CN107810194B - 用于制备经修饰的血管性血友病因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提供经修饰的血管性血友病因子(von Villebrand Factor，VWF)分子、其制备方法及其用途。本发明还提供用于治疗凝血障碍的药物组合物。

Description

用于制备经修饰的血管性血友病因子的方法

发明领域

本发明涉及用于改善凝血障碍治疗的产品和方法。

发明背景

存在由凝血因子缺陷引起的各种出血性障碍。最常见的障碍是血友病A和B，分别由凝血因子VIII(FVIII)和IX的缺陷引起。另一种已知的出血性障碍是血管性血友病(vonWillebrand's disease，VWD)。

在血浆中，FVIII主要作为血管性血友病因子(von Willebrand factor，VWF)的非共价复合物存在，其凝血功能是加速因子Ⅸa依赖性X因子转化为Xa。

经典血友病或血友病A是遗传性出血性障碍。它是由凝血FVIII的染色体X连锁缺陷引起的，几乎完全影响每10,000人发生的1至2个个体的男性。X染色体缺陷由本身不患血友病的女性携带者传播。血友病A的临床表现是出血倾向增加。

在进行预防性治疗的严重血友病A患者中，FVIII必须每周静脉内(i.v.)约3次施用，因为FVIII的血浆半衰期短，约12至14小时。每次i.v.施用麻烦，与疼痛相关，并且具有感染的风险，特别是因为这主要由患者自己或已被诊断患有血友病A的儿童的父母在家进行。

因此，非常希望增加FVIII的半衰期，使得含有这样的FVIII的药物组合物能够不必太过频繁地施用。

已经进行若干尝试以延长非活化的FVIII的半衰期：通过减少其与细胞受体的相互作用(WO 03/093313 A2、WO 02/060951 A2)，通过将聚合物共价连接到FVIII(WO 94/15625、WO 97/11957和US 4970300)，通过包封FVIII(WO 99/55306)，通过引入新的金属结合位点(WO 97/03193)，通过肽键(WO 97/40145和WO 03/087355)或二硫键(WO 02/103024A2)将A2结构域共价连接到A3结构域或通过将A1结构域共价连接到A2结构域(WO2006/108590)。

增强FVIII或VWF的功能半衰期的另一方法是通过FVIII的聚乙二醇化(WO 2007/126808、WO 2006/053299、WO 2004/075923)或通过VWF的聚乙二醇化(WO 2006/071801)。聚乙二醇化VWF增加的半衰期将间接地也增加存在于血浆中FVIII的半衰期。还已经描述了FVIII的融合蛋白(WO 2004/101740、WO2008/077616和WO 2009/156137)。

VWF(其在不同形式的血管性血友病(VWD)中缺失、功能缺陷或仅以减少量可用)是存在于哺乳动物血浆中的具有多种生理功能的多聚体粘附糖蛋白。在初期止血期间，VWF作为血小板表面上的特异性受体和细胞外基质成分如胶原蛋白之间的介质。此外，VWF作为促凝血因子FVIII的载体和稳定蛋白。VWF在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列和cDNA序列公开于Collins et al.1987,ProcNatl.Acad.Sci.USA 84:4393–4397中。前体多肽pre-pro-VWF由N-末端22个残基的信号肽、接着741个残基的肽原(pro-peptide)和成熟血浆VWF中发现的2050个残基的多肽组成(Fischer et al.,FEBS Lett.351:345-348,1994)。在内质网中的信号肽切割后，在VWF的两个单体之间形成C-末端二硫桥。在通过分泌途径的进一步运输期间，添加了12个N-连接和10个O-连接的碳水化合物侧链。更重要的是，VWF二聚体通过N-末端二硫桥多聚化，741个氨基酸长度的肽原在晚期高尔基体中被酶PACE/弗林蛋白酶切割掉。

一旦分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13可以在VWF的A1结构域内切割高分子量VWF多聚体。因此，血浆VWF由从500kDa的单个二聚体到由至多20多个分子量超过10,000kDa的二聚体组成的多聚体的全范围的多聚体组成。这里的VWF-HMWM具有最强的止血活性，可以在瑞斯托菌素辅因子活性(VWF:RCo)中测定。VWF:RCo/VWF抗原的比例越高，高分子量多聚体的相对量越高。

在血浆中，FVIII以高亲和力结合VWF，其保护其免于过早的清除，因此，除了其在初期止血中的作用外，起到稳定FVIII、调节FVIII血浆水平的关键作用，因此也是控制第二期止血的核心因素。结合VWF的非活化FVIII的半衰期在血浆中约为12至14小时。在3型血管性血友病中，不存在或几乎不存在VWF，FVIII的半衰期仅为约2至6小时，由于FVIII的浓度降低，导致这种患者的轻度至中度血友病A的症状。VWF对FVIII的稳定作用也已经用于帮助在CHO细胞中重组表达FVIII(Kaufman et al.1989,Mol Cell Biol 9:1233-1242)。

已经描述了VWF衍生的多肽(特别是VWF片段)用于在体外和体内稳定FVIII。WO2013/106787 A1涉及包含某些VWF片段和FVIII蛋白的嵌合蛋白。WO 2014/198699 A2和WO2013/083858 A2描述了VWF片段及其在治疗血友病中的用途。WO 2011/060242 A2公开了包含某些VWF片段和抗体Fc区的融合多肽。WO2013/093760 A2描述了一种制备蛋白质的方法，其包括用重组α-2,3-唾液酸转移酶共表达FVIII或VWF多肽，包括截短形式的VWF。Yee etal.(2014)Blood 124(3):445-452发现含有D'D3结构域的VWF片段足以稳定小鼠中的因子VIII。然而，尽管VWF D'D3-Fc融合蛋白在输注入FVIII-缺陷小鼠时显示出显著延长的存活，但是VWF D'D3-Fc融合蛋白没有延长共同输注的FVIII的存活。

Trummer等人(Biotech.Bioeng.(2006)Vol.94,No.6,p.1033-1044)研究了发酵温度对糖蛋白的唾液酸化水平的影响，他们发现对于促红细胞生成素，在30℃唾液酸化降低了40％而在33℃则降低了20％。

Ahn等人也研究了发酵温度对糖蛋白的唾液酸化水平的影响，并且对于促红细胞生成素发表了(Biotech.Bioeng.(2008)Vol.101,No.6,p.1234-1244)在37℃非唾液酸化糖蛋白的百分比为2.4％而在32℃则为2.1％。

存在增加FVIII和FVIII产物的半衰期而降低施用频率的方法的持续需要。

发明概述

本发明人已经发现，如果在降低的温度如低于36℃培养用编码VWF片段的重组DNA转染的哺乳动物细胞，可以显著提高VWF片段的N-聚糖的唾液酸化。以这种方式获得的产品表现出改善的药代动力学和延长的平均停留时间(MRT)，并且还可用于改善共同施用的FVIII的药代动力学和延长其MRT。本发明人已经发现，通过共同施用特征在于其N-聚糖的高度唾液酸化的半衰期延长的VWF衍生的多肽，可以显著降低FVIII的清除率。因此它们特别适用于治疗凝血障碍。特别是能够结合包含其中所有N-聚糖的超过75％平均具有至少一个唾液酸的N-聚糖的FVIII的VWF片段显示出特别有用。

如上所述的本发明方法的另一个优点是获得的VWF片段具有比以常规方式产生的VWF片段更高的二聚体比例。本发明人发现二聚体对FVIII的亲和力比单体更高。

在本发明的特别优选的实施方案中，本发明的VWF衍生的多肽可以连接到半衰期延长部分，并且其特征在于其N-聚糖的高度唾液酸化并且具有特定低量的具有多价末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖，包括特定低量的具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖，并且甚至更优选特定低量的具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖。

因此，本发明涉及以下实施方案[1]至[53]：

[1]产生包含具有增加的唾液酸化的N-聚糖的糖蛋白的方法，其包括(i)提供包含编码包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽的核酸的细胞，和(ii)在低于36.0℃的温度培养所述细胞，其中所述包含截短的VWF的多肽优选具有大于全长VWF的循环平均停留时间(MRT)。

[2]产生包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白的二聚体的方法，其包括(i)提供包含编码所述糖蛋白的氨基酸序列的核酸的细胞，和(ii)在低于36.0℃的温度培养所述细胞。

[3]增加包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白的二聚化的方法，其包括(i)提供包含编码所述糖蛋白的氨基酸序列的核酸的细胞，和(ii)在低于36.0℃的温度培养所述细胞。

[4]前述项中任一项的方法，其中所述细胞还包含编码唾液酸转移酶、优选α-2,6-唾液酸转移酶和/或α-2,3-唾液酸转移酶的重组核酸。

[5]前述项中任一项的方法，其中在步骤(ii)之前，在37.0℃±1.0℃的温度培养所述细胞，并且步骤(ii)包括在34.0℃±2.0℃的温度培养所述细胞。

[6]产生包含具有增加的唾液酸化的N-聚糖的糖蛋白的方法，其包括(i)提供包含编码包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽的核酸和编码α-2,6-唾液酸转移酶的重组核酸的细胞，以及(ii)在允许表达所述糖蛋白的条件下培养所述细胞。

[7]前述项中任一项的方法，其中所述细胞是转染的哺乳动物细胞，并且步骤(i)包括将编码包含截短的VWF的多肽的核酸和任选的编码唾液酸转移酶的重组核酸导入哺乳动物细胞。

[8]前述项中任一项的方法，其还包括从培养基中回收糖蛋白的步骤。

[9]前述项中任一项的方法，其还包括使前述项中任一项中获得的糖蛋白进行离子交换层析，由此将具有高唾液酸化的糖蛋白与具有低唾液酸化的糖蛋白分离；并收集从离子交换柱洗脱的具有高唾液酸化的级分。

[10]前述项中任一项的方法，其还包括使前述项中任一项中获得的糖蛋白与唾液酸转移酶和唾液酸供体体外接触。

[11]项[10]的方法，其中唾液酸转移酶是α-2,6-唾液酸转移酶、α-2,3-唾液酸转移酶或其组合。

[12]前述项中任一项的方法，其中所述糖蛋白还包含与截短的VWF融合的半衰期延长异源多肽。

[13]项[12]的方法，其中半衰期延长异源多肽包含或由选自以下的多肽组成：白蛋白或其长度为至少100个氨基酸的片段，免疫球蛋白恒定区及其部分，如Fc片段，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的C-末端肽，称为XTEN的具有大流体动力学体积的溶剂化随机链，同型氨基酸重复序列(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，白蛋白，α白蛋白(afamin)，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。

[14]项[1]至[11]中任一项的方法，包括将前述项中任一项中获得的糖蛋白与半衰期延长部分缀合。

[15]项[14]的方法，其中半衰期延长部分选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚唾液酸(PSA)和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链。

[16]前述项中任一项的方法，其中所获得的糖蛋白的至少75％的N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。

[17]前述项中任一项的方法，其中所获得的糖蛋白的至少80％的N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。

[18]前述项中任一项的方法，其中所获得的糖蛋白的至少85％的N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。

[19]前述项中任一项的方法，其中至少50％的所获得的糖蛋白平均以二聚体形式存在。

[20]通过前述任一项的方法能够获得的糖蛋白。

[21]包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，并且至少75％，优选至少85％，更优选至少90％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％，更优选至少99％的所述N-聚糖平均包含平均至少一个唾液酸部分。

[22]包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，其中小于35％，优选小于34％，优选小于33％，优选小于32％，优选小于31％，优选小于30％，优选小于29％，优选小于28％，优选小于27％，优选小于26％，优选小于25％，优选小于24％，优选小于23％，优选小于22％，优选小于21％，优选小于20％，优选小于19％，优选小于18％，优选小于17％，优选小于16％，优选小于15％，优选小于14％，优选小于13％，优选小于12％，优选小于11％，优选小于10％，优选小于9％，优选小于8％，优选小于7％，优选小于6％以及优选小于5％的所述N-聚糖平均包含两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基。

[23]根据项[21]和[22]的糖蛋白。

[24]包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，其中小于6％，优选小于5％，优选小于4％，优选小于3％，优选小于2％，以及优选小于1％的所述N-聚糖平均包含三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基。

[25]根据项[21]和[24]或根据项[22]和[24]或根据项[23]和[24]的糖蛋白。

[26]项[21]至[25]的糖蛋白，其中至少70％的所述N-聚糖平均包含至少一个α-2,6-唾液酸部分或一个α-2,3-唾液酸部分。

[27]项[20]至[26]中任一项的糖蛋白，其中截短的VWF包含(a)SEQ ID NO：9的氨基酸776至805或(b)与SEQ ID NO：9的氨基酸776至805具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

[28]项[20]至[27]中任一项的糖蛋白，其中截短的VWF包含(a)SEQ ID NO：9的氨基酸766至864或(b)与SEQ ID NO：9的氨基酸766至864具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

[29]项[20]至[28]中任一项的糖蛋白，其中截短的VWF由(a)SEQ ID NO：9的氨基酸764至1242，(b)与SEQ ID NO：9的氨基酸764至1242具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或(c)(a)或(b)的片段组成。

[30]项[20]至[29]中任一项的糖蛋白，其还包含与截短的VWF融合的半衰期延长异源多肽，和/或与糖蛋白缀合的半衰期延长部分。

[31]项[30]的糖蛋白，其中所述半衰期延长异源多肽包含人血清白蛋白或其片段或由其组成，其中所述片段的长度为至少100个氨基酸。

[32]项[30]的糖蛋白，其中与糖蛋白融合的所述异源多肽包含选自以下多肽或由其组成：免疫球蛋白恒定区及其部分，如Fc片段，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的C-末端肽，称为XTEN的具有大流体动力学体积的溶剂化随机链，同型氨基酸重复序列(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，白蛋白，α白蛋白，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。

[33]项[30]的糖蛋白，其中与糖蛋白缀合的所述半衰期延长部分选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚唾液酸(PSA)，弹性蛋白样多肽，肝素前体聚合物，透明质酸和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链。

[34]项[20]至[33]中任一项的糖蛋白，其中所述糖蛋白是二聚体。

[35]项[34]的二聚体糖蛋白，其中所述二聚体糖蛋白对FVIII的亲和力大于单体糖蛋白对所述FVIII的亲和力，其中所述单体糖蛋白具有与二聚体糖蛋白相同的氨基酸序列。

[36]项[20]至[35]中任一项的糖蛋白，其中所述截短的VWF具有相对于SEQ IDNO：9中所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸置换，其中具有所述一个或多个氨基酸置换的所述截短的VWF比由除了相对于SEQ ID NO：9的所述一个或多个氨基酸置换之外相同氨基酸序列组成的截短的VWF具有对FVIII更大的亲和力。

[37]项[36]的糖蛋白，其中所述糖蛋白对FVIII的亲和力大于参照多肽的亲和力，其中所述参照多肽的氨基酸序列与所述糖蛋白的氨基酸序列相同，除了参照多肽的截短的VWF的氨基酸序列不具有相对于SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的所述一个或多个置换。

[38]组合物，其包含项[20]至[37]中任一项中定义的糖蛋白的群，其中组合物中二聚体糖蛋白与单体糖蛋白的比例大于1.0，优选大于1.5，更优选大于2.0，最优选大于2.5。

[39]药物组合物，其包含项[20]至[37]中任一项所述的糖蛋白和药学上可接受的赋形剂。

[40]项[39]的药物组合物，其中组合物中至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％的糖蛋白以二聚体形式存在。

[41]项[20]至[37]中任一项所定义的糖蛋白，其用于治疗凝血障碍，所述治疗包括向受试者施用有效量的所述糖蛋白。

[42]根据项[41]所述的糖蛋白，其中所述治疗还包括向所述受试者施用有效量的FVIII。

[43]根据项[42]所述的糖蛋白，其中与单独使用FVIII的治疗相比，通过共同施用所述糖蛋白增加所述FVIII的血浆MRT和/或降低所述FVIII的清除率。

[44]根据项[42]或[43]所述的糖蛋白，其中与单独使用FVIII的治疗相比，降低FVIII的施用频率。

[45]根据项[42]至[44]中任一项所述的糖蛋白，其中静脉内施用所述糖蛋白和/或所述FVIII。

[46]根据项[42]至[44]中任一项所述的糖蛋白，其中皮下施用所述糖蛋白和/或所述FVIII。

[47]根据项[42]至[46]中任一项所述的糖蛋白，其中分开施用所述糖蛋白和所述FVIII。

[48]项[20]至[37]中任一项所定义的糖蛋白用于提高因子VIII的血浆MRT的用途。

[49]项[20]至[37]中任一项所定义的糖蛋白用于降低从循环中施用的FVIII的清除率的用途。

[50]项[48]或[49]的用途，其中所述因子VIII被外源性施用于患有血友病A的受试者。

[51]药盒，其包含(i)FVIII和(ii)项[20]至[37]中任一项所定义的糖蛋白，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血障碍。

[52]治疗凝血障碍的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如项[20]至[37]中任一项所定义的糖蛋白。

[53]延长外源性施用的FVIII的循环半衰期的方法，其包括共同施用项[20]至[37]中任一项的糖蛋白。

附图说明

图1：如实施例8.1中测定的，在大鼠中定量为白蛋白的D'D3-FP二聚体的平均停留时间和清除率(平均值)。

图2：如实施例8.1中测定的，在大鼠中定量为FVIII抗原的rVIII-SC的平均停留时间和清除率(平均值)。

图3：如实施例8.2中测定的，在大鼠中定量为白蛋白的D'D3-FP二聚体的平均停留时间和清除率(平均值)。

图4：如实施例8.2中测定的，在大鼠中定量为FVIII抗原的全长因子VIII的平均停留时间和清除率(平均值)。

图5：图6至25中所示的糖结构的图例

图6：显示中性N-聚糖的批号B-140526的概况

图7：显示单唾液酸N-聚糖的批号B-140526的概况

图8：显示二唾液酸N-聚糖的批号B-140526的概况

图9：显示三唾液酸N-聚糖的批号B-140526的概况

图10：显示四唾液酸N-聚糖的批号B-140526的概况

图11：显示中性N-聚糖的批号B-140616KS的概况

图12：显示单唾液酸N-聚糖的批号B-140616KS的概况

图13：显示二唾液酸N-聚糖的批号B-140616KS的概况

图14：显示三唾液酸N-聚糖的批号B-140616KS的概况

图15：显示四唾液酸N-聚糖的批号B-140616KS的概况

图16：显示中性N-聚糖的批号B-140825的概况

图17：显示单唾液酸N-聚糖的批号B-140825的概况

图18：显示二唾液酸N-聚糖的批号B-140825的概况

图19：显示三唾液酸N-聚糖的批号B-140825的概况

图20：显示四唾液酸N-聚糖的批号B-140825的概况

图21：显示中性N-聚糖的批号B-140623KS的概况

图22：显示单唾液酸N-聚糖的批号B-140623KS的概况

图23：显示二唾液酸N-聚糖的批号B-140623KS的概况

图24：显示三唾液酸N-聚糖的批号B-140623KS的概况

图25：显示四唾液酸N-聚糖的批号B-140623KS的概况

图26：比较样品B140526的具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的定量测定。第一列显示中性、单唾液酸、二唾液酸、三唾液酸和四唾液酸N-聚糖的所有N-聚糖的定量分布，加起来为100％。第二栏显示具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的百分比(涉及全部N-聚糖的100％)。在本样品中，仅检测到具有两个或多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的中性、单唾液酸和二唾液酸N-聚糖。第三栏显示具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的百分比(涉及全部N-聚糖的100％)。在本样品中，仅检测到具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的中性N-聚糖。

图27：根据本发明的样品B140616KS的具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的定量测定。第一列显示中性、单唾液酸、二唾液酸、三唾液酸和四唾液酸N-聚糖的所有N-聚糖的定量分布，加起来为100％。第二栏显示具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的百分比(涉及所有N-聚糖的100％)。在本样品中，仅检测到具有两个或多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的中性、单唾液酸和二唾液酸N-聚糖。第三栏显示具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的百分比(涉及全部N-聚糖的100％)。在本样品中，仅检测到具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的中性N-聚糖。

图28：根据本发明的样品B140825的具有两个或更多个末端和非唾液酸化的半乳糖残基的N-聚糖的定量测定。第一列显示中性、单唾液酸、二唾液酸、三唾液酸和四唾液酸N-聚糖的所有N-聚糖的定量分布，加起来为100％。第二栏显示具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的百分比(涉及全部N-聚糖的100％)。在本样品中，仅检测到具有两个或多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的中性、单唾液酸和二唾液酸N-聚糖。第三栏显示具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的百分比(涉及全部N-聚糖的100％)。在本样品中，仅检测到具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的中性N-聚糖。

图29：根据本发明的样品B140623KS的具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的定量测定。第一列显示中性、单唾液酸、二唾液酸、三唾液酸和四唾液酸N-聚糖的所有N-聚糖的定量分布，加起来为100％。第二栏显示具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的百分比(涉及所有N-聚糖的100％)。在本样品中，仅检测到具有两个或多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的中性、单唾液酸和二唾液酸N-聚糖。第三栏显示具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖的百分比(涉及全部N-聚糖的100％)。在本样品中，仅检测到具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的中性N-聚糖。

详述

在第一方面，本发明涉及产生包含唾液酸化N-聚糖的糖蛋白的方法，其包括(i)提供包含编码包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽的核酸的细胞，和(ii)在低于36.0℃的温度培养所述细胞。优选地，所产生的糖蛋白的N-聚糖具有增加的唾液酸化和/或高度的唾液酸化。

在第二方面，本发明涉及产生包含唾液酸化N-聚糖的糖蛋白的方法，其包括(i)提供包含编码包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽的核酸和编码α-2,3-唾液酸转移酶和/或α-2,6-唾液酸转移酶的重组核酸的细胞，和(ii)在允许糖蛋白和唾液酸转移酶表达的条件下培养细胞。优选地，所产生的糖蛋白的N-聚糖具有增加的唾液酸化和/或高唾液酸化。

如本文所用，术语“糖蛋白”是指包含一个或多个共价连接的寡糖链的蛋白质或多肽。寡糖链可以由单个无支链的糖残基链组成，或者可以由分支一次或多次的糖残基链组成。

“N-连接的聚糖”是与多肽的天冬酰胺残基共价连接的寡糖。这种N-连接聚糖上的末端半乳糖可以通过附接α-2,3-或α-2,6-连接的唾液酸进行修饰(如图5至25所示)。优选地，末端半乳糖是D-半乳糖。N-聚糖通常是分支的，并且可以是例如二触角、三触角或四触角型的，从而在一个N-聚糖中可以有两个、三个或四个末端半乳糖残基，其可以被唾液酸化成不同程度或全部非唾液酸化。“末端”是指从N-聚糖的附接点到本发明的糖蛋白的肽链在N-聚糖的给定分支中最远的位置。

术语“唾液酸”是指通常作为动物寡糖的末端单糖发现的神经氨酸的N-或O-取代的衍生物(综述参见Varkis(1992)Glycobiology vol.2no.1pp.25-40)。最常见的唾液酸是N-乙酰神经氨酸。“增加的唾液酸化”是指糖蛋白的至少75％的N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。作为非限制性实例，如本发明的实施例6中那样确定“增加至少75％的唾液酸化”，即通过从给定的目的糖蛋白中酶促切割所有N-聚糖，然后测定切割的无唾液酸的N-聚糖(“去唾液酸N-聚糖”)的量和全部切割的N-聚糖的总量。“至少75％的唾液酸化”则相应于去唾液酸N-聚糖的25％或更少的全部切割的N-聚糖的总量的量。

由于唾液酸化减少的糖蛋白与去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)结合，然后在受体介导的胞吞作用后最终降解，增加的唾液酸化对于维持给定的治疗性糖蛋白在循环中更长是重要的。

ASGP-R仅由实质肝细胞表达，每个细胞含有100,000-500,000个结合位点。这些受体随机分布在面向血液毛细血管的窦状质膜上。它们的主要功能是通过去唾液酸糖蛋白的识别、结合和胞吞作用来保持血浆糖蛋白稳态(Stokmaier等(2009)Bioorganic&MedicinalChemistry，7254-7264)。

人ASGP-R由两个同源的亚单位组成，分别命名为H1和H2，它们分别形成非共价异源寡聚体复合物，估计比例为2-5:1。这种ASGP-R复合物与暴露糖基结构的糖蛋白结合，其具有非唾液酸化末端D-半乳糖和N-乙酰-D-半乳糖胺残基。已经发现，糖结构与ASGP-R的结合亲和力强烈取决于配体的化合价。尽管单个D-半乳糖残基的亲和力仅在毫摩尔范围内，但二、三和四触角去唾液酸的聚糖分别以10^-6、5×10^-9和10^-9M的解离常数结合。

因此，在本发明的特别优选的实施方案中，特征在于其N-聚糖的高度唾液酸化的本发明的糖蛋白具有特定低量的具有多价末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖，包括特定低量的具有两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖，甚至更优选特定低量的具有三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基的N-聚糖。

在第一步中，本发明的方法包括提供包含编码包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽的核酸的细胞的步骤。

截短的VWF

本文所用的术语“血管性血友病因子”(VWF)不仅包括天然存在的(天然的)VWF，还包括至少保持天然存在的VWF的FVIII结合活性的变体，例如，其中一个或多个残基被插入、缺失或置换的序列变体。通过实施例11中所述的FVIII-VWF结合测定确定FVIII结合活性。

根据本发明的优选VWF是由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列所表示的人VWF。编码SEQ ID NO：9的cDNA示于SEQ ID NO：8。

编码人天然VWF的基因转录成9kb的mRNA，其翻译成2813个氨基酸的前多肽原(pre-propolypeptide)，估计分子量为310,000Da。前多肽原含有N-末端22个氨基酸的信号肽、接着741个氨基酸的多肽原(pro-polypeptide)(SEQ ID NO：9的氨基酸23-763)和成熟亚单位(SEQ ID NO：9的氨基酸764-2813)。从N-末端切割741个氨基酸的多肽原得到由2050个氨基酸组成的成熟VWF。人天然VWF前多肽原的氨基酸序列示于SEQ ID NO：9。除非另有说明，否则本申请中VWF残基的氨基酸编号参考SEQ ID NO：9，即使VWF分子没有包含SEQ IDNO：9的所有残基。

天然VWF的多肽原包含多个结构域。在文献中可以找到不同的结构域注释(参见例如Zhou et al.(2012)Blood 120(2):449-458)。本申请中应用了VWF的天然前多肽原的以下结构域注释：

D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK

参考SEQ ID NO：9，D'结构域由氨基酸764-865组成；D3结构域由氨基酸866-1242组成。

特征“截短”是指多肽不包含成熟VWF的全部氨基酸序列(SEQ ID NO：9的氨基酸764-2813)。通常，截短的VWF不包含SEQ ID NO：9的所有氨基酸764-2813，而仅包含其片段。截短的VWF也可以被称为VWF片段，或者为复数形式的VWF片段。

通常，截短的VWF能够结合因子VIII。优选地，截短的VWF能够结合成熟形式的人天然因子VIII。在另一实施方案中，截短的VWF能够结合由氨基酸序列SEQ ID NO：10组成的单链因子VIII。可以通过实施例11中所述的FVIII-VWF结合测定来确定截短的VWF与因子VIII的结合。

本发明的截短的VWF优选包含与SEQ ID NO：9的氨基酸776至805具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够结合FVIII。在优选实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO：9的氨基酸776至805具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO：9的氨基酸776至805或由其组成。除非另有说明，否则在参照序列(例如SEQID NO：9的氨基酸776至805)的整个长度上确定序列同一性。

本发明的截短的VWF优选包含与SEQ ID NO：9的氨基酸766至864具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够结合FVIII。在优选实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO：9的氨基酸766至864具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO：9的氨基酸766至864或由其组成。

在另一优选实施方案中，截短的VWF由(a)与SEQ ID NO：9的氨基酸764至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。更优选地，截短的VWF由(a)与SEQ ID NO：9的氨基酸764至1242具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF由(a)SEQ ID NO：9的氨基酸764至1242或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。

如下面更详细描述的，本发明的方法包括提供包含编码包含截短的VWF的多肽的核酸的细胞。通过本身已知的技术将核酸引入合适的宿主细胞中。

在优选实施方案中，宿主细胞中的核酸编码(a)与SEQ ID NO：9的氨基酸1至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的成熟VWF仍然能够结合FVIII。更优选地，所述核酸编码(a)与SEQ ID NO：9的氨基酸1至1242具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。最优选地，核酸编码(a)SEQ ID NO：9的氨基酸1至1242，或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。特别是如果最终产生的糖蛋白是二聚体，则核酸将包含编码VWF(例如SEQ ID NO：9)的氨基酸1至763的序列，即使糖蛋白中的截短的VWF不包含VWF(例如SEQ ID NO：9)的氨基酸1至763。

在其他实施方案中，截短的VWF包含以下氨基酸序列之一或由其组成，每个氨基酸序列均参考SEQ ID NO：9：

776-805；766-805；764-805；776-810；766-810；764-810；776-815；766-815；764-815；

776-820；766-820；764-820；776-825；766-825；764-825；776-830；766-830；764-830；

776-835；766-835；764-835；776-840；766-840；764-840；776-845；766-845；764-845；

776-850；766-850；764-850；776-855；766-855；764-855；776-860；766-860；764-860；

776-864；766-864；764-864；776-865；766-865；764-865；776-870；766-870；764-870；

776-875；766-875；764-875；776-880；766-880；764-880；776-885；766-885；764-885；

776-890；766-890；764-890；776-895；766-895；764-895；776-900；766-900；764-900；

776-905；766-905；764-905；776-910；766-910；764-910；776-915；766-915；764-915；

776-920；766-920；764-920；776-925；766-925；764-925；776-930；766-930；764-930；

776-935；766-935；764-935；776-940；766-940；764-940；776-945；766-945；764-945；

776-950；766-950；764-950；776-955；766-955；764-955；776-960；766-960；764-960；

776-965；766-965；764-965；776-970；766-970；764-970；776-975；766-975；764-975；

776-980；766-980；764-980；776-985；766-985；764-985；776-990；766-990；764-990；

776-995；766-995；764-995；776-1000；766-1000；764-1000；776-1005；766-1005；764-1005；

776-1010；766-1010；764-1010；776-1015；766-1015；764-1015；776-1020；766-1020；764-1020；

776-1025；766-1025；764-1025；776-1030；766-1030；764-1030；776-1035；766-1035；764-1035；

776-1040；766-1040；764-1040；776-1045；766-1045；764-1045；776-1050；766-1050；764-1050；

776-1055；766-1055；764-1055；776-1060；766-1060；764-1060；776-1065；766-1065；764-1065；

776-1070；766-1070；764-1070；776-1075；766-1075；764-1075；776-1080；766-1080；764-1080；

776-1085；766-1085；764-1085；776-1090；766-1090；764-1090；776-1095；766-1095；764-1095；

776-1100；766-1100；764-1100；776-1105；766-1105；764-1105；776-1110；766-1110；764-1110；

776-1115；766-1115；764-1115；776-1120；766-1120；764-1120；776-1125；766-1125；764-1125；

776-1130；766-1130；764-1130；776-1135；766-1135；764-1135；776-1140；766-1140；764-1140；

776-1145；766-1145；764-1145；776-1150；766-1150；764-1150；776-1155；766-1155；764-1155；

776-1160；766-1160；764-1160；776-1165；766-1165；764-1165；776-1170；766-1170；764-1170；

776-1175；766-1175；764-1175；776-1180；766-1180；764-1180；776-1185；766-1185；764-1185；

776-1190；766-1190；764-1190；776-1195；766-1195；764-1195；776-1200；766-1200；764-1200；

776-1205；766-1205；764-1205；776-1210；766-1210；764-1210；776-1215；766-1215；764-1215；

776-1220；766-1220；764-1220；776-1225；766-1225；764-1225；776-1230；766-1230；764-1230；

776-1235；766-1235；764-1235；776-1240；766-1240；764-1240；776-1242；766-1242；764-1242；

764-1464；764-1250；764-1041；764-828；764-865；764-1045；764-1035；764-1128；764-1198；

764-1268；764-1261；764-1264；764-1459；764-1463；764-1464；764-1683；764-1873；764-1482；

764-1479；764-1672；和764-1874。

在某些实施方案中，截短的VWF相对于成熟野生型VWF具有内部缺失。例如，可以缺失A1，A2，A3，D4，C1，C2，C3，C4，C5，C6结构域或其组合，并保留D'结构域，D3结构域和CK结构域。在进一步的实施方案中，截短的VWF不包含血小板糖蛋白Ibα(GPIbα)，胶原和/或整联蛋白αIIbβIII(C1结构域内的RGDS序列)的结合位点。在其他实施方案中，截短的VWF不包含位于VWF的中心A2结构域的ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)。在另一个实施方案中，截短的VWF不包含GPIbα的结合位点和/或不包含胶原的结合位点和/或不包含整联蛋白αIIbβIII的结合位点和/或不包含其位于VWF中心A2结构域的ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)。

在其它实施方案中，截短的VWF包含与前一段所述的氨基酸序列之一具有至少90％，或至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，条件是截短的VWF能够与FVIII结合。

如果糖蛋白的两个单体共价连接，则该糖蛋白被称为本发明的“二聚体”。优选地，两个单体亚单位通过至少一个二硫桥共价连接，例如一个，二个，三个或四个二硫桥。形成至少一个二硫桥的半胱氨酸残基优选位于糖蛋白的截短的VWF部分内。在一个实施方案中，这些半胱氨酸残基为Cys-1142，Cys-1222，Cys-1225，Cys-1227及其组合。

如果糖蛋白是二聚体，则截短的VWF优选包含两个多肽或由其组成，每个多肽具有与SEQ ID NO：9的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，或氨基酸764至1227具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且能够结合FVIII。在优选实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO：9的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，或氨基酸764至1227具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO：9的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，或氨基酸764至1227或由其组成。

截短的VWF可以是WO 2013/106787 A1，WO 2014/198699 A2，WO 2011/060242 A2或WO 2013/093760 A2中公开的VWF片段中的任一种，其公开内容通过引用并入本文。

多肽的进一步组分

除截短的VWF之外，糖蛋白可以还包含半衰期延长部分。半衰期延长部分可以是与截短的VWF融合的异源氨基酸序列。或者，半衰期延长部分可以通过不同于肽键的共价键与包含截短的VWF的多肽化学偶联。

在本发明的某些实施方案中，糖蛋白的半衰期通过化学修饰来延长：如半衰期延长部分例如聚乙二醇(PEG化)，糖基化PEG，羟乙基淀粉(HES化)，聚唾液酸，弹性蛋白样多肽，肝素前体聚合物或透明质酸的附接。在另一个实施方案中，糖蛋白通过化学接头与HLEP例如白蛋白缀合。Conjuchem LLC已经以示例性方式描述了这种缀合技术的原理(参见例如美国专利号7,256,253)。

在其它实施方案中，半衰期延长部分是半衰期增强蛋白(HLEP)。优选地，HLEP是白蛋白或其片段。白蛋白的N-末端可以与截短的VWF的C-末端融合。或者，白蛋白的C-末端可以与截短的VWF的N-末端融合。一个或多个HLEP可以融合到VWF的N-或C-末端部分，条件是它们不干扰或消除截短的VWF与FVIII的结合能力。

在一个实施方案中，多肽具有以下结构：

tVWF-L1-H,[式1]

其中tVWF是截短的VWF，L1是化学键或者接头序列，而H是HLEP。

L1可以是化学键或由一个或多个氨基酸组成的接头序列，例如1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸，并且可以彼此相同或不同。通常，接头序列不存在于野生型VWF中的相应位置。存在于L1中的合适的氨基酸的实例包括Gly和Ser。接头应该是非免疫原性的并且可以是不可切割的或可切割的接头。不可切割的接头可以包括WO2007/090584中举例说明的交替的甘氨酸和丝氨酸残基。在本发明的另一个实施方案中，截短的VWF部分和白蛋白部分之间的肽接头由肽序列组成，其用作人蛋白质中的天然结构域间接头。优选地，其天然环境中的此类肽序列位于蛋白质表面附近，并且可被免疫系统接近，使得可以假定对该序列具有天然耐受性。实例在WO2007/090584中给出。可切割的接头序列描述于例如WO 2013/120939 A1中。

下文描述了优选的HLEP序列。本发明同样包括对相应HLEP的确切的“N-末端氨基酸”的融合，或与相应HLEP的“N-末端部分”的融合，其包括HLEP的一个或多个氨基酸的N-末端缺失。多肽可以包含多于一个HLEP序列，例如两个或三个HLEP序列。这些多个HLEP序列可以串联融合到VWF的C-末端部分，例如作为连续重复序列。

在本发明的另一实施方案中，本发明的复合物的半衰期通过化学修饰来延长，如半衰期延长部分例如聚乙二醇(PEG化)，糖基化PEG，羟乙基淀粉(HES化)，聚唾液酸，弹性蛋白样多肽，肝素前体聚合物或透明质酸的附接。在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白通过化学接头与HLEP例如白蛋白缀合。Conjuchem LLC已经以示例性方式描述了这种缀合技术的原理(参见例如美国专利号7,256,253)。

半衰期增强多肽(HLEP)

优选地，半衰期延长部分是半衰期延长多肽(HLEP)，更优选HLEP选自白蛋白或其片段，免疫球蛋白恒定区及其部分，例如Fc片段，具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(例如XTEN(Schellenberger et al.2009；Nature Biotechnol.27:1186-1190)，同型氨基酸重复序列(HAP)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，α白蛋白，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，转铁蛋白或其变体，人绒毛膜促性腺激素-β亚单位的羧基末端肽(CTP)，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽或脂质。

本文使用的“半衰期增强多肽”优选选自白蛋白，白蛋白家族成员，免疫球蛋白G的恒定区及其片段，能够在生理条件下与白蛋白、白蛋白家族的成员以及免疫球蛋白恒定区的部分结合的区域和多肽。它可以是本文所述的全长半衰期增强蛋白(例如白蛋白，白蛋白家族成员或免疫球蛋白G的恒定区)或其一个或多个片段，其能够稳定或延长治疗活性或凝血因子的生物活性。这样的片段长度可以是来自HLEP片段的10个或更多个氨基酸，或者可以包括至少约15个，至少约20个，至少约25个，至少约30个，至少约50个，至少约100个或更多个连续氨基酸，或者可以包括HLEP序列的部分或全部，只要与没有HLEP的相应多肽相比，HLEP片段提供至少25％的功能性半衰期延长。

糖蛋白的HLEP部分可以是野生型HLEP的变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入、缺失和置换，其中此类改变基本上不改变截短的VWF的FVIII-结合活性。

特别地，本发明的所提出的截短的VWF HLEP融合构建体可以包括HLEP的天然存在的多态性变体和HLEP片段。HLEP可以衍生自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人，猴，牛，羊或猪。非哺乳动物HLEP包括但不限于母鸡和鲑鱼。

白蛋白作为HLEP

术语“人血清白蛋白”(HSA)和“人白蛋白”(HA)和“白蛋白”(ALB)在本申请中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”较宽，并且包括人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。

如本文所用，“白蛋白”统称为白蛋白多肽或氨基酸序列，或白蛋白片段或变体，其具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如生物活性)。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段，特别是本文SEQ ID NO：11所示的成熟形式的人白蛋白或其他脊椎动物或其片段的白蛋白，或这些分子或其片段的类似物或变体。

特别地，本发明的所提出的截短的VWF融合构建体可以包括天然存在的人白蛋白的多态性变体和人白蛋白的片段。一般而言，白蛋白片段或变体将为至少10个，优选至少40个，最优选多于70个氨基酸长。

本发明的优选实施方案包括具有增强的与FcRn受体结合的白蛋白变体。与具有野生型白蛋白融合的截短的VWF相比，这种白蛋白变体可能导致截短的VWF白蛋白变体融合蛋白的更长的血浆半衰期。

本发明的所提出的VWF融合构建体的白蛋白部分可以包含HA的至少一个亚结构域或结构域或其保守修饰。

免疫球蛋白作为HLEP

免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)是本领域已知的以增加治疗性蛋白质的半衰期(Dumont J A et al.2006.BioDrugs 20:151-160)。IgG的重链恒定区由3个结构域(CH1-CH3)和铰链区组成。免疫球蛋白序列可以衍生自任何哺乳动物，或分别衍生自亚类IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。没有抗原结合结构域的IgG和IgG片段也可以用作HLEP。治疗性多肽部分优选经由抗体的铰链区或甚至可以是可切割的肽接头连接到IgG或IgG片段。几项专利和专利申请描述了治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区的融合，以增强治疗性蛋白质的体内半衰期。US 2004/0087778和WO 2005/001025描述了Fc结构域或免疫球蛋白恒定区的至少部分与生物活性肽的融合蛋白具有增加肽的半衰期，否则其将在体内快速清除。描述了Fc-IFN-β融合蛋白，其实现了增强的生物活性，延长的循环半衰期和更大的溶解性(WO 2006/000448)。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内效力的Fc-EPO蛋白(WO 2005/063808)以及Fc与G-CSF(WO 2003/076567)，胰高血糖素样肽-1(WO 2005/000892)，凝血因子(WO 2004/101740)和白介素-10(美国专利号6,403,077)的融合，均具有半衰期增强特性。

根据本发明可以使用的各种HLEP在WO 2013/120939 A1中详细描述。

核酸

编码待表达的多肽的核酸可以根据本领域已知的方法制备。基于VWF的cDNA序列(SEQ ID NO：8)，可以设计并产生编码上述截短的VWF构建体的重组DNA。

即使由宿主细胞分泌的糖蛋白不包含VWF的氨基酸1至763，优选编码糖蛋白的细胞内前体的核酸(例如DNA)包含编码与SEQ ID NO：9的氨基酸23至763或优选氨基酸1至763具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。最优选地，编码糖蛋白的细胞内前体的核酸(例如DNA)包含编码SEQ ID NO：9的氨基酸23至763或SEQ ID NO：9的氨基酸1至763的核苷酸序列。

可以使用其中DNA含有以正确取向插入表达质粒的整个开放阅读框的构建体用于蛋白质表达。典型表达载体含有指导对应于携带质粒细胞中插入核酸的大量mRNA的合成的启动子。它们还可以包括允许其在宿主生物体内自主复制的复制序列的起点，以及提高合成mRNA翻译效率的序列。稳定的长期载体可以通过使用例如病毒的调节元件(例如，来自EB病毒基因组的OriP序列)维持为自由复制的实体。还可以产生已将载体整合到基因组DNA中的细胞系，并且以这种方式，基因产物是连续生产的。

通常，通过将编码包含截短的VWF的多肽的核酸引入哺乳动物宿主细胞来获得待提供的细胞。

宿主细胞

根据本发明可以使用对细胞培养和糖蛋白的表达敏感的任何宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC No：85110503)；人视网膜成纤维细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293细胞或亚克隆用于生长在悬浮培养物中的293细胞，Graham etal.，J.GenVirol.，36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243 251,1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather etal.,Annals NY.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；PS4细胞；人羊水细胞(CAP)；和人肝细胞系(Hep G2)。优选地，细胞系是啮齿动物细胞系，特别是CHO或BHK的仓鼠细胞系。

适于引入足以实现哺乳动物宿主细胞中目的糖蛋白表达的核酸的方法是本领域已知的。参见，例如，Gething et al.,Nature,293:620-625,1981；Mantei et al.,Nature,281:40-46,1979；Levinson et al.EP 117,060；和EP 117,058。对于哺乳动物细胞，将遗传物质引入哺乳动物细胞的常用方法包括Graham和van der Erb的磷酸钙沉淀法(Virology,52:456-457,1978)或Hawley-Nelson的lipofectamine^TM(Gibco BRL)方法(Focus 15:73,1993)。Axel在美国专利号4,399,216中已经描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面。对于将遗传物质引入哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown et al.,Methods inEnzymology,1989,Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537,1990,和Mansouret al.,Nature,336:348-352,1988。

培养细胞

在第二步中，本发明第一方面的方法包括在低于36.0℃的温度培养细胞。在第二方面的方法中，该方法包括在允许糖蛋白表达的条件下培养细胞。

选择用于培养宿主细胞系的基础培养基对于本发明不是关键的，并且可以是本领域已知的适用于培养哺乳动物细胞的那些中的任一种或其组合。诸如Dulbecco's改良的Eagle培养基，Ham's F-12培养基，Eagle's最小必需培养基和RPMI-1640培养基等培养基是可以商购获得的。生长因子例如重组胰岛素的添加是可选的。在一个实施方案中，所述培养基是完全不含任何蛋白质或至少不含任何不是重组产生的蛋白质的意义上的“无蛋白质”。人血清白蛋白可以用作产生糖蛋白的无血清培养补充物。优选地，培养基含有蛋白酶抑制剂，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂，其适于组织培养并且是合成或植物来源的。

通常，本发明可以与任何适合于糖蛋白表达的细胞培养方法一起使用。例如，细胞可以分批培养或分批补料培养，其中在充分表达糖蛋白后终止培养，之后收获表达的糖蛋白。或者，细胞可以连续培养(例如灌注培养)的方式生长，其中培养是不终止的，并且新的营养物质和其它成分被周期性地或连续地添加到培养物中，在此期间周期性地或连续地收获表达的糖蛋白。如果该方法包括如下所述的温度变换，那么后一个实施方案是优选的。培养可以是任何常规类型的培养，如分批、补料分批或连续培养，但优选连续培养。合适的连续培养包括灌注培养。

细胞可以以从业者选择的任何方便的体积生长。例如，细胞可以在体积从几毫升到几升的小规模反应容器中生长。或者，细胞可以在体积从大约至少1升至10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更多或这之间的任何体积的大规模商用生物反应器中生长。培养通常在生物反应器中进行，所述生物反应器通常为1(一)至10000(万)升例如5、10、50、100、1000、2500、5000或8000升容量的不锈钢、玻璃或塑料容器。容器通常是刚性的，但是可以使用柔性塑料袋，特别是用于较小体积。这些通常是“一次性”类型。

哺乳动物细胞例如CHO和BHK细胞通常作为悬浮培养物进行培养。也就是说，细胞悬浮在培养基中，而不是粘附在固体支持物上。或者可以将细胞固定在载体上，特别是微载体上。多孔载体如

或

可能特别合适。

为了获得高唾液酸化，细胞(例如CHO细胞)优选在降低的温度例如在低于36.0℃培养。“降低的温度”是指低于用于相应细胞系生长的最佳温度或正常温度的温度。对于大多数哺乳动物细胞，正常温度是37℃。因此，根据本发明优选在30.0至36.0℃，30.5至35.5℃，31.0至35.0℃，31.5至34.5℃，32.0至34.0℃或32.5至33.5℃的降低的温度培养细胞(例如CHO细胞)。优选地，在30.0℃±1.0℃，31.0℃±1.0℃，32.0℃±1.0℃，33.0℃±1.0℃，34.0℃±1.0℃，或35.0℃±1.0℃的降低的温度培养细胞。

降低的温度保持足以增加待表达的糖蛋白的唾液酸化的时间段。优选地，降低的温度保持至少1小时，至少6小时，至少12小时，至少18小时，至少24小时，至少48小时，至少72小时，至少96小时，至少120小时，或至少144小时。在其他实施方案中，降低的温度保持1小时至8周，6小时至6周，12小时至5周，18小时至4周，24小时至3周，48小时至14天，72小时至10天，或3至7天。

为了实现这一点，培养过程中培养物可能经历一次或多次温度变换。当变换培养物的温度时，温度变换可能是相对渐进的。例如，完成温度改变可能需要几个小时或几天的时间。或者，温度变换可能相对突然。在培养过程中温度可以稳定地增加或降低。或者，温度可以在培养过程中的不同时间以不连续的量增加或减少。随后的温度或温度范围可以低于或高于初始或先前的温度或温度范围。本领域普通技术人员将理解，在该实施方案中包含多个不连续的温度变换。例如，温度可以变换一次(变换至较高或较低的温度或温度范围)，细胞保持在该温度或温度范围一段时间，之后温度可以再次变换至新的温度或温度范围，其可以为高于或低于之前温度或温度范围的温度或温度范围。每次不连续的变换后培养物的温度可以是恒定的，或者可以保持在一定的温度范围内。

典型地，细胞(例如CHO细胞)将首先在37.0℃±1.0℃的“正常”温度培养，直到达到靶细胞密度。最初的培养期之后是温度变换至降低的温度。在降低的温度培养一段时间之后，温度可能会或可能不会变换至正常温度。优选地，细胞(例如CHO细胞)最初在37.0℃±1.0℃下培养几天，然后在31.0-35.0℃的降低的温度制造。

基于本公开内容，本领域普通技术人员将能够根据相应细胞系的特定需求和从业者的特定生产要求来选择细胞生长的温度。

在某些实施方案中，一旦表达的糖蛋白达到足够高的滴度，分批和补料分批生物反应器终止。另外地或可选地，一旦细胞达到足够高的密度(如由从业者的需求所确定)，分批和分批补料生物反应器可以终止。例如，一旦细胞达到1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％的最大活细胞密度，培养物可以终止。另外地或可选地，分批和分批补料生物反应器可以在代谢废物如乳酸盐和铵的过量累积之前终止。

在某些情况下，在随后的产生阶段过程中给细胞培养物补充可能已经被细胞消耗或代谢的营养物质或其他培养基成分是有益的。作为非限制性实例，给细胞培养物补充激素和/或其它生长因子，无机离子(例如钠离子，氯离子，钙离子，镁离子和磷酸盐)，缓冲剂，维生素，核苷或核苷酸，微量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)，氨基酸，脂质或葡萄糖或其它能量来源可能是有益的。这些补充成分可以全部一次添加到细胞培养物中，或者它们可以一系列添加物的形式提供给细胞培养物，或者它们可以在灌注培养过程中与新鲜培养基一起提供。

作为分批和分批补料生物反应器的替代，本发明也可以在连续灌注生物反应器中培养表达本发明的糖蛋白的细胞时实施。

本领域普通技术人员将能够调整特定细胞培养条件以优化细胞培养物的某些特征，包括但不限于生长速率，细胞活力，细胞培养物的最终细胞密度，有害代谢副产物例如乳酸盐和铵的最终浓度，表达的糖蛋白的滴度，寡糖侧链的程度和组成，或者从业者认为重要的这些或者其他条件的任何组合。

分离表达的糖蛋白

一般而言，通常希望分离和/或纯化根据本发明表达的糖蛋白。在某些实施方案中，表达的糖蛋白分泌到培养基中，因此作为纯化过程中的第一步，可以通过例如离心或过滤除去细胞和其它固体。

可以通过包括但不限于层析(例如离子交换层析，亲和层析，尺寸排阻层析和羟基磷灰石层析)，凝胶过滤，离心或差别溶解度，乙醇沉淀和/或通过任何其他可用于纯化蛋白质的技术(参见例如，Scopes,Protein Purification Principles and Practice 2ndEdition,Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.and Hames,B.D.(eds.),Protein Expression:A Practical Approach,Oxford Univ Press,1999；and Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(eds.),Guide to Protein Purification:Methods inEnzymology(Methods in Enzymology Series,Vol.182),Academic Press,1997，其中的每一个通过引用并入本文)分离和纯化表达的糖蛋白。特别是对于免疫亲和层析，糖蛋白可以通过将其与包含针对该糖蛋白产生并固定到固定支持物上的抗体的亲和柱结合而分离。或者，可以通过标准重组技术将亲和标签(如流感包膜序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶)连接至糖蛋白，以允许通过合适的亲和柱进行容易的纯化。蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟(PMSF)，亮抑蛋白酶肽，胃酶抑素或抑蛋白酶多肽可以在任何阶段或所有阶段添加以减少或消除纯化过程中糖蛋白的降解。当细胞必须被裂解以分离和纯化表达的糖蛋白时，蛋白酶抑制剂是特别有利的。另外地或可替代地，糖苷酶抑制剂可以在任何阶段或所有阶段添加以减少或消除共价连接的寡糖链的酶促修整(trimming)。在本申请的实施例5中描述了优选的纯化方法。

根据本发明表达的糖蛋白与在传统细胞培养条件下生长的情况相比，具有更充分的唾液酸化作用。因此，可以在纯化步骤中利用的本发明的一个实际益处在于，根据某些本发明方法生长的糖蛋白上的另外的和/或改变的唾液酸残基可赋予其不同的生物化学性质，比根据更传统方法生长的糖蛋白可能被从业者用来更容易地纯化糖蛋白，或者纯化至更高纯度。例如，利用唾液酸残基的负电荷，糖蛋白可以通过阴离子交换层析纯化或极大地富集。从而可以进一步富集具有高唾液酸化作用的糖蛋白。

在另一个实施方案中，通过本发明的方法获得的糖蛋白的唾液酸化可以通过使糖蛋白与唾液酸转移酶在体外接触而进一步增加。唾液酸转移酶通常是哺乳动物唾液酸转移酶，优选它是人唾液酸转移酶。唾液酸转移酶可以是α-2,3-唾液酸转移酶和/或α-2,6-唾液酸转移酶。优选地，唾液酸转移酶是人α-2,3-唾液酸转移酶(Genbank NP_775479-ST3GAL1)和/或人α-2,6-唾液酸转移酶。最优选地，唾液酸转移酶是由Genbank NP_003023-ST6GAL1确定的人α-2,6-唾液酸转移酶。进一步存在于体外反应中的是唾液酸基供体或唾液酸供体。合适的供体包括例如胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-NANA)，Roche目录号05974 003 103。用于体外唾液酸化的合适的试剂盒可从Roche获得(目录号07 012 250103)。

本领域的普通技术人员将会理解，确切的纯化技术将根据待纯化的糖蛋白的特征、表达糖蛋白的细胞的特征和/或其中细胞生长的培养基的组成而变化。

如上所述，在第二方面，本发明涉及产生包含具有增加的唾液酸化的N-聚糖的糖蛋白的方法，其包括(i)提供包含编码包含截短的血管性血友病因子(VWF)和编码α-2,3-唾液酸转移酶和/或α-2,6-唾液酸转移酶、优选α-2,6-唾液酸转移酶的重组核酸的细胞，和(ii)在允许表达糖蛋白的条件下培养所述细胞。

α-2,3-唾液酸转移酶优选为人α-2,3-唾液酸转移酶。编码人α-2,3-唾液酸转移酶的cDNA序列显示在SEQ ID NO：12中，并且基于此，本领域技术人员可以设计含有α-2,3-唾液酸转移酶的编码序列的合适的表达载体。

α-2,6-唾液酸转移酶优选为人α-2,6-唾液酸转移酶。编码人α-2,6-唾液酸转移酶的cDNA序列如SEQ ID NO：7所示，并且基于此，本领域技术人员可以设计出含有α-2,6-唾液酸转移酶的编码序列的合适的表达载体。

根据已知的培养方法，可以在允许表达糖蛋白的条件下培养转染的细胞。

可以使用已建立的纯化技术来回收和/或分离糖蛋白。

上文结合本发明的第一方面的方法描述的实施方案适用于第二方面的方法，加以必要的修改。

本发明的糖蛋白

在第三方面，本发明涉及通过本文所述的方法能够获得的糖蛋白。

在第四方面，本发明涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，并且至少75％，优选至少80％，更优选至少85％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。在优选的实施方案中，至少87％，至少90％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。本发明人证实，包含高度唾液酸化的VWF片段的多肽本身不仅具有延长的半衰期，而且还能够延长共同施用的FVIII的半衰期。换言之，本发明的糖蛋白的施用导致共同施用的FVIII的延长的半衰期和/或降低的清除率。

在第五方面，本发明涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，其中糖蛋白的N-聚糖的至少50％的唾液酸基是α-2,6-连接的唾液酸基。通常，末端唾液酸基可以通过α-2,3-或通过α-2,6-键与半乳糖基附接。在一个实施方案中，本发明的糖蛋白的N-聚糖包含比α-2,3-连接的唾液酸基更多的α-2,6-连接的唾液酸基。优选地，N-聚糖的至少60％，或至少70％，或至少80％或至少90％的唾液酸基是α-2,6-连接的唾液酸基。这些实施方案可以通过例如在哺乳动物细胞中共表达人α-2,6-唾液酸转移酶来获得。

在第六方面，本发明涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的糖蛋白，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，其中糖蛋白的N-聚糖的至少50％的唾液酸基是α-2,3-连接的唾液酸基。通常，末端唾液酸基可以通过α-2,3-或通过α-2,6-键与半乳糖基连接。在一个实施方案中，本发明的糖蛋白的N-聚糖包含比α-2,6-连接的唾液酰基更多的α-2,3-连接的唾液酸基。优选地，N-聚糖的至少60％，或至少70％，或至少80％或至少90％的唾液酸基是α-2,3-连接的唾液酸基。这些实施方案可以通过例如在哺乳动物细胞中共表达人α-2,3-唾液酸转移酶来获得。

上文已经描述了本发明的糖蛋白的优选氨基酸序列。上面结合本发明的第一方面描述的实施方案在细节上适用于第三、第四、第五和第六方面，加以必要的修改。

如本文所用的“本发明的糖蛋白”是指根据第三、第四、第五或第六方面的糖蛋白。本发明的糖蛋白具有增加的N-聚糖的唾液酸化，特别是增加的α-2,6-唾液酸化或增加的α-2,3-唾液酸化。

在一个实施方案中，本发明的糖蛋白的至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％的N-聚糖包含至少一个唾液酸基。在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白内的截短的VWF的至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的N-聚糖包含至少一个唾液酸基。

在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白的小于25％，小于20％，小于15％，或小于12％，或甚至小于10％，或小于8％，或小于6％，或小于5％，或小于4％，或小于3％，或小于2％或甚至小于1％的N-聚糖是去唾液酸-N-聚糖，即它们是缺少唾液酸基的N-聚糖。在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白内的截短的VWF的小于25％，小于20％，小于15％，或小于12％，或小于10％，或小于8％，或小于6％，或小于5％，或小于4％，或小于3％，或小于2％，或甚至小于1％的N-聚糖是去唾液酸-N-聚糖，即它们不具有唾液酸基。

在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白的至少30％，或至少35％或至少40％的N-聚糖是单唾液酸-N-聚糖，即它们是具有一个唾液酸基的N-聚糖。在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白内的截短的VWF的至少30％，或至少35％或至少40％的N-聚糖是单唾液酸-N-聚糖。作为非限制性实例，可以如实施例6和实施例12中详述的那样测定单唾液酸化N-聚糖的量。

在又一个实施方案中，本发明的糖蛋白的至少15％，或至少25％或至少30％的N-聚糖是二唾液酸-N-聚糖，即它们是具有2个唾液酸基的N-聚糖。在又一个实施方案中，本发明的糖蛋白内的截短的VWF的至少15％，或至少25％或至少30％的N-聚糖是二唾液酸-N-聚糖。作为非限制性实例，可如实施例6和实施例12中详述的那样测定二唾液酸化N-聚糖的量。

在又一个实施方案中，本发明的糖蛋白的至少5％或至少10％的N-聚糖是三唾液酸-N-聚糖，即它们是具有3个唾液酸基的N-聚糖。在又一个实施方案中，本发明的糖蛋白内截短的VWF的至少5％或至少10％的N-聚糖是三唾液酸-N-聚糖。作为非限制性实例，可以如实施例6和实施例12中详述的那样测定三唾液酸化N-聚糖的量。

在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白的至少20％，或至少30％或至少40％的N-聚糖包含两个或更多个唾液酸基。在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白中截短的VWF的至少20％，或至少30％或至少40％的N-聚糖包含两个或更多个唾液酸基。

本发明的其它优选实施方案包含截短的血管性血友病因子(VWF)，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，其中小于35％，优选小于34％，优选小于33％，优选小于32％，优选小于31％，优选小于30％，优选小于29％，优选小于28％，优选小于27％，优选小于26％，优选小于25％，优选小于24％，优选小于23％，优选小于22％，优选小于21％，优选小于20％，优选小于19％，优选小于18％，优选小于17％，优选小于16％，优选小于15％，优选小于14％，优选小于13％，优选小于12％，优选小于11％，优选小于10％，优选小于9％，优选小于8％，优选小于7％，优选小于6％以及优选小于5％的所述N-聚糖平均包含两个或更多个末端和非唾液酸化的半乳糖残基。

本发明的其他甚至更优选的实施方案包含截短的血管性血友病因子(VWF)，其中所述截短的VWF能够与因子VIII(FVIII)结合，并且其中所述截短的VWF包含N-聚糖，其中小于6％，优选小于5％，优选小于4％，优选小于3％，优选小于2％，以及优选小于1％的所述N-聚糖平均包含三个或更多个末端和非唾液酸化的半乳糖残基。

上述实施方案可以彼此组合。上述N-聚糖的任何百分比或唾液酸化程度的任何指示应理解为平均百分比或程度，即它们指分子群而不是单个分子。显然，糖蛋白群体内的个体糖蛋白分子的糖基化或唾液酸化将显示出一些异质性。

已经进一步发现，根据本发明获得的糖蛋白具有高比例的二聚体。因此，本发明的糖蛋白优选作为二聚体存在。在一个实施方案中，至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％或约100％的糖蛋白作为二聚体存在。在另一个实施方案中，本发明的糖蛋白的二聚体:单体的比例为至少1.5，优选至少2，更优选至少2.5或至少3。通过本发明的方法获得的二聚体形成是有利的，因为二聚体对因子VIII具有改善的亲和力。本发明的糖蛋白的二聚体含量和二聚体与单体的比例可以如实施例5所述进行测定。

在另一个优选的实施方案中，本发明的糖蛋白包含异源多肽，例如如上定义的HLEP。最优选地，HLEP是人血清白蛋白(参见SEQ ID NO：11)。上文描述的实施方案在此适用，加以必要的修改。

本发明的糖蛋白优选能够与因子VIII结合(参见上文)。在一个实施方案中，本发明的糖蛋白对因子VIII的亲和力大于人天然VWF对相同因子VIII的亲和力。因子VIII亲和力可以指人天然因子VIII，或指特征在于SEQ ID NO：10的因子VIII。

已经发现，根据本发明的具有高比例二聚体的糖蛋白制剂确实对因子VIII具有增加的亲和力。对因子VIII的这种增加的亲和力确实导致本发明的糖蛋白对因子VIII的稳定性增强。作为对增加的二聚体比例的替代或组合，具有在因子VIII结合结构域内确实增加对因子VIII的亲和力的根据本发明的糖蛋白的突变是本发明的优选实施方案。例如在WO2013/120939A1中公开了合适的突变。

本发明的另一方面是如本文所定义的用于治疗凝血障碍的糖蛋白。该治疗包括给患者施用有效量的糖蛋白。该治疗可以还包括施用FVIII。

本发明的另一方面是包含本发明的糖蛋白和药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。

本发明的另一个方面是药盒，其包含(i)如上定义的糖蛋白和(ii)因子VIII。优选地，糖蛋白和FVIII包含在分开的组合物中。

本发明的另一个方面是药盒，其包含(i)如上定义的糖蛋白和(ii)因子VIII，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血障碍。

本发明的另一方面是上文定义的多肽来增加因子VIII的终末半衰期(terminalhalf-life)或平均停留时间(MRT)或降低因子VIII的清除率的用途。为了评估药代动力学数据，应用线性药代动力学模型(通过中央隔室的化合物消除)。因此，除非另有说明，否则本文使用的任何药代动力学参数均基于线性药代动力学模型(通过中央隔室的化合物消除)。

在一定时间t的“半衰期”T1/2(t)是将时间t存在的血浆浓度C(t)减半所需的时间，即C[t+T1/2(t)]＝C(t)/2。当t趋于无穷大时，“终末半衰期”是T1/2(t)的极限。可以确定曲线下面积(AUC)以评估清除作用。清除率降低导致更高的AUC值和半衰期增加。

本文所用的术语“MRT”是指药物分子停留在体内的平均时间。在具有恒定清除率的线性药代动力学系统中，MRT可以计算为第一时刻曲线下面积(AUMC)除以AUC。第一时刻曲线是时间乘以当时的血浆浓度。

如果共同施用有效量的本发明的糖蛋白，则i)相对于单独施用FVIII或者ii)相对于施用与本发明的糖蛋白具有相同蛋白质序列但完全脱唾液酸化N-聚糖的结构的参照蛋白质，或者iii)相对于施用与本发明的糖蛋白具有相同蛋白质序列但是其超过35％的N-聚糖包含两个或更多个末端和非唾液酸化的N-聚糖并且其多于6％的N-聚糖包含三个或更多个末端和非唾液酸化的半乳糖残基的参照蛋白质，所施用的FVIII的MRT增加至少25％，优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少100％，最优选至少125％。

根据本发明的包括在降低的温度培养的方法制备的糖蛋白的MRT大于具有相同氨基酸序列的在37℃下培养的参照糖蛋白的MRT。根据本发明的方法制备的糖蛋白(或本发明的任何糖蛋白)相对于参照糖蛋白的MRT增加优选为至少25％，更优选至少50％，最优选至少100％。

本文所用的术语“清除率”是指血浆清除药物的速率。具体地，它是药物的当前消除速率除以其当前的血浆浓度。在单次静脉内施用后的线性药代动力学系统中，清除率可以计算为剂量相对于血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)的比，只要清除率是恒定的。清除率越小，血浆清除药物所花费的时间越长。

如果共同施用有效量的本发明的糖蛋白，则i)相对于单独施用FVIII或者ii)相对于施用与本发明的糖蛋白具有相同蛋白质序列但完全脱唾液酸化N-聚糖的结构的参照蛋白质或者iii)相对于施用与本发明的糖蛋白具有相同蛋白质序列但是其超过35％的其N-聚糖包含两个或更多个末端和非唾液酸化的N-聚糖并且其多于6％的N-聚糖包含三个或更多个末端和非唾液酸化的半乳糖残基的参照蛋白质，所施用的FVIII的清除率降低至少10％，更优选至少25％，更优选至少40％，更优选至少50％，最优选至少60％。

根据本发明的包括在降低的温度培养的方法制备的糖蛋白的清除率小于具有相同氨基酸序列的在37℃下培养的参照糖蛋白的清除率。根据本发明的方法制备的糖蛋白(或本发明的任何糖蛋白)相对于参照糖蛋白的清除率的降低优选为至少40％，更优选至少50％，最优选至少60％。

本发明进一步涉及增加体内因子VIII的MRT或半衰期的方法，或降低体内因子VIII清除率的方法，包括向受试者施用有效量的如上所定义的糖蛋白。

本发明的另一方面是一种治疗凝血障碍的方法，包括向有需要的患者施用有效量的如上文所定义的糖蛋白。

另一方面是上文定义的糖蛋白的用途，用于降低治疗血友病A中FVIII的施用频率。静脉内或皮下施用FVIII的频率可以减少至每周两次。或者，静脉内或皮下施用FVIII的频率可以减少到每周一次，甚至更低，例如每10天一次或每14天一次。FVIII可以每周两次，每5天，每周一次，每10天，每两周，每三周，每四周一次或每月一次，或任何两个前述值之间的任何范围，例如每四天到每月，每10天至每两周，或者每周两到三次，等。

另一方面是如上所定义的糖蛋白来降低在治疗血友病A中施用的FVIII的剂量的用途。

治疗凝血障碍

本发明的糖蛋白可用于治疗包括血友病A在内的凝血障碍。术语“血友病A”是指功能性凝血FVIII缺乏症，其通常是遗传性的。

疾病的治疗包括已经在任何临床阶段或症状时诊断为患有任何形式的疾病的患者的治疗；疾病的症状或指征的发作或进展或加重或恶化的延缓；和/或预防和/或降低疾病的严重性。

向其施用本发明的糖蛋白的“受试者”或“患者”优选是人。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成年患者。

在本文中描述了包含本发明的糖蛋白和任选的一个或多个附加治疗剂例如如下所述的第二治疗剂的组合物。组合物通常作为包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者的所需方法)。

本发明的糖蛋白可以通过各种途径施用于患者，例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、腹腔内、肌内、鞘内、外用或局部。任何给定情况下最合适的施用途径将取决于具体的糖蛋白、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，静脉内施用本发明的糖蛋白。

优选静脉内或皮下施用糖蛋白和FVIII。

在第一个实施方案中，静脉内施用糖蛋白和FVIII二者。在第二个实施方案中，皮下施用糖蛋白和FVIII二者。

在另一个实施方案中，静脉内施用FVIII，并且通过不同的途径施用糖蛋白。在进一步的实施方案中，皮下施用糖蛋白，并且经由不同的途径施用FVIII。例如，可以皮下施用糖蛋白，并且可以静脉内施用FVIII。

在另外的实施方案中，皮下施用FVIII，并且通过不同的途径施用糖蛋白。在另外的实施方案中，静脉内施用糖蛋白，并通过不同的途径施用FVIII。例如，可以静脉内施用糖蛋白，并且可以皮下施用FVIII。

术语“因子VIII”和“FVIII”在本文中可互换使用并且包括血浆衍生的FVIII和重组FVIII。重组FVIII包括但不限于全长FVIII以及双链B结构域缺失或截短的变体以及单链B结构域缺失或截短的变体，例如WO 2004/067566中描述的和具有在B结构域外突变但具有FVIII的生物活性的其它FVIII变体。

确定用本发明的糖蛋白的有效剂量、总剂量和治疗长度在本领域技术人员的能力范围内。

药物组合物

可以通过将具有所需纯度的糖蛋白与任选的本领域通常使用的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中称为“载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子洗涤剂、抗氧化剂和其它各种添加剂混合制备适用于本文所述方法的本发明的糖蛋白的治疗剂型，作为冻干制剂或水溶液储存。参见Remington's PharmaceuticalSciences,16th edition(Osol,ed.1980)。这样的添加剂所用的剂量和浓度必须对接受者无毒。

缓冲剂有助于将pH值保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠柠檬酸盐混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲剂(例如葡萄糖酸-葡糖酸钠混合物，葡萄糖酸-氢氧化钠混合物，葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。

可以加入防腐剂以延缓微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量加入防腐剂。合适的防腐剂包括苯酚，苄醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵和苯扎碘铵)，氯化六甲双铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可以加入有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高的糖醇，例如甘油，赤藓醇，阿糖醇，木糖醇，山梨醇和甘露醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到添加剂，所述添加剂溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上面列举的)；氨基酸如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨醇，木糖醇，核糖醇，肌醇(myoinisitol)，半乳糖醇，甘油等，包括环多醇如纤维醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个或更少残基的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以活性蛋白质的0.1至10,000重量/重量份存在。

可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)，泊洛沙姆(184、188等)，普朗尼克多元醇，聚氧乙烯脱水山梨醇单醚(

等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml或约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。

另外的其它赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如EDTA)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E)和共溶剂。

除了本发明的糖蛋白之外，本文的制剂还可以含有第二治疗剂。合适的第二治疗剂的实例提供如下。

施用方案可以根据许多临床因素(包括疾病的类型、疾病的严重程度和患者对本发明的糖蛋白的敏感性)从每月一次到每天发生变化。在具体实施方案中，本发明的糖蛋白以下面的方式施用：每周两次，每5天，每周一次，每10天，每两周，每三周，每四周一次或每月一次，或在上述值中的任意两个值之间的任何范围，例如从每四个星期到每个月，从每10天到每两周，或每周两到三次等。

待施用的本发明的糖蛋白的剂量将根据具体的糖蛋白、受试者以及疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如，是否使用第二治疗剂)和所选择的施用途径；可以由本领域技术人员容易地确定合适的剂量。

本领域技术人员将认识到，本发明的糖蛋白的单个剂量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度、施用形式、途径和部位以及受治疗的特定受试者的年龄和状况确定，以及医生将最终确定要使用的合适的剂量。每当合适时，该剂量可以重复。如果发展出副作用，剂量的量和/或频率可以根据正常的临床实践改变或减少。

组合治疗

优选地，用本发明的糖蛋白治疗的患者也用常规的凝血障碍疗法治疗。例如，患有血友病的患者通常也在用因子VIII治疗。

根据本发明，用本发明的糖蛋白治疗的患者也用因子VIII治疗。本发明的糖蛋白和因子VIII分子可以同时或以连续的方式施用，两种施用模式都包括在术语“组合疗法”和“共同施用”中。本发明的糖蛋白和因子VIII分子可以作为混合物施用，即在相同的组合物中，或者分别施用，即作为分开的组合物施用。

在根据本发明使用的组合物中因子VIII的浓度通常在10-10,000IU/mL的范围内。在不同的实施方案中，本发明组合物中FVIII的浓度在10-8,000IU/mL，或10-5,000IU/mL，或20-3,000IU/mL或50-1,500IU/mL的范围内，或3000IU/mL或2,500IU/mL，或2,000IU/mL，或1,500IU/mL，或1,200IU/mL，或1,000IU/mL，或800IU/mL，或750IU/mL，或600IU/IU/mL，或500IU/mL，或400IU/mL，或300IU/mL，或250IU/mL，或200IU/mL，或150IU/mL，或125IU/mL，或100IU/mL，或62.5IU/mL，或50IU/mL。

“国际单位”或“IU”是通过使用针对以“IU”方式校准的国际标准制剂而校准的标准的FVIII活性测定测量的FVIII的凝血活性(效力)的量度单位，所述FVIII活性测定例如一步凝血测定或显色底物FVIII活性测定。一步凝血测定是本领域已知的，例如N Lee，Martin L et al.，An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIIIConcentrates，Thrombosis Research(Pergamon Press Ltd.)30,511 519(1983)中所述的。一步测定的原理：该测试作为激活的部分凝血活酶时间(aPTT)测定的经修改的版本进行：血浆与磷脂和表面活化剂的孵育导致内源性凝血系统因子的激活。添加钙离子会引发凝血级联。测定形成可测量的纤维蛋白凝块的时间。该测定在存在因子VIII缺乏血浆的情况下进行。缺乏血浆的凝血能力由待测试样品中包含的凝血因子VIII恢复。凝血时间的缩短与样品中存在的因子VIII的量成正比。凝血因子VIII的活性通过与国际单位中具有因子VIII的已知活性的标准制剂直接比较来定量。

另一个标准测定是显色底物测定。显色底物测定可以商业购买，例如coamaticFVIII测试试剂盒(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V.le Monza 338-20128Milano，Italy)。显色测定原理：在钙和磷脂存在下，因子X被因子IXa激活成因子Xa。因子VIIIa作为辅因子刺激该反应。FVIIIa由待测样品中FVIII的反应混合物中的少量凝血酶形成。当使用最佳浓度的Ca2+，磷脂和因子IXa和过量的因子X时，因子X的活化与因子VIII的效力成正比。活化的因子X从显色底物S-2765中释放显色团pNA。因此，在405nm处测量的pNA的释放与所形成的FXa的量成正比，因此也与样品的因子VIII活性成正比。

序列表中所示的核苷酸和氨基酸序列总结在下表中。

表1：

以下实施例说明本发明，但不应将其解释为将本发明限制于下文所述的具体实施方案。

实施例1：D'D3白蛋白融合蛋白(D'D3-FP)的产生

通过定制基因合成(Eurofins Genomics，Ebersberg，Germany)制备由编码VWF氨基酸1至1242的cDNA、甘氨酸/丝氨酸接头和人白蛋白的cDNA组成的D'D3-FP的表达盒。通过侧接限制性位点(EcoRI、NotI)，从提供的克隆载体中切下表达盒并将其插入到用EcoRI和NotI线性化的pIRESneo3载体(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)中。所得到的表达质粒含有CMV启动子控制下的通过短接头编码序列融合到白蛋白编码序列的编码VWF肽原D'和D3(SEQ ID NO：9的VWF氨基酸1至1242)的核苷酸序列。编码序列的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：1，成熟D'D3-FP的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：2。

实施例2：在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中转染质粒并稳定表达D'D3-FP二聚体

如上所述的表达质粒在XL10Gold(Agilent Technologies)中生长并使用标准操作方案(Qiagen，Hilden，Germany)纯化。

使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染CHO K1细胞，并在500-1000μg/ml遗传霉素存在下，在无血清培养基(CD-CHO，Invitrogen)中生长。共转染如WO2007/144173中所述的编码PACE/弗林蛋白酶(pFu-797)的表达质粒，以最大化肽原切割功效。根据其通过白蛋白特异性酶免疫测定(见下文)定量的D'D3-FP表达产量，生长并选择单细胞来源的克隆。最终选择用于D'D3-FP发酵的细胞系称为T2050-CL3。

实施例3：α-2,6唾液酸转移酶的共表达

在如实施例2所述的细胞系生成过程中，可以共转染携带编码α-2,6唾液酸转移酶的表达单元以支持非啮齿动物唾液酸附着的质粒。

在巢式PCR设置至使用用于第一PCR的引物We2556(SEQ ID NO.3)和We 2558(SEQID NO.4)和用于第二PCR的引物We2553(SEQ ID NO.5)和We 2559(SEQ ID NO.6)，从人肝cDNA文库(Ambion)中扩增人α-2,6唾液酸转移酶的编码序列。对于第一PCR，将2μL Ambion人肝cDNA文库与34.5μL水，10μl 5x PCR缓冲液Phusion GC(New England Biolabs)，1μl10mM dNTP，1μL We2556(10pmol)，1μl We2558(10pmol)和0.5μL Phusion DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)混合，并使用以下降落(touchdown)操作方案进行扩增：最初98℃60秒，15个循环：a)98℃变性15秒，b)64℃退火30秒和c)72℃延伸2分钟，其中退火步骤的温度每循环降低0.3℃，然后进行25个循环：a)98℃变性25秒，b)62℃退火30秒，和c)72℃延伸2分钟，然后是72℃最后延伸10分钟的步骤，然后通过冷却终止反应并保持在4℃。对于巢式PCR，将2μL第一PCR反应物与34.5μL水，10μl 5x PCR缓冲液Phusion GC，1μl 10mM dNTP，1μL We2553(10pmol)，1μl We2559(10pmol)和0.5μL的Phusion DNA聚合酶混合，并使用如第一PCR所述的降落操作方案进行扩增。巢式PCR在PCR片段的5'末端添加NheI限制酶切割位点，在PCR片段的3'末端添加BamH1位点。该片段被NheI和BamH1切割并连接到已经被相同的酶打开的表达载体pIRESneo3中。然后，所得到的表达载体可以用于共转染。

实施例4：在生物反应器中产生D'D3-FP

用于产生含D'D3-FP的多肽的发酵方法以细胞系T2050-CL3的解冻开始，随后在摇瓶中细胞扩增，最后使用Sartorius BioStat B-DCU 5L生物反应器和BioStat STR 50L一次性生物反应器以灌注模式进行的发酵过程。BioSeps 10L或200L(Applikon)分别用作细胞保留装置。细胞培养基是具有8mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO₄的PowerCHO3(LonzaBESP1204)或具有10mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO₄的ProCHO5(Lonza BESP1072)。

摇瓶中的种子训练在37℃，7.5％CO₂下以160rpm的摇床速度进行。

用2.5×10⁵个细胞/mL的靶VCD接种5L生物反应器。在+37.0℃，pH为7.00，氧饱和度为30％下，在具有8mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO₄的PowerCHO3中培养细胞。在已经从+37℃的生物反应器进行初始收获之后，温度变换至+34.0℃(评价范围

)。使用鼓泡的CO₂为酸和NaHCO₃为碱来控制pH。覆盖空气流速设定为0.5L/min。使用环形鼓泡器作为鼓泡单元。在下拉(down pull)模式下，搅拌速率为150rpm，2倍倾斜度叶轮。

用3.0×10⁵个细胞/mL的靶VCD接种50L生物反应器。在+37.0℃，pH为6.90，氧饱和度为30％下，在具有10mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO₄的ProCHO5培养基中培养细胞。在初始的一个或两个收获之后，温度变换至+34.0℃。PH控制如上，覆盖空气流速设定为2L/min。使用微量鼓泡器作为鼓泡单元。在下拉模式下，搅拌速率为90rpm，2倍倾斜度叶轮。

当生物反应器中的VCD≥1.0×10⁶个细胞/mL时，开始灌注。灌注速率设定为1.0体积/体积/天。BioSep在7(30)W的输入功率下以反冲洗模式操作，其为5(10)分钟运行时间和10秒反冲洗(括号中的数字表示50L生物反应器)。将灌注液和排出液进行直列式(inline)过滤并在+2至+8℃下经48小时收集于袋中。使用葡萄糖消耗作为参数，使用2g/L葡萄糖的靶标，使用浊度探头通过活性排出控制VCD。收获液和排出液进行直列式过滤，由一次性过滤器和一次性袋组成的收获系统每隔一天更换一次。

为了制备下述PK分析的材料，通过亲和层析和尺寸排阻层析纯化相应温度变化之前和之后的收获物。

实施例5：使用亲和层析和尺寸排阻层析纯化D'D3-FP二聚体

使用具有30kD膜(例如Pall Centramate OS030T12)的TFF系统(例如PallCentramate 500S)将来自生物反应器的无细胞收获物浓缩30倍。将浓缩物加入NaCl和EDTA至终浓度为0.75M NaCl和5mM EDTA，并加载至用20mM Tris缓冲液pH 7.4预平衡的CaptureSelect Human Albumin柱(Life Technologies)上过夜。用平衡缓冲液洗涤柱后，用洗脱缓冲液(20mM Tris，2M MgCl₂，pH7.4)洗脱D'D3-FP。然后将洗脱液10倍浓缩，并使用具有30kD截止值的超离心过滤器(例如Amicon.UFC903024)对50mM Tris，150mM NaCl，pH7.4进行透析。为了将D'D3-FP二聚体与单体部分分开，将该材料加载至用50mM Tris，150mMNaCl，pH 7.4预平衡的Superdex 200pg柱(GE Healthcare Code：17-1069-01)上，合并含有D'D3-FP二聚体的峰级分。使用二聚体和单体峰级分曲线下面积计算二聚体与单体的比例。

实施例6：总唾液酸化测定

材料和方法：

乙酸来自Sigma-Aldrich(产品号338826)。乙腈来自Burdick and Jackson(产品号LC015)。2-氨基苯甲酰胺(2-AB)来自Aldrich(产品号A89804)。氢氧化铵来自Sigma-Aldrich(产品号338818)。碳酸氢铵来自Fluka(产品号09830)。二甲基亚砜来自Sigma(产品号D2650)。二硫苏糖醇(DTT)来自Sigma(产品号646563)。甲酸来自Thermo(产品号28905)。N-糖苷酶F(PNGase 250U)来自Roche(产品号11 365 193 00)。氰基硼氢化钠来自Aldrich(产品号156159)。Oasis HLB 3cc 60mg SPE柱来自Waters(部件号：WAT094226)。50KDaAmicon Ultra 4离心超滤器来自Millipore(目录号UFC805008)。Zeba Spin 7K MWCO柱2mL来自Thermo(产品号89889)

PNGase F酶促聚糖释放：

在约60℃下用溶于约70mM碳酸氢铵、pH 8.5的DTT将大约700μg的D'D3-FP还原30分钟。将还原的样品冷却至室温，并在室温下用碘乙酰胺在黑暗中烷基化30分钟。使用2mLZeba Spin 7K MWCO柱将烷基化的样品缓冲液交换成50mM碳酸氢铵pH8.6。向缓冲液交换的样品中加入40U PNGase并将样品在37℃孵育14小时。再加入40U的PNGase，将样品在37℃再孵育6小时。将PNGase消化的样品通过50KDa Amicon Ultra 4超滤器离心。滤液在CentriVap中干燥。

释放的N-聚糖的2-AB标记：

为了制备2-AB标记试剂，将23mg的2-氨基苯甲酰胺溶解在350μL的DMSO中，并加入150μL的冰醋酸。将所得溶液加入到32mg氰基硼氢化钠中并充分混合直到溶解。

将50μL的2-AB试剂加入到干燥的样品中并在65℃的黑暗中孵育3.5小时。

Waters Oasis HLB 3cc 60mg SPE柱用3mL 95％乙腈，3mL 35％乙腈然后3mL95％乙腈调节。通过加入1.95mL 95％v/v乙腈稀释2-AB标记的样品，并立即加载到HLB柱上，并在重力下排空。样品在重力下用3×3mL的95％v/v乙腈洗涤，并用3mL的35％v/v乙腈洗脱。洗脱液在Centrivap中干燥。干燥的2-AB衍生样品通过加入35μL Milli Q水溶解并涡旋混合。溶解后，加入85μL乙腈并短暂混合。将样品转移至HPLC小瓶用于分析。

2-AB聚糖分析：

在由RS二元泵、自动取样器、RS柱隔室和RS荧光检测器组成的Thermo DionexUltimate 3000系统上进行高效液相层析。使用Dionex GlycanPac AXH-1,1.9μm，2.1×150mm柱(P/N 082472)实现2-AB聚糖衍生物的分离。流动相A由100％乙腈组成，流动相B由用5M氢氧化铵溶液调节至pH 4.0的50mM甲酸组成。柱温保持在50℃，流速为0.200mL/min。柱子用15％B平衡。注入6μL样品后，流动相组成在50分钟内线性变为40％B，然后在10分钟内变为80％B，然后在0.1分钟内变为95％B，然后保持在95％B 4.9分钟，然后在0.1分钟内回到15％B。该柱在15％B下重新平衡14.9分钟。在320nm的激发波长和420nm的发射波长下进行荧光检测。

结果：

表2：提供D’D3-FP的批次用于PK分析：

从37℃至33℃(例如批次B-140825)或至34℃(例如批次B-140623KS)的温度变换后获得的收获物中纯化的D'D3-FP蛋白质显示出改善的唾液酸化模式，因为检测到去唾液酸和单唾液酸结构的量降低，同时特别是二唾液酸和三唾液酸结构增加。去唾液酸结构的含量降低对D'D3-FP蛋白本身以及共同施用的FVIII的半衰期具有积极影响(参见实施例8)。

作为温度变换的结果，发现了另外的有益效果，因为在较低温度D'D3-FP二聚体相对于单体增加，其中二聚体由于其增加的与FVIII的结合而为优选的结构。

表3.温度对二聚体含量的影响

收获前生物反应器温度	％二聚体	％单体	二聚体:单体之比
				37	52.3	47.7	1.1
35	71.0	29.0	2.45
				33	71.2	28.8	2.5
32	74.6	25.4	2.94
				31	77.5	22.5	3.44

如表4所示，相对于全长VWF，没有观察到温度变换对唾液酸化程度的有益影响。具体而言，相对于在37℃的标准温度的表达，当在与实施例4中所述相似的生物反应器条件下表达全长野生型VWF白蛋白融合物(“rVWF-FP”)时并且当温度降低至33.5℃时，无法降低去唾液酸结构的含量。如US 2014/0072561A1中所述进行纯化。

表4.全长VWF的唾液酸化

将在37℃收获的批次的唾液酸化程度相对于100的标称值进行标准化。对在33.5℃收获的批次确定的唾液酸化程度低于在37℃收获的批次的唾液酸化程度。

实施例7：D'D3-FP抗原浓度的测定

通过其性能为本领域技术人员已知的ELISA测定人白蛋白。简而言之，用每孔100μL在缓冲液A[Sigma C3041]中稀释至2μg/mL的捕获抗体(山羊抗人白蛋白-IgG，目录号A80-129A，Bethyl Laboratories，Inc.)在环境温度孵育微孔板16小时。用缓冲液B(SigmaP3563)洗涤板三次后，用每孔200μL封闭液(目录号110500，Candor Biosience GmbH)在环境温度封闭微孔板1.5小时。用缓冲液B(Sigma P3563)再次洗涤板3次后，将在LowCross缓冲液(目录号100500，Candor Biosience GmbH)中的系列稀释的测试样品以及在LowCross缓冲液中系列稀释的N蛋白标准SL(OQIM13，Siemens Healthcare 50-0.78ng/mL)(每孔体积：100μL)在+37℃孵育1小时。用缓冲液B洗涤四次的步骤后，将100μL在封闭溶液中的1:40,000稀释的检测抗体(过氧化物酶标记的山羊抗人白蛋白-IgG，目录号A80-129P，BethylLaboratories，Inc.)-D，加入到每个孔中并在+37℃孵育45分钟。用缓冲液B洗涤三次后，每孔加入100μL底物溶液(1:10(v/v)TMB OUVF：TMB Buffer OUVG，Siemens Healthcare)，并在环境温度在黑暗中孵育20分钟。添加100μL终止液(OSFA，Siemens Healthcare)将样品制备成在450nm波长的合适的酶标仪中读取。然后使用N蛋白标准SL作为参照的标准曲线计算测试样品的浓度。

实施例8：PK分析

目标

我们旨在表征唾液酸化对半衰期延长的血管性血友病因子(VWF)片段D'D3-FP二聚体和FVIII的药代动力学(PK)的影响。这些研究的一个目的是确定大鼠中D'D3-FP二聚体的唾液酸化对其PK和另外对共同施用的FVIII的PK的影响(实施例8.1)。第二个实施例涵盖了对大鼠全长FVIII产品

的影响(实施例8.2)。针对每种制剂指示批号(参见上面的表2)和以％计的D'D3-FP二聚体唾液酸化程度。

实施例8.1：通过在大鼠中共同施用高度唾液酸化的D'D3-FP二聚体延长FVIII的药代动力学

材料与方法

动物：在Charles River Laboratories(Sulzfeld，Germany)培育重量范围为230-300g的雌性Crl：CD(Sprague Dawley)大鼠。在室内，动物被保持在标准安置条件下，即在21-22℃，12小时/12小时的光-暗周期。动物随意饲喂标准大鼠饮食(Ssniff-

，Soest，Germany)。自来水随意提供。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。

实验室评估：测试品以总体积为3mL/kg通过单次注射i.v.施用到侧尾静脉中。所有D'D3-FP二聚体制剂以基于人白蛋白值的1000μg/kg的剂量水平施用，并在+37℃孵育约30分钟后与200IU/kg rVIII-SingleChain(rVIII-SC，rVIII-单链，显色活性)共同施用。只接受rVIII-SC的动物作为对照(表5)。

使用交替取样方案静脉内推注注射后5分钟、2小时、4小时、8小时、24小时、32小时、48小时和72小时，在短期麻醉下，对血液样品进行眶后取血。PK曲线是从每组(n＝3每个时点，n＝6每组)两只老鼠的两个组群获得的。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)将血液样品进行抗凝处理，加工成血浆，并在-20℃保存用于测定FVIII抗原和/或白蛋白。

通过使用对人白蛋白特异性的免疫测定(实施例7)测量蛋白质的白蛋白部分来确定D'D3-FP二聚体暴露，并且用来自Stago，S.A.S.，France的FVIII Asserachrom ELISA检测试剂盒检测FVIII:Ag血浆水平。

表5：处理组

FVIII:C＝显色FVIII活性

*在括号内给出批号

结果

D'D3-FP二聚体通过其白蛋白成分进行定量，并且测量进行至多72小时p.a.，并且所有测量数据都远高于测定的检测极限。平均停留时间(MRT)和清除率(CL)通过非隔室法估算，数据显示在图1中。和与具有83.6％和89.8％唾液酸化的D'D3-FP二聚体制剂(分别为B-140616KS和B-140623KS)的共同施用相比，与具有40.6％唾液酸化的D'D3-FP二聚体(B-140526)共同施用的rVIII-SC时具有更短的MRT和更高的清除率。

根据这一观察结果，相应修改了通过ELISA定量为FVIII:Ag的共同施用的FVIII(200IU/kg显色FVIII活性)的药代动力学曲线。值得一提的是，并不是所有48小时和72小时的血浆水平都可以测量，有些值低于57mIU/mL的检测限。显然，单独的rVIII-SC具有最短的MRT和最高的清除率，当共同施用D'D3-FP二聚体时通常延长(图2)。那些自己暴露时间较长的D'D3-FP二聚体也延长了FVIII PK曲线。因此，具有40.6％唾液酸化的D'D3-FP二聚体(B-140526)的MRT比具有>80％唾液酸化的D'D3-FP二聚体的MRT更短且清除率更高。

因此，FVIII:Ag的药代动力学曲线依赖于D'D3-FP二聚体的唾液酸化，即观察到40.6％的唾液酸化为最短的PK以及>80％的唾液酸化为最长的PK。

更详细地进行对D'D3-FP二聚体的PK特征的评估，即另外计算非隔室模型中的最大浓度(C_max)和终末半衰期(t1/2)，以及计算x倍数增加(表6)。

89.8％和40.6％之间的唾液酸化对D'D3-FP二聚体的清除率的影响超过2倍(如通过测量随着时间的白蛋白浓度测定的，89.8％D'D3-FP二聚体为0.91mL/kg/h，而40.6％D'D3-FP二聚体为2.06mL/kg/h)。这涉及平均停留时间超过40％的增加(MRT，即56.9-81.5小时)以及终末半衰期的超过30％的增加(即44.0-58.6小时)。

如MRT和清除率的图所示，即使不像D'D3-FP二聚体那样明显，这转化为共同施用的FVIII的PK特征(表6，FVIII:Ag)：清除率降低超过30％(3.93mL/kg/h至2.95mL/kg/h)，MRT增加19％(16.5h至19.6h)，终末半衰期延长15％(11.4h至13.1h)。

因此，取决于唾液酸化的百分比的D'D3-FP二聚体给出随时间的增加暴露的增加，这也可以通过单独给予rVIII-SC的PK特征的倍数增加来看出。40.6％的唾液酸化延长FVIII PK 1.5-1.9倍，优化的具有89.8％唾液酸化的D'D3-FP二聚体延长FVIII PK 2.0-2.2倍，83.6％唾液酸化得到中间值。因此，这一效应与研究范围内从40.6％至89.8％的唾液酸化程度相关。

表6：在大鼠中共同施用rVIII-SC和D'D3-FP二聚体后，D'D3-FP二聚体和FVIII:Ag的药代动力学参数(非隔室分析)

剂量D'D3-FP二聚体为1mg/kg，剂量rVIII-SC为200IU/kg

*括号内给出了D'D3-FP二聚体唾液酸化程度

实施例8.2：通过在大鼠中共同施用高度唾液酸化的D'D3-FP二聚体延长全长FVIII的药代动力学

材料与方法

动物：在Charles River Laboratories(Sulzfeld，Germany)培育重量范围为220-300g的雌性Crl：CD(Sprague Dawley)大鼠。在室内，动物被保持在标准安置条件下，即在21-22℃，12小时/12小时的光-暗周期。动物随意饲喂标准大鼠饮食(Ssniff-

，Soest，Germany)。自来水随意提供。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。

实验室评估：测试品以总体积为3mL/kg通过单次注射i.v.施用到侧尾静脉中。所有D'D3-FP二聚体制剂以基于人白蛋白值的1000μg/kg的剂量水平施用，并在+37℃孵育约30分钟后与200IU/kg

(标称显色活性)共同施用。只接受

的动物作为对照(表7)。

使用交替取样方案静脉内推注注射后5分钟、2小时、4小时、8小时、24小时、32小时、48小时和72小时，在短期麻醉下，对血液样品进行眶后取血。PK曲线是从每组(n＝3每个时点，n＝6每组)两只老鼠的两个组群获得的。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)将血液样品进行抗凝处理，加工成血浆，并在-20℃保存用于测定FVIII抗原和/或白蛋白。

通过使用对人白蛋白特异性的免疫测定(实施例7)测量蛋白质的白蛋白部分来确定D'D3-FP二聚体暴露，并且用来自Stago，S.A.S.，France的FVIII Asserachrom ELISA检测试剂盒检测FVIII:Ag血浆水平。

表7：处理组(实验性)

FVIII:C＝显色FVIII活性

*在括号内给出批号

结果

D'D3-FP二聚体通过其白蛋白成分进行定量，并且测量进行至多72小时p.a.，并且在整个观察期内测量的数据远高于检测极限。平均停留时间(MRT)和清除率(CL)通过非隔室法估算，数据显示在图3中。当与具有87.3％唾液酸化作用的D'D3-FP二聚体制剂共同施用时相比，与共同施用具有40.6％唾液酸化的D'D3-FP二聚体的

的组中D'D3-FP二聚体的PK特征具有更短的MRT和更高的清除率。

根据这一观察结果，相应修改了通过ELISA定量为FVIII:Ag的共同施用的FVIII(200IU/kg标称显色FVIII活性)的药代动力学曲线。值得一提的是，

处理组直到4-8小时p.a.时可以测量样品，而D'D3-FP二聚体共同处理组直到24-32小时p.a.时可以测量样品，其后的值低于117mIU/mL的测定检测极限。显然，单独的

具有最短的MRT和最高的清除率，当共同施用D'D3-FP二聚体时通常延长(图4)。那些自己暴露时间较长的D'D3-FP二聚体也延长了FVIII PK曲线。因此，具有40.6％唾液酸化的D'D3-FP二聚体的MRT比具有>85％唾液酸化的D'D3-FP二聚体的MRT更短且清除率更高。因此，FVIII:Ag的药代动力学曲线依赖于D'D3-FP二聚体的唾液酸化，即观察到40.6％的唾液酸化为最短的PK以及>85％的唾液酸化为最长的PK。

更详细地进行对D'D3-FP二聚体的PK特征的评估，即另外计算非隔室模型中的最大浓度(C_max)和终末半衰期(t1/2)，以及计算相对于单独给予的

的x倍数增加(表8)。

87.3％至40.6％之间的唾液酸化对D'D3-FP二聚体的清除率的影响超过1.5倍(如通过测量随着时间的白蛋白浓度测定的，87.3％D'D3-FP二聚体为1.32mL/kg/h，而40.6％D'D3-FP二聚体为2.17mL/kg/h)。这涉及对平均停留时间(MRT，+14％，即54.4h至62.0h)和终末半衰期(t1/2，+4％，即42.2h至44.0h)的轻微影响。

如MRT和清除率的图所示，即使大部分不像D'D3-FP二聚体那样明显，这转化为共同施用的FVIII的PK特征(表8，FVIII:Ag)：清除率降低超过20％(12.99mL/kg/h至10.66mL/kg/h)，MRT增加12％(10.2h至11.4h)，终末半衰期延长11％(8.9h至9.9h)。

因此，对于全长FVIII产品

取决于唾液酸化的百分比的D'D3-FP二聚体给出随时间的增加暴露的增加，这也可以通过单独给予

的PK特征的倍数增加来看出。40.6％唾液酸化延长FVIII PK 2.3-2.9倍，优化的具有87.3％唾液酸化的D'D3-FP二聚体延长FVIII PK 2.8-3.2倍。

表8：在大鼠中共同施用

和D'D3-FP二聚体后D'D3-FP二聚体和FVIII:Ag的药代动力学参数(非隔室分析)

剂量D'D3-FP二聚体为1mg/kg，剂量

为200IU/kg

*括号内给出了D'D3-FP二聚体唾液酸化程度

PK研究结果的结论

这些研究表明，D'D3-FP二聚体和FVIII的共同施用使用不同的FVIII产物延长FVIII:Ag血浆暴露。该延长依赖于D'D3-FP二聚体唾液酸化的状态：通常，更好的唾液酸化进一步优化FVIII血浆暴露。具体而言，具有40.9％唾液酸化的D'D3-FP二聚体就FVIII:Ag血浆暴露而言劣于具有在83.6-89.8％范围内的唾液酸化作用的D'D3-FP。

由于在大鼠中(与人A型血友病患者相反)，人和内源性FVIII与D'D3-FP二聚体竞争结合位点，可以预期在人血友病患者中对FVIII的作用甚至更强。

实施例9：D'D3-FP的体外唾液酸化

将D'D3-FP二聚体用pH 7.0的35mM乙酸钠/35mM Tris缓冲液透析。向110μl约600μg蛋白质添加溶解于100μl水中作为供体底物的0.75mg CMP-NANA(Roche目录号05974003103)和10.5μl ST6GAL-1(60μg，Roche目录号07012250103，溶于水)。混合物在37℃孵育6小时，在-15℃至-25℃下冷冻终止反应。这个程序是根据制造商的建议。然后通过使用SEC Superdex 200pg(GE Healthcare，Code 90-1002-10)的层析从试剂中纯化D'D3-FP二聚体。如上所述测定唾液酸化，结果在表9中给出。

表9：体外唾液酸化研究的结果

起始材料的唾液酸化程度相对于100的标称值进行标准化。体外唾液酸化后的唾液酸化程度明显高于起始材料的唾液酸化程度。

实施例10：阴离子交换层析富集高度唾液酸化的VWF片段

根据实施例5制备的D'D3-FP使用阴离子交换层析进一步纯化以降低去唾液酸N-聚糖结构的含量。因此，使用20mM Tris x HCl pH7.4缓冲液将D'D3-FP溶液稀释至足够低的电导率以允许D'D3-FP完全结合到柱上(通常低于5mS/cm)并加载到填充有使用含有20mMTris x HCl，20mM NaCl pH 7.4的平衡缓冲液平衡过的Poros XQ树脂的层析柱(填充高度约20cm)。用平衡缓冲液洗柱后，用平衡缓冲液至洗脱缓冲液(20mM Tris x HCl，500mMNaCl pH 7.4)的平直线性梯度洗脱D'D3-FP。将包含D'D3-FP的洗脱峰分级分离成大约10个相似体积的级分，并丢弃含有增加量的去唾液酸N-聚糖结构的D'D3-FP的早期峰级分，而合并含有去唾液酸N-低于所需水平(例如20％或更低)的聚糖结构的后期峰级分。

或者，进行D'D3-FP的纯化操作，差别在于对于含有去唾液酸N-聚糖结构含量低于15％(或低于10％)的D'D3-FP的那些级分，只进行D'D3-FP洗脱液峰级分的合并。

如所描述的，通过合并相应的级分，可以制备具有所需的最大含量的去唾液酸N-聚糖结构的合适D'D3-FP制剂。

基于使用用于洗脱的线性梯度获得的结果，可以衍生出含有不同浓度NaCl的缓冲液的逐级梯度，其也可以去除具有较高量的去唾液酸N-聚糖结构的第一部分，从而得到含量低于15％的去唾液酸N-聚糖结构的D'D3-FP洗脱液。

实施例11：测定FVIII对VWF片段二聚体和单体的亲和力

如上所述分离D'D3-FP单体和二聚体，并经由Biacore仪器(T200，GE Healthcare)通过表面等离子体共振来评估FVIII对这些制剂的亲和力。

通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(乙醇胺盐酸盐)(两者均包含在来自GEHealthcare的胺偶联试剂盒(BR1000-50)中)将抗白蛋白抗体(MA1-20124，ThermoScientific)经由其N-末端共价偶联到活化的CM 3芯片上。对于固定化，将3μg/mL抗体在乙酸钠缓冲液(10mM，pH5.0)中稀释，并将抗体溶液以流速10μL/min流过芯片7分钟。在固定化程序之后，通过将乙醇胺溶液(1M，pH 8.3)以流速10μL/min流过芯片5分钟，使非偶联的葡聚糖细丝饱和。饱和流动池的目的是使分析物与芯片的非特异性结合最小化。通过使用与上述相同的程序用乙醇胺饱和空流动池来建立参照流动池。

分别通过D'D3-FP蛋白(5μg/mL)流过芯片3分钟(10μL/min的流速)，将二聚体和单体D'D3-FP蛋白质固定在共价偶联的抗白蛋白抗体上。二聚体D'D3-FP的捕获质量为335RU，单体D'D3-FP为147RU，假定在单体上和二聚体D'D3-FP上对于FVIII都有一个结合位点。

为了产生FVIII的结合曲线，将每种D'D3-FP蛋白制剂在运行缓冲液(HBS-P+：0.1MHEPES、1.5M NaCl和0.5％v/v Surfactant P20，pH7.4；产品代码BR100671，GEHealthcare)中稀释至0.25nM、0.5nM、1nM、3nM和4nM的浓度。通过进行单循环动力学，将每个稀释物浓度升高的样品流过芯片2分钟(流速30μL/min)，然后解离时间为10分钟，运行缓冲液HBS-P+。所有测量均进行两次。将测量程序的温度调节至+25℃。

使用BiaEvaluation Software计算结合参数。曲线拟合方法基于Langmuir方程。用于计算的输入数据是170kDa的分析物FVIII(rVIII-单链)的摩尔质量，其他参数如最大RU值和斜率自动从拟合的结合和解离曲线中提取出来。BiaEvaluation Software的输出是结合速率常数和解离速率常数，从中计算亲和力常数。结果示于表10。

表10：FVIII对D’D3-FP二聚体和单体的亲和力数据

rVIII-单链与单体D'D3-FP的缔合速率常数略有增加，而rVIII-单链与D'D3-FP二聚体的解离速率常数是单体的三分之一。解离速率常数和缔合速率常数的商表示rVIII-单链对D'D3-FP的亲和力。因此与D'D3-FP单体相比，二聚体D'D3-FP显示出对FVIII的增加的亲和力。

实施例12：个体N-聚糖物质的定量测定

由PNGase F释放的N-聚糖用荧光基团2-氨基苯甲酰胺(AB)标记并且使用允许使用准确质量和停留时间信息的同时定量测定和鉴定标记的N-聚糖的直列式(in-line)LC-荧光-高分辨率MS检测进行纯化。使用混合模式的HILIC/RP LC-柱，允许根据电荷和结构分离释放的和AB标记的N-聚糖，其使得能够根据末端半乳糖和非唾液酸化残基的数量定量测定不同的结构。使用参照样品(n＝5)发现使用曲线下面积的荧光定量的标准偏差平均小于0.5％。在分离的AB标记的N-聚糖中存在末端和非唾液酸化的半乳糖残基通过用β1-4-半乳糖苷酶处理释放的AB标记的N-聚糖并使用相同的LC-FLD-MS方法重新注射并分析移位的峰值来证实。

应用以下方法：

PNGase F酶促聚糖释放：

在60℃下用溶于碳酸氢铵(pH 8.5)的DTT将大约700μg纯化的蛋白质还原30分钟。将还原的样品冷却至室温，并在室温下用碘乙酰胺在黑暗中烷基化30分钟。使用2mL ZebaSpin 7K MWCO柱将烷基化的样品缓冲液交换成50mM碳酸氢铵pH8.6。向缓冲液交换的样品中加入40U PNGase并将样品在37℃孵育14小时。再加入40U的PNGase，将样品在37℃再孵育6小时。将PNGase消化的样品通过50KDa Amicon Ultra 4超滤器离心。滤液在CentriVap中干燥。

释放的N-聚糖的2-AB标记：

按照制造说明书制备2-AB标记试剂。将50μL的2-AB试剂加入到干燥的样品中并在65℃的黑暗中孵育3.5小时。

Waters Oasis HLB 3cc 60mg SPE柱用3mL 95％乙腈，3mL 35％乙腈然后3mL95％乙腈调节。通过加入1.95mL 95％v/v乙腈稀释2-AB标记的样品，并立即加载到HLB柱上，并在重力下排空。样品在重力下用3×3mL的95％v/v乙腈洗涤，并用3mL的35％v/v乙腈洗脱。干燥的2-AB衍生样品通过加入35μL Milli Q水溶解并涡旋混合。溶解后，加入85μL乙腈并短暂混合。将样品转移至HPLC小瓶用于分析。

2-AB聚糖分析：

在由RS二元泵、自动取样器、RS柱隔室和RS荧光检测器组成的Thermo DionexUltimate 3000系统上进行高效液相层析。使用Dionex GlycanPac AXH-1,1.9μm，2.1×150mm柱(P/N 082472)实现2-AB聚糖衍生物的分离。流动相A由100％乙腈组成，流动相B由用5M氢氧化铵溶液调节至pH4.0的50mM甲酸组成。柱温保持在50℃，流速为0.200mL/min。在320nm的激发波长和420nm的发射波长下进行荧光检测。

LC-FLD系统与高分辨率正交TOF-MS(MaXis，Bruker-Daltonik，Bremen，Germany)偶联。传输毛细管保持在-4500V的电压(阳离子极性模式)。使用标准ESI喷雾器(Bruker，Bremen，Germany)将雾化器设定为0.8bar，干燥气体温度为180℃，干燥气体流速为7L/min。离子传输在m/z 200-3000的范围内进行了优化，以获得最高灵敏度，同时在整个质量范围内保持分辨率R>50,000。TOF-MS质量校正在LC-MS实验之前通过直接注入100倍稀释的ESTuning Mix(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)以4ul/min进行。

序列表

<110> 瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司

<120> 用于制备经修饰的血管性血友病因子的方法

<130> 2015_L004_A243

<150> EP2015168934.6

<151> 2015-05-22

<160> 12

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5616

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA encoding construct VWF fragment - G/S linker - albumin

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> EcoRI restriction enzyme cleavage site

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(3757)

<223> coding sequence for VWF amino acids 1 to 1242

<220>

<221> misc_feature

<222> (3758)..(3850)

<223> coding sequence for glycine/serine linker

<220>

<221> misc_feature

<222> (3851)..(5608)

<223> coding sequence for human albumin

<220>

<221> misc_feature

<222> (5609)..(5616)

<223> NotI restriction enzyme cleavage site

<400> 1

gaattcccgc agccctcatt tgcaggggaa gatgattcct gccagatttg ccggggtgct 60

gcttgctctg gccctcattt tgccagggac cctttgtgca gaaggaactc gcggcaggtc 120

atccacggcc cgatgcagcc ttttcggaag tgacttcgtc aacacctttg atgggagcat 180

gtacagcttt gcgggatact gcagttacct cctggcaggg ggctgccaga aacgctcctt 240

ctcgattatt ggggacttcc agaatggcaa gagagtgagc ctctccgtgt atcttgggga 300

attttttgac atccatttgt ttgtcaatgg taccgtgaca cagggggacc aaagagtctc 360

catgccctat gcctccaaag ggctgtatct agaaactgag gctgggtact acaagctgtc 420

cggtgaggcc tatggctttg tggccaggat cgatggcagc ggcaactttc aagtcctgct 480

gtcagacaga tacttcaaca agacctgcgg gctgtgtggc aactttaaca tctttgctga 540

agatgacttt atgacccaag aagggacctt gacctcggac ccttatgact ttgccaactc 600

atgggctctg agcagtggag aacagtggtg tgaacgggca tctcctccca gcagctcatg 660

caacatctcc tctggggaaa tgcagaaggg cctgtgggag cagtgccagc ttctgaagag 720

cacctcggtg tttgcccgct gccaccctct ggtggacccc gagccttttg tggccctgtg 780

tgagaagact ttgtgtgagt gtgctggggg gctggagtgc gcctgccctg ccctcctgga 840

gtacgcccgg acctgtgccc aggagggaat ggtgctgtac ggctggaccg accacagcgc 900

gtgcagccca gtgtgccctg ctggtatgga gtataggcag tgtgtgtccc cttgcgccag 960

gacctgccag agcctgcaca tcaatgaaat gtgtcaggag cgatgcgtgg atggctgcag 1020

ctgccctgag ggacagctcc tggatgaagg cctctgcgtg gagagcaccg agtgtccctg 1080

cgtgcattcc ggaaagcgct accctcccgg cacctccctc tctcgagact gcaacacctg 1140

catttgccga aacagccagt ggatctgcag caatgaagaa tgtccagggg agtgccttgt 1200

cacaggtcaa tcacacttca agagctttga caacagatac ttcaccttca gtgggatctg 1260

ccagtacctg ctggcccggg attgccagga ccactccttc tccattgtca ttgagactgt 1320

ccagtgtgct gatgaccgcg acgctgtgtg cacccgctcc gtcaccgtcc ggctgcctgg 1380

cctgcacaac agccttgtga aactgaagca tggggcagga gttgccatgg atggccagga 1440

cgtccagctc cccctcctga aaggtgacct ccgcatccag catacagtga cggcctccgt 1500

gcgcctcagc tacggggagg acctgcagat ggactgggat ggccgcggga ggctgctggt 1560

gaagctgtcc cccgtctatg ccgggaagac ctgcggcctg tgtgggaatt acaatggcaa 1620

ccagggcgac gacttcctta ccccctctgg gctggcggag ccccgggtgg aggacttcgg 1680

gaacgcctgg aagctgcacg gggactgcca ggacctgcag aagcagcaca gcgatccctg 1740

cgccctcaac ccgcgcatga ccaggttctc cgaggaggcg tgcgcggtcc tgacgtcccc 1800

cacattcgag gcctgccatc gtgccgtcag cccgctgccc tacctgcgga actgccgcta 1860

cgacgtgtgc tcctgctcgg acggccgcga gtgcctgtgc ggcgccctgg ccagctatgc 1920

cgcggcctgc gcggggagag gcgtgcgcgt cgcgtggcgc gagccaggcc gctgtgagct 1980

gaactgcccg aaaggccagg tgtacctgca gtgcgggacc ccctgcaacc tgacctgccg 2040

ctctctctct tacccggatg aggaatgcaa tgaggcctgc ctggagggct gcttctgccc 2100

cccagggctc tacatggatg agagggggga ctgcgtgccc aaggcccagt gcccctgtta 2160

ctatgacggt gagatcttcc agccagaaga catcttctca gaccatcaca ccatgtgcta 2220

ctgtgaggat ggcttcatgc actgtaccat gagtggagtc cccggaagct tgctgcctga 2280

cgctgtcctc agcagtcccc tgtctcatcg cagcaaaagg agcctatcct gtcggccccc 2340

catggtcaag ctggtgtgtc ccgctgacaa cctgcgggct gaagggctcg agtgtaccaa 2400

aacgtgccag aactatgacc tggagtgcat gagcatgggc tgtgtctctg gctgcctctg 2460

ccccccgggc atggtccggc atgagaacag atgtgtggcc ctggaaaggt gtccctgctt 2520

ccatcagggc aaggagtatg cccctggaga aacagtgaag attggctgca acacttgtgt 2580

ctgtcgggac cggaagtgga actgcacaga ccatgtgtgt gatgccacgt gctccacgat 2640

cggcatggcc cactacctca ccttcgacgg gctcaaatac ctgttccccg gggagtgcca 2700

gtacgttctg gtgcaggatt actgcggcag taaccctggg acctttcgga tcctagtggg 2760

gaataaggga tgcagccacc cctcagtgaa atgcaagaaa cgggtcacca tcctggtgga 2820

gggaggagag attgagctgt ttgacgggga ggtgaatgtg aagaggccca tgaaggatga 2880

gactcacttt gaggtggtgg agtctggccg gtacatcatt ctgctgctgg gcaaagccct 2940

ctccgtggtc tgggaccgcc acctgagcat ctccgtggtc ctgaagcaga cataccagga 3000

gaaagtgtgt ggcctgtgtg ggaattttga tggcatccag aacaatgacc tcaccagcag 3060

caacctccaa gtggaggaag accctgtgga ctttgggaac tcctggaaag tgagctcgca 3120

gtgtgctgac accagaaaag tgcctctgga ctcatcccct gccacctgcc ataacaacat 3180

catgaagcag acgatggtgg attcctcctg tagaatcctt accagtgacg tcttccagga 3240

ctgcaacaag ctggtggacc ccgagccata tctggatgtc tgcatttacg acacctgctc 3300

ctgtgagtcc attggggact gcgcctgctt ctgcgacacc attgctgcct atgcccacgt 3360

gtgtgcccag catggcaagg tggtgacctg gaggacggcc acattgtgcc cccagagctg 3420

cgaggagagg aatctccggg agaacgggta tgagtgtgag tggcgctata acagctgtgc 3480

acctgcctgt caagtcacgt gtcagcaccc tgagccactg gcctgccctg tgcagtgtgt 3540

ggagggctgc catgcccact gccctccagg gaaaatcctg gatgagcttt tgcagacctg 3600

cgttgaccct gaagactgtc cagtgtgtga ggtggctggc cggcgttttg cctcaggaaa 3660

gaaagtcacc ttgaatccca gtgaccctga gcactgccag atttgccact gtgatgttgt 3720

caacctcacc tgtgaagcct gccaggagcc gggaggctcg agcgggggat ctggcgggtc 3780

tggaggctct ggagggtcgg gaggctctgg aggctctggg ggatctggcg ggtctggagg 3840

gtcgggatcc gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga 3900

aaatttcaaa gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga 3960

agatcatgta aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga 4020

gtcagctgaa aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt 4080

tgcaactctt cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga 4140

gagaaatgaa tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag 4200

accagaggtt gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa 4260

atacttatat gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt 4320

tgctaaaagg tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg 4380

cctgttgcca aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag 4440

actcaagtgt gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc 4500

tcgcctgagc cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga 4560

tcttaccaaa gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag 4620

ggcggacctt gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga 4680

atgctgtgaa aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga 4740

gatgcctgct gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa 4800

aaactatgct gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag 4860

gcatcctgat tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct 4920

agagaagtgc tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt 4980

taaacctctt gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca 5040

gcttggagag tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca 5100

agtgtcaact ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg 5160

ttgtaaacat cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct 5220

gaaccagtta tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg 5280

cacagaatcc ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata 5340

cgttcccaaa gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc 5400

tgagaaggag agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc 5460

caaggcaaca aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa 5520

gtgctgcaag gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc 5580

tgcaagtcaa gctgccttag gcttataggc ggccgc 5616

<210> 2

<211> 1095

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polypeptide encoded by SEQ ID NO:1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(479)

<223> VWF D碊3 region (VWF amino acids 764 - 1242)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (480)..(510)

<223> glycine/serine linker

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (511)..(1195)

<223> human albumin

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Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp

1 5 10 15

Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro

35 40 45

Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys

50 55 60

Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys

65 70 75 80

Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr

85 90 95

Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr

100 105 110

Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr

115 120 125

Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile

130 135 140

Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly

165 170 175

Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val

180 185 190

Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser

195 200 205

Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr

210 215 220

Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln

225 230 235 240

Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val

245 250 255

Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg

260 265 270

Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met

275 280 285

Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val

290 295 300

Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

305 310 315 320

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys

325 330 335

Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly

340 345 350

Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu

355 360 365

Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn

370 375 380

Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu

385 390 395 400

Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro

405 410 415

Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp

420 425 430

Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys

435 440 445

Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys

450 455 460

Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser

465 470 475 480

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

485 490 495

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ala

500 505 510

His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn

515 520 525

Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys

530 535 540

Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala

545 550 555 560

Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu

565 570 575

His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu

580 585 590

Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg

595 600 605

Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg

610 615 620

Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn

625 630 635 640

Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His

645 650 655

Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys

660 665 670

Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu

675 680 685

Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala

690 695 700

Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

705 710 715 720

Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala

725 730 735

Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His

740 745 750

Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala

755 760 765

Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys

770 775 780

Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile

785 790 795 800

Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala

805 810 815

Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala

820 825 830

Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His

835 840 845

Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu

850 855 860

Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr

865 870 875 880

Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn

885 890 895

Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys

900 905 910

Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val

915 920 925

Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly

930 935 940

Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

945 950 955 960

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys

965 970 975

Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val

980 985 990

Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val

995 1000 1005

Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile

1010 1015 1020

Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

1025 1030 1035

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln

1040 1045 1050

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys

1055 1060 1065

Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys

1070 1075 1080

Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

1085 1090 1095

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR primer alpha-2,6 sialyltransferase

<400> 3

ggacctgaag gcctgccg 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR primer alpha-2,6 sialyltransferase

<400> 4

aggaaaatgt tcttcccagg c 21

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nested PCR primer alpha-2,6 sialyltransferase

<400> 5

gcggctagcg ccaccatgat tcacaccaac ctgaaga 37

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nested PCR primer alpha-2,6 sialyltransferase

<400> 6

cgcggatccc tagcagtgaa tggtccggaa g 31

<210> 7

<211> 1221

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

atgattcaca ccaacctgaa gaaaaagttc agctgctgcg tcctggtctt tcttctgttt 60

gcagtcatct gtgtgtggaa ggaaaagaag aaagggagtt actatgattc ctttaaattg 120

caaaccaagg aattccaggt gttaaagagt ctggggaaat tggccatggg gtctgattcc 180

cagtctgtat cctcaagcag cacccaggac ccccacaggg gccgccagac cctcggcagt 240

ctcagaggcc tagccaaggc caaaccagag gcctccttcc aggtgtggaa caaggacagc 300

tcttccaaaa accttatccc taggctgcaa aagatctgga agaattacct aagcatgaac 360

aagtacaaag tgtcctacaa ggggccagga ccaggcatca agttcagtgc agaggccctg 420

cgctgccacc tccgggacca tgtgaatgta tccatggtag aggtcacaga ttttcccttc 480

aatacctctg aatgggaggg ttatctgccc aaggagagca ttaggaccaa ggctgggcct 540

tggggcaggt gtgctgttgt gtcgtcagcg ggatctctga agtcctccca actaggcaga 600

gaaatcgatg atcatgacgc agtcctgagg tttaatgggg cacccacagc caacttccaa 660

caagatgtgg gcacaaaaac taccattcgc ctgatgaact ctcagttggt taccacagag 720

aagcgcttcc tcaaagacag tttgtacaat gaaggaatcc taattgtatg ggacccatct 780

gtataccact cagatatccc aaagtggtac cagaatccgg attataattt ctttaacaac 840

tacaagactt atcgtaagct gcaccccaat cagccctttt acatcctcaa gccccagatg 900

ccttgggagc tatgggacat tcttcaagaa atctccccag aagagattca gccaaacccc 960

ccatcctctg ggatgcttgg tatcatcatc atgatgacgc tgtgtgacca ggtggatatt 1020

tatgagttcc tcccatccaa gcgcaagact gacgtgtgct actactacca gaagttcttc 1080

gatagtgcct gcacgatggg tgcctaccac ccgctgctct atgagaagaa tttggtgaag 1140

catctcaacc agggcacaga tgaggacatc tacctgcttg gaaaagccac actgcctggc 1200

ttccggacca ttcactgcta a 1221

<210> 8

<211> 8442

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(8442)

<400> 8

atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac atc cat ttg 288

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85 90 95

ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

tat gcc tcc aaa ggg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg atc gat ggc agc ggc 432

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

aac ttt caa gtc ctg ctg tca gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

ctg tgt ggc aac ttt aac atc ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

gaa ggg acc ttg acc tcg gac cct tat gac ttt gcc aac tca tgg gct 576

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

ctg agc agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tct cct ccc agc agc 624

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

tca tgc aac atc tcc tct ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

tgc cag ctt ctg aag agc acc tcg gtg ttt gcc cgc tgc cac cct ctg 720

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

gtg gac ccc gag cct ttt gtg gcc ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gcc tgc cct gcc ctc ctg gag tac gcc 816

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265 270

cgg acc tgt gcc cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cac 864

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

agc gcg tgc agc cca gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

gtg tcc cct tgc gcc agg acc tgc cag agc ctg cac atc aat gaa atg 960

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310 315 320

tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc agc tgc cct gag gga cag ctc 1008

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

ctg gat gaa ggc ctc tgc gtg gag agc acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc ctc tct cga gac tgc aac 1104

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

acc tgc att tgc cga aac agc cag tgg atc tgc agc aat gaa gaa tgt 1152

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

cca ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tca cac ttc aag agc ttt gac 1200

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

aac aga tac ttc acc ttc agt ggg atc tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405 410 415

gat tgc cag gac cac tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

cct ggc ctg cac aac agc ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

gcc atg gat ggc cag gac gtc cag ctc ccc ctc ctg aaa ggt gac ctc 1440

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

cgc atc cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc ctc agc tac ggg gag 1488

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485 490 495

gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500 505 510

tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515 520 525

ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tct ggg ctg gcg gag ccc 1632

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555 560

gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635 640

gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

660 665 670

tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795 800

agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840 845

tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890 895

tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970 975

cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

1040 1045 1050

acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060 1065

cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070 1075 1080

tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115 1120 1125

agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165 1170

cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195 1200

cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240 1245

gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

1250 1255 1260

gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270 1275

gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285 1290

gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300 1305

atc tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gcc gtg gtg gag tac cac gac 3969

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

ggc tcc cac gcc tac atc ggg ctc aag gac cgg aag cga ccg tca 4014

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

gag ctg cgg cgc att gcc agc cag gtg aag tat gcg ggc agc cag 4059

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

gtg gcc tcc acc agc gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa atc 4104

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355 1360 1365

ttc agc aag atc gac cgc cct gaa gcc tcc cgc atc gcc ctg ctc 4149

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

1370 1375 1380

ctg atg gcc agc cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg atc ccg 4239

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

1400 1405 1410

gtg ggc att ggg ccc cat gcc aac ctc aag cag atc cgc ctc atc 4284

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

1415 1420 1425

gag aag cag gcc cct gag aac aag gcc ttc gtg ctg agc agt gtg 4329

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

gat gag ctg gag cag caa agg gac gag atc gtt agc tac ctc tgt 4374

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

gac ctt gcc cct gaa gcc cct cct cct act ctg ccc ccc cac atg 4419

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

1460 1465 1470

gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg ctc ttg ggg gtt tcg acc ctg 4464

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

gaa gga tcg gac aaa att ggt gaa gcc gac ttc aac agg agc aag 4554

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

agc atc cac gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

gag tac ccc ttc agc gag gca cag tcc aaa ggg gac atc ctg cag 4689

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555 1560

cgg gtg cga gag atc cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570 1575

ggg ctg gcc ctg cgg tac ctc tct gac cac agc ttc ttg gtc agc 4779

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600 1605

gga aat cct gcc tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

1610 1615 1620

cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959

Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp

1640 1645 1650

ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala

1670 1675 1680

cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat ata ggg cct cgt ctc act 5184

Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

1715 1720 1725

cag gtg tca gtg ctg cag tat gga agc atc acc acc att gac gtg 5229

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

1730 1735 1740

cca tgg aac gtg gtc ccg gag aaa gcc cat ttg ctg agc ctt gtg 5274

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745 1750 1755

gac gtc atg cag cgg gag gga ggc ccc agc caa atc ggg gat gcc 5319

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

1760 1765 1770

ttg ggc ttt gct gtg cga tac ttg act tca gaa atg cat ggg gcg 5364

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

cgc ccg gga gcc tca aag gcg gtg gtc atc ctg gtc acg gac gtc 5409

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

tct gtg gat tca gtg gat gca gca gct gat gcc gcc agg tcc aac 5454

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

1805 1810 1815

aga gtg aca gtg ttc cct att gga att gga gat cgc tac gat gca 5499

Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

1820 1825 1830

gcc cag cta cgg atc ttg gca ggc cca gca ggc gac tcc aac gtg 5544

Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835 1840 1845

gtg aag ctc cag cga atc gaa gac ctc cct acc atg gtc acc ttg 5589

Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

1850 1855 1860

ggc aat tcc ttc ctc cac aaa ctg tgc tct gga ttt gtt agg att 5634

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

1865 1870 1875

tgc atg gat gag gat ggg aat gag aag agg ccc ggg gac gtc tgg 5679

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

1880 1885 1890

acc ttg cca gac cag tgc cac acc gtg act tgc cag cca gat ggc 5724

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

1895 1900 1905

cag acc ttg ctg aag agt cat cgg gtc aac tgt gac cgg ggg ctg 5769

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

1910 1915 1920

agg cct tcg tgc cct aac agc cag tcc cct gtt aaa gtg gaa gag 5814

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

1925 1930 1935

acc tgt ggc tgc cgc tgg acc tgc ccc tgc gtg tgc aca ggc agc 5859

Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

1940 1945 1950

tcc act cgg cac atc gtg acc ttt gat ggg cag aat ttc aag ctg 5904

Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu

1955 1960 1965

act ggc agc tgt tct tat gtc cta ttt caa aac aag gag cag gac 5949

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

1970 1975 1980

ctg gag gtg att ctc cat aat ggt gcc tgc agc cct gga gca agg 5994

Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985 1990 1995

cag ggc tgc atg aaa tcc atc gag gtg aag cac agt gcc ctc tcc 6039

Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

2000 2005 2010

gtc gag ctg cac agt gac atg gag gtg acg gtg aat ggg aga ctg 6084

Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

2015 2020 2025

gtc tct gtt cct tac gtg ggt ggg aac atg gaa gtc aac gtt tat 6129

Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

2030 2035 2040

ggt gcc atc atg cat gag gtc aga ttc aat cac ctt ggt cac atc 6174

Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile

2045 2050 2055

ttc aca ttc act cca caa aac aat gag ttc caa ctg cag ctc agc 6219

Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser

2060 2065 2070

ccc aag act ttt gct tca aag acg tat ggt ctg tgt ggg atc tgt 6264

Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys

2075 2080 2085

gat gag aac gga gcc aat gac ttc atg ctg agg gat ggc aca gtc 6309

Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

2090 2095 2100

acc aca gac tgg aaa aca ctt gtt cag gaa tgg act gtg cag cgg 6354

Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg

2105 2110 2115

cca ggg cag acg tgc cag ccc atc ctg gag gag cag tgt ctt gtc 6399

Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

2120 2125 2130

ccc gac agc tcc cac tgc cag gtc ctc ctc tta cca ctg ttt gct 6444

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135 2140 2145

gaa tgc cac aag gtc ctg gct cca gcc aca ttc tat gcc atc tgc 6489

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

2150 2155 2160

cag cag gac agt tgc cac cag gag caa gtg tgt gag gtg atc gcc 6534

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala

2165 2170 2175

tct tat gcc cac ctc tgt cgg acc aac ggg gtc tgc gtt gac tgg 6579

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

2180 2185 2190

agg aca cct gat ttc tgt gct atg tca tgc cca cca tct ctg gtt 6624

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200 2205

tat aac cac tgt gag cat ggc tgt ccc cgg cac tgt gat ggc aac 6669

Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn

2210 2215 2220

gtg agc tcc tgt ggg gac cat ccc tcc gaa ggc tgt ttc tgc cct 6714

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

2225 2230 2235

cca gat aaa gtc atg ttg gaa ggc agc tgt gtc cct gaa gag gcc 6759

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240 2245 2250

tgc act cag tgc att ggt gag gat gga gtc cag cac cag ttc ctg 6804

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255 2260 2265

gaa gcc tgg gtc ccg gac cac cag ccc tgt cag atc tgc aca tgc 6849

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys

2270 2275 2280

ctc agc ggg cgg aag gtc aac tgc aca acg cag ccc tgc ccc acg 6894

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285 2290 2295

gcc aaa gct ccc acg tgt ggc ctg tgt gaa gta gcc cgc ctc cgc 6939

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300 2305 2310

cag aat gca gac cag tgc tgc ccc gag tat gag tgt gtg tgt gac 6984

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315 2320 2325

cca gtg agc tgt gac ctg ccc cca gtg cct cac tgt gaa cgt ggc 7029

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

2330 2335 2340

ctc cag ccc aca ctg acc aac cct ggc gag tgc aga ccc aac ttc 7074

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

2345 2350 2355

acc tgc gcc tgc agg aag gag gag tgc aaa aga gtg tcc cca ccc 7119

Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro

2360 2365 2370

tcc tgc ccc ccg cac cgt ttg ccc acc ctt cgg aag acc cag tgc 7164

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

2375 2380 2385

tgt gat gag tat gag tgt gcc tgc aac tgt gtc aac tcc aca gtg 7209

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

2390 2395 2400

agc tgt ccc ctt ggg tac ttg gcc tca acc gcc acc aat gac tgt 7254

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

2405 2410 2415

ggc tgt acc aca acc acc tgc ctt ccc gac aag gtg tgt gtc cac 7299

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420 2425 2430

cga agc acc atc tac cct gtg ggc cag ttc tgg gag gag ggc tgc 7344

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

2435 2440 2445

gat gtg tgc acc tgc acc gac atg gag gat gcc gtg atg ggc ctc 7389

Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

2450 2455 2460

cgc gtg gcc cag tgc tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

2465 2470 2475

tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485 2490

tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

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gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

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ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614

Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

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gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659

Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu

2540 2545 2550

gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

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gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

2570 2575 2580

ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794

Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp

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gtg tgc acg acc tgc cgc tgc atg gtg cag gtg ggg gtc atc tct 7839

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser

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gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

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ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

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tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile

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atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

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cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

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agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

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gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154

Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

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tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

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gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

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tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp

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atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334

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gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424

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195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys

515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg

740 745 750

Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln

755 760 765

Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met

770 775 780

Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro

785 790 795 800

Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu

805 810 815

Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn

820 825 830

Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln

835 840 845

Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu

850 855 860

Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu

865 870 875 880

Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser

885 890 895

Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala

900 905 910

Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe

915 920 925

Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys

930 935 940

Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His

945 950 955 960

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn

965 970 975

Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe

980 985 990

Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu

995 1000 1005

Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr

1010 1015 1020

Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met

1025 1030 1035

Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg

1040 1045 1050

Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile

1055 1060 1065

His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr

1070 1075 1080

Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val

1085 1090 1095

Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu

1100 1105 1110

Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val

1115 1120 1125

Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His

1130 1135 1140

Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp

1145 1150 1155

Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala

1160 1165 1170

Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu

1175 1180 1185

Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln

1190 1195 1200

Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser

1205 1210 1215

Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly

1220 1225 1230

Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys

1235 1240 1245

His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu

1250 1255 1260

His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu

1265 1270 1275

Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu

1280 1285 1290

Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe

1295 1300 1305

Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His

1310 1315 1320

Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro

1325 1330 1335

Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr

1340 1345 1350

Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr

1355 1360 1365

Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp

1370 1375 1380

Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn

1385 1390 1395

Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu

1400 1405 1410

Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln

1415 1420 1425

Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu

1430 1435 1440

Tyr

<210> 11

<211> 585

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 12

<211> 1023

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

atggtgaccc tgcggaagag gaccctgaaa gtgctcacct tcctcgtgct cttcatcttc 60

ctcacctcct tcttcctgaa ctactcccac accatggtgg ccaccacctg gttccccaag 120

cagatggtcc tggagctctc cgagaacctg aagagactga tcaagcacag gccttgcacc 180

tgcacccact gcatcgggca gcgcaagctc tcggcctggt tcgatgagag gttcaaccag 240

accatgcagc cgctgctgac cgcccagaac gcgctcttgg aggacgacac ctaccgatgg 300

tggctgaggc tccagcggga gaagaagccc aataacttga atgacaccat caaggagctg 360

ttcagagtgg tgcctgggaa tgtggaccct atgctggaga agaggtcggt gggctgccgg 420

cgctgcgccg ttgtgggcaa ctcgggcaac ctgagggagt cttcttatgg gcctgagata 480

gacagtcacg actttgtcct caggatgaac aaggcgccca cggcagggtt tgaagctgat 540

gttgggacca agaccaccca ccatctggtg taccctgaga gcttccggga gctgggagat 600

aatgtcagca tgatcctggt gcccttcaag accatcgact tggagtgggt ggtgagcgcc 660

atcaccacgg gcaccatttc ccacacctac atcccggttc ctgcaaagat cagagtgaaa 720

caggataaga tcctgatcta ccacccagcc ttcatcaagt atgtctttga caactggctg 780

caagggcacg ggcgataccc atctaccggc atcctctcgg tcatcttctc aatgcatgtc 840

tgcgatgagg tggacttgta cggcttcggg gcagacagca aagggaactg gcaccactac 900

tgggagaaca acccatccgc gggggctttt cgcaagacgg gggtgcacga tgcagacttt 960

gagtctaacg tgacggccac cttggcctcc atcaataaaa tccggatctt caaggggaga 1020

tga 1023

Claims (18)

1.产生糖蛋白的方法，所述糖蛋白由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成；

所述方法包括(i)提供包含编码所述糖蛋白的多肽的核酸的CHO细胞，和(ii)在低于36.0℃的温度培养所述CHO细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞还包含编码唾液酸转移酶的重组核酸，并且其中所述唾液酸转移酶是α-2,6-唾液酸转移酶或α-2,3-唾液酸转移酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(ii)之前，在37.0℃±1.0℃的温度培养所述细胞，并且步骤(ii)包括在34.0℃±2.0℃的温度培养所述细胞。

4.根据权利要求1或2的方法，还包括(i)使根据权利要求1或2获得的糖蛋白进行离子交换层析，由此将具有高唾液酸化的糖蛋白与具有低唾液酸化的糖蛋白分离；并收集从离子交换柱洗脱的具有高唾液酸化的级分；或(ii)将根据权利要求1或2获得的糖蛋白与唾液酸转移酶和唾液酸供体体外接触。

5.根据权利要求1或2的方法，其中所获得的糖蛋白中至少75％的N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。

6.根据权利要求1或2的方法，其中平均至少50％的所获得的糖蛋白以二聚体形式存在。

7.糖蛋白，所述糖蛋白由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成；并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，

i)其中至少75％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分，和/或

ii)其中小于35％的所述N-聚糖平均包含两个或更多个末端和非唾液酸化的半乳糖残基，和/或

iii)其中小于6％的所述N-聚糖平均包含三个或更多个末端和非唾液酸化的半乳糖残基。

8.根据权利要求7所述的糖蛋白，i)其中至少80％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。

9.根据权利要求7所述的糖蛋白，i)其中至少85％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。

10.根据权利要求7所述的糖蛋白，其中至少70％的所述N-聚糖平均包含至少一个α-2,6-唾液酸部分或至少一个α-2,3-唾液酸部分。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的糖蛋白，还包含与所述糖蛋白缀合的半衰期延长部分。

12.根据权利要求7至10中任一项所述的糖蛋白，其中所述糖蛋白是二聚体。

13.根据权利要求12所述的二聚体糖蛋白，其中所述二聚体糖蛋白对FVIII的亲和力大于单体糖蛋白对所述FVIII的亲和力，其中所述单体糖蛋白具有与二聚体糖蛋白相同的氨基酸序列。

14.药物组合物，其包含权利要求7至13中任一项所述的糖蛋白和药学上可接受的赋形剂。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述组合物中至少50％的所述糖蛋白以二聚体形式存在。

16.如权利要求7至13中任一项所定义的糖蛋白，其用于治疗凝血障碍，所述治疗包括向受试者施用有效量的所述糖蛋白和有效量的FVIII，其中静脉内或皮下施用所述糖蛋白，并且静脉内或皮下施用所述FVIII。

17.根据权利要求16所述的糖蛋白，其中与单独使用所述FVIII的治疗相比，通过共同施用所述糖蛋白增加所述FVIII的平均停留时间(MRT)和/或降低所述FVIII的清除率；和/或其中与单独使用所述FVIII的治疗相比，降低所述FVIII的施用频率。

18.药盒，其包含(i)FVIII和(ii)权利要求7至13中任一项所定义的糖蛋白，所述药盒用于同时、分开或顺序用于治疗凝血障碍。

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