TW201731488A - 重組ｖｗｆ調配物 - Google Patents

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彼得 杜瑞柴克
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Abstract

本發明提供重組溫韋伯氏因子(rVWF)之長期穩定醫藥調配物及製備及投予該等調配物之方法。

Description

重組VWF調配物
本申請案主張2007年12月28日申請之美國臨時申請案第61/017,418號及2007年12月31日申請之美國臨時申請案第61/017,881號之優先權，該等申請案中之每一者皆以全文引用的方式併入本文中。
大體而言，本發明係關於重組VWF之調配物及製備包含重組VWF之組合物的方法。
溫韋伯氏因子(Von Willebrand factor，VWF)為以尺寸範圍為約500至20,000kD之一系列多聚物形式於血漿中循環的醣蛋白。多聚形式之VWF包含藉由二硫鍵連接在一起之250kD多肽亞單位。VWF介導初始血小板黏著於受損血管壁之下內皮細胞。僅較大多聚物展現止血活性。咸假定內皮細胞分泌大聚合形式之VWF且VWF中具有低分子量形式者(低分子量VWF)由蛋白水解裂解產生。具有大分子量之多聚物係儲存於內皮細胞之魏貝爾-帕拉德小體(Weibel-Pallade body)中且在刺激之後釋放。
VWF係由內皮細胞及巨核細胞以基本上由重複域組成之前原VWF(prepro-VWF)形式合成。信號肽裂解之後，原VWF(pro-VWF)經由其C末端區處之二硫連接二聚化。二聚體充當多聚化之原聚體，該多聚化受制 於游離末端之間的二硫連接。繼組裝為多聚體後，蛋白水解移除前肽序列(Leyte等人，Biochem.J.274(1991),257-261)。
自VWF之經選殖cDNA預測出的主要轉譯產物為2813個殘基之前驅多肽(前原VWF)。前原VWF由22個胺基酸之信號肽及741個胺基酸之前肽組成，而成熟VWF包含2050個胺基酸(Ruggeri Z.A.及Ware,J.,FASEB J.,308-316(1993))。
VWF之缺失為溫韋伯氏病(Von Willebrand disease，VWD)之病因，該疾病之特徵在於程度不同之顯著出血表型。第3型VWD為VWF完全丟失之最嚴重形式，而第1型VWD與VWF之定量損失有關且其表型可極輕微。第2型VWD與VWF之定性缺失有關且可與第3型VWD同樣嚴重。第2型VWD具有多種亞型，一些亞型與高分子量多聚體之損失或減少相關。第2a型溫韋伯氏症候群(Von Willebrand syndrome type 2a，VWS-2A)之特徵在於中間體與大多聚體皆損失。VWS-2B之特徵在於最高分子量多聚體損失。與VWF有關之其他疾病及病症為技術領域中所已知。
美國專利第6,531,577號、第7,166,709號及歐洲專利申請案第04380188.5號描述血漿衍生之VWF調配物。然而，除關於血漿衍生VWF之量及純度問題外，亦存在血液傳播病原體之風險(例如，病毒及變異型庫賈氏病(Variant Creutzfeldt-Jakob disease，vCJD))。
因此，於技術領域中對開發包含重組VWF之穩定醫藥調配物存在需求。
本發明提供適用於包含重組VWF之組合物的調配物，其產生高度穩定之醫藥組合物。該穩定醫藥組合物適用作治療患有可受益於重組VWF投藥 之病症或病狀的個體之治療劑。
在一具體態樣中，本發明提供一種重組溫韋伯氏因子(rVWF)之穩定液體醫藥調配物，其包含：(a)rVWF；(b)緩衝劑；(c)一或多種鹽；(d)視情況的穩定劑；及(e)視情況的界面活性劑；其中該rVWF包含選自由以下者所組成之群組的多肽：a)SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列；b)a)之生物活性類似物、片段或變異體；c)由SEQ ID NO：1中所示之聚核苷酸編碼的多肽；d)c)之生物活性類似物、片段或變異體；及e)由在中等嚴格雜交條件下與SEQ ID NO：1中所示之聚核苷酸雜交之聚核苷酸編碼的多肽；其中該緩衝液包含約0.1mM至約500mM範圍內之pH緩衝劑且其中pH在約2.0至約12.0之範圍內；其中該鹽濃度為約1mM至500mM；其中該穩定劑濃度為約0.1mM至1000mM；且其中該界面活性劑濃度為約0.01g/L至0.5g/L。
在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中rVWF包含SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列。在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中緩衝劑係選自由檸檬酸鈉、甘胺酸、組胺酸、Tris及此等藥劑之組合所組成之群組。在又一具體態樣中，提供上述調配物，其中緩衝劑為檸檬酸鹽。在本發明之又一具體態樣中，提供上述調配物，其中pH在6.0-8.0或6.5-7.3之範圍內。在一相關具體態樣中，提供上述調配物，其中pH為7.0。在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中緩衝劑為檸檬酸鹽且pH為7.0。
在又一具體態樣中，提供上述調配物，其中鹽係選自由氯化鈣、氯化鈉及氯化鎂所組成之群組。在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中鹽濃度在0.5mM至300mM之範圍內。在另一具體態樣中，提供上述調配物， 其中鹽為濃度為10mM之氯化鈣。
在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中rVWF包含SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列；其中緩衝劑為檸檬酸鹽且pH為7.0；且其中鹽為濃度為10mM之氯化鈣。在又一具體態樣中，提供上述調配物，其中rVWF包含SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列；其中緩衝劑為檸檬酸鈉且pH為7.0；且其中鹽為濃度為10mM之氯化鈣及濃度為100mM之NaCl。
其他調配物亦涵蓋於本發明中。舉例而言，在一具體態樣中，提供上述調配物，其中一或多種緩衝劑為濃度各自為3.3mM之組胺酸及Tris。在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中pH為7.0。在又一具體態樣中，提供上述調配物，其中第一鹽為濃度為30mM之氯化鈉且第二鹽為濃度為0.56mM之氯化鈣。
在本發明之又一具體態樣中，提供上述調配物，其中穩定劑係選自由以下者所組成之群組：甘露糖醇、乳糖、山梨糖醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纖維二糖、龍膽二糖、異麥芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖及此等穩定劑之組合。在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中穩定劑為濃度為7.8mM之海藻糖及濃度為58.6mM之甘露糖醇。
在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中界面活性劑係選自由毛地黃皂苷(digitonin)、Triton X-100、Triton X-114、TWEEN-20、TWEEN-80及此等界面活性劑之組合所組成之群組。在另一具體態樣中，提供上述調配物，其中界面活性劑為0.03g/L之TWEEN-80。
在本發明之一具體態樣中，提供上述調配物，其中rVWF包含SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列；其中緩衝劑為濃度為3.3mM之組胺酸及濃度為3.3mM之Tris(pH 7.0)；其中第一鹽為濃度為30mM之氯化鈉且第二鹽為濃度為0.56mM之氯化鈣；其中穩定劑為濃度為7.8mM之海藻糖及濃度為58.6mM之甘露糖醇；且其中界面活性劑為0.03g/L之TWEEN-80。
圖1展示由於麩胱甘肽之存在，26週後rVWF在Advate緩衝液中不穩定。
圖2展示於4℃下rVWF在Advate 1：3緩衝液中穩定持續至多12週。
圖3展示基於檸檬酸鹽之調配物的穩定性好於含有0.1M麩胱甘肽之Advate 1：3緩衝液調配物。
圖4展示在Advate緩衝液中在26週期間rVWF濃度穩定。
圖5展示在Advate 1：3緩衝液中rVWF濃度隨時間穩定。
圖6展示在基於檸檬酸鹽之緩衝液中rVWF濃度隨時間穩定。
圖7展示大多數賦形劑使rVWF之展開溫度增加約1℃或2℃。
圖8展示10mM CaCl2使rVWF之展開溫度增加約8℃至約67℃。
圖9展示CaCl2之作用在pH 7.3及pH 6.5下類似。
術語之定義
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬技術領域內之一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。以下參考案對熟習技能者提供本發明中所使用之許多術語的通用定義：Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2 版1994)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker編，1988)；THE GLOSSARY OF GENETICS，第5版，R.Rieger等人(編)，Springer Verlag(1991)；及Hale及Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。
各公開案、專利申請案、專利及本文所引用之其他參考案均以全文引用的方式併入本文中，該引用的程度並非與本揭示案不一致。
此處應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指代物。
如本文中所使用，除非另外規定，否則以下術語具有歸於其之含義。
關於肽化合物之術語「包含(comprising)」意謂化合物可於給定序列之胺基與羧基末端中任一者或兩者處包括額外胺基酸。當然，此等額外胺基酸應不顯著干擾該化合物之活性。關於本發明之組合物，術語「包含(comprising)」意謂組合物可包括額外組份。此等額外組份應不顯著干擾該組合物之活性。
術語「藥理學活性(pharmacologically active)」意謂如此所述之物質經測定具有影響醫學參數(例如，但不限於血壓、血細胞計數、膽固醇含量)或疾病病況(例如，但不限於癌症、自體免疫病症)之活性。
如本文中所使用，術語「表現(express/expressing/expression)」意謂允許或使基因或DNA序列中之資訊變得顯現，例如藉由活化轉錄及轉譯相應基因或DNA序列所涉及之細胞功能來產生蛋白質。DNA序列表現於細胞中或藉由細胞表現以形成諸如蛋白質之「表現產物(expression product)」。表 現產物自身(例如所得蛋白質)亦可稱為「經表現(expressed)」。表現產物之特徵可為細胞內、細胞外或分泌型產物。術語「細胞內(intracellular)」意謂在細胞內。術語「細胞外(extracellular)」意謂在細胞外，諸如跨膜蛋白。若物質在很大程度上自細胞上或細胞內之某處出現在細胞外，則其由細胞「分泌(secreted)」。
如本文中所使用，「多肽(polypeptide)」係指包含經由肽鍵連接之胺基酸殘基、結構變異體、相關天然存在之結構變異體及其合成非天然存在類似物的聚合物。合成多肽可例如使用自動多肽合成器來製備。術語「蛋白質(protein)」通常指大的多肽。術語「肽(peptide)」通常指短的多肽。
如本文中所使用，多肽之「片段(fragment)」欲指多肽或蛋白質之小於全長多肽或蛋白質表現產物的任何部分。
如本文中所使用，「類似物(analog)」係指結構實質上類似且具有相同生物活性、但可具有不同程度之活性之兩種或兩種以上多肽中的任一者，完整分子，或其片段。基於涉及一或多個胺基酸取代其他胺基酸之一或多個突變，類似物在其胺基酸序列之組成方面不同。基於經置換之胺基酸及置換其之胺基酸的物理化學或功能相關性，取代可為保守或非保守的。
如本文中所使用，「變異體(variant)」係指經修飾以包含通常不為分子之一部分之其他化學部分的多肽、蛋白質或其類似物。該等部分可調節分子之可溶性、吸收、生物半衰期等。或者，該等部分可降低分子之毒性且消除或減少分子之不良副作用等。能夠介導該等作用之部分揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)中。用於使該等部分偶合於分子之程序為技術領域中所熟知。舉例而言，變異體可為具有賦予蛋白質較長活 體內半衰期之化學修飾的凝血因子。在各種態樣中，多肽藉由糖基化、聚乙二醇化及/或聚唾液酸化來修飾。
重組VWF
前原VWF之聚核苷酸及胺基酸序列分別於SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2中闡明，且分別可以GenBank寄存編號NM_000552及NP_000543獲得。對應於成熟VWF蛋白質之胺基酸序列於SEQ ID NO：3中闡明(對應於全長前原VWF胺基酸序列之胺基酸764-2813)。
一種形式之適用rVWF至少具有活體內穩定(例如結合)至少一種因子VIII(FVIII)分子及視情況的具有藥理學上可接受之糖基化模式的特性。其特定實例包括無A2域、因此抗蛋白水解之VWF(Lankhof等人，Thromb.Haemost.77：1008-1013,1997)，及包括醣蛋白lb結合域及對膠原蛋白及肝素之結合位點的Val 449至Asn 730之VWF片段(Pietu等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.164：1339-1347,1989)。對VWF穩定至少一種FVIII分子之能力的測定可根據現有技術中已知之方法在VWF缺陷型哺乳動物中進行。
本發明之rVWF可藉由技術領域中已知之任何方法來產生。一特定實例揭示於1986年10月23日公開之WO86/06096及1990年7月23日申請之美國專利申請案第07/559,509號中，該等案關於產生重組VWF之方法以引用的方式併入本文中。因此，用於下述之方法為技術領域中所已知：(i)藉由遺傳工程化產生重組DNA，例如經由RNA之逆轉錄及/或DNA之擴增；(ii)藉由轉染將重組DNA引入原核或真核細胞，例如經由電穿孔或顯微注射；(iii)培養該等經轉形之細胞，例如以連續或分批方式；(iv)表現 VWF，例如原構性表現或在誘導之後表現；及(v)分離該VWF，例如自培養基或藉由收穫經轉形之細胞；以便(vi)獲得經純化之rVWF，例如經由陰離子交換層析法或親和力層析法。重組VWF可在經轉形之宿主細胞中使用技術領域中熟知之重組DNA技術來產生。舉例而言，可使用合適限制酶自DNA切離編碼多肽之序列。
或者，DNA分子可使用化學合成技術合成，諸如胺基磷酸酯方法。又，可使用此等技術之組合。
本發明亦提供在適當宿主中編碼本發明之多肽的載體。該載體包含編碼多肽的操作性連接於適當表現控制序列之聚核苷酸。在聚核苷酸插入載體中之前或之後實現此操作性連接之方法眾所周知。表現控制序列包括啟動子、活化子、增強子、操縱子、核糖體結合位點、起始信號、終止信號、帽信號、聚腺苷酸化信號及控制轉錄或轉譯所涉及之其他信號。其中具有聚核苷酸之所得載體用於使宿主轉形。此轉形可使用技術領域中熟知之方法來執行。
大量可獲得且熟知之宿主細胞中的任一者可用於實施本發明。特定宿主之選擇取決於由技術領域公認之多種因素，包括(例如)與所選表現載體之相容性、由DNA分子編碼之肽的毒性、轉形速率、肽回收容易性、表現特徵、生物安全性及成本。必須達到此等因素之平衡，其條件為並非所有宿主細胞同樣有效地表現特定DNA序列。在此等通用準則中，適用微生物宿主細胞包括培養物中之細菌、酵母及其他真菌、昆蟲、植物、哺乳動物(包括人類)細胞，或技術領域中已知之其他宿主。
隨後，培養及純化經轉形之宿主。可在習知醱酵條件下培養宿主細胞 以使所需化合物得以表現。該等醱酵條件為技術領域中所熟知。最後，藉由技術領域中熟知之方法自培養物中純化多肽。
視用於表現本發明之化合物的宿主細胞而定，碳水化合物(寡醣)基團可便利地連接於已知為蛋白質中之糖基化位點的位點。一般而言，當其為序列Asn-X-Ser/Thr之一部分時，其中X可為除脯胺酸外之任何胺基酸，O-連接的寡醣連接於絲胺酸(Ser)或蘇胺酸(Thr)殘基，而N-連接的寡醣連接於天冬醯胺(Asn)殘基。X較佳為不包括脯胺酸之19種天然存在胺基酸中之一者。各類型中存在之N-連接的及O-連接的寡醣之結構及糖殘基不同。通常在兩者上均存在之一種類型之糖為N-乙醯神經胺酸(稱為唾液酸)。唾液酸通常為N-連接的與O-連接的寡醣之末端殘基且藉助於其負電荷可賦予糖基化化合物酸性特性。可將該(該等)位點併入本發明之化合物的連接子中且較佳在重組產生多肽化合物期間藉由細胞糖基化(例如在諸如CHO、BHK、COS之哺乳動物細胞中)。然而，該等位點可進一步藉由技術領域中已知之合成或半合成程序來糖基化。
或者，化合物可藉由合成方法製備。舉例而言，可使用固相合成技術。合適技術為技術領域中所熟知，且包括以下文獻中所述者：Merrifield(1973),Chem.Polypeptides，第335-61頁(Katsoyannis及Panayotis編)；Merrifield(1963),J.Am.Chem.Soc.85：2149；Davis等人(1985),Biochem.Intl.10：394-414；Stewart及Young(1969),Solid Phase Peptide Synthesis；美國專利第3,941,763號；Finn等人(1976),The Proteins(第3版)2：105-253；及Erickson等人(1976),The Proteins(第3版)2：257-527。固相合成為製備個別肽之較佳技術，因為其為製備小肽之最成本有效方法。
VWF之片段、變異體及類似物
用於製備多肽片段、變異體或類似物之方法為技術領域中所熟知。
使用(但不限於)酶促裂解(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)以及使用重組方法以產生具有特定胺基酸序列之多肽片段來製備多肽之片段。可產生包含具有特定活性之蛋白質區域(諸如多聚化域或技術領域中已知之任何其他可鑑別VWF域)的多肽片段。
製備多肽類似物之方法亦眾所周知。多肽之胺基酸序列類似物可為取代、插入、添加或缺失類似物。包括多肽片段之缺失類似物缺乏天然蛋白質之一或多個對於功能或免疫原性活性非必需之殘基。插入類似物包括於多肽中之非末端點處添加(例如)胺基酸。此類似物可包括插入免疫活性抗原決定基或僅單個殘基。包括多肽片段之添加類似物包括於蛋白質之兩個末端中的任一者處添加一或多個胺基酸且包括(例如)融合蛋白。
取代類似物通常於蛋白質內之一或多個位點處將野生型之一個胺基酸換成另一胺基酸，且可經設計以調節多肽之一或多種特性而不損失其他功能或特性。在一態樣中，取代為保守性取代。「保守性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」意謂將一胺基酸用具有類似化學特性之側鏈的胺基酸取代。用於產生保守性取代之類似胺基酸包括具有以下側鏈者：酸性側鏈(麩胺酸、天冬胺酸)；鹼性側鏈(精胺酸、離胺酸、組胺酸)；極性醯胺側鏈(麩胺醯胺、天冬醯胺)；疏水性脂族側鏈(白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸)；芳族側鏈(苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸)；小側鏈(甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸)；或脂族羥基側鏈(絲胺酸、蘇胺酸)。
類似物可實質上同源或實質上與其所來源之重組VWF相同。較佳類似物為保留野生型多肽之至少一些生物活性(例如凝血活性)者。
所涵蓋之多肽變異體包括藉由諸如以下技術化學修飾之多肽：泛素化、包括聚唾液酸化(polysialation)之糖基化、與治療劑或診斷劑接合、標記、諸如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)之共價聚合物連接、引入不可水解之鍵及藉由化學合成通常人類蛋白質中不存在之胺基酸(諸如鳥胺酸)的插入或取代。變異體保留本發明之未經修飾之分子的相同或基本上相同之結合特性。該化學修飾可包括使藥劑直接或間接(例如經由連接子)連接於VWF多肽。在間接連接之情況下，預期連接子可為可水解或不可水解連接子。
製備聚乙二醇化多肽類似物通常將包含以下步驟：(a)在使結合構築體多肽連接於一或多個PEG基團的條件下使多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應；及(b)獲得反應產物。一般而言，醯化反應之最佳反應條件將根據已知參數及所需結果來確定。舉例而言，PEG：蛋白質之比率愈大，聚聚乙二醇化產物之百分比愈大。在一些具體態樣中，結合構築體將於N-末端處具有單一PEG部分。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)可連接於凝血因子以提供較長活體內半衰期。PEG基團可具有任何適宜分子量且可為線性或分枝基團。PEG之平均分子量在約2千道爾頓(kiloDalton，「kD」)至約100kDa、約5kDa至約50kDa或約5kDa至約10kDa之範圍內。藉由經由PEG部分上之天然或工程化反應性基團(例如醛、胺基、硫醇或酯基)與凝血因子上之反應性基團(例如醛、胺基或酯基)醯化或還原烷基化或藉由技術領域中已知之任何其他技術使PEG基團連接 於凝血因子。
用於製備聚唾液酸化多肽之方法描述於美國專利公開案20060160948，Fernandes et Gregoriadis；Biochim.Biophys.Acta 1341：26-34,1997，及Saenko等人，Haemophilia 12：42-51,2006中。簡言之，於室溫下在黑暗中攪拌含有0.1M NaIO4之多聚乙醯神經胺糖酸的溶液以使CA氧化。在黑暗中以例如0.05M磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)透析經活化之CA溶液且將此溶液添加至rVWF溶液中且於室溫下在黑暗中在平緩震盪下培養18h。隨後可藉由超濾/透濾將游離試劑自rVWF-聚唾液酸接合物分離。rVWF與聚唾液酸之接合亦可使用戊二醛作為交聯試劑來達成(Migneault等人，Biotechniques 37：790-796,2004)。
進一步預期本發明之多肽可為與第二藥劑之融合蛋白，該第二藥劑為多肽。在一具體態樣中，為多肽之第二藥劑為(但不限於)酶、生長因子、抗體、細胞激素、趨化因子、細胞表面受體、細胞表面受體之胞外域、細胞黏著分子或上述蛋白質之片段或活性域。在一相關具體態樣中，第二藥劑為凝血因子，諸如因子VIII、因子VII、因子IX。所預期之融合蛋白藉由技術領域中熟知之化學或重組技術來製備。
亦預期前原VWF及原VWF多肽可提供本發明之調配物的治療益處。舉例而言，美國專利第7,005,502號描述一種醫藥製劑，其包含大量誘導活體外產生凝血酶之原VWF。除天然存在之成熟VWF的重組生物活性片段、變異體或類似物外，本發明亦涵蓋前原VWF(SEQ ID NO：2中所示)或原VWF多肽(SEQ ID NO：2之胺基酸殘基23至764)之重組生物活性片段、變異體或類似物於本文所述之調配物中的用途。
編碼片段、變異體及類似物之聚核苷酸可易於藉由熟習技術者產生以編碼天然存在分子之具有與天然存在分子相同或類似之生物活性的生物活性片段、變異體或類似物。此等聚核苷酸可使用PCR技術、DNA編碼分子之消化/連接及其類似技術來製備。因此，熟習此項技術者將能夠使用技術領域中已知之任何方法(包括，但不限於位點特異性突變誘發)產生DNA股之單一鹼基改變以產生經改造密碼子及錯義突變。如本文中所使用，片語「中等嚴格雜交條件(moderately stringent hybridization conditions)」意謂(例如)於42℃下在50%甲醯胺中雜交及於60℃下在0.1×SSC、0.1% SDS中洗滌。熟習此項技術者應瞭解，基於欲雜交之序列的長度及GC核苷酸鹼基含量進行此等條件之變化。技術領域中之配方標準適於確定確切雜交條件。參見Sambrook等人，9.47-9.51，於Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中。
通用調配物及賦形劑
賦形劑為包括於調配物中之添加劑，因為其賦予或增強藥品之穩定性及傳遞。不考慮包括其之理由，賦形劑為藥品之必要組份且因此需要為安全的且患者良好耐受。對於蛋白質藥物而言，賦形劑之選擇尤為重要，因為其會影響藥物之功效與免疫原性。因此，需要在適當選擇提供合適之穩定性、安全性及可銷售性的賦形劑情況下開發蛋白質調配物。
開發用於治療性蛋白質之調配物的主要挑戰在於使產品相對於製造、運輸及儲存之壓力穩定。調配物賦形劑之作用在於提供相對於此等壓力之穩定化作用。亦可利用賦形劑以降低高濃度蛋白質調配物之黏度以便使其能夠傳遞且增強患者便利性。一般而言，賦形劑可基於其使蛋白質相對於 各種化學及物理壓力穩定之機制加以分類。一些賦形劑用於減輕特定壓力之作用或調節特定蛋白質之特定敏感性。其他賦形劑對蛋白質之物理及共價穩定性具有更普遍作用。本文所述之賦形劑藉由其化學類型或其於調配物中之功能作用來編組。當論述各賦形劑類型時，提供對穩定化方式之簡短描述。
鑒於本文提供之教示內容及指導，熟習此項技術者將瞭解何量或何範圍之賦形劑可包括於任何特定調配物中以得到促進保留生物藥物(例如多肽)之穩定性的本發明之生物醫藥調配物。舉例而言，欲包括於本發明之生物醫藥調配物中之鹽的量及類型可根據最終溶液之所需滲透壓度(亦即等滲、低滲或高滲)以及欲包括於調配物中之其他組份的量及滲透壓度來選擇。類似地，藉由參考包括於調配物中之多元醇或糖的類型來例示，該賦形劑之量將視其滲透壓度而定。
舉例而言，包括約5%山梨糖醇可達成等滲性，而需要約9%蔗糖賦形劑達成等滲性。可包括於本發明之生物醫藥調配物內的一或多種賦形劑之濃度之量或範圍的選擇已在上文參考鹽、多元醇及糖加以例示。然而，熟習此項技術者應瞭解，本文所述且進一步參考特定賦形劑加以例示之考慮因素同樣適用於賦形劑之所有類型及組合，包括(例如)鹽、胺基酸、其他滲透劑、界面活性劑、穩定劑、膨化劑、冷凍保護劑、凍乾保護劑、抗氧化劑、金屬離子、螯合劑及/或防腐劑。
此外，當以莫耳濃度報導特定賦形劑時，熟習此項技術者將認識到亦涵蓋溶液之當量百分比(%)w/v(例如(溶液樣品中之物質的公克數/溶液毫升數)×100%)。
當然，一般熟習此項技術者將認識到本文所述之賦形劑的濃度在特定調配物中具有互依性。舉例而言，當例如存在高多肽濃度時或當例如存在高穩定劑濃度時，可降低膨化劑之濃度。另外，一般熟習此項技術者將認識到為維持不存在膨化劑之特定調配物的等滲性，將相應地調節穩定劑之濃度(亦即，將使用「滲透(tonicifying)」量之穩定劑)。常見賦形劑為技術領域中所已知且可見於Powell等人，Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations(1998),PDA J.Pharm.Sci.Technology,52：238-311中。
緩衝液及緩衝劑
通常觀察到藥理學活性多肽調配物之穩定性在窄pH範圍內最大。最佳穩定性之此pH範圍需要早先在預調配物研究期間鑑別。已證明諸如加速穩定性研究及量熱篩選研究之數種方法適用於此目的(Remmele R.L.Jr.等人，Biochemistry,38(16)：5241-7(1999))。完成調配物之後，藥品須在其整個儲存期限內製造及保存。因此，幾乎總是利用緩衝劑來控制調配物之pH。
通常將有機酸、磷酸鹽及Tris用作蛋白質調配物中之緩衝液。緩衝物質之緩衝能力在等於pKa之pH下最大且當pH增加或減小遠離此值時緩衝能力降低。90%之緩衝能力存在於其pKa之一個pH單位內。緩衝能力亦隨緩衝濃度增加而相稱地增加。
當選擇緩衝液時需要考慮數種因素。首先，緩衝液物質及其濃度需要根據其pKa及所需調配物pH來確定。確保緩衝液與多肽及其他調配物賦形劑相容且不催化任何降解反應同樣重要。欲考慮之第三重要態樣為投藥之後緩衝液可能誘發之刺痛及刺激的感覺。舉例而言，已知檸檬酸鹽在注射之後引起刺痛(Laursen T等人，Basic Clin Pharmacol Toxicol.,98(2)：218-21 (2006))。刺痛及刺激之可能性對於經由皮下(SC)或肌肉內(IM)途徑投予之藥物(在此情況下藥物溶液殘留於部位處歷時相對較長時間段)而言比藉由靜脈內(IV)途徑投予(在此情況下調配物在投藥之後迅速稀釋至血液中)更大。對於藉由直接IV輸液投予之調配物而言，需要監控緩衝液(及任何其他調配物組份)之總量。須尤其留意以磷酸鉀緩衝液之形式投予的鉀離子，其可誘發患者之心血管作用(Hollander-Rodriguez JC等人，Am.Fam.Physician.,73(2)：283-90(2006))。
選擇生理學上相容且維持醫藥調配物之所需pH的存在於組合物中之緩衝系統。在一具體態樣中，溶液之pH介於pH 2.0與pH 12.0之間。舉例而言，溶液之pH可為2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7、4.0、4.3、4.5、4.7、5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.7、8.0、8.3、8.5、8.7、9.0、9.3、9.5、9.7、10.0、10.3、10.5、10.7、11.0、11.3、11.5、11.7或12.0。
pH緩衝化合物可以適合於使調配物之pH維持在預定層面的任何量存在。在一具體態樣中，pH緩衝濃度介於0.1mM與500mM(1M)之間。舉例而言，預期pH緩衝劑為至少0.1mM、0.5mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.2mM、1.5mM、1.7mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、500mM。
用於緩衝本文所述之調配物的例示性pH緩衝劑包括(但不限於)甘胺酸、組胺酸、麩胺酸鹽、丁二酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris及胺 基酸或胺基酸之混合物，包括(但不限於)天冬胺酸、組胺酸及甘胺酸。
鹽
通常添加鹽以增加調配物之離子強度，其對於蛋白質可溶性、物理穩定性及等滲性可為重要的。鹽可以多種方式影響蛋白質之物理穩定性。離子可藉由結合於蛋白質表面上之帶電殘基來使蛋白質之天然狀態穩定。或者，鹽可藉由結合於沿蛋白質骨架之肽基團(-CONH-)來使變性狀態穩定。鹽亦可藉由屏蔽蛋白質分子內之殘基之間的排斥靜電相互作用來使蛋白質天然構形穩定。蛋白質調配物中之鹽亦可屏蔽蛋白質分子之間的可導致蛋白質凝集及不溶之吸引靜電相互作用。在所提供之調配物中，鹽濃度介於0.1mM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、80mM、100mM、120mM、150mM、200mM、300mM與500mM之間。
穩定劑及膨化劑
在本發明之醫藥調配物中，可添加穩定劑(或穩定劑之組合)以防止或減少儲存誘發之凝集及化學降解。重構後之混濁或渾濁溶液表示蛋白質已沈澱或至少凝集。術語「穩定劑(stabilizer)」意謂能夠防止在水溶液狀態下凝集或其他物理降解以及化學降解(例如自溶、脫醯胺、氧化等)之賦形劑。習用於醫藥組合物中之穩定劑包括(但不限於)蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纖維二糖、龍膽二糖、異麥芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘胺酸、精胺酸HCl、多羥基化合物(包括多醣，諸如葡聚糖、澱粉、羥乙基澱粉、環糊精、N-甲基吡咯啶酮、纖維素及玻糖醛酸)、氯化鈉[Carpenter等人，Develop.Biol.Standard 74：225,(1991)]。在本發明之調配物中，穩定劑係以約0.1mM、0.5 mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.2mM、1.5mM、1.7mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、500mM、700mM、900mM或1000mM之濃度併入。
需要時，調配物亦包括適量膨化劑及滲透壓度調節劑。膨化劑包括(例如)甘露糖醇、甘胺酸、蔗糖、聚合物(諸如葡聚糖)、聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素、乳糖、山梨糖醇、海藻糖或木糖醇。在一具體態樣中，膨化劑為甘露糖醇。膨化劑係以約0.1mM、0.5mM、0.7mM、0.8 0.9mM、1.0mM、1.2mM、1.5mM、1.7mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、500mM、700mM、900mM或1000mM之濃度併入。
界面活性劑
蛋白質分子具有與使其易受空氣-液體、小瓶-液體及液體-液體(矽油)界面處之吸附及變性影響的表面相互作用之高傾向。已觀察到此降解路徑逆向取決於蛋白質濃度且導致形成可溶性及不溶性蛋白質聚集體或經由吸附於表面而自溶液損失蛋白質。除容器表面吸附外，在物理攪拌下加劇表面誘發之降解，如將在產品之運輸及處置期間所經歷。
界面活性劑常用於蛋白質調配物中以防止表面誘發之降解。界面活性劑為具有與蛋白質競爭界面位置之能力的兩性分子。界面活性劑分子之疏 水性部分佔據界面位置(例如空氣/液體)，而分子之親水性部分保持面向本體溶劑。於足夠濃度(通常近似清潔劑之臨界微胞濃度)下，界面活性劑分子之表面層用以防止蛋白質分子吸附於界面。由此，使表面誘發之降解減至最少。最常用界面活性劑為脫水山梨糖醇聚乙氧基化物之脂肪酸酯，亦即聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。兩者僅在賦予分子疏水性特徵之脂族鏈的長度方面不同，分別為C-12及C-18。因此，聚山梨醇酯-80之表面活性更大且具有比聚山梨醇酯-20低的臨界微胞濃度。
清潔劑亦可影響蛋白質之熱力學構形穩定性。在此處同樣，特定清潔劑賦形劑之作用將具有蛋白質特異性。舉例而言，已展示聚山梨醇酯降低一些蛋白質之穩定性且增加其他蛋白質之穩定性。蛋白質之清潔劑去穩定可根據清潔劑分子之可參與與部分或完全展開之蛋白質狀態之特異性結合的疏水性尾來合理化。此等類型之相互作用會引起構形平衡移向更膨脹之蛋白質狀態(亦即增加蛋白質分子之疏水性部分暴露，此與結合聚山梨醇酯相反)。或者，若蛋白質天然狀態展現一些疏水性表面，則清潔劑與天然狀態之結合可使該構形穩定。
聚山梨醇酯之另一態樣為其本身易於氧化降解。通常，作為原材料，其含有足夠量之過氧化物以使蛋白質殘基側鏈(尤其甲硫胺酸)氧化。由添加穩定劑引起之氧化性損害的可能性強調調配物中應使用最低有效濃度之賦形劑。對於界面活性劑而言，給定蛋白質之有效濃度將取決於穩定化之機制。已假定若界面活性劑穩定化之機制與防止表面變性有關，則有效濃度將近似清潔劑之臨界微胞濃度。相反地，若穩定化之機制與特異性蛋白質-清潔劑相互作用相關，則有效界面活性劑濃度將與蛋白質濃度及相互 作用之化學計量有關(Randolph T.W.等人，Pharm Biotechnol.,13：159-75(2002))。
亦可添加適量之界面活性劑以防止冷凍及乾燥期間之表面相關凝集現象[Chang,B,J.Pharm.Sci.85：1325,(1996)]。例示性界面活性劑包括陰離子、陽離子、非離子、兩性離子及兩性界面活性劑，包括衍生自天然存在胺基酸之界面活性劑。陰離子界面活性劑包括(但不限於)月桂基硫酸鈉、二辛基磺基丁二酸鈉及二辛基磺酸鈉、鵝去氧膽酸、N-月桂醯基肌胺酸鈉鹽、十二烷基硫酸鋰、1-辛烷磺酸鈉鹽、水合膽酸鈉、去氧膽酸鈉及甘去氧膽酸鈉鹽。陽離子界面活性劑包括(但不限於)氯苄烷銨或苄索氯銨、單水合氯化十六烷基吡錠及溴化十六烷基三甲基銨。兩性離子表面活性劑包括(但不限於)CHAPS、CHAPSO、SB3-10及SB3-12。非離子界面活性劑包括(但不限於)毛地黃皂苷、Triton X-100、Triton X-114、TWEEN-20及TWEEN-80。界面活性劑亦包括(但不限於)聚桂醇400，聚烴氧40硬脂酸酯，聚氧乙烯氫化蓖麻油10、40、50及60，單硬脂酸甘油酯，聚山梨醇酯40、60、65及80，大豆卵磷脂及其他磷脂，諸如二油基磷脂醯膽鹼(dioleyl phosphatidyl choline，DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(dimyristoylphosphatidyl glycerol，DMPG)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(dimyristoylphosphatidyl choline，DMPC)及二油基磷脂醯甘油(dioleyl phosphatidyl glycerol，DOPG)；蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。因此進一步提供包含個別或呈不同比率之混合物形式的此等界面活性劑之組合物。在本發明之調配物中，界面活性劑係以約0.01g/L至約0.5g/L之濃度併入。
其他常見賦形劑組份
胺基酸
已發現胺基酸在蛋白質調配物中作為緩衝劑、膨化劑、穩定劑及抗氧化劑之多種用途。使用組胺酸及麩胺酸分別在5.5-6.5及4.0-5.5之pH範圍內緩衝蛋白質調配物。組胺酸之咪唑基具有pKa=6.0且麩胺酸側鏈之羧基具有4.3之pKa，其使此等胺基酸適合於在其各自pH範圍內緩衝。麩胺酸尤其適用於該等情況(例如Stemgen®)。組胺酸通常見於市售蛋白質調配物(例如Xolair®、Herceptin®、Recombinate®)中，且此胺基酸提供檸檬酸鹽(已知在注射後刺痛之緩衝劑)之替代物。有趣地，亦已報導相對於在液體與凍乾呈現中以高濃度使用時之凝集，如在具有ABX-IL8(IgG2抗體)之調配物中所觀察到，組胺酸具有穩定作用(Chen B等人，Pharm Res.,20(12)：1952-60(2003))。亦觀察到組胺酸(至多60mM)降低此抗體之高濃度調配物的黏度。然而，在相同研究中，作者觀察到在不鏽鋼容器中之抗體的凍融研究期間含有組胺酸之調配物的凝集增加及褪色。作者將此歸因於自鋼容器腐蝕浸出之鐵離子的作用。關於組胺酸之另一注意在於其在金屬離子存在下經歷光氧化(Tomita M等人，Biochemistry,8(12)：5149-60(1969))。在調配物中使用甲硫胺酸作為抗氧化劑顯現前景；已觀察到其有效抵抗多種氧化壓力(Lam XM等人，J Pharm Sci.,86(11)：1250-5(1997))。
已展示胺基酸甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸藉由優選排斥機制來穩定蛋白質。甘胺酸亦為凍乾調配物(例如Neumega®、Genotropin®、Humatrope®)中之常用膨化劑。已展示精胺酸為抑制凝集之有效藥劑且已用於液體與凍乾調配物中(例如Activase®、Avonex®、Enbrel®液體)。此外，在精胺酸存在下某些蛋白質之再摺疊的效率增強已歸因於其在再摺疊期間 對競爭凝集反應之抑制。
抗氧化劑
蛋白質殘基之氧化由多種不同來源引起。除添加特定抗氧化劑外，防止氧化性蛋白質損傷包括在產物之整個製造過程及儲存中謹慎控制多種因素，諸如大氣氧、溫度、曝光及化學污染。最常用之醫藥抗氧化劑為還原劑、氧/自由基淨化劑或螯合劑。治療性蛋白質調配物中之抗氧化劑為水溶性的且在整個產品儲存期內保持活性。還原劑及氧/自由基淨化劑藉由除去溶液中之活性氧物質而起作用。諸如EDTA之螯合劑藉由結合促進自由基形成之痕量金屬污染物而有效。舉例而言，EDTA用於酸性纖維母細胞生長因子之液體調配物中以抑制半胱胺酸殘基之金屬離子催化氧化。EDTA已用於如Kineret®及Ontak®之市售產品中。
除各種賦形劑防止蛋白質氧化之有效性外，抗氧化劑本身誘導蛋白質之其他共價或物理變化的可能性受到關注。舉例而言，還原劑會引起分子內二硫鍵斷裂，此會導致雙硫改組。在過渡金屬離子存在下，已證明抗壞血酸及EDTA促進多種蛋白質及肽中之甲硫胺酸氧化(Akers MJ，及Defelippis MR.Peptides and Proteins as Parenteral Solutions.於：Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins中.Sven Frokjaer,Lars Hovgaard編Pharmaceutical Science.Taylor and Francis,UK(1999)；Fransson J.R.,J.Pharm.Sci.86(9)：4046-1050(1997)；Yin J等人，Pharm Res.,21(12)：2377-83(2004))。已報導硫代硫酸鈉降低rhuMab HER2中光及溫度誘發之甲硫胺酸氧化的程度；然而，在此研究中亦報導硫代硫酸鹽-蛋白質加合物之形成(Lam XM,Yang JY等人，J Pharm Sci.86(11)：1250-5(1997))。根據蛋白質之特定壓力及 敏感性進行對適當抗氧化劑之選擇。
金屬離子
一般而言，過渡金屬離子於蛋白質調配物中為不合需要的，因為其會催化蛋白質中之物理及化學降解反應。然而，當特定金屬離子為蛋白質之輔因子時其包括於調配物中，且當特定金屬離子形成配位錯合物時其包括於蛋白質之懸浮液調配物(例如胰島素之鋅懸浮液)中。最近，已提出使用鎂離子(10-120mM)來抑制天冬胺酸異構化為異天冬胺酸(WO 2004039337)。
金屬離子賦予蛋白質穩定性或增強之活性的兩個實例為人類脫氧核糖核酸酶(rhDNase，Pulmozyme®)及因子VIII。在rhDNase之情況下，Ca+2離子(至多100mM)經由特異性結合位點增強酶之穩定性(Chen B等人，J Pharm Sci.,88(4)：477-82(1999))。事實上，自具有EGTA之溶液移除鈣離子使得脫醯胺及凝集增加。然而，僅在Ca+2離子情況下觀察到此作用；觀察到其他二價陽離子Mg+2、Mn+2及Zn+2使rhDNase不穩定。在因子VIII中觀察到類似作用。Ca+2及Sr+2離子使蛋白質穩定，而如Mg+2、Mn+2及Zn+2、Cu+2及Fe+2之其他離子使酶不穩定(Fatouros,A.等人，Int.J.Pharm.,155,121-131(1997))。在關於因子VIII之獨立研究中，在Al+3離子存在下觀察到凝集速率之顯著增加(Derrick TS等人，J.Pharm.Sci.,93(10)：2549-57(2004))。作者注意到如緩衝鹽之其他賦形劑通常受Al+3離子污染，且說明需要在經調配產物中使用具有適當品質之賦形劑。
防腐劑
當開發包括一種以上來自相同容器之萃取物的多用途非經腸調配物 時，防腐劑為必需的。其主要功能在於抑制微生物生長且確保在整個藥品之儲存期或使用期內產物無菌。常用防腐劑包括苄醇、苯酚及間甲酚。儘管防腐劑具有悠久的使用歷史，但包括防腐劑之蛋白質調配物之開發可具有挑戰性。防腐劑對蛋白質幾乎總是具有去穩定作用(凝集)，且此已變成限制其用於多劑量蛋白質調配物中之主要因素(Roy S等人，J Pharm Sci.,94(2)：382-96(2005))。
迄今為止，大多數蛋白質藥物已經調配僅用於單一用途。然而，當多劑量調配物為可能時，其具有賦予患者便利性之附加優勢及增加之市場性。一良好實例為人類生長激素(human growth hormone，hGH)，其中經防腐處理之調配物的開發已產生更方便、多用途注射筆呈現之商業化時。目前市場上可得到至少四種含有hGH之經防腐處理之調配物的該等筆裝置。Norditropin®(液體，Novo Nordisk)、Nutropin AQ®(液體，Genentech)及Genotropin(凍乾雙腔藥筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而Somatrope®(Eli Lilly)以間甲酚調配。
在經防腐處理之劑型的調配物開發期間需要考慮數個態樣。須優化藥品中之有效防腐劑濃度。此需要測試劑型中之給定防腐劑之賦予抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性的濃度範圍。舉例而言，在介白素-1受體(第I型)之液體調配物的開發中使用差示掃描熱量測定(differential scanning calorimetry，DSC)成功地篩選三種防腐劑。根據防腐劑於常用於市售產品中之濃度下對穩定性之影響，將其分級(Remmele RL Jr.等人，Pharm Res.,15(2)：200-8(1998))。
一些防腐劑會引起注射部位反應，其為需要在選擇防腐劑時加以考慮 之另一因素。在致力於評估Norditropin中之防腐劑及緩衝劑的臨床試驗中，觀察到疼痛感覺在含有苯酚及苄醇之調配物中與含有間甲酚之調配物相比較低(Kappelgaard A.M.,Horm Res.62 Suppl 3：98-103(2004))。有趣地，在常用防腐劑中，苄醇具有麻醉特性(Minogue SC及Sun DA.,Anesth Analg.,100(3)：683-6(2005))。
凍乾
亦預期包含本發明之VWF多肽的調配物可在投藥之前凍乾。凍乾係使用技術領域中常見之技術進行且應關於所開發之組合物加以優化[Tang等人，Pharm Res.21：191-200,(2004)及Chang等人，Pharm Res.13：243-9(1996)]。
在一態樣中，凍乾循環包含三個步驟：冷凍、第一乾燥及第二乾燥[A.P.Mackenzie,Phil Trans R Soc London,Ser B,Biol 278：167(1977)]。在冷凍步驟中，冷卻溶液以引發結冰。此外，此步驟誘發膨化劑之結晶。冰在第一乾燥階段中昇華，其係藉由使用真空及引入熱量以促進昇華而使腔室壓力降低至冰之蒸氣壓以下來進行。最後，在第二乾燥階段中在降低之腔室壓力下及於升高之儲存溫度下移除吸附或結合之水。該過程產生稱為凍乾餅之物質。此後，該餅可用無菌水或適於注射之稀釋劑來重構。
凍乾循環不僅確定賦形劑之最終物理狀態且亦影響其他參數，諸如重構時間、外觀、穩定性及最終含水量。冷凍狀態下之組合物結構經歷數次轉變(例如玻璃轉移、濕潤及結晶)，其於特定溫度下發生且可用於理解及優化凍乾過程。玻璃轉移溫度(Tg及/或Tg')可提供關於溶質之物理狀態之資訊且可藉由差示掃描熱量測定(DSC)來測定。Tg及Tg'為當設計凍乾循環時必須考慮之重要參數。舉例而言，Tg'對於第一乾燥為重要的。此外， 在乾燥狀態下，玻璃轉移溫度提供關於最終產物之儲存溫度之資訊。
製備方法
本發明進一步涵蓋製備醫藥調配物之方法。例如無菌注射用水、用於多劑量用途之具有防腐劑的水或具有適量界面活性劑(例如聚山梨醇酯-20)之水、0.4%生理食鹽水、0.3%甘胺酸或水性懸浮液的各種水性載劑可含有活性化合物與適合於製造水性懸浮液之賦形劑的混合物。在各種態樣中，該等賦形劑為懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯基吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑可為天然存在之磷脂(例如卵磷脂)，或氧化烯與脂肪酸之縮合產物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或氧化乙烯與長鏈脂族醇之縮合產物(例如十七伸乙基氧基十六醇)，或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及己糖醇之偏酯的縮合產物(諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)，或氧化乙烯與衍生自脂肪酸及己糖醇酸酐之偏酯的縮合產物(例如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯。
投藥
為向人類或測試動物投予組合物，在一態樣中，組合物包含一或多種醫藥學上可接受之載劑。如下文所述，片語「醫藥學上(pharmaceutically)」或「藥理學上(pharmacologically)」可接受係指穩定、抑制蛋白質降解(諸如凝集)且裂解產物，且另外當使用技術領域中熟知之途徑投藥時不產生過敏反應或其他不良反應的分子實體及組合物。「醫藥學上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carriers)」包括任何及所有臨床上適用之溶劑、分散介質、塗層、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物， 包括上文所揭示之彼等藥劑。
醫藥調配物可經口、局部、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、經陰道、經直腸或藉由顱內注射來投予。如本文中所使用，術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸液技術。亦涵蓋藉由靜脈內、皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射進行投藥及/或於特定部位處進行手術植入。通常，組合物基本上無熱原質，以及會對受體有害之其他雜質。
組合物之單次或多次投藥可以治療醫師所選之劑量含量及模式來進行。對於預防或治療疾病而言，適當劑量將取決於如以上所定義之欲治療的疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、藥物是出於預防性目的或出於治療性目的投予、先前療法、患者之臨床病史及對藥物之反應及主治醫師之判斷。
套組
作為另一態樣，本發明包括套組，其包含一或多種以有利於其向個體投藥之用途的方式包裝之醫藥調配物。在一具體態樣中，該套組包括包裝於諸如密封瓶或管之容器中的本文所述之醫藥調配物(例如，包含治療性蛋白質或肽之組合物)，以及描述化合物或組合物在實施方法中之用途的貼於該容器上或包括於包裝中之標籤。在一具體態樣中，該醫藥調配物包裝於容器中以使得容器中頂空之量(例如液體調配物與容器頂部之間的空氣量)極小。較佳地，頂空之量可忽略不計(亦即，幾乎無)。在一具體態樣中，該套組含有具有治療性蛋白質或肽組合物之第一容器及具有用於該組合物之生理學上可接受之重構溶液的第二容器。在一態樣中，醫藥調配物係以單位劑型包裝。套組可進一步包括適合於根據特定投藥途徑投予醫藥 調配物之裝置。較佳地，套組含有描述醫藥調配物之用途的標籤。
劑量
治療本文所述之病狀之方法所涉及的給藥方案將由主治醫師考慮改變藥物作用之各種因素來加以判定，例如患者之年齡、病狀、體重、性別及飲食、任何感染之嚴重程度、投藥時間及其他臨床因素。舉例而言，本發明之重組VWF的典型劑量為約50U/kg，相當於500μg/kg。
本發明之調配物可藉由初始大丸劑、接著連續輸液來投予以維持藥品之治療循環含量。作為另一實例，本發明之化合物可以單次劑量形式投予。一般熟習此項技術者將易於優化如藉由良好醫學規範及個別患者之臨床病狀所判定的有效劑量及投藥方案。給藥頻率將視藥劑之藥物動力學參數及投藥途徑而定。最佳醫藥調配物將由熟習此項技術者根據投藥途徑及所需劑量加以判定。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA 18042)第1435-1712頁，其揭示內容以引用的方式併入本文中。該等調配物可影響所投予之藥劑的物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。視投藥途徑而定，合適之劑量可根據體重、體表面積或器官尺寸來計算。適當劑量可經由使用測定血液含量劑量以及適當劑量-反應資料之既定檢定來確定。最終給藥方案將由主治醫師考慮改變藥物作用之各種因素來判定，例如藥物之特定活性、患者之損傷嚴重程度及反應性、患者之年齡、病狀、體重、性別及飲食、任何感染之嚴重程度、投藥時間及其他臨床因素。當進行研究時，將出現關於用於各種疾病及病狀之適當劑量含量及治療持續時間的其他資訊。
以下實施例不欲具有限制性，而僅例示本發明之特定具體態樣。
實施例1
震盪實驗
為測定各種調配物中rVWF之沈澱量，在多種條件下測試在劇烈震盪後rVWF之回收百分比。
於室溫(RT)下使於Advate緩衝液(90mM NaCl、1.68mM CaCl2、10mM L-組胺酸、10mM tris、0.26mM麩胱甘肽、23.4mM海藻糖、175.7mM甘露糖醇及0.1g/L TWEEN-80，pH 7.0)或Advate 1：3緩衝液(於水中稀釋3倍之Advate緩衝液)中之rVWF於震盪器上經受劇烈震盪歷時0min、1min、2.5小時或4天，且相對於震盪之前的起始物質量測rVWF之回收百分比。如表1中所示，在Advate緩衝液中觀察到約40-80%之損失，而在Advate 1：3緩衝液中觀察到約20-30%之損失。VWF抗原VWF：Ag對應於可在VWF特異性ELISA中使用多株抗-VWF抗體偵測之VWF的量，而VWF：RCo對應於在瑞斯托菌素(ristocetin)存在下引起穩定血小板之凝集之VWF的量。在兩種情況下，使用相對於實際WHO標準校準之人類參考血漿作為標準(1ml參考血漿通常含有1U VWF)。
亦在震盪實驗中測試冷凍/解凍及凍乾之影響。於-20℃下在-20℃冷室中或於乾冰上執行冷凍，在兩種情況下於室溫下執行解凍且兩者皆自液體調配物開始。對於凍乾而言，將本文所述之經調配VWF樣品在試驗規模凍乾器中於<=-40℃下冷凍且使用標準凍乾程式來凍乾。直接對液體調配物(2ml於5ml小瓶中)執行震盪。如表2中所示，rVWF之回收百分比在Advate 1：3緩衝液中與Advate緩衝液相比較高。
亦在震盪實驗中對儲存於有頂空及無頂空之注射器中的rVWF量測回收百分比。有趣地，當將rVWF儲存於無頂空之注射器中且如上所述震盪時，未觀察到rVWF沈澱。相比之下，當將rVWF儲存於有頂空之注射器中時，觀察到一些沈澱。
總而言之，劇烈震盪導致在Advate緩衝液或Advate 1：3緩衝液中rVWF損失至少30%，其中Advate緩衝液展示回收率損失與Advate 1：3緩衝液相比較高。有趣地，當將rVWF儲存且在汽車中運輸約5000km(代表在運輸期間之預期震盪)時，未觀察到劇烈震盪實驗中所觀察到之相同沈澱。rVWF之沈澱可藉由儲存於無頂空之注射器中來消除。
實施例2
重組VWF之穩定性
藉由評估各種調配物中存在之rVWF的活性含量來測試rVWF之穩定性。
如圖1中所示，在Advate緩衝液中26週後rVWF不穩定，此係歸因於0.3mM麩胱甘肽之存在。然而，如圖2中所示，在Advate 1：3緩衝液中rVWF較穩定(例如於4℃下歷時12週)。
如圖3中所示，基於檸檬酸鹽之調配物(15mM檸檬酸鈉、10mM CaCl2、100mM NaCl，pH 7.0)的穩定性好於含有0.1M麩胱甘肽之Advate 1：3緩衝液調配物。
同樣，隨時間在各種緩衝液中量測rVWF之濃度。如圖4、圖5及圖6中所示，在Advate緩衝液、Advate 1：3緩衝液及基於檸檬酸鹽之緩衝液中rVWF濃度分別隨時間穩定。
實施例4
定液體調配物之特徵
使用差示掃描熱量測定(DSC)評估蛋白質(rVWF)在各種緩衝液中展開之程度。如表3中所示，Advate緩衝液pH 7.0對於穩定化最佳。
DSC為將增加樣品及參考物之溫度所需之熱量之量的差以溫度函數形式量測之熱分析技術。DSC實驗之結果為熱通量對比溫度或對比時間之曲線。
差示掃描熱量計可在加熱及冷卻的同時掃描一定溫度範圍，且其藉由量測達到設定溫度所需之熱量的量來測定相變，亦即熔融、結晶或玻璃轉移。用一組具有已知熱容量Cp及熔點Tm之純金屬(鋅、銦及錫)來校準熱量計。將各個參考緩衝液置於參考毛細血管中且將rVWF樣品置於儀器之樣品毛細血管中。
此外，如圖7中所示，大多數調配物賦形劑使展開溫度增加約1-2℃。圖8展示10mM CaCl2使展開溫度增加約8℃至約67℃，此為亦可藉由Advate緩衝液達到之展開溫度。如圖9中所示，CaCl2之此作用於pH 7.3及6.5下類似。最後，分析海藻糖及蔗糖對展開溫度之影響。與單獨檸檬酸鹽相比，海藻糖與蔗糖皆不增加rVWF之展開溫度。對於rVWF在各種賦形劑存在下之展開溫度(Tmax)資料的總結在表4中陳述。
除各種緩衝液外，使用DSC評估rVWF在Advate中於各種pH值下之展開溫度。結果在下5表中展示。Advate緩衝液pH 7.0對於rVWF之穩定化為最佳的(亦即，最高展開溫度；峰值1)。
於各種溫度下儲存各種時間長度後評估rVWF在Advate緩衝液及Advate 1：3緩衝液中之螢光光譜。於40℃下在Advate或Advate 1：3緩衝液中儲存0至28天後觀察到螢光光譜無(或僅略微)變化。於其他溫度下未觀察到差異。
同樣，使用膠濾(Superose 6)評估rVWF之降解。雖然於4℃下在Advate緩衝液中26週後觀察到一些降解，但於4℃下26週後觀察到rVWF在Advate 1：3緩衝液中幾乎無降解。於40℃下，麩胱甘肽隨時間增加降解之量(儘管在Advate 1：3緩衝液中程度較慢)。
根據以上實施例，與未經稀釋之Advate緩衝液相比，Advate 1：3緩衝液提供關於凍乾後冷凍/解凍及回收率之優勢。此外，Advate 1：3緩衝液可在於40℃下培養期間比Advate緩衝液更好地穩定(例如，維持生物活性)rVWF活性。在Advate 1：3緩衝液中之rVWF對於於4℃下培養4週為穩定的。最後，DSC已證明pH 7.0對於防止rVWF降解為最佳的(亦即，展示最高展開溫度)。
因此，鑒於本文所提供之資料，對於rVWF推薦藉由NaCl調整至所需滲透壓度之包括15mM檸檬酸鹽(或甘胺酸或組胺酸)、10mM CaCl2(pH 6.5-7.3)的調配物。舉例而言，在一具體態樣中，基於檸檬酸鹽之配方為15mM檸檬酸鈉、10mM CaCl2、100mM NaCl，pH 7.0。
或者，亦涵蓋無麩胱甘肽之Advate或Advate 1：3緩衝液：Advate：90mM NaCl、1.68mM CaCl2、10mM L-組胺酸、10mM Tris、0.26mM麩胱甘肽、23.4mM海藻糖、175.7mM甘露糖醇及0.1g/L TWEEN-80，pH 7.0；Advate 1：3：30mM NaCl、0.56mM CaCl2、3.3mM L-組胺酸、3.3mM tris、7.8mM海藻糖、58.6mM甘露糖醇及0.03g/L TWEEN-80，ph 7.0。
<110> 麥西艾森等人
<120> 重組VWF調配物
<130> TW103123730
<150> 61/017,881
<151> 2007-12-31
<160> 3
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 8833
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的聚核苷酸
<220>
<221> misc_特徵
<223> 前原vWF
<400> 1
<210> 2
<211> 2783
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MISC_特徵
<223> 前原vWF
<400> 2
<210> 3
<211> 2050
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MISC_特徵
<223> 成熟vWF
<400> 3

Claims (21)

  1. 一種重組溫韋伯氏因子(recombinant von Willebrand Factor，rVWF)之穩定液體醫藥調配物，其包含：(a)rVWF；(b)緩衝劑；(c)一或多種鹽；(d)視情況的穩定劑；及(e)視情況的界面活性劑；其中該rVWF包含選自由以下者所組成之群組的多肽：a)SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列；b)a)之生物活性類似物、片段或變異體；c)由SEQ ID NO：1中所示之聚核苷酸編碼的多肽；d)c)之生物活性類似物、片段或變異體；及e)由在中等嚴格雜交條件下與SEQ ID NO：1中所示之聚核苷酸雜交之聚核苷酸編碼的多肽；其中該緩衝液包含約0.1mM至約500mM範圍內之pH緩衝劑且其中pH在約2.0至約12.0之範圍內；其中該鹽濃度為約1mM至500mM；其中該穩定劑濃度為約0.1mM至1000mM；且其中該界面活性劑濃度為約0.01g/L至0.5g/L。
  2. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該rVWF包含SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該緩衝劑係選自由檸檬酸鈉、甘胺酸、組胺酸、Tris及此等藥劑之組合所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第3項之調配物，其中該緩衝劑為濃度為15mM之檸檬酸鈉。
  5. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中pH在6.0-8.0之範圍內。
  6. 如申請專利範圍第5項之調配物，其中pH在6.5-7.3之範圍內。
  7. 如申請專利範圍第4項之調配物，其中pH為7.0。
  8. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該緩衝劑為檸檬酸鹽且該pH為7.0。
  9. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該鹽係選自由氯化鈣、氯化鈉及氯化鎂所組成之群組。
  10. 如申請專利範圍第9項之調配物，其中該鹽濃度在0.5mM至300mM之範圍內。
  11. 如申請專利範圍第10項之調配物，其中該鹽為濃度為10mM之氯化鈣。
  12. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該rVWF包含SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列；其中該緩衝劑為檸檬酸鹽且該pH為7.0；且其中該鹽為濃度為10mM之氯化鈣。
  13. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該rVWF包含SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列；其中該緩衝劑為濃度為15mM之檸檬酸鈉且該pH為7.0；且其中該鹽為濃度為10mM之氯化鈣及濃度為100mM之NaCl。
  14. 如申請專利範圍第3項之調配物，其中該一或多種緩衝劑為濃度各自為3.3mM之組胺酸及Tris。
  15. 如申請專利範圍第3項之調配物，其中該pH為7.0。
  16. 如申請專利範圍第9項之調配物，其中該一或多種鹽為濃度為30mM之氯化鈉及濃度為0.56mM之氯化鈣。
  17. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該穩定劑係選自由以下者所組成之群組：甘露糖醇、乳糖、山梨糖醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纖維二糖、龍膽二糖、異麥芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖及此等穩定劑之組合。
  18. 如申請專利範圍第17項之調配物，其中該等穩定劑為濃度為7.8mM之海藻糖及濃度為58.6mM之甘露糖醇。
  19. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該界面活性劑係選自由毛地黃皂苷(digitonin)、Triton X-100、Triton X-114、TWEEN-20、TWEEN-80及此等界面活性劑之組合所組成之群組。
  20. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該界面活性劑為0.03g/L之TWEEN-80。
  21. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該rVWF包含SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列；其中該等緩衝劑為濃度為3.3mM之組胺酸及濃度為3.3mM之Tris，pH 7.0；其中該等鹽為濃度為30mM之氯化鈉及濃度為0.56mM之氯化鈣；其中該等穩定劑為濃度為7.8mM之海藻糖及濃度為58.6mM之甘露糖醇；且其中該界面活性劑為0.03g/L之TWEEN-80。
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