ES2233924T3 - Un procedimiento para preparar fragmentos terapeuticos de factor von willebrand. - Google Patents

Abstract

UNA SOLUCION ACUOSA DE UN FRAGMENTO DE FACTOR DE VON WILLEBRAND MODIFICADO CON CISTEINA QUE NO CONTIENE SUSTANCIALMENTE AGREGADOS Y QUE SE PUEDE UTILIZAR TERAPEUTICAMENTE PARA EL TRATAMIENTO DE LA TROMBOSIS Y UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE TAL SOLUCION QUE CONSISTE EN: (A) FORMAR UNA SOLUCION ACUOSA DEL FRAGMENTO Y UN DESNATURALIZANTE; (B) PURIFICAR LA SOLUCION DEL FRAGMENTO Y EL DESNATURALIZANTE BAJO CONDICIONES QUE FOMENTEN LA CONVERSION DE LAS FORMAS AGREGADAS DEL FRAGMENTO EN FORMAS DIMERICAS Y/O MONOMERICAS DE LAS MISMAS PARA ASI OBTENER UN FRAGMENTO PURIFICADO; (C) SEPARAR EL FRAGMENTO DISUELTO, PURIFICADO DEL DESNATURALIZANTE AL TIEMPO QUE SE MANTIENE LA SOLUCION ACUOSA DEL FRAGMENTO A UN PH DE 2,5 APROXIMADAMENTE HASTA MENOS DE 5,5 APROXIMADAMENTE PARA AUMENTAR LA MONOMERIZACION Y DISMINUIR LA AGREGACION DE DICHO FRAGMENTO MODIFICADO CON LO QUE SE FORMA UNA SOLUCION ACUOSA DEL FRAGMENTO QUE NO CONTIENE SUSTANCIALMENTE AGREGADOS.

Description

Un procedimiento para preparar fragmentos terapéuticos de factor von Willebrand.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polipéptidos terapéuticos. Más específicamente, esta invención se refiere a fragmentos purificados de factor de von Willebrand que pueden ser utilizados, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades vasculares, tales como la trombosis.

El término "hemostasis" hace referencia a los procesos que comprenden los mecanismos de defensa del cuerpo contra la pérdida de sangre en circulación provocada por una lesión vascular. La presente invención se refiere a la provisión de formas terapéuticamente útiles de polipéptidos, basadas en el factor de von Willebrand ("vWF" -"von Willebrand Factor"), una de las proteínas del mecanismo hemostático.

Procesos que son normales como respuesta fisiológica ante una herida vascular pueden conducir, en circunstancias patológicas tales como en un paciente afectado por una enfermedad vascular arterosclerótica o una deficiencia cardiaca congestiva crónica, a la formación de trombos (coágulos) indeseados, con la consiguiente obstrucción vascular. La dificultad en el flujo de sangre a los órganos puede conducir, en tales circunstancias, a estados patológicos graves, que incluyen el infarto de miocardio, una causa principal de mortalidad en los países desarrollados.

La restricción o supresión del flujo de sangre en el seno del sistema circulatorio como respuesta a una herida o como resultado de un estado de enfermedad vascular implica una compleja serie de reacciones que pueden dividirse en dos procesos, la hemostasis primaria y la hemostasis secundaria. La hemostasis primaria hace referencia al proceso de formación de tapones de plaquetas o coágulos blandos. Las plaquetas son estructuras con forma de disco y carentes de núcleo de entre aproximadamente 2 y 5 micras de diámetro, que se obtienen de células megacariocíticas. La hemostasis primaria efectiva se lleva a cabo por la adhesión de plaquetas, la interacción de las plaquetas con la superficie del endotelio vascular dañado, en el que han quedado al descubierto fibras de colágeno subyacentes y/o otras macromoléculas adhesivas, tales como proteoglicanos y glicosaminoglicanos, a los que se unen las
plaquetas.

La hemostasis secundaria comprende el reforzamiento o entrelazamiento del coágulo de plaquetas blando. Este proceso secundario es iniciado por las proteínas que circulan en el plasma (factores de coagulación), las cuales se activan durante la hemostasis primaria, ya sea como respuesta a una herida o a un estado de enfermedad vascular. La activación de estos factores trae consigo, en última instancia, la producción de una matriz polimérica del fibrinógeno de proteína (llamado entonces "fibrina"), la cual refuerza el coágulo blando.

Existen, sin embargo, circunstancias en las que se desea evitar la deposición de plaquetas en los vasos sanguíneos, por ejemplo, en la prevención y el tratamiento de la trombosis o la embolia, y con el fin de evitar la oclusión de injertos arteriales. La formación de trombos de plaquetas durante los procedimientos quirúrgicos puede también interferir con las tentativas para aliviar las obstrucciones ya existentes en los vasos.

Los medicamentos contra las plaquetas incluyen compuestos que suprimen la hemostasis primaria al alterar las plaquetas o su interacción con otros componentes del sistema circulatorio. Un compuesto que ha sido descrito para uso como medicamento contra las plaquetas es un fragmento de vWF con radical alquilo, que tiene un peso molecular de aproximadamente 52.000 y se obtiene por digestión tríptica, o con tripsina, de vWF, y que comprende aproximadamente los residuos 449-728 del mismo. Este fragmento terapéutico es el objeto de la Solicitud de la Oficina Europea de Patentes de serie Nº 87304615, depositada el 22 de mayo de 1987 y publicada con el Nº 255206 el 3 de febrero de 1988.

A modo de antecedente se destaca el hecho de que el vWF, en el que se basa el fragmento anteriormente mencionado, es una proteína multimérica (de múltiples monómeros) de elevado peso molecular, que circula en la sangre y que está implicada en la coagulación de la sangre. Es un hecho aceptado que el vWF hace que las plaquetas se liguen o unan al vaso sanguíneo dañado por su capacidad de formación de un puente entre las plaquetas y el vaso. Está también aceptado que los lugares de unión de las plaquetas de vWF están contenidos dentro de los residuos anteriormente mencionados 449-728.

Por lo que respecta al funcionamiento del fragmento de vWF con radical alquilo anteriormente mencionado como medicamento contra las plaquetas, se cree que el fragmento actúa ligándose o asociándose al receptor de glicoproteína Ib\alpha de las plaquetas, por lo que inhibe la unión de las plaquetas del vWF en la sangre. En efecto, el fragmento de vWF ocupa el receptor superficial de GPIb que sería ocupado normalmente por el vWF de la sangre, pero, debido a que carece de la actividad de formación de puentes de la molécula de vWF, más grande, de la que se deriva, no inicia la agregación de las plaquetas ni la formación de coágulos resultante.

En la práctica, resulta difícil obtener cantidades terapéuticamente útiles de este u otros fragmentos de vWF del plasma sanguíneo. Las dificultades incluyen la separación efectiva del fragmento de residuos 449-728 de otros componentes, por ejemplo, con digestiones trípticas, o con tripsina, así como los requisitos para la esterilización efectiva de los componentes derivados de la sangre potencialmente contaminado con virus humanos como el de la hepatitis o el VIH. En consecuencia, ha demostrado ser deseable producir este fragmento de vWF utilizando ADN de recombinación en células portadoras o huésped, incluyendo, por ejemplo, células huésped bacterianas.

Desgraciadamente, se ha encontrado que los fragmentos de vWF producidos por los sistemas de expresión bacterianos se acumulan en grandes cantidades como agregados insolubles (cuerpos de inclusión) en el interior de las células huésped. Para el propósito de obtener fórmulas terapéuticamente útiles de los fragmentos (residuos 449-728), es necesario extraer el fragmento en forma soluble de los cuerpos de inclusión contenidos en las células huésped.

La presente invención incluye en su ámbito la recuperación de un fragmento terapéuticamente útil de vWF, expresado a partir de moléculas de ADN de recombinación en células bacterianas huésped.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar una solución acuosa de fragmento de factor de von Willebrand (vWF -"von Willebrand Factor") alterado con cisteína, que tiene un peso molecular de aproximadamente 33.000, un residuo de terminal amino en aproximadamente el residuo aminoácido 449, y un residuo de terminal carboxídico en aproximadamente el residuo aminoácido 728, con las etapas consiguientes de:

(A)

proporcionar una solución acuosa de fragmentos de vWF alterados con cisteína, preparados con agente desnaturalizante o adulterante y de manera recombinada, los cuales están basados en el vWF humano, de tal modo que los fragmentos tienden a agregarse en la ausencia de agente desnaturalizante;

(B)

purificar la solución acuosa del fragmento y del agente desnaturalizante mediante la consiguiente cromatografía de intercambio de aniones y cationes a un pH de entre aproximadamente 2,5 y por debajo de 5,5, a fin de proporcionar un fragmento purificado; y

(C)

separar el fragmento disuelto y purificado del agente desnaturalizante, al tiempo que se mantiene la solución acuosa del fragmento a un pH de entre aproximadamente 2,5 y menos que aproximadamente 5,5, con el fin de incrementar la monomerización de dicho fragmento y reducir su agregación, por lo que se forma una solución acuosa de fragmento de vWF alterado con cisteína que contiene menos del 0,5% de agregado soluble.

Las realizaciones preferidas se describen en las reivindicaciones 2 a 14.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un perfil de equilibrio de monómero / dímero, según se ve afectado por la concentración total de fragmento de factor de von Willebrand con radical alquilo.

La Figura 2 es un registro de la inhibición del aglutinamiento de plaquetas (agregación), provocada por las concentraciones especificadas de fragmento de factor de von Willebrand con radical alquilo.

La Figura 3 es un registro de la capacidad comparativa del fragmento de factor de von Willebrand con radical alquilo, no agregado y agregado, para inhibir el aglutinamiento de las plaquetas.

La Figura 4 muestra el perfil de dicroísmo circular del fragmento de vWF con radical alquilo y no agregado, a un pH de 3,5 y a un pH de 4,5.

Definiciones

A menos que se indique aquí de otra manera, los siguientes términos tienen los significados que se indican.

CADN - Una molécula o secuencia de ADN que ha sido sintetizada enzimáticamente a partir de la(s) secuencia(s) presentes en un patrón o plantilla de mARN.

Expresión - El procedimiento experimentado por un gen estructural para producir un producto. En el caso de un producto de proteína, es una combinación de trascripción y traslación.

Molécula de DNA de recombinación - Una molécula que consiste en segmentos de DNA procedentes de diferentes genomas que han sido unidos extremo con extremo y que tienen, o pueden ser modificados para tener, la capacidad de infectar alguna célula huésped y ser mantenidos en su interior.

Clonación - El procedimiento para obtener una población de organismos o secuencias de ADN, u otras macromoléculas derivadas de uno de dichos organismos o secuencias, mediante reproducción asexual o replicación de
ADN.

Actividad biológica - Una o más funciones de una molécula, efectos de la misma, o actividades llevadas a cabo o causadas por una molécula, en un contexto biológico (esto es, en un organismo o en una reproducción o facsímil in vitro). Una actividad biológica característica del fragmento monomérico de residuos 445-733 de la subunidad de factor de von Willebrand madura, es la capacidad potencial de unirse o ligarse a los receptores de GPIb\alpha de las plaquetas, con lo que se inhibe el aglutinamiento de plaquetas.

Un aspecto adicional de la actividad biológica característica del fragmento monomérico de residuos 445-733 de la subunidad de factor de von Willebrand madura es la capacidad para unirse únicamente a un receptor de GPIb\alpha de plaqueta, por lo que permite a la molécula inhibir la unión inducida por botrocetina del vWF multimérico a las plaquetas. Otros efectos resultantes de la especie 445-733 monomérica, o relacionados con la misma, incluyen la inhibición de la activación de las plaquetas, o de su adhesión a las superficies. De esta forma, tal fragmento tiene utilidad terapéutica como agente contra los trombos.

Condiciones reductoras - Se refieren a la presencia de un agente "reductor" en una solución que contiene factor de von Willebrand, o polipéptidos derivados del mismo, agente que causa la rotura de los enlaces de disulfuro del vWF.

Factor de von Willebrand (vWF) - Se entiende que todas las referencias que se hacen aquí al factor de von Willebrand se refieren al vWF en humanos. Se pretende que la expresión "factor de von Willebrand" incluya dentro de su ámbito la expresión "vWF maduro" definida en lo que sigue.

vWF maduro - El vWF en circulación, tal como se encuentra en el plasma o según está unido al sub-endotelio. Consiste en una población de monómeros de polipéptido que están, típicamente, asociados formando numerosas especies de multímeros de los mismos, de tal manera que cada subunidad (monómero) de éstos tiene una longitud de 2.050 residuos. De manera adicional, cuando se expresa en células de mamífero, el vWF maduro se encuentra habitualmente asociado al radical glicosil, o glicosilado. El factor de von Willebrand se encuentra como un componente de la matriz sub-endotelial, como un componente de los gránulos \alpha sintetizados por plaquetas activadas, y como una proteína de plasma sanguíneo en circulación.

Monomérico - Cuando se utiliza en relación con un fragmento de vWF alterado con cisteína, "monomérico" hace referencia a un único polipéptido que no está ligado ni de forma covalente ni de forma no covalente a otro polipéptido. "Dimérico" se refiere a una asociación no covalente de dos monómeros. Un fragmento de vWF alterado con cisteína y "agregado" hace referencia a estructuras más largas que los dímeros.

Purificado o substancialmente en forma pura - Cuando se utiliza en relación con polipéptidos derivados de vWF, éste y los términos similares a él significan que la composición carece substancialmente de la mayor parte del protoplasma celular, de proteína que no es de vWF y de material extracelular con el que se presenta habitualmente el polipéptido en el cuerpo.

La Tabla 1 muestra las designaciones estándar de tres letras para los aminoácidos, tal como se utilizan en la Solicitud.

TABLA I

	Alanina	Ala
	Cisteína	Cys
	Ácido aspártico	Asp
	Ácido glutámico	Glu
	Fenilalanina	Phe
	Glicina	Gly
	Histidina	His
	Isoleucina	Ile
	Lisina	Lys
	Leucina	Leu
	Metionina	Met
	Asparagina	Asn
	Prolina	Pro
	Glutamina	Gln
	Arginina	Arg
	Serina	Ser
	Treonina	Thr
	Valina	Val
	Triptófano	Trp
	Tirosina	Tyr

Descripción detallada de la invención

El polipéptido contra los trombos al que hace referencia la presente invención es un fragmento de vWF alterado con cisteína, que comprende el dominio de secuencia de aminoácidos de la subunidad de vWF madura que comienza en el residuo 445 (serina) de la misma y que finaliza con el residuo 733 (valina) de la misma, y que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 33.000, en el cual los residuos de cisteína del mismo (posiciones 459, 462, 464, 471, 474, 509 y 695) están alterados de una forma tal, que su tendencia a interaccionar con otros residuos de cisteína está inhibida de tal modo, que esas uniones o enlaces basados en la cisteína no son capaces de formarse dentro de un único fragmento o entre fragmentos, de manera que la formación de tales enlaces tiende a formar materiales que tienden a ser insolubles o biológicamente activos. Por conveniencia, se hace referencia aquí a dicho fragmento como "fragmento de vWF alterado con cisteína". Esta expresión incluye dentro de su ámbito fragmentos que engloban o se solapan con la secuencia de residuos 445-733, y que contienen todos o parte de los dominios de unión de GPIb\alpha de la misma. La expresión "fragmento de vWF alterado con cisteína" incluye también polipéptidos que representan secuencias de aminoácidos mutantes del dominio de residuos 445-733 que tienen utilidad contra los trombos. Tales secuencias mutantes pueden implicar o no residuos de cisteína.

Se anticipa que ciertas formas del polipéptido resultante de la expresión de un cADN o de otra molécula de ADN de recombinación apropiada de una célula huésped eucariótica, pueden también ser efectivamente monomerizadas y formuladas de acuerdo con la práctica de la invención.

En tanto en cuanto el fragmento de vWF alterado con cisteína tiene como base un fragmento de vWF, se expone en lo que sigue información referente a esta proteína y a su papel en la hemostasis y en la trombosis. El factor de von Willebrand existe en los humanos como una serie de multímeros de elevado peso molecular, de hasta 30 subunidades glicosiladas por multímero, en el cual se cree que las subunidades son idénticas, de manera que cada una de ellas tiene un peso molecular aproximado de 270.000 (270 kDa). Cada subunidad humano "madura" en circulación consiste en 2.050 residuos aminoácidos.

Se cree que la formación de una única capa, o monocapa, inicial de plaquetas que cubren las superficies endoteliales lesionadas comprende una función de formación de puentes en la que el vWF multimérico que limita la superficie se enlaza, por uno de sus lados, a ciertos componentes del sub-endotelio, tales como el colágeno o los proteoglicanos, y, por el otro lado, al receptor de GPIb-IX de una membrana de plaqueta. Se cree que la interacción del vWF multimérico con complejo glicoproteína Ib-IX (en la GPIb(\alpha)) da lugar a la activación de las plaquetas y facilita el reclutamiento de plaquetas adicionales que actúan formando un trombo en crecimiento. Las plaquetas en rápida acumulación se entrelazan también mediante la unión de fibrinógeno. Es de particular importancia en este proceso el carácter multimérico y multivalente del vWF en circulación, que permite que la macromolécula lleve efectivamente a cabo sus funciones de enlace y formación de puentes.

El fragmento de vWF alterado con cisteína al que se refiere la presente invención compite, en efecto, con el factor vWF por los receptores de GPIb\alpha e inactiva los receptores, de tal manera que no están disponibles para la interacción con el factor vWF, lo que tiene como resultado que se inhibe la formación de coágulos. En cuanto a la naturaleza del fragmento, trabajos previos de investigación han establecido que el dominio de la subunidad de factor de von Willebrand madura de 2.050 residuos que se une al receptor de glicoproteína Ib-IX de membrana de plaqueta (GPIb(\alpha)) es el fragmento de la misma que se extiende desde aproximadamente el residuo 449 (valina) de la subunidad en circulación hasta aproximadamente el residuo 728 (lisina) de la misma. Este fragmento tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 52.000 y puede ser generado por digestión con tripsina, seguida de una reducción con disulfuro del vWF. El dominio de enlace de la GPIb(\alpha) comprende residuos contenidos en dos secuencias discontinuas Cys^{474}-Pro^{488} y Leu^{694}-Pro^{708} dentro del fragmento. Mohri, H. et al., J. Biol. Chem., 263 (34), 17901-17904 (1988). Típicamente, se hace referencia al fragmento de peso molecular 52.000 como fragmento "52/48", lo que refleja el hecho de que los sistemas enzimáticos humanos glicosilan el fragmento contribuyendo a su peso molecular. La magnitud de la glicosilación varía de una molécula a otra, siendo dos pesos, 52.000 y 48.000, los más comunes. Según se expresa a partir de las células huésped bacterianas de recombinación, el fragmento carece de glicosilación post-traslacional asociada a la expresión del mismo en las células de mamífero. Sin el peso adicional como contribución de la glicosilación, el polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 33.000. Tanto el fragmento "52/48" como el "33" inhiben de manera competitiva el enlace o unión del factor de von Willebrand a las plaquetas.

Como se ha mencionado anteriormente, es difícil obtener cantidades terapéuticamente útiles del fragmento de vWF a partir de plasma sanguíneo. En consecuencia, ha demostrado ser deseable producir este fragmento de vWF utilizando ADN de recombinación en células huésped o portadoras. Se dispone de una amplia variedad de sistemas de recombinación para la expresión de una secuencia de ADN que codifica el fragmento. A continuación se describen ejemplos de tres sistemas. Estos sistemas han sido utilizados con éxito, y emplean células huésped bacterianas y codifican el fragmento de residuos 445-733, ligeramente mayor. Se ha determinado que las secuencias de residuos terminales amino y carboxílico adicionales no tienen un efecto significativo en la utilidad del fragmento como sustancia contra la formación de trombos.

(I) Un vector designado como pMMB3, que incorpora un precursor P_{R} de alta eficiencia a partir de lambda bacteriófaga. La introducción de la expresión del fragmento de vWF en E. coli se consiguió cultivando células hasta la mitad de la fase de crecimiento logarítmico, a 30ºC, y a continuación cambiando la temperatura a 42ºC.

(II) Un vector designado como pMMB5, que incorpora un sistema precursor trp-lac (tac) híbrido, regulado por el represor lac. La inducción en este sistema se logró cultivando células hasta la mitad de la fase de crecimiento logarítmico, a 37ºC, a lo que siguió la adición del IPTG análogo a la lactosa.

Los resultados obtenidos con el pMMB3 y el pMMB5 son muy similares. Brevemente, las células de E. coli, transformadas con cada uno de los plásmidos anteriores, se hicieron crecer hasta la mitad de la fase de crecimiento logarítmico, inducida durante entre 1 y 16 horas, para ser cosechadas y fraccionadas en componentes soluble e insoluble. El fragmento de vWF exhibía una extrema insolubilidad después del craqueo o descomposición de una de las poblaciones de células.

(III) Un tercer vector (plásmido), utilizado para la expresión del fragmento de vWF, y que confiere resistencia a la kanamicina (Km^{R}), contiene un precursor obtenido de la T7 bacteriófaga. El vector se obtuvo por el Dr. F. William Studier, de los Brookhaven National Laboratories, y se construyó como sigue. El plásmido se construyó extrayendo un gen resistente a la ampicilina del pET-8c mediante la escisión de un fragmento de BspHI-EcoRI (pBR322 bp 3195-4361) y reemplazándolo por un fragmento de 869 bp que codifica la resistencia a la kanamacina (Km^{R}), con el gen de Km^{R} orientado en el sentido horario (de giro de las agujas del reloj) en el vector. El gen de Km^{R} deriva del Tn903 (Oka et al., J. Mol. Biol., 147: 217-226 (1981)), y se obtuvo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con pUC4KISS (Barany, F., Gene, 37: 111-123 (1985)) como plantilla. El fragmento que porta el gen de Km^{R} comienza 50 nucleótidos por delante del codon de iniciación y finaliza exactamente en el codon de terminación.

Un plásmido que expresa el fragmento de vWF y que confiere resistencia a la kanamicina se construyó a partir de un vector designado como pET-8c52K y pET-8c(Km^{R}). Brevemente, un fragmento de XbaI/BamI que codifica el fragmento de vWF se escindió del pET-8c52K y se ligó para formar XbaI/BamHI recortado de pET-8c(Km^{R}). El ADN plásmido resultante (pET-8c52K9Km^{R}) se transformó en células de E. coli DH-1, y se identificó un único producto de aislamiento que liberó el fragmento de tamaño apropiado por digestión con Xba/BamHI. El ADN de este producto de aislamiento se utilizó a continuación para transformar la E. coli BL21(DE3)pLysS. Se utilizó a continuación un único producto de aislamiento de esta transformación para la expresión del fragmento de vWF.

En este sistema, el ADN de vWF se coloca sobre un vector que contiene el precursor y señales de iniciación de la traslación para la proteína T\phi de la T7 bacteriófaga. Puede suministrarse entonces la polimerasa de ARN a la célula huésped, ya sea por inducción o por infección. En este caso particular, el vector de expresión de vWF se colocó sobre una célula que portaba un profago que contenía el gen para la polimerasa de ARN T7, bajo el control del precursor lac UV5. La adición del IPTG análogo a la lactosa a un cultivo en crecimiento de células indujo la polimerasa de ARN T7, la cual, a su vez, transcribió el ADN pretendido o de objetivo al plásmido. La trascripción por parte de la polimerasa de RNA T7 fue tan activa que el ARN de objetivo se acumuló en cantidades comparables con el ARN ribosomal, y la proteína de objetivo constituyó una fracción principal de la proteína celular. Como caracterización inicial de la síntesis del fragmento de vWF, se indujeron células y se tomaron muestras en instantes de tiempo comprendidos entre 0,5 y 16 horas después de la inducción. Estos datos indicaron que, al cabo de 4 horas desde la inducción, el fragmento de vWF constituía aproximadamente el 25% del total de proteína celular. Este nivel es mucho mayor que el generado, ya sea por el tac, ya sea por el sistema de vector de P_{R}.

Es de particular significación para la provisión de polipéptidos terapéuticos a partir de sistemas de recombinación la capacidad para provocar la expresión de cantidades farmacológicamente útiles de la sustancia terapéutica. De los tres sistemas referidos anteriormente, se prefiere el sistema (III) debido a que produce un mayor aporte de fragmento.

Los fragmentos de vWF producidos por un sistema de expresión bacteriana, tal como, por ejemplo, el sistema (III), tienden, desgraciadamente, a acumularse en grandes cantidades como agregados insolubles (cuerpos de inclusión) en el seno de las células huésped, sin que se disponga de ningún mecanismo en las células huésped para desencadenar su liberación efectiva de las mismas. Por ejemplo, un péptido de señal de mamífero no será generalmente reconocido en el sistema bacteriano. Dichos agregados insolubles de polipéptido expresado (cuerpos de inclusión) son un resultado bien conocido de las tentativas para producir grandes cantidades de proteína útil a partir de sistemas bacterianos de recombinación, véase Williams, D. C. et al., Science, 215, 687-689, (1992), y pueden reflejar polipéptidos plegados o doblados de forma inadecuada.

Se ha propuesto teóricamente que la formación de los cuerpos de inclusión está relacionada con la presencia en su interior de una elevada concentración efectiva de residuos de cisteína. Se cree que se potencia la formación de enlaces incorrectos de disulfuro, que efectivamente sucede, ya sea dentro de los cuerpos de inclusión o durante las tentativas para disolver los polipéptidos desde los mismos. En el caso de que se hayan formado dentro de un fragmento (un enlace dentro de una cadena), tales enlaces pueden conducir a la conformación biológicamente activa de la molécula. Cuando se han formado entre fragmentos (un enlace entre cadenas), dichos enlaces pueden conducir a dímeros o agregados insolubles o biológicamente inactivos. El fragmento de vWF que comprende residuos 445-733 contiene siete residuos de cisteína en las posiciones 459, 462, 464, 471, 474, 509 y 695. De esta forma, la manipulación con éxito de las proteínas de mamífero expresadas a partir de sistemas bacterianos en recombinación ha requerido, en general, que los residuos de cisteína de las mismas sean alterados de tal manera que no puedan reaccionar con otros residuos de cisteína. Sin este tratamiento, se produce típicamente la reacción indeseada de los residuos de cisteína de las mismas, lo que conduce a la formación de agregados de polipéptido insolubles o biológicamente inactivos, que son inadecuados para un uso efectivo como sustancias terapéuticas.

Se dispone de numerosos procedimientos bien conocidos que pueden ser utilizados para alterar con éxito los residuos de cisteína. Una de tales técnicas implica el tratamiento de los residuos de cisteína con un agente reductor, tal como, por ejemplo, el 6-mercaptoetanol el ditiotreitol ("DTT"), seguido de una asociación permanente con radical alquilo, o alquilación, (por ejemplo, con yodoacetamida) de siete residuos de cisteína del fragmento. Es posible fijar muchas otras etiquetas o trazas covalentes a los residuos de cisteína de objetivo, siendo los únicos requisitos que la traza pueda aplicarse en condiciones de pH que no desnaturalicen o adulteren irreversiblemente la proteína de objetivo, y siendo dicha fijación de un tipo que, bajo las condiciones a las que se ve expuesto el fragmento durante su tratamiento o almacenamiento adicional, no permitirá la reacción química con otros residuos de cisteína. Dichos procedimientos de aplicación de trazas covalentes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen también, por ejemplo, la reacción con (A) ácido yodoacético, o con (B) agentes yodantes, tales como la yodofluoresceína. De manera adicional, los residuos de cisteína pueden alterarse químicamente, tal como por sulfitolización. La alteración puede llevarse a cabo también por mutagénesis dirigida de manera localizada de un DNA de codificación, que reemplaza los residuos de cisteína por residuos "inertes", tales como, por ejemplo, la glicina o la alanina, o por borrado de las posiciones de la secuencia correspondientes a la cisteína. Se altera un número suficiente de los residuos de cisteína con el fin de evitar los problemas causados por su presencia.

Como se describe en el Ejemplo 1 que se proporciona más adelante, se prefiere que los efectos de agregación provocados por la unión de disulfuro incorrecta se eliminen, por lo que respecta a las formulaciones terapéuticas de esta invención, por la reducción química (con ditiotreitol, "DTT") seguida de una asociación con radical alquilo, o alquilación, permanente (con yodoacetamida). A pesar de este tratamiento, se ha encontrado que el polipéptido resultante (designado en lo sucesivo como el "fragmento de vWF con radical alquilo" de la invención) permanece acumulado en forma agregada y, por tanto, terapéuticamente inútil. Otros tipos de fragmentos alterados con cisteína pueden ser igualmente resistentes a la solubilización para su formulación terapéutica, y el comportamiento de agregación responsable de ello no está relacionado con las cisteínas.

En consecuencia, esta invención proporciona etapas de tratamiento que resultan eficaces a la hora de solubilizar el fragmento alterado con cisteína, y ello proporciona soluciones acuosas del fragmento que son aceptables, por ejemplo, para su inyección en pacientes, de tal manera que dichas soluciones que contienen el fragmento disuelto se encuentran en una forma no agregada y terapéuticamente útil.

De este modo, la presente invención incluye dentro de su ámbito una identificación de las condiciones en las que puede proporcionarse el fragmento de vWF expresado, que comprende cuerpos de inclusión, en primer lugar como un fragmento alterado con cisteína y no agregado, estabilizado en una solución que contiene un agente desnaturalizante o adulterante, y, en segundo lugar, como un fragmento no agregado, estabilizado en una solución que contiene únicamente sustancias terapéuticamente aceptables que son compatibles con la inyección en humanos.

Es posible utilizar cualesquiera medios adecuados para recuperar el fragmento de vWF del sistema de recombinación en el que se prepara el fragmento. Como etapa inicial, los agregados insolubles del fragmento, esto es, los cuerpos de inclusión, son separados de otros componentes celulares. Esto implica la rotura o disgregación de las células huésped y la separación de los materiales disgregados de las células de la proteína insolubilizada (como cuerpos de inclusión). Ejemplos de medios de que se dispone para llevar esto a cabo son procedimientos que comprenden el uso de disgregación por ultrasonidos, o sonificación, y homogeneización. Procedimientos representativos incluyen los descritos en las Patentes norteamericanas Nos. 4.828.929 y 4.673.641.

Un procedimiento preferido para extraer los cuerpos de inclusión de las células huésped se describe en el Ejemplo 1 que se proporciona más adelante, e implica ciclos repetidos de utilización de la homogeneización mecánica para llevar a cabo la disgregación de las células en presencia de uno o más detergentes, y la separación de los materiales de las células disgregados de los fragmentos de vWF por centrifugación. Debe comprenderse que pueden utilizarse también otros procedimientos.

El fragmento de vWF agregado que se ha recuperado de los sistemas de recombinación comprende un espectro ancho de polipéptidos que va desde trímeros solubles del fragmento a estructuras macroscópicas insolubles en las que se unen miles de tales fragmentos de polipéptido individuales. Típicamente, sin embargo, estos agregados compuestos de entre aproximadamente 10 y 20 fragmentos o menos, y que tienen un peso molecular de entre 200.000 y 400.000, son solubles. Dichos fragmentos, a los que se hace referencia aquí como "agregado soluble", tienen una utilidad terapéutica relativamente baja según se mide en ensayos in vitro (véase el Ejemplo 3 y la Figura 3). Ciertos complejos incluso mayores son también solubles, aunque también de utilidad terapéutica relativamente baja.

Los "fragmentos no agregados" (o fragmentos "substancialmente carentes de agregación") que se obtienen del procedimiento que aquí se describe comprenden una población compuesta de fragmento monomérico y también de fragmento dimérico ligado o enlazado de manera no covalente. Basándose en experimentos que utilizan cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC -"High Performance Liquid Chromatography"), la cantidad de "agregado soluble" presente en dichas muestras es menor que aproximadamente el 0,5%. De hecho, se espera para la mayor parte de las preparaciones que el porcentaje de contaminación sea menor, al ser en gran medida un elemento espurio del entorno o medio salino del sistema de HPLC. Como se explicará más adelante, los dímeros aislados de esta forma existen en equilibrio (Figura 1) con el monómero, y se ha determinado que tienen, en promedio, la mitad de la actividad de aglutinamiento anti-plaquetas de los monómeros, en relación con su peso. Esto sugiere el enmascaramiento de uno o dos lugares de enlace dentro del dímero. En relación con la producción de muestras terapéuticamente útiles de fragmento no agregado, se prefiere la preparación de muestras que contienen una cantidad mayoritaria de monómero y una cantidad menor de dímero.

En la práctica de la invención, el procedimiento para la preparación de fragmento disuelto y no agregado comienza con una etapa que convierte el agregado soluble en agregado insoluble. Esto implica la preparación de una solución acuosa que contiene el fragmento de vWF alterado con cisteína y el agente desnaturalizante.

La forma preferida de la invención implica la asociación permanente con radical alquilo del fragmento en una solución acuosa, bajo condiciones en las que un agente desnaturalizante facilita la formación de agregados solubles del fragmento. La disociación del material agregado puede supervisarse mediante cualquiera de diversas técnicas bien conocidas, incluyendo la cromatografía de gel basada en la exclusión por tamaño y en la ultra-centrifugación.

La asociación con radical alquilo del fragmento viene precedida por la reducción de los enlaces de disulfuro dentro de las cadenas y entre cadenas, en el agregado de cuerpos de inclusión. Esto es seguido por la asociación permanente con radical alquilo de los residuos de cisteína reducidos. Tanto la reducción como la asociación con radical alquilo del fragmento pueden llevarse a cabo por cualesquiera medios adecuados, y tales etapas de tratamiento de las proteínas son conocidas.

La reducción implica generalmente hacer reaccionar una solución acuosa del agregado con un agente reductor adecuado, bajo condiciones que convierten los enlaces de disulfuro del agregado proteínico en grupos tiol. Ejemplos de agentes reductores que se pueden utilizar son el \delta-mercaptoetenol y el ditiotreitol, siendo el preferido el último que se ha mencionado.

El producto de reducción puede entonces someterse a asociación con radical alquilo bajo condiciones tales que el agente de asociación con radical alquilo funciona marcando con una traza, de forma permanente y covalente, los grupos sulfhidril libres del fragmento, de un modo tal, que son y permanecen inactivos cuando el fragmento proteínico se somete a una manipulación o almacenamiento adicional. Puede utilizarse cualquier agente de asociación con radical alquilo adecuado. Ejemplos de tales agentes incluyen ácido yodoacético y yodoacetamida, prefiriéndose la última que se ha mencionado.

De acuerdo con la invención, el fragmento de vWF alterado con cisteína, incluyendo la forma asociada con radical alquilo del mismo, y la producción subsiguiente de fragmento no agregado, se lleva a cabo manipulando el fragmento en una solución acuosa que contiene un agente desnaturalizante o adulterante. La expresión "agente desnaturalizante", tal como se emplea aquí, se refiere a sustancias que son capaces, en concentraciones adecuadas, de modificar la conformación de los fragmentos, típicamente mediante uno o más de los siguientes mecanismos representativos: alterar el entorno o medio disolvente, es decir, el estado de hidratación de ciertos grupos del fragmento, al proporcionar ciertas interacciones con la superficie disolvente o al disgregar contactos iónicos o de enlaces de hidrógeno u otras interacciones, dentro de un fragmento o entre fragmentos. En general, los efectos de un agente desnaturalizante son reversibles. Por ejemplo, al realizar una diálisis contra una solución que no contiene agente desnaturalizante, se invierte el efecto inducido por el agente desnaturalizante. La naturaleza del agente desnaturalizante utilizado en la práctica de la presente invención, así como las condiciones del tratamiento, son tales que los efectos del uso del agente desnaturalizante son reversibles. En consecuencia, el uso de materiales o condiciones que causan un efecto irreversible deberá ser evitado, por ejemplo, el uso de una temperatura elevada o la aplicación de sustancias que se unan al fragmento con una afinidad tal elevada como para ser, en un sentido práctico, imposibles de
retirar.

La expresión "agente desnaturalizante" y el término "detergente", tal como se utilizan aquí, se consideran equivalentes siempre y cuando se satisfagan los criterios anteriores. Ejemplos de materiales adecuados para uso como agentes desnaturalizantes en la presente invención incluyen la urea y el hidrocloruro de guanidina, así como detergentes tales como, por ejemplo, el polioxietilen (9) p-tert-octilfenol (Nonidet® P40), el polioxietilen (9-10) p-tert-octilfenol (Triton-X-100), y el desoxicolato de sodio.

El agente desnaturalizante más preferido para uso en la presente invención es la urea. Ésta es altamente soluble en soluciones acuosas y es capaz de ser extraída rápidamente de la solución por diálisis. Debido a que la urea es una sustancia no iónica, ésta no interfiere con materiales de intercambio iónico que pueden emplearse en el procedimiento para eliminar los contaminantes de origen bacteriano, tales como el ADN y la endotoxina, como se describe más adelante. Un intervalo de concentraciones recomendado para la urea es entre aproximadamente 4 M y aproximadamente 8 M.

La práctica de la presente invención puede incluir también etapas que se han encontrado particularmente útiles para eliminar del fragmento de vWF alterado con cisteína contaminantes de origen bacteriano, tales como, por ejemplo, el ADN bacteriano, la endotoxina bacteriana (lipopolisacárido) y proteínas bacterianas. La eliminación de tales contaminantes permite al fragmento ser utilizado en formulaciones terapéuticas. Según se establece en general, el procedimiento comprende someter a una solución acuosa del fragmento de vWF asociado con radical alquilo e impuro, y al agente desnaturalizante, a un material de intercambio aniónico y, a continuación, a un material de intercambio catiónico.

El tratamiento de la solución con contenido de contaminante con el material de intercambio aniónico se lleva a cabo a un pH alcalino y resulta eficaz para la eliminación de la solución de ADN bacteriano y endotoxina, que se adhieren al material de intercambio aniónico. Para este propósito, la solución deberá contener una cantidad de sales en tal magnitud, que los componentes bacterianos se adhieran al material de intercambio aniónico y los fragmentos de vWF no.

La solución se pone a continuación en contacto, a un pH ácido, con un material de intercambio catiónico al que se une el fragmento, con lo que se separa el fragmento de la proteína bacteriana. El pH ácido de la solución habrá de ser tal, que algunos de los grupos carboxilo del material de intercambio catiónico se ionicen, y algunos de los grupos carboxilo del fragmento incorporen un protón con el fin de evitar la agregación. La elución del fragmento del material de intercambio catiónico puede llevarse a cabo con una solución amortiguadora o tampón de elución adecuada, por ejemplo, y preferiblemente, una solución acuosa que contenga ácido cítrico ionizado y un agente desnaturalizante no iónico.

El ejemplo 1 que se proporciona más adelante describe una serie preferida de etapas que son representativas de los métodos que separan efectivamente del fragmento los contaminantes bacterianos en condiciones en las que se logra el propósito global del procedimiento -convertir la población de fragmentos de vWF alterados con cisteína en fragmentos no agregados.

Si bien el hidrocloruro de guanidina se considera un agente desnaturalizante preferido, éste interfiere con los materiales de intercambio iónico y debe ser substancialmente retirado antes de efectuar cualesquiera etapas de intercambio iónico que eliminen contaminantes del tipo anteriormente mencionado. Una concentración recomendada de hidrocloruro de guanidina se encuentra entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8 M.

Es importante que el fragmento se mantenga, durante su solubilización adicional, en presencia de agente desnaturalizante a un pH desde aproximadamente 2,5 hasta por debajo de aproximadamente 5,5. La titración con ácido de las cadenas laterales de aminoácido del fragmento de vWF asociado con radical alquilo, demuestra que el fragmento incorpora protones al máximo a un pH de 3,5, de manera que el fragmento de polipéptido porta entonces una carga neta de (+) 41. Se cree que es importante mantener el fragmento en un entorno que maximice la carga neta, a fin de preservar la solubilidad del fragmento, facilitando la disociación de agregados solubles en agregados más pequeños y en material no agregado, y evitando también la reasociación de los fragmentos. Se prefiere un valor de pH de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4. La más preferida es la solubilización en presencia de agente desnaturalizante a un pH de 3,5. Puede utilizarse cualquier ácido adecuado para ajustar el pH. Ejemplos de ácidos que se pueden emplear incluyen ácido hidroclórico o ácido láctico. Sin embargo, se prefiere el uso de un ácido que proporcione una capacidad de amortiguación en el intervalo de pH entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5. Lo más preferido es el uso de ácido cítrico.

Si bien se conocen numerosos procedimientos para solubilizar proteínas de cuerpo de inclusión agregadas en presencia de un agente desnaturalizante, cualquier uso clínico del producto resultante requiere que el desnaturalizante contenido en su interior sea reemplazado por materiales clínicamente aceptables que no sean tóxicos ni irritantes, de tal manera que la solución resultante cumpla la normativa legal para su inyección en humanos. Las tentativas para formular un fragmento de vWF alterado con cisteína, e incluso un fragmento en forma asociada con radical alquilo, reconstituida a partir de cuerpos de inclusión, en una solución que tiene un pH fisiológico o una concentración de iones representativa de la salinidad de la sangre, han tenido como resultado únicamente productos que contienen proteína agregada insoluble.

Así, si bien la monomerización del fragmento alterado con cisteína con agentes desnaturalizantes produce una composición en la cual los fragmentos han sido substancialmente disociados, la formulación con éxito del polipéptido para uso clínico sin agente desnaturalizante ha demostrado ser, hasta ahora, imposible. Si bien se obtiene una carga neta de +41 sobre el fragmento de vWF para un pH de 3,5, y aunque dicha carga es representativa de la carga neta que se puede generar sobre muchas proteínas de tamaño comparable, o es incluso más substancial que ésta, las moléculas monoméricas así producidas se vuelven a agregar en ausencia de desnaturalizante. En lo que sigue se proporciona una explicación de las etapas de procedimiento que permiten preparar una formulación clínica de una forma soluble del fragmento de vWF alterado con cisteína, así como almacenarla y dispensarla.

Un aspecto importante de la presente invención es la constatación de que la solubilidad del fragmento de vWF alterado con cisteína en una solución de pH ácido se mejora si la solución contiene una concentración relativamente baja de sustancias iónicas. Tales sustancias pueden darse en la forma de sales orgánicas o inorgánicas, soluciones amortiguadoras o tampón, aminoácidos u otras moléculas cargadas. Como se desarrolla más adelante, se cree que el hecho de mantener el fragmento alterado con cisteína en dicha solución acuosa facilita, en relación con las soluciones que tienen valores de pH y de concentración de sales iónicas fisiológicos, la solubilización de los grupos semipolares o hidrófobos del fragmento por parte de la solución acuosa. En consecuencia, dichas soluciones se emplean para reemplazar las soluciones que contienen agente desnaturalizante descritas anteriormente, para el almacenamiento de formulaciones clínicas.

En la práctica de la invención, la concentración de sustancias iónicas, definida como la suma total de las concentraciones de los iones positivos y de los iones negativos que son adicionales a la contribución de los grupos cargados proporcionados por el fragmento, no deberá exceder de aproximadamente 75 mM en una solución acuosa del fragmento. Cuando se supera esta concentración, ausente la presencia del agente desnaturalizante, la agregación de los fragmentos de vWF alterados con cisteína es de una magnitud tan significativa, que el material resulta inadecuado para su almacenamiento a largo plazo con vistas a su utilización clínica, ya sea en solución, ya sea cuando se descongela de un almacenamiento en congelación o cuando se reconstituye a partir de su forma liofilizada, y, como se desarrolla más adelante, puede ser, además, inadecuado para su almacenamiento temporal, antes de un procesamiento adicional,

La concentración a la que el fragmento de vWF alterado con cisteína, substancialmente carente de agregado, está presente en las formulaciones acuosas de la invención puede variar a lo largo de un intervalo relativamente amplio, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml. De esta forma, el fragmento alterado con cisteína puede ser hecho soluble, por ejemplo, en las formulaciones preferidas, en hasta al menos 30 mg/ml aproximadamente, sin que se produzca la formación de agregado soluble. Como consecuencia del equilibro que existe entre monómeros y dímeros del fragmento alterado con cisteína "no agregado", y debido a la más alta actividad inhibitoria específica del monómero (véanse el Ejemplo 2 y la Figura 1), se prefieren los intervalos de concentración que favorecen el monómero, tales como hasta aproximadamente 15 mg/ml, siendo el más preferido el comprendido entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 mg/ml, una concentración particularmente adecuada para la dosificación eficaz.

En la práctica de la invención se prefiere una formulación terapéutica que contenga hasta aproximadamente
10 mM de sal inorgánica, hasta aproximadamente 15 mM de un compuesto iónico adicional, tal como, por ejemplo, un hidrocloruro de aminoácido, y hasta aproximadamente 10 mM de una solución amortiguadora. Con respecto a la explicación de los intervalos de concentración preferidos para los anteriores o similares compuestos, se entiende que "mM" hace referencia a la concentración de compuesto, y no de los iones individuales, cuya suma total no ha de exceder de aproximadamente 75 mM.

De manera adicional, puede añadirse un modificador de tonicidad no iónico, tal como un azúcar o un derivado del azúcar, incluyendo, por ejemplo, manitol, sacarosa o maltosa, a las formulaciones de la presente invención, ya sea antes del almacenamiento en forma líquida, ya sea antes de la liofilización de las mismas. La cantidad de éste puede comprender de aproximadamente 0 a aproximadamente el 15% (w/v (peso / volumen)). Dichas preparaciones pueden ser congeladas y descongeladas a continuación para su uso terapéutico.

Una formulación acuosa preferida comprende NaCl u otra sal inorgánica a entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10 mM, ácido cítrico u otra disolución amortiguadora apropiada a entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5 mM, y monohidrocloruro de lisina u otro aminoácido a entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 15 mM.

Una realización altamente preferida de la presente invención es una solución que tiene un pH de aproximadamente 3,5 y que comprende en torno a 1,5 mM de NaCl, aproximadamente 1 mM de ácido cítrico, y aproximadamente 1 mM de monohidrocloruro de lisina. La adición de un modificador de tonicidad no iónico, tal como, por ejemplo, manitol a aproximadamente el 5% (w/v), hace que las formulaciones de la invención sean aproximadamente isotónicas con las soluciones fisiológicas.

Siguiendo las etapas de tratamiento que se han descrito aquí, es posible preparar una solución acuosa de fragmento de vWF alterado con cisteína que carece sustancialmente de agregado. La expresión "que carece sustancialmente de agregado" incluye una solución terapéutica u otra composición farmacéutica de fragmento de vWF alterado con cisteína que contiene una cantidad de agregado soluble y/o de agregado insoluble que no es suficiente para desencadenar consecuencias clínicas adversas en los pacientes cuando se administra en dosis terapéuticas.

La práctica de la presente invención puede ser empleada para preparar soluciones acuosas de fragmentos alterados con cisteína que carecen sustancialmente de agregado y en las que la concentración del fragmento en las mismas es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mg/ml, y, más preferiblemente, aproximadamente 10 mg/ml.

La práctica de la invención puede emplearse también para preparar soluciones acuosas de fragmentos alterados con cisteína que carecen sustancialmente de agregado, en las que el porcentaje en peso de monómero es al menos de aproximadamente el 40 a aproximadamente el 100%, preferiblemente al menos de aproximadamente el 65 a aproximadamente el 80% en peso, y, de la forma más preferida, al menos aproximadamente el 75% en peso.

El fragmento de vWF alterado con cisteína puede ser formulado para su almacenamiento en forma no agregada en agua desionizada carente de pirogeno, ajustando el pH resultante en aproximadamente 3,5, sin soluciones amortiguadoras, sales o compuestos iónicos adicionales, a excepción de los necesarios para la titración de la preparación. En tal caso, se prefiere la adición de un modificador de tonicidad no iónico. Dichas preparaciones pueden también ser liofilizadas o congeladas y después descongeladas para su uso terapéutico. De esta forma, la invención proporciona soluciones terapéuticas que tienen tal estabilidad, que pueden ser liofilizadas o congeladas y reconstituidas o descongeladas después de tal manera que, con tal tratamiento, se recupera la actividad inicial.

Las composiciones producidas de acuerdo con la práctica de la invención pueden ser almacenadas durante al menos un mes a 4ºC de manera que la composición permanece sustancialmente carente de agregado.

Con respecto a la selección de un pH preferido para almacenar una solución, o para dicha solución antes de la liofilización o la congelación de la misma, se constata que la titración con ácido de las cadenas laterales de aminoácido del fragmento alterado con cisteína, por la que se genera el fragmento de carga completa de (+)41, se completa a un pH de aproximadamente 3,5. En consecuencia, se prefieren las formulaciones comprendidas en el intervalo de pH de entre aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Una acidez mayor puede desnaturalizar la proteína, en tanto que valores de pH mayores se aproximan demasiado al pH isoeléctrico (5,5) de la proteína, para el cual se producirá la agregación.

Se constata también que formulaciones que tienen un pH fuera del intervalo preferido o que contienen una concentración de iones fuera del intervalo preferido, pueden ser, sin embargo, adecuadas para el almacenamiento de una solución acuosa de fragmento con radical alquilo durante periodos intermedios de tiempo (tales como antes de un tratamiento adicional), previos a su almacenamiento a largo plazo.

El fragmento de vWF alterado con cisteína proporcionado a partir de vWF según se aísla del sistema circulatorio o de un sistema de mamífero en recombinación, puede también ser formulado de acuerdo con la práctica de la invención con unas características de solubilidad y estabilidad mejoradas. La formulación así preparada puede ser isotónica con la sangre, o bien puede ser hipertónica o hipotónica con la misma.

Se cree que los procedimientos de monomerización y formulación de esta invención son efectivos, al menos en parte, porque las condiciones de tratamiento descritas aquí permiten aprovechar las propiedades de ciertos residuos aminoácidos hidrófobos e hidrófilos, así como de los dominios resultantes dentro de la secuencia del fragmento de vWF alterado con cisteína. Se ha mencionado anteriormente que el mantenimiento del fragmento alterado con cisteína a un pH de 3,5 confiere al polipéptido una carga neta de +41, lo que se cree que mejora su carácter hidrófilo y, por tanto, su solubilidad. La titración (protonación) de las cadenas laterales de ácido glutámico y aspártico a un pH aproximado de, o por debajo de, 4,5, constituye un modulador potencialmente significativo de la estructura de la proteína que puede explicar también la estabilización contra la agregación conferida sobre el fragmento de vWF por su almacenamiento a un pH de 3,5.

Es bien conocido el hecho de que las cadenas laterales de homopolímeros aminoácidos cargadas pueden desestabilizar las hélices \alpha. El ácido poli-L-glutámico y la poli-L-lisina no cargados forman, por ejemplo, estructuras helicoidales \alpha estables, en tanto que las formas cargadas de los mismos son estables únicamente como regiones de espira aleatoria. Véanse Urnes, P. and Dozy, P., Adv. Protein Chem., 16, 401 (1961), Lehniger, A. L., Biochemistry, pág. 113, Worth Publishing Company (1970). Se espera que los residuos de ácido glutámico y aspártico adecuadamente colocados, cuando se cargan negativamente, desestabilizarán también las regiones helicoidales \alpha situadas dentro del fragmento de vWF alterado con cisteína. En su forma con exceso de protones, sin embargo, por ejemplo, a un pH de 3,5, es más probable que se acomoden a ser incluidos en regiones estructuralmente ordenadas, o a permitir la formación próxima de éstas o su propagación.

Se cree que, en la medida en que dichas regiones estructurales ordenadas se vean aumentadas, o formadas por protonación de aspartato o glutamato a un pH de 3,5, limitarán la facilidad con la que pueden enlazarse cualesquiera de dichas regiones (presentes en los instantes anteriores como una espira aleatoria que contiene residuos hidrófobos a un pH aproximado de 7,0). Se anticipa que dichos efectos pueden medirse por un incremento en la entalpía de activación necesaria para la asociación hidrófoba.

Se espera también que dichas asociaciones se vean minimizadas en soluciones acuosas que, comparadas con las soluciones fisiológicas, contengan una concentración substancialmente más baja de sustancias iónicas disueltas.

Se espera que el hecho de que el mantenimiento a un pH de 3,5 facilite o no la monomerización de una proteína particular e inhiba o no la agregación de la misma, dependa del número total de residuos de aspartato y glutamato contenidos en la estructura de polipéptido, así como de su separación con respecto a sub-dominios de residuos aminoácidos particulares cuyo potencial para participar en una estructura ordenada depende, en parte, del estado de protonación del glutamato y del aspartato proximales. Es evidente, por lo tanto, que la cuestión de si el ajuste a un pH de 3,5 de polipéptidos producidos con recombinación y alterados con cisteína facilitará o estabilizará la monomerización de los mismos, es un asunto que debe ser acometido con un criterio de especie polipéptida en especie polipéptida.

Factores particulares que son útiles en la evaluación de la utilidad potencial de la formulación a un pH bajo para evitar el comportamiento de agregación que, de otro modo, aparecería en condiciones de almacenamiento a un pH fisiológico de 7,0, se presentan en lo que sigue utilizando como modelo fragmento de vWF alterado con cisteína.

(A) El fragmento de vWF de residuos 445-447 y alterado con cisteína, contiene 21 residuos de glutamato y 15 de aspartato, de un total de 289 posiciones de secuencia que indican que un número significativo de los lugares en los que la estructura secundaria ordenada ha sido perturbada a un pH de 7,0 pueden quedar ordenados con la protonación de residuos concretos de ácido glutámico o de ácido aspártico.

(B) Se conoce el hecho de que muchos residuos clásicamente hidrófobos prefieren o permiten dominios helicoidales \alpha o en lámina plegada \delta y pueden, como consecuencia de la reclusión o captación en un sub-dominio estructural ordenado a un pH de 3,5, ser menos capaces de participar en la agregación hidrófoba. Tales residuos incluyen la alanina, la leucina, la fenilalanina, la tirosina, el triptófano, la cisteína, la metionina, la aspargina, la glutamina y la valina. La cuestión de si una sub-región particular adyacente a un residuo de Asp o de Glu es de una naturaleza hidrófoba, de tal manera que será útil a la hora de conferir sobre ella una estructura secundaria ordenada, como puede hacerse posible por la protonación de glutamato o de aspartato, puede responderse, en parte, haciendo referencia al modelo de Kyte, J. et al., J. Mol. Biol., 157, 105-132 (1982). El modelo de Kyte predice la extensión del carácter hidrófobo (o hidrofílico) que exhibirá una secuencia péptida particular cuando esté presente en polipéptidos de mayor tamaño. Se asigna un índice global de hidrofobia / hidrofilia basándose en las contribuciones de los residuos individuales y en la posición de los aminoácidos particulares, unos en relación con otros, en la secuencia de objetivo o buscada.

(C) Existen, dentro del fragmento de residuos 445-733, numerosas secuencias de 5 ó más residuos en las que se espera que se incremente la estructura ordenada por medio de la protonación de ácido glutámico o aspártico en la región de pH comprendido entre 3,5 y 4,0, con respecto al orden alcanzado para un pH próximo a 7,0. Dominios representativos cuyo carácter en hélice \alpha puede ser mejorado a un pH de 3,5 incluyen los siguientes (haciendo referencia a la secuencia publicada):

(1)

Cys^{464} - Leu^{469} (que contiene Asp en 465);

(2)

Cys^{471} - Glu^{476} (que contiene también Glu en 472);

(3)

Leu^{494} - Ile^{499} (que contiene Glu y Asp, respectivamente en 497, 498);

(4)

Leu^{512} - Asp^{520} (que contiene también Asp en 514);

(5)

Glu^{527} - Leu^{533} (que contiene también Glu en 529, 531);

(6)

Val^{537} - Glu^{542} (que contiene también Asp en 539);

(7)

Val^{533} - Tyr^{558} (que contiene Glu en 557);

(8)

Val^{680} - Gln^{686} (que contiene Asp en 681 y Glu en 682, 684); y

(10)

Tyr^{693} - Ala^{698} (que contiene Asp en 696).

El incremento en la estructura ordenada que puede producirse en el fragmento de vWF alterado con cisteína y no agregado, por un desplazamiento o cambio de pH de 4,5 a 3,5 se describe en el Ejemplo 4 y en la Figura 4 del mismo.

Por lo que respecta al uso terapéutico de formulaciones de fragmento de vWF alterado con cisteína que carecen substancialmente de agregado, la cantidad que se ha de administrar para la prevención o la inhibición de la trombosis dependerá de la gravedad con la que el paciente se vea afectado por la trombosis, pero puede determinarse fácilmente para cualquier paciente concreto. Las formulaciones de la presente invención que comprenden soluciones o nuevas suspensiones de material liofilizado, pueden inyectarse en los pacientes directamente o mezcladas con otras sustancias fisiológicamente compatibles, tales como modificadores de tonicidad no iónicos, justo antes de ser inyectadas.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de fragmento de factor de von Willebrand con radical alquilo, en forma no agregada

El siguiente procedimiento se ha concebido para (1) poner en disolución agregados solubles (típicamente de 200 kDa o superiores), disueltos a partir de una bolita o gránulo de cuerpo de inclusión de fragmento de vWF, tal como se hace referencia más adelante; (2) eliminar los contaminantes que no son aceptables en las formulaciones terapéuticas (tales como ADN bacteriano y endotoxinas); (3) iniciar la "monomerización" del fragmento en una serie de etapas que dan lugar a agregados cada vez más pequeños; y (4) proporcionar el material no agregado resultante en una solución amortiguadora o tampón de formulación que estabiliza el fragmento contra una nueva agregación.

El material en gránulo de cuerpo de inclusión se obtuvo de un cultivo apropiado de E. coli BL21(DE3)pLysS de la forma que sigue. Se cosecharon o recogieron células a partir de 50 litros de cultivo aireado y concentrado, con el uso de cartuchos de membrana de micro-filtro de fibra hueca. Se emplearon dos cartuchos de filtro Amicon H5MPO1-43 en modo de recirculación. Las células se concentraron hasta un volumen de entre 2 y 4 litros sobre los filtros Amicon, después de lo cual las células se lavaron por diafiltrado en el aparato de filtrado Amicon con 5 volúmenes, aproximadamente de 10 a 20 litros, de solución salina regulada o amortiguada con Tris (0,025 M de Tris, 3,03 g/litro de H_{2}O, 0,2 M de NaCl, 11,7 g/litro de H_{2}O, pH final: 7,5 \pm 0,2, 25ºC; a la que se hace referencia en lo sucesivo como A-1).

Se recuperaron las células del filtrado en 4 litros de solución salina amortiguada con Tris (A-1). Como preparación para la rotura o disgregación de las células, se añadió desoxicolato de sodio la suspensión de las células, con el fin de alcanzar una concentración final de 0,5 g/litro. Las células se disgregaron mecánicamente haciéndolas pasar a través de un Microfluidizer® (aparato de micro-fluidización) (Microfluidics Corp., M-110Y Microfluidizer®) inmediatamente después de ser recogidas. Después de que las células hubieron pasado una vez a través del Microfluidizer®, se añadió un segundo detergente, el Tween 80, a la suspensión de células descompuestas con el fin de alcanzar una concentración final del 0,025%, con el uso de 25 ml de Tween 80 al 2,5% (v/v (volumen / volumen)), disueltos en 1 litro de TBS. Esto se lleva a cabo calentando la solución amortiguadora A-1, y añadiendo gota a gota el Tween 80 a la solución y mezclándola hasta que la solución es visiblemente homogénea. La solución se enfrió hasta la temperatura ambiente y se añadió a continuación a la suspensión de células disgregadas para obtener una concentración final del 0,025% (v/v); (en lo que sigue, A-2). Si el Tween estuviera presente en el primer paso, el Microfluidizer® podría quedar obstruido y se requeriría la limpieza del recorrido del flujo antes de que las células pudieran ser disgregadas. Una vez que las células fueron disgregadas, se centrífugo la suspensión (10.000 x g; 35 minutos; 4ºC) con el fin de separar los cuerpos de inclusión, que constituían el producto primario, de los residuos celulares solubles. En esta etapa, los cuerpos de inclusión pueden ser almacenados durante una noche a -20ºC.

Los cuerpos de inclusión se pusieron de nuevo en suspensión en 35 ml de solución amortiguadora con Tris, A-3, por cada gramo de peso en mojado de cuerpo de inclusión, según se determinó por la diferencia de pesos entre el tubo centrífugo (A-3 - 0,05 M de Tris, 6,06 g/litro de H_{2}O, 1,21 mM de desoxicolato de sodio, 0,5 g/litro de H_{2}O, 2 mM de ditiotreitol (DTT), 0,31 g/litro de H_{2}O, 2 mM de EDTA, 0,74 g/litro de H_{2}O, 5% (v/v) de glicerol, 50 ml/litro de H_{2}O, 0,025% (v/v) de Tween 80, 10 ml de Tween 80 al 2,5% (A-2)/litro de H_{2}O, pH final 9,0 \pm 0,2, 25ºC). Los gránulos de cuerpo de inclusión se volvieron a suspender de la misma manera en la disolución reguladora con el uso de un homogeneizador Polytron (Brinkmann). Los cuerpos de inclusión nuevamente suspendidos se hicieron pasar a través del Microfluidizer® con el fin de garantizar una mezcla total con la solución amortiguadora. Tras su paso a través del Microfluidizer®, los cuerpos de inclusión fueron recogidos por centrifugación. Se efectuó el procedimiento de lavado un total de tres veces con la solución amortiguadora con Tris A-3. Al final del tercer lavado, los cuerpos de inclusión en forma de gránulos se suspendieron de nuevo en una solución amortiguadora con Tris A-4, que no contenía los detergentes desoxicolato ni Tween (A-4 - 0,05 M de Tris, 6,06 g/litro de H_{2}O, 2 mM de ditiotreitol (DTT), 0,31 g/litro de H_{2}O, 2 mM de EDTA, 0,74 g/litro de H_{2}O, 5% (v/v) de glicerol, 50 ml/litro de H_{2}O, pH final 9,0 \pm 0,2, 25ºC). El cuarto y último lavado se llevó a cabo con la solución amortiguadora con Tris a-4. El producto crudo o en bruto se recogió después de su centrifugación, se secó por drenaje y puede ser almacenado a -70ºC.

Cada gramo de gránulo de cuerpo de inclusión se disolvió en un volumen de 7,5 ml de solución amortiguadora que comprendía 6 M de urea, 0,05 M de Tris\cdotHCl y 1 M de cloruro de sodio, con un pH de 8,8. El material de vWF "solubilizado" resultante representa una población heterogénea de agregados solubles que tienen, típicamente, un peso molecular de aproximadamente 200 kDa o mayor.

La mezcla se situó bajo una atmósfera de nitrógeno y se le añadió ditiotreitol (DTT) hasta una concentración final de 0,01 M, con una agitación suave, a fin de reducir los enlaces de disulfuro del fragmento. Se prosiguió la agitación de la mezcla en la oscuridad durante 1 hora a 37ºC. Se añadió yodoacetimida (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) hasta una concentración final de 0,05 M. Se añadió a continuación DTT adicional con el fin de elevar la concentración final de DTT a 0,03 M. La solución, que contenía fragmento de vWF con radical alquilo, se hizo pasar entonces a través de un filtro de 0,2 micras y se transfirió a un recinto o local frío que se mantuvo a 4ºC \pm 2ºC. Se llevaron a cabo procedimientos de purificación subsiguientes en un local frío, a 4ºC, utilizando reactivos previamente equilibrados a esa temperatura.

El material con radical alquilo se diluyó 5 en un factor de 5 mediante la adición de una solución amortiguadora que comprendía 6 M de urea, 0,05 M de Tris\cdotHCl, 5 mM de EDTA disodio, a un pH de 8,0. La solución resultante contenía también 0,2 M de NaCl que se conservaba de la solución de asociación con radical alquilo. La preparación de vWF diluida se sometió a cromatografía en una columna de partículas de agarosa conformadas a modo de bolitas de entre 45 y 165 micras, que presentaban cadenas laterales de amonio cuaternario adecuadas para el intercambio aniónico (Q-Sepharose®, Pharmacia, Uppsala, Suecia), las cuales habían sido previamente equilibras con solución amortiguadora que comprendía 6 M de urea, 25 mM de Tris\cdotHCl, 0,02 M de cloruro potásico, 0,1 mM de EDTA disodio, 0,1 mM de DTT, con un pH de 8,0. Bajo estas condiciones, el fragmento de factor de von Willebrand no se unía a la Q-Sepharose®; sin embargo, sí que se unieron contaminantes tales como ADN cargado negativamente y endotoxina bacteriana, incluyendo lipopolisacárido.

La carga neta de cada unidad monomérica de polipéptido dentro de los agregados solubles es, en estas condiciones, aproximadamente (-2). Se cree que esta carga neta baja, en combinación con la elevada concentración de sales de la muestra aplicada, impide que se una agregado a la fase estacionaria. El fragmento de vWF con contenido de fracción no ligada, principalmente en la forma de una población de agregados solubles, se filtró a continuación a través de un filtro de 0,2 micras, después de lo cual la materia filtrada se diluyó en un factor de 10 mediante la adición de una solución amortiguadora que comprendía 6 M de urea, 0,01 M de citrato de sodio, con un pH de 3,5. La preparación resultante se mantuvo entonces aproximadamente 1 hora a 4ºC. Durante este periodo se inició la disociación de los agregados solubles, lo que desplazó la población de fragmento a agregados de menor tamaño y a moléculas monoméricas o diméricas.

Se ajustó entonces el pH de la preparación a 4,8 mediante la adición de un volumen suficiente de citrato de sodio 1,0 M carente de solución amortiguadora, después de lo cual la preparación se hizo pasar sobre un gel de agarosa configurado a modo de bolitas, compuesto de partículas de entre 45 y 165 micras que contenían cadenas laterales de carboximetilo capaces de efectuar un intercambio catiónico (CM-Sepharose®, Pharmacia, Uppsala, Suecia), previamente equilibradas en una disolución amortiguadora que comprendía 6 M de urea, 0,01 M de citrato de sodio, con un pH de 4,8, habiéndose seleccionado el pH de resultas de un compromiso entre la necesidad de mantener los grupos carboxilo de resina en forma no protonada, y la de evitar el desplazamiento de la población de fragmento de vuelta al estado agregado si aquél se aproximaba demasiado al pH isoeléctrico del fragmento (aproximadamente 5,5). De otro modo, habría sido preferible un pH de 3,0 con el fin de empujar la población de fragmento hacia los dímeros o los monómeros.

Cuando se cargaba de esta manera, entre el 80 y el 100% aproximadamente del fragmento de vWF producido se unía a la CM-Sepharose®. La columna se lavó a continuación con una solución amortiguadora de pH 4,8 que contenía 6 M de urea y 0,01 M de citrato de sodio, hasta que no se detectó ningún material adicional absorbente de los rayos UV (medidos a 280 nm) en el efluente. La solución amortiguadora de elución se cambió a continuación a una de 6 M de urea, 0,01 M de citrato de sodio, 0,15 M de cloruro de sodio, con un pH de 4,8. Se detectó una pequeña cantidad de material absorbente de los rayos UV, eluyéndose desde la columna en esta solución. Se extrajeron de este modo cantidades sustanciales de la endotoxina bacteriana remanente. Se prosiguió la elución hasta que no se detectó dicho material absorbente de los rayos UV adicional. La fracción unida a la CM-Sepharose® se lavó entonces con una solución amortiguadora que comprendía 6 M de urea, 0,01 M de citrato de sodio, con un pH de 4,8, hasta que el cloruro sódico presente en la solución amortiguadora previa fue completamente desplazado.

La fracción de vWF ligada y purificada se lavó, por último, con una solución amortiguadora que comprendía 6 M de urea, 0,01 M de ácido cítrico, con un pH de 3,0, lo que provocó la elución de una pequeña cantidad adicional de material absorbente de los rayos ultravioleta. Se prosiguió con el lavado hasta que ya no pudo detectarse este material. Si bien un pH de 3,0 está sobradamente por debajo del pKa de los grupos carboxilo de columna no ocupada, los complejos previamente formados entre el fragmento de vWF cargado positivamente y la resina negativamente cargada permanecen substancialmente intactos a este pH durante el tiempo indicado. El mantenimiento de los fragmentos de vWF a este pH bajo se prosigue con el fin de favorecer la monomerización adicional de la población de fragmento, de tal manera que los monómeros y los dímeros son ahora predominantes y el agregado soluble queda substancialmente reducido. Los porcentajes de monómero, dímero y agregado pueden ser determinados de acuerdo con el procedimiento de ensayo del Ejemplo 2.

El fragmento de factor de vWF con recombinación se eluyó finalmente de la columna de CM-Sepharose® con una solución amortiguadora de pH 3,0 que comprendía 6 M de urea y 0,2 M de ácido cítrico. El pico de elución se recogió como una rebalsa de fracciones absorbentes de los rayos UV y se filtro a través de un filtro de 0,2 micras. La población de fragmentos eluída presenta un 50% de material dimérico y un 50% de material monomérico, y en ella no se ha detectado prácticamente ningún agregado soluble. Se encuentra que los iones de citrato a un pH de 3,0 portan, en promedio, una carga neta negativa de -0,5 y tienen, en promedio, 2,5 grupos carboxilo protonados (el pKa_{1} del citrato es 3,08). Se cree que los iones de citrato facilitan la rotura de los complejos de resina fragmentaria al competir por los fragmentos cargados positivamente, desempeñando, en la práctica, el papel de una fase "estacionaria"
adicional.

El producto de elución se concentró hasta aproximadamente 10 mg/ml de proteína por ultrafiltrado. El producto concentrado se volvió a filtrar de nuevo a través de un filtro desechable con un tamaño apropiado, 0,2 micras, tras lo cual el material se sometió a diálisis contra 50 volúmenes de "solución amortiguadora de formulación", que comprendía 1 mM de monohidrocloruro de lisina, 1,5 mM de cloruro sódico, 1 mM de ácido cítrico, manitol al 5% (w/v), y que tenía un pH de 3,5. La solución amortiguadora de diálisis se reemplazó 3 veces a lo largo de un periodo de 2 a 3 días, a cuyo término la monomerización se había completado también. El producto resultante (que contenía aproximadamente el 70% de monómero y el 30% de dímero, véase el Ejemplo 2) se filtró a través de un filtro de tamaño apropiado, de 0,2 micras, y se almacenó a 4ºC hasta ser introducido en un vial.

Se determinaron el ADN y la endotoxina residuales de la solución de vWF purificada, dando, respectivamente, cantidades de aproximadamente 0,15 Eu/mg de proteína y aproximadamente 0,94 pg/mg de proteína. Se llevó a cabo el análisis de ADN mediante hibridización contra muestras de ADN de E. coli. La endotoxina se analizó por medio del ensayo de disgregación con amebocito Limulus.

La solución en masa esterilizada se cargó en un vial de vidrio de cuarzo opaco de tipo I (Wheaton Scientific, Millville, NJ) hasta aproximadamente el nivel de volumen de 4 ml de un vial de 20 ml de capacidad, después de lo cual se aplicaron a los viales llenos inhibidores de liofilización de caucho gris de butilo siliconizado (West Co.). Los viales se colocaron entonces en un liofilizador de vacío (Hull Corporation, Hatboro, PA) y se congelaron a -42ºC, después de lo cual fueron expuestos a un vacío de 60 micras durante 12 horas. Transcurridas las 12 horas, la temperatura de la muestra se incrementó gradualmente (a lo largo de 24 horas) hasta alcanzar aproximadamente 30ºC. Esta temperatura y el vacío se mantuvieron durante un periodo adicional de 16 horas. Se restableció la presión atmosférica en la cámara mediante el uso de nitrógeno seco esterilizado, después de lo cual se taparon los viales. Se almacenaron los viales a 4ºC hasta que se requiriesen, momento en el cual pueden ser reconstituidos utilizando un volumen de 4 ml de agua carente de pirogeno.

Ejemplo 2 Demostración de que las preparaciones de fragmento de vWF con radical alquilo y no agregado reflejan un equilibrio entre dímero y monómero

Se prepararon muestras de fragmento de vWF con radical alquilo y no agregado que contenían concentraciones totales de fragmento diferentes, de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1, y se situaron en una solución amortiguadora de formulación convencional (1 mM de monohidrocloruro de lisina, 1,5 mM de cloruro sódico, 1 mM de ácido cítrico, manitol al 5% (w/v), con un pH de 3,5), y se incubaron a continuación a 4ºC durante una noche. Las muestras se aplicaron entonces a una columna que contenía un gel dextran entrelazado o con enlaces transversales (Sephadex® G-100, Pharmacia, Uppsala, Suecia), para someterlas a cromatografía basada en exclusión de peso molecular (tamaño), de tal manera que pudo determinarse el porcentaje de monómero y de dímero que comprendían, conjuntamente, el producto no agregado.

En general, es posible determinar cualesquiera cantidades de agregado soluble en muestras de fragmento por detección en el volumen vacío sobre una columna G-100. Con respecto a las cantidades de agregados de pequeño tamaño (es decir, trímeros, tetrámeros), puede utilizarse una columna G-50.

Se cargaron muestras de dos ml (entre 1 y 11 mg/ml) en la columna G-100 de 1,5 x 88 cm, a 4ºC. Se recogieron fracciones eluyentes de tres ml, y se controló su concentración de proteínas a 280 nm. El pico de fragmento monomérico se encontró centrado aproximadamente en la fracción 24, y el dimérico en la fracción 31.

La Figura 1 muestra una representación gráfica del porcentaje de monómero detectado en las muestras tras su incubación durante una noche, en la solución amortiguadora de formulación, en función de los mg/ml totales de fragmento en las muestras. Por extrapolación a partir del intervalo lineal que se presenta en la Figura 1, el almacenamiento de fragmento de vWF a una concentración de aproximadamente 20 mg/ml da lugar a un producto que es fundamentalmente un dímero. Puede generarse un producto terapéutico que es fundamentalmente monomérico a partir de muestras que tienen una concentración de almacenamiento de fragmento de 2 mg/ml. Se produce, en consecuencia, un desplazamiento del equilibrio monómero / dímero rebajando la concentración de fragmento con radical alquilo y no agregado, en las soluciones de almacenamiento adecuadas para la administración a pacientes. Resultados similares se obtuvieron tanto si las soluciones ensayadas fueron reconstituidas o no con un volumen apropiado de agua carente de pirogeno, partiendo de un almacenamiento previo en forma liofilizada.

Puesto que el fragmento monomérico tiene una mayor capacidad para inhibir la agregación de las plaquetas que el fragmento dimérico, considerado en relación con su peso, la utilidad terapéutica del fragmento de vWF preparado por inyección en la solución amortiguadora de formulación, puede ser incrementada mediante el almacenamiento a una concentración diluida del fragmento tal como aproximadamente 2 mg/ml, o mediante su reconstitución hasta obtener la misma. Se constata que la formulación del fragmento en las soluciones de almacenamiento preferidas de la invención proporciona un producto en el cual el porcentaje de monómero y de dímero en el producto no se ve afectado substancialmente por la liofilización y la rehidratación.

Ejemplo 3 Efecto de la agregación en la actividad biológica del fragmento de vWF con radical alquilo

La botrocetina, una proteína extraída del veneno de la Bothrops jaracaca, facilita la unión o ligadura in vitro del factor de von Willebrand multimérico a las plaquetas (Read et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4514-4518 (1978)). El lugar de unión de la botrocetina en la subunidad de vWF madura se ha localizado dentro de la región de la misma que contiene las posiciones de secuencia de aminoácidos 445-733, y, por tanto, en el dominio de unión de la GPIb. Véase Andrews, R. K. et al., Biochemistry, 28, 8317-8326 (1989). Se cree que la unión de la botrocetina al vWF induce en la molécula de vWF un cambio de conformación que, de otro modo, se induciría in vivo mediante una señal asociada al daño en el sistema vascular. En consecuencia, se ensayó, en un ensayo desencadenado por botrocetina, el efecto que tiene la agregación del fragmento con radical alquilo en su capacidad para inhibir la aglutinación de las plaquetas con la intermediación de vWF multimérico.

El fragmento de vWF con radical alquilo y no agregado representa la concentración combinada del monómero y del dímero. No se calculó el porcentaje real de dímero. La referencia a la Figura 1 demuestra que las muestras de fragmento de factor de von Willebrand con radical alquilo y no agregadas que se purificaron de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1 contienen, si se han almacenado en una solución amortiguadora de formulación en entre 2 y 8 mg/ml, contienen aproximadamente el 70% de fragmento de factor de von Willebrand con radical alquilo de monómero y el 30% dimérico. El fragmento dimérico es aproximadamente la mitad de eficaz, considerado en relación con su peso, que el monómero a la hora de inhibir el aglutinamiento de las plaquetas, si bien el dímero es tan completamente soluble como el monómero en las condiciones que se utilizan en los ensayos de este Ejemplo.

La inhibición del aglutinamiento por el fragmento con radical alquilo se midió, por tanto, en función de la concentración de monómero y de dímero (a partir de preparaciones que no contenían material agregado), y se comparó con la respuesta proporcionada por las preparaciones de agregado. El protocolo de aglutinamiento se adaptó del procedimiento de Brinkhous, K. M. y Read, M. S., Blood, 55(3), 517-520 (1980), y Fugimura et al., J. Biol. Chem., 261, 381-385 (1960).

En este ensayo se utilizaron cantidades específicas de botrocetina y vWF multimérico para aglutinar (agregar) una cantidad específica de plaquetas, definiendo con ello un valor de referencia del 100% de agregación. Se utilizaron cantidades específicas de fragmento de vWF para crear mezclas de reacción que comprendían también vWF en múltiples subunidades, botrocetina y plaquetas, de tal manera que pudo determinarse la IC_{50} (la concentración de fragmento de vWF eficaz para inhibir el 50% del aglutinamiento de plaquetas inducido por la botrocetina).

Las plaquetas para el ensayo se prepararon utilizando una técnica de filtración de gel de acuerdo con el procedimiento de Marguerie et al., J. Biol. Chem., 254, 5357-5363 (1979), y se fijaron a continuación siguiendo una forma modificada del procedimiento de Allain et al., J. Lab. Clin. Med., 85, 318-328 (1975), en la que dichas modificaciones comprendían: (1) aplicar como agente fijante paraformaldehído al 0,5%; (2) después de lo cual se produjo la fijación en 30 minutos a temperatura ambiente. Además, las plaquetas se trataron con el propósito de hacer inoperantes los lugares receptores de glicoproteína IIb/IIIa, al tratar (durante 30 minutos a 37ºC) una suspensión de las plaquetas con 5 mM de EDTA a un pH de 8,5, provocando la disociación de los complejos receptores IIb/IIIa intactos. Se llevó a cabo el seguimiento de la inhibición de la aglutinación (agregación) de las plaquetas en cubetas de vidrio siliconizadas que se mantenían a 37ºC y con una agitación constante (1.000 rpm) en un aparato Perfilador de Agregación de Plaquetas ("Platelet Aggregation Profiler"), modelo PAP-4 (BioData Co., Hatboro, PA), que se hacía funcionar de acuerdo con las instrucciones suministradas por el fabricante.

Los ensayos se realizaron como sigue. Los componentes de ensayo se mantuvieron en hielo antes de ser utilizados a 37ºC en las incubadoras de ensayo. Para comenzar el ensayo, se añadieron 0,4 ml de plaquetas humanas fijadas (2 x 10^{8}/ml) a la cubeta, y se incubaron a 37ºC durante 4 minutos. Una pequeña cantidad, del orden de los \mul, de fragmento de vWF disuelto en solución amortiguadora de formulación (que contenía también el 0,1% de albúmina de suero humano), o un volumen equivalente de solución amortiguadora-HSA de formulación (para control), se añadió a continuación a la cubeta para llevar a cabo una incubación de un minuto a 37ºC. En relación con los perfiles de aglutinamiento que se presentan en la Figura 2, se utilizó una muestra de 30 \mul de regulación amortiguadora-HSA de formulación como control, y se emplearon cantidades de 30 \mul de diluciones en serie de fragmento con radical alquilo y purificado (dando como resultado concentraciones finales de ensayo del fragmento de 17,0, 8,5 y 4,3 \mug/ml). Se añadió entonces en cada cubeta vWF nativo multimérico, preparado de acuerdo con el método de Newman et al., Br. J. Hematol., 21, 1-20 (1971), y se incubó a 37ºC durante un minuto. Se añadió una parte alícuota apropiada de vWF a la mezcla de reacción con el fin de proporcionar una concentración final de vWF de 6,3 \mug/ml. Por último, se añadieron 12,5 \mul de una solución de botrocetina adecuadamente concentrada (purificada de acuerdo con el procedimiento de Read et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4514-4518 (1978)), a fin de proporcionar una concentración final de botrocetina de 8,2 \mug/ml en la mezcla de reacción, la cual se incubó seguidamente durante un tiempo final de un minuto a 37ºC. Se supervisó entonces la reacción de aglutinamiento a lo largo de un periodo de tiempo de dos minutos. Como demuestra la Figura 2, el fragmento de vWF con radical alquilo y no agregado (que representa una población de aproximadamente 70% de monómero / 30% de dímero) es eficaz, de un modo que depende de la dosis, como inhibidor de la agregación de plaquetas.

La Figura 3 presenta un experimento similar en el cual el fragmento no agregado (que comprende aproximadamente 70% de monómero / 30% de dímero) se comparó con material de fragmento agregado en lo que se refiere a la capacidad de inhibición del aglutinamiento. Los ensayos se llevaron a cabo como anteriormente, utilizando cantidades de 30 \mul de fragmento de vWF de una concentración que proporcionaba 7,3 \mug/ml como concentración final de material potencialmente inhibidor del aglutinamiento. El material no agregado resultaba substancialmente eficaz en la inhibición del aglutinamiento de las plaquetas, en tanto que el material derivado del vWF agregado no lo era. La referencia a la Figura 3 muestra que, en las condiciones de ensayo de este Ejemplo, se obtiene un 50% de inhibición del aglutinamiento para una concentración de fragmento (IC_{50}) de aproximadamente 7,3 \mug/ml de material agregado (equivalente a 0,22 \muM del mismo), en tanto que la forma agregada no exhibía mas del 5% de efecto inhibitorio bajo estas condiciones.

Ejemplo 4 Efecto del contenido combinado de hélice \alpha y lámina \delta en la solubilidad del fragmento de vWF con radical alquilo y no agregado

La Figura 4 muestra una comparación del perfil de dicroísmo circular del fragmento de vWF con radical alquilo (para un pH de 3,5 contra otro de 4,5) en una solución que comprende solución amortiguadora de formulación convencional, sin manitol. Se produjeron espectros para muestras idénticamente concentradas y a 25ºC en un espectro-fotómetro modelo 500A de la Jasco, Inc. (Easton, MD), barriendo en sentido descendente desde aproximadamente 350 nm.

No pudo determinarse el espectro del fragmento con radical alquilo en una solución amortiguadora de fosfato 1 mM, con un pH de 7,5, debido a la precipitación del fragmento. No se determinaron las contribuciones respectivas de las regiones de hélice \alpha, de lámina plegada \delta y de espira aleatoria, a la rotación total en las proximidades de los 222 nm; sin embargo, es claro que el fragmento con radical alquilo posee una estructura más ordenada a un pH de 3,5 que a un pH de 4,5.

Depósito de cadenas útiles para la puesta en práctica de la invención

Se realizaron, bajo el Tratado de Budapest, en la Colección Americana de Cultivos Tipo ("American Type Culture Collection"), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, depósitos de cultivos biológicamente puros de las siguientes cadenas. Los números de acceso que se indican fueron asignados tras un ensayo de viabilidad con éxito, y se pagaron las tasas exigidas.

El acceso a dichos cultivos será posible durante el tiempo en que se encuentre pendiente la Solicitud de Patente, por una persona designada para ser habilitada para ello por el Comisionado de la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos, bajo los artículos 37 C.F.R. \NAK1.14 y 35 U.S.C. \NAK122, o bien si se requiere dicho acceso en virtud del Tratado de Budapest, en el momento en que se requiera. Toda restricción de la disponibilidad para el público de dichos cultivos será irrevocablemente retirada con la concesión de una Patente basada en la Solicitud, y dichos cultivos permanecerán disponibles de forma permanente durante un plazo de al menos cinco años tras la petición más reciente de aporte de muestras, y, en cualquier caso, durante un periodo de al menos 30 años a partir de la fecha de los depósitos. En el caso de que los cultivos queden inutilizados o se destruyan inadvertidamente, serán reemplazados por cultivo(s) viable(s) de la misma descripción taxonómica.

	Cadena / Plásmido	ATTC Nº	Fecha de depósito
	BL21(DE3)
	pLysS / pET-8c52K(Km^{R})	68306	17 de abril de 1990

Claims (14)

1. Un procedimiento para preparar una solución acuosa de fragmento de factor de von Willebrand (vWF -"von Willebrand Factor") alterado con cisteína, que tiene un peso molecular de aproximadamente 33.000, un residuo de terminal amino en aproximadamente el residuo aminoácido 449, y un residuo de terminal carboxídico en aproximadamente el residuo aminoácido 728, con las etapas consiguientes de:

(A)

proporcionar una solución acuosa de fragmentos de vWF alterados con cisteína, preparados con agente desnaturalizante o adulterante y de manera recombinada, los cuales están basados en el vWF humano, de tal modo que los fragmentos tienden a agregarse en la ausencia de agente desnaturalizante;

(B)

purificar la solución acuosa del fragmento y del agente desnaturalizante mediante la consiguiente cromatografía de intercambio de aniones y cationes a un pH de entre aproximadamente 2,5 y por debajo de 5,5, a fin de proporcionar un fragmento purificado; y

(C)

separar el fragmento disuelto y purificado del agente desnaturalizante, al tiempo que se mantiene la solución acuosa del fragmento a un pH de entre aproximadamente 2,5 y menos que aproximadamente 5,5, con el fin de incrementar la monomerización de dicho fragmento y reducir su agregación, por lo que se forma una solución acuosa de fragmento de vWF alterado con cisteína que contiene menos del 0,5% de agregado soluble.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la fuente de dicho fragmento es un fragmento preparado sometiendo una solución acuosa del fragmento de vWF con recombinación y del agente desnaturalizante a condiciones de asociación con radical alquilo, con lo que se forma un fragmento de vWF con radical alquilo.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye congelar o liofilizar dicha solución que carece substancialmente de agregado.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicho pH se mantiene entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual dichas condiciones de asociación con radical alquilo incluyen el uso de yodoacetamida como agente de asociación con radical alquilo.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el agente desnaturalizante al que se hace referencia en cada una de las etapas (A), (C) y (E) es urea.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual dicho fragmento de vWF es producido por una célula huésped bacteriana.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la forma del fragmento alterada con cisteína es un fragmento de vWF con radical alquilo.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual, en la etapa (F), la solución acuosa contiene ácido cítrico ionizado y un agente desnaturalizante no iónico, y en el cual la afinidad del fragmento eluído por los iones citrato de dicha solución acuosa que contiene ácido cítrico ionizado, facilita su solubilización a partir de dicha resina de intercambio catiónico.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual dicho pH se mantiene entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha solución acuosa del fragmento de la etapa (F), para un pH de entre aproximadamente 2,5 y menos que aproximadamente 5,5, incluye en ella de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml de dicho fragmento.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha solución acuosa del fragmento de la etapa (F), para un pH de entre aproximadamente 2,5 y menos que aproximadamente 5,5, incluye una concentración total de iones en la solución de menos que aproximadamente 75 mM.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha solución acuosa del fragmento de la etapa (F), para un pH de entre aproximadamente 2,5 y menos que aproximadamente 5,5, incluye entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml de dicho fragmento, y en el cual la concentración total de iones en la solución es menor que aproximadamente 75 mM.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el fragmento de factor de von Willebrand (vWF) alterado con cisteína tiene un residuo de terminal amino en el residuo aminoácido 445, y un residuo de terminal carboxídico en el residuo aminoácido 733.