ES2302336T3 - Fragmentos terapeuticos de factor von willebrand. - Google Patents

Abstract

SE APORTAN UNOS PROCESOS PARA PREPARAR SOLUCIONES ACUOSAS DE CISTEINA-FRAGMENTO ALTERADO DE FACTOR VON WILLEBRAND SUSTANCIALMENTE LIBRES DE AGREGADOS Y CAPACES DE USO TERAPEUTICO PARA TRATAR LA TROMBOSIS. EL PROCESO VINDICADO INCLUYE LA PROVISION DE UNA SOLUCION ACUOSA DEL FRAGMENTO VWF Y DEL DESNATURALIZANTE Y CONTIENE CONTAMINANTES NO DESEADOS, EN DONDE DICHA SOLUCION TIENE UN PH ACIDICO; LA SEPARACION DE DICHOS CONTAMINANTES DESDE LA MENCIONADA SOLUCION AL COLOCAR LA SOLUCION EN CONTACTO CON UN MEDIO DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD AL QUE SE ADHIEREN DICHOS FRAGMENTOS VWF; ELUSION DE LOS MENCIONADOS FRAGMENTOS VWF DESDE DICHO MEDIO DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD EN PRESENCIA DEL DESNATURALIZANTE; Y LA SEPARACI N DEL FRAGMENTO ELUIDO DE DICHO DESNATURALIZANTE MIENTRAS SE MANTIENE LA SOLUCION ACUOSA DEL FRAGMENTO A UN PH DE ALREDEDOR DE 2,5 A MENOS DE 5,5 CON EL FIN DE AUMENTAR LA MONOMERIZACION Y DISMINUIR LA AGREGACION DE DICHO FRAGMENTO, FORMANDO ASI UNA SOLUCION ACUOSA DEL FRAGMENTO VWF QUEQUEDA SUSTANCIALMENTE LIBRE DE AGREGADOS.

Description

Fragmentos terapéuticos de factor von Willebrand.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para preparar polipéptidos terapéuticos. Más específicamente, esta invención se refiere a fragmentos purificados de factor de von Willebrand que se pueden usar, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos vasculares tales como la trombosis.

El término "hemostasis" se refiere a aquellos procesos que comprenden los mecanismos de defensa del cuerpo frente a la pérdida de sangre circulante causada por una lesión vascular. La presente invención se refiere a la provisión de formas de polipéptidos terapéuticamente útiles basadas en el factor de von Willebrand ("vWF"), una de las proteínas del mecanismo hemostático.

Los procesos que son normales como una respuesta fisiológica a la lesión vascular pueden llevar en circunstancias patológicas, tales como en un paciente afectado de una enfermedad vascular ateroesclerótica o de insuficiencia cardíaca congestiva crónica, a la formación de trombos (coágulos) indeseados que producen oclusión vascular. La deficiencia de flujo sanguíneo hacia los órganos en tales circunstancias puede llevar a graves estados patológicos, incluyendo infarto de miocardio, una causa destacada de mortalidad en los países desarrollados.

La restricción o terminación del flujo sanguíneo dentro del sistema circulatorio en respuesta a una herida o como resultado de una enfermedad vascular implica una serie compleja de reacciones que se pueden dividir en dos procesos, hemostasis primaria y secundaria. La hemostasis primaria se refiere al proceso de formación de trombo plaquetario o coágulo blando. Las plaquetas son estructuras discoides no nucleadas de aproximadamente 2-5 micras de diámetro derivadas de células megacariocíticas. La hemostasis primaria eficaz se alcanza por la adhesión de las plaquetas, la interacción de las plaquetas con la superficie del endotelio vascular dañado, sobre el que están expuestas fibras de colágeno subyacentes y/o otras macromoléculas adhesivas tales como proteoglucanos y glucosaminoglucanos, a las que se unen las plaquetas.

La hemostasis secundaria implica el refuerzo o reticulación del coágulo blando de plaquetas. Este proceso secundario es iniciado por las proteínas circulantes en el plasma (factores de coagulación) que se activan durante la hemostasis primaria, ya sea en respuesta a una herida o a una enfermedad vascular. La activación de estos factores da finalmente como resultado la producción de una matriz polimérica del fibrinógeno proteínico (llamado entonces "fibrina") que refuerza el coágulo blando.

Sin embargo, hay circunstancias en las que se desea evitar la sedimentación de las plaquetas en los vasos sanguíneos, por ejemplo, en la prevención y tratamiento de la trombosis o ictus y para prevenir la oclusión de los injertos arteriales. La formación de trombos plaquetarios durante las operaciones quirúrgicas también puede interferir con los intentos de aliviar las obstrucciones preexistentes de los vasos sanguíneos.

Los fármacos antiplaquetarios incluyen compuestos que reducen la hemostasis primaria alterando las plaquetas o su interacción con otros componentes del sistema circulatorio. Un compuesto que ha sido descrito para ser usado como fármaco antiplaquetario es un fragmento alquilado de vWF que tiene un peso molecular de aproximadamente 52.000 y que se obtiene por digestión tríptica del vWF y que comprende aproximadamente los restos 449-728 del mismo. Este fragmento terapéutico es el tema de la Solicitud de la Oficina de Patentes Europeas Número de Serie 87304615, presentada el 22 de mayo de 1987, publicada con el No. 25 5206 el 3 de febrero de 1988.

Prior et al. describen un procedimiento para preparar una solución acuosa del fragmento 445-733 de vWF mediante purificación por cromatografía en columna (Bio/Technology, volumen 11 (6), 1993, 709-713 y Bio/Technology, volumen 10, 1992, 66-73).

El documento US 5.238.919 describe un polipéptido capaz de inhibir la unión del factor de von Willebrand a las plaquetas, a la heparina y al colágeno, que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que corresponde a un fragmento del factor de von Willebrand que tiene un resto amino-terminal en torno al aminoácido 449 Val y que tiene un resto carboxi-terminal en torno al aminoácido 728 Arg (columna 5, líneas 34 a 40).

Además Sugimoto et al. describen un fragmento recombinante, que comprende los restos 445-733 de la subunidad de vWF maduro, en el que los siete restos de cisteína de la secuencia fueron reducidos y alquilados (Biochemistry 1991, 30, 5202-5209;)

El documento WO 92/17192 describe un polipéptido adaptado sobre un fragmento de la subunidad del factor natural de von Willebrand maduro, que tiene una secuencia de aminoácidos modificada y una afinidad incrementada de unión a ligandos tales como colágeno, glucosaminoglucanos, proteoglucanos o factor de coagulación VIII.

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El documento WO 93/00107 describe también una solución acuosa de fragmento del factor de von Willebrand con cisteína alterada, que está sustancialmente libre de agregados y puede tener uso terapéutico para tratar la trombo-
sis.

A modo de antecedentes, hay que hacer notar que el vWF, sobre el que se basa el fragmento mencionado, es una proteína multimérica de alto peso molecular que circula en la sangre y que está implicada en la coagulación sanguínea. Se admite que el vWF hace posible que las plaquetas se unan al vaso sanguíneo dañado mediante la formación de un puente entre las plaquetas y el vaso sanguíneo. Se admite también que los sitios de unión a las plaquetas del vWF están contenidos en los restos 449-728 mencionados antes.

En cuanto al funcionamiento del mencionado fragmento de vWF como un fármaco antiplaquetario, se cree que el fragmento funciona mediante la unión de las plaquetas al receptor Ib\alpha glucoproteínico, inhibiendo de este modo la unión del vWF, a las plaquetas en la sangre. En efecto, el fragmento de vWF ocupa el receptor de superficie de GPIb que debería ser ocupado normalmente por el vWF de la sangre, pero debido a que carece de la actividad de formar puentes que tiene la molécula más grande de vWF de la cual se deriva, no inicia la adhesión de las plaquetas ni la formación del coágulo resultante.

En la práctica es difícil derivar cantidades terapéuticamente útiles de éste u otros fragmentos de vWF a partir del plasma sanguíneo. Las dificultades incluyen la separación efectiva del fragmento de los restos 449-728 de otros componentes, por ejemplo, las digestiones trípticas, y los requerimientos para la esterilización efectiva de los componentes derivados de la sangre potencialmente contaminados con virus humanos tales como hepatitis y HIV. Por consiguiente, se ha visto que es deseable producir este fragmento de vWF usando DNA recombinante en células hospedantes, incluyendo, por ejemplo, células hospedantes bacterianas.

Lamentablemente, se ha encontrado que los fragmentos de vWF producidos por sistemas de expresión bacteriana se acumulan en grandes cantidades como agregados insolubles (cuerpos de inclusión) dentro de las células hospedantes. Para el propósito de preparar formulaciones terapéuticamente útiles de los fragmentos (restos 449-728), es necesario extraer el fragmento en forma soluble de los cuerpos de inclusión contenidos en las células hospedantes.

La presente invención incluye dentro de su alcance la recuperación de un fragmento terapéuticamente útil de vWF expresado a partir de moléculas de DNA recombinante en células bacterianas hospedantes. La invención engloba también la provisión de dichos fragmentos en forma pura y no agregada, incluyendo formulaciones terapéuticas que están sustancialmente libres de agregados.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar una solución acuosa de un fragmento del factor de von Willebrand (vWF) con cisteína alterada, que tiene un resto amino-terminal en el resto aminoácido 445 y un resto carboxi-terminal en el aminoácido 733, y que está sustancialmente libre de agregados, cuyo procedimiento comprende:

(A)

proporcionar una solución acuosa ácida que incluye un fragmento de vWF con cisteína alterada, un desnaturalizante, y contaminantes indeseados;

(B)

separar dichos contaminantes de dicha solución, poniendo en contacto dicha solución con un medio de cromatografía de afinidad que contiene heparina a la que se adhieren dichos fragmentos de vWF;

(C)

eluir dicho fragmento de vWF de dicho medio de cromatografía de afinidad en presencia del desnaturalizante; y

(D)

separar el fragmento eluido de dicho desnaturalizante, mientras se mantiene la solución acuosa del fragmento a un pH desde aproximadamente 2,5 hasta menos de aproximadamente 5,5, para aumentar la monomerización, y disminuir la agregación de dicho fragmento, formando de este modo una solución acuosa de fragmento de vWF que está sustancialmente libre de agregados.

De forma preferida, el fragmento de vWF con cisteína alterada de la etapa (A), se proporciona como un fragmento alquilado, el desnaturalizante mencionado en las etapas (A) y (B) es urea, y el pH se mantiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 4.

En adición a su papel como un sitio de unión para las plaquetas, el fragmento de los restos 445-733 de la subunidad de vWF maduro, comprende un dominio de la subunidad que es responsable in vivo de la unión no covalente y covalente de las subunidades de vWF para formar grandes multímeros de vWF. Por consiguiente, existe una tendencia de este polipéptido a dimerizarse y/o formar agregados. Esto es indeseable porque la forma más biológicamente activa del fragmento es la forma monomérica. Un aspecto de la presente invención, por tanto, implica inhibir la formación de agregados en las formulaciones del fragmento de vWF con cisteína alterada, teniendo dichos agregados poca utilidad terapéutica en el tratamiento de trastornos cardiovasculares y representando potencialmente un riesgo de consecuencias clínicas adversas.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la provisión de un procedimiento para limitar la dimerización del fragmento del factor de von Willebrand con cisteína alterada, monomérico, aislado por cromatografía de afinidad con heparina, en el que dicho fragmento tiene un resto amino-terminal en el resto aminoácido 445 y un resto carboxi-terminal en el aminoácido 733, implicando dicha dimerización uno o más enlaces iónicos, hidrófobos, o de hidrógeno, que facilitan la asociación in vivo de dos o más subunidades de vWF maduro, comprendiendo dicho procedimiento la formación de una solución acuosa del fragmento monomérico de vWF con cisteína alterada, que tiene un pH desde aproximadamente 2,5 hasta menos de aproximadamente 5,5, y que incluye hasta aproximadamente 10 mg/ml de dicho fragmento, y en el que la concentración total en la solución de especies adicionales de iones (si los hubiera) es menos de aproximadamente 75 mM.

La presente invención se puede usar para la provisión de una formulación acuosa que contiene fragmentos de vWF con cisteína alterada, no agregados, que puede ser almacenada de forma efectiva durante considerables periodos de tiempo antes de la administración a un paciente. Por tanto, se proporciona una formulación acuosa que comprende fragmentos de vWF con cisteína alterada, no agregados, que si se liofiliza y después se rehidrata, permanece después en forma sustancialmente no agregada, esto es, está sustancialmente libre de agregados.

Además la presente invención es útil para el desarrollo de la capacidad de obtener el fragmento de vWF alquilado puro, a partir de los cuerpos de inclusión de tal forma que las macromoléculas contaminantes, por ejemplo, el DNA y/o proteínas o endotoxinas del hospedante, se separan totalmente. Las etapas de purificación particularmente útiles para conseguir esto, incluyen: (A) separar el tipo mencionado de contaminantes de una solución acuosa del fragmento de vWF alquilado y del desnaturalizante, poniendo en contacto una solución de los mismos que tiene un pH alcalino con un material de intercambio aniónico al que se adhieren dichos contaminantes; (B) poner en contacto la solución acuosa de la que se han separado los contaminantes con una resina de intercambio catiónico a la que se adhiere el fragmento de vWF alquilado; y (C) eluir el fragmento de vWF alquilado desde la resina de intercambio catiónico poniendo en contacto la resina con una solución acuosa que contiene ácido cítrico ionizado y un desnaturalizante no iónico, en la que la afinidad del fragmento eluido por los iones citrato de la fase móvil facilita la solubilización desde la fase estacionaria.

En otro aspecto más de la presente invención, se emplea un método alternativo de purificación que utiliza cromatografía de afinidad.

Un procedimiento para preparar una solución acuosa de un fragmento del factor de von Willebrand (vWF) con cisteína alterada, que tiene un resto amino-terminal en el resto aminoácido 445 y un resto carboxi-terminal en el aminoácido 733, y que está sustancialmente libre de agregados, cuyo procedimiento comprende

(A)

proporcionar una solución acuosa de urea y de fragmento de vWF, que se prepara por medios recombinantes y que contiene contaminantes bacterianos no deseados, teniendo dicha solución un pH inferior a aproximadamente 6,5;

(B)

separar dichos contaminantes de dicha solución, poniendo en contacto dicha solución con un medio de cromatografía de afinidad, que contiene heparina a la cual se adhiere el fragmento de vWF;

(C)

eluir dicho fragmento de vWF de dicho medio de cromatografía de afinidad en presencia del desnaturalizante, poniendo en contacto dicho fragmento de vWF con una solución salina acuosa que tiene una concentración suficiente para hacer que dicho fragmento de vWF se disocie de dicha heparina de dicho medio de cromatografía de afinidad; y

(D)

separar el fragmento eluido del desnaturalizante, mientras se mantiene la solución acuosa del fragmento a un pH desde aproximadamente 2,5 hasta menos de aproximadamente 5,5, para aumentar la monomerización, y disminuir la agregación de dicho fragmento, formando de este modo una solución acuosa del fragmento de vWF que está sustancialmente libre de agregados.

La presente invención es útil también para proporcionar un método de tratamiento de la trombosis en un paciente, utilizando una formulación terapéutica de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un perfil del equilibrio monómero/dímero que es afectado por la concentración total de fragmento del factor de von Willebrand alquilado.

La Figura 2 es un registro de la inhibición de la aglutinación (agregación) de plaquetas causada por las concentraciones especificadas de fragmento del factor de von Willebrand alquilado.

La Figura 3 es un registro de la capacidad comparativa del fragmento del factor de von Willebrand alquilado, no agregado y agregado, para inhibir la aglutinación de las plaquetas.

La Figura 4 muestra el perfil de dicroismo circular del fragmento de vWF alquilado, no agregado, a pH 3,5 y pH 4,5.

Definiciones

A menos que se indique otra cosa, los siguientes términos tienen aquí los significados indicados.

cDNA - Una molécula o secuencia de DNA que ha sido sintetizada enzimáticamente a partir de la secuencia(s) presente en una plantilla de mRNA.

Expresión - El proceso sufrido por un gen estructural para producir un producto. En el caso de un producto proteínico, es una combinación de transcripción y traducción.

Molécula de DNA recombinante - Una molécula que consiste en segmentos de DNA de diferentes genomas que han sido unidos extremo con extremo y tienen, o pueden ser modificados para tener, la capacidad de infectar algunas células hospedantes y ser mantenidos en ellas.

Clonación - El proceso de obtener una población de organismos, o secuencias de DNA u otras macromoléculas derivadas de uno de tales organismos o secuencias, mediante reproducción asexual o replicación de DNA.

Actividad biológica - Una o más funciones, resultado de actividades realizadas o causadas por una molécula en un contexto biológico (esto es, en un organismo o en un facsímil in vitro). Una actividad biológica característica del fragmento monomérico de los restos 445-733 de la subunidad del factor de von Willebrand maduro, es la capacidad potencial de unirse a los receptores GPIb\alpha de las plaquetas, inhibiendo de este modo la aglutinación
plaquetaria.

Un aspecto adicional de la actividad biológica característica del fragmento monomérico de los restos 445-733 de la subunidad del factor de von Willebrand maduro, es la capacidad de unirse solamente a un receptor GPIb\alpha de plaquetas, haciendo de este modo posible que la molécula inhiba la unión inducida por botrocetina del vWF multimérico a las plaquetas. Otros efectos resultantes o relacionados de la especie monomérica 445-733, incluyen la inhibición de la activación de las plaquetas, o la adhesión a las superficies. Así, un fragmento de este tipo tiene utilidad terapéutica como agente antitrombótico.

Condiciones reductoras - Se refiere a la presencia de un agente "reductor" en una solución que contiene el factor de von Willebrand, o polipéptidos derivados del mismo, cuyo agente causa la rotura de los enlaces disulfuro del
vWF.

Factor de von Willebrand (vWF) - Se entiende que todas las referencias que se hacen aquí al factor de von Willebrand se refieren al vWF en humanos. El término "factor de von Willebrand" se pretende que incluya dentro de su alcance el término "vWF maduro" definido a continuación.

vWF maduro - vWF circulante como se encuentra en el plasma o como unido al subendotelio. Consiste en una población de monómeros polipeptídicos que están típicamente asociados en numerosas especies de multímeros de los mismos, teniendo cada subunidad (monómero) de éstos una longitud de 2.050 restos. Adicionalmente, cuando se expresa en células de mamífero, el vWF maduro usualmente está glucosilado. El factor de von Willebrand se encuentra como un componente de la matriz subendotelial, como un componente de los gránulos \alpha segregados por plaquetas activadas, y como una proteína plasmática de la sangre circulante.

Monomérico - Cuando se usa con respecto a un fragmento de vWF con cisteína alterada, "monomérico" se refiere a un único polipéptido que no está unido ni covalentemente ni no covalentemente a otro polipéptido. "Dimérico" se refiere a una asociación no covalente de dos monómeros. Fragmento de vWF con cisteína alterada, "agregado", se refiere a estructuras mayores que los dímeros.

Purificado o sustancialmente en forma pura - Cuando se usa con respecto a los polipéptidos derivados de vWF, éste y los términos similares significan que la composición está sustancialmente libre de la mayor parte del protoplasma celular, de proteínas no vWF, o de material extracelular con el que el polipéptido se presenta normalmente en el
cuerpo.

Cromatografía de afinidad - Se refiere a métodos cromatográficos que utilizan la capacidad de las proteínas de unirse a moléculas específicas, fuertemente pero no covalentemente. Para realizar la cromatografía de afinidad, una molécula denominada ligando, por ejemplo, heparina, se une covalentemente a un material cromatográfico, usualmente una matriz porosa, inerte. Una solución que contiene la proteína a ser purificada, en este caso vWF, y otras diferentes sustancias indeseadas, se pasa a través del material cromatográfico. La proteína deseada se une selectivamente al ligando unido al material cromatográfico, y es retenida, mientras que las otras sustancias son eluidas. Los fragmentos de vWF se pueden recuperar entonces en forma altamente purificada, cambiando las condiciones de elución para liberar la proteína de su interacción de unión con el ligando.

Heparina se refiere a un glucosaminoglucano sulfatado de forma variable que consiste principalmente en restos alternantes con enlace \alpha(1\rightarrow4) de D-glucuronato-2-sulfato y N-sulfo-D-glucosamina-6-sulfato.

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La Tabla 1 muestra las designaciones estándar de tres letras para los aminoácidos que se usan en la solicitud.

TABLA I

Alanina	Ala
Cisteína	Cys
Ácido aspártico	Asp
Ácido glutámico	Glu
Fenilalanina	Phe
Glicina	Gly
Histidina	His
Isoleucina	Ile
Lisina	Lys
Leucina	Leu
Metionina	Met
Asparragina	Asn
Prolina	Pro
Glutamina	Gln
Arginina	Arg
Serina	Ser
Treonina	Thr
Valina	Val
Triptófano	Trp
Tirosina	Tyr

Descripción detallada de la invención

El polipéptido antitrombótico al que se refiere la presente invención, es un fragmento de vWF con cisteína alterada, que comprende el dominio de la secuencia de aminoácidos de la subunidad de vWF maduro que empieza con su resto 445 (serina) y termina con su resto 733 (valina), y que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 33.000 en el que los restos de cisteína del mismo (posiciones 459, 462, 464, 471, 474, 509 y 695) están alterados de tal manera que su tendencia a interactuar con otros restos de cisteína está inhibida, de modo que los enlaces basados en la cisteína no son capaces de ser formados dentro de un único fragmento ni entre fragmentos, tendiendo la formación de tales enlaces a formar materiales que tienden a ser insolubles o biológicamente activos. Por conveniencia, dicho fragmento se denomina aquí "fragmento de vWF con cisteína alterada". Este término incluye dentro de su alcance fragmentos que engloban o coinciden con la secuencia de los restos 445-733 y contienen todos o parte de los dominios de la misma que se unen a GPIb\alpha. El término "fragmento de vWF con cisteína alterada" incluye también polipéptidos que representan secuencias de aminoácidos mutantes del dominio de los restos 445-733 que tienen utilidad antitrombótica. Tales secuencias mutantes pueden incluir o no restos de cisteína.

Se puede adelantar que las formas del polipéptido resultante de la expresión de un cDNA apropiado u otra molécula de DNA recombinante en una célula hospedante eucariótica, pueden ser también monomerizadas de modo efectivo y formuladas de acuerdo con la práctica de la invención.

Puesto que el fragmento de vWF con cisteína alterada, se basa en un fragmento de vWF, a continuación se da información con respecto a esta proteína y su papel en la hemostasis y trombosis. El factor de von Willebrand existe en los seres humanos como una serie de multímeros de alto peso molecular de hasta 30 subunidades glucosiladas por multímero, en los que se cree que las subunidades son idénticas, teniendo cada una un peso molecular aproximado de 270.000 (270 kDa). Cada subunidad humana circulante "madura" consiste en 2.050 restos aminoácidos.

Se cree que la formación de una monocapa inicial de plaquetas que cubre las superficies endoteliales lesionadas implica una función de formación de puentes en los que el vWF multimérico unido a la superficie se une por un lado a los componentes del subendotelio, tales como colágeno o proteoglucanos, y por el otro lado al receptor GPIb-IX de una membrana plaquetaria. Se cree que la interacción del vWF multimérico con el complejo glucoproteína Ib-IX (en GPIb(\alpha)) da como resultado la activación de las plaquetas y facilita el reclutamiento de plaquetas adicionales que funcionan para formar un trombo creciente. Las plaquetas que se acumulan rápidamente se reticulan también mediante la unión de fibrinógeno. Es de particular importancia en este proceso el carácter multimérico y multivalente del vWF circulante, que facilita que la macromolécula lleve a cabo de modo efectivo sus funciones de unión y de formación de puentes.

El fragmento de vWF con cisteína alterada que se usa en la presente invención, compite efectivamente con el factor vWF por los receptores GPIb\alpha e inactiva a los receptores de forma que no estén disponibles para la interacción con el vWF, dando como resultado que la formación de coágulos es inhibida. En cuanto a la naturaleza del fragmento, los anteriores trabajos de investigación han establecido que el dominio de la subunidad de 2.050 restos del factor de von Willebrand maduro que se une al receptor glucoproteína Ib-IX (GPIb(\alpha)) de la membrana plaquetaria, es el fragmento de la misma que se extiende desde aproximadamente el resto 449 (valina) de la subunidad circulante hasta aproximadamente el resto 728 (lisina) de la misma. Este fragmento tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 52.000 y puede ser generado por digestión con tripsina, seguida por la reducción de disulfuros del vWF. El dominio de unión a GPIb(\alpha) del vWF comprende los restos contenidos en dos secuencias discontinuas Cys^{474}-Pro^{488} y Leu^{694}-Pro^{708} dentro del fragmento. Mohri, H. et al., J. Biol. Chem., 263(34), 17901-17904 (1988). Típicamente, el fragmento de peso molecular 52.000 se denomina fragmento "52/48", reflejando el hecho de que los sistemas enzimáticos humanos glucosilan el fragmento contribuyendo a su peso molecular. La cantidad de glucosilación varía de molécula a molécula, siendo los dos pesos, 52.000 y 48.000, los más comunes. Cuando se expresa en células hospedantes bacterianas recombinantes, el fragmento carece de la glucosilación post-translacional asociada con la expresión del mismo en células de mamífero. Sin el peso adicional aportado por la glucosilación, el polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 33.000. Ambos fragmentos "52/48" y "33" inhiben competitivamente la unión del factor de von Willebrand a las plaquetas.

Como se ha mencionado antes, es difícil obtener cantidades terapéuticamente útiles del fragmento de vWF a partir del plasma sanguíneo. Por lo tanto, se ha demostrado que es deseable producir este fragmento de vWF usando DNA recombinante en células hospedantes. Hay disponible una amplia variedad de sistemas recombinantes para la expresión de una secuencia de DNA que codifica el fragmento. A continuación se describen ejemplos de tres sistemas. Estos sistemas han sido usados satisfactoriamente y emplean células bacterianas hospedantes y codifican el fragmento ligeramente más grande de los restos 445-733. Se ha determinado que las secuencias adicionales de los restos amino y carboxi terminales, no tienen ningún efecto significativo sobre la utilidad del fragmento como antitrombótico.

(I)

un vector denominado pMMB3, que incorpora un promotor P_{R} altamente eficiente procedente del bacteriófago lambda. La inducción de la expresión del fragmento de vWF en E. coli se consiguió cultivando las células en fase semilog a 30ºC y aumentando después la temperatura a 42ºC.

(II)

un vector denominado pMMB5, que incorpora un sistema promotor híbrido trp-lac (tac) regulado por el represor lac. La inducción en este sistema se consiguió cultivando las células en fase semilog a 37ºC seguido por la adición del análogo de lactosa IPTG.

Los resultados obtenidos con pMMB3 y pMMB5 fueron muy similares. En resumen, las células de E. coli transformadas con cada uno de los anteriores plásmidos se cultivaron en fase semilog, se sometieron a inducción durante 1-16 horas, se recogieron y se fraccionaron en componentes solubles e insolubles. El fragmento de vWF presentó una extrema insolubilidad después de la lisis de cualquiera de las poblaciones de células.

(III)

Un tercer vector (plásmido) usado para la expresión del fragmento de vWF, y que confiere resistencia a la canamicina (Km^{R}), contiene un promotor procedente del bacteriófago T7. Se obtuvo el vector de Dr. F. William Studier de Brookhaven National Laboratories y se construyó como sigue. Se construyó el plásmido separando el gen de resistencia a la ampicilina procedente de pET-8c por medio de la escisión de un fragmento BspHI-EcoRI (pBR322 de 3195-4361 bp) y reemplazando éste con un fragmento de 869 bp que codifica la resistencia a la canamicina (Km^{R}), estando orientado el gen Km^{R} en el vector en el sentido de las agujas del reloj. El gen Km^{R} se deriva de Tn903 (Oka, et al., J. Mol. Biol., 147:217-226 (1981)) y se obtuvo usando la reacción en cadena de la polimerasa con pUC4KISS (Barany, F., Gene, 37:111-123 (1985)) como plantilla. El fragmento que lleva el gen Km^{R} empieza 50 nucleótidos por delante del codón de iniciación Km^{R} y termina exactamente en el codón de terminación.

Se construyó un plásmido que expresa el fragmento de vWF y que confiere resistencia a la canamicina a partir de un vector denominado pET-8c52K y de pET-8c(Km^{R}). En resumen, un fragmento XbaI/BamI que codifica el fragmento de vWF se escindió de pET-8c52K y se ligó al pET-8c(Km^{R}) partido por XbaI/BamHI. El DNA plásmido resultante (pET-8c52K9Km^{R})) se transformó en las células DH-1 de E. coli y se identificó un único aislado que liberó el fragmento de tamaño apropiado por digestión con Xba/BamHI. Se usó entonces el DNA de este aislado para transformar BL21(DE3)pLysS de E. coli. Se usó entonces un único aislado de esta transformación para la expresión del fragmento de vWF.

En este sistema, el DNA de vWF se coloca en un vector que contiene el promotor y las señales de iniciación de la traducción para la proteína T\varphi del bacteriófago T7. Se puede liberar entonces la T7 RNA-polimerasa a la célula hospedante ya sea por inducción o por infección. En este caso particular, el vector de expresión de vWF se colocó en una célula que lleva un profago que contiene el gen de la T7 RNA-polimerasa bajo el control del promotor lac UV5. La adición del análogo de lactosa IPTG a un cultivo de crecimiento de células indujo la T7 RNA polimerasa, que a su vez transcribió el DNA objetivo en el plásmido. La transcripción por la T7 RNA polimerasa fue tan activa que el RNA objetivo se acumula en cantidades comparables al RNA ribosómico y la proteína objetivo constituye una fracción principal de la proteína celular. Como una caracterización inicial de la síntesis del fragmento de vWF, se sometieron las células a inducción y se tomaron muestras a momentos de tiempo entre 0,5 y 16 horas post-inducción. Estos datos indicaron que a las 4 horas post-inducción, el fragmento de vWF constituía aproximadamente 25% de la proteína celular total. Este nivel es mucho más alto que el generado por el sistema del vector tac o por el sistema del vector P_{R}.

Es de particular importancia para la provisión de polipéptidos terapéuticos a partir de sistemas recombinantes, la capacidad de producir la expresión de cantidades farmacológicamente útiles de los polipéptidos terapéuticos. De los tres sistemas mencionados antes, se prefiere el sistema (III) porque produce un mayor rendimiento del fragmento.

Los fragmentos de vWF producidos por un sistema de expresión bacteriano, tal como por ejemplo, el sistema (III), lamentablemente tienden a acumularse en grandes cantidades como agregados insolubles (cuerpos de inclusión) dentro de las células hospedantes, no estando disponible ningún mecanismo en las células hospedantes para provocar desde ellas la secreción efectiva de los mismos. Por ejemplo, un péptido señal de un mamífero generalmente no será reconocido en el sistema bacteriano. Los mencionados agregados insolubles del polipéptido expresado (cuerpos de inclusión) son un resultado bien conocido del intento de producir grandes cantidades de proteína útil a partir de sistemas bacterianos recombinantes, Williams, D.C. et al., Science, 215, 687-689, (1982), y pueden reflejar polipéptidos plegados indebidamente.

Existe la teoría de que la formación de los cuerpos de inclusión está relacionada con la presencia en ellos de una alta concentración efectiva de restos de cisteína. Se cree que los enlaces disulfuro incorrectos están estimulados para formarse, y lo hacen, o bien dentro de los cuerpos de inclusión o durante los intentos de solubilizar los polipéptidos de los mismos. Cuando se forman dentro de un fragmento (un enlace intracadenas), tales enlaces pueden llevar a una conformación biológicamente inactiva de la molécula. Cuando se forman entre fragmentos (un enlace intercadenas) tales enlaces pueden llevar a dímeros o agregados insolubles o biológicamente inactivos. El fragmento de vWF que comprende los restos 445-733 contiene siete restos de cisteína en las posiciones 459, 462, 464, 471, 474, 509 y 695. Por lo tanto, la manipulación satisfactoria de las proteínas de mamífero expresadas en sistemas bacterianos recombinantes, generalmente ha requerido que los restos de cisteína de las mismas sean alterados de tal modo que no puedan reaccionar con otros restos de cisteína. Sin este tratamiento, habitualmente tiene lugar la reacción indeseada de los restos de cisteína, llevando a la formación de agregados polipeptídicos insolubles o biológicamente inactivos inadecuados para un uso eficaz como compuestos terapéuticos.

Existen numerosos procedimientos bien conocidos que se pueden usar para alterar satisfactoriamente los restos de cisteína. Una de tales técnicas implica el tratamiento de los restos de cisteína con un agente reductor tal como, por ejemplo, 6-mercaptoetanol o ditiotreitol "DTT" seguido por alquilación permanente (por ejemplo, con yodoacetamida) de los siete restos de cisteína del fragmento. Se pueden unir a los restos de cisteína objetivos otras numerosas marcas covalentes, siendo los únicos requerimientos que se pueda aplicar la marca en condiciones de pH que no desnaturalicen irreversiblemente la proteína objetivo, siendo dicha unión de un tipo, que en las condiciones a las que se expone el fragmento durante la elaboración o almacenamiento posterior, no permita la reacción química con otros restos de cisteína. Tales procedimientos de marcado covalente son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen también, por ejemplo, la reacción con (A) ácido yodoacético o (B) agentes yodantes tales como yodofluoresceína. Adicionalmente, los restos de cisteína se pueden alterar químicamente tal como por sulfitolización. La alteración se puede llevar a cabo también mediante mutagénesis dirigida al sitio de un DNA codificador, reemplazando los restos de cisteína con restos "inertes" tales como, por ejemplo, glicina o alanina, o mediante deleción de las posiciones de la secuencia correspondientes a la cisteína. Se altera un número suficiente de restos de cisteína para evitar los problemas causados por su presencia.

Como se describe en el Ejemplo 1 más adelante, se prefiere que los efectos de la agregación causada por los enlaces disulfuro incorrectos, sean eliminados, en lo que respecta a las formulaciones terapéuticas de esta invención, por reducción química (con ditiotreitol, "DTT"), seguida por alquilación permanente (con yodoacetamida). A pesar de este tratamiento, se ha encontrado que el polipéptido resultante (de aquí en adelante denominado el "fragmento de vWF alquilado" de la invención) permanece acumulado en agregados, y por tanto en una forma sin utilidad terapéutica. Otros tipos de fragmentos con cisteína alterada, pueden ser igualmente resistentes a la solubilización para una formulación terapéutica, sin que esté relacionado con las cisteínas el comportamiento de agregación responsable de
esto.

Por consiguiente, esta invención proporciona etapas de tratamiento que son efectivas en la solubilización del fragmento con cisteína alterada, agregado, y proporciona soluciones acuosas del fragmento que son aceptables, por ejemplo, para inyección a los pacientes, conteniendo dichas soluciones el fragmento disuelto que está en forma no agregada y terapéuticamente útil.

Así, la presente invención permite una identificación de condiciones bajo las cuales el fragmento expresado de vWF, que comprende cuerpos de inclusión, se puede proporcionar en primer lugar como un fragmento con cisteína alterada, no agregado, estabilizado en una solución que contiene un desnaturalizante y en segundo lugar, como un fragmento no agregado, estabilizado en una solución que contiene solamente sustancias terapéuticamente aceptables compatibles con la inyección a los seres humanos.

Se puede utilizar cualquier medio adecuado para recuperar el fragmento de vWF desde el sistema recombinante en el que se prepara el fragmento. Como una etapa inicial, los agregados insolubles del fragmento, esto es, los cuerpos de inclusión, se separan de otros componentes celulares. Esto implica la rotura de las células hospedantes y la separación de los materiales de las células rotas de las proteínas insolubilizadas (como cuerpos de inclusión). Ejemplos de medios adecuados para conseguir esto, son los procedimientos que incluyen el uso de sonicación y homogenización. Los procedimientos representativos incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos Nos. 4.828.929 y 4.673.641.

Un procedimiento preferido para extraer los cuerpos de inclusión de las células hospedantes se describe en el Ejemplo 1 más adelante, e incluye ciclos repetidos del uso de la homogenización mecánica para efectuar la rotura de las células en presencia de uno o más detergentes y la separación de los materiales de las células rotas de los fragmentos de vWF por centrifugación. Se debe entender que se pueden usar también otros procedimientos disponibles.

El fragmento de vWF agregado, recuperado del sistema recombinante, comprende un amplio espectro de polipéptidos que varían desde trímeros solubles del fragmento a estructuras macroscópicas insolubles en las que están unidos miles de tales fragmentos polipeptídicos individuales. Típicamente, sin embargo, aquellos agregados compuestos de aproximadamente 10 a 20 fragmentos o menos, y que tienen un peso molecular de 200.000 a 400.000, son solubles. Dichos fragmentos, que se denominan aquí "agregados solubles", tienen una utilidad terapéutica relativamente baja, medida en ensayos in vitro (véase el Ejemplo 3 y la Figura 3). Ciertos complejos incluso más grandes son también solubles, aunque también de utilidad terapéutica relativamente baja.

Los "fragmentos no agregados" (o fragmentos "sustancialmente libres de agregados") que resultan del procedimiento descrito en esta memoria, comprenden una población compuesta de fragmentos monoméricos y también de fragmentos diméricos unidos de forma no covalente. Basándose en los experimentos que usan cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), la cantidad de "agregados solubles" presentes en tales muestras es inferior a aproximadamente 0,5%. De hecho, se espera que en la mayor parte de las preparaciones el % de contaminación sea más bajo, siendo en gran medida un artefacto del entorno salino del sistema de HPLC. Como se expondrá más adelante, los dímeros así aislados existen en equilibrio (Figura 1) con el monómero y se ha determinado que tienen como media la mitad de la actividad anti-aglutinación plaquetaria que tienen los monómeros, basada en peso. Esto da a entender el enmascaramiento de uno de los dos sitios de unión dentro del dímero. En conexión con la producción de muestras terapéuticamente útiles de fragmentos no agregados, se prefiere la preparación de muestras que contienen una cantidad importante de monómeros y una cantidad menor de dímeros.

En la práctica de la invención, el procedimiento para la preparación de fragmentos solubilizados y no agregados, empieza con una etapa que convierte los agregados insolubles en agregados solubles. Esto implica la preparación de una solución acuosa que contiene el fragmento de vWF con cisteína alterada, y el desnaturalizante.

La forma preferida de la invención incluye la alquilación permanente del fragmento en una solución acuosa en condiciones en las que un desnaturalizante facilita la formación de agregados solubles del fragmento. Se puede hacer seguimiento de la disociación del material agregado por cualquiera de las diversas técnicas bien conocidas incluyendo la cromatografía en gel basada en la exclusión por tamaños y la ultracentrifugación.

La alquilación del fragmento va precedida por la reducción de los enlaces disulfuro intra-cadenas e inter-cadenas en el agregado del cuerpo de inclusión. Esto va seguido por la alquilación permanente de los restos de cisteína reducidos. Tanto la reducción como la alquilación del fragmento se pueden efectuar por cualquier medio adecuado, tales como las etapas de tratamiento de las proteínas que son conocidas.

Generalmente la reducción implica el hacer reaccionar una solución acuosa del agregado con un agente reductor adecuado en condiciones que convierten los enlaces disulfuro del agregado proteináceo en grupos tiol. Ejemplos de agentes reductores que se pueden usar son 6-mercaptoetenol, y ditiotreitol, siendo preferido el mencionado en último lugar.

El producto de la reducción se puede someter entonces a alquilación en condiciones tales que el agente alquilante funciona para marcar permanente y covalentemente los grupos sulfhidrilo libres del fragmento, de tal manera que sean y permanezcan inactivos cuando el fragmento proteináceo sea sometido a posterior manipulación o almacenamiento. Se puede usar cualquier agente alquilante adecuado. Los ejemplos de tales agentes incluyen ácido yodoacético, y yodoacetamida, siendo preferida la mencionada en último lugar.

De acuerdo con la invención, el fragmento de vWF con cisteína alterada, incluyendo la forma alquilada del mismo, y la subsiguiente producción de fragmento no agregado, se efectúa manipulando el fragmento en una solución acuosa que contiene un desnaturalizante. El término "desnaturalizante", como se usa aquí, se refiere a sustancias que a concentraciones apropiadas son capaces de cambiar la conformación de los fragmentos, generalmente mediante uno o más de los siguientes mecanismos representativos: alterando el entorno del disolvente, esto es, el estado de hidratación de ciertos grupos del fragmento, mediante proporcionar ciertas interacciones de superficie del disolvente o mediante ruptura de los contactos iónicos o de enlace de hidrógeno u otras interacciones dentro de los fragmentos o entre ellos. Generalmente, los efectos de un desnaturalizante son reversibles. Por ejemplo, después de diálisis frente a una solución que no contiene desnaturalizante, el efecto inducido por el desnaturalizante se invierte. La naturaleza del desnaturalizante usado en la práctica de la presente invención y las condiciones de tratamiento son tales que los efectos del uso del desnaturalizante son reversibles. Por consiguiente, se debería evitar el uso de materiales o condiciones que causan un efecto irreversible, por ejemplo, el uso de alta temperatura o la aplicación de sustancias que se unen al fragmento con una afinidad tan alta como para ser, en un sentido práctico, imposibles de eliminar.

Los términos "desnaturalizante" y "detergente", como se usan aquí, se consideran equivalentes siempre que se satisfagan los criterios anteriores. Los ejemplos de materiales adecuados para uso como desnaturalizantes en la presente invención, incluyen urea e hidrocloruro de guanidina, y detergentes tales como, por ejemplo, polioxietileno (9) p-terc-octilfenol (Nonidet® P40), polioxietileno (9-10) p-terc-octilfenol (Triton-X-100), y desoxicolato de sodio.

El desnaturalizante más preferido para uso en la presente invención es la urea. Es muy soluble en soluciones acuosas y es capaz de ser eliminada de la solución por diálisis. Debido a que la urea es una sustancia no iónica, no interfiere con los materiales de intercambio iónico que se pueden usar en el proceso para separar los contaminantes de origen bacteriano tales como DNA y endotoxina, como se describe más adelante. Un intervalo recomendado de concentración de urea es de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M.

La práctica de la presente invención puede incluir también etapas que se han encontrado particularmente útiles para separar del fragmento de vWF con cisteína alterada, los contaminantes de origen bacteriano tales como, por ejemplo, DNA bacteriano, endotoxinas bacterianas (lipopolisacáridos) y proteínas bacterianas. La separación de dichos contaminantes permite que el fragmento sea usado en formulaciones terapéuticas. Expresado de forma general, el proceso incluye someter una solución acuosa del fragmento de vWF alquilado impuro y del desnaturalizante a un material de intercambio aniónico y después a un material de intercambio catiónico.

El tratamiento de la solución que contiene contaminantes con el material de intercambio aniónico se efectúa a pH alcalino y es efectivo para separar de la solución el DNA y las endotoxinas bacterianas que se adhieren al material de intercambio aniónico. Para este propósito, la solución debería contener una cantidad de sal en una proporción tal que los componentes bacterianos se adhieran al material de intercambio aniónico y los fragmentos de vWF no lo hagan.

La solución se pone entonces en contacto a pH ácido con un material de intercambio catiónico al que se une el fragmento, separando de este modo el fragmento de la proteína bacteriana. El pH ácido de la solución debe ser tal que parte de los grupos carboxilo del material de intercambio catiónico están ionizados y parte de los grupos carboxilo sobre el fragmento están protonados para evitar la agregación. La elución del fragmento desde el material de intercambio catiónico se puede efectuar con un tampón de elución adecuado, por ejemplo, y preferiblemente, una solución acuosa que contiene ácido cítrico ionizado y un desnaturalizante no iónico.

El ejemplo 1 que sigue, describe una serie de etapas que son representativas de métodos que separan de modo efectivo del fragmento los contaminantes bacterianos, en condiciones en las que se alcanza el objetivo global del proceso - convertir la población de fragmentos de vWF con cisteína alterada, en fragmentos no agregados.

Aunque el hidrocloruro de guanidina se considera un desnaturalizante preferido, interfiere con los materiales de intercambio iónico y debe ser sustancialmente separado previamente a cualquier etapa de intercambio iónico que separe los contaminantes del tipo mencionado. Una concentración recomendada de hidrocloruro de guanidina es de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 M.

El ejemplo 5 que sigue, es ilustrativo de una realización especialmente preferida de la presente invención, en la que el fragmento es separado de los contaminantes bacterianos por un método de cromatografía de afinidad. Este método proporciona una purificación del vWF rápida, eficiente, a gran escala, basada en la afinidad del vWF por la heparina.

En parte, esta realización se basa en la verificación de que los fragmentos de vWF purificados en los presentes procesos incluyen una secuencia de 23 restos de aminoácidos (Tyr^{565} a Ala^{587}) que se sabe que se unen a la heparina. La afinidad del fragmento por la heparina, facilita el uso de un método de cromatografía de afinidad que evita el co-aislamiento de las proteínas cargadas similarmente, observado a menudo con los métodos de cromatografía de intercambio iónico.

El medio de cromatografía de afinidad usado en esta realización comprende moléculas de heparina unidas a una matriz cromatográfica. Cuando los fragmentos de vWF se cargan sobre una columna cromatográfica que contiene este medio, los fragmentos se unen reversiblemente a las moléculas de heparina y son retenidos selectivamente mientras que los contaminantes indeseados pasan a través de la columna cromatográfica. Los fragmentos de vWF se pueden eluir entonces mediante una solución salina que tiene suficiente fuerza iónica para evitar la asociación no covalente de vWF y las moléculas de heparina. Entonces, el vWF eluido puede ser purificado además usando etapas adicionales de cromatografía.

El medio de cromatografía de afinidad usado en la práctica de esta realización se puede preparar fácilmente usando métodos conocidos en la técnica o se puede encontrar en el comercio. Si se desea, se puede unir la heparina a una matriz de cromatografía deseada, tal como sefarosa o agarosa, utilizando protocolos conocidos en la técnica, tales como los protocolos que emplean bromuro de cianógeno. Alternativamente, se pueden utilizar medios de cromatografía de afinidad comercialmente disponibles, por ejemplo, heparina-Sepharose CL-6B comercializada por Pharmacia. En las realizaciones preferidas, se utiliza un material de cromatografía de afinidad comercialmente disponible.

Aunque los métodos de cromatografía de afinidad de la presente invención se pueden llevar a cabo en un intervalo de valores de pH, se han obtenido resultados superiores cuando estos métodos se realizan a un pH por debajo de aproximadamente 6. Se ha encontrado que la combinación de un desnaturalizante, tal como urea, y condiciones de bajo pH da como resultado una unión altamente selectiva de vWF al medio de cromatografía de afinidad y se minimizan las interacciones no específicas. La utilización de condiciones de bajo pH parece que no solamente contribuye a la unión selectiva del fragmento, sino que también conserva los fragmentos de vWF en un estado no agregado, facilitando de este modo la subsiguiente renaturalización de los fragmentos. Por consiguiente, en las realizaciones preferidas, los métodos de cromatografía de afinidad que se reivindican aquí, se llevan a cabo a un pH por debajo de aproximadamente 6 en presencia de un desnaturalizante tal como urea.

Después de cualquiera de los métodos de intercambio iónico o de cromatografía de afinidad descritos anteriormente en esta memoria, es importante que el fragmento se mantenga durante la solubilización posterior, en la presencia de un desnaturalizante a un pH de aproximadamente 2,5 hasta por debajo de aproximadamente 5,5. La titulación con ácido de las cadenas laterales de aminoácido del fragmento de vWF alquilado, demuestra que el fragmento está totalmente protonado a pH 3,5, llevando entonces el fragmento polipeptídico una carga neta de (+)41. Se cree que el mantenimiento del fragmento en un entorno que maximiza la carga neta es importante para mantener la solubilidad del fragmento, facilitando la disociación de los agregados solubles en agregados más pequeños y en material no agregado, y previniendo también la reasociación de fragmentos. Se prefiere un valor de pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. La solubilización en presencia de un desnaturalizante a pH 3,5 es la más preferida. Se puede usar cualquier ácido adecuado para ajustar el pH. Los ejemplos de ácidos que se pueden utilizar incluyen ácido clorhídrico o ácido láctico. Sin embargo se prefiere el uso de un ácido que proporcione capacidad tamponante en el intervalo de pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. El uso de ácido cítrico es el más preferido.

Aunque se conocen numerosos procedimientos para solubilizar las proteínas agregadas de los cuerpos de inclusión en presencia del desnaturalizante, cualquier uso clínico del producto resultante requiere que el desnaturalizante contenido en el mismo sea reemplazado por materiales clínicamente aceptables que no son tóxicos ni irritantes, de modo que la solución resultante cumpla con los estándares legales para inyección a los seres humanos. Los intentos de formular un fragmento de vWF con cisteína alterada, e incluso un fragmento en forma alquilada, reconstituido a partir de los cuerpos de inclusión, en una solución que tiene un pH fisiológico o una concentración de iones reflejo de la salinidad de la sangre, sólo han producido productos que contienen proteínas agregadas
insolubles.

Así, aunque la monomerización del fragmento con cisteína alterada, con desnaturalizantes, produce una composición en la que los fragmentos han sido sustancialmente disociados, hasta ahora se ha demostrado que es imposible una formulación satisfactoria del polipéptido para uso clínico sin desnaturalizante. Aunque se obtiene una carga neta de +41 sobre el fragmento de vWF a pH 3,5, y aunque tal carga es representativa o incluso más sustancial que la carga neta que se puede generar sobre muchas proteínas de tamaño comparable, las moléculas monoméricas así producidas vuelven a formar agregados en la ausencia de desnaturalizante. De aquí en adelante sigue una exposición de las etapas del procedimiento que hacen posible preparar una formulación clínica de una forma soluble del fragmento de vWF con cisteína alterada, y almacenar y dispensar la misma.

Un importante aspecto de la presente invención es el reconocimiento de que la solubilidad de un fragmento de vWF con cisteína alterada, en una solución de pH ácido, se mejora si la solución contiene una concentración relativamente baja de sustancias iónicas. Tales sustancias pueden tomar la forma de sales orgánicas o inorgánicas, tampones, aminoácidos u otras moléculas cargadas. Como se amplía más adelante, se cree que mantener el fragmento con cisteína alterada, en una solución acuosa de este tipo, facilita, con respecto a las soluciones que tienen valores fisiológicos de pH y concentración iónica de sales, la solubilización de los grupos semipolares o hidrófobos del fragmento por la solución acuosa. Por consiguiente se usan dichas soluciones para reemplazar a las soluciones que contienen desnaturalizante, descritas antes para el almacenamiento de las formulaciones clínicas.

En la práctica de la invención, la concentración de sustancias iónicas, definida como la suma total de la concentración de los iones positivos y de los iones negativos que son adicionales a la contribución de los grupos cargados proporcionados por el fragmento, no debería exceder de aproximadamente 75 mM en una solución acuosa del fragmento. Cuando se excede esta concentración, en ausencia de desnaturalizante, la agregación de los fragmentos de vWF con cisteína alterada, es de una magnitud tan importante que el material es inadecuado para el almacenamiento a largo plazo para uso clínico, ya sea en solución o cuando se descongela después de ser almacenado congelado o cuando se reconstituye de la forma liofilizada, y como se detalla más adelante, puede ser además inadecuado para el almacenamiento temporal previo a una elaboración posterior.

La concentración a la que un fragmento de vWF con cisteína alterada, sustancialmente libre de agregados, está presente en las formulaciones acuosas de la invención puede variar dentro de un intervalo relativamente amplio, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/ml. Así, un fragmento con cisteína alterada se puede hacer soluble, por ejemplo, en las formulaciones preferidas, hasta como mínimo aproximadamente 30 mg/ml sin formación de agregados solubles. Debido al equilibrio que existe entre los monómeros y los dímeros del fragmento con cisteína alterada "no agregado", y debido a la más alta actividad inhibidora específica del monómero (véase el Ejemplo 2, y la Figura 1), se prefieren los intervalos de concentración que favorecen al monómero tales como hasta aproximadamente 15 mg/ml, siendo el más preferido de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mg/ml, una concentración particularmente adecuada para una dosificación eficaz.

En la práctica de la invención se prefiere una formulación terapéutica que tiene una concentración hasta aproximadamente 10 mM de sal inorgánica, hasta aproximadamente 15 mM de un compuesto iónico adicional, tal como, por ejemplo, un hidrocloruro de aminoácido, y hasta aproximadamente 10 mM de un tampón. Con respecto a la exposición de los intervalos preferidos de concentración de los compuestos anteriores o similares, se entiende que "mM" se refiere a la concentración de compuesto, no de los iones individuales cuya suma total no debe exceder de aproximadamente 75 mM.

Adicionalmente, se puede añadir a las formulaciones de la presente invención un modificador de tonicidad no iónico, tal como un azúcar o derivado de azúcar, incluyendo, por ejemplo, manitol, sacarosa, o maltosa, ya sea antes del almacenamiento en forma líquida o ya sea antes de la liofilización de las mismas. La cantidad del mismo puede comprender de aproximadamente 0 a aproximadamente 15% (p/v). Tales preparaciones pueden ser congeladas y después descongeladas para uso terapéutico.

Una formulación acuosa preferida comprende NaCl o otra sal inorgánica a concentración de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mM, ácido cítrico u otro tampón apropiado de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mM, y monohidrocloruro de lisina u otro aminoácido de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 mM.

En la presente invención es muy preferida una solución que tiene un pH de aproximadamente 3,5 y que comprende NaCl aproximadamente 1,5 mM, ácido cítrico aproximadamente 1 mM, y monohidrocloruro de lisina aproximadamente 1 mM. La adición de un modificador de tonicidad no iónico tal como, por ejemplo, manitol a aproximadamente 5% (p/v), hace que las formulaciones de la invención sean aproximadamente isotónicas con las soluciones
fisiológicas.

Siguiendo las etapas del proceso descritas aquí, es posible preparar una solución acuosa de fragmento de vWF con cisteína alterada, que está sustancialmente libre de agregados. El término "sustancialmente libre de agregados" incluye una solución terapéutica u otra composición farmacéutica del fragmento de vWF con cisteína alterada, que contiene una cantidad de agregado soluble y/o de agregado insoluble que es insuficiente para provocar consecuencias clínicas adversas en los pacientes cuando se administra en dosis terapéuticas.

La práctica de la presente invención se puede utilizar para preparar soluciones acuosas de fragmentos con cisteína alterada, sustancialmente libres de agregados, en las que la concentración de fragmento varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mg/ml y lo más preferiblemente aproximadamente 10 mg/ml.

La práctica de la invención se puede utilizar también para preparar soluciones acuosas de fragmentos con cisteína alterada, sustancialmente libres de agregados en los que el porcentaje en peso de monómero es como mínimo de aproximadamente 40 a aproximadamente 100%, preferiblemente como mínimo de aproximadamente 65 a aproximadamente 80% en peso y lo más preferiblemente como mínimo aproximadamente 75% en peso.

El fragmento de vWF con cisteína alterada, se puede formular para almacenamiento en forma no agregada, en agua desionizada libre de pirógenos, siendo ajustado el pH resultante a aproximadamente 3,5, sin tampones, sales, ni compuestos iónicos adicionales excepto cuando sea necesario para titular la preparación. En tal caso, se prefiere la adición de un modificador de tonicidad no iónico. Tales preparaciones pueden ser también liofilizadas o congeladas y después descongeladas para uso terapéutico. Así, la invención proporciona soluciones terapéuticas que tienen una estabilidad tal que pueden ser liofilizadas o congeladas, y después reconstituidas o descongeladas, de tal modo que tras dicho tratamiento se recupera la actividad original.

Las composiciones producidas según la práctica de la invención, se pueden almacenar durante al menos un mes a 4ºC, permaneciendo la composición sustancialmente libre de agregados.

Con respecto a la selección de un pH preferido para el almacenamiento de una solución, o para tal solución antes de la liofilización o congelación de la misma, se observa que la titulación con ácido de las cadenas laterales de aminoácidos del fragmento con cisteína alterada, que genera así el fragmento con carga completa (+)41, se termina a pH aproximadamente 3,5. Por lo tanto, se prefieren las formulaciones en el intervalo de pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Mayor acidez puede desnaturalizar la proteína, mientras que valores más altos de pH se acercan demasiado al pH isoeléctrico (5,5) de la proteína, en el que tiene lugar la agregación.

Se observa también que las formulaciones que tienen un pH fuera del intervalo preferido o que contienen una concentración de iones fuera del intervalo preferido, sin embargo, pueden ser adecuadas para el almacenamiento de una solución acuosa de fragmento alquilado durante periodos intermedios de tiempo (tales como antes del proceso adicional) antes del almacenamiento a largo plazo.

El fragmento de vWF con cisteína alterada, proporcionado a partir de vWF cuando se aísla del sistema circulatorio o de un sistema recombinante de mamífero, se puede formular también según la práctica de la invención con mejores características de solubilidad y estabilidad. La formulación así preparada puede ser isotónica con la sangre, o puede ser hipertónica o hipotónica con ella.

Se cree que los procedimientos de monomerización y formulación de esta invención son efectivos, al menos en parte, porque las condiciones de tratamiento descritas aquí hacen posible que se pueda sacar ventaja de las propiedades de ciertos restos de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos y de los dominios resultantes dentro de la secuencia del fragmento de vWF con cisteína alterada. Se ha mencionado previamente que el mantenimiento del fragmento con cisteína alterada a pH 3,5 confiere al polipéptido una carga neta de ^{+}41, lo que se cree que mejora su carácter hidrófilo y por tanto la solubilidad. La titulación (protonación) de las cadenas laterales de ácido glutámico y ácido aspártico a un pH de aproximadamente 4,5 o inferior, es un modulador potencialmente importante de la estructura de la proteína que puede explicar también la estabilización frente a la agregación conferida en el fragmento de vWF por almacenamiento a pH 3,5.

Es bien conocido que las cadenas laterales, cargadas, de homopolímeros de aminoácidos pueden desestabilizar las hélices \alpha. El ácido poli-L-glutámico y la poli-L-lisina no cargados, por ejemplo, forman estructuras \alpha-helicoidales estables mientras que las formas cargadas de los mismos son estables solamente como regiones de espiral aleatoria. Urnes, P. and Dozy, P., Adv. Protein Chem., 16, 401 (1961), Lehninger, A.L., Biochemistry, p.113, Worth Publishing Company (1970). Es de esperar que los restos de ácido glutámico y ácido aspártico en posición apropiada, cuando están cargados negativamente también desestabilizarán las regiones \alpha-helicoidales dentro del fragmento de vWF con cisteína alterada. En la forma protonada, sin embargo, por ejemplo a pH 3,5, lo más probable es que se acomoden siendo incluidos en regiones estructurales ordenadas o permitiendo la formación vecinal, o la propagación de estas regiones.

Se cree que en la medida que tales regiones estructurales ordenadas están extendidas, o formadas por la protonación de aspartato o glutamato a pH 3,5, restringirán la facilidad con la que se pueden unir cualquiera de tales regiones (anteriormente presentes como una espiral aleatoria que contiene restos hidrófobos a pH aproximadamente 7,0). Es de anticipar que tales efectos pueden ser medidos por un aumento de la entalpía de activación necesaria para la asociación hidrófoba.

Se espera también que tales asociaciones se minimicen en soluciones acuosas que, comparadas con las soluciones fisiológicas, contienen una concentración sustancialmente más baja de sustancias iónicas disueltas.

Es de esperar que tanto si el mantenimiento a pH 3,5 facilita como si no facilita la monomerización, e inhibe la agregación de una proteína particular, depende del número total de restos de aspartato y glutamato en la estructura del polipéptido y de su espaciado con respecto a los subdominios de los restos particulares de aminoácidos cuyo potencial para participar en la estructura ordenada es dependiente en parte del estado de protonación del glutamato y aspartato próximos. Es evidente por tanto que si la colocación a pH 3,5 de los polipéptidos con cisteína alterada, producidos recombinantemente, facilita o estabiliza la monomerización de los mismos, es una cuestión que debe ser evaluada sobre una especie de polipéptido según la especie.

Los factores particulares útiles en la evaluación de la utilidad potencial de la formulación de bajo pH para evitar el comportamiento de agregación, de otro modo evidente en las condiciones de almacenamiento a pH fisiológico de 7,0, se presentan de aquí en adelante usando el fragmento de vWF con cisteína alterada, como modelo.

(A)

El fragmento de vWF de restos 445-733 con cisteína alterada, contiene 21 restos de glutamato y 15 restos de aspartato de un total de 289 posiciones de la secuencia lo que indica que un número importante de sitios en los que la estructura secundaria ordenada se perturba a pH 7,0, pueden llegar a estar ordenados en la protonación de restos particulares de ácido glutámico o ácido aspártico;

(B)

Es conocido que muchos restos clásicamente hidrófobos prefieren o permiten dominios \alpha-helicoidales o de 6 hojas plegadas y, debido al secuestro en un subdominio estructuralmente ordenado a pH 3,5, pueden ser menos capaces de participar en la agregación hidrófoba. Dichos restos incluyen alanina, leucina, fenilalanina, tirosina, triptófano, cisteína, metionina, asparragina, glutamina y valina. Si una particular subrregión adyacente a un resto Asp o Glu es o no de una naturaleza hidrófoba de tal modo que podría ser útil para conferir sobre ella una estructura secundaria ordenada como podría ser permitida por la protonación de glutamato o aspartato, puede ser contestado en parte por referencia al modelo de Kyte, J. et al., J. Mol. Biol., 157, 105-132 (1982). El modelo Kyte predice la extensión del carácter hidrófobo (o hidrófilo) que una particular secuencia peptídica exhibirá cuando esté presente en polipéptidos más grandes. Se asigna un índice global de hidrofobicidad/hidrofilidad basado en las contribuciones de los restos individuales y la posición de los aminoácidos particulares en relación uno con otro en la secuencia objetivo.

(C)

Hay dentro del fragmento de los restos 445-733 numerosas secuencias de 5 o más restos en las que se espera que la estructura ordenada pueda ser mejorada por la protonación de ácido glutámico o ácido aspártico en la región de pH 3,5 a 4,0, con relación al orden alcanzado cerca del pH 7,0. Los dominios representativos cuyo carácter \alpha-helicoidal puede ser mejorado a pH 3,5, incluyen los siguientes (con referencia a la secuencia publicada):

(1)

Cys^{464} - Leu^{469} (que contiene Asp en 465);

(2)

Cys^{471} - Glu^{476} (que contiene también Glu en 472);

(3)

Leu^{494} - Ile^{499} (que contiene Glu y Asp en 497, 498 respectivamente);

(4)

Leu^{512} - Asp^{520} (que contiene también Asp en 514);

(5)

Glu^{527} - Leu^{533}_{ } (que contiene también Glu en 529, 531);

(6)

Val^{537} - Glu^{542}_{ } (que contiene también Asp en 539);

\newpage

(7)

Val^{553} - Tyr^{558}_{ } (que contiene Glu en 557);

(8)

Val^{680} - Gln^{686} (que contiene Asp en 681 y Glu en 682, 684); y

(10)

Tyr^{693} - Ala^{698} (que contiene Asp en 696).

El incremento en la estructura ordenada que se puede producir en un fragmento de vWF con cisteína alterada, no agregado, mediante un cambio de pH de 4,5 a 3,5 está descrito en el Ejemplo 4 y en la Figura 4.

Con respecto al uso terapéutico de formulaciones del fragmento de vWF con cisteína alterada, que están sustancialmente libres de agregados, la cantidad a administrar para la prevención o inhibición de la trombosis dependerá de la gravedad con la que el paciente es susceptible a la trombosis, pero se puede determinar fácilmente para cualquier paciente particular. Las formulaciones usadas en la presente invención que comprenden soluciones, o material liofilizado resuspendido, pueden ser inyectadas directamente a los pacientes o ser mezcladas con otras sustancias fisiológicamente compatibles, tales como los modificadores de tonicidad no iónicos justo antes de la inyección.

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Ejemplos

Referencia 1

Preparación de fragmento del factor de von Willebrand alquilado, en forma no agregada

El siguiente procedimiento está diseñado para (1) poner en solución los agregados solubles (típicamente de 200 kDa o más alto) disueltos a partir de un sedimento de los cuerpos de inclusión del fragmento de vWF, como se hace referencia más adelante; (2) separar los contaminantes que son inaceptables en las formulaciones terapéuticas (tales como DNA y endotoxinas bacterianas); (3) iniciar la "monomerización" del fragmento en una serie de etapas que darán como resultado agregados cada vez más pequeños; y (4) proporcionar el material no agregado resultante en un tampón de formulación que estabiliza el fragmento frente a la reagregación.

Se obtuvo el material del sedimento de los cuerpos de inclusión a partir de un cultivo apropiado de BL21(DE3)pLysS de E. coli como sigue. Se recogieron las células de 50 litros de cultivo oxigenado y se concentraron usando cartuchos de membrana de microfiltros de fibra hueca. Se emplearon dos cartuchos de filtro Amicon H5MPO1-43 de un modo recirculante. Se concentraron las células hasta un volumen de 2 a 4 litros sobre los filtros Amicon, después de lo cual se lavaron las células por diafiltración en el aparato de filtración Amicon con 5 volúmenes, aproximadamente 10 a 20 litros, de solución salina tamponada de Tris (Tris 0,025 M, H_{2}O 3,03 gramos/litro, NaCl 0,2 M, H_{2}O 11,7 gramos/litro, pH final 7,5 \pm 0,2, 25ºC; de aquí en adelante denominada A-1).

Se recogieron las células de la filtración en 4 litros de solución salina tamponada de Tris (A-1). En la preparación para romper las células, se añadió desoxicolato de sodio a la suspensión de células hasta alcanzar una concentración final de 0,5 g/litro. Se rompieron las células mecánicamente mediante el pase a través de un Microfluidizer® (Microfluidics Corp., M-110Y Microfluidizer®) inmediatamente después de la recogida. Después que hubieron pasado las células una vez a través del Microfluidizer®, se añadió un segundo detergente, Tween 80 a la suspensión de las células lisadas hasta alcanzar una concentración final de 0,025%, usando 25 ml de Tween 80 al 2,5% (v/v), disuelto en 1 litro de TBS. Esto se realizó calentando el tampón A-1 y añadiendo el Tween 80, gota a gota a la solución y mezclando hasta que la solución fue visiblemente homogénea. Se enfrió la solución a temperatura ambiente y después se añadió a la suspensión de células rotas para dar una concentración final de 0,025% (v/v); (de aquí en adelante A-2). Si el Tween está presente en el primer pase, se puede llegar a obstruir el Microfluidizer® y será preciso limpiar el trayecto del caudal antes de que se puedan romper las células. Una vez que se rompieron las células, se centrifugó la suspensión (10.000 x g; 35 minutos, 4ºC) para separar los cuerpos de inclusión, que son principalmente producto, procedente de los desechos solubles de las células. En esta etapa, los cuerpos de inclusión se pueden almacenar durante la noche a -20ºC.

Se resuspendieron los cuerpos de inclusión en 35 ml de tampón Tris A-3 por gramo de cuerpo de inclusión, peso húmedo, determinado por la diferencia en peso del tubo de centrífuga (A-3 - Tris 0,05 M, H_{2}O 6,06 gramos/litro, desoxicolato de sodio 1,21 mM, H_{2}O 0,5 gramos/litro, ditiotreitol (DTT) 2 mM, H_{2}O 0,31 gramos/litro, EDTA 2 mM, H_{2}O 0,74 gramos/litro, glicerol al 5% (v/v), H_{2}O 50 ml/litro, Tween 80 al 0,025% (v/v), 10 ml de Tween 80 al 2,5% (A-2)/litro de H_{2}O, pH final 9,0 \pm 0,2, 25ºC). Los sedimentos de los cuerpos de inclusión se resuspendieron rutinariamente en tampón, usando un homogenizador politrón (Brinkmann). Los cuerpos de inclusión resuspendidos se pasaron a través del Microfluidizer® para asegurar la mezcla completa con el tampón. Después del pase a través del Microfluidizer®, se recogieron los cuerpos de inclusión por centrifugación. Se llevó a cabo el procedimiento de lavado durante un total de tres veces con tampón Tris A-3. Al final del tercer lavado, los cuerpos de inclusión sedimentados se resuspendieron en tampón Tris A-4, que no contiene los detergentes desoxicolato ni Tween (A-4 - Tris 0,05 M, H_{2}O 6,06 gramos/litro, ditiotreitol (DTT) 2 mM, H_{2}O 0,31 gramos/litro, EDTA 2 mM, H_{2}O 0,74 gramos/litro, glicerol al 5% (v/v), H_{2}O 50 ml/litro, pH final 9,0 \pm 0,2, 25ºC). El cuarto y último lavado se realizaron con tampón Tris A-4. Se recogió el producto crudo después de centrifugación, se drenó para secar, y se almacenó a
-70ºC.

Cada gramo de sedimento de los cuerpos de inclusión, se disolvió en un volumen de 7,5 ml de tampón que comprende urea 6 M, Tris-HCl 0,05 M, y cloruro de sodio 1 M, pH 8,8. El material de vWF "solubilizado" resultante, representa una población heterogénea de agregados solubles que tienen típicamente un peso molecular de aproximadamente 200 kDa o más alto.

Se puso la mezcla en una atmósfera de nitrógeno y se añadió ditiotreitol (DTT) hasta una concentración final de 0,01 M, con agitación suave, para reducir los enlaces disulfuro del fragmento. Se continuó la agitación de la mezcla en la oscuridad durante 1 hora a 37ºC. Se añadió yodoacetimida (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) hasta una concentración final 0,05 M. Se continuó la incubación en la oscuridad durante una hora a 37ºC. Se añadió entonces DTT adicional para subir la concentración final de DTT a 0,03 M. Se pasó entonces la solución que contiene el fragmento de vWF alquilado a través de un filtro de 0,2 micras y se transfirió a una cámara frigorífica mantenida a 4ºC \pm 2ºC. Los posteriores procedimientos de purificación se realizaron en una cámara frigorífica, a 4ºC, usando reactivos preequilibrados a esa temperatura.

Se diluyó el material alquilado 5 veces mediante la adición de un tampón que comprende urea 6 M, Tris-HCl 0,05 M, EDTA disódico 5 mM, a pH 8,0. La solución resultante contiene también NaCl 0,2 M arrastrado desde la solución de alquilación. La preparación diluida de vWF se cromatografió sobre una columna de 252 mm x 150 mm de partículas de agarosa formadas por perlas de 45-165 micras que tiene cadenas laterales de amonio cuaternario adecuadas para el intercambio aniónico (Q-Sepharose®, Pharmacia, Uppsala, Sweden) que había sido preequilibrada con tampón que comprende urea 6 M, Tris\cdotHCl 25 mM, cloruro de potasio 0,02 M, EDTA disódico 0,1 mM, DTT 0,1 mM, pH 8,0. En estas condiciones, el fragmento de factor de von Willebrand no se unió a la Q-Sepharose®; sin embargo se unieron los contaminantes tales como DNA cargado negativamente y endotoxina bacteriana, incluyendo
lipopolisacáridos.

En estas condiciones la carga neta sobre cada unidad monomérica de polipéptido dentro de los agregados solubles es aproximadamente (-2). Se cree que esta baja carga neta, en combinación con la alta concentración en sal de la muestra aplicada, evita la unión de los agregados a la fase estacionaria. El fragmento de vWF que contiene la fracción no unida, principalmente como una población de agregados solubles, se filtró entonces a través de un filtro de 0,2 micras, tras lo cual se diluyó el filtrado 10 veces por adición de un tampón que comprende urea 6 M, citrato de sodio 0,01 M, pH 3,5. La preparación resultante se mantuvo entonces aproximadamente 1 hora a 4ºC. Durante este periodo, comenzó la disociación de los agregados solubles, llevando la población de fragmentos a agregados más pequeños y a moléculas monoméricas y díméricas.

Se ajustó entonces el pH de la preparación a 4,8 mediante la adición de un volumen suficiente de citrato de sodio 1,0 M no tamponado, tras lo cual se pasó la preparación sobre un gel de agarosa en perlas formado por partículas de 45-165 micras que contienen cadenas laterales de carboximetilo capaces de intercambio catiónico (CM-Sepharose®, Pharmacia, Uppsala, Sweden), preequilibrado en tampón que comprende urea 6 M, citrato de sodio 0,01 M, pH 4,8, siendo seleccionado el pH como un compromiso entre la necesidad de mantener los grupos carboxilo de la resina en una forma no protonada, y evitar que la población de fragmentos vuelva al estado de agregados por aproximarse demasiado al pH isoeléctrico del fragmento (aproximadamente 5,5). Un pH de 3,0 debería haber sido preferible si no, para llevar a la población de fragmentos hacia dímeros y monómeros.

Cuando se cargó de esta forma, aproximadamente 80-100% del producto fragmento de vWF, se unió a la CM-Sepharose®. Se lavó entonces la columna con un tampón de pH 4,8 que contiene urea 6 M y citrato de sodio 0,01 M hasta que no se detectó en el efluente ningún material adicional que absorbe en el UV (medido a 280 nm). Se cambió entonces el tampón de elución a urea 6 M, citrato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 4,8. Se detectó una pequeña cantidad de material adicional que absorbe en el UV, eluyendo desde la columna en esta solución. Se separaron de este modo cantidades sustanciales de endotoxina bacteriana remanente. Se continuó la elución hasta que no se detectó ningún material adicional que absorbe en el UV. Se lavó entonces la fracción unida a CM-Sepharose con un tampón que comprende urea 6 M, citrato de sodio 0,01 M, pH 4,8 hasta que el cloruro de sodio presente en el anterior tampón fue completamente desplazado.

La fracción vWF unida, purificada, se lavó finalmente con un tampón que comprende urea 6 M, ácido cítrico 0,01 M, pH 3,0, haciendo que fuera eluida una pequeña cantidad adicional de material que absorbe en el UV. Se continuó el lavado hasta que no se pudo detectar más de este material. Aunque el pH 3,0 está muy por debajo del pKa de los grupos carboxilo de la columna no ocupados, los complejos preformados entre el fragmento de vWF cargado positivamente y la resina cargada negativamente, permanecen sustancialmente intactos a este pH durante el tiempo indicado. El mantenimiento de los fragmentos de vWF a este bajo pH, continúa promoviendo la monomerización adicional de la población de fragmentos, siendo ahora predominantes los monómeros y dímeros y estando sustancialmente reducidos los agregados solubles. El porcentaje de monómeros, dímeros y agregados se puede determinar según el procedimiento de ensayo del Ejemplo 2.

El fragmento del factor de vWF recombinante, fue eluido finalmente de la columna CM-Sepharose® con un tampón de pH 3,0 que comprende urea 6 M y ácido cítrico 0,2 M. Se recogió el pico que eluye, como un conjunto de fracciones que absorben en el UV y se filtró a través de un filtro de 0,2 micras. La población eluida de fragmentos representa 50% de material dimérico y 50% de material monomérico, no siendo detectado virtualmente ningún agregado soluble. Se ha encontrado que los iones citrato a pH 3,0, soportan como promedio una carga negativa neta de -0,5, teniendo un promedio de grupos carboxilo protonados de 2,5 (el pKa_{1} de citrato es 3,08). Se cree que los iones citrato facilitan la separación de los complejos fragmento-resina mediante la competición por los fragmentos cargados positivamente, en efecto realizando el papel de una fase "estacionaria" adicional.

Se concentró el producto eluido hasta aproximadamente 10 mg/ml de proteína por ultrafiltración. Se refiltró de nuevo el producto concentrado a través de un filtro desechable de 0,2 micras, de tamaño apropiado, tras lo cual se dializó el material frente a 50 volúmenes de "tampón de formulación" que comprende monohidrocloruro de lisina 1 mM, cloruro de sodio 1,5 mM, ácido cítrico 1 mM, manitol al 5% (p/v), que tiene un pH de 3,5. Se reemplazó el tampón de diálisis 3 veces a lo largo de un periodo de 2-3 días, en cuyo momento la monomerización es también completa. El producto resultante (que contiene aproximadamente 70% de monómero y 30% de dímero, véase el Ejemplo 2) se filtró a través de un filtro de 0,2 micras, de tamaño apropiado, y se almacenó a 4ºC hasta que se llenó en
viales.

Se determinó que el DNA y la endotoxina residuales en la solución de vWF purificado, eran aproximadamente 0,94 Eu/mg de proteína y aproximadamente 0,15 pg/mg de proteína respectivamente. Se realizó el análisis de DNA por hibridización frente a muestras de DNA de E. coli. La endotoxina se analizó por el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus.

La solución estéril a granel se cargó en viales de vidrio flint tipo I (Wheaton Scientific, Millville, NJ) aproximadamente a un nivel de 4 ml de volumen en un vial de 20 ml de capacidad, después de lo cual se aplicaron a los viales llenos, tapones para liofilización, grises, de goma de butilo siliconados (West Co.). Se colocaron entonces los viales en un liofilizador a vacío (Hull Corporation, Hatboro, PA) y se congelaron a -42ºC, tras lo cual se expusieron a un vacío de 60 micras durante 12 horas. Después de 12 horas, se aumentó gradualmente la temperatura de la muestra (a lo largo de 24 horas) hasta aproximadamente 30ºC. Se mantuvieron esta temperatura y vacío durante 16 horas adicionales. Se restableció la presión atmosférica en la cámara usando nitrógeno estéril seco, después de lo cual se capsularon los viales. Se almacenaron los viales a 4ºC hasta que se necesitaron, en cuyo momento se pueden reconstituir usando un volumen de 4 ml de agua libre de pirógenos.

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Referencia 2

Demostración de que las preparaciones de fragmento de vWF alquilado, no agregado, reflejan un equilibrio entre dímero y monómero

Se prepararon muestras de fragmento de vWF alquilado, no agregado, que contienen diferentes concentraciones totales de fragmento, según el procedimiento del Ejemplo 1 y se pusieron en un tampón de formulación estándar (monohidrocloruro de lisina 1 mM, cloruro de sodio 1,5 mM, ácido cítrico 1 mM, manitol al 5% (p/v) a pH 3,5), y después se incubaron a 4ºC durante la noche. Se aplicaron entonces las muestras a una columna que contiene un gel de dextrano reticulado (Sephadex® G-100, Pharmacia, Uppsala, Sweden) para cromatografía basada en exclusión por peso molecular (tamaño) de forma que se pueda determinar el porcentaje de monómeros y de dímeros juntos que comprende el producto no agregado.

Generalmente, se pueden determinar todas las cantidades de agregado soluble en las muestras de fragmento, mediante la detección en el volumen vacío de una columna G-100. Con respecto a las cantidades de pequeños agregados (esto es, trímeros, tetrámeros) se puede usar una columna G-50.

Se cargaron muestras de 2 ml (1-11 mg/ml) en la columna G-100 de 1,5 x 88 cm a 4ºC. Se recogieron fracciones de eluyente de 3 ml y se controlaron en cuanto a la concentración de proteínas a 280 nm. El pico del fragmento monomérico se concentró aproximadamente en la fracción 24 y el dímero en la fracción 31.

La Figura 1 muestra una representación del % de monómero detectado en las muestras, después de la incubación durante la noche en el tampón de formulación, como una función del total de mg/ml de fragmento en las muestras. Extrapolando desde el intervalo lineal presentado en la Figura 1, el almacenamiento del fragmento de vWF a una concentración de aproximadamente 20 mg/ml, da como resultado un producto que es principalmente dímero. El producto terapéutico que es principalmente monomérico, se puede generar a partir de muestras que tienen una concentración de fragmento, para almacenamiento, de 2 mg/ml. Se produce por tanto una subida en el equilibrio monómero/dímero al reducir la concentración de fragmento alquilado, no agregado, en soluciones de almacenamiento adecuadas para la administración a pacientes. Se obtuvieron resultados similares, tanto si las soluciones ensayadas fueron reconstituidas como si no fueron reconstituidas con un volumen apropiado de agua libre de pirógenos, a partir del anterior almacenamiento en forma liofilizada.

Puesto que el fragmento monomérico tiene una mayor capacidad para inhibir la agregación de plaquetas que el fragmento dimérico, basada en peso, la utilidad terapéutica del fragmento de vWF preparado para inyección en tampón de formulación se puede aumentar por el almacenamiento, o reconstitución, a una concentración diluida de fragmento tal como aproximadamente 2 mg/ml. Se hace notar que la formulación del fragmento en las soluciones de almacenamiento preferidas de la invención, proporciona un producto en el que el porcentaje de monómeros y de dímeros en el producto no se ve sustancialmente afectado por la liofilización ni por la rehidratación.

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Referencia 3

Efecto de la agregación sobre la actividad biológica del fragmento de vWF alquilado

La botrocetina, una proteína extraída del veneno de Bothrops jararaca, facilita la unión in vitro del factor de von Willebrand multimérico a las plaquetas (Read, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4514-4518 (1978). El sitio de unión para la botrocetina en la subunidad de vWF maduro, ha sido localizado dentro de la región de la misma que contiene las posiciones 445-733 de la secuencia de aminoácidos, y por tanto el dominio de unión a GPIb. Andrews, R.K. et al., Biochemistry, 28, 8317-832-6 (1989). Se cree que la unión de botrocetina a vWF induce en la molécula de vWF un cambio conformacional que de otra manera podría ser inducido in vivo por una señal asociada con el daño al sistema vascular. Por lo tanto, se midió el efecto de agregación del fragmento alquilado sobre su capacidad de inhibir la aglutinación de las plaquetas mediada por el vWF multimérico en un ensayo provocado por la
botrocetina.

El fragmento de vWF alquilado, no agregado, representa la concentración combinada del monómero y del dímero. No se calculó el porcentaje real de dímero. La referencia a la Figura 1 demuestra que las muestras de fragmento del factor de von Willebrand alquilado, no agregado, purificado según el procedimiento del Ejemplo 1, contienen, si se almacenan en tampón de formulación a concentración entre 2 y 8 mg/ml, aproximadamente 70% de monómero y 30% de fragmento de factor de von Willebrand alquilado dimérico. El fragmento dimérico es aproximadamente la mitad de efectivo, basado en peso, que el monómero en la inhibición de la aglutinación plaquetaria, aunque el dímero es tan completamente soluble como el monómero en las condiciones utilizadas en los ensayos de este
ejemplo.

La inhibición de la aglutinación por el fragmento alquilado, se midió por tanto como una función de la concentración de monómero y dímero (a partir de las preparaciones que contienen material no agregado) y se comparó con la respuesta proporcionada por las preparaciones agregadas. El protocolo de aglutinación se adaptó del procedimiento de Brinkhous, K.M. and Read, M.S., Blood, 55(3), 517-520 (1980) y Fugimura, et al., J. Biol. Chem., 261,381-385 (1986).

En este ensayo, se utilizaron cantidades específicas de botrocetina y vWF multimérico para aglutinar (agregar) una cantidad especificada de plaquetas, con lo que se define un valor de referencia de 100% de agregación. Se utilizaron cantidades específicas de fragmento de vWF alquilado, para crear mezclas de reacción que comprenden también multisubunidades de vWF, botrocetina, y plaquetas, de modo que se pueda determinar la IC_{50} (concentración de fragmento de vWF efectiva para inhibir el 50% de aglutinación plaquetaria inducida por la botrocetina).

Las plaquetas para el ensayo, se prepararon usando una técnica de filtración en gel según el procedimiento de Marguerie, et al., J. Biol. Chem., 254, 5357-5363 (1979), y después se fijaron siguiendo una forma modificada del procedimiento de Allain, et al., J. Lab. Clin. Med., 85, 318-328 (1975), comprendiendo dichas modificaciones: (1) la aplicación como fijador, de paraformaldehído al 0,5%; (2) después de lo cual, se consiguió la fijación en 30 minutos a temperatura ambiente. En adición, se trataron las plaquetas para hacer inoperativos los sitios del receptor de glucoproteína IIb/IIIa, mediante tratamiento (durante 30 minutos a 37ºC) de una suspensión de las plaquetas con EDTA 5 mM a pH 8,5, lo que causa la disociación de los complejos del receptor IIb/IIIa intacto. La inhibición de la aglutinación de plaquetas (agregación) fue monitorizada en cubetas de vidrio siliconado mantenidas a 37ºC con agitación constante (1000 rpm) en un Platelet Aggregation Profiler, Model PAP-4 (BioData Co., Hatboro, PA) manejado según las instrucciones suministradas por el fabricante.

Se realizaron los ensayos como sigue. Los componentes de ensayo se mantuvieron en hielo antes de usarlos a 37ºC en las incubaciones de ensayo. Para empezar el ensayo, se añadieron a la cubeta 0,4 ml de plaquetas humanas fijadas (2 x 10^{8} ml) y se incubaron a 37ºC durante 4 minutos. Se añadió entonces a la cubeta una pequeña cantidad, \mul, de fragmento de vWF disuelto en tampón de formulación (que contiene también 0,1% de seroalbúmina humana) o un volumen equivalente de tampón de formulación-HSA (como control) para un minuto de incubación a 37ºC. Con respecto a los perfiles de aglutinación presentados en la Figura 2, se usó como control una muestra de 30 \mul de tampón de formulación-HSA, y se usaron cantidades de 30 \mul de diluciones seriadas de fragmento alquilado purificado (dando como resultado concentraciones finales de fragmento para ensayo, de 17,0, 8,5 y 4,3 \mug/ml). Se añadió entonces a cada cubeta, vWF nativo multimérico, preparado según el método de Newman, et al., Br. J. Hematol., 21, 1-20 (1971), y se incubó a 37ºC durante un minuto. Se añadió a la mezcla de reacción una alícuota apropiada de vWF para proporcionar una concentración final de vWF de 6,3 \mug/ml. Finalmente, se añadieron 12,5 \mul de una solución apropiadamente concentrada de botrocetina (purificada según el procedimiento de Read, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4514-4518 (1978)) para dar una concentración final de botrocetina de 8,2 \mug/ml en la mezcla de reacción, que se incubó después durante un último minuto a 37ºC. Se hizo entonces seguimiento de la reacción de aglutinación a lo largo de un periodo de dos minutos. Como se demuestra en la Figura 2, el fragmento de vWF alquilado, purificado y no agregado, (que representa una población de aproximadamente 70% de monómero/30% de dímero), es eficaz, de forma dependiente de la dosis, como inhibidor de la agregación plaquetaria.

La Figura 3 presenta un experimento similar en el que el fragmento no agregado (que comprende aproximadamente 70% de monómero/30% de dímero) se comparó con material de fragmento agregado, en cuanto a la potencia de inhibición de la aglutinación. Se realizaron los ensayos como anteriormente, usando cantidades de 30 \mul de fragmento de vWF de una concentración que proporciona 7,3 \mug/ml como la concentración final del material que potencialmente inhibe la aglutinación. El material no agregado fue sustancialmente eficaz para inhibir la aglutinación plaquetaria mientras que el material derivado de vWF agregado, no lo fue. La referencia a la Figura 3 muestra que en las condiciones de ensayo de este ejemplo, se obtiene el 50% de inhibición de la aglutinación en una concentración de fragmento (IC_{50}) de aproximadamente 7,3 \mug/ml de material no agregado (equivalente a una concentración 0,22 \muM del mismo), mientras que la forma agregada presenta un efecto inhibidor de no más del 5% en estas
condiciones.

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Referencia 4

Efecto del contenido combinado \alpha-helicoidal y de 6-hojas sobre la solubilidad del fragmento de vWF alquilado, no agregado

La Figura 4 muestra una comparación del perfil de dicroismo circular del fragmento de vWF alquilado (a pH 3,5 frente a 4,5), en una solución que comprende el tampón de formulación estándar sin manitol. Se produjeron los espectros para muestras idénticamente concentradas a 25ºC en un espectrofotómetro modelo 500A de Jasco, Inc. (Easton, MD) escaneando a partir de aproximadamente 350 nm.

El espectro del fragmento alquilado no se pudo determinar en tampón de fosfato 1 mM, pH 7,5, debido a la precipitación del fragmento. No se determinaron las contribuciones respectivas de las regiones del componente, hélice \alpha, 6 hojas plegadas, y espiral aleatoria, a la rotación total cerca de 222 nm; sin embargo, es claro que el fragmento alquilado tiene una estructura más ordenada a pH 3,5 que a pH 4,5.

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Ejemplo 5

Preparación del fragmento de factor de von Willebrand alquilado, en forma no agregada, utilizando cromatografía de afinidad

Este procedimiento utiliza cromatografía de afinidad con heparina, para purificar los fragmentos de vWF y aislarlos de las proteínas y DNA contaminantes. El procedimiento está diseñado para: (1) poner en solución agregados solubles (típicamente de 200 kDa o más altos) disueltos a partir de un sedimento de cuerpos de inclusión del fragmento de vWF, como se indica más adelante; (2) separar los contaminantes que son inaceptables en las formulaciones terapéuticas (tales como DNA y endotoxinas bacterianas); (3) iniciar la "monomerización" del fragmento en una serie de etapas que darán como resultado agregados cada vez más pequeños; y (4) proporcionar el material no agregado resultante, en un tampón de formulación que estabiliza el fragmento frente a la reagregación.

Se obtuvo el material del sedimento de los cuerpos de inclusión a partir de un cultivo apropiado de BL21(DE3)pLysS de E. coli como sigue. Se recogieron las células de 50 litros de cultivo oxigenado y se concentraron usando cartuchos de membrana de microfiltros de fibra hueca. Se emplearon dos cartuchos de filtro Amicon H5MPO1-43 de un modo recirculante. Se concentraron las células hasta un volumen de 2 a 4 litros sobre los filtros Amicon, después de lo cual se lavaron las células por diafiltración en el aparato de filtración Amicon con 5 volúmenes, aproximadamente 10 a 20 litros, de solución salina tamponada de Tris (Tris 0,025 M, H_{2}O 3,03 gramos/litro, NaCl 0,2 M, H_{2}O 11,7 gramos/litro, pH final 7,5 \pm 0,2, 25ºC; de aquí en adelante denominada A-1).

Se recogieron las células de la filtración en 4 litros de solución salina tamponada de Tris (A-1). En la preparación para romper las células, se añadió desoxicolato de sodio a la suspensión de las células hasta alcanzar una concentración final de 0,5 g/litro. Se rompieron las células mecánicamente mediante el pase a través de un Microfluidizer® (Microfluidics Corp., M-110Y Microfluidizer®) inmediatamente después de la recogida. Después que las células hubieron pasado una vez a través del Microfluidizer®, se añadió un segundo detergente (Tween 80) a la suspensión de células lisadas hasta alcanzar una concentración final de 0,025%, usando 25 ml de Tween 80 al 2,5% (v/v), disuelto en 1 litro de TBS. Esto se realizó calentando el tampón A-1 y añadiendo el Tween 80, gota a gota a la solución y mezclando hasta que la solución fue visiblemente homogénea. Se enfrió la solución a temperatura ambiente y después se añadió a la suspensión de células rotas para dar una concentración final de 0,025% (v/v); (de aquí en adelante A-2). Si el Tween o un detergente similar está presente en el primer pase, se puede llegar a obstruir el Microfluidizer y será preciso limpiar el trayecto del caudal antes de que se puedan romper las células.

Una vez que se rompieron las células, se centrifugó la suspensión (10.000 x g; 35 minutos, 4ºC) para separar los cuerpos de inclusión, que son principalmente producto, procedente de los desechos solubles de las células. Si fuera necesario, los cuerpos de inclusión se pueden almacenar durante la noche a -20ºC antes de la siguiente etapa del proceso de purificación.

Se resuspendieron los cuerpos de inclusión en 35 ml de tampón Tris A-3 por gramo de cuerpo de inclusión, peso húmedo, determinado por la diferencia en peso del tubo de centrífuga (A-3 - Tris 0,05 M, H_{2}O 6,06 g/litro, desoxicolato de sodio 1,21 mM, H_{2}O 0,5 g/litro, ditiotreitol (DTT) 2 mM, H_{2}O 0,31 g/litro, EDTA 2 mM, H_{2}O 0,74 g/litro, glicerol al 5% (v/v), H_{2}O 50 ml/litro, Tween 80 al 0,025% (v/v), 10 ml de Tween 80 al 2,5% (A-2)/litro H_{2}O, pH final 9,0 \pm 0,2, 25ºC). Los sedimentos de los cuerpos de inclusión, se resuspendieron rutinariamente en tampón, usando un homogenizador politrón (Brinkmann). Los cuerpos de inclusión resuspendidos se pasaron a través del Microfluidizer® para asegurar la mezcla completa con el tampón. Después del pase a través del Microfluidizer®, se recogieron los cuerpos de inclusión por centrifugación. Se llevó a cabo el procedimiento de lavado durante un total de tres veces con tampón Tris A-3. Al final del tercer lavado, los cuerpos de inclusión sedimentados se resuspendieron en tampón Tris A-4, que no contiene los detergentes desoxicolato ni Tween (A-4 - Tris 0,05 M, H_{2}O 6,06 g/litro, ditiotreitol (DTT) 2 mM, H_{2}O 0,31 g/litro, EDTA 2 mM, H_{2}O 0,74 g/litro, glicerol al 5% (v/v), H_{2}O 50 ml/litro, pH final 9,0 \pm 0,2, 25ºC). El cuarto y último lavado se realizaron con tampón Tris A-4. Se recogió el producto crudo después de centrifugación, se drenó para secar, y se almacenó a -70ºC.

Cada gramo de sedimento de los cuerpos de inclusión, se disolvió en un volumen de 7,5 ml de tampón que comprende urea 6 M, Tris\cdotHCl 0,05 M, y cloruro de sodio 1 M, pH 8,8. El material de vWF "solubilizado" resultante, representa una población heterogénea de agregados solubles que tienen típicamente un peso molecular de aproximadamente 200 kDa o más alto.

Se puso la mezcla en una atmósfera de nitrógeno y se añadió ditiotreitol (DTT) hasta una concentración final de 0,01 M, con agitación suave, para reducir los enlaces disulfuro del fragmento. Se continuó la agitación de la mezcla en la oscuridad durante 1 hora a 37ºC. Se añadió yodoacetimida (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) hasta una concentración final 0,05 M. Se continuó la incubación en la oscuridad durante una hora a 37ºC. Se añadió entonces DTT adicional para subir la concentración final de DTT a 0,03 M. Se pasó entonces la solución que contiene el fragmento de vWF alquilado, a través de un filtro de 0,2 micras y se transfirió a una cámara frigorífica mantenida a 4ºC \pm 2ºC. Los posteriores procedimientos de purificación se realizaron en una cámara frigorífica, a 4ºC, usando reactivos preequilibrados a esa temperatura.

El material alquilado se diluyó 5 veces con una solución que comprende urea 6 M, citrato de sodio 10 mM, pH 5,5, para una conductividad equivalente a NaCl 150 mM. Se ajustó el pH con citrato de sodio 1 M a pH 5,5, si fuera necesario. Se cargó entonces el material sobre una columna de heparina-sefarosa (heparina-Sepharose CL-6B comercializada por Pharmacia, producto con número de código 17-0467-01) equilibrada en urea 6 M, citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 100 mM que tiene un pH de 5,5. Se lavó la columna con una solución que comprende urea 6 M, citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 250 mM, que tiene un pH de 5,5. Se eluyó el producto con una solución que comprende urea 6 M, citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 700 mM, que tiene un pH de 5,5.

Se diluyó entonces el eluato aproximadamente 7 veces con una solución que comprende urea 6 M, ácido cítrico 10 mM, pH 3,5. Después del ajuste del pH a 3,5, se mantuvo esta solución durante 1 hora a 4ºC. Se ajustó entonces el pH a 4,8 con ácido cítrico 1 M, y se cargó el producto sobre una columna CM Spherodex (CM Spherodex M comercializada por IBF, no. de catálogo 262010) equilibrada en urea 6 M, citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 4,8. Se lavó la columna con urea 6 M, ácido cítrico 500 mM, pH 3,0. Se eluyó entonces el producto con urea 6 M y ácido cítrico 700 mM, pH 3,0.

Se concentró el producto eluido hasta aproximadamente 10 mg/ml de proteína por ultrafiltración. Se refiltró de nuevo el producto concentrado a través de un filtro desechable de 0,2 micras, de tamaño apropiado, tras lo cual se dializó el material frente a 50 volúmenes de "tampón de formulación" que comprende monohidrocloruro de lisina 1 mM, cloruro de sodio 1,5 mM, ácido cítrico 1 mM, manitol al 5% (p/v), que tiene un pH de 3,5. Se reemplazó el tampón de diálisis 3 veces a lo largo de un periodo de 2-3 días, en cuyo momento la monomerización es también completa. El producto resultante (que contiene aproximadamente 70% de monómero y 30% de dímero, véase el Ejemplo 2) se filtró a través de un filtro de 0,2 micras, de tamaño apropiado, y se almacenó a 4ºC hasta que se llenó en viales.

Se determinó que el DNA y la endotoxina residuales, en la solución de vWF purificado, eran aproximadamente 0,94 Eu/mg de proteína y aproximadamente 0,15 pg/mg de proteína respectivamente. Se realizó el análisis de DNA por hibridización frente a muestras de DNA de E. coli. La endotoxina se analizó por el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus.

La solución estéril a granel se cargó en viales de vidrio flint tipo I (Wheaton Scientific, Millville, NJ) aproximadamente a un nivel de 4 ml de volumen en un vial de 20 ml de capacidad, después de lo cual se aplicaron a los viales llenos, tapones para liofilización, grises, de goma de butilo siliconados (West Co.). Se colocaron entonces los viales en un liofilizador a vacío (Hull Corporation, Hatboro, PA) y se congelaron a -42ºC, tras lo cual se expusieron a un vacío de 60 micras durante 12 horas. Después de 12 horas, se aumentó gradualmente la temperatura de la muestra (a lo largo de 24 horas) hasta aproximadamente 30ºC. Se mantuvieron esta temperatura y vacío durante 16 horas adicionales. Se restableció la presión atmosférica en la cámara usando nitrógeno estéril seco, después de lo cual se capsularon los viales. Se almacenaron los viales a 4ºC hasta que se necesitaron, en cuyo momento se pueden reconstituir usando un volumen de 4 ml de agua libre de pirógenos.

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Depósito de cepas útiles en la práctica de la invención

Se presentaron depósitos de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas, cumpliendo las condiciones del Tratado de Budapest, ante la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. Los números de acceso indicados fueron asignados después de los ensayos satisfactorios de viabilidad, y se pagaron las tasas requeridas.

El acceso a dichos cultivos estará disponible durante el tiempo de demora de la solicitud de patente para una persona determinada por el Commissioner of the United States Patent and Trademark Office para habilitada según el 37 C.F.R. \NAK1,14 y 35 U.S.C. \NAK122, o cuando tal acceso es requerido por el Tratado de Budapest. Todas las restricciones sobre la disponibilidad de dichos cultivos para el público serán irrevocablemente eliminadas después de la concesión de una patente basada en la solicitud y dichos cultivos permanecerán permanentemente disponibles durante un periodo de al menos cinco años a partir de la petición más reciente de suministro de muestras y en cualquier caso durante un periodo de 30 años como mínimo desde la fecha de los depósitos. Si los cultivos llegaran a ser no viables o fueran destruidos inadvertidamente, serían reemplazados con cultivo(s) viables de la misma descripción taxonómica.

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1

Claims (8)

1. Un procedimiento para preparar una solución acuosa de un fragmento del factor de von Willebrand (vWF) con cisteína alterada, que tiene un resto amino-terminal en el resto aminoácido 445 y un resto carboxi-terminal en el aminoácido 733, y que está sustancialmente libre de agregados, cuyo procedimiento comprende

(A)

proporcionar una solución acuosa ácida que incluye un fragmento de vWF con cisteína alterada, un desnaturalizante, y contaminantes indeseados;

(B)

separar dichos contaminantes de dicha solución, poniendo en contacto dicha solución con un medio de cromatografía de afinidad que contiene heparina a la que se adhieren dichos fragmentos de vWF;

(C)

eluir dicho fragmento de vWF de dicho medio de cromatografía de afinidad en presencia del desnaturalizante; y

(D)

separar el fragmento eluido de dicho desnaturalizante, mientras se mantiene la solución acuosa del fragmento a un pH de 2,5 hasta menos de 5,5, para aumentar la monomerización y disminuir la agregación de dicho fragmento, formando de este modo una solución acuosa de fragmento de vWF que está sustancialmente libre de agregados.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cromatografía de afinidad (B) se realiza a un pH por debajo de 6.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fuente de dicho fragmento de vWF es una molécula de DNA recombinante expresada en una célula bacteriana hospedante.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento de vWF con cisteína alterada, se prepara sometiendo una solución acuosa de un fragmento de vWF recombinante y un desnaturalizante a condiciones de alquilación, formando de este modo un fragmento de vWF alquilado.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho desnaturalizante es urea.

6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha solución acuosa de fragmento con un pH de 2,5 y menos de 5,5, tiene una concentración total de iones inferior a 75 mM.

7. Un procedimiento para limitar la dimerización del fragmento del factor de von Willebrand (vWF) con cisteína alterada, monomérico, aislado por cromatografía de afinidad con heparina, en el que dicho fragmento tiene un resto amino-terminal en el resto aminoácido 445 y un resto carboxi-terminal en el aminoácido 733, implicando dicha dimerización uno o más enlaces iónicos, hidrófobos, o de hidrógeno, que facilitan la asociación de dos o más subunidades de vWF maduro, comprendiendo dicho procedimiento la formación de una solución acuosa del fragmento monomérico de vWF con cisteína alterada que tiene un pH de 2,5 a menos de 5,5, y que incluye hasta aproximadamente 10 mg/ml de dicho fragmento, y en el que la concentración total en la solución de especies adicionales de iones (si los hubiera) es inferior a 75 mM.

8. Un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende:

(A)

proporcionar una solución acuosa de urea y de fragmento de vWF, que se prepara por medios recombinantes y que contiene contaminantes bacterianos indeseados, teniendo dicha solución un pH inferior a 6,5;

(B)

separar dichos contaminantes de dicha solución, poniendo en contacto dicha solución con un medio de cromatografía de afinidad, que contiene heparina a la cual se adhiere el fragmento de vWF;

(C)

eluir dicho fragmento de vWF de dicho medio de cromatografía de afinidad en presencia del desnaturalizante, poniendo en contacto dicho fragmento de vWF con una solución salina acuosa que tiene una concentración suficiente para hacer que dicho fragmento de vWF se disocie de dicha heparina de dicho medio de cromatografía de afinidad; y

(D)

separar el fragmento eluido del desnaturalizante, mientras se mantiene la solución acuosa del fragmento a un pH de 2,5 hasta menos de 5,5, para aumentar la monomerización y disminuir la agregación de dicho fragmento, formando de este modo una solución acuosa de fragmento de vWF que está sustancialmente libre de agregados.