MX2007003185A - Tratamiento de trastornos oseos con farmacos anabolicos esqueletales. - Google Patents

Abstract

Se describen en la presente metodos para la prevencion y tratamiento de una variedad de condiciones en mamiferos manifestadas por la perdida de masa osea, incluyendo osteoporosis; la presente invencion proporciona metodos para utilizar PTHrP, o analogos del mismo, para el tratamiento de trastornos oseos metabolicos que son tanto efectivos como con una mayor seguridad.

Description

TRATAMIENTO DE TRASTORNOS ÓSEOS CON FÁRMACOS ANABÓLICOS ESQUELETALES SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud está relacionada con U.S.S.N. 10/340,484, presentada el 10 de enero de 2003, que está relacionada con U.S.S.N. 60/347,215, presentada el 10 de enero de 2002; U.S.S.N. 60/353,296, presentada el 1 de febrero de 2002; U.S.S.N. 60/368,955, presentada el 28 de marzo de 2002; y U.S.S.N. 60/379,125, presentada el 8 de mayo de 2002; cada una de las cuales se Incorpora aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN En términos generales, la presente invención se refiere a mótnrlnc nara la nrov/onri?n \/ tratamiontn rio una x/ariorlarl rio r^nnrli innoc on los mamíferos manifestadas por pérdida de la masa ósea, que incluyen la osteoporosis. Más particularmente, la presente invención se refiere a métodos de uso de PTHrP, o un análogo de la misma, para el tratamiento de trastornos metabólicos del hueso, que son eficaces y tienen una mayor seguridad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante toda la vida adulta, el hueso continuamente sufre remodelación mediante los ciclos Interactivos de formación y resorción de hueso (recambio de hueso). La resorción de hueso normalmente es rápida y es mediada por los osteoclastos (células de resorción de hueso), formados por células precursoras fagocítlcas mononucleares en los sitios de remodelación de hueso. Este proceso continúa después con la aparición de los osteoblastos (células formadoras de hueso), que forman lentamente el hueso para reemplazar el hueso perdido. El hecho de que la terminación de este proceso lleve normalmente al reemplazo y renovación balanceadas del hueso, indica que las señales y eventos moleculares que afectan la remodelación del hueso están estrechamente controlados. El mecanismo de pérdida de hueso no está bien entendido, pero para efectos prácticos, el trastorno se origina de un desequilibrio en la formación de hueso sano nuevo v la resorción de hueso vie-O desplazado hacia una pérdida neta de tejido de hueso. Esta pérdida de hueso incluye una reducción del contenido mineral y los componentes de matriz de proteína del hueso, y conduce a un mayor porcentaje de fracturas de los huesos femorales y los huesos del antebrazo y las vértebras, predominantemente. A su vez, estas fracturas producen un aumento de la morbilidad general y una notable pérdida de la estatura y la movilidad, y en muchos casos un aumento de la mortalidad que resulta de las complicaciones.

Se conocen varios trastornos del crecimiento de hueso que ocasionan un desequilibrio en el ciclo de remodelación de hueso. Entre estos están principalmente las enfermedades metabólicas del hueso, tales como la osteoporosis, osteomalacia/raquitismo, falla renal crónica e hiperparatiroidismo, que dan como resultado la pérdida anormal o excesiva de la masa ósea (osteopenia). La osteoporosis, o hueso poroso, es una enfermedad caracterizada por masa ósea baja y deterioro estructural del tejido óseo, lo que conduce a la fragilidad del hueso y a una mayor susceptibilidad de fracturas de la cadera, la espina dorsal y la muñeca. Es una enfermedad devastadora entre las mujeres posmenopáuslcas y también entre los hombres más viejos. Los costos nacionales por medicamentos y hospitalizaciones se estiman en la actualidad en la escala de $ 50,000,000 de dólares al año, y probablemente aumenten conforme envejezca la población de los Estados Unidos. En la actualidad, el soporte principal de la terapia son los GQmn!ementQS orales de calcio comn!ementos de vitamina D y una familia de medicamentos denominada "Inhibidores de resorción" que reducen la resorción de hueso osteoclástica. Estos incluyen estrógenos, tales como estrógenos conjugados (Premarln®), moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM's), tales como raloxlfeno (Evista®); calcitonlna (Miacalcin®); y bifosfonatos tales como alendronato (Fosamax®), rlsedronato (Actonel®), etldronato (Didronel®), pamidronato (Aredia®), tiludronato (Skelld®), o ácido zoledrónlco (Zometa®). Véase "The writing group for the PEPI trial", JAMA 2J6: 1389-1396 (1996); Delmas y otros, N Engl J Med 337: 1641-1647 (1997); Chestnut y otros, Osteoporosis Int 8 (supl. 3): 13 (1998); Liberman y otros, N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung y otros, N Engl J Med 344: 333-40 (2001 ). Estos fármacos son efectivos para retardar la pérdida mineral ósea e incluso ocasionan aumentos moderados de la densidad mineral ósea en la espina lumbar, en una escala del 2% (calcio, vitamina D, calcltonina), 3% (raloxifeno), 6% (estrógenos), u 8% (bifosfonatos). En general se requieren de 2 a 3 años de administración para lograr los efectos de esta magnitud. Véase "The writing group for the PEPI trial", JAMA 276: 1389-1396 (1996); Delmas y otros, N Engl J Med 337: 1641-1647 (1997); Chestnut y otros, Osteoporosis Int 8 (supl. 3): 13 (1998); Liberman y otros, N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung y otros, N Engl J Med 344: 333-40 (2001 ). La osteoporosis existe en general cuando las pérdidas minerales esqueléticas están en la escala de 50% por abajo de la masa ósea pico, lo que ocurre a la edad de aproximadamente 30 años. Desde la perspectiva de la corrección de! déficit de! minera! óseo !a reversión com !eta de este 50% de pérdida requeriría un incremento de 100% de la masa ósea. Por lo tanto, desde esta perspectiva, los Incrementos del 2% al 8% de la densidad mineral ósea que se originan de la terapia contra la resorción, aunque son clínicamente significativos y benéficos, dejan un espacio significativo de mejoramiento. Puesto que el uso de los Inhibidores de resorción para Impedir la pérdida de hueso no da producción de hueso nuevo, la eficacia final de los inhibidores de resorción en términos cuantitativos es limitada. Estas consideraciones enfatizan la necesidad de desarrollar mecanismos farmacéuticos para producir hueso nuevo. Recientemente se ha acumulado evidencia que demuestra claramente que la hormona paratiroidea (PTH) es un nuevo miembro, muy eficiente, de dicho armamento terapéutico para la osteoporosis. Véase Finkelstein y otros, N Engl J Med 331 : 1618-1623 (1994); Hodsman y otros, J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay y otros, Lancet 350:550-555 (1997); ?eer y otros, N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001 ); Roe y otros, Programa y Resúmenes de la 81° Asamblea de la Endocrine Soclety, p. 59 (1999); Lañe y otros, J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998). La PTH fue identificada primero en extractos de la glándula paratiroides en los años 1920. La secuencia completa de aminoácidos de PTH se determinó en los años 1970. Como los pacientes con sobreproducción de la hormona paratiroidea (es decir, hlperparatiroldismo) desarrollan una declinación de la masa ósea (algunas veces muy severa), durante el siglo pasado se consideró amnliampnffí a la PTH mmn un p>IÁt¡rn .'íin <->mharnn estudios tanto en animales como en humanos han demostrado ahora claramente que cuando se administra subcutáneamente en una sola dosis diaria (denominada "intermitentemente" -en contraste con la sobreproducción continua de PTH que ocurre en los pacientes con hiperparatiroidismo), la PTH puede inducir un aumento notable de la densidad mineral ósea y la masa ósea. De esta manera, la PTH es muy diferente de la clase de fármacos inhibidores de resorción. Véase Finkelstein y otros, N Engl J Med 331: 1618- 1623 (1994); Hodsman y otros, J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay y otros, Lancet 350: 550-555 (1997); Neer y otros, N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001 ); Roe y otros, Programa y Resúmenes de la 81° Asamblea de la Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe y otros, J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998). Aunque la base celular de este efecto anabólico está por ser definido, los efectos microscópicos y fisiológicos son evidentes: cuando se administra Intermitentemente la PTH se origina una notable activación de los osteoblastos formadores de hueso, mientras que los osteoclastos de resorción de hueso se activan en un grado menor. Estos efectos son direcclonalmente opuestos a los fármacos inhibidores de resorción anteriormente descritos, que inhiben la actividad tanto osteoclástica como osteoblástica. Para poner estos resultados en términos cuantitativos, en múltiples estudios se ha mostrado que la PTH aumenta la densidad mineral ósea de la espina lumbar en aproximadamente 10-15%, dependiendo del estudio (véase Finkelstein y otros, N Engl J Med 331 : 1618-1623 (1994); Hnrlsman v ntrnc / Clin Pnrln rinnl etab 82" fi^Q-28 Í1997V L?ndS3V V OÍTOS Lancet 350: 550-555 (1997); Roe y otros, Programa y Resúmenes de la 81° Asamblea de la Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe y otros, J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)). En un estudio se informó que la densidad mineral ósea de la médula espinal aumentaba hasta 30%, determinada utilizando absorciometría de rayos X de doble energía (DXA), y hasta 80% según una tomografía computarizada cuantitativa (QCT) del hueso trabecular de la espina lumbar (véase, Roe y otros, Programa y Resúmenes de la 81° Asamblea de la Endocrine Society, p. 59 (1999)). Además de aumentar la masa ósea, recientemente se ha mostrado que la PTH tiene una eficacia significativa contra las fracturas, tanto en la espina dorsal como en los sitios no vertebrales. Se ha mostrado que la PTH reduce las fracturas entre un 60% y 90%, dependiendo del sitio del esqueleto y la definición de la fractura: Neer y otros, N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001 ). Estos efectos son por lo menos tan pronunciados como la eficacia contra las fracturas de los agentes inhibidores de resorción (véase, "The writing group for the PEPI trial", JAMA 276: 1389-1396 (1996); Delmas y otros, N Engl J Med 337: 1641 -1647 (1997); Chestnut y otros, Osteoporosis Int 8 (supl. 3): 13 (1998); Liberman y otros, N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung y otros, N Engl J Med 344: 333-40 (2001 )), y pueden ser superiores. De esta manera, la PTH parece ser el primer miembro de una nueva clase de fármacos contra la osteoporosis, que a diferencia de los agentes inhibidores de resorción, se ha denominado la clase de fármacos "anabólicos esqueléticos" o "anabólicos" contra la osíßoporosis. La proteína relacionada con la hormona paratiroldea (PTHrP) parece ser un segundo miembro de esta clase de fármacos anabólicos esqueléticos. Véase Stewart y otros, J Bone Min Res 15: 1517-1525 (2000). La PTHrP es el producto de un gen distinto al que codifica la PTH. La PTHrP comparte aproximadamente 60% de homología de aminoácidos con la PTH en los primeros 13 aminoácidos, y después las secuencias divergen completamente: Yang y otros en: Bilezikian, Raisz, y Rodan (Eds).

"PRINCIPLES OF BONE BIOLOGY", Academlc Press, San Diego California, p. 347-376 (1996). La PTHrP inicialmente es traducida como una prohormona que después sufre un procesamiento extenso posterior a la traducción. Una de las formas procesadas, o formas secretorias auténticas, identificadas en el laboratorio del inventor, es PTHrP-(1-36): Wu y otros, J Biol Chem 271 : 24371-24381 (1996). La PTHrP-(1-36) se une al receptor común de PTH/PTHrP, también denominado receptor PTH-1 , en el hueso y riñon: Everhart-Caye y otros, J Clin Endocrinol Metab, 81 : 199-208 (1996); Orloff y otros, Endocrinology, 131 : 1603-1611 (1992). La PTHrP-(1-36) se une a este receptor con igual afinidad que PTH, y activa las rutas de transducción de señal de PKA y PKC con la misma potencia que PTH: Everhart-Caye y otros, J Clin Endocrino! Metab, 81 : 199-208 (1996); Orloff y otros, Endocrinology, 131: 1603-1611 (1992). La PTHrP fue identificada originalmente por el Inventor (Burtis y otros, J Biol Chem 262: 7151-7156 (1987); Stewart y otros, Biochem Biophys E>ao nmrr, ? AR- R79_R7« fin- 1803, (1987); Moseley y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84: 5048-5052 (1987)) mediante su función como el agente causante del síndrome paraneoplásico humano común denominado hipercalcemia humoral de malignidad (HHM): Stewart y otros, N Engl J Med 303: 1377-1383 (1980). Por ejemplo, los humanos con HHM pueden perder hasta 50% de su masa esquelética durante un periodo de algunos meses como resultado de elevaciones sostenidas de la PTHrP circulante: Stewart y otros, J CHn Endo Metab 55: 219-227 (1982). Estudios subsiguientes en animales han indicado que cuando se administra intermitentemente en ratas con osteoporosis, la PTHrP es capaz de aumentar la masa ósea. Sin embargo, sorprendentemente, los incrementos de la densidad mineral ósea, la masa ósea, la formación de hueso y los biomecanismos esqueléticos inducidos por PTHrP, no fueron tan notables como los observados usando cantidades equimolares de PTH: Stewart y otros, J Bone Min Res 15: 1517-1525 (2000). No obstante, los efectos anabólicos e incrementadores de la biomecánica de la PTHrP son sorprendentes, puesto que la PTHrP es considerada ampliamente como la hormona esquelética catabólica fundamental, responsable de pérdidas minerales esqueléticas muy notables en los pacientes con HHM: Stewart y otros, J Clin Endo Metab 55: 219-227 (1982). La observación de que es realmente anabólica para el esqueleto cuando se le administra intermitentemente no se había previsto, como lo pone en evidencia el hecho de que muchos investigadores y compañías farmacéuticas han trahaiaHn li iranto lr»c nltimnc ? PTW on la nctonnorncic norn ninguno ha incluido la PTHrP, a pesar de haber sido del dominio publico desde su descripción inicial en 1987. En 1999, Eli Lilly publicó un informe para la FDA que indicaba que la administración diaria de PTH a las ratas durante un periodo de 2 años les producía el desarrollo de sarcomas osteogénicos. Véase la notificación a la FDA para los poseedores de PTH IND, del 11 de diciembre de 1998 (Neer y otros, N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001 ). El desarrollo de estos tumores esqueléticos malignos es muy problemático para los expertos en el campo, porque el desarrollo de tumores esqueléticos derivados de osteoblastos en este modelo de toxicidad preclínica, era biológicamente creíble como relacionado con la PTH en términos causativos. Un problema principal en la historia del osteosarcoma en la rata es que en los estudios de toxicidad preclínica la PTH se administró a las ratas en desarrollo durante 2 años. Esto representa la mayor parte de la vida de la rata, también de aproximadamente 2 años. En los humanos, el tratamiento con PTH generalmente tiene una duración de 2 a 3 años (Finkelstein y otros, N Engl J Med 331 : 1618-1623 (1994); Hodsman y otros, Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay y otros, Lancet 350: 550-555 (1997); ?eer y otros, N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001 ); Roe y otros, Programa y Resúmenes de la 81° Asamblea de la Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe y otros, J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)). La mayoría de los investigadores prevén que la duración del tratamiento con PTH será de 18 meses a 3 años. Por lo tanto, persiste un problema a! considerar algunos que un tratamiento a largo plazo con la PTH podría dar como resultado osteosarcomas en los humanos. Por consiguiente, persiste la necesidad de un método de prevención y tratamiento de trastornos del hueso utilizando fármacos anabólicos esqueléticos que sean seguros y eficaces.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para la prevención y tratamiento de una variedad de condiciones en un mamífero manifestadas por pérdida de la masa ósea, que incluyen la osteoporosis. La invención se basa en la observación sorprendente de que la administración de dosis muy altas de una PTHrP, o un análogo relacionado, puede producir incrementos muy notables de la BMD en un periodo muy corto. El periodo de administración es preferiblemente de 15, 18, 21 , 24, 30, ó 36 meses, de preferencia 7, 8, 9, 10, 11 , 0 12 meses, de preferencia 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6 meses. Las dosis altas de los fármacos anabólicos esqueléticos no producen efectos secundarios adversos significativos cuando se administran durante periodos breves o a intervalos de dosificación intermitentes. Por consiguiente, los métodos de la presente invención ofrecen mayor seguridad reduciendo o eliminando sustancialmente el riesgo de los efectos secundarios negativos asociados comúnmente con los fármacos anabólicos espue!ét!G?s tales co o hinerca!cem!a falla rena! hipotensión, o el riesgo de desarrollar sarcomas osteogénicos. Las velocidades de incremento de BMD logradas con los métodos de la presente invención son extremadamente altas. En una modalidad, 3 meses de tratamiento con PTHrP-(1-36) produce porcentajes de incremento de BMD que fueron mayores que cualquier porcentaje previamente obtenido con los agentes inhibidores de resorción y dosis mas bajas de PTH durante periodos prolongados de administración. Los porcentajes de incremento de BMD obtenidos con los métodos de la presente invención son preferiblemente de por lo menos 1% por mes, 1.1 % por mes ó 1.2% por mes, de preferencia 1.3% por mes ó 1.4% por mes, muy preferiblemente mas de 1.5% por mes ó 1.6% por mes. Generalmente los incrementos de BMD observados no se obtienen con los fármacos inhibidores de resorción durante dos a tres años de administración. En realidad, varios agentes inhibidores de resorción disponibles (SERM's, calcitonina, vitamina D, calcio) nunca alcanzan los incrementos de BMD obtenidos con los métodos de la presente invención. Además, los incrementos de BMD obtenidos con los métodos de la presente invención son comparables o superiores a los logrados usando dosis mas bajas de PTH durante periodos más largos de administración. Por lo tanto, la presente invención provee métodos para la prevención y tratamiento de trastornos del hueso, que utilizan fármacos anabólicos esqueléticos que son seguros y eficaces. El incremento resultante en. BMD logrado con. los métodos de !a presente invención preferiblemente da como resultado puntuaciones T > -2.5, de preferencia puntuaciones T > -2.0, y de preferencia puntuaciones T > 1.0. Además, preferiblemente, el incremento resultante en BMD logrado con los métodos de la presente invención previene las fracturas resultantes; preferiblemente, la incidencia de las fracturas se reduce por lo menos 50%, 60% ó 70%, de preferencia por lo menos 75%, 80% ó 85%, de preferencia por lo menos 90% ó 95%.

En un aspecto, la presente invención provee métodos para incrementar la masa ósea en un paciente animal o humano administrando intermitentemente al paciente PTHrP, o un análogo de la misma, a una dosis de entre 5 µg/día y 50 mg/día, o mayor. Una escala de dosis preferida es 10-45,000 µg/día. Otras escalas de dosis preferidas incluyen 25-40,000 µg/día, 35-37,500 µg/día, 50-35,000 µg/día, 100-30,000 µg/día, 150-25,000 µg/día, 200-20,000 µg/día, 250-15,000 µg/día, 30-10,000 µg/día, 350-7,500 µg/día, 400-3,000 µg/día, 400-1 ,500 µg/día, 400-1 ,200 µg/día, 400-900 µg/día, 400-600 µg/día, 80-500 µg/día, 90-500 µg/día, 100-500 µg/día, 150-500 µg/día, 200-500 µg/día, 250-500 µg/día, 300-500 µg/día, 350-500 µg/día, 400-500 µg/día, y 450-500 µg/día. En una modalidad preferida, la PTHrP-(1-36) se administra a una dosis de entre 50 y 3,000 µg/día. Otras escalas de dosis preferidas incluyen 400-1 ,500 µg/día, 400-1 ,200 µg/día, 400-900 µg/día, y 400-600 µg/día (aproximadamente 6.5-18 µg/kg/día, 6.5-15 µg/kg/día, 6.5-12 µg/kg/día, y 6.5-9 µg/kg/día). I a nrPQPntp inv nri?n tamhi?n nrnwoa mófnHnc nara infromontar la densidad ósea usando la administración de PTHrP, o análogos de la misma, durante periodos mayores a los que se administraba previamente en animales o humanos. En un aspecto, la presente invención provee métodos para incrementar la masa ósea en un paciente animal o humano administrando intermitentemente PTHrP, o un análogo de la misma, durante un periodo de entre 1 y 36 meses. El periodo de administración es de preferencia de 15, 18, 21 , 24, ó 36 meses; de preferencia de 7, 8, 9, 10, 11 , ó 12 meses; muy de preferencia de 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6 meses. Los métodos de la invención se pueden emplear con un paciente que sufre un trastorno metabólico del hueso, o está en riesgo de padecerlo, que incluye osteoporosis primaria o secundaria, osteomalacia, osteodistrofia renal, y otros tipos de trastornos esqueléticos asociados con la pérdida de hueso. En una modalidad, los porcentajes de incremento de BMD obtenidos con los métodos de la presente Invención son de por lo menos 1.5% por mes. En otro aspecto, la PTHrP, o un análogo de la misma, se puede administrar a un paciente que sufre de una fractura de hueso, por ejemplo una fractura mixta o una fractura simple. Las modalidades preferidas incluyen la administración de PTHrP-(1-34) a las dosis anteriormente descritas, a pacientes que sufren de fractura de hueso. En otro aspecto, la PTHrP o un análogo de la misma, se puede administrar a un paciente quirúrgico para promover la cicatrización del hueso después de una cirugía, por ejemplo cirugía de reemplazo de cadera o cirugía cardiaca, u otros procedimientos invasivos r?ue desp!azan o dañan e! hueso. Las modalidades preferidas de esto incluyen la administración de PTHrP-(1-36) a las dosis anteriormente descritas. Otras modalidades incluyen PTHrP, fragmentos o análogos de la misma, administrados o aplicados al hueso dañado en formulaciones de pasta para hueso que tienen las dosis anteriormente descritas. La PTHrP, o un análogo de la misma, usada en los métodos de la presente invención, puede ser definida por la SEQ ID NO: 2; tiene por lo menos 70% de homología con la SEQ ID NO:2; o puede ser codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones severas con una secuencia de ácido nucleico complementaria a SEQ ID NO:1. Los análogos de PTHrP que se pueden usar en los métodos de esta invención incluyen los fragmentos PTHrP-(1-30) a PTHrP-(1-173). Los análogos de PTHrP también pueden incluir análogos con una secuencia modelo de péptido antipático (MAP) de hélice alfa sustituida en la región C-terminal de PTHrP-(1-34), tal como [MAP1-10]22-31 hPTHrP-(1-34)NH2). Los análogos de PTHrP también pueden incluir peptidomiméticos y fármacos de molécula pequeña que tienen actividades biológicas agonistas anabólicas esqueléticas, como se definen en la presente. La PTHrP se puede administrar por vía subcutánea, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, tópica (en la superficie del hueso, por ejemplo como una pasta o una solución), bucal, rectal, vaginal, intranasal y por medio de aerosol. La administración intermitente puede ser por inyecciones periódicas una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días una vez a !a semana dos veces a la semana cada dos semanas dos veces al mes y mensualmente. Alternativamente, en los métodos de la presente invención se puede usar la administración pulsátil del fármaco anabólico esquelético mediante una minibomba. También son adecuadas las matrices de liberación lenta o prolongada que tienen la PTHrP, fragmentos o análogos de la misma. En otro aspecto, la presente Invención provee métodos para incrementar la masa ósea en un paciente animal o humano. En una modalidad, el método comprende administrar entre 1.5 mg y 90 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a un mes. En otra modalidad, el método comprende administrar entre 3 y 180 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a dos meses. En otra modalidad, el método comprende administrar entre 4.5 mg y 270 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a tres meses. En otra modalidad, el método comprende administrar entre 9 mg y 540 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a seis meses. En otra modalidad, el método comprende administrar entre 18 mg y 1080 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a un año. En otra modalidad, el método comprende administrar entre 36 mg y 2160 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a dos años. En otra modalidad, el método comprende administrar entre 54 mg y 3240 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a tres años. En otra modalidad, el método comprende administrar entre 70 mg y 10,000 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a tres años. En otra modalidad, el método comprende administrar entre 100 mg y 50,000 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, intermitentemente durante un periodo que va de una semana a tres años. De acuerdo con estos métodos, la PTHrP, o análogos de la misma, se pueden administrar en un intervalo de dosis intermitente de dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, dos veces a la semana, cada dos semanas, dos veces al mes, o mensualmente. En otro aspecto, la presente invención provee un equipo para incrementar la masa ósea en un paciente animal o humano. En una modalidad, el equipo comprende entre 1.5 mg y 90 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones escritas con las indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a un mes. En otra modalidad, el equipo comprende entre 3 mg y 180 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones escritas con las indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a dos meses. En otra modalidad, el equipo comprende entre 4.5 mg y 270 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones impresas con las indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a tres meses. En otra modalidad, el equipo comprende entre 9 mg y 540 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones impresas con las Indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a seis meses. En otra modalidad, el equipo comprende entre 18 mg y 1080 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones impresas con las indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a un año. En otra modalidad, el equipo comprende entre 36 mg y 2160 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones impresas con las indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a dos años. En otra modalidad, el equipo comprende entre 54 mg y 3240 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones impresas con las indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a tres años. En otra modalidad, el equipo comprende entre 70 mg y 10,000 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones impresas con las indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a tres años. En otra modalidad, el equipo comprende entre 100 mg y 50,000 mg de PTHrP, o un análogo de la misma, e instrucciones impresas con las indicaciones para la administración intermitente de PTHrP, o un análogo de la misma, a un paciente animal o humano durante un periodo que va de una semana a tres años. Además, los métodos de la presente invención pueden comprender el paso de coadministrar, simultáneamente o secuencialmente con PTHrP, un agente inhibidor de la resorción de hueso. El agente inhibidor de la resorción de hueso puede ser un bifosfonato, estrógeno, un modulador selectivo del receptor de estrógeno, un modulador selectivo del receptor de andrógeno, calcitonina, un análogo de la vitamina D, o una sal de calcio. El agente inhibidor de la resorción de hueso puede ser también alendronato, risedronato, etidronato, pamidronato, tiludronato, ácido zoledrónico, raloxlfeno, tamoxifeno, droloxifeno, toremifeno, idoxifeno, levormeloxifeno, o estrógenos conjugados. En una modalidad, el paciente recibe la administración intermitente del fármaco anabólico esquelético durante un periodo de tres meses, seguido por un periodo de tres meses de tratamiento con un agente inhibidor de la resorción de hueso. El técnico experto reconocerá que el régimen de tratamiento secuencial podría empezar con un periodo de tratamiento con un agente inhibidor de resorción de hueso, seguido por un periodo de tratamiento con el fármaco anabólico esquelético, que la duración de los periodos de tratamientos secuenciales puede ser modificada (por ?P.mnln 1 -1 R v pno É-f fármacn anahrilirví ocpi iglótir-n ca uorlo coadministrar con el agente inhibidor de resorción de hueso (por ejemplo el periodo de tratamiento secuencial de un fármaco anabólico esquelético y un agente inhibidor de resorción de hueso, seguido por un periodo de tratamiento con un agente inhibidor de resorción de hueso solo). Los periodos de tratamiento secuencial (por ejemplo tres meses del fármaco anabólico esquelético, seguido por tres meses del agente inhibidor de resorción de huesos) se pueden repetir hasta que la BMD del paciente se restaure (por ejemplo una puntuación T < -2.0 ó -2.5 por debajo de la media). En otro aspecto la invención incluye un sistema de computadora y métodos para el diseño de peptidomiméticos y fármacos de molécula pequeña que tienen actividades biológicas de agonista o antagonista anabólica esquelética. En una modalidad, el sistema incluye un procesador, memoria, un visualizador o medios de salida de datos, medios de entrada de datos, y una serie de instrucciones legibles en computadora que tienen por lo menos un algoritmo capaz de hacer una estructura tridimensional de un agente anabólico esquelético, fragmento o derivado del mismo, así como también un receptor para dicho agente anabólico esquelético. En una modalidad muy preferida, el sistema comprende un algoritmo de diseño asistido por computadora (CAD) capaz de hacer un peptidomimético o fármaco de molécula pequeña en función de los sitios activos del agente anabólico esquelético o el receptor. Estos y otros objetos de la presente invención serán evidentes de la descripción detallada de la invención que se da mas abajo BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se entenderá adicionalmente de la siguiente descripción haciendo referencia a los dibujos, en donde: La figura 1 es una alineación de homología de PTHrP-(1-36) humana con la secuencia correspondiente en otras especies, alineada para maximizar la identidad de aminoácidos, y en donde los aminoácidos que difieren de los aminoácidos correspondientes de la secuencia humana están en letra negrita, y los aminoácidos que son variantes de sustitución conservativa de los aminoácidos correspondientes de la secuencia humana están en letra negrita y subrayados. La figura 2 es una alineación de homología de PTH-(1-34) humana con la secuencia correspondiente en otras especies, alineada para maximizar la identidad de aminoácidos, y en donde los aminoácidos que difieren de los aminoácidos correspondientes de la secuencia humana están en letra negrita, y los aminoácidos que son variantes de sustitución conservativa de los aminoácidos correspondientes de la secuencia humana están en letra negrita y subrayados. La figura 3 es una alineación de homología de TIP-(1-39) humana con la secuencia correspondiente en el ratón, alineada para maximizar la identidad de aminoácidos, y en donde los aminoácidos que difieren de los aminoácidos c-orresnQndientes de !a secuencia humana están en letra negrita, y los aminoácidos que son variantes de sustitución conservativa de los aminoácidos correspondientes de la secuencia humana están en letra negrita y subrayados. Las figuras 4A-4B son una gráfica lineal que representa los cambios de la densidad de la masa ósea (BMD) de la vértebra lumbar, expresada como porcentaje de cambio (figura 4A) y cambio de peso (figura 4B) en mujeres posmenopáusicas con osteoporosis que reciben placebo (N=7) o 410.25 µg/día de PTHrP-(1-36) (N=8). La figura 5 ilustra los cambios en la densidad mineral ósea como porcentaje de cambio de la línea basal después de tratamiento con PTHrP o un placebo (PBO), medida en la espina lumbar (L/S), el cuello femoral (FN) y la cadera (TH). Existe un notable incremento de la densidad mineral ósea en la espina lumbar en respuesta al tratamiento con PTHrP, un incremento mas moderado en el cuello femoral, y casi no hay incremento en la densidad mineral ósea en la cadera. Las figuras 6A-6C ilustran marcadores de recambio de hueso en los sujetos tratados con placebo y con PTHrP. La figura 6A muestra los resultados de osteocalcina en el suero expresados como el cambio con respecto a la línea basal. La figura 6B indica los valores de N-telopéptido (NTX) en el suero en los dos grupos. La figura 6C indica las desoxipiridinolinas urinarias en los dos grupos. Los resultados demuestran que la PTHrP estimulan la osteocalcina en el suero y, por deducción, la formación de hueso nero no la resorción de hueso. Las figuras 7A-7B ilustran el calcio total (figura 7A) y el calcio ionizado (figura 7B) en el suero en los grupos de PTHrP y placebo. No hay diferencia en el calcio sérico total o ionizado entre los grupos de PTHrP y de control, y ningún paciente en ningún grupo desarrolló hipercalcemia, medida por el calcio sérico total o ionizado. La figura 8 es una gráfica lineal que representa los cambios de la densidad de la más ósea (BMD) de la vértebra lumbar, expresados como % de cambio, en mujeres posmenopáusicas con osteoporosis, que recibieron placebo (N=7) o 410.25 µg/día de PTHrP-(l-36) (N=8), en comparación con los efectos de otros fármacos para la osteoporosis reportados en otros estudios clínicos publicados. Las figuras 9A-9F son una gráfica que representa estudios de unión de competencia (figuras 9A-9C) de 125l-Uyr36]PTHrP-(l-36)NH2 bajo condiciones de equilibrio con membranas corticales renales humanas (RCM) (figura 9A), membranas SaOS-2 (figura 9B), y células SaOS-2 intactas (figura 9C). Se muestran curvas de competencia para [Tyr36]PTHrP-(l -36)NH2 sin marcar (?), hPTH-(1-34) (o), rPTH-(1-34) (A), bPTH-(1-34) (•), Uyr^jbPTH-(7-34)NH2 (p), y hPTHrP-(7-34)NH2 (~). Los valores son la media ±SEM de determinaciones por duplicado para un experimento representativo. Las figuras 9D-9F son gráficas lineales que representan las transformaciones de Scatchard correspondientes de experimentos de unión representativos. Las figuras 10A-10C son gráficas que representan la estimulación de ia actividad de adeniiaio ciciasa en membranas corticales renales (RCM) humanas (figura 10A), membranas SaOS-2 (figura 10B), y células SaOS-2 intactas (figura 10C) por medio de [Tyr36]PTHrP-(1-36)NH2 (?), [Nle8'18,Tyr34]hPTH-(1-34) (o), rPTH-(1-34) (A), y bPTH-(1-34) (•). Las pruebas se realizaron bajo las mismas condiciones empleadas en las pruebas de unión respectivas. Los valores son la media ±SEM de determinaciones duplicadas para un experimento representativo. La figura 11 ¡lustra una gráfica que representa el transcurso de tiempo de la unión de los péptldos PTHrP y PTH que incluyen 125l[Nle8,18, Tyr34]-hPTH-(1-34)NH2 para membranas renales caninas a 2°C: -o- unión total de radioligando; --•-- unión de radioligando en presencia de 106M de bPTH-(1-34) sin marcar (unión ¡nespecífica); --•-- unión específica de radioligando. Los puntos representan la media ± SEM de determinaciones por triplicado. El SEM fue demasiado pequeño para indicar en los puntos sin barras de error. Los resultados son representativos de los obtenidos en tres experimentos. La figura 12 es una gráfica que representa estudios de unión de competencia de 125l-[Nle8,18, Tyr34] hPTH-(1-34)NH2, para membranas renales caninas a 20°C, con [Nle8,18, Tyr34] hPTHh-(1-34)NH2 sin marcar (A), bPTH-(1-34) (•), y [Tyr36] PTHrP-(1-36)NH2 (o). Los puntos representan la media + S.E. para determinaciones por triplicado en tres experimentos separados (bPTH-(1-34) y [Tyr36]PTHrP-(1-36)amida), o en dos experimentos separados [Nle8,18, Tyr34]hPTH-(1-34)NH2). Los puntos individuales se expresaron como u? ? µui ?ci Rajo uc la UI IIVJI I ooµc?m a v_?c¿? ? 11 m lavja d i au cí l ia uo µcµn ? OII I marcar (porcentaje de unión máxima). El recuadro indica el análisis de Scatchard de un experimento representativo. B/F, unido /libre. La figura 13 es una gráfica que representa estudios de unión de competencia de 125l-[Tyr36]PTHrP-(1-36)NH2, para membranas renales caninas a 20°C, con [Nle8,18, Tyr34]hPTHh-(1-34)NH2 sin marcar (A), bPTH-(1- 34) (•), y [Tyr36]PTHrP-(1-36)NH2 (o), PTHrP-(49-74) (?) y [Cys5,Trp1 ,GIy13] PTHrP-(5-18) (P1 -PEPTIDE) (o). Los puntos representan la media ± S.E. para determinaciones por triplicado en tres experimentos separados (bPTH-(1-34) y [Tyr36]PTHrP-(1-36)amida), o en un experimento [Nle8,18, Tyr^4]hPTH-(1-34)NH2). Los puntos individuales se expresaron como un porcentaje de la unión específica determinada en ausencia de péptido sin marcar (porcentaje de unión específica máxima). Se muestra un análisis de Scatchard (recuadro) de un experimento representativo. B/F, unido /libre. La figura 14 ilustra el cambio del contenido mineral del hueso femoral en los cinco grupos. Se muestra BMC como un porcentaje de cambio con respecto a los animales operados en falso en cada punto de tiempo. Nótese que hay un incremento progresivo del contenido mineral del hueso femoral en cada grupo de ratas tratadas con péptido, y que los cambios son altamente significativos en términos estadísticos. Las figuras 15A-15E son una serie de microfotografías de la tibia proximal derecha después de 90 días de tratamiento. A. Falso; B. OVX; C. SDZ-PTH-893; D. rhPTH(1-34); E. hPTHrP(1-36). Después de ovariectomía, ß! hueso s nierde en la tibia nrox!ma!. E! tratamiento con SDZ-PTH-893 o PTH(1-34) durante 90 días, no solo restaura el hueso perdido sino que aumenta significativamente el volumen del hueso trabecular con respecto al grupo tratado en falso. La PTHrP(l -36) restaura el hueso perdido solo parcialmente. Amplificación 5.5x. Las figuras 16A-16C representan cambios histomorfométrlcos óseos seleccionados durante el periodo de seis meses. Los puntos clave son que: No. 1 el área trabecular, la velocidad de formación de hueso y la superficie de resorción, declinan con la edad en los grupos OVX; No. 2 los tres péptidos tuvieron efectos notablemente positivos en comparación con los controles de OVX en el área trabecular y la velocidad de formación de hueso; y No. 3 a pesar de este notable aumento de velocidad de formación de hueso, las velocidades de resorción de hueso fueron similares los meses 1-6 entre los grupos tratados y de control. Las figuras 17A-17C ilustran cambios de la resistencia mecánica (carga a la falla) durante los seis meses de tratamiento. Los puntos clave son que: No. 1 los notables mejoramientos en las mediciones biomecánicas ocurrieron en los tres grupos de cada uno de los tres péptidos; y No. 2 ocurrieron mejoramientos en sitios tanto predominantemente trabeculares como predominantemente corticales. Las figuras 18A-18B ilustran cambios en el calcio sérico y el contenido renal de calcio durante los seis meses. Nótese que las ratas tratadas con SDZ-PTH-893 desarrollaron hipercalcemia moderada y notables aumentos en el contenido rena! de calcio.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Generalidades Durante toda la vida adulta, el hueso continuamente sufre remodelación mediante los ciclos interactivos de formación y resorción de hueso (recambio de hueso). La resorción de hueso normalmente es rápida y es mediada por osteoclastos (células de resorción de hueso), formados por células precursoras fagocíticas mononucleares en los sitios de remodelación de hueso. Este proceso continúa después con la aparición de osteoblastos (células formadoras de hueso), que forman lentamente el hueso para reemplazar el hueso perdido. Las actividades de los diversos tipos de células que participan en los procesos de remodelación son controladas por factores sistémicos (por ejemplo hormonas, linfocinas, factores de crecimiento, vitaminas) y locales (por ejemplo citocinas, moléculas de adhesión, linfocinas y factores de crecimiento) que interaccionan. El hecho de que la terminación de este proceso conduce normalmente al reemplazo y renovación balanceadas del hueso indica que las señales y eventos moleculares que afectan la remodelación de hueso están estrechamente controlados. El mecanismo de pérdida de hueso no está bien entendido, pero para efectos prácticos, el trastorno se origina de un desequilibrio en la formación de hueso sano nuevo y la resorción de hueso viejo, desplazado hacia una Pé dida neta de te-iido de hueso. Esta nérdida de hueso incluye una reducción del contenido mineral y los componentes de matriz de proteína del hueso, y conduce a un mayor porcentaje de fracturas de los huesos femorales y los huesos del antebrazo y las vértebras, predominantemente. A su vez, estas fracturas producen un aumento de la morbilidad general y una notable pérdida de la estatura y la movilidad, y en muchos casos un aumento de la mortalidad que resulta de las complicaciones. Se conocen varios trastornos del crecimiento de hueso que ocasionan un desequilibrio en el ciclo de remodelación de hueso. Entre estos están principalmente las enfermedades metabólicas del hueso, tales como la osteoporosls, raquitismo, osteomalacia, falla renal crónica e hiperparatiroidismo, que dan como resultado la pérdida anormal o excesiva de la masa ósea (osteopenia). Otras enfermedades del hueso, como la enfermedad de Paget, también causan una pérdida excesiva de la masa ósea en sitios localizados. Los pacientes que sufren de falla renal crónica sufren casi universalmente de pérdida de la masa del hueso esquelético (osteodistrofia renal). Aunque se sabe que el mal funcionamiento del riñon ocasiona un desequilibrio de calcio y fosfato en la sangre, hasta la fecha el reemplazo de calcio y fosfato por diálisis no inhibe significativamente la osteodistrofia en los pacientes que sufren de falla renal crónica. En los adultos, los síntomas de osteodistrofia frecuentemente son una causa significativa de morbilidad. En los niños, la falla renal frecuentemente da como resultado falta de crecimiento debido a la incapacidad >~>ara mantener o aumentar !a masa ósea. El raquitismo u osteomalacia ("huesos blandos") es un defecto de la mineralización del hueso (por ejemplo mineralización incompleta) y clásicamente está relacionada con la deficiencia o resistencia a la vitamina D (1 ,25-dihidroxi-vitamina D3). El defecto puede ocasionar fracturas de compresión y una reducción de la masa ósea, así como también zonas extendidas de hipertrofia y cartílago proliferativo en lugar de tejido óseo. La deficiencia se puede originar de una deficiencia nutricional (por ejemplo la raquitis en los niños), mala absorción de la vitamina D o el calcio, y/o deterioro del metabolismo de la vitamina. Desde su descripción inicial en los años 1920 se ha sabido que el hiperparatiroidismo (sobreproducción de la hormona paratiroidea) ocasiona pérdida anormal de hueso. En los niños, el hiperparatiroidismo puede inhibir el crecimiento. En los adultos con hiperparatiroidismo la integridad del esqueleto está comprometida y son comunes las fracturas de la cadera, vértebra y otros sitios. El desequilibrio de la hormona paratiroidea normalmente puede originarse de adenomas paratiroideos o hiperplasia de la glándula paratiroides. El hiperparatiroidismo secundario se puede originar de varios trastornos tales como la deficiencia en vitamina D o el uso farmacológico prolongado de un glucocorticoide como la cortisona. El hiperparatiroidismo secundario y la osteodlstrofia renal pueden originarse de falla renal crónica. En las primeras etapas de la enfermedad los osteoclastos son estimulados para reabsorber el hueso en respuesta al exceso de la hormona nrßsßptß. Finalmente conforme avanza la enfermedad el hueso trabecular y cortical puede ser reabsorbidos y la médula es reemplazada con fibrosis, macrófagos y áreas de hemorragia como consecuencia de microfracturas. Esta condición, que ocurre tanto en hiperparatiroidismo primario como secundario, es referida patológicamente como osteítis fibrosa quística. La osteoporosis es un deterioro estructural del esqueleto causado por pérdida de la masa ósea, originada por un desequilibrio de la formación de hueso, resorción de hueso, o ambas cosas, de tal manera que la resorción domina la fase de formación de hueso, reduciendo así la capacidad de soporte de peso del hueso afectado. La osteoporosis afecta a más de 10 millones de personas en los Estados Unidos, pero solamente del 10% al 20% son diagnosticadas y tratadas. En los adultos sanos, las velocidades a las que se forma y reabsorbe el hueso están estrechamente coordinadas a fin de mantener la renovación del hueso esquelético. Sin embargo, en las personas con osteoporosis se desarrolla un desequilibrio de estos ciclos de remodelación de hueso, que produce tanto pérdida de la masa ósea como formación de los defectos de microarquitectura en la continuidad del esqueleto. Estos defectos esqueléticos creados por perturbación de la secuencia de remodelación se acumulan, y finalmente alcanzan un punto en el cual la integridad estructural del esqueleto queda severamente comprometida y es probable la fractura del hueso. Las principales manifestaciones clínicas son fracturas vertebrales y de rtadp.ra , , n —prn _ n , updpn .. s —pr . a _fpi-.tadas tnrtas l —as n , —ar . fpR H —AI . A _R —p ,np.lpfn . I — a osteoporosis se define como una reducción de la masa (o densidad) ósea, o la presencia de una fractura por fragilidad. Esta reducción en tejido óseo va acompañada de un deterioro de la arquitectura del esqueleto, lo que conduce a un riesgo de fractura notablemente mayor. La osteoporosis es definida operacionalmente por la Fundación Nacional para la Osteoporosis (EE. UU.) y la Organización Mundial de la Salud como una densidad ósea de -2.0 ó -2.5 desviaciones estándares (SD) por abajo de la media (también referida como una puntuación T de -2.0 ó -2.5). Los que están en el extremo inferior de la escala normal de los jóvenes (una puntuación T > 1 SD por abajo de la media) tienen una densidad ósea baja y se consideran "osteopénicos" y pueden estar en riesgo de osteoporosis. Aunque este desequilibrio ocurre gradualmente en la mayoría de los individuos conforme envejecen ("osteoporosis senil"), en las mujeres posmenopáusicas es mucho más severa y ocurre a una proporción más rápida. Además, la osteoporosis también puede originarse de desequilibrios nutricionales y endocrinos, trastornos hereditarios y varias transformaciones malignas.

Epidemiología En los Estados Unidos hasta 8 millones de mujeres y 2 millones de hombres tienen osteoporosis (puntuación T < -2.5), y 18 millones de personas más tienen valores de masa ósea que los ponen en un mayor riesgo HA dp.Qarrnllar netp.nnnrnsL: í*nnr pipmnln una ni inti larti?n T maca ?«pa < - 1.0). La osteoporosis ocurre más frecuentemente conforme avanza la edad, ya que el tejido óseo se pierde progresivamente. En las mujeres, la pérdida de la función ovárica en la menopausia (normalmente después de los 50 años) precipita una pérdida ósea rápida, de tal manera que la mayoría de las mujeres cumplen con el criterio de osteoporosls a la edad de 70 años. La epidemiología de las fracturas sigue tendencias similares a las de la pérdida de la densidad ósea. La frecuencia de fracturas del radio distante aumenta antes de los 50 años y alcanzan una meseta a los 60 años, con solo un ligero incremento posterior relacionado con la edad. En contraste, el porcentaje de incidencia de fracturas de cadera se duplica cada 5 años después de los 70 años. Esta epidemiología distinta puede estar relacionada con la manera en la que las personas se caen conforme envejecen, con menos caídas sobre una mano estirada. Cada año ocurren en los Estados Unidos por lo menos 1.5 millones de fracturas como consecuencia de la osteoporosis. Conforme la población continúe envejeciendo, el número total de fracturas continuará subiendo.

Patofisiología La osteoporosis se origina de la pérdida ósea debida a los cambios normales de la remodelación de hueso relacionados con la edad, así como también de los factores extrínsecos e intrínsecos que exageran estos procesos. Estos cambios pueden estar sobrepuestos sobre un pico bajo de masa ósea. Consecuentemente el nroceso de remodelacién de hueso es fundamental para comprender la patofisiología de la osteoporosis. El esqueleto aumenta de tamaño por crecimiento lineal y por aposición del tejido óseo nuevo en las superficies externas de la corteza. Este último proceso es el fenómeno de remodelación, que también permite que la forma de los huesos largos se adapte a los esfuerzos realizados sobre los mismos. La mayor producción de las hormonas sexuales en la pubertad es requerida para una maduración esquelética máxima, que alcanza una masa y densidad máximas en la edad adulta temprana. La nutrición y el estilo de vida también tienen una función Importante en el crecimiento, aunque los factores genéticos son los principales determinantes de la masa y densidad esqueléticas máximas. Muchos genes controlan el crecimiento esquelético, la masa ósea máxima y la talla del cuerpo, pero es probable que genes separados controlen la estructura y densidad esqueléticas. Se han hecho estimaciones de heredabilidad del 50% al 80% para la densidad y tamaño óseos, basadas en estudios con gemelos. Aunque frecuentemente la masa ósea máxima es menor entre individuos con una historia familiar de osteoporosis, no se han duplicado consistentemente los estudios de asociación de los genes candidatos [receptor de vitamina D; colágeno de tipo I, el receptor de estrógeno (ER), interleucina (IL) 6; y factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) I]. Estudios de entrelazamiento sugieren que varios locus genéticos están asociados con una masa ósea alta. Una vez que se ha obtenido la masa esquelética máxima, el Toce-so de remodelac-ión sinue siendo !a nrinc-ina! actividad metabéüca de! esqueleto. Este proceso tiene tres funciones primarias: (1) reparar el microdaño del esqueleto, (2) mantener la resistencia del esqueleto, y (3) suministrar calcio del esqueleto para mantener el calcio en el suero. Las demandas agudas de calcio incluyen resorción mediada por osteoclasto así como también transporte de calcio por los osteocitos. La activación de la remodelación puede ser inducida por microdaño al hueso debido a un esfuerzo excesivo o acumulado.

La remodelación del hueso también está regulada por varias hormonas circulantes que incluyen estrógenos, andrógenos, vitamina D y PTH, así como también factores de crecimiento producidos localmente, tales como IGF-I y -II, factor de crecimiento de transformación (TGF)ß, PTHrP, IL's, prostaglandinas, factor de necrosis de tumor (TNF), y osteoprotegrina y muchos otros. Las influencias adicionales incluyen la nutrición (particularmente el consumo de calcio) y el grado de actividad física. El resultado final de este proceso de remodelación es que el hueso reabsorbido es reemplazado por una cantidad igual de tejido óseo nuevo. De esta manera, la masa del esqueleto permanece constante después de haber logrado el máximo de masa ósea en la edad adulta. Sin embargo, después de los 30 a 45 años, los procesos de resorción y formación se llegan a desequilibrar y la resorción rebasa la formación. Este desequilibrio puede empezar a diferentes edades y varía en diferentes sitios esqueléticos; se hace exagerado en mujeres después de la menopausia. La pérdida excesiva de hnp.sn SP nupdp. dp.hp.r a un ¡nr.rpmpntn ríe* la arvt?viHarl n?t nHácti a una reducción de la actividad osteoblástica. Además, un incremento en la frecuencia de la activación de remodelación puede amplificar el pequeño desequilibrio observado en cada unidad de remodelación.

Medición de la masa ósea Actualmente se tienen disponibles varias técnicas no invasivas para estimar la masa o densidad esquelética. Estas incluyen absorciometría de rayos X de energía doble (DXA), absorclometría de rayos X de energía sencilla (SXA), tomografía computarizada cuantitativa (CT), y ultrasonido. La DXA es una técnica de rayos x altamente precisa que se ha convertido en un estándar para medir la densidad ósea en la mayoría de los centros. Aunque se puede usar para medir cualquier sitio esquelético, usualmente las determinaciones clínicas se hacen en la espina lumbar y la cadera. Se han desarrollado máquinas de DXA portátiles que miden el talón (calcáneo), antebrazo (radio y cubito), o el dedo (falanges), y la DXA también se puede usar para medir la composición del cuerpo. En la técnica de DXA, se usan dos energías de rayos x para estimar el área de tejido mineralizado, y el contenido mineral se divide entre el área, lo que corrige parcialmente la talla del cuerpo. Sin embargo, esta corrección solamente es parcial puesto que la DXA es una técnica de exploración bidimensional y no puede estimar la profundidad ni la longitud posteroanterior del hueso. De esta manera, la gente menuda tiende a tener una densidad mineral ósea (BMD) menor que la nromedio. .Actualmente están en evaluación técnicas de DXA más nuevas que miden la información BMD. Los espolones de hueso, que son frecuentes en la osteoartritis, tienden a Incrementar falsamente la densidad ósea de la médula espinal. Como la instrumentación de DXA es provista por varios fabricantes diferentes, el rendimiento varía en términos absolutos. Consecuentemente, se ha hecho una práctica estándar relacionar los resultados con valores "normales" usando las puntuaciones de T, que comparan los resultados individuales con los de una población joven que se hace coincidir en raza y género. Alternativamente, las puntuaciones Z comparan los resultados Individuales con los de una población igualada en edad que también está igualada en raza y género. De esta manera, una mujer de 60 años de edad con una puntuación Z de -1 (1 SD por abajo de la media para la edad), podría tener una puntuación T de -2.5 (2.5 SD por abajo de la media de un grupo de control joven). La CT se usa principalmente para medir la médula espinal, y se usa CT periférica para medir el hueso en el antebrazo o la tibia. Está en marcha una investigación sobre el uso de CT para medir la cadera. La CT tiene la ventaja añadida de estudiar la densidad ósea en subtipos de hueso, por ejemplo trabecular contra cortical. Los resultados obtenidos por CT son diferentes de todos los otros actualmente disponibles, puesto que esta técnica analiza específicamente el hueso trabecular y puede proveer una medición verdadera de la densidad (masa ósea por unidad de volumen). Sin embargo, la CT sigue siendo cara, implica mayor exposición a la radiación, y es menos reproducible. El ultrasonido se utiliza para medir la masa ósea calculando la atenuación de la señal conforme pasa a través del hueso, o la velocidad con la cual atraviesa el hueso. No está claro si el ultrasonido determina la calidad del hueso pero esto puede tener una ventaja de la técnica. Debido a su costo relativamente bajo y a su movilidad, el ultrasonido es susceptible de usarse como un procedimiento de tamizado. Todas estas técnicas para medir la BMD han sido aprobadas por la Food and Drug Administration (FDA) de EE. UU. en función de su capacidad para predecir el riesgo de fractura. La cadera es el sitio preferido de medición en la mayoría de los individuos, ya que determina directamente la masa ósea en un sitio de fractura importante. Cuando se realizan mediciones de cadera mediante DXA, se puede medir al mismo tiempo la médula espinal. En los individuos más jóvenes, tales como mujeres perimenopáusicas, las mediciones de la médula espinal pueden ser el indicador más sensible de la pérdida de hueso.

B) Propiedades estructurales y funcionales de los péptidos PTHrP El péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP), una proteína de mas de 140 aminoácidos, y fragmentos del mismo, reproducen la mayor parte de las acciones biológicas de la PTH. La PTHrP es elaborada por varios tumores humanos y de animal y otros tejidos y puede tener una función en la hinerr.alr.emia de malipnidaH L s ser-Ußnc-ias de nucleótidos V aminoácidos de hPTHrP-(1-36) se proveen en las SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente. La actividad biológica está asociada con la porción N-terminal. La secuencia de aminoácidos del segmento N-terminal de PTHrP humana (hPTHrP) muestra una gran homología con el segmento N-terminal de varias especies, como se ilustra en la figura 1. La PTH y la PTHrP, aunque productos distintivos de diferentes genes, exhiben una considerable homología funcional y estructural y pueden haber evolucionado de un gen ancestral compartido. La estructura del gen para PTHrP humana, sin embargo, es más compleja que la de PTH, que contiene múltiples exones y múltiples sitios para patrones de empalme alternativo durante la formación del ARNm. Se producen productos de proteína de 141 , 139 y 173 aminoácidos, y pueden resultar otras formas moleculares del rompimiento específico de tejido en sitios de rompimiento internos accesibles. Las funciones biológicas de estas diversas especies moleculares y la naturaleza de las formas circulantes de PTHrP son inciertas. No se tiene la certeza de si la PTHrP circula en un grado significativo en los adultos humanos normales; como un factor paracrino, la PTHrP puede ser producida, actuar, y ser destruida localmente dentro de los tejidos. Parece que en los adultos la PTHrP tiene poca influencia sobre la homeostasis del calcio, excepto en estados patológicos, cuando tumores grandes, especialmente del tipo de célula escamosa, producen una sobreproducción masiva de la hormona. La homología de secuencia entre hPTH y hPTHrP está limitada principalmente a los trece residuos N-terminales, 8 de los cuales son idénticos; solo 1 de 10 aminoácidos de la reglón de unión del receptor (25-34) de la hPTH está conservado en la hPTHrP. La similitud conformacional puede sustentar la actividad común. Cohén y otros {J. Biol. Chem. 266: 1997-2004 (1991)) han sugerido que gran parte de la secuencia de PTH-(1-34) y PTHrP-(1-34), en particular las regiones (5-18) y (21-34), asumen una configuración de a-hélice, pero hacen notar que hay cierta duda de que esta configuración prevalezca para el extremo terminal carboxilo bajo las condiciones fisiológicas. Dicha estructura secundaria puede ser importante para la interacción de lípido, interacción del receptor, y/o estabilización estructural. El término "proteína relacionada con la hormona paratiroidea" (PTHrP) abarca PTHrP naturales, así como también PTHrP sintéticas o recombinantes (rec PTHrP). Además, el término "proteína relacionada con la hormona paratlroidea" abarca variantes alélicas, variantes de especie y variantes de sustitución conservativa de aminoácidos. El término también abarca PTHrP-(1-36) de longitud completa, así como también fragmentos de PTHrP, que incluyen moléculas pequeñas de peptidomiméticos que tienen una bioactividad similar a PTHrP, por ejemplo en las pruebas que aquí se describen. Como con la PTH, la actividad biológica de la PTHrP está asociada con la porción N-terminal, siendo aparentemente los residuos (1-30) el mínimo requerido. De esta manera, se entenderá que los fragmentos de las v v>an-p:nanmfnco- /-Ji?s D i TU? I I II I , c ?u . u.»i, l„a a?p4u-:*v.iuau u:iu~IiuAy:u~-z.a-. equivalente a PTHrP(1-36), se pueden usar en los métodos de la invención si así se desea. Los fragmentos de PTHrP incorporan por lo menos los residuos de aminoácidos de PTHrP necesarios para una actividad biológica similar a la de PTHrP intacta (1-36). Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen PTHrP-(1-30), PTHrP-(1-31 ), PTHrP-(1-32), PTHrP-(1-33), PTHrP-(1-34), PTHrP-(1-35), PTHrP-(1-36), ... PTHrP-(1-139), PTHrP-(1-140), y PTHrP-(1-141 ). El término "proteína relacionada con la hormona paratiroidea" también abarca variantes y análogos funcionales de PTHrP que tienen una secuencia de aminoácidos homologa a la PTHrP-(1-36). De esta manera, la presente invención incluye formulaciones farmacéuticas que comprenden dichas variantes y análogos funcionales de PTHrP, que llevan modificaciones como sustituciones, supresiones, inserciones, inversiones o ciclizaciones, pero que no obstante tienen sustancialmente la actividad biológica de la hormona paratlroidea. De acuerdo con la presente invención, una "secuencia de aminoácidos homologa" significa una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, por una o más sustituciones de aminoácido conservativas, o por una o más sustituciones de aminoácido no conservativas, supresiones, o adiciones localizadas en posiciones en las que no destruyen la actividad biológica del polipéptido. Las sustituciones de aminoácido conservativas normalmente incluyen sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Estas clases incluyen, por ejemplo, (A) aminoácidos que tienen cadenas polares laterales sin carga, tales r.nmn asnaranina plutamina serina trennina \/ tirnsina- (R aminná ipns ?I IO tienen cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; (C) aminoácidos que tienen cadenas laterales acidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (D) aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares, tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y cisteína. Preferiblemente, dicha secuencia es por lo menos 75%, de preferencia 80%, de preferencia 85%, muy de preferencia 90%, preferiblemente 95% homologa a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. De acuerdo con la presente invención, las secuencias de aminoácidos homologas incluyen secuencias que son idénticas o sustancialmente idénticas a una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en SEQ ID NO:2. Por "secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica" se entiende una secuencia que es por lo menos 60%, de preferencia 70%, de preferencia 80%, de preferencia 90%, muy de preferencia 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia. Preferiblemente, la secuencia homologa difiere de la secuencia de referencia, si acaso, por una mayoría de sustituciones de aminoácido conservativas. El cálculo del porcentaje de homología y del porcentaje de identidad se hace alineando primero un polipéptido PTHrP candidato con la SEQ ID NO:2, como se provee en la figura 1. Una vez alineados, se cuenta el número de aminoácidos idénticos y/o el número de variantes de sustitución de aminoácidos conservativa, compartidos entre el polipéptido candidato y la SEQ !D NQ:2. Para el cálculo de porcenta'e de identidad el número de aminoácidos idénticos entre el polipéptido PTHrP candidato y la secuencia de referencia se divide entre el número total de aminoácidos de la secuencia de referencia, y este número se multiplica por 100 para obtener un valor de porcentaje. Para el cálculo del porcentaje de homología, el número total de aminoácidos idénticos y de variantes de sustitución conservativa de aminoácidos entre el polipéptido PTHrP candidato y la secuencia de referencia, se divide entre el número total de aminoácidos de la secuencia de referencia, y se multiplica por 100 para obtener un valor de porcentaje. La figura 1 provee una alineación de homología de la PTHrP-(1-36) humana (SEQ ID NO:2) con la secuencia correspondiente en otras especies, alineada para maximizar la identidad de aminoácidos. Los aminoácidos de otras especies que difieren del aminoácido correspondiente en la secuencia humana están en letras negritas, y los aminoácidos que son variantes de sustitución conservativa de los aminoácidos correspondientes de la secuencia humana están en letras negritas y subrayados. Se proveen los valores de porcentaje de identidad y porcentaje de homología. Alternativamente, la homología se puede medir usando software de análisis de secuencia (por ejemplo, "Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group", Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1770 Unlversity Avenue, Madison, Wisconsin, 53705). Secuencias de aminoácidos similares se alinean para obtener el grado máximo de homología (es decir, de identidad). Para este fin, puede ser necesario introducir artificialmente esnac-ios en la secuencia. Una vez "ue la alineación óptima se ha establecido, se establece el grado de homología (es decir, de identidad), registrando todas las posiciones en las cuales los aminoácidos de ambas secuencias son idénticos, con respecto al número total de posiciones. Los factores de similitud incluyen tamaño, forma y carga eléctrica similares. Un método particularmente preferido para determinar similitudes de aminoácidos es la matriz PAM25O descrita por Dayhoff y otros, "5 ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE" 345-352 (1978 y Supl.), que se incorpora aquí como referencia. Primero se calcula una puntuación de similitud como la suma de las puntuaciones de similitud de los aminoácidos alineados en pares. Las inserciones y supresiones se ignoran para el cálculo de porcentaje de homología e identidad. Por consiguiente, en este cálculo no se utilizan penalizaciones de espacio. La puntuación bruta se normaliza entonces dividiéndola entre la media geométrica de las puntuaciones del compuesto candidato y la secuencia de referencia. La media geométrica es la raíz cuadrada del producto de estas puntuaciones. La puntuación bruta normalizada es el porcentaje de homología. Los polipéptidos que tienen una secuencia homologa a una de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOS:1 o 2, incluyen variantes alélicas naturales, así como también mutantes y variantes o cualquier otra variante no natural análoga en términos de actividad de formación de hueso, a un polipéptido que tiene una secuencia como la que se muestra en la SEQ ID NO:2. Una variante alélica es una forma alterna de un polipéptido que está caracterizada porque tiene una sustitución, supresión, o adición de uno o más aminoácidos que sustancialmente no altera la función biológica del polipéptido. Por "función biológica" se entiende las funciones del polipéptido en las células en las cuales ocurre naturalmente, incluso si la función no es necesaria para el crecimiento o supervivencia de las células. Por ejemplo, la función biológica de una porina es permitir la entrada a las células de los compuestos presentes en el medio extracelular. Un polipéptido puede tener más de una función biológica. Las variantes alélicas son muy comunes en la naturaleza. Una variación alélica puede ser reflejada igualmente en el polinucleótido. Los polinucleótidos, por ejemplo moléculas de ADN, que codifican variantes alélicas, pueden ser recuperados fácilmente por amplificación en una reacción en cadena de pollmerasa (PCR) del ADN genómico extraído mediante los métodos convencionales. Esto implica el uso de iniciadores de oligonucleótido sintéticos que coinciden en dirección 5' y 3' de los extremos 5' y 3' del dominio codificador. Se pueden diseñar iniciadores adecuados de acuerdo con la información de secuencia de nucleótidos provista en la SEQ ID NO:1. Normalmente un iniciador puede consistir de 10-40 nucleótidos, de preferencia 15-25 nucleótidos. También puede ser ventajoso seleccionar iniciadores que contienen nucleótidos C y G en una proporción suficiente para asegurar una hibridación eficiente, por ejemplo, una cantidad de nucleótidos C v G de nor !o menos 40% de "referencia 50% de !a cantidad tota! de nucleótidos. Los homólogos útiles que no ocurren naturalmente se pueden diseñar usando métodos conocidos para identificar regiones de un péptido PTHrP que probablemente es tolerante de cambios y/o supresiones de la secuencia de aminoácido. Por ejemplo, se conocen variantes modificadas o mejoradas en estabilidad de PTHrP. Por ejemplo, Vickery y otros (J. Bone Miner. Res 11 : 1943-1951 (1996)) describen un análogo de PTHrP con una secuencia modelo de péptido antipático (MAP) de a-hélice sustituida en la región C-terminal de hPTHrP(1-34), y se informa que el análogo resultante, [MAP1-10]22-31 hPTHrP-(1-34)NH2], tiene una actividad anabólica mayor que el péptido original en las ratas osteopénicas ovariectomizadas. Se han descrito otros análogos de polipéptido sintéticos biológicamente activos de PTH y PTHrP en los cuales los residuos de aminoácido (22-31) están sustituidos con aminoácidos hidrofílicos y aminoácidos lipofílicos que forman una a-hélice antipática. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos: 5,589,452; 5,693,616; 5,695,955; 5,798,225; 5,807,823; 5,821 ,225; 5,840,837; 5,874,086; y 6,051 ,686, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. Estos homólogos y otros de estos compuestos peptidomiméticos biológicamente activos son útiles para crear agonistas o antagonistas de molécula pequeña de PTHrP, PTH o péptidos TIP, como se expone en el ejemplo 6. Los derivados de polipéptido que son codificados por los polinucieoíidos de la invención inciuyen, por ejemplo, irag entos, polipepíidos que tienen grandes supresiones internas derivadas de polipéptidos de longitud completa, y proteínas de fusión. Se pueden derivar fragmentos de polipéptido de la invención de un polipéptido que tiene una secuencia homologa a cualquiera de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOS:2-13, al grado tal que los fragmentos retengan las propiedades deseadas de formación sustancial de hueso del polipéptido original.

Un polinucleótido de la Invención, que tiene una secuencia codificadora homologa, puede hibridar, preferiblemente bajo condiciones severas, con un polinucleótido que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1. Los procedimientos de hibridación se describen por ejemplo en Ausubel y otros, "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY", John Wiley & Sons Inc. (1994); Silhavy y otros, "EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1984); Davis y otros, "A MANUAL FOR GENETIC ENGINEERING: ADVANCED BACTERIAL GENETICS", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1980), cada una incorporada aquí como referencia. Los parámetros importantes que se pueden considerar para optimizar las condiciones de hibridación son reflejados en una fórmula que permite el cálculo de un valor crítico de temperatura de fusión, arriba de la cual dos cadenas de ADN complementarias se separan entre sí: Casey y Davídson, Nucí. Acid Res. 4:1539 (1977). Esta fórmula es como sigue: T . m. ..= R _1. .fi_ + O Ü ? -. (° ,/n„ n _+C _?, + 1. . fi~ I .n~pa ír —nnren . .trar'?n . . H „P„ i .n—n . . positivo) -0.6 x (% formamida). Bajo las condiciones apropiadas de severidad, la temperatura de hibridación (Th) es de aproximadamente de 20-40 °C, 20-25 °C, o de preferencia 30-40 °C, por abajo de la Tm calculada. Los expertos en la materia entenderán que las condiciones óptimas de temperatura y sal pueden ser determinadas fácilmente de manera empírica en experimentos preliminares usando los procedimientos convencionales.

Por ejemplo, se pueden lograr condiciones severas para incubaciones de prehibridación e hibridación, (i) en 4-16 horas a 42 °C en SSC 6x que contiene 50% de formamida, o (ii) en 4-16 horas a 65 °C en una solución acuosa de SSC 6x (1 M de NaCI, 0.1 M de citrato de sodio (pH 7.0)). La fórmula anterior se usa para polinucleótidos que contienen de 30 a 600 nucleótidos y después se corrige restando (600/ tamaño del polinucleótido en pares de bases). Las condiciones de severidad son definidas por una Th que es de 5 °C a 10 °C menor de Tm. Las condiciones de hibridación con oligonucleótidos de menos de 20-30 bases no siguen exactamente las reglas anteriormente expuestas. En dichos casos, la fórmula para calcular la Tm es como sigue: Tm = 4 x (G+C) + 2 (A+T). Por ejemplo, un fragmento de 18 nucleótidos de 50% G+C tendría una Tm aproximada de 54 °C. Consecuentemente, los métodos de la presente invención inr.li iven el nsn de un néntidn PTHrP seler.r'.innaHn HPI rtrnnn ?I IP rnnsicto on- (a) PTHrP de longitud completa; (b) variantes biológicamente activas de PTHrP de longitud completa; (c) fragmentos biológicamente activos de PTHrP; (d) variantes de fragmentos biológicamente activos de PTHrP; (e) variantes biológicamente activas que tienen por lo menos 75% de homología con SEQ ID NO:2; (f) variantes biológicamente activas que tienen por lo menos 60% de identidad con la SEQ ID NO:2; y (g) variantes biológicamente activas codificadas por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones severas con una secuencia de ácido nucleico complementaria de la SEQ ID NO:1. La PTHrP incluye, sin limitación, PTHrP humana (hPTHrP), PTHrP bovina (bPTHrP), y PTHrP de rata (rPTHrP). Un análogo de PTHrP es un péptido que es un análogo o fragmento estructural (preferiblemente un fragmento N-teminal que contiene 50 aminoácidos o menos) de una PTHrP natural y, como la PTHrP, también es capaz de unirse al receptor de PTH y estimular la actividad de adenilato ciclasa, promoviendo así la formación de hueso. Ejemplos de dichos fragmentos incluyen, sin limitación, PTHrP-(1-30), PTHrP-(1-31 ), PTHrP-(1-32), PTHrP-(1-33), PTHrP-(1-34), PTHrP-(1-35), PTHrP-(1-36),.... PTHrP-(1-39), PTHrP-(1-40), y PTHrP-(1-141). Las siguientes publicaciones describen las secuencias de péptidos de PTHrP: Yasuda *»' otros, J. Bio!. Chem. 264: 7720-7725 ^1989 Schermer, J. Bone & Min. Res. 6: 149-155 (1991); y Burtis, Clin. Chem. 38: 2171-2183 (1992). Se pueden encontrar más ejemplos en las siguientes publicaciones: solicitud alemana 4203040 A1 (1993); solicitud de PCT 94/01460 (1994); solicitud de PCT 94/02510 (1994); solicitud EP 477885 A2 (1992); solicitud EP 561412 A1 (1993); solicitud de PCT 93/20203 (1993); patente de EE. UU. No. 4,771 ,124 (1988); solicitud de PCT 92/11286 (1992); solicitud de PCT 93/06846 (1993); solicitud de PCT 92/10515 (1992); patente de EE. UU. No. 4,656,250 (1987); solicitud de EP 293158 A2 (1988); solicitud de PCT 94/03201 (1994); solicitud de EP 451 ,857 A1 (1991); patente de EE. UU. No. 5,229,489 (1993); y solicitud de PCT 92/00753 (1992). La PTHrP ejerce influencias de desarrollo importantes sobre el desarrollo del hueso fetal y en la fisiología del adulto. Un knockout de homocigoto del gen de PTHrP (o el gen para el receptor de PTH) en ratones ocasiona una deformidad letal en la cual los animales nacen con severas deformidades esqueléticas que se asemejan a una condrodisplasia. Muchos tipos diferentes de células producen PTHrP, que incluyen cerebro, páncreas, corazón, pulmón, tejido mamario, placenta, células endoteliales y músculo liso. En animales fetales, la PTHrP dirige la transferencia de calcio a través de la placenta, y en el tejido mamario son producidas altas concentraciones de PTHrP y secretadas en la leche. La leche humana y bovina, por ejemplo, contiene concentraciones muy altas de la hormona; el significado biológico de esto último es desconocido. La PTHrP también nuede tener una función en !a contracción uterina u otras funciones biológicas, que están aún por aclararse en otros sitios de tejido.

Acciones biológicas de la PTHrP Como la PTHrP comparte una homología significativa con PTH en el extremo amino critico, se une y activa al receptor de PTH/PTHrP, con efectos muy similares a los observados con PTH. Sin embargo, parece que la PTHrP y no la PTH es el regulador predominante fisiológico de la masa ósea, siendo esencial la PTHrP para el desarrollo de la masa ósea completa. Demostrando esto, estrategias condicionales de genes knockout que emplean ratones en los cuales el gen de PTHrP fue destruido en osteoblastos, impidieron la producción de PTHrP localmente dentro del hueso del adulto, pero tenían concentración normal de PTH en el hueso adulto. Ausente de PTHrP, y estos ratones desarrollaron osteoporosis, demostrando que la PTHrP derivada de osteoblasto ejerce efectos anabólicos en el hueso que promueven la función del osteoblasto; véase Karaplis, A.C. "Conditlonal Knockout of PTHrP in Osteoblasts Leads to Premature Osteoporosis" Resumen 1052, Congreso Anual de la Sociedad Americana de Investigación de Hueso y Mineral, Septiembre de 2002, San Antonio, Texas; J Bone Mineral Res, Vol 17 (Sup 1), p. S138, 2002, que se incorpora como referencia. Estos hallazgos indican que la PTHrP, y no la PTH, es el regulador normal más importante de la masa ósea bajo condiciones fisiológicas normales, y que el tratamiento de la osteoporosis con PTH, aunque efectivo, sirve únicamente mmn un sustitntn He la PTHrP PI anténtinn repnladnr de la masa ?sea El receptor de PTH/PTHrP de 500 aminoácidos (también conocido como el receptor PTH1 ) pertenece a una subfamilia de GCPR que incluye los de glucagón, secretina, y péptido intestinal vasoactivo. Las regiones extracelulares están involucradas en la unión de la hormona, y los dominios ¡ntracelulares, después de la activación de la hormona, se unen a las subunidades de proteína G para transducir la señalización de hormona a respuestas celulares por medio de la estimulación de segundos mensajeros.

Un segundo receptor de PTH (el receptor PTH2) es expresado en cerebro, páncreas y diversos otros tejidos. Su secuencia de aminoácidos y el patrón de su unión y respuesta estimuladora para PTH y PTHrP, difieren del receptor PTH1. El receptor de PTH/PTHrP responde equivalentemente a PTH y PTHrP, mientras que el receptor PTH2 responde únicamente a PTH. El ligando endógeno de este receptor parece ser el péptido infundibular tubular 39 o TIP-39. El significado fisiológico del sistema receptor PTH2-TIP39, está por ser definido. Recientemente, se ha caracterizado un péptido hipotalámico de 39 aminoácidos, el péptido infundibular tubular (TIP-39), y es probablemente un ligando natural del receptor PTH2. Los receptores PTH1 y PTH2 se pueden rastrear evolutivamente en retrospectiva hasta el pez. Los receptores PTH1 y PTH2 del pez cebra exhiben las mismas respuestas selectivas a PTH y PTHrP que los receptores PTH1 y PTH2 humanos. La conservación evolutiva de la estructura y función sugiere funciones biológicas únicas para estos receptores. I as nrntoínac d ría la Haso fí i inon ol ror-ontrir ría PTH/PTI-lrD con adenilato ciclasa, una enzima que genera AMP cíclico, lo que conduce a la activación de la proteína cinasa A. El acoplamiento de proteínas G de la clase Gq enlaza la acción de hormona con fosfolipasa C, una enzima que genera fosfatos de inositol (por ejemplo IP3) y DAG, lo que conduce a la activación de la proteína cinasa C y la liberación de calcio intracelular. Estudios que utilizan el receptor de PTH/PTHrP clonado confirman que se puede acoplar con más de una proteína G y a la ruta de la segunda cinasa mensajera, explicando aparentemente la multiplicidad de rutas estimuladas por PTH y PTHrP. Las respuestas del segundo mensajero caracterizadas incompletamente (por ejemplo, la activación de cinasa MAP) pueden ser independientes de la fosfolipasa C o la estimulación de adenilato ciclasa (sin embargo, esta última ruta de señalización del segundo mensajero para PTH y PTHrP es la más fuerte y mejor caracterizada). Los detalles de los pasos bioquímicos mediante los cuales un incremento de la concentración intracelular de AMP cíclico, IP3, DAG y Ca2+ intracelular conduce a cambios finales en la translocalización de calcio ECF y ion fosfato ECF, o en la función de la célula de hueso, son desconocidos. La estimulación de proteína cinasas (A y C) y el transporte intracelular de calcio están asociados con una variedad de respuestas de tejido específicas de hormona. Estas respuestas incluyen la inhibición del transporte de fosfato y bicarbonato, estimulación del transporte de calcio, y activación de la 1a -hidroxilasa renal en el riñon. Las respuestas en el hueso incluyen efectos <3 JUI < ? ra OII II ^OI vjs ??iaycp?, n IUI c? i ?c? ??? UC \a luoiataaa cuucilll la, aoilVIUdU UC ornitina descarboxilasa, citrato descarboxilasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; la síntesis de ADN, proteína y fosfolípido; el transporte de calcio y fosfato; y la liberación de citocina local /factor de crecimiento. Finalmente, estos eventos bioquímicos conducen a una respuesta hormonal integrada en el recambio de hueso y la homeostasis del calcio.

C) Otros agentes anabólicos Otros agentes proveen efectos anabólicos similares a los mostrados por PTHrP, por ejemplo PTH y TIP. Las composiciones de PTHP y TIP, y sus usos, son similares a los de PTHrP aquí expuestos. Estos agentes anabólicos esqueléticos, PTH y TIP o análogos de los mismos, aumentan la masa ósea en un paciente humano en necesidad de lo mismo, cuando se administran a dicho paciente a una dosis de entre 10 y 3000 µg/día, durante un periodo de 1-36 meses. En modalidades alternativas la dosis es preferiblemente de entre 10 y 50,000 µg/día, 20 y 30,000 µg/día, 35 y 20,000 µg/día, 40 y 15,000 µg/día, 45 y 10,000 µg/día, 50-5,000 µg/día, de preferencia 75-1 ,500 µg/día, de preferencia 100-1 ,200 µg/día, y muy de preferencia 300-1 ,000 µg/día. En otras modalidades alternativas, el periodo de administración es preferiblemente de 12, 15 o 18 meses, de preferencia, 7, 8, 9, 10 u 11 meses, y muy de preferencia 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 meses. El incremento de la masa ósea se pueden monitorear mediante las pruebas que aquí se describen. Estos agentes anabólicos esqueléticos se pueden combinar con la PTHrP. Se describen mas abajo.

Péptidos PTH La PTH es un péptido de una sola cadena de 84 aminoácidos.

La secuencia de aminoácidos de PTH ha sido caracterizada en múltiples especies de mamífero, revelando una notable conservación en la porción amino terminal, lo que es crítico para muchas acciones biológicas de la molécula. La actividad biológica esta asociada con la porción N-terminal, siendo los residuos (1-29) aparentemente los mínimos requeridos. El segmento N-terminal de la PTH humana (hPTH) difiere del segmento N-termlnal de las hormonas bovina (bPTH) y porcina (pPTH) solo en tres y dos residuos de aminoácido, respectivamente. La PTH se sintetiza inicialmente como una molécula más grande (hormona preproparatiroidea, que consiste en 115 aminoácidos), que después se reduce de tamaño por corte de péptido señal (hormona proparatiroidea, 90 aminoácidos), y después por un segundo rompimiento de prohormona antes de la secreción como un péptido de 84 aminoácidos. Las regiones hidrofóbicas de la hormona preproparatiroidea sirven para guiar el transporte del polipéptido de los sitios de síntesis sobre los polirribosomas a través del retículo endoplásmico hacia los granulos secretorios. Fragmentos sintéticos sustituidos modificados de la secuencia amino terminal tan pequeños como de 1-14 residuos, son suficientes para ?P.th/ar ol ro ontnr mavnr I as fnnr-innos hinl?pir-ac rio la ropiAn r»arKnvilr> terminal de PTH (por ejemplo 35-84) están en investigación; puede existir un receptor o receptores separados para esta región de la molécula. Fragmentos acortados o modificados en el extremo amino todavía se unen al receptor de PTH, pero pierden la capacidad de estimular respuestas biológicas. Por ejemplo, el péptido compuesto de la secuencia 7-34 es un inhibidor competitivo de la unión in vitro de la hormona activa a los receptores, pero in vivo es un inhibidor débil.

El término "hormona paratiroidea" (PTH) abarca PTH natural, así como también PTH sintética o recombinante (rec PTH). Además, el término "hormona paratiroidea" abarca variantes alélicas, variantes de especies y variantes de sustitución conservativa de aminoácidos. El término también abarca PTH-(1-84) de longitud completa así como también fragmentos de PTH. De esta manera, se entenderá que los fragmentos de las variantes de PTH, en cantidades que dan una actividad biológica equivalente a la PTH(1-84), se pueden usar en los métodos de la invención, si así se desea. Los fragmentos de PTH incorporan por lo menos los residuos de aminoácido de PTH necesarios para una actividad biológica similar a la de PTH intacta. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen: PTH-(1-29), PTH-(1-30), PTH-(1-31), PTH-(1-32), PTH-(1-33), PTH-(1-34), PTH-(1-80), PTH-(1-81 ), PTH-(1-82), PTH-(1-83), y PTH-(1-84). El término "hormona paratiroidea" también abarca variantes y análogos funcionales de PTH que tienen una secuencia de aminoácidos hom?lnpa a PTH- -? 'í De. p.sta manera la D.resente invención iP.cluvs formulaciones farmacéuticas que comprenden dichas variantes de PTH y análogos funcionales, que llevan modificaciones como sustituciones, supresiones, inserciones, inversiones o ciclizaciones, pero que no obstante tienen sustancialmente de la actividad biológica de la hormona paratiroidea. Las variantes de PTH de estabilidad mejorada son conocidas, por ejemplo, de WO 92/11286 y WO 93/20203, que se incorporan aquí como referencia. Las variantes de PTH pueden incorporar por ejemplo sustituciones de aminoácido que mejoran la estabilidad y la vida media de PTH, tales como el reemplazo de los residuos de metionina en las posiciones 8 y/o 18, y el reemplazo de asparagina en la posición 16. Análogos de PTH ciclizados se describen por ejemplo en WO 98/05683, que se incorpora aquí como referencia. El término "hormona paratiroidea" también abarca análogos de aminoácidos sustituidos que utilizan el esqueleto de PTH-(1-11) o PTH-(1-14): Shimizu y otros, J Biol Chem., 276: 49003-49012 (2001 ); Shimizu y otros, Endocrinology 42: 3068-3074 (2001); Cárter y Gardella, Biochim Biophys Acta 1538: 290-304 (2001); Shimizu y otros, J Biol Chem., 275: 21836-51843 (2000), cada una incorporada aquí como referencia. La figura 2 provee una alineación de homología de la secuencia de referencia, PTH-(1-34) humana (SEQ ID NO: 15), con la secuencia correspondiente de la otra especie alineada para maximizar la identidad de aminoácidos. Las "secuencias de aminoácidos homologas" significa una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en !a SEQ !D NO: 1-5 nor una o más sustituciones conservativas de aminoácidos, o por una o más sustituciones no conservativas de aminoácidos, supresiones o adiciones localizadas en posiciones en las que no destruyen la actividad biológica del polipéptido. Preferiblemente, dicha secuencia es por lo menos 75%, de preferencia 80%, de preferencia 85%, de preferencia 90%, y muy de preferencia 95% homologa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Las secuencias de aminoácidos homologas también incluyen secuencias que son idénticas o sustancialmente idénticas a una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la SEQ ID NO: 15. Por "secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas" se entiende una secuencia que es por lo menos 60%, de preferencia 70%, de preferencia 80%, de preferencia 90% y muy de preferencia 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia. Preferiblemente, la secuencia homologa difiere de la secuencia de referencia, si acaso, por una mayoría de sustituciones de aminoácido conservativas. Los péptidos PTH útiles en los métodos de la presente invención incluyen el uso de un péptido PTH seleccionado del grupo que consiste en: a) hormona paratiroidea de longitud completa; b) variantes biológicamente activas de la hormona paratiroidea de longitud completa; c) fragmentos biológicamente activos de la hormona paratiroidea; d) fragmentos de variantes biológicamente activas de la hnrmnna naratirniHoa- e) variantes biológicamente activas que tienen por lo menos 75% de homología con la SEQ ID NO: 15; f) variantes biológicamente activas que tienen por lo menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 15; g) variantes biológicamente activas codificadas por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones severas con una secuencia de ácido nucleico complementaria de la SEQ ID NO: 14.

Péptidos TIP Recientemente se caracterizó un péptido hipotalámico de 39 aminoácidos, el péptido infundibular tubular (TIP-39), y probablemente es un ligando natural del receptor PTH2. Por consiguiente, TIP-39, y los fragmentos y análogos biológicamente activos de los mismos, se pueden usar en los métodos de la presente invención. El término "péptido infundibular tubular" abarca TIP natural, así como también TIP sintético o recombínate (TIPrec). Además, el término "péptido infundibular tubular" abarca variantes alélicas, variantes de especies, y variantes de sustituciones conservativas de aminoácidos. El término también abarca TIP-(1-39) de longitud completa, así como también fragmentos de TIP. Por lo tanto, se entenderá que los fragmentos de las variantes de TIP, en cantidades que dan una actividad biológica equivalente a TIP-(1-39), se pueden usar en los métodos de la invención, si así se desea. Los fragmentos de TIP incorporan por lo menos los residuos de TIP necesarios nara una actividad biológica similar a la de T!P-(1-39) intacto. Ejemplos de dichos fragmentos son TIP-(1-29), TIP-(1-30), TIP-(1-31 ), ... TIP-(1-37), TIP-(1-38) y TIP-(1-39). El término "péptido infundibular tubular" también abarca variantes y análogos funcionales de TIP que tienen una secuencia de aminoácidos homologa a TIP-(1-39). De esta manera, la presente invención incluye formulaciones farmacéuticas que comprenden dichas variantes y análogos funcionales de TIP que llevan modificaciones como sustituciones, supresiones, inserciones, inversiones o ciclizaciones, pero que no obstante tienen sustancialmente la actividad biológica de TIP-(1-39). El cálculo del porcentaje de homología y del porcentaje de identidad se determinan alineando primero un polipéptido TIP candidato con la SEQ ID NO:26, como se provee en la figura 3. Una "secuencia de aminoácidos homologa" significa una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:15, por una o más sustituciones de aminoácido conservativas, o por una o más sustituciones de aminoácido no conservativas, supresiones, o adiciones localizadas en posiciones en las que no destruyen la actividad biológica del polipéptido. Preferiblemente, dicha secuencia es por lo menos 75%, de preferencia 80%, de preferencia 85%, muy de preferencia 90%, preferiblemente 95% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26. Las secuencias de aminoácidos homologas también incluyen secuencias que son idénticas o sustancialmente idénticas a una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la Sf- ID NID1 Por "con ionHac HO aminnó irlnc sustancialmente idénticas" se entiende una secuencia que es por lo menos 60%, de preferencia 70%, de preferencia 80%, de preferencia 90%, y muy de preferencia 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia. Preferiblemente, la secuencia homologa difiere de la secuencia de referencia, si acaso, por una mayoría de sustituciones de aminoácido conservativas. Los métodos de la presente invención incluyen el uso de un péptido TIP seleccionado del grupo que consiste en: a) TIP de longitud completa; b) variantes biológicamente activas de TIP de longitud completa; c) fragmentos biológicamente activos de TIP; d) fragmentos de variantes biológicamente activas de TIP; e) variantes biológicamente activas que tienen por lo menos 75% de homología con la SEQ ID NO: 26; f) variantes biológicamente activas que tienen por lo menos 60% de identidad con la SEQ ID NO: 26; y g) variantes biológicamente activas codificadas por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones severas con una secuencia de ácido nucleico complementaria de la SEQ ID NO: 25.

D) Formulaciones y métodos de tratamiento I oo ppmnno! ÍnpQo la lo rM-Ooantci ¡rn/Qr?f Ar*. /aof -v QC C?I PTHrP y los agentes anabólicos esqueléticos anteriormente descritos) se pueden administrar intermitentemente mediante cualquier vía que sea compatible con las moléculas particulares y, cuando se incluyen, con el agente inhibidor de resorción de hueso particular. De esta manera, según sea apropiado, la administración puede ser por vía oral o parenteral, que incluye las vías de administración subcutánea, intravenosa, inhalación, nasal, e intraperitoneal. Además, la administración intermitente puede ser mediante inyecciones periódicas de un bolo de la composición una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, dos veces a la semana, cada dos semanas, dos veces al mes, y una vez al mes. Las composiciones terapéuticas de la presente invención se pueden proveer a un individuo mediante cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo localmente, por ejemplo por inyección, implante o administración tópica a un sitio de tejido) o sistémicamente (por ejemplo parenteralmente u oralmente). Cuando la composición se provee parenteralmente, por ejemplo mediante administración intravenosa, subcutánea, intramolecular, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o mediante aerosol, preferiblemente la composición comprende parte de una solución o suspensión fluida acuosa o fisiológicamente compatible. De esta manera, el excipiente o vehículo es fisiológicamente aceptable de modo que además de suministrar la composición deseada, al paciente, no afecta adversamente ni otra manera el balance de electrolitos ni del volumen del paciente. El medio fluido para el agente puede comprender así solución salina fisiológica normal (por ejemplo NaCI acuoso al 0.9%, 0.15 M pH 7-7.4). Alternativamente, en los métodos de la presente invención se puede emplear administración pulsátil del fármaco anabólico esquelético por medio de una minibomba. Las soluciones útiles para la administración parenteral se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en el área farmacéutica que se describen por ejemplo en "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES" (Gennaro, A., ed.), Mark Pub., 1990. Las formulaciones de los agentes terapéuticos de la invención pueden incluir por ejemplo polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados, y similares. En particular, las formulaciones para la administración directa pueden incluir glicerol y otras composiciones de alta viscosidad para ayudar a mantener el agente en el sitio deseado. Los polímeros biocompatibles, preferiblemente bioabsorbibles, que incluyen por ejemplo ácido hialurónico, colágeno, fosfato de tricalcio, polibutirato, polímeros de láctido y glicólido y copolímeros lacto/glicólidos, pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación del agente in vivo. Otros sistemas de suministro parenteral potencialmente útiles para estos agentes incluyen partículas de copolímero de etileno -acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para administración por inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lartnsa n nueHen sor snlurinnos a posas m ío r-nntionon nnr oiomnln ótor polioxietileno-9-laurílico, glicocolato, y desoxicolato, o soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales, o como un gel para ser aplicado intranasalmente. Las formulaciones para administración parenteral también pueden incluir glicocolato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal, o ácido cítrico para administración vaginal. También se pueden preparar supositorios para administración rectal mezclando el péptido PTHrP (solo en combinación con un agente inhibidor de la resorción de hueso), con un excipiente no irritante tal como manteca de cacao u otras composiciones que son sólidas a temperatura ambiente y líquidas a la temperatura del cuerpo. Las formulaciones para administración tópica a la superficie de la piel se pueden preparar dispersando la molécula capaz de liberar el péptido PTHrP (solo o en combinación con un agente inhibidor de la resorción de hueso, o un agente anabólico), con un vehículo dermatológicamente aceptable tal como una loción, crema, ungüento o jabón. Son particularmente útiles los vehículos capaces de formar una película o capa sobre la piel para localizar la aplicación e inhibir la remoción. Para administración tópica a las superficies de tejido internas, el agente se puede dispersar en un adhesivo de tejido líquido o semisólido u otra sustancia conocida que aumente la absorción hacia una superficie de tejido, por ejemplo una pasta de hueso. Por ejemplo, se puede usar ventajosamente hidroxipropilcelulosa o soluciones de fibrinógeno/trombina. Alternativamente se pueden usar soluciones de recubrimiento de teüdo tales como formulaciones que contienen pectina. El método de tratamiento puede constituir un solo periodo de administración intermitente de un fármaco anabólico esquelético (por ejemplo durante un periodo que varía de 1-3 meses a 15-18 meses). De preferencia, el periodo de administración es de 12, 15 o 18 meses, de preferencia 7, 8, 9, 10 u 11 meses, y muy de preferencia 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6 meses. Alternativamente, en otra modalidad, el método de tratamiento puede constituir una serie de periodos de administración seguidos por periodos de descanso (por ejemplo periodos secuenciales de 3 meses de administración intermitente de un fármaco anabólico esquelético y 3 meses sin administrar el fármaco). Los periodos de tratamientos secuenciales se pueden repetir hasta que se restaure la BMD el paciente (por ejemplo, una puntuación T < -2.0 ó -2.5 por debajo de la media, o de preferencia < -1.0 debajo de la media). En otra modalidad, el método de tratamiento también incluye el paso de coadministrar a dicho paciente, simultáneamente o secuencialmente, un agente inhibidor de la resorción de hueso. El agente inhibidor de la resorción de hueso puede ser un bifosfonato, estrógeno, un modulador selectivo del receptor de estrógeno, un modulador selectivo del receptor de andrógeno, calcitonina, un análogo de vitamina D, o una sal de calcio. El agente inhibidor de la resorción de hueso también puede ser alendronato, risedronato, etidronato, pamidronato, tiludronato, ácido zoledrónico, raloxifeno, tamoxifeno, droloxifeno, toremifeno, idoxifeno, levormeloxifeno, o estrógenos conjugados. En una modalidad, el paciente recibe la administración intermitente de! fármaco anabólico esquelético durante un periodo, seguido por un periodo de tratamiento con un agente inhibidor de la resorción de hueso, solo o en combinación con el fármaco anabólico esquelético. En una modalidad actualmente preferida, primero se administra un agente anabólico tal como PTHrP, por ejemplo durante un periodo de tres meses o más largo, seguido por la administración de un agente inhibidor de la resorción, solo o en combinación con el fármaco anabólico esquelético, por ejemplo, durante un periodo adicional de 3 meses o más largo. Sin desear restringirse a la teoría, la administración inversa, es decir, dar el agente inhibidor de resorción antes que el agente anabólico, disminuye la eficacia del agente anabólico. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, los agentes anabólicos tales como PTHrP, deben ser la terapia primaria de la osteoporosis, usando después los inhibidores de resorción para mantener e incrementar los efectos de PTHrP/PTH/TIP, y por ejemplo administrar para la osteoporosis estrógenos o bifosfonatos como agentes de segunda línea después de los anabólicos. Sin embargo, el experto en la materia reconocerá que el régimen de tratamiento secuencial podría empezar con un periodo de tratamiento con un agente inhibidor de la resorción de hueso, seguido por un periodo de tratamiento con el fármaco anabólico esquelético, que la duración de los periodos de tratamiento secuencial se pueden modificar (por ejemplo 1-18 meses), y que el fármaco anabólico esquelético se puede coadministrar con el agente inhibidor de la resorción de hueso (por ejemplo el periodo de tratamiento secuencial de un fármaco anabólico esquelético y un agente inhibidor de la resorción de hueso, seguido por ur, periodo de tratamiento de un agente inhibidor de la resorción de hueso solo). Nuevamente, como se indicó arriba, los periodos de tratamiento secuencial (por ejemplo 3 meses del fármaco anabólico esquelético, seguido por 3 meses del agente inhibidor de la resorción de hueso), se pueden repetir hasta que se restaure la BMD del paciente (por ejemplo, una puntuación T < -2.0 ó -2.5 por abajo de la media, o preferiblemente < -1.0 por abajo de la media). Comúnmente se considera que los agentes anabólicos esqueléticos muestran muchos efectos secundarios adversos, y como resultado, la dosis y administración de estos agentes se controla cuidadosamente y se monitorea cuidadosamente al paciente para atender cualquier emergencia de efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, originalmente se pensó que la PTHrP era responsable de la mayoría de los casos de hipercalcemia de malignidad, un síndrome que se asemeja al hiperparatiroidismo, creyéndose que el perfil de toxicidad era similar o aún mayor al de PTH. Sin embargo, los perfiles de toxicidad de otros agentes anabólicos esqueléticos no parecen ser aplicables a la PTHrP. Los hallazgos de la presente invención indican que, a pesar de administrarse en dosis de por ejemplo por lo menos 20 veces más altas que las dosis consideradas seguras para PTH, la PTHrP no ocasiona efectos secundarios significativos. Por ejemplo, dosis intermitentes de PTHrP de alrededor de 50 microgramos a cerca de 400 microgramos, administrados subcutáneamente (cada 2 horas durante 8 horas después de una dosis), no parecen causar hipercaícemia. De hecho, nunca se ha observado que la administración de PTHrP haya causado hipercalcemia a ninguna dosis dada hasta ahora; de tal manera que dosis mayores de 450 microgramos y hasta 1 miligramo son seguras, bien toleradas por los pacientes y son eficaces. En algunos casos parecen seguras las dosis individuales de 3-10 miligramos, e incluso dosis de hasta 50 mg o más parecen ser bien toleradas, y también es posible un monitoreo apropiado del paciente.

Específicamente no ha habido ejemplos del desarrollo de hipercalcemia (definida en los estudios que se describen en el ejemplo 1 y el ejemplo 5 como calcio sérico por arriba de 9.9 mg/dl, una definición muy conservativa de hipercalcemia) en 18 pacientes tratados con PTHrP, a pesar de las dosis empleadas comparativamente altas. Esto contrasta con el estudio de Neer y otros, que muestra una incidencia de 11 % de hipercalcemia entre pacientes tratados con PTH a la dosis de 20 microgramos, y una incidencia de 28% de hipercalcemia entre pacientes que recibieron la dosis de 40 microgramos. De manera interesante, Neer y otros definieron la hipercalcemia como una concentración de calcio en el suero mayor de 10.6 mg/dl. Calculando nuevamente los resultados del estudio de Neer y otros usando el criterio más riguroso aquí descrito de 9.9 mg/dl para hipercalcemia, habría resultado una incidencia de hipercalcemia mucho mayor en el estudio de Neer y otros. Otros investigadores han observado hipercalcemia aún más severa con hasta 15 mg/dl, lo que es casi letal, utilizando PTH(1-84) a dosis He anrn?¡madamente AC) mirrnpramns De esta manera, la PTHrP ofrece muchas ventajas sobre la PTH como un agente terapéutico. Es un agente esquelético anabólico puro que no es hipercalcémico, y no tiene otros efectos adversos incluso cuando se administra a las dosis comparativamente más altas exploradas hasta la fecha. En segundo lugar, parece mucho más eficaz que PTH para incrementar la densidad de la masa ósea. En tercer lugar, es más estable que la PTH. En cuarto lugar, tiene una farmacocinética notablemente diferente y muy favorable con respecto a PTH. En quinto lugar, es responsable de mantener la masa ósea en los adultos, a diferencia de la PTH, que no es requerida para mantener la masa ósea. En sexto lugar, puede lograr puntos finales terapéuticos en periodos más cortos y por lo tanto es más segura para administración humana, por ejemplo su uso durante únicamente 3-9 meses puede lograr efectos dramáticos sobre la BMD, sin cruzar el umbral de 12 meses del osteosarcoma.

E) Bioensavo de la eficacia anabólica de los análogos de PTHrP La síntesis, selección y uso de PTHrP o sus análogos y otros agentes anabólicos, que son capaces de promover la formación de hueso, son del dominio de una persona con conocimientos medios en la materia. Por ejemplo, se pueden usar pruebas in vitro o in vivo muy conocidas para determinar la eficacia de varios análogos de PTHrP candidatos para promover la formación de hueso en los pacientes humanos. Para las pruebas de unión in vitro, se pueden usar células de tipo osteoblasto que son líneas celulares permanentes con características osteoblásticas y poseen receptores para PTHrP de origen de rata o humano. Las células de tipo osteoblasto adecuadas incluyen ROS 17/2 (Jouishomme y otros, Endocrinology, 130: 53-60 (1992)), UMR 106 (Fujimori y otros, Endocrinology, 130: 29-60 (1992)), y las SaOS-2 derivadas de humano (Fukuyama y otros, Endocrinology, 131 : 1757-1796 (1992)). Las líneas celulares están disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, ATCC, Rockville, Maryland, y se pueden mantener en un medio de crecimiento específico estándar. Adicionalmente también se pueden utilizar células de riñon embriónico humano transfectadas (HEK 293) que expresan los receptores PTH1 o PTH2 humanos para las pruebas de unión in vitro; véase Pines y otros, Endocrinology, 135: 1713-1716 (1994). Para las pruebas funcionales in vitro, se pueden probar las actividades de tipo PTHrP de los fragmentos de péptido o derivados de PTHrP poniendo en contacto una escala de concentraciones del compuesto de prueba con las células en un cultivo, y se puede determinar la estimulación de la activación de segundas moléculas mensajeras acopladas con los receptores, por ejemplo la estimulación de la acumulación de AMP cíclico en la célula, o un incremento de la actividad enzimática de la proteína cinasa C, los cuales se monitorean fácilmente mediante las pruebas convencionales; véase Jouishomme y otros, Endocrinology, 130: 53-60 (1992); Abou-Samra y otros, Endocrinology, 125: 2594-2599 (1989); Fujimori y otros, Endocrinology, 128: 3032-3039 (1991); Fukaya a y otros, Endocrinology, 134: 1851-1858 (1994); Abou-Samra y otros, Endocrinology, 129: 2547-2554 (1991); y Pines y otros, Endocrinology, 135: 1713-1716 (1994). Otros parámetros de la acción de PTH incluyen un incremento en el calcio y los fosfoinositoles citosólicos, y la biosíntesis de colágeno, osteocalcina, y la alteración de la actividad de fosfatasa alcalina. Las actividades agonistas de los subfragmentos de PTH han sido analizadas exitosamente poniendo en contacto los péptidos con células de riñon de rata en cultivo, y determinando la acumulación de AMP cíclico (Blind y otros, Clin. Endocrinol., 101 : 150-155 (1993), y la estimulación de la producción de 1 ,25-deshidroxi-vitamina D3 (Janulis y otros, Endocrinology, 133: 713-719 (1993)). Como lo muestran los ejemplos 2 y 3 siguientes, la PTH y PTHrP con actividad de formación de hueso se unen específicamente con los receptores PTH/PTHrP y producen una estimulación dependiente de la dosis de la acumulación de AMPc en membranas corticales renales humanas, en membranas de osteosarcoma de tipo osteoblasto humano, y en células intactas (ejemplo 2), y en membranas corticales renales caninas (ejemplo 3). Con [Nle8'18 Tyr34] hPTH-(1-34)NH2 o hPTHrP-(1-36) como los análogos estándares de referencia, se puede generar una relación de dosis-respuesta usando análisis estándar de regresión no lineal. La potencia relativa de varios análogos de PTHrP (en unidades/mg) se puede determinar de la proporción entre la CE50 del análogo estándar de referencia y la del análogo de PTHrP. La C-E50 se define como la dosis que provoca una respuesta máxima media de la acumulación de AMPc. El procedimiento detallado para manejar las células, preparar la prueba y los métodos de cuantificación de AMPc, se describen en Sistane y otros, Pharmacopeial Forum 20: 7509-7520 (1994). Para las pruebas in vivo, los análogos de PTHrP candidatos se pueden caracterizar por su capacidad para incrementar la masa ósea trabecular y cortical en ratas ovarioectomizadas, osteopénicas, como se describe en el ejemplo 4.

El ejemplo 5 describe una prueba clínica aleatorizada de doble ciego, prospectiva y controlada por placebo, de 3 meses, que muestra la efectividad de PTHrP como un agente anabólico esquelético. La PTHrP exhibe efectos secundarios mínimos, por ejemplo, a pesar de las dosis comparativamente altas, no se observa un incremento significativo de hipercalcemia. El ejemplo 6 describe un sistema de computadora y métodos para usar el mismo para un diseño estructural de peptidomiméticos y moléculas pequeñas que tienen actividad biológica anabólica esquelética. Los siguientes ejemplos se proveen únicamente con fines ilustrativos y de ninguna manera tienen la intención de limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1 Tratamiento a corto plazo de la osteoporosis posmenopáusica con dosis muu alta rlol aponto ana AIií»r» acpi iol?firn DT IDD La proteína relacionada con la hormona paratiroidea o "PTHrP", es el agente catabólico esquelético fundamental. Inicialmente fue descubierta como la causa del síndrome paraneoplásico letal común, la hipercalcemia humoral de malignidad o "HHM". La hipercalcemia que ocurre en los pacientes con HHM se origina principalmente de una activación sorprendente de la resorción de hueso osteclástica. De esta manera, la PTHrP parecería un candidato poco probable como un agente anabólico esquelético. La finalidad del presente estudio fue determinar si la administración de dosis altas intermitentes de un péptido PTHrP durante un periodo corto podría producir incrementos significativos de BMD sin efectos secundarios negativos, y por lo tanto la PTHrP pudiera ser un agente anabólico esquelético efectivo en mujeres posmenopáusicas con osteoporosis. Deduciendo que la hormona paratiroidea (PTH) puede ocasionar incrementos demostrables de la densidad mineral ósea durante 3 meses de tratamiento, y que la PTHrP requeriría ser por lo menos tan efectiva como la PTH para aumentar la masa ósea para ser terapéuticamente útil, el estudio descrito aquí como ejemplo 1 es la prueba clínica piloto de doble ciego, aleatorizada, controlada por placebo, de 3 meses, en la cual se comparó la PTHrP con el tratamiento con placebo. La velocidad de incremento, así como el incremento absoluto, observados en la densidad mineral ósea de la espina lumbar con PTHrP, son nranHoc h oto lo Í? K usando los fármacos para osteoporosis disponibles actualmente. La PTHrP administrada subcutáneamente en altas dosis por sólo tres meses parece ser un agente anabólico potente, produciendo un incremento de 4.7% en la BMD de la espina lumbar. Esto se compara muy favorablemente con los fármacos inhibidores de resorción disponibles para la osteoporosis, y la PTH. A pesar de las altas dosis, la PTHrP fue bien tolerada.

Materiales y métodos Preparación de hPTHrP-(1-36) y placebo para invección en humanos Se preparó hPTHrP-(1-36) sintética por síntesis de fase sólida, como se describió previamente (Everhart-Caye y otros, J Clin Endocrinol Metab 81 : 199-208 (1996)). En resumen, se pesó hPTHrP-(1-36), se disolvió en ácido acético 10 mM, se filtró a través del filtro de una jeringa de 0.2 µm estéril, se distribuyó en alícuotas asépticamente en alícuotas de 5 a 600 µg en frascos de vidrio estériles, se selló asépticamente en los frascos, se congeló a -80°C, y se liofilizó. Se prepararon frascos de placebo exactamente de la misma forma. Los frascos se almacenaron a -80°C. Se confirmó el contenido de péptidos por análisis de aminoácidos, RÍA de PTHrP-(1-36) (descrito más adelante) o ARN de PTHrP-(1-36) y bioensayo de adenilil ciclasa (descrito más adelante). Se hizo una prueba de pirógenos por el método de prueba del coágulo-gel del lisado de arnibociíos de lírnuio (Associates of Cape Cod, Faimouíh, Massachusetts), usando endotoxina estándar de Escherichia coli 0113 como un control. La concentración de endotoxina en los frascos estuvo abajo del límite de detección inferior (menos de 0.03 unidades de endotoxina/mL). Los frascos se etiquetaron en coordinación con la University of Pittsburgh Medical Center Investigational Pharmacy. Inmediatamente antes del inicio de cada inyección, la PTHrP-(1-36) de un frasco se reconstituyó en 1.0 mL de solución salina a 0.9%. La masa de hPTHrP-(1-36) es de 4260.6 Da. Las estructuras de los péptidos se confirmaron por espectroscopia de masa y análisis de aminoácidos. Se confirmó más de 99% de pureza por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa.

Bioensayo de adenilil ciclasa Se puso a prueba la potencia biológica de hPTHrP-(1-36) usando una prueba de adenilil ciclasa realizada en células de osteosarcoma humanas SaOS2 confluentes, usando un método descrito previamente en detalle (Everhart-Caye y otros, J. Clin Endocrinol Metab 81 : 199-208 (1996); Orloff y otros, Endocrinol 131 : 1603-1611 (1992); Merendino y otros, Science 231 : 388-390 (1986)). En resumen, se obtuvieron células SaOS2 de la ATCC, Rockville, Maryland, y se mantuvieron en medio de McCoy complementado con FBS a 10%, 2 mmol/L de L-glutamina, penicilina (50 U/mL) y estreptomicina (50 µg/mL). Las células se sembraron aproximadamente 10 días antes de la prueba en placas de 24 pocilios, y habían sido confluentes por aproximadamente 7 días previos a la prueba. Las células se incubaron a 25°C con isobutilmetilxantina (500 mmol/L) por 10 minutos, los péptidos se añadieron, y la incubación se continuó a 25°C por otros 10 minutos. Se aspiró el medio, las células se solubilizaron en ácido trifluoroacético a 5%, y los extractos se neutralizaron usando 25:75% de trioctilamina: freón. El contenido de AMPc en los extractos se midió por RÍA (Biomedical Technologies, Stoughton, Massachusetts). El péptido se examinó en por lo menos tres pruebas diferentes.

RÍA de PTHrP El RÍA de hPTHrP-(1-36) usando antisuero S2, se ha descrito en detalle previamente (Yang y otros, Biochem., 33: 7460-7469 (1994); Burtis y otros, N. Engl. J. Med., 322: 1106-1112 (1990)). En resumen, se usó el método de lactoperoxidasa para preparar amida de Tyr36PTHrP-(1-36) marcada con 125l, para su uso como radioligando (véase más adelante) como se describió previamente (Orloff y otros, J. Biol. Chem., 264: 6097-6103 (1989)). Duplicados de estándar o muestra de prueba (100 µL) se incubaron durante la noche a 4°C con 100 µL de una dilución 1 :1500 de S-2 en amortiguador P10BT (PBS conteniendo BSA 10% y Tritón X-100 al 0.1%). Se usó Tyr36 yodada de una dilución 1 :1500 de S2 en amortiguador P10BT (PBS conteniendo BSA al 10% y Tritón X-100 al 0.1 %). Se añadió a los tubos Tyr36hPTHrP-(1-36)amida yodada (2000-8000 cpm) en amortiguador PBT, y la mezcla se incubó durante la noche a 4°C. Se logró separación de fase usando carbón revestido de dextrano. La sensibilidad de la prueba es de 50 prpol/L. El aníisuero reconoce a hPTHrP-(i-74), (1-36) y (1-141) con iguai afinidad, pero no puede reaccionar en forma cruzada con hPTHrP-(37-74) o con hPTH-(1-34) o hPTH-(1-84) (Yang y otros, Biochem., 33: 1460-1469 (1994)). Bioquímica de orina y suero Se analizó sangre para estudios de química y hematología de rutina en el University of Pittsburgh Medical Center Clinical Chemistry Laboratory, y se analizaron 25 concentraciones de vitamina D en el plasma.

Se midió la osteocalcina como se describe en Gundberg y otros, J CHn Endocrinol Metab 83: 3258-3266 (1998), incorporada en la presente como referencia. Se midieron N-telopéptido (N-Tx) (Osteomark) en suero y desoxipiridinolinas (DPD) urinarias (Pyrillnks-D), usando equipos comerciales de Ostex International, Seattie Washington, y Quidel Corp, Santa Clara California, respectivamente. Sujetos de estudio Se identificaron para este estudio dieciséis mujeres postmenopáusicas sanas consecutivas con osteoporosis. Todos los sujetos del estudio dieron su consentimiento después de ser informados. Los participantes en los grupos experimental y de control fueron de edades similares (edad media de aproximadamente 65 años), peso, estatura, BMI, años de menopausia, años bajo estrógeno e ingestión de calcio similares, y tuvieron 25 concentraciones de vitamina D similares en el plasma. Ambos grupos exhibieron osteoporosis en la espina lumbar. Antes de! inicio de! estudio, cada sujeto se sometió a una exploración de la densidad mineral ósea (DXA) de la espina lumbar y la cadera al inicio y a la conclusión del estudio. Los criterios de inclusión incluyeron una puntuación T menor de -2.5 en la espina lumbar, siendo más de tres años posmenopáusicas, estando bajo reemplazo de estrógeno por cuando menos tres años, y estando en salud generalmente excelente. Los criterios de exclusión incluyeron uso en el pasado de cualquier medicación para osteoporosis, incluyendo bisfosfonatos, calcitonina o modificadores selectivos del receptor de estrógeno. El uso común de medicaciones o agentes que podrían influir sobre el metabolismo del calcio o hueso (por ejemplo, tiazidas, dosis no fisiológicas de hormona tiroidea, glucocorticoides, litio, alcohol, etc.), fue también un criterio de exclusión. Todos los sujetos de estudio proveyeron consentimiento informado. El protocolo fue aprobado por el University of Pittsburgh Institutional Review Board. Protocolo del estudio El uso de PTHrP en pruebas clínicas en humanos fue aprobado por la FDA (IND # 49175, incorporada en la presente como referencia). El protocolo fue aprobado por el University of Pittsburgh Institutional Review Board. Esta fue una prueba clínica controlada por placebo, de doble ciego y aleatorizada. La medida de resultado primaria fue la densidad mineral ósea de la espina lumbar. Las medidas de resultado secundarias fueron densidad mineral ósea del cuello femoral y de la cadera, marcadores de cambio óseo, calcio en el suero, creatinina en el suero, manejo de fósforo renal, y eventos adversos. Los dieciséis sujetos fueron aleatorizados para recibir tres meses de tratamiento con PTHrP o placebo (frascos vacíos preparados idénticamente no conteniendo PTHrP). Cada sujeto recibió también 400 Ul de vitamina D y 1000 mg de calcio como carbonato de calcio por día (Os-Cal, Smith Kline Beecham/Glaxo, King of Prussia, Pennsylvania), y esto se inició dos semanas antes del inicio de los tratamientos con PTHrP o placebo. Se les enseñó a los sujetos en casa el almacenamiento a -20°C, reconstitución y autoinyección de PTHrP o placebo. Los frascos fueron reconstituidos por los sujetos de estudio en 1.0 ml de solución salina bacteriostática estéril inmediatamente antes de su uso, a una dosificación promedio de PTHrP de 410.25 µg por día, o placebo de solución salina, y fue autoadministrada en la grasa subcutánea abdominal. Los sujetos regresaron para estudios de sangre y orina a 0, 14, 30, 60 y 90 días del estudio. Se llevó a cabo un estudio de la densidad ósea final en el día 90 del estudio. Acatamiento del estudio Un paciente en el grupo tratado con placebo se separó del estudio después de tres días. Los sujetos restantes en cada grupo concluyeron el estudio sin evento alguno. El análisis de datos siguiente incluye a los dieciséis pacientes a la línea basal, y los ocho sujetos con PTHrP y siete sujetos con placebo, quienes concluyeron los tres meses del estudio. Consideraciones de seguridad Se monitoreó a los sujetos del estudio a 0, 2, 4, 8 y 12 semanas - ti i i n oi ?ai?ci ? ??a, x^i uµ iui ?^7 ?uiai isao, c?? ??c?? n icuauco yaou up uc m isioo, enfermedades o síntomas cardiovasculares, u otras enfermedades no específicas. Se cuestionó a los sujetos respecto a efectos adversos en cada visita, es decir, 0, 14, 30, 60 y 90 días del estudio. Densitometría ósea Se midió en forma simulada la densitometría ósea en la espina lumbar y la cadera, usando un densitómetro modelo 2000 (Hologic Inc., Bedford Massachusetts). Los resultados fueron revisados en forma simulada e independientemente por dos médicos densitometristas óseos experimentados. Análisis estadístico Se llevó a cabo el análisis estadístico usando la prueba T no apareada de Student, usando el software Excel (Microsoft, Seattie, Washington). Los valores p menores de 0.05 se consideran como significativos.

Resultados Demografía de la línea basal La demografía de la línea basal en los dos grupos se muestra en el cuadro I. Los sujetos fueron de edad, peso, estatura, BMI, años de menopausia, años con estrógenos e ingestión de calcio similares, y tuvieron 25 concentraciones plasmáticas de vitamina D similares. En el grupo tratado con placebo, dos eran fumadores y uno estaba bajo una dosis de reemplazo norma! e hormona tiroidea n ra hinQt'rQiHi m.Q. Ambos prunos exhibieron osteoporosis en la espina lumbar. Acatamiento del estudio Un paciente en el grupo tratado con placebo se separó del estudio después de tres días debido a insuficiencia respiratoria y tensión del tórax después de una inyección subcutánea. Los sujetos restantes en cada grupo concluyeron el estudio sin evento alguno. El siguiente análisis de datos incluye a los 16 pacientes a la línea basal, y los ocho sujetos con PTHrP y siete sujetos con placebo, quienes concluyeron los tres meses del estudio. Resultado primario BMD L/S Los cambios de BMD en la espina lumbar durante los tres meses del estudio, se muestran en las figuras 4A-4B. La gráfica de la izquierda muestra los cambios en la densidad mineral ósea medida por DXA como por ciento de cambios de la línea basal. La gráfica de la derecha muestra los mismos datos como cambios absolutos en la densidad mineral ósea a partir de la línea basal en g/cm2. En cada gráfica, la línea pronunciada representa a los sujetos tratados con PTHrP (n = 8 indica que se incluyen los ocho pacientes tratados con PTHrP), y la línea punteada aquellos que reciben placebo. En el grupo tratado con placebo, se presentan los datos, incluyendo el dato aberrante (+) y con el dato aberrante excluido (-), como se describe en el texto (n = 6/7 indica el número de sujetos que reciben placebo, incluyendo o excluyendo ß! dato aberrante). La barra de errores representa el SEM (error estándar de la media). Se determinaron valores p usando prueba T apareada de Student. Como puede verse en la gráfica de la izquierda, el incremento en la BMD en la espina lumbar en el grupo tratado con PTHrP fue de 4.72% durante tres meses. En contraste, el cambio en el grupo tratado con placebo fue más pequeño, 1.4%, p = 0.025. Este incremento sorprendentemente grande en el grupo tratado con placebo reflejó un incremento de 6.5% en un sujeto. Se desconoce la razón del incremento marcado, 6.5%, en la BMD en el dato aberrante del grupo tratado con placebo. El incremento se confirmó por revisión simulada independiente de exploraciones DXA, y no se debió a posicionamiento u otras consideraciones técnicas. Este sujeto no fue diferente de los otros sujetos con placebo en la BMD del cuello femoral o la cadera total a la línea basal o a la conclusión, y no fue diferente con respecto a la BMD de la espina lumbar a la línea basal. No hubo evidencia de una fractura por compresión vertebral antes o después del estudio, y no hubo calcificación aórtica o artrítica. Este sujeto tuvo una de las 25 concentraciones más bajas de vitamina D en plasma en el estudio (16 ng/ml), y es posible que un componente del incremento marcado de este sujeto reflejara corrección de osteomalacia moderada. Si este sujeto se excluye, el incremento en el grupo tratado con placebo fue de 0.6%, p = 0.003. Se obtuvieron hallazgos similares cuando los resultados se expresan como cambios absolutos en la BMD en gramos por cm2 (gráfica de la derecha), con el incremento en el grupo tratado con PTHrP siendo de 0.0375 g/cm2, y de 0.011 ó 0.005 p/c en el pruno tratado con n!acebo denendiendo de si el dato aberrante se incluye (p = 0.022) o se excluye (p = 0.003). Resultados secundarios BMD de toda la cadera y cuello femoral Los cambios de BMD expresados como por ciento de cambio de la línea basal en toda la cadera y el cuello femoral, se muestran en la figura 5, y se comparan con los cambios en la espina lumbar. Las barras en color gris claro indican el grupo tratado con placebo (PBO), y las barras en negro indican el grupo experimental (PTHrP). Los datos de L/S son los mismos presentados en las figuras 4A-4B, e incluyen el dato aberrante. La barra de errores indica el SEM, y los valores P se determinaron usando prueba T apareada de Student. No hubo diferencia significativa entre los grupos tratados con PTHrP o PBO en el sitio de la cadera durante el estudio. Marcadores de cambio óseo Las figuras 6A-6C ilustran tres diferentes marcadores de cambio óseo en los sujetos tratados con placebo y tratados con PTHrP. La figura 6A ilustra la osteocalcina en suero, un marcador de la formación de hueso, incrementada en una forma estadísticamente significativa durante el estudio en los sujetos tratados con PTHrP, pero no los controles tratados placebo. Por supuesto, como se ilustra en la figura 6A, los incrementos en la osteocalcina en suero fueron evidentes tan tempranamente como el día 15 (el período más temprano en que se obtuvieron las muestras de sangre). En contraste, la NTX en suero, un marcador de resorción ósea, se mantuvn sin r.amhins Hurante el estudie en Ins suiotns trataHns n PTHrP como lo hizo en los controles tratados con placebo, como se muestra en la figura 6B. La excreción de DPD urinaria, un segundo marcador de resorción ósea, se mantuvo también sin cambios; véase la figura 6C. En las tres figuras, la línea punteada indica el grupo tratado con placebo, y la línea pronunciada el grupo tratado con PTHrP. La barra de errores indica el SEM, y los valores P se determinaron usando ANOVA para medidas repetidas. Estos hallazgos sugieren que la PTHrP estimula selectivamente la formación de hueso sin que estimule además las velocidades normales de resorción ósea. Química de orina y suero Las figuras 7A-7B ilustran el calcio ionizado en suero y el calcio total en suero en los sujetos tratados con placebo y con PTHrP. La línea punteada indica el grupo tratado con placebo, y la línea pronunciada el grupo tratado con PTHrP. La barra de errores indica el SEM, y los valores P se determinaron usando ANOVA para medidas repetidas. Los niveles de calcio continuaron siendo normales y constantes en los sujetos tratados con PTHrP, así como en los controles tratados con placebo. Ningún sujeto desarrolló un incremento significativo en el calcio ionizado o el calcio total en suero. La creatinina en suero continuó siendo normal, así como en los sujetos tratados con PTHrP y los sujetos tratados con placebo (creatinina media en suero, ±SEM, en el día 90 = 0.825 ± 0.05 mg/dl en el grupo tratado con PTHrP, contra 0.84 ± 0.06 en el grupo tratado con placebo, p = ns). El fósforo en suero fue también similar en ambos grupos a lo largo del estudio (3.2 mg/dl ± 0.18 en ei grupo tratado con PTHrP, contra 2.9 ± 0.17 en ei grupo tratado con placebo, p = ns), como lo fue el máximo tubular para el fósforo (3.3 mg/dl ± 0.27 en el grupo tratado con PTHrP, contra 2.6 ± 0.24 en el grupo tratado con placebo, p = ns). La figura 8 ilustra una comparación de la actividad anabólica de la PTHrP con resultados de pruebas clínicas seleccionadas de osteoporosis previamente publicadas. "Ralox 150" se refiere a Delmas PD, y otros, N Engl J Med 337: 1641-7 (1997); "Ralox 120" se refiere a Ettinger B, y otros, JAMA 282: 637-45 (1999); y "calcitonina" se refiere a Chestnut C. y otros, Osteoporosis Int 8 (supl. 3): 13 (1998); "alendro", "risedro" y "zoledro" se refieren a estudios que usan alendronato (Liberman UA, y otros, N Engl J Med 333: 1437-43 (1995) y Murphy MG, y otros, J Clin Endocrinol Metab 86: 1116-25 (2001 ), risedronato (Fogelman I, y otros, J Clin Endocrinol Metab., 85: 1895-1900 (2000) y McCIung MR y otros, N Engl J Med 344: 333-40, (2001 ) y zoledronato, Reid IR, y otros, N Engl J Med 346: 653-61 2002). "PTH" se refiere a dos estudios que usan hormona paratiroidea, Lindsay R, y otros, Lancet 350: 550-5 (1997) y ?eer RM, y otros, N Engl J Med 344: 1434-41 (2001 ), y "PTHrP" se refiere al presente estudio. Cada una de las referencias anteriores se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Eventos adversos Ningún sujeto en el grupo tratado con PTHrP experimentó debilidad, náusea, vómito, diarrea, constipación, ruborización, calambres musculares o fenómenos alérgicos. Un sujeto tratado con PTHrP experimentó 3O se.ni indos de nalnitaninnes del r.nn norsistonc'a deSD'jás ds ¡3 tercera inyección, las cuales no recurrieron con inyecciones subsiguientes. Todos los sujetos tratados con PTHrP concluyeron el estudio. En contraste, un sujeto en el grupo tratado con placebo experimentó ruborización, mareo y náusea después de su inyección en el día 3 del estudio, y este sujeto se retiró del estudio. Discusión Estos estudios indican que la PTHrP, administrada subcutáneamente en dosis muy grandes durante un período muy breve, puede causar incrementos estadísticamente y biológicamente importantes en la densidad ósea de la espina lumbar. Esto es sorprendente por muchas razones. Primero, la PTHrP se identificó originalmente como un resultado de sus acciones catabólicas sobre el esqueleto en hipercalcemia de malignidad humoral. Segundo, la velocidad y el incremento absoluto en la BMD de la espina lumbar, casi 5% en tres meses, son más grandes que los observados usando muchas medicaciones inhibidoras de resorción para la osteoporosis disponibles actualmente (véase la figura 8). Por supuesto, nunca se han reportado incrementos de esta magnitud usando calcitonina ni raloxifeno, aún cuando estos agentes se administren por tanto como tres años. El estrógeno causa incrementos similares en la BMD de la espina lumbar, pero un cambio de 5% requiere tres años de tratamiento. Los cambios observados usando algunos bisfosfonatos, incluyendo etidronato, alendronato, risedronato y zoledronato, pueden igualar o exceder 5%, pero requieren mucho más de tres meses, típicamente uno o más años= Por supuesto, los cambios observados se comparan favorablemente con los cambios observados, y pueden exceder posiblemente los mismos, en estudios reportados hasta la fecha usando PTH durante un período de tres meses. Vistos desde la perspectiva de las terapias inhibidoras de resorción disponibles, los efectos de las altas dosis de PTHrP a corto plazo son notables. Las dosis de PTHrP usadas en este estudio fueron grandes en comparación con las usadas en estudios con PTH similares. Los sujetos en este estudio recibieron 6.56 microgramos/kg/día, dosis que en promedio fue de 410.25 microgramos por día en los ochos sujetos que recibieron PTHrP. Esta es alrededor de 10 a 20 veces más grande que las dosis de hPTHrP-(1-34) (20-40 microg ramos/día) usadas comúnmente en estudios de osteoporosis. Las dosis de PTH mayores de 20 microgramos/día, se asocian con hipercalcemia y otros efectos adversos en humanos. Por lo tanto, es sorprendente que los sujetos sanos toleren dosis de esta magnitud sin que desarrollen hipercalcemia, hipotensión postural, náusea, ruborización u otros efectos adversos. Las diferencias no pueden atribuirse a diferencias en las cantidades molares de los dos péptidos usados, para PTHrP(1-36) está muy cerca en peso molecular a PTH(1-34) (Mr de aproximadamente 4200). Ni pueden atribuirse las diferencias a diferentes interacciones con el receptor de PTH/PTHrP común: hPTHrP(1-34) y hPTHrP(1-36) exhiben características de activación de transducción de señales y cinética de unión similares o idénticas. De modo importante, en la comparación de individuo con individuo con hPTH íl-34) in vitro y también in vivo administrada intravenosamente a voluntarios humanos, la PTHrP(1-36) es igual en potencia a la hPTH(1-34). Diferentes velocidades de depuración metabólica en suero son también una explicación improbable, ya que los inventores han demostrado que el T-?/2 de la PTHrP(1-36) infundida intravenosamente es de seis minutos, indistinguible de los cinco a seis minutos reportados para la hPTH(1-34). Las diferencias en los efectos de los dos péptidos sobre el esqueleto se refieren a diferentes características farmacocinéticas de la PTH y la PTHrP después de la inyección subcutánea. Se ha reportado en dos estudios, que la PTH(1-34) humana alcanza niveles máximos en plasma a 30 a 45 minutos después de la inyección, mientras que los presentes inventores han reportado que los niveles máximos de la PTHrP en plasma ocurren a 15 minutos o antes de este tiempo después de una dosis subcutánea. Por supuesto, puesto que el punto de tiempo de 15 minutos fue el primero que los presentes inventores examinaron, y puesto que los valores de la PTHrP circulante parecieron estar en una declinación aguda en este punto de tiempo inicial de 15 minutos, es muy probable que el máximo ocurra mucho antes, quizá a 5 a 10 minutos. De esta manera, la hPTHrP(1-36) es absorbida más rápidamente que la PTH después de la inyección subcutánea, y los niveles de la PTHrP en plasma alcanzan su máximo, y disminuyen por lo tanto más rápidamente, que los de la PTH. La diferente cinética de absorción y depuración de la PTHrP contra la PTH sustenta el requisito para una gran dosis de PTHrP, así como la falta de hinerr.alr.emia en ¡OS D3CÍsnteS estudiados a pesar de estas grandes dosis. Esta seguridad aparente es apoyada por estudios previos de los presentes inventores, en los cuales otros siete sujetos recibieron la misma dosis de 6.56 microgramos/kg/día por dos semanas sin eventos adversos, y otro estudio en el cual esta dosis se administró como una dosis individual a tres individuos sanos. De esta manera, no se han encontrado eventos adversos en un total de 18 sujetos humanos sanos que reciben estas grandes dosis de PTHrP por períodos de un día, dos semanas o tres meses. Desde el punto de vista mecanicista, los datos del marcador de cambio óseo (véase las figuras 6A, 6B y 6C) sugieren que la PTHrP puede tener efectos puramente anabólicos sobre el esqueleto, sin el incremento acompañante en la resorción ósea observada usando PTH. De esta manera, en contraste con la PTH, que exhibe propiedades de estimulación de resorción y formación, la PTHrP parece tener efectos osteoblásticos o anabólicos selectivos, sin efectos concomitantes de estimulación de la resorción. Es improbable que la falta de un efecto de resorción se deba al uso concomitante de estrógeno, puesto que la respuesta de resorción a la PTH no es suprimida por el estrógeno. De modo interesante, mientras que la velocidad de incremento en la BMD en el presente estudio fue muy grande, el incremento total en el marcador de formación osteocalcina fue similar a, o significativamente menor que, el reportado usando PTH. El incremento en formación relativamente menor aparente, en el ambiente de un incremento más bien dramático en la BMD, apoya la evidencia bioquímica de una falta aparente de un efecto de estimulación de la resorción. La confirmación de este hallazgo puede hacerse usando biopsias de esqueleto e histomorfometría ósea cuantitativa. La falta de un efecto de resorción no se debe probablemente a la duración breve (tres meses) de la administración de PTHrP, puesto que estudios previos han mostrado que la PTH incrementa la resorción ósea significativamente en tres meses, o bien antes de este tiempo. Por ejemplo, en un estudio, Lindsay y otros, {Lancet 350: 550-555 (1997)), la resorción evaluada usando NTX urinaria fue ya elevada en dos semanas, y fue incrementada por 25% en tres meses. Finkelstein y otros, (N Engl J Med 331 : 1618-1623 (1994)) demostraron que la hidroxiprolina y las piridinolinas urinarias, dos marcadores diferentes de resorción ósea, fueron incrementadas por aproximadamente 200% en tres meses después del tratamiento con PTH. En forma similar, Hodsman (J Clin Endocrinol Metab 82: 620-628 (1997)) ha demostrado que la hidroxiprolina y la ?TX urinarias, son incrementadas significativamente por sólo cuatro semanas de tratamiento usando PTH. Asimismo, es improbable que la falta de un efecto de resorción se deba al uso concomitante de estrógeno. Primero, el mismo tipo de disociación se observó en el primer estudio de los presentes inventores en mujeres posmenopáusicas sin el uso de estrógeno (Plotkin y otros, J Clin Endocrinol Metab 83: 2786-2791 (1998)). Segundo, la respuesta de resorción a la PHT es fácilmente aparente en mujeres estrogenizadas en los estudios de Roe y de Lindsay en tres meses (Roe y otros. Program and Abstracts of the 81st Annual Meeting of the Endocrine Society, San Diego, California, junio 12-15, 1999, p. 59; Lindsay y otros, Lancet 350: 550-555 (1997)). De esta manera, a partir de los datos disponibles hasta la fecha, parece que la PTHrP, a las dosis usadas hasta ahora y por la duración observada hasta la fecha, puede ser diferente de la PTH, y puede exhibir efectos puramente anabólicos. Asumiendo que el efecto anabólico selectivo es reproducible en estudios más largos y más grandes como se describió anteriormente, se formula la hipótesis de que las diferencias en la formación y resorción óseas entre la PTH y la PTHrP pueden resultar también de sus diferentes farmacocinéticas después de la absorción subcutánea, como se describió anteriormente. Es bien sabido que la exposición más duradera de los osteoblastos o sus precursores in vitro o in vivo a la PTH disminuye la respuesta anabólica, mientras que aumenta la respuesta de resorción osteoclástica (véase, Rosen y Bilezikian, J Clin Endocrinol Metab. 86: 957-964 (2001 ); Dempster y otros, Endocrine Reviews 14: 690-709 (1993); Dobnig y Turner, Endocrinology 138: 4607-4612 (1997)). Por buena suerte, la absorción y depuración aceleradas de la PTHrP después de la inyección subcutánea, en comparación con las de la PTH, pueden favorecer además el equilibrio de formación contra resorción. Las dosis de PTHrP usadas en este estudio fueron muy grandes. Los sujetos en este estudio recibieron una dosificación promedio de 410.25 µg por día en los ocho sujetos que recibieron PTHrP. Esta es alrededor de 10 a 20 veces más grande que las dosis de hPTH=(1=34) (20=40 icrogramos/día) usadas comúnmente en estudios de osteoporosis. Las dosis de PTH mayores de 20 microgramos/día, son conocidas por estar asociadas con hipercalcemia y otros efectos adversos. Por lo tanto, es sorprendente que los sujetos sanos toleren dosis de PTHrP de esta magnitud sin que desarrollen hipercalcemia, hipotensión postural, náusea, ruborización u otros efectos adversos. Las diferencias no pueden atribuirse a diferencias en las cantidades molares de los dos péptidos usados, para PTHrP(1-36) está muy cerca en peso molecular a PTH(1-34) (Mr de aproximadamente 4200). Ni pueden atribuirse las diferencias a diferentes interacciones con el receptor de PTH/PTHrP común: hPTHrP(1-34) y hPTHrP(1-36) exhiben características de activación de transducción de señales y cinética de unión similares o idénticas, en humanos. Diferentes velocidades de depuración metabólica en suero son también una explicación improbable, ya que se ha demostrado que el T-?/2 de la PTHrP(1-36) infundida intravenosamente es de aproximadamente seis minutos, indistinguible de los aproximadamente cinco a seis minutos reportados para la hPTH(1-34). Sin que sea restringido por la teoría, una explicación posible es que las diferencias en los efectos de los dos péptidos sobre el esqueleto se refieren a diferentes características farmacocinéticas de la PTH y la PTHrP después de la inyección subcutánea. La PTH(1-34) humana alcanza niveles máximos en plasma a aproximadamente 30 a 45 minutos después de la inyección, mientras que los niveles máximos de la PTHrP en plasma ocurren a aproximadamente 15 minutos o antes de este tiempo después de una dosis subcutánea. De esta manera, es probable que la hPTHrP(1-36) sea absorbida más rápidamente que la PTH después de la inyección subcutánea, y los niveles de la PTHrP en plasma alcanzan su valor máximo y disminuyen más rápidamente que los de la PTH. Estas diferencias farmacocinéticas pueden dar también razón de la respuesta selectiva o anabólica pura observada. Es bien sabido que la exposición más duradera de los osteoblastos in vitro o in vivo a la PTH disminuye la respuesta anabólica, mientras que aumenta la respuesta de resorción osteoclástica. La absorción y depuración aceleradas de la PTHrP después de la inyección subcutánea, en comparación con las de la PTH, pueden favorecer además el equilibrio de formación contra resorción. En este estudio, los sujetos en los grupos tratados con placebo y PTHrP estuvieron recibiendo concomitantemente estrógeno, además de complementos de vitamina D y calcio, en parte, por razones éticas, de modo que el grupo tratado con placebo recibiría alguna forma de tratamiento aceptado comúnmente para osteoporosis. Como para la PTH, falta por determinar si el efecto anabólico de la PTHrP es intensificado por el uso concomitante de estrógeno. Estudios con PTH en humanos muestran en general una eficacia similar, si los sujetos están recibiendo o no estrógeno (véase la figura 8), aunque no han habido estudios hasta la fecha que consignen directamente esta cuestión para la PTHrP. Queda por determinar si la PTHrP podría ser más o menos efectiva cuando se administre concomitantemente con otros agentes inhibidores de resorción (bisfosfonatos, moduladores selectivos del receptor estrógeno, etc.). El tratamiento a corto plazo y a dosis muy altas con PTHrP(1-36), causa un incremento notable en la BMD de la espina lumbar. En contraste a los efectos inhibidores de resorción y anabólicos sobre el esqueleto combinados o netos de la PTH administrada intermitentemente, la PTHrP parece tener efectos predominantemente anabólicos con poco o ningún componente de resorción. No es probable que las diferencias entre la PTH y la PTHrP reflejen diferencias en la señalización o interacciones de los receptores entre las dos moléculas, pero probablemente residen en diferentes propiedades farmacocinéticas de las dos moléculas después de la administración subcutánea. De los siete sujetos que reciben placebo por cuatro meses, seis sujetos no demostraron cambio significativo alguno en la densidad mineral ósea (BMD) en la cadera o espina lumbar. Un sujeto tratado con placebo exhibió un incremento de 6% en la BMD de la espina lumbar. Claramente, ésta no es la respuesta esperada o típicamente encontrada al placebo (el grupo que escribe para la prueba PEPI, JAMA 276: 1389-1396 (1996); Delmas y otros, N Engl J Med 337: 1641 -1647 (1997); Chestnut y otros, Osteoporosis Int 8 (supl. 3): 13 (1998); Liberman y otros, N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung y otros, N Engl J Med 344: 333-40 (2001); Finkelstein y otros, N Engl J Med 331 : 1618-1623 (1994); Hodsman y otros, J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay y otros, Lancet 350: 550-555 (1997); ?eer y otros, N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001 ); Roe y otros, Program and Abstracts of the 81 st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe y otros, J Clin invest 102: 1627-1633 (1998)), sugiriendo que este sujeto pudo haber tenido deficiencia de vitamina D a la línea basal, o una fractura por compresión vertebral incidental no radiológicamente aparente. Como se ilustra en las figuras 4A-4B, los ocho sujetos que reciben PTHrP demostraron incrementos importantes en la BMD de la espina lumbar, con un valor medio de aproximadamente 4.75%. Cuando se comparan con los siete controles, incluyendo el dato aberrante del placebo, los resultados son significativos (p = 0.026). Cuando se compararon con los seis controles tratados con placebo realmente normales, los resultados son altamente significativos (p = 0.003). Estos resultados son bastante extraordinarios y sorprendentes por varias razones. Primero, ninguno de los fármacos para osteoporosis disponibles, los inhibidores de resorción, da este tipo de incrementos en la BMD en dicho marco de tiempo corto (el grupo que escribe para la prueba PEPI, JAMA 276: 1389-1396 (1996); Delmas y otros, N Engl J Med 337: 1641-1647 (1997); Chestnut y otros, Osteoporosis Int 8 (supl. 3): 13 (1998); Liberman y otros, N Engl J Med 333: 1437-1443 (1995); McCIung y otros, N Engl J Med 344: 333-40 (2001 ). Como se ilustra en la figura 8, la velocidad de incremento en la BMD observada en el presente estudio, es mayor que las velocidades de incremento de la BMD reportadas en estudios clínicos previos. Los resultados son extremadamente rápidos: tres meses de terapia con PTHrP-(1-36) dieron incrementos no observados generalmente por dos a tres años con los inhibidores de resorción como se describió anteriormente. Por supuesto, varios inhibidores de resorción disponibles (SERMs, calcitonina, vitamina D, calcio), nunca logran estos incrementos de la BMD. Segundo, los resultados son comparables, o superiores, a los obtenidos usando PTH, el mejor agente anabólico estudiado para el esqueleto hasta la fecha (Finkelstein y otros, N Engl J Med 331 : 1618-1623 (1994); Hodsman y otros, J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay y otros, Lancet 350: 550-555 (1997); ?eer y otros, N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001 ); Roe y otros, Program and Abstracts of the 81 st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe y otros, J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)). Tercero, las dosis requeridas son sorprendentemente altas: como se indicó anteriormente, dosis estándar de PTH-(1-34) están en la escala de 20 a 40 µg/día (Finkelstein y otros, N Engl J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman y otros, J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay y otros, Lancet 350: 550-555 (1997); ?eer y otros, N Engl J Med 344:" 1434-1441 (2001); Roe y otros, Program and Abstracts of the 81 st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe y otros, J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)), algunas 10 a 20 menores que las usadas en la presente para la PTHrP-(1-36). Cuarto, a pesar de las dosis relativamente enormes de la PTHrP administradas en el presente estudio, no se han encontrado eventos adversos, mientras que dichos eventos adversos se han notado con dosis mucho más pequeñas de PTH (Finkelstein y otros, N Engi J Med 331: 1618-1623 (1994); Hodsman y otros, J Clin Endocrinol Metab 82: 620-28 (1997); Lindsay y otros, Lancet 350: 550-555 (1997); ?eer y otros, N Engl J Med 344: 1434-1441 (2001); Roe y otros, Program and Abstracts of the 81 st Annual Meeting of the Endocrine Society, p. 59 (1999); Lañe y otros, J Clin Invest 102: 1627-1633 (1998)). La ausencia de toxicidad y el requisito de altas dosis en humanos, parecen ser comparables a los hallazgos en ratas descritos anteriormente, en los cuales dosis equimolares de PTHrP tuvieron menos eficacia y menos toxicidad en comparación con la PTH. Estas observaciones, como se indicó anteriormente, parecen reflejar las diferencias afortunadas y no predecibles en la farmacocinética de la PTHrP en comparación con la PTH después la administración subcutánea. Quinto, se ve ampliamente a la PTHrP como la hormona catabólica más esencial para el esqueleto, responsable de la dramática pérdida de minerales del esqueleto en pacientes con HHM. No se anticipó la observación de que la PTHrP es realmente marcadamente anabólica para el esqueleto cuando se administra "intermitentemente" (por ejemplo, una vez al día). Esto es evidenciado por el hecho de que muchos investigadores y firmas farmacéuticas han trabajado por más de diez años (y probablemente tanto como 70 años) con la PTH en la osteoporosis, pero ninguno ha abarcado a la PTHrP a pesar de que ha estado en el dominio público desde su descripción inicial en 1987. Por último, el régimen de tratamiento de la presente invención para e¡ tratamiento de !a osteoporosis tiene una concentración no anticipada y no predecible adicional que se refiere a la seguridad. En estudios preclínicos de toxicidad, se administró PTH a ratas en crecimiento por dos años. Algunas ratas desarrollaron osteosarcomas después de aproximadamente un año de terapia con PTH. Esto sugiere que el uso del agente anabólico por períodos menores de un año, puede poner a los humanos en menor riesgo que los usados por períodos más largos. La eficacia temprana de la PTHrP en estudios en humanos, sugiere que es probable que duraciones de tratamiento más breves sean efectivas en humanos. En apoyo de esto, es la observación de que a pesar de las dosis muy altas de PTHrP usadas en este estudio, no se han observado eventos adversos en sujetos humanos. Además, la disponibilidad de un agente puramente o predominantemente anabólico, puede permitir procedimientos combinados para tratar la osteoporosis usando regímenes concomitantes, intermitentes o secuenciales con agentes inhibidores de resorción. De conformidad con los métodos de la presente invención, puede tratarse a los pacientes, por ejemplo, inicialmente con un curso de varios meses de PTHrP, o un análogo o fragmento de la misma, y se puede cambiar entonces a una formulación inhibidora de resorción oral sin riesgo de osteosarcoma. En resumen, este tratamiento a corto plazo y a altas dosis con PTHrP(1-36), causa un incremento notable en la BMD de la espina lumbar. Estudios similares con dosis incluso mayores, por ejemplo, 1000 a 3000 microgramos/día, muestran incrementos comparables en la densidad ósea sin anabólicos combinados o netos sobre el esqueleto, que tiene la PTH administrada intermitentemente durante el mismo período, la PTHrP puede tener efectos predominantemente anabólicos con poco de un componente de resorción. No es probable que las diferencias entre la PTH y la PTHrP reflejen diferencias en la señalización o las interacciones de los receptores entre las dos moléculas, pero probablemente residen en las diferentes propiedades farmacocinéticas de las dos moléculas después de la administración subcutánea. A pesar de las dosis muy altas de PTHrP usadas, no se han observado eventos adversos en 18 sujetos humanos. La disponibilidad de un agente puramente o predominantemente anabólico, además de la PTH, puede permitir otros procedimientos combinados para tratar la osteoporosis, usando regímenes concomitantes, intermitentes o secuenciales con agentes inhibidores de resorción.

EJEMPLO 2 Caracterización de análogos de PTHrP usando receptores renales y óseos de humano El propósito del presente estudio fue caracterizar varios análogos de PTH y PTHrP usando receptores renales de humano y receptores óseos de humano. Se examinó también la capacidad de estos análogos para estimular la adenilato ciclasa. Para una descripción detallada de los métodos en. el presente eiemplo véase, por ejemplo, Orloff y otros, Endocrino!., 131 : 1603-1611 (1992), incorporada en la presente como referencia.

Materiales y métodos Péptidos Se prepararon (Tyr36)hPTHrP-(1-36)amida [hPTHrP-(1-36)], hPTHrP-(1-74) y hPTHrP-(37-74) por síntesis de fase sólida, como se describió previamente (Orloff y otros, J. Biol. Chem., 131 : 1603-1611 (1992); Stewart y otros, J. Clin. Invest., 81 : 596-600 (1988)). Se adquirieron hPTH-(1-34), (Nle8*18, Tyr34)hPTH-(1-34), (b)PTH-(1-34) de bovino, (r)PTH-(1-34) de rata, hPTHrP-(1-86), (N!e8'18,Tyr34)bPTH-(3-34)amida, (D-Trp12, Tyr34)bPTH-(7-34)amida, (Tyr34)bPTH-(7-34)amida, hPTHrP-(7-34)amida y hPTH-(13-34) de Bachem, Inc. (Torrance, California). Se obtuvo bPTH-(1-84) del National Hormone and Pituitary Program, a través del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK). Se adquirió (Tyr36)(c)PTHrP-(1-36)amida de pollo, de Península Laboratories, Inc., Belmont, California. La hPTHrP-(1-141) fue provista por Genentech, Inc., So. San Francisco, California, y la rPTH-(1-34) transaminada fue provista por el Dr. David L. Carnes, Jr. (San Antonio, Texas). Se prepararon PTH-(1-34)amida, [Nle8,18, D-Trp12]bPTH-(7-18)-hPTHrP-(19-34)NH2 y [D-Trp12]hPTHrP-(7-18) [Tyr^bPTH-(19-34)NH2 de pollo por síntesis de fase sólida, según se describe (Caufield y otros, Endocrinol 123: 2949-2951 (1988); Chorev y otros, J Bone Min Res 4: S270 (1989)). La concentración de péptidos para todos los péptidos usados, se da como el valor determinado por análisis de aminoácidos. Los mismos lotes de péptidos se usaron en todos los estudios. Radioyodación Se llevó a cabo radioyodación de hPTHrP-(1-36), usando una modificación del método de lactoperoxidasa como se describió previamente (Orloff y otros, J. Biol. Chem., 264: 6097-6103 (1989); Orloff y otros, J Bone Min Res 6: 279-287 (1991 )). Se logró la purificación del radioligando por HPLC de fase inversa, usando una columna C18 µ-Bondapak de 20 cm (Waters Associates, Milford, Massachusetts). El radioligando preparado y purificado de esta forma, se forma casi exclusivamente de la forma monoyodada. La actividad específica varió de 300-450 µCi/µg a la hora de la yodación. El radioligando exhibió actividad biológica completa en la prueba de adenilato ciclasa renal de canino cuando se comparó con el péptido no marcado (Orloff y otros, J. Biol. Chem., 264: 6097-6103 (1989)). Cultivo de células La línea de células de osteosarcoma humanas tipo osteoblasto, SaOS-2 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland), se mantuvo en medio de McCoy complementado con suero de bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 µg/ml). El medio se cambió cada tercer día, y los estudios se llevaron a cabo a 5 a 7 días después de la confluencia. Se determinó el número de células usando un contador Coulter. Preparación de membranas Se prepararon RCIVi humanas altamente purificadas, usando ultracentrifugación discontinua de gradiente de sacarosa como se describió previamente (Orloff y otros, J Bone Min Res 6: 279-287 (1991)). Todos los pasos se llevaron a cabo en presencia de los siguientes inhibidores de proteasa: aprotinina [10 unidades de inhibidor de kalicreína (UIK/ml], pepstatina (5 µg/ml), leupeptina (45 µg/ml) y fluoruro de fenilmetansulfanilo (10 µg/ml). La corteza renal normal de humano fue de cuatro muestras de nefrectomía separadas removida para carcinoma localizado de células transicionales, carcinoma de células renales o quistes benignos. La función renal en todos los individuos fue normal, evaluada por creatinina en suero y pielografía. Las membranas fueron agrupadas, distribuidas en alícuotas y almacenadas a -70°C para uso posterior. Se prepararon membranas de células SaOS-2 como se describió previamente en detalle. En resumen, se rasparon células post-confluentes en matraces de 150 cm2 en amortiguador de membrana [Tris-HCl 10 mM (pH 7.5), MgCI2 0.2 mM, EGTA 0.5 mM, ditiotreitol 1 mM, leupeptina 45 µg/ml, pepstatina 5 µg/ml, aprotinina 10 UIK/ml y fluoruro de fenilmetanosulfanilo 10 µg/mlj a 0°C. Se logró la disolución de las células por sonicación, y la suspensión se centrifugó a 13,000 x g por 15 minutos a 4°C. La pella se resuspendió con un homogenizador de vidrio Dounce en amortiguador de membrana (menos ditiotreitol) que contenía sacarosa 250 mM. La suspensión se estratificó sobre un cojín del amortiguador de membrana que contenía sacarosa al 45%, y se centrifugó a 70,000 x g por 30 minutos a 4°C. La fracción de membrana estratificada en la ipteríaz se colectó, se diluyó 5 veces con amortiguador de membrana que contenía sacarosa 250 mM, y se volvió a centrifugar. La pella se resuspendió en amortiguador de membrana que contenía sacarosa 250 mM, se distribuyó en alícuotas, y se almacenó a -70°C. Se determinó la concentración de proteínas por el método de Lowry, usando BSA como estándar. Estudios de unión del receptor Se ha descrito previamente la prueba de unión a la membrana usando RCM humanas a 30°C (Orloff y otros, J Bone Min Res 6: 279-287 (1991)). Se añadieron RCM humanas a una concentración final de 90 µg/ml. La unión total (TB) de 125l-(Tyr36)hPTHrP-(1-36)NH2 a RCM humanas varió entre 11 % y 20% de los conteos totales añadidos, y la unión inespecífica (NSB) varió de 2.4 a 4.0%. La unión específica de 125l-(Tyr36)hPTHrP-(1-36)NH2 alcanzó el equilibrio a alrededor de 30 minutos a 30°C. El tiempo de incubación de 30 minutos se usó para estudios subsiguientes de competencia de unión en equilibrio. La prueba de unión para membranas de células SaOS-2 se llevó a cabo como para RCM humanas. Se añadieron membranas a una concentración final de 112.5 µg/ml, y la unión específica alcanzó el equilibrio a alrededor de 60 minutos a 30°C. La TB varió de 15 a 20%, y la NSB de 4.0 a 4.3%. La unión a células SaOS-2 intactas se llevó a cabo según se describe (Orloff y otros, Am J Physiol 262: E599-E607 (1992)), con las Í-.: .;?.-.+?,-. ,-. ?„ ?„4., „j;„,, ?„ , .„:?„ „ < cor> — iyuísi i c i i i?uiu a iui iso. s nsvai?i i a ?auu coiuuiuo uc ui IIUI i a I U ? en presencia de quimiostatina (100 µg/ml) y bacitracina (200 µg/ml). La unión específica de l25l-(Tyr36)hPTHrP-(1-36)NH2 alcanzó el equilibrio a alrededor de 150 minutos a 15°C. El tiempo de incubación de 150 minutos se usó por lo tanto para estudios de unión competitiva. La viabilidad celular, evaluada por exclusión de azul trípano, fue mayor de 95% al final de una incubación estándar. La unión total (TB) varió de 18. a 23% de la radiactividad total añadida, y la unión no específica (NSB) varió consistentemente entre 5 y 7%.

Se examinó la estabilidad del radioligando durante la incubación bajo condiciones de prueba respectivas para cada preparación de membrana (membranas de células SaOS-2 y de riñon humano), y para la prueba de células intactas (SaOS-2), por la capacidad de 5l-(Tyr36)hPTHrP-(1-36) expuesta a las células para volverse a unir en comparación con la unión del radioligando "fresco" (Orloff y otros, J Biol Chem 264: 6097-6103 (1989); Orloff y otros, J Bone Min Res 6: 279-287 (1991)). La unión repetida específica de 125l-(Tyr36) hPTHrP-(1-36) a RCM humanas, membranas de células SaOS-2 y células SaOS-2 intactas, fue de 92%, 98% y 83%, respectivamente. Esto indicó que no ocurrió degradación significativa del radioligando bajo las condiciones de prueba respectivas. Prueba de adenilato ciclasa Se examinó la actividad de estimulación de adenilato ciclasa en células SAOS-2 confluentes, como se describió previamente para células ROS 17/2.8 (Merendino y otros, Science 231 : 388-390 (1986)), con la siguiente modificación. La prueba de células intactas se llevó a cabo a 15°C, las mismas condiciones usadas para la unión a células SAOS-2 intactas (véase arriba). Experimentos de curso de tiempo demostraron que la estimulación máxima del AMPc por la PTHrP y la PTH ocurrió después de una incubación por 60 minutos. Se generaron de esta manera curvas de dosis-respuesta para cada péptido usando incubaciones por 60 minutos a 15°C bajo las condiciones de la prueba de unión. Bajo estas condiciones, la estimulación máxima varió entre 80 y 200 veces arriba de la actividad basal.

Se examinó la actividad de adenilato ciclasa en membranas de riñon humano y membranas de células SaOS-2 como se describió previamente en detalle, para membranas renales de canino (Orloff y otros, J Biol Chem 264: 6097-6103 (1989); Orloff y otros, J Bone Min Res 6: 279-287 (1991)), con las siguientes modificaciones: Experimentos de curso de tiempo llevados a cabo a 30°C, demostraron acumulación máxima de AMPc a 10 minutos para membranas de riñon humano, y a 30 minutos para membranas de células SaOS-2. Por lo tanto, se generaron curvas de respuesta a la dosis para cada péptido a 30°C por 10 minutos en membranas de riñon humano, y a 30°C por 30 minutos en membranas de células SaOS-2. Como con las pruebas de adenilato ciclasa en células intactas, se llevaron a cabo pruebas de adenilato ciclasa en membranas de células óseas y renales bajo las condiciones de la prueba de unión. Los resultados se expresan como porcentaje de la estimulación máxima de AMPc para comparar las respuestas de la dosis de péptidos de diferentes experimentos. La estimulación máxima de AMPc varió de 3 a 8 veces arriba de la basa! para RCM humanass y de 2 a 7 veces para membranas de células SaOS-2. Análisis de datos Se determinaron valores de Cl50 para experimentos de unión competitiva, y valores de CE50 para curvas de respuesta a la dosis de adenilato ciclasa, a partir de la concentración de péptidos, dando 50% de la respuesta máxima. Se evaluaron las diferencias estadísticas por medio de prueba T de Student de dos colas pareada y no pareada. Se llevó a cabo otro análisis de los datos de unión competitiva, con el programa de ajuste de la curva no lineal de mínimos cuadrados computarizado LIGAND (Munson y otros, Anal Biochem 107: 220-239 (1980)).

Resultados Estudios de unión Los datos de unión competitiva usando 125l-hPTHrP-(1-36) como radioligando en cada una de tres preparaciones de tejido, se muestran en las figuras 9A-9F y en el cuadro II (véase más adelante). La unión del radioligando fue desplazada por completo por todos los análogos de la PTH y la PTHrP en cada tejido examinado, salvo para la hPTHrP-(37-74) que, como era de esperarse, no inhibió la unión de 125l-hPTHrP-(1-36). El análisis de Scatchard de los datos (figuras 9A-9F, gráficas inferiores) con el programa de cómputo LIGAND, fue compatible con una clase individual de sitios del receptor de alta afinidad en cada tejido. El número de receptores, calculado a partir de los valores de Bmá?. fue de 0.24 ± 0.06 y 0.36 + 0.08 pmol/mg de proteínas de la membrana para RCM humanas y membranas de células SaOS-2, respectivamente, y de 25,900 ± 1500 receptores por célula para células SaOS-2 intactas. Se comparó primero la competencia de unión a PTHrP radiomarcada con agonistas de PTH y PTHrP, en membranas de células SaOS-2 y RCM (cuadro II y figuras 9A-9F, figuras 9A y 9B). En general, la afinidad relativa de agonistas seleccionados en RCM se asemeja estrechamente a la observada en membranas de células SaOS-2. La rPTH-(1-34), bPTH-(1-34) y cPTHrP-(1-36) exhibieron afinidades relativas similares en comparación con la hPTHrP-(1-36), mientras que (Nle8,8Tyr34)hPTH-(1-34) y cPTH-(1-34)NH2 fueron menos potentes que la hPTHrP-(1-36) en ambos sistemas de prueba. La afinidad relativa de bPTH-(1-84) fue aproximadamente 10 veces menor que la de los análogos amino-terminales. En general, estos estudios no describieron diferencias importantes entre la unión a PTH/PTHrP en el hueso, en comparación con el riñon. Prueba de adenilato ciclasa La afinidad relativa de los análogos agonistas en las pruebas de unión, se reflejó en su potencia de estimulación de adenilato ciclasa, con dos excepciones notables (cuadro II y figuras 10A-10C). Aunque la rPTH-(1-34) fue similar en afinidad de unión a la hPTHrP-(1-36) en membranas de células SaOS-2 y RCM, fue 10 veces más potente para estimular la adenilato ciclasa en ambas preparaciones de membrana. La bPTH-(1-84), que exhibió menor afinidad de unión, retuvo su potencia relativa inferior en comparación con !a hPTHrP-(1-36) en la prueba de adenilato ciclasa de membranas de células SaOS-2, pero fue esencialmente equipotente a la hPTHrP-(1-36) para estimular la producción de AMPc en RCM. Para investigar si existían diferencias entre las preparaciones de células disueltas e intactas, se estudiaron también células SaOS-2 intactas (cuadro lll y figuras 9C y 10C). En general, la afinidad relativa y la potencia de estimulación de AMPc de los agonistas de péptidos que se pusieron a prueba, asemejaron estrechamente los resultados obtenidos en membranas de células SaOS-2 y RCM. Sin embargo, la potencia absoluta para algunos de los análogos amino-terminales, varió entre 2 a 4 veces menos que la observada en membranas de células SaOS-2 o RCM. De modo interesante, la rPTH-(1-34) no demostró acoplamiento mejorado del segundo mensajero respecto a su afinidad de unión en células SaOS-2 (cuadro lll), un patrón que se había observado en membranas de células SaOS-2 y RCM (cuadro II). La afinidad de la hPTHrP-(1-74) fue sustancialmente menor que la de la hPTHrP-(1-36), aunque esta diferencia fue mayor para RCM (25 veces) que para células SaOS-2 (9 veces). De modo interesante, la hPTHrP-(1-141) tuvo una afinidad 5 veces mayor que la hPTHrP-(1-74) en ambas pruebas, pero continuó siendo menos potente que la hPTHrP-(1-36). La afinidad relativa de la bPTH-(1-84) fue similar a la de la hPTHrP-(1-74), pero como se indicó en el párrafo anterior, no exhibió el acoplamiento mejorado a la adenilato ciclasa en membranas o células SaOS-2 como lo tuvo en RCM.

EJEMPLO 3 Caracterización de análogos de PTHrP usando receptores renales caninos El propósito del presente estudio fue comparar las propiedades de los receptores renales para PTH y PTHrP, y determinar si los dos péptidos interactúan con los mismos receptores. Para lograr este propósito, el péptido relacionado con PTH, rTyr36]PTHrP-(1-36)amida (PTHrP-(1-36)) y [Nle8'8,Tyr34]hPTH-(1-34)amida (NNT-hPTH-(1-34)), fueron radioyodados y se usaron en estudios de unión competitiva usando membranas corticales renales caninas (CRMC), para evaluar la unión de varios análogos de PTH y PTHrP. Se examinó también la capacidad de estos análogos de PTH y PTHrP para estimular la adenilato ciclasa. Para una descripción detallada de los métodos en el presente ejemplo véase, por ejemplo, Orloff y otros, J. Biol. Chem., 264: 6097-6103 (1989), incorporada en la presente como referencia.

Materiales y métodos Péptidos Se preparó el péptido relacionado con PTH, (Tyr36) PTHrP-(1-36)amida (PTHrP-(1-36)), por síntesis de fase sólida, como se describió previamente (Stewart y otros, J. Clin. Invest., 81 : 596-600 (1988)). Se prepararon PTHrP-(49-74) y (Cys5,Trpn,Gly13)PTHrP-(5-18) (P1 -péptido), usando métodos de fase sólida similares. Se compraron r.N!e8,18.Tyr3 ]hPTH-(1-34)amida (NNT-hPTH-(1-34)), y PTH bovina (bPTH)(1-34) a Bachem Inc., Torrance, California. La concentración de todos los péptidos usados se da como el valor determinado por análisis de aminoácidos y no como el peso seco del péptido.

Radioyodación La radioyodación de los péptidos PTHrP (1-36) y NHT-hPTH(1- 34) se realizó usando una modificación (Thorell y otros, Biochim. Biophys. Acta, 251 : 363-369 (1971 ) del método de lactoperoxidasa (Marchalonis, Biochem J., 113: 299-305 (1969)). El péptido (10 µg/10 µl) se mezcló con Na125l (1 mCi/10 µl) (Amersham, Arlington Heights, Illinois) y lactoperoxidasa (2µg) (Sigma Chemicals, San Luis Misuri). La reacción se inició con la adición de peróxido de hidrógeno (20 µl de H202 al 0.03%) y se mantuvo con 3 adiciones mas de 20 microlitros de H202 al 0.3%', a intervalos de 2.5 minutos, durante un total de 10 minutos. Después, la mezcla de yodación se aplicó a un cartucho C18 Sep-Pak (Waters Associates, Milford, Massachusetts). El cartucho se lavó en 3 ml de TFA al 0.1%, y después se eluyó con 3 ml de acetonitrilo: H20 75:25% (v:v), que contenía TFA al 0.1%, en tubos de ensayo de vidrio borosilicato que contenían 30 µl de BSA al 2%. El producto eluido se liofilizó y se purificó por HPLC de fase inversa usando una columna de 30 cm U-Bondapak C18 (Waters Associates). La columna se equilibró con H20 que contenía TFA al 0.1 % y se desarrolló con acetonitrilo en TFA al 0.1%. Para •"I MMT-.PTI-l/'l ^? ol /-iradionto omnloarln fi 10 i in pradionta linoal do fifi minutos de 33-43% de acetonitrilo. Para 125l PTHrP-(1-36), la elución se realizó con un gradiente lineal de 50 minutos de 27-34% de acetonitrilo. Las fracciones eluidas se recogieron en tubos de vidrio de borosilicato (12 x 75mm) que contenían 30 µl de BSA al 1%, y se monitoreó su actividad en un espectrómetro gamma. Análisis de radioliqando El radioligando purificado por HPLC se sometió a digestión enzimática completa en 100 µl de un amortiguador que consistía de Tris-HCl (50 mM) pH 7.5, NaCI (75 mM), y azida de sodio (0.005%) (Brown y otros, Biochem, 20: 4538-4546 (1981)). Se le agregó una mezcla de tripsina (1 µg/10 µl), carboxipeptidasa Y (1 µg/10 µl), leucina aminopeptidasa (1 µg/10 µl) y pronasa E (2 µg/10 µl) (todas de Sigma, San Luis, Misuri), y la digestión se efectuó a 37°C durante 24 h. La reacción se detuvo añadiendo 100 µl de TFA al 0.1%. Se inyectó una alícuota de 100 µl del producto digerido, junto con 2 nmol de estándares de tirosina sin yodo y diyodotirosina, sobre una columna C18 u-Bondapak. La columna se eluyó con un gradiente lineal de metanol 15-30% en TFA al 0.1% durante 30 min a una velocidad de flujo de 1.5 ml/min, y las fracciones se recogieron (600 µl). Se monitoreó la absorción UV a 214 nm. Preparación de las membranas Se prepararon membranas corticales renales caninas altamente purificadas (CRCM) usando una modificación del procedimiento de Fitzpatrick > . Jn ?.-»-~? y us (JCI UJO mestizos adultos se homogeneizó en tres volúmenes (ml:g) de sacarosa 0.25 M que contenía 5.0 mM de Tris HCl (pH 7.5), 1.0 mM de EDTA, 6.5 KlU/ml de aprotinina y 50 µg/ml de bacitracina (amortiguador SET) a 4°C, con 10 golpes de 30 segundos de una mano de mortero de teflón impulsada por motor a 2000 rpm. El producto homogeneizado se filtró a través de un grosor de la malla de nylon y se centrifugó a 1475 xg durante 10 minutos. El sobrenadante se desechó y la pella se resuspendió en un volumen de 2.0 M de sacarosa, 5 mM de Tris HCl, 1 mM de EDTA (pH 7.5), 6.5 KlU/ml de aprotinina, y 50 µ/ml de bacitracina. Esto se centrifugó a 13,300xg durante 10 min y la pella se desechó. El sobrenadante se diluyó 8 veces con amortiguador ET (5 mM de Tris HCl, 1 mM de EDTA (pH 7.5), 6.5 KlU/ml de aprotinina, y 50 µg/ml de bacitracina), y se centrifugó a 20,000xg durante 15 minutos. El sobrenadante se desechó y la capa superior blanca de la pella se removió y se resuspendíó en un volumen de amortiguador SET. La centrifugación a 20,000xg se repitió 2 veces más y la pella blanca se suspendió en un volumen de amortiguador SET. Esto es referido como "CRCM cruda". Las membranas se purificaron adicionalmente mediante una modificación del procedimiento descrito por Segre y otros (J. Biol. Chem., 254: 6980-6986 (1979)). La pella blanca anteriormente descrita se centrifugó a 2,200xg durante 15 minutos y el sobrenadante y la porción superior de la pella resultante de doble capa se removió y se resuspendió en amortiguador SET. Esto se centrifugó a 20,000xg durante 15 minutos y el sobrenadante se desechó. Después, !a pella se estratificó en un gradiente discontinuo de sacarosa en Tris 0.01 M, Na2EDTA 0.001 M (pH 7.5), 6.5 KlU/ml de aprotinina, y 50 µg/ml de bacitracina. El gradiente consistía de 39% de sacarosa (2 ml), 37% de sacarosa (4 ml), y 32% de sacarosa (2 ml). Las membranas se centrifugaron a 25,000 rpm (75,000xg) durante 90 min a 4°C. Las bandas mayores estaban presentes en cada interfaz, además de una pella en el fondo del tubo. Estudios preliminares de la fracción más ligera (que no traspasa la sacarosa) y la fracción en la interfaz de 32%-37% indicaron la unión específica más alta y la unión inespecífica más baja. Sin embargo, la fracción más ligera mostró menos degradación del radioligando en estudios de re-unión. Por lo tanto, todos los experimentos subsiguientes se realizaron con esta fracción, excepto en donde se indique específicamente. Las membranas anteriores se diluyeron con tres volúmenes de amortiguador ET, se centrifugaron durante 15 minutos a 7,800xg, se suspendieron en un volumen de SET, se dividieron en alícuotas de 750 µl y se guardaron a -70°C. Las membranas así preparadas retuvieron la actividad completa de unión del receptor durante un periodo de almacenamiento de por lo menos 6 meses. Se usó una sola preparación de membrana para todos los experimentos de unión convencionales. Se realizó una segunda preparación de membrana usando el mismo procedimiento anterior, pero en presencia de leupeptina (5 µg/ml), pepstatina (5 µg/ml), aprotinina (10 KlU/ml), N-etilmaleimida (NEM) (1.0 mM), y fluoruro de fenilmetanosulfamilo (PMSF) (10 µg/ml) en todos los pasos NissensQ.n v otros, Biochem.., 26: 1874-1878 H987^ La protßína se midió mediante el método de Lowry usando BSA como estándar. Estudios de unión de receptor Se realizaron estudios de unión en tubos de ensayo de vidrio borosilicato siliconizado de 12x75mm a 20 °C, en un volumen final de 0.2ml. El amortiguador de unión consistía en 50 mM de Tris HCl (pH 7.5), 4.2 mM de MgCI2, 0.3% de BSA, 26 mM de KCl, aproximadamente 60-80x103 cpm/tubo de radioligando y, en donde era apropiado, de péptidos no marcados.

Basándose en los estudios de estabilidad de radioligando que se describen más abajo, se añadió bacitracina hasta una concentración final de 100 µg/ml para experimentos realizados con 125l NNT-hPTH-(1-34) y 200 µg/ml para 125l PTHrP-(1-36). La unión se inició añadiendo 50 µg de membrana. Al final de los periodos de incubación descritos, alícuotas triplicadas de 50 µl se estratificaron sobre 300 µl de amortiguador de unión enfriado en hielo que contenía 1.0% de BSA, en tubos de polipropileno de 500 µl. Los tubos se centrifugaron a aproximadamente 16,000xg durante 3 minutos a 4 °C en una microcentrífuga. El sobrenadante se aspiró y la punta del tubo que contenía el radioligando asociado con membrana se cortó. Se midió la radioactividad tanto en la pella como en el sobrenadante. La unión total (TB) de radioligando varió de 7.2-14.6% de la cuenta total añadida para 125INNT-hPTH-(1-34) y 25.5-30.0% para 125IPTHrP-(1-36). La unión inespecífica (NSB) fue de 1.8+ 0.3% (±SEM) para 125INNT-hPTH-(1-34) y 9.9 ± 0.8% para 125IPTHrP-(1-36). La recuperación de ambos „.„„„.?.„ „.„. ,„.. i s iunyai ??a µcai a ?? l uua?iui i y IUB luuua us lavau IUC i um \a\ lau ici us i nayui de 95%. Prueba de adenilato ciclasa La actividad estimuladora de adenilato ciclasa se examinó usando una prueba de adenilato ciclasa sensible a PTH en membrana cortical renal canina (CRCM) amplificada en el nucleótido de guanilo, realizada como se describió previamente en detalle (Stewart y otros, Proc. Nati. Acad. Sci.

USA, 80: 1454-1478 (1987)). Brevemente, se añadió PTHrP-(1-36) sintética o bPTH-(1-34) por duplicado a tubos de ensayo que contenían CRCM cruda, y se examinó la conversión de a-[32P]AMPc en [32P]AMPc a 30°C. Los resultados se expresan como el incremento en porcentaje de la actividad de adenilato ciclasa en tubos que contienen los péptidos en comparación con los tubos que contienen únicamente vehículo. También se examinó la actividad estimuladora de adenilato ciclasa de los dos péptidos usando membranas de la interfaz de 32% altamente purificadas. La incubación se efectuó bajo condiciones de unión a 20°C durante 20 minutos en presencia de un inhibidor de proteasa, bacitracina (20.0 µg/ml). Todos los otros aspectos de esta prueba fueron idénticos a la prueba estándar. Análisis de datos Se determinaron las constantes de disociación (Kd) por medio de análisis de Scatchard de los datos obtenidos de experimentos de unión competitiva usando radioligando y concentraciones crecientes de ligando sin marcar. En estudios de competencia usando un competidor sin marcar diferente del radioligando, se derivaron afinidades de unión (Ki) de la Cl50 (concentración de ligando sin marcar que desplaza 50% de la unión específica de radioligando), usando el programa de computadora EBDA (McPherson, "KINETIC, EBDA, LIGAND, LOWRY: A COLLECTION OF RADIOLIGAND BINDING ANALYSIS PROGRAMS", p. 14-97, Elsevier, Amsterdam (1985)). Se determinaron las diferencias estadísticas mediante la prueba t de Student por pares. Se hizo un análisis adicional de curvas de competencia con el programa LIGAND de ajuste de curva no lineal de mínimos cuadrados computarizado, de Munson y Rodbard {Anal. Biochem., 107:220-239 (1980)), modificado para uso en microcomputadora por McPherson (id.). Se compararon los ajustes de computadora de un modelo de un sitio o dos sitios de unión, indicando el modelo estadísticamente preferido. Se determinó la significación usando una prueba F parcial. Resultados Caracterización de la unión de ligando; Asociación La unión específica de 125l NNT-hPTH-(1-34) alcanzó un equilibrio de 20 minutos a 20°C (figura 11). La unión inespecífica se hizo relativamente cuantitativa durante unos 5 minutos a 2.5 ± 0.1% (SEM) del total de radioactividad añadida. Para todos los experimentos de equilibrio subsiguientes, el tiempo de incubación fue de 20 minutos. La unión específica bajo estas condiciones varió de 65-85% del total de radioactividad ligada para 125l NNT-hPTH-(1-34), y 55-75% del total de unión de 125l PTHrP-(1-36). Po í iHino Ho i íAn La inhibición de la unión de 125l-[Nle8'18,Tyr34]hPTH-(1-34)amida se hizo usando concentraciones crecientes de [Nle8,18,Tyr34]hPTH-(1-34)amida sin marcar, bPTH-(1-34), y PTHrP-(1-36), bajo condiciones de equilibrio (figura 12). Los análogos de PTH fueron ligeramente más potentes que PTHrP-(1-36) para inhibir la unión (menos de dos veces), con una K¡ media de 7.5 nM para [Nle8,18, Tyr34]hPTH-(1-34)amida y 6.1 nM para bPTH-(1-34). La constante de afinidad de unión (K¡) para PTHrP-(1-36) fue de 11.5 nM (cuadro II, parte superior). Cuando se usó 125l-PTHrP-(1-36) como radioligando, los tres péptidos sintéticos fueron aproximadamente equipotentes para inhibir la unión (figura 13). Las constantes de disociación para [Nle8,18,Tyr34]hPTH-(1-34)amida, bPTH-(1-34), y PTHrP-(1-36) fueron de 8.5, 10.5 y 14.1 nM, respectivamente (cuadro II, parte superior). Tanto PTHrP-(49-74) como una PTHrP amino terminal bioactiva sintética de 13 aminoácidos (péptido P^, no pudieron inhibir la unión de 125l-PTHrP-(1-36) a las membranas renales caninas (figura 13). En las figuras 12 y 13 se presentan gráficas de Scatchard representativas de los datos de unión en equilibrio. El valor de Bmax para el análogo de PTH fue de 2.73 ± 0.31 pmol/mg de proteína, y para PTHrP-(1-36) fue de 5.08+ 0.56 pmol/mg de proteína. El análisis de los dos grupos de datos con el programa LIGAND mostraron una sola clase de sitios de receptor de alta afinidad; los datos no se pudieron ajustar a un modelo de dos sitios. c^ rn ..».nn , „->AI ? ? CGGL-1 /EGGLJ.-O «~ i -.~,,,J ~-.,J. .: ?~ ?_? i i caumci i, ?aus ai lai jyu us r ? ? ?; r I I II G i iw n iai u? I CU JVJ \a unión de cada radioligando al mismo grado, sugiriendo que los análogos de PTH/PTHrP se unen a un receptor similar o idéntico. El análisis de Scatchard indicó una clase homogénea de sitios de receptor de alta afinidad sin interacciones de unión cooperativas significativas. Los fragmentos de PTHrP biológicamente inactivos no pudieron desplazar el radioligando. Estos datos, que muestran afinidades de unión y valores de Bma? similares para los análogos de PTHrP y PTH en membranas renales caninas, también se han observado en células derivadas de hueso (Juppner y otros, J. Biol. Chem., 263: 8557-8560 (1988)), en membranas renales caninas y en células de osteosarcoma UMR-106 (Nissenson y otros, J. Biol. Chem., 263: 12866-12871 (1988)). Prueba de adenilato ciclasa En contraste con sus afinidades similares en la prueba de unión, la bPTH-(1-34) fue sustancialmente más potente que PTHrP-(1-36) en la prueba de adenilato ciclasa cortical renal canino (cuadro II). Esta relación se observó tanto en las condiciones de prueba estándares (30°C durante 30 min) como bajo las condiciones de prueba de unión (20°C durante 20 min, con bacitracina). En la prueba estándar (30 min, 30°C), la bPTH-(1-34) tuvo más de 6 veces la potencia de PTHrP-(1-36), con valores Km de 0.06 y 0.40 nM, respectivamente. Para excluir la posibilidad de que ocurriera destrucción selectiva de PTHrP durante la prueba en presencia de las membranas renales, la prueba de adenilato ciclasa se realizó bajo condiciones de unión que habían mostrado proteólisis despreciable de radioligandos. Bajo condiciones idénticas a la prueba de unión en equilibrio (20°C, 20 min, con bacitracina), la estimulación de adenilato ciclasa con bPTH-(1-34) fue 15 veces mayor que para PTHrP-(1-36). Los valores de Km bajo las condiciones de prueba de unión fueron de 0.13 y 2.00 nM, respectivamente.

EJEMPLO 4 Caracterización de análogos de PTHrP usando ratas ovariectomizadas osteopénicas Los análogos de PTHrP candidatos se evaluaron para determinar su efecto sobre la masa ósea en ratas ovariectomizadas, generalmente de acuerdo con los procedimientos de Stewart y otros, J. Bone Min Res, 15: 1517-1525 (2000), que se incorpora aquí como referencia. En el presente ejemplo, se seleccionaron 3 moléculas de PTH/PTHrP para comparación directa: PTH(1-34), PTHrP(1-36), y el análogo de PTH, SDZ-PTH-893 (Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gln18, Thr33, Ala34hPTH(1-34)). Se hizo un estudio de 6 meses en el cual ratas adultas (6 meses) ovariectomizadas (OVX) tratadas con vehículo y OVX en falso, se compararon con ratas OVX que recibieron 40 µg/kg por día de PTH(1-34), PTHrP(1-36) o PTH-SDZ-893.

Métndns Péptidos y administración del péptido Se preparó PTH(1-34) recombinante humana (rec hPTH(1-34) o LY333334) como se describió previamente (Hirano y otros, J Bone Min Res 14: 536-545 (1999)); Frolick y otros, J Bone Min Res 14: 163-72 (1999)). Se preparó PTHrP(1-36) usando síntesis en fase sólida como se describió previamente (Everhart-Caye y otros, J Clin Endocrínol Metab 81: 199-208 (1996); Henry y otros, J Clin Endocrinol Metab 82: 900-906 (1997); Plotkin y otros, J Clin Endocrinol Metab 83: 2786-2791 (1998)). Las secuencias de PTHrP(1-36) humana y de rata son idénticas. Se preparó SDZ-PTH-893 (Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gln 8, Thr33, Ala34hPTH(1-34) (Gamse y otros, J Bone Min Res 12 (supl): S317 (1997)) usando síntesis en fase sólida. Se determinó que el espectro de masa y la composición de aminoácidos eran los correctos para cada péptido, y se confirmó una pureza mayor de 97% mediante HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos se administraron subcutáneamente en HCl 0.001 N en solución salina que contenía 2% de suero de rata ovariectomizada (OVX) inactivado con calor a pH 4.2. Animales Todos los estudios se realizaron usando ratas Sprague-Dawley hembras, negativas de virus y anticuerpo, de Harían Sprague-Dawley (Indianápolis, Indiana). Todas las ratas se sometieron a ovarectomía u ovarectomía en falso a los 5 meses de edad. Los estudios empezaron a los 6 meses de edad, un mes después de la ovarectomía o la operación en falso. Las ratas se mantuvieron con una dieta ue contenía Q.5% de calcio ? 0.4% de fósforo. El ciclo de luz fue de 12 h. Protocolo El protocolo empleado se describe en forma esquemática en el cuadro IV. Los animales se asignaron al azar en 17 grupos de 10, como se describe en el cuadro. Excepto los animales del primer grupo, que se sacrificaron a los cinco meses de edad, el resto de los animales se observaron durante un mes, y el tratamiento con los diversos péptidos de prueba o vehículo se empezó a los 6 meses de edad. En los animales tratados con péptido, el péptido se administró diariamente por vía subcutánea a una dosis de 40 µg/kg/día en el vehículo anteriormente descrito. En los animales tratados con vehículo solo se administró el vehículo de forma idéntica. Química Se determinó la química del suero y la orina como se describe en el cuadro XI utilizando métodos de autoanálisis estándares (Boehringer-Mannheim-Hitachi, Indianápolis, Indiana). El contenido de calcio en el riñon se determinó después de extracción de los ríñones completos en ácido tricloroacético al 5%, seguido por medición del calcio con un analizador de calcio (Calcette, Midfield, Massachusetts). Mediciones de la masa ósea La masa ósea se determinó usando el peso de ceniza ósea, así como también mediciones de DEXA del radio, fémur y todo el cuerpo. El contenido mineral óseo de todo el cuerpo se determinó usando un densitómetro Norland DXA Eclipse, y los resultados se expresan en mg. La densidad mineral ósea (BMD) del fémur izquierdo en mg/cm2 , el contenido mineral óseo (BMC) en mg, y el área transversal en cm2 (área X), se determinaron usando un densitómetro calibrado Hologic QDR 4500A, acoplado con software Small Animal Regional High Resolution, realizado por S. Orwoll en la Oregon Health Sciences University, Portland Oregon. Se hicieron mediciones de la longitud máxima del radio izquierdo usando calibradores Fowler/Sylvac Ultra-Cal lll (Newton, Massachusetts). El peso de ceniza del radio se determinó como lo describen Hock y otros, J Bone Min Res 7: 65-72 (1992); Hock y otros, Endocrinology 125: 2022-2027 (1989)), después de limpiar cuidadosamente el radio del tejido no esquelético, deshidratación en éter durante 48 h, seguido por secado al aire durante 24 h, y calcinación en un horno de mufla (Barnstead/Thermodyne, Dubuque, lowa) a 850 °C durante 16 h. Los pesos de ceniza se registraron en mg usando una microbalanza. Histomorfometría del hueso Se hizo una histomorfometría de secciones del hueso incrustadas en metacrilato de metilo de la tibia derecha de cada animal después de sacrificarlo, como se describe en el cuadro IV. Los animales se marcaron usando calceina, 30 mg/kg, administrada subcutáneamente 7 y 3 días antes del sacrificio. Las mediciones histomorfométricas estándares se realizaron como se muestra en los cuadros IV-VI ((Parfitt y otros, J Bone Min Res 2: 595-610 (1987)). Mediciones biompr-ánic-as de resistencia Se hizo una flexión en tres puntos sobre eje medio femoral y una compresión del cuerpo vertebral L5, a 37 °C. El corte del cuello femoral se hizo a temperatura ambiente. Los métodos completos de estas pruebas se han reportado previamente (Sato y otros, Endocrinology 138:4330-4337 (1997); Turner y Burr, Bone 14: 595-608 (1993); Sato y otros, Endocrinology 139: 4642-51 (1998), cada una incorporada aquí como referencia).

Análisis estadístico Se hicieron análisis estadísticos utilizando el software SAS. Se hizo un análisis bidireccional de varianza para determinar si había interacciones significativas entre los tratamientos y el tiempo, y si había diferencias ente los agentes. Se hicieron comparaciones por pares mediante pruebas de T de contraste si había interacciones significativas, y mediante prueba de Dunnett si no se encontraban interacciones significativas. El grado de significación se estableció en p < 0.05.

Resultados Se observaron incrementos estadística y cuantitativamente significativos en el área transversal del fémur, el contenido mineral del hueso femoral y la densidad mineral ósea de los grupos tratados con PTH, PTHrP y SDZ-PTH, con un orden de clasificación de SDZ-PTH > PTH > PTHrP (véase el cuadro VIII). El contenido mineral del hueso femoral (figura 14) aumentó significativa y notablemente en cada uno de los grupos tratados con péptido, en los tres puntos de tiempo determinados. No se observaron cambios en la longitud del fémur debidos al tratamiento (véase el cuadro VIII). No hubo diferencia importante de BMC en todo el cuerpo en los tres grupos tratados con péptidos en comparación con sus controles OVX igualados en tiempo (véase el cuadro VIII para ver los detalles). El peso de la ceniza del radio (véase el cuadro VIII) aumentó significativamente durante el estudio en el grupo de animales tratados con péptido, aumentando mas allá de los valores observados en los grupos de control tanto OVX como operados en falso. Se hizo una histomorfometría ósea para determinar las características estructurales de los cambios esqueléticos, así como también las variaciones del recambio de hueso. Como puede verse en las figuras 15A-15E y 16A-16C el área trabecular (Tb.Ar) declinó notablemente en los animales de control OVX, y permaneció baja durante todo el estudio, en comparación con los animales operados en falso. En contraste, ocurrió un aumento notable del área trabecular en los 3 grupos tratados con péptido, con el mismo orden de clasificación observado en las medidas de la masa ósea: SDZ-PTH > PTH > PTHrP. El aumento de Tb.Ar en los animales tratados fue principalmente el resultado de un incremento en el grosor trabecular, que resultó en una reducción de la separación trabecular (véase el cuadro V). La formación de hueso (MS/BS) declinó con la edad durante los primeros 30 días en todos los animales (figuras 15A-15E; consultar el cuadro VI para más detalles). Sin embargo, en cada punto de tiempo después de empezar el tratamiento, los parámetros de formación de hueso aumentaron significativamente en los tres grupos de animales tratados con péptido, en comparación con los animales OVX y los animales operados en falso igualados en edad (cuado VI, figuras 15A-15E). Los parámetros de resorción de hueso declinaron con la edad en los cinco grupos (figuras 16A-16C; consultar el cuadro Vil para más detalles). En contraste con las diferencias de formación de hueso entre los grupos, no hubo diferencias importantes en los parámetros de resorción entre los animales OVX y los operados en falso en cualquier punto de tiempo. Las mediciones biomecánicas mejoraron en los tres grupos tratados con péptidos (figuras 17A-17C; consultar los cuadros IX y X para ver detalles adicionales). En la espina lumbar, las medidas de resistencia biomecánica aumentaron con cada uno de los péptidos. En el cuello femoral, la carga final también aumento con los 3 péptidos. Los cambios fueron estadísticamente significativos y cuantitativamente grandes. De manera importante, para los 3 péptidos, las medidas biomecánicas de la espina lumbar y el cuello femoral rebasaron las encontradas no solo en los controles OVX, sino también en los controles operados en falso. En el eje medio del fémur, un sitio de hueso cortical, se observaron hallazgos similares (figuras 17A-17C). En general, los tres grupos tratados con péptidos mostraron parámetros biomecánicos aumentados o mejorados en comparación con los grupos de control operados en falso y 0\/Y v estns r.amhins fl iprnn pstadístir.a p.nantitatiwa \/ fnnr-irvnalmonto mnw significativos (véase el cuadro X para ver los detalles completos). El peso corporal aumentó al aumentar la edad en los tres grupos durante todo el estudio, pero no hubo diferencias significativas entre los grupos tratados y de control. Los animales ganaron peso aproximadamente a la misma velocidad (véase el cuadro XI para ver los detalles). La media del calcio en el suero permaneció normal en los animales operados en falso y OVX durante todo el estudio (figuras 18A-18B; véase el cuadro XI para ver los detalles completos). Esto también fue el caso para los animales tratados con PTH y PTHrP. En contraste con estos dos grupos de tratamiento, ocurrió una franca hipercalcemia en los animales tratados con SDZ-PTH, con concentraciones de calcio medias de 11.3, 11.6 y 11.7 mg/dl, en los meses 1 , 3 y 6, respectivamente. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas. También fueron biológicamente significativas, ya que cuatro de los treinta animales tratados con SDZ-PTH-893 (13%) murieron durante el estudio, a los 75, 83, 130 y 133 días de tratamiento. Aunque la media del calcio sérico fue normal en el grupo de PTH, un animal tratado con PTH (3%) murió con hipercalcemia el día 171. Ningún animal tratado con PTHrP murió durante el estudio.

Discusión Los análogos de PTHrP candidatos u otros agentes anabólicos esqueléticos se pueden probar usando los métodos anteriormente descritos. Se espera que los análogos de PTHrP, u otros agentes anabólicos esqueléticos útiles en los métodos de la presente invención, aumenten significativamente el total de calcio en el hueso, el calcio trabecular, el calcio de hueso cortical, el grosor trabecular y el volumen de hueso, con respecto a los controles OVX no tratados.

EJEMPLO 5 Sistema y métodos para diseñar peptidomiméticos y moléculas pequeñas que tienen actividad biológica similar a PTHrP y agentes anabólicos esqueléticos Como se describió arriba, PTHrP, PTH, y péptidos TIP, así como también sus receptores y rutas metabólicas resultantes, se pueden usar para desarrollar peptidomiméticos y fármacos de molécula pequeña, que sean útiles como agonistas y antagonistas de estos agentes anabólicos esqueléticos. Como se usa aquí, un "peptidomimético" se refiere a los derivados de los fragmentos o péptidos de longitud completa de los agentes anabólicos esqueléticos PTHrP, PTH, o TIP, anteriormente descritos, que muestran una actividad biológica que incluye la modulación de la masa ósea, así como también mezclas, composiciones farmacéuticas y composiciones que comprenden los mismos. Un "fármaco de molécula pequeña" se refiere a un comnijesto no natura! de bain neso molecular, F-- tiene una actividad similar. En cualquier caso, la actividad biológica de un peptidomimético o un fármaco de molécula pequeña, puede ser agonista o antagonista a la de PTHrP, PTH, o TIP, o puede incluir un espectro de actividad, esto es, puede ser antagonista para la actividad de PTH y agonista para la actividad de PTHrP. Como con la PTH la actividad biológica de la PTHrP está asociada con la porción N-terminal, los residuos (1-30) suministrando mínimamente la actividad biológica. También se han probado las formas truncadas del péptido infundibular tubular de 39 aminoácidos (TIP) para determinar su actividad biológica. Los receptores de estos agentes también son un blanco para el diseño de fármacos basado en la estructura. Como se describió arriba, el receptor de PTH/PTHrP de 500 aminoácidos (también conocido como el receptor PTH1) pertenece a una subfamilia de GCPR que influye los de glucagón, secretina y péptido intestinal vasoactivo. Las regiones extracelulares están implicadas en la unión de hormona, y los dominios intracelulares, después de la activación de la hormona, se unen a las subunidades de la proteína G para transducir la señalización de hormona en respuestas celulares mediante la estimulación de segundos mensajeros.

Similarmente, estos segundos mensajeros proveen un blanco para fármacos. Como se describió arriba, un segundo receptor de PTH (el receptor PTH2) se expresa en el cerebro, páncreas y otros tejidos. Su secuencia de aminoácidos e! natróp de su unión la respuesta estimuladora para PTH y PTHrP, difieren del receptor PTH1. El receptor de PTH/PTHrP responde equivalentemente a PTH y PTHrP, mientras que el receptor PTH2 responde únicamente a PTH. El ligando endógeno de este receptor parece ser el péptido infundibular tubular 39 o TIP-39. En un aspecto de la invención, estas composiciones modulan, esto es, regulan positivamente o regulan negativamente, la actividad del receptor PTH1 o PTH2. En otro aspecto, se provee un sistema que comprende información estructural con respecto a las coordenadas atómicas obtenidas por difracción de rayos X de un péptido, fragmento, peptidomimético, o fármaco de molécula pequeña, de PTHrP, PTH o TIP. En otra modalidad se provee un anticuerpo para un péptido, fragmento, peptidomimético, o fármaco de molécula pequeña, de PTHrP, PTH o TIP. En otra modalidad se provee una preparación cristalina pura de un péptido, fragmento, peptidomimético, o fármaco de molécula pequeña, de PTHrP, PTH o TIP. Las estructuras de los receptores PTH1 o PTH2, o de un péptido, fragmento, peptidomimético, o fármaco de molécula pequeña, de PTHrP, PTH o TIP, se obtienen mediante difracción de rayos X de los polipéptidos cristalizados, espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional de los mismos, o mediante métodos similares para obtener estructuras de alta resolución de materiales biológicos. Las estructuras de alta resolución se refieren a estructuras resueltas a mas de 2.8 ángstrom, de nreferpnr.ia a mas de 9 ?npatmm \/ SP usan nara manoar IQS cH?ns aH-h/nc de estos receptores y sus ligandos. Las estructuras se determinan e interpretan usando los sistemas de computadora que se describen en ia técnica, por ejemplo un sistema que tiene por lo menos un banco de memoria, un visualizador, medios de entrada de datos, un procesador y una serie de instrucciones que comprenden un algoritmo para leer, interpretar y obtener los datos estructurales, todo lo cual es muy conocido en la técnica; por ejemplo, véase la patente de EE. UU. No. 6,273,598 de Keck y otros, titulada "Computer system and methods for producing morphogen of human OP-1", que se incorpora aquí como referencia. De acuerdo con la presente invención, dichos sistemas pueden ser autónomos o de red, esto es, por medio de una red conmutada por paquete. Se emplean programas de diseño asistido por computadora (CAD) para diseñar peptidomiméticos y agentes de molécula pequeña que tienen las actividades apropiadas de antagonista o agonista del receptor, en función de los mapas estructurales obtenidos. Los agentes candidatos se analizan para determinar su actividad biológica similar a PTHrP, PTH y TIP, usando las pruebas aquí descritas, así como también pruebas similares conocidas.

CUADRO I Demografía de la línea basal PBO PTHRP P (n=8) (n=8) Edad (años) 56.5+1.3 61.5±2.4 ns Altura (cm) 162.5±2.3 161.6±2.3 ns Peso (kg) 62.1±2.7 62.3±3.0 ns BMI 23.6±1.1 24.0+1.5 ns Plasma 25 D (nmol/L) 61.9+2.1 63.1+2.1 ns Ingestión de calcio 940±186 1438+296 ns (mg/día) Años de menopausia 13.5±2.9 12.3±2.3 ns Años con estrógenos 8.4±1 J 8.0±1.5 ns # sobre Tiroxina 1/8 0/8 Fumador 2/8 0/8 BMD L/S (g/cm2) 0.748±.03 0J63±.01 ns BMD L/S (puntuación -2.71±.26 -2.58±.12 ns T) BMD cadera total 0.710±.02 0J22±.02 ns (g/cm2) BMD cadera total -1.9+.15 -1.77+021 ns (puntuación T) BMD FN (g/cm2) 0.572±.02 0.654±.03 .05 BMD FN (puntuación -2.5+.21 -1.95±.27 ns T) CUADRO II Actividad in vitro de |Tvr36l PTHrP-1-36)amida en comparación con bPTH- (1-34) Kd/k¡ Km Péptido ^l-PTH 1Z?l-PTHrP Prueba Condiciones estándar de unión nM bPTH-(1- 6.1+1.5a 10.5+4.4b 0.06+0.01c 0.13+0.01a 34) PTHrP-(1- 11.5+2.5a 14.0±5.4b 0.40+0.07° 2.00+0.17a 36) a p= 0.03 b No significativo c p<0.002 Los estudios de unión se realizaron a 20 °C usando [Nle8*18Tyr34]hPTH-(1-34)amida (125I-PTH) o [Tyr36]PTHrP-(1-36)amida (125l-PTHrP) como radioligando. Los valores de K se determinaron por análisis de Scatchard y los valores de K¡ se derivaron de los valores de Cl50. La estimulación de adenilato ciclasa se evaluó bajo condiciones de prueba estándares empleando membranas renales caninas parcialmente purificadas, e incubaciones de 30 min a 30°C. También se evaluó la estimulación de adenilato ciclasa bajo condiciones de prueba de unión, usando membranas renales caninas altamente purificadas en presencia de bacitracina (200 µg/ml) e incubaciones de 20 min a 20°C.

CUADRO II (Continuación) Actividad in vitro de agonistas de PTH y PTHrP en RCM (membranas de riñon) humanas en comparación con membranas SaOS-2 Unión (Clso) (nM) Adenilato ciclasa (CE50) (nM) Péptido Membranas Membranas Membranas Membranas de riñon SaOS de riñon SaOS (Tyr°°)hPTHrP-(1-36)NH2 0.42+0.07 0.64±0.02 0.50±0.10 0.5110.07 (Nle°'"Ty hPTH-(1-34) 3.6+0Ja 2.0+0.33 1.1±0.1b 1.9±0.4° bPTH-(1-34) 0.39±0.06 1.5±0.4 0.26+0.14 0.50±0.06 rPTH-(1-34) 0.35±0.15 0.56±0.06 0.05+0.01 b 0.09±0.03b cPTH-(1-34)NH2 21.5±8.5a 20.0+5.0b 5.4±0.01b 16.3±4.8d (Tyr36)cPTHrP-(1-36)NH2 0.47±0.22 1 .1 ±0-3 0.49±0.06 0.8710.34 bPTH-(1-84) 5.1±2.3b 8.0+2.0b 0.59±0.21 2.4í0.2d Los valores son la media + SEM de dos o más experimentos para cada péptido. •JO Análisis estadístico contra: (Tyr36)hPTHrP-(1-36)NH2: a P < 0.01. b P < 0.05. C P < 0.001. d P < 0.0001.

CUADRO lll Actividad in vitro de agonistas de PTH v PTHrP en RCM (membranas de riñon) humanas en comparación con células intactas de SaOS-2 Unión (Cl so) (nM) Adeniiato ciclasa (CE50) (nM) Péptido Membranas de Células SaOS Membranas de Células SaOS riñon riñon (TyrO0)hPTHrP-(1-36)NH2 0.42+0.07 1.510.1 0.5010.10 1.010.1 hPTH-(1-34) 1.9±0.4a 3.1+0.3 0J010.40 1.610.0a (Nle8'18, Tyr34)hPTH-(1-34) 3.6±0Ja 2.8+0.1 b 1.110.1° 2.3+0.4b bPTH-(1-34) 0.39+0.06 1.310.1 0.2610.14 1.210.1 rPTH-(1-34) 0.35±0.15 0.9±0.2° 0.05+0.01° 0.9+0.1 b cPTH-(1-34)NH2 21.5±8.5a 0d 5.410.1 e 3.910.1 b |Tyr36]cPTHrP-(1-36)NH2 0.4710.22 od 0.4910.06 0.810.1 hPTHrP-(1-74) 9.513.5a 12.911.4b 7.810.8a 9.2+1.0b hPTHrP-(1-141) 2.010.1 e 2.410.1 a 1.310.4 1.9+0.4e bPTH-(1-84) 5.112.3° 17.5l2.5b 0.5910.21 7.711.4b Los valores son la media ± SEM de dos o más experimentos para cada péptido. Análisis estadístico contra: [Tyr36]hPTHrP-(1-36)NH2: a P < 0.01. b P < 0.0001. c P < 0.05. d P 0 Estos péptidos se probaron en membranas SaOS-2, no en células SaOS-2 (véase el cuadro ll) e P < 0.001.

CUADRO IV Protocolo p<0.05. Los datos de línea basal no se incluyeron en análisis estadísticos y se muestran únicamente con fines descriptivos. a contra OVX igualadas en tiempo b contra PTH(1-34) igualadas en tiempo c contra operadas en falso igualadas en tiempo CUADRO V Histomorfometría estructural de la tibia proximal derecha en ratas maduras ovariectomizadas (OVX) a las gue se dio una vez al día rec hPTH-(1-34), PTHrP-(1-36), o SDZ-PTH-893, durante 30. 90 o 180 días Área trabecular Número Espacio Grosor Tb.A. % trabecular Tb.N. trabecular trabecular Tb.Th. #/min Tb.Sp. Fm Fm Línea basal OVX 1712 3.1+0.2 281124 5414 Línea basal OVX en falso 2812 4J10.2 156110 6012 30 días Falso 2011a 3.910.2a 206113a 5112 OVX 611 1.310.3 847+98 4612 PTH (1-34) 1912a 2.310.1a'° 367l28a'° 8115a'0 PTHrP(1-36) 13i1a'b'° 2.110.1a'° 436136a'0 62l3a,b,° SDZ PTH 893 2313a 2.510.2a'° 348142a'0 93+4a'° 90 días co Falso 2011a 3.710.3a 230127a 5213 cn OVX 311 0.610.1 21781363 5116 PTH (1-34) 38l3a,c 2.4l0.2a'c 274134a 15816a'0 PTHrP(1-36) 19i3a' 2.1i0.2a'c 398i35a,'c 8915a'b'° SDZ PTH 893 50l5a'° 2.410.1a'° 210123a 205120a'0 18 días Falso 1513a 2.710.3a 374178a 5314 OVX 917 0J10.2 19231492 77132 PTH (1-34) 38i3a'° 2.310.1a 279129a 163i8a'° PTHrP(1-36) 23±2a,b,o 2.310.2a 361143a 97+4a'b'° SDZ PTH 893 5714a'0 3.310.5a,b 139+26a'b'° 183120a'0 Los datos se expresan como media +SEM para 7 a 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05. Los datos de línea basal no se incluyeron en análisis estadísticos y se muestran únicamente con fines descriptivos. a contra OVX igualadas en tiempo b contra PTH(1-34) igualadas en tiempo ° contra operadas en falso igualadas en tiempo CUADRO VI Mediciones de formación de hueso de la tibia proximal derecha en ratas maduras ovariectomizadas (OVX), a las gue se dio una vez al día rec hPTH-(1-34) (LY333334), PTHrP-(1-36), o SDZ-PTH-893, durante 30, 90 o 180 días Superficie de Velocidad de Velocidad de mineralización MS/BS aposición MAR formación de hueso (%) (µm/d) BFR/BS (µm/d) Línea basal OVX 3711 4J10.8 1 J7127 Línea basal OVX en falso 3212 4.410.4 1.42120 30 días Falso 1812a 2.810.1 a 0.5516 OVX 2612 2.410.1 0.6916 rhPTH (1-34) 4912a'0 2.4+0.1° 1 .18l7a'° PTHrP(1-36) 39l1a'b'° 2.6+0.1 1.00l4a'b'° SDZ PTH 893 5613a'0 2.61.1 1.42l8a'b'° 90 días Cú Falso 1411a 2.410.2 0.3614 03 OVX 21+2 2.410.1 0.5116 rhPTH (1-34) 4111a'0 3.010.1a'0 1.2314a'0 PTHrP(1-36) 37l1 a'b'° 3.6+0Ja 1.36+28a, ,c SDZ PTH 893 37l1a'b'° 3.610.7a 1 .36l28a,b'° 4412a'0 3.310.2a'0 1.45110a'0 18 días Falso 1412 2.610.3 0.3817 OVX 1912 2.910.2 0.5418 rhPTH (1-34) 40i2a'° 3.810.7° 1.53128a'0 PTHrP(1-36) 29+1 a,b'° 3.610.5° 1.05l13a'b'° SDZ PTH 893 4513a'0 3.210.2° 1 .43+9a'° Los datos se expresan como media +SI?M para 7 a 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05. Los datos de línea basal no se incluyeron en análisis estadísticos y se muestran únicamente con fines descriptivos. a contra OVX igualadas en tiempo contra PTH(1-34) igualadas en tiempo 0 contra operadas en falso igualadas en tiempo CUADRO Vil Mediciones de resorción de hueso de la tibia proximal derecha en ratas maduras ovariectomizadas (OVX), a las gue se dio una vez al día rec hPTH-(1-34) (LY333334), PTHrP-(1-36), o SDZ-PTH-893, durante 30, 90 o 180 días Superficie de resorción Superficie de osteoclasto E.PM OcPM (%) (%) Línea basal OVX 20.3+1-4 9.010.8 Línea basal OVX en falso . 18.311.8 6.1+1.0 30 días Falso 9.912.1 2.110.6 OVX 11.411J 3J10.9 rhPTH(1-34) 8.611.2 2.310.6 PTHrP (1-36) 9.411.7 2.410.6 SDZ PTH 893 7.111.3a 1.610.6a 90 días Falso 7.011.0 1.610.5 OVX 9.612.0 4.511.1 RhPTH(1-34) 10.611.3° 2.610.5 PTHrP (1-36) 10.311.5 3.110.6 SDZ PTH 893 10.011.3 2.010.7 180 días Falso 2.410.4 0.810.2 OVX 2.311.1 1.210.6 rhPTH(1-34) fi.4+1.5 2.0+0,4 PTHrP (1-36) 6.411.1a'° 2.010.6 SDZ PTH 893 3.011.0 0.4l0.3b Los datos se expresan como media +SEM para 7 a 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05. Los datos de línea basal no se incluyeron en análisis estadísticos y se muestran únicamente con fines descriptivos. a contra OVX igualadas en tiempo b contra hPTH(1-34) igualadas en tiempo c contra operadas en falso igualadas en tiempo CUADRO VIH Masa ósea del cuerpo completo, radio o fémur en ratas maduras ovariectomizadas a las que se dio una vez al día rec hPTH-d-34) (LY333334), PTHrP-(1-36), o SDZ-PTH-893, durante 30, 90 o 180 días BMC de todo el Peso de ceniza Fémur izquierdo cuerpo del radio (mg) Longitud Area X BMC BMD Línea basal OVX' 6611a 5511 34.610.2 1.6210.03 0.28910.008 0.17710.002 Línea basal en falso2 5311 52+1 33.6+0.2 1.5510.03 0.29410.007 0.19010.004 30 días OVX 6612a 58+2 34.9+0.3 1.6010.05 0.28910.014 0.18010.004 Falso 5811 54+1 34.3+0.2a'° 1.57+0.03 0.30010.009 0.19010.004 rhPTH (1-34) 6413° 60+1° 34.910.3 1.6810.04° 0.34010.011a'0 0.20010.004a PTHrP(1-36) 67+2° 5811 34J10.2 1.6410.03 0.31310.011b 0.191+0.004 SDZ PTH 893 6712° 6211a'0 34.910.3 1 J3i0.04a'° 0.36110.009a'0 0.210l0.002a'b'° 90 días co OVX 6814a 5210 35.510.4 1.6510.02 0.29310.006 0.17810.003 oo Falso 5712 5414 34.110.3a 1.5710.05 0.30910.017 0.19810.006a rhPTH (1-34) 6913° 6611a'0 35.710.2° 1.7310.03° 0.401 +0.010a'° 0.232l0.005a'° PTHrP(1-36) 6914° 60+2a'° 35.5+0.2° 1.7110.04° 0.348í0.007a,b'° 0.203i0.003a'b SDZ PTH 893 7012° 6911a'0 35.710.2° 1.82i0.02a,b'° 0.442+0.006a'° 0.242l0.003a'° 180 días OVX 7214a 5911 35.310.3 1.5710.04 0.28010.009 0.17710.004 Falso 59+3 54+2 34.310.3a 1.5310.04 0.29110.009 0.18910.004a rhPTH (1-34) 7113° 7212a'0 35.610.3° 1.84l0.04a'° 0.45110.012a'° 0.23410.004a'° PTHrP(1-36) 7812° 62i1a'b'° 35.110.3° 1.64i0.03b'° 0.35710.007a'b'° 0.218i0.003a' '° SDZ PTH 893 68+3° 78+3a'° 36.410.3° 1.9610.05a'0 0.53010.018a'° 0.273+0.005a'° Abreviaciones: X = Área; BMC = Concentración mineral ósea; BMD = Densidad mineral ósea; OVX = Ratas ovariectomizadas; Falso = Ratas operadas en falso. Los datos se expresan como la media 1 error estándar de la media (SEM) para 10 ratas por grupo. En el cuadro 3 se muestran diferencias estadísticamente significativas. contra OVX igualadas en tiempo b contra PTH(1-34) igualadas en tiempo contra operadas en falso igualadas en tiempo OVX efectuada el día 1 ; BMC realizada el día 30 CUADRO IX Ganancia de peso corporal v química sérica de ratas maduras ovariectomizadas a las que se les dio una vez al día rec hPTH-(1-34), PTHrP (1-36). o SDZ PTH 893. durante 30, 90 o 180 días Ganancia de Calcio en el Fosfato en Magnesio Creatinina en Nitrógeno de Riñon (mg Fosfatasa peso suero el suero en el suero el suero urea en el Ca/g peso alcalina corporal (g) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) suero húmedo) (Ul/L) (mg/dL) Línea basal — 10J10.1 7J10.3 2.9110.07 0J410.01 16.510.6 0.20+0.01 78+5 Falso — 10.610.1 7.3+0.3 2J510.08 0J610.01 18.210.6 0.2510.04 100+4 Línea basal OVX 30 días Falso 1.0+1 .4 10.810.1a 7.9+0.5 3.0610.10 0J910.01 17.9+OJ 0.2210.01 7416a OVX 1 J13.0 10.4+0.1 7.310.2 2.9410.08 0J8+0.02 17J10.9 0.2710.03 8813 PTH (1-34) 2.211.3 10.710.1a 6.510.2ao 2.8910.06 0.8010.01 20.110.8a0 0.25+0.02 8313 PTHrP(1 -36) 2.211.3 10.510.1 6.810.2 2.88+0.07 0J810.01 17.710.4 0.2910.06 9015° SDZ PTH 893 -1.311 .8 11.3+0.3a o 5.5l0.2a c 2.9010.07 0.79+0.01 19.110.6 0.2610.01a 8314 o 90 días Falso 13.1+3.8 10.210.1a 6.510.2a 2J410.05 0J9+0.02 20.110.9 0.2110.03 7114a OVX 22.215.3 10.110.1 5.710.2 2.5710.06 0.8010.01 19.510.8 0.19+0.02 103+11 PTH (1 -34) 30.614.8 10Ji0.1at' 5.410.2° 2J010.03 0J810.02 22.111.2 0.36+0.06ac 10216° PTHrP(1-36) 14.313.9 10.3+0.1 b 5.4l0.3a ° 2.6010.08 0.7810.02 21.311.3 0.21+0.03b 10314° SDZ PTH 893 26.513J 11.6l0.1ab° 4Ji0.1 a° 2JU0.08 0J810.01 22J10Ja 0.35+0.06a° 10217° 180 días Falso 34.4 10.4 10.610.1a 7.110.4a 3.1110.04a 0.8110.02 18.811.2 0.2210.01 7515 OVX 52.313.0 10.210.2 6.210.3 2.7510.08 0.8110.03 18.210.9 0.2410.02 10116 PTH (1 -34) 41.4116.2 10.910.2a 6.0+0.3° 2.8010.07° 0.7510.02 19.810.8 0.2410.02a 10815° PTHrP(1-36) 45.815.5 10.6í0.1ß 6.0+0.2° 2.6710.05° 0J2+0.01ac 1 J4l0.8b 0.2210.01 b 10816° SDZ PTH 893 33J+8.5 1 1 J+0.6ac 5.5l0.3a° 2.9010.08° 0.87i0.05b 20.011.0 1.28l0.60ab° 10018° Abreviaciones: OVX: Ratas ovariectomizadas; Falso: Ratas operadas en falso. Los datos se expresan como la media + error estándar de la media (SEM) para 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05. a contra OVX igualadas en tiempo b contra hPTH(1-34) igualadas en tiempo 0 contra operadas en falso igualadas en tiempo CUADRO X Mediciones biomecánicas de resistencia del cuello del fémur y diáfisis media de ratas maduras OVX tratadas durante 6 meses con hPTH1-34 ÍPTH). PTHrP-(1-36) (PTHrP). o el análogo de PTH, SDZ PTH893 0 contra operadas en falso igualadas en tiempo CUADRO XI Ganancia de peso corporal v química sérica de ratas maduras ovariectomizadas a las que se les dio una vez al día rec hPTH-(1-34), PTHrP (1-36). o SDZ PTH 893, durante 30, 90 o 180 días Ganancia Calcio en el Fosfato en Magnesio Creatinina en Nitrógeno de Riñon (mg Fosfatasa de peso suero (mg/dL) el suero en el suero el suero urea en el Ca/g peso alcalina corporal (g) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) suero húmedo) (Ul/L) (mg/dL) Línea basal — 10J10.1 7J10.3 2.91+0.07 0.7410.01 16.5+0.6 0.20+0.01 7815 Falso — 10.610.1 7.310.3 2J510.08 0J610.01 18.210.6 0.2510.04 10014 Línea basal OVX 30 días Falso 1.0+1.4 10.810.1a 7.910.5 3.0610.10 0.7910.01 17.910.7 0.2210.01 7416a OVX 1 J+3.0 10.410.1 7.310.2 2.9410.08 0.7810.02 17.710.9 0.2710.03 8813 PTH (1-34) 2.2+1.3 10.710.1" 6.5l0.2a° 2.8910.06 0.8010.01 20.1i0.8a° 0.2510.02 8313 PTHrP(1-36) 2.2+1.3 10.510.1 6.810.2 2.88+0.07 0J810.01 17J10.4 0.2910.06 9015° SDZ PTH 893 -1.311.8 11.3l0.3a ° 5.510.2a ° 2.9010.07 0J9+0.01 19.1+0.6 0.2610.01a 8314 90 días Falso 13.113.8 10.210.1" 6.510.2a 2.7410.05 0J910.02 20.1+0.9 0.2110.03 7114a OVX 22.215.3 10.110.1 5J+0.2 2.5710.06 0.8010.01 19.510.8 0.1910.02 103111 PTH (1-34) 30.614.8 10Jl0.1a° 5.410.2° 2.7010.03 0J8+0.02 22.1+1.2 0.3610.06a0 10216° PTHrP(1 -36) 14.313.9 10.310.1 5.4i0.3a ° 2.6010.08 0J8+0.02 21.311.3 0.21i0.03b 10314° SDZ PTH 893 26.5+3.7 11.610.1ab° 4.710.1 a0 2.7110.08 0J810.01 22.710 ,7a 0.35l0.06a° 10217° 180 días Falso 34.4 10.4 10.610.1a 7.110.4a 3.1110.04a 0.8110.02 18.8+1.2 0.2210.01 7515 OVX 52.313.0 10.2+0.2 6.2+0.3 2.7510.08 0.8110.03 18.210.9 0.2410.02 10116 PTH (1-34) 41.4116.2 10.910.2a 6.010.3° 2.8010.07° 0.7510.02 19.8+0.8 0.2410.02a 10815° PTHrP(1-36) 45.815.5 10.610.1" 6.010.2° 2.6710.05° 0.7210.01 a° 1 J4i0.8b 0.2210.01 b 10816° SDZ PTH 893 33J18.5 11.7+0.6a° 5.5+0.3ac 2.90+0.08° 0.87l0.05b 20.0+1.0 1.2810.60abc 100+8° Abreviaciones: OVX: Ratas ovariectomizadas; Falso: Ratas operadas en falso. Los datos se expresan como la media + error estándar de la media (SEM) para 10 ratas por grupo. Diferencias estadísticamente significativas, p<0.05. a contra OVX igualadas en tiempo b contra hPTH(1-34) igualadas en tiempo 0 contra operadas en falso igualadas en tiempo Equivalentes De la descripción detallada anterior de las modalidades específicas de la invención, será evidente que se ha descrito un método único de administrar PTHrP, o un análogo de la misma, que da como resultado un tratamiento seguro y eficaz de la osteoporosis, que minimiza el riesgo o elimina los efectos secundarios negativos, tales como la hipercalcemia o el riesgo de desarrollar sarcomas osteogénicos. Aunque se han descrito aquí detalladamente modalidades particulares, esto se ha hecho únicamente a manera de ejemplo con fines de ilustración, y no se tiene la intención de limitarse con respecto al alcance de las reivindicaciones anexas que se dan mas adelante. En particular, el inventor contempla las sustituciones, alteraciones y modificaciones que se pueden hacer a la invención sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, definida por medio de las reivindicaciones. Por ejemplo, la elección del análogo de PTHrP, o la vía de administración; ST considera que rutinario para una persona con conocimientos medios en las modalidades aquí descritas.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- El uso de PTHrP-(1-36) a una dosis de por lo menos 3,000 µg/día hasta 10,000 µg/día, en la fabricación de un medicamento útil para aumentar la masa ósea en un paciente humano, en donde el medicamento se adapta para ser administrable intermitentemente durante un periodo de por lo menos 3 meses, en donde la densidad de la masa ósea de dicho paciente aumenta a una tasa de por lo menos 1 % por mes. 2.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la densidad de la masa ósea de dicho paciente aumenta a una tasa de por lo menos 1.5% por mes. 3.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento se adapta para ser administrable a dicho paciente a una dosis de ..„ur„ µy/uid. 4.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento se adapta para ser administrable subcutáneamente. 5.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho paciente humano sufre de osteoporosis primaria o secundaria, o está en riesgo de padecerla. 6.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho paciente humano sufre de un trastorno metabólico de hueso seleccionado del grupo que consiste en: osteomalacia, osteodistrofia renal y otros tipos de trastornos esqueléticos asociados con pérdida de hueso, o está en riesgo de padecerlo. 7.- El uso de PTHrP-(1-36) a una dosis de por lo menos 3,000 µg/día hasta 10,000 µg/día, en la fabricación de un medicamento útil para aumentar la masa ósea en un paciente humano, en donde el medicamento se adapta para ser administrable intermitentemente durante un periodo de tres meses, en donde la densidad de la masa ósea de dicho paciente aumenta por lo menos 3%. 8.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la densidad de la masa ósea de dicho paciente aumenta a una tasa de por lo menos 4.5%. 9.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho medicamento que comprende PTHrP, o un análogo de la misma, se adapta para ser administrable subcutáneamente. paciente humano sufre de osteoporosis primaria o secundaria, o está en riesgo de padecerla. 11.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho paciente humano sufre de un trastorno metabólico de hueso seleccionado del grupo que consiste en: osteomalacia, osteodistrofia renal y otros tipos de trastornos esqueléticos asociados con pérdida de hueso, o está en riesgo de padecerlo. 12.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 o la reivindicación 7, en donde dicho paciente humano sufre de una fractura de hueso. 13.- El uso que se reclama en la reivindicación 12, en donde la fractura de hueso es originada por un procedimiento quirúrgico en el paciente. 14.- El uso de PTHrP-(1-36) a una dosis de por lo menos 3,000 µg/día hasta 50,000 µg/día, en la fabricación de un medicamento útil para aumentar la masa ósea en un paciente humano, en donde el medicamento se adapta para ser administrable intermitentemente durante un periodo de dos meses, en donde la densidad de la masa ósea de dicho paciente aumenta por lo menos 2.5%. 15.- El uso de PTHrP-(1-36) a una dosis de por lo menos 3,000 µg/día hasta 50,000 µg/día, en la fabricación de un medicamento útil para aumentar la masa ósea en un paciente humano, en donde el medicamento se adapta para ser administrable intermitentemente durante un periodo de un mes, en donde la densidad de la masa ósea de dicho paciente aumenta por lo menos CO/ I . ^ /O.