de material permeado que está enriquecida en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y reducida en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW) en comparación con los multímeros de vWF en el sobrenadante del cultivo celular antes de la separación y (ii) una fracción de material retenido que está reducida en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y enriquecida en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW) en comparación con los multímeros de vWF en el sobrenadante del cultivo celular antes de la separación.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción mejorada de factor de von Willebrand recombinante en un biorreactor

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para la producción recombinante de factor von Willebrand (vWF) en un biorreactor separando diferentes especies de multímeros de vWF durante la fermentación.

Antecedentes

La biotecnología ofrece la promesa de producir productos biofarmacéuticos de bajo coste, incluyendo proteínas recombinantes. Muchas proteínas terapéuticas, tales como los factores de coagulación, tienen potencial terapéutico si se pueden producir de forma recombinante de una manera que conserve su actividad biológica y produzca rendimientos suficientes para ser comercialmente viables. Por ejemplo, los factores de coagulación producidos de forma recombinante, tales como el factor de von Willebrand (vWF), tienen el potencial de tratar una amplia variedad de trastornos hemorrágicos. Sin embargo, este potencial no se ha alcanzado adecuadamente en parte debido a la complejidad inherente de las moléculas biológicas de origen natural y la variedad de limitaciones asociadas con la síntesis de sus contrapartidas proteicas recombinantes en células manipuladas genéticamente. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad en la técnica de procedimientos mejorados para producir proteínas terapéuticas altamente biológicamente activas recombinantes tales como vWF.

Las proteínas terapéuticas recombinantes generalmente se expresan en células eucariotas que se cultivan en biorreactores de tamaño variable. En el campo se conocen varios modos de operar dichos biorreactores, como procedimientos de alimentación por lotes y procedimientos de perfusión. En dichos procedimientos de fermentación, es deseable mantener viabilidad celular y densidad celular altas para obtener la proteína recombinante deseada en una forma concentrada que facilite la purificación posterior.

El documento WO 2008/006494 desvela un procedimiento de perfusión en el que la acumulación de la proteína terapéutica deseada en el sobrenadante del cultivo celular se logra a altas concentraciones alimentando los componentes del medio de cultivo al cultivo celular en un biorreactor y en el que el cultivo celular que comprende las células, la proteína terapéutica y el medio de cultivo celular se hace circular sobre un sistema de separación en el que el sistema de separación separa la proteína terapéutica de sustancias de menor peso molecular que la proteína terapéutica, tales como de metabolitos. El límite de peso molecular (MWCO) de las sustancias a separar de la proteína terapéutica de interés en el documento WO 2008/006494 está entre 5.000 Da y 500.000 Da, preferentemente como máximo 100.000 Da.

El documento WO 2008/152075 A1 describe un procedimiento para producir un biopolímero de interés en un procedimiento de fermentación de perfusión continua, en el que el biorreactor comprende una unidad de filtro de impurezas y un módulo de recolección de producto. Se muestra además que la unidad de filtro de impurezas permite eliminar impurezas con un peso molecular (MW) por debajo del MW del biopolímero de interés mientras se retienen las células y el biopolímero de interés en el biorreactor. Además, el módulo de recolección del producto permite eliminar biopolímeros de interés e impurezas mientras se retienen las células en el biorreactor. Por lo tanto, el documento WO 2008/152075 A1 se refiere a la eliminación de impurezas mientras se retienen células y compuestos de alto peso molecular (por ejemplo, producto) en el biorreactor.

El documento EP2171034 desvela un procedimiento de producción de un biopolímero en un procedimiento de fermentación continua en el que se usa un filtro de impurezas que permite eliminar impurezas con un peso molecular inferior al peso molecular del biopolímero de interés del biopolímero de interés en el biorreactor. Esta patente también desvela un procedimiento de fermentación continua en el que una combinación de una unidad de filtro equipada con un filtro de impurezas se combina con una unidad de filtro equipada con un filtro de producto que permitirá que el biopolímero de interés pase para recolectar el biopolipéptido de interés. Se describen tamaños de poro de filtro de impurezas de hasta 80.000 Da por lo que el intervalo preferido es de 2.000 Da a 15.000 Da. Como biopolímeros de interés, solo se describen polipéptidos con un peso molecular dado. El biopolímero de interés más grande desvelado es el Factor VIII que tiene un peso molecular de aproximadamente 280.000 Da.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la relación de la actividad del cofactor de ristocetina del vWF respecto al antígeno de vWF (vWF:RCoF/vWF:Ag) en el biorreactor durante el procedimiento por lotes.

La figura 2 muestra la relación de la actividad del cofactor de ristocetina del vWF respecto al antígeno de vWF (vWF:RCoF/vWF:Ag) en el material retenido (biorreactor) y en el material permeado durante el procedimiento del ejemplo 2.

La figura 3 muestra la acumulación de vWF de HMW en el material retenido (biorreactor) y el agotamiento de vWF de HMW en el material permeado en el día 4 en el ejemplo 2. Las intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar de las bandas 1-5, 6-10 y > 11 se determinaron como se describe en el ejemplo La figura 4 muestra la relación de la actividad del cofactor de ristocetina del vWF respecto al antígeno de vWF (vWF:RCoF/vWF:Ag) en el material retenido (biorreactor) y en el material permeado durante el procedimiento del ejemplo 3.

La figura 5 muestra la acumulación de vWF de HMW en el material retenido (biorreactor) y el agotamiento de vWF de HMW en el material permeado en el día 9 en el ejemplo 3. Las intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar de las bandas 1-5, 6-10 y > 11 se determinaron como se describe en el ejemplo 2.

La figura 6 muestra un dibujo esquemático de la configuración del procedimiento hipotético del ejemplo 4.

La figura 7 muestra un dibujo esquemático de la configuración del procedimiento hipotético del ejemplo 5.

La figura 8 muestra la acumulación de vWF de HMW en el material retenido (biorreactor) y el agotamiento de vWF de HMW en el material permeado en el día 7 del ejemplo 6. Las intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar de las bandas 1-5, 6-10 y > 11 se determinaron como se describe en el ejemplo 2.

La figura 9 muestra la relación de la actividad del cofactor de ristocetina del vWF respecto al antígeno de vWF (vWF:RCoF/vWF:Ag) en el material retenido (biorreactor) y en el material permeado durante el procedimiento del ejemplo 6 como se describe en el ejemplo 2.

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere al sorprendente descubrimiento de que se puede usar un sistema de separación en un biorreactor durante un procedimiento de fermentación para separar determinadas formas multiméricas de vWF de otras formas multiméricas de vWF. Dichas formas multiméricas diferentes de vWF con diferente peso molecular tienen diferentes propiedades y/o diferentes actividades biológicas. Dicha separación que ya tiene lugar durante la etapa de fermentación corriente arriba de la fabricación reduce en gran medida el esfuerzo de purificación en el procesamiento corriente abajo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un factor de von Willebrand (vWF) recombinante como se define en la reivindicación 1.

La presente invención se refiere a un procedimiento para fabricar un factor de von Willebrand (vWF) recombinante mediante el cultivo de células huésped en un biorreactor en un medio de cultivo celular, en el que las células huésped producen vWF recombinante que es secretado al medio de cultivo celular y en el que el vWF en el medio de cultivo celular comprende multímeros de vWF de diferente tamaño,

en el que al menos un componente del medio de cultivo celular es alimentado al medio de cultivo celular y en el que el cultivo celular que comprende las células, el vWF recombinante y el medio de cultivo celular es bombeado sobre un sistema de separación que tiene un tamaño límite de peso molecular de aproximadamente 750.000 Da, y en el que el sistema de separación separa los multímeros de vWF en al menos

una fracción de material permeado que está enriquecida en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y reducida en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW) en comparación con los multímeros de vWF en el sobrenadante de cultivo celular antes de la separación y una fracción de material retenido que está reducida en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y enriquecida en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW) en comparación con los multímeros de vWF en el sobrenadante de cultivo celular antes de la separación.

En una realización de la invención, las dos fracciones del vWF tienen actividades biológicas diferentes.

En otra realización de la invención, la fracción deseada del vWF recombinante destinada a ser purificada adicionalmente es el material permeado.

En otra realización, el vWF recombinante en el material permeado está enriquecido en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y reducido en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW), en la que los multímeros de vWF de LMW corresponden a las bandas 1 a 5 y los multímeros de vWF de HMW corresponden a bandas 11 y superiores en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330).

En otra realización de la invención, la relación de multímeros de vWF de LMW en el material permeado es igual o inferior a 0,9, o en otras palabras, la relación de las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímero de vWF 1 a 5 en el material retenido divididas por las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímero de vWF 1 a 5 en el material permeado está por debajo de 0,9, en la que las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímero de vWF 1 a 5 se refieren al valor numérico que se obtiene cuando la cantidad de bandas 1 a 5 determinada en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) se divide por la cantidad de bandas 1 a 5 de un plasma humano estándar como se determina en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330). Se usa preferentemente plasma humano estándar (SHP) (Siemens, Standard Human Plasma, ORKL17).

En otra realización de la invención, la fracción deseada del vWF recombinante destinado a ser purificada adicionalmente es el material retenido.

En otra realización de la invención, la relación de multímeros de vWF de HMW en el material retenido es igual o superior a 1,1, o en otras palabras, la relación de las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 11 y superiores en el material retenido divididas por las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 11 y superiores en el material permeado es igual o superior a 1,1, en la que las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 11 y superiores se refieren al valor numérico que se obtiene cuando la cantidad de bandas 11 y superior se determina en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) se divide por la cantidad de bandas 11 y superiores de un plasma humano estándar como se determina en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330). Se usa preferentemente plasma humano estándar (SHP) (Siemens, Standard Human Plasma, ORKL17).

De acuerdo con la invención, el tamaño límite de peso molecular del sistema de separación es de aproximadamente 750.000 Da.

En otra realización de la invención, tiene lugar una segunda separación en la que el material retenido obtenido en cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente se somete a una segunda separación en la que los multímeros de vWF ultragrandes están enriquecidos en dicho material retenido, proporcionando un segundo material permeado en el que la proporción de los multímeros de vWF ultragrandes en la cantidad total de multímeros de vWF se reduce en comparación con la proporción de multímeros de vWF ultragrandes en la cantidad total de multímeros de vWF en el material retenido antes de dicha segunda separación.

En una realización, la segunda separación se realiza en paralelo con la primera separación y, en otra realización, la segunda separación se realiza después de la primera separación.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que los entendidos comúnmente en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquiera de los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden utilizar en la práctica o en el ensayo de la presente invención, se describen procedimientos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Por "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta el 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso, longitud u otra unidad de referencia descrita en el presente documento. En toda la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que las palabras "comprenden", "comprende", y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.

Por "que consiste en" se entiende que incluye, y limitado a, lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, y que ningún otro elemento puede estar presente. Por "que consiste esencialmente en" se entiende cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren en la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados ni contribuyen a ella. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan materialmente o no a la actividad o acción de los elementos enumerados.

Por "actividad biológica" se entiende una función medible de vWF que vWF realiza también in vivo cuando se administra a un ser humano. Como se usa en el presente documento, los términos "función" y "funcional" y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica de vWF. La actividad biológica de vWF puede ser determinada, por ejemplo, por el experto en la materia usando procedimientos para determinar la actividad del cofactor de ristocetina (vWF:RCoF) (Federici AB y col. 2004. Haematologica 89: 77-85), la unión de vWF a GP Ib del complejo de glucoproteína plaquetaria Ib-V-IX (Sucker y col. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12: 305-310), un ensayo de unión a colágeno (Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80: 466-471) o un ensayo de unión a FVIII. La unión a FVIII puede determinarse, por ejemplo, mediante análisis Biacore.

Por "biorreactor" se entiende cualquier dispositivo o sistema fabricado o diseñado que proporciona y soporta un entorno biológicamente activo para el cultivo celular que permite que las células crezcan y produzcan el producto de interés. Los biorreactores en general miden y regulan los parámetros físicos y químicos que se necesitan para generar este entorno biológico activo. Los biorreactores se pueden operar en diferentes modos como por lotes, semicontinuo o continuo. Los biorreactores que son operados en modo continuo están equipados adicionalmente con una entrada de medios y un dispositivo para separar las células del sobrenadante. Comúnmente, los biorreactores son cilíndricos o cúbicos, que varían en tamaño desde mililitros hasta metros cúbicos, y a menudo están hechos de acero inoxidable o plástico.

La expresión "célula huésped" incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor de un vector recombinante introducido, un polinucleótido o un polipéptido aislado. Las células huésped incluyen la progenie de una sola célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en el complemento total de ADN) a la célula madre original debido a una mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Una célula huésped incluye células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido. Una célula huésped que comprende un vector recombinante es una célula huésped recombinante. Las células huésped específicas se definen a continuación.

Un "sistema de separación" de acuerdo con la invención significa un dispositivo que puede usarse para retener células huésped dentro de un biorreactor durante un procedimiento de fermentación en el que al menos parte del sobrenadante del cultivo celular se separa de las células huésped por medio de un sistema de separación que comprende un filtro que tiene un determinado límite de peso molecular. Las células huésped y los multímeros de vWF por encima de un determinado peso molecular son retenidos por dicho filtro con un determinado límite de peso molecular. Las moléculas pequeñas, los nutrientes y los metabolitos, así como los multímeros de vWF por debajo de un determinado límite de peso molecular pueden pasar dicho filtro con un determinado límite de peso molecular. La retención de células dentro del recipiente de cultivo se puede lograr usando varios dispositivos de retención de células. Se pueden usar diferentes principios de separación para este procedimiento. Los procedimientos podrían basarse en sedimentación por gravedad, sedimentación acústica, sedimentación centrífuga o filtración. Los siguientes conjuntos de aparatos se pueden usar para este procedimiento: filtros internos o externos tales como filtros rotatorios internos o externos (por ejemplo, Spinfilter P de Sartorius), filtros de flujo transversal externos, filtros de cartucho de fibra hueca externos o internos (por ejemplo, flujo tangencial alterno (ATF) de Refine). El tamaño de poro del filtro con un determinado límite de peso molecular (MWCO) está, de acuerdo con la divulgación proporcionada a continuación, entre 0,05 pm y 1,0 pm. El MWCO de acuerdo con la divulgación proporcionada en el presente documento es igual o superior a 500.000 Da, o igual o superior a 550.000 Da, o igual o superior a 600.000 Da, o igual o superior a 650.000 Da, o igual o superior a 700.000 Da, o aproximadamente 750.000 Da, o igual o inferior a 1.000.000 Da, o igual o inferior a 950.000 Da o igual o inferior a 900.000 Da, o igual o inferior a 850.000 Da, o igual o inferior a 800.000 Da.

La parte del cultivo celular que ha pasado el dispositivo de separación se llama "material permeado", mientras que la parte del cultivo celular que es retenida por el dispositivo de separación se llama "material retenido". Un MWCO de 500.000 usado en un sistema de separación significa que las proteínas por debajo de 500.000 Da pasan la separación y están enriquecidas en el material permeado, mientras que las proteínas por encima de 500.000 Da son retenidas por el filtro y, por lo tanto, están enriquecidas en el material retenido.

Esta separación puede usarse para enriquecer determinadas fracciones de multímeros de vWF con diferentes tamaños moleculares que tienen diferentes actividades biológicas.

"Sustancialmente" o "esencialmente" significa casi total o completamente, por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de alguna cantidad dada.

La expresión "factor de von Willebrand" o "vWF", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier polipéptido que tiene la actividad biológica del vWF de tipo silvestre o al menos una actividad biológica parcial de vWF. El gen que codifica vWF de tipo silvestre se transcribe en un ARNm de 9 kb que se traduce en un prepolipéptido de 2813 aminoácidos con un peso molecular estimado de 310.000 Da. El prepolipéptido consiste en 2813 aminoácidos y contiene un péptido señal de 22 aminoácidos, un propolipéptido de 741 aminoácidos y la subunidad madura. La escisión del polipéptido de 741 aminoácidos del extremo N da como resultado vWF maduro que consiste en 2050 aminoácidos. La secuencia de ADNc de pre-pro-vWF de tipo silvestre se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de pre-pro-vWF de tipo silvestre se muestra en la SEQ ID NO: 2. El término "vWF", como se usa en el presente documento, se refiere a la forma madura de vWF a menos que se indique lo contrario.

El propolipéptido de vWF de tipo silvestre comprende múltiples dominios que están dispuestos en el siguiente orden: D1 -D2-D'-D3-A1 -A2-A3-D4-B1-B2-B3-C 1-C2-CK

Los dominios D1 y D2 representan el propéptido que se escinde para producir el vWF maduro. Los 90 restos carboxi terminales comprenden el dominio "CK" que es homólogo a la superfamilia de proteínas "nudo de cistina". Estos miembros de la familia tienden a dimerizarse a través de enlaces disulfuro.

Preferentemente, el vWF de tipo silvestre comprende la secuencia de aminoácidos del vWF de tipo silvestre como se muestra en la SEQ ID NO: 2. También se incluyen adiciones, inserciones, deleciones N-terminales, C-terminales o internas de vWF siempre que se mantenga al menos una actividad biológica parcial de vWF. El experto en la materia puede determinar la actividad biológica del vWF de tipo silvestre usando procedimientos para la actividad del cofactor de ristocetina (Federici AB y col. 2004. Haematologica 89: 77-85), unión de vWF a GP Iba del complejo de glucoproteína plaquetaria Ib-V-IX (Sucker y col. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12: 305-310), un ensayo de unión a colágeno (Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80: 466-471) o un ensayo de unión de FVIII

Determinadas realizaciones pueden incluir la producción recombinante de vWF de tipo silvestre como se describe, en el documento WO 2010/048275, o variantes del mismo, por ejemplo, en las que se han introducido una o más deleciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos para aumentar o disminuir al menos una actividad biológica de la proteína.

Por consiguiente, determinadas realizaciones pueden emplear una cualquiera o más de estas secuencias relacionadas con vWF, incluyendo combinaciones y variantes de las mismas. También se incluyen secuencias relacionadas con vWF de otros organismos, tales como otros mamíferos descritos en el presente documento y conocidos en la técnica.

En determinadas realizaciones, el término "vWF" incluye "proteínas de fusión" de vWF, preferentemente "proteínas de fusión" de una proteína de vWF y un socio de fusión "heterólogo". También se incluyen proteínas de fusión o proteínas modificadas que comprenden un sodio de fusión heterólogo o una secuencia heteróloga y al menos un fragmento o porción mínima de una proteína de vWF.

Como se usa en el presente documento, una "proteína de fusión" incluye una proteína de vWF o fragmento de la misma unida a otra proteína de vWF (por ejemplo, diferente) (por ejemplo, para crear múltiples fragmentos), a una proteína de vWF, o a ambas. Una "proteína no de vWF" se refiere a un "polipéptido heterólogo" que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que es diferente de una proteína de vWF y que puede derivarse del mismo organismo o de un organismo diferente. La proteína de vWF de la proteína de fusión puede corresponder a toda o una parte de una secuencia de aminoácidos de la proteína de vWF biológicamente activa. En determinadas realizaciones, una proteína de fusión de vWF incluye al menos una (o dos, tres, etc.) porciones biológicamente activas de una proteína de vWF.

De manera más general, la fusión con secuencias heterólogas, tales como albúmina o inmunoglobulinas o fragmentos derivados de inmunoglobulinas sin un dominio de unión a antígeno, tal como el fragmento Fc, puede utilizarse para eliminar características no deseadas o para mejorar las características deseadas (por ejemplo, propiedades farmacocinéticas) de un vWF. Por ejemplo, la fusión con una secuencia heteróloga puede aumentar la estabilidad química, disminuir la capacidad inmunógena, mejorar el direccionamiento in vivo y/o aumentar la semivida en circulación de una proteína de vWF.

La "albúmina", como se usa en el presente documento, incluye polipéptidos de la familia de proteínas de la albúmina tales como la albúmina de suero humano y la albúmina de suero bovino, incluyendo las variantes y derivados de las mismas, tales como las variantes y fragmentos de proteínas de la albúmina manipulados genéticamente o modificados químicamente. La porción de albúmina de una proteína de fusión puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, vaca, oveja o cerdo. Las albúminas no de mamífero incluyen, pero no se limitan a, gallina y salmón. La porción de albúmina del polipéptido unido a albúmina puede ser de un animal diferente que la porción de proteína de vWF de la proteína de fusión.

La familia de proteínas de la albúmina, incluida dentro del término "albúmina" usado en el presente documento, comprende proteínas de transporte de suero relacionadas evolutivamente, por ejemplo, albúmina, alfa-fetoproteína (Af P; Beattie y Dugaiczyk, Gene. 20: 415-422, 1982), afamina (AFM; Lichenstein y col., J. Biol. Chem. 269: 18149­ 18154, 1994), y proteína de unión a la vitamina D (DBP; Cooke & David, J. Clin. Invest. 76: 2420-2424, 1985). Se ha reivindicado que la alfa-fetoproteína mejora la semivida de un polipéptido terapéutico unido (véase el documento WO 2005/024044). Sus genes representan un grupo multigénico con similitudes estructurales y funcionales que se mapean a la misma región cromosómica en seres humanos, ratones y ratas. Algunas realizaciones de la invención, por lo tanto, pueden usar dichos miembros de la familia de la albúmina, o fragmentos y variantes de los mismos como se definen en el presente documento, como parte de una proteína de fusión. Los miembros de la familia de la albúmina de las proteínas de fusión terapéuticas de la invención también pueden incluir variantes polimórficas de origen natural de AFP, AFM y DBP.

La proteína de VWF, o un fragmento o variante de la misma, puede fusionarse con un polipéptido de albúmina de suero humano, o un fragmento o variante del mismo (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/156137). La albúmina de suero humano (HSA o HA), es una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura, y es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero y también funciona como un portador de ligandos endógenos y exógenos. Entre otros beneficios, la fusión con HSA o un fragmento o variante de la misma puede aumentar la vida útil, la semivida en suero y/o la actividad terapéutica de las proteínas de vWF descritas en el presente documento.

Preferentemente, una proteína de fusión comprende albúmina como la porción C-terminal, y una proteína de vWF como la porción N-terminal. En otras realizaciones, la proteína de fusión tiene proteínas de vWF fusionadas tanto en el extremo N como en el extremo C de la albúmina.

Se puede emplear una secuencia de enlazador peptídico para separar los componentes de una proteína de fusión. Por ejemplo, los enlazadores peptídicos pueden separar los componentes en una distancia suficiente para garantizar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia de enlazador peptídico puede incorporarse en la proteína de fusión usando técnicas estándar descritas en el presente documento y bien conocidas en la técnica. Las secuencias de enlazador peptídico adecuadas pueden elegirse basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interactuar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptido; y (3) la ausencia de restos hidrófobos o cargados que pudieran reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de forma útil como enlazadores incluyen las desveladas en Maratea y col., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; patente de Estados Unidos N° 4.935.233 y patente de Estados Unidos N° 4.751.180.

Uno o más de los enlazadores peptídicos o no peptídicos son opcionales. Por ejemplo, las secuencias de enlazador pueden no ser necesarias en una proteína de fusión en la que los polipéptidos primero y segundo tienen regiones de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.

Determinadas realizaciones de la presente invención también contemplan el uso de proteínas de vWF modificadas, que incluyen modificaciones que mejoraron las características deseadas de la proteína, como se describe en el presente documento. Las modificaciones de las proteínas de vWF incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de la cadena lateral, modificaciones de la cadena principal y modificaciones de los extremo N y C, que incluyen acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de restos de carbohidratos o lipídicos, cofactores y similares. Las modificaciones ejemplares también incluyen la PEGilación de una proteína de vWF (véase, por ejemplo, Veronese y Harris, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 453-456, 2002, incorporado por referencia en el presente documento). Las variantes de VWF que están conjugadas químicamente con polímeros biológicamente aceptables se describen, por ejemplo, en el documento WO 2006/071801.

La invención también se puede usar con "variantes" de proteínas vWF. El término "variante" de proteína incluye proteínas que se distinguen de la SEQ ID NO: 2 por la adición, deleción y/o sustitución de al menos un resto de aminoácido, y que normalmente retienen una o más actividades de la proteína de referencia. Está dentro de la habilidad de los expertos en la materia identificar aminoácidos adecuados para la sustitución y diseñar variantes con actividad sustancialmente inalterada, mejorada o disminuida, en relación con una secuencia de referencia.

Una variante de proteína se puede distinguir de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, que pueden ser conservativas o no conservativas, como se describe en el presente documento y se conocen en la técnica. En determinadas realizaciones, la variante de proteína comprende sustituciones conservativas y, a este respecto, se entiende bien en la técnica que algunos aminoácidos pueden cambiarse a otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad de la proteína.

Las expresiones "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprenden una "secuencia un 50 % idéntica a", como se usan en el presente documento, se refieren al grado en que las secuencias son idénticas, nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido, en una ventana de comparación. Por lo tanto, se puede calcular un "porcentaje de identidad de secuencia" comparando dos secuencias óptimamente alineadas en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el resto de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Las expresiones usadas para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de al menos 12 pero con frecuencia de 15 a 18 y, a menudo, de al menos 25 unidades monoméricas, incluidos nucleótidos y restos de aminoácidos. Debido a que dos polipéptidos pueden comprender, cada uno, (1) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia completa de polipéptidos) que es similar entre los dos polipéptidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polipéptidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polipéptidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polipéptidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, generalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más generalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se compara una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que la dos secuencias están alineadas de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de aproximadamente un 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE. UU.) O por inspección y la mejor alineación (es decir, la que da como resultado el mayor porcentaje de homología en la ventana de comparación) generada por cualquiera de los diversos procedimientos seleccionados.

Como se ha señalado anteriormente, las proteínas variantes biológicamente activas pueden contener sustituciones conservativas de aminoácidos en diversos lugares a lo largo de su secuencia, en comparación con un resto de referencia. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" incluye una en la que el resto de aminoácido se sustituye con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, que generalmente se pueden subclasificar de la siguiente manera:

Ácidos: el resto tiene una carga negativa debido a la pérdida de iones H a pH fisiológico y el resto es atraído por una solución acuosa para buscar las posiciones de la superficie en la conformación de un péptido en el que está contenido, cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral ácida incluyen ácido glutámico y ácido aspártico.

Básicos: el resto tiene una carga positiva debido a la asociación con el ion H a pH fisiológico o dentro de una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina) y el resto es atraído por una solución acuosa para buscar las posiciones de la superficie en la conformación de un péptido en el que está contenido, cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral básica incluyen arginina, lisina e histidina.

Cargados: los restos se cargan a pH fisiológico y, por lo tanto, incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas o básicas (es decir, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina e histidina).

Hidrófobos: los restos no están cargados a pH fisiológico y el resto es repelido por una solución acuosa para buscar las posiciones internas en la conformación de un péptido en el que está contenido, cuando el péptido está en medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba incluyen tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y triptófano.

Neutras/polares: los restos no están cargados a pH fisiológico, pero el resto no es suficientemente repelido por soluciones acuosas de modo que buscaría posiciones internas en la conformación de un péptido en el que está contenido, cuando el péptido está en medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra/polar incluyen asparagina, glutamina, cisteína, histidina, serina y treonina.

Esta descripción también caracteriza determinados aminoácidos como "pequeños" ya que sus cadenas laterales no son lo suficientemente grandes, incluso si faltan grupos polares, para conferir hidrofobicidad. Con la excepción de la prolina, los aminoácidos "pequeños" son aquellos con cuatro carbonos o menos cuando al menos un grupo polar está en la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no lo está. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral pequeña incluyen glicina, serina, alanina y treonina. La prolina de aminoácidos secundarios codificada por genes es un caso especial debido a sus efectos conocidos sobre la conformación secundaria de las cadenas peptídicas. La estructura de la prolina difiere de todos los otros aminoácidos de origen natural en que su cadena lateral está unida al nitrógeno del grupo a-amino, así como al carbono a. Para los fines de la presente invención, la prolina se clasifica como un aminoácido "pequeño".

El grado de atracción o repulsión requerido para la clasificación como polar o no polar es arbitrario y, por lo tanto, los aminoácidos específicamente contemplados por la invención se han clasificado como uno u otro. La mayoría de los aminoácidos no nombrados específicamente se pueden clasificar en función del comportamiento conocido.

Los restos de aminoácidos pueden subclasificarse adicionalmente como cíclicos o no cíclicos, aromáticos o no aromáticos, clasificaciones autoexplicativas con respecto a los grupos sustituyentes de cadena lateral de los restos, y como pequeños o grandes. El resto se considera pequeño si contiene un total de cuatro átomos de carbono o menos, incluido el carbono del carboxilo, siempre que esté presente un sustituyente polar adicional; tres o menos si no lo está. Los restos pequeños son, por supuesto, siempre no aromáticos. Dependiendo de sus propiedades estructurales, los restos de aminoácidos pueden estar en dos o más clases. Para los aminoácidos de proteínas de origen natural, la subclasificación de acuerdo con este esquema se presenta en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1 : Subclasificación de aminoácidos

La sustitución conservativa de aminoácidos también incluye agrupaciones basadas en cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que la sustitución de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante sobre las propiedades del polipéptido variante resultante. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado una proteína biológicamente activa mediante el ensayo de su actividad cromógena y/o de coagulación, como se describe en el presente documento.

Las expresiones "multímeros de vWF de bajo peso molecular" o "multímeros de vWF de LMW" o "vWF de LMW" se usan como sinónimos y se pretende que correspondan a las bandas 1 a 5 en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330).

Las expresiones "multímeros de vWF de alto peso molecular" o "multímeros de vWF HMW" o "vWF de HMW" se usan como sinónimos y se pretende que correspondan a las bandas 11 y superiores en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330), en el que "superiores" significa la banda 11 y todos los multímeros de vWF más grandes.

"Multímeros de vWF de peso molecular ultragrande" o "multímeros de vWF de ULMW" se usan como sinónimos y se pretende que correspondan a las bandas 20 y superiores en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330), en el que "superiores" significa banda 20 y todos los multímeros de vWF más grandes.

La expresión "relación de multímeros de HMW" se refiere a la relación de las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 11 y superiores en el material retenido dividido por las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 11 y superiores en el material permeado.

La expresión "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 11 y superiores se refiere al valor numérico que se obtiene cuando la cantidad de bandas 11 y superiores como se determina en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) se divide por la cantidad de bandas 11 y superiores de un plasma humano estándar como se determina en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330). Se usa preferentemente plasma humano estándar (SHP) (Siemens, Standard Human Plasma, ORKL17).

La expresión "Relación de multímeros de LMW" se refiere a la relación de las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 1 a 5 en el material retenido dividida por las "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 1 a 5 en el material permeado.

La expresión "intensidades de píxeles acumuladas relacionadas con el plasma humano estándar" de las bandas de multímeros de vWF 1 a 5 se refiere al valor numérico que se obtiene cuando la cantidad de bandas 1 a 5 como se determina en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) se divide por la cantidad de bandas 1 a 5 de un plasma humano estándar como se determina en un análisis densidométrico de vWF de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330). Se usa preferentemente plasma humano estándar (SHP) (Siemens, Standard Human Plasma, ORKL17).

Una relación de multímeros de vWF de LMW en el material permeado "por debajo de" la relación de multímeros de vWF de LMW del medio de cultivo celular antes de la separación es normalmente una relación disminuida "estadísticamente significativa", y puede incluir una disminución que es 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2.1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,3, 4,4, 4,6, 4,8, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces (incluyendo todos los números enteros y decimales e intervalos entre y por encima de 1, por ejemplo, 5,5, 5,6, 5,7, 5.8, etc.) por debajo de la relación de multímeros de vWF de LMW del medio de cultivo celular antes de la separación.

Una relación de multímeros de vWF de HMW en el material retenido "por encima de" la relación de multímeros de vWF de HMW del medio de cultivo celular antes de la separación es normalmente una relación aumentada "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2.2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,3, 4,4, 4,6, 4,8, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces (incluyendo todos los números enteros y decimales e intervalos entre y por encima de 1, por ejemplo, 5,5, 5,6, 5,7, 5.8, etc.) por encima de la relación de multímeros de vWF de HMW del medio de cultivo celular antes de la separación.

Expresión y purificación de proteínas de la invención

Las realizaciones de la presente invención incluyen procedimientos y composiciones relacionadas para expresar, recoger y opcionalmente purificar las fracciones de vWF descritas en el presente documento.

Por ejemplo, determinadas realizaciones incluyen procedimientos para producir un vWF o una variante del mismo, que comprenden cultivar una célula en un medio de cultivo celular, opcionalmente una célula de mamífero, en el que la célula comprende al menos un polinucleótido introducido que codifica el vWF, en el que dicho polinucleótido está unido operativamente a al menos un elemento regulador y expresa la proteína y recoger la proteína a partir de la célula o medio de cultivo celular.

El vWF recombinante o variantes del mismo pueden prepararse convenientemente usando protocolos estándar. Como un ejemplo general, el vWF recombinante puede prepararse mediante un procedimiento que incluye uno o más de las etapas de: (a) preparar una construcción que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína y que está unida operativamente a al menos un elemento regulador; (b) introducir la construcción en una célula huésped; (c) cultivar la célula huésped para expresar el polipéptido y (d) recoger o aislar el polipéptido a partir de la célula huésped.

Para expresar un vWF, se puede insertar una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, o un equivalente funcional, en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Los procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican vWF y elementos de control transcripcional y traduccional apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo y son conocidos en la técnica.

Los "elementos reguladores" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión incluyen aquellas regiones no traducidas del vector, por ejemplo, potenciadores, promotores, regiones 5' y 3' no traducidas, uno o varios sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN (si está presente ADN genómico que contiene intrones), uno o varios sitios de poliadenilación, una o varias secuencias de terminación de la transcripción, que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad.

Dependiendo del sistema de vectores y del huésped utilizado, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo los promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, en sistemas de células de mamíferos, generalmente se prefieren los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos.

También se pueden usar señales de iniciación específicas para conseguir una traducción más eficaz de secuencias que codifican un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes.

En los casos en que las secuencias que codifican el vWF, su codón de iniciación y las secuencias corriente arriba se insertan en el vector de expresión apropiado, pueden no ser necesarias señales de control transcripcional o traduccional adicionales. Sin embargo, en los casos en que solo se inserta la secuencia codificante, o una porción de la misma, se deben proporcionar señales de control traduccional exógenas que incluyen el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación deberá estar en el correcto marco de lectura para garantizar la traducción de todo el inserto. Los elementos exógenos traduccionales y los codones de iniciación pueden tener diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede potenciar mediante la inclusión de potenciadores que son adecuados para el sistema celular concreto que se use, tales como los descritos en las referencias.

En células huésped de mamíferos, generalmente hay disponibles numerosos sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en los que como vector de expresión se usa un adenovirus, las secuencias que codifican un polipéptido de interés se pueden ligar en un complejo de transcripción/traducción del adenovirus que consista en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede usarse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células huésped infectadas. Además, los potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (VSR) o el promotor/potenciador del CMV, pueden usarse para aumentar la expresión en células huésped de mamíferos.

Las células huésped adecuadas son células eucariotas superiores tales como células de mamífero. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (por ejemplo, células HEK293, células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión; células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10)); células de sertoli de ratón; células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (células VERO, VERO-76, ATCC CRL-1587); células Co S, células de carcinoma de cuello uterino humano (células Hela, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3a , ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (HepG2, HB8065); tumor mamario de ratón (m Mt 060562, ATCC CCL51); células TR1; células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas de células huésped de mamíferos útiles incluyen ovario de hámster chino (células CHO, incluyendo células DHFR-CHO); y líneas celulares de mieloma tales como NSO y Sp2/0.

Otras líneas celulares adecuadas incluyen, sin limitación, Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Hep II de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1); células DUKX (línea celular c Ho ) y DG44 (línea celular CHO). También son útiles las células 3T3, células de Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras células.

Determinados sistemas de expresión de células de mamífero preferidos incluyen sistemas de expresión basados en células CHO y HEK293. Ejemplos particulares de células CHO incluyen células CHO-K1 y CHO-S. También se incluyen células huésped que se pueden cultivar en medio sin suero, tales como determinadas células HEK293 y células CHO.

En algunas realizaciones, las células huésped son capaces de crecer en cultivos en suspensión. Como se usa en el presente documento, las células competentes en suspensión son aquellas que pueden crecer en suspensión sin formar agregados grandes y firmes, es decir, células que son monodispersas o crecen en agregados sueltos con solo unas pocas células por agregado. Las células competentes en suspensión incluyen, sin limitación, células que crecen en suspensión sin adaptación o manipulación (por ejemplo, células hematopoyéticas, células linfoides) y células que se han hecho competentes en suspensión mediante la adaptación gradual de células dependientes de la unión (por ejemplo, células epiteliales, fibroblastos) para crecimiento en suspensión.

En algunas realizaciones, las células huésped pueden incluir células mutantes o recombinantes, incluyendo células que expresan un espectro de proteínas cualitativa o cuantitativamente diferente que catalizan la modificación postraduccional de proteínas (por ejemplo, enzimas de glucosilación tales como glucosil transferasas y/o glucosidasas, enzimas de procesamiento tales como propéptidos, incluyendo las enzimas que promueven la formación de vWF funcional), en relación con el tipo de célula de la que derivaron.

Como ejemplo, la célula huésped comprende un polinucleótido introducido que codifica al menos una proteína de "factor de procesamiento", en el que dicho polinucleótido está unido operativamente a al menos un elemento regulador y expresa la proteína del factor de procesamiento. La expresión "factor de procesamiento" incluye cualquier proteína, péptido, cofactor no peptídico, sustrato o ácido nucleico que promueve la formación de una proteína funcional. Los ejemplos de factores de procesamiento incluyen, pero sin limitarse a, la enzima convertidora de aminoácidos básicos emparejados (PACE), la epóxido reductasa dependiente de vitamina K (VKOR), la gamma-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K (VKGC), o una combinación de las mismas. Realizaciones particulares utilizan la o las secuencias humanas para PACE, VKOR y/o VKGC.

PACE, originalmente aislada de una línea celular de hígado humano, es una endopeptidasa similar a la subtilisina, es decir, una enzima propeptídica que exhibe especificidad para la escisión en los residuos básicos de una proteína (por ejemplo, -Lys-Arg-, -Arg-Arg-, o -Lys-Lys-). La coexpresión de PACE y una proproteína que requiere procesamiento para la producción de la proteína madura da como resultado una expresión de alto nivel de la proteína madura.

Para la producción a largo plazo de alto rendimiento de vWF, generalmente se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable vWF se pueden transformar usando vectores de expresión que pueden contener varios orígenes de replicación virales y/p elementos de expresión endógena y un gen de un marcador seleccionable en el mismo vector o en otro diferente. Tras la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante aproximadamente 1-2 días en medios no selectivos antes de cambiar a medios selectivos. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas.

La proliferación de clones de células transformadas de forma estable se puede realizar usando técnicas de cultivo tisular adecuadas al tipo de célula. Se puede usar cualquier número de marcadores o sistemas seleccionables para recuperar o identificar líneas celulares transformadas o transducidas, ya sean transitorias o estables. Estos incluyen, pero no se limitan a, los genes de la timidina cinasa del virus del herpes simple y los genes de adenina fosforribosiltransferasa que pueden emplearse en células tk- o aprt-, respectivamente. Además, se pueden usar la resistencia antimetabolitos, a antibióticos o a herbicidas como base de la selección; por ejemplo, la dihidrofolato reductasa (DHFR) confiere resistencia al metotrexato; npt confiere resistencia a los aminoglucósidos, neomicina y G-418; y als o pat confieren resistencia al clorsulfurón y a la fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente. Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo, trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina.

Las células huésped transformadas con una secuencia de polinucleótidos que codifica vWF pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de vWF del cultivo celular. Se puede usar cualquier medio de cultivo celular definido químicamente. Los ejemplos particulares incluyen medios de cultivo sin suero, medios libres de proteínas, medios de cultivo químicamente definidos y medios de cultivo que carecen de componentes derivados de animales.

Los medios de cultivo celular ejemplares incluyen, sin limitación, medio Eagle basal (BME); medio CMRL-1066; medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM); medio Glasgow mínimo esencial, GMEM; medio H-Y (Hybri-Max®); medio 199; medio Eagle mínimo esencial (EMEM); medio NCTC; medio S-77 de Swim; y medio E de Williams. Medio de Click; medio 131 de MCDB y medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM). También se incluye DMEM/mezcla nutriente de Ham F-12 (50:50), que se usa con frecuencia como un medio base para el desarrollo de medios patentados y especializados para cultivar células CHO para la biofabricación, y medio 302 de MCDB, que se desarrolló para células CHO.

En realizaciones particulares, el medio es una formulación basada en DMEM/F12 de HAM sin suero suplementada con uno o más de los siguientes: (a) glutamina; por ejemplo, concentración final de aproximadamente 0,9 g/l, (b) sulfato férrico x7H2O, por ejemplo, a aproximadamente 0,0006 g/l, (c) putrescina, x 2HCl, por ejemplo, a aproximadamente 0,0036 g/l, (d) vitamina K1, por ejemplo, a aproximadamente 0,0025 g/l, (e) Synperonic; por ejemplo, a una concentración final de aproximadamente 1 g/l, (f) rojo fenol, por ejemplo, a aproximadamente 0,008 g/l, (g) etanolamina, por ejemplo, a aproximadamente 0,00153 g/l, y/o (h) Na-hidrogenocarbonato, por ejemplo, a aproximadamente 2 g/l.

En realizaciones específicas, el medio de cultivo celular es un medio CD-CHO o un medio CD-CHO AGT ™ o un medio CD OptiCHO™ AGT™, que están disponibles en el mercado (INVITROGEN®) o medios Pro-CHO™ o Power-CHO™ (LONZA®). Los medios CH-CHO, CD-CHO AGT™ y CD OptiCHO™ AGT™ pueden usarse como un medio químicamente definido, un medio libre de proteínas y/o un medio libre de suero, y pueden suplementarse con L-glutamina, si se desea. Los niveles de Ca2+ del medio IX CD-CHO AGT™ sin suplementos de calcio pueden variar de aproximadamente 0,25-0,35 mM (como se determina por espectroscopía de absorción atómica).

Como se ha señalado anteriormente, determinadas realizaciones utilizan un medio de cultivo celular libre de suero. Un ejemplo incluye un medio libre de suero definido que es capaz de producir una amplia gama de células en suspensión y monocapa, y que incluye un sustituto del suero compuesto por fetuina, transferrina, fosfatidilcolina (por ejemplo, 1 -oleoil-2-palmitoilfosfatidilcolina), ácido linoleico y colesterol. Otro ejemplo incluye un medio de cultivo celular que contiene un esterol tal como colesterol, que es estabilizado por un tensioactivo en lugar de productos de suero o micelas de fosfolípidos, y que opcionalmente contiene ácidos carboxílicos solubles como precursores de ácidos grasos para satisfacer los requisitos de lípidos y/o alcoholes que son capaces de promover la célula.

Determinadas realizaciones emplean un medio de cultivo celular que carece de componentes "derivados de animales". Como se usa en el presente documento, los componentes "derivados de animales" pueden incluir cualquier componente que se produzca en un animal intacto (por ejemplo, proteínas aisladas y purificadas a partir del suero) o componentes producidos usando componentes producidos en un animal intacto (por ejemplo, un aminoácido elaborado usando una enzima aislada y purificada de un animal para hidrolizar un material de origen vegetal). Por el contrario, una proteína que tiene la secuencia de una proteína animal (es decir, la proteína tiene un origen genómico en un animal) pero que se produce in vitro en cultivo celular (por ejemplo, en una levadura o célula bacteriana recombinante, o en una línea celular de mamífero, recombinante o no), en medios que carecen de componentes que se producen en, y aislados y purificados a partir de un animal intacto no es un componente "derivado de animales". Por ejemplo, una proteína que tiene la secuencia de una proteína animal (es decir, tiene un origen genómico en un animal) pero que se produce en una célula recombinante en medios que carecen de componentes derivados de animales no es un componente "derivado de animales". Por consiguiente, un medio de cultivo celular que carece de componentes derivados de animales es uno que puede contener proteínas animales que se producen de forma recombinante; dicho medio, sin embargo, no contiene, por ejemplo, suero animal o proteínas u otros productos purificados a partir de suero animal. Dicho medio puede, por ejemplo, contener uno o más componentes derivados de plantas.

Se puede usar cualquier medio de cultivo celular que soporte el crecimiento y mantenimiento celular en las condiciones de la invención. Normalmente, el medio contiene agua, un regulador de osmolalidad, un tampón, una fuente de energía, aminoácidos, una fuente de hierro inorgánica o recombinante, uno o más factores de crecimiento sintéticos o recombinantes, vitaminas y cofactores. Los medios que carecen de componentes y/o proteínas derivados de animales están disponibles de proveedores comerciales, tales como, por ejemplo, SIGMA®, SAFC, INVITROGEN®, GIBCO® o LONZA®.

Por ejemplo, determinadas realizaciones emplean técnicas de cultivo celular en suspensión. Los ejemplos de técnicas de cultivo celular en suspensión incluyen procedimientos de perfusión, procedimientos por lotes (por ejemplo, procedimientos por lotes simples, procedimientos por lotes alimentados) y procedimientos semicontinuos (draw-fill).

En un procedimiento de suspensión de perfusión celular, las células se inoculan normalmente en un recipiente de cultivo de semillas que contiene un medio de cultivo celular, que preferentemente carece de componentes derivados de animales y se propaga hasta que las células alcanzan una densidad mínima.

Posteriormente, el cultivo de semillas propagado se transfiere a un recipiente de cultivo a gran escala, que contiene del mismo modo un medio de cultivo que preferentemente carece de componentes derivados de animales. Las células se propagan hasta que se alcanza al menos una densidad celular predeterminada. En esta fase, las células crecen en suspensión para permitir que el número de células dentro del recipiente de cultivo aumente a un valor predeterminado o crítico.

El intercambio de medios se puede realizar perfundiendo continuamente el recipiente de cultivo con medio nuevo mientras las células recombinantes son retenidas en el recipiente de cultivo. La cantidad de medio perfundido puede depender de la densidad celular y es normalmente de aproximadamente el 10-300 %, preferentemente de aproximadamente el 10 % al 95 %, del 25 % al 80 %, del volumen del tanque por día (24 horas).

En la fase de crecimiento, el cultivo se propaga hasta que las células alcanzan una determinada densidad. Al alcanzar esta densidad, el cultivo entra en la fase de producción.

Cuando la densidad celular alcanza el valor adecuado para el inicio de la fase de producción, aproximadamente el 60­ 95 % del medio del tanque en el tanque se cambia cada 24 horas, preferentemente aproximadamente el 80 %. Un intercambio del 80 % del medio también se usa preferentemente en la fase de producción. Los valores establecidos también pueden cambiarse en este momento y establecerse en valores adecuados para la producción de la proteína respectiva. La perfusión del medio se realiza preferentemente de forma continua. El caudal del medio se puede expresar en términos de porcentaje de volumen del tanque del medio por período de tiempo definido.

La perfusión del medio puede ser de aproximadamente el 10-200 % del volumen del tanque durante 10-48 horas; preferentemente, la perfusión del medio es aproximadamente el 90 % durante 10-48 horas, más preferentemente la perfusión del medio es aproximadamente el 80 % del volumen del tanque cada 24 horas.

La retención de células dentro del recipiente de cultivo se puede lograr usando varios dispositivos de retención de células. Se pueden usar diferentes principios de separación para este procedimiento. Los procedimientos podrían basarse en sedimentación por gravedad, sedimentación acústica, sedimentación centrífuga o filtración. Los siguientes conjuntos de aparatos se pueden usar para este procedimiento: filtros internos o externos tales como filtros rotatorios internos o externos (por ejemplo, Spinfilter P de Sartorius), filtros de flujo transversal externos, filtros de cartucho de fibra hueca externos o internos (por ejemplo, flujo tangencial alterno (ATF) de Refine).

Los multímeros de VWF pueden variar desde un dímero simple hasta multímeros que consisten en más de 16 monómeros de vWF unidos covalentemente. Las diferentes formas de proteínas tienen diferentes actividades biológicas. Por ejemplo, los multímeros de bajo peso molecular de vWF tienen una actividad menor de cofactor de ristocetina (vWF:RCoF), mientras que las formas de alto peso molecular de vWF tienen una mayor actividad de vWF:RCoF. Una actividad alta de vWF:RCoF de una preparación de vWF se correlaciona con una alta actividad en la hemostasia primaria, ya que las preparaciones de vWF con alto vWF:RCoF contribuyen de manera más eficiente a la aglutinación de las plaquetas y al anclaje de las plaquetas al colágeno expuesto por una lesión. La relación de vWF:RCoF respecto al contenido de antígeno (vWF:Ag) en plasma humano es, por definición, 1,0.

Por lo tanto, es deseable fabricar preparaciones farmacéuticas de vWF con una relación de vWF:RCoF respecto a vWF:Ag de al menos 0,5, o al menos 0,55, o al menos 0,6, o al menos 0,65 o al menos 0,7, o al menos 0,75, o al menos 0,8, o al menos 0,85, o al menos 0,9, o al menos 0,95 o al menos 1,0.

En determinadas situaciones terapéuticas, también es preferible fabricar preparaciones de vWF que tengan una relación vWF:RCoF/vWF:Ag aumentada superior a la presente en el plasma humano, por ejemplo de al menos 1,05, o al menos 1,1, o al menos 1,15, o al menos 1,2 o al menos 1,25, o al menos 1,3, o al menos 1,35, o al menos 1,40, o al menos 1,45 o al menos 1,50, o al menos 1,55 o al menos 1,60, o al menos 1,65 o al menos 1,70 o al menos 1,75, o al menos 1,80, o al menos 1,85 o al menos 1,90 o al menos 1,95 o al menos 2,0.

Para fabricar preparaciones farmacéuticas de vWF con relaciones de vWF:RCoF/vWF:Ag aumentadas, normalmente es necesario idear procedimientos de purificación corriente abajo que aumenten la cantidad de multímeros de vWF de mayor peso molecular. Esto a menudo es engorroso y puede dar como resultado una disminución del rendimiento del producto vWF ya que cada etapa de purificación corriente abajo generalmente se asocia con alguna pérdida de producto.

Los inventores de la presente invención han descubierto ahora sorprendentemente que el enriquecimiento de multímeros de vWF de mayor peso molecular ya se puede lograr en la etapa corriente arriba de la fabricación durante el cultivo celular mediante el uso de un dispositivo de separación que retiene las formas multiméricas deseadas de alto peso molecular de vWF en el biorreactor (material retenido) mientras que las formas menos deseadas de vWF de bajo peso molecular pasan el dispositivo de separación (material permeado). Sin embargo, como las formas de vWF de bajo peso molecular todavía son capaces de unirse a y estabilizar el Factor VIII, la fracción en el material permeado también puede ser un producto para determinados usos específicos, como para la estabilización del Factor VIII. En el último caso, la fracción de bajo peso molecular de los multímeros de vWF puede ser la forma de vWF deseada.

La recolección de la fracción que está enriquecida en multímeros de vWF de HMW se puede hacer i) al final del procedimiento de fermentación o ii) de forma concomitante usando un dispositivo de separación adicional. Este dispositivo de separación adicional en el caso ii) podría ser cualquier dispositivo de separación que separe las células del material retenido y que no separe más los multímeros de vWF de LMW de los multímeros de vWF de HMW. Como resultado de dicho procedimiento de fermentación en el caso ii) se obtiene una preparación de vWF que se enriquece en multímeros de vWF de HMW y el tiempo de residencia en el biorreactor se reduce en comparación con un procedimiento de fermentación como en el caso i). Acortar la residencia es beneficioso en general para minimizar los acontecimientos de degradación.

Sin embargo, si la relación de vWF:RCoF/vWF:Ag es mayor que 2,0, existe un riesgo creciente de complicaciones tromboembólicas cuando dichas preparaciones se administran a pacientes, ya que dichos multímeros de vWF de peso molecular ultragrande pueden conducir a la aglutinación de las plaquetas en situaciones no fisiológicas.

Si dichos multímeros de peso molecular ultra grande están presentes en el medio de cultivo celular, puede ser beneficioso aplicar dispositivos de separación con un límite de peso molecular (MWCO) de 10.000.000 Da que retiene los multímeros ultra grandes de vWF en el biorreactor (material retenido) mientras que las formas deseadas de vWF de alto peso molecular se separan en el filtrado.

Los inventores han descubierto un procedimiento para fabricar un factor de von Willebrand (vWF) recombinante mediante el cultivo de células huésped en un biorreactor en un medio de cultivo celular, en el que las células huésped producen vWF recombinante que es secretado al medio de cultivo celular y en el que el vWF en el medio de cultivo celular comprende multímeros de vWF de diferente tamaño, en el que al menos un componente del medio de cultivo celular es alimentado al medio de cultivo celular y en el que el cultivo celular que comprende las células, el vWF recombinante y el medio de cultivo celular es bombeado sobre un sistema de separación y en el que el sistema de separación separa los multímeros de vWF en al menos una fracción de material permeado que está enriquecida en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y reducida en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW) en comparación con los multímeros de vWF en el sobrenadante del cultivo celular antes de la separación y una fracción de material retenido que está reducida en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y enriquecida en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW) en comparación con el multímeros de vWF en el sobrenadante de cultivo celular antes de la separación

La relación de multímeros de vWF de HMW preferentemente es igual o está por encima de 1,1, o por encima de 1,2, o por encima de 1,25, o por encima de 1,30, o por encima de 1,35, o por encima de 1,40 o por encima de 1,45 o por encima de 1,50 o por encima de 1,60, o por encima de 1,70, o por encima de 1,80, o por encima de 1.90.

En una realización preferida, la invención abarca también un biorreactor que comprende un medio de cultivo celular que comprende multímeros de vWF en un material retenido y un medio de cultivo celular que comprende multímeros de vWF en un material permeado en el que

la relación de multímeros de vWF de HMW es igual o está por encima de 1,1, o por encima de 1,2, o por encima de 1,25, o por encima de 1,30, o por encima de 1,35, o por encima de 1,40 o por encima de 1,45 o por encima de 1,50 o por encima de 1,60, o por encima de 1,70, o por encima de 1,80, o por encima de 1,90.

La relación de multímeros de vWF de LMW preferentemente es igual o está por debajo de 0,90, o por debajo de 0,85, o por debajo de 0,80, o por debajo de 0,75, o por debajo de 0,70 o por debajo de 0,65 o por debajo de 0,60, o por debajo de 0,55, o por debajo de 0,50.

Una realización preferida de la invención abarca también un biorreactor que comprende un medio de cultivo celular que comprende multímeros de vWF y un medio de cultivo celular que comprende multímeros de vWF en un material permeado en el que la relación de multímeros de vWF de LMF está por debajo de 0,90, o por debajo de 0,85, o por debajo de 0,80, o por debajo de 0,75, o por debajo de 0,70 o por debajo de 0,65 o por debajo de 0,60, o por debajo de 0,55, o por debajo de 0,50.

Al elegir los MWCO del dispositivo de separación, el experto en la materia está capacitado por la presente invención para elegir el tamaño molecular del producto de vWF que posteriormente se purifica de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica.

Dicha separación de los multímeros vWF de diferente peso molecular ya en la fase de fermentación, es decir, durante el procesamiento corriente arriba, facilita enormemente la separación en una posterior postfermentación o purificación corriente abajo, ya que las fracciones deseadas del multímero de vWF ya están enriquecidas en los multímeros de vWF deseados. Por lo tanto, se requieren potencialmente menos etapas de purificación en el procesamiento corriente abajo, lo que da como resultado un tiempo de procesamiento más rápido y mayores rendimientos. La invención generalmente también conduce a una mayor pureza de la preparación de vWF resultante, ya que parte de la purificación comienza ya en el biorreactor y el procesamiento corriente abajo posterior comienza con un vWF ya enriquecido para la fracción de peso molecular deseada.

Determinadas realizaciones pueden incluir procedimientos de cultivo que monitorizan y controlan determinados parámetros, tales como pH, tensión de oxígeno disuelto (DOT) y temperatura. Como ejemplo, el pH puede controlarse regulando la concentración de CO2 en el gas de espacio superior y/o el rociador, y mediante la adición de base al medio de cultivo cuando sea necesario. Por lo tanto, determinadas realizaciones incluyen la producción a gran escala de un polipéptido recombinante en un medio de cultivo celular, en el que se monitoriza la concentración de CO2 disuelto en el cultivo y se emplea un rociado de aire constante o intermitente a través del medio de cultivo para mantener determinados intervalos de concentración de CO2. En algunos aspectos, el intervalo predeterminado para la concentración de CO2 disuelto es de aproximadamente 80-200 mmHg, preferentemente de aproximadamente 100­ 180 mmHg, por ejemplo, aproximadamente 140 mmHg. En la mayoría de los casos, la velocidad de rociado del aire se controla en relación con la concentración monitorizada de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Por ejemplo, la velocidad de rociado de aire puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,000-0,100 l/min por l de líquido de cultivo, preferentemente de aproximadamente 0,005-0,020 l/min por l de líquido de cultivo, particularmente en el que la concentración monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentración del valor establecido (predeterminado). En algunos casos, la velocidad de rociado del aire está en el intervalo de 0,000-0,005, tal como aproximadamente 0,0 l/min por l de líquido de cultivo cuando la concentración monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentración del valor establecido -5 mmHg; y en el intervalo de 0,010-0,100 l/min por l de líquido de cultivo cuando la concentración monitorizada de CO2 disuelto es igual a la concentración del valor establecido 5 mmHg (véase la solicitud de los Estados Unidos N°. 2006/0216790). Dichos procedimientos se pueden usar para mantener un pH deseado en el medio de cultivo celular, por ejemplo, en el que cualquier sustancia sólida o líquida añadida al medio de cultivo no da lugar a un valor de pH localizado superior a aproximadamente 7,5.

La tensión de oxígeno disuelto puede mantenerse, por ejemplo, rociando con aire u oxígeno puro o mezclas de los mismos. El medio de control de temperatura es normalmente agua u otro líquido, calentado o enfriado según sea necesario. En determinados aspectos, el agua puede pasar a través de una camisa que rodea el recipiente o a través de un serpentín sumergido en el cultivo.

El vWF producido por una célula recombinante se puede purificar y caracterizar de acuerdo con una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Los sistemas ejemplares para realizar la purificación de proteínas y analizar la pureza de las proteínas incluyen la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) (por ejemplo, los sistemas ÁKTA y Bio-Rad FPLC), la cromatografía de interacción hidrófoba y la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Los procesos químicos ejemplares para la purificación incluyen cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, Q, S), cromatografía de exclusión por tamaño, gradientes de sal, purificación por afinidad (por ejemplo, Ni, Co, FLAG, maltosa, glutatión, proteína A/G), filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico en cerámica HyperD®, de fase inversa y columnas de interacción hidrófoba (HIC), entre otras conocidas en la técnica. También se incluyen procedimientos analíticos tales como SDS-PAGE (por ejemplo, Coomassie, tinción de plata), enfoque isoeléctrico preparativo (IEF), inmunotransferencia, Bradford, solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) y ELISA, que pueden utilizarse durante cualquier etapa del procedimiento de producción o purificación, normalmente para medir la pureza de la composición proteica.

En determinados aspectos, el vWF recombinante puede someterse a múltiples etapas de purificación cromatográfica, incluyendo cualquier combinación de cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía con colorantes, cromatografía con hidroxiapatito, cromatografía de exclusión por tamaño y preferentemente cromatografía por inmunoafinidad, principalmente para concentrar la proteína deseada y para eliminar sustancias que pueden causar fragmentación, activación y/o degradación de la proteína recombinante durante la fabricación, almacenamiento y/o uso. Los ejemplos ilustrativos de dichas sustancias que se eliminan preferentemente por purificación incluyen otros contaminantes proteicos, tales como enzimas de modificación como PACE/furina, VKOR y VKGC; proteínas, tales como proteínas de la célula huésped, que se liberan en los medios de cultivo de tejidos desde las células de producción durante la producción de proteínas recombinantes; contaminantes no proteicos, tales como lípidos; y mezclas de contaminantes proteicos y no proteicos, tales como lipoproteínas. Los procedimientos de purificación para proteínas de vWF son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 2011/022657).

Para minimizar el riesgo teórico de contaminaciones por virus, se pueden incluir etapas adicionales en el procedimiento que permitan la inactivación o eliminación efectiva de virus. Dichas etapas incluyen, por ejemplo, tratamiento térmico en estado líquido o sólido, tratamiento con disolventes y/o detergentes, radiación en el espectro visible o UV, radiación gamma y nanofiltración.

Composiciones farmacéuticas

La divulgación de la presente invención incluye proteínas y, preferentemente, proteínas de vWF que se producen de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento, y se formulan en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para administración a una célula o un animal, ya solas o en combinación con una o más otras modalidades de terapia. También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la divulgación también se pueden administrar en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no hay límite para otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten negativamente a los efectos moduladores u otros que se desean lograr.

En las composiciones farmacéuticas de la divulgación, La formulación de excipientes farmacéuticamente aceptables y soluciones portadoras es bien conocida por los expertos en la materia, al igual que el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en diversos regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, subcutánea e intramuscular.

En determinadas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas o terapéuticas de la divulgación no estimulan una reacción inmunitaria. En algunos aspectos, la composición farmacéutica que comprende la o las proteínas puede formularse en forma líquida estable. En otros aspectos, la composición farmacéutica puede formularse en forma liofilizada; la o las proteínas pueden liofilizarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen normalmente antes de su uso mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.

De acuerdo con la divulgación presentada en el presente documento, las proteínas pueden tener una solubilidad que es deseable para la vía de administración particular, tal como la administración intravenosa. Los ejemplos de solubilidades deseables incluyen al menos aproximadamente 1 mg/ml, al menos aproximadamente 10 mg/ml, al menos aproximadamente 25 mg/ml y al menos aproximadamente 50 mg/ml.

En determinadas circunstancias, será deseable administrar las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento por vía parenteral, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraarterial, por vía intratecal, por vía intraparenquimatosa, por vía intraventricular, por vía intrauretral, por vía intraesternal, por vía intracraneal, por vía intrasinovial o incluso por vía intraperitoneal). Los dispositivos adecuados para administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluyendo microagujas), inyectores sin agujas y técnicas de infusión.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse de forma adecuada, si fuera necesario, y el diluyente líquido en primer lugar se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son las técnicas de secado a vacío y las técnicas de criodesecación que dan como resultado un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una de sus soluciones anteriormente esterilizadas por filtración.

Las composiciones desveladas en el presente documento se pueden formular en una forma neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se pueden administrar de un modo compatible con la formulación de dosificación y una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran con facilidad mediante diversas formas de dosificación, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en el presente documento, "portador" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden incorporarse principios activos suplementarios.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas o perjudiciales cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como principio activo es bien entendida en la materia.

Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectables, como suspensiones o soluciones líquidas; también se pueden preparar las formas sólidas adecuadas para la solución en o la suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o sostenida. Las composiciones de liberación sostenida incluyen liberación retardada, modificada, pulsada, controlada, dirigida y programada.

Los procedimientos de formulación son bien conocidos en la técnica. Las proteínas recombinantes proporcionadas en el presente documento pueden administrarse de acuerdo con cualquier régimen de dosificación terapéuticamente eficaz. La cantidad y frecuencia de dosificación se pueden seleccionar para crear una cantidad efectiva de las proteínas y minimizar los efectos nocivos. La cantidad efectiva dependerá de una variedad de factores, que incluyen la vía de administración, el tipo de sujeto a tratar y las características físicas del sujeto en consideración, tales como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores que los expertos en la técnica médica reconocerán.

Las formulaciones de vWF se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 2010/048275.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto nivel de detalle a modo de ilustración y ejemplo a efectos de claridad de comprensión, será fácilmente evidente para un experto en la materia a la luz de las enseñanzas de la presente invención que se pueden realizar determinados cambios y modificaciones de la misma. Los ejemplos siguientes se proporcionan a modo de ilustración únicamente y no como limitación. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente varios parámetros no críticos que podrían modificarse o cambiarse para dar esencialmente resultados similares.

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud se presenta con un listado de secuencias en formato electrónico. Todo el contenido del listado de secuencias se incorpora en el presente documento por referencia.

Ejemplos

Todas las fermentaciones se realizaron usando un controlador Biostat B-DCU de Sartorius para controlar el pH a 7,0, el DO al 30 % de saturación de aire, la temperatura y una velocidad de agitador de 150 rpm. El procedimiento se ejecutó en un recipiente Sartorius B con un volumen de trabajo de 5 l. Después de la inoculación del reactor, se realizó una fase de crecimiento a 37 °C, seguida de una fase de producción a 33 °C. Todos los procedimientos se realizaron con la misma línea de células CHO que expresan un vW f de longitud completa de tipo silvestre fusionado en su extremo C-terminal a la proteína de albúmina de longitud completa de tipo silvestre humana. La línea celular se obtuvo como se describe en el documento WO 2009/156137.

Ejemplo 1 (procedimiento por lotes, ejemplo comparativo)

Se inició un procedimiento por lotes que se ejecuta con medios CSL-DBM-PFCDM (SAFC) con una densidad celular de 4,4*105 células/ml. Después de 7 días, se alcanzó una densidad celular de 6,9*106 células/ml. Se tomó una muestra del biorreactor diariamente y se determinó la actividad de vWF (vWF:RCoF) y el antígeno (vWF:Ag). A partir de estas mediciones, se calculó la relación vWF:RCoF/vWF:Ag. La figura 1 muestra que esta relación está disminuyendo ligeramente después de alcanzar un nivel máximo aproximadamente el día 2.

Ejemplo 2 (Procedimiento de la invención)

El módulo de retención, un ATF 4 (Refine Technology) se operó con un caudal de escape de 3 l/min y un caudal de presión de 3 l/min. Se usó una membrana de fibra hueca de límite de peso molecular (MWCO) de 750 kDa obtenida de GE Healthcare Life Sciences operada en modo de flujo ATF para enriquecer el vWF de alto peso molecular (HMW) en el biorreactor y para reducir el vWF de bajo peso molecular (LMW) en el biorreactor. Se usó un medio de cultivo basado en CD CHO (Gibco) durante la fase de crecimiento y también como medio de alimentación. El cultivo se inició con 5* 105 células/ml. Después de una fase de crecimiento (datos no mostrados) de 4 días, se inició el ATF con una tasa de recolección de material permeado de aproximadamente el 100 % del volumen del tanque por día. En este momento, la densidad celular en el biorreactor era 3,8* 106 células/ml. Cuando la densidad celular alcanzó 7* 106 células/ml, la temperatura se cambió de 37 °C a 33 °C para la fase de producción.

Se tomó diariamente una muestra del biorreactor y del material permeado y se determinó la actividad del cofactor de ristocetina de vWF (vWF:RCoF) y el antígeno de vWF (vWF:Ag). A partir de estas mediciones, se calculó la relación vWF:RCoF/vWF:Ag. Se demostró que debido a la eliminación de vW f de LMW, la relación vWF:RCoF/vWF:Ag en el material retenido (biorreactor) estaba aumentando, mientras que la relación vWF:RCoF/vWF:Ag en el material permeado disminuía debido a la eliminación de vWF de HMW (figura 2).

Se realizó un análisis de multímeros de vWF (electroforesis de multímeros) en el día 4 de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) para mostrar el enriquecimiento de vWF de alto peso molecular en el material retenido (biorreactor) y la separación y eliminación de vWF de bajo peso molecular en el material permeado. Además del análisis de multímeros de muestras del material retenido y del material permeado, se realizó un análisis de multímeros de una muestra de plasma humano estándar (SHP) (Siemens, Standard Human Plasma, ORKL17) de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) y se usó como referencia en cada transferencia individual. La "intensidad de píxeles acumulada relacionada con el plasma humano estándar" se calculó dividiendo la intensidad de píxeles por separado para cada una de las secciones de banda 1-5, 6-10 y >11 en la muestra respectiva por la intensidad de píxeles promedio de las secciones de banda correspondientes del plasma humano estándar, en el que ambas intensidades de píxeles individuales acumuladas se determinaron de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) (tabla 2, figura 3).

Tabla 2 (análisis de multímeros de vWF):

Ejemplo 3 (Procedimiento de la invención)

El módulo de retención, un ATF 4 (Refine Technology) se operó con un caudal de escape de 3 l/min y un caudal de presión de 3 l/min. Se usó una membrana de fibra hueca de límite de peso molecular (MWCO) de 750 kDa obtenida de GE Healthcare Life Sciences operada en modo de flujo ATF para enriquecer el vWF HMW en el biorreactor y para reducir el vWF de LMW en el biorreactor. Se usó un medio de cultivo celular basado en PowerCHO-3 (Lonza) para todo el procedimiento. El cultivo se inició con 4*105 células/ml. Después de una fase de crecimiento (datos no mostrados) de 3 días, se inició el ATF con una tasa de recolección de material permeado de aproximadamente el 100 % del volumen del tanque por día. En este momento, la densidad celular en el biorreactor era 1,4* 106 células/ml. Cuando la densidad celular alcanzó 1,7*106 células/ml, la temperatura se cambió de 37 °C a 33 °C para la fase de producción.

Se tomó diariamente una muestra del biorreactor y del material permeado y se determinaron la actividad (vWF:RCoF) y el antígeno (vWF:Ag) como se describe en el ejemplo 1. A partir de estas mediciones, se calculó la relación vWF:RCoF/vWF:Ag. Se demostró que debido a la eliminación de vWF de LMW, la relación vWF:RCoF/vWF:Ag en el material retenido (biorreactor) estaba aumentando, mientras que la relación vWF:RCoF/vWF:Ag en el material permeado disminuía debido a la eliminación de vWF de HMW (figura 4).

Al final del procedimiento, se realizó una electroforesis de multímeros para mostrar la acumulación de vWF de alto peso molecular en el biorreactor y la separación/eliminación de vWF de bajo peso molecular con el material permeado. La intensidad de píxeles acumulada relacionada con el plasma humano estándar se calculó como anteriormente.

Se realizó un análisis de multímeros de vWF (electroforesis de multímeros) en el día 9 de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) para mostrar el enriquecimiento de vWF de alto peso molecular en el material retenido (biorreactor) y la separación y eliminación de vWF de bajo peso molecular en el material permeado. Además del análisis de multímeros de muestras del material retenido y del material permeado, se realizó un análisis de multímeros de una muestra de plasma humano estándar (SHP) (Siemens, Standard Human Plasma, ORKL17) de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) y se usó como referencia en cada transferencia individual. La "intensidad de píxeles acumulada relacionada con el plasma humano estándar" se calculó entonces como se describe en el ejemplo 2 (tabla 3, figura 5).

Tabla 3 (análisis de multímeros de vWF):

Ejemplo 4

Otro aspecto de las invenciones es un procedimiento en el que el material retenido como se obtiene en cualquiera de los ejemplos 2 y 3 se recolecta directamente del biorreactor usando un dispositivo de separación adicional. El dispositivo de separación en este caso podría ser cualquier dispositivo de separación que separe las células del material retenido y que no separe más los multímeros de vWF de LMW de los multímeros de vWF de HMW. Las condiciones y los medios del biorreactor son como se describen en ejemplos anteriores.

Como resultado de dicho procedimiento de fermentación, se obtiene una preparación de vWF que está enriquecida en multímeros de vWF de HMW y reducida el tiempo de residencia en el biorreactor. Además, este tipo de procedimiento no está limitado en el tiempo de procedimiento debido a que no se produce acumulación de multímeros de vWF.

Ejemplo 5

Otro aspecto de las invenciones es un procedimiento en el que el material retenido como se obtiene en cualquiera de los ejemplos 2 y 3 se somete adicionalmente a una segunda separación en la que ahora los multímeros de vWF ultragrandes (multímeros de vWF de ULMW) se enriquecen en el material retenido, proporcionando un segundo material permeado en el que la proporción de los multímeros de vWF ultragrandes en la cantidad total de multímeros de vWF se reduce en comparación con la proporción de multímeros de vWF ultragrandes en la cantidad total de multímeros de vWF en el material retenido antes de dicha segunda separación. Las condiciones y los medios del biorreactor son como se describen en ejemplos anteriores. Un segundo sistema ATF está conectado al biorreactor (figura 6) que está equipado con una membrana de fibra hueca de MWCO de aproximadamente 10.000.000 Da o 0,1 |jm. Al recolectar el material permeado del segundo sistema de separación con un caudal del 20-200 % del volumen del tanque, se eliminan los multímeros de vWF de ULMW.

Como resultado de dicha fermentación que comprende una primera separación que conduce a un enriquecimiento de los multímeros de vWF de HMW con una segunda separación que conduce al agotamiento de los multímeros de HMW a partir de los multímeros de vWF de ULMW genera una preparación de VWF en el material permeado de la segunda separación que está agotado tanto para los multímeros de vWF de LMW como para los multímeros de vWF de ULMW, teniendo entonces una alta actividad en la hemostasia primaria pero evitando posibles efectos adversos por la presencia de multímeros vWF de ULMW.

Las dos separaciones se pueden realizar en paralelo o secuencialmente.

Ejemplo 6 (Procedimiento de la invención)

La fermentación se realizó usando un controlador Biostat B-DCU de Sartorius para controlar el pH a 7,0, el DO al 30 % de saturación de aire, la temperatura y una velocidad de agitador de 150 rpm. El procedimiento se ejecutó en un recipiente Sartorius B con un volumen de trabajo de 5 l.

Después de la inoculación del reactor, se realizó una fase de crecimiento a 37 °C, seguida de una fase de producción a 33,5 °C. El procedimiento se realizó con una línea de células CHO que expresa un vWF de longitud completa de tipo silvestre (Secuencia NCBI NP_000543). La línea celular se obtuvo como se describe en el documento WO 2009/156137.

El módulo de retención, un ATF 4 (Refine Technology) se operó con un caudal de escape de 3 l/min y un caudal de presión de 3 l/min. Se usó una membrana de fibra hueca de límite de peso molecular (MWCO) de 750 kDa obtenida de GE Healthcare Life Sciences operada en modo de flujo ATF para enriquecer el vWF de alto peso molecular (HMW) en el biorreactor y para reducir el vWF de bajo peso molecular (LMW) en el biorreactor.

Se usó un medio de cultivo basado en CD CHO (Gibco) durante la fase de crecimiento y también como medio de alimentación. El cultivo se inició con 7,6*105 células/ml.

Después de una fase de crecimiento (datos no mostrados) de 1 día, se inició el ATF con una tasa de recolección de material permeado de aproximadamente el 100 % del volumen del tanque por día. Además, la temperatura se cambió de 37 °C a 33,5 °C durante toda la fase de producción. En este momento, la densidad celular en el biorreactor era 10,9*105 células/ml. En el día 7 la densidad celular alcanzó las 70.0*105 células/ml

Se tomó diariamente una muestra del biorreactor y del material permeado y se determinó la actividad del cofactor de ristocetina de vWF (vWF:RCoF) y el antígeno de vWF (vWF:Ag). A partir de estas mediciones, se calculó la relación vWF:RCoF/vWF:Ag. Se demostró que debido a la eliminación de vW f de LMW, la relación vWF:RCoF/vWF:Ag en el material retenido (biorreactor) estaba aumentando, mientras que la relación vWF:RCoF/vWF:Ag en el material permeado disminuía debido a la eliminación de vWF de HMW (figura 9).

Se realizó un análisis de multímeros de vWF (electroforesis de multímeros) en el día 7 de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) para mostrar el enriquecimiento de vWF de alto peso molecular en el material retenido (biorreactor) y la separación y eliminación de vWF de bajo peso molecular en el material permeado. Además del análisis de multímeros de muestras del material retenido y del material permeado, se realizó un análisis de multímeros de una muestra de plasma humano estándar (SHP) (Siemens, Standard Human Plasma, ORKL17) de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) y se usó como referencia en cada transferencia individual. La "intensidad de píxeles acumulada relacionada con el plasma humano estándar" se calculó dividiendo la intensidad de píxeles por separado para cada una de las secciones de banda 1-5, 6-10 y >11 en la muestra respectiva por la intensidad de píxeles promedio de las secciones de banda correspondientes del plasma humano estándar, en el que ambas intensidades de píxeles individuales acumuladas se determinaron de acuerdo con Ott y col. (Am J Clin Pathol 2010; 133: 322-330) (tabla 4, figura 8).

Tabla 4 (análisis de multímeros de vWF):

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CSL Ltd.

<120> Producción mejorada de factor de von Willebrand recombinante en un biorreactor

<130> 2014 P002 A227

<150> EP 14172338.7

<151> 13-06-2014

<160>3

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 8442

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(8442)

<400> 1

atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc etc att 48 Met lie Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu lie

1 5 10 15

ttg cea ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tea tcc acg 96 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

gcc cga tgc age ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144 _{Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly}

35 40 45

age atg tac age ttt gcg gga tac tgc agt tac etc ctg gca ggg ggc 192 _{Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly}

50 55 60

tgc cag aaa cgc tcc ttc teg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser lie lie Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

aga gtg age etc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac ate cat ttg 288 _{Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp lie His Leu}

85 90 95

ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

tat gcc tcc aaa g gg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384 _{Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys}

115 120 125

ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg ate gat ggc age ggc 432 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg lie Asp Gly Ser Gly

130 135 140

aac ttt caa gtc ctg ctg tea gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480 _{Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly}

145 150 155 160

ctg tgt ggc aac ttt aac ate ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528 Leu Cys Gly Asn Phe Asn lie Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

gaa ggg acc ttg acc teg gac cct tat gac ttt gee aac tea tgg gct 576 _{Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala}

180 185 190

ctg age agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tet cct ccc age age 624 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

tea tgc aac ate tcc tet ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672 _{Ser Cys Asn lie Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln}

210 215 220

tgc cag ctt ctg aag age acc teg gtg ttt gee cgc tgc cae cct ctg 720 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

gtg gac ccc gag cct ttt gtg gee ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gee tgc cct gee etc ctg gag tac gee 816 _{Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala}

260 265 270

cgg acc tgt gee cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cae 864 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

age gcg tgc age cea gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

gtg tcc cct tgc gee agg acc tgc cag age ctg cae ate aat gaa atg 960 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His lie Asn Glu Met

305 310 315 320

tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc age tgc cct gag gga cag etc 1008 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

ctg gat gaa ggc etc tgc gtg gag age acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc etc tet cga gac tgc aac 1104 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

ace tgc att tgc cga aac age cag tgg ate tgc age aat gaa gaa tgt 1152 Thr Cys lie Cys Arg Asn Ser Gln Trp lie Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

cea ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tea cae ttc aag age ttt gac 1200 _{Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp}

385 390 395 400

aac aga tac ttc acc ttc agt ggg ate tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248 _{Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly lie Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg}

405 410 415

gat tgc cag gac cae tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser lie Val lie Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

cct ggc ctg cae aac age ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392 _{Pro Gly Leu Hls Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val}

450 455 460

gcc atg gat ggc cag gac gtc cag etc ccc etc ctg aaa ggt gac etc 1440 Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

cgc ate cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc etc age tac ggg gag 1488 _{Arg lie Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu}

485 490 495

gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536 _{Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu}

500 505 510

tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584 _{Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn}

515 520 525

ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tet ggg ctg gcg gag ccc 1632 _{Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro}

530 535 540

cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cae ggg gac tgc cag 1680 _{Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln}

545 550 555 560

gac ctg cag aag cag cae age gat ccc tgc gcc etc aac ccg cgc atg 1728 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

gag gcc tgc cat cgt gcc gtc age ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824 Glu Ala Cys Hls Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

cgc tac gac gtg tgc tcc tgc teg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

gcc ctg gcc age tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920 _{Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val}

625 630 635 640

gcg tgg cgc gag cea ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct etc 2016 _{Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu}

660 665 670

tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

tgc ccc cea ggg etc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112 _{Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys}

690 695 700

gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag ate ttc cag cea gaa gac 2160 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu lie Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

ate ttc tea gac cat cae acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208 lie Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

cae tgt acc atg agt gga gtc ccc gga age ttg ctg cct gac gct gtc 2256 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

etc age agt ccc ctg tct cat cgc age aaa agg age cta tcc tgt cgg 2304 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

ggg etc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400 _{Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met}

785 790 795 800

age atg ggc tgt gtc tct ggc tgc etc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys lie Gly Cys Asn Thr

835 840 845

tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

gcc acg tgc tcc acg ate ggc atg gcc cae tac etc acc ttc gac ggg 2640 _{Ala Thr Cys Ser Thr lie Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly}

865 870 875 880

etc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688 _{Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp}

885 890 895

tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg ate cta gtg ggg aat aag 2736 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg lie Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

gga tgc age cae ccc tea gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc ate ctg 2784 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr lie Leu

915 920 925

gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832 _{Val Glu Gly Gly Glu lie Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys}

930 935 940

agg ccc atg aag gat gag act cae ttt gag gtg gtg gag tet ggc cgg 2880 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

tac ate att ctg ctg ctg ggc aaa gee etc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928 Tyr lie lie Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970 975

cae ctg age ate tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976 His Leu Ser lie Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc ate cag aac aat gac etc a< 3024 _{Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly lie Gln Asn Asn Asp Leu TI}

995 1000 1005

age age aac etc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069 _{Ser Ser} Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

tcc tgg aaa gtg age teg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

ctg gac tea tcc cct gee acc tgc cat aac aac ate atg aag cag 3159 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn lie Met Lys Gln

1040 1045 1050

acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga ate ctt acc agt gac gtc ttc 3204 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg lie Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060 1065

cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cea tat ctg gat gtc 3249 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070 1075 1080

tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gee 3294 _{Cys lie} Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser lie Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

tgc ttc tgc gac acc att gct gee tat gee cae gtg tgt gee cag 3339 Cys Phe Cys Asp Thr lie Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gee aca ttg tgc ccc cag 3384 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115 1120 1125

age tgc gag gag agg aat etc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429 _{Ser Cys} Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

tgg cgc tat aac age tgt gca cct gee tgt caa gtc acg tgt cag 3474 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

cae cct gag cea ctg gee tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165 1170

cat gee cae tgc cct cea ggg aaa ate ctg gat gag ctt ttg cag 3564 _{His Ala} His Cys Pro Pro Gly Lys lie Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cea gtg tgt gag gtg gct ggc 3609 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195 1200

cgg cgt ttt gee tea gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

cct gag cae tgc cag att tgc cae tgt gat gtt gtc aac etc acc 3699 Pro Glu His Cys Gln lie Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

tgt gaa gee tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240 1245

gat gee ccg gtg age ccc acc act ctg tat gtg gag gac ate teg 3789 Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp H e Ser

1250 1255 1260

gaa ccg ccg ttg cae gat ttc tac tgc age agg cta ctg gac ctg 3834 Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270 1275

gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879 Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285 1290

gaa gtg ctg aag gee ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924 Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300 1305

ate tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gee gtg gtg gag tac cae gac 3969 lie Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

ggc tcc cae gee tac ate ggg etc aag gac cgg aag cga ccg tea 4014 Gly Ser His Ala Tyr lie Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

gag ctg cgg cgc att gee age cag gtg aag tat gcg ggc age cag 4059 Glu Leu Arg Arg lie Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

gtg gee tcc acc age gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa ate 4104 Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln lie

1355 1360 1365

ttc age aag ate gac cgc cct gaa gee tcc cgc ate gee ctg etc 4149 Phe Ser Lys lie Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg lie Ala Leu Leu

1370 1375 1380

ctg atg gee age cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194 Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg ate ccg 4239 Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val lie Val lie Pro

1400 1405 1410

gtg ggc att ggg ccc cat gee aac etc aag cag ate cgc etc ate 4284 _{Val Gly} lie Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln lie Arg Leu lie

1415 1420 1425

gag aag cag gee cct gag aac aag gee ttc gtg ctg age agt gtg 4329 Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

gat gag ctg gag cag caa agg gac gag ate gtt age tac etc tgt 4374 Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu lie Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

gac ctt gee cct gaa gee cct cct cct act ctg ccc ccc cae atg 4419 Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

1460 1465 1470

gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg etc ttg ggg gtt teg acc ctg 4464 _{Ala Gln} Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509 _{Gly Pro} Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

gaa gga teg gac aaa att ggt gaa gee gac ttc aac agg age aag 4554 Glu Gly Ser Asp Lys lie Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599 Glu Phe Met Glu Glu Val lie Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

age ate cae gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644 Ser lie His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

gag tac ccc ttc age gag gca cag tcc aaa ggg gac ate ctg cag 4689 _{Glu Tyr} Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp lie Leu Gln

1550 1555 1560

cgg gtg cga gag ate cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734 Arg Val Arg Glu lie Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570 1575

ggg ctg gee ctg cgg tac etc tet gac cae age ttc ttg gtc age 4779 _{Gly Leu} Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824 Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600 1605

gga aat cct gee tet gat gag ate aag agg ctg cct gga gac ate 4869 Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu lie Lys Arg Leu Pro Gly Asp lie

1610 1615 1620

cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914 Gln Val Val Pro lie Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct ate etc ate cag gac 4959 Leu Glu Arg lie Gly Trp Pro Asn Ala Pro lie Leu lie Gln Asp

1640 1645 1650

ttt gag acg etc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004 Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag ate ccc acc etc tcc cct gca 5049 _{Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln lie Pro Thr Leu Ser Pro Ala}

1670 1675 1680

cct gac tgc age cag ccc ctg gac gtg ate ctt etc ctg gat ggc 5094 Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val lie Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

tcc tcc agt ttc cea gct tet tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139 Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

gcc aag gct ttc att tea aaa gcc aat ata ggg cct cgt etc act 5184 _{Ala Lys Ala Phe lie Ser Lys Ala Asn lie Gly Pro Arg Leu Thr}

1715 1720 1725

cag gtg tea gtg ctg cag tat gga age ate acc acc att gac gtg 5229 Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser lie Thr Thr lie Asp Val

1730 1735 1740

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2420 2425 2430

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2570 2575 2580

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2810

<210>2

<211> 2813

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995 1000 1005

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1190 1195 1200

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1205 1210 1215

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1220 1225 1230

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1235 1240 1245

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1250 1255 1260

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1265 1270 1275

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1280 1285 1290

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1295 1300 1305

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1310 1315 1320

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1325 1330 1335

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1340 1345 1350

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1355 1360 1365

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1370 1375 1380

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1385 1390 1395

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1400 1405 1410

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1415 1420 1425

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1430 1435 1440

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1445 1450 1455

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1460 1465 1470

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1475 1480 1485

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1490 1495 1500

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1505 1510 1515

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1535 1540 1545

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1550 1555 1560

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1580 1585 1590

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1595 1600 1605

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1610 1615 1620

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1790 1795 1800

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1835 1840 1845

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1850 1855 1860

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1865 1870 1875

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1955 1960 1965

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1970 1975 1980

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1985 1990 1995

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2465 2470 2475

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Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

2555 2560 2565

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

2570 2575 2580

Leu Asn Gly Thr Val lie Gly Pro Gly Lys Thr Val Met lie Asp

2585 2590 2595

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val lie Ser

2600 2605 2610

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

2615 2620 2625

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2630 2635 2640

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr lie Gln Leu Arg Gly Gly Gln lie

2645 2650 2655

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

2660 2665 2670

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

2675 2680 2685

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

2690 2695 2700

Glu Gly Gly Lys lie Met Lys lie Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

2705 2710 2715

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp lie Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

2720 2725 2730

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp lie His

2735 2740 2745

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser lie Asp

2750 2755 2760

lie Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

2765 2770 2775

Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val

2780 2785 2790

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

2795 2800 2805

Arg Lys Cys Ser Lys

2810

<210>3

<211> 2813

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(2813)

<400>3

Met lie Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu lie

1 5 10 15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser lie lie Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp lie His Leu 85 90 95

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg lie Asp Gly Ser Gly 130 135 140

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

Leu Cys Gly Asn Phe Asn lie Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Cys Asn lie Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220

980 985 990

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly lie Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn lie Met Lys Gln 1040 1045 1050

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg lie Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080

Cys lie Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser lie Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095

Cys Phe Cys Asp Thr lie Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys lie Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215

Pro Glu His Cys Gln lie Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240 1245

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp lie Ser

1250 1255 1260

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270 1275

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285 1290

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300 1305

lie Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

Gly Ser His Ala Tyr lie Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

Glu Leu Arg Arg lie Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln lie

1355 1360 1365

Phe Ser Lys lie Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg lie Thr Leu Leu

1370 1375 1380

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val lie Val lie Pro

1400 1405 1410

Val Gly lie Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln lie Arg Leu lie

1415 1420 1425

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu lie Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met

1460 1465 1470

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

Glu Gly Ser Asp Lys lie Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

Glu Phe Met Glu Glu Val lie Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

Ser lie His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp lie Leu Gln

1550 1555 1560

Arg Val Arg Glu lie Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570 1575

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600 1605

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu lie Lys Arg Leu Pro Gly Asp lie

1610 1615 1620

Gln Val Val Pro lie Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

Leu Glu Arg lie Gly Trp Pro Asn Ala Pro lie Leu lie Gln Asp

1640 1645 1650

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln lie Pro Thr Leu Ser Pro Ala

1670 1675 1680

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val lie Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

Ala Lys Ala Phe lie Ser Lys Ala Asn lie Gly Pro Arg Leu Thr

1715 1720 1725

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser lie Thr Thr lie Asp Val

1730 1735 1740

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745 1750 1755

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln lie Gly Asp Ala

1760 1765 1770

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val lie Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

1805 1810 1815

Arg Val Thr Val Phe Pro lie Gly lie Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

1820 1825 1830

Ala Gln Leu Arg lie Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835 1840 1845

Val Lys Leu Gln Arg lie Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

1850 1855 1860

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg lie

1865 1870 1875

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

1880 1885 1890

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

1895 1900 1905

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

1910 1915 1920

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

1925 1930 1935

Thr Cys GlyCys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

1940 1945 1950

Ser Thr Arg

His lie ValThr Phe Asp Gly Gln AsnPheLys Leu

1955 1960 1965

Thr Gly SerCys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

1970 1975 1980

Leu Glu Vallie Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985 1990 1995

Gln Gly CysMet Lys Ser lie Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

2000 2005 2010

Val Glu LeuHis Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

2015 2020 2025

Val Ser ValPro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

2030 2035 2040

Gly Ala lieMet His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His lie

2045 2050 2055

Phe Thr PheThr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser

2060 2065 2070

Pro Lys ThrPhe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly lie Cys

2075 2080 2085

Asp Glu Asn

Gly Ala AsnAsp Phe Met Leu Arg AspGlyThr Val

2090 2095 2100

Thr Thr Asp

Trp Lys ThrLeu Val Gln Glu Trp ThrValGln Arg

2105 2110 2115

Pro Gly GlnThr Cys Gln Pro lie Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

2120 2125 2130

Pro Asp SerSer His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135 2140 2145

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala lie Cys

2150 2155 2160

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val lie Ala

2165 2170 2175

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

2180 2185 2190

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200 2205

Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn

2210 2215 2220

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

2225 2230 2235

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240 2245 2250

Cys Thr Gln Cys lie Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255 2260 2265

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln lie Cys Thr Cys

2270 2275 2280

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285 2290 2295

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300 2305 2310

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315 2320 2325

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

2330 2335 2340

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

2345 2350 2355

Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro

2360 2365 2370

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

2375 2380 2385

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

2390 2395 2400

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

2405 2410 2415

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420 2425 2430

Arg Ser Thr lie Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

2435 2440 2445

Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

2450 2455 2460

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

2465 2470 2475

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485 2490

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

2495 2500 2505

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

2510 2515 2520

Pro Glu Asn Pro Cys Leu lie Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

2525 2530 2535

Glu Val Phe lie Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu

2540 2545 2550

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

2555 2560 2565

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

2570 2575 2580

Leu Asn Gly Thr Val lie Gly Pro Gly Lys Thr Val Met lie Asp

2585 2590 2595

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val lie Ser

2600 2605 2610

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

2615 2620 2625

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2630 2635 2640

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr lie Gln Leu Arg Gly Gly Gln lie

2645 2650 2655

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

2660 2665 2670

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

2675 2680 2685

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

2690 2695 2700

Glu Gly Gly Lys lie Met Lys lie Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

2705 2710 2715

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp lie Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

2720 2725 2730

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp lie His

2735 2740 2745

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser lie Asp

2750 2755 2760

lie Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

2765 2770 2775

Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val

2780 2785 2790

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

2795 2800 2805

Arg Lys Cys Ser Lys

2810

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de fabricación de un factor de von Willebrand (vWF) recombinante mediante el cultivo de células huésped en un biorreactor en un medio de cultivo celular, en el que las células huésped producen vWF recombinante que es secretado al medio de cultivo celular y en el que el vWF en el medio de cultivo celular comprende multímeros de vWF de diferente tamaño, en el que al menos un componente del medio de cultivo celular es alimentado al medio de cultivo celular y en el que el cultivo celular que comprende las células, el vWF recombinante y el medio de cultivo celular es bombeado sobre un sistema de separación que tiene un tamaño límite de peso molecular de aproximadamente 750.000 Da, y en el que el sistema de separación separa los multímeros de vWF en al menos

(i) una fracción de material permeado que está enriquecida en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y reducida en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW) en comparación con los multímeros de vWF en el sobrenadante del cultivo celular antes de la separación y

(ii) una fracción de material retenido que está reducida en multímeros de vWF de bajo peso molecular (LMW) y enriquecida en multímeros de vWF de alto peso molecular (HMW) en comparación con los multímeros de vWF en el sobrenadante del cultivo celular antes de la separación.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fracción deseada del vWF recombinante destinada a ser purificada adicionalmente es el material permeado.

3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en el que la relación de multímeros de vWF de LMW es igual o inferior a 0,9.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fracción deseada del vWF recombinante destinada a ser purificada adicionalmente es el material retenido.

5. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 4, en el que la relación de multímeros vWF de HMW es igual o superior a 1,1.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1, 4 y 5, en el que el vWF recombinante en el material retenido tiene una relación vWF:RCoF/vWF:Ag superior a 1,2.

7. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que el vWF recombinante es una proteína de fusión en la que el vWF está fusionado con albúmina o con un fragmento Fc de una inmunoglobulina.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material retenido obtenido de este modo se somete a una segunda separación en la que los multímeros de vWF ultragrandes se enriquecen en dicho material retenido, proporcionando un segundo material permeado en el que la proporción de los multímeros de vWF ultragrandes en la cantidad total de multímeros de vWF se reduce en comparación con la proporción de multímeros de vWF ultragrandes en la cantidad total de multímeros de vWF en el material retenido antes de dicha segunda separación.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la segunda separación se realiza en paralelo con la primera separación.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la segunda separación se realiza después de la primera separación.

11. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 10, en el que el tamaño límite de peso molecular del segundo sistema de separación es de aproximadamente 10.000.000 Da.