MXPA04006728A

MXPA04006728A - Tratamiento de desordenes oseos con medicamentos anabolicos esqueleticos.

Info

Publication number: MXPA04006728A
Application number: MXPA04006728A
Authority: MX
Inventors: F Stewart Andrew
Original assignee: Osteotrophin Llc
Priority date: 2002-01-10
Filing date: 2003-01-10
Publication date: 2005-08-19
Also published as: US20080306005A1; EP1531855A4; US7384912B2; JP2005525312A; AU2003207512B2; US7015195B2; WO2003059291A3; CA2472472A1; AU2003207512A1; US20060025342A1; JP2011088924A; AU2008216969A1; EP1531855A2; US20030171288A1; WO2003059291A2

Abstract

Se describen en la presente metodos para la prevencion y tratamiento de una variedad de condiciones mamiferas manifestadas por perdida de la masa osea, incluyendo osteoporosis. La presente invencion proporciona metodos para utilizar PTHrP o analogos del mismo, para el tratamiento de desordenes oseos metabolicos, que son tanto efectivos como tienen una seguridad aumentada.

Description

TRATAMIENTO DE DESÓRDENES ÓSEOS CON MEDICAMENTOS ANABÓLICOS ESQUELÉTICOS Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a métodos para la prevención y tratamiento de una variedad de condiciones mamíferas manifestadas por pérdida de la masa ósea, incluyendo osteoporosis. Más particularmente, la presente invención se refiere a métodos para el uso de PTHrP, o un análogo del mismo, para el tratamiento de desórdenes óseos metabólicos que son eficaces y tienen una seguridad incrementada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A través de la vida adulta, los huesos experimentan continuamente la remodelación a través de los ciclos interactivos de la formación y resorción (trastorno) ósea. La resorción ósea es típicamente rápida y se media por osteoclastos (células de resorción ósea), formados por células precursoras fagociticas mononucleares en los sitios de remodelación ósea. Este proceso se sigue entonces por la aparición de osteoblastos (células formadoras óseas), los cuales forman el hueso lentamente para reemplazar el hueso perdido. El hecho de que el término de este proceso normalmente conduce a un reemplazo y renovación equilibrados del hueso indica que las señales moleculares y eventos que influencian la remodelación ósea se controlan de manera exacta. El mecanismo de pérdida ósea no se comprende bien, pero en efecto práctico, el desorden surgen de un desequilibrio en la formación de nuevos huesos saludables y la resorción de los huesos antiguos, sesgado hacia una pérdida neta de tejido óseo. Esta pérdida ósea incluye una disminución tanto en el contenido mineral como en los componentes de matriz proteínica del hueso y conduce a un índice de fractura incrementado de los huesos femorales y huesos en el antebrazo y vértebras, predominantemente. Estas fracturas, a su vez, conducen a un incremento en la morbidez general, una pérdida notable de estatura y movilidad y, en muchos casos, un incremento en la mortandad como resultado de complicaciones. Se conocen varios desórdenes de desarrollo óseo que originan un desequilibrio en el ciclo de remodelación ósea. El principal entres estos son las enfermedades óseas metabólicas, tales como la osteoporosis, osteomalacia/raquitismo, falla renal crónica e hiperparatiroidismo, lo cual da como resultado una pérdida excesiva o anormal de la masa ósea (osteopenia). La osteoporosis, o hueso poroso, es una enfermedad caracterizada por masa ósea escasa y deterioro estructural del tejido óseo, lo que conduce a fragilidad ósea y a una susceptibilidad incrementada a las fracturas de la cadera, espina y cadera. Es una enfermedad devastadora tanto entre mujeres post-menopáusicas como también entre hombres de edad avanzada. Los costos a nivel nacional por medicamentos y hospitalizaciones se estiman en $50,000,000 por rango anual en la actualidad y es probable que se incrementen a medida que envejezca la población de EU. En la actualidad, los soportes principales de la terapia son los complementos orales de calcio, los complementos de vitamina D y una familia de medicamentos llamados "anti-resorptivos" los cuales reducen la resorción ósea osteoclástica. Estos incluyen estrógenos, tales como estrógenos conjugados (Premarin®); moduladores receptores de estrógeno selectivos (SERMs), tales como raloxifeno (Evista®); calcitonina (Miacalcin®); y bisfosfonatos, tales como alendronato (Fosamax®), risedronato (Actonel®), etidronato (Didronel®), pamidronato (Aredia®), tiludronato (Skelid®) o ácido zoledrónico (Zometa®). Ver, The writing group for PEPI trial, JAMA 276: 1389-1396 (1996); Delmas et al., N Engl J Med 337. 1641-1647 (1997); Chestnut et al., Osteoporosis Int 8 (suppl 3): 13 (1998); Liberman et al., N Engl J Med 333 1437-1443 (1995); McCIung et al., N Engl J Med 344: 333-40 (2001). Estos fármacos son eficaces en la disminución de la pérdida mineral ósea e incluso originan incrementos moderados en la densidad mineral del hueso espinal lumbar en el rango de 2% (calcio, vitamina D, calcitonina), 3% (raloxifeno), 6% (estrógenos) u 8% (bisfosfonatos). En general, se requieren dos a tres años de administración para lograr efectos de esta magnitud. Ver, Ver, The writing group for PEPI trial, JAMA 276. 1389-1396 (1996); Delmas ef al., N Engl J Med 337: 1641-1647 (1997); Chestnut ef al., Osteoporosis Int 8 (suppl 3): 13 (1998); Liberman et al., N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung et al., N Engl J Med 344: 333-40 (2001). La osteoporosis existe, en general, cuando las pérdidas minerales esqueléticas se encuentran en el rango de 50% por debajo de la masa ósea pico, lo cual ocurre aproximadamente a la edad de 30. Visto desde la perspectiva de corrección del déficit de minerales óseos, la reversión completa de esta pérdida del 50% requeriría de un incremento del 100% en la masa ósea. Por lo tanto, visto desde esta perspectiva, los incrementos de 2-8% en la densidad mineral ósea que resultan de la terapia anti-resorptiva, aunque clínicamente importantes y benéficos, dejan un espacio muy significativo para mejorar. Ya que el uso de anti-resorptivos para prevenir la pérdida ósea no da como resultado la producción de hueso nuevo, la eficacia final de los anti-resorptivos en términos cuantitativos es limitada. Estas consideraciones enfatizan la necesidad de desarrollar mecanismos farmacéuticos para producir hueso nuevo. Recientemente, se ha acumulado evidencia que demuestra claramente que la hormona paratiroide (PTH) es un nuevo miembro muy eficaz de tal nuevo armamento terapéutico de la osteoporosis. Ver, Finkelstein et al. N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman et al., J Clin Endocrino! Metab 82. 620-28 (1997); Lindsay et al., Lancet 350: 550-555 (1997); Neer et al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001); Roe et al., Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe er al., J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998). PTH se identificó primero en extractos de glándula paratiroide en los años 20's. La secuencia amino ácida completa de PTH se determinó en los años 70's. Debido a que los pacientes con sobreproducción de la hormona paratiroide (es decir, hiperparatiroidismo) desarrollan una declinación en la masa ósea (algunas veces muy severa), el PTH se ha considerado ampliamente como un agente esquelético catabólico en el siglo pasado. Sin embargo, estudios tanto animales como humanos han demostrado ahora claramente que cuando se administra de manera subcutánea como una dosis única diaria, (así llamada "intermitentemente" - en contraste con la sobreproducción continua de PTH que ocurre en pacientes con hiperparatiroidismo), el PTH puede inducir incrementos notables en la densidad mineral ósea y la masa ósea. Por lo tanto, PTH es muy diferente de la clase de fármacos anti-resorptivos. Ver, Finkelstein et al. N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman ef al., J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay et al., Lancet 350: 550-555 (1997); Neer et al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001); Roe ef al., Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe et al., J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998). Aunque la base celular para este efecto anabólico aún está por definirse, los efectos a nivel microscópico y fisiológico son claros: cuando se administra PTH de manera intermitente se da como resultado una activación notable de los osteoblastos formadores de hueso, mientras que los osteoclastos de resorción ósea se activan en un menor grado. Estos efectos son direccionalmente opuestos de los fármacos anti-resorptivos arriba descritos, los cuales inhiben tanto la actividad osteoclástica como también la osteoblástica. Para colocar estos resultado en términos cuantitativos, PTH ha demostrado en múltiples estudios incrementar la densidad mineral ósea espinal lumbar en aproximadamente 10-15%, dependiendo del estudio (ver, Finkelstein ef al. N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman ef al., J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay et al., Lancet 350: 550-555 (1997); Neer eí al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001); Roe ef al., Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe ef al., J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)).

En un estudio, la densidad mineral ósea espinal se reportó incrementada en tanto como 30%, cuando se determinó el uso de absorciometría por rayos-X de doble energía (DXA) y tanto como 80% cuando se utilizó tomografía computarizada cuantitativa (QCT) de hueso trabecular de la espina lumbar (ver, Roe ef al., Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, 59 (1999)). Además de incrementar la masa ósea, PTH ha demostrado recientemente tener una eficacia anti-fractura significativa, tanto en los sitios de espina como en sitios no vertebrales. El PTH ha demostrado reducir las fracturas entre 60% y 90% dependiendo del sitio esquelético y la definición de la fractura. Neer ef al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001). Estos efectos son al menos tan pronunciados como la eficacia anti-fractura de los anti-resorptivos (ver, El grupo de escritura para el ensayo PEPI, JAMA 276: 1389-1396 (1996); Delmas et al., N Engl J Med 337: 1641-1647 (1997); Chestnut ef al., Osteoporosis Int 8 (Suppl 3): 13 (1998); Liberman ef al., N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung ef al., N Engl J Med 344: 333-40 (2001)) y puede ser superior. Por lo tanto, PTH parece ser el primer miembro de una nueva clase de fármacos de anti-osteoporosis, los cuales en contraste con los anti-resorptivos, han llamado a la clase "anabólica" esquelética de fármacos de osteoporosis o "anabólicos". La proteína relacionada con la hormona paratiroide (PTHrP) parece ser un segundo miembro de esta clase de fármacos anabólicos esqueléticos. Ver, Stewart ef al., J Bone Min Res 15: 1517-1525 (2000). PTHrP es el producto de un gen distinto del que codifica a PTH. PTHrP comparte aproximadamente 60%^de homología en el nivel amino ácido con PTH en los primeros 13 amino ácidos, y después las secuencias cambian por completo. Yang eí al., En: Bilezikian, Raisz y Rodan (Ed). PRINCIPIOS DE BIOLOGÍA ÓSEA. Academic Press, San Diego, CA, pp. 347-376 (1996). PTHrP se traduce inicialmente como una pro-hormona que experimenta después un procesamiento post-traslacional extenso. Una de las formas procesadas, o formas segregadoras auténticas, como se identifica en el laboratorio del inventor, es PTHrP-(1 -36). Wu eí al., J Biol Chem 271: 24371-24381 (1996). PTHrP-(1 -36) se une al receptor común de PTH/PTHrP, también llamado el receptor de PTH-1, en hueso y riñon. Everhart-Caye et al., J Clin Endocrino! Metab, 81: 199-208 (1996); Orloff eí al., Endoc nology, 131: 1603-1611 (1992). PTHrP-(1-36) se une a este receptor con igual afinidad a PTH, y activa las trayectorias de transducción de señal PKA y PKC con igual potencia que PTH. Everhart-Caye et al., J Clin Endocrino! Metab 81: 199-208 (1996); Orloff et al., Endocrinology, 131: 1603-1611 (1992). PTHrP se identificó originalmente por el inventor (Burtis et al., J Biol Chem 262: 7151-7156 (1987); Stewart eí al., Biochem Biophys Res Comm 146: 672-678 (1987) y otros (Strewler et al., J Clin Invest, 80: 1803 (1987); Moseley eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 84: 5048-5052 (1987)) a través de su papel como el agente causante del síndrome paraneoplástico humano común llamado hipercalcemia humoral de malignidad (HHM). Stewart eí al., N Engl J Med 303: 1377-1383 (1980). Por ejemplo, los humanos con HHM pueden perder tanto como el 50% de su masa esquelética ósea durante un periodo de unos cuantos meses, como resultado de elevaciones prolongadas en PTHrP circulante. Stewart et al., J Clin Endo Metab 55: 219-227 (1982). Los estudios animales posteriores han indicado que PTHrP es capaz de incrementar la masa ósea en ratas con osteoporosis cuando se administra de manera intermitente. Sin embargo, sorprendentemente, los incrementos en la densidad mineral ósea, la masa ósea, la formación ósea y la biomecánica esquelética inducida por PTHrP no fueron tan dramáticos como aquellos observados con el uso de cantidades equimolares de PTH. Stewart et al., J Bone Min Res 15: 1517-1525 (2000). No obstante, estos efectos anabólicos y mejoradores de la biomecánica de PTHrP son sorprendentes ya que PTHrP se observa ampliamente como el responsable de la hormona esquelética catabólica más esencial de las dramáticas pérdidas minerales esqueléticas en pacientes con HHM. Stewart ef al., J Clin Endo Metab 55: 219-227 (1982). La observación de que es realmente anabólico para el esqueleto cuando se administra de manera intermitente no se anticipó, como es evidente por el hecho de que muchos investigadores y firmas farmacéuticas han trabajado los últimos 10 años con PTH en osteoporosis, pero ninguno ha recurrido a PTHrP ha pesar de que se ha encontrado en el dominio público desde su descripción inicial en 1987. En 1999, Eli Lilly liberó un reporte a la FDA que indicó que la administración diaria de PTH a ratas durante un periodo de dos años dio como resultado el desarrollo de sarcomas osteogénicos en estas ratas. Ver, FDA notificaron to PTH IND holders, 11 de Diciembre, 1998 (Neer ef al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001)). El desarrollo de estos tumores esqueléticos malignos es extremadamente problemático para los expertos en el campo, debido a que el desarrollo de tumores esqueléticos derivados de osteoblastos en este modelo de toxicidad pre-clínica fue biológicamente razonable en términos causativos, en relación con PTH. Una preocupación clave en la historia de osteosarcoma en ratas es que el PTH se administró en los estudios de toxicidad pre-clínica a ratas en desarrollo durante dos años. Esto representa la gran mayoría de la duración de vida de la rata, también de aproximadamente dos años. En humanos, el tratamiento con PTH ha tenido generalmente una duración de dos a tres años (Finkelstein et al. N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman et al., J Clin Endocrino! Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay et al., Lancet 350: 550-555 (1997); Neer et al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001); Roe er al., Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe et al., J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)). La mayoría de los investigadores anticipan que la duración del tratamiento con PTH será desde 18 meses hasta 3 años. Por consiguiente, permanece una preocupación en mente de que cierto tratamiento con PTH a largo plazo podría dar como resultado osteosarcomas en humanos. De acuerdo con lo anterior, permanece una necesidad en la materia de un método para la prevención y tratamiento de desórdenes óseos que utilicen fármacos anabólicos esqueléticos que sean tanto seguros como eficaces.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos útiles para la prevención y tratamiento de una variedad de condiciones mamíferas manifestadas por pérdida de masa ósea, incluyendo osteoporosis. La invención se basa en la sorprendente observación de que la administración de dosis muy elevadas de un PTHrP, o un análogo relacionado, puede producir incrementos drásticos en BMD en un periodo de tiempo muy corto. El periodo de administración es preferentemente de 15, 18, 21, 24, 30 o 36 meses, más preferentemente 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses y más preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, o 6 meses. Las dosis elevadas del fármaco anabólico esquelético no producen ningún efecto secundario adverso cuando se administra por periodos de tiempo cortos. De acuerdo con lo anterior, los métodos de la presente invención ofrecen mayor seguridad al eliminar o reducir el riesgo de efectos secundarios negativos comúnmente asociados con fármacos anabólicos esqueléticos, tales como hipercalcemia, falla renal, hipotensión o el riesgo de desarrollar sarcomas osteogénicos. Las velocidades de incremento en BMD logrados con los métodos de la presente invención son extremadamente rápidas. En una modalidad, tres meses de tratamiento con PTHrP-(1-36) produjeron velocidades de incremento en BMD que fueron mayores a cualquier velocidad previamente obtenida con anti-resorptivos y dosis menores de PTH durante periodos de administración más prolongados. Las velocidades de incremento en BMD logradas con los métodos de la presente invención son preferentemente de al menos 1.0% por mes, 1.1% por mes o 1.2% por mes, más preferentemente 1.3% por mes o 1.4% por mes, y más preferentemente sobre 1.5% por mes o 1.6% por mes. Los incrementos en BMD observados generalmente no se obtienen con anti-resorptivos durante dos o tres años de ad ministraciones. No obstante, varios anti-resorptivos dispon ibles (SE RMs , calcitonina, vitamina D, calcio) nu nca logran los incrementos en BMD obtenidos con los métodos de la presente invención . Además , los incrementos en BM D obtenidos con los métodos de la presente invención son comparables o superiores a aquellos logrados mediante el uso de menores dosis de PTH durante periodos de administración más prolongados. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona métodos para la prevención y tratamiento de desórdenes óseos mediante el uso de fármacos anabólicos esqueléticos q ue son tanto seguros como eficaces. El incremento resultante en BMD log rado con los métodos de la presente invención preferentemente da como resultado puntuaciones T de >-2.5, más preferentemente da como resultado puntuaciones T de >-2.0, y más preferentemente da como resultado puntuaciones T de >- 1 .0. Además, el incremento resu ltante en B M D log rado con los métodos de la presente invención preferentemente evita fracturas q ue resultan preferentemente en al menos una red ucción de 50% , 60% o 70% en incidencia de fracturas, más preferente en al menos una reducción de 75% , 80% u 85% en i ncidencia de fracturas y más preferentemente en al menos una red ucción de 90% o 95% en i ncidencia de fracturas. En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para incrementar la masa ósea en un paciente an imal o h umano med iante la administración intermitente al paciente de PTHrP, o un a ná logo del mismo, a una dosis entre 50 y 3,000 µg/d ía . Un ra ngo de dosis preferido es de 400-3,000 µg/d ía . Otros rangos de dosis preferidos i ncl uyen 400- 1,500 g/día, 250-50 µg/á'a. En una modalidad preferida, PTHrP-(1 -36) se administra a una dosis de entre 50 y 3,000 µ9^?3. Un rango de dosis preferido es de 400-3,000 µ9^?8. Otros rangos de dosis preferidos incluyen 400-1,500 µg/d¡a, 400-1,200 µg/día, 400-900 µg/día, 400-600 µg/dia. La presente invención también proporciona métodos para incrementar la densidad ósea mediante el uso de la administración de PTHrP, o análogos del mismo, por periodos de tiempo mayores a los previamente administrados en animales o humanos. En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para el incremento de la masa ósea en un paciente animal o humano mediante la administración intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, durante un periodo de entre 1-36 meses. El periodo de administración es preferentemente de 15, 18, 21, 24, 30 o 36 meses, más preferentemente de 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses y más preferentemente de 1, 2, 3, 4, 5, o 6 meses. Los métodos de la invención pueden emplearse con un paciente afligido por, o en riesgo de, un desorden óseo metabolico que incluye osteoporosis primaria o secundaria, osteomalacia, osteodistrofia renal y otros tipos de desórdenes esqueléticos con pérdida ósea asociada. En una modalidad, las velocidades de incremento en BMD logradas por los métodos de la presente invención son de al menos 1.5% por mes. PTHrP, o un análogo del mismo, utilizado en los métodos de la presente invención puede definirse por la SEQ ID NO: 2; tener al menos 70% de homología con la SEQ ID NO: 2 o codificarse por una secuencia de ácido nucleico que se hibridize bajo condiciones estrictas hacia una secuencia de ácido nucleico complementaria de la SEQ ID NO: 1. Los análogos de PTHrP que pueden utilizarse en los métodos de esta invención incluyen fragmentos de PTHrP-(1-30) a PTHrP(1-173). Los análogos de PTHrP también pueden incluir análogos con una secuencia péptida, alfa-helicoidal, anfipática, modelo (MAP) sustituida en la región de terminal C de hPTHrP(1-34) tal como [MAP1 -10]22-31 h PTHrP- (1 -34)NH2). Los análogos de PTHrP también pueden incluir peptidoimitadores y fármacos de molécula pequeña que tengan actividades biológicas agonísticas, anabólicas, esqueléticas, según se define en la presente. El PTHrP puede administrarse mediante administración subcutánea, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intranasal, y en aerosol. La administración intermitente puede ser por inyecciones periódicas una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, dos veces por semana, dos veces al mes y una vez al mes. Alternativamente, el uso de administración pulsátil del fármaco anabólico esquelético mediante mini-bombeo puede emplearse en los métodos de la presente invención. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para incrementar la masa ósea en un paciente animal o humano. En una modalidad, el método comprende la administración de entre 1.5 y 90 mg de PTHrP; o un análogo del mismo, de manera intermitente durante un periodo de un mes. En otra modalidad, el método comprende la administración de entre 3 y 18 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, intermitentemente durante un periodo de dos meses. En todavía otra modalidad , el método comprende la administración de entre 4.5 y 270 mg de PTH rP, o un análogo del mismo, de manera intermitente durante un periodo de tres meses. En todavía otra modal idad , el método comprende la administración de entre 9 y 540 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, de manera intermitente durante un periodo de seis meses. En todavía otra modalidad, el método comprende la administración de entre 1 8 y 1 080 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, de manera intermitente durante un periodo de un año. En todavía otra modalidad , el método comprende la administración de entre 36 y 2160 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, de manera intermitente durante un periodo de dos a ños . En todavía otra modalidad , el método comprende la administración de entre 54 y 3240 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, de manera intermitente d urante un periodo de tres años . De acuerdo con este método, el PTH rP , o análogo del mismo, puede administrarse en un intervalo de dos is d e una vez al d ía, una vez cada dos d ías, una vez cada tres d ías, u na vez a la semana , dos veces a la semana , cada dos semanas, dos veces a l mes o cada mes. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona u n equipo para i ncrementar la masa ósea en un paciente animal o humano. En una modalidad, el eq ui po comprende entre 1 .5 y 90 mg de PTH rP , o un análogo del mismo, e indicaciones escritas que proporcionan instrucciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, en un paciente anima l o humano durante un periodo de un mes. En otra modalidad , el eq uipo comprende entre 3 y 180 mg de PTHrP, o un a nálogo del mismo, e indicaciones escritas que proporcionan instrucciones para administración intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, en u n paciente animal o humano durante un periodo de dos meses . En todavía otra modalidad, el equipo comprende entre 4.5 y 270 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, e ind icaciones escritas que proporcionan instrucciones para administración intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, en u n paciente animal o h umano durante un periodo de tres meses. En todavía otra modalidad , el equipo comprende entre 9 y 540 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, e ind icaciones escritas q ue proporcionan instrucciones para admin istración intermitente de PTHrP, o un a nálogo del mismo, en un paciente animal o humano durante un periodo de seis meses. En todavía otra modalidad , el equipo comprende entre 1 8 y 1 080 mg de PTH rP , o un análogo del mismo, e indicaciones escritas q ue proporcionan instrucciones para administración intermitente de PTH rP, o un análogo del mismo, en un paciente animal o humano durante un período de un año. En todavía otra modalidad , el equipo comprende entre 36 y 21 60 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, e indicaciones escritas que proporcionan instrucciones para adm inistración intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, en un paciente animal o humano d urante un periodo de dos años . En todavía otra modalidad , el eq uipo comprende entre 54 y 3240 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, e ind icaciones escritas que proporcionan instrucciones para ad ministración intermitente de PTHrP, o un a nálogo del mismo, en u n paciente animal o humano durante un periodo de tres años. Los métodos de la presente invención pueden comprender además la etapa de co-ad ministrar, ya sea de ma nera simu ltánea o secuencial con el PTHrP, un agente inhibidor de resorción ósea. El agente inhibidor de resorción ósea puede ser un bisfosfonato, estrógeno, un modulador receptor de estrógeno selectivo, un mod u lador receptor de andrógeno selectivo, calcitonina, un análogo de vitamina D, o una sal de calcio. El agente inhibidor de resorción ósea también puede ser alendronato, risedronato, etidronato, pamidronato, ti l ud ronato, ácido zoled rónico, raloxifeno, tamoxifeno, d roloxifeno, toremifeno, idoxifeno, levormeloxifeno o estrógenos conj ugados. En una mod alidad , el paciente recibe la administración intermitente del fármaco anabólico esq uelético durante un periodo de tiempo de tres meses, seguido por un periodo de tratamiento de tres meses con un agente inhibidor de resorción ósea. Un técnico experto reconocerá que el rég imen de tratamiento secuencia! podría iniciarse con un periodo de tratamiento con un agente i nh ibidor de resorción ósea seguido por un periodo de tratamiento con el fármaco anabólico esquelético, que la longitud de los periodos de tratamiento secuenciales puede modificarse (por ejemplo, 1 - 18 meses) y q ue el fármaco anabólico esquelético puede co-administrarse con el agente inhibidor de resorción ósea (por ejemplo, el periodo de tratamiento secuencial de un fármaco anabólico esq uelético y un agente inhi bidor de resorción ósea seguido por un periodo de tratamiento d e un agente inhibidor de resorción ósea solo). Los periodos de trata miento secuencial (por ejemplo, tres meses del fármaco anabólico esquelético seguidos por tres meses del agente inhibidor de resorción ósea) pueden repetirse hasta que se restaure el BMD del paciente (por ejemplo, u na puntuación T de >-2.0 o -2.5 por debajo de la media). En todavía otro aspecto, la invención incluye un sistema computarizado y métodos para el diseño de peptidoimitadores y fármacos de molécula pequeña que tienen actividades biológicas agonísticas y antagonísticas, anabólicas, esqueléticas. En una modalidad, el sistema incluye un procesador, memoria, una pantalla de desplieg ue o medios de salida de datos, un medio de entrada de datos y un conjunto de instrucciones legibles por computadora que tienen al menos un algoritmo capaz de o que se vuelve una estructura tri-dimensional de un agente anabólico esquelético, fragmento, o derivado del mismo, así como también un receptor para tal agente anabólico esquelético. En una modalidad más preferida, el sistema comprende un algoritmo de diseño auxiliado por computadora (CAD) capaz de producir un peptidoimitador o fármaco de molécula pequeña en base a los sitios activos del agente anabólico esquelético o receptor. Estos y otros objetos de la presente invención serán aparentes a partir de la descripción detallada de la invención abajo proporcionada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DI BUJ OS La presente invención se entenderá aún más a partir de la siguiente descripción con relación a las tablas, en las cuales: La figura 1 es una alineación por homolog ía de PTHrP-( 1 -36) humano con la secuencia correspondiente en otras especies, alineada para maximizar la identidad amino ácida, y en donde los amino ácidos que difieren del amino ácido correspondiente en la secuencia humana se encuentran en negritas y los amino ácidos que son variantes de sustitución amino ácida conservadores de los amino ácidos correspondientes en la secuencia humana se encuentran en negritas y subrayados. La figura 2 es una alineación por homolog ía de PTH-( 1 -34) humano con la secuencia correspondiente en otras especies, alineada para maximizar la identidad amino ácida, y en donde los amino ácidos q ue difieren del amino ácido correspondiente en la secuencia humana se encuentran en negritas y los amino ácidos que son variantes de sustitución amino ácida conservadores de los amino ácidos correspondientes en la secuencia humana se encuentran en negritas y subrayados . La figura 3 es una alineación por homolog ía de TI P-( 1 -39) humano con la secuencia correspondiente en ratón , al ineada para maximizar la identidad amino ácida, y en donde los amino ácidos que difieren del amino ácido correspondiente en la secuencia humana se encuentran en negritas y los amino ácidos q ue son variantes de sustitución amino ácida conservadores de los ami no ácidos correspondie ntes en la secuencia humana se encuentran en negritas y subrayados. La figura 4 es una gráfica de l íneas q ue ilustra los cambios en la densidad de masa ósea vertebral lumbar (BM D) expresados como % de cambios (panel izquierdo) y cambios en peso (en gramos) (panel derecho) en mujeres post-menopáusicas con osteoporosis que reciben placebo (N=7) o 41 0.25 µg/d ía de PTH rP-( 1 -36) (N = 8). La figura 5 ilustra cambios en la densidad mineral ósea como cambios porcentuales de la línea de base , después de tratamientos con PTHrP o un placebo (PBO) , seg ún se mide en la espina lumba r (L/S), el cuello femoral (FN ) y la cadera total (TH ). Existe un incremento notable en la densidad mi neral ósea en la espi na lumbar en respuesta al tratamiento con PTHrP, un incremento más moderado en el cuello femoral y aproximadamente nulo incremento en la densidad mineral ósea en la cadera total. La figura 6 ilustra marcadores de trastorno óseo en los sujetos tratados con placebo y PTHrP. La figura 6(a) demuestra que la osteocalcina en suero resulta expresada como cambio de la línea base. La figura 6(b) indica los valores de N-telopéptido en suero (NTX) en los dos grupos. La figura 6(c) indica las deoxipiridinolinas urinarias en los dos grupos. Los resultados demuestran que PTHrP estimula la osteocalcina en suero y, por inferencia, la formación ósea, pero no la resorción ósea. La figura 7 ilustra el calcio total en suero (panel izquierdo) y el calcio ionizado (panel derecho) en los grupos de PTHrP y placebo. No existe diferencia en el calcio total o ionizado en suero entre los grupos de PTHrP y de control y ningún paciente en ninguno de los grupos desarrolló hipercalcemia según se midió por el calcio en suero total o ionizado. La figura 8 es una gráfica de líneas que ilustra los cambios en la densidad de masa ósea vertebral lumbar (BMD) expresada como % de cambio en mujeres post-menopáusícas con osteoporosis que reciben placebo (N=7) o 410.25 g/día o PTHrP-(1-36) (N=8) en comparación con los efectos de otros diversos fármacos para osteoporosis reportados en otros estudios clínicos publicados. La figura 9 son gráficas de líneas que ilustran estudios de unión por competencia (Paneles Superiores) de 125l-[Tyr36]PTHrP-(1-36)NH2 bajo condiciones de equilibrio en membranas corticales renales humanas (RCM) (Panel A), membranas SaOS-2 (Panel B) y células intactas SaOS-2 (Panel C). Las curvas de competencia se muestran para [Tyr36]PTHrP-(1-36)NH2 (?) no etiquetado, hPTH-(1-34) (o), rPTH-(1-34) (A), bPTH-(1-34) (·)¦ [Tyr34]bPTH-(7-34)NH2 ( ), y hPTHrP-(7-34)NH2 (~).

Los valores son la +SEM media de determinaciones duplicadas para un experimento representativo. Los Paneles Inferiores son gráficas de lineas que ilustran las transformaciones Scatchard correspondientes de los experimentos de unión representativos. La figura 10 son gráficas de líneas que ilustran la estimulación de la actividad de ciclasa adenilada en membranas corticales renales humanas (RCM) (Panel A), membranas SaOS-2 (Panel B), y células intactas SaOS-2 (Panel C) por [Tyr36]PTHrP-(1-36)NH2 (?), [Nie8 18,Tyr34]hPTH-(1-34) (o), rPTH-(1 -34) (A) y bPTH-(1-34) (.). Los ensayos se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones empleadas en los ensayos de unión respectivos. Los valores son la +SEM media de determinaciones duplicadas para un experimento representativo. La figura 11 ilustra una gráfica de líneas que representa el curso del tiempo para la unión de PTHrP y péptidos PTH que incluyen 125l[Nle8'18,Tyr34]-hPTH-(1-34)NH2 para membranas renales caninas a 20°C: —o— unión total de radioligando; — ?— unión de radioligando en presencia de 10"6 M bPTH-(1-34) no etiquetado (unión no específica); --·-- unión específica de radioligando. Los puntos representan la ±SEM media de determinaciones triplicadas. La SEM fue demasiado pequeña para indicarse en aquellos puntos sin barras de error. Los resultados son representativos de aquellos obtenidos en tres experimentos. La figura 12 es una gráfica de líneas que ilustra estudios de unión por competencia de 125l-[Nle8J8,Tyr3 ]hPTH-(1 -34)NH2 en membranas renales caninas a 20°C con [Nle818,Tyr34]hPTHh-(1 -34)NH2 no etiquetado (A), bPTH-(1-34) (·) y [Tyr36]PTHrP-(1 -36)NH2 (o). Los puntos representan la +S.E. media de determinaciones triplicadas en tres experimentos separados (bPTH-(1-34) y [Tyr36]PTHrP-(1 -36)amida) o en dos experimentos separados [Nle8 18,Tyr34]hPTH-(1 -34)NH2). Los puntos individuales se expresaron como un porcentaje de la unión específica determinada en ausencia de péptido no etiquetado (porcentaje de unión máxima). Conjunto Interno significa el análisis Scatchard de un experimento representativo. B/F, unido/libre. La figura 13 es una gráfica de líneas que ilustra los estudios de unión por competencia de 25l-[Tyr36]PTHrP-(1 -36)NH2 en membranas renales caninas a 20°C con [Nle8'18,Tyr3 ]hPTHh-(1-34)NH2 no etiquetado (A), bPTH-(1-34) (·), [Tyr36]PTHrP-(1-36)NH2 (o), PTHrP-(49-74) (?) y [Cys5, Trp11, Giy 3]PTHrP-(5-18) (P1 -PÉPTIDO) ( ). Los puntos representan la +S.E. media de determinaciones triplicadas en tres experimentos separados (bPTH-(1-34) y [Tyr36]PTHrP-(1-36)amida) o en un experimento [Nle8,18,Tyr3 ]hPTH-(1-34)NH2). Los puntos individuales se expresaron como un porcentaje de la unión específica determinada en ausencia de péptido no etiquetado (por ciento de máxima unión específica). Se muestra el análisis Scatchard [conjunto interno) de un experimento representativo. B/F, unido/libre. La figura 14 ilustra el cambio en el contenido mineral óseo femoral en los cinco grupos. BMC se muestra como un cambio porcentual de los animales sustituto en cada punto de tiempo. Observe que existe un incremento progresivo en el contenido mineral óseo femoral en cada g rupo de ratas tratadas con péptido, y que los cambios son a ltamente significativos en términos estad ísticos. La figu ra 1 5 es una serie de fotomicrografías de la tibia proximal derecha después de 90 d ías de tratamiento. A. Sustituto; B. OVX; C. SDZ-PTH-893; D. rhPTH( 1 -34); E . hPTHrP( 1 -36). Después de la ovariectom ía , el hueso se pierde en la tibia proximal. El tratamiento ya sea con SDZ-PTH-893 o PTH ( 1 -34) durante 90 d ías no solamente restaura el hueso perdido sino q ue incrementa significativamente el volumen óseo trabecular sobre el sustituto. PTHrP(1 -36) solamente restaura parcialmente el hueso perdido. Ampl ificación 5.5x. La figura 16 ilustra cambios h istomorfométricos óseos seleccionados durante el periodo de seis meses . Los puntos clave son que: a)el área trabecular, la velocidad de formación ósea y la superficie de resorción disminuyen con la edad en los grupos de OVX; b) los tres péptidos tienen efectos notablemente positivos en comparación con controles de OVX en el área trabecular y la velocidad de formación ósea ; y c) a pesar de este notable incremento en la velocidad de formación ósea , las velocidades de resorción ósea fueron similares en 1 -6 meses entre los grupos tratados y de control . La figura 1 7 ilustra cambios en la resistencia biomecánica (carga respecto a falla) durante los seis meses de trata miento . Los puntos clave son q ue: a) las mejoras notables en las mediciones biomecánicas ocurrieron en los tres grupos para cada uno de los tres péptidos; y b) las mejoras ocurrieron tanto en sitios predominantemente trabeculares como predominantemente corticales. La figura 18 ilustra cambios en el conten ido de calcio en suero y calcio renal durante los seis meses. Observe que las ratas tratadas con SD2-PTH-893 desarrollaron hipercalcemia moderada e incrementos notables en el contenido de calcio renal .

DESC RIPCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCI ÓN A. G ENERAL A través de la vida adulta, los huesos experimentan continuamente una remodelación a través de los ciclos interactivos de formación y resorción ósea (trastorno óseo). La resorción ósea es típicamente rápida y se med ia por osteoclastos (cél ulas de resorción ósea), formados por célu las precursoras fagocíticas monon ucleares en los sitios de remodelación ósea. Este proceso es seguido entonces por la aparición de osteoblastos (células formadoras de hueso), los cuales forman hueso lentamente para reemplazar el hueso perdido. Las actividades de los d iversos tipos de células q ue participan en el proceso de remodelación se controla n por interacción de factores sistémicos (por ejemplo, hormonas, linfoquinas, factores de creci miento, vitaminas) y locales (por ejemplo, citocinas, moléculas de adhesión , linfoqu inas y factores de crecimiento). El hecho de que el término de este proceso normalmente conduce al reemplazo desequilibrado y renovación de hueso ind ica que las señales moleculares y eventos q ue influencia n la remodelación ósea se controlan de manera exacta. El mecanismo de pérdida de hueso no se comprende bien pero, en efecto práctico, el desorden surge de u n deseq uilibrio en la formación de hueso sal udable nuevo y la resorción del hueso a ntiguo, sesgado hacia una pérdida neta de tej ido óseo. Esta pérd ida ósea incl uye una disminución tanto en el contenido mineral como en los componentes de matriz proteínica del hueso y cond uce a un índ ice de fractura incrementado de los huesos femorales y huesos en e l antebrazo y vértebras predominantemente. Estas fracturas, a su vez, cond ucen a un incremento en la morbidez general, una pérdida notable de estatura y movilidad y, en muchos casos , un i ncremento en la mortandad que resulta de complicaciones. Se conocen varios desórdenes de crecimiento óseo que originan un desequilibrio en el ciclo de remodelación ósea. El principal entre éstos son las enfermedades óseas metabólicas , tales como osteoporosis , raq uitismo, osteomalacia , falla renal crónica e hiperparatiroid ismo, lo cual da como resultado una pérd ida anormal o excesiva de masa ósea (osteopenia). Otras enfermedades óseas , tales como la enfermedad de Paget, también originan una pérdida excesiva de masa ósea en sitios localizados. Los pacientes que sufren de falla renal crónica (riñon) también sufren universalmente de pérdida de masa ósea esq uelética (osteodistrofia renal ). Aunque se sabe que la disfunción del riñon origina un deseq uilibrio de calcio y de fosfato en la sang re, a la fecha, la reposición de calcio y fosfato mediante diálisis no i nhibe de manera significativa la osteod istrofia en pacientes que sufren de falla rena l crónica. En adultos, los s íntomas osteod istróficos con frecuencia son una causa importante de morbidez. En los niños, la falla renal con frecuencia da como resultado una falla en el crecimiento, debido a la falla por mantener y/o incrementar la masa ósea. El raquitismo u Osteomalacia ("huesos blandos") es u n defecto en la mineralización ósea (por ejemplo, mineralización i ncompleta) y clásicamente se relaciona con la deficiencia o resistencia a la vita mina D ( 1 ,2,5-dihidroxi vitamina D3) . El defecto puede originar fracturas por compresión en huesos y una d isminución en la masa ósea, así como también zonas extendidas de hipertrofia y cartílago proliferatívo en lugar de tejido óseo. La deficiencia puede resultar de una deficiencia nutricional (por ejemplo, raqu itismo en niños), mala absorción de vitami na D o calcio y/o metabolismo afectado de la vitamina . Se ha sabido que el hiperparati roidismo (sobreproducción de la hormona paratiroide) origina u na pérdida ósea anormal desde su descripción inicial en los años 20's. En niños, el hiperparatiroidismo puede inhibir el crecimiento. En adultos con h iperparatiroidismo, la integ ridad del esqueleto se compromete y son comunes las fracturas de caderas, vértebras y otros sitios. El desequilibrio hormonal paratiroideo puede resultar típicamente de adenomas paratiroides o hiperplasia de glánd ula paratiroide. El hiperparatiroid ismo secundario puede resultar de varios desórdenes tales como deficiencia en vitamina D o uso farmacológico prolongado de un glucocorticoide tal como cortisona. El hiperparatiroidismo secundario y la osteodistrofia rena l puede resu ltar de la falla renal crónica . En las eta pas tempra nas de la enfermedad , los osteoclastos se estimulan para resorber hueso e n respuesta al exceso de hormona presente. A medida que prog resa la enfermedad , el hueso trabecular y cortical puede resorberse finalmente y el semejante se reemplaza con fibrosis, macrófagos y áreas de hemorragia como consecuencia de microfracturas. Esta cond ición , q ue ocurre tanto en hiperparatiroidismo primario como secundario, es referida patológicamente como osteítis cística fibrosa . La osteoporosis es un deterioro estructural del esq ueleto causado por pérd ida de masa ósea que resu lta de un deseq uilibrio en la formación de hueso, resorción ósea o ambos, de tal manera que la resorción domina la fase de formación ósea , reduciendo as í la capacidad de soporte de peso del hueso afectado. La osteoporosis afecta > 1 0 millones de individuos en los Estados Un idos , pero solamente 1 0 hasta 20% se d iagnostican y tratan . En un adulto saludable, las velocidades a las cuales se forma el hueso y se resorbe se coordinan de manera exacta a fin de mantener la renovación del hueso esquelético. Sin embargo, en individuos osteoporóticos, se desarrolla un deseq uilibrio en estos ciclos de remodelación ósea q ue da como resultado tanto u na pérdida de masa ósea como también la formación de defectos micro-arq uitectónicos en la continu idad del esqueleto. Estos defectos esq ueléticos , creados por perturbación en la secuencia de remodelación , se acumu lan y finalmente alcanzan un punto en el cual se compromete severamente la integrid ad estructural del esqueleto y es probable la fractura ósea . Las pri ncipales manifestaciones cl í nicas son fracturas en vértebras y caderas , pero pueden afectarse todas las partes del esqueleto. La osteoporosis se define como una reducción (o densidad) de la masa ósea o la presencia de una fractura por fragilidad . Esta reducción en el tej ido óseo se acompaña por el deterioro en la arquitectura del esq ueleto, cond uciendo a un riesgo notablemente incrementado de fractu ra. La osteoporosis se define operacionalmente por la National Osteoporosis Foundation and World Health Organization como una densidad ósea que cae -2.0 o -2.5 desviaciones estándares (SD) por debajo de la media (también referida como puntuación T de -2.0 o -2.5). Aquellos que caen en el extremo inferior del rango normal en jóvenes (una puntuación T de > 1 SD por debajo de la med ia) tienen baja densidad ósea y se consideran "osteopénicos" y se encuentran en riesgo incrementado de osteoporosis. Aunque este desequil ibrio ocurre gradualmente en la mayoría de los ind ividuos a med ida q ue envejecen ("osteoporosis senil ") es mucho más severa y ocurre a una rápida velocidad en las mujeres post-menopáusicas. Además, la osteoporosis también puede resu lta r de desequilibrios n utricionales y endocrinos, desórdenes hered itarios y varias transformaciones ma lignas.

Epidemiología En los Estados U nidos, tanto como 8 mi llones de mujeres y 2 mil lones de hombres tienen osteoporosis (puntuación T <-2.5) y 1 8 mil lones adicionales de individuos tienen niveles de masa ósea que los colocan en un riesgo incrementado de desarrollar osteoporosis (por ejemplo, puntuación T de masa ósea <-1 .0). La osteoporosis ocurre con más frecuencia al i ncrementarse la edad , a medida q ue se pierde prog resivamente el tejido óseo. En las mujeres, la pérdida de la función de los ovarios en la menopausia (típicamente después de los 50) precipita la rápida pérdida ósea por lo q ue la mayoría de las mujeres cumplen con el criterio de osteoporosis a la edad de 70. La epidemiolog ía de fracturas sigue tendencias similares como la pérd ida de densidad ósea. Las fractu ras del radio distal se incrementan en frecuencia antes de los 50 y se estabilizan a la edad de 60, con solamente un modesto incremento relacionado con la edad posteriormente. En contraste, los índices de incidencia de fracturas de cadera se d uplican cada cinco años después de la edad de 70. esta epidemiolog ía d istinta puede relacionarse con la manera como se caen las personas a medida que envejecen, con menores caídas sobre un brazo estirado. Al menos 1 .5 millones de fracturas ocu rren cada año en los Estados Unidos como consecuencia de osteoporosis. A medida q ue la población continúe envejeciendo, el nú mero total de fracturas continuará escalándose .

Patofisiología La osteoporosis resulta de pérdida ósea debido a cambios normales relacionados con la edad e n la remodelación ósea , así como también factores extrínsecos e intrínsecos que exageran este proceso. Estos cambios pueden sobreponerse a u na masa ósea de pico bajo. En consecuencia , el proceso de remodelación ósea es fu ndamenta l para el entendimiento de la patofisiolog ía de la osteoporosis. El esq ueleto se incrementa en tama ño med iante crecimiento lineal y med iante aposición de nuevo tejido óseo en las superficies externas de la corteza. Este ú ltimo proceso es el fenómeno de remodelación , el cual también permite q ue los huesos largos se adapten en forma a las tensiones colocadas sobre el los. La producción de hormona sexual incrementada en la pubertad se req u iere para una máxima maduración esquelética , la cual alcanza una masa y densidad máximas en la adultez temprana. La nutrición y el estilo de vida también juegan un importante papel en el crecimiento, aunq ue los factores genéticos son las principales determinantes de la masa esquelética y densidad pico. Numerosos genes controlan el crecimiento esq uelético, la masa ósea pico y el tamaño corporal, pero es probable que genes separados controlen la estructura y densidad del esqueleto. La herencia estima el 50 hasta 80% de densidad y tamaño óseo se derivan en base a estudios dobles . Aunq ue con frecuencia la masa ósea pico se d isminuye entre individuos con una historia familiar de osteoporosis , los estud ios de asociación de genes candidatos [receptor de vitamina D; colágeno Tipo I , el receptor de estrógenos (ER), interleukin (I L) 6 ; y factor de crecimiento simi lar a la insulina (IG F) I] no se han reproducido de manera consistente . Los estudios de enlace sug ieren que varios sitios genéticos se asocia n con masa ósea elevada . U na vez q ue se ha logrado una masa esq uelética pico, el proceso de remod elación permanece siendo la princi pal actividad metabólica del esq ueleto. Este proceso tiene tres funciones primarias: ( 1 ) reparar el micro-daño dentro del esq ueleto, (2) mantener la resistencia esquelética y (3) suministrar calcio desde el esqueleto para mantener calcio en suero . Las demandas ag uas de ca lcio involucran la resorción mediada por osteoclastos as í como también el transporte de calcio por osteocitos. La activación de la remodelación puede inducirse mediante microdaño al hueso debido a la tensión excesiva o acumulada. La remodelación ósea también se regula por varias hormonas circulantes, incluyendo estrógenos, andrógenos, vitamina D, y PTH, así como también los factores de crecimiento localmente producidos tales como IGF-I y II, el factor de crecimiento de transformación (TGF) ß, PTHrP, lis, prostaglandinas, factor de necrosis de tumor (TNF) y osteoprotegrina y muchos otros. Las influencias adicionales incluyen la nutrición (particularmente la ingesta de calcio) y el nivel de actividad física. El resultado final de este proceso de remodelación es que el hueso resorbido se reemplaza por una cantidad igual de tejido óseo nuevo. Sin embargo, después de 30 a 45 años de edad, los procesos de resorción y formación se desequilibran y la resorción excede a la formación. Este desequilibrio puede iniciarse a diferentes edades y varía en diferentes sitios esqueléticos; se exagera en las mujeres después de la menopausia. La pérdida ósea excesiva puede deberse a un incremento en la actividad osteoclástica y/o una disminución en la actividad osteoblástica. Además, un incremento en la frecuencia de la actividad de remodelación puede amplificar el pequeño desequilibrio observado en cada unidad de remodelación.

Medición de la Masa Ósea Varias técnicas no invasivas se encuentran ahora disponibles para estimar la masa esquelética o la densidad. Estas incluyen absorciometría de rayos X de doble energía (DXA), absorciometría de rayos X de energía individual (SXA), tomografía computada cuantitativa (CT) y ultrasonido. DXA es una técnica de rayos X altamente exacta que se ha vuelto el estándar para medir la densidad ósea en la mayoría de los centros. Aunque puede utilizarse para mediciones de cualquier sitio esquelético, las determinaciones clínicas se elaboran normalmente en la espina lumbar y cadera. Se han desarrollado máquinas portátiles de DXA que miden el talón (calcáneo), antebrazo (radio y cubito), o dedos (falanges) y la DXA también puede utilizarse para medir la composición corporal. En la técnica de DXA se utilizan dos energías de rayos X para estimar el área de tejido mineralizado y el contenido mineral se divide entre el área, lo cual corrige parcialmente el tamaño corporal. Sin embargo, esta corrección es solamente parcial ya que DXA es una técnica de exploración bi-dimensional y no puede estimar las profundidades o longitud posteroanterior del hueso. Por lo tanto, la gente pequeña tiende a tener una densidad mineral ósea menor al promedio (BMD). Las técnicas de DXA más recientes que miden la información de BMD se encuentran actualmente bajo evaluación. Los espolones óseos, que son frecuentes en la osteoartritis, tienden a incrementar falsamente la densidad ósea de la espina. Debido a que la instrumentación de DXA se proporciona por varios diferentes fabricantes, la emisión varía en términos absolutos. En consecuencia, se ha vuelto una práctica estándar el relacionar los resultados con valores "normales" mediante el uso de puntuaciones T, que comparan los resultados individuales con aquellos en una población joven que se compara por raza y género. Alternativamente, las puntuaciones Z comparan resultados individuales con aquellos de una población agrupada por edad que también se compara respecto a raza y género. Por lo tanto, una mujer de 60 años de edad con una puntuación Z de -1 ( 1 SD por debajo de la media para la edad) pod ría tener una pu ntuación T de -2.5 (2.5 SD por debajo de la media para u n grupo de control joven ). CT se utiliza básicamente para medir la espina, y CT periférico se utiliza para medir hueso en el antebrazo o tibia. La investigación en el uso de CT para la med ición de la cadera se encuentra en cu rso. CT tiene la ventaja adicional de estudiar la densidad ósea en los subti pos de hueso, por ejemplo, trabecu lar contra cortical . Los resu ltados obtenidos de CT sin diferentes de todos los otros actualmente d isponibles ya q ue esta técnica analiza específicamente el h ueso trabecular y puede proporcionar u na medición de densidad verdadera (masa de hueso por vol umen de u n idad ) . Sin embargo, CT permanece siendo costosa, involucra una mayor exposición a la radiación y es menos reproducible. El ultrasonido se utiliza para medir la masa ósea al calcular la atenuación de la seña l a medida q ue pasa a través del hueso o la velocidad con la cual atraviesa el hueso. No es claro si el ultrasonido determina la calidad ósea, pero esto puede ser una ventaja de la técnica . Debido a q ue tiene movi lidad y un costo relativamente bajo , el ultrasonido es sujeto a utilizarse como un procedimiento de selección . Todas estas técn icas para medir BMD se han aprobado por la U. S. Food and Drug Ad ministration (FDA) en base a su capacid ad para predecir el riesgo de fractura. La cadera es el sitio preferido para med ir en la mayoría de los individuos, ya que determina di rectamente la masa ósea en un importante sitio de fractura. Cuando se llevan a cabo mediciones de cadera por DXA, la espina puede medirse al mismo tiempo. En individuos más jóvenes, tal como mujeres perimenopáusicas, las mediciones de espina pueden ser el indicador más sensible de pérdida ósea.

B. PROPIEDADES ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DE PÉPTIDOS PTH P El péptido relacionado con la hormona paratiroide (PTHrP), una proteína amino acida 140+ y los fragmentos de la misma reproducen las principales acciones biológicas de PTH. PTHrP se elabora mediante un número de tumores humanos y animales y otros tejidos y puede jugar un papel en la hipercalcemia de malignidad. El nucleótido y secuencias amino ácidas de hPTHrP-(1-36) se proporcionan en las SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente. La actividad biológica se asocia con la porción de terminal N.

La secuencia amino ácida del segmento de terminal N de PTHrP humano (hPTHrP) muestra una gran homología con el segmento de terminal N de diversas especies, como se ilustra en la figura 1. PTH y PTHrP, aunque productos distintivos de diferentes genes, exhiben una considerable homología funcional y estructural y pueden resultar de un gen ancestral compartido. Sin embargo, la estructura del gen para PTHrP human es más compleja que la de PTH, conteniendo múltiples exones y múltiples sitios para patrones de división alternos durante la formación del mARN. Los productos proteínicos de 141, 139 y 173 amino ácidos se producen y otras formas moleculares pueden resultar de la disociación específica de tejido en sitios de disociación interna accesibles. Los roles biológicos de estas diversas especies moleculares y la naturaleza de las formas circulantes de PTHrP no son claros. Es incierto si PTHrP circula en cualquier nivel significativo en adultos humanos normales; como un factor de paracrina, PTHrP puede producirse, actuar y destruirse localmente dentro de tejidos. En adultos, PTHrP parece tener poca influencia en homeostasis de calcio, excepto en estados de enfermedad, cuando grandes tumores, especialmente del tipo de célula escamosa, conducen a la sobreproducción masiva de la hormona. La homología de secuencia entre hPTH y hPTHrP es enormemente limitada a los 13 residuos de terminal N, 8 de los cuales son idénticos; solamente 1 de 10 amino ácidos en la región de unión a receptor (25-34) de hPTH se conserva en hPTHrP. La similitud conformacional puede sustentar la actividad común. Cohén et al. (J. Biol. Chem. 266: 1997-2004 (1991)) ha sugerido que mucha de la secuencia de PTH-(1-34) y PTHrP-(1 -34), en particular las regiones (5-18) y (21-34), supone una configuración a-helicoidal, mientras se observa que existe cierto cuestionamiento acerca de si esta configuración prevalece para el extremo de terminal carbóxilo bajo condiciones fisiológicas. Tal estructura secundaria puede ser importante para la interacción de lípidos, interacción receptora y/o estabilización estructural. El término "proteína relacionada con la hormona paratiroide" (PTHrP) abarca PTHrP naturalmente ocurrente, así como también PTHrP sintético o recombinante (PTHrP rec). Además, el término "proteína relacionada con la hormona paratiroide" abarca variantes alélicas, variantes de especies y variantes de sustitución amino ácida conservadoras. El término también abarca PTHrP-(1-36) de longitud completa, así como también fragmentos de PTHrP, incluyendo moléculas peptidoimitadoras pequeñas que tienen bioactividad similar a PTHrP, por ejemplo, en los ensayos descritos en la presente. Como con PTH, la actividad biológica de PTHrP se asocia con la porción de terminal N, con residuos (1-30) aparentemente al mínimo requerido. Por lo tanto, se entenderá que los fragmentos de las variantes de PTHrP, en cantidades que dan la actividad biológica equivalente a PTHrP-(1 -36), pueden utilizarse en los métodos de la invención si se desea. Los fragmentos de PTHrP incorporan al menos los residuos amino ácidos de PTHrP necesarios para una actividad biológica similar a la de PTHrP-(1-36) intacto. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen PTHrP-(1 -30), PTHrP-(1-31), PTHrP-(1-32), PTHrP-(1 -33),...PTHrP-(1 -139), PTHrP-(1-140) y PTHrP-(1-141). El término "proteína relacionada con la hormona paratiroide" también abarca variantes y análogos funcionales de PTHrP que tienen una secuencia amino ácida homologa con PTHrP-(1-36). La presente invención incluye así formulaciones farmacéuticas que comprenden tales variantes de PTHrP y análogos funcionales, que contienen modificaciones similares a sustituciones, omisiones, inserciones, inversiones o ciclizaciones, pero no obstante tienen substancialmente las actividades biológicas de la hormona paratiroide. De acuerdo con la presente invención, "secuencia amino ácida homologa" significa una secuencia amino ácida que difiere de una secuencia amino ácida mostrada en la SEQ ID NO: 2, por una o más sustituciones amino ácidas conservadoras o por una o más sustituciones amino ácidas no conservadoras, omisiones o adiciones localizadas en posiciones en las cuales no destruyen las actividades biológicas del polipéptido. Las sustituciones amino ácidas conservadoras típicamente incluyen sustituciones entre amino ácidos de la misma clase. Estas clases incluyen, por ejemplo, (a) amino ácidos que tienen cadenas laterales polares sin carga, tales como asparagina, glutamina, serlna, treonina, y tirosina; (b) amino ácidos que tienen cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; (c) amino ácidos que tienen cadenas laterales acídicas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y (d) amino ácidos que tienen cadenas laterales no polares, tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano, y cisteína. Preferentemente, tal secuencia es al menos 75%, preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90% y más preferentemente 95% de homología con la secuencia amino ácida en la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con la presente invención, las secuencias amino ácidas homologas incluyen secuencias que son idénticas o substancialmente idénticas a una secuencia amino ácida como se muestra en la SEQ ID NO: 2. Por "secuencia amino ácida substancialmente idéntica" se entiende una secuencia que es al menos 60%, preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 90% y más preferentemente 95% idéntica a una secuencia amino ácida de referencia. Preferentemente, la secuencia homologa difiere de la secuencia de referencia, si es del todo, por una mayoría de sustituciones amino ácidas conservadoras. El cálculo de % de homología y % de identidad se determina primero mediante la alineación de un polipéptido cand idato de PTHrP con la SEQ I D NO: 2, según se proporciona en la fig ura 1 . U na vez al ineados, el nú mero total de amino ácidos idénticos y/o el n úmero de variantes de sustitución amino ácidos conservadores compartidos entre el pol ipéptido candidato y la SEQ I D NO: 2 se cuentan. Para el cálculo de % de identidad, el número de amino ácidos idénticos entre el pol ipéptido candidato de PTHrP y la secuencia de referencia se divide entre el número total de amino ácidos en la secuencia de referencia y este número se multi pl ica por 100 a fin de obtener un valor porcentual. Para el cálculo dé % de homolog ía, el número total de amino ácidos idénticos y variantes de sustitución amino ácidos conservadores entre el pol ipéptido cand id ato de PTHrP y la secuencia de referencia se divide entre el n úmero total de amino ácidos en la secuencia de referencia y se multipl ica por 1 00 a fin de obtener un valor porcentual . La figu ra 1 proporciona una a li neación por homolog ía de PTHrP-( 1 -36) humano (SEQ ID NO: 2) con la secuencia correspondiente en otra especie, alineada para maximizar la id entidad amino ácida. Los amino ácidos en otras especies q ue d ifieren del amino ácido correspondiente en la secuencia humana se encuentran en negritas y los amino ácidos que son variantes de sustitución amino ácidas conservadoras de los amino ácidos correspondientes en la secuencia humana se encuentran en negritas y subrayados . Los va lores de % de identidad y % de homolog ía se proporcionan. Alternativamente, la homología puede medirse med ia nte el uso de software de análisis de secuencia (por ejemplo, Paquete de Software de Análisis de Secuencia del Genetics Computer Group, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, adison, Wl 53705). Las secuencias amino ácidas similares se alinean para obtener el máximo grado de homología (es decir, identidad). Para este fin, puede ser necesario introducir de manera artificial espacios en la secuencia. Una vez que se ha establecido la alineación óptima, se establece el grado de homología (es decir, identidad) mediante el registro de todas las posiciones en las cuales son idénticos los amino ácidos de ambas secuencias, con relación al número total de posiciones. Los factores de similitud incluyen tamaño, forma y carga eléctrica similares. Un método particularmente preferido para la determinación de similitudes amino ácidas es la matriz PAM250 descrita en Dayhoff et al., 5 ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE 345-352 (1978 & Suppl.), incorporado en la presente para referencia. Se calcula primero una puntuación de similitud en cuanto a la suma de puntuaciones de similitud amino ácida alineadas por par. Las inserciones y omisiones se ignoran con el propósito de homología e identidad porcentuales. De acuerdo con lo anterior, las penalidades de espacio no se utilizan en este cálculo. La puntuación en bruto se normaliza entonces mediante su división entre la media geométrica de las puntuaciones del compuesto candidato y la secuencia de referencia. La media geométrica es la raíz cuadrada del producto de estas puntuaciones. La puntuación en bruto normalizada es la homología porcentual. Los polipéptidos que tienen un homólogo de secuencia hacia de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOS: 1 o 2, incl uyen variantes alélicas naturalmente ocurrentes, así como también mutantes y varia ntes o cualq uier otra variante no naturalmente ocurrente q ue sea análoga en términos de actividad de formación ósea , respecto a un polipéptido q ue tiene una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO : 2. Una variante alélica es una forma alterna de un polipéptido que se caracteriza por tener una sustitución, omisión o ad ición de uno o más amino ácidos que no alteran substa ncia!mente la función biológica del polipéptido. Por "función biológica" se entiende la función del polipéptido en las células en las cuales ocurre de manera natu ral , i ncluso si la función no es necesaria para el desarrollo o supervivencia de las célu las. Por ejemplo, la función biológica de un poro es permiti r la entrada en las cél ulas de compuestos presentes en el med io extracel ular. U n polipéptido puede tener más de una función biológica. Las variantes alélicas son muy comunes en la naturaleza . La variación alélica puede reflejarse ig ualmente en el nivel pol inucleótido. Los polinucleótidos, por ejemplo, las moléculas de ADN , que codifican variantes alélicas pueden recuperarse fácilmente mediante amplificación por reacción en cadena de polimerasa ( PC R) del ADN genómico extra ído mediante métodos convencionales. Esto involucra el uso de ca rgas de inicio oligonucleótidas sintéticas que se compara n corriente arriba y corrie nte debajo de los extremos 5' y 3' del dominio codificador. Las cargas de inicio adecuadas pueden diseñarse de acuerdo con la información de secuencia nucleótida proporcionada en la SEQ I D NO: 1 . Típicamente , una carga de inicio puede consisti r en 1 0-40, preferentemente 15-25 nucleótidos. También puede ser ventajoso seleccionar cargas de inicio que contienen nucleótidos C y G en una proporción suficiente para asegurar la hibridización eficiente; por ejemplo, una cantidad de nucleótidos C y G de al menos 40%, preferentemente 50% de la cantidad total de nucleótidos. Los homólogos útiles que no ocurren de manera natural pueden diseñarse mediante el uso de métodos conocidos para la identificación de regiones de un péptido de PTHrP que es probable que sea tolerante a los cambios y/u omisiones de la secuencia amino ácida. Por ejemplo, las variantes modificadas o de estabilidad mejorada de PTHrP se conocen en la materia. Por ejemplo, Vickery et al., (J. Bone Miner. Res., 11: 1943-1951 (1996)) describió un análogo de PTHrP con una secuencia péptida, alfa-helicoidal, anfipática, modelo (MAP) sustituida en la región de terminal C de hPTHrP(1-34) y reportó que el análogo resultante, [ AP1-10J22-31 hPTHrP-(1 -34)NH2), tuvo mayor actividad anabólica que el péptido principal en ratas osteopénicas a las que se extirparon ovarios. Se han descrito otros análogos polipéptidos, sintéticos, biológicamente activos de PTH y PTHrP, en los cuales los residuos amino ácidos (22-31) se sustituyen con amino ácidos hidrofílicos y amino ácidos lipofílicos que forman una a-hélice anfipática. Ver, por ejemplo, las Patentes de E.U. Nos: 5,589,452; 5,693,616; 5,695,955; 5,798,225; 5,807,823; 5,821,225; 5,840,837; 5,874,086; y 6,051,686, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Estos homólogos y otros tales compuestos peptidoimitadores biológicamente activos son útiles en la creación de agonistas o antagonistas de molécula pequeña de PTHrP, PTH o péptidos TIP, según se expone en el Ejemplo 6. Los derivados polipéptidos que se codifican por polinucleótidos de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos, polipéptidos que tienen grandes omisiones internas derivadas de polipéptidos de longitud completa y proteínas de fusión. Los fragmentos polipéptidos de la invención pueden derivarse de un polipéptido que tiene un homólogo de secuencia respecto a cualquiera de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOS: 2-13, hasta el grado en que los fragmentos retienen las propiedades de formación ósea, substanciales, deseadas, del polipéptido principal. Un polinucleótido de la invención, que tiene una secuencia codificadora análoga, puede hibridizarse, preferentemente bajo condiciones estrictas, respecto a un polinucleótido que tiene una secuencia complementaria a la secuencia nucleótida en la SEQ ID NO: 1. Los procedimientos de hibridización se describen en, por ejemplo, Ausubel eí al., CU RENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons Inc. (1994); Silhavy et al., EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1984); Davis et al., A MANUAL FOR GENETIC ENGINEERING: ADVANCED BACTERIAL GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1980), cada una incorporada en la presente para referencia. Los parámetros importantes que pueden considerarse en la optimización de condiciones de hibridización se reflejan en una fórmula que permite el cálculo de un valor crítico, la temperatura de fusión por encima de la cual dos filamentos de ADN complementarios se separan entre sí. Casey y Davidson, Nucí. Acid Res. 4: 1539 (1997). Esta fórmula es la siguiente: Tm = 81 .5 + 0.5 x (% G + C) + 1 .6 log (concentración iónica positiva) - 0.6 x (% formamida). Bajo condiciones estrictas adecuadas, la temperatura de hibridización (Th) es de aproximadamente 20-40°C , 20-25°C o, preferentemente, 30-40°C por debajo de la Tm calculada. Aq uellos expertos en la materia comprenderán que la temperatura óptima y las condiciones de sal pueden determinarse fácilmente de manera empírica en los experimentos preliminares mediante el uso de procedimientos convencionales. Por ejemplo, las cond iciones estrictas puede log rarse , tanto para pre-hi bridización como también incubaciones por hi brid ización , (i) dentro de 4- 1 6 horas a 42°C, en 6xSSC q ue contiene 50% de formamida o (ii) dentro de 4- 16 horas a 65°C en una solución acuosa de 6xSSC ( 1 M de NaCI, 0.1 M de citrato de sodio (pH 7.0)). Para los polinucleótidos que contienen 30 hasta 600 nucleótidos, la fórmula anterior se utiliza y después se corrige mediante substracción (600/tamaño polinucleótido en pares base). Las cond iciones estrictas se definen por una Th q ue se encuentra 5 hasta 1 0°C por debajo de la Tm. Las cond iciones de hibrid ización con ol igonucleótidos más cortos que 20-30 bases no siguen exactamente las reg las arriba establecidas. En tales casos, la fórmula para calcular la Tm es la siguiente: Tm = 4 x (G + C) + 2 (A+T) Por ejemplo, un fragmento de 18 nucleótidos de 50% G+C tendría una Tm aproximada de 54°C. En consecuencia, los métodos de la presente invención incluyen el uso de un péptido de PTHrP seleccionado a partir del grupo que consiste en: (a) PTHrP de longitud completa; (b) variantes biológicamente activas de PTHrP de longitud completa; (c) fragmentos de PTHrP biológicamente activos; (d) variantes biológicamente activas de fragmentos de PTHrP; (e) variantes biológicamente activas que tienen al menos 75% de homología con la SEQ ID NO: 2; (f) variantes biológicamente activas que tienen al menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 2; y (g) variantes biológicamente activas, codificadas por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones estrictas respecto a una secuencia de ácido nucleico complementaria de la SEQ ID NO: 1. PTHrP incluye, pero sin limitarse, PTHrP humano (hPTHrP), PTHrP bovino (bPTHrP) y PTHrp de rata (rPTHrp). Un análogo de PTHrP es un péptido el cual es un análogo o fragmento estructural (preferentemente, un fragmento de terminal N que contiene 50 o menos amino ácidos) de un PTHrP naturalmente ocurrente y, como el PTHrP, capaz también de unirse a receptor de PTH y estimular la actividad de ciclasa de adenilato, promoviendo así la formación ósea. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero sin limitarse, PTHrP-(1-30), PTHrP-(1 -32), PTHrP-(1-33),...PTHrP(1-139, PTHrP-(1 -140), y PTHrP-(1 -141 ). Las siguientes publicaciones exponen las secuencias de péptidos de PTHrP: Yasuda et al., J. Biol. Chem. 264: 7720-7725 (1989); Schermer, J. Bone & Min. Res. 6: 149-155 (1991); y Burtis, Clin. Chem. 38: 2171-2183 (1992). Pueden encontrarse más ejemplos en las siguientes publicaciones: Solicitud Alemana 4203040 A1 (1993); Solicitud de PCT 94/01460 (1994); Solicitud de PCT 94/02510 (1994); Solicitud de EP 477885 A2 (1992); Solicitud de EP 561412 A1 (1993); Solicitud de PCT 93/20203 (1993); Patente de E.U. No. 4,771,124 (1988); Solicitud de PCT 92/11286 (1992); Solicitud de PCT 93/06846 (1993); Solicitud de PCT 92/10515 (1992); Patente de E.U. No. 4,656,250 (1987); Solicitud de EP 293158 A2 (1988); Solicitud de PCT 94/03201 (1994); Solicitud de EP 451,867 A1 (1991); Patente de E.U. No. 5,229,489 (1993); y Solicitud de PCT 92/00753 (1992). PTHrP ejerce importantes influencias de desarrollo en el desarrollo óseo fetal y en la fisiología en adultos. Un golpe decisivo homocigoso del gen de PTHrP (o el gen para el receptor de PTH) en ratones origina una deformidad letal en la cual los animales nacen con severas deformidades esqueléticas que parecen condrodisplasia. Muchos diferentes tipos de células producen PTHrP, incluyendo el cerebro, páncreas, corazón, pulmón, tejido mamario, placenta, células endoteliales, y músculo suave. En animales fetales, el PTHrP dirige la transferencia de calcio a través de la placenta y se producen concentraciones elevadas de PTHrP en tejido mamario y se segrega en la leche. La leche humana y bovina, por ejemplo, contiene concentraciones muy elevadas de la hormona; la importancia biológica de la última se desconoce. El PTHrP también puede jugar un papel en la contracción del útero y otras funciones biológicas , acla rándose aún en otros sitios de tejido.

Acciones Biológicas de PTHRP Debido a que el PTHrP comparte u na homolog ía importa nte con PTH en el término amino crítico, se une a y activa el receptor de PTH/PTHrP, con efectos muy similares a aq uellos observados con PTH . Sin embargo, PTHrP, no PTH , parece ser el regulador fisiológico predominante de la masa ósea, siendo PTHrP esencial para el desarrol lo de la masa ósea total. Demostrando esto, las estrategias de i mpacto genético condicionales, que emplean ratones en los cuales el gen de PTHrP se i nterrumpió en osteoblastos, evitaron la producción de PTH rP de manera local dentro del hueso adulto, pero lo cual tuvo n iveles normales de PTH en el hueso adulto. El PTHrP ausente y estos ratones desarrollaron osteoporosis , demostrando que PTHrP derivado de osteoblasto ejerce efectos anabólicos en hueso mediante la promoción de la función de osteoblastos. Ver, Karaplis, A. C. "El Impacto Cond icional de PTHrP en Osteoblastos Conduce a Osteoporosis Prematura". Resumen 1052, Annual eeting of the American Society for Bone and Mineral Research, Septiembre 2002, San Antonio, TX. J Bone Mineral Res, Vol 17 (Suppl 1 ), pp S 138 , 2002, incorporado para referencia . Estos hal lazgos ind ican que PTHrP, y no PTH , es el reg ulador normal más i mportante de la masa ósea bajo condiciones fisiológicas normales y q ue el tratamiento con PTH para la osteoporosis , aunque eficaz, sirve solamente como un subrogado de PTHrP, el auténtico regulador de masa ósea. El receptor de PTH/PTHrP de 500 amino ácidos (también conocido como el receptor de PTH 1 ) pertenece a u na sub-familia de GCPR que incluye aquellos para glucagon , secretina y péptido intestinal vasoactivo. Las regiones extracelulares se involucran en la un ión de hormonas, y los dominios intracelulares, después de la activación de hormonas, se unen a sub-unidades de proteína G a fin de transd ucir la señalización de hormonas hacia respuestas celulares a través de la estimulación de seg undos mensajeros . Un segundo receptor de PTH (receptor de PTH2) se expresa en el cerebro, páncreas y varios otros tejidos. Su secuencia amino ácida y el patrón de su unión y respuesta estimuladora a PTH y PTH rP d ifieren de aquellas del receptor de PTH 1 . El receptor de PTH/PTHrP responde de igual manera a PTH y a PTH rP, mientras q ue el receptor de PTH2 responde solamente a PTH . El ligando endógeno de este receptor parece ser un péptido-39 o TIP-39, infundibular, tubular. La importancia fisiológ ica del sistema receptor de PTH2-TI P-39 permanece por definirse . Recientemente, se ha caracterizado u n péptido hipotalámico de 39 amino ácidos, péptido infundibular tubular (TIP-39) y es probablemente un ligando natural del receptor de PTH2. Los receptores de PTH 1 y PTH2 pueden rastrearse hacia atrás en tiempo evolutivo respecto a pez. Los receptores PTH 1 y PTH2 del pez cebra exhiben las mismas respuestas selectivas a PTH y PTHrP q ue los receptores humanos de PTH 1 y PTH2. La conservación evolutiva de la estructura y función sugiere papeles biológicos únicos para estos receptores. Las proteínas G de la clase Gs enlazan el receptor de PTH/PTHrP a ciclasa de adenilato, una enzima que genera AMP cíclico, conduciendo a la activación de q uinasa de proteína A. El acoplamiento a prote ína G de la clase Gq enlaza la acción hormonal a fosfol ipasa C, una enzima que genera fosfatos de inositol (por ejemplo, I P3) y DAG, conduciendo a la activación de quinasa de proteína C y liberación de calcio ¡ntracelular. Los estudios q ue utilizan el receptor clonado de PTH/PTHrP confirman que puede acoplarse a más de una proteína G y una trayectoria de quinasa de segundo mensajero, explicando aparentemente la capacidad de reproducción de las trayectorias esti muladas por PTH y PTHrP . Las respuestas de segundo mensajero, ca racterizadas de manera incompleta, (por ejemplo, activación de quinasa MAP ) pueden ser independientes de fosfolipasa C o estimu lación de ciclasa de aden ilato (s in embargo, la última es la más fuerte y trayectoria de señalización de segundo mensajero mejor caracterizada para PTH y PTH rP). Se desconocen los detalles de las etapas bioqu ímicas mediante las cuales una concentración ¡ntracelular incrementada de AMP cíclico, IP3, DAG y Ca2+ ¡ntracelular conducen a cambios finales en ca lcio en ECF y translocación iónica de fosfato o función celular ósea. La estimulación de las q uinasas de prote ína (A y C) y el transporte de calcio ¡ntracelular se asocian con una variedad de respuestas de tejido específicas de hormona . Estas respuestas incluyen la inhibición de transporte de fosfato y bicarbonato, estimulación del transporte de calcio y activación de la 1 a-hidroxilasa renal en el riñon. Las respuestas en hueso incluyen efectos sobre síntesis de colágeno; fosfatas alcalina incrementada, decarboxilasa de ornitina, decarboxilasa de citrato y actividades de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato; síntesis de ADN, proteína y fosfolípidos; transporte de calcio y fosfato; y liberación de citosina local/factor de crecimiento. Finalmente, estos eventos bioquímicos conducen a una respuesta hormonal integrada en el trastorno óseo y la homeostasis de calcio.

C. OTROS AGENTES ANABÓLICOS Otros agentes proporcionan efectos anabólicos, similares a aquellos demostrados por PTHrP, por ejemplo, PTH y TIP. Las composiciones de PTH y TIP y sus usos son similares a aquellos para PTHrP expuestos en la presente. Estos agentes anabólicos esqueléticos, PTH y TIP, o análogos de los mismos, incrementan la masa ósea en un paciente humano en necesidad de los mismos, cuando se administran a dicho paciente en una dosis de entre 10 y 3,000 µg/día durante un periodo de 1-36 meses. En modalidades alternativas, la dosis es preferentemente de 50-1,000 µg/día, más preferentemente de 50-500 µg día. En todavía otras modalidades alternativas, el periodo de administración es preferentemente de 12, 15 o 18 meses, más preferentemente de 7, 8, 9, 10 u 11 meses y más preferentemente de 1, 2, 3, 4, 5, o 6 meses. El incremento en la masa ósea puede monitorearse mediante los ensayos descritos en la presente. Estos agentes anabólicos esqueléticos pueden combinarse con PTHrP. Se describen a continuación.

Péptidos PTH PTH es un péptido de cadena individual de 84 amino ácidos. La secuencia amino ácida de PTH se ha caracterizado en múltiples especies mamíferas, revelando la notable conservación en la porción de terminal amino, lo cual es crítico para muchas acciones biológicas de la molécula. La actividad biológica se asocia con la porción de terminal N, requiriéndose aparentemente como mínimo los residuos (1-29). El segmento de terminal N de PTH humano (hPTH) difiere del segmento de terminal N de las hormonas bovina (bPTH) y porcina (pPTH) en solamente tres y dos residuos amino ácidos, respectivamente. El PTH se sintetiza ¡nicialmente como una molécula mayor (hormona preproparatiroide, que consiste en 115 amino ácidos), la cual se reduce después de tamaño mediante disociación de péptido de señal (hormona proparatiroide, 90 amino ácidos) y después una segunda disociación de prohormona antes de la secreción como un péptido de 84 amino ácidos. Las regiones hidrofóbicas de la hormona preproparatiroide sirven a un papel en la guía del transporte del polipéptido desde sitios de síntesis en poliribosomas a través del retículo endoplásmico respecto a gránulos segregadores. Los fragmentos sintéticos sustituidos, modificados de la secuencia de terminal amino, tan pequeños como 1-14 residuos, son suficientes para activar el receptor principal. Los papeles biológicos para la región de terminal carbóxila de PTH (por ejemplo, 35-84) se encuentran en investigación; puede existir un receptor o receptores separados para esta región de la molécula. Los fragmentos acortados o modificados en el término amino aún se unen al receptor de PTH pero pierden la capacidad de estimular respuestas biológicas. Por ejemplo, el péptido compuesto de la secuencia 7-34 es un inhibidor competitivo de unión hormonal activa a receptores in vitro pero es un inhibidor débil in vivo. El término "hormona paratiroide" (PTH) abarca PTH naturalmente ocurrente, así como también PTH sintético o recombinante (PTH rec). Además, el término "hormona paratiroide" abarca variantes alélicas, variantes de especies y variantes de sustitución amino ácida conservadoras. El término también abarca PTH-(1-84) de longitud completa, así como también fragmentos de PTH. Se entenderá por lo tanto que los fragmentos de variantes de PTH, en cantidades que dan actividad biológica equivalente a PTH-(1-84), pueden utilizarse en los métodos de la invención, si se desea. Los fragmentos de PTH incorporan al menos los residuos amino ácidos de PTH necesarios para una actividad biológica similar a la del PTH intacto. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen: PTH-(1-29), PTH-(1-30), PTH-(1-31), PTH-(1-32), PTH-(1-33), PTH-(1-34), PTH-(1-80), PTH-(1-81), PTH-(1-82), PTH-(1-83) y PTH-(1-84). El término "hormona paratiroide" también abarca variantes y análogos funcionales de PTH teniendo una secuencia amino ácida homologa con PTH-(1-34). La presente invención incluye, por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas que comprenden tales variantes de PTH y análogos funcionales, portando modificaciones como sustituciones, omisiones, inserciones, inversiones o ciclizaciones, pero teniendo, no obstante, substancialmente las actividades biológicas de la hormona paratiroide. Se conocen variantes de PTH estabilidad mejorada en la materia, por ejemplo, WO 92/11286 y WO 93/20203, cada una incorporada en la presente para referencia. Las variantes de PTH pueden incorporar, por ejemplo, sustituciones amino ácidas que mejoran la estabilidad de PTH y la vida útil en depósito, tal como el reemplazo de los residuos de metionina en las posiciones 8 y/o 18 y el reemplazo de asparagina en la posición 16. Los análogos de PTH ciclados se exponen en, por ejemplo, WO 98/05683, incorporada en la presente para referencia. El término "hormona paratiroide" también abarca análogos sustituidos por amino ácidos que utilizan la estructura de PTH-(1-11) o PTH-(1-14). Shimizu et al., J Biol Chem., 276: 49003-49012 (2001); Shimizu et al., Endocrinology 42: 3068-3074 (2001); Cárter y Gardella, Biochim Biophys Acta 1538: 290-304 (2001); Shimizu et al., J Biol Chem, 275: 21836-21843 (2000), cada uno incorporado en la presente para referencia. La figura 2 proporciona uñi alineación por homología de la secuencia de referencia, PTH-(1-34) humano (SEQ ID NO: 15), con la secuencia correspondiente en otras especies, alineada para maximizar la identidad amino ácida. "Secuencia amino acida homologa" significa una secuencia amino ácida que difiere de una secuencia amino ácida mostrada en la SEQ ID NO: 15, por una o más sustituciones amino ácidas conservadoras o por una o más sustituciones amino ácidas no conservadoras, omisiones o adiciones localizadas en posiciones en las cuales no destruyen las actividades biológicas del péptido. Preferentemente, tal secuencia es al menos 75%, preferentemente 80%, más preferentemente 85% , más preferentemente 90% y más preferentemente 95% homóloga a la secuencia amino ácida en la SEQ I D NO: 2. Las secuencias amino ácidas homologas también incluyen secuencias q ue son idénticas o substancia lmente idéntica a una secuencia amino ácida según se muestra en la SEQ ID NO: 1 5. Por "secuencia amino ácida substancialmente idéntica" se entiende una secuencia q ue es al menos 60%, preferentemente 70% , más preferentemente 80%, más preferentemente 90% y más preferentemente 95% idéntica a u na secuencia amino ácida de referencia. Preferentemente , la secuencia homóloga difiere de la secuencia de referencia , si es del todo, en u na mayoría de sustituciones amino ácidas conservadoras. Los péptidos de PTH útiles en los métodos de la presente invención incluyen el uso de un péptido de PTH seleccionado a partir del grupo q ue consiste en: (a) hormona paratiroide de longitud completa ; (b) variantes biológicamente activas de hormona paratiroide de longitud completa; (c) fragmentos de hormona paratiroide biológicamente activos; (d ) variantes biológicamente activas de frag mentos de hormona paratiroide ; (e) variantes biológicamente activas q ue tienen al menos 75% de homolog ía con la SEQ I D NO: 1 5 ; (f) variantes biológicamente activas q ue tienen al menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 1 5; y (g) variantes biológicamente activas, codificadas por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones estrictas respecto a una secuencia de ácido nucleico complementaria de la SEQ ID NO: 14.

Péptidos TIP Recientemente, un péptido hipotalámico de 39 amino ácidos, péptido infundibular tubular (TIP-39), se ha caracterizado y es probablemente un ligando natural del receptor de PTH2. De acuerdo con lo anterior, TIP-39 y los fragmentos biológicamente activos del mismo pueden utilizarse en los métodos de la presente invención. El término "péptido infundibular tubular" abarca TIP naturalmente ocurrente, así como también TIP sintética o recombinante (TIP rec). Además, el término "péptido infundibular tubular" abarca variantes alélicas, variantes de especies y variantes de sustitución amino ácida conservadora. El término también abarca TIP-(1 -39) de longitud completa, así como también fragmentos de TI P. Se entenderá entonces que los fragmentos de variantes TIP, en cantidades que dan actividad biológica equivalente a TIP-(1 -39), pueden utilizarse en los métodos de la invención, si se desea. Los fragmentos de TI P incorporan al menos los residuos amino ácidos de TIP necesarios para una actividad biológica similar a la de TIP-( 1 .39) intacto. Los ejemplos de tales fragmentos son TIP-(1 .29), TIP-0-30), TIP-(1 -31 ),... TIP-(1 -37), TIP-(1 -38) y TIP-(1 -39). El término "péptido infundibular tubular" también abarca variantes y análogos funcionales de TIP que tienen una secuencia amino ácida homologa con TIP-(1 .39). La presente invención i ncluye, por lo tanto, formulaciones farmacéuticas que comprenden tales variantes de TI P y análogos funcionales, que contienen modificaciones como sustituciones, omisiones , inserciones , inversiones o ciclizaciones , pero, no obsta nte, tienen substancialmente las actividades biológicas de TI P-(1 -39). El cálculo de % de homología y % de identidad se determinan mediante la alineación primero de un pol ipéptido TI P candidato con la SEQ ID NO: 26, según se proporciona en la figu ra 3. "Secuencia amino ácida homologa" significa una secuencia amino ácida que d ifiere de una secuencia amino ácida mostrada en la SEQ I D NO: 1 5 , por una o más sustituciones amino acidas conservadoras o por una o más sustituciones amino acidas no conservadoras, omisiones o adiciones localizadas en posiciones en las cuales no destruyen las actividades biológicas del polipéptido. Preferentemente, tal secuencia es al menos 75% , preferentemente 80%, más preferentemente 85% , más preferentemente 90% y más preferentemente 95% homologa a la secuencia amino ácida en la SEQ ID NO : 26. Las secuencias amino ácidas homologas también incluyen secuencias que son idénticas o substa ncial mente idénticas a una secuencia amino ácida seg ún se muestra en la SEQ ID NO: 26. Por " secuencia amino ácida substa ncialmente idéntica" se entiende una secuencia q ue es al menos 60%, preferentemente 70% , más preferentemente 80% , más preferentemente 90% y más preferentemente 95% idéntica a una secuencia amino ácida de referencia. Preferentemente, la secuencia homologa difiere de la secuencia de referencia, si es del todo, por una mayoría de sustituciones amino ácidas conservadoras. Los métodos de la presente invención incluyen el uso de un péptido TIP seleccionado a partir del grupo que consiste en: (a) TIP de longitud completa; (b) variantes biológicamente activas de TIP de longitud completa; (c) fragmentos de TIP biológicamente activos; (d) variantes biológicamente activas de fragmentos de TIP; (e) variantes biológicamente activas que tienen al menos 75% de homología con la SEQ ID NO: 26; (f) variantes biológicamente activas que tienen al menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 26; y (g) variantes biológicamente activas, codificadas por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones estrictas respecto a una secuencia de ácido nucleico complementaria de la SEQ ID NO: 25.

D. FORMULACIONES Y MÉTODOS DE TRATAMIENTO Las composiciones de la presente invención (es decir, péptido PTHrP y los agentes anabólicos esqueléticos arriba descritos) pueden administrarse de manera intermitente por cualquier ruta que sea compatible con las moléculas en particular y, cuando se incluye, con el agente de inhibición de resorción ósea en particular. Por lo tanto, según lo adecuado, la administración puede ser oral o parenteral, incluyendo las rutas de administración subcutánea, intravenosa, inhalación, nasal e intraperitoneal. Además, la administración intermitente puede ser mediante inyecciones periódicas de un bolo de la composición una vez al d ía, una vez cada dos días, una vez cada tres d ías, una vez a la semana, dos veces por semana, una vez a la quincena, dos veces al mes y una vez al mes. Las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden proporcionarse a un individuo mediante cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, localmente, como mediante inyección, implantación o administración tópica a un sitio de tejido) o de manera sistémica (por ejemplo, de manera parenteral u oral). Cuando la composición está por proporcionarse de manera parenteral, tal como mediante administración intravenosa, subcutánea, intramolecular, oftálmica, intraperitoneal , intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, íntracisternal, intracapsular, intranasal o mediante aerosol, la composición preferentemente comprende parte de una suspensión fluida o solución acuosa o fisiológicamente compatible. Por lo tanto, el transporte o vehículo es fisiológicamente aceptable a fin de que además de suministrar la composición deseada al paciente, no afecta de otro modo negativamente los electrolitos del paciente y/o el equilibrio de volumen. El medio fluido para el agente puede comprometer así la solución salina fisiológica normal (por ejemplo, 0.9% NaCI acuoso, 0.15 M, pH 7-7.4). Alternativamente, el uso de administración pulsátil del fármaco anabólico esquelético mediante mini-bombeo puede emplearse en los métodos de la presente invención. Las soluciones útiles para administración parenteral pueden prepararse mediante cualq uiera de los métodos muy conocidos en la materia farmacéutica , descritos, por ejemplo, en REM I N GTON'S PHARMACEUTICAL SC I ENCES (Gennaro, A. ed . ), Mack Pub. , 1 990. Las formulaciones de los agentes terapéuticos de la invención pueden incluir, por ejemplo, glicoles de polialquileno tales como g licol de polietileno, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y lo similar. Las formulaciones para administración directa, en particular, pueden incluir g licerol y otras composiciones de alta viscosidad para ayudar a mantener el agente en el sitio deseado. Los pol ímeros biocompatibles, preferentemente bioresorbibles, que incluyen , por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, fosfato de tricalcio, polibutirato, láctido y pol ímeros glicólidos y copolímeros láctidos/glicólidos, pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación del agente in vivo. Otros sistemas de suministro parenterales potencialmente úti les para estos agentes incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión ¡mplantables y li posomas. Las formulaciones para administración por inha lación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa , o pueden ser soluciones acuosas q ue contienen , por ejemplo, éter de polioxietileno-9-laurilo, glicocolato y deoxicolato, o soluciones aceitosas para admin istración en la forma de gotas nasales o como un gel para aplicarse de manera ¡ntranasa l. Las formulaciones para administración parentera l también pueden incluir glicocolato para admin istración bucal, metoxisalicilato para administración rectal , o ácido cútrico para administración vagi nal. Los supositorios para administración rectal también pueden prepararse mediante mezcla del péptido de PTHrP (solo o en combinación con un agente inhibidor de resorción ósea) con un excipiente no irritante tal como manteca de cacao u otras composiciones que son sólidas a temperatura ambiente y líquidas a temperaturas corporales. Las formulaciones para administración tópica en la superficie de la piel pueden prepararse mediante dispersión de la molécula capaz de liberar el péptido de PTHrP (solo o en combinación con un agente inhibidor de resorción ósea, o un agente anabólico) con un vehículo dermatológicamente aceptable tal como una loción, crema, ungüento o jabón . Son particularmente útiles los vehículos capaces de formar una película o capa sobre la piel a fin de localizar la aplicación e inhibir el retiro. Para administración tópica en superficies de tejido interno, el agente puede dispersarse en un adhesivo de tejido l íquido u otra substancia que se sepa mejora la adsorción en una superficie de tejido. Por ejemplo, hidroxipropilcelulosa o soluciones de fibrinógeno/trombina pueden utilizarse para tomar ventaja. Alternativamente, pueden utilizase las soluciones de cubierta de tejido, tales como formulaciones que contienen pectina. El método de tratamiento puede constituir un solo periodo de administración intermitente de un fármaco anabólico esquelético (por ejemplo, durante un periodo de tiempo que varía entre 1 -3 meses hasta 1 5-18 meses). El periodo de administración es preferentemente de 12, 15 o 18 meses, más preferentemente de 7, 8, 9, 10 u 1 1 meses y más preferentemente de 1 , 2, 3, 4, 5, o 6 meses. Alternativamente, en otra modalidad, el método de tratamiento puede constituir una serie de periodos de administración seguidos por periodos sin administración (por ejemplo, periodos secuencias de tres meses de administración intermitente de un fármaco anabólico esquelético y tres meses de no administración). Los periodos de tratamiento secuenciales pueden repetirse hasta que el BMD del paciente se restaure (por ejemplo, una puntuación T de <-2.0 o -2.5 por debajo de la media o preferentemente de <-1 .0 por debajo de la media). En todavía otra modalidad, el método de tratamiento incluye además la etapa de co-administrar, ya sea de manera simultánea o secuencial a dicho paciente, un agente inhibidor de resorción ósea. El agente inhibidor de resorción ósea puede ser un bisfosfonaro, estrógeno, un modulador receptor de estrógeno selectivo, un modulador receptor de andrógeno selectivo, calcitonina, un análogo de vitamina D o una sal de calcio. El agente inhibidor de resorción ósea también puede ser alendronato, risedronato, etidronato, pamidronato, tiludronato, ácido zoledrónico, raloxifeno, tamoxifeno, droloxifeno, toremifeno, idoxifeno, levormeloxifeno o estrógenos conjugados. En una modalidad , el paciente recibe la administración intermitente del fármaco anabólico esquelético durante un periodo de tiempo, seguido por un periodo de tratamiento con un agente inhibidor de resorción ósea, ya sea solo o en combinación con el fármaco anabólico esquelético. En una modalidad actualmente preferida, un agente anabólico tal como PTHrP se administra primero, por ejemplo, durante un periodo de tres meses o más, seguido por administración de un agente anti-resorptivo ya sea solo o en combinación con el fármaco anabólico esquelético, por ejemplo, durante un periodo adicional de tres meses o más. Sin limitarse a la teoría, la administración inversa, es decir, el otorgar el agente anti-resorptivo antes de la admin istración del agente anabólico, d isminuye la eficacia del agente anabólico. No obstante, de acuerdo con la presente invención, los agentes anabólicos tales como PTHrP deben ser los terapéuticos de osteoporosis pri marios, con antiresorptivos uti lizados posteriormente para mantener y mejorar los efectos de PTHrP/PTH/TIP y, por ejemplo, el estrógeno o bisfosfonatos de osteoporosis admin istrados como agentes de segunda línea después de los anabólicos. Sin embargo, un técnico experto reconocerá q ue el rég imen de tratamiento secuencial podría iniciarse con un periodo de tratamiento con un agente in hibidor de resorción ósea segu ido por un periodo de tratamiento con el fármaco anabólico esquelético, que la longitud de los periodos de tratamiento secuenciales puede modificarse (por ejemplo, 1 - 1 8 meses) y q ue el fármaco anabólico esq uelético puede co-admin istrarse con el agente i nhibidor de resorción ósea (por ejemplo , periodo de tratamiento secuencia de un fármaco anabólico esq uelético y un agente inh ibidor de resorción ósea seguido por un periodo de tratamiento de un agente inhibidor de resorción ósea solo). N uevamente, según se establece arriba , los periodos de tratamiento secuenciales (por ejemplo, tres meses del fármaco anabólico esq uelético segu idos por tres meses del agente inhibidor de resorción ósea) pueden repetirse hasta que se restaure la BMD del paciente (por ejemplo, una puntuación T de <-2.0 o -2.5 por debajo de la media o preferentemente <-1 .0 por debajo de la med ia). Los agentes anabólicos esqueléticos se cree comúnmente que demuestran numerosos efectos secundarios adversos y, como resultado, la dosis y administración de estos agentes se controla cuidadosamente y el paciente se monitorea cuidadosamente respecto a u na emergencia de efectos secundarios indeseados. Por ejemplo, PTH rP se consideró originalmente el responsable de la mayoría de los casos de hipercalcemia de malignidad , un síndrome q ue se parece al hiperparatiroidismo, con un perfil de toxicidad que se cree similar o incluso mayor al de PTH. Sin embargo, los perfiles de toxicidad de otros agentes anaból icos esqueléticos no parecen ser apl icables a PTHrP . Los hallazgos de la presente invención indican que a pesar de administrarse en dosis , por ejemplo, al menos 20 veces mayores que aquellas consideradas seguras para PTH, PTHrP no origi na efectos secundarios importantes. Por ejemplo, las dosis intermitentes de PTHrP de aproximadamente 50 microgramos hasta aproximadamente 400 microgramos dadas de manera subcutánea (Q2H durante 8 horas después de una dosis), no parece originar hipercalcemia. De hecho, la administración de PTHrP nu nca se ha observado que origi ne hipercalcemia en ning una dosis dada aú n, tales como dosis q ue exceden los 450 microgramos . Las dosis terapéuticas de hasta 1 miligramo son seguras y eficaces y, en ciertos casos, las dosis de 3 miligramos o mayores son también posibles dado el mon itoreo adecuado del paciente. Espec íficamente, no existen ejemplos del desarrollo de hipercalcemia (definida en los estudios descritos en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo 5 como un calcio en suero por encima de 9.9 mg/dl , una defin ición muy conservadora de hipercalcemia) en 18 pacientes tratados con PTHrP a pesar de las mayores dosis comparativamente empleadas. Esto contrasta con el estudio de Neer, et al. que demuestra una incidencia de 1 1 % de hipercalcemia reportada entre pacientes tratados con PTH en la dosis de 20 microgramos y una incidencia de 28% de hipercalcemia reportada entre pacientes q ue recibieron la dosis de 40 microg ramos. De manera interesante, Neer, et al. definieron la hipercalcemia como un calcio en suero mayor de 1 0.6 mg/d l. El recálculo de los resultados del estudio de Neer, et al. utilizando el criterio más riguroso de 9.9 mg/dl para hipercalcemia descrito en la presente, da ría como resultado u na incidencia de hipercalcemia mucho mayor en el estudio de Neer, et al. Otros investigadores se han visto incluso más severos respecto a hiperca lcemia; de hasta 1 5 mg/dl, lo cual es casi letal, utilizando PTH ( 1 -84) a dosis de aproximadamente 40 microgramos. Por lo tanto, PTH rP ofrece muchas ventajas sobre PTH como un terapéutico. Es un agente esquelético anabólico puro q ue no es hipercalcémico y no tiene otros efectos adversos aún cuando se administre en las dosis comparativamente mayores exploradas a la fecha . En segundo lugar, parece basta nte más eficaz q ue PTH en el i ncremento de la densidad de masa ósea . En tercer l ugar, es más estable que PTH . En cuarto lugar, es notablemente diferente y un farmacocinético más favorable que PTH . En quinto lugar, es responsable de mantener la masa ósea en adultos, en contraste con PTH , el cual no se req uiere para mantener la masa ósea. En sexto lugar, puede lograr puntos finales terapéuticos en estructuras de tiempo más cortas y por lo tanto es más seguro para administración en humanos, por ejemplo, el uso durante solo 3-9 meses puede lograr efectos dramáticos en BMD sin cruzar el umbral de osteosarcoma de 12 meses.

E. BIOENSAYO DE EFICACIA ANABÓLICA DE ANÁLOGOS DE PTHRP La síntesis, selección y uso de PTHrP p análogos del mismo y otros agentes anabólicos, que son capaces de promover la formación ósea, se encuentran dentro de la habilidad de una persona de experiencia ordinaria en la materia. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos in vitro o in vivo muy conocidos para determinar la eficacia de diversos análogos de PTHrP candidatos a fin de promover la formación ósea en pacientes humanos. Para los ensayos de unión in vitro, pueden utilizarse las células similares a osteoblastos que son líneas celulares permanentes con características osteoblásticas y poseen receptores para PTHrP de origen ya sea de rata o humano. Las células similares a osteoblastos adecuadas incluyen ROS 17/2 (Jouishomme et al., Endocrinology, 130: 53-60 (1992)), UMR 106 (Fujimori et al., Endocrinology, 130: 29-60 (1992)) y SaOS-2 derivado de humano (Fukuyama et al., Endocrinology, 131: 1757-1769 (1992)). Las líneas celulares se encuentran disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Md., y pueden mantenerse en medio de crecimiento específico estándar. Adicionalmente, las células de riñon embriónicas, humanas, transfectadas (HEK 293) que expresan receptores de PTH1 o PTH2 humano también pueden utilizarse para ensayos de unión in vitro. Ver, Pines et al., Endocrinology, 135: 1713-1716 (1994). Para ensayos funcionales in vitro, las actividades análogas similares a PTHrP de los fragmentos péptidos o derivados de PTHrP pueden examinarse mediante contacto de un rango de concentración del compuesto de prueba con las células en cultivo y determinación de la estimulación de la activación de segundas moléculas mensajeras acopladas a los receptores, por ejemplo, la estimulación de acumulación de AMP cíclico en la célula o un incremento en la actividad enzimática de la quinasa de proteína C, ambas cuales se monitorean fácilmente mediante ensayos convencionales. Ver, Jouishomme et al., Endocrinology, 130: 53-60 (1992); Abou-Samra et al., Endocrinology, 125: 2594-2599 (1989); Fujimori ef al., Endocrinology, 128: 3032-3039 (1991); y Pines et al., Endocrinology, 135: 1713-1716 (1994). Otros parámetros de la acción de PTH incluyen el incremento en el calcio citosólico y fosfoinositoles y la biosíntesis de colágeno, osteocalcina y alteración en la actividad de fosfatasa alcalina. Las actividades agonistas de los subfragmentos de PTH se han analizado exitosamente medíante contacto de péptidos con células de riñon de rata en cultivo y la determinación de la acumulación de AMP cíclico (Blind ef al., Clin. Endocrinol., 101: 150-155 (1993)) y la estimulación de la producción de 1 ,25-dehidroxivitamina D3 (Janulis et al., Endocrinology, 133: 713-719 (1993)). Como se demuestra en los Ejemplos 2 y 3 abajo, PTH y PTHrP con actividad de formación ósea se unen específicamente con receptores de PTH/PTHrP y producen una estimulación dependiente de la dosis de acumulación de cAMP en membranas corticales renales humanas, en membranas de osteosarcoma similares a osteoblastos humanos y células intactas (Ejemplo 2) y en membranas corticales renales caninas (Ejemplo 3). Con [Nle8'18,Tyr34]hPTH-(1 -34)NH2 o hPTHrP-( 1 -36) como los análogos de referencia estándares, puede generarse una relación de dosis-respuesta mediante el uso de análisis de regresión no lineal estándar. La potencia relativa para diversos análogos de PTHrP (en unidades/mg) puede determinarse a partir de la proporción de EC5o del análogo de referencia estándar respecto a la del análogo de PTHrP . EC50 se define como la dosis que provoca una respuesta máxima med ia de acumulación de cAMP en la presente. El procedimiento detallado para el manejo de las células, el establecimiento del ensayo, así como también los métodos para la cuantificación de cAMP, se describe en Sistane et al., Pharmacopeial Forum 20: 7509-7520 (1 994). Para ensayos in vivo, los aná logos de PTHrP candidatos pueden caracterizarse por sus habilidades para incrementar la masa ósea trabecular y cortical en ratas con exti rpación de ovarios, osteopénicas, según se describe en el Ejemplo 4. El Ejemplo 5 describe u n ensayo cl ínico, aleatorizado, controlado por placebo, prospectivo, doblemente oculto, de tres meses, que demuestra la eficacia de PTHrP como un agente anabólico esq uelético. PTH rP muestra efectos secundarios m ín imos , por ejemplo, a pesar de las dosis comparativamente elevadas , sin q ue se observe un incremento importante en hipercalcemia . El Ejemplo 6 describe un sistema de computadora y métodos para el uso del mismo, para diseño de base estructural de los peptidoimitadores y moléculas pequeñas que tienen actividad biológica anabólica.

Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente para propósitos ilustrativos y de ninguna manera intentan limitar el alcance de la presente invención .

EJEMPLO 1 TRATAMIENTO DE DOSIS MUY ELEVADA, A CORTO PLAZO, DE OSTEOPOROSIS POST-MENOPÁUSICA CON EL AG ENTE ANABÓLICO ESQUELÉTICO PTH RP La prote ína relacionada con la hormona paratiroide , o "PTH rP" , es el agente catabólico esquelético más esencial . Se descubrió ¡nicialmente como la causa del síndrome paraneoplástico letal común , hipercalcemia humoral de malignidad o "H H M". La hi percalcemia que ocurre entre pacientes con H HM resulta principalmente d e una activación repentina de la resorción óseo osteoclástica. Por lo tanto, PTHrP se observaría como un candidato no probable como agente anabólico esquelético. El propósito del presente estudio fue determi nar si la administración altas dosis intermitentes de un péptido PTH rP, d urante u n periodo de tiempo corto, podría prod ucir incrementos significativos en BMD sin efectos secundarios negativos, y como tal , PTH rP pod ría ser un agente anabólico esquelético eficaz en mujeres con osteoporosis post-menopáusica. Con el razonamiento de q ue la hormona pa ratiroide (PTH) puede originar incrementos demostrables en la densid ad mineral ósea dentro de los tres meses de tratamiento y que PTHrP necesitaría ser al menos tan eficaz como PTH en el incremento de la masa ósea para ser terapéuticamente útil, el estud io descrito en la presente como Ejemplo 1 es un ensayo clínico, piloto, controlado por placebo, aleatorizado, doblemente oculto, de tres meses en el cual PTHrP se comparó con el tratamiento con placebo. La velocidad de incremento, así como también el i ncremento absoluto, observados en la densidad mineral ósea de la espina l umbar con PTHrP son grandes y pueden ser iguales o exceder aq uellos reportados a la fecha mediante el uso de los fármacos de osteoporosis actualmente disponibles. El PTHrP ad ministrado de manera subcutánea en dosis elevadas d urante solamente tres meses parece ser un potente agente anabólico, produciendo un incremento de 4.7% en BM D de la espina lumbar. Esto se compara muy favorablemente con los fármacos anti-resorptivos d isponibles para la osteoporosis y PTH. A pesar de las elevadas dosis, PTHrP se toleró bien.

Materiales y Métodos Preparación de h PTHrP-(1 -36) y placebo para inyección hu mana Se preparó h PTH rP-( 1 -36) si ntético media nte síntesis sólida , como se describió previamente ( Everhart-Caye ef al. , J Clin Endocrino! Metab 81 1 99-208 ( 1 996)). En resumen , hPTHrP-( 1 -36) se pesó, disolvió en 1 0 m M de ácido acético, se filtró a través de un filtro de jeringa estéril de 0.2 µ??, se colocó asépticamente en alícuotas de 5-600 µg en frascos de vidrio estériles, se sellaron asépticamente en los frascos, se congelaron a -80°C y se liofilizaron. Los frascos de placebo se prepararon exactamente de la misma manera. Los frascos se almacenaron a -80°C. El contenido de péptido se confirmó mediante análisis amino ácido, PTHrP-(1 -36) RIA (abajo descrito) o PTHrP-(1 -36) RNA, y bioensayo de ciclasa de adenililo (abajo descrito). La examinación por pirógeno se llevó a cabo mediante método de ensayo de coagulación en gel del lisado de amebocito de límulo (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA), utilizando endotoxína estándar de Escherichia coli 0113 como un control. La concentración de endotoxína en los frascos se encontró por debajo del límite inferior de detección (<0.03 unidades de endotoxina/mL). Los frascos se etiquetaron en coordinación con la Farmacia Investigacional del Centro Médico de la Universidad de Pittsburg. Inmediatamente previo al inicio de cada inyección, el PTHrP-(1-36) de un frasco se reconstituyó en 1.0 mL de solución salina al 0.9%. La masa de hPTHrP(1-36) es de 4260.6 Da. Las estructuras de los péptidos se confirmaron mediante espectroscopia de masa y análisis amino ácido. Se confirmó una pureza mayor de 99% mediante cromatografía líquida de alto desempeño, de fase inversa.

Bioensayo de ciclasa de adenililo La potencia biológica de hPTHrP-(1 -36) se examinó mediante el uso de un ensayo de ciclasa de adenililo llevado a cabo en células de osteosarcoma humanas de SaOS2 confluentes, utilizando un método previamente descrito en detalle (Everhart-Caye ef al., J Clin Endocrino! Metab 81: 199-208 (1996); Orloff ef al., Endocrinol 131: 1603-1611 (1992); Merendino et al., Science 231: 388-390 (1986)). En resumen, las células de SaOS2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, y se mantuvieron en medio de McCoy complementado con 10% de FBS, 2 mmol/L de L-glutamina, penicilina (50 U/mL) y estreptomicina (50 µ9/???). Las células se colocaron sobre placas aproximadamente 10 días antes del ensayo en placas de 24 cavidades y que habían sido confluentes durante aproximadamente 7 días previos al ensayo. Las células se incubaron a 25°C con isobutilmetilxantina (500 mmol/L) durante 10 min, se agregaron los péptidos y la incubación continuó a 25°C durante otros 10 minutos. El medio se aspiró, las células se solubilizaron en ácido tricloroacético al 5% y los extractos se neutralizaron mediante el uso de 25:75% de trioctilamina:Freón. El contenido de cAMP en los extractos se midió por RIA (Tecnologías Biomédicas, Stoughton, MA). El péptido se examinó en al menos tres ensayos diferentes.

RIA de PTHrP El RIA de hPTHrP-( -36) que utiliza antisuero S2 se ha descrito en detalle previamente (Yang et al., Biochem., 33: 7460-7469 (1994); Burtis et al., N. Engl. J. Med., 332: 1106-1112 (1990)). En resumen, el método de lactoperoxidasa se utilizó para preparar amida de Tyr36PTHrP-(1-36) etiquetada 125l para utilizarse como radioligando (ver abajo) como se describe previamente (Orloff et al., J. Biol. Chem., 264: 6097-6103 (1989)). Los duplicados del ensayo de estándar o la muestra (100 µ?) se incubaron durante la noche a 4°C con (100 µ?) de una dilución de 1:1500 de S-2 en regulador de P10BT (PBS que contiene BSA al 10% y 0.1% de Tritón X-100). Tyr36 yodado de una dilución de 1:1500 de S2 en regulador P10BT (PBS que contiene BSA al 10% y 0.1% de Tritón X-100).

La amida de Tyr36hPTHrP-(1-36) yodada (2000-8000 cpm) en regulador de PBT se agregó a los tubos y la mezcla se incubó durante la noche a 4°C. La separación de fase se llevó a cabo mediante el uso de carbón vegetal cubierto con dextrano. La sensibilidad del ensayo es de 50 pmol/L. El antisuero reconoce hPTHrP-(1 -74), (1-36) y (1-141) con igual afinidad, pero falla en la reacción cruzada con hPTHrP-(37-74) o con hPTH-(1-34) o hPTH-(1-84) (Yang et al., Biochem., 33: 7460-7469 (1994)).

Bioquímicas de Suero y Orina La sangre se analizó estudios químicos de rutina y de hematología en el Laboratorio de Química Clínica del Centro Médico de la Universidad de Pittsburg, ya que eran concentraciones de plasma 25-vitamina D. La osteocalcina se midió como se describe en Gundberg, et al., J Clin Endocrino! Metab 83: 3258-3266 (1998), incorporado para referencia. El N-telopéptido en suero (N-Tx) (Osteomark) y deoxipiridinolinas urinarias (DPD) (Pirienlaces-D) se midieron mediante el uso de equipos comerciales de Ostex International, Seattle WA, y Quidel Corp, Santa Clara CA, respectivamente.

Sujetos de Estudio Se identificaron dieciséis mujeres postmenopáusicas saludables con osteoporosis para este estudio. Todos los sujetos de estudio proporcionaron consentimiento informado. Los participantes en el experimento y grupos de control fueron de edad similar (edad media de aproximadamente 65), peso, altura, BMI, años de menopausia, años con estrógeno, ingesta de calcio y tuvieron concentraciones similares de vitamina D en plasma. Ambos grupos mostraron osteoporosis en la espina lumbar. Antes de comenzar el estudio, cada sujeto experimentó una exploración de densidad mineral ósea (DXA) de la espina lumbar y cadera al inicio y al término del estudio. Los criterios de inclusión incluyeron una puntuación T de menos de -2.5 en la espina lumbar, siendo más de tres años post-menopáusica, encontrándose en el reemplazo de estrógenos durante al menos tres años y encontrándose generalmente con excelente salud. Los criterios de exclusión incluyeron el uso en el pasado de cualquier medicamento para osteoporosis, incluyendo bisfosfonatos, calcitonina o modificadores receptores de estrógeno selectivos. El uso actual de medicamentos o agentes que podrían influenciar el metabolismo óseo o de calcio (por ejemplo, tiazidas, dosis no fisiológicas de hormona tiroide, glucocorticoides, litio, alcohol, etc. ) también fue un criterio de exclusión. Todos los sujetos de estudio proporcionaron consentimiento informado. El protocolo se aprobó por el Consejo de Revisión Institucional de la Universidad de Pittsburg .

Protocolo de Estudio El uso de PTHrP en ensayos clínicos humanos se aprobó por la FDA (IND # 49175, incorporado en la presente para referencia). El protocolo se aprobó por el Consejo de Revisión I nstitucional de la Universidad de Pittsburg. Este fue u ensayo clínico, controlado por placebo, doblemente oculto, aleatorizado. La medición de resultado primaria fue la densidad mineral ósea de la espina lumbar. Las mediciones de resultado secundarias fueron la densidad mi neral ósea de cadera y cuello femoral , marcadores de trastorno óseo, calcio en suero, creatinina en suero, manejo de fósforo renal y eventos adversos. Los dieciséis sujetos se aleatorizaron para recibir tres meses de tratamiento ya sea con PTHrP o placebo (frascos vacíos preparados de manera idéntica q ue no contienen PTH rP). Cada sujeto también recibió 400 IU de vitamina D y 1 000 mg de calcio como carbonato de calcio por día (Os-Cal, Smith Kline Beecham/Glaxo, King of Prusia , PA) y se inició dos semanas antes del inicio de tratamientos con PTHrP o placebo. Los sujetos se consideraron resguardados en su hogar a -20°C, reconstitución y auto-inyección de PTH rP o placebo. Los frascos se reconstituyeron por los sujetos de estudio en 1 .0 mi de solución sa l ina estéri l bacterioestática inmediatamente antes de usarse , hasta una dosis promed io de PTHrP de 41 0.25 µg por d ía , o placebo de solución salina , y se auto-ad mini stró en la grasa subcutánea abdominal. Los sujetos reg resaron por estudios de sangre y orina a 0, 1 4, 30, 60 y 90 días del estud io. Se l levó a cabo u n estudio final de densidad ósea el d ía 90 del estud io.

Cumplimiento del Estudio Un paciente en el grupo de placebo salió del estud io después de tres d ías . Los sujetos restantes en cada grupo completaron el estudio sin noticias. El análisis de los datos q ue sigue incluye a 16 pacientes en la línea base, y los ocho sujetos de PTHrP y siete de placebo q ue completaron los tres meses del estudio.

Consideraciones de seguridad Los sujetos de estudio se monitorearon a 0, 2, 4 , 8 y 1 2 semanas respecto a hipercalcemia, salpullidos, q uejas G l , molestias o síntomas card iovasculares u otras molestias no específicas. Se preguntó a los sujetos respecto a los efectos adversos en cada visita , es decir, 0, 14, 30, 60 y 90 d ías del estudio.

Densitometría Ósea La densitometría ósea en la espina y cadera se midió sin consideración mediante el uso de un densitómetro Modelo 2000 (Hologic Inc. , Bedford MA) . Los resultados se revisaron sin consideración y de manera independiente por dos médicos densitometristas óseos experimentados.

Análisis Estadístico El anál isis estad ístico se llevó a cabo med ia nte el uso de una prueba 7 sin par de Estudiante, utilizando software Excel (Microsoft, Seattle, WA). Los valores P de menos de 0.05 se consideraron significativos.

Resultados Datos Demográficos de Línea Base. Los datos demográficos de l ínea base en los dos grupos se muestran en la Tabla I . Los sujetos fueron de edad , peso, estatura, BMI, años de menopausia , años con estrógenos, ingesta de calcio similares y concentraciones de vitamina D en plasma de 25. En el grupo de placebo, dos eran fumadores y uno se encontraba en u na dosis de reemplazo normal de hormona tiroide para hipotiroidismo . Ambos grupos mostraron osteoporosis en la espina lumbar.

Cumplimiento del estudio. Un paciente en el grupo de placebo salió del estudio después de tres d ias debido a falta de respiración y fatiga de pecho después de una inyección subcutánea. Los sujetos restantes e n cada grupo completaron el estudio sin alteración. Los siguientes análisis de datos incluyen a los 1 6 pacientes en la l ínea base y los ocho sujetos de PTH rP y siete de placebo que completaron los tres meses del estudio.

Resu ltados Primarios BMD en L/S Los cambios en BMD en la espina lumbar los tres meses del estud io se muestran en la fig ura 4. El panel izq uierdo muestra los cambios en la densidad mineral ósea según se mide por DXA como cambios porcentuales de la línea base. El panel derecho muestra los mismos datos como cambios absolutos en la densidad mineral ósea d e la l ínea base en gm/cm2. En cada panel, la l ínea en negrita representa los sujetos tratados con PTHrP (n=8 indica q ue se incluyeron los ocho pacientes tratados con PTHrP) y la l ínea pu nteada aq uellos que reciben placebo. En el grupo de placebo, los datos se presentan incluyendo al ausente (+) y con el ausente excluido (-), según se describe en el texto (n=6/7 indica el número de sujetos que reciben placebo, incluyendo o excluyendo al ausente). Las barras de error representan la SEM. Los valores P se determinaron mediante el uso de la prueba T igualada del Estud iante. Como puede observarse en el panel izquierdo, el incremento en BMD en la espina lumbar en el grupo de PTH rP fue de 4.72% d urante tres meses. En contraste, el cambio en el grupo de placebo fue menor, 1 .4%, p=0.025. Este i ncremento sorprendentemente grande en el grupo de placebo reflejó un incremento de 6.5% en un sujeto. La razón del incremento notable, 6.5%, en BMD en el ú nico ausente de placebo se desconoce. El incremento se confirmó por una revisión independiente sin consideración de exploraciones por DXA y o se debió a posición u otras consideraciones técnicas. Este sujeto no fue diferente a los otros sujetos de placebo en el BM D total d e cadera o cuello femoral en la l ínea de base o en la conclusión , y no fue diferente con respecto al BMD de espina de l ínea base. No hubo evidencia de una fractura por compresión vertebral antes o después del estudio, y no hubo calcificación aórtica o artrítica . Este sujeto tuvo una de las concentraciones más bajas de vitamina D en plasma 25 en el estud io ( 1 6 ng/ml) y es posible q ue un componente de este incremento notable del sujeto reflejara corrección de osteomalacia media . Si se excluye este sujeto, el incremento en el g rupo de placebo era de 0.6%, p=0.003. Se obtuvieron hallazgos si milares cuando los resultados se expresaron como cambios absolutos en BMD en gramos por cm2, y 0.01 1 o 0.005 gm/cm2 en el grupo de placebo, depend iendo de si el ausente se i ncluye (p=0.022) o se excluye (0.003).

Resultados Secundarios BMD Total en Cuello Femoral y Cadera Los cambios en BMD expresados como cambios porcentuales de la l ínea base en la cadera y cuello femoral en total se muestran en la figura 5, y se comparan con los cambios en la espi na lumbar. Las barras de color gris claro ind ican el grupo de placebo (PBO) y las barras de color neg ro indican el grupo experimental (PTHrP). Los datos de L/S son iguales a aquellos presentados en la figura 4 e incluyen al ausente. Las barras de error ind ican SE M y los valores P se determinaron mediante el uso de una prueba T igualada de Estud iante. No hubo diferencia significativa entre los g rupos de PTH rP o PBO en cualq uier sitio de la cadera durante el estud io . Marcadores de trastorno óseo La figura 6 ilustra tres diferentes marcadores de trastorno óseo en los sujetos tratados con placebo y con PTHrP . La fig ura 6(a) i lustra osteocalcina en suero, un marcador de formación ósea, incrementado en una manera estad ísticamente significativa durante el estud io en los sujetos tratados con PTHrP pero no los controles de placebo. No obstante, como se il ustra en la fig u ra 6(a) , los incrementos de osteocalcina en suero fueron aparentes desde el d ía 1 5 (periodo de tiempo más temprano en que se obtuvieron muestras sang u íneas). En contraste, NTX en suero, un marcador de resorción ósea, permaneció sin cambios durante el estudio en los sujetos tratados con PTHrP, como lo hizo en los controles de placebo, como se muestra en la figura 6(b). La excreción de DPD en orina , un segundo marcador de resorción ósea, también se encontró sin cambios , ver, fig ura 6(c). En las tres figuras, la l ínea punteada indica el grupo de placebo y la línea sólida el grupo de PTHrP. Las barras de error indican la SEM , y los valores P se determinaron mediante el uso de ANOV para mediciones repetidas. Estos hallazgos sugieren q ue PTHrP estimula de manera selectiva la formación ósea sin velocidades normales de estimulación adicionales de la resorción ósea . Químicas en suero y orina La fig ura 7 ilustra calcio total en suero y en suero ionizado en los sujetos tratados con placebo y PTH rP . La línea punteada indica el g rupo de placebo y la l ínea sólida el g rupo de PTHrP. Las barras de error indican la SEM y los valores P se determinaron mediante el uso de ANOVA para mediciones repetidas. Los n iveles de calcio permanecen normales y constantes tanto en los sujetos tratados con PTH rP como también en los controles de placebo. Ningún sujeto desarrolló un incremento significativo en el calcio total en suero o ionizado. La creati nina en suero permaneció normal en ambos sujetos de PTHrP y de placebo (creatinina en suero media, +SEM , el d ía 90=0.825 + 0.05 mg/dl en el grupo de PTH rP contra 0.84 + 0.06 en el grupo de placebo, p =ns). El fósforo en suero también fue similar en ambos grupos a través de todo el estud io (3.2 mg/d l + 0. 1 8 en el grupo de PTH rP contra 2.9 + 0. 1 7 en el grupo de placebo, p=ns), como lo fue la máxima tubu lar para fósforo (3.3 mg/dl + 0.27 en el grupo de PTHrP contra 2.6 + 0.24 en el grupo de placebo, p = ns). La figura 8 ilustra una comparación de la actividad anaból ica de PTHrP con resultados de los ensayos clínicos de osteoporosis previamente publicados, seleccionados. "Ralox 150" se refiere a Delmas PD, et al., N Engl J Med 337: 1641-7, (1997); "Ralox 120" a Ettinger B, et al., JAMA 282:637-45 (1999); y "Calcitonina" a Chestnut C, et al., Osteoporosis Int 8 (suppl 3): 13 (1998); "alendro", "risedro" y "zoledro" se refiere a estudios que emplean alendronato (Liberman UA, et al., N Engl J Med 333:1437-43, (1995) y Murphy MG, er al., J Clin Endocrinol Metab 86:1116-25, (2001), a risedronato (Fogelman I; er al., J Clin Endocrinol Metab., 85:1895-1900, (2000) y McCIung MR, et al., N Engl J Med 344:333-40 (2001) y a zoledronato, Reid IR, et al., N Engl J Med 346:653-61, 2002). "PTH" se refiere a dos estudios que emplean hormona paratiroide, Lindsay R, et al., Lancet 350: 550-5 (1997) y Neer RM, ef al., N Engl J Med 344: 1434-41 (2001), y "PTHrP" se refiere al estudio actual. Cada una de las referencias anteriores se incorpora así en la presente para referencia en su totalidad. Eventos Adversos Ningún sujeto en el grupo de PTHrP experimentó debilidad, náusea, vómito, diarrea, constipación, flujo repentino, calambres musculares o fenómenos alérgicos. Un sujeto de PTHrP experimentó 30 segundos de palpitaciones cardiacas al permanecer después de la tercer inyección, lo cual no ocurrió con las inyecciones posteriores. Todos los sujetos de PTHrP completaron el estudio. En contraste, un sujeto en el grupo de placebo experimentó flujo repentino, mareo y nausea después de su inyección el día tres del estudio, y este sujeto se apartó del estudio.

Discusión Estos estudios indican que PTHrP, administrado de manera subcutánea en dosis muy grandes durante un periodo de tiempo muy breve, puede originar incrementos estadística y biológicamente importantes en la densidad ósea de la espina . Esto es sorprendente por varias razones. Pri mero, PTHrP se identificó orig i nalmente como resultado de sus acciones esq ueléticas catabólicas en h ipercalcemia humoral de malignidad. En segundo lugar, la velocidad y el incremento absoluto en BMD de espina, casi 5% en tres meses, es mayor q ue aq uella observada mediante el uso de muchos medicamentos para osteoporosis anti-resorptivos , actualmente d ispon ibles , (ver, figura 8). No obstante, los incrementos de esta magnitud nunca se han reportado con el uso de calcitonina ni raloxifeno, incluso cuando estos agentes se dan por tanto como tres años . El estrógeno orig ina i ncrementos simi lares en BMD de espina, pero un cambio de 5% req uiere tres años de tratamiento. Los cambios observados con el uso de alg unos bisfosfonatos, incluyendo etidronato, alendronato, risedronato y zoledronato, pueden igualar o exceder 5% , pero requieren de mucho más de tres meses, típicamente uno o más años . No obstante , los cambios observados se comparan favorablemente y posiblemente pueden exceder aquellos observados en estudios reportados a la fecha con el uso de PTH durante un periodo de tres meses. Visto desde la perspectiva de terapias anti-resorptivas disponibles, son impresionantes los efectos de la dosis elevada a corto plazo de PTHrP. Las dosis de PTH rP empleadas en este estudio fueron grandes en comparación con aquellas utilizadas en estudios de PTH similares. Los sujetos en este estudio recibieron 6.56 microgramos/kg/día, lo cual en promedio fueron 410.25 microgramos por día en los ocho sujetos que recibieron PTHrP. Esto es 10 20 veces mayor que las dosis de hPTH(1-34) (20-40 microgramos/día) comúnmente empleada en estudios de osteoporosis. Las dosis de PTH de más de 20 microgramos/día se asocian con hipercalcemia y otros efectos adversos en humanos. Es sorprendente, por consiguiente, que los sujetos saludables toleraran dosis de esta magnitud sin desarrollar hipercalcemia, hipotensión postural, nausea, flujo repentino u otros efectos adversos. Las diferencias no pueden atribuirse a diferencias en cantidades molares de los dos péptidos empleados, para PTHrP (1-36) es muy cercano en peso molecular a PTH(1-34) (aproximadamente 4200 Mr). Las diferencias tampoco pueden atribuirse a diferentes interacciones con el receptor de PTH/PTHrP común: tanto hPTH(1-34) como hPTHrP(1-36) muestran cinéticas de unión similares o idénticas y características de activación por transducción de señal. De manera importante, en la comparación de cabeza a cabeza con hPTH(1-34) in vitro y también in vivo dado intravenosamente a voluntarios humanos, PTHrP(1-36) es igual en potencia a hPTH(1-34). También las diferentes velocidades de disociación metabolica en suero son una explicación no probable, ya que hemos demostrado que Ti 2 de PTHrP(1-36) infusionado de manera intravenosa es de seis minutos, indistinguible de los cinco a seis minutos reportados para hPTH(1-34). Las diferencias en los efectos esqueléticos de los dos péptidos se refieren a diferentes características farmacocinéticas de PTH y PTHrP después de inyección subcutánea. PTH(1-34) humano se ha reportado en dos estudios que alcanza niveles de plasma picos a 30-45 minutos después de la inyección, mientras que hemos reportado que los niveles de plasma pico de PTHrP ocurren en o antes de 15 minutos después de una dosis subcutánea. No obstante, ya que el punto de tiempo de 15 minutos fue el primero que examinamos y ya que los valores de PTHrP en circulación parecen encontrarse en una ahusada declinación en su punto de tiempo de 15 minutos iniciales, es muy probable que el pico ocurra mucho antes, tal vez en cinco a diez minutos. Por lo tanto, hPTHrP(1-36) se absorbe más rápidamente que PTH después de inyección subcutánea y los niveles de plasma de PTHrP alcanza su pico y por consiguiente se declinan más rápidamente que aquellos de PTH. Las diferentes cinéticas de absorción y evacuación de PTHrP contra PTH subrayan el requisito de una gran dosis de PTHrP así como también la falta de hipercalcemia y otras toxicidades observadas en los pacientes estudiados a pesar de estas grandes dosis. Esta aparente seguridad se soporta por nuestro estudio anterior en el cual unos siete sujetos adicionales recibieron la misma dosis de 6.56 microgramos/kg/día durante dos semanas sin eventos adversos, y otro estudio en el cual esta dosis se administró como una sola dosis a tres individuos saludables. Por lo tanto, ningún evento adverso se ha encontrado en un total de 18 sujetos humanos saludables que reciben estas grandes dosis de PTHrP durante periodos de un día, dos semanas o tres meses. Mecánicamente, los datos marcadores de trastorno óseo (ver, figura 6(a), (b) y (c)) sugieren que PTHrP pueden tener efectos puramente anabólicos en el esqueleto, sin el incremento acompañante en la resorción ósea observada con el uso de PTH. Por lo tanto, en contraste con PTH, el cual muestra propiedades tanto de formación como de esti mulación de la resorción, PTH rP parece tener efectos osteoblásticos o anabólicos selectivos, sin efectos estimuladores de resorción concomitantes. La falta de un efecto resorptivo es improbable debido al uso concomitante de estrógeno ya que la respuesta de resorción a PTH no se elimina por el estrógeno. De manera i nteresante, aunque la velocidad de incremento en BMD en el estud io actual fue muy g rande, el incremento total en la osteocalcina marcadora de formación fue ya sea similar a , o significativamente inferior a lo reportado con el uso de PTH . El i ncremento aparente relativamente i nferior en la formación , en el establecimiento de un incremento más bien dramático en B MD , soporta la evidencia bioqu ímica de una aparente falta de un efecto estimulador de resorción. La confirmación de este hallazgo puede hacerse med iante el uso de biopsias esqueléticas e histomorfometría ósea cuantitativa . La falta de un efecto de resorción no es probable debido a la breve duración (tres meses) de administración de PTHrP, ya que los estud ios anteriores han demostrado q ue PTH incrementa la resorción ósea significativamente en o bastante antes de los tres meses . Por ejemplo, en un estudio, Lindsay er al. (Lancet 350: 550-555 ( 1 997)) , la resorción se determina mediante el uso de NTX en orina, ya elevado a dos semanas y se incrementó en 25% a los tres meses. Finkelstein et al. (N Engl J Med 331: 1 61 8-1623 ( 1 994)) demostró que la hidroxiprolina y pirid inolinas en orina, dos d iferentes marcadores de la resorción ósea , se incrementaron en aproximadamente 200% a tres meses después del tratamiento con PTH . De manera similar, Hodsman (J Clin Endocrinol Metab 82: 620-628 ( 1997)) ha demostrado que tanto hid roxi prolina en orina como NTX se incrementan significativamente en solamente cuatro semanas de tratamiento con el uso de PTH. De manera similar, la falta de un efecto de resorción es improbable debido al uso concomitante de estrógeno. En primer l ugar, el mismo tipo de disociación se observó en nuestro estud io anterior en mujeres post-menopáusicas sin uso de estrógeno (Plotkin et al. , J Clin Endocrinol Metab 83: 2786-2791 (1998)). En segundo lugar, la respuesta de resorción a PTH es fácilmente aparente en mujeres tratadas con estrógenos en ambos estudios de Roe y Lindsay a los tres meses (Roe et al., Program and Abstracts oí the 81 st Annual Meeting of the Endocrine Society, San Diego, CA, junio 1 2-15, 1 999, p. 59; Lindsay et al., Lancet 350: 550-555 ( 1 997)). Por lo tanto, a partir de los datos dispon ibles a la fecha , parece que PTHrP, en las dosis empleadas y por la duración observada a la fecha , puede ser d iferente de PTH y puede mostrar efectos puramente anabólicos . Suponiendo que el efecto anabólico selectivo es reproducible en estudios más grandes y de mayor duración como se describe arriba, se tiene la hipótesis de q ue la diferencia en formación y resorción ósea entre PTH y PTH rP también puede resultar de sus diferentes farmacoci néticas después de la absorción subcutánea , como se describe arriba. Es bien sabido que la mayor exposición de osteoblastos o sus precursores ¡n vitro i in vivo a PTH disminuye la respuesta anabólica, m ientras q ue aumenta la respuesta de resorción osteoclástica (ver, Rosen & Bilezikian, J Clin Endocrino! Metab 86: 957-964 (2001); Dempster et al., Endocrine Reviews 14: 690-709 (1993); Dobnig & Turner, Endocrinology 138: 4607-4612 (1997)). Por suerte, la absorción y evacuación aceleradas de PTHrP después de la inyección subcutánea, en comparación con aquella de PTH, puede favorecer aún más el equilibrio de formación contra resorción. Las dosis de PTHrP empleadas en este estudio fueron muy grandes. Los sujetos en este estudio recibieron una dosis promedio de 410.25 µ? por día en los ocho sujetos que recibieron PTHrP. Esto es como 10 a 20 veces mayor que las dosis de hPTH(1-34) (20-40 µg/d\a) comúnmente empleadas en estudios de osteoporosis. Las dosis de PTH de más de 20 µ ??'\? se sabe que se asocian con hipercalcemia y otros efectos adversos. Por consiguiente, es sorprendente que los sujetos saludables toleraran dosis de PTHrP de esta magnitud sin desarrollar hipercalcemia, hipotensión postural, náusea, flujo continuo u otros efectos adversos. Las diferencias no pueden atribuirse a diferencias en cantidades molares de los dos péptidos empleados, ya que PTHrP(1-36) es muy cercano en peso molecular a PTH(1-34) (aproximadamente 4200 Mr). Las diferencias tampoco pueden atribuirse a diferentes interacciones con el receptor común de PTH/PTHrP: tanto hPTH(1-34) como hPTHrP(1-36) muestran cinéticas de unión similares o idénticas y características de activación por transducción de señal, en humanos. Las diferentes velocidades de evacuación metabólica en suero también son una explicación improbable, ya que se ha demostrado que T1/2 de PTHrP(1-36) infusionado de manera intravenosa es de aproximadamente seis minutos, indistinguibles de los aproximadamente cinco a seis minutos reportados para hPTH( 1 -34). Sin limitarse a la teoría, una explicación posible es q ue las diferencias en efectos esqueléticos de los dos péptidos se relacionan con d iferentes características farmacoci néticas de PTH y PTH rP después de la inyección subcutánea. PTH(1 -34) humano alcanza niveles de plasma pico a aproximadamente 30-45 minutos después de la inyección, mientras que los niveles de plasma pico de PTHrP ocurren en o antes de aproximadamente 1 5 minutos después de una dosis subcutánea. Por lo tanto, hPTH rP( 1 -36 ) se absorbe probablemente más rápido que PTH después de inyección subcutánea y los niveles de plasma de PTHrP alcanza n su pico y declinación más rápidamente que aq uel los de PTH. Estas d iferencias farmacoci néticas también pueden contar para la respuesta anabólica selectiva o pura observada. Es bien sabido que la mayor exposición de los osteoblastos ¡n vitro o in vivo a PTH d isminuye la respuesta anabólica , mientras q ue aumenta la respuesta de resorción osteoclástica. La absorción y evacuación aceleradas de PTHrP después de la inyección subcutánea, en comparación con aq uellas de PTH , puede favorecer aún más el equilibrio de formación contra resorción. En este estudio, los sujetos en ambos g ru pos de placebo y de PTHrP recibieron de manera concomitante estrógeno, además de complementos de calcio y vitamina D, en parte , por razones éticas , a fin de que el grupo de placebo reciba cierta forma de tratamiento actualmente aceptado para osteoporosis. Como para PTH , permanece por determinarse si el efecto anabólico de PTHrP se mejora por uso concomitante de estrógeno. Los estudios que utilizan PTH en humanos muestran en general una eficacia similar si los sujetos reciben estrógeno o no (ver, figura 8), aunque no existen estudios a la fecha que se dirijan directamente a esta cuestión de PTHrP. Aún está por determinarse si PTHrP pudiera ser más o menos eficaz cuando se da de manera concomitante con otros agentes anti-resorptivos (bisfosfonatos, moduladores receptores de estrógeno selectivos, etc.). El tratamiento de dosis muy elevada a corto plazo con PTHrP(1-36) origina un incremento notable en el BMD de la espina. En contraste con los efectos esqueléticos combinados o de resorción neta y anabólico del PTH intermitente administrado, PTHrP parece tener efectos predominantemente anabólicos con componente poco o nulo resorptivo. Las diferencias entre PTH y PTHrP no es probable que reflejen las diferencias en las interacciones de receptor o señalización entre las dos moléculas, pero probablemente reside en las propiedades farmacocinéticas diferentes de las dos moléculas que siguen a la administración subcutánea. De los siete sujetos que reciben placebo durante cuatro meses, seis sujetos demostraron nulos cambios significativos en la densidad mineral ósea (BMD) ya sea en la cadera o la espina. Un sujeto de placebo mostró un incremento de 6% en el BMD de espina. Esto claramente no es lo esperado ni la respuesta típicamente encontrada para el placebo (El grupo de escritura para el ensayo PEPI, JAMA 276: 1389-1396 (1996); Delmas et al., N Engl J Med 337: 1641-1647 (1997); Chestnut ef al., Osteoporosis Int 8 (suppl 3): 13 (1998); Liberman et al., N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung eí al., N Engl J Med 344: 333-40 (2001); Finkelstein et al., N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman et al., J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay et al, Lancet 350: 550-555 (1997); Neer et al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001); Roe et al., Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe ef al., J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)), sugiriendo que este sujeto puede haber tenido una deficiencia de vitamina D en la línea base o una fractura por compresión vertebral, radiológicamente no aparente, incidental. Como se ilustra en la figura 4, los ocho sujetos que reciben PTHrP demostraron incrementos importantes en el BMD de espina lumbar, con un valor medio de aproximadamente 4.75%. Cuando se compara con los siete controles, incluyendo el ausente de placebo, los resultados son significativos (p=0.026). Cuando se compara con seis controles de placebo verdaderamente normales, los resultados son altamente significativos (p=0.003). Estos resultados con bastante extraordinarios y sorprendentes por varias razones. En primer lugar, ninguno de los fármacos de osteoporosis disponibles, los anti-resorptivos, produjo esta clase de incrementos en BMD en tal estructura de tiempo corto (El grupo de escritura para el ensayo PEPI, JAMA 276: 1389-1396 (1996); Delmas et al., N Engl J Med 337: 1641-1647 (1997); Chestnut ef al., Osteoporosis Int 8 (suppl 3): 13 (1998); Liberman ef al., N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung ef al., N Engl J Med 344: 333-40 (2001)). Como se ilustra en la figura 8, la velocidad de incremento en BMD observado en el presente estudio es mayor que las velocidades del incremento de BMD reportado en estudios clínicos previos. Los resultados son extremadamente rápidos: tres meses de terapia con PTHrP-(1-36) produjeron incrementos generalmente no observados durante dos a tres años con anti-resorptivos como se describe arriba. No obstante, varios de los anti-resoptivos disponibles (SERMs, calcitonina, vitamina D, calcio) nunca lograron estos incrementos en BMD. En segundo lugar, los resultados son comparables o superiores a aquellos logrados mediante el uso de PTH, el mejor agente esquelético anabólico estudiado a la fecha (Finkelstein et al., N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman et al., J Clin Endrocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay et al., Lancet 350: 550-555 (1997); Neer er al., N Engl J Med 344. 1434-1441 (2001); Roe er al., Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe et al., J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)). En tercer lugar, las dosis requeridas son sorprendentemente elevadas: como se observó con anterioridad, las dosis estándares de ???-(1-34) se encuentran en el rango de 20-40 µg día (Finkelstein et al., N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman et al., J Clin Endrocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay et al., Lancet 350: 550-555 (1997); Neer et al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001); Roe et al., Program and Abstracts of the 81 st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe et al., J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)), algunos 10-20 veces mayores que aquellos empleados en la presente para PTHrP-(1-36). En cuarto lugar, a pesar de las dosis relativamente enormes de PTHrP administradas en el presente estudio, no se ha encontrado evento adverso alguno, mientras que tales eventos adversos se han observado con dosis bastante mayores de PTH (Finkelstein et al., N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman et al., J Clin Endrocrinot Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay ef al., Lancet 350: 550-555 (1997); Neer et al., N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001); Roe et al., Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe et al., J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)). La ausencia de toxicidad y el requisito de dosis elevadas en humanos parece comparable a los hallazgos en ratas arriba descritos, en los cuales las dosis equimolares de PTHrP tuvieron menos eficacia y menos toxicidad en comparación con PTH. Estas observaciones, como se anotó arriba, parecen reflejar las diferencias por suerte y no predecibles en farmacocinéticos de PTHrP en comparación con PTH después de la administración subcutánea. En quinto lugar, PTHrP se observa ampliamente como la hormona esquelética, catabólica, más esencial de las dramáticas pérdidas minerales esqueléticas en pacientes con HHM. No se anticipó la observación de que PTHrP en realidad notablemente anabólico para el esqueleto cuando se administra "de manera intermitente" (por ejemplo, una vez por día). Esto se hace evidente por el hecho de que muchos investigadores y firmas farmacéuticas han trabajado por más de 10 años (y probablemente tanto como 70 años) con PTH en osteoporosis, pero ninguno ha abarcado a PTHrP a pesar de que se ha encontrado en el dominio público desde su descripción inicial en 1987. Finalmente, el régimen de tratamiento de la presente invención para el tratamiento de osteoporosis tiene una resistencia adicional, no anticipada e impredeci ble con relación a la seguridad . En estud ios de toxicidad pre-cl ínica , PTH se administró a ratas en crecimiento d urante dos años. Algunas ratas desarrollaron osteosarcomas después de aproximadamente un año de terapia con PTH. Esto sugiere que el uso de agente anabólico por periodos de menos de un año puede colocar a los humanos en menos riesgo que aq uellos utilizados por periodos de tiempo mayores. La eficacia temprana de PTHrP en estudios humanos sugiere que las duraciones más breves del tratamiento son probablemente eficaces en humanos. Soporta a esto la observación de que a pesar de q ue se emplean dosis muy elevadas de PTH rP en este estud io, no se han observado eventos adversos en sujetos humanos. Además, la disponibilidad de u n agente anaból ico de manera pura o predominante puede permitir enfoque combinados para el tratamiento de osteoporosis mediante el uso de regímenes concomitantes, intermitentes o secuenciales con agentes de anti-resorción. De acuerdo con los métodos de la presente invención , los pacientes pueden tratarse, por ejem p lo, inicial mente con u n curso de varios meses de PTHrP, o un análogo o fragmento del mismo, y después cambiar a una formulación oral de anti-resorción sin riesgo de osteosarcoma . En resumen, el tratamiento de dosis elevada a corto plazo, con PTH rP( 1 -36), origina un incremento notable en BMD de espina . En contraste con los efectos combi nados o resorptivos netos y esq ueléticos anabólicos de la administración intermitente de PTH durante el mismo periodo de tiempo , PTHrP puede tener efectos predomina ntemente anabólicos con un poco de un componente de resorción. Las diferencias entre PTH y PTHrP no es probable que reflejen las diferencias en interacciones de receptor o señalización entre las dos moléculas, pero probablemente residen en las propiedades farmacocinéticas diferentes de las dos moléculas siguientes a la administración subcutánea. A pesar de las muy elevadas dosis de PTHrP empleadas, no se han observado eventos adversos en 18 sujetos humanos. La disponibilidad de un agente puramente o predominantemente anabólico, además de PTH, puede permitir enfoque adicionales combinados para el tratamiento de osteoporosis mediante el uso de regímenes concomitantes, intermitentes o secuenciales con agentes de anti-resorción.

EJEMPLO 2 CARACTERIZACIÓN DE ANÁLOGOS DE PTHRP MEDIANTE EL USO DE RECEPTORES ÓSEOS Y RENALES HUMANOS El propósito del presente estudio fue caracterizar diversos análogos de PTH y PTHrP mediante el uso de receptores renales humanos y óseos humanos. La disponibilidad de estos análogos para estimular la ciclasa de adenilato también se examinó. Para una descripción detallada de los métodos en el presente ejemplo, ver, por ejemplo, Orloff et al., Endocrino!., 131: 1603-1611 (1992), incorporado en la presente para referencia.

Materiales y Métodos Péptidos (Tyr)36hPTHrP-(1-36)amida [hPTHrP-(1-36)], hPTHrP-(1-74), y hPTHrP-(37-74) se prepararon por síntesis de fase sólida según se describe previamente (Orloff eí al. J. Biol. Chem., 131: 1063-1611 (1992); Stewart et al. J. Clin. Invest., 81: 596-600 (1988)). hPTH-(1-34) sintético, (Nle8 18, Tyr34)hPTH-(1-34), (b)PTH-(1 -34) de bovino, (r)PTH-(1 -34) de rata, hPTHrP-(1 -86), (Nle8 18, Tyr34) PTH-(3-34)amida, (D-Trp12, Tyr34)bPTH-(7-34)amida, (Tyr34)bPTH-(7-34)amida, hPTHrP-(7-34)amida, y hPTH-(13-34) se adquirieron de Bachem, Inc. (Torrance, CA). bPTH-(1-84) se obtuvo del Programa de Hormona Nacional y Pituitaria a través del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades de Riñon y Digestivas (NIDDK). La (c)PTHrP-(1 -36)amida de pollo (Tyr36) se adquirió de Península Laboratories, CA, y rPTH-(1-34) transaminada se proporcionó por el Dr. David. L. Carnes, Jr., (San Antonio, TX). PTH-(1 -34)amida de pollo, [Nle818, D-Trp12]Bpht-(7-18)-hPTHrP-(19-34)NH2 y [D-Trp12]hPTHrP-(7-18) [Tyr3 ]bPTH-( 9-34)NH2 se prepararon por síntesis de fase sólida según se describe (Caufield et al., Endocrinol 123: 2949-2951 (1988); Chorev eí al. J Bone Min Res 4.S270 (1989)). La concentración de peptido para todos los péptidos utilizados se da como el valor determinado por análisis de aminoácido. Los mismos grupos de péptidos se utilizaron en todos los estudios.

Radioiodinación La radioiodinación de hPTHrP-(1 -36) se realizó utilizando una modificación del método de lactoperoxidasa según se describe previamente (Orloff et al. J. Biol. Chem., 264: 6097-6103 (1989): Orloff et al. J. Bone Min Res 6: 279-287 (1991)). La purificación de radioligando se logró por HPLC de fase inversa utilizando una columna de 30 cm µ-Bondapak C18 (Waters Associates, Milford, MA). El radioligando preparado y purificado en esta manera se compone casi exclusivamente de la forma monoiodinada. La actividad específica varió de 300-450 µC/µg al momento de la iodinación. El radioligando mostró actividad biológica completa en el ensayo de ciclasa de adenilato renal canino cuando se comparó al peptido no etiquetado (Orloff et al. J. Biol. Chem. 264: 6097-6103 (1989)).

Cultivo Celular El estirpe de célula osteosarcoma como osteoblasto humano, SaOS-2 (American Type Culture Collection, Rockville, MD), se mantuvo en medio McCoy complementado con 10% de suero de bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, penicilina (50 U/ml), y streptomicina (50 µg/ml). El medio se cambió cada día, y los estudios se realizaron en 5-7 días posteriores a la confluencia. Los números de célula se determinaron utilizando un contador Coulter.

Preparación de las membranas RCM humanas altamente purificadas se prepararon utilizando ultracentrifugación de gradiente de sucrosa discontinua según se describe previamente (Orloff et al., J Bone Min Res 6: 279-287 (1991)). Todas las etapas se realizaron en la presencia de los siguientes inhibidores de proteasa: aprotinina [10 unidades de inhibidor Kallikrein (KlU/ml], pepstatina (5 g/ml), leupeptina (45 µg/ml), y fenilmetanosulfanilfluoruro ( 10 µ?/?a?). la corteza de riñon humano normal fue de especímenes de nefrectomía separada removida por carcinoma de célula transitoria localizada , carcinoma de célula renal , o quistes benig nos. La fu nción renal en todos los individuos fue normal según se valoró por creati nina de suero y pielografía. Las membranas se agrupa ron , se al icuotaron , y se almacenaron a -70°C para el último uso. Las membranas celulares SaOS-2 se prepararon según se describe previamente a detalle. Brevemente, las célu las postconfluentes en frascos de 1 50 cm2 se rasparon en regulador de membrana [1 0 mM de Tris HCI (pH 7.5), 0.2 m M de Mg CI2, 0.5 mM EGTA, 1 mM de d itiotreitol , leupeptina 45 µg/ml, pepstatina 5µg/m\, aprotinina 1 0 KI U/ml, y sulfanii-fluoruro de fenilmetano ( 10 µg/ml] a 0° C. La ru ptura celular se logró por sonificación y la suspensión se centrífugo a 1 3,000 x g por 1 5 min a 4°C. La pasti lla se volvió a suspender con un homogenizador de vidrio Dounce en regulador de membrana (ditiotreitol menor) conteniendo 250 mM de sucrosa. La suspensión se estratificó sobre un coj ín del regulador de membrana conteniendo 45% de sucrosa y se centrífugo a 70,000 x g por 30 min a 4°C. La fracción de membrana estratificándose en la i nterfase se colectó, se d iluyó 5 pl iegues con regulador de membrana conteniendo 250 mM de sucrosa, y se volvieron a centrifugar. La pasti lla se volvieron a suspender en regulador de membrana conteniendo 250 mM de sucrosa, se alicuotó, y se almacenó a -70° C. Las concentraciones de proteína se determinaron por el método de Lowry utilizando BSA como estándar.

Estudios de Unión de Receptor El ensayo de unión de membrana que utiliza RCM humana a 30°C se ha descrito previamente (Orloff et al. J Bone Min Res 6: 279-287 (1991)). RCM humana se agregaron a una concentración final de 90 µg/ml. La unión total (TB) de 25l-(Tyr36)hPTHrP-(1-36)NH2 para RCM humana varió entre 11% y 20% de conteos totales agregados y la unión no específica (NSB) varió de 2.4-4.0%. La unión específica de 125l-(Tyr36)hPTHrP-(1-36)NH2 alcanzó equilibrio por 30 min a 30°C. El tiempo de incubación de 30 min se utilizó para estudios de competencia de unión de equilibrio subsecuente. El ensayo de unión para las membranas SaOS-2 se condujo como para RCM humana. Las membranas se agregaron a una concentración final de 112.5 µg/ml y la unión específica alcanzó equilibrio por 60 min a 30°c. TB varío de 15-20% y NSB de 4.0-4.3%. La unión a células SaOS-2 intactas se realizó según se describe (Orloff et al. Am. J. Physiol 262: E599-E607 (1992)) con las siguientes modificaciones. Los estudios de unión se condujeron a 15°C en la presencia de quimostatina (100 µg ml) y bacitracina (200 µg/ml). La unión específica de 25l-(Tyr36)hPTHrP-(1 -36)NH2 alcanzó el equilibrio por 150 min a 15°C. El tiempo de incubación de 150 min se utilizó por lo tanto para estudios de unión competitiva. La viabilidad celular, según se valoró por la exclusión de triptano azul, fue mayor a 95% al final de una incubación estándar. La unión total (TB) varió de 18-23% de la radioactividad total agregada y la unión no específica (NSB) consistentemente varió entre 5-7%.

La estabilidad de radioligando durante la incubación bajo condiciones de ensayo respectivo para cada preparación de membrana (riñon humano y membranas SaOS-2) y para el ensayo de célula intacta (SaOS-2) se examinó por la habilidad de 125l-(Tyr36)hPTHrP-(1 -36) expuesta a las células para volver a unirse según se compara a la unión de radioligando "fresco" (Orloff ef al., J. Biol. Chem 264:6097-6103, (1989); Orloff et al. J Bone Min Res 6: 279-287 (1991)). La reunión específica de 25l-(Tyr36) hPTHrP-(1-36) a RCM humana, membranas SaOS-2, y células intactas SaOS-2 fue 92%, 98%, y 83% respectivamente. Esto indicó que la degradación significante de radioligando no ocurrió bajo las condiciones de ensayo respectivas.

Ensayo de ciclasa de adenilato La actividad estimuladora de ciclasa de adenilato se examinó en células SAOS-2 confluentes según se describe previamente para células ROS 17/2.8 (Merendino et al. Science 231:388-390, (1986)), con la siguiente modificación. El ensayo de célula intacta se condujo a 15°C, las mismas condiciones empleadas para unión a células SaOS-2 intactas (vide supra). Los experimentos de curso de tiempo demostraron que la estimulación cAMP máxima para PTHrP y PTH ocurrió después de una incubación de 60 min. Las curvas de respuesta de dosis para cada peptido se generaron de esta manera utilizando incubaciones de 60 min a 15°C bajo condiciones de ensayo de unión. Bajo estas condiciones, la estimulación máxima varió entre 80- y 200 pliegues arriba de la actividad básica.

La actividad de ciclasa de adenilato se examinó en membranas de riñon humano y membranas de célula SaOS-2 según se describe previamente a detalle para membranas renales caninas (Orloff ef al. , J Biol Chem 264: 6097-6103, ( 1989); Orloff et al. J Bone Min Res 6: 279-287 (1991 )), con las siguientes modificaciones: los experimentos de curso de tiempo a 30°C demostraron que la acumulación de cAMP máxima a 1 0 min para membranas de riñon humano y 30 min para membranas SaOS-2. Por lo tanto, las curvas de respuesta de dosis para cada peptido se generaron a 30°C por 10 min en riñon humano y 30°C por 30 min en membranas SaOS-2. As í como con los ensayos de ciclasa de aden ilato de célula intacta, los ensayos de ciclasa de adenilato de membrana de célu la ósea y riñon se realizaron bajo condiciones de ensayo de unión . Los resu ltados se expresan como porcentaje de estimulación de cMAP máxima a fin de comparar las respuestas de dosis de peptido de d iferentes experimentos . La estimulación de cAMP máxima varió de 3- a 8-plieg ues arriba de lo básico para RCM hu mano, y de 2- a 7-pl iegues para membranas SaOS-2.

Análisis de Datos Los valores I C50 para los experimentos de u nión competitiva y valores EC50 para curvas de respuesta de dosis de ciclasa de adenilato se determinaron de la concentración de peptido que prod uce 50% de la respuesta máxima. Las diferencias estadísticas se valoraron por prueba de Estudiante de dos extremos igualados o no igualados. El análisis adicional de los datos de un ión competitiva se llevó a cabo con el programa de ajuste de curva no lineal de menos cuadros computarizado LIGANDO (Munson et al. Anal Biochem 107: 220-239 (1980)).

Resultados Estudios de Unión Los datos de unión competitiva utilizando 125l-hPTHrP-(1-36) como radioligando en cada una de las tres preparaciones de tejido se muestra en la FIG. 9 y la Tabla II (de abajo). La unión de radioligando se desplazó completamente para todos los análogos de PTHrP y PTH en cada tejido examinado, excepto para hPTHrP-(37-74), que, según se espera, no inhibió la unión de 125l-hPTHrP-(1 -36). El análisis Statchard de los datos (FIG. 9, paneles inferiores) con el programa de computadora LIGANDO fue compatible con un clase única de sitios de receptor de alta afinidad en cada tejido. Los números de receptor, calculados de los valores Bmax, fueron 0.24 + 0.06 y 0.36 + 0.08 pmol/mg de proteína de membrana para RCM humana y membranas SaOS-2, respectivamente, y 25,900 + 1500 receptores por célula para células intactas SaOS-2. La competencia de la unión de PTHrP radioetiquetado con agonistas PTHrP y PTH se comparó primero en RCM y membranas SaOS-2 (Tabla II y FIG. 9, Paneles A y B). En general, la afinidad relativa de agonistas seleccionados en RCM casi fue en paralelo a aquella observada en las membranas SaOS-2. rPTH-(1-34), bPTH-(1-34), y cPTHrP-(1-36) mostraron afinidades relativas similares según se compara a hPTHrP-(1-36), mientras que (Nle818Tyr34)hPTH-(1-34) y cPTH-(1-34)NH2 fueron menos potentes que hPTHrp-(1 -36) en ambos sistemas de ensayo. La afinidad relativa de bPTH-(1-84) fue aproximadamente 10-pliegues menos que los análogos de terminal amino. De manera global, estos estudios mostraron diferencias no importantes entre la unión PTH/PTHrP en hueso según se compara al riñon.

Ensayo de Ciclasa de Adenilato La afinidad relativa de los análogos de agonista en los ensayos de unión se reflejó en su potencia estimuladora de ciclasa de adenilato, con dos excepciones notables (Tabla II y FIG. 10). A pesar de que rPTH-(1-34) fue similar en afinidad de unión a hPTHrP-(1 -36) en RCM y membranas SaOS-2, fue 10-pliegues más potente en la ciclasa de adenilato estimuladora en ambas preparaciones de membrana. bPTH-(1-84), que demostró afinidad de unión inferior, retuvo su potencia relativa inferior según se compara a hPTHrP-(1-36) en el ensayo de ciclasa de adenilato de membrana SaOS-2, pero fue esencialmente equipotente para hPTHrP-(1-36) en producción de cAMP estimuladora en RCM. A fin de investigar si existieron diferencias entre las preparaciones de célula rota e intactas, las células intactas SaOS-2 también se estudiaron (Tabla III y FIGS. 9C y 10C). En general, la afinidad relativa y la potencia estimuladora de cAMP de los agonistas de peptido que se probaron, fueron casi en paralelo a los resultados en RCM y membranas SaOS-2. Sin embargo, la potencia absoluta para algunos análogos de terminal amino varió entre 2- a -4 pliegues menos que aquella observada ya sea en las membranas SaOS-2 o RCM. De manera interesante, rPTH-(1-34) no demostró acoplamiento de segundo mensajero acoplado relativo a su afinidad de unión en células SaOS-2 (Tabla III), un modelo que se había observado en RCM y membranas SaOS-2 (Tabla II). La afinidad de hPTHrP-(1-74) fue sustanciaimente menor a aquella de hPTHrP-(1 -36), a pesar de que esta diferencia fue mayor para RCM (25-pliegues) que para células SaOS-2 (9-pliegues). De manera interesante, hPTHrP-(1-141) tuvo 5-pliegues de mayor afinidad que hPTHrP-(1-74) en ambos ensayos, pero permaneció menos potente que h PTH rP-( 1-36). La afinidad relativa de bPTH-(1-84) fue similar a aquella de hPTHrP-(1 -74), pero según se señala en el párrafo precedente, no mostró el acoplamiento mejorado para ciclasa de adenilato en células SaOS-2 o membranas como tuvo en RCM.

EJEMPLOS 3 CARACTERIZACIÓN DE ANÁLOGOS PTHrP UTILIZANDO RECEPTORES RENALES CANINOS El propósito del presente estudio fue comparar las propiedades de los receptores renales para PTH y PTHrP y determinar si los dos péptidos interactúan con los mismos receptores. Para lograr esta ayuda, el peptido relacionado a PTH, [Tyr36]PTHrP-(1 -36)amida (PTHrP-(1-36)), y [Nle8- 8, Tyr3 ]hPTH-(1-34)amida (NNT-hPTH-(1 -34)) se radioiodinaron y se utilizaron en los estudios de unión competitiva utilizando membranas corticales renales caninas (CRMC) para valorar la unión de varios análogos PTH y PTHrP. La habilidad de estos análogos PTH y PTHrP para estimular la ciclasa de adenilato también se examinó. Para una descripción detallada de los métodos en el presente ejemplo, ver por ejemplo, Orloff et al. J. Biol. Chem., 264: 6097-6103 (1989), incorporada en la presente para referencia.

Materiales y Métodos Péptidos El peptido relacionado PTH (Tyr36) PTHrP-(1-36)amida (PTHrP-(1-36)) se preparó por síntesis de fase sólida según se describe previamente (Stewart et al. J. Clin. Invest., 81: 596-600 (1988)). PTHrP-(49-74) y (Cys5, Trp11, Gly13)PTHrP-(5-18) (peptido Pl) se prepararon utilizando métodos de fase sólida similares. [Nle8 18, Tyr34]hPTH-(1 -34)am¡da sintética (NNT-hPTH-(1-34)) y PTH(bPTH)(1-34) de bovino se adquirieron de Bachem Inc., Torrance, CA. La concentración de peptido para todos los péptidos utilizados se da como el valor determinado por el análisis de aminoácido y no como el peso seco del peptido.

Radio-i od i nación La radio-iodinación de los péptidos PTHrP (1-36) y NHT-hPTH (1-34) se realizó utilizando una modificación (Thorell et al., Biochim. Biophys. Acta, 251: 363-369 (1971)) del método de lactoperoxidasa (Marchalonis, Biochem. J., 113: 299-305 (1969)). El peptido (10 µ9/10 µ?) se mezcló con Na 25l (1 mCi/10 µ?) (Ámsterdam, Arlington Heights, IL) y lactoperoxidasa (2 µg) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). La reacción se inició por la adición de peróxido de hidrógeno (20 µ? de 0.03% de H202) y se mantuvo por tres adicionales de 20 µ? de 0.03% de H202 a intervalos de 2.5 mm por un total de 10 min. La mezcla de ¡odinación se aplicó asi a un cartucho C18 Sep-Pak (Waters Associates, Milford, MA). El cartucho se lavó con 3 mi de 0.1% de TFA, y después se eluyó con 3 mi de 75:25% de "acetonitrilo: H20 (v.v) conteniendo 0.1% de TFA en tubos de prueba de vidrio de borosilicato conteniendo 30 µ? de 2% de BSA. El eluato se liofilizó y se purificó por HPLC de fase inversa utilizando una columna C18 u-Bondapak (Waters Associates). La columna se equilibró con H20 conteniendo 0.1% de TFA y se desarrolló con acetonitrilo en 0.1% de TFA. Para 125INNT-PTH-(1-34), el gradiente empleado fue un gradiente lineal de 60 min de 33-43% de acetonitrilo. Para 125IPTHrP-(1 -36), la elución se logró con un 27-34% de gradiente de acetonitrilo lineal de 50 min. Las fracciones eluidas se colectaron en tubos de vidrio de borosilicato (12x75 mm) conteniendo 30 µ? de 1% de BSA y se monitorearon para radioactividad en un espectrómetro gamma.

Análisis de Radioligando El radioligando purificado por HPLC se sometió a digestión enzimática completa en 100 µ? de un regulador que consiste de Tris-HCI (50 mM) pH 7.5, NaCI (75 mM), y asida de sodio (0.005%) (Brown et al., Biochem. 20:4538-4546 (1981)). Una mezcla de tripsina (1 µg/10 µ?), carboxipeptidasa Y (1 µg 10 µ?), aminopeptidasa de leucina (1 µg/10 µ?), y pronasa E (2 µg/ 0 µ?) (todos de Sigma, St. Louis, MO) se agregó y la digestión se llevó a cabo a 37°C por 24 horas. La reacción se detuvo al agregar 100 µ? de 0.1% de TFA. Una alícuota de 100 µ? de la digestión se inyectó, junto con 2 nmol de cada una de noyodotirosina y diyodotirosina estándar, sobre una columna C18 u-Bondapak. La columna se eluyó con un gradiente lineal de 15-30% de metanol en 0.1% de TFA durante 30 mm a una velocidad de flujo de 1.5 ml/mm, y las fracciones (600 µ?) se contaron. La absorción UV a 214 nm se monitoreó.

Preparación de Membranas Las membranas corticales renales caninas altamente purificadas (CRCM) se prepararon util izando u na modificación del procedimiento de Fitzpatrick et al. (J. Biol. Chem. , 244: 3561 -3569 ( 1 969)). La corteza renal de perros cruzados adultos se homogenizó en 3 volúmenes (ml:gm) de 0.25M de sucrosa conten iendo 5.0 mM de Tris HCI (pH 7.5), 1 .0 mM de EDTA, 6.5 KIU/ml de aprotinina y 50 µg/ml de bacitracina (regulador SET) a 4°C con diez de golpes de 30 segundos de un pistón de teflón cond ucido por motor a 2000 RPM . El homogenato se filtró a través de u n espesor de malla de nylon y se centrífugo a 1475xg por 1 0 mm. El sobrenadante se descartó y la pastilla se volvió a suspender en 1 volu men de 2.0 M de sucrosa, 5 mM de TrisHCI, 1 mM de EDTA (pH 7.5) , 6.5 KIU/ml de aprotinina , y 50 g/ml de bacitracina. Esto se centrífugo a 1 3, 300xg por 1 0 minutos y la pastilla se descartó. El sobrenadante se diluyó 8 pliegues con regulador ET (5 mM de TrisHCI, 1 mM de EDTA (Ph 7.5), 6.5 KI U/ml de aprotinina , y 50 µg/ml de bacitracina ) y se centrífugo a 20,000xg por 1 5 min . El sobrenadante se descartó y la capa superior blanca de la pastilla se removió y se volvió a suspender en un volumen de regulador SET. La centrifugación 20, 000 g se repitió dos veces más , y la pastilla blanca se suspendió en un volumen de reg ulador SET. Estos se refieren como "CRCM cruda". Las membranas se purificaron más por u na modificación del procedimiento descrito por Segre et al. (J. Biol. Chem., 254: 6980-6986 (1979)). La pastilla blanca anteriormente descrita se centrífugo a 2200xg por 1 5 mm y el sobrenadante y la parte superior de la pastilla de dos capas resultante se removió y se volvió a suspender en regulador SET. Esto se centrifugó a 20,000xa/ por 1 5 mm y el sobrenadante se descartó. La pasti lla se estratificó así sobre un g radiente d isconti nuo de sucrosa en 0.01 M de Tris, 0.001 M de Na2EDTA (pH 7.5), 6.5 KI U/ml de aprotinina , y 50 µ9/?t?? de bacitracina. E l gradiente consistió de 39% de sucrosa (2 mi), 37% de sucrosa (4 mi), y 32% de sucrosa (2 mi). Las membranas se centrifugaron a 25 , 000 rpm (75,000xg) por 90 mm a 4°C. Las bandas principales se presentaron en cada interfase además de un pastilla en la parte inferior del tubo. Los estudios preliminares de la fracción más ligera (no entrante a la sucrosa) y la fracción en el 32%-37% de interfase ind icaron la unión específica más alta y la unión no específica más baja. Sin embargo, la fracción más ligera, demostró menos degradación del radil igando en los sitios de reun ión. Por lo tanto, todos los experimentos subsecuentes se cond ujeron con esta fracción excepto en donde se ind icaron específicamente. Las membranas anteriores se d iluyeron con tres vol úmenes de regulador ET, se centrifugaron por 1 5 min a 7,800xg, se suspendieron en un volumen SET, se alicuotaron en 750 µ? de a l ícuotas y se almacenaron a -70°C. Las membranas as í preparadas retuvieron la actividad de unión de receptor total por al menos un período de almacenamiento de 6 meses. Una preparación de membrana ún ica se utilizó para todos los experimentos de unión convencionales . U na seg unda preparación de membrana se realizó uti lizando el mismo procedimiento como el anterior, pero en la presencia de leupeptina (5 µ?/?t??), pepstatina (5 µ?/???), aprotinina (10 KIU/ml), N-etilmaleimida (NEM) (1.0 mM), y fluoruro de fenilmetanosulfanilo (PMSF) (10 µ9/???) en todas las etapas (Nissenson ef al., Biochem., 26: 1874-1878 (1987)). La proteína se midió por el método de Lowry utilizando BSA como estándar.

Estudios de Unión de Receptor Los ensayos de unión se condujeron en tubos de prueba de vidrio de borosilicato de 12x75 mm con silicona a 20°C en un volumen final de 0.2 mi. El regulador de unión consistió de 50 mM de Tris HCI (pH 7.5), 4.2 mM de MgCI2, 0.3% de BSA, 26 mM de KCI, aproximadamente 60-80x103 cpm/tubo de radioligando, y, en donde es adecuado, péptidos no etiquetados. En base a los estudios de estabilidad de radioligando abajo descritos, la bacitracina se agregó a una concentración final de 100 µ9/??? para los experimentos conducidos con 25l NNT-hPTH-(1 -34) y 200 µg/ml para 125l PTHrP-(1-36). La unión se inició al agregar 50 mg de membrana. Al final de los períodos de incubación descritos, 50 µ? de alícuotas al triple se estratificaron sobre 300 µ? de regulador de unión frío conteniendo 1.0% de BSA en 500 µ? de tubos de polipropileno. Los tubos se centrifugaron a aproximadamente 16,000xg por tres min a 4°C en un microcentrífugo. El sobrenadante se aspiró y la punta del tubo que contiene el radioligando asociado por membrana se cortó. La radioactividad tanto en la pastilla como en el sobrenadante se midió. La unión total (TB) de radioligando varió entre 7.2-14.6%) de conteos totales agregados para 125l NNT-hPTH-(1 -34) y 25.5-30.0% para 125l PTHrP-(1 -36). La unión no específica (NSB) fue 1 .8+0.3% (+ SEM) para 125l N NT-h PTH-(1 -34) y 9.9 + 0.8% para 1 25l PTHrP-( 1 -36). La recuperación tanto de los radioligandos de incubación como los tu bos de lavado fue rutinariamente en exceso de 95% .

Ensayo de C iclasa de Adenilato La actividad estimuladora de ciclasa de adenilato se exami nó utilizando un ensayo de ciclasa de adenilato sensible a PTH de membrana cortical renal canina (CRCM) amplificada por nucleótido de guanilo, realizado según se describe previamente a detalle (Stewart et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 30:1454-1478 ( 1 987)). En resumen, PTHrP-( 1 -36) sintético o bPTH-( 1 -34) se ag regó en duplicado a tubos de ensayo que contienen CRCM cruda, y la conversión de a-[32P]cAMP a [32P]cAMP a 30°C por 30 min, se examinó. Los resultados se expresan como el porcentaje de incremento en la actividad de ciclasa de adenilato en tubos que contienen los péptidos según se compara con los tubos que contienen solamente veh ículo. La actividad estimuladora de ciclasa de adenilato de ambos péptidos también se examinó utilizando 32% de membranas de i nterfase altamente purificadas. La incubación se llevó a cabo bajo cond iciones de unión a 20°C por 20 min en la presencia del inhibidor de proteasa, bacitraci na (200 µg/ml). Todos los otros aspectos de este ensayo fueron idénticos al ensayo estándar.

Análisis de Datos Las constantes de disociación (Kd) se determinaron por análisis Scatchard de los datos obtenidos de experimentos de unión competitivos que utilizan radioligando e incremento de concentraciones de ligando no etiquetado. En estudios de competencia que utilizan un competidor no etiquetado diferente del radioligando, las afinidades de unión (Ki) se derivaron del IC50 (concentración de desplazamiento de ligando no etiquetado 50% de unión de radioligando específica) utilizando el programa de computadora EBDA (McPherson, KINETIC, EBDA, LIGAND, LOWRY: A COLLECTION OF RADIOLIGAND BINDING ANÁLISIS PROGRAMS, pp. 14-97, Elsevier, Ámsterdam (1985)). Las diferencias estadísticas se determinaron por la prueba igualada de Estudiante. El análisis adicional de curvas de competencia se llevó a cabo con el programa de ajuste de curvas no lineal, menos cuadrado, computarizado, de LIGANDO de Munson y Rodbard (Anal. Biochem., 707:220-239 (1980)), modificado para uso en microcomputadora por McPherson (Ibid). Los ajustes de la computadora a un modelo de uno o dos sitios se compararon, indicado el modelo estadísticamente preferido. La importancia se determinó mediante el uso de una prueba parcial F.

Resultados Caracterización de Unión de Ligando; Asociación La unión específica de 12 l NNT-hPTH-(1 -134) alcanzó el equilibrio de 20 minutos a 20°C (figura 11). La unión no específica se volvió relativamente el contenido por unos 5 minutos a 2.5 + 0.1% (SEM) de radioactividad total agregada. Para todos los experimentos de equilibrio posteriores, el tiempo de incubación fue de 20 minutos. La unión específica bajo estas condiciones varió desde 65-85% de la radioactividad total unida para 125l NNT-hPTH-(1-34) y 55-75% de la unión total de 125l PTHrP(1-36).

Estudios de Unión La inhibición de la unión de la amida 125l-[Nle8'18, Tyr34]hPTH-(1-34) se llevó a cabo mediante el uso de concentraciones crecientes de amida de amida 125l-[Nle8'18, Tyr34]hPTH-(1-34) no etiquetada, bPTH-(1-34) y PTHrP-(1-36) bajo condiciones de equilibrio (figura 12). Los análogos de PTH fueron ligeramente más potentes que PTHrP-(1-36) en la inhibición de la unión (menos de 2 veces) con una K¡ media de 7.5 nM para la amida [Nle8 18, Tyr34]hPTH-(1-34) y 6.1 nM para bPTH-(1.34). La constante de afinidad por unión (K¡) para PTHrP-(1-36) fue de 11.5 nM (Tabla II; arriba). Cuando se utilizó 125l-PTHrP-(1-36) como el radioligando, los tres péptidos sintéticos fueron aproximadamente equipotentes en la inhibición de la unión (figura 13). Las constantes de disociación de la unión para la amida de [Nle8 18, Tyr34]hPTH-(1-34), bPTH-(1-34) y PTHrP-(1-36) fueron 8.5, 10.5 y 14.1 nM, respectivamente (Tabla II, arriba). Tanto PTHrP-(49-74) como también PTHrP de terminal amino bio-inactiva, de 13 amino ácidos, sintética (péptido Pi) fallaron al inhibir la unión de 125l-PTHrP-(1 -36) a membranas renales caninas (figura 13). Las gráficas Scatchard representativas de los datos de unión en equilibrio se presentan en las figuras 12 y 13. El valor Bmax para el análogo de PTH fue de 2.73 + 0.31 pmol/mg de proteína y para PTHrP-(1-36) fue de 5.08 + 0.56 pmol/mg de proteina. El análisis de ambos conjuntos de datos con el programa LIGANDO demostró una sola clase de sitios receptores de alta afinidad; los datos no encajarían en un modelo de dos sitios. En resumen, cada análogo de PTH/PTHrP no etiquetado redujo la unión de cada radioligando en el mismo grado, sugiriendo que los análogos de PTH/PTHrP se unen a un receptor similar o idéntico. El análisis de Scatchard indicó una clase homogénea de sitios receptores de alta afinidad sin interacciones de unión cooperativas importantes. Los fragmentos de PTHrP biológicamente inactivos fallaron al desplazar el radioligando. Estos datos, que demuestran afinidades de unión similares y valores Bmax para PTHrP y análogos de PTH en membranas caninas renales, también se han observado en células derivadas de hueso (Juppner et al., J. Biol. Chem., 263: 8557-8560 (1988)), en membranas caninas renales y células de osteosarcoma UMR-106 (Nissenson et al., J. Biol. Chem., 263: 12866-12871 (1988)).

Ensayo de Ciclasa de Adenílato: En contraste con sus afinidades similares en el ensayo de unión, bPTH-(1-34) fue substancialmente más potente que PTHrP-(1-36) en el ensayo de ciclasa de adenílato cortinal, renal, canina (Tabla II). Esta relación se observó en ambas condiciones de ensayo estándar (30°C durante 30 minutos) y bajo condiciones de ensayo de unión (20°C durante 20 minutos, con bacítracina). En el ensayo estándar (30 min, 30°C), bPTH-(1-34) tuvo más de 6 veces la potencia de PTHrP-(1-36) con valores Km de 0.06 y 0.40 n , respectivamente. Para excluir la posibilidad de que ocurriera la destrucción selectiva de PTHrP durante el ensayo en presencia de membranas renales, el ensayo de ciclasa de adenilato se llevó a cabo bajo condiciones de unión que habían demostrado dar como resultado la proteolisis insignificante de radioligandos. Bajo condiciones idénticas al ensayo de unión en equilibrio (20°C, 20 min, con bacitracina), la estimulación de ciclasa de adenilato por bPTH-(1-34) fue 15 veces mayor que para PTHrP-(1 -36). Los valores Km bajo condiciones de ensayo de unión fueron de 0.13 y 2.00 nM, respectivamente.

EJEMPLO 4 CARACTERIZACIÓN DE ANÁLOGOS DÉ PTHRP MEDIANTE EL USO DE RATAS OSTEOPÉNICAS, CON EXTIRPACIÓN DE OVARIOS Los análogos de PTHrP candidatos se evaluaron respecto a su efecto en la masa ósea en ratas con extirpación de ovarios, generalmente de acuerdo con los procedimientos de Stewart et al., J. Bone Min Res, 15: 1517-1525 (2000), incorporado en la presente para referencia. En el presente ejemplo, se seleccionaron tres moléculas de PTH/PTHrP para comparación directa: PTH(1-34), PTHrP(1-36) y el análogo de PTH, SDZ-PTH-893 (Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gln18, Thr33, Ala34hPTH(1 -34)). Se llevó a cabo un estudio de seis meses en el cual ratas adultas (de seis meses de edad) tratadas con vehículo, con extirpación de ovarios (OVX) y OVX sustituto se compararon con ratas de OVX que reciben 40 µg/kg por día de ya sea PTH(1-34), PTHrP(1-36) o PTH-SDZ-893.

Métodos Péptidos y Administración de Péptidos El PTH(1-34) humano recombinante (rec hPTH(1-34) o LY333334) se preparó como se describe previamente (Hirano ef al, J Bone Min Res 14: 536-545 (1999); Frolick et al., J Bone Min Res 14: 163-72 (1999)). El PTHrP(1-36) se preparó mediante el uso de síntesis de fase sólida como se describe previamente (Everhart-Caye et al., J Clin Endocrino! Metab 81: 199-208 (1996); Henry et al., J Clin Endocrino! Metab 82: 900-906 (1997); Plotkin ef al, J Clin Endocrino! Metab 83: 2786-2791 (1998)). Las secuencias de humano y de rata de PTHrP(1-36) son idénticas. SDZ-PTH-893 ((Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gln 8, Thr33, Ala34hPTH(1-34) (Gamse et al., J Bone Min Res 12(suppl): S317 (1997)) se preparó mediante el uso de síntesis de fase sólida. El espectro de masa y la composición amino acida se determinaron como correctos para cada péptido y se confirmó una pureza mayor de 97% por HPLC de fase inversa analítica. Los péptidos se administraron de manera subcutánea en 0.001 N de HCI en solución salina que contiene 2% de suero de rata con extirpación de ovarios (OVX) inactivado por calor a pH 4.2.

Animales Todos los estudios se llevaron a cabo utilizando ratas Sprague-Dawley hembras, negativas a anticuerpos y virus de Harían Sprague-Dawley (Indianápolis, IN). Todas las ratas experimentaron ovariectomía de sustitución u ovariectomía a los 5 meses de edad. Los estudios comenzaron a los seis meses de edad , un mes después de la ovariectomía u operación de sustitución. Las ratas se mantuvieron en una dieta que contiene 0.5% de calcio y 0.4% de fósforo. El ciclo de luz fue de 1 2 horas.

Protocolo El protocolo empleado se describe en forma esq uemática en la Tabla IV. Los animales se asignaron de manera aleatoria a 1 7 g rupos de 10 como se describe en la Tabla. Excepto para los animales en el primer grupo, los cuales fueron sacrificados a los ci nco meses de edad, los animales restantes se observaron durante un mes, y el tratamiento con los diversos péptidos o vehículos de prueba se inició a los seis meses de edad. Para los animales tratados con péptido, el péptido se administró diariamente, de manera subcutánea a una dosis de 40 µg/kg/d ía en el veh ículo arriba descrito. Para los an imales tratados con veh ículo, el veh ículo solo se administró en una manera idéntica.

Químicas Las q u ímicas de suero y orina como se describen en la Tabla XI se llevaron a cabo mediante el uso de métodos de autoanálisis estándares (Boeringer-Mannheim-Hitachi , I ndianápolis , IN ). El contenido de calcio en riñon se determi nó después de la extracción de los rí ñones completos en ácido tricloroacético al 5%, seg uido por una medición de calcio mediante el analizador de calcio (Calcette, idfield , MA).

Mediciones de la Masa Ósea La masa ósea se determinó mediante el uso de peso de ceniza ósea así como también de med iciones DEXA del rad io, fémur y cuerpo completo. El contenido mineral óseo del cuerpo entero se determinó mediante el uso de un densitómetro Eclipse DXA de Norland , y los resultados se expresan en mg. La densidad mineral ósea del fémur izquierdo en mg/cm2 (BMD), el contenido mineral óseo en mg (BMC) y área de corte transversal en cm2 (área X) se determinaron mediante el uso de un densitómetro QD R 4500A Hologic calibrado, acoplado a un software de Alta Resolución Reg ional de Animales Peq ueños, según se lleva a cabo por S. Orwoll en la Universidad de Ciencias de la Sa lud de Oregon., Pórtland O R. La mediciones de longitud máxima del radio izquierdo se llevaron a cabo mediante el uso de calibres U ltra-Cal I I I de Fowler/Sylvac (Newton, MA). El peso de cenizas del rad io se determinó como se describe (Hock et al. , J Bone Min Res 7: 65-72 ( 1 992); Hock et al., Endocrinology 125: 2022-2027 ( 1 989)) después de una cu idadosa limpieza del radio, de tejido no esq uelético, deshidratación en éter du rante 48 horas, seg uido por secado por aspersión d ura nte 24 horas, y calcinación en un horno (Barnstead/Thermodyne, Dubuque , IA) a 850°C durante 16 horas. Los pesos de cenizas se reg istraron en mg mediante el uso de una microbala nza.

Histomorfometría Ósea La histomorfometría ósea se llevó a cabo en secciones incrustadas en metacrilato de metilo de la tibia derecha de cada animal después de sacrificio como se describe en la Tabla IV. Los an imales se etiq uetaron utilizando calceína, 30 mg/kg , administrada subcutáneamente siete y tres d ías antes del sacrificio. Las mediciones histomorfométricas estándares se llevaron a cabo como se muestra en las Tablas IV-VI (Parfitt et al. , J Soné Min Res 2: 595-61 0 ( 1 987)).

Mediciones Biomecánicas de Resistencia La curvatura de tres puntos en el eje medio del femoral y la compresión del cuerpo vertebral L5 se realizaron a 37°C. El cizallamiento del cuello femoral se realizó a temperatura ambiente. Los métodos completos para estas pruebas se han reportado previamente (Sato et al. , Endocrinology 138: 4330-4337 ( 1 997); Turner y Burr, Bone 14: 595-608 ( 1 993); Sato et al. , Endocrinology 139: 4642-51 ( 1 998), cada uno incorporado en la presente para referencia).

Análisis Estadístico Los análisis estad ísticos se llevaron a cabo med iante el uso de software de SAS . El análisis de varianza de dos vías se l levó a cabo para determinar si existían interacciones significativas entre los tratamientos y el tiempo, y si existían diferencias entre agentes . Las comparaciones por par se realizaron mediante contraste de pruebas T si se presentaban interacciones sig nificativas y por la prueba de Dun nett si no se encontraban interacciones significativas. El nivel de importancia se estableció en p>0.05.

Resultados Los incrementos estad ística y cuantitativamente significativos se observaron en el área de corte transversal del fémur, el contenido mineral óseo femoral y la densidad mineral ósea de los grupos de PTH , PTHrP y SDZ-PTH , con un orden de rango de SDZ-PTH>PTH>PTH rP (ver Tabla VII I). El contenido mineral óseo femoral (figura 14) se incrementó de manera importante y notable en cada uno de los grupos tratados con péptido, en cada uno de los tres puntos de tiempo determinados. No se observaron cambios en la longitud del fémur debido al tratamiento (ver Tabla VI I I). No hubo diferencias importantes en el B MC del cuerpo entero en los tres gru pos tratados con péptido en comparación con sus controles de OVX igualados en tiempo (ver Tabla VI I I para detalles). E l peso de ceniza del radio (ver Tabla VI I I ) se i ncrementó de manera i mportante durante el estudio en los g rupos animales tratados con péptido, incrementándose más allá de los valores observados en los grupos de OVX y de control por sustitución. La h istomorfometría ósea se llevó a cabo con objeto de determinar las características estructurales de los cambios esq ueléticos así como también cambios en trastorno óseo. Como puede observarse en las figuras 1 5 y 16 , el área tra becular (TB.Ar) se decl inó notablemente en los animales de control OVX y permaneció oprimida a través de todo el estud io, en comparación con los animales sustitutos. En contraste, los incrementos notables en el área trabecular ocurrieron en los tres grupos tratados con péptido, con el mismo orden de ra ngo observado en las mediciones de masa ósea: SDZ-PTH>PTH>PTHrP. El Tb.Ar incrementado es los animales tratados fue principalmente el resultado del grosor trabecular incrementado, lo cual dio como resultado una separación trabecular red ucida (ver Tabla V). La formación ósea (MS/BS) declinó con la edad los primeros 30 d ías en todos los an imales (figura 1 5; ver Tabla VI para mayor detalle). Sin embargo, cada punto de tiempo después del inicio del tratamiento, los parámetros de formación ósea se incrementaron significativamente en los tres grupos de animales tratados con péptido en comparación con los animales OVX y sustitutos acoplados por edad (Tabla VI , fig ura 1 5). Los parámetros de resorción ósea declinaron con la edad en los cinco grupos (figura 16; ver Tabla VII para mayor detalle). En contraste con las diferencias en la formación ósea entre los grupos, no existen diferencias importantes en la formación ósea entre los grupos, no existen d iferencias importantes en los parámetros de resorción entre animales OVX en cualq uier punto de tiempo. Las mediciones biomecánicas mejoraron los tres grupos tratados con péptido (figura 17 y ver Tabla IX y X para detalle adicional). En la espina lumbar, las mediciones de resistencia biomecán ica se incrementaron con cada uno de los péptidos. En el cuello femoral , la carga final también se incrementó con los tres polipéptidos. Los cambios fueron estad ísticamente sig nificativos y cuantitativamente grandes. De manera importante, para los tres péptidos, las mediciones biomecánicas en la espina lumbar y el cuello femoral excedieron aquel las encontradas no solamente en controles de OVX, sino también en los controles de sustitución. En el eje medio del fémur, un sitio de hueso cortical, se observaron hallazgos similares (figura 17). En general, los tres grupos tratados con péptidos demostraron parámetros biomecánicos aumentados o mejorados en comparación con ambos grupos de control OVX y sustituto, y estos cambios fueron estadística, cuantitativa y funcionalmente muy significativos (ver Tabla X para completar detalles). El peso corporal se incrementó con el incremento de la edad en todos los grupos a través del estudio pero no hubo diferencias significativas entre los grupos de control y tratado. Los animales ganaron peso a aproximadamente la misma velocidad (ver Tabla XI para detalles). El calcio en suero promedio permaneció normal en los animales sustituto y OVX a través de todo el estudio (figura 18, ver Tabla XI para completar detalles). Esto fue verdadera también para los animales tratados con PTH y PTHrP. En contraste con estos dos grupo de tratamiento, la hipercalcemia franca ocurrió en los animales tratados con SDZ-PTH, con concentraciones de calcio promedio de 11.3, 11.6 y 11.7 mg/dl en los meses 1, 3 y 6, respectivamente. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas. También fueron biológicamente significativas ya que cuatro de los 30 animales tratados con SDZ-PTH-893 (13%) murió durante el estudio a 75, 83, 130 y 133 días de tratamiento. Aunque el calcio en suero promedio fue normal en el grupo de PTH, un animal tratado con PTH (3%) murió con hipercalcemia el día 171. Ningún animal tratado con PTHrp murió durante el estudio.

Discusión Los análogos de PTHrP candidatos u otros agentes anabólicos esqueléticos pueden examinarse utilizando los métodos arriba descritos. Los análogos de PTHrP u otros agentes anabólicos esqueléticos, útiles en los métodos de la presente invención, se espera que se incrementen significativamente en el calcio óseo total, calcio trabecular, calcio óseo cortical, grosor trabecular y volumen óseo sobre controles OVX no tratados.

EJEMPLO 5 SISTEMA Y MÉTODOS PARA DISEÑO DE PEPTIDOMIMÉTICOS Y PEQUEÑAS MOLÉCULAS QUE TIENEN ACTIVIDAD BIOLÓGICA SIMILAR A PTHRP Y AGENTES ANABÓLICOS ESQUELÉTICOS Según se describe anteriormente, los péptidos PTHrP, PTH y TIP, así como también sus receptores y trayectorias metabólicas resultantes, puede utilizarse para desarrollar los peptidomiméticos y fármacos de pequeña molécula, que son útiles como agonistas y antagonistas de estos agentes anabólicos esqueléticos. Según se utiliza en la presente, un "peptidomimético" se refiere a derivados de los fragmentos o péptidos de longitud completa de los agentes anabólicos esqueléticos PTHrP, PTH o TIP, anteriormente descritos, que demuestran actividad biológica incluyendo la modulación de masa ósea, así como también las mezclas, composiciones farmacéuticas, y composiciones que comprenden las mismas. Un "fármaco de molécula pequeña" se refiere a un compuesto de peso molecular bajo que ocurre naturalmente, teniendo actividad similar. En cualq uier caso, la actividad biológica de un fármaco de peq ueña molécula o peptidomimético puede ser agon ística o antagonística a aquella de PTHrP, PTH, o TIP, o puede incl uir un espectro de actividad , es decir, puede ser antagon ística a la actividad PTH y agonística a la actividad PTHrP. Como con PTH , la actividad biológica de PTHrP se asocia con la parte de terminal N , con residuos (1 -30) de manera m ínima proporcionando la actividad biológica . Las formas truncadas del peptido infundibular tubular de 39 aminoácidos (TI P) también se ensayan para la actividad biológ ica. Los receptores para estos agentes también son objetivos para el d iseño de fármaco de base estructu ral . Seg ún se describe anteriormente, el receptor PTH/PTHrP de 500 aminoácidos (también conocido como el receptor PTH 1 ) pertenece a una subfamilia de GCPR que incluye aquellos para glucagon, secretina, y peptido intestinal vasoactivo. Las regiones extracelulares se incluyen en la unión de hormona, y los dominios intracelulares , después de la activación de hormona , se unen a las subunidades de proteína G para transduci r la señalización de hormona en respuestas celulares a través de la estimulación de los segundos mensajeros. Estos segundos mensajeros de igual forma proporcionan objetivos de fármaco. También anteriormente descrito, un segundo receptor PTH (receptor PTH2) se expresa en cerebro, páncreas y otros diversos tejidos. Su secuencia de aminoácidos y modelo de su u n ión y respuesta estimuladora a PTH y PTHrP difieren de aq uella del receptor PTH 1 . El receptor PTH/PTHrP responde de manera equivalente a PTH y PTHrP, mientras que el receptor PTH2 responde solamente a PTH . El ligando endógeno de este receptor parece ser peptido-39 o TIP-39 infundibular tubular. En un aspecto de la invención, estas composiciones modulan, es decir, regulan hacia arriba o regulan hacia abajo la actividad de receptor PTH 1 o PTH2. En otro aspecto, un sistema que comprende la información estructural en relación a las coordenadas atómicas obtenidas por la desviación de rayos x de un peptido PTHrP, PTH, o TIP, fragmento, peptidomimético o fármaco de molécula pequeña, se proporciona. En otra modalidad, y anticuerpo para un peptido PTHrP, PTH o TIP, fragmento, peptidomimético o fármaco de molécula pequeña, se proporciona. Aún en otra modalidad, una preparación cristalina purificada de un peptido PTHrP, PTH, o TIP, fragmento, peptidomimético o fármaco de molécula pequeña, se proporciona. Las estructuras de receptores PTH 1 o PTH2, o un peptido PTHrP, PTH , o TIP, fragmento, peptidomimético o fármaco de pequeña molécula se obtienen por desviación de rayos x de polipéptidos cristalizados, espectroscopia de resonancia magnética nuclear 2-D de los mismos, o por métodos de obtención de estructuras de alta resolución de materiales biológicos. Las estructuras de alta resolución se refieren a estructuras resueltas a mayores de 2.8 angstromos, y preferentemente mayores a 2.3 angstromos, y se utilizan para mapear los sitios activos de estos receptores y sus ligandos. Las estructuras se determinan y se interpretan utilizando sistemas de computadora descritos en la materia, por ejemplo, teniendo al menos un banco de memoria, una pantalla, un medio de entrada de datos, un procesador y un grupo de instrucción comprendiendo un algoritmo para lectura, interpretando y volviendo los datos estructurales, todos los cuales se conocen en la materia, por ejemplo, ver, Patente de E. U. No. 6 ,273 ,598 para Keck et al. , titu lada , Sistema de Computadora y Métodos para producir análogos de morfogen de O P-1 humano, incorporada en la presente para referencia. De acuerdo a la presente invención , tales sistemas pueden mantenerse solos o trabajarse por red , es decir, a través de una red encendida por paq uete. Los programas de diseño ayudados por computadora (CAD) se emplean para diseñar los peptidomiméticos y los agentes de molécu la peq ueña teniendo actividades de agon ista o antagonista de receptor adecuado, en base a los mapas estructurales obtenidos. Los agentes candidato se ensayan para la actividad biológ ica como PTHrP, PTH , y TI P uti lizando los ensayos descritos en la presente, así como también los ensayos simi lares conocidos en la materia.

TABLA I. Demográficos de Línea Base PBO PTHRP B. (n=8) (n=8) Edad (años) 56.5±1.3 61.5±2.4 ns Altura (cm) 162.5±2.3 161.6±2.3 ns Peso (kg) 62.1+2.7 62.3±3.0 ns BMI 23.6±1.1 24.0+1.5 ns Plasma 25 D 61.9±2.1 63.1±2.1 ns (nmol/L) Ingesta de Calcio 940+186 1438+296 ns (mg/día) Años después de la 13.5+2.9 12.3±2.3 ns menopausia Años con estrógeno 8.4±1.7 8.0±1.5 ns # en Tiroxina 1/8 0/8 ns Fumador 2/8 0/8 ns L/S B D (gm/cm2) 0.748±.03 0.763±.01 ns L/S BMD -2.71 + .26 -2.58+.12 ns (Puntuación/T) T. Cadera BMD 0.710±.02 0.7221.02 ns (gm/cm2) T. Cadera BMD -1.9+.15 -1.77+021 ns (Puntuación/T) FN BMD (gm/cm2) 0.572±.02 0.654±.03 ns FN BMD -2.5+.21 -1.95±.27 ns (Puntuación-T) TABLA II PTHrP-(1-36) 11.5+2.5a 14.0±5.4" 0.40+0.07° 2.00±0.17a ap = 0.03 0 No significativo cp < 0.002 Los estudios de unión se condujeron a 20°C utilizando amida de [Nle · Tyr ]hPTH-(1- 34) monoyodada (125I-PTH) o amida de [Tyr36]PTHrP-{1 -36) ('"l-PTHrP) como el radioligando. Los valores Kd se determinaron por análisis Scatchard y los valores K¡ se derivaron de los valores IC50. La estimulación por ciclasa de adenilato se evaluó bajo condiciones de ensayo estándares, empleando membranas renales caninas, parcialmente purificadas e incubaciones de 30 minutos a 30°C. La estimulación por ciclasa de adenilato también se evaluó bajo condiciones de ensayo de unión, utilizando membranas renales caninas altamente purificadas en presencia de bacitracina (200 µg/ml) e incubaciones de 20 minutos a 20°C.

Actividad in vitro de PTH y agonistas de PTHrP en RCM humano (membranas de riñon) en comparación con membranas de SaOS-2 Unión (IC50) (nM) Ciclasa de adenilato Péptido (EC50) (nM) Membranas Membranas Membranas Membranas de riñon de SaOS de riñon de SaOS (Tyr36)hPTHrP-(1- 0.42±0.07 0.64±0.02 0.50±0.10 0.5±0.07 36)NH2 (Nle818Tyr34)hPTH- 3.6±0.7a 2.0+0.3a 1.1±0.1" 1.9±0.4C (1-34) bPTH(1-34) 0.39±0.06 1.5+0.4 0.26±0.14 0.50+0.06 rPTH-(1-34) 0.35+0.15 0.56±0.06 0.05±0.01" 0.09±0.03ß (Tyr36)cPTHrP-(1- 0.47±0.22 1.1+0.3 0.49±0.06 0.87±0.34 36)NH2 BPTH-(1-84) 5.1±2.3b 8.0+2.0" 0.59±0.21 2.4±0.2rf Los valores son la media + SEM de dos o más experimentos para cada péptido. Análisis es 5t taa dd ííssttii cco contra (Tyr3S)hPTHrP-(1 -36)NH2: P < 0.01 6 PP << 00..0055 P < 0.001 d P < 0.0001 TABLA III Actividad in vitro de PTH y agonistas de PTHrP en RCM humano (membranas de riñon) en comparación con células d SaSO-2 intactas Unión (ICS0) (nM) Ciclasa de adenilato Péptldo (EC50) (nM) Membranas Membranas Membranas Membranas de riñon de SaOS de riñon de SaOS [Tyr36]hPTHrP- 0.42±0.07 1.5±0.10 0. .50+0.10 1.0±0.1 (1-36)NH2 hPTH-(1-34) 1.9±0.4a 3.1±0.3" 0. .70+0.40 1.6+0.0a [Nle818, Tyr34] 3.6±0.7a 2.8+0.1" 1. 1±0.1c 2.3±0.4b hPTH-(1-34) bPTH-(1-34) 0.39+0.06 1.3+0.1 0. 26±0.14 1.2±0.1 rPTH-(1-34) 0.35±0.15 0.9±0.2C 0. 05+0.01c 0.9+0.1" cPTH-(1- 21.5±8.5a 0" 5. 4+0.1e 3.9+0.1" 34)NH2 [Tyr36]cPTHrP- 0.47±0.22 od 0. 49+0.06 0.8+0.1 (1-36)NHZ hPTHrP-(1-74) 9.5±3.5a 12.9±1.4" 7. 8+0.8a 9.2+1.0" hPTHrP-(1- 2.0±0.1e 2.4±0.1a 1. 3±0.4 1.9±0.4e 141) BPTH-(1-84) 5.1±2.3C 17.5±2.5" 0. 59+0.21 7.7±1.4" Los valores son la media +. SEM de dos o más experimentos para cada péptido. Análisis estadístico contra (Tyr36)hPTHrP-(1 -36)NH2: aP<0.01 bP<0.0001. CP<0.05 dP0, Estos péptidos se examinaron en membranas de SaOS-2, no en células de SaOS-2 (ver Tabla II) eP<0.001 TABLA IV Protocolo Meses de tratamiento ID Cirugía No/Grupo 1 2 3 4 5 6 7 SB Sustituto 10 Eliminado O OVX 10 Eliminado S30 Sustituto 10 Soportado Vehículo V30 OVX 10 Soportado Vehículo P30 OVX 10 Soportado PTH R30 OVX 10 Soportado PTHrP A30 OVX 10 Soportado STZ S90 Sustituto 10 Soportado Vehículo Vehículo Vehículo V90 OVX 10 Soportado Vehículo Vehículo Vehículo P90 OVX 10 Soportado PTH PTH PTH R90 OVX 10 Soportado PTHrP PTHrP PTHrP A90 OVX 10 Soportado STZ STZ STZ S180 Sustituto 10 Soportado Vehículo Vehículo Vehículo Vehículo Vehículo Vehicle V180 OVX 10 Soportado Vehículo Vehículo Vehículo Vehículo Vehículo Vehicle P180 OVX 10 Soportado PTH PTH PTH PTH PTH PTH R180 OVX 10 Soportado PTHrP PTHrP PTHrP PTHrP PTHrP PTHrP A180 OVX 10 Soportado STZ STZ STZ STZ STZ STZ TABLA V Histomorfometría Estructural De La Tibia Próxima Derecha En Ratas Maduras Con Extirpación De Ovarios (OVX) Dado Una Vez Al Día Rec hPTH-(1-34), PTHrP-(1-36) o SDZ-PTH-893, Durante 30, 90 o 180 Días Area Trabecular Numero Trabecular Espacio Densidad 30 Días 20±1a 3.9+0.2a 206±13a 51±2 Sustituto 6±1 1.3±0.3 847±98 46±2 OVX 19+2a 2.3+0.1a'° 367+28a c 81±5a c PTH(1-34) 13±1 a,b,c 2.1±0.1a'c 436+36a c 62±3a, ,c PTHrP(1-36) 23±3a 2.5±0.2a c 348±42a o 93±4a c SDZPTH893 — 1 N; a 90 Días 20±2a 3.7+0.3a 230±27a 52±3 Sustituto 3±1 0.6+0.1 2178±363 51±6 OVX 38±3a c 2.4±0.2a c 274±34a 158±6a'c PTH(1-34) 19±3a'b 2.1±0.2a c 398+35a,b,c 89±5a' 'c PTHrP(1-36) 50±5a c 2.4±0.1a c 210±23a 205±20a'c SDZPTH893 180 Días Sustituto 15±3a 2.7±0.3a 374+78a 53±4 OVX 9±7 0.7±0.2 1923±492 77±32 PTH(1-34) 38±3a'c 2.3±0.1a 279±29a 163±8a'c PTHrP(1-36) 23±2a. ,c 2.3+0.2a 361+433 97±4a,b,c SDZPTH893 57±4a'c 3.3+0.5a b 139±26a'b'c 183+20a c Los datos expresan una + SEM media para 7 a 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05. Los datos de línea base no se incluyeron en análisis estadísticos y se muestran solamente con propósitos descriptivos. a contra OVX igualado en tiempo b contra PTH(1-34) igualado en tiempo c contra sustituto igualado en tiempo Tabla VI Mediciones De Formación Ósea De La Tibia Proximal Madura En Ratas Maduras Con Extirpación De Ovarios (OVX) A Las Que Se Da Una Vez Al Día Rec hPTH-(1-34) (Ly333334), PTHrP-(1-36) o SDZ PTH 893, Un Análogo De PTHrP, Durante 30, 90 o 180 Días Superficie Mineralizante Velocidad de Aposición Velocidad de formación MS/BS MAR Ósea BFR/BS (µp?/d) (µ??/d) Línea Base OVX 37±1 4.7±0.8 1.77±27 Línea Base Sustituto 32±2 4.4±0.4 1.42+20 30 Días 18+2a 2.8±0.1a 0.55±6 Sustituto 26±2 2.4±0.1 0.69±6 OVX 49±2a'c 2.4±0.1° 1.18±7a'° hrPTH(1-34) a.b.c 39+1 2.6+0.1 1.00±4a'bJ PTHrP(1-36) a,c 1 i42±8a.b,, 56±3 2.6±0.1 SDZPTH893 90 Días 14+1a 2.4+0.2 0.36±4 Sustituto r 21±2 2.4±0.1 0.51±6 -si OVX 41 ±1 a'' 3.0±0.1a'c 1.23±4a c rhPTH(1-34) a,b,c 37 + 1 3.6±0.7a 1.36+28a,b,c PTHrP(1-36) a,b 44±2 3.3±0.2a,c 1.45±10a,c SDZPTH 893 180 Días 14±2 2.6±0.3 0.38±7 Sustituto 19±2 2.9±0.2 0.54±8 OVX 40±2a 3.8+0.7° 1.53±28a'c rhPTH(1-34) 29+1 a' a,b,c 3.6±0.5C 1.05±13 PTHrP(1-36) 45+3a 3.2±0.2C 1.43±9a'° SDZPTH 893 Los datos se expresan como una + SEM media para 7 a 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05. Los datos de linea base no se Incluyeron en análisis estadísticos y se muestran solamente con propósitos descriptivos. a contra OVX igualado en tiempo 11 contra hPTH(1-34) Igualado en tiempo c contra sustituto igualado en tiempo TABLA VII Mediciones de Resorción Ósea de la Tibia Proximal Derecha en Ratas Maduras con Extirpación de Ovarios (OVX) Dado Una Sola Vez al Día rec hPTH-(1-34) (LY333334), PTHrP-(1-36) o SDZ-PTH-893, un Análogo de PTHrP, durante 30, 90 o 180 Días Superficie de Superficie Osteoclasta Resorción Oc.PM E.P.M. (%) Línea Base OVX 20.3±1.4 9.0+0.8 Línea Base Sustituto 18.3+1.8 6.1+1.0 30 Días 9.9±2.1 2.1+0.6 Sustituto 11.4+1.7 3.7±0.9 OVX 8.6±1.2 2.3+0.6 rhPTH(1-34) 9.4+1.7 2.4±0.6 PTHrP(1-36) 7.1+1.3a 1.6+0.6 a SDZPTH 893 90 Días 7.0+1.0 1.6±0.5 Sustituto 9.6+2.0 4.5+1.1 OVX 10.6±1.3C 2.6+0.5 rhPTH(1-34) 10.3+1.5 3.1±0.6 PTHrP(1-36) 10.0+1.3 2.0±0.7 SDZPTH 893 180 Días 2.4±0.4 0.8+0.2 Sustituto 2.3±1.1 1.2±0.6 OVX 6.4±1.5 2.0+0.4 rhPTH(1-34) 6.4±1.1a c 2.0±0.6 PTHrP(1-36) 30±1.0 0.4+0.3b SDZPTH 893 Los datos se expresan como una + SEM media para 7 a 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05. Los datos de línea base no se incluyeron en análisis estadísticos y se muestran solamente con propósitos descriptivos. a contra OVX igualado en tiempo contra hPTH(1-34) igualado en tiempo c contra sustituto igualado en tiempo TABLA VIII Masa Ósea del Cuerpo Completo, Radio, o Fémur en Ratas Maduras Con Extirpación de Ovarios A Las Que Se Da Una Vez Al Día rec hPTH-(1-34) (LY333334), PTHrP-(1-36) o SDZ PTH 893, un Análogo de PTHrP, Durante 30, 90 o 180 Días BMC de Peso de Fémur Izquierdo Cuerpo Ceniza de Longitud Área X BMC BMD Completo Radio (mg) Línea Base 66±1a 55±1 34.6+0.2 1.62+0.03 0.289±0.008 0.177±0.002 OVX1 Línea Base 53±1 52±1 33.6+0.2 1.55±0.03 0.294±0.007 0.190±0.004 Sustituto2 30 Días OVX 66±2a 58+2 34.9+0.3 1.60±0.05 0.289±0.014 0.180±0.004 Sustituto 58±1 54+1 34.3±0.2a c 1.57+0.03 0.300+0.009 0.190+0.004 rhPTH(1-34) 64±3C 60±1c 34.9±0.3 1.68±0.04c 0.340+0.011a c 0.200±0.004a , PTHrP(1-36) 67±2C 58±1 34.7±0.2 1.64±0.03 0.313±0.011b 0.19110.004 SDZPTH 893 67±2C 62+1a c 34.9+0.3 1.73+0.04a'c 0.361+0.009a c 0.210±0.002a'b c ? 90 Días OVX 68±4a 52±0 35.5±0.4 1.65+0.02 0.293+0.006 0.178±0.003 Sustituto 57+2 54±4 34.1+0.3a 1.57±0.05 0.309±0.017 0.19810.006a rhPTH(1-34) 69±3C 66±1a c 35.7±0.2C 1.73±0.03c 0.401+0.010a c 0.232+0.005a'c PTHrP(1-36) 69+4° 60±2a,c 35.5±0.2C 1.71±0.04c 0.348+0.007a b 0 0.203±0.003a'b SDZPTH893 70±2C 69±1a c 35.7±0.2C 1.82+0.02a'b c 0.442+0.006a c 0.24210.003a c 180 Días OVX 72±4a 59±1 35.3±0.3 1.57+0.04 0.280±0.009 0.177+0.004 Sustituto 59±3 54+2 34.3±0.3a 1.53+0.04 0.291±0.009 0.18910.004a rhPTH(1-34) 71+3° 72±2a c 35.6±0.3C 1.84+0.04a c 0.451+0.012a c 0.234+0.004a c PTHrP(1-36) 68±2C 62±1a.b,c 35.1±0.3C 1.64±0.03b'° 0.357+0.007a'b c 0.218+0.003a'b'c SDZPTH893 68i3c 78+3a c 36.4+0.03c 1.96+0.05a'c 0.530+0.018a c 0.27310.005a'c TABLA IX Ganancia en Peso Corporal y Químicas en Suero en Ratas Maduras con Extirpación de Ovarios a las que se da Una Vez al Día rec hPTH-(1-34), PTHrP(1-36) o SDZ PTH 893, durante 30, 90 o 180 Días Ganancia Calcio en Fosfato Magnesio Creatinina Nitrógeno Riñon Fosfatasa de Peso Suero en Suero en Suero en Suero de Urea (mg Ca/gm alcalina Corporal (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) en Suero peso (IU/L) (g) (mg/dL) húmedo) Línea Base 10.7+0.1 7.7+0.3 2.91+0.07 0.74+0.01 16.5+0.6 0.20±0.01 78±5 Sustituto — 10.6+0.1 7.3±0.3 2.75±0.08 0.76±0.01 18.2±0.6 0.25±0.04 100±4 Línea Base OVX 30 Días Sustituto 1.0±1.4 10.8±0.1a 7.9±0.5 3.06±0.10 0.79±0.01 17.9±0.7 0.22±0.01 74±6a OVX 1.7±3.0 10.4±0.1 7.3±0.2 2.94±0.08 0.78±0.02 17.7+0.09 0.27±0.03 88±3 PTH(1-34) 2.2±1.3 10.7+0.1a 6.5±0.2ac 2.89+0.06 0.80±0.01 20.1+0.8ac 0.25±0.02 83±3 ¦ PTHrP(1- 2.2±1.3 10.5+0.1 6.8+0.2 2.88+0.07 0.78+0.01 17.7±0.4 0.29+0.06 90±5C ? 36) c o SDZPTH893 -1.3+1.8 11.3±0.3abc 5.5±0.2abc 2.90+0.07 0.79±0.01 19.1±0.6 0.26±0.01a 83±4 ' 90 Días Sustituto 13.1+3.8 10.2+0. 6.5+0.2a 2.74±0.05 0.79±0.02 20.1±0.09 0.2110.03 71±4a OVX 22.2+5.3 10.1 ±0.1 5.7+0.2 2.57±0.06 0.80±0.01 19.5+0.08 0.19+0.02 103+11 PTH(1-34) 30.6±4.8 10.7±0.1ac 5.4+0.2c 2.70±0.03 0.78+0.02 22.1±1.2 0.36±0.06ac 102±6C PTHrP(1-36) 14.3±3.9 10.3±0.1 5.4+0.3a c 2.60±0.08 0.78+0.02 21.3±1.3 0.21+0.03" 103±4C SDZPTH893 26.5±3.7 11.6+0.1a c 4.7±0.1ac 2.71±0.08 0.78±0.01 22.7±0.7a 0.35±0.06ac 102±7C 180 Días Sustituto 34.4±10.4 10.6±0.1a 7.1+0.4a 3.11±0.04a 0.81±0.02 18.8+1.2 0.22+0.01 75±5 OVX 52.3±13.0 10.2±0.2 6.2+0.3 2.75+0.08 0.81±0.03 18.2±0.9 0.24+0.02 101±6 PTH(1-34) 41.4±16.2 10.9±0.2a 6.0+0.3c 2.80+0.07° 0.75±0.02 19.8±0.8 0.24+0.02a 108±5C PTHrP(1-36) 45.8±5.5 10.6±0.1a 6.0±0.2C 2.67+0.05c 0.72+0.01ac 17.4+0.8b 0.22±0.01b 108±6C SDZPTH 33.7±8.5 11.7±0.6ac 5.5±0.3ac 2.90±0.08c 893 0.87±0.05 20.0±1.0 1.28±0.60abc 100±8C Abreviatura: WW = Peso Húmedo; OVX = Con extirpación de ovarios. Los datos se expresan como un error estándar + medio de la media (SEM) para 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05 8 contra OVX igualado en tiempo b contra hPTH(1-34) igualado en tiempo c contra sustituto igualado en tiempo TABLA X Mediciones Biomecánicas de Resistencia del Cuello de fémur y Diáfisis Media de Ratas Maduras OVX Tratadas Durante 6 Meses con hPTH-1-34 (PTH), PTHrP-(1-36) (PTHrP) o el análogo de PTH, SDZ PTH PTH 9 147±6ac 0.89±0.01ac 5.4±0.3ac 241±9ac 814±31ac 61±4ac 251±8ac 10.7±0.4ac 5.0±0.3ao PTHrP 9 133±4abc 0.72±0.02a c 4.6±0.1b 202±3abc 767+73ac 53±4ac 239±6ac 11.9±1.2ac 4.7±0.4ac SDZ 6 165±8ac 1.02±0.02ac 6.2±0.6ac 256±13ac 824±48ac 69±6ac 250±13ac 9.6±0.6 5.7±0.5ac Abreviatura: n = número de ratas por grupo; OVX = Con extirpación de ovarios. Los datos se muestran como V SEM media. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05 3 contra OVX igualado en tiempo b contra hPTH(1-34) igualado en tiempo c contra sustituto igualado en tiempo TABLA XI Ganancia en Peso Corporal y Químicas en Suero en Ratas Maduras con Extirpación de Ovarios a las que se da Una Vez al Día rec hPTH-(1-34), PTHrP(1-36) o SDZ PTH 893, durante 30, 900 180 Días Ganancia Calcio en Fosfato Magnesio Creatinina Nitrógeno Riñón Fosfatasa de Peso Suero en Suero en Suero en Suero de Urea (mg Ca/gm alcalina Corporal (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) en Suero peso (IU/L) (g) (mg/dL) húmedo) Línea Base 10.7+0.1 7.7+0.3 2.91+0.07 0.7410.01 16.5+0.6 0.2010.01 7815 Sustituto Línea Base -- 10610.1 7.310.3 2.7510.08 0.76+0.01 18.2+0.6 0.2510.04 10014 OVX 30 Días Sustituto 1.011.4 10.810.1a 7.910.5 3.0610.10 0.7910.01 17.9+0.7 0.2210.01 7416a OVX 1.7 + 3.0 10.410.1 7.310.2 2.9410.08 0.7810.02 17.710.9 0.2710.03 8813 PTH(1-34) 2.2+1.3 10.710.1a 6.510.2a0 2.8910.06 0.8010.01 20.1+0.8a° 0.2510.02 8313 PTHrP(1-36) 2.2±1.3 10.510.1 6.8+0.2 2.8810.07 0.7810.01 17.710.4 0.2910.06 9015° ¦ SDZ PTH893 -1.3±1.8 11.3i0.3abc 5.5i0.2abc 2.9010.07 0.79+0.01 19.1+0.6 0.26+0.01a 8314 90 Días Sustituto 13.1±3.8 10.210.1a 6.5+0.2a 2.7410.05 0.79+0.02 20.110.09 0.2110.03 7114a OVX 22.215.3 10.1+0.1 5.7+0.2 2.57+0.06 0.8010.01 19.510.08 0.1910.02 103111 PTH(1-34) 30.614.8 10.7+0.1ac 5.4 + 0.2° 2.7010.03 0.78+0.02 22.1+1.2 0.36l0.06a° 102+6° PTHrP(1-36) 14.313.9 10.3l0.1b 5.4+0.3a c 2.6010.08 0.7810.02 21.311.3 0.21+0.03b 10314° SDZPTH893 26.513.7 11.610.1abc 4.7l0.1ac 2.7110.08 0.78+0.01 22.710.7a 0.35l0.06a° 10217° 180 Días Sustituto 34.4110.4 10.610.1a 7.1+0.4a 3.1110.04a 0.81+0.02 18.8+1.2 0.2210.01 7515 OVX 52.3113.0 10.210.2 6.210.3 2.7510.08 0.81+0.03 18.2+0.09 0.2410.02 10116 PTH(1-34) 41.4116.2 10.910.2a 6.0+0.3° 2.80+0.07° 0.75+0.02 19.810.8 0.2410.02a 10815° PTHrP(1-36) 45.815.5 10.610.1a 6.010.2° 2.67l0.05c 0.72+0.01a° 17.4+0.8b 0.22+0.01" 10816° SDZPTH893 33.718.5 11.7l0.6ac 5.5l0.3ac 2.9010.08° 0.87l0.05 20.0+1.0 1.28i0.60ab° 10018° EQU IVALENCIAS A partir de la descripción detallada anterior de las modalidades específicas de la invención, debe ser aparente q ue un método único para administración de PTHrP, o un análogo del mismo, se ha descrito, da ndo como resultado un tratamiento seguro y eficaz de osteoporosis que reduce el riesgo de o elimina los efectos secundarios negativos, tales como hipercalcemia o el riesgo de desarrollar sarcomas osteogénicos . Aunque se han expuesto modalidades particulares en la presente en detalle, esto se ha hecho a manera de ejemplo solamente con el propósito de i lustración y no intenta limitarse con respecto al alcance de las reivindicaciones anexas que siguen. En particular, se contempla por el i nventor q ue las sustituciones, alteraciones y modificaciones pueden hacerse a la invención sin apartarse del espíritu y alcance de la invención según se define por las reivindicaciones. Por ejemplo, la elección del a nálogo de PTHrP, o la ruta de admin istración se cree son materia de rutina para u na persona de experiencia ordinaria en la materia con conocimiento de las modalidades descritas en la presente.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano que necesita del mismo, comprendiendo dicho método la administración de manera intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente en una dosis de entre 50 y 3,000 2. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano que necesita del mismo, comprendiendo dicho método la administración de manera intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente en una dosis de entre 50 y 3,000 µglá'\a durante un periodo de 1-36 meses. 3. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano que necesita del mismo, comprendiendo dicho método la administración de manera intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente durante un periodo de 1-36 meses. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la densidad de masa ósea de dicho paciente se incrementa a una velocidad de al menos 1.5% por mes. 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque dicho PTHrP, o un análogo del mismo, se administra de manera intermitente hasta que se restaura la densidad de masa ósea de dicho paciente. 6. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho paciente tiene una puntuación T final de >-2.5. 7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque dicho incremento en la densidad de masa ósea da como resultado al menos una disminución de 50% en la incidencia de fracturas óseas. 8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque dicho análogo de PTHrP comprende una secuencia amino ácida seleccionada a partir del grupo que consiste en una secuencia: (i) definida por la SEQ ID NO: 2; (ii) que tiene al menos 70% de homología con la SEQ I D NO: 2; y (iii) codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones estrictas hacia una secuencia de ácido nucleico complementaria de la SEQ ID NO: 1 . 9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque dicho análogo de PTHrP es un fragmento de PTHrP seleccionado a partir del grupo que consiste en: PTHrP-(1 -30) a PTHrP-( 1 -173). 10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque dicho análogo de PTHrP es un análogo de PTHrP con una secuencia péptida alfa-helicoidal, anfipática, modelo (MAP) sustituida en la región de terminal C de hPTHrP (1 -34). 1 1 . El método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho análogo de PTHrP es [MAP1 -10]22-31 hPTHrP-( 1 -34)NH2). 12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, caracterizado porque dicha dosis es de 50-1 ,500 µg/día. 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, caracterizado porque dicha dosis es de 50-900 µg/día. 14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque dicho PTHrP, o un análogo del mismo, se administra de manera subcutánea. 15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque dicho PTHrP, o un análogo del mismo, se administra mediante la ruta de administración seleccionada a partir del grupo que consiste en: administración oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intranasal, y en aerosol. 16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque comprende además la etapa de co-administrar, ya sea de manera simultánea o secuencial, a dicho paciente, un agente inhibidor de resorción ósea. 17. El método según la reivindicación 1 6, caracterizado porque dicho agente inhibidor de resorción ósea se selecciona a partir del grupo que consiste en: un bisfosfonato, estrógeno, un mod ulador receptor de estrógeno selectivo, un modulador receptor de andrógeno selectivo, calcitonina, un análogo de vitamina D, y una sal de calcio. 18. El método según la reivindicación 1 6, caracterizado porque dicho agente inhibidor de resorción ósea se selecciona a partir del grupo que consiste en : alendronato, risedronato, etidronato, pamidronato, tiludronato, ácido zoledrónico, raloxifeno, tamoxifeno, droloxifeno, toremifeno, idoxifeno, levormeloxifeno y estrógenos conjugados. 19. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque dicho paciente humano sufre o se encuentra en riesgo de un desorden óseo metabólico seleccionado a partir del grupo que consiste en: osteoporosis primaria o secundaria, osteomalacia, osteodistrofia renal y otros tipos de desórdenes esqueléticos con pérdida ósea asociada. 20. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano que necesita el mismo, comprendiendo dicho método la administración de entre 1 .5 y 90 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente de manera intermitente, durante un periodo de un mes. 21 . Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano que necesita el mismo, comprendiendo dicho método la administración de entre 3 y 180 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente de manera intermitente, durante un periodo de dos meses. 22. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano que necesita el mismo, comprendiendo dicho método la administración de entre 4.5 y 270 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente de manera intermitente, durante un periodo de tres meses. 23. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano que necesita el mismo, comprendiendo dicho método la administración de entre 9 y 540 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente de manera intermitente, durante un periodo de seis meses. 24. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano q ue necesita el mismo, comprendiendo dicho método la administración de entre 18 y 1080 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente de manera intermitente, durante un periodo de 12 meses. 25. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano q ue necesita el mismo, comprendiendo dicho método la administración de entre 36 y 2160 mg de PTHrP, o un análogo del mismo, a dicho paciente de manera intermitente, durante un periodo de 24 meses . 26. Un método para incrementar la masa ósea en un paciente humano q ue necesita el mismo, comprendiendo d icho método la administración de entre 54 y 3240 mg de PTHrP, o un aná logo del mismo, a dicho paciente de manera intermitente, durante un periodo de 36 meses. 27. El método según cualquiera de las reivindicaciones 20-26, caracterizado porque dicho PTHrP, o un análogo del mismo, se administra en un intervalo de dosis seleccionado a partir del grupo q ue consiste en una vez al d ía , una vez cada dos d ías , una vez cada tres días, una vez a la semana, dos veces por semana , una vez a la quincena, dos veces al mes y una vez al mes . 28. Un eq uipo para incrementar la masa ósea , comprendiendo dicho equipo: (a) entre 1 .5 y 90 mg de PTHrP, o u n análogo del mismo; y (b) indicaciones escritas q ue proporcionan instrucciones para la ad ministración intermitente de PTH rP, o un análogo del mismo, a un paciente h umano d urante un periodo de un mes. 29. Un eq ui po para i ncrementar la masa ósea , comprendiendo dicho eq uipo: (a) entre 3 y 180 mg de PTHrP, o un análogo del mismo; y (b) ind icaciones escritas q ue proporcionan instrucciones para la administración intermitente de PTHrP, o u n análogo del mismo, a un paciente humano durante un periodo de dos meses. 30. Un equipo para incrementar la masa ósea, comprendiendo dicho equipo: (a) entre 4.5 y 270 mg de PTHrP, o un análogo del mismo; y (b) indicaciones escritas que proporcionan instrucciones para la administración intermitente de PTHrP, o u n análogo del mismo, a un paciente humano d urante u n periodo de tres meses. 31 . Un equipo para incrementar la masa ósea , comprendiendo dicho equipo: (a) entre 9 y 540 mg de PTH rP, o un a nálogo del mismo; y (b) ind icaciones escritas que proporcionan instrucciones para la administración intermitente de PTHrP, o u n análogo del mismo, a un paciente humano durante u n periodo de seis meses . 32. Un equipo para incrementar la masa ósea, comprendiendo d icho eq uipo: (a) entre 1 8 y 1 080 mg de PTH rP, o un análogo del mismo; y (b) indicaciones escritas que proporcionan instrucciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, a un paciente humano durante un periodo de 1 2 meses. 33. Un equipo para incrementar la masa ósea , comprend iendo dicho eq uipo: (a) entre 36 y 2160 mg de PTH rP, o un análogo del mismo; y (b) indicaciones escritas que proporcionan instrucciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, a un paciente humano durante un periodo de 24 meses. 34. Un equipo para incrementar la masa ósea, comprendiendo dicho equipo: (a) entre 54 y 3240 mg de PTHrP, o un análogo del mismo; y (b) indicaciones escritas que proporcionan instrucciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo del mismo, a un paciente humano durante un periodo de 36 meses. 35. El equipo según cualquiera de las reivindicaciones 28-34, caracterizado porque dichas indicaciones escritas proporcionan instrucciones para que el PTHrP, o un análogo del mismo, se administre a un intervalo de dosis seleccionado a partir del grupo que consiste en una vez al día, una vez cada dos d ías, una vez cada tres días, una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez a la quincena, dos veces al mes y una vez al mes.