CN117881416A

CN117881416A - 用于治疗儿童的骨骼发育不良的c型利钠肽变体

Info

Publication number: CN117881416A
Application number: CN202280048709.1A
Authority: CN
Inventors: J·戴; E·菲仕乐瓦
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Current assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2022-07-11
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本公开提供了C型利钠肽(CNP)变体用于治疗儿童骨骼发育不良并且改善骨骼发育不良的一种或多种症状的用途，如长骨生长或生长速度，以及在具有骨骼发育不良和/或CNP相关症状或组分的其它病症中的用途。

Description

用于治疗儿童的骨骼发育不良的C型利钠肽变体

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年7月9日提交的美国临时专利申请第63/220,275号和于2022年6月8日提交的美国临时专利申请第63/350,196号的优先权权益，所述美国临时专利申请特此通过引用整体并入。

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技术领域

本公开总体上涉及C型利钠肽(CNP)变体用于治疗儿童的骨骼发育不良的用途。

背景技术

利钠肽家族由三种结构相关的肽组成：心房利钠肽(ANP)(基因库登录号NP_006163，针对ANP前体蛋白NPPA)、脑利钠肽(BNP)(基因库登录号NP_002512，针对BNP前体蛋白NPPB)和C型利钠肽(CNP)(《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》，168：863-870(1990)(基因库登录号NP_077720，针对CNP前体蛋白NPPC)(《高血压杂志(J.Hypertens.)》，10：907-912(1992))。这些小单链肽(ANP、BNP、CNP)具有17-氨基酸环结构(Levin等人，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》，339：863-870(1998))，并且在多种生物过程中具有重要作用。ANP和BNP与利钠肽受体A(NPR-A)结合并且活化所述NPR-A，也称为鸟苷酸环化酶A(GC-A)，引起胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平升高。同样，CNP与NPR-B(GC-B)相互作用以刺激cGMP的产生(《高血压杂志》，10：1111-1114(1992))。第三种类型的受体NPR-C以高亲和力与利钠肽中的每种利钠肽结合，并且主要功能是从胞外室捕获肽并将肽沉积到溶酶体中，所述肽在所述酶体中被降解(《科学(Science)》，238：675-678(1987))。ANP和BNP主要在心脏的肌肉细胞内产生，并且被认为在心血管稳态中具有重要作用(《科学》，252：120-123(1991))。CNP表达更广泛，包含中枢神经系统、生殖道、骨骼和血管内皮(《高血压(Hypertension)》，49：419-426(2007))。

在人中，CNP最初由利钠肽前体C(NPPC)基因作为单链126-氨基酸前体多肽原产生(《生物化学与生物物理研究通讯》，168：863-870(1990))。去除信号肽产生pro-CNP，并且通过内切蛋白酶弗林蛋白酶进一步切割产生活性的53-氨基酸肽(CNP-53)，其被分泌并再次切割产生成熟的22-氨基酸肽(CNP-22)(Wu，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》278：25847-852(2003))。CNP-53和CNP-22的分布不同，其中CNP-53主要存在于组织中，而CNP-22主要可见于血浆和脑脊液中(J.Alfonzo，《受体和信号转导研究杂志(Recept.Signal.Transduct.Res.)》，26：269-297(2006))。软骨中主要的CNP形式未知。CNP-53和CNP-22都与NPR-B类似地结合。此外，它们都以剂量依赖且类似的方式诱导cGMP产生(VT Yeung，《肽(Peptides)》，17：101-106(1996))。

先前已经描述了天然CNP基因和多肽。美国专利第5，352,770号公开了从猪脑中分离和纯化的与人CNP序列相同的CNP-22以及其在治疗心血管适应症中的用途。美国专利第6,034,231号公开了人proCNP基因和多肽(126个氨基酸)和人CNP-53基因和多肽。

CNP通过膜结合中性内肽酶(NEP)的作用并且通过NPR-C从胞外空间清除，所述NEP快速地降解CNP(《生化杂志(Biochem.J.)》，291(Pt 1)：83-88(1993))，所述NPR-C与CNP结合，并且将其沉积到溶酶体中，其中CNP被降解。已示出CNP在正常人体内的半衰期为2.6分钟(《临床内分泌与代谢杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)》，78：1428-35(1994))。CNP的低血浆浓度(《骨与矿物质研究杂志(J.Bone Moner.Res.)》，19(增刊1)S20(2004))以及其在许多组织中与NPR-B的共表达表明CNP主要通过自分泌/旁分泌机制发挥作用。

如上所述，CNP与利钠肽受体B(NPR-B)结合并且活化所述NPR-B，也称为鸟苷酸环化酶B(GC-B)，引起胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平升高。由cGMP产生介导的下游信号传导影响多种生物过程，包含软骨内骨化。因此，此途径中组分中的任何组分水平升高或降低都可能导致骨或软骨生长异常。例如，在小鼠模型中敲除CNP或NPR-B会导致动物具有侏儒表型，其中长骨和椎骨较短。阻断适当的CNP信号传导的人NPR-B突变已被鉴定并且导致侏儒症(Olney等人，《临床内分泌与代谢杂志》91(4)：1229-1232(2006)；Bartels等人，《美国人类遗传学杂志(Am.J.Hum.Genet.)》75：27-34(2004))。相比之下，被工程化成产生水平升高的CNP的小鼠表现出长的长骨和椎骨。

软骨发育不全是成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)基因中常染色体显性突变的结果，导致软骨形成异常。FGFR-3通常对软骨细胞生长以及因此骨生长具有负调节作用。在软骨发育不全中，FGFR-3的突变形式具有持续活性，这导致骨严重缩短。软骨细胞增殖和分化似乎都受到干扰，导致生长板软骨非常短(P.Krejci等人，《细胞科学杂志(J.CellSci.)》118：5089-5100(2005))。软骨内骨化是控制纵向长骨生长的过程。生长板有四个区域——静止区、增殖区、肥大区和钙化区。在生长板中，增殖细胞表达NPR-B，而肥大细胞表达NPR-C(Yamashite等人，《生化杂志》127：177-179(2000))。在正常的软骨内骨生长中，软骨细胞排列成柱并且在生长板的增殖区增殖。软骨发育不全患者的这些柱是紊乱的。另外，肥大区是细胞变大并且最终凋亡(裂解)的地方，导致骨细胞侵入和矿化。软骨发育不全患者的肥大软骨细胞和区域的总体大小比正常患者的肥大软骨细胞和区域的总体大小要小得多。CNP是NPR-B(一种软骨细胞和骨生长的正调节剂)的激动剂。CNP/NPR-B的下游信号传导在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)水平下抑制FGFR-3通路。MAPK的抑制促进生长板的增殖区和肥大区软骨细胞的增殖和分化，从而引起骨生长。

在人中，激活FGFR-3的突变是遗传性侏儒症的主要原因。FGFR-3激活的小鼠作为软骨发育不全(骨骼发育不良最常见的形式)的模型，并且CNP的过度表达会使这些动物免于侏儒症。因此，CNP和CNP的功能变体是用于治疗各种骨骼发育不良的潜在疗法。

CNP的治疗用途目前因其血浆半衰期短而受到限制，已示出在人体体内的血浆半衰期仅为2.6分钟(Hunt等人，《临床内分泌与代谢杂志》，78：1428-35(1994))。为了将CNP浓度增加到人血浆中通常存在的固有水平(约5pM)以上，在所有使用全身施用CNP的人和动物研究中，需要连续输注。将人血浆中CNP半衰期缩短的两种机制是通过中性内肽酶(NEP)降解和通过利钠肽受体C(NPR-C)清除(Olney，《生长激素和IGF研究(Growth Horm.&IGFRes.)》，16：S6-S14(2006))。具有更长的体内血清半衰期并且表现出与野生型CNP类似或改进的活性的CNP变体对于可持续的治疗策略是重要的。

各种CNP类似物和衍生物的生物活性已得到评估。参见例如，美国专利7,276,481、PCT公开第WO 94/20534号，其公开了CNP-22和ANP的5-氨基酸C末端的嵌合体，指定为血管钠肽(VNP)。美国专利8,198,242、8,598,121、9,907,834和10,646,550公开了CNP变体用于治疗如软骨发育不全等骨骼发育不良的用途。美国专利7,642,243和8,658,373描述了CNP-22或CNP-53的变体用于治疗关节炎的用途。

发明内容

本公开涉及当CNP变体肽以高于某种剂量的量和/或在如本文所描述的某种药物施用方案下施用时，CNP变体肽用于治疗儿童的骨骼发育不良，例如介于2岁与5岁之间的儿童，特别是小于或约2岁的儿童；用于治疗一种或多种骨骼发育不良相关的症状；或用于改善患有骨骼发育不良的受试者的一种或多种后果或生理症状的用途。本文公开了施用CNP变体肽可以改善软骨发育不全受试者的生长速度。

在各个实施例中，本公开提供了一种治疗约2岁至约5岁受试者的骨骼发育不良的方法，所述方法包括以有效治疗所述受试者的所述骨骼发育不良或改善所述骨骼发育不良的至少一种症状或生理后果的量向所述受试者施用包括C型利钠肽(CNP)变体的组合物，其中所述CNP变体选自由本文所公开的CNP变体组成的组。

在各个实施例中，本公开提供了一种治疗小于或约2岁受试者的骨骼发育不良的方法，所述方法包括以有效治疗所述受试者的所述骨骼发育不良或改善所述骨骼发育不良的至少一种症状或生理后果的量向所述受试者施用包括C型利钠肽(CNP)变体的组合物，其中所述CNP变体选自由本文所公开的CNP变体组成的组。

在各个实施例中，所述组合物以30μg/kg的剂量施用。在各个实施例中，所述受试者为约6月龄至约2岁。在各个实施例中，所述受试者为0至约6月龄。在各个实施例中，所述受试者为约3至约6月龄。在各个实施例中，所述受试者为0至约3月龄。在各个实施例中，如果受试者在小于约2岁时开始治疗，则当受试者年满2岁时，剂量可以减少到15μg/kg。

在一个实施例中，治疗是改善骨骼发育不良的一种或多种症状，所述改善选自由以下组成的组：绝对生长增加、生长速度改善或增加，QCT骨矿物质密度(BMD)增加、生长板形态改善、长骨生长增加、脊柱形态改善、肘关节活动范围改善或增加以及睡眠呼吸暂停减少。

在一个实施例中，所述骨骼发育不良选自由以下组成的组：软骨发育不全、软骨发育不良、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性骨发育不全、成骨不全、软骨成长不全、点状软骨发育不良、纯合软骨发育不全、短指发育不良、先天致死型低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋骨多指综合征、软骨发育不良、肢根型点状软骨发育不良、詹森型干骺端发育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia)、先天性椎体骨骺结构不良、骨发育不全症、畸型发育不良、先天性股骨短、兰格型肢中骨发育不良(Langer-type mesomelicdysplasia)、尼弗哥特型肢中骨发育不良(Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、罗宾诺综合征(Robinow syndrome)、莱因哈特综合症(Reinhardt syndrome)、肢端发育不全、周围性骨发育不全、克尼斯特发育不良(Kniest dysplasia)、纤维软骨增生症、罗伯茨综合症(Roberts syndrome)、肢端肢中发育不全、小肢、莫基奥综合征(Morquio syndrome)、克尼斯特综合征(Kniest syndrome)、后生发育不良、脊椎干骺端发育不良、NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征(Turner′s syndrome)/莱-韦二氏(Leri Weill))、PTPN11突变(努南综合症(Noonan′s syndrome))和特发性身材矮小。在一个实施例中，所述骨骼发育不良是软骨发育不全。

还提供了一种增加小于或约2岁受试者的长骨生长的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包括CNP变体肽的组合物，其中所述施用增加长骨生长。还提供了一种增加约2岁至约5岁受试者的长骨生长的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包括CNP变体肽的组合物，其中所述施用增加长骨生长。在一个实施例中，受试者患有软骨发育不全。

本公开还考虑了一种增强或增加小于或约2岁受试者的生长的速度(即，生长速度)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包括CNP变体肽的组合物，其中所述施用增强或增加受试者的生长速度。还提供了一种增强或增加约2岁至约5岁受试者的生长的速度(即，生长速度)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包括CNP变体肽的组合物，其中所述施用增强或增加受试者的生长速度。在一个实施例中，受试者患有软骨发育不全。在各个实施例中，生长速度的增强或增加是受试者的年化生长速度相对于基线在25％-50％的变化范围内的增加。在一个实施例中，生长速度的增强或增加是受试者的年化生长速度相对于基线至少约25％，更优选地至少约40％的增加。

经考虑生长速度的增强可以是通过测量站立高度、坐高、体重、头围、上臂长度、下臂长度、大腿长度、小腿长度、手长和/或脚长来评估的。

在本文所描述的各种方法和组合物中，CNP变体肽选自由以下组成的组：

在各个实施例中，CNP变体肽选自由以下组成的组：

在本文所描述的各种方法中，所施用的CNP变体肽的量的范围为约15μg/kg至约100μg/kg，优选地约15μg/kg至约60μg/kg，更优选地约30μg/kg至约60μg/kg。在各个实施例中，所施用的CNP变体肽的量为至少约15μg/kg或至少约30μg/kg。

在本文所描述的各种方法中，CNP变体肽或包括其的组合物或制剂皮下或肠胃外施用，优选地皮下施用。还经考虑CNP变体肽通过其它途径施用。示例性施用途径包含但不限于皮下、关节内、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮内、鞘内、腹膜内、肌内、皮内、鞘内、局部、经皮或经粘膜施用。

在本文所描述的各种方法中，CNP变体肽或包括其的组合物或制剂以单次治疗或多剂量施用于受试者。多剂量可以每天施用一次，或者在治疗过程中以多剂量施用。在各个实施例中，经考虑CNP变体肽或包括其的组合物或制剂以单剂量或多剂量、每天、每隔一天、每3天、每周2次、每周3次、每周、每两周、每3周、每月、每6周、每2个月、每3个月或主治医生认为合适的其它时间施用。在特别优选的实施例中，将CNP变体肽或包括其的组合物或制剂每天一次施用于受试者，持续至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月或更长时间的时间段。

在本文所描述的方法的某些实施例中，调整CNP变体肽或包括其的组合物或制剂的施用以用于预防性或治疗性治疗时间段，随后是恢复时间段。例如，CNP变体肽或包括其的组合物或制剂可以每天或每周多次关节内、皮下、静脉内或通过另一方式施用一段时间，随后一段时间不治疗，然后重复所述循环。在一些实施例中，初始治疗时间段(例如，每天或每周多次施用CNP变体肽)为3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在相关实施例中，不治疗的时间段持续3天、1周、2周、3周或4周。在某些实施例中，CNP变体肽的给药方案是每天，持续3天，随后停药3天；或者每天或每周多次，持续1周，随后停药3天或1周；或者每天或每周多次，持续2周，随后停药1或2周；或者每天或每周多次，持续3周，随后停药1、2或3周；或者每天或每周多次，持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，随后停药1、2、3或4周。

在本文所描述的各种方法中，优选的是CNP变体肽或包括其的组合物或制剂的施用不会在受试者中引起或导致被评定为二级或更高级的不良事件。在本文所描述的方法的其它实施例中，CNP变体肽或包括其的组合物或制剂的施用不引起所述受试者的血液血红蛋白浓度、血小板数、血液电解质浓度、血液尿素氮浓度、血液肌酐浓度、血液碱性磷酸酶浓度、血液丙氨酸氨基转移酶浓度和/或血液天冬氨酸氨基转移酶浓度在临床上的显著变化。

在本文所描述的各种方法中，在优选的实施例中，与基线(即，在CNP变体肽或包括其的组合物或制剂的施用之前)相比，CNP变体肽或包括其的组合物或制剂的施用引起(i)上身长度与下身长度比率；(ii)所述上臂长度与前臂长度比率或(iii)所述大腿长度与小腿长度比率变化介于约-0.25与约0.25、约-0.20与约0.20、约-0.15与约0.15、约-0.10与约0.10或约-0.05与约0.05之间。

在各个实施例中，本公开提供了包括CNP变体肽的组合物或制剂、或包括CNP变体肽的组合物或制剂在本文所描述的方法中用途。在一个实施例中，所述组合物或制剂进一步包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在某些实施例中，组合物由包括pH为约4至约6的柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂或乙酸/乙酸盐缓冲剂的液体或冻干制剂制备。在各个实施例中，pH为约5.5。

还考虑了一种如本文所描述的方法，所述方法进一步包括施用第二药剂。

在各个实施例中，本文所描述的方法和组合物或制剂中使用的CNP变体肽可以附接到疏水性酸，并且可以附接到一种或多种疏水性酸。疏水性酸的非限制性实例包含直链或支链、饱和或不饱和C5-C12羧酸(例如，戊酸、庚酸等)和天然脂肪酸。疏水性酸可以附接到一个或多个氨基酸残基的N末端、C末端和/或侧链。在一个实施例中，疏水性酸缀合到N末端。

在又另一个实施例中，本发明的方法和组合物中使用的CNP变体肽是嵌合体或融合蛋白，包括CNP变体肽和可切割的肽或蛋白质、或肽标签。示例性可切割的蛋白质或肽包含但不限于组氨酸(例如hexa-His)标签；TAF12：人转录因子TAF12；KSI：酮类固醇异构酶；MBP：麦芽糖结合蛋白；13-Gal：13-半乳糖苷酶；GST：谷胱甘肽-S-转移酶；Trx：硫氧还蛋白；CBD：几丁质结合域；BMPM：BMP-2突变、SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白、淀粉结合蛋白、内切葡聚糖酶A的纤维素结合结构域、外切葡聚糖酶Cex的纤维素结合域、生物素结合域、recA、Flag、c-Myc、poly(His)、poly(Arg)、poly(Asp)、poly(Gln)、poly(Phe)、poly(Cys)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、生物素、亲和素、链霉亲和素、抗体表位和其片段。

在各个实施例中，可用于所述方法的CNP变体肽可以是单体或二聚体。在相关实施例中，二聚体CNP变体肽的单体可以通过接头或不通过接头将N末端附接到N末端、通过接头或不通过接头将N末端附接到C末端、或通过接头或不通过接头将C末端附接到C末端。

在本文所公开的实施例中的任何实施例中，CNP变体肽可以具有与野生型CNP-22基本上相同或更佳的生物活性。例如，CNP变体肽可以保留野生型CNP-22的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的活性，或者可以具有比CNP-22更大的活性，例如在与NPR-B(GC-B)相互作用以刺激cGMP产生的方面。可替代地或另外，在调节软骨内骨生长和软骨细胞活性方面，包含但不限于软骨细胞增殖、软骨细胞分化、抑制丝裂原激活蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-1)激酶信号传导通路以及促进软骨内骨化，CNP变体肽可以保留野生型CNP-22的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的活性，或者可以具有比CNP-22更大的活性。在本文所描述的实施例中的任何实施例中，CNP变体肽可以包括与野生型CNP-22的氨基酸6-22或1-22具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大同一性或同源性的氨基酸序列。

在各个实施例中，CNP变体肽可以任选地具有缀合或延伸，例如在N末端和/或C末端处，以促进软骨靶向、减少肾清除、和/或增加对NEP降解的抗性。此类缀合或延伸可以包括由例如polyAsp、polyGlu、软骨靶向肽、唾液蛋白、PEG、碳水化合物、疏水性酸、NPPC或非CNP(多)肽或其组合形成或衍生的分子或序列。

进一步经考虑，CNP变体肽可以缀合到疏水性聚合或非聚合物部分，例如庚酸、戊酸或脂肪酸。疏水性部分可以缀合到氨基酸残基的侧链，包含但不限于赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸，或者可以附接到CNP变体的N末端和/或C末端。

在各个实施例中，CNP变体肽包括合成聚合物基团。在各个实施例中，变体包括通过可水解接头与所述变体偶联的合成聚合物基团。在各个实施例中，合成聚合物基团包括亲水性聚合物部分。在各个实施例中，亲水性聚合物部分包括聚乙二醇(PEG)。

在各个实施例中，本公开提供了药物组合物的用途，所述药物组合物包括CNP变体肽、任选地另一种生物活性剂以及任选地药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在各个实施例中，组合物是适于肠胃外注射的无菌药物组合物。在一些实施例中，组合物包括基本上纯的CNP变体肽，例如至少约90％或95％纯。在一些实施例中，组合物含有少于约5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的污染物，如其它人蛋白、猪蛋白或CNP-53或其片段(除了期望的CNP变体肽之外)。在各个实施例中，向受试者施用无菌组合物以治疗或预防本文所公开的骨骼发育不良或骨骼发育不良的一种或多种症状或生理后果。

可用于本文的CNP变体肽有利地保留CNP活性并表现出增加的血清半衰期。保留CNP活性可以被示出为，例如，在相同浓度(例如，1μM的CNP肽或大于ED80)下保留期望的体内生物效应，或保留CNP-22的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少约100％的cGMP刺激活性。在一些实施例中，与CNP-22相比，CNP变体肽表现出血清半衰期增加至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍。

在相关实施例中，与野生型CNP-22相比，本文所描述的CNP变体肽具有增加的NEP抗性并且表现出增加的半衰期。在一个实施例中，与野生型CNP-22相比，CNP变体肽的半衰期增加约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％。

还考虑了本文所描述的前述CNP变体肽或包括其的组合物或制剂中的任何一者在制备用于治疗小于或约2岁儿童的骨骼发育不良以及本文所描述的与骨骼发育不良相关的症状或其它生理表现的药物中的用途。还考虑了本文所描述的前述CNP变体肽或包括其的组合物或制剂中的任何一者在制备用于治疗约2岁至约5岁儿童的骨骼发育不良以及本文所描述的与骨骼发育不良相关的症状或其它生理表现的药物中的用途。还考虑了包括前述CNP变体肽或包括其的组合物或制剂中的任何一者的注射器，例如，一次性或预填充注射器、无菌密封容器，例如，小瓶、瓶子、器皿和/或试剂盒或包装，任选地以及合适的使用说明书。

还经考虑CNP变体处于包括以下的制剂中：(a)本文所描述的CNP变体肽和(b)选自由缓冲剂、等渗剂、稳定剂和抗吸附剂组成的组的一种或多种组分。在特别优选的实施例中，制剂中使用的缓冲剂可以是柠檬酸一水合物、柠檬酸钠二水合物或两者的组合。在又其它优选的实施例中，本发明的制剂中使用的等渗剂可以是海藻糖二水合物、D-甘露醇或两者的组合。在其它优选的实施例中，本发明的制剂中使用的稳定剂是L-甲硫氨酸。在又其它优选的实施例中，本发明的制剂中使用的抗吸附剂是聚山梨醇酯80。

在各个实施例中，可用于所述方法的制剂是冻干的，呈液体形式，或呈由先前冻干形式重构的液体形式。在某些实施例中，可用于所述方法的制剂不含防腐剂，并且任选地可以包含在1型未处理的硼硅酸盐玻璃小瓶中。任选地，制剂的pH在介于约5.0与约6.0的范围内，优选地约5.5。

在一些实施例中，组合物是液体制剂。在某些实施例中，制剂包括浓度范围为约0.1mg/ml至约20mg/ml、或约0.5mg/ml至约20mg/ml、或约1mg/ml至约20mg/ml、或约0.1mg/ml至约10mg/ml、或约0.5mg/ml至约10mg/ml、或约0.5至5mg/ml、或约0.5至3mg/ml、或约0.5mg/ml至约2.0mg/ml、或约0.8至约2.0mg/ml、或约1mg/ml至约10mg/ml的CNP变体。在各个实施例中，CNP变体处于0.5mg/mL至2mg/mL的浓度中。在各个实施例中，CNP变体处于0.8mg/mL至2mg/mL的浓度中。在各个实施例中，CNP变体处于0.8mg/mL的浓度中。在各个实施例中，CNP变体处于2.0mg/mL的浓度中。在各个实施例中，CNP变体是由冻干粉末重构的。在各个实施例中，制剂的CNP变体肽是CNP-38或Pro-Gly-CNP-37(BMN111)。

在其它实施例中，用于所述方法的制剂包括如本文所描述的CNP变体肽、柠檬酸一水合物、柠檬酸钠二水合物、海藻糖二水合物、D-甘露醇、L-甲硫氨酸和聚山梨醇酯80。在某些实施例中，CNP变体肽以介于约0.5mg/ml与约2.0mg/ml之间的浓度存在，柠檬酸一水合物以介于约0.15mg/ml与约0.40mg/ml之间的浓度存在，柠檬酸钠二水合物以介于约0.5mg/ml与约1.5mg/ml之间的浓度存在，海藻糖二水合物以介于约30mg/ml与约70mg/ml之间的浓度存在，D-甘露醇以介于约10mg/ml与约20.0mg/ml之间的浓度存在，L-甲硫氨酸以介于约0.5mg/ml与约1.5mg/ml之间的浓度存在，并且聚山梨醇酯80以介于约0.01mg/ml与约0.1mg/ml之间的浓度存在。在各个实施例中，CNP变体以约2.0mg/ml的浓度存在，柠檬酸一水合物以约0.28mg/ml的浓度存在，柠檬酸钠二水合物以约1.08mg/ml的浓度存在，海藻糖二水合物以约58.01mg/ml的浓度存在，D-甘露醇以约15.0mg/ml的浓度存在，L-甲硫氨酸以约0.73mg/ml的浓度存在，并且聚山梨醇酯80以约0.05mg/ml的浓度存在。在各个实施例中，CNP变体以约0.8mg/ml的浓度存在，柠檬酸一水合物以约0.28mg/ml的浓度存在，柠檬酸钠二水合物以约1.08mg/ml的浓度存在，海藻糖二水合物以约58.01mg/ml的浓度存在，D-甘露醇以约15.0mg/ml的浓度存在，L-甲硫氨酸以约0.73mg/ml的浓度存在，并且聚山梨醇酯80以约0.05mg/ml的浓度存在。

应理解，本文中所描述的每个特征或实施例或组合是本公开的任何方面的非限制性的说明性实例并且因此意味着可与本文中所描述的任何其它特征或实施例或组合结合。例如，在用诸如“一个实施例”、“一些实施例”、“进一步实施例”、“特定示例性实施例”和/或“另一个实施例”等语言来描述特征的情况下，这些类型的实施例中的每个实施例是在无需列出每个可能组合的情况下本文中所描述的旨在与任何其它特征结合的特征或特征组合的非限制性实例。这种特征或特征组合应用于本公开的任何方面。在公开落入范围内的值的实例的情况下，考虑这些实例中的任何实例为范围的可能端点、考虑此类端点之间的任何数值和所有数值，并且考虑上端点和下端点的任何组合和所有组合。

附图说明

图1示出了群组1-3中进行52周伏索利肽(vosoritide)治疗的研究组的人口构成。

图2表示治疗52周时研究群组1-3的基线Z评分。

图3表示基线AGV以及研究群组1-3在52周内基线AGV的变化。

图4展示了治疗52周后身高Z评分随时间推移的积极变化。

具体实施方式

本公开涉及使用CNP变体肽治疗小于或约2岁儿童的骨骼发育不良、骨骼发育不良的一种或多种症状或生理后果以及具有骨骼发育不良和/或CNP相关症状或组分的其它病症的方法。用CNP变体肽治疗骨骼发育不良会减轻骨骼发育不良的一种或多种症状或生理后果，增加有需要的受试者的长骨生长，或改善或增加有需要的受试者的生长速度，例如在患有骨骼发育不良的受试者中。

定义

除非另外说明，否则包含所述说明书和权利要求的本申请中所使用的以下术语具有以下给出的定义。

如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指示，否则不定冠词“一个/一种(a/an)”以及定冠词“所述(the)”包含复数和单数指代物。

术语“约”或“大约”意指如本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这将部分取决于如何测量或确定值。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意指在1个、2个、3个或4个标准偏差内。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。每当术语“约”或“大约”处在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，应理解术语“约”或“大约”适用于所述系列数值中的每个数值。

标准化学术语的定义可见于参考文献中，包含Carey和Sundberg，《高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)》，第3版，A和B卷(纽约普莱南出版社(Plenum Press，NewYork)1992)。除非另有说明，否则本公开的实践可以采用本领域技术范围内的合成有机化学、质谱法、制备型和分析型色谱法、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的某些常规方法。参见例如，T.E.Creighton，《蛋白质：结构与分子性质(Proteins：Structuresand Molecular Properties)》(W.H.弗里曼出版社和公司(W.H.Freeman and Company)，1993)；A.L.Lehninger，《生物化学(Biochemistry)》(沃思出版社有限公司(WorthPublishers，Inc.)，第4版，2004)；Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manua1》)(第2版，1989)；《酶学方法(Methods In Enzymology)》(S.Colowick和N.Kaplan编辑，学术出版社(Academic Press，Inc.))；《雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，第18版(宾夕法尼亚州伊斯顿市：麦克出版公司(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company)，1990)。

本文所引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，特此通过引用整体并入本文。

全文使用以下氨基酸缩写。

丙氨酸：Ala(A) 精氨酸：Arg(R)

天冬酰胺：Asn(N) 天冬氨酸：Asp(D)

半胱氨酸：Cys(C) 谷氨酰胺：Gln(Q)

谷氨酸：Glu(E) 甘氨酸：Gly(G)

组氨酸：His(H) 异亮氨酸：Ile(I)

亮氨酸：Leu(L) 赖氨酸：Lys(K)

甲硫氨酸：Met(M) 苯丙氨酸：Phe(F)

脯氨酸：Pro(P) 丝氨酸：Ser(S)

苏氨酸：Thr(T) 色氨酸：Trp(W)

酪氨酸：Tyr(Y) 缬氨酸：Val(V)

本文使用常规符号来描绘多肽和肽序列：多肽或肽序列的左手端是氨基末端；多肽序列的右手端是羧基末端。

在一个实施例中，本文所描述的可用于所述方法的CNP变体肽是使用编码CNP变体肽的多核苷酸通过重组方式产生的。由此类多核苷酸表达的CNP变体肽可以通过以下方法产生，所述方法包含在适于表达编码CNP变体的多核苷酸的条件下在培养基中生长宿主细胞，以及从宿主细胞或培养基中分离表达产物。根据任何翻译后处理，实际表达产物可能与经编码的蛋白质产物略有不同。至少在美国专利第8，198，242号中公开了用于产生本发明的CNP变体肽的方法，所述美国专利通过引用并入本文。

在两个或更多个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”和“同一性”百分比是指当针对最大对应性进行比较和比对时，相同的或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法或通过手动比对和视觉检查测量的。

在两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上同源”或“基本上相同”是指，当针对最大对应性进行比较和比对时，具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法或通过手动比对和视觉检查测量的。在某些实施例中，在长度为至少约25、50、100或150个残基的序列区域上存在基本同源性或同一性。在另一个实施例中，序列在任一或两个比较生物聚合物的整个长度上基本上同源或相同。

为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机，指定子序列坐标(如有必要)，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于所指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下来进行：Smith和Waterman，《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》，2：482(1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，48：443(1970)的同源性比对算法；Pearson和Lipman，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，85：2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施方案(威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(GeneticsComputer Group，575Science Dr.，Madison，WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或视觉检查。可用的算法的一个实例是PILEUP，其使用了Feng和Doolittle，《分子进化杂志(J.Mol.Evol.)》，35：351-360(1987)的渐进比对方法的简化，并且类似于Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》，5：151-153(1989)描述的方法。可用于产生序列的多个比对的另一算法是Clustal W(Thompson等人，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》，22：46734680(1994))。适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法(Altschul等人，《分子生物学杂志》，215：403-410(1990)；Henikoff和Henikoff，《美国国家科学院院刊》，89：10915(1989)；Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊》，90：5873-5787(1993))。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心公开获得。

“野生型”(wt)是指物种中的多核苷酸、多肽或蛋白质的天然形式的术语，包含序列。野生型形式区别于由基因突变产生的多核苷酸、多肽或蛋白质的突变形式。

在一个实施例中，作为第二肽的“类似物”或“变体”或“衍生物”的第一肽是与第二肽具有至少约50％、60％或70％序列同源性，但小于100％序列同源性的肽。此类类似物、变体或衍生物可以包含非天然存在的氨基酸残基，包含但不限于高精氨酸、鸟氨酸、青霉胺和正缬氨酸以及天然存在的氨基酸残基。

利钠肽前体C(NPPC)多肽是单链126-氨基酸前体多肽原，并且切割后最终产生野生型CNP-22(wtCNP-22)。从NPPC去除信号肽产生pro-CNP，并且通过内切蛋白酶弗林蛋白酶进一步切割产生活性的53-氨基酸肽(CNP-53)，其被分泌并再次切割产生成熟的22-氨基酸肽(CNP或CNP-22)。在一个实施例中，“CNP变体肽”在相同数目的氨基酸残基上与野生型NPPC至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源。进一步考虑了CNP变体肽可以包括NPPC多肽的约1至约53、或1至38、或1至37、或1至35、或1至34、或1至33、或1至32、或1至31、或1至27、或1至22、或10至35、或约15至约37个残基。在一个实施例中，CNP变体可以包括源自NPPC多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53个氨基酸的序列。

术语“有效量”意指足以对受试者的健康状况、病理学或疾病产生期望结果或用于诊断目的的剂量。期望的结果可以包括剂量接受者的主观或客观改善。“治疗有效量”是指有效产生对健康具有预期有益作用的药剂的量。任何个体情况下的适宜“有效量”可由本领域普通技术人员使用常规实验确定。应理解，用于任何特定患者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且将取决于多种因素，包含所采用的具体化合物的活性；所述化合物的生物利用度、代谢稳定性、排泄率和作用长度；化合物的施用方式和时间；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；以及特定情况的严重程度。

“治疗”是指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。在某些实施例中，“治疗”是指出于治疗性、预防性或诊断性目的向受试者施用化合物或组合物。

“预防性”治疗是对未表现出疾病体征或仅表现出疾病的早期体征的受试者施用的治疗目的是降低发生病理的风险。本公开的化合物或组合物可以作为预防性治疗来给予，以降低发生病理的可能性或将病理的严重程度最小化(如果发生的话)。

“治疗性”治疗是向表现出病理体征或症状的受试者施用的治疗，目的是减少或消除那些体征或症状。体征或症状可以是生化的、细胞的、组织学的、功能性的或物理性的、主观的或客观的。本公开的化合物还可以作为治疗性治疗或用于诊断而给予。

“药物组合物”或“制剂”是指适于在受试者动物(包含人和哺乳动物)中药用的组合物。药物组合物包括治疗有效量的CNP变体肽、任选地另一种生物活性剂以及任选地药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一实施例中，药物组合物涵盖包括构成载体的活性成分和惰性成分，以及由成分中的任何两种或更多种成分的组合、络合或聚集或由成分中的一种或多种成分的解离，或由成分中的一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接得到的任何产物的组合物。因此，本公开的药物组合物涵盖通过混合本公开的化合物和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂而制备的任何组合物。

“药学上可接受的载体”是指标准药物载体、缓冲剂等中的任何一者，如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％葡萄糖水溶液和乳液(例如油/水或水/油乳液)。赋形剂的非限制性实例包含佐剂、粘结剂、填料、稀释剂、崩解剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、助流剂、甜味剂、调味剂和着色剂。合适的药物载体、赋形剂和制剂描述于《雷明顿氏药物科学》，第19版(伊斯顿市的麦克出版公司，1995)。优选的药物载体取决于活性剂的预期施用方式。通常的施用模式包含肠内(例如，口服)或肠胃外(例如，皮下、肌内、静脉内或腹膜内注射；或局部、经皮或经粘膜施用)。

“药学上可接受的盐”是可以配制成药用化合物的盐，包含但不限于金属盐(例如，钠、钾、镁、钙等)和氨或有机胺的盐。

“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”意指在生物学或其它方面不是不期望的材料，即，所述材料可以施用于个体，而不引起任何不期望的生物效应，或者不以有害方式与包含所述材料的组合物的组分中的任何组分或存在于个体身体上或体内的任何组分相互作用。

“生理状况”是指动物(例如人)的身体状况。生理条件包含但不限于体温和生理离子强度、pH和酶的水性环境。生理状况还涵盖特定受试者体内不同于大多数受试者中存在的“正常”状况的状况，例如，不同于为大约37℃的正常人体温或不同于为大约7.4的正常人血液pH。

如本文所使用的，术语“受试者”涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包含但不限于哺乳动物类别的任何成员：人、非人灵长类动物，如黑猩猩以及其它猿物种和猴物种；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊、猪等；家养动物，如兔子、狗和猫等；实验室动物，包含如大鼠、小鼠和豚鼠等啮齿动物。非哺乳动物的实例包含但不限于鸟类、鱼类等。所述术语不表示特定年龄或性别。

术语“聚乙二醇”、“PEG”、“聚环氧乙烷”和“PEO”在本文中可互换使用，除非另有说明。通过氨基缀合到与数字n相关的“PEOn”聚合物的CNP变体通常具有以下式：CH3-[-O-CH2CH2-]n-C(＝O)-NHR，其中n是环氧乙烷单元的数量，并且R表示肽的其余部分。“PEOn”聚合物可以任选地在羰基碳与重复环氧乙烷单元之间具有亚烷基(CH2)m，其中m是1至5的整数。此类“PEOn”(例如，PEO12或PEO24)聚合物是单分散的，即，是具有特定分子量的单一离散聚合物。类似地，通过氨基缀合到与数字nK相关的“PEGnK”聚合物的CNP变体通常具有以下式：CH3-[-O-CH2CH2-]p-C(＝O)-NHR，其中p是大于1的整数。“PEGnK”聚合物还可以任选地在羰基碳与重复环氧乙烷单元之间具有亚烷基(CH2)m，其中m是1至5的整数。然而，此类“PEGnK”(例如，PEG1K、PEG2K、PEG5K或PEG20K)聚合物是多分散的，即，含有具有分子量分布的聚合物的混合物，其中数字nK表示聚合物数均分子量(Mn)，以千道尔顿为单位。例如，缀合到CNP变体的“PEG2K”表示聚合物数均分子量约为2kDa的多分散PEG聚合物。

当给出聚合物(例如，PEG)的质量范围(例如以kDa为单位)时，所述范围是指聚合物数均分子量的范围，而不是多分散混合物中多种聚合物的分子量范围，除非另有明确说明。

CNP变体肽

CNP-22作为治疗剂的使用因其血浆半衰期短而受到限制(《临床内分泌与代谢杂志》，78：1428-35(1994))。在人血浆中，CNP-22的浓度通常低于五皮摩尔。CNP-22在人体中被NEP和NPR-C降解并且通过循环中清除(《生长激素和IGF研究》，16：S6-S14)。在所有使用全身施用CNP-22的人和动物研究中，连续输注已用于增加受试者中的CNP-22浓度。具有较长半衰期和至少类似水平功能的CNP肽将有利于基于CNP的治疗策略。具有改进特性的CNP变体肽公开于国际申请第WO 2009/067639号和第WO 2010/135541号以及美国专利第8,198,242号、第8,598,121号、第8,377,884号、第9,907,834号和第10,646,550号中，所有具体通过引用并入本文。

考虑用于所述方法的示例性CNP变体肽包含：

在某些实施例中，CNP变体肽是CNP-37或CNP-38的衍生物。CNP-37变体肽可以在CNP-37的37个位置中的任何一个或多个位置处含有氨基酸添加、缺失和/或用天然或非天然氨基酸或肽模拟物(例如肽键等排物)取代。基于CNP-22的编号，可以在CNP-37中进行的取代的非限制性实例包含K4R、G5S、G5R、G8S、K10R、G15S、S16Q、M17N、G19R和其组合。

在一个实施例中，CNP变体肽是已被修饰成包括疏水性部分的CNP-38、CNP-37、CNP-36、CNP-35、CNP-34、CNP-33或CNP-32。在各个实施例中，疏水性部分是聚乙二醇。

另外的CNP变体公开于国际申请PCT/US2020/045885中，所述国际申请描述了可用于治疗骨骼发育不良的CNP变体的疏水性肽盐，并且通过引用并入本文。考虑使用的仍其它CNP变体描述于PCT/US2020/051100(通过引用并入本文)中，其公开了CNP序列变体PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：66)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：1)：PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：67)；以及PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：68)，任选地其中所述变体进一步包括乙酰基。在各个实施例中，乙酰基位于肽的N末端上。在各个实施例中，肽进一步包括在C末端处的OH或NH2基团。在各个实施例中，变体肽包括缀合物部分。在各个实施例中，缀合物部分位于CNP环状结构域的残基上或CNP环状结构域以外的位点处。在各个实施例中，缀合物部分位于赖氨酸残基上。在各个实施例中，缀合物部分包括一个或多个酸部分。在各个实施例中，酸部分是疏水性酸。在各个实施例中，缀合物部分包括连接到亲水性间隔子一个或多个酸部分。在各个实施例中，亲水性间隔子是任何氨基酸。在各个实施例中，亲水性间隔子是γ谷氨酸(γGlu)。在各个实施例中，亲水性间隔子是OEG(8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)。在各个实施例中，亲水性间隔子是γ谷氨酸(γGlu)或OEG(8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)。在各个实施例中，亲水性间隔子是连接到一个或两个或更多个OEG(8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)的γ谷氨酸(γGlu)。在各个实施例中，酸部分是脂肪酸。示例性脂肪酸包含短链、中链或长链脂肪酸，或二羧基脂肪酸。在各个实施例中，脂肪酸是饱和的或不饱和的。考虑了C-6至C-20脂肪酸，包含但不限于饱和的或不饱和的C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各个实施例中，脂肪酸是癸酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸或其二酸。

在一个实施例中，CNP变体肽是经修饰的CNP-37或CNP-38肽，其在弗林蛋白酶切割位点处具有突变/取代，旨在提高对弗林蛋白酶的体内抗性，和/或在N末端处含有甘氨酸或脯氨酸-甘氨酸，旨在提高血浆稳定性并且防止焦谷氨酰胺形成。示例性CNP-37变体包含但不限于：

在某些实施例中，CNP变体肽可以包括合成聚合物基团。在各个实施例中，变体包括通过可水解接头与所述变体偶联的合成聚合物基团。在各个实施例中，合成聚合物基团包括亲水性聚合物部分。在一实施例中，亲水性聚合物是水溶性的，使得与其缀合的CNP肽不会在水性(例如生理性)环境中沉淀出来。进一步地，亲水性聚合物是生物相容的，即，不会在体内引起损伤、毒性或免疫反应。亲水性聚合物可以是支化或非支化的。在一个实施例中，亲水性聚合物不是支化的。在各个实施例中，亲水性聚合物部分包括聚乙二醇(PEG)。CNP变体与亲水性聚合物的缀合位点是可能的，包含但不限于：(1)仅在N末端处；(2)仅在C末端处；(3)仅在内部位点(例如，Lys 4和/或Lys 10)处；(4)在N末端和C末端处；(5)N末端和内部位点处；以及(6)在C末端和内部位点处。

用于制备PEG化CNP变体肽的方法通常包括使用本领域已知的技术的以下步骤：(a)使CNP变体与PEG化试剂在适于将PEG连接到CNP肽(例如，在N末端处)的条件下反应，以及(b)获得反应产物。

CNP变体肽的合成和纯化

在一些实施例中，使用某些实施例中本领域已知的某些技术通过重组表达产生本文可用的CNP变体肽。参见例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，《分子克隆：实验室手册》，第二版冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(纽约冷泉港(ColdSpring Harbor，N.Y.)(1989))；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning：A PracticalApproach)》，I和II卷，D.N.Glover编辑(1985)；以及《当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》，约翰威立父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)(1994)。

在某些实施例中，CNP变体肽通过重组方法产生，所述重组方法包括在引起由所述多核苷酸编码的融合多肽表达的条件下，在培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞包括编码CNP变体肽的第一多核苷酸，所述CNP变体肽连接到编码可切割的肽或蛋白质的第二多核苷酸，其中融合多肽包括直接连接到可切割的肽或蛋白质或通过接头间接连接到其的CNP变体肽。在一些实施例中，用包括编码CNP变体肽的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，所述CNP变体肽连接到编码可切割的肽或蛋白质的多核苷酸。在某些实施例中，融合多肽表达为可溶性蛋白或包涵体。表达的融合多肽可以从宿主细胞或培养基中分离，并且分离的融合多肽可以与切割剂接触以释放CNP变体肽。

产生CNP变体肽的方法描述于美国专利8,198,242、8,377,884以及8,598,121、9,907,834和10,646,550中，所述美国专利通过引用并入本文。

用于产生CNP变体肽的宿主细胞可以是细菌、酵母、昆虫、非哺乳动物脊椎动物或哺乳动物细胞。细菌细胞包含但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞系和菌株。大肠杆菌细胞系和菌株的非限制性实例包含BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pGro7、ArcticExpress(DE3)、C41[也称为C41(DE3)]、C43[也称为C43(DE3)]、Origami B(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX和Tuner(DE3)。在一实施例中，CNP变体肽和CNP融合蛋白使用BL21(DE3)细胞产生。哺乳动物细胞包含但不限于仓鼠、猴、黑猩猩、狗、猫、牛、猪、小鼠、大鼠、兔、羊和人细胞。宿主细胞可以是永生化细胞(细胞系)或非永生化(初级或次级)细胞，并且可以是多种细胞类型中的任何一种，如但不限于成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞(例如乳腺上皮细胞、肠上皮细胞)、卵巢细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞或CHO细胞)、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、血液形成元素(例如淋巴细胞、骨髓细胞)、软骨细胞和其它骨源性细胞，以及这些体细胞类型的前体。在适合于细胞生长、DNA或RNA表达以及表达CNP变体肽的细胞的鉴定/选择的条件下培养含有CNP变体DNA或RNA的宿主细胞。

在某些实施例中，CNP变体肽重组表达为包括CNP变体肽和可切割的载体蛋白或可切割的标签(例如肽标签)的融合蛋白，其中融合蛋白包括直接连接到可切割的载体蛋白或标签或通过接头间接连接到其的CNP变体肽。载体蛋白或标签的使用有利于例如融合蛋白的检测、分离和/或纯化。可切割的载体蛋白和标签包含但不限于组氨酸(例如hexa-His)标签；人转录因子TAF12(TAF12)、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠结构域、TAF12的突变体和其片段、TAF12(C/A)、TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A&D/E)、TAF12(C/A&4D/4E)、TAF12(C/A&6D/6E)、TAF12(C/A&10D/10E)；酮类固醇异构酶(KSI)；麦芽糖结合蛋白(MBP)；β-半乳糖苷酶(β-Gal)；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；硫氧还蛋白(Trx)；几丁质结合域(CBD)；BMP-2、BMP-2突变体、BMP-2(C/A)；SUMO；以及其突变体和片段。

在其它实施例中，本文所描述的CNP变体肽根据本领域已知的方法使用肽合成仪合成并且纯化，例如根据Atherton和Sheppard，《固相肽合成：一种实用的方法(SolidPhase Peptide Synthesis：a Practical Approach)》，IRL出版社(IRL Press)(英国牛津(Oxford，England)(1989))的方法。

使用CNP变体肽的方法

骨相关病症/骨骼发育不良

成纤维细胞生长因子(FGF)在骨形成中发挥重要作用，并且FGF受体基因(FGFR 1、2和3)的突变会导致多种遗传性骨骼畸形(《当代生物学(Curr.Biol.)》，5：500-507(1995))。特别是，FGFR-3的激活突变会导致长骨病症，包含软骨发育不全，这是人类遗传性侏儒症的最常见形式(《自然(Nature)》，371：252-254(1994)；《细胞(Cell)》，78：335-342(1994))、轻度病症软骨发育不良(《美国纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》，785：182-187(1996))和更严重的新生儿致死性发育不全(TD)I型和II型(《人类分子遗传学(Hum.Mol.Genet.)》，5：509-512(1996)；《自然遗传学(Nat.Genet.)》，9：321-328(1995))。过度表达FGF-2并且随后激活FGFR-3的小鼠模型表现出长骨缩短和畸形巨头(《细胞分子生物学(Mol.Biol.Cell)》，6：1861-73(1995))。与此模型一致，FGFR-3缺陷的小鼠表现出显著的骨骼过度生长，其中生长板更宽(《自然遗传学》，12：390-397(1996))。

通过刺激软骨细胞的基质产生、增殖和分化以及增加长骨生长，本公开的CNP变体肽可用于治疗患有骨相关病症如骨骼发育不良的哺乳动物，包含人。CNP响应性骨相关病症和骨骼发育不良的非限制性实例包含软骨发育不全、软骨发育不良、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性骨发育不全、成骨不全、软骨成长不全、点状软骨发育不良、纯合软骨发育不全、短指发育不良、先天致死型低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋骨多指综合征、软骨发育不良、肢根型点状软骨发育不良、詹森型干骺端发育不良、先天性椎体骨骺结构不良、骨发育不全症、畸型发育不良、先天性股骨短、兰格型肢中骨发育不良、尼弗哥特型肢中骨发育不良、罗宾诺综合征、莱因哈特综合症、肢端发育不全、周围性骨发育不全、克尼斯特发育不良、纤维软骨增生症、罗伯茨综合症、肢端肢中发育不全、小肢、莫基奥综合征、克尼斯特综合征、后生发育不良、脊椎干骺端发育不良、NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱-韦二氏)、PTPN11突变(努南综合症)和特发性身材矮小。进一步地，CNP变体可用作生长激素的辅助剂或替代物，用于治疗特发性身材矮小和其它骨骼发育不良。

另外，CNP变体肽可用于治疗其它骨相关病状和病症，如佝偻病、低磷性佝偻病[包含X连锁低磷性佝偻病(也称为维生素D抗性佝偻病)和常染色体显性低磷性佝偻病]，以及骨软化症[包含肿瘤性骨软化症(也称为致癌性骨软化症或致癌性低磷性骨软化症)]。

在各个实施例中，骨相关病症、骨骼发育不良或身材矮小症由NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱-韦二氏)或PTPN11突变(努南综合征)引起。

在各个实施例中，骨相关病症、骨骼发育不良或身材矮小症由NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱-韦二氏)或PTPN11突变(努南综合征)或胰岛素生长因子1受体(IGF1R)引起。

在各个实施例中，CNP变体可用于治疗生长板病症和身材矮小，包含家族性身材矮小、显性家族性身材矮小，也称为显性遗传性身材矮小或特发性身材矮小。在各个实施例中，身材矮小或生长板病症是胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度豪猪蛋白(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3突变的结果。

在各个实施例中，生长板病症或身材矮小与RAS蛋白病相关基因的一个或多个突变相关。

在各个实施例中，骨相关病症、骨骼发育不良或身材矮小由RAS蛋白病引起。在各个实施例中，RAS蛋白病是努南综合征、考斯泰勒综合征(Costello syndrome)、心脏面部皮肤综合征、1型神经纤维瘤病或LEOPARD综合征。

在一个实施例中，RAS蛋白病是1型遗传性牙龈纤维瘤病。

在各个实施例中，CNP变体可用于治疗生长板病症和身材矮小，包含家族性身材矮小、显性家族性身材矮小，也称为显性遗传性身材矮小或特发性身材矮小。在各个实施例中，身材矮小或生长板病症是胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度豪猪蛋白(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰岛素生长因子1受体(IGF1R)突变的结果。

在各个实施例中，身材矮小与RAS蛋白病相关基因的一个或多个突变相关。

RAS蛋白病是一组罕见的遗传性病状，由Ras/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路基因突变引起。RAS蛋白病是一组通过RAS/MAPK通路信号传导增强表征的病症。此通路引起RAF/MEK/ERK通路的下游激活。身材矮小是某些RAS蛋白病的特性特征。例如，CNP信号传导抑制RAF并且导致MEK和ERK激活减少。

本文考虑了RAS蛋白病的治疗。与身材矮小相关的RAS蛋白病包含努南综合征、考斯泰勒综合征、心脏面部皮肤综合征、1型神经纤维瘤病和LEOPARD综合征。1型遗传性牙龈纤维瘤病也是本文考虑的RAS蛋白病。RAS蛋白病患者(包含努南综合征、考斯泰勒综合征、心脏面部皮肤综合征、1型神经纤维瘤病、LEOPARD综合征、1型遗传性牙龈纤维瘤病)包含具有以下基因中的一种或多种基因的杂合变体的患者：BRAF、CBL、HRAS、KRAS、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MRAS、NF1、NRAS、PPP1CB、PTPN11、RAF1、RRAS、RIT1、SHOC2、SOS1或SOS2(Tajan等人《内分泌学评论(Endocr.Rev.)》2018；39(5)：676-700)。

多个基因突变可能导致努南综合征，其通过身材矮小、心脏缺陷、出血问题和骨骼畸形来表征。所有努南综合征病例的约一半是由PTPN11基因突变引起的。SOS1基因突变导致另外的10％至15％，并且RAF1和RITl基因各占病例的约5％。其它基因的突变各自占少数病例。15％至20％的努南综合征患者的这种病症的原因未知。

PTPN11、SOS1、RAF1和RIT1基因均编码在RAS/MAPK细胞信号传导通路中重要的蛋白质，所述RAS/MAPK细胞信号传导通路是细胞分裂和生长(增殖)、分化和细胞迁移所必需的。与努南综合征相关的基因中的许多突变会导致所产生的蛋白质被打开(活跃)，并且这种长时间的激活会改变正常的RAS/MAPK信号传导，这会破坏细胞生长和分裂的调节，从而导致努南综合征的特性特征。参见例如Chen等人，《美国国家科学院院刊》111(31)：11473-8，2014，Romano等人，《儿科(Pediatrics.)》126(4)：746-59，2010以及等人，《美国医学遗传学杂志(Am J Med Genet)》170(7)：1874-80，2016。经考虑具有激活MAPK通路的突变的受试者将受益于用如本文所描述的CNP变体的治疗以改善骨生长和身材矮小。还经考虑具有激活MAPK通路的突变的受试者将受益于用如本文所描述的CNP变体的治疗以改善与NPR2受体在其表面表达的全身其它细胞中过度活跃的MAPK通路相关的其它合并症。

在某些实施例中，本文所描述的CNP变体肽以及组合物和制剂可用于改善骨骼发育不良的症状或生理后果中的一种或多种，其中这种改善可能是绝对生长增加、生长速度增加、定性计算机断层扫描(QCT)骨矿物质密度增加、生长板形态改善、长骨生长增加、脊柱形态改善、肘关节活动范围改善和/或睡眠呼吸暂停减少。在这方面，值得注意的是，术语“改善(improved/improvement)”、“增加”、“减少”和其语法等同物都是相对术语，当与疾病状态的症状或生理后果相关使用时，是指与用本发明的CNP变体肽(或包括其的组合物或制剂)治疗之前疾病的相同症状或生理后果相比(即，与“基线”相比)，用本发明的CNP变体肽(或包括其的组合物或制剂)治疗之后疾病的症状或生理后果的状态。如本文所描述的，“基线”状态可以通过测量治疗前受试者的状态(随后可以与同一受试者治疗之后的状态进行比较)，或者通过测量具有相同或相似特征(例如年龄、性别和/或疾病状态或进展)的同一患病受试者群体的状态来确定。

增加或增强生长速度

还可以为了增强或增加患有骨骼发育不良的受试者的生长速度的目的而施用本公开的组合物和制剂。在优选的实施例中，受试者患有软骨发育不全。治疗功效通过各种参数来测量。在各个实施例中，功效评估为年化生长速度从基线期到干预期的变化。功效还评估为从基线到治疗结束的身高标准偏差评分(SDS)(也称为身高Z评分)的变化来评估，如使用CDC生长曲线进行测量的，并且生长速度SDS基于儿童的骨矿物质密度研究(Kelly等人，《临床内分泌与代谢杂志》2014；99(6)：2104-2112)。

可以使用本领域熟知的标准技术随时间推移进行受试者的生长速度的测量。在某些实施例中，可以在指定的时间段内进行如站立高度、坐高、体重、头围、上臂长度、下臂(前臂)长度、大腿长度、小腿长度(膝盖到脚)、手长(手腕到手指末端)和/或脚长等参数的测量，以确定具体生长速率，如通过任何特定参数(即，生长速度)测量的。特定时间段内生长速度的测量可以“年化”，其中将特定时间段内计算的生长速率转换为一年时间段内的预期生长速率。可以将用本发明的CNP变体肽治疗之前的受试者的生长速度测量(即，“基线”生长速度)与用本发明的CNP变体肽治疗期间或之后的生长速度测量进行比较，以确定治疗对受试者生长速度变化的影响。“基线”生长速度还可以由与用本发明的CNP变体肽治疗的个体具有相同的一般年龄、性别和疾病状态的受试者群体确定。

可以定量测量如通过评估由用本发明的CNP变体肽(或包括其的组合物或制剂)治疗有需要的受试者所诱导或引起的上文所描述的参数中的一个或多个参数(例如站立高度等)来测量的生长速度的改善。在这方面，在某些实施例中，用本发明的CNP变体(或包括其的组合物或制剂)治疗的受试者中任何特定参数的生长速度的年化增加或改善比基线高至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多。在某些实施例中，本文描述的方法引起如通过站立高度测量的生长速度的年化增加高于基线至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多。在其它实施例中，本文所描述的方法引起如通过坐高、体重、头围、上臂长度、下臂(前臂)长度、大腿长度、小腿长度(膝盖到脚)、手长(手腕到手指末端)或脚长测量的生长速度的年化增加高于基线至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多。如本文所描述的，基线比较器可以是在用本发明的CNP变体肽治疗同一受试者前如通过特定参数测量的年化生长速度，或者可以是由与用本发明的CNP变体肽治疗的个体具有相同的一般年龄、性别和疾病状态的受试者群体确定的生长速度。

还可以在用CNP变体肽治疗之前和之后从受试者获得和某些身体部分与其它部分的比例相关的人体测量数据，以确定CNP变体肽的施用是否引起这种比例的变化。例如，可以在用CNP变体肽治疗前(即，基线)和用CNP变体肽治疗之后计算上身长度(腰部到头)与下身长度(腰部到脚)的比率，以确定用CNP变体肽治疗是否对身体比例产生不利影响。在较年幼的受试者中，例如0至2岁的患者，针对年化生长速度和Z评分的测量，体长和头臀长的测量可能优先于站立高度和坐高。

还可以计算并且比较上臂与前臂长度或大腿与小腿(膝盖到脚)的比率，以确定CNP变体肽治疗对身体比例的影响。在优选的实施例中，与基线相比，向受试者施用CNP变体肽不引起如通过任何特定比率测量的身体比例的显著变化。在这方面，在某些实施例中，用本发明的CNP变体肽或包括其的组合物或制剂治疗引起上文所描述的比率中的任何比率的变化不超过0.5、0.25、0.20、0.15、0.10或0.05，优选地不大于0.05。

在本文所描述的各种方法中，优选的是CNP变体肽或包括其的组合物或制剂的施用不会在治疗的受试者中导致与研究药物相关的二级或更高级别、或者三级或更高级别的不良事件。在这方面，用于测量和分级与用化合物治疗受试者相关的生理事件的技术，以及分级不良事件列表，由美国国家卫生研究院(National Institute for Health，NIH)根据不良事件通用术语标准(CTCAE)v5.0维护(快速参考指南，不良事件通用术语标准(CTCAE)5.0版发布：2017年11月27日)，所述文献通过引用并入本文。

此外，在本文所描述的各种方法中，优选的是CNP变体肽或包括其的组合物或制剂的施用不引起以下生理参数中的一种或多种生理参数在临床上的显著变化(与基线相比增加或减少)：血液血红蛋白浓度、血小板数、血液电解质浓度、血液尿素氮浓度、血液肌酐浓度、血液碱性磷酸酶浓度、血液丙氨酸氨基转移酶浓度或血液天冬氨酸氨基转移酶浓度。“临床上的显著变化”意指观察到的引起受试者整体健康状况发生可检测/可观察的不利生理变化的上述参数中的任何一种或多种参数的变化。

CNP变体肽的药物组合物和制剂

在另外的实施例中，本公开考虑了包括CNP变体肽的药物组合物和制剂以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂的用途。在某些实施例中，组合物进一步包括一种或多种其它生物活性剂(例如，蛋白酶抑制剂、受体酪氨酸激酶和/或清除受体NPR-C)。

赋形剂、载体和稀释剂的非限制性实例包含媒剂、液体、缓冲液、等渗剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、润湿剂、佐剂等。组合物可以含有液体(例如水、乙醇)；具有各种缓冲内容物(例如Tris-HCl、磷酸盐、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液)、pH和离子强度的稀释剂；去污剂和增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；抗氧化剂(例如甲硫氨酸、抗坏血酸、焦亚硫酸钠)；防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、间甲酚)；和增容物质(例如乳糖、甘露醇、蔗糖)。赋形剂、稀释剂和载体在药物组合物制剂中的用途是本领域已知的；参见例如《雷明顿氏药物科学》，第18版，第1435-1712页，麦克出版公司(宾夕法尼亚州伊斯顿市(1990))，所述文献通过引用整体并入本文。

例如，载体包含但不限于稀释剂、媒剂和佐剂以及植入载体，和不与活性成分反应的惰性、无毒固体或液体填料和封装材料。载体的非限制性实例包含磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水和乳液(例如油/水乳液)。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油和其混合物。

在一些实施例中，组合物是液体制剂。在某些实施例中，制剂包括浓度范围为约0.1mg/ml至约20mg/ml、或约0.5mg/ml至约20mg/ml、或约1mg/ml至约20mg/ml、或约0.1mg/ml至约10mg/ml、或约0.5mg/ml至约10mg/ml、或约1mg/ml至约10mg/ml、或约2mg/ml至约10mg/ml、或约2mg/ml、或约10mg/ml的CNP变体肽。在其它实施例中，制剂可以是冻干制剂或可以是先前由冻干制剂重构的液体制剂。

在另外的实施例中，组合物包括缓冲溶液或缓冲剂以将含有CNP的溶液或悬浮液的pH维持在期望的范围内。缓冲溶液的非限制性实例包含磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水和汉克氏缓冲盐水(Hank′s buffered saline)。缓冲剂包含但不限于乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸一水合物和柠檬酸钠二水合物。也可以使用缓冲剂的混合物。在某些实施例中，缓冲剂是乙酸/乙酸盐或柠檬酸/柠檬酸盐。组合物中合适的缓冲剂的量部分取决于所使用的具体缓冲液和溶液或悬浮液的期望pH。例如，乙酸盐在pH 5下比在pH 6下是更有效的pH缓冲液，因此在pH 5下的溶液中可以使用比在pH 6下更少的乙酸盐。在一些实施例中，缓冲剂的浓度为约10mM±5mM。在某些实施例中，组合物的pH为约pH 3至约pH 7.5、或约pH 3.5至约pH 7、或约pH 3.5至约pH 6.5、或约pH 4至约pH 6、或约pH 4至约pH 5，或者在约pH 5.0±1.0下，或者在约pH 5.5±1.0下。

在其它实施例中，组合物含有等渗剂以使溶液或悬浮液等渗并且更适合注射。等渗剂的非限制性实例包含NaCl、海藻糖、甘露醇、右旋糖、葡萄糖、甘油、山梨糖醇、木糖醇和乙醇。在某些实施例中，等渗剂是海藻糖或甘露醇，其可以单独或组合使用。在某些实施例中，海藻糖或甘露醇的浓度为约160±20mM、或约140mM±20mM、或约120±20mM、或约100mM±20mM、或约80mM±20mM、或约60mM±20mM。

在各个实施例中，组合物可以包括防腐剂。防腐剂包含但不限于间甲酚和苯甲醇。在某些实施例中，防腐剂的浓度为约0.4％±0.2％、或约1％±0.5％、或约1.5％±0.5％、或约2.0％±0.5％。在本发明的某些实施例中，组合物或制剂不含防腐剂。

在各个实施例中，组合物含有抗吸附剂(例如，以减轻CNP变体对玻璃或塑料的吸附)。抗吸附剂包含但不限于苯甲醇、聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。在某些实施例中，抗吸附剂的浓度为约0.001％至约0.5％、或约0.01％至约0.5％、或约0.1％至约1％、或约0.5％至约1％、或约0.5％至约1.5％、或约0.5％至约2％、或约1％至约2％。

在各个实施例中，组合物包括稳定剂。稳定剂的非限制性实例包含甘油、丙三醇、硫代甘油、甲硫氨酸和抗坏血酸和其盐。在一些实施例中，当稳定剂为硫代甘油或抗坏血酸或其盐时，稳定剂的浓度为约0.1％至约1％。

在各个实施例中，组合物含有抗氧化剂。示例性抗氧化剂是但不限于抗坏血酸。在某些实施例中，抗氧化剂与CNP变体肽的摩尔比为约0.1∶1至约15：1、或约1∶1至约15：1、或约0.5∶1至约10：1、或约1∶1至约10∶1或约3∶1至约10∶1。

组合物中可以使用药学上可接受的盐，包含但不限于无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐)、有机酸盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐)和胺盐(例如异丙胺、三甲胺、二环己胺、二乙醇胺)。药学上可接受的盐的深入讨论可见于以下：《雷明顿氏药物科学》，第18版，麦克出版公司，(宾夕法尼亚州伊斯顿市(1990))。

用于肠胃外施用的制剂可以制备为例如液体溶液或悬浮液、适于注射前溶解或悬浮在液体介质中的固体形式、或乳液。例如，无菌可注射溶液和悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的稀释剂、载体、溶剂(例如缓冲水溶液、林格氏溶液(Ringer′ssolution)、等渗氯化钠溶液)、分散剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂等来调配。另外，可以使用无菌固定油、脂肪酯、多元醇和/或其它非活性成分。作为另外的实例，用于肠胃外施用的制剂包含无菌可注射水溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以含有悬浮剂和增稠剂。

示例性含CNP肽的制剂描述于美国专利8,198,242、8,598,121、9,907,834和10,646,550中。考虑使用pH在约4至约6范围内的CNP制剂。

在各个实施例中，组合物是缓释组合物。

在各个实施例中，CNP变体肽可以调配在药物载体中，用于施用于受骨骼发育不良影响的受试者。在一些实施例中，CNP变体肽的液体制剂根据成分的任何组合调配，并且其量或浓度如下文所描述：

包括CNP变体肽的组合物也可以是冻干制剂。在某些实施例中，冻干制剂包括缓冲液和增容剂，以及任选的抗氧化剂。示例性缓冲液包含但不限于乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。示例性增容剂包含但不限于甘露醇、蔗糖、葡聚糖、乳糖、海藻糖和聚维酮(PVPK24)。在某些实施例中，甘露醇和/或海藻糖的量为约3％至约10％、或约4％至约8％、或约4％至约6％。在某些实施例中，蔗糖的量为约6％至约20％、或约6％至约15％、或约8％至约12％。

在各个实施例中，CNP变体肽的冻干制剂由根据下文所描述成分和其量或浓度的任何组合调配的制剂制备：

在各个实施例中，包括CNP变体肽的制剂的pH为约3-7、或约3-6、或约3.5-6.5、或约4-6、或约4-5、或约4.5-5.5。在一些实施例中，对于pH 4-5.5，合适的缓冲剂是乙酸/乙酸盐(例如乙酸钠)，并且对于pH 5.5-6，合适的缓冲剂是柠檬酸/柠檬酸盐。柠檬酸/柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)在pH 3-6或pH 4-6范围内也是合适的缓冲剂。在某些实施例中，缓冲剂在制剂中的浓度为约2-50mM、或约2-40mM、或约2-30mM、或约5-30mM、或约2-20mM、或约5-20mM、或约5-15mM。

此外，为了最小化或避免CNP变体肽的脱酰胺化，可以通过冻干从制剂中除去水。在一些实施例中，冻干制剂含有以下组分的任何组合：缓冲剂：乙酸钠和乙酸，或柠檬酸钠和柠檬酸；等渗剂/增容剂：甘露醇(例如，3-10％、2-8％或4-6％)；蔗糖(例如，6-20％、5-15％或8-12％)；抗氧化剂：甲硫氨酸和/或抗坏血酸，其中每种抗氧化剂与CNP变体肽的摩尔比为约0.1∶1至约1∶1、或约0.5∶1至约5∶1、或约1∶1至约15∶v、或约1∶1至约10∶1、或约3∶1至约10∶1。

还可以通过在较低温度如在约5℃、0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃或-100℃下储存CNP组合物(例如液体制剂或冻干制剂)来最小化或避免脱酰胺化。

为了最小化或避免CNP变体肽中可氧化残基(例如甲硫氨酸)的氧化，可以用一种或多种抗氧化剂调配所述变体。示例性抗氧化剂包含但不限于甲硫氨酸、抗坏血酸和硫代甘油。例如甲硫氨酸残基的氧化也可以通过用氮气或氩气从液体介质(如果是液体制剂)中清除氧气，和/或通过用氮气或氩气从容器或包装中清除氧气来最小化或防止。

在一些实施例中，为了最小化或防止吸附(例如，CNP变体肽吸附到塑料或玻璃上)，将聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或苯甲醇、或其组合添加到CNP制剂中。在某些实施例中，抗吸附剂中的每种抗吸附剂的浓度为约0.001％至约0.5％、或约0.01％至约0.5％、或约0.1％至约1％、或约0.5％至约1％、或约0.5％至约1.5％、或约0.5％至约2％、或约1％至约2％。制剂中抗吸附剂的示例性范围包含但不限于约0.001％至约0.5％的聚山梨醇酯20、约0.001％至约0.5％的聚山梨醇酯80和/或约0.5％至约1.5％的苯甲醇。

在各个实施例中，制剂包括柠檬酸、柠檬酸钠、海藻糖、甘露醇、甲硫氨酸、聚山梨醇酯80和任选地无菌注射用水(WFI)。

本公开还提供了含有例如瓶子、小瓶、安瓿、管、筒和/或注射器的试剂盒，其包括液体(例如，无菌可注射)制剂或固体(例如，冻干)制剂。试剂盒还可以含有药学上可接受的媒剂或载体(例如溶剂、溶液和/或缓冲液)，用于将固体(例如冻干)制剂重构成用于(例如通过注射)施用的溶液或悬浮液，包含但不限于在注射器中重构冻干制剂，用于注射或将浓缩物稀释到较低浓度。此外，临时注射溶液和悬浮液可以由例如包括含有CNP的组合物的无菌粉末、颗粒或片剂来制备。试剂盒还可以包含分配装置，如气雾剂或注射分配装置、笔式注射器、自动注射器、无针注射器、注射器和/或针头。

给药的剂量和频率

如本文所使用的，术语活性剂(例如CNP变体肽)的“治疗有效量”是指为患者提供治疗益处的量。所述量可能因人体而异，并且可能取决于多种因素，包含患者的整体身体状况。本领域技术人员可以使用公开可用的材料和程序容易地确定CNP变体肽的治疗有效量。例如，基于0-17岁软骨发育不全儿童(214名女性和189名男性)的生长图表，用于疗法的CNP变体肽的量应给出可接受的生长速率，所述生长图表列出了年龄别身高、头围和节段生长(Horton WA等人，软骨发育不全的标准生长曲线(Standard growth curves forachondroplasia)，《儿科杂志(J.Pediatr.)》，93：435-8(1978))。CDC图表可以用于评估年龄别体重、身高别体重或年龄别BMI。还可以测量本质上更慢性的过程的次要结果。

特定个体的给药频率可以根据各种因素而变化，包含所治疗的病症以及个体对疗法的状况和应答。在某些实施例中，将含有CNP变体肽的药物组合物施用于受试者约每天一次、每两天一次、每三天一次、或每周一次、每周两次、每周三次、每两周一次或每月一次。在一个实施例中，为了治疗骨相关病症(例如，骨骼发育不良，包含软骨发育不全)，向患者施用每日或每周的CNP变体肽剂量，直到成年和/或贯穿成年。

在某些实施例中，本文所描述的CNP变体组合物以约3、4、5、6、7、8、9或10nmol/kg至约300nmol/kg、或约20nmol/kg至约200nmol/kg范围内的剂量施用。在一些实施例中，CNP组合物以约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175，180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的剂量或主治医生认为合适的其它剂量施用。在其它实施例中，CNP变体组合物以约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的剂量或主治医生认为合适的其它剂量施用。在其它实施例中，CNP变体组合物以约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mg/kg、或约0.5、0.8、1.0、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/kg的剂量或主治医生认为合适的其它剂量施用。本文所描述的CNP或CNP变体的剂量可以根据本文所描述的给药频率/施用频率来施用，包含但不限于每天、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。在各个实施例中，每天皮下施用CNP或CNP变体。在各个实施例中，每周皮下施用CNP或CNP变体。在各个实施例中，CNP变体以2.5μg/kg/天至60μμg/kg/天、10μg/kg/天至45μg/kg/天或15μg/kg/天至30μg/kg/天的剂量施用。在各个实施例中，CNP变体以15μg/kg/天的剂量施用。在各个实施例中，CNP变体以30μg/kg/天的剂量施用。CNP变体肽的施用可以发生在延长的时间段内，在一些情况下，超过一个月、三个月、六个月、12个月或更长时间。在各个实施例中，治疗可以在3个月或6个月时开始，或者当例如通过基因测试确定受试者患有骨骼发育不良时开始，并且可以持续，直到生长板闭合。

CNP变体或其组合物还可以通过在靶作用位点(例如，异常或退化的关节或软骨区域)处植入储库来施用。可替代地，CNP变体可以通过透皮递送(例如，通过皮肤上的贴剂)在舌头下舌下施用(例如，舌下片剂)或以微球、微胶囊、脂质体(不带电或带电(例如，阳离子))、聚合物微粒(例如，聚酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液等的形式口服施用。

本文所描述的CNP变体组合物可以以治疗有效剂量施用于有需要的患者以治疗、改善或预防骨相关病症(例如，骨骼发育不良，包含软骨发育不全)。CNP变体的安全性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药理学程序确定，例如，通过确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且其可以被表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的活性剂通常是优选的。

针对特定受试者的CNP变体肽的给药/施用频率可以根据各种因素而变化，包含所治疗的病症以及受试者对疗法的状况和应答。每次给药，CNP变体肽可以以单剂量或多剂量施用。在某些实施例中，CNP变体肽以单剂量或多剂量、每天、每隔一天、每3天、每周2次、每周3次、每周、每两周、每3周、每月、每6周、每2个月、每3个月或主治医生认为合适的时间施用。

在一些实施例中，施用CNP变体肽以用于生长期(例如，软骨形成)，随后是恢复期(例如，成骨)。例如，CNP变体肽可以每天或每周多次静脉内、皮下、关节内或通过其它方式施用一段时间，随后一段时间不治疗，然后重复所述循环。在一些实施例中，初始治疗时间段(例如，每天或每周多次施用CNP变体肽)为3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在相关实施例中，不治疗的时间段持续3天、1周、2周、3周或4周。在某些实施例中，CNP变体肽的给药方案是每天，持续3天，随后停药3天；或者每天或每周多次，持续1周，随后停药3天或1周；或者每天或每周多次，持续2周，随后停药1或2周；或者每天或每周多次，持续3周，随后停药1、2或3周；或者每天或每周多次，持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，随后停药1、2、3或4周。

施用方式

CNP变体肽或包括其的药物组合物或制剂可以以各种方式施用于受试者，例如通过皮下、关节内、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮内或鞘内注射。在一个实施例中，CNP变体肽通过单次皮下、关节内、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮内或鞘内注射每天一次、每隔一天一次、每三天一次或每周一次来施用。

CNP变体肽也可以通过在疾病位点处或附近直接注射来施用。进一步地，CNP变体肽可以通过在靶作用位点(例如，异常或退化的关节或软骨区域)处植入储库来施用。可替代地，CNP变体肽可以在舌头下舌下(例如，舌下片剂)或通过吸入肺部(例如，吸入器或气雾剂喷雾)、通过递送到鼻腔(例如，鼻内喷雾)、通过递送到眼睛(例如，滴眼剂)或通过透皮递送(例如，通过皮肤上的贴剂)来施用。CNP变体肽还可以以微球、微胶囊、脂质体(不带电或带电(例如，阳离子))、聚合物微粒(例如，聚酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液等的形式口服施用。

另外的施用方法是通过渗透泵(例如，Alzet泵)或微型泵(例如，Alzet微型渗透泵)，其允许在预定时间段内进行CNP变体肽或药物组合物的受控、连续和/或缓释递送。渗透泵或微型泵可以植入皮下或靶位点附近(例如四肢的长骨、骨骺等)。

对于本领域技术人员显而易见的是，CNP变体肽或其组合物还可以通过其它方式施用。CNP变体肽或其组合物的最有效施用模式的确定在本领域技术人员的技术范围内。

生物标志物

为了治疗骨相关病症，可以测量生长指标，如子宫内和新生儿的长骨生长测量以及骨生长生物标志物的测量，如CNP、cGMP、II型胶原蛋白、X型胶原蛋白、骨钙素和增殖细胞核抗原(PCNA)。

用于评估骨骼发育不良的治疗的生物标志物还包含NTproCNP、X胶原蛋白的N末端片段(CXM)、CNP、cGMP、II型胶原蛋白前肽和其片段、II型胶原蛋白和其片段、I型胶原蛋白前肽和其片段、I型胶原蛋白和其片段、骨钙素、增殖细胞核抗原(PCNA)、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素、X胶原蛋白和碱性磷酸酶。可以在任何合适的生物样品中测量软骨和骨相关生物标志物，包含但不限于组织、血液、血清、血浆、脑脊液、滑液和尿液。在一些实施例中，生物标志物是在来自进行体内功效/药效学研究的动物的血液、血浆或血清中和/或从离体研究的条件培养基中测量的。

一种CNP信号传导标志物是cGMP(鸟苷3′，5′环单磷酸)。CNP与其同源受体NPR-B结合并激活其后，这种胞内信号传导分子的水平会增加。可以从CNP暴露之后的细胞培养物提取物(体外)、CNP暴露之后来自骨外植体研究的条件培养基(离体)以及在皮下、静脉内或通过本领域已知的其它施用途径施用CNP的数分钟内在血浆中(体内)测量cGMP的升高水平。

还可以测量软骨和骨特异性分析物(或软骨和骨相关标志物)来评估CNP功效。例如，切割的II型胶原蛋白片段是软骨转换的软骨特异性标志物。II型胶原蛋白是软骨的主要有机成分，并且II型胶原蛋白片段(切割的胶原蛋白)被释放到循环中，并且随后在软骨转换后分泌到尿液中。软骨转换先于新骨形成。

可以测量的骨形成的骨特异性生物标志物是I型前胶原的N末端前肽(PINP)。I型胶原蛋白的合成是骨形成的重要步骤，因为I型胶原蛋白是骨基质的主要有机组分。在胶原蛋白合成期间，前肽从前胶原分子中释放出来，并且可以在血清中检测到。另外，I型胶原蛋白片段可以作为骨吸收的标志物进行测量。

软骨和骨形成以及生长的其它潜在生物标志物包含聚集蛋白聚糖硫酸软骨素(软骨转换的软骨特异性标志物)、II型胶原蛋白前肽(软骨形成的软骨特异性标志物)、I型胶原蛋白C-端肽(CTx)、碱性磷酸酶(骨特异性)和骨钙素(骨形成的骨特异性标志物)。可以使用可商购获得的试剂盒测量软骨和骨相关生物标志物，例如，在来自体内功效/药效学研究和离体研究的条件培养基的血清中。可以在任何合适的生物样品中测量软骨和骨相关生物标志物，包含但不限于组织、血液、血清、血浆、脑脊液、滑液和尿液。

在一个实施例中，在已施用本文所描述的CNP变体或组合物的受试者中测定或测量至少一种骨或软骨相关生物标志物的水平，以便监测CNP组合物对体内骨和软骨形成以及生长的影响。例如，至少一种骨或软骨相关生物标志物水平的增加可能表明，施用CNP变体或组合物对骨生长具有积极作用，并且是针对骨骼发育不良和其它骨或软骨相关疾病或与CNP活性降低相关的病症的有用治疗。示例性骨或软骨相关生物标志物包含但不限于CNP(例如，CNP的内源性水平)、cGMP、II型胶原前肽和其片段、II型胶原和其片段、I型胶原C-端肽(CTx)、骨钙素、增殖细胞核抗原(PCNA)、I型前胶原前肽(PINP)和其片段、I型胶原和其片段、X型胶原、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素和碱性磷酸酶。在各个实施例中，测得的生物标志物包含NTproCNP、X胶原蛋白的N末端片段(CXM)、CNP、cGMP、II型胶原蛋白前肽和其片段、II型胶原蛋白和其片段、I型胶原蛋白前肽和其片段、I型胶原蛋白和其片段、骨钙素、增殖细胞核抗原(PCNA)、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素、X胶原蛋白和碱性磷酸酶。

在各个实施例中，通过从将要施用、正在施用或已经施用CNP变体的受试者获得生物样品来测量生物标志物。可以使用本领域已知的技术测量生物标志物，包含但不限于蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)和酶活性测定。生物样品可以是血液、血清、尿液或其它生物流体。

本公开的另外的方面和细节将根据以下实例而变得显而易见，所述实例旨在是说明性而非限制性的。

实例

实例1-CNP变体在0-5岁软骨发育不全患者中的2期试验

为了确定CNP变体肽对较年幼软骨发育不全患者的骨骼发育不良(如软骨发育不全)症状以及对长骨生长和/或生长速度(如通过治疗后与治疗前相比患者站立高度的增加速率测量的)的影响，剂量研究是在小于2岁(含)和2至5岁的软骨发育不全(ACH)儿童中进行的，所述儿童有ACH记录，如通过临床依据记录并通过基因测试证实的。

在施用包括如本文所描述的CNP变体肽的制剂之前。更具体地，将Pro-Gly-CNP-37肽调配成无菌、无防腐剂的组合物，其包括2.0mg/ml CNP肽与0.28mg/ml柠檬酸一水合物、1.08mg/ml柠檬酸钠二水合物、58.01mg/ml海藻糖二水合物、15mg/ml D-甘露醇、0.73mg/mlL-甲硫氨酸和0.05mg/ml聚山梨醇酯80的组合，pH 5.5。此液体组合物由包括所描述组分的最初冻干制剂重构，并且以无菌、单次使用、I型未经处理的硼硅酸盐透明玻璃小瓶提供。这种重构的液体制剂用于本文所描述的所有人临床治疗研究中。

为了评估ACH较年幼儿童每天SC注射伏索利肽的安全性和功效，开展了0至5岁的随机、双盲、安慰剂对照、全球、多中心2期研究(研究111-206和扩展研究111-208)。

群组1-≥24月龄至<60月龄的儿童(总共n≥30：接受伏索利肽的三名前哨受试者，以及按1：1随机分配到治疗组或安慰剂对照组的至少27名另外受试者)，按年龄分层(≥24月龄至<36月龄以及≥36月龄至<60月龄)。所有受试者群组1：15μg/kg/天皮下注射(所有受试者)。

群组2-≥6月龄至<24月龄的儿童(总共n≥20：接受伏索利肽的三名前哨受试者，以及按1：1随机分配到治疗组或安慰剂对照组的至少17名另外受试者)，按年龄分层(≥6月龄至<15月龄以及≥15月龄至<24月龄)。此群组中的所有受试者均以30μg/kg/天治疗，当受试者年满2岁时，调整到15μg/kg/天。

群组3-0月龄至<6月龄的儿童(总共n≥20：接受伏索利肽的三名前哨受试者，以及按1：1随机分配到治疗组或安慰剂对照组的至少17名另外受试者)。治疗在3个月观察之后≥3个月至<6个月时开始。

群组1和群组2受试者必须在筛选前进行至少6个月时间段的治疗前生长评估，并且在111-206的筛选访视前至少6个月记录一次身高/体长测量结果。群组3受试者在治疗前必须至少观察3个月。此观察期可以通过以下获得：(1)通过事先登记另一项相关研究，或(2)通过在开始治疗之前登记此111-206用于进行至少3个月的非治疗观察。

主要终点包含第52周时的长度/身高z评分以及任何不良事件的评估。次要终点包含第52周时的AGV、双侧下肢X射线、脊柱X射线、全身和脊柱DXA、AUC0-∞、AUC0-t、C_max、T_max、t_1/2、CL/F、V_z/F、髋关节监测临床评估、Bayley-III、WeeFIM和ITQOL评分、CBCL评分、抗伏索利肽总抗体(TAb)、抗伏索利肽抗体与内源性CNP、ANP和BNP(TAb)的交叉反应性、抗伏索利肽中和抗体(NAb)、CXM和骨特异性碱性磷酸酶、II型胶原蛋白(CTX-II)、环磷酸鸟苷(cGMP)、人体测量结果、上身与下身部分比率、上臂长度与下臂(前臂)长度比率、大腿长度(股)与膝盖至脚跟长度比率、大腿长度(股)与胫骨长度比率以及臂展与站立高度比率。

探索性成像评估数据包含脊柱、长骨和四肢的测量结果和形态，以及生长板、骨龄和骨矿物质密度的量度。测定包含用于进行基线髋关节评估的骨盆前后(AP)x射线；用于评估骨龄(Greulich，1971，斯坦福大学出版社(Stanford University Press))；(Tanner，1975，《学术出版社》)、生长板、手长和皮质厚度的左手和手腕的后前(PA)射线照相；用于评估生长板、胫骨长度、皮质厚度和弓形的AP下肢射线照相；用于评估横向椎弓根间距离的腰椎的AP射线照相。进行腰椎侧位射线照相以评估胸腰椎前凸角度、椎体形态以及与椎管狭窄相关的其它潜在变化，进行前臂和胫骨QCT扫描以评估骨矿物质密度、生长板形态和骨长度。此扫描可以用标准CT扫描仪、校准体模和指定软件，使用预定的低辐射剂量方案来获取，这避免直接辐射到头部和躯干。

肘关节运动范围的屈伸量度是用测角仪测量的。

通过相对于基线的变化来评估生物标志物，并且包含但不限于评估软骨转换(CTX-II)、软骨细胞和成骨细胞活性(骨特异性碱性磷酸酶)、骨形成(P1NP)、骨转换(骨钙素)；和CNP生物活性标志物(cGMP、NT-proCNP和ANP)以及另外的生物标志物。在指定时间点收集胶原蛋白和骨转换的血液和尿液生化标志物以及CNP活性标志物的样品。

不良事件.定期评估上文所描述的群组中的每个群组中的所有患者的具体由CNP变体肽治疗引起的不良事件(如通过不良事件通用术语标准(CTCAE)(5.0版发布：2017年11月27日)定义)的存在。三个研究群组中的任何研究群组中的没有患者出现被确定与研究药物相关的二级或更高级不良事件，这表明用CNP变体肽治疗软骨发育不全患者不会导致严重的不良生理事件。

每个研究群组中的所有患者均被定期监测血红蛋白浓度、血小板数量、血电解质浓度、血尿素氮浓度、血肌酐浓度、血碱性磷酸酶浓度、血丙氨酸氨基转移酶浓度和血天冬氨酸氨基转移酶浓度。

通过与疾病控制中心(Centre for Disease Control，CDC)提供的平均身材儿童的参考数据进行比较，每次站立高度测量结果均转换为适合年龄和性别的标准偏差评分(SDS)，也称为身高Z评分。按群组和总体汇总并呈现了前哨受试者的身高Z评分以及其在第26周和第52周相对于基线的变化。

类似于身高Z评分汇总了AGV、上身与下身部分比率以及站立高度和坐高。按群组和总体汇总了前哨受试者的结果。在每个时间点汇总了其它人体测量量度(坐高、头围等)，并且评估了相对于基线的变化。对于较年幼的受试者，测量并且在分析中使用体长而不是站立高度。类似地，测量的是头臀而不是坐高。

44名受试者已纳入研究111-206并接受治疗，四名前哨受试者和31名随机受试者在群组1中，并且4名前哨受试者和16名随机受试者在群组2中。群组3中包含3名前哨受试者和4名随机受试者。在第一评估期，在群组1中，四名前哨受试者已完成52周的治疗，而所有26名随机受试者已完成第13周访视，并且九名随机受试者已完成第39周访视。在群组2中，两名前哨受试者已完成第26周的访视。在数据截止日期时，没有受试者停止研究药物或111-206研究。在后来的评估期，已纳入67名受试者，并且所有37名接受治疗的受试者均包含在安全性分析群体和完整分析集(FAS)中，所述FAS被认为是主要功效分析集。另外，研究206和研究208均正在进行中，并且截至数据截止点，随机受试者仍处于盲态，因此下文呈现的结果是前哨受试者的结果。图1提供了研究参与者的人口统计资料。

结果：52周的治疗

前哨受试者的结果的汇总呈现在表1中。

表1.年化生长速度、身高Z评分和身体比例相对于基线的变化(前哨受试者)

平均值±SD，2个或更少受试者的个体值，-：未测量

AGV：年化生长速度。

a)从研究206开始的时间段

b)对于群组1和2，计算基于过去6个月内的研究901的身高数据；对于群组3，计算基于过去3个月内的研究901的身高数据。

c)每次访视的AGV使用前12个月的高度数据计算。

身高Z评分相对于基线的变化

对于群组1前哨受试者，平均值(SD)基线身高Z评分为-4.51(0.33)。对于群组l前哨受试者(N＝4)，在第26周身高Z评分相对于基线的平均值(SD)变化为+0.15(0.19)，并且在第52周为+0.34(0.27)。

对于群组2前哨受试者，平均值(SD)基线身高Z评分为-4.72(0.53)。对于群组2前哨受试者(N＝4)，在第26周相对于基线的平均值(SD)变化为+0.43(0.69)，并且在第52周为+0.84(0.25)。对于群组3前哨受试者，平均值(SD)基线身高Z评分为-4.18(0.77)。对于群组3前哨受试者(N＝3)，在第26周身高Z评分相对于基线的平均值(SD)变化为+0.08。

年化生长速度相对于基线的变化

群组1前哨受试者的基线AGV为6.21cm/年，群组2前哨受试者的基线AGV为11.93cm/年，并且群组3的基线AGV为24.78厘米/年。在群组1前哨受试者(N＝4)中，治疗26周后，AGV相对于基线的平均值(SD)增加为0.69(1.70)cm/年，并且治疗52周后，AGV相对于基线的平均值(SD)增加为0.57(0.91)cm/年。

在四个群组2前哨受试者中，治疗26周后，AGV相对于基线的平均值(SD)减少为1.53(3.03)cm/年，并且在第52周AGV相对于基线的平均值(SD)减少为2.75(1.65)cm/年。在群组3前哨受试者中，治疗26周后，AGV相对于基线的平均值(SD)减少为5.03cm/年。

上身与下身部分比率

在初始检查点，两个群组的上半身与下半身比率没有随时间推移的变化。在群组1前哨受试者(N＝4)中，从基线到第26周，上半身与下半身部分比率的平均值(SD)变化为-0.04(0.06)，并且到第52周为-0.02(0.12)。对于群组2前哨受试者(N＝2)，从基线到第26周，上半身与下半身部分比率的平均值(SD)变化为-0.07(0.05)cm，并且在第52周为-0.19(0.28)cm。在后来的检查点，群组3也发现了同样的效果，其中在第26周比率变化为-0.37。

站立高度和坐高

在群组1前哨受试者(N＝4)中，在第26周站立高度相对于基线的平均值(SD)变化为3.38(0.82)cm，并且在第52周为6.78(1.12)cm。经过2年的治疗，受试者中的每位受试者的站立高度都发现一致改善。在第26周坐高相对于基线的平均值(SD)变化为1.98(1.12)cm，并且在第52周为4.69(0.43)cm。

在群组2前哨受试者(N＝2)中，在第26周站立高度相对于基线的平均值(SD)变化为5.15(1.01)cm，并且在第52周为9.22(0.98)cm。在2个前哨受试者中，在第26周坐高相对于基线的平均值(SD)变化为3.70(0.19)cm。

四肢身体比例相对于基线的变化以及生长量度相对于基线的变化

在第26周和第52周，身体比例没有出现在临床上的显著变化。在所有生长量度(头围、臂展、上臂长度、下臂长度、下半身长度、大腿长度、膝盖到脚跟长度和胫骨长度)中，群组1和群组2的生长都有一致的积极改善。

在研究111-206中，在每天以15μg/kg治疗52周内，2至5岁ACH受试者的平均Cmax和AUC0-∞与较年长ACH受试者(5-18岁)使用15μg/kg的平均Cmax和AUC0-∞基本一致，范围分别为3810至6860pg/mL和118000至350000皮克-分钟/毫升。中位Tmax范围为14.0至15.5分钟，并且平均t1/2范围为15.2至29.3分钟。平均CL/F和Vz/F范围分别为82.1至150毫升/分钟/千克和2650至3800mL/kg。有证据表明，在15rig/kg下，研究111-206群组1年龄为2至<5岁受试者的暴露类似于研究111-301中年龄为5至18岁受试者的暴露。

群组2前哨使用相同剂量15μg/kg。对群组2的PK数据分析表明，达到期望暴露的合适剂量为30μg/kg/天，随后将3名前哨增加到30μg/kg/天，直到受试者年满2岁，那时所述受试者恢复到15μg/kg剂量。将以同样的方式评估群组3。

下文呈现了在第52周安慰剂和群组1-3的完整数据集(FAS)的分析。

表2.在第52周身高Z评分的协方差分析(总体、群组1、2和3)

CI：置信区间；FAS：完整分析集；SD：标准偏差

^a差值是伏索利肽减去安慰剂。^b两侧p值。^c基于10个插补数据集。

LS平均值和LS平均值的差值通过协方差模型分析获得。模型术语包含治疗、性别、年龄层、基线年龄、基线AGV和基线身高Z评分。

对于<24月龄的参与者，体长优先于站立高度。在基线时<24月龄且在第52周＞＝24月龄的受试者，体长优先。

如果第52周分析访视窗口内没有可用的身高评估，则根据插补身高得出在第52周的身高Z评分。

表3.在第52周年化生长速度的协方差分析(总体、群组1、2和3)

CI：置信区间；FAS：完整分析集；SD：标准偏差

LS平均值和LS平均值的差值通过协方差模型分析获得。模型术语包含治疗、性别、年龄层、基线年龄和基线AGV。

对于群组1和2中的受试者，基线AGV定义为[(基线身高-基线前6个月111-901中最后一次身高测量结果)/(基线日期-基线前6个月111-901中最后一次身高评估日期)]x365.25。对于群组3的参与者，使用111-901或111-206中基线前3个月的身高。基线后访视时的AGV是根据基线得出的。例如，在第52周AGV＝[(第52周访视的身高-基线访视的身高)/(第52周访视的日期-基线访视的日期)]x365.25。

图2表示治疗52周时每个群组的基线Z评分。图3表示每个群组在52周内的基线AGV，并且图4展示了治疗52周后身高Z评分随时间推移的正向变化。在第52周的总体结果显示，与安慰剂(n＝32)相比，伏索利肽(n＝43)：使身高Z评分增加0.30SD(95％CI0.07，0.54)，AGV增加0.92cm/年(95％CI0.24，1.59)，并且没有使上半身与下半身部分比率恶化，变化了-0.06(95％CI-0.15，0.03)。在第52周的数据显示，与所有群组中的对照相比，伏索利肽治疗提高了年化生长速度，并且还提高了经治疗患者的总体身高Z评分。

还分析了伏索利肽在不同患者群体中的药代动力学PK的任何变化(表4)。可获得接受30μg/kg伏索利肽的4名前哨受试者和33名随机受试者(≥24月龄至<60月龄)的PD信息(血浆cGMP和血清CXM)。

表4.BMN 111的多次皮下剂量的药代动力学参数

平均值±SD，tmax：中值[最小值，最大值]，2名或更少受试者的个体值，-：未计算Cmax：最大血浆浓度，AUC0-t：施用后时间0至t的血浆浓度-时间曲线下面积，tmax：达到最大血浆浓度所需的时间，t1/2：终末阶段的消除半衰期，CL/F：表观全身清除率，Vz/F：表观分布容积

a)n＝1

表5示出了在尿液cGMP/Cr中在每个评估时间点相对于基线的变化，并且表6示出了在血清CXM中相对于基线随时间推移的变化。仅分析群组1和2中的前哨受试者的PD参数。

表5.每个评估时间点尿cGMP/Cr相对于给药前的变化

平均值±SD(n)，2名或更少受试者的个体值，-：未计算，单位：pmol cGMP/mg Cr

a)使用施用后大约2至4小时的值进行评估。

表6.在每个评估时间点血清CXM^a)中相对于基线的变化

平均值±SD(n)，2名或更少受试者的个体值，-：未计算，单位：pg/mL

a)使用BMN 11l施用前的值评估血清CXM。

观察到给药后血浆cGMP浓度增加，所述浓度在52周的时间段内保持恒定，并且类似于较年长组中观察到的变化。与基线和安慰剂相比，在整个研究期间(长达39周内)，血清中的针对伏索利肽的CXM(平均值和中位数)增加。然而，伏索利肽与安慰剂之间的值有很大重叠。测量的参数存在高变异性。

群组1受试者(19名接受伏索利肽治疗的受试者和16名接受安慰剂治疗的受试者，≥24月龄至<60月龄)的更新盲法分析显示，血清CXM水平(对所有访视和每次治疗进行平均)大致类似于较年长儿童(即，研究111-301)在相应治疗中观察到的水平。

结果：多于100周的治疗

治疗超过100周的受试者的最新结果显示与第52周的结果类似。群组1(N＝4)中的受试者接受伏索利肽，持续中值978天(范围：921至1012天)，并且群组2(N＝4)中的受试者接受伏索利肽，持续中值733.5天(范围：706至741天)。在两项研究111-206/208中，群组1中的所有前哨受试者均接受了治疗随访，持续至少130周，并且群组2中的所有前哨受试者均接受了治疗随访到第104周；值得注意的是，群组2中的一名受试者在第104周访视时没有进行身高评估，因为所述访视是在数据截止日期之后安排的。

身高Z评分

在群组1前哨中，如通过身高z评分评估的身高缺陷减少在用伏索利肽治疗2.5年内持续。在第104周，三名前哨受试者中的两名受试者的身高Z评分示出提高了+0.77SDS和+0.86SDS，而另外两名受试者的身高Z评分提高了+0.27SDS(在第78周)和+0.20SDS。群组1在第52周(N＝4)表现出相对于基线的平均值(标准差[SD])变化为+0.34(0.27)标准差评分(SDS)，在第104周(N＝3)为+0.62(0.36)SDS，并且在第130周(N＝4)为+0.49(0.34)SDS。对于群组2前哨，在第52周(N＝4)身高Z评分相对于基线的平均值(SD)变化为+0.84(0.25)SDS，并且在第104周(N＝3)持续，其中相对于基线的平均值(SD)变化为+0.69(0.55)SDS。

AGV

在群组1前哨中，在基线时平均值(SD)AGV为6.21(1.73)cm/年。2名受试者在第104周和1名受试者在第78周的AGV高于在基线时的AGV；其中在第104周的第四个受试者仅略有下降。AGV下降的受试者具有高基线AGV并且是群组中最年幼的；AGV的下降可能是由于受试者处于更陡峭的增长下降曲线。在111-206中治疗第一年的平均值(SD)AGV保持在6.78(1.00)cm/年，并且在111-208中治疗第二年为5.85(0.39)cm/年。在群组2前哨中，在基线时平均值(SD)AGV为11.93(1.32)cm/年，治疗第一年为9.17(1.06)，并且治疗第二年为6.55(0.38)。在未经治疗的此年龄范围的ACH儿童中，AGV的下降并不像预期的那么明显，因此说明了伏索利肽对生长速度的积极作用。

站立高度/体长

对于群组1前哨，在第104周，发现受试者中的每个受试者的上半身与下半身部分比率持续下降。在第52周站立高度相对于基线的平均值(SD)增加为6.78(1.12)cm，在第104周时12.91(1.61)cm，并且在第130周为15.28(1.39)cm。在群组2前哨中，在第52周站立高度相对于基线的平均值(SD)变化为9.22(0.98)cm，并且在第104周为15.76(1.42)。

上身与下身比率

在群组1前哨中，随着治疗时间的推移，上半身与下半身部分比率有所下降，其中在第52周的比率相对于基线的平均值(SD)变化为-0.02(0.12)，在第104周(N＝3)为-0.19(0.10)，并且在第130周(N＝4)为-0.19(0.14)。在群组2前哨中，在第52周(N＝4)上半身与下半身部分比率的平均值(SD)减少为-0.19(0.28)，其中在第104周(N＝3)观察到进一步下降，显示相对于基线的平均值(SD)变化为-0.33(0.20)。

基于生物/机制方面的考虑，只要生长板开放，预期伏索利肽将对所有ACH患者发挥有利作用，但是对具有较高生长潜力的年幼患者的益处可能比较年长儿童的益处更大。

基于上文所描述的人临床数据，还将如上文所描述测试向儿童和婴儿软骨发育不全患者每日皮下施用30μg/kg/天的剂量的功效和安全性。完全期望此类给药方案将为人患者的软骨发育不全提供有效且安全的治疗。

本领域的技术人员可以预期如本文所描述的实施例和说明性实例中阐述的本公开的许多修改和变化。因此，只有在所附权利要求中出现的此类限制才应该列在本公开中。

Claims

1.一种治疗小于或约2岁受试者的骨骼发育不良的方法，所述方法包括以有效治疗所述受试者的所述骨骼发育不良的量向所述受试者施用包括C型利钠肽(CNP)变体的组合物，其中所述CNP变体选自由以下组成的组：

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PEO12-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：61)；PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：62)；

PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEO24-CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：63)；PEO24-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：64)；以及

PEO24-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：65)。

2.一种增加小于或约2岁受试者的长骨生长的方法，所述方法包括以有效增加长骨生长的量向所述受试者施用包括C型利钠肽(CNP)变体的组合物，其中所述CNP变体选自由以下组成的组：

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：1)；

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQID NO：)；

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO：6)；

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO：7)；

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO：8)；

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO：9)；

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AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO：15)；

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GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO：31)；

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KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO：34)；

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO：35)；

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SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO：37)；

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO：38)；

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3.一种增加小于或约2岁受试者的生长速度的方法，所述方法包括以有效增加所述受试者的生长速度的量向所述受试者施用包括C型利钠肽(CNP)变体的组合物，其中所述CNP变体选自由以下组成的组：

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：1)；

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO：6)；

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO：7)；

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO：8)；

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO：9)；

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO：10)；

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GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO：31)；

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GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO：39)；

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：44)；

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO：47)；

PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：48)；MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：49)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4，5，9R)])(SEQ ID NO：50)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：51)；

4.根据权利要求3所述的方法，其中生长速度的增加是如通过所述受试者的站立高度高于基线至少25％来测量的年化生长速度的增加，或者其中所述生长速度的增加是如通过所述受试者的站立高度高于基线至少40％来测量的年化生长速度的增加。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述生长速度的增加是通过测量站立高度、坐高、体重、头围、上臂长度、下臂长度、大腿长度、小腿长度、手长或脚长来评估的。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其不引起所述受试者的血液血红蛋白浓度、血小板数、血液电解质浓度、血液尿素氮浓度、血液肌酐浓度、血液碱性磷酸酶浓度、血液丙氨酸氨基转移酶浓度或血液天冬氨酸氨基转移酶浓度在临床上的显著变化。

7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其引起

(a)上身长度与下身长度比率变化介于-0.05与0.05之间；

(b)所述上臂长度与前臂长度比率变化介于-0.05至0.05之间；和/或

(c)所述大腿长度与所述小腿长度比率变化介于-0.05与0.05之间。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中

(a)所述组合物每天施用一次；

(b)所述组合物在至少6个月的时间段内每天施用一次；或

(c)所述组合物在至少12个月的时间段内每天施用一次。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物通过皮下施用施用于所述受试者。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物每天、每隔一天、每周3次、每周2次或每周一次施用。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物以30μg/kg的剂量施用。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者为约6月龄至约2岁。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者为约0至约6月龄。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中当所述受试者为2岁时，剂量可减少到15μg/kg。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述骨骼发育不良选自由以下组成的组：低磷性佝偻病、软骨发育不全、软骨发育不良、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性骨发育不全、成骨不全、软骨成长不全、点状软骨发育不良、纯合软骨发育不全、短指发育不良、先天致死型低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋骨多指综合征、软骨发育不良、肢根型点状软骨发育不良、詹森型干骺端发育不良(Jansen-type metaphysealdysplasia)、先天性椎体骨骺结构不良、骨发育不全症、畸型发育不良、先天性股骨短、兰格型肢中骨发育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中骨发育不良(Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、罗宾诺综合征(Robinow syndrome)、莱因哈特综合症(Reinhardt syndrome)、肢端发育不全、周围性骨发育不全、克尼斯特发育不良(Kniest dysplasia)、纤维软骨增生症、罗伯茨综合症(Roberts syndrome)、肢端肢中发育不全、小肢、莫基奥综合征(Morquio syndrome)、克尼斯特综合征(Kniest syndrome)、后生发育不良、脊椎干骺端发育不良、NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征(Turner′ssyndrome)/莱-韦二氏(LeriWeill))、PTPN11突变(努南综合症(Noonan′s syndrome))和特发性身材矮小。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述骨骼发育不良是软骨发育不全。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括一种或多种药物赋形剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合物包括柠檬酸一水合物、柠檬酸钠二水合物、海藻糖二水合物、D-甘露醇、L-甲硫氨酸和聚山梨醇酯80。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CNP变体选自由以下组成的组：

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO：1)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP-37)(SEQ ID NO：43)；

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO：20)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-37(M32N)](SEQ ID NO：40)；

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP-37)(SEQID NO：42)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP-37)(SEQ ID NO：41)；

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP-37(M32N)(SEQ ID NO：44)；

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO：45)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO：21)；

EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO：22)；HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO：23)；以及PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO：24)。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CNP变体选自由以下组成的组：

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO：1)；以及LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO：20)。

21.一种组合物，其包括C型利钠肽(CNP)变体，所述组合物用于治疗小于或约2岁受试者的骨骼发育不良，其中所述CNP变体肽以约30μg/kg的量施用于所述受试者并且选自由以下组成的组：

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：1)；

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO：6)；

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO：7)；

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO：8)；

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO：9)；

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO：10)；

KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO：11)；

SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO：12)；

RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO：13)；

AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO：14)；

AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO：15)；

WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO：16)；

GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO：31)；

ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO：32)；

NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO：33)；

KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO：34)；

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO：35)；

LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO：36)；

SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO：37)；

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO：38)；

GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO：3*)；

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：44)；

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO：47)；

PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：52)；MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：53)；PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：54)；PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEGlK-CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：55)；

22.一种制剂的用途，其用于制备用于治疗小于或约2岁受试者的骨骼发育不良的药物，所述制剂包括C型利钠肽(CNP)变体，其中所述CNP变体肽以约30μg/kg的量施用于所述受试者并且选自由以下组成的组：

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：1)；

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO：6)；

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO：7)；

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO：8)；

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO：9)；

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO：10)；

KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO：11)；

SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO：12)；

RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO：13)；

AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO：14)；

AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO：15)；

WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO：16)；

KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO：30)；

GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO：31)；

ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO：32)；

NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO：33)；

KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO：34)；

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO：35)；

LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO：36)；

SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO：37)；

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO：38)；

GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO：39)；

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：44)；

GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO：47)；