CN114796460A

CN114796460A - C型利尿钠肽变体在治疗骨骼发育不良中的用途

Info

Publication number: CN114796460A
Application number: CN202210522331.6A
Authority: CN
Inventors: S·布伦斯; S·邦廷; T·朱; A·O·奥克哈马菲; C·P·普赖斯; D·J·文特; C·亚普
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Current assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2022-07-29
Also published as: CL2018000215A1; US10646550B2; AU2016298425A1; CA2994280A1; EP3328416B1; RU2728567C2; US20230293637A1; TWI820795B; RU2018106890A; US20180207239A1; WO2017020034A1; JP6882256B2; FI3328416T3; RU2018106890A3; CN108472336A; JP2023144124A; IL257125A; US20170028023A1; HK1255864A1; IL278488B

Abstract

本申请提供C型利尿钠肽变体在治疗骨骼发育不良中的用途。具体地，本公开內容提供C型利尿钠肽(CNP)变体的用途，以及包含CNP变体肽的新颖医药组合物及制剂，用于治疗骨骼发育不良、骨骼发育不良的一种或多种症状如长骨生长或生长速度、和其它具有与骨骼发育不良及/或CNP相关的症状或组成的病变。

Description

C型利尿钠肽变体在治疗骨骼发育不良中的用途

本申请是申请号为201680058019.9、申请日为2016年8月1日、发明名称为“C型利尿钠肽变体在治疗骨骼发育不良中的用途”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

通常，本公开內容涉及C型利尿钠肽(CNP)变体在治疗骨骼发育不良中的用途及CNP变体肽制剂。

背景技术

利尿钠肽家族由三种结构上相关的肽组成：心利尿钠肽(ANP)(ANP前体蛋白NPPA的基因银行登记号为NP_006163，)、脑利尿钠肽(BNP)(BNP前体蛋白NPPB的基因银行登记号为NP_002512，)、及C型利尿钠肽(CNP)(Biochem.Biophys.Res.Commun.,168:863-870(1990)(CNP前体蛋白NPPC的基因银行登记号为NP_077720)(J.Hypertens.,10:907-912(1992))。这些小的单链肽(ANP、BNP、CNP)具有17个氨基酸的环结构(Levin et al.,N.Engl.J.Med.,339:863-870(1998))，且在多个生物学过程中扮演重要角色。ANP和BNP结合并活化利尿钠肽受体A(NPR-A)，也称鸟苷酸环化酶A(GC-A)，导致更高的细胞内环状单磷酸鸟苷(cGMP)水平。同样，CNP与NPR-B(GC-B)作用，以刺激cGMP的生成(J.Hypertens.,10:1111-1114(1992))。第三种类型的受体，NPR-C，以高亲和性结合各利尿钠肽，并其主要作用以从细胞外的隔室捕捉该肽并将该肽存放于溶酶体内，该肽于溶酶体内被降解(Science,238:675-678(1987))。ANP和BNP主要在心脏的肌肉细胞内生产，且据信在心血管内稳态中扮演重要角色(Science,252:120-123(1991))。CNP被更广泛地表达在包括中枢神经系统、生殖道、骨及血管内皮中(Hypertension,49:419-426(2007))。

在人体内，CNP最初是从利尿钠肽前体C(NPPC)基因作为单链、126个氨基酸的前多肽而生产的(Biochem.Biophys.Res.Commun.,168:863-870(1990))。移除该信号肽得到proCNP，通过内切蛋白酶弗林(furin)进一步裂解产生活性的、53个氨基酸的肽(CNP-53)，该肽被分泌并再次裂解以产生成熟的、22个氨基酸的肽(CNP-22)(Wu,J.Biol.Chem.278:25847-852(2003))。CNP-53和CNP-22的区别在于其分布，CNP-53主要存在于组织内，而CNP-22主要发现于血浆和脑脊髓液中(J.Alfonzo,Recept.Signal.Transduct.Res.,26:269-297(2006))。软骨中主要的CNP未知。CNP-53和CNP-22两者均类似地结合至NPR-B。此外，它们都以计量依赖性且类似的方式诱导cGMP生产(VT Yeung,Peptides,17:101-106(1996))。

天然CNP基因和多肽先前已经揭示于US 5,352,770中，该专利揭露了从猪脑分离并纯化在序列上与人CNP一致的CNP-22及其在治疗心血管适应症中的用途。US 6,034,231揭露了proCNP(126个氨基酸)的人类基因和多肽，以及人CNP-53基因和多肽。

通过快速降解CNP的膜结合中性肽链内切酶(NEP)的作用，且通过结合至CNP并将CNP沉积在溶酶体中的NPR-C，将CNP从细胞外空隙清除(Biochem.J.,291(Pt 1):83-88(1993))，其中，CNP在溶酶体处被降解。已经显示，CNP在正常人体内的体内半衰期为具2.6分钟(J.Clin.Endocrinol.Metab.,78:1428-35(1994))。低血浆浓度的CNP(J.BoneMoner.Res.,19(Suppl.l)S20(2004))及其与NPR-B在大量组织内的共表达暗示，CNP主要通过自分泌/旁分泌机制起作用。

如上所述，CNP结合并活化利尿钠肽受体B(NPR-B)，也称鸟苷酸环化酶B(GC-B)，导致更高的细胞内环状单磷酸鸟苷(cGMP)水平。由cGMP生成介导的下游信号传递影响包括软骨内成骨的生物过程的多样阵列。据此，这一通路中任何组分的水平的提高或压低可导致畸变骨或软骨生长。例如，将小鼠模型中的CNP或NPR-B敲除，导致具有矮小表型的长骨和椎骨较短的动物。已经证实，人NPR-B中的阻断适宜CNP信号传递的突变导致侏儒症(Olney,etal.,J.Clin.Endocrinol.Metab.91(4):1229-1232(2006)；Battels,et al.,Am.J.Hum.Genet.75:27-34(2004))。相比之下，经工程化以生产升高水平的CNP的小鼠显现延长的长骨和椎骨。

软骨发育不全是纤维母细胞生长因子受体3(FGFR-3)的基因中常染色体线性突变的结果，其造成软骨形成的畸形。正常情况下，FGFR-3对于软骨细胞生长以及由软骨细胞生长造成的骨生长具有负调控效果。在软骨发育不全中，突变形式的FGFR-3具有持续活性，这导致严重缩短的骨。软骨细胞增殖和分化似乎被扰乱，导致相当端的生长板软骨(P.Krejciet al.,J.Cell Sci.118:5089-5100(2005))。软骨内成骨是管理纵向长骨生长的过程。存在四个生长板区域：休眠区、增殖区、肥大区、和钙化区。在生长板中，NPR-B由增殖细胞表达，而NPR-C由肥大细胞表达(Yamashite et al.,J.Biochem.127:177-179(2000))。在正常的软骨内骨生长中，软骨细胞组织成柱体，并在该生长板的增殖区内增殖。在软骨发育不全的患者体内，这些柱体是紊乱无序的。此外，该肥大区是细胞变大并最终凋亡(裂解)之处，导致骨细胞入侵和矿化。在软骨发育不全的患者体内，该肥大的软骨细胞和该区的总尺寸比正常患者体内的小得多。CNP是NPR-B的激动剂，是软骨细胞和骨生长的正调节因子。CNP/NPR-B的下游信号传递以促分裂原活化蛋白激酶(MAP K)的水平抑制FGFR-3通道。在MAP K水平上的抑制促进该生长板的增殖区和肥大区内软骨细胞的增殖和分化，导致骨生长。

人体内，FGFR-3的活化突变之遗传性侏儒症的主要肇因。使用具有活化FGFR-3的小鼠作为软骨发育不全的模型，软骨发育不全是骨骼发育不良的最常见形式，而CNP的过度表达将这些动物从侏儒症拯救回流。据此，CNP和CNP的功能性变体是治疗多种骨骼发育不良的潜在疗法。

CNP的治疗用途目前受限于其血浆半衰期短，在人体内，该半衰期为2.6分钟(JClin.Endocrinol.Metab.,78:1428-35(1994))。为了将CNP浓度增加为高于在人血浆中典型发现的固有水平(约5pM)，在所有使用全身性给药CNP的人类和动物研究中，连续输液是必要的。CNP在人血浆中的半衰期通过两种机制被降低，该机制是通过中性肽链内切酶(NEP)降解且通过利尿钠肽受体C(NPR-C)清除(Growth Horm.&IGF Res.,16:S6-S 14(2006))。具有更长的体内血清半衰期且展现与野生型CNP类似或改善的活性的CNP变体，对于可持续发展的治疗策略是重要的。

已经评估了CNP的多种类似物和衍生物的生物学活性。见，如，US 7,276,481和WO94/20534揭露了CNP-22与ANP的5-氨基酸C端的设计为血管钠肽(VNP)的嵌合体。US 8,198,242和US 8,598,121揭露了CNP变体在治疗骨骼发育不良如软骨发育不全中的用途。US 7,642,243和US 8,658,373揭示了CNP-22或CNP-53的变体在治疗关节炎中的用途。

发明内容

本揭示內容涉及，当以超过及/或低于本文中揭示的某些药物给药方案的剂量给药CNP变体肽时，该CNP变体肽在治疗骨骼发育不良、治疗一种或多种骨骼发育不良相关症状、或改善苦于骨骼发育不良的患者体内骨骼发育不良的一种或多种后果或生理学症状的用途。本文中揭露，给药CNP变体肽可导致软骨发育不全受试者的骨生长速度改善。多种具体例中，该CNP变体肽系CNP-38或Pro-Gly-CNP-37。

多种具体例中，本揭示內容提供治疗骨骼发育不良的方法，包含给药包含CNP变体肽的组合物至有此需要的受试者，给药量为至少7.5μg/kg，其中，该给药治疗骨骼发育不良或改善骨骼发育不良的至少一种症状或生理学后果。

一种具体例中，该治疗是对骨骼发育不良的一种或多种症状的选自增加绝对生长、改善或增加生长速度、增加QCT骨矿物密度(BMD)、改善生长板形态、增加长骨生长、改善脊柱形态、改善或增加肘关节活动范围、及减少睡眠呼吸暂停所组成组的改善。

一种具体例中，该骨骼发育不良选自软骨发育不全、软骨发育不良、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性发育不良、成骨不全、软骨成骨不全、点状软骨发育不良、纯合软骨发育不全、点状软骨发育不良、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋骨多指综合征、软骨发育不良、肢根型点状软骨发育不良、Jansen型干骺端发育不良、先天性脊椎骨骺发育不良、骨发育不全、弯曲变形性发育不良、先天性短股骨、Langer型肢中骨发育不良、Nievergelt型肢中骨发育不良、Robinow综合征、Reinhardt综合征、肢端发育不全、周围骨发育障碍、Kniest发育不良、纤维软骨增生症、Roberts综合征、肢端肢中发育不良、短肢、Morquio综合征、Kniest综合征、后生发育不良、和脊椎干骺端发育不良组成的组。优选具体例中，该骨骼发育不良是软骨发育不全。

还提供增加受试者体内长骨生长的方法，包含给药包含CNP变体肽的组合物至有此需要的受试者，给药量为至少7.5μg/kg，其中，该给药增加了长骨生长。优选具体例中，该受试者患有软骨发育不全。

本揭示內容还关注一种提升或增加受试者体内生长的速度(即，生长速度)的方法，包含给药包含CNP变体肽的组合物至有此需要的受试者，给药量为至少7.5μg/kg，其中，该给药提升或增加了该受试者体内的生长速度。优选具体例中，该受试者患有软骨发育不全。多种具体例中，生长速度的该提升或增加是，年化生长速度自该受试者基线起的改变在25％至50％范围内。一种具体例中，该生长速度的该提升或增加是，年化生长速度自该受试者基线起的改变为至少约25％，更优选至少约40％。

预期通过测量立高、坐高、体重、头围、上臂长、下臂长、大腿长、小腿长、手长及/或脚长来评估生长速度的该提升。

本文所揭示的多种方法和组合物中，该CNP变体肽可选自下列所组成的组：

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-37(M32N)，SEQ ID NO:l]、

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP-37，SEQ ID NO:2)、

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP-37，SEQ ID NO:3)、

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP-37(M32N)，SEQ ID NO:4]、

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37，SEQ ID NO:5)、

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP-37，SEQ ID NO:6)、以及

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP-37或CNP-38，SEQ ID NO:7)。

多种优选具体例中，该CNP变体肽是CNP-38或Pro-Gly-CNP-37。

本文所揭示的多种方法中，所给药的CNP变体肽量的范围是自约7.5μg/kg至约100μg/kg，优选约7.5μg/kg至约80μg/kg，更优选约7.5μg/kg至约60μg/kg。多种具体例中，所给药的CNP变体肽为至少约7.5μg/kg、至少约15μg/kg、至少约30μg/kg或至少约60μg/kg。

本文所揭示的多种方法中，该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂或皮下给药，或肠道外给药，较佳为皮下给药。还预期通过其它途径给药该CNP变体肽。例示性的给药途径包括，但不限于，皮下给药、关节内给药、静脉给药、动脉给药、腹膜给药、肌肉给药、皮内给药、鞘内给药、腹膜内给药、肌肉给药、皮内给药、鞘内给药、外用给药、透皮给药或透黏膜给药。

本文所揭示的多种方法中，该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂可在一次治疗中或以多剂形式给药至受试者。该多剂可在治疗进程中每天给药一次、或以多剂给药。多种具体例中，预期该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂以单剂或多剂形式给药，给药频率为每天一次、每2天一次、每3天一次、每周两次、每周3次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每6周一次、每2个月一次、每3个月一次、或主治医生认为适合的频率。特优选具体例中，将该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂每天一次给药至受试者，持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更久的时间。

本文所揭示方法的某些具体例中，调节该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂的给药，以令预防或治疗性处理期后跟随一个恢复期。例如，该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂可以关节内、皮下、静脉给药方式或另一模式每天给药一次或每周给药多次，给药一段时间后，在一段时间内不做任何治疗，随后重复该循环。一些具体例中，初始治疗的时间段(如，每天给药一次或每周给药数次该CNP变体肽)为3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。相关具体例中，不做治疗的时间段为3天、1周、2周、3周或4周。某些具体例中，该CNP变体肽的剂量方案为，每天一次，持续3天，之后休息3天；或每天一次或每周多次，持续1周，之后休息3天或1周；或每天一次或每周多次，持续2周，之后休息1周或2周；或每天一次或每周多次，持续3周，之后休息1周、2周或3周；或每天一次或每周多次，持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，之后休息1、2、3或4周。

本文所揭示的多种方法中，优选该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂的给药不在该受试者体内造成或导致被归为二级或更高的不良事件。本文所揭示方法的其它具体例中，该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂的给药不导致所述受试者体内血液血红蛋白浓度、血小板数、血液电解质浓度、血尿素氮浓度、血液肌酸酐浓度,血液碱性磷酸酶浓度、血液丙氨酸氨基转移酶浓度及/或血液天冬氨酸氨基转移酶浓度的临床显着改变。

本文所揭示的多种方法中，优选具体例中，该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂的给药导致(i)上身长与下身长之比、(ii)上臂长与前臂长之比、或(iii)大腿长与小腿长之比与基线(即，在给药该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂之前)相比的改变，为约-0.25与约0.25之间、约-0.20与约0.20之间、约-0.15与约0.15之间、约-0.10与约0.10之间、或约-0.05与约0.05之间。

多种具体例中，本揭示內容提供包含CNP变体肽的组合物或制剂，或包含CNP变体肽的组合物或制剂在本文中揭示的方法中的用途。一种具体例中，该组合物或制剂进一步包含药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂。某些具体例中，该组合物从包含pH为约4至约6的柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂或醋酸/醋酸盐缓冲剂的液体或冻干制剂制备。多种具体例中，该pH为约5.5。

还预期一种如本文中揭示的治疗方法，进一步包含给药第二试剂。

多种具体例中，本文所揭示的方法及组合物或制剂中使用的CNP变体肽可附接至疏水性酸，且可附接至一种或多种疏水性酸。疏水性酸的非限制性实例包括直链或支链、饱和或不饱和C₅-C₁₂羧酸(如，戊酸、庚酸等)及天然脂肪酸。该疏水性酸可附接至一种或多种氨基酸残基的N端、C端、及/或侧链。一种具体例中，该疏水性酸接合至N端。

又一具体例中本发明的方法及组合物中使用的CNP变体肽是嵌合体或融合蛋白，其包含CNP变体肽、可裂解的肽或蛋白质、或肽标签。例示性的可裂解蛋白质或肽包括，但不限于，组氨酸(如，六-His)标签；TAF12：人转录因子TAF12；KSI：酮类固醇异构酶；MBP：麦芽糖结合蛋白；β-Gal：β-半乳糖苷酶；GST：谷胱甘肽-S-转移酶；Trx：硫氧还蛋白；CBD：甲壳素结合域；BMPM：BMP-2突变、SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白、淀粉结合蛋白、内切葡聚糖酶A的纤维素结合域、外切葡聚糖酶Cex的纤维素结合域、生物素结合域、recA、Flag、c-Myc、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(Gln)、聚(Phe)、聚(Cys)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗体表位、及其片段。

本文所揭示的多种具体例中，该CNP变体肽可以是单体或二聚体。相关具体例中，二聚体CNP变体肽的单体可经由链接基或不经链接基而N端附接至N端、经由链接基或不经链接基而N端附接至C端、或经由链接基或不经链接基而C端附接至C端。

本文中揭露的任何具体例中，与野生型CNP-22相比，该CNP变体肽的生物学活性可基本上相同或更佳。例如，该CNP变体肽可保留野生型CNP-22活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高，或可具有比CNP-22更高的活性，如，当与NPR-B(GC-B)相互作用以刺激cGMP的生成时。或者，或此外，该CNP变体肽可保留野生型CNP-22活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或跟高，或可具有比CNP-22更高的活性，如，当调节软骨内骨生长及软骨细胞活性时，该调节包括而不限于软骨细胞增殖、软骨细胞分化、抑制氮活化蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-1)激酶信号传递通道、以及促进软骨内成骨。本文中揭示的任何具体例中，该CNP变体肽可包含一与野生型CNP-22的氨基酸6至22或1至22的统一性或相似性为至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的氨基酸序列。

多种具体例中，该CNP变体肽可视需要具有，如，位于N端及/或C端的接合或延展，以促进软骨靶向、降低肾清除率、及/或增加对NEP降解的抗性。该结合或延展可包含从例如聚Asp、聚Glu、软骨靶向肽、唾液蛋白、PEG、碳水化合物、疏水性酸、NPPC或非CNP(多)肽、或其组合形成或衍生的分子或序列。

进一步预期，该CNP变体肽可接合至疏水性聚合或非聚合部分，如，庚酸、戊酸、或脂肪酸。该疏水性部分可接合至氨基酸残基的侧链，或可附接至该CNP变体的N端及/或C端，其中，该氨基酸包括，但不限于，赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸。

多种具体例中，可用于该方法中的CNP变体肽的pH为自约8至约10.5或自约8.5至约10的范围。

多种具体例中，本揭示內容提供包含CNP变体肽、视需要另一生物活性剂、及视需要的药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂的医药组合物的用途。多种具体例中，该组合物是适用于肠道外注射的无菌医药组合物。一些具体例中，该组合物包含基本上醇的CNP变体肽，如，纯度为至少约90％或95％。一些具体例中，该组合物含有少于约5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的污染物，如其它人体蛋白、猪蛋白、或CNP-53或其片段(所希望的CNP变体肽除外)。多种具体例中，将该无菌组合物给药至受试者，用于治疗或预防骨骼发育不良或本文中揭示的骨骼发育不良的一种或多种症状或生理学后果。

可用于本文的CNP变体肽有利地保留了CNP活性，并展现增加的血清半衰期。例如，CNP活性的保留可显示为所希望的体内生物学效果的保留，或在相同浓度(如，1μΜ的CNP肽或大于ED80)下，CNP-22的cGMP刺激活性保留至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少约100％。一些具体例中，CNP变体肽展现比CNP-22增加至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40被的血清半衰期。

相关具体例中，与野生型CNP-22相比，本文中揭示的CNP变体肽具有增加的NEP抗性并展现增加的半衰期。一种具体例中，与野生型CNP-22相比，该CNP变体肽的半衰期增长了约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％。

还预期任何前述CNP变体肽、或包含该CNP变体肽的组合物或制剂在制备用于治疗骨骼发育不良及本文中揭示的与骨骼发育不良相关的症状或其它生理学临床表现的药物中的用途。还预期注射器如一次性或预填充注射器、无菌密封容器如小管、瓶、皿、及/或试剂盒或试剂盒或包装，其包含任何前述CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂、以及视需要的适当使用说明书。

本文中还预期制剂，其包含(a)本文中揭示的CNP变体肽、以及(b)一种或多种选自缓冲剂、等渗剂、稳定剂及抗吸附剂所组成组的组分。特优选具体例中，该制剂中采用的缓冲剂可以是一水合柠檬酸、二水合柠檬酸钠、或两者的组合。又一优选具体例中，本发明的制剂中采用的等渗剂可以是二水合海藻糖、D-甘露醇、或两者的组合。其它优选具体例中，本发明的制剂中采用的稳定剂是L-蛋氨酸。又一优选具体例中，本发明的制剂中采用的抗吸附剂是聚山梨醇酯80。

多种具体例中，本发明的制剂是冻干形式、液体形式、或已经从先前冻干的形式重建的液体形式。某些具体例中，本发明的制剂不含防腐剂，且视需要可包含在1型未反应的硼硅酸盐玻璃小管中。视需要，本发明的制剂的pH为约5.0与约6.0之间的范围，优选约5.5。

其它具体例中，本发明的制剂包含浓度为至少约2.0mg/ml、5.0mg/ml、10.0mg/ml、或更高的CNP变体肽。特优选具体例中，本发明的制剂包含浓度为约10.0mg/ml的CNP变体肽。特优选具体例中，该制剂的CNP变体肽是CNP-38或Pro-Gly-CNP-37。

其它具体例中，本发明的制剂包含如本文中揭示的CNP变体肽、一水合柠檬酸、二水合柠檬酸钠、二水合海藻糖、D-甘露醇、L-蛋氨酸和聚山梨醇酯80。某些优选具体例中，该CNP变体肽以介于约2.0mg/ml与约10.0mg/ml之间的浓度存在，该一水合柠檬酸以介于约0.15mg/ml与约0.40mg/ml之间的浓度存在，该二水合柠檬酸钠以介于约0.5mg/ml与约1.5mg/ml之间的浓度存在，该二水合海藻糖以介于约30mg/ml与约70mg/ml之间的浓度存在，该D-甘露醇以介于约10mg/ml与约20.0mg/ml之间的浓度存在，该L-蛋氨酸以介于约0.5mg/ml与约1.5mg/ml之间的浓度存在，以及，该聚山梨醇酯80以介于约0.01mg/ml与约0.1mg/ml之间的浓度存在。特优选具体例中，该CNP变体以约10.0mg/ml的浓度吋，该一水合柠檬酸以约0.28mg/ml的浓度存在，该二水合柠檬酸钠以约1.08mg/ml的浓度存在，该二水合海藻糖以约58.01mg/ml的浓度存在，该D-甘露醇以约15.0mg/ml的浓度存在，该L-蛋氨酸以约0.73mg/ml的浓度存在，以及，该聚山梨醇酯80以约0.05mg/ml的浓度存在。

本文中揭示的含有CNP变体肽的制剂有用于且可用于本文中揭示的多种方法中。

应理解，本文中揭示的各特征或具体例或组合是本揭示內容任何方面的非限制性的例示性说明用的实施例，且就此意为可与本文中揭示的任何其它特征或具体例或组合形式组合。例如，若特征以词语如“一具体例”、“一些具体例”、“进一步的具体例”、“具体例示性具体例”、及/或“另一具体例”揭示时，这些类型的具体例各自为一特征的非限制性实例，其意图与本文中揭示的任何其它特征、特征的组合形式组合，而不必列举每一可能的组合。这些特征或特征的组合应用于本揭示內容的任何方面。若揭露了落入范围内的数值的实例，预期任何这些实施例均可作为范围的可能的端点，这些端点之间的任何和所有数值均在预料之中，且展望上限和下限的任何和所有组合。

具体实施方式

本揭示內容涉及使用CNP变体肽治疗骨骼发育不良、骨骼发育不良的一种或多种症状或生理学后果、及其它具有骨骼发育不良及/或CNP相关症状或组分的病变的方法。本揭示內容还涉及包含CNP变体肽的组合物和制剂，以及此类组合物或制剂在治疗骨骼发育不良或骨骼发育不良的症状或生理学后果、增加有此需要的受试者体内的长骨生长、或改善或增加有此需要的受试者如苦于骨骼发育不良的受试者的生长速度中的用途。

A.定义

除非另作说明，本说明书中，包括说明书和权利要求书中使用的下述术语，具有下文给出的定义。

如本说明书和所附权利要求书中所用，除非语境中明确排除，不定冠词“一(a)”、“一(an)”和定冠词“该”包括复数和单数个指示物。

术语“约”或“大约”意为，特定值的该领域技术人员确定可接受的误差，其部分地取决于该值如何测量或测定。某些具体例中，术语“约”或“大约”意为处于1、2、3、或4标准偏差内。某些具体例中，术语“约”或“大约”意为处于给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.05％内。无论何时，当术语“约”或“大约”在一系列的两个或更多个数值中的第一数值之前时，理解为该术语“约”或“大约”应用于该系列的每一个数值。

标准化学术语的定义可于工具书中找到，该工具书包括Carey和Sundberg所著《高等有机化学(第三版)》(Advanced Organic Chemistry,3^rd Edition,Vols.A and B(PlenumPress,New York 1992))。除非另作说明，对本揭示內容的实践可采用该领域范围内的某些传统有机化学合成方法、质谱、制备和分析色谱、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学。见，如，T.E.Creighton的《蛋白质：结构和分子性质》(Proteins:Structures andMolecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993))；A.L.Lehninger的《生物化学(第四版)》(Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,4^th Edition,2004))；Sambrook,et ah的《分子克隆：实验室手册(第二版)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2^ndEdition,1989))；《酶学方法》(Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.))；《雷明顿药物科学(第十八版)》(Remington's PharmaceuticalSciences,18^th Edition(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990))。

本文中引用的所有出版物、专利和专利申请案，无论在前或灾后，均通过引用而以其整体并入本文。

本文中，通篇使用下述氨基酸缩写：

本文中，使用传统符号来描绘多肽和肽序列：多肽或肽序列的左手端为氨基端；而多肽序列的右手端为羧基端。

一种具体例中，本文中揭示的可用于该方法中的CNP变体肽是经由重组手段使用编码CNP变体肽的多核苷酸生成的。这些多核苷酸所表达的CNP变体肽可通过下述方法生产，该方法包括：令宿主细胞在培养基中在适用于该编码CNP变体的多核苷酸的表达的条件下生长，以及从该宿主细胞或培养基分离表达产物。依据转译后处理，实际表达产物可能与所编码的蛋白产物略有不同。生产本发明的CNP变体肽的方法至少揭露于通过引用而并入本文的US 8,198,242中。

在两种或多种多核苷酸或多肽序列的语境中，术语“一致的”和百分比“一致性”是指，当进行最大对应性的比对和对准并使用下述序列比较算法之一或目测进行测量时，两个或多个序列或子序列是相同的或具有具体百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。

在两个核酸或多肽的语境中，短语“基本同源”或“基本一致”通常是指，当进行最大对应性的比对和对准并使用下述序列比较算法之一或目测进行测量时，两个或多个序列或子序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或98％的核苷酸或氨基酸残基一致性。某些具体例中，该基本同源性或一致性在该序列的多个区域上存在，该区域的长度为至少约25、50、100或150个残基。另一具体例中，该序列在一个或两个进行比较的生物聚合物的整个长度是基本同源或一致的。

对于序列比对，典型地，一个序列用作参考序列，并将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机；若需要，设定子序列坐标；以及，设定序列算法成像参数。随后，该序列比较算法基于所设定的程序参数，计算该测试序列相对于该参考序列的百分比序列一致性。

例如，可通过局部同源性算法(Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981))、通过同源性校准算法(Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970))、通过相似度检索方法(Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444(1988))、通过这些算法的计算机执行(GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)、或通过目测完成用于比较的序列的最优对准。可用算法的一个实例是PILEUP，该算法使用渐近性对准方法的简化版(Feng&Doolittle,J.Mol.Evol.,35:351-360(1987))，且类似于Higgins&Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)揭示的方法。可用于生成序列对准的另一算法是Clustal W(Thompson etal.,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))。适用于测定百分比序列一致性和序列相似度的算法的实例是BLAST算法(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)；Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915(1989)；Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5787(1993))。实施BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。

“野生型(wt)”是指代天然形式的术语，包括物种的多核苷酸、多肽或蛋白质的序列。多核苷酸、多肽或蛋白质的野生型形式与由遗传突变引起的突变形式截然不同。

一种具体例中，作为第二肽的“类似物”或“变体”或“衍生物”的第一肽，是与该第二肽的序列同源性为至少约50％、60％或70％但低于100％的肽。这些类似物、变体或衍生物可由非天然出现的氨基酸残基以及天然出现的氨基酸残基构成，其中，该非天然出现的氨基酸残基包括而不限于，高精氨酸、鸟氨酸、青霉胺、和戊氨酸。

该利尿钠肽前体C(NPPC)多肽是单链的126个氨基酸的初前多肽，且在裂解时最终导致野生型CNP-22(wtCNP-22)。将该信号肽从NPPC移除，得到proCNP，并通过内且蛋白质furin进一步裂解，生产活性的53个氨基酸的肽(CNP-53)，该CNP-53被分泌并再次裂解，以产生成熟的22个氨基酸的肽(CNP，或CNP-22)。一种具体例中，“CNP变体肽”在相同数目的氨基酸残基上，与野生型NPPC的同源性为至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。进一步预期，CNP变体肽可包含该NPPC多肽的自约1至约53、或1至38、或1至37、或1至35、或1至31、或1至27、或1至22、或10至35、或约15至约37个残基。一种具体例中，CNP变体可包含源自该NPPC多肽的由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35,36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53个氨基酸构成的序列。

术语“有效量”意为足以对健康状况、病理、或受试者的疾病产生所希望结果的剂量，或用于诊断目的。该所希望的结果可包含接受该剂量者的主观或客观的改善。“治疗有效量”是指有效于对健康产生预料之中的有益效果的量。在任何独立情形中，适宜的“有效”量可由该领域技术人员使用常规实验确定。应理解，对特定患者的具体剂量水平和给药频率可变，且将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性；该化合物的生物应用性、代谢稳定性、排泄率和作用时长；该化合物的给药模式和给药时间；患者的年龄、体重、一般健康情况、性别、和饮食；以及特定状况的严重性。

“治疗”是指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。某些具体例中，“治疗”是指给药化合物或组合物至受试者，用于治疗、预防或诊断目的。

“预防性”治疗是给予不展现疾病迹象或仅展现该疾病早期迹象的受试者的治疗手段，用于降低发展病理风险目的。本揭示內容的化合物或组合物可作为预防性治疗手段而给予，以降低发展病理或，若发展，则最小化该病理的严重性。

“治疗性”治疗是给予展现病理迹象或症状的受验者的治疗手段，用于削弱或消除那些迹象或症状。该迹象或症状可以是生化的、细胞的、组织学的、功能性的或体能性的、主观的或客观的。本揭示內容的化合物亦可作为治疗性手段而给出，或用于诊断。

“医药组合物”或“制剂”是指适用于受试动物包括人类和哺乳动物的医药用途的组合物。医药组合物包含治疗有效量的CNP变体肽、视需要的另一生物学活性剂、以及视需要的药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂。一种具体例中，医药组合物涵盖包含活性成分及构成载体的惰性成分组合物，以及直接或间接从两种或多种给成分的组合、复配或聚集而得、或从一种或多种该成分的解离而得、或从一种或多种该成分的其它类型的反应或相互作用而得的任何产物。据此，本揭示內容的医药组合物涵盖通过将本揭示內容的化合物与药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合而作成的任何组合物。

“药学可接受的载体”是指任何标准药学载体、缓冲剂等，如磷酸缓冲盐水溶液、右旋葡萄糖的5％水溶液、和乳液(如，水包油乳液或油包水乳液)。赋形剂的非限制性实例包括佐剂、粘合剂、填料、稀释剂、崩解剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、助流剂、甜味剂、芳香剂、和着色剂。适当的药学载体、赋形剂和稀释剂揭示于《雷明顿药物科学(第十九版)》(Remington's Pharmaceutical Sciences,19^th Ed.(Mack Publishing Co.,Easton,1995))中。优选的药学载体取决于活性剂的预定给药模式。典型的给药模式包括肠内给药(如口服)或肠道外给药(如，皮下、肌肉、静脉或腹腔内注射；或外用、透皮或透肌肉给药)。

“药学可接受的盐”是可配制为用于医药用途的化合物的盐，包括，但不限于，金属盐(如，钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等)和铵盐或有机胺。

“药学可接受的”或“药理学可接受的”是指并非生物学上或以其它方式不希望的材料，即，该材料可给药至个体，而不造成任何不希望的生物学效果、或不以有害的方式与包含该材料的组合物中任何组分相互作用、或不以有害的方法与该个体身体上或身体内存在的任何组分反应。

“生理条件”是指动物(如，人)体内的条件。生理条件包括，但不限于，体温和生理学离子强度、pH和酶的水性环境。生理条件也涵盖不同于大部分受试者体内存在的“正常”条件的特定受试者体内的条件，如，其与正常人大约37℃的体温不同，或与正常人大约7.4的血液pH不同。

本文中使用的术语“受试者”涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括，但不限于，哺乳动物纲的任何成员：人，非人灵长类如黑猩猩、及其它猿及猴类物种；耕畜如牛、马、绵羊、山羊、猪；牲畜如兔、狗、和猫；实验动物，包括啮齿动物如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括，但不限于，鸟、鱼等。该术语并不只是特定的年龄或性别。

除非另作说明，术语“聚乙二醇”、“PEG”、“聚环氧乙烷”和“PEO”可互换使用。CNP变体经由胺基接合至与数字n有关的“PEOn”聚合物，通常具有式：CH₃-[-O-CH₂CH₂-]_n-C(＝O)-NHR，其中，n是环氧乙烷单元的数目，而R表示该肽的剩余部分。该“PEOn”聚合物可视需要具有亚烷基(CH₂)_m，其中，m是1至5的整数，位于该羰基碳与重复的环氧乙烷单元之间。这一“PEOn”(如，PEO12或PEO24)聚合物是单分散的，即，是特定分子量的单离散聚合物。同样，CNP变体经由胺基接合至于数字nK有关的“PEGnK”聚合物，通常具有式：CH₃-[-O-CH₂CH₂-]_p-C(＝O)-NHR，其中，p是大于1的整数。该“PEGnK”聚合物亦可视需要具有亚烷基(CH₂)_m，其中，m是1至5的整数，位于该羰基碳与重复的环氧乙烷单元之间。但是，这一“PEGnK”(如，PEG1K、PEG2K、PEG5K或PEG20K)聚合物是多分散的，即，含有多种具有分子量分布的聚合物的混合物，其中，数字nK表示以千道尔顿计的该聚合物的数均分子量(Mn)。例如，接合至CNP变体的“PEG2K”表示数均分子量为2kDa作用的多分散PEG聚合物。

除非另作表达说明，当给定(如，以kDa为单位)聚合物的质量范围时，该范围是指聚合物数均分子量的范围，而不是多分散混合物中多种聚合物的分子量范围。

B.CNP变体肽

CNP-22作为治疗剂的用途受限于其在血浆中的短半衰期(J.Clin.Endocrinol.Metab.,78:1428-35(1994))。在人血浆中，CNP-22的浓度典型低于5皮摩尔。在人体内，CNP-22被NEP和NPR-C降解和清除(Growth Hormone&IGF Res.,16:S6-S14)。在使用全身性给药CNP-22的所有人类和动物研究中，已经使用连续输液以增加受试者体内的CNP-22浓度。具有长半衰期和至少类似水平的功能性的CNP，将有利于基于CNP的治疗策略。具有改善性质的CNP变体肽揭露于国际申请案WO 2009/067639和WO 2010/135541中以及US 8,198,242、US 8,598,121和US 8,377,884中，全部通过引用而具体地并入本文。

某些具体例中，该CNP变体肽是CNP-37或CNP-38的衍生物。该CNP-37变体肽可含有位于CNP-37的37个位置中任意一处或多处的氨基酸加入、删除、及/或以天然或非天然氨基酸或模拟肽(如，肽键等排物)替代。可在CNP-37中作成替代的非限制性实例包括，基于CNP-22的编号，K4R、G5S、G5R、G8S、K10R、G15S、S 16Q、M17N、G19R、及其组合。

一种具体例中，该CNP变体肽是经修饰的CNP-37或CNP-38，在furin裂解位点具有被设计为改善对furin蛋白酶的体内抗性的突变/替代，及/或含有位于N端的设计为改善血浆稳定性并防止焦谷氨酰胺形成的甘氨酸或脯氨酸-甘氨酸。

例示性CNP-37变体包括，但不限于：

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-37(M32N)，SEQ ID NO:l]、

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP-37，SEQ ID NO:2)、

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP-37，SEQ ID NO:3、

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP-37(M32N)，SEQ ID NO:4]、

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37，SEQ ID NO:5)、

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP-37，SEQ ID N0:6)、以及

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP-37或CNP-38，SEQ ID NO:7)。

C.CNP变体肽的合成和纯化

一些具体例中，通过重组表达，使用该领域已知的某些技术以某些具体例生产可用于本文中的CNP变体肽。见，如，《分子克隆：实验室手(第二版)》(Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition.Cold SpringHarbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))；《DNA克隆：实践指南》(DNACloning:A Practical Approach,Volumes I and II,D.N.Glover,Ed.(1985))；以及《分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994))。

某些具体例中，通过重组过程生产该CNP变体肽，该重组过程包含在培养基中培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码CNP变体肽的第一多核苷酸，且该CNP变体肽链接至编码可裂解肽或蛋白质的第二多核苷酸，培养条件为导致由该多核苷酸编码的融合多肽的表达，其中，该融合多肽包含直接或经由链接基而间接链接至该可裂解肽或蛋白的CNP变体肽。一些具体例中，以表达载体转化该宿主细胞，其中，该表达载体包含编码该CNP变体肽的多核苷酸，且该CNP变体肽链接至编码该可裂解肽或蛋白的多核苷酸。某些具体例中，该融合多肽被表达为可溶性蛋白或表达为包涵体。所表达的融合多肽可自该宿主细胞或培养基分离，且所分离的融合多肽可与裂解剂接触，以释放该CNP变体肽。

生产CNP变体肽的方法揭示于通过引用而并入本文的US 8,198,242、US8,377,884和US 8,598,121中。

用来生产CNP变体肽的宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、非哺乳动物类脊椎动物细胞、或哺乳动物细胞。细菌细胞包括而不限于大肠杆菌(E.coli)细胞系和细胞株。大肠杆菌细胞系和细胞株的非限制性实例包括BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pGro7、ArcticExpress(DE3)、C41[亦称C41(DE3)]、C43[亦称C43(DE3)]、OrigamiB(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX、和Tuner(DE3)。一种具体例中，使用BL21(DE3)细胞生产CNP变体肽和CNP融合蛋白。哺乳动物细胞包括，但不限于，仓鼠、猴、黑猩猩、狗、猫、牛、猪、小鼠、大鼠、兔、绵羊和人的细胞。该宿主细胞可以是无限增殖化细胞(细胞系)或非无限增殖化(初生或次生)细胞，且可以是多种细胞类型的任意细胞，例如但不限于，纤维母细胞、角化细胞、上皮细胞(如，乳腺上皮细胞、肠上皮细胞)、卵巢细胞(如，中国仓鼠卵巢细胞或CHO细胞)、内皮细胞、胶质细胞、神经细胞、血液的构成元素(如，淋巴细胞、骨髓细胞)、软骨细胞及其它骨源细胞、及这些体细胞类型的前体。将含有该CNP变体DNA或RNA的宿主细胞在适用于该细胞生长、该DNA或RNA的表达、及表达该CNP变体肽的细胞的鉴别/选择的条件下培养。

某些具体例中，该CNP变体肽被重组表达为包含CNP变体肽及可裂解载体蛋白或可裂解标签(如，肽标签)的融合蛋白，其中，该融合蛋白包含直接链接或经由链接基间接链接至可裂解载体蛋白或标签的CNP变体肽。使用载体蛋白或标签促进了例如该融合蛋白的删除、分离及/或纯化。可裂解的载体蛋白和标签包括，但不限于，组氨酸(如，六-His)标签；人转录因子TAF12(TAF12)、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12(C/A)、TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A&D/E)、TAF12(C/A&4D/4E)、TAF12(C/A&6D/6E)、TAF12(C/A&10D/10E)；酮类固醇异构酶(KSI)；麦芽糖结合蛋白(MBP)；β-半乳糖苷酶(β-Gal)；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；硫氧还蛋白(Trx)；甲壳素结合域(CBD)；BMP-2、BMP-2突变体、BMP-2(C/A)；SUMO；以及突变体及其片段。

其它具体例中，根据该领域中已知的方法，如根据Atherton和Sheppard的《固相肽合成：实用方法》(Solid Phase Peptide Synthesis:a Practical Approach,IRL Press(Oxford,England(1989))的方法，使用肽合成器合成本文中揭示的CNP变体肽并纯化。

D.使用CNP变体肽的方法、CNP变体肽的医药组合物、以及给药途径

使用CNP变体的方法

骨相关病变/骨骼发育不良

纤维母细胞生长因子(FGF)在骨形成中扮演重要角色，FGF受体基因(FGFR 1、2和3)中的突变引起各种各样的遗传性骨骼畸形(Curr.Biol.,5:500-507(1995))。特别地，FGFR-3中的激活突变是长骨病变的原因，该长骨病变包括软骨发育不全、最常见形式的人类遗传性侏儒症(Nature,371:252-254(1994)；Cell,78:335-342(1994))、中等病变的软骨发育不良(Ann.N.Y.Acad.Sci.,785:182-187(1996))、以及更严重的和I型和II型新生儿致死性软骨发育不良(TD)(Hum.Mol.Genet.,5:509-512(1996)；Nat.Genet.,9:321-328(1995))。过度表达FGF-2并必然激活FGFR-3的鼠模型显示缩短的长骨和巨头(Mol.Biol.Cell,6:1861-73(1995))。与此模型一致，FGFR-3中具有缺陷的鼠显示显着的具有更宽生长板的骨骼过度生长(Nature Genet.,12:390-397(1996))。

通过刺激软骨细胞的基质产生、增殖和分化以及增加长骨生长，本揭示內容的CNP变体肽可用于治疗患有骨相关病变如骨骼发育不良的哺乳动物，包括人类。CNP响应骨相关病变和骨骼发育不良的非限制性实例包括软骨发育不全、软骨发育不良、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性发育不良、先天性成骨不全、软骨成骨不全、先天性软骨发育异常、纯合软骨发育不全、先天性软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酯酶症、围产期致死型先天性成骨不全、短肋骨多指综合征、软骨发育不良、先天性肢根型之软骨发育不全、Jansen型干骺端发育不良、先天性脊柱骨骺发育不利、骨发育不全、弯曲变形性发育不良、先天性短股骨、Langer型肢中骨发育不良、Nievergelt型肢中骨发育不良、Robinow综合征、Reinhardt综合征、肢端发育不全、周围骨发育障碍、Kniest发育不良、纤维软骨增生症、Roberts综合征、肢端肢中发育不良、短肢、Morquio综合征、Kniest综合征、后生发育不良、和脊椎干骺端发育不良。再者，该CNP变体可作为生长激素的附件或替代物用于治疗特发性身材矮小及其它骨骼发育不良。

此外，该CNP变体肽可用于治疗其它骨相关病症和病变，如佝偻病、低磷酸盐血性佝偻病[包括X-性联遗传低磷酸血性佝偻病(亦称抗维生素D佝偻病)和常染色体线性低磷酸血性佝偻病]、和骨软化症[包括肿瘤诱发的骨软化症(亦称瘤源骨软化症或瘤源低磷酸血性骨软化症)]。

某些具体例中，本发明的CNP变体肽及包含该CNP变体肽的组合物和制剂可用于改善骨骼发育不良的一种或多种症状或生理学后果，其中，该改善可以是增加的绝对生长、增加的生长速度、增加的定量计算机断层扫描(QCT)骨矿物密度、生长板形态的改善、增加的长骨生长、脊柱形态的改善、肘关节移动范围的改善及/或睡眠呼吸暂停的减少。就此而言，注意，术语“改善的”、“改善”、“增加”、“减少”及其语法等效表达全部是当涉及疾病状态的症状或生理学后果而使用时的相关术语，指在使用本发明的CNP变体肽(或包含该CNP变体肽的组合物或制剂)治疗后，该疾病的症状或生理学后果的状态与使用本发明的CNP变体肽(或包含该CNP变体肽的组合物或制剂)治疗前该疾病的相同状态或生理学后果相比(即，与“基线”相比)。如上所述，“基线”状态可通过测量治疗前受试者的状态(其随后可与治疗后的相同受试者比较)确定，或通过测量遭受相同痛楚且具有相同或相似特征(如，年龄、性别及/或疾病状态或进展)的受试者群体的状态而确定。

增加或提升生长速度

可给药本发明的组合物和制剂，用于提升或增加苦于骨骼发育不良的受试者的生长速度的目的。优选具体例中，该受试者苦于软骨发育不全。

可使用该领域中周知的标准技术进行一段时间内受试者体内生长速度的测量。某些具体例中，可在具体时间段内测量参数如立高、坐高、体重、头围、上臂长、下臂(前臂)长、大腿长、小腿(膝盖至足)长、手长(腕至手指末端)及/或脚长，以确定如通过任何特定参数测得的具体生长速率(即，生长速度)。在具体时间段内进行的生长速度的测量可“年化”，其中，在具体时间段内计算的生产速率被转化为一年内的预期生长速率。在使用本发明的CNP变体肽治疗之前的受试者体内生长速度的测量值(即，“基线”生长速度)，可与使用本发明的CNP变体肽治疗过程中或之后的生长速度测量值比较，以确定该治疗在改变该受试者体内生长速度上的效果。也可以从各自使用本发明的CNP变体肽治疗的具有相同年龄、性别和疾病状态的受试者群体测得“基线”生长速度。

可定量地测量生长速度的改善，而该改善是通过评估使用本发明的CNP变体肽(或包含该CNP变体肽的组合物或制剂)治疗有此需要的受试者而诱发或造成的一种或多种上述参数(如，立高等)而测量的。就此而言，某些具体例中，使用本发明的CNP变体(或包含该CNP变体的组合物或制剂)治疗的受试者体内任何特定参数的生长速度相对于基线的年化增加或改善为，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％、或更高。某些具体例中，本文中揭示的方法导致通过标准高度测量的生长速度相对于基线的年化增加为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％、或更高。其它具体例中，本文中揭示的方法导致生长速度相对于基线的年化增长为至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％、或更高，其中该生长速度是通过坐高、体重、头围、上臂长、前臂(前臂)长、大腿长、小腿(膝盖至足)长、手长(腕至手指末端)或脚长测量的。如本文中所述，基线比较器可以是通过使用本发明的CNP变体肽治疗之前的相同受试者的具体参数测量的年化生长速度，或者可以是从各自使用本发明的CNP变体肽治疗的具有相同年龄、性别和疾病状态的受试者群体确定的生长速度。

亦可在使用CNP变体肽治疗之前和之后从受试者获得与某些身体环节与其它环节的均衡性相关的人体测量学数据，以确定CNP变体肽的给药是否导致这一均衡性的改变。例如，可在使用CNP变体肽治疗之前(即，基线)及使用CNP变体肽治疗之后计算上身长(腰部至头顶)与下身长(腰部至足)的比，以确定使用该CNP变体肽治疗是否对身体均衡性产生不良反应。亦可计算并比较上臂长与前臂长之比或大腿长与小腿长(膝盖至足)之比，以确定CNP变体肽治疗对身体均衡性的效果。在本发明的优选具体例中，给药CNP变体肽至受试者并不导致身体均衡性的显着改变，该改变通过任何与基线相比的具体比率测量。就此而言，某些具体例中，使用本发明的CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂进行治疗，导致任何上述比率的改变不超过0.5、0.25、0.20、0.15、0.10或0.05，优选不超过0.05。

本文所揭示的多种方法中，优选该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂的给药不再所治疗受验者体内造成与所研究药物相关的二级或更高、或三级或更高的不良事件。就此而言，用于测量并评级与使用化合物治疗受试者相关的生理学事件，而经评级的不良事件列表可在通过引用而并入本文的http://evs.nci.nih.gov/ftpl/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_8.5xl l.pdf中找到。

此外，本文所揭示的多种方法中，优选该CNP变体肽或包含该CNP变体肽的组合物或制剂的给药不导致一种或多种下述生理学参数的临床上显着的改变(与基线相比或增加或减少)：血液血红蛋白浓度、血小板数、血液电解质浓度、血尿素氮浓度、血液肌酸酐浓度、血液碱性磷酸酶浓度、血液丙氨酸氨基转移酶浓度或血液天冬氨酸氨基转移酶浓度。“临床上显着的改变”意为，所观察到的造成该受试者整体健康的可检测/可观察的负面生理学改变的一种或多种上述参数的改变。

CNP变体肽的医药组合物和制剂

在其它具体例中，本揭示內容关注包含CNP变体肽以及一种或多种药学可接受的赋形剂、载体及/或稀释剂的医药组合物和制剂的用途。某些具体例中，该组合物进一步包含一种或多种生物活性剂(如，蛋白酶的抑制剂、酪氨酸激酶、及/或清除受体NPR-C)。

赋形剂、载体和稀释剂的非限制性实例包括运载剂、液体、缓冲剂、等渗剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、润湿剂、佐剂等。该组合物可含有液体(如，水、乙醇)；多种缓冲成分的稀释剂(如，Tris-HCl、磷酸盐、醋酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂)、pH和离子强度；洗涤剂和增溶剂(如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；抗氧化剂(如，蛋氨酸、抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)；防腐剂(如，Thimerosol、苯甲醇、间甲酚)；以及填充物质(如，乳糖、甘露醇、蔗糖)。赋形剂、稀释剂和载体在医药组合物制剂中的使用是该领域已知的，如，见通过引用而以其整体并入本文的《雷明顿药物科学(第十八版)》(Remington'sPharmaceutical sciences,18^th Edition,pages 1435-1712,Mack Publishing Co.(Easton,Pennsylvania(1990)))。

例如，载体包括而不限于，稀释剂、运载剂和佐剂，以及移植载体、和不与该活性成分反应的惰性的非毒性固体或液体填料和封装材料。载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水、及乳液(如，水包油乳液)。载剂可以是含有例如乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油及其混合物的溶剂或分散介质。

一些具体例中，该组合物是液体制剂。某些具体例中，该制剂包含浓度范围在自约0.1mg/ml至约20mg/ml、或自约0.5mg/ml至约20mg/ml、或自约1mg/ml至约20mg/ml、或自约0.1mg/ml至约10mg/ml、或自约0.5mg/ml至约10mg/ml、或自约1mg/ml至约10mg/ml、或自约2mg/ml至约10mg/ml内、或约2mg/ml或约10mg/ml的CNP变体肽。其它具体例中，该制剂可以是冻干制剂，或者可以是预先从冻干制剂重建的液体制剂。

进一步的具体例中，该组合物包含缓冲溶液或缓冲剂，以将该含有CNP的溶液或悬浮液的pH维持在所希望的范围内。缓冲溶液的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水、及Hank缓冲盐水。缓冲剂包括而不此案有，醋酸钠、磷酸钠、一水合柠檬酸和二水合柠檬酸钠。亦可使用缓冲剂的混合物。某些具体例中，该缓冲剂是醋酸/醋酸盐或柠檬酸/柠檬酸盐。适用于组合物中的缓冲剂的量部分地取决于所使用的特定缓冲液和该溶液或悬浮液的所希望的pH。例如，醋酸盐是在pH 5时比在pH 6时更有效的pH缓冲液，因此，在pH 5的溶液中可使用比pH 6溶液中更少的醋酸盐。一些具体例中，该缓冲剂的浓度为约10mM±5mM。某些具体例中，组合物的pH为自约pH 3至约pH 7.5、或自约pH 3.5至约pH 7、或自约pH3.5至约pH 6.5、或自约pH 4至约pH 6、或自约pH 4至约pH 5、或未约pH 5.0±1.0、或未约pH 5.5±1.0。

其它具体例中，该组合物含有等渗剂，以使得该溶液或悬浮液等渗且更适用于注射。等渗剂的非限制性实例包括NaCl、海藻糖、甘露醇、右旋葡萄糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、木糖醇、和乙醇。某些具体例中，该等渗剂是海藻糖或甘露醇，其可单独使用或合用。某些具体例中，海藻糖或甘露醇的浓度为约160±20mM、或约140mM±20mM、或约120±20mM、或约100mM±20mM、或约80mM±20mM、或约60mM±20mM。

多种具体例中，该组合物可包含防腐剂。防腐剂包括，但不限于，间甲酚和苯甲醇。某些具体例中，该防腐剂的浓度为约0.4％±0.2％、或约1％±0.5％、或约1.5％±0.5％、或约2.0％±0.5％。本发明的某些具体例中，该组合物或制剂不含防腐剂。

多种具体例中，该组合物含有抗吸附剂(如，缓和CNP变体至玻璃或塑料的吸附)。抗吸附剂包括，但不限于，苯甲醇、聚山梨醇酯20、及聚山梨醇酯80。某些具体例中，该抗吸附剂的浓度为自约0.001％至约0.5％、或自约0.01％至约0.5％、或自约0.1％至约1％、或自约0.5％至约1％、或自约0.5％至约1.5％、或自约0.5％至约2％、或自约1％至约2％。

多种具体例中，该组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括甘油、丙三醇、硫代甘油、蛋氨酸、和抗坏血酸及其盐。一些具体例中，当该稳定剂是硫代甘油或抗坏血酸或其盐时，该稳定剂的浓度为自约0.1％至约1％。

多种具体例中，该组合物含有抗氧化剂。例示性抗氧化剂是而不限于抗坏血酸。某些具体例中，抗氧化剂与CNP变体肽的摩尔比为自约0.1:1至约15:1、或自约1:1至约15:1、或自约0.5:1至约10:1、或自约1:1至约10:1、或自约3:1至约10:1。

药学可接受的盐可用于该组合物中，包括而不限于，矿物酸盐(如，盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐)、有机酸的盐(如，醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐)、及胺类的盐(如，异丙胺、三甲胺、二环己基胺、二乙醇胺)。对药学可接受盐的深入探讨可在《雷明顿药物科学(第十八版)》(Remington's Pharmaceutical Sciences,18^thEdition,Mack Publishing Company,(Easton,Pennsylvania(1990)))中找到。

用于肠道外给药的制剂可制备为例如溶液或悬浮液、制备为适用于在注射前溶解或悬浮于液体介质中的固体形式、或制备为乳液。例如，可根据该领域中已知的技术使用适当的稀释剂、载体、溶剂(如，缓冲水性溶液、林格溶液、等渗氯化钠溶液)、分散剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂等配制为无菌的可注射溶液和悬浮液。此外，可使用无菌固化油、脂肪酯类、多元醇及/或其它非活性成分。作为进一步的实例，用于肠道外给药的制剂包括水性无菌可注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和令该制剂与预期接受者血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可含有悬浮剂和增稠剂。

例示性的含有CNP肽的制剂揭示于US 8,198,242和US 8,598,121中。预期使用pH范围为自约4至约6的CNP制剂。

多种具体例中，CNP变体肽可配置于药学载体中，用于给药至受到骨骼发育不良影响的受试者。一些具体例中，根据下述成分及其量或浓度，配制CNP变体肽的液体制剂：

包含CNP变体肽的组合物亦可为冻干制剂。某些具体例中，该冻干制剂包含缓冲和填充剂，以及视需要的抗氧化剂。例示性缓冲剂包括而不限于醋酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。例示性填充剂包括而不限于甘露醇、蔗糖、右旋葡萄糖、乳糖、海藻糖、和聚维酮(PVPK24)。某些具体例中，甘露醇及/或海藻糖的量为自约3％至约10％、或自约4％至约8％、或自约4％至约6％。某些具体例中，蔗糖的量为自约6％至约20％、或自约6％至约15％、或自约8％至约12％。

多种具体例中，从根据下述成分及其量或浓度的任意组合配制的制剂制备CNP变体肽的冻干制剂：

多种具体例中，包含CNP变体肽的制剂的pH为约3至7、或约3至6、或约3.5至6.5、或约4至6、或约4至5、或约4.5至5.5。一些具体例中，对于pH 4至5.5，适当的缓冲剂是醋酸/醋酸盐(如，醋酸钠)；而对于pH 5.5至6，适当缓冲剂是柠檬酸/溟蒙酸盐。柠檬酸/柠檬酸盐(如，柠檬酸钠)也是pH 3至6或pH 4至6范围内的适用缓冲剂。某些具体例中，该制剂中缓冲剂的浓度为约2至50mM、或约2至40mM、或约2至30mM、或约5至30mM、或约2至20mM、或约5至20mM、或约5至15mM。

另外，为了最小化或避免CNP变体肽的脱酰胺基作用，可通过冻干从该制剂移除水。一些具体例中，冻干制剂含有下述成分的任意组合：缓冲剂：醋酸钠与醋酸、或柠檬酸钠与柠檬酸；等渗剂/填充剂：甘露醇(如，3至10％、2至8％或4至6％)、蔗糖(如，6至20％、5至15％或8至12％)；抗氧化剂：蛋氨酸及/或抗坏血酸，且各抗氧化剂与CNP变体肽的摩尔比为自约0.1:1至约1:1、或自约0.5:1至约5:1、或自约1:1至约15:1、或自约1:1至约10:1、或自约3:1至约10:1。

通过在较低温度如约5℃、0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、或-100℃储存CNP组合物(如，液体制剂或冻干制剂)，也可最小化或避免脱酰胺基作用。

为了最小化或避免CNP变体肽中可氧化残基(如，蛋氨酸)的氧化，该变体可与一种或多种抗氧化剂配伍。例示性抗氧化剂包括，但不限于，蛋氨酸、抗坏血酸、和硫代甘油。通过使用氮气或氩气从液体介质(如果是液体制剂)清除氧气，及/或通过使用氮气或氩气从容器或波状中清除氧气，也可最小化或防止例如蛋氨酸残基的氧化。

一些具体例中，为了最小化或防止吸附(如，CNP变体肽至塑料或玻璃的吸附)，将聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、或苯甲醇、或其组合加入CNP制剂中。某些具体例中，各抗吸附剂的浓度为自约0.001％至约0.5％、或自约0.01％至约0.5％、或自约0.1％至约1％、或自约0.5％至约1％、或自约0.5％至约1.5％、或自约0.5％至约2％、或自约1％至约2％。该制剂中抗吸附剂的例示性范围包括，但不限于，自约0.001％至约0.5％的聚山梨醇酯20、自约0.001％至约0.5％的聚山梨醇酯80、及/或自约0.5％至约1.5％的苯甲醇。

本揭示內容还提供试剂盒，该试剂盒含有，例如包含液体(如，无菌可注射)制剂或固体(如，冻干)制剂的瓶子、小瓶、安瓿、管、暗盒及/或注射器。该试剂盒亦可含有药学可接受的运载剂或载体(如，溶剂、溶液及/或缓冲液)，用于将固体(如，冻干)制剂重建为溶液或悬浮液进行给药(如，通过注射)，包括而不限于，将冻干制剂重建于注射器中用于注射或用于将浓缩液稀释至较低的浓度。再者，可从例如包含该含有CNP的组合物的无菌粉体、颗粒、或片剂制备临时注射溶液和悬浮液。该试剂盒亦可包括分散装置，如气溶胶或注射分散装置、注射笔、自动注射器、无针注射器、针筒及/或针。

给药剂量及频率

如本文中所使用，术语“治疗有效量”的活性剂(如，CNP变体肽)是指向患者提供治疗性益处的量。该量对于不同个体可变，且可取决于大量因素，包括该患者的整体身体状况。治疗有效量的CNP变体肽可由该领域技术人员使用可公开获得的材料和过程轻易地确定。例如，用于治疗性的CNP变体肽的量应给出基于患有软骨发育不全的0至17岁少儿(214位女性和189位男性)生长曲线图的可接受的生长速率，该生长曲线图列举了年龄别身高、头围、和体节生长(Horton WA et al.,Standard growth curves for achondroplasia,J.Pediatr.,93:435-8(1978))。可使用CDC曲线图来评估年龄别体重和年龄别升高或年龄别BMI。亦可测量事实上更为长期进程的次要指标。

对特定个体的给药频率可依据各种因素而变，该因素包括被治疗的病变和该个体的状况以及对该治疗的响应。某些具体例中，含有CNP变体肽的医药组合物给药至受试者的频率为约每天一次、每2天一次、每3天一次、或每周一次、每周两次、每周三次、每2周一次、每月一次。一种具体例中，对于骨相关病变(如，骨骼发育不良，包括软骨发育不全)的治疗，将每天或每周剂量的CNP变体肽给药至患者，直至及/或贯穿成人期。

某些具体例中，本文中揭示的CNP变体肽以自约5或10nmol/kg至约300nmol/kg、或自约20nmol/kg至约200nmol/kg范围内的剂量给药。一些具体例中，该CNP变体肽以约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的剂量或主治医生认为适宜的其它剂量给药。其它具体例中，该CNP变体肽以约5、7.5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg/kg的剂量、或约1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/kg的剂量、或主治医生认为适宜的其它剂量给药。多种具体例中，该CNP变体肽以自约7.5至100μg/kg、或自约15至75μg/kg、或约15至30μg/kg、或约2.5μg/kg、7.5μg/kg、15.0μg/kg、30.0μg/kg或60.0μg/kg的剂量给药。可给家本文中揭示的投予频率/给药频率给药CNP变体肽剂量，包括，但不限于，每天一次、每周2或3次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次等。CNP变体肽的给药可在延长的时间段内出现，在一些情形下，持续一个月、3个月、6个月或更久。

对特定受试者投予/给药CNP变体肽的频率可依据多种因素而变，该因素包括被治疗的病变以及该受试者的状况和对该治疗的响应。每次投予时，该CNP变体肽可以单剂或多剂给药。某些具体例中，该CNP变体肽以单剂或多剂给药，每天一次、每两天一次、每3天一次、每周2次、每周3次、每周一次、每双周一次、每3周一次、每月一次、每6周一次、每2个月一次、每3个月一次，或如主治医生认为适宜的频率给药。

一些具体例中，给药CNP变体肽，以至形成生长期(如，软骨形成)，之后为恢复期(如，骨生成)。例如，该CNP变体肽可以静脉给药、皮下给药、关节内给药或通过其它模式给药，每天给药一次或每周给药多次，持续一段时间，之后一段时间内不做任何治疗，随后重复该循环。一些具体例中，初始治疗期(如，每天一次或每周多次给药该CNP变体肽)为3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。相关具体例中，不做任何处理期持续3天、1周、2周、3周或4周。某些具体例中，该CNP变体肽的剂量方案是每天给药一次，持续3天，之后停止3天；或每天给药一次或每周给药多次，持续1周，之后停止3天或1周；或每天给药一次或每周给药多次，持续2周，之后停止1或2周；或每天给药一次或每周给药多次，持续3周，之后停止1、2或3周；或每天给药一次或每周给药多次，持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，之后停止1、2、3或4周。

给药模式

该CNP变体肽、或包含该CNP变体肽的医药组合物或制剂可以各种途径给药，如，通过皮下注射、关节内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔内注射、肌肉注射、皮内注射、或鞘内注射而给药至受试者。一种具体例中，该CNP变体肽单独通过皮下注射、关节内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔内注射、肌肉注射、皮内注射或鞘内注射给药，给药频率为每天一次、每两天一次、每三天一次、或每周一次。

该CNP变体肽亦可通过在疾病部位或邻近疾病部位处的直接注射而给药。再者，该CNP变体肽可通过将药舱植入靶标作用部位(如，不正常的或退化的关节或软骨区域)而给药。或者，该CNP变体肽可于舌头下进行舌下给药(如，舌下片)、或通过吸入至肺部而给药(如，吸入器或气溶胶喷雾)、通过输送至鼻腔而给药(如，鼻腔喷雾)、通过输送至眼部给药(如，滴眼液)、或通过透皮输送(如，通过贴在皮肤上的手段)。该CNP变体肽亦可以微球、微胶囊、脂质体(不带电或带电(如，阳离子脂质体))、聚合物微球(如，聚酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液等形式口服给药。

另外的给药方法是通过渗透泵(如，Alzet泵)或迷你泵(如，Alzet迷你渗透泵)给药，这一方法令CNP变体肽或医药组合物在预定的时间内被可控、连续及/或缓释输送。该渗透泵或迷你泵可植入至皮下、或邻近靶标部位(如，四肢的长骨、骨骺等)处。

该领域技术人员明显可知，该CNP变体肽或其组合物亦可通过其它模式给药。确定该CNP变体肽或其组合物的最有效的给药模式完全处于该领域技术人员的知识范围内。

从下述实施例将明确可知本揭示內容的其它方面和细节，这些实施例的目的为例示性说明而非限制。

实施例

实施例1.软骨发育不全患者的6个月人类临床试验数据

为了确定CNP变体肽对软骨发育不全患者体内骨骼发育不良症状如软骨发育不全、及长骨生长及/或生长速度(通过患者治疗后立高与治疗前相比的增长率测量)的效果，在5至14岁(含)的有软骨发育不全(ACH)记录的ACH儿童体内进行计量递增研究，该记录由临床理由提供并由基因测试证实。

在给药本文中揭示的包含CNP变体肽的制剂之前，以三个月的时间间隔，从未接受治疗的研究患者采集一系列生长测量值(多个不同的参数)和生长速度速率测量值(至少包括患者的立高)，以构建用于如上述生长速度和身体均衡性比率的基线水平。一旦获得用于生长速度和身体均衡性比率的基线水平，则将包含CNP变体肽(具体为Pro-Gly-CNP-37，SEQID NO:5)的制剂以日剂量皮下给药，剂量方案为下述日剂量之一：群体1(n＝8)，日剂量为2.5μg/kg的Pro-Gly-CNP-37肽；群体2(n＝8)，日剂量为7.5μg/kg的Pro-Gly-CNP-37肽；群体3(n＝10)，日剂量为15.0μg/kg的Pro-Gly-CNP-37肽。每天皮下给药，持续给药6个月。

更具体而言，将Pro-Gly-CNP-37肽配制为包含2.0mg/ml或10mg/ml的CNP肽与0.28mg/ml的一水合柠檬酸、1.08mg/ml的二水合柠檬酸钠、58.01mg/ml的二水合海藻糖、15mg/ml的D-甘露醇、0.73mg/ml的L-蛋氨酸和0.05mg/ml的聚山梨醇酯80组合的无菌、无防腐剂、pH 5.5的组合物。这一液体组合物是从包含上述组分的原始冻干制剂重建的，且提供于无菌的一次性I型未处理硼硅酸盐透明玻璃小管中。在本文中揭示的所有人类临床治疗中采用这一重建的液体制剂。

在该CNP变体肽的给药进程中，进行各种评估，包括体重；骨长度和骨生长的测量，包括计算上臂长与前臂长之比、大腿长与小腿长之比、以及上身长与下身长之比。通过测量患者的立高，并将该术语与先前获得的基线生长速度速率比较，从而计算生长速度的测量值。在该CNP变体肽的第一次给药后大约第15、22、29、43、85、127和183天，进行该评估。

探索性成像评估数据包括脊柱、长骨和四肢的测量值和形态，以及对生长板、骨龄、及骨矿物密度的测量。试验包括骨盆的前后(AP)x射线检验，用于基线管关节评估；左手和腕部的后前(PA)放射线摄片，以评估骨龄(Greulich,1971,Stanford UniversityPress.；Tanner,1975,Academic Press.)、生长板、手长、及皮质厚度；AP下肢放射线摄片，以评估生长板、胫骨长、皮质厚度、及弯腰；腰椎的AP放射线摄片，以评估横向椎弓根间距。实施用来评估胸腰椎前凸角、脊椎形态、以及其它与椎管狭窄相关的潜在改变的腰椎侧向放射线摄片，用来评估骨矿物密度、生长板形态、和骨长的前臂及胫骨QCT扫描。可使用标准CT扫描仪、校准体模、及指定软件，使用预设的避免直接辐射头部和躯干的低辐射剂量方案获取这一扫描。

睡眠研究：已经多次发现，童年期未治疗的睡眠呼吸暂停与极差的功能性和健康结果相关，包括对儿童发育的某些方面如行为和学习的负面影响。被报导与睡眠呼吸暂停有关的儿童认知缺陷包括学习能力、记忆能力、和视觉-空间技能；语言功能、言语流畅性、在校表现和执行能力。此外，已经发现，小儿睡眠障碍性呼吸与下列有关：生长畸形；心脏健康的改变，包括收缩压和舒张压、自发调节、脑氧合作用、及脑血流量的改变，暗示儿童期阻塞性睡眠呼吸暂停症状可能长期危及心血管健康；以及炎症的全身性标记物(Marcus,2012,Pediatrics)。通过在整夜监控过程中测量血氧饱和度、脉搏率、和气流，使用睡眠测试装置来评估睡眠障碍性呼吸的存在和严重性。睡眠呼吸暂停的评估包括，但不限于，确定每小时的呼吸暂停和呼吸不足的发作次数(Apnea/Hypopnea Index,AHI)。

使用测角仪进行肘关节活动范围的屈伸测量。

通过相对于基线的变化评估生物标记物，该评估包括，但不限于，软骨周转(CTX-II)、软骨细胞和成骨细胞活性(骨特异性碱性磷酸酶)、骨形成(P1NP)、骨周转(骨钙素)、和CNP生物活性的标记物(cGMP、NT-proCNP、及ANP)以及其它生物标记物的评估。在指定时间点采集用于胶原和骨周转的血液和尿液生化标记物的样品、以及用于CNP活性标记物的样品。

结果：通过测量治疗过程中的立高相对于治疗前所测的基线生长速度速率的改变，测量群体1(2.5μg/kg/天)、群体2(7.5μg/kg/天)和群体3(15μg/kg/天)中总计26位患者的作为使用CNP变体肽Pro-Gly-CNP-37治疗结果的生长速度变化。在6个月研究其内立高生长速度的平均变化总结在表1中。如表1中所示，在使用2.5μg/kg/天的Pro-Gly-CNP-37治疗6个月(群体1)的软骨发育不全患者中未观察到生长速度的显着增长。但与群体1中的患者形成对照，使用7.5μg/kg/天的Pro-Gly-CNP-37治疗6个月(群体2)的软骨发育不全患者显示统计学显着的立高生长速度(与先前计算的他们的基线立高生长速度速率相比)增长(p值为0.04)。更具体而言，群体2中的患者显示立高生长速度平均增长1.3cm/年，这表示相对于基线的年化生长速度增长45％。最终，使用15μg/kg/天的Pro-Gly-CNP-37治疗6个月的软骨发育不全患者(群体3)也显示统计学显着的立高生长速度(与先前计算的他们的基线立高生长速度速率相比)增长(p值为0.01)。更具体而言，群体3中的患者显示立高生长速度平均增长2.0cm/年，这表示相对于基线的年化生长速度增长50％。这些数据表明，每天皮下给药至少7.5μg/kg的CNP变体肽治疗软骨发育不全，持续时间为6个月或更久，对骨生长、生长速度、及对软骨发育不全症状的一般性治疗产生有益效果。

表1

身体均衡性：计算所有群体中全部患者在使用该CNP变体肽治疗前(基线)、和治疗过程中的身体均衡性比(上身长与下身长之比、上臂长与前臂长之比、和大腿长与小腿[膝盖至足]长之比)。

对于群体1，平均基线上身长与下身长之比、平均基线上臂长与前臂长之比、以及平均基线大腿长与小腿长之比分别为2.09、1.13和0.67。使用2.5μg/kg的该CNP变体肽进行6个月的每天皮下给药治疗后，所测定的相同身体比例分别为2.07、1.11和0.67，表示那些相同身体比例的平均改变分别为-0.02、-0.02和0.0。

对于群体2，平均基线上身长与下身长之比、平均基线上臂长与前臂长之比、以及平均基线大腿长与小腿长之比分别为2.03、1.14和0.66。使用7.5μg/kg的该CNP变体肽进行6个月的每天皮下给药治疗后，所测定的相同身体比例分别为2.03、1.14和0.66，表示那些相同身体比例的平均改变分别为0.0、0.0和0.0。

对于群体3，平均基线上身长与下身长之比、平均基线上臂长与前臂长之比、以及平均基线大腿长与小腿长之比分别为1.91、1.13和0.69。使用15μg/kg的该CNP变体肽进行6个月的每天皮下给药治疗后，所测定的相同身体比例分别为1.89、1.08和0.69，表示那些相同身体比例的平均改变分别为-0.02、-0.05和0.0。

这些数据表明，使用CNP变体肽治疗软骨发育不全患者，对整体身体均衡性没有显着的负面效果，在使用CNP变体肽治疗6个月后，所测量的相对于基线的身体均衡性比的改变全部落入-0.05与0.05之间的范围内。

不利事件：定期评估上述各群体中的所有患者在治疗进程中是否存在明确由使用该CNP变体肽治疗而造成的不利事件(如http://evs.nci.nih.gov/ftpl/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_8.5xl l.pdf所定义)。没有证据显示3个研究群体的任何患者存在被确定为与该研究药物相关的二级或更高级的不利事件，表明使用CNP变体肽治疗软骨发育不全患者并未导致严重的生理学不利事件。

此外，定期监控每一研究群体中所有患者的血液血红蛋白浓度、血小板数、血液电解质浓度、血尿素氮浓度、血液肌酸酐浓度、血液碱性磷酸酶浓度、血液丙氨酸氨基转移酶浓度、和血液天冬氨酸氨基转移酶浓度。从三个研究群体中各自获得的数据表明，未观察到上述安全性标志物的临床显着变化，再次证实了对软骨发育不全及相关症状进行CNP变体肽疗法的基本安全性。

实施例2.软骨发育不全的12个月人类临床试验数据(群体3)

在第一个6个月的临床试验治疗和评估期后，来自上述实施例1中揭示的群体3的10位软骨发育不全患者继续进行另外6个月的每天皮下给药15μg/ml的Pro-Gly-CNP-37的临床方案(总计12个月)。在额外的6个月治疗期内，进行多种评估，包括体重的评估，骨长和骨生长的评估，包括计算上臂长与前臂长之比、大腿长与小腿长之比、以及上身长与下身长之比。还通过测量该患者的立高而计算生长速度测量值，并将该数据与先前获得的基线生长速度速率比较。

结果：通过测量治疗过程中的立高相对于治疗前所测的基线生长速度速率的改变，测量群体3(15μg/kg/天)中总计10位患者的作为使用CNP变体肽Pro-Gly-CNP-37治疗12个月的结果的生长速度变化。从这一持续12月的研究中获得的数据表明，使用15μg/kg/天的Pro-Gly-CNP-37治疗12个月的软骨发育不全患者(群体3)显示了统计学显着的立高生长速度(与先前计算的他们的基线立高生长速度速率相比)增长(p值为0.017)。更具体而言，群体3中的患者显示立高生长速度增长1.9cm/年，这表示相对于基线的年化生长速度增长超过47％。这些数据表明，每天皮下给药至少15μg/kg的CNP变体肽治疗软骨发育不全，持续时间为12个月或更久，对骨生长、生长速度、及对软骨发育不全症状的一般性治疗产生有益效果。

身体均衡性：计算群体3中10位患者在使用该CNP变体肽治疗前(基线)、和治疗过程中的身体均衡性比(上身长与下身长之比、上臂长与前臂长之比、和大腿长与小腿[膝盖至足]长之比)。

对于群体3，平均基线上身长与下身长之比、平均基线上臂长与前臂长之比、以及平均基线大腿长与小腿长之比分别为1.91、1.13和0.69。使用15μg/kg的该CNP变体肽进行6个月的每天皮下给药治疗后，所测定的相同身体比例分别为1.88、1.16和0.69，表示那些相同身体比例的平均改变分别为-0.03、0.03和0.0。

这些数据表明，使用CNP变体肽治疗软骨发育不全患者，对整体身体均衡性没有显着的负面效果，在使用CNP变体肽治疗12个月后，所测量的相对于基线的身体均衡性比的改变全部落入-0.05与0.05之间的范围内。

不利事件：定期评估群体3中的所有患者在治疗进程中是否存在明确由使用该CNP变体肽治疗而造成的不利事件(如http://evs.nci.nih.gov/ftpl/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_8.5xl l.pdf所定义)。没有证据显示群体3中患者存在被确定为与该研究药物相关的二级或更高级的不利事件，表明使用CNP变体肽治疗软骨发育不全患者并未导致严重的生理学不利事件。

此外，定期监控群体3中所有患者的血液血红蛋白浓度、血小板数、血液电解质浓度、血尿素氮浓度、血液肌酸酐浓度、血液碱性磷酸酶浓度、血液丙氨酸氨基转移酶浓度和血液天冬氨酸氨基转移酶浓度。从本研究获得的资料表明，未观察到任何上述安全性标志物的临床显着变化，再次证实了对软骨发育不全及相关症状进行CNP变体肽疗法的基本安全性。

基于上述人类临床数据，也如上文所述测试将Pro-Gly-CNP-37以30μg/kg/天和60μg/kg/天的日剂量皮下给药至人类软骨发育不全患者的效能和安全性。基于本文揭露的数据，完全可预期，此类给药方案将对人类软骨发育不全的患者提供有效且安全的治疗。

该领域技术人员根据本文中揭示的具体例和例示性实施例中的细节对本揭示內容做出多种修改和变更。因此，本揭示內容仅应受限于所附权利要求书中出现的此类限制。

序列表

<110> 生物马林药物股份有限公司(BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC.)

<120> C型利尿钠肽变体在治疗骨骼发育不良中的用途

<130> 30610/49788

<150> US-62/199,081

<151> 2015-07-30

<150> US-62/320,704

<151> 2016-04-11

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly

1 5 10 15

Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 2

<211> 38

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

20 25 30

Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Pro Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

20 25 30

Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

20 25 30

Asn Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 5

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys

1 5 10 15

Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly

20 25 30

Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys

1 5 10 15

Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly

20 25 30

Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

<210> 7

<211> 38

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser

20 25 30

Met Ser Gly Leu Gly Cys

35

Claims

1.一种制剂，包含：

(a)包括以下氨基酸序列的具有37至40个氨基酸的CNP变体肽：

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:8)；及

(b)一水合柠檬酸、二水合柠檬酸钠、二水合海藻糖、D-甘露醇、L-蛋氨酸和聚山梨醇酯80，其中，

(i)所述制剂是冻干的；

(ii)所述制剂是是液体形式；或

(iii)所述制剂是从冻干制剂再造的。

2.如权利要求1所述的制剂，其包含

(a)至少2.0mg/ml的所述CNP肽变体；

(b)至少10.0mg/ml的所述CNP肽变体；或

(c)10.0mg/ml的所述CNP肽变体。

3.如权利要求2所述的制剂，其中，所述一水合柠檬酸以自0.15mg/ml至0.40mg/ml的浓度存在，所述二水合柠檬酸钠以自0.5mg/ml至1.5mg/ml的浓度存在，所述二水合海藻糖以自30mg/ml至70mg/ml的浓度存在，所述D-甘露糖以自10mg/ml至20mg/ml的浓度存在，所述L-蛋氨酸以自0.5mg/ml至1.5mg/ml的浓度存在，以及，所述聚山梨醇酯80以自0.01mg/ml至0.1mg/ml的浓度存在。

4.如权利要求2所述的制剂，其中，所述一水合柠檬酸以0.28mg/ml的浓度存在，所述二水合柠檬酸钠以1.08mg/ml的浓度存在，所述二水合海藻糖以58.01mg/ml的浓度存在，所述D-甘露醇以15mg/ml的浓度存在，所述L-蛋氨酸以0.73mg/ml的浓度存在，以及，所述聚山梨醇酯80以0.05mg/ml的浓度存在。

5.如权利要求1所述的制剂，其

(a)不含防腐剂；

(b)包含在硼硅酸盐玻璃小瓶内；或

(c)具有5.0与6.0之间的pH。

6.如权利要求1所述的制剂，其

(a)不含防腐剂；

(b)包含在硼硅酸盐玻璃小瓶内；或

(c)具有5.5的pH。

7.如权利要求1所述的制剂，其中所述CNP肽变体进一步包括亲水性聚合物。

8.如权利要求7所述的制剂，其中所述亲水性聚合物为聚乙二醇(PEG)。

9.如权利要求7所述的制剂，其中所述亲水性聚合物在选自下列所组成的组接合所述CNP肽变体：(1)仅在N端；(2)仅在C端；(3)仅在内部位置；(4)在N端和C端两者；(5)在N端和内部位置；及(6)在C端和内部位置。

10.如权利要求9所述的制剂，其中所述CNP肽变体以所述肽的内部赖氨酸(Lys)残基接合所述亲水性聚合物。

11.如权利要求7所述的制剂，其中所述CNP肽变体经由链结基接合所述亲水性聚合物。

12.一种如权利要求1至11中任一项所述的制剂于制备治疗骨骼发育不良的药剂的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其中，所述CNP肽变体是以提供每天至少7.5μg/kg；每天至少15.0μg/kg；每天至少30.0μg/kg；或每天至少60.0μg/kg的剂量存在。