ES2912300T3 - Procedimientos de preparación de factor von Willebrand modificado - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una glicoproteína que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado y que comprende N-glicanos con sialilación aumentada, en el que el VWF truncado es capaz de unión a un Factor VIII (FVIII), - en el que el VWF truncado consiste en (a) aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9, o en (b) una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 90% con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9, cuyo procedimiento comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende el VWF truncado, y (ii) cultivar dichas células a una temperatura menor que 36,0°C.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de preparación de factor von Willebrand modificado

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una glicoproteína que comprende un Factor von Willebrand (VWF) truncado y que comprende N-glicanos con sialilación aumentada. La invención se refiere además a una glicoproteína que comprende un Factor von Willebrand (VWF) truncado. La glicoproteína puede utilizarse para mejorar el tratamiento de los trastornos de la coagulación sanguínea.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Existen diversos trastornos hemorrágicos causados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Los trastornos más comunes son la hemofilia A y B, que resultan de las deficiencias del Factor VIII (FVIII) y IX de la coagulación sanguínea, respectivamente. Otro trastorno hemorrágico conocido es la enfermedad de von Willebrand (VWD).

En el plasma, el FVIII existe principalmente como un complejo no covalente con el Factor von Willebrand (VWF), y su función coagulante es acelerar la conversión del Factor X en Xa dependiente del Factor IXa.

La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico heredado. Es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X de la coagulación sanguínea FVIII, y afecta casi exclusivamente a los varones con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10.000. La anomalía del cromosoma X es transmitida por mujeres portadoras que no son a su vez hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es una mayor tendencia al sangrado.

En los pacientes con hemofilia A grave sometidos a tratamiento profiláctico, el FVIII debe administrarse por vía intravenosa (i.v.) aproximadamente 3 veces por semana debido a la corta semivida plasmática del FVIII, de aproximadamente 12 a 14 horas. Cada administración i.v. es engorrosa, está asociada al dolor y conlleva el riesgo de una infección, especialmente porque la mayoría de las veces es realizada en casa por los propios pacientes o por los padres de los niños que han sido diagnosticados de hemofilia A.

Por lo tanto, sería muy deseable aumentar la semivida del FVIII para que las composiciones farmacéuticas que contienen dicho FVIII tengan que administrarse con menos frecuencia.

Se han hecho varios intentos para prolongar la semivida del FVIII no activado, ya sea por medio de la reducción de su interacción con los receptores celulares (documentos WO 03/093313 A2, WO 02/060951 ), por medio de la unión covalente de polímeros al FVIII (documentos WO 94/15625 , WO 97/11957 A1 y US 4970300), por encapsulamiento del FVIII (documento WO 99/55306 ), por medio de la introducción de sitios novedosos de unión de metales (documento WO 97/03193 ), por medio de la unión covalente del dominio A2 al dominio A3, ya sea por vía peptídica (documentos WO 97/40145 y WO 03/087355 ) o por enlace disulfuro (documento WO 02/103024 A) o por medio de la unión covalente del dominio A1 al dominio A2 (documento WO 2006/108590 ).

Otro enfoque para mejorar la semivida funcional del FVIII o del VWF es la PEGilación del FVIII (documentos WO 2007/126808, WO 2006/053299, WO 2004/075923) o por PEGilación del VWF (documento WO 2006/071801). El aumento de la semivida del FVW PEGilado también aumentaría indirectamente la semivida del FVIII presente en el plasma. También se han descrito proteínas de fusión del FVIII (documentos WO 2004/101740 A2, WO2008/077616 A1 y WO 2009/156137 A1).

El VWF, que falta, está funcionalmente defectuoso o sólo está disponible en cantidad reducida en diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand (VWD), es una glicoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de los mamíferos, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el VWF actúa como mediador entre los receptores específicos de la superficie de las plaquetas y los componentes de la matriz extracelular, como el colágeno. Además, el VWF sirve como proteína portadora y estabilizadora del FVIII procoagulante. El VWF se sintetiza en las células endoteliales y los megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADNc del VWF de tipo salvaje se divulgan en Collins et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:4393-4397. El polipéptido precursor, pre-pro-VWF, consiste en un péptido señal de 22 residuos en su extremo N, seguido de un propéptido de 741 residuos y del polipéptido de 2050 residuos que se encuentra en el VWF plasmático maduro (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Tras la escisión del péptido señal en el retículo endoplasmático, se forma un puente disulfuro C-terminal entre dos monómeros del VWF. Durante el transporte posterior a través de la vía secretora se añaden 12 cadenas laterales de carbohidratos ligadas a la N y 10 ligadas a la O. Más importante aún, los dímeros del VWF se multimerizan a través de puentes disulfuro N-terminales y el propéptido de 741 aminoácidos de longitud es escindido por la enzima PACE/furina en el aparato de Golgi tardío.

Una vez secretada en el plasma, la proteasa ADAMTS13 puede escindir los multímeros de alto peso molecular del VWF dentro del dominio A1 del VWF. Por lo tanto, el VWF plasmático está formado por toda una gama de multímeros que van desde dímeros simples de 500 kDa hasta multímeros formados por hasta más de 20 dímeros de un peso molecular superior a 10.000 kDa. El VWF-HMWM es el que tiene la mayor actividad hemostática, que puede medirse en la actividad del cofactor de ristocetina (VWF:RCo). Cuanto mayor sea la relación VWF:RCo/VWF antígeno, mayor será la cantidad relativa de multímeros de alto peso molecular.

En el plasma, el FVIII se une con alta afinidad al VWF, lo que lo protege de la eliminación prematura y, por lo tanto, desempeña, además de su función en la hemostasia primaria, un papel crucial para estabilizar el FVIII, regular los niveles plasmáticos del FVIII y, como consecuencia, también es un factor central para controlar la hemostasia secundaria. La semivida del FVIII no activado unido al VWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en el plasma. En la enfermedad de von Willebrand de tipo 3, en la que no existe o casi no existe el FVIII, la semivida del FVIII es sólo de aproximadamente 2 a 6 horas, lo que da lugar a síntomas de hemofilia A de leve a moderada en dichos pacientes debido a la disminución de las concentraciones de FVIII. El efecto estabilizador del VWF sobre el FVIII también se ha utilizado para ayudar a la expresión recombinante del FVIII en células CHO (Kaufman et al. 1989, Mol Cell Biol 9:1233-1242).

Se ha descrito que los polipéptidos derivados del VWF, en particular los fragmentos del VWF, estabilizan el FVIII in vitro e in vivo. El documento WO 2013/106787 A1 se dirige a proteínas quiméricas que comprenden una proteína VWF y ciertos fragmentos del FVIII. Los documentos WO 2014/198699 A 2yW O 2013/083858 A2 describen fragmentos de VWF y su uso en el tratamiento de la hemofilia. El documento WO 2011/060242 A2 desvela polipéptidos de fusión que comprenden ciertos fragmentos de VWF y una región Fc de anticuerpos. El documento WO2013/093760 A2 describe un procedimiento para preparar una proteína, que comprende la coexpresión de polipéptidos de FVIII o VWF, incluyendo formas truncadas de VWF, con una a-2,3-sialiltransferasa recombinante. Yee et al. (2014) Blood 124(3):445-452 han descubierto que un fragmento de VWF que contiene los dominios D'D3 fusionados es suficiente para estabilizar el Factor VIII en ratones. Sin embargo, aunque una proteína de fusión VWF D'D3-Fc mostró una supervivencia notablemente prolongada cuando se transfirió a ratones con deficiencia de FVIII, la proteína de fusión VWF D'D3-Fc no prolongó la supervivencia del FVIII cotransfundido.

El efecto de la temperatura de fermentación sobre el nivel de sialilación de una glicoproteína fue investigado por Trummer et al (Biotech. Bioeng. (2006) Vol. 94, No. 6, p. 1033-1044) que han descubierto para la eritropoyetina a 30°C una disminución de la sialilación de 40% y a 33°C una disminución de 20%.

Ahn et al. también investigaron el efecto de la temperatura de fermentación en el nivel de sialilación de una glicoproteína y publicaron para la eritropoyetina (Biotech. Bioeng.(2008) Vol. 101, No. 6, p. 1234-1244) un porcentaje de glicoproteína asialo a 37°C de 2,4 %, y a 32° C de 2,1 %.

Existe una necesidad constante de procedimientos para aumentar la semivida del FVIII y de los productos de FVIII con una frecuencia de administración reducida.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una glicoproteína como se define en la reivindicación 1. La presente invención se refiere además a una glicoproteína como se define en la reivindicación 7. La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica, una glicoproteína para uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea, y un kit farmacéutico como se define en las reivindicaciones 12, 14 y 16, respectivamente.

Los inventores han descubierto que la sialilación de los N-glicanos de los fragmentos de VWF puede aumentar significativamente si las células de mamífero transfectadas con ADN recombinante que codifica un fragmento de VWF se cultivan a una temperatura más baja, por ejemplo, por debajo de 36°C. Los productos así obtenidos presentan una farmacocinética mejorada y una media de tiempo de residencia (MRT) prolongada y pueden utilizarse para mejorar también la farmacocinética y prolongar la MRT de un FVIII coadministrado. Los inventores han descubierto que la depuración del FVIII puede reducirse significativamente mediante la coadministración de un polipéptido derivado del VWF de semivida prolongada que se caracteriza por un alto grado de sialilación de sus N-glicanos. Por lo tanto, están especialmente indicados para el tratamiento de los trastornos de la coagulación sanguínea. Los fragmentos de VWF capaces de unión al FVIII que comprenden N-glicanos en los que más del 75% de todos los N-glicanos, en promedio, tienen al menos un ácido siálico, han demostrado ser particularmente útiles.

Otra ventaja del procedimiento de la presente invención como se ha descrito anteriormente es que los fragmentos de VWF obtenidos tienen una mayor proporción de dímeros que los fragmentos de VWF producidos de manera convencional. Los inventores han descubierto que los dímeros tienen una mayor afinidad con el FVIII que los monómeros.

En realizaciones particulares preferentes de la invención, el polipéptido derivado del VWF de la invención puede estar conectado a un resto de extensión de la semivida y se caracteriza por un alto grado de sialilación de sus N-glicanos y tiene una cantidad particularmente baja de N-glicanos con residuos de galactosa terminales y no sialilados, incluyendo una cantidad particularmente baja de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados, y aún más preferentemente una cantidad particularmente baja de N-glicanos con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

La presente invención se refiere por tanto a las siguientes realizaciones:

[1] Un procedimiento para producir una glicoproteína que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado y que comprende N-glicanos con sialilación aumentada, en el que el VWF truncado es capaz de unión a un Factor VIII (FVIII), en el que el VWF truncado consiste en (a) aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NÚM.:9 o (b) una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 90% con aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NÚM.:9, cuyo procedimiento comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende el VWF truncado, y (ii) cultivar dichas células a una temperatura menor que 36,0°C.

[2] El procedimiento del apartado [1], en el que las células comprenden además un ácido nucleico recombinante que codifica una sialiltransferasa, preferentemente una a-2,6-sialiltransferasa y/o una a-2,3-sialiltransferasa.

[3] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que antes de la etapa (ii) las células se cultivan a una temperatura de 37,0°C±1,0°C, y la etapa (ii) comprende el cultivo de las células a una temperatura de 34,0°C±2,0°C.

[4] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que las células son células de mamífero transfectadas, y la etapa (i) comprende introducir en las células de mamífero el ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende el VWF truncado, y opcionalmente el ácido nucleico recombinante que codifica una sialiltransferasa.

[5] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, que comprende además la etapa de recuperar la glicoproteína del medio de cultivo.

[6] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, que comprende además someter la glicoproteína obtenida en cualquiera de los apartados anteriores a cromatografía de intercambio iónico, en la que la glicoproteína con alta sialilación se separa de la glicoproteína con baja sialilación; y recoger las fracciones eluidas de la columna de intercambio iónico con alta sialilación.

[7] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, que comprende además poner en contacto la glicoproteína obtenida en uno cualquiera de los apartados anteriores con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico in vitro.

[8] El procedimiento del apartado [7], en el que la sialiltransferasa es una a-2,6-sialiltransferasa, una a-2,3-sialiltransferasa o una de sus combinaciones.

[9] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que la glicoproteína comprende además un polipéptido heterólogo de semivida extendida fusionado al VWF truncado.

[10] El polipéptido del apartado [9], en el que el polipéptido heterólogo que extiende la semivida comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en albúmina o un fragmento de las mismas con una longitud de al menos 100 aminoácidos, regiones constantes de inmunoglobulina y sus porciones, por ejemplo el fragmento Fc, la transferrina y sus fragmentos, el péptido de extremo C terminal de la gonadotropina coriónica humana, las cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico conocidas como XTEN, las repeticiones de homo-aminoácidos (HAP), las repeticiones de prolina-alaninaserina (PAS), la albúmina, la afamina, la alfa-fetoproteína, la proteína de unión a la vitamina D, los polipéptidos capaces de unión en condiciones fisiológicas a la albúmina o a las regiones constantes de las inmunoglobulinas, y sus combinaciones.

[11] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados [1] a [8], que comprende la conjugación de la glicoproteína obtenida en uno cualquiera de los apartados anteriores con el resto que prolonga la semivida.

[12] El procedimiento del apartado [11], en el que el resto que prolonga la semivida se selecciona del grupo que consiste en hidroxietil almidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiales (PSA) y ligandos de unión a la albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos.

[13] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que, en promedio, al menos 75% de los N-glicanos de la glicoproteína obtenida comprenden al menos un resto de ácido siálico.

[14] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que, en promedio, al menos 80% de los N-glicanos de la glicoproteína obtenida comprenden al menos un resto de ácido siálico.

[15] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que, en promedio, al menos 85% de los N-glicanos de la glicoproteína obtenida comprenden al menos un resto de ácido siálico.

[16] El procedimiento de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que, en promedio, al menos 50% de la glicoproteína obtenida está presente como dímero.

[17] Una glicoproteína que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, en la que el VWF truncado consiste en (a) aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9 o (b) una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 90% con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9, en la que dicho VWF truncado es capaz de unión a un Factor VIII (FVIII), y en la que dicha glicoproteína comprende N-glicanos, y al menos 75%, preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90%, preferentemente al menos 95%, preferentemente al menos 96%, preferentemente al menos 97%, más preferentemente al menos 99% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido siálico.

[18 ] Una glicoproteína que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, en el que dicho VWF truncado es capaz de unión a un Factor VIII (FVIII), y en el que dicha glicoproteína comprende N-glicanos, en el que menos de 35%, preferentemente menos de 34%, preferentemente menos de 33%, preferentemente menos de 32%, preferentemente menos de 31%, preferentemente menos de 30%, preferentemente menos de 29%, preferentemente menos de 28%, preferentemente menos de 27%, preferentemente menos de 26%, preferentemente menos de 25%, preferentemente menos de 24%, preferentemente menos de 23% preferentemente menos de 22%, preferentemente menos de 21%, preferentemente menos de 20% preferentemente menos de 19%, preferentemente menos de 18%, preferentemente menos de 17%, preferentemente menos de 16%, preferentemente menos de 15%, preferentemente menos de 14%, preferentemente menos de 13%, preferentemente menos de 12%, preferentemente menos de 11%, preferentemente menos de 10%, preferentemente menos de 9%, preferentemente menos de 8% preferentemente menos de 7%, preferentemente menos de 6% y preferentemente menos de 5% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

[19] Una glicoproteína de acuerdo con los apartados [17] y [18].

[20] Una glicoproteína que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, en el que el VWF truncado consiste en (a) aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9 o (b) una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 90% con aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9, en la que dicho VWF truncado es capaz de unión a un Factor VIII (FVIII), y en la que dicha glicoproteína comprende N-glicanos, en los que menos de 6%, preferentemente menos de 5%, preferentemente menos de 4%, preferentemente menos de 3%, preferentemente menos de 2%, y preferentemente menos de 1% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

[21] Una glicoproteína de acuerdo con los apartados [17] y [20] o de acuerdo con los apartados [18] y [20] o de acuerdo con los apartados [19] y [20].

[22] La glicoproteína de los apartados [17] a [21], en la que al menos 70% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido a-2,6-sialico o un resto de ácido a-2,3-sialico.

[23] La glicoproteína de uno cualquiera de los apartados [17] a [22], que comprende además un polipéptido heterólogo que prolonga la semivida fusionado al FVW truncado, y/o un resto que prolonga la semivida conjugado con la glicoproteína.

[24] La glicoproteína del apartado [23], en la que dicho polipéptido heterólogo que prolonga la semivida comprende o consiste en albúmina sérica humana o un fragmento de la misma, en el que la longitud de dicho fragmento es de al menos 100 aminoácidos.

[25] La glicoproteína del apartado [23], en la que dicho polipéptido heterólogo fusionado a la glicoproteína comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en regiones constantes de inmunoglobulina y sus porciones, por ejemplo el fragmento Fc, la transferrina y sus fragmentos, el péptido de extremo C terminal de la gonadotropina coriónica humana, las cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico conocidas como XTEN, las repeticiones de homo-aminoácidos (HAP), las repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), la albúmina, la afamina, la alfa-fetoproteína, la proteína de unión a la vitamina D, los polipéptidos capaces de unión en condiciones fisiológicas a la albúmina o a las regiones constantes de las inmunoglobulinas, y sus combinaciones .

[26] El polipéptido del apartado [23], en el que el resto que prolonga la semivida se conjuga con el polipéptido, en el que dicha fracción de extensión de la semivida se selecciona preferentemente del grupo que consiste en hidroxietil almidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiálicos (PSA), polipéptidos similares a la elastina, polímeros de heparosán, ácido hialurónico y ligandos de unión a la albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos.

[27] La glicoproteína de uno cualquiera de los apartados [17] a [26], en el que la glicoproteína es un dímero.

[28] La glicoproteína dimérica del apartado [27], en la que la afinidad de dicha glicoproteína dimérica con el FVIII es mayor que la afinidad de una glicoproteína monomérica con dicho FVIII, en la que dicha glicoproteína monomérica tiene la misma secuencia de aminoácidos que la glicoproteína dimérica.

[29] La glicoproteína de uno cualquiera de los apartados [17] a [28], en la que dicho VWF truncado tiene una o más sustituciones de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NÚM.:9, en la que el VWF truncado que tiene dichas sustituciones de aminoácidos tiene una mayor afinidad por el FVIII que un VWF truncado que consiste en la misma secuencia de aminoácidos excepto por dichas sustituciones de aminoácidos en relación con la SEQ ID NÚM.:9.

[30] La glicoproteína del apartado [29], en la que la afinidad de dicha glicoproteína por el FVIII es mayor que la afinidad de un polipéptido de referencia, en la que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de referencia es idéntica a la secuencia de aminoácidos de dicha glicoproteína, excepto que la secuencia de aminoácidos del FVR truncado del polipéptido de referencia no tiene dicha una o más sustituciones en relación con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NÚM.:9.

[31] Una composición que comprende una población de glicoproteínas como la definida en uno cualquiera de los apartados [17] a [30], en la que la relación entre la glicoproteína dimérica y la glicoproteína monomérica en la composición es mayor que 1,0, preferentemente mayor que 1,5, más preferentemente mayor que 2,0, más preferentemente mayor que 2,5.

[32] Una composición farmacéutica que comprende una glicoproteína de uno cualquiera de los apartados [17] a [30] y un excipiente aceptable para uso farmacéutico.

[33] La composición farmacéutica del apartado [32], en la que al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% de las glicoproteínas en la composición están presentes como dímeros.

[34] La glicoproteína como se define en uno cualquiera de los apartados [17] a [30] para uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea, dicho tratamiento comprende la administración a un individuo de una cantidad eficaz de dicha glicoproteína.

[35] La glicoproteína para uso de acuerdo con el apartado [34], en la que dicho tratamiento comprende además la administración al individuo de una cantidad eficaz de un FVIII.

[36] La glicoproteína para su uso de acuerdo con el apartado [35], en la que la MRT plasmática del FVIII aumenta, y/o la depuración del FVIII se reduce, por la coadministración de la glicoproteína, en comparación con un tratamiento con el FVIII solo.

[37] La glicoproteína para uso de acuerdo con el apartado [35] o [36], en la que la frecuencia de administración del FVIII se reduce en comparación con un tratamiento con el FVIII solo.

[38] La glicoproteína para uso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [35] a [37], en la que la glicoproteína y/o el FVIII se administran por vía intravenosa.

[39] La glicoproteína para uso de acuerdo con uno de los apartados [35] a [37], en la que la glicoproteína y/o el FVIII se administran por vía subcutánea.

[40] La glicoproteína para uso de acuerdo con uno de los apartados [35] a [39], en la que la glicoproteína y el FVIII se administran por separado.

[41] La glicoproteína definida en uno cualquiera de los apartados [17] a [30] para uso en el aumento de la MRT plasmática del Factor VIII.

[42] La glicoproteína como se define en uno cualquiera de los apartados [17] a [30] para uso en la reducción de la depuración del FVIII administrado de la circulación.

[43] La glicoproteína para uso del apartado [41] o [42], en la que dicho Factor VIII se administra exógenamente a un individuo que tiene hemofilia A.

[44] Un kit farmacéutico que comprende (i) un FVIII y (ii) una glicoproteína como se define en uno cualquiera de los apartados [17] a [30] para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Fig. 1: Media de tiempo de residencia y depuración (media) del dímero de D'D3-FP cuantificado como albúmina en ratas, según se determinó en el Ejemplo 8.1.

Fig. 2: Media de tiempo de residencia y depuración (media) del rVIII-SC cuantificado como antígeno del FVIII en ratas, según se determinó en el Ejemplo 8.1.

Fig. 3: Media de tiempo de residencia y depuración (media) del dímero de D'D3-FP cuantificado como albúmina en ratas, según se determinó en el Ejemplo 8.2.

Fig. 4: Media de tiempo de residencia y depuración (media) del Factor VIII de longitud completa cuantificado como antígeno del fV iII en ratas, según se determinó en el Ejemplo 8.2.

Fig. 5: Leyenda de las glicoestructuras mostradas en las Figuras 6 a 25

Fig. 6: Perfil del ote B-140526 que muestra los N-glicanos neutros

Fig. 7: Perfil del ote B-140526 que muestra los N-glicanos mono-sialo

Fig. 8: Perfil del ote B-140526 que muestra los N-glicanos di-sialo

Fig. 9: Perfil del ote B-140526 que muestra los N-glicanos tri-sialo

Fig. 10: Perfil del lote

Fig. 11: Perfil del lote

Fig. 12: Perfil del lote

Fig. 13: Perfil del lote

Fig. 14: Perfil del lote

Fig. 15: Perfil del lote

Fig. 16: Perfil del lote

Fig. 17: Perfil del lote

Fig. 18: Perfil del lote

Fig. 19: Perfil del lote

Fig. 20: Perfil del lote

Fig. 21: Perfil del lote

Fig. 22: Perfil del lote

Fig. 23: Perfil del lote

Fig. 24: Perfil del lote

Fig. 25: Perfil del lote

Fig. 26: Determinación cuantitativa de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados de la muestra comparativa B140526. La primera columna muestra la distribución cuantitativa de todos los N-glicanos para N-glicanos neutros, mono-sialo, di-sialo, tri-sialo y tetra-sialo sumando el 100%. La segunda columna muestra el porcentaje (en relación con el 100% de todos los N-glicanos) de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. En la presente muestra sólo se detectaron N-glicanos neutros, mono-sialo y di-sialo con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. La tercera columna muestra el porcentaje (en relación con el 100% de todos los N-glicanos) de N-glicanos con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. En la presente muestra sólo se detectaron N-glicanos neutros con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

Fig. 27: Determinación cuantitativa de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados de la muestra B140616KS de acuerdo con la invención. La primera columna muestra la distribución cuantitativa de todos los N-glicanos para N-glicanos neutros, mono-sialo, di-sialo, tri-sialo y tetra-sialo sumando el 100%. La segunda columna muestra el porcentaje (en relación con el 100% de todos los N-glicanos) de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. En la presente muestra sólo se detectaron N-glicanos neutros, mono-sialo y di-sialo con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. La tercera columna muestra el porcentaje (en relación con el 100% de todos los N-glicanos) de N-glicanos con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. En la presente muestra sólo se detectaron N-glicanos neutros con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

Fig. 28: Determinación cuantitativa de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados de la muestra B140825 de acuerdo con la invención. La primera columna muestra la distribución cuantitativa de todos los N-glicanos para N-glicanos neutros, mono-sialo, di-sialo, tri-sialo y tetra-sialo sumando el 100%. La segunda columna muestra el porcentaje (en relación con el 100% de todos los N-glicanos) de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. En la presente muestra sólo se detectaron N-glicanos neutros, mono-sialo y di-sialo con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. La tercera columna muestra el porcentaje (en relación con el 100% de todos los

N-glicanos) de N-glicanos con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. En la presente muestra sólo se detectaron N-glicanos neutros con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

Fig. 29: Determinación cuantitativa de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados de la muestra B140623KS de acuerdo con la invención. La primera columna muestra la distribución cuantitativa de todos los N-glicanos para N-glicanos neutros, mono-sialo, di-sialo, tri-sialo y tetra-sialo sumando el 100%. La segunda columna muestra el porcentaje (en relación con el 100% de todos los N-glicanos) de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. En la presente muestra sólo se detectaron N-glicanos neutros, mono-sialo y di-sialo con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. La tercera columna muestra el porcentaje (en relación con el 100% de todos los

N-glicanos) de N-glicanos con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados. En la presente muestra sólo se detectaron N-glicanos neutros con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una glicoproteína como se define en la reivindicación 1.

El término "glicoproteína", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una proteína o polipéptido que comprende una o más cadenas de oligosacáridos unidas covalentemente, como se define en la reivindicación 7. Las cadenas de oligosacáridos pueden estar compuestas por una única cadena no ramificada de residuos de azúcar o pueden estar compuestas por una cadena de residuos de azúcar que se ramifica una o más veces.

Los "glicanos ligados al N" son oligosacáridos que están unidos covalentemente a los residuos de asparagina de un polipéptido. Las galactosas terminales de dichos glicanos ligados a N se pueden modificar por medio de la unión de un ácido siálico ligado a la a-2,3 o a la a-2,6. Preferentemente las galactosas terminales son D-galactosas. Los N-glicanos suelen estar ramificados y pueden ser, por ejemplo, de tipo bi-, tri- o tetra-antenario, de modo que puede haber dos, tres o cuatro residuos de galactosa terminales en un N-glicano, que pueden estar sialilados en diversos grados o ser todos no sialilados. "Terminal" se refiere a la posición más distante en una rama dada de un N-glicano desde el punto de unión del N-glicano a la cadena peptídica de la glicoproteína de la invención.

El término "ácido siálico" se refiere a los derivados sustituidos en N u O del ácido neuramínico que se suelen encontrar como monosacáridos terminales de los oligosacáridos animales (para una revisión, véase Varkis (1992) Glycobiology vol. 2 No. 1 pp. 25-40). El ácido siálico más común es el ácido N-acetil neuramínico. Una "sialilación aumentada" significa que al menos el 75% de los N-glicanos de la glicoproteína comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. A modo de ejemplo no limitativo, un "aumento de la sialilación de al menos el 75%" se determina como en el Ejemplo 6 de la presente invención, es decir, por medio de la escisión enzimática de todos los N-glicanos de una glicoproteína de interés dada y la determinación posterior de la cantidad de N-glicanos escindidos sin ácidos siálicos ("N-glicanos asialo") y la cantidad total de todos los N-glicanos escindidos. Una "sialilación de al menos el 75%" corresponde entonces a una cantidad del 25% de N-glicanos asialo o menos de la cantidad total de todos los N-glicanos escindidos.

El aumento de la sialilación es importante para mantener una determinada glicoproteína terapéutica durante más tiempo en la circulación, ya que las glicoproteínas con una sialilación reducida se unen al receptor de la asialoglicoproteína (ASGP-R) y luego, tras la endocitosis mediada por el receptor, finalmente se degradan.

El ASGP-R se expresa exclusivamente en los hepatocitos parenquimatosos, que contienen entre 100.000 y 500.000 sitios de unión por célula. Estos receptores están distribuidos aleatoriamente en la membrana plasmática sinusoidal que da a los capilares sanguíneos. Su función principal es mantener la homeostasis de las glicoproteínas plasmáticas mediante el reconocimiento, la unión y la endocitosis de las asialoglicoproteínas (Stokmaier et al (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry, 7254-7264).

El ASGP-R humano consiste en dos subunidades homólogas, designadas H1 y H2, que forman un complejo heteroligomérico no covalente con una proporción estimada de 2-5:1, respectivamente. Este complejo ASGP-R se une a las glicoproteínas exponiendo las glicoestructuras con residuos de D-galactosa y N-acetil-D-galactosamina terminales no sialilados. Se ha descubierto que la afinidad de unión de las glicoestructuras al ASGP-R depende en gran medida de la valencia del ligando. Mientras que la afinidad de un solo residuo de D-galactosa es sólo en el rango milimolar, los glicanos desialilados bi-, tri- y tetraantenarios se unen con constantes de disociación de 10-6, 5*10'9 y 10-9 M, respectivamente.

Por lo tanto, la glicoproteína de la invención según se ha definido anteriormente se caracteriza por un alto grado de sialilación de sus N-glicanos tiene una cantidad particularmente baja de N-glicanos con residuos de galactosa terminales y no sialilados, incluyendo una cantidad particularmente baja de N-glicanos con dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados, y aún más preferentemente una cantidad particularmente baja de N-glicanos con tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

En una primera etapa, los procedimientos de la invención comprenden la etapa de proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado.

El VWF truncado

El término "factor de von Willebrand" (VWF), tal y como se utiliza aquí, incluye el VWF natural (nativo), pero también variantes del mismo que conservan al menos la actividad de unión al FVIII del VWF natural, por ejemplo, variantes de secuencia en las que se han insertado, eliminado o sustituido uno o más residuos. La actividad de unión del FVIII se determina mediante un ensayo de unión del FVIII al FWF como se describe en el ejemplo 11.

Un VWF preferente de acuerdo con esta invención es el VWF humano representado por la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NÚM.:9. El ADNc que codifica la SEQ ID NO:9 se muestra en la SEQ ID NO:8.

El gen que codifica el VWF nativo humano se transcribe en un ARNm de 9 kb que se traduce en un prepropolipéptido de 2813 aminoácidos con un peso molecular estimado de 310.000 Da. El prepropolipéptido contiene un péptido señal de 22 aminoácidos N-terminal, seguido de un pro-polipéptido de 741 aminoácidos (aminoácidos 23-763 de la SEQ ID NO:9) y la subunidad madura (aminoácidos 764-2813 de la SEQ ID NO:9). La escisión del propolipéptido de 741 aminoácidos del N-terminal da lugar a un VWF maduro que consiste en 2050 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del prepropolíptido del VWF humano nativo se muestra en la SEQ ID NO:9. A menos que se indique lo contrario, la numeración de aminoácidos de los residuos del VWF en esta solicitud se refiere a la SEQ ID NÚM.: 9, incluso si la molécula de VWF, en particular un VWF truncado, no comprende todos los residuos de la SEQ ID NÚM.: 9.

El propolipéptido del VWF nativo comprende múltiples dominios. En la literatura se pueden encontrar diferentes anotaciones de dominio (véase, por ejemplo Zhou et al. (2012) Blood 120(2): 449-458). En esta solicitud se aplica la siguiente anotación de dominio del prepropolíptido nativo del VWF: D1 -D2-D'-D3-A1 -A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK

Con referencia a la SEQ ID NO:9, el dominio D' consiste en los aminoácidos 764-865; y el dominio D3 consiste en los aminoácidos 866-1242.

El VWF truncado es capaz de unirse a un Factor VIII. Preferentemente, el VWF truncado es capaz de unirse a la forma madura del Factor VIII nativo humano. En otra realización, el VWF truncado es capaz de unirse al Factor VIII de cadena única que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC. ID Núm.: 10. La unión del VWF truncado al Factor VIII puede determinarse mediante un ensayo de unión FVIII-VWF como se describe en el Ejemplo 11.

El VWF truncado de la presente invención comprende o consiste preferentemente en (a) una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos el 90% con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEC. ID Núm.: 9, o (b) un fragmento de la misma, a condición de que el VWF truncado siga siendo capaz de unión al FVIII. Más preferentemente, el VWF truncado consiste en (a) una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.: 9, a condición de que el VWF truncado siga siendo capaz de unión al FVIIII. Más preferentemente, el VWF truncado consiste en los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID Nú M.:9.

Como se describe con más detalle a continuación, el procedimiento de la invención comprende proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido que comprende el VWF truncado. El ácido nucleico se introduce en las células huésped adecuadas por medio de técnicas conocidas per se.

El ácido nucleico de la célula huésped codifica una secuencia de aminoácidos con un identidad de secuencia de al menos 90% con los aminoácidos 1 a 1242 de la SEQ ID NÚM.: 9, a condición de que el VWF maduro truncado siga siendo capaz de unión al FVIII. Más preferentemente, el ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos el 99%, con los aminoácidos 1 a 1242 de la SEQ ID NÚM.: 9, a condición de que el VWF truncado siga siendo capaz de unión al FVIII.. Más preferentemente, el ácido nucleico codifica los aminoácidos 1 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9. Especialmente si la glicoproteína eventualmente producida es un dímero, el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 763 del VWF (por ejemplo, la SEQ ID NÚM.: 9), incluso si el VWF truncado en el polipéptido no comprende los aminoácidos 1 a 763 del VWF (por ejemplo, la SEQ ID NÚM.: 9).

En ciertas realizaciones, el VWF truncado tiene una deleción interna en relación con el VWF maduro de tipo salvaje. Por ejemplo, los dominios A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6, CK o combinaciones de los mismos se pueden suprimir, y se mantiene el dominio D', el dominio D3 y el dominio CK. En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende los sitios de unión para la glicoproteína plaquetaria Iba (GPIba), el colágeno y/o la integrina aIIbpIII (secuencia RGDS dentro del dominio C1). En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13 que se encuentra en el dominio central A2 del VWF. Aún en otra realización, el VWF truncado no comprende los sitios de unión para GPIba, y/o no comprende el sitio de unión para el colágeno, y/o no comprende el sitio de unión para la integrina aIIbpIII, y/o no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13 que se encuentra en el dominio central A2 del VWF.

Una glicoproteína se denomina "dímero" en la presente invención si dos monómeros de la glicoproteína están unidos covalentemente. Preferentemente, las dos subunidades monoméricas están unidas covalentemente a través de al menos un puente disulfuro, por ejemplo, por medio de uno, dos, tres o cuatro puentes disulfuro. Los residuos de cisteína que forman el al menos un puente disulfuro se encuentran preferentemente dentro de la porción truncada del VWF del polipéptido de la invención. En una realización, estos residuos de cisteína son Cys-l099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, o Cys-1227 y una de sus combinaciones.

Si la glicoproteína de la invención es un dímero, el VWF truncado preferentemente comprende o consiste en dos polipéptidos cada uno con una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 90% con los aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225, los aminoácidos 764 a 1227, los aminoácidos 764 a 1242, los aminoácidos 764 a 1247, o los aminoácidos 764 a 1227 de la SEQ ID NÚM.: 4 y es capaz de unión al FVIII. En realizaciones preferidas, el VWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con los aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225, o los aminoácidos 764 a 1227 de la SEC. ID Núm.: 4 y es capaz de unirse al FVIII. Aún más preferentemente, el VWF truncado comprende o consiste en los aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225, los aminoácidos 764 a 1227, los aminoácidos 764 a 1242, o los aminoácidos 764 a 1227 de la SEQ ID NÚM.: 9.

Otros componentes del polipéptido

Además del VWF truncado, la glicoproteína puede además comprender un resto de extensión de la semivida. La fracción de extensión de la semivida puede ser una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada con el VWF truncado. Alternativamente, la fracción de extensión de semivida puede conjugarse químicamente con el polipéptido que comprende el VWF truncado mediante un enlace covalente diferente a un enlace peptídico.

En ciertas realizaciones de la invención, la semivida del polipéptido de la invención se prolonga mediante una modificación química, por ejemplo, la unión de un resto que prolonga la semivida, tal como el polietilenglicol (PEGilación), el PEG glicosilado, el hidroxietilalmidón (HESilación), los ácidos polisiálicos, los polipéptidos similares a la elastina, los polímeros de heparosán o el ácido hialurónico. En otra realización, el polipéptido de la invención se conjuga con un HLEP como la albúmina a través de un enlazador químico. El principio de esta tecnología de conjugación ha sido descrito de forma ejemplar por Conjuchem LLC (véase, por ejemplo La patente estadounidense n° 7.256.253).

En otras realizaciones, la fracción que prolonga la semivida es una proteína que aumenta la semivida (HLEP). Preferentemente, la HLEP es una albúmina o un fragmento de la misma. El N-terminal de la albúmina puede fusionarse con el C-terminal del VWF truncado. Alternativamente, el C-terminal de la albúmina puede fusionarse con el N-terminal del VWF truncado. Se pueden fusionar uno o más HLEP a la parte N- o C-terminal del VWF siempre que no interfieran 0 supriman la capacidad de unión del VWF truncado al FVIII.

En una realización el polipéptido tiene la siguiente estructura:

tVWF - L1 - H, [fórmula 1] en la que tVWF es el VWF truncado, L1 es un enlace químico o una secuencia de enlace, ^{y H es una} HlEp.

L1 puede ser un enlace químico o una secuencia de enlace que consiste en uno o más aminoácidos, por ejemplo de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (por ejemplo 1 , 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Normalmente, las secuencias enlazadoras no están presentes en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible. Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos por residuos de glicina y serina alternados, como se ejemplifica en el documento WO 2007/090584 A1. En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la parte truncada del VWF y la parte de la albúmina consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores naturales entre dominios en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en WO2007/090584. Las secuencias de enlace escindibles se describen, por ejemplo, en WO 2013/120939 A1.

Las secuencias HLEP preferidas se describen infra. También se incluyen en la invención las fusiones al "aminoácido de extremo N terminal" exacto o al "aminoácido de extremo C terminal" exacto de1HLEP respectiva, o las fusiones a la "parte de extremo N terminal" o a la "parte de extremo C terminal" del HLEP respectivo, que incluyen deleciones de extremo N terminales de uno o más aminoácidos del HLEP. El polipéptido puede comprender más de una secuencia HLEP, por ejemplo, dos o tres secuencias HLEP. Estas múltiples secuencias HLEP pueden fusionarse con la parte C-terminal del VWF en tándem, por ejemplo, como repeticiones sucesivas.

En ciertas realizaciones de la invención, la semivida del polipéptido de la invención se prolonga mediante una modificación química, por ejemplo, la unión de un resto que prolonga la semivida, como el polietilenglicol (PEGilación), el PEG glicosilado, el hidroxietilalmidón (HESilación), los ácidos polisiálicos, los polipéptidos similares a la elastina, los polímeros de heparosán o el ácido hialurónico. En otra realización, el polipéptido de la invención se conjuga con un HLEP como la albúmina a través de un enlazador químico. El principio de esta tecnología de conjugación ha sido descrito de forma ejemplar por Conjuchem LLC (véase, por ejemplo La patente estadounidense n° 7.256.253).

Polipéptidos potenciadores de la semivida (HLEP)

Preferentemente, el resto que prolonga la semivida es un polipéptido que prolonga la semivida (HLEP), más preferentemente el HLEP se selecciona de la albúmina o fragmentos de la misma, la región constante de la inmunoglobulina y porciones de la misma, por ejemplo el fragmento Fc, cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico (por ejemplo XTe N (Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186 a 1190), repeticiones de homo-aminoácidos (HAP) o repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, transferrina o variantes de la misma, péptido carboxilo-terminal (CTP) de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana, polipéptidos o lípidos capaces de unión en condiciones fisiológicas a la albúmina o a la región constante de la inmunoglobulina.

Un "polipéptido potenciador de la semivida", como se utiliza en la presente memoria, se selecciona preferentemente del grupo formado por la albúmina, un miembro de la familia de la albúmina, la región constante de la inmunoglobulina G y fragmentos de la misma, la región y los polipéptidos capaces de unión en condiciones fisiológicas a la albúmina, a los miembros de la familia de la albúmina, así como a porciones de una región constante de la inmunoglobulina. Puede ser una proteína de media vida de longitud completa descrita en la presente memoria (por ejemplo, la albúmina, un miembro de la familia de la albúmina o la región constante de la inmunoglobulina G) o uno o más fragmentos de la misma que sean capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica del factor de coagulación. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir al menos unos 15, al menos unos 20, al menos unos 25, al menos unos 30, al menos unos 50, al menos unos 100, o más aminoácidos contiguos de la secuencia HLEP o pueden incluir parte o todos los dominios específicos de1 HLEP respectivo, siempre que el fragmento HLEP proporcione una extensión de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con el polipéptido respectivo sin la HLEP.

La porción HLEP de la glicoproteína puede ser una variante de un HLEP de tipo silvestre. El término "variantes" incluye inserciones, supresiones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, cuando dichos cambios no alteren sustancialmente la actividad de unión al FVIII del VWF truncado.

En particular, las construcciones de fusión VWF-HLEP truncadas propuestas de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de HLEPs y fragmentos de HLEP. El HLEP puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, humano, mono, vaca, oveja o cerdo. Las HLEP no mamíferas incluyen, entre otras, la gallina y el salmón.

Albúmina como HELP

Los términos "albúmina de suero humano" (HSA) y "albúmina humana" (HA) y "albúmina" (ALB) se utilizan indistintamente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "albúmina sérica" son más amplios y abarcan la albúmina sérica humana (y sus fragmentos y variantes), así como la albúmina de otras especies (y sus fragmentos y variantes).

Tal y como se utiliza aquí, "albúmina" se refiere colectivamente al polipéptido de albúmina o a la secuencia de aminoácidos, o a un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de la albúmina. En particular, la "albúmina" se refiere a la albúmina humana o a sus fragmentos, especialmente la forma madura de la albúmina humana tal como se muestra en la SEQ ID NO:11 o la albúmina de otros vertebrados o sus fragmentos, o análogos o variantes de estas moléculas o sus fragmentos.

En particular, las construcciones de fusión VWF-HLEP truncadas propuestas de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de la albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. En general, un fragmento o variante de albúmina tendrá una longitud de al menos 10, preferentemente de al menos 40, y más preferentemente de más de 70 aminoácidos.

Las realizaciones preferentes de la invención incluyen variantes de albúmina con una unión mejorada al receptor FcRn. Dichas variantes de albúmina pueden dar lugar a una semivida plasmática más larga de una proteína de fusión de la variante de albúmina del VWF truncada en comparación con una fusión del VWF truncado con una albúmina de tipo salvaje.

La porción de albúmina de las construcciones de fusión VWF-HLEP truncadas propuestas de la invención puede comprender al menos un subdominio o dominio de HA o sus modificaciones de conservación.

Inmunoglobulinas como HLEP

Las regiones constantes (Fc) de la inmunoglobulina G (IgG) son conocidas en el arte para aumentar la semivida de las proteínas terapéuticas (Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). La región constante de la cadena pesada de la IgG consiste en 3 dominios (CH1-CH3) y una región bisagra. La secuencia de inmunoglobulina puede proceder de cualquier mamífero o de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, respectivamente. Las IgG y los fragmentos de IgG sin un dominio de unión al antígeno también pueden utilizarse como HLEP. La porción de polipéptido terapéutico está conectada a la IgG o a los fragmentos de IgG preferentemente a través de la región bisagra del anticuerpo o de un enlazador peptídico, que incluso puede ser escindible. Diversas patentes y solicitudes de patentes describen la fusión de proteínas terapéuticas con regiones constantes de inmunoglobulina para aumentar la vida media in vivo de las proteínas terapéuticas. US 2004/0087778 y WO 2005/001025 describen proteínas de fusión de dominios Fc o al menos porciones de regiones constantes de inmunoglobulina con péptidos biológicamente activos que aumentan la semivida del péptido, que de otro modo se eliminaría rápidamente in vivo. Se describieron proteínas de fusión Fc-IFN-p que conseguían una mayor actividad biológica, una vida media circulante prolongada y una mayor solubilidad (el documento WO 2006/000448 A2). Se desvelaron proteínas Fc-EPO con una vida media sérica prolongada y una mayor potencia in vivo (WO 2005/063808 A1), así como fusiones de Fc con G-CSF (el documento WO 2003/076567 A2), péptido similar al glucagón-1 (el documento WO 2005/000892 A2), factores de coagulación (el documento WO 2004/101740 A2) y la interleucina-10 (la Patente de los Estados Unidos N° 6.403.077), todos ellos con propiedades de mejora de la semivida.

Varios HLEP que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención se describen en detalle en WO 2013/120939 A1.

Ácido nucleico

El ácido nucleico que codifica el polipéptido a ser expresado puede prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. En base a la secuencia de ADNc del VWF (SEQ ID NÚM.: 8), se puede diseñar y generar ADN recombinante que codifique las construcciones VWF truncado mencionadas con anterioridad.

Incluso si la glicoproteína que es secretada por las células huésped no comprende los aminoácidos 1 a 763 del VWF, es preferente que el ácido nucleico (por ejemplo el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos el 99%, con los aminoácidos 23 a 763 o, preferentemente, con los aminoácidos 1 a 763 de la SEQ ID NÚM.: 9. Más preferentemente, el ácido nucleico (por ejemplo, el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 23 a 763 de la SEQ ID NÚM.:9, o los aminoácidos 1 a 763 de la SEQ ID NÚM.:9.

Los constructos en los que el ADN contiene el marco de lectura abierto completo insertado en la orientación correcta en un plásmido de expresión pueden utilizarse para la expresión de proteínas. Los vectores de expresión típicos contienen promotores que dirigen la síntesis de grandes cantidades de ARNm correspondientes al ácido nucleico insertado en las células portadoras del plásmido. También pueden incluir una secuencia de origen de replicación que permite su replicación autónoma dentro del organismo anfitrión, y secuencias que aumentan la eficiencia con la que se traduce el ARNm sintetizado. Los vectores estables a largo plazo pueden mantenerse como entidades de libre replicación utilizando elementos reguladores de, por ejemplo, virus (por ejemplo, las secuencias OriP del genoma del virus de Epstein Barr). También se pueden producir líneas celulares que hayan integrado el vector en el ADN genómico, y de esta manera el producto génico se produce de forma continua.

Típicamente, las células a proporcionar se obtienen introduciendo el ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención en células huésped de mamífero.

Células huésped

Cualquier célula huésped susceptible de cultivo celular, y de expresión de glicoproteínas, puede ser utilizada de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, una célula huésped es de mamífero. Ejemplos no limitantes de células de mamífero que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen la línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/ 1, EcACC ^{No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países} Bajos)); línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. ^{Reprod., 23:243 251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC} cCl ^{70); células de riñón de mono verde africano} (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino ^{(MDCK, ATCC CCL 34) células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A,} AtCC ^{CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (HepG2,} Hb ^{8065); tumor mamario de ratón} (MmT ^{060562, ATCC} CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células PS4; células de amniocitos humanos (CAP); y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Preferentemente, la línea celular es una línea celular de roedores, especialmente una línea celular de hámster como CHO o BHK.

Los procedimientos adecuados para introducir ácidos nucleicos suficientes para lograr la expresión de una glicoproteína de interés en células huésped de mamíferos son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981 Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979 Levinson et al. EP 117.060 y EP 117,058. En el caso de las células de mamíferos, los procedimientos habituales para introducir material genético en ellas incluyen el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978) o el procedimiento de lipofectamina™ (Gibco BRL) de Hawley-Nelson (Focus 15:73, 1993). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de células de mamíferos han sido descritos por Axel en US. Pat. N° 4.399.216. Para diversas técnicas de introducción de material genético en células de mamíferos, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527 a 537, 1990 y Mansour et al., Nature, 336:348 a 352, 1988.

Cultivo de las células

En una segunda etapa, el procedimiento del primer aspecto de la invención comprende cultivar las células a una temperatura menor que 36,0°C. En el procedimiento del segundo aspecto, el procedimiento comprende cultivar las células en condiciones que permitan la expresión de la glicoproteína.

El medio basal seleccionado para cultivar la línea celular huésped no es crítico para la presente invención y puede ser cualquiera de, o una combinación de, los conocidos en la técnica que son adecuados para cultivar células de mamífero. Los medios tales como el Medio Eagle Modificado de Dulbecco, el Medio F-12 de Ham, el Medio Esencial Mínimo de Eagle y el Medio RPMI-1640 y similares están disponibles comercialmente. La adición de factores de crecimiento, tales como la insulina recombinante, es opcional. En una realización, el medio está "libre de proteínas" en el sentido de que está completamente libre de cualquier proteína o al menos está libre de cualquier proteína que no sea producida recombinantemente. La albúmina de suero humano se puede utilizar como suplemento de cultivo sin suero para la producción de la glicoproteína. Preferentemente, el medio contiene un inhibidor de la proteasa, tal como un inhibidor de la serina proteasa, que es adecuado para el cultivo de tejidos y que es de origen sintético o vegetal.

En general, la presente invención se puede utilizar con cualquier procedimiento de cultivo celular que sea susceptible de expresar glicoproteínas. Por ejemplo, las células pueden crecer en cultivos por partidas o alimentados por partidas, en los que el cultivo se termina tras una expresión suficiente del polipéptido, tras de lo que se cosecha la glicoproteína expresada. Alternativamente, las células pueden crecer en cultivos continuos (por ejemplo, cultivos de perfusión), en los que el cultivo no se termina y se añaden nuevos nutrientes y otros componentes de forma periódica o continua al cultivo, durante el cual la glicoproteína expresada se cosecha de forma periódica o continua. Esta última realización es preferente si el procedimiento comprende un cambio de temperatura como se describe a continuación. El cultivo puede ser de cualquier tipo convencional, tal como, por ejemplo, por partidas, por partidas alimentados o continuo, pero es preferentemente continuo. Los cultivos continuos adecuados incluyen el cultivo por perfusión.

Las células se pueden cultivar en cualquier volumen conveniente seleccionado por el profesional. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en recipientes de reacción a pequeña escala cuyo volumen oscila entre unos pocos mililitros y varios litros. Alternativamente, las células se pueden cultivar en biorreactores comerciales a gran escala cuyo volumen oscila entre aproximadamente 1 litro y 10, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 8.000, 10.000, 12.000 litros o más, o cualquier volumen intermedio. El cultivo se lleva a cabo normalmente en un biorreactor, que suele ser un recipiente de acero inoxidable, vidrio o plástico de 1 (uno) a 10.000 (diez mil) litros de capacidad, por ejemplo, 5, 10, 50, 100, 1.000, 2.500, 5.000 u 8.000 litros. El recipiente suele ser rígido, pero se pueden utilizar bolsas de plástico flexibles, sobre todo para volúmenes pequeños. Por lo general, son del tipo "de un solo uso".

Las células de mamífero, tal como las células de CHO y BHK, se cultivan generalmente como cultivos en suspensión. Es decir, las células están suspendidas en el medio, en lugar de adherirse a un soporte sólido. Las células se pueden inmovilizar alternativamente en un portador, en particular en un microportador. Los portadores porosos, tales como Cytoline®, Cytopore® o Cytodex®, pueden ser especialmente adecuados.

Para obtener una alta sialilación, las células (por ejemplo, las células de CHO) se cultivan preferentemente a una temperatura disminuida, por ejemplo, a menos de 36,0 °C. "Temperatura disminuida" se refiere a una temperatura que es menor que la temperatura óptima o a la temperatura normal para el crecimiento de la línea celular respectiva. Para la mayoría de las células de mamíferos la temperatura normal es de 37 °C. Por lo tanto, se prefiere de acuerdo con la invención que las células (por ejemplo, las células de CHO) se cultiven a una temperatura reducida de 30,0 a 36,0 °C, de 30,5 a 35,5 °C, de 31,0 a 35,0 °C, de 31,5 a 34,5 °C, de 32,0 a 34,0 °C, o de 32,5 a 33,5 °C. Preferentemente, las células se cultivan a una temperatura reducida de 30,0 °C ± 1,0 °C, 31,0 °C ± 1,0 °C, 32,0 °C ± 1,0 °C, 33,0 °C ± 1,0 °C, 34,0 °C ± 1,0 °C, o 35,0 °C ± 1,0 °C.

La disminución de la temperatura se mantiene durante un período de tiempo suficiente para aumentar la sialilación de la glicoproteína a expresar. Preferentemente, la temperatura reducida se mantiene durante al menos 1 hora, al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos 120 horas o al menos 144 horas. En otras realizaciones, la temperatura reducida se mantiene de 1 hora a 8 semanas, de 6 horas a 6 semanas, de 12 horas a 5 semanas, de 18 horas a 4 semanas, de 24 horas a 3 semanas, de 48 horas a 14 días, de 72 horas a 10 días, o de 3 a 7 días.

Para lograr esto, un cultivo puede ser sometido a uno o más cambios de temperatura durante el curso del cultivo. Al cambiar la temperatura de un cultivo, el cambio de temperatura puede ser relativamente gradual. Por ejemplo, puede tardar varias horas o días en completar el cambio de temperatura. Alternativamente, el cambio de temperatura puede ser relativamente abrupto. La temperatura se puede aumentar o reducir constantemente durante el proceso de cultivo. Alternativamente, la temperatura se puede aumentar o disminuir en cantidades discretas en varios momentos durante el proceso de cultivo. Las temperaturas posteriores o intervalos de temperatura pueden ser inferiores o superiores a las temperaturas iniciales o anteriores. Los expertos en la técnica entenderán que en esta realización se incluyen múltiples cambios de temperatura discretos. Por ejemplo, la temperatura se puede cambiar una vez (ya sea a una temperatura o intervalo de temperatura más alto o más bajo), las células se mantienen a esta temperatura o intervalo de temperatura durante un cierto período de tiempo, después de lo cual la temperatura puede cambiarse de nuevo a una nueva temperatura o intervalo de temperatura, que puede ser más alta o más baja que la temperatura o el intervalo de temperatura de la temperatura o el intervalo de temperatura anterior. La temperatura del cultivo después de cada turno discreto puede ser constante o se puede mantener dentro de un determinado intervalo de temperaturas.

Típicamente, las células (por ejemplo, células de CHO) se cultivarán inicialmente a una temperatura "normal" de 37,0 °C±1,0 °C hasta que se alcance la densidad celular objetivo. A continuación, el período de cultivo inicial va seguido por un cambio de temperatura a la temperatura reducida. Después de un período de cultivo a la temperatura reducida, puede seguir o no un cambio de temperatura a la temperatura normal. Preferentemente, las células (por ejemplo, las células de CHO) se cultivarán inicialmente a 37,0 °C±1,0 °C durante varios días, y a continuación se fabricarán a una temperatura reducida de 31,0 - 35,0 °C.

En base a la presente divulgación, aquellos con experiencia en la técnica pueden seleccionar las temperaturas en las que cultivar las células, dependiendo de las necesidades particulares de la respectiva línea celular y de los requisitos particulares de producción del profesional.

En ciertas realizaciones, los biorreactores por partidas y alimentados por partidas se terminan una vez que el polipéptido expresado alcanza un título suficientemente alto. Adicional o alternativamente, los biorreactores por partidas y alimentados por partidas se pueden terminar una vez que las células alcanzan una densidad suficientemente alta, de acuerdo con las necesidades del profesional. Por ejemplo, el cultivo se puede terminar una vez que las células alcancen el 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad celular máxima viable. Adicionalmente o alternativamente, los biorreactores por partidas y alimentados por partidas pueden ser terminados antes de la acumulación excesiva de productos metabólicos de desecho como el lactato y el amonio.

En ciertos casos, puede ser beneficioso complementar un cultivo celular durante la fase de producción posterior con nutrientes u otros componentes del medio que han sido agotados o metabolizados por las células. Como ejemplos no limitativos, puede ser beneficioso complementar un cultivo celular con hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones inorgánicos (tales como, por ejemplo, sodio, cloruro, calcio, magnesio y fosfato), tampones, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, oligoelementos (compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales muy bajas), aminoácidos, lípidos o glucosa u otra fuente de energía. Dichos componentes suplementarios pueden ser añadidos al cultivo celular de una sola vez, o pueden ser proporcionados al cultivo celular en una serie de adiciones o pueden ser proporcionados junto con el medio fresco durante un cultivo de perfusión.

Como alternativa a los biorreactores por partidas y alimentados por partidas, la invención también se puede practicar cuando las células que expresan un polipéptido de la invención se cultivan en biorreactores de perfusión continua.

Los expertos en la técnica pueden adaptar condiciones específicas de cultivo celular para optimizar ciertas características del cultivo celular, que incluye, pero sin limitación, la tasa de crecimiento, la viabilidad celular, la densidad celular final del cultivo celular, la concentración final de subproductos metabólicos perjudiciales tal como el lactato y el amonio, el título del polipéptido expresado, la extensión y la composición de las cadenas laterales de oligosacáridos o cualquier combinación de estas u otras condiciones que el profesional considere importantes.

Aislamiento de la glicoproteína expresada

En general, será típicamente deseable aislar y/o purificar polipéptidos expresados de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, el polipéptido expresado se secreta en el medio y, por lo tanto, las células y otros sólidos se pueden remover, como por ejemplo, por medio de centrifugación o filtrado, como primera etapa en el procedimiento de purificación.

La glicoproteína expresada se puede aislar y purificar por procedimientos estándar que incluyen, pero sin limitación, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, exclusión por tamaño y cromatografía de hidroxiapatita), filtración en gel, centrifugación o solubilidad diferencial, precipitación con etanol y/o por cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas (Véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principies and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987 Higgins, S. J. and Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999y Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997), ambos incorporados por referencia en la presente memoria). Para la cromatografía de inmunoafinidad en particular, la glicoproteína se puede aislar por medio de la unión a una columna de afinidad que comprende anticuerpos que fueron criados contra esa glicoproteína y fueron fijados a un soporte estacionario. Alternativamente, se pueden unir a la glicoproteína etiquetas de afinidad, tal como una secuencia de la capa de la gripe, poli-histidina o glutatión-S-transferasa, por medio de técnicas recombinantes estándar, para permitir una fácil purificación por medio de la etapa por la columna de afinidad apropiada. Los inhibidores de la proteasa, tal como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), la leupeptina, la pepstatina o la aprotinina, se pueden añadir en cualquiera o en todas las etapas a fin de reducir o eliminar la degradación del polipéptido durante el procedimiento de purificación. Los inhibidores de la proteasa son particularmente ventajosos cuando las células deben ser lisadas para aislar y purificar el polipéptido expresado. Adicional o alternativamente, se pueden añadir inhibidores de glicosidasa en cualquiera o en todas las etapas a fin de reducir o eliminar el recorte enzimático de las cadenas de oligosacáridos unidas covalentemente. Un procedimiento de purificación preferente se describe en el ejemplo 5 de esta solicitud.

Las glicoproteínas expresadas de acuerdo con la presente invención tienen una sialilación más extensa que la que tendrían si se cultivaran en condiciones tradicionales de cultivo celular. Por lo tanto, un beneficio práctico de la presente invención que se puede explotar en la etapa de purificación es que los residuos de ácido siálico adicionales y/o alterados en una glicoproteína cultivada de acuerdo con algunos de los presentes procedimientos inventivos pueden conferirle propiedades bioquímicas diferentes que pueden ser utilizadas por el profesional para purificar ese polipéptido más fácilmente, o con una mayor pureza, de lo que sería posible para una glicoproteína cultivada de acuerdo con procedimientos más tradicionales. Por ejemplo, la glicoproteína se puede purificar o enriquecer en gran medida por medio de cromatografía de intercambio aniónico, haciendo uso de la carga negativa de los residuos de ácido siálico. De este modo, se puede lograr un mayor enriquecimiento de la glicoproteína con alta sialilación.

En una realización adicional, la sialilación de la glicoproteína pobtenida por un procedimiento de la invención se puede aumentar de forma adicional poniendo en contacto el polipéptido con una sialiltransferasa in vitro. La sialiltransferasa es típicamente una sialiltransferasa de mamífero, preferentemente una sialiltransferasa humana. La sialiltransferasa puede ser una a-2,3-sialiltransferasa y/o una a-2,6-sialiltransferasa. Preferentemente, la sialiltransferasa es una a-2,3-sialiltransferasa humana (Genbank NP_775479-ST3GAL 1) y/o una a-2,6-sialiltransferasa humana. Más preferentemente, la sialiltransferasa es la a-2,6-sialiltransferasa humana identificada por el Genbank NP_003023-ST6GAL 1). También está presente en la reacción in vitro un donante de grupo sialilo, o donante de ácido siálico. Entre los donantes adecuados se encuentran, por ejemplo, el ácido citidina-5-monofosfórico-N-acetilneuramínico (CMP-NANA), catálogo de Roche núm. 05974003 103. Un kit adecuado para la sialilación in vitro está disponible a partir de Roche (Número de Catálogo 07012250 103).

Los expertos en la técnica apreciarán que la técnica de purificación exacta variará dependiendo del carácter de la glicoproteína a ser purificada, el carácter de las células de las que se expresa la glicoproteína, y/o la composición del medio en el que se cultivaron las células.

Como se ha mencionado anteriormente, la invención, en un segundo aspecto, se refiere a un procedimiento de producción de un polipéptido que comprende N-glicanos con sialilación aumentada, que comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado y un ácido nucleico recombinante que codifica una a-2,3-sialiltransferasa y/o una a-2,6-sialiltransferasa, preferentemente una a-2,6-sialiltransferasa, y (ii) cultivar las células en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

La a-2,3-sialiltransferasa es preferentemente una a-2,3-sialiltransferasa humana. La secuencia de ADNc que codifica la a-2,3-sialiltransferasa humana se muestra en la SEQ ID NÚM.: 12, y en base a ella los expertos en la técnica pueden diseñar vectores de expresión adecuados que contengan una secuencia codificadora de la a-2,3-sialiltransferasa.

La a-2,6-sialiltransferasa es preferentemente una a-2,6-sialiltransferasa humana. La secuencia de ADNc que codifica la a-2,6-sialiltransferasa humana se muestra en la SEC. ID Núm.: 7, y basándose en ella los expertos pueden diseñar vectores de expresión adecuados que contengan una secuencia codificadora de la a-2,6-sialiltransferasa.

Las células transfectadas se pueden cultivar en condiciones que permitan la expresión de la glicoproteína de acuerdo con procedimientos de cultivo conocidos.

La glicoproteína se puede recuperar y/o aislar mediante el uso de técnicas de purificación establecidas.

Las realizaciones descritas anteriormente en relación con el procedimiento del primer aspecto de la invención se aplican al procedimiento del segundo aspecto mutatis mutandis.

Glicoproteína de la invención

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una glicoproteína que comprende un Factor von Willebrand (VWF) truncado como se define en la reivindicación 7.

Dicha glicoproteína comprende N-glicanos, y al menos 75%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 85% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido siálico. En realizaciones preferentes, al menos 90%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos el 99%, de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido siálico. Los inventores descubrieron que los polipéptidos que comprenden fragmentos de FVW altamente sialilados no sólo pueden tener una vida media más prolongada por sí mismos, sino que también pueden ser capaces de prolongar aún más la vida media del FVIII coadministrado. En otras palabras, la administración del polipéptido de la invención conduce a una semivida prolongada y/o a una eliminación reducida del FVIII coadministrado.

Preferentemente, al menos 50% de los grupos sialilo de los N-glicanos de las glicoproteínas son grupos sialilo ligados a a-2,6. En general, los grupos sialilo terminales pueden estar unidos a los grupos galactosa a través de un enlace a-2.3- o a través de un enlace a-2,6. En una realización, los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden más grupos sialilo ligados a a-2,6 que a a-2,3. Preferentemente, al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90% de los grupos sialilo de los N-glicanos son grupos sialilo ligados a a-2,6. Estas realizaciones pueden obtenerse, por ejemplo, coexpresando la a-2,6-sialiltransferasa humana en células de mamífero.

Preferentemente, al menos 50% de los grupos sialilo de los N-glicanos de las glicoproteínas son grupos sialilo ligados a a-2,3. En general, los grupos sialilo terminales pueden estar unidos a los grupos galactosa a través de un enlace a-2.3- o a través de un enlace a-2,6. En una realización, los N-glicanos de la glicoproteína de la invención comprenden más grupos sialilo ligados a a-2,3 que a a-2,6. Preferentemente, al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90% de los grupos sialilo de los N-glicanos son grupos sialilo ligados a a-2,3. Estas realizaciones pueden obtenerse, por ejemplo, coexpresando la a-2,3-sialiltransferasa humana en células de mamífero.

La glicoproteína de la invención tiene una sialilación aumentada de N-glicanos, y en particular una a-2,6-sialilación aumentada o una a-2,3-sialilación aumentada.

Al menos 90%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de los N-glicanos de la glicoproteína de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico. En otra realización, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de los N-glicanos del VWF truncado dentro de la glicoproteína de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico.

Preferentemente, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 12%, o incluso menos de 10%, o menos de 8%, o menos de 6%, o menos de 5%, o menos de 4%, o menos de 3%, o menos de 2% o incluso menos de 1% de los N-glicanos de la glicoproteína de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos que carecen de un grupo ácido siálico. En otra realización, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 12%, o menos de 10%, o menos de 8%, o menos de 6%, o menos de 5%, o menos de 4%, o menos de 3%, o menos de 2% o incluso menos de 1% de los N-glicanos del VWF truncado dentro de la glicoproteína de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, no tienen un grupo ácido siálico.

Preferentemente, al menos 30%, o al menos 35%, o al menos 40%, de los N-glicanos de la glicoproteína de la invención son monosialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos con un grupo de ácido siálico. En otra realización, al menos 30%, o al menos 35%, o al menos 40% de los N-glicanos del VWF truncado dentro del polipéptido de la invención son monosialo-N-glicanos. A modo de ejemplo no limitativo, la cantidad de N-glicanos monosialilados se puede determinar como se detalla en el Ejemplo 6 y Ejemplo 12.

En aún otra realización preferente, al menos 15%, o al menos 25%, o al menos 30% de los N-glicanos de la glicoproteína de la invención son disialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos con 2 grupos de ácido siálico. En otra realización, al menos 15%, o al menos 25%, o al menos 30% de los N-glicanos del VWF truncado dentro de la glicoproteína de la invención son disialo-N-glicanos. A modo de ejemplo no limitativo, la cantidad de N-glicanos monosialilados se puede determinar como se detalla en el Ejemplo 6 y Ejemplo 12.

En aún otra realización preferente, al menos 5%, o al menos 10%, de los N-glicanos de la glicoproteína de la invención son trisialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos con 3 grupos de ácido siálico. En aún otra realización, al menos 5%, o al menos 10%, de los N-glicanos del VWF truncado dentro de la glicoproteína de la invención son trisialo-N-glicanos. A modo de ejemplo no limitativo, la cantidad de N-glicanos trisialilados se puede determinar como se detalla en el Ejemplo 6 y Ejemplo 12.

En aún otra realización preferente, al menos 20%, o al menos 30%, o al menos 40%, de los N-glicanos de la glicoproteína de la invención comprenden dos o más grupos de ácido siálico. En otra realización, al menos 20%, al menos 30%, o al menos 40%, de los N-glicanos del VWF truncado dentro del glicoproteína de la invención comprenden dos o más grupos de ácido siálico.

De acuerdo con otro aspecto, la glicoproteína de la invención comprende N-glicanos definidos en la reivindicación 7, en la que menos de 35%, preferentemente menos de 34%, preferentemente menos de 33%, preferentemente menos de 32%, preferentemente menos de 31%, preferentemente menos de 30%, preferentemente menos de 29%, preferentemente menos de 28%, preferentemente menos de 27%, preferentemente menos de 26%, preferentemente menos de 25%, preferentemente menos de 24%, preferentemente menos de 23%, preferentemente menos de 22%, preferentemente menos de 21%, preferentemente menos de 20%, preferentemente menos de 19%, preferentemente menos de 18%, preferentemente menos de 17%, preferentemente menos de 16%, preferentemente menos de 15%, preferentemente menos de 14%, preferentemente menos de 13%, preferentemente menos de 12%, preferentemente menos de 11%, preferentemente menos de 10%, preferentemente menos de 9%, preferentemente menos de 8%, preferentemente menos de 7%, preferentemente menos de 6% y preferentemente menos de 5% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

De acuerdo con otro aspecto, una glicoproteína incluso más preferente de la invención como se define en la reivindicación 7 comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, en la que dicho VWF truncado es capaz de unión a un Factor VIII (FVIII), y en la que dicho VWF truncado comprende N-glicanos, en la que menos de 6%, preferentemente menos de 5%, preferentemente menos de 4%, preferentemente menos de 3%, preferentemente menos de 2%, y preferentemente menos de 1% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

Las realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse entre sí. Todos los porcentajes de N-glicanos mencionados anteriormente, o cualquier indicación del grado de sialilación, deben entenderse como porcentajes o grados medios, es decir, se refieren a una población de moléculas, no a una única molécula. Está claro que la glicosilación o sialilación de las moléculas individuales de glicoproteínas dentro de una población de glicoproteínas mostrará cierta heterogeneidad.

Se ha descubierto además que los polipéptidos de esta invención pueden tener una alta proporción de dímeros. Por lo tanto, la glicoproteína de la invención preferentemente está presente como dímero. En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95% o aproximadamente 100% de las glicoproteínas están presentes como dímeros. En otra realización, la relación dímero : monómero de la glicoproteína de la invención es al menos 1,5, preferentemente al menos 2, más preferentemente al menos 2,5 o al menos 3. La formación de dímeros obtenida por los procedimientos de la invención es favorable, dado que el dímero tiene una afinidad mejorada con el Factor VIII. El contenido de dímeros y la relación entre dímeros y monómeros del polipéptido de la invención pueden determinarse como se describe en el Ejemplo 5.

En otra realización preferente, la glicoproteína de la invención comprende un polipéptido heterólogo, por ejemplo un HLEP como se ha definido anteriormente. Lo más preferente es que el HLEP sea albúmina de suero humano (véase SEQ ID NÚM.:11). Las realizaciones descritas supra se aplican en este caso mutatis mutandis.

La glicoproteína de la invención es capaz de unión al Factor VIII (véase arriba). En una realización, la afinidad de la glicoproteína de la invención al Factor VIII es mayor que la del VWF nativo humano a la misma molécula de Factor VIII. La afinidad del factor VIII se puede referir al Factor VIII nativo humano, o a la molécula de Factor VIII caracterizada por la SEQ ID NÚM.: 10.

Se ha descubierto que las preparaciones de la glicoproteína de acuerdo con esta invención con una alta proporción de dímeros tienen una mayor afinidad al Factor VIII. Esta mayor afinidad al Factor VIII conduce a una mayor estabilización del Factor VIII por los polipéptidos de la presente invención. Alternativamente o en combinación con una proporción aumentada de dímeros también los polipéptidos de acuerdo con la invención con mutaciones dentro del dominio de unión al Factor VIII que aumentan la afinidad al Factor VIII son realizaciones preferentes de la invención. Se divulgan mutaciones adecuadas, por ejemplo, en WO 2013/120939 A1.

Otro aspecto de la invención es una glicoproteína como se define en la presente memoria para su uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea. El tratamiento comprende la administración a un paciente de una cantidad eficaz de la glicoproteína. El tratamiento puede comprender además la administración de un FVIII.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una glicoproteína de la invención, y un excipiente o vehículo aceptable para uso farmacéutico.

Otro aspecto de la presente invención es un kit farmacéutico que comprende (i) una glicoproteína como se define anteriormente en la presente memoria y (ii) un Factor VIII. Preferentemente, la glicoproteína y el FVIII están contenidos en composiciones separadas.

Otro aspecto de la presente invención es un kit farmacéutico que comprende (i) una glicoproteína como se define anteriormente en la presente memoria y (ii) un Factor VIII, para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea.

Otro aspecto de la invención es la glicoproteína para uso como el como se define anteriormente en la presente memoria para aumentar la semivida terminal o el tiempo de residencia medio (MRT) o reducir la depuración del Factor VIII. Para la evaluación de los datos farmacocinéticos se aplicó un modelo farmacocinético lineal (eliminación del compuesto a través del compartimento central). Por consiguiente, todos los parámetros farmacocinéticos utilizados en la presente memoria se basan en un modelo farmacocinético lineal (eliminación del compuesto a través del compartimento central), a menos que se indique lo contrario.

La "semivida" T1/2(t) en un determinado tiempo t es el tiempo que tarda en reducirse a la mitad la concentración plasmática C(t) presente en el tiempo t. La "semivida terminal" (en este último texto abreviada como t1/2) es el límite de T1/2(t) cuando t tiende a infinito. La "semivida terminal" es el límite de T1/2(t) cuando t tiende a infinito. El área bajo la curva (AUC) puede determinarse para evaluar los efectos de la depuración. Una reducción de la depuración conduce a valores de a Uc más altos y a un aumento de la semivida.

El término "MRT", según se utiliza en la presente memoria, significa el tiempo medio que una molécula de fármaco (por ejemplo, el polipéptido de la invención o un FVIII) reside en el cuerpo. En un sistema farmacocinético con depuración constante, el MRT puede calcularse como el área bajo la curva del primer momento (AUMC) dividida por el AUC0-inf. La curva del primer momento es el tiempo multiplicado por la concentración de plasma en ese momento.

La MRT del FVIII administrado se incrementa en al menos 25%, preferentemente en al menos 50%, más preferentemente en al menos 75%, más preferentemente en al menos 100%, más preferentemente en al menos 125%, si se coadministra una cantidad eficaz de la glicoproteína de la presente invención i) en relación con la administración del FVIII solo o ii) en relación con la administración de una proteína de referencia que tiene la misma secuencia proteica que la glicoproteína de la invención pero una estructura de N-o iii) en relación con la administración de una proteína de referencia que tenga la misma secuencia proteica que la glicoproteína de la invención, pero más del 35 % de sus N-glicanos comprendan dos o más N-glicanos terminales y no sialilados y más del 6 % de sus N-glicanos comprendan tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

La MRT de la glicoproteína preparada de acuerdo con el procedimiento de la presente invención que comprende el cultivo a una temperatura reducida es mayor que el de una glicoproteína de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos y que fue cultivada a 37°C. El aumento del m Rt de la glicoproteína preparada de acuerdo con el procedimiento de la presente invención (o de cualquier glicoproteína de la presente invención) en relación con la glicoproteína de referencia es preferentemente de al menos 25%, más preferentemente de al menos 50%, más preferentemente de al menos 100%.

El término "aclaramiento", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la tasa de eliminación del fármaco en el plasma. En concreto, es la tasa de eliminación actual de un fármaco dividida por su concentración plasmática actual. En un sistema farmacocinético tras una única administración intravenosa, el aclaramiento se puede calcular como la relación entre la dosis y el área bajo la curva de la concentración de plasma a lo largo del tiempo (AUC), a condición de que el aclaramiento sea constante. Cuanto menor sea el aclaramiento, más tiempo tardará el plasma en ser eliminado del fármaco.

La depuración del FVIII administrado se reduce en al menos 10%, preferentemente en al menos 25%, más preferentemente en al menos 40%, más preferentemente en al menos 50%, más preferentemente en al menos 60%, si se coadministra una cantidad eficaz de la glicoproteína de la presente invención i) en relación con la administración del FVIII solo o ii) en relación con la administración de una proteína de referencia que tiene la misma secuencia proteica que la glicoproteína de la invención pero una estructura de N-o iii) en relación con la administración de una proteína de referencia que tenga la misma secuencia proteica que la glicoproteína de la invención, pero más del 35 % de sus N-glicanos comprendan dos o más N-glicanos terminales y no sialilados y más del 6 % de sus N-glicanos comprendan tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

La depuración de la glicoproteína preparada de acuerdo con el procedimiento de la presente invención que comprende el cultivo a una temperatura reducida es menor que el de una glicoproteína de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos que se cultivó a 37°C. La reducción de la depuración de la glicoproteína preparada de acuerdo con el procedimiento de la presente invención (o de cualquier glicoproteína de la presente invención) en relación con la glicoproteína de referencia es preferentemente de al menos 40%, más preferentemente de al menos 50%, más preferentemente de al menos 60%.

La glicoproteína como se define anteriormente en la presente memoria puede utilizarse para aumentar la MRT o la semivida, o en un procedimiento para reducir la depuración del Factor VIII in vivo, que comprende la administración a un individuo de una cantidad eficaz de una glicoproteína.

La glicoproteína según se define anteriormente en la presente memoria puede utilizarse en un procedimiento de tratamiento del trastorno de la coagulación sanguínea, que comprende la administración a un paciente necesitado de dicho tratamiento de una cantidad eficaz de la glicoproteína como se define anteriormente en la presente memoria.

El uso de la glicoproteína como se define anteriormente en la presente memoria puede reducir la frecuencia de administración del FVIII en el tratamiento de la hemofilia A. La frecuencia de administración subcutánea del FVIII se puede reducir a dos veces por semana. Alternativamente, la frecuencia de la administración subcutánea del FVIII se puede reducir a una vez por semana, o incluso a una frecuencia menor, por ejemplo, una vez cada 10 días o una vez cada 14 días. El FVIII se puede administrar dos veces por semana, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, desde cada cuatro días hasta cada mes, desde cada 10 días hasta cada dos semanas, etc.

Preferentemente, el uso de la glicoproteína como se define anteriormente en la presente memoria puede reducir la dosis de FVIII que se debe administrar en el tratamiento de la hemofilia A.

Tratamiento de los trastornos de la coagulación

Las glicoproteínas de la invención son útiles para tratar los trastornos de la coagulación, incluida la hemofilia A. El término "hemofilia A" se refiere a una deficiencia en la coagulación funcional del FVIII, que suele ser hereditaria.

El tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes a los que ya se les ha diagnosticado cualquier forma de la enfermedad en cualquier fase o manifestación clínica; el retraso del inicio o la evolución o el agravamiento o el deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o la reducción de la gravedad de la enfermedad.

Un "individuo" o "paciente" al que se administra una glicoproteína de la invención es preferentemente un ser humano. En ciertos aspectos, el humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el humano es un paciente adulto.

En la presente memoria se describen composiciones que comprenden una glicoproteína de la invención y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como los segundos agentes terapéuticos descritos a continuación. Las composiciones suelen suministrarse como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado para administrarla a un paciente).

Las glicoproteínas de la invención se puede administrar a un paciente por una variedad de vías tal como oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, tópica o local. La vía de administración más adecuada en cada caso dependerá de la glicoproteína específica, del individuo y de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y del estado físico del individuo. Típicamente, una glicoproteína de la invención se administrará por vía intravenosa.

La glicoproteína y el FVIII se administran preferentemente por vía intravenosa o subcutánea.

En una primera realización, tanto el polipéptido como el FVIII se administran por vía intravenosa. En una segunda realización, tanto el polipéptido como el FVIII se administran por vía subcutánea.

En otra realización, el FVIII se administra por vía intravenosa, y el polipéptido se administra por una vía diferente. En otras realizaciones, la glicoproteína se administra por vía subcutánea, y el FVIII se administra por una vía diferente. Por ejemplo, la glicoproteína se puede administrar por vía subcutánea, y el FVIII se puede administrar por vía intravenosa.

En otras realizaciones, el FVIII se administra por vía subcutánea, y el polipéptido se administra por una vía diferente. En otras realizaciones, la glicoproteína se administra por vía intravenosa, y el FVIII se administra por una vía diferente. Por ejemplo, la glicoproteína se puede administrar por vía intravenosa, y el FVIII se puede administrar por vía subcutánea.

Los términos "Factor VIII" y "FVIII" se utilizan indistintamente en la presente memoria y abarcan tanto el FVIII derivado del plasma como el FVIII recombinante. El FVIII recombinante abarca, sin limitación, el FVIII de longitud completa, así como las variantes de dos cadenas del dominio B suprimidas o truncadas, así como las variantes de una sola cadena del dominio B suprimidas o truncadas, por ejemplo las descritas en el documento WO 2004/067566 A1 y otras variantes del FVIII con mutaciones fuera del dominio B pero que tienen la actividad biológica del FVIII.

La determinación de la dosificación eficaz, del número total de dosis y la duración del tratamiento con una glicoproteína de la invención está bien dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, y puede determinarse por el uso de un estudio de escalamiento de dosis estándar.

Composiciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas de las glicoproteínas de la invención adecuadas en los procedimientos descritos en la presente memoria pueden prepararse para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el polipéptido que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales aceptables para uso farmacéutico que se emplean típicamente en la técnica (todos los cuales se denominan en la presente memoria "vehículos"), es decir, agentes tamponadores, agentes estabilizadores, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ta edición (Osol, ed. 1980). Estos aditivos deben ser no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas.

Los agentes tamponadores ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse en concentraciones que van desde unos 2 mM hasta unos 50 mM. Los agentes tamponadores adecuados incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sus sales, tal como tamponadores de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), tamponadores de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódicofumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), tampones de oxalato (por ejemplo mezcla de oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido lácticohidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Además, se pueden utilizar tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina como Tris.

Pueden añadirse conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y pueden añadirse en cantidades que oscilan entre el 0,2% y el 1% (p/v). Los conservantes adecuados incluyen el fenol, el alcohol bencílico, el meta-cresol, el metilparabeno, el propilparabeno, el cloruro de octadecildimetilbencilamonio, los haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), el cloruro de hexametonio y los alquilparabenos como el metilparabeno o el propilparabeno, el catecol, el resorcinol, el ciclohexanol y el 3-pentanol. Para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas pueden añadirse isotonificadores, a veces conocidos como "estabilizadores", que incluyen alcoholes de azúcares polihídricos, preferentemente trihídricos o superiores, como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes cuya función puede variar desde un agente de volumen hasta un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a evitar la desnaturalización o la adherencia a la pared del envase. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes polihídricos de azúcar (enumerados anteriormente); aminoácidos como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc, azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, como la lactosa, la trehalosa, la estaquiosa, el manitol, el sorbitol, el xilitol, el ribitol, el mioinisitol, el galactitol, el glicerol y similares, incluidos los ciclitoles como el inositol; el polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, como la urea, el glutatión, el ácido tióctico, el tioglicolato de sodio, el tioglicerol, el a-monotioglicerol y el tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos); proteínas como la albúmina de suero humano, la albúmina de suero bovino, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como los monosacáridos de polivinilpirrolidona, como la xilosa, la manosa, la fructosa y la glucosa; disacáridos como la lactosa, la maltosa, la sacarosa y los trisacáridos como la rafinosa; y polisacáridos como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de peso de proteína activa.

Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, lo que también permite exponer la formulación a la tensión superficial de cizallamiento sin causar la desnaturalización de la proteína. Entre los tensioactivos no iónicos adecuados se encuentran los polisorbatos (20, 80, etc.), los polioxámeros (184, 188, etc.), los polioles plurónicos, los monoéteres de sorbitán polioxilados (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Otros excipientes diversos incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes. La formulación de la presente memoria también puede contener un segundo agente terapéutico además de una glicoproteína de la invención. A continuación se ofrecen ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.

El programa de dosificación puede variar desde una vez al mes hasta diariamente, dependiendo de una serie de factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la misma y la sensibilidad del paciente a la glicoproteína de la invención. En realizaciones específicas, una glicoproteína de la invención se administra dos veces por semana, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo desde cada cuatro semanas hasta cada mes, desde cada 10 días hasta cada dos semanas, o de dos a tres veces por semana, etc.

La dosificación de una glicoproteína de la invención que se va a administrar variará de acuerdo con la glicoproteína particular, el individuo y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, la condición física del individuo, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico) y la vía de administración seleccionada; la dosificación adecuada puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica.

Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosificaciones individuales de una glicoproteína de la invención se determinarán por la naturaleza y el alcance de la afección que se está tratando, la forma, la vía y el sitio de administración, y la edad y la condición del individuo particular que se está tratando, y que un médico determinará en última instancia las dosificaciones apropiadas que se utilizarán. Esta dosificaciones puede repetirse tantas veces como sea necesario. Si se producen efectos secundarios, se puede modificar o reducir la cantidad y/o la frecuencia de la dosificación, de acuerdo con la práctica clínica habitual.

Terapia combinada

Preferentemente, el paciente que se trata con la glicoproteína de la invención también se trata con una terapia convencional de trastornos de la coagulación. Por ejemplo, un paciente que padece hemofilia suele ser tratado también con Factor VIII.

De acuerdo con esta invención, el paciente que está siendo tratado con la glicoproteína de la invención también es tratado con el Factor VIII de coagulación sanguínea. La glicoproteína de la invención y el Factor VIII se pueden administrar de forma simultánea, o de una forma secuencial, ambos modos de administración están englobados por el término "terapia combinada" y "coadministración". La glicoproteína de la invención y el Factor VIII pueden administrarse como una mezcla, es decir, dentro de la misma composición, o por separado, es decir, como composiciones independientes.

La concentración de Factor VIII en la composición utilizada está típicamente en el intervalo de 10-10.000 UI/ml. En diferentes realizaciones, la concentración de FVIII en las composiciones de la invención está en el intervalo de 10­ 8.000 UI/ml, o 10-5.000 UI/ml, o 20-3.000 UI/ml, o 50-1.500 UI/ml, o 3.000 UI/ml, o 2.500 UI/ml, o 2.000 UI/ml, o 1.500 UI/ml, o 1.200 UI/ml, o 1.000 UI/ml, o 800 UI/ml, o 750 UI/ml, o 600 UI/ml, o 500 UI/ml, o 400 UI/ml, o 300 UI/ml, o 250 UI/ml, o 200 UI/ml, o 150 UI/ml, o 125 UI/ml, o 100 UI/ml, o 62,5 UI/ml, o 50 UI/ml.

La "Unidad Internacional", o "UI", es una unidad de medida de la actividad de la coagulación sanguínea (potencia) del FVIII, medida por un ensayo de actividad del FVIII, tal como un ensayo de coagulación de una etapa o un ensayo de actividad del FVIII con sustrato cromogénico, mediante el uso de un estándar calibrado contra una preparación estándar internacional calibrada en "UI". Los ensayos de coagulación de una etapa son conocidos en la técnica, como el descrito en N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983). Principio del ensayo de una etapa: La prueba se ejecuta como una versión modificada del ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): La incubación del plasma con fosfolípidos y un activador de superficie conduce a la activación de los factores del sistema intrínseco de coagulación. La adición de iones de calcio desencadena la cascada de coagulación. Se determina el tiempo hasta la formación de un coágulo de fibrina medible. El ensayo se realiza en presencia de plasma deficiente de Factor VIII. La capacidad de coagulación del plasma deficiente se restablece mediante el Factor de Coagulación VIII incluido en la muestra a analizar. El acortamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la cantidad de Factor VIII presente en la muestra. La actividad del Factor VIII de la coagulación se cuantifica por comparación directa con una preparación estándar con una actividad conocida del Factor VIII en Unidades Internacionales.

Otro ensayo estándar es un ensayo de sustrato cromogénico. Los ensayos de sustrato cromogénico se pueden adquirir comercialmente, tales como el kit de ensayo Coamatic® FVIII (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italia). Principio del ensayo cromogénico: En presencia de calcio y fosfolípidos, el Factor X es activado por el Factor IXa a Factor Xa. Esta reacción es estimulada por el Factor VIIIa como cofactor. El FVIIIa se forma por bajas cantidades de trombina en la mezcla de reacción a partir del FVIII en la muestra a medir. Cuando se utilizan las concentraciones óptimas de Ca2+, fosfolípido y Factor IXa y una cantidad excesiva de Factor X, la activación del Factor X es proporcional a la potencia del Factor VIII. El Factor X activado libera el cromóforo pNA del sustrato cromogénico S-2765. La liberación de pNA, medida a 405 nm, es por lo tanto proporcional a la cantidad de FXa formado y, por lo tanto, también a la actividad del Factor VIII de la muestra.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos mostradas en el listado de secuencias se resumen en la siguiente Tabla: Tabla 1:

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, pero no deben interpretarse como una limitación de la presente invención a las realizaciones específicas descritas a continuación en la presente memoria.

Ejemplo 1: Generación de la proteína de fusión de albúmina D'D3 (D'D3-FP):

El casete de expresión para D'D3-FP que consiste en ADNc que codifica los aminoácidos 1 a 1242 del VWF, un enlazador de glicina/serina y el ADNc de la albúmina humana se preparó mediante síntesis genética a medida (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania). A través de los sitios de restricción flanqueantes (EcoRI, Notl), el casete de expresión se extrajo del vector de clonación suministrado y se insertó en un vector pIRESneo3 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) linealizado con EcoRI y Notl. El plásmido de expresión resultante contenía secuencias de nucleótidos que codificaban el propéptido del VWF, D' y D3 (aminoácidos del VWF 1 a 1242 de la SEQ ID NO:9) fusionados a la secuencia codificante de la albúmina a través de una secuencia codificante de enlace corto bajo el control del promotor CMV. La secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante se muestra como SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácidos de la D'D3-FP madura se muestra como SEQ ID NO:2.

Ejemplo 2: Transfección de plásmidos y expresión estable del dímero D'D3-FP en células de ovario de hámster chino (CHO)

Los plásmidos de expresión descritos anteriormente se cultivaron en XL10 Gold (Agilent Technologies) y se purificaron utilizando protocolos estándar (Qiagen, Hilden, Germany).

Las células CHO K1 se transfectaron utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se cultivaron en medio libre de suero (CD-CHO, Invitrogen) en presencia de 500-1000 pg/ml de Geneticina. Un plásmido de expresión que codifica PACE/furina (pFu-797) como se describe en el documento WO 2007/144173 se cotransfectó para maximizar la eficacia de la escisión del propéptido. Los clones derivados de células individuales se cultivaron y seleccionaron según su rendimiento de expresión de D'D3-FP, cuantificado mediante un inmunoensayo enzimático específico para la albúmina (véase más adelante). La línea celular finalmente seleccionada para la fermentación de D'D3-FP se denominó T2050-CL3.

Ejemplo 3: Coexpresión de una a-2,6 sialil transferasa

Durante un procedimiento de generación de líneas celulares como el descrito en el ejemplo 2, puede cotransfectarse un plásmido que lleva una unidad de expresión que codifica una a-2,6 sialil transferasa para favorecer la fijación de ácidos siálicos no roedores.

La secuencia de codificación de la a-2,6 sialil transferasa humana se amplifica a partir de una biblioteca de ADNc de hígado humano (Ambion) utilizando los cebadores We2556 (SEQ-ID NÚM.: 3) y We 2558 (SEQ-ID NÚM.: 4) para una primera y los cebadores We2553 (SEQ-ID NÚM.: 5) y We 2559 (SEQ-ID NÚM.: 6) para una segunda PcR ^{en una} configuración de PCR anidada. Para la primera PCR se mezclan 2 pL de la biblioteca de ADNc de hígado humano de Ambion con 34,5 pL de agua, 10 pL de tampón de PCR 5x Phusion GC (New England Biolabs), 1 pL de dNTP 10mM, 1 pL de We2556 (10 pmol), 1 pL de We2558 (10 pmol) y 05 pL de polimerasa de ADN Phusion (New England Biolabs) y se amplificó utilizando un protocolo de retoque de 60 segundos iniciales a 98°C, 15 ciclos de a) 15 segundos de desnaturalización a 98°C, b) 30 segundos de recocido a 64°C y c) 2 minutos de elongación a 72°C, donde la temperatura de la etapa de recocido se reduce en 0.3°C por ciclo, seguidos de 25 ciclos de a) 25 segundos de desnaturalización a 98°C, b) 30 segundos de recocido a 62°C y c) 2 minutos de elongación a 72°C, seguidos de un paso de extensión final durante 10 minutos a 72°C, tras lo cual se detiene la reacción enfriando y manteniendo a 4°C. Para la PCR anidada, se mezclan 2 pL de la primera reacción de PCR con 34,5 pL de agua, 10 pL de tampón de PCR 5x Phusion GC, 1 pL de dNTP 10mM, 1 pL de We2553 (10 pmol), 1 pL de We2559 (10 pmol) y 0,5 pL de ADN polimerasa Phusion y se amplifican utilizando el protocolo de touchdown descrito para la primera PCR. La PCR anidada añade un sitio de corte de la enzima de restricción Nhel en el extremo 5' y un sitio BamH1 en el extremo 3' del fragmento de la PCR. Este fragmento es cortado por Nhel y BamH1 y ligado en el vector de expresión plRESneo3 que había sido abierto por las mismas enzimas. El vector de expresión resultante puede utilizarse para la cotransfección.

Ejemplo 4: Producción de D'D3-FP en biorreactores

El procedimiento de fermentación para la producción de D'D3 comenzó con la descongelamiento de la línea celular T2050-CL3, seguida de la expansión celular en matraces agitados y, finalmente, un procedimiento de fermentación en modo de perfusión utilizando el biorreactor BioStat B-DCU de 5 L de Sartorius y los biorreactores de un solo uso BioStat STR de 50 L. Como dispositivos de retención celular se utilizaron los BioSeps 10L o 200L (Applikon), respectivamente. Los medios de cultivo celular fueron PowerCHO3 (Lonza BESP1204) con 8 mM de L-glutamina y 1 pM de CuSO4 o ProCHO5 (Lonza BESP1072) con 10 mM de L-glutamina y 1 pM de CuSO4.

Los trenes de siembra en frascos de agitación se realizaron a 37°C, 7,5% de CO2 a una velocidad de agitación de 160 rpm.

El biorreactor de 5L fue inoculado con un VCD objetivo de 2,5 * 105 células/ml. Las células se cultivaron en PowerCHO3 con 8 mM de L-glutamina y 1 pM de CuSO4 a una temperatura de 37,0°C, un pH de 7,00 y una saturación de oxígeno del 30%. Se realizó un cambio de temperatura a 34,0°C (intervalo evaluado de 31 °C a 35°C) después de haber tomado las recolecciones iniciales del funcionamiento del biorreactor a 37°C. El pH se controló utilizando CO2 sometido a burbujeo como ácido y NaHCO3 como base. El caudal de aire de superposición se fijó en 0,5 L/min. Se utilizó un burbujeador de anillo como unidad de burbujeo. La velocidad de agitación fue de 150 rpm con un impulsor de palas de doble paso en modo de tracción hacia abajo.

El biorreactor de 50L fue inoculado con un VCD objetivo de 3,0 * 105 células/ml. Las células se cultivaron en medio ProCHO5 con 10 mM de L-glutamina y 1 pM de CuSO4 a una temperatura de 37,0°C, un pH de 6,90 y una saturación de oxígeno del 30%. Se realizó un cambio de temperatura a 34,0°C después de una o dos recolecciones iniciales. Control del PH como en el caso anterior, el caudal de aire de superposición se fijó en 2 L/min. Se utilizó un microburbujeador como unidad de burbujeo. La velocidad de agitación fue de 90 rpm con un impulsor de palas de doble paso en modo de tracción hacia abajo.

La perfusión se inició cuando el VCD en el biorreactor era >1,0 x106 células/ml. La tasa de perfusión se fijó en 1,0 volumen/volumen/día. El BioSep fue operado en modo de retrolavado con 5 (10) minutos de funcionamiento y 10 segundos de retrolavado a una potencia de entrada de 7 (30) W (los números entre paréntesis se refieren al biorreactor de 50L). El perfusato y la hemorragia se filtraron en línea y se recogieron en bolsas durante 48 horas a una temperatura de 2 a 8°C. El VCD se controló por sangrado activo mediante una sonda de turbidez utilizando el consumo de glucosa como parámetro con un objetivo de 2 g/L de glucosa. La recolección y el sangrado se filtraron en línea, el sistema de recolección que consiste en un filtro desechable y una bolsa desechable se cambió cada dos días.

Para preparar el material para los análisis de PK descritos a continuación, se purificaron las recolecciones de proteínas de fusión de albúmina D'D3 mediante cromatografía de afinidad y de exclusión de tamaño.

Ejemplo 5: Purificación del dímero D'D3-FP mediante cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión por tamaño

La cosecha libre de células del biorreactor se concentró 30 veces utilizando un sistema TFF (por ejemplo, Pall Centramate 500 S) con una membrana de 30 kD (por ejemplo, Pall Centramate OS030T12). Ese concentrado se enriqueció con NaCl y EDTA hasta una concentración final de 0,75 M de NaCl y 5 mM de EDTA y se cargó durante la noche en una columna CaptureSelect Human Albumin (Life Technologies) que se preequilibró con un tampón Tris 20 mM de pH 7,4. Tras lavar la columna con tampón de equilibrio, el D'D3-FP se eluyó con tampón de elución (20 mM Tris, 2 MgCl2, pH 7,4). A continuación, el eluído se concentró 10 veces y se dializó contra 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,4 utilizando filtros ultracentrífugos con un corte de 30 kD (por ejemplo, Amicon. UFC903024). Para separar el dímero D'D3-FP de la porción de monómero ese material se cargó en una columna Superdex 200 pg (Código GE Healthcare: 17-1069-01) preequilibrada con 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,4 y se agruparon las fracciones de pico que contenían el dímero D'D3-FP. El área bajo la curva para las fracciones de pico de dímero y monómero se utilizó para calcular la relación de dímero a monómero.

Ejemplo 6: Ensayo de sialilación total

Materiales y Procedimientos:

El ácido acético era de Sigma-Aldrich (Prod. 338826). El acetonitrilo era de Burdick and Jackson (Prod. LC015). La 2-aminobenzamida (2-AB) era de Aldrich (Prod. A89804). El hidróxido de amonio era de Sigma-Aldrich (Prod. 338818). El bicarbonato de amonio era de Fluka (Prod. 09830). El dimetilsulfóxido era de Sigma Prod. (D2650). El ditiotreitol (DTT) era de Sigma (Prod.646563). El ácido fórmico era de Thermo (Prod. 28905). La N-Glicosidasa F (PNGase 250U) era de Roche (Prod. 11 365 19300). El cianoborohidruro de sodio era de Aldrich (Prod. 156159). Los cartuchos SPE Oasis HLB 3cc 60 mg eran de Waters (Núm. de Pieza: WAT094226). Los ultrafiltros centrífugos Amicon Ultra 4 de 50KDa eran de Millipore (Cat. Núm. UFC805008). Las columnas Zeba Spin 7K MWCO de 2ml eran de Thermo (Núm.

89889)

Liberación enzimática de glicanos por PNGasa F:

Aproximadamente 700 pg de D'D3-FP se redujeron con DTT en aproximadamente 70 mM de bicarbonato de amonio, pH 8,5 a 60°C durante 30 min. La muestra reducida se enfrió a temperatura ambiente y se alquiló con yodoacetamida a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. La muestra alquilada se intercambió en tampón en bicarbonato de amonio 50mM pH 8,6 utilizando una columna Zeba Spin 7K MWCO de 2ml. A la muestra intercambiada con el tampón, se añadieron 40U de PNGasa y se incubó la muestra a 37°C durante 14 horas. Se añadieron 40U adicionales de PNGasa y la muestra se incubó durante otras 6 horas a 37°C. La muestra digerida con PNGasa se centrifugó a través de un ultrafiltro Amicon Ultra 4 de 50KDa. El filtrado se secó en un CentriVap.

Etiquetado con 2-AB de N-glicanos liberados:

Para preparar el reactivo de etiquetado 2-AB, se disolvieron 23 mg de 2-aminobenzamida en 350 pL de DMSO y se añadieron 150 pL de ácido acético glacial. La solución resultante se añadió a 32 mg de cianoborohidruro de sodio y se mezcló exhaustivamente hasta su disolución. Se añadieron 50 pL del reactivo 2-AB a la muestra seca y se incubaron en la oscuridad a 65°C durante 3,5 horas.

Se acondicionó un cartucho SPE Waters Oasis HLB 3cc 60 mg con 3 ml de acetonitrilo al 95%, 3ml de acetonitrilo al 35% y luego 3 ml de acetonitrilo al 95%. La muestra marcada con 2-AB se diluyó por la adición de 1,95 ml de acetonitrilo al 95% v/v y se cargó inmediatamente en el cartucho HLB y se dejó drenar por gravedad. La muestra se lavó por gravedad con 3x 3ml de acetonitrilo al 95% v/v y se eluyó con 3ml de acetonitrilo al 35% v/v. El eluido se secó en un Centrivap. La muestra seca derivada del 2-AB se disolvió por la adición de 35 pL de agua Milli Q y mezcla en vórtex. Tras la disolución, se añadieron 85 pL de acetonitrilo y se mezclaron brevemente. La muestra se transfirió a un vial de HPLC para su análisis.

Análisis de glicanos 2-AB:

La cromatografía líquida de alto rendimiento se llevó a cabo en un sistema Thermo Dionex Ultimate 3000 que consistía en una bomba binaria RS, un automuestreador, un compartimento de columna RS y un detector de fluorescencia RS.

La separación de los derivados de los glicanos 2-AB se realizó con una columna Dionex GlycanPac AXH-1, 1,9 |jm, 2,1 x ^{1 5 0} mm (P/N 082472). La fase móvil A consistió en 100% de acetonitrilo, la fase móvil B consistió en ácido fórmico 50mM ajustado a pH 4.0 con solución de hidróxido de amonio 5M. La columna se mantuvo a 50° C y el caudal fue de 0,200 ml/min. La columna se equilibró con un 15% de B. Tras la inyección de 6 jL de muestra, la composición de la fase móvil se cambió linealmente a un 40% de B durante 50 minutos, luego a un 80% de B durante 10 minutos, luego a un 95% de B durante 0,1 minutos, luego se mantuvo a un 95% de B durante 4,9 minutos y luego se volvió a un 15% de B durante 0,1 minutos. La columna se volvió a calibrar al 15% de B durante 14,9 minutos. La detección de fluorescencia se realizó con una longitud de onda de excitación de 320 nm y una longitud de onda de emisión de 420 nm.

Resultados

Tabla 2: Lotes de D'D3-FP proporcionados para análisis PK:

La proteína D'D3-FP purificada a partir de cosechas tomadas después del cambio de temperatura de 37°C a 33°C (por ejemplo, el lote B-140825) o a 34°C (por ejemplo, el lote B-140623KS) mostró un patrón de sialilación mejorado en el sentido de que se detectó una cantidad reducida de estructuras asialo y monosialo, mientras que, en particular, aumentaron las estructuras di-sialo y tri-sialo. El contenido reducido de estructuras asialo tuvo un efecto positivo en la semivida de la propia proteína D'D3-FP, así como en un FVIII coadministrado (véase el Ejemplo 8).

Se ha descubierto un efecto beneficioso adicional como resultado del cambio de temperatura en el sentido de que la proporción de dímeros D'D3-FP aumentó sobre el monómero a temperaturas más bajas, en el que el dímero es la estructura preferente debido a su mayor unión al FVIII.

Tabla 3 Efecto de la Temperatura en el Contenido de Dímeros

Como se muestra en la Tabla 4, el efecto beneficioso de un cambio de temperatura en el grado de sialilación no se observó con respecto al VWF de longitud completa. Específicamente, el contenido de asialoestructuras no pudo reducirse cuando se expresó la fusión de albúmina de VWF de longitud completa de tipo silvestre ("rVWF-FP") en condiciones de biorreactor similares a las descritas en el Ejemplo 4 y cuando se redujo la temperatura a 33,5°C en comparación con la expresión a la temperatura estándar de 37°C. La purificación se había realizado como se describe en el documento US 2014/0072561 A1.

Tabla 4: Sialilación de VWF de longitud completa

El grado de sialilación del lote cosechado a 37°C se normalizó a un valor nominal de 100. El grado de sialilación determinado para el lote cosechado a 33,5°C fue menor que el del lote cosechado a 37°C.

Ejemplo 7: Determinación de la concentración de antígeno D'D3-FP

La albúmina humana se determinó mediante un ELISA cuyo rendimiento es conocido por los expertos en la técnica. En pocas palabras, las microplacas se incubaron con 100 pL por pocillo del anticuerpo de captura (antialbúmina humana-IgG de cabra, Cat. Núm. A80-129A, Bethyl Laboratories, Inc.), diluido a 2 pg/ml en Buffer A [Sigma C3041] durante 16 horas a temperatura ambiente. Tras lavar las placas tres veces con tampón B (Sigma P3563), se bloquearon las microplacas con 200 pL por pocillo de solución de bloqueo (Cat. Núm. 110500, Candor Biosience GmbH), durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Tras lavar nuevamente las placas tres veces con tampón B (Sigma P3563), se realizaron diluciones en serie de la muestra de ensayo en Tampón LowCross (Cat. Núm. 100500, Candor Biosience GmbH,) así como diluciones en serie de N Protein Standard Sl (OQIM13, Siemens Healthcare 50-0,78 ng/ml) en LowCross Buffer (volúmenes por pocillo: 100 pL) se incubaron durante una hora a 37°C. Después de cuatro etapas de lavado con tampón B, 100 pL de una dilución 1:40.000 en solución de bloqueo del anticuerpo de detección (anti-Albúmina Humana-IgG de cabra marcado con peroxidasa, Cat. Núm. A80-129P, Bethyl Laboratories, Inc.)-D, se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 45 min. a 37°C. Después de tres etapas de lavado con tampón B, se añadieron 100 pL de solución de sustrato (1:10 (v/v) TMB OUVF : TMB Buffer OUVG, Siemens Healthcare) se añadieron por pocillo y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La adición de 100 pL de solución de parada (OSFA, Siemens Healthcare) preparó las muestras para su lectura en un lector de microplacas adecuado a una longitud de onda de 450 nm. A continuación, se calcularon las concentraciones de las muestras de ensayo utilizando la curva estándar con el estándar de proteína N SL como referencia.

Ejemplo 8: Análisis PK:

Objetivos

Se pretende caracterizar el impacto de la sialilación en la farmacocinética (PK) del fragmento D'D3-FP del Factor von Willebrand (VWF) de semivida extendida y del FVIII. Uno de los objetivos de estos estudios era determinar la influencia de la sialilación del dímero D'D3-FP en su PK y, además, en la PK del FVIII coadministrado en ratas (Ejemplo 8.1). Un segundo ejemplo abarca el efecto sobre un producto de FVIII de longitud completa Advate® en ratas (Ejemplo 8.2). Para cada preparación se indica el número de lote (véase la Tabla 2 anterior) y el grado de sialilación del dímero D'D3-FP en %.

Ejemplo 8.1: Prolongación de la farmacocinética del FVIII por la coadministración del dímero D'D3-FP altamente sialilado en ratas

Material y procedimientos

Animales: Fueron criados ratones hembra Crl:CD (Sprague Dawley) en un intervalo de peso de 230-300 g en Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germany). Internamente, los animales se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 21-22°C bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 h. Los animales fueron alimentados ad libitum con una dieta estándar para ratas (Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany). Se suministró agua del grifo ad libitum. La cría de animales y los procedimientos del estudio cumplían la ley alemana de bienestar animal y la normativa de la Unión Europea.

Evaluaciones de laboratorio: Los artículos de prueba se administraron por vía intravenosa mediante una única inyección en la vena lateral de la cola a un volumen de 3 ml/kg. Todas las preparaciones de dímeros de D'D3-FP se administraron a un nivel de dosis de 1000 pg/kg en base a los valores de albúmina humana, y se coadministraron con 200 UI/kg de rVIII-SingleChain (rVIII-SC, actividad cromogénica) después de incubar durante aproximadamente 30 minutos a 37°C. Los animales que sólo recibieron rVIII-SC sirvieron de control (Tabla 5).

Se tomaron muestras de sangre por vía retro-orbital bajo anestesia de corta duración a los 5 min, 2, 4, 8, 24, 32, 48 y 72 h después de la inyección intravenosa en bolo, utilizando un esquema de muestreo alternado. El perfil PK se tomó de dos cohortes de ratas por grupo (n=3 por punto temporal, n=6 por grupo). Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (2 parte de citrato de sodio al 3,13% 8 partes de sangre), se procesaron para obtener plasma y se almacenaron a -20°C para la determinación del antígeno FVIII y la albúmina.

La exposición al dímero D'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la proteína utilizando un inmunoensayo específico para la albúmina humana (ejemplo 7), y los niveles plasmáticos de FVIII:Ag se detectaron con el kit de prueba FVIII Asserachrom ELISA de Stago, S.A.S., France.

Tabla 5: Grupos de tratamiento

Resultados

El dímero D'D3-FP se cuantificó a través de su componente de albúmina, y las mediciones se realizaron hasta 72 h p.a., y todos los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección del ensayo. La media de tiempo de residencia (MRT) y la depuración (CL) se estimaron mediante procedimientos no compartimentales y los datos se presentan en la Fig. 1. El rVIII-SC coadministrado con el dímero D'D3-FP con un 40,6% de sialilación (B-140526) tuvo un MRT más corto y un depuración mayor que cuando se coadministró con las preparaciones de dímero D'D3-FP con un 83,6% y un 89,8% de sialilación (B-140616KS y B-140623KS, respectivamente).

De acuerdo con esta observación, el perfil farmacocinético del FVIII coadministrado (200 UI/kg de actividad cromogénica del FVIII), cuantificado como FVIII:Ag mediante ELISA, se modificó en consecuencia. Cabe mencionar que no se pudieron medir todos los niveles plasmáticos a las 48h y 72 h, algunos valores estaban por debajo del límite de detección de 57 mUI/ml. Claramente, el rVIII-SC por sí solo tuvo la MRT más corto y la depuración más alto, que se prolongó en general cuando se coadministró el dímero D'D3-FP (Fig. 2). Esos dímeros D'D3-FP, que tenían una exposición más larga por sí mismos, también prolongaron el perfil PK del FVIII. Así, la MRT del dímero D'D3-FP con un 40,6% de sialilación (B-140526) fue más corto y la depuración fue mayor en comparación con el dímero D'D3-FP con sialilación >80%.

Por lo tanto, el perfil farmacocinético del FVIII:Ag dependía de la sialilación del dímero D'D3-FP, es decir, el PK más corto se observó con un 40,6% de sialilación y el PK más largo con los de >80% de sialilación.

La evaluación de las características PK del dímero D'D3-FP se hizo con más detalle, es decir, calculando adicionalmente las concentraciones máximas (Cmáx) y la semivida terminal (t1/2) en un modelo no compartimental, así como calculando los incrementos en x veces (Tabla 6). La sialilación entre 89,8% y 40,6% influyó en la depuración del dímero D'D3-FP en más de 2 veces (0,91 ml/kg/h para el dímero D'D3-FP del 89,8% y 2,06 ml/kg/h para el dímero D'D3-FP del 40,6%, de acuerdo con se determinó midiendo la concentración de albúmina a lo largo del tiempo). Esto se relaciona con un aumento de más de 40% en la media de tiempo de residencia (MRT, es decir, de 56,9 h a 81,5 h) y un aumento de más del 30% en la semivida terminal (es decir, de 44,0 h a 58,6 h).

Como se muestra en los gráficos para la MRT y la depuración, esto se traduce en las características PK del FVIII coadministrado, aunque no es tan evidente como para el dímero D'D3-FP (Tabla 6, FVIII:Ag): la depuración disminuye en más de 30% (3.93 ml/kg/h a 2.95 ml/kg/h), la MRT aumenta en 19% (16,5 h a 19,6 h) y la semivida terminal en 15% (11,4 h a 13,1 h).

Por lo tanto, el aumento de la exposición en el tiempo está dado por el dímero D'D3-FP dependiendo del porcentaje de sialilación, como también puede verse por el aumento del pliegue de las características PK del rVIII-SC administrado solo. Mientras que 40,6% de sialilación prolonga la FC del FVIII 1,5-1,9 veces, un dímero D'D3-FP optimizado con un 89,8% de sialilación prolonga la FC del FVIII 2,0-2,2 veces, y un 83,6% de sialilación conduce a valores intermedios. Por lo tanto, este efecto se correlaciona con el grado de sialilación dentro del rango investigado de 40,6% a 89,8%.

Tabla 6: Parámetros farmacocinéticos del dímero D'D3-FP y del FVIII:Ag tras la coadministración de rVIII-SC y del dímero D'D3-FP en ratas (análisis no compartimental)

Ejemplo 8.2: Prolongación de la farmacocinética del FVIII completo por la coadministración del dímero D'D3-FP altamente sialilado en ratas

Material y procedimientos

Animales: Fueron criados ratones hembra Crl:CD (Sprague Dawley) en un intervalo de peso de 220-300 g en Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germany). Internamente, los animales se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 21-22°C bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 h. Los animales fueron alimentados ad libitum con una dieta estándar para ratas (Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany). Se suministró agua del grifo ad libitum. La cría de animales y los procedimientos del estudio cumplían la ley alemana de bienestar animal y la normativa de la Unión Europea.

Evaluaciones de laboratorio: Los artículos de prueba se administraron por vía intravenosa mediante una única inyección en la vena lateral de la cola a un volumen de 3 ml/kg. Todas las preparaciones de dímeros de D'D3-FP se administraron a un nivel de dosis de 1000 pg/kg basado en los valores de albúmina humana, y se coadministraron con 200 Ul/kg de Advate® (actividad cromogénica nominal) después de incubar durante aproximadamente 30 minutos a 37°C. Los animales que sólo recibieron Advate® sirvieron de control (Tabla 7).

Se tomaron muestras de sangre por vía retro-orbital bajo anestesia de corta duración a los 5 min, 2, 4, 8, 24, 32, 48 y 72 h después de la inyección intravenosa en bolo, utilizando un esquema de muestreo alternado. El perfil PK se tomó de dos cohortes de ratas por grupo (n=3 por punto temporal, n=6 por grupo). Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (2 parte de citrato de sodio al 3,13% 8 partes de sangre), se procesaron para obtener plasma y se almacenaron a -20°C para la determinación del antígeno FVIII y la albúmina.

La exposición al dímero D'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la proteína utilizando un inmunoensayo específico para la albúmina humana (ejemplo 7), y los niveles plasmáticos de FVIII:Ag se detectaron con el kit de prueba FVIII Asserachrom ELISA de Stago, S.A.S., Francia.

Tabla 7: Grupos de tratamiento (de acuerdo con el experimento)

Resultados

El dímero D'D3-FP se cuantificó a través de su componente de albúmina, y las mediciones se realizaron hasta 72 h p.a., y los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección durante todo el período de observación. La media de tiempo de residencia (MRT) y la depuración (CL) se estimaron mediante procedimientos no compartimentales y los datos se presentan en la Fig. 3. Las características PK del dímero de D'D3-FP en el grupo de Advate® coadministrado con el dímero de D'D3-FP con un 40,6% de sialilación tuvieron un MRT más corto y un depuración mayor que cuando se coadministró con el preparado de dímero de D'D3-FP con 87,3% de sialilación.

De acuerdo con esta observación, el perfil farmacocinético del FVIII coadministrado (200 UI/kg de actividad cromogénica nominal del FVIII), cuantificado como FVIII:Ag mediante ELISA, se modificó en consecuencia. Cabe mencionar que las muestras pudieron medirse hasta las 4-8 h p.a. con el grupo tratado con Advate® y hasta las 24­ 32 h p.a. con los grupos co-tratados con el dímero D'D3-FP, después los valores estuvieron por debajo del límite de detección del ensayo de 117 mUI/ml. Claramente, Advate® por sí solo tuvo la MRT más corta y la depuración más alta, que se prolongó en general cuando se coadministró el dímero D'D3-FP (Fig. 4). Esos dímeros D'D3-FP, que tenían una exposición más larga por sí mismos, también prolongaron el perfil PK del FVIII. Por lo tanto, la MRT del dímero D'D3-Fp con un 40,6% de sialilación fue más corta y la depuración fue mayor en comparación con el dímero D'D3-FP con sialilación >85%. Por lo tanto, el perfil farmacocinético del FVIII:Ag dependía de la sialilación del dímero D'D3-FP, es decir, la PK más corta se observó con un 40,6% de sialilación y la PK más larga con las de >85% de sialilación.

La evaluación de las características PK del dímero D'D3-FP se hizo con más detalle, es decir, calculando adicionalmente las concentraciones máximas (Cmáx) y la semivida terminal (t1/2) en un modelo no compartimental, así como calculando los incrementos de x veces respecto a Advate® administrado solo (Tabla 8).

La sialilación entre 87,3% y 40,6% influyó en la depuración del dímero de D'D3-FP en más de 1,5 veces (1,32 ml/kg/h para el dímero de D'D3-FP del 87,3% y 2,17 ml/kg/h para el dímero de D'D3-FP del 40,6%, de acuerdo con se determinó midiendo la concentración de albúmina en el tiempo). Esto se relaciona con ligeros efectos en la media de tiempo de residencia (MRT, 14%, es decir, de 54,4 h a 62,0 h) y en la semivida terminal (t1/2, 4%, es decir, de 42,2 h a 44,0 h).

Como se muestra en los gráficos de MRT y depuración, esto se traduce en las características PK del FVIII coadministrado, aunque en su mayoría no es tan obvio como para el dímero D'D3-FP (Tabla 8, FVIII:Ag): la depuración disminuye en más de 20% (12,99 ml/kg/h a 10,66 ml/kg/h), la MRT aumenta en un 12% (10,2 h a 11,4 h) y la semivida terminal en 11% (8,9 h a 9,9 h).

Por lo tanto, también para el producto de FVIII de longitud completa Advate®, el aumento de la exposición en el tiempo está dado por el dímero D'D3-FP dependiendo del porcentaje de sialilación, como también puede verse por el aumento del pliegue de las características PK de Advate® administrado solo. Si bien 40,6% de sialilación prolonga la FC del FVIII 2,3-2,9 veces, un dímero D'D3-FP optimizado con 87,3% de sialilación prolonga la FC del fV iII 2,8-3,2 veces.

Tabla 8: Parámetros de farmacocinética del dímero D'D3-FP y del FVIII:Ag tras la coadministración de Advate® y del dímero D'D3-FP en ratas (análisis no compartimental)

Conclusión de los resultados del estudio PK

Estos estudios demuestran que la coadministración del dímero D'D3-FP y el FVIII prolonga la exposición plasmática del FVIII:Ag utilizando diferentes productos de FVIII. Esta prolongación depende del estado de sialilación del dímero D'D3-FP: generalmente, una mejor sialilación optimiza aún más la exposición plasmática del FVIII. En detalle, el dímero D'D3-FP con una sialilación de 40,9% fue inferior con respecto a la exposición plasmática del FVIII:Ag a D'D3-FP con una sialilación en el intervalo de 83,6-89,8%.

Dado que en ratas (en contraste con los pacientes de hemofilia A humana), el FVIII humano y el endógeno compiten con los sitios de unión del dímero D'D3-FP, puede esperarse que el efecto sobre el FVIII en el paciente con hemofilia humana sea aún más fuerte.

Ejemplo 9: Sialilación in vitro de D'D3-FP

El dímero D'D3-FP se dializó contra un tampón de acetato de sodio 35 mM / Tris 35 mM a pH 7,0. A aproximadamente 600 |jg de la proteína en 110 jL , se añadieron 0,75 mg de CMP-NANA (Cat. Núm. Roche 05974003103) disueltos en 100 jL de agua como sustrato donante y 10,5 jL de ST6GAL-1 (60 jg , Cat. Núm. Roche 07012250103, en agua). La mezcla se incubó a 37°C durante 6 horas y la reacción se detuvo por congelamiento a -15°C a -25°C. Este procedimiento se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. A continuación, el dímero D'D3-FP se purificó a partir de los reactivos mediante cromatografía utilizando SEC Superdex 200pg (GE Healthcare, Code 90­ 1002-10). La sialilación se determinó como se ha descrito anteriormente y los resultados se recogen en la Tabla 9.

Tabla 9: resultados de un estudio de sialilación in vitro

El grado de sialilación del material de partida se normalizó a un valor nominal de 100. El grado de sialilación tras la sialización in vitro fue sustancialmente mayor que el del material de partida.

Ejemplo 10: Cromatografía de intercambio aniónico para enriquecer los fragmentos de VWF altamente sialilados

El D'D3-FP preparado de acuerdo con el ejemplo 5 se purifica en forma adicional utilizando cromatografía de intercambio aniónico para reducir el contenido de estructuras de N-glicano asialo. Por lo tanto, la solución de D'D3-FP se diluye utilizando un tampón de 20 mM Tris x HCI pH 7,4 hasta una conductividad lo suficientemente baja como para permitir la unión completa del D'D3-FP a la columna (en general, por debajo de 5 mS/cm) y se carga en una columna de cromatografía (altura de llenado de aproximadamente 20 cm) llena de resina Poros XQ que se ha equilibrado utilizando un tampón de equilibrio que contiene 20 mM Tris x HCI, 20 mM NaCl pH 7,4. Tras lavar la columna con tampón de equilibrio, D'D3-FP se eluye utilizando un gradiente lineal plano desde el tampón de equilibrio hasta el tampón de elución (20 mM Tris x HCI, 500 mM NaCl pH 7,4). El pico de elución que contiene D'D3-FP se fracciona en aproximadamente 10 fracciones de volúmenes similares y se descartan las primeras fracciones de pico que contienen D'D3-FP con mayores cantidades de estructuras de N-glicano asialo y se agrupan las últimas fracciones de pico que contienen estructuras de N-glicano asialo por debajo del nivel deseado (por ejemplo, 20 % o menos).

Alternativamente, la ejecución de purificación de D'D3-FP se realiza con la diferencia de que la agrupación de las fracciones de picos de eluidos de D'D3-FP sólo se realiza para aquellas fracciones que contienen D'D3-FP con un contenido de estructura de N-glicano asialo menor quel 15% (o menor que 10%).

Como se ha descrito, mediante la agrupación de las fracciones correspondientes se pueden fabricar preparaciones adecuadas de D'D3-FP con un contenido máximo deseado de estructuras de N-glicanos asialo.

En base a los resultados obtenidos con un gradiente lineal utilizado para la elución, se pueden derivar gradientes de paso con tampones que contengan diferentes concentraciones de NaCl que también permitan la eliminación de las primeras fracciones con cantidades más altas de estructuras de N-glicanos asialo, dando así lugar a eluatos de D'D3-FP con un contenido menor que 15% de estructuras de N-glicanos asialo.

Ejemplo 11: Determinación de la afinidad del FVIII con el dímero y el monómero del fragmento del VWF

El monómero y el dímero de D'D3-FP se aislaron como se ha descrito anteriormente, y la afinidad del FVIII a estas preparaciones se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial a través de un instrumento Biacore (T200, GE Healthcare).

Un anticuerpo antialbúmina (MA1-20124, Thermo Scientific) se acopló covalentemente a través de su N-terminal a un chip CM 3 activado mediante NHS (N-Hidroxisuccinimida) y EDC (clorhidrato de etanolamina), ambos contenidos en el kit de acoplamiento de aminas (BR1000-50) de GE Healthcare. Para la inmovilización se diluyeron 3 pg/ml del anticuerpo en tampón de acetato de sodio (10 mM, pH 5,0) y la solución de anticuerpo se pasó sobre el chip durante 7 min. a un caudal de 10 pL/min. Tras el procedimiento de inmovilización, los filamentos de dextrano no acoplados se saturaron haciendo fluir una solución de etanolamina (1 M, pH 8,3) sobre el chip durante 5 minutos (a un caudal de 10 pl/min). El objetivo de saturar la celda de flujo era minimizar la unión inespecífica de los analitos al chip. Se preparó una celda de flujo de referencia saturando una celda de flujo vacía con etanolamina mediante el mismo procedimiento anterior.

Las proteínas D'D3-FP diméricas y monoméricas, respectivamente, se inmovilizaron al anticuerpo antialbúmina covalentemente acoplado mediante un flujo de las proteínas D'D3-FP (5 pg/ml) sobre el chip durante 3 min (tasa de flujo de 10 pL/min). La masa capturada de D'D3-FP dimérico fue de 335 RU y la de la D'D3-FP monomérica de 147 rU, ^{asumiendo un sitio de unión tanto en el monómero como en el dímero D'D3-FP para el FVIII.}

Para crear curvas de unión para el FVIII, cada preparación de proteína D'D3-FP se diluyó en tampón de funcionamiento (HBS-P+: 0.1 M HEPES, 1,5 M NaCl y 0,5% v/v Surfactant P20, pH 7,4; código de producto BR100671, GE Healthcare) a concentraciones de 0,25 nM, 0,5 nM, 1 nM, 3nM y 4 nM. Realizando una cinética de ciclo único, las muestras con concentraciones ascendentes de cada dilución fueron pasadas sobre el chip durante 2 min. (caudal 30pL/min.), seguido de un tiempo de disociación de 10 min. con el tampón de funcionamiento HBS-P+. Todas las mediciones se realizaron dos veces. La temperatura para el procedimiento de medición se ajustó a 25°C.

Los parámetros de unión se calcularon con el software BiaEvaluation. Los procedimientos de ajuste de curvas se basaron en las ecuaciones de Langmuir. Los datos de entrada para los cálculos fueron la masa molar del analito FVIII (rVIII-Cadena Sencilla), otros parámetros como RU máx. y las pendientes se extrajeron automáticamente de las curvas de asociación y disociación ajustadas. Las salidas del software BiaEvaluation son las constantes de velocidad de asociación y las constantes de velocidad de disociación, a partir de las cuales se calcularon las constantes de afinidad. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10: Datos de afinidad de rFVIII para dímero y monómero D'D3-FP

La constante de velocidad de asociación fue ligeramente mayor para el rVIII de Cadena Sencilla al D'D3-FP monomérico, mientras que la constante de velocidad de disociación del rVIII de Cadena Sencilla al dímero de D'D3-FP fue tres veces más lenta que al monómero. El cociente de la constante de velocidad de disociación y la constante de velocidad de asociación indica la afinidad del rVIII de Cadena Sencilla con D'D3-FP. Por lo tanto, el D'D3-FP dimérico muestra una mayor afinidad con el FVIII en comparación con el monómero D'D3-FP.

Ejemplo 12: Determinación cuantitativa de especies individuales de N-glicanos

Los N-Glicanos liberados por la PNGasa F se etiquetaron con un fluoróforo 2-aminobenzamida (AB) y se purificaron antes de su análisis utilizando LC-fluorescencia en línea - detección MS de alta resolución que permite la determinación cuantitativa simultánea y la identificación de los N-Glicanos marcados utilizando información precisa de masa y tiempo de retención. El uso de una columna LC HILIC/RP de modo mixto permitió la separación de los N-Glicanos liberados y marcados con AB en función de la carga y la estructura, lo que permitió una determinación cuantitativa de las diferentes estructuras de acuerdo con el número de residuos terminales de galactosa y no sialilados. La desviación estándar de la cuantificación de la fluorescencia utilizando el área bajo la curva resultó ser, en promedio, menor que 0,5% utilizando una muestra de referencia (n=5). La presencia de residuos de galactosa terminales y no sialilados en los N-glicanos etiquetados con AB separados se confirmó tratando los N-glicanos etiquetados con AB liberados con p1-4-Galactosidasa y volviéndolos a inyectar utilizando los mismos procedimientos LC-FLD-MS y analizando los picos desplazados.

Se aplicaron los siguientes procedimientos:

Liberación enzimática de glicanos por PNGasa F: Aproximadamente 700|jg de la proteína purificada se redujeron con DTT en bicarbonato de amonio, pH 8,5, a 60°C durante 30 minutos. La muestra reducida se enfrió a temperatura ambiente y se alquiló con yodoacetamida a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. La muestra alquilada se intercambió en tampón en bicarbonato de amonio 50mM pH 8,6 utilizando una columna Zeba Spin 7k MWCO de 2ml. A la muestra intercambiada con tampón, se añadieron 40U de PNGasa y se incubó la muestra a 37°C durante 14 horas. Se añadieron 40 U adicionales de PNGasa y se incubó la muestra durante otras 6 horas a 37°C . La muestra digerida con PNGasa se centrifugó a través de un ultrafiltro Amicon Ultra 4 de 50KDa. El filtrado se secó en un CentriVap.

Etiquetado con 2-AB de N-glicanos liberados:

El reactivo de etiquetado 2-AB se preparó siguiendo las instrucciones de fabricación. Se añadieron 50 jL del reactivo 2-AB a la muestra seca y se incubaron en la oscuridad a 65°C durante 3,5 horas.

Se acondicionó un cartucho SPE Oasis HLB 3cc 60 mg de Waters con 3 ml de acetonitrilo al 95%, 3ml de acetonitrilo al 35% y luego 3 ml de acetonitrilo al 95%. La muestra etiquetada con 2-AB se diluyó por la adición de 1,95 ml de acetonitrilo al 95% v/v y se cargó inmediatamente en el cartucho HLB y se dejó drenar por gravedad. La muestra se lavó por gravedad con 3x 3ml de acetonitrilo al 95% v/v y se eluyó con 3ml de acetonitrilo al 35% v/v. La muestra seca derivada del 2-AB se disolvió por la adición de 35 |jL de agua Milli Q y mezcla en vórtex. Tras la disolución, se añadieron 85 jL de acetonitrilo y se mezclaron brevemente. La muestra se transfirió a un vial de HPLC para su análisis.

Análisis de glicanos 2-AB:

La cromatografía líquida de alto rendimiento se llevó a cabo en un sistema Thermo Dionex Ultimate 3000 compuesto por una Bomba Binaria RS, un Automuestreador, un Compartimento de Columna RS y un Detector de Fluorescencia RS. La separación de los derivados de los glicanos 2-AB se realizó con una columna Dionex GlycanPac AXH-1, 1,9 jm , 2,1 x 150 mm (P/N 082472). La fase móvil A consistió en 100% de acetonitrilo, la fase móvil B consistió en ácido fórmico 50mM ajustado a pH 4,0 con solución de hidróxido de amonio 5M. La columna se mantuvo a 50° C y el caudal fue de 0,200 ml/min. La detección de fluorescencia se realizó con una longitud de onda de excitación de 320 nm y una longitud de onda de emisión de 420 nm.

El sistema LC-FLD se acopló a un TOF-MS ortogonal de alta resolución (MaXis, Bruker-Daltonik, Bremen, Germany). El capilar de transferencia se mantuvo a una tensión de -4500 V (modo de polaridad iónica positiva). El nebulizador se ajustó a 0,08 MPa utilizando el pulverizador ESI estándar (Bruker, Bremen, Germany), la temperatura del gas seco a 180°C y el caudal de gas seco a 7 L/min. La transferencia de iones se optimizó en el intervalo m/z 200-3000 para obtener la máxima sensibilidad, manteniendo la resolución R > 50.000 en todo el intervalo de masas. La calibración de masa del TOF-MS se realizó antes del experimento de LC-MS mediante la infusión directa de una dilución de 100 veces de ES Tuning Mix (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) a 4 ul/min.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir una glicoproteína que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado y que comprende N-glicanos con sialilación aumentada, en el que el VWF truncado es capaz de unión a un Factor VIII (FVIII),

- en el que el VWF truncado consiste en (a) aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9, o en (b) una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 90% con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9,

cuyo procedimiento comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende el VWF truncado, y (ii) cultivar dichas células a una temperatura menor que 36,0°C.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células comprenden además un ácido nucleico recombinante que codifica una sialiltransferasa, preferentemente una a-2,6-sialiltransferasa o una a-2,3-sialiltransferasa.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que antes de la etapa (ii) las células se cultivan a una temperatura de 37,0°C±1,0°C, y la etapa (ii) comprende el cultivo de las células a una temperatura de 34,0°C±2,0°C.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además (i) someter la glicoproteína obtenida en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores a una cromatografía de intercambio iónico, a través de la glicoproteína con alta sialilación se separa de la glicoproteína con baja sialilación; y recoger las fracciones eluidas de la columna de intercambio iónico con alta sialilación; o (ii) poner en contacto la glicoproteína obtenida en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico in vitro.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en promedio, al menos 75% de los N-glicanos de la glicoproteína obtenida comprenden al menos un resto de ácido siálico.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en promedio, al menos 50% de la glicoproteína obtenida está presente como dímero.

7. Una glicoproteína que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, en la que el VWF truncado consiste en (a) aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9 o (b) una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia de al menos 90% con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:9, en la que dicho VWF truncado es capaz de unión a un Factor VIII (FVIII), y en la que dicha glicoproteína comprende N-glicanos

i) en la que al menos 75%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 85% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido siálico y/o

ii) en la que menos de 35% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados y/o

iii) en el que menos de 6% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

8. La glicoproteína de la reivindicación 7, en la que al menos 70% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido a-2,6-sialico o al menos un resto de ácido a-2,3-sialico.

9. La glicoproteína de la reivindicación 7 u 8, que comprende además un polipéptido heterólogo que prolonga la semivida fusionado al VWF truncado, y/o un resto que prolonga la semivida conjugado con la glicoproteína.

10. La glicoproteína como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la glicoproteína es un dímero.

11. La glicoproteína dimérica de la reivindicación 10, en la que la afinidad de dicha glicoproteína dimérica con el FVIII es mayor que la afinidad de una glicoproteína monomérica con dicho FVIII, en la que dicha glicoproteína monomérica tiene la misma secuencia de aminoácidos que la glicoproteína dimérica.

12. Una composición farmacéutica que comprende la glicoproteína de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 y un excipiente aceptable para uso farmacéutico.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que al menos 50% de las glicoproteínas de la composición están presentes como dímeros.

14. Una glicoproteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 para su uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea, dicho tratamiento comprende administrar a un individuo una cantidad eficaz de dicha glicoproteína y una cantidad eficaz de un FVIII, en la que la glicoproteína se administra por vía intravenosa o subcutánea, y el FVIII se administra por vía intravenosa o subcutánea.

15. La glicoproteína para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la media de tiempo de residencia (MRT) del FVIII aumenta y/o la depuración del FVIII disminuye por la coadministración de la glicoproteína, en comparación con un tratamiento con el FVIII solo; y/o en la que la frecuencia de administración del FVIII se reduce en comparación con un tratamiento con el FVIII solo.

16. Un kit farmacéutico que comprende (i) un FVIII y (ii) una glicoproteína como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea.