JP2022547723A - Ｃｎｐバリアントおよびそのコンジュゲート - Google Patents

Abstract

本開示は、一般に、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＲ）の安定なバリアント、および骨関連障害を治療するためのその使用に関する。本開示は、増加した循環半減期および水性媒体中での安定性を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の新規バリアント、そのようなＣＮＰバリアントを含む薬学的組成物、およびそのようなＣＮＰバリアントを使用して、軟骨無形成症などの骨関連障害を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰに応答性の障害を治療する方法に関する。
【選択図】図２Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９０１，０９３号、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３５，０５０号、２０２０年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９６３，３５０号、２０２０年１月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９６４，８５２号、および２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，６６７号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表を明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「５４７３６＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、これは２０２０年８月６日に作成され、サイズは５４，４２９バイトである。配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、一般に、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）のバリアント、ＣＮＰバリアントを含む薬学的組成物、および使用方法に関する。ＣＮＰバリアントは、骨格異形成症（例えば、軟骨無形成症）などの、骨関連障害を含むがこれらに限定されない、ＣＮＰに応答する疾患の治療のための治療剤として有用である。

Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６８：８６３－８７０（１９９０）（ＣＮＰ前駆体タンパク質、ＮＰＰＣに対するＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０７７７２０）（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．，１０：９０７－９１２（１９９２））は、１７アミノ酸のループ構造（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３９：８６３－８７０（１９９８））を有するペプチド（ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ）のファミリーにおける小さな一本鎖ペプチドであり、複数の生物学的プロセスにおいて重要な役割を有する。ＣＮＰはナトリウム利尿ペプチド受容体－Ｂ（ＮＰＲ－Ｂ、ＧＣ－Ｂ）と相互作用して、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の生成を刺激する（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．，１０：１１１１－１１１４（１９９２））。ＣＮＰは、中枢神経系、生殖管、骨、および血管内皮など、広く発現している（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，４９：４１９－４２６（２００７））。

ヒトでは、ＣＮＰは、最初にナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）遺伝子から一本鎖１２６アミノ酸プレプロポリペプチドとして産生される（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６８：８６３－８７０（１９９０））。シグナルペプチドの除去によりプロＣＮＰが生成され、エンドプロテアーゼであるフューリンによるさらなる切断により、活性な５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ－５３）が生成される。これは、未知の酵素によって再度分泌および切断され、成熟した２２アミノ酸ペプチドを産生する。（ＣＮＰ－２２）（Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２５８４７－８５２（２００３））。ＣＮＰ－５３とＣＮＰ－２２とはそれらの分布が異なり、ＣＮＰ－５３は組織で優勢であるが、ＣＮＰ－２２は主に血漿および脳脊髄液に見られる（Ｊ．Ａｌｆｏｎｚｏ，Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，２６：２６９－２９７（２００６））。ＣＮＰ－５３およびＣＮＰ－２２はどちらもＮＰＲ－Ｂと同様に結合する。

ｃＧＭＰ生成によって媒介される下流シグナル伝達は、軟骨内骨化を含む多種多様な生物学的プロセスに影響を及ぼす。例えば、マウスモデルにおけるＣＮＰまたはＮＰＲ－Ｂのいずれかのノックアウトは、より短い長骨および椎骨を伴う矮小化された表現型を有する動物をもたらす。適切なＣＮＰシグナル伝達をブロックするヒトＮＰＲ－Ｂの変異が同定されており、小人症を引き起こす（Ｏｌｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９１（４）：１２２９－１２３２（２００６）、Ｂａｒｔｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：２７－３４（２００４））。対照的に、高レベルのＣＮＰを産生するように操作されたマウスは、細長い長骨および椎骨を示す。
ＣＮＰ（ＣＮＰ２２）の治療的使用は、その短い血漿半減期によって制限されており、これはヒトにおいてインビボで２．６分であることが示されている（Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，７８：１４２８－３５（１９９４））。より長いインビボ血清半減期を有し、野生型ＣＮＰと同様またはその改善された活性を示すＣＮＰバリアントは、持続可能な治療戦略にとって重要である。

Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６８：８６３－８７０（１９９０） Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．，１０：９０７－９１２（１９９２） Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３９：８６３－８７０（１９９８） Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．，１０：１１１１－１１１４（１９９２） Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，４９：４１９－４２６（２００７）

本開示は、増加した循環半減期および水性媒体中での安定性を有するＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の新規バリアント、そのようなＣＮＰバリアントを含む薬学的組成物、およびそのようなＣＮＰバリアントを使用して、軟骨無形成症などの骨関連障害を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰに応答性の障害を治療する方法に関する。

様々な実施形態において、本開示は、ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１）、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号６）、およびＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）からなる群から選択されるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）のバリアントを提供する。

様々な実施形態において、本開示は、ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１）、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号６）、ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、およびＰＧＱＥＨＰＱＡＲＫＹＫＧＡＱＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号７）からなる群から選択されるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）のバリアントを提供する。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、アセチル基をさらに含む。様々な実施形態において、アセチル基は、ペプチドのＮ末端上にある。様々な実施形態において、ペプチドは、Ｃ末端にＯＨまたはＮＨ_２基をさらに含む。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、コンジュゲート部分を含む。様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、ＣＮＰ環状ドメインの残基上、またはＣＮＰ環状ドメイン以外の部位にある。様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、リジン残基上にある。様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、１つ以上の酸部分を含む。様々な実施形態において、酸部分は、疎水性酸である。

様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、親水性スペーサーに連結された１つ以上の酸部分を含む。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、任意のアミノ酸である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、ガンマグルタミン酸（γＧｌｕ）である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、ＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、ガンマグルタミン酸（γＧｌｕ）またはＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、１つまたは２つ以上のＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）に連結されたガンマグルタミン酸（γＧｌｕ）である。様々な実施形態において、酸部分は、脂肪酸である。例示的な脂肪酸には、短鎖、中鎖、もしくは長鎖脂肪酸、またはジカルボン酸脂肪酸が含まれる。様々な実施形態において、脂肪酸は飽和または不飽和である。Ｃ－６、Ｃ－８、Ｃ－１０、Ｃ－１２、Ｃ－１４、Ｃ－１６、Ｃ－１８、またはＣ－２０脂肪酸を含むがこれらに限定されない、Ｃ－６～Ｃ－２０脂肪酸、飽和または不飽和が企図される。様々な実施形態において、脂肪酸は、デカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、またはそれらの二酸である。

様々な実施形態において、酸部分および親水性スペーサーは、構造ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡを有する。様々な実施形態において、酸部分および親水性スペーサーは、以下の構造を有し、

、式中、「

」は、ＣＮＰバリアントへの付着点を表す。様々な実施形態において、「

」は、加水分解可能なリンカーへの付着点を表し、加水分解可能なリンカーは、ＣＮＰバリアントに付着される。様々な実施形態において、加水分解可能なリンカーは、無傷のＣＮＰバリアントを放出することができる。

様々な実施形態において、コンジュゲート部分を有するＣＮＰバリアントは、放出調節組成物の成分である。様々な実施形態において、放出調節組成物は、延長放出組成物である。様々な実施形態において、コンジュゲート部分および加水分解可能なリンカーを含むＣＮＰバリアントは、ＣＮＰバリアントを放出することができ、（ｉ）ＣＮＰバリアントの約２０％未満は、１日目までに放出され、（ｉｉ）ｐＨ７～７．６で、ＣＮＰバリアントの約９０％は、毎週放出されるか、またはＣＮＰバリアントの約９０％は、隔週で放出されるか、またはＣＮＰバリアントの約９０％は、毎月放出される。

様々な実施形態において、（ｉ）ｐＨ７．０～７．６において、約２５％未満、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５％のペプチドが１日目までに放出され、（ｉｉ）ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約９０％が毎週放出されるか、またはペプチドの約９０％が隔週で放出されるか、またはペプチドの約９０％が毎月放出される。さらに、（ｉ）ｐＨ７．０～７．６において、約２５％未満、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５％のペプチドが１日目までに放出され、（ｉｉ）ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が毎週放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が隔週で放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が３週間ごとに放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が毎月放出されるか、あるいは代替的に、ｉｉ）ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％が毎週放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％が隔週で放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％が３週間ごとに放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％が、毎月放出されることが企図される。

様々な実施形態において、バリアントは、構造：ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、またはＡｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号８）を有する。

様々な実施形態において、バリアントは、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号８）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号９）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１０）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１１）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１２）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＫＹＫＧＡＱＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１３）、および
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＫＹＫＧＡＱＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１４）からなる群から選択される。

様々な実施形態において、バリアントは、１つ以上のリンカー基を含む。様々な実施形態において、リンカーは、ＣＮＰ環状ドメインの残基上、またはＣＮＰ環状ドメイン以外の部位にある。様々な実施形態において、リンカーは、リジン残基上にある。

様々な実施形態において、リンカーは、加水分解可能なリンカーである。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、リンカーを介してコンジュゲート部分に付着される。様々な実施形態において、リンカーは、コンジュゲート部分の親水性スペーサーを介してコンジュゲート部分に付着される。様々な実施形態において、リンカーは、アミノエトキシ－２－エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）である。様々な実施形態において、リンカーは、ビシン型またはペプトイドリンカーであり、これは、ビシン（ビス－２－ヒドロキシエチルグリシンアミド）と同様の切断可能なメカニズムを有するが、代わりに非対称Ｎ－アルキルペプチド、すなわち、ペプトイドを介して切断するリンカーを指す。様々な実施形態において、リンカーは、非酵素的β脱離に基づく電子リンカーである。様々な実施形態において、電子リンカーは、ＳＯ_２部分を含む。ＣＮＰコンジュゲートに示されるリンカーの例を図１に示す。Ｓａｎｔｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９：６２１１－６２１６， ２０１２も参照されたい）。

様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、合成ポリマー基である。様々な実施形態において、バリアントは、加水分解可能なリンカーを介してバリアントに結合された合成ポリマー基を含む。様々な実施形態において、合成ポリマー基は、親水性ポリマー部分を含む。様々な実施形態において、親水性ポリマー部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。様々な実施形態において、親水性ポリマー部分は、６～２０原子鎖長を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、合成的に作製される。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．０～７．６で１０日間安定である。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．０～７．４で少なくとも１０日間安定である。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．２～７．６で少なくとも１０日間安定である。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、脱アミド化に対して安定である。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、酸化に対して安定である。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、脱アミド化、および／もしくは酸化、またはそれらの組み合わせに対して安定である。様々な実施形態において、メチオニンは、ノルロイシンによって置き換えられる。様々な実施形態において、１０日後に検出可能な脱アミド化はほとんどまたは全くない。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．０～７．６で約１０日の半減期を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．０～７．４で約１０日の半減期を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．２～７．６で約１０日の半減期を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．０～７．６で少なくとも１０日の半減期を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．０～７．４で少なくとも１０日の半減期を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、約３７℃、ｐＨ７．２～７．６で少なくとも１０日の半減期を有する。様々な実施形態において、半減期は、少なくとも約１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、３０日以上である。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、ｃＧＭＰアッセイにおいて０．１～１０ｎＭのＥＣ５０を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、ｃＧＭＰアッセイにおいて０．１～２５ｎＭのＥＣ５０を有する。

様々な実施形態において、バリアントペプチドの４５％超は、生理学的条件、例えば、約３７℃、ｐＨ７．０～７．６の水性媒体中で１０日後に検出される。様々な実施形態において、バリアントペプチドの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超は、生理学的条件、例えば、約３７℃、ｐＨ７．０～７．６の水性媒体中で１０日後に検出される。

様々な実施形態において、バリアントペプチドの４５％超は、３７℃、ｐＨ７．４の水性媒体中で１０日後に検出される。様々な実施形態において、バリアントペプチドの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超は、３７℃、ｐＨ７．４の水性媒体中で１０日後に検出される。

様々な実施形態において、バリアントペプチドの４５％超は、生理学的条件、例えば、約３７℃、ｐＨ７．０～７．６の血漿中で１０日後に検出される。様々な実施形態において、バリアントペプチドの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超は、生理学的条件、例えば、約３７℃、ｐＨ７．０～７．６の血漿中で１０日後に検出される。

様々な実施形態において、バリアントペプチドの４５％超は、３７℃、ｐＨ７．４の血漿中で１０日後に検出される。様々な実施形態において、バリアントペプチドの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超は、３７℃、ｐＨ７．４の血漿中で１０日後に検出される。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、脂質、脂肪酸、親水性スペーサー、もしくはリンカー、または任意選択でそれらの組み合わせにコンジュゲートされる。様々な実施形態において、リンカーは、親水性ポリマー部分である。様々な実施形態において、親水性ポリマー部分は、合成親水性ポリマー部分である。

様々な実施形態において、バリアントペプチドは、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ３７と比較してより長い半減期を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、ＣＮＰ－２２と比較してより長い半減期を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ３７および／またはＣＮＰ－２２と比較してより長い半減期を有する。様々な実施形態において、バリアントペプチドは、インビトロおよび／またはインビボで、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ３７および／またはＣＮＰ－２２と比較してより長い半減期を有する。

本開示はさらに、本明細書に記載のＣＮＰバリアント、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。

様々な実施形態において、組成物は、約４～約６のｐＨを有するクエン酸／クエン酸塩緩衝液または酢酸／酢酸塩緩衝液を含む製剤から調製される凍結乾燥製剤である。様々な実施形態において、凍結乾燥製剤は、マンニトール、スクロース、ソルビトール、トレハロース、ポリソルベート８０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される等張性調整剤または増量剤をさらに含む製剤から調製される。様々な実施形態において、凍結乾燥製剤は、メチオニン、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩形態、チオグリセロール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗酸化剤をさらに含む製剤から調製される。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアント組成物は、０．８ｍｇ～１０ｍｇの再構成のための凍結乾燥粉末として供給される。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアント組成物は、再構成のための０．８ｍｇまたは２ｍｇの凍結乾燥された防腐剤を含まない粉末として供給される。

様々な実施形態において、組成物は、延長放出組成物である。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ－３７）（ＢＭＮ１１１）（配列番号１）である。

骨関連障害または骨格異形成症の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、本明細書に記載のＣＮＰバリアントを含む組成物を対象に投与することを含む、方法も提供される。

様々な実施形態において、骨関連障害または骨格異形成症は、骨関節炎、低リン酸血症性くる病、軟骨無形成症、軟骨低形成症、低身症、小人症、骨軟骨異形成症、致死性異形成症、骨形成不全症、軟骨無発生症、点状軟骨異形成症、同型接合性軟骨形成不全症、点状軟骨異形成症、彎曲肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ症、周産期致死型骨形成不全症（ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｌｅｔｈａｌ ｔｙｐｅ ｏｆ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ）、短肋骨多指症症候群、軟骨低形成症、肢根型点状軟骨異形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端骨異形成症、成長不全性骨形成症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨症、ランガー型中脚異形成症、ニーバーゲルト型中脚異形成症、ロビンノウ症候群、ラインハルト症候群、先端骨形成不全症、末梢異形成症、ニースト異形成症、線維軟骨形成症、ロバーツ症候群、遠位中間肢異形成症（ａｃｒｏｍｅｓｏｍｅｌｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、短肢症、モルキオ症候群、ニースト症候群、複合有機栄養性異形成、および脊椎骨端骨幹端異形成からなる群から選択される。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、特発性低身長および他の骨格異形成症を治療するための成長ホルモンの補助剤または代替物として有用である。

様々な実施形態において、骨関連障害、骨格異形成症または低身長障害は、ＮＰＲ２変異、ＳＨＯＸ変異（ターナー症候群／レリーワイル）、またはＰＴＰＮ１１変異（ヌーナン症候群）に起因する。

様々な実施形態において、骨関連障害、骨格異形成症または低身長障害は、ＮＰＲ２変異、ＳＨＯＸ変異（ターナー症候群／レリーワイル）、またはＰＴＰＮ１１変異（ヌーナン症候群）、またはインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に起因する。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、家族性低身長、優性遺伝性低身長としても知られる優性家族性低身長、または特発性低身長を含む、成長板障害および低身長を治療するのに有用である。様々な実施形態において、低身長または成長板障害は、コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１０）、アグリカン（ＡＣＡＮ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、ＰＴＰＮ１１、ＮＰＲ２、ＮＰＰＣ、またはＦＧＦＲ３の変異の結果である。

様々な実施形態において、成長板障害または低身長は、ＲＡＳ病に関連する遺伝子の１つ以上の変異に関連している。

様々な実施形態において、骨関連障害、骨格異形成症または低身長障害は、ＲＡＳ病に起因する。様々な実施形態において、ＲＡＳ病は、ヌーナン症候群、コステロ症候群、心臓顔面皮膚症候群、神経線維腫症１型、またはレオパード症候群である。

一実施形態において、ＲＡＳ病は、遺伝性歯肉線維腫症１型である。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、家族性低身長、優性遺伝性低身長としても知られる優性家族性低身長、または特発性低身長を含む、成長板障害および低身長を治療するのに有用である。様々な実施形態において、低身長または成長板障害は、コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１０）、アグリカン（ＡＣＡＮ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、ＰＴＰＮ１１、ＮＰＲ２、ＮＰＰＣ、ＦＧＦＲ３、またはインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）の変異の結果である。

様々な実施形態において、成長板障害または低身長は、ＲＡＳ病に関連する遺伝子の１つ以上の変異に関連している。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、－１．０、－１．５、－２．０、－２．５、または－３．０未満の身長ＳＤＳを有し、身長ＳＤＳ－１．０、－１．５、－２．０、または－２．５未満である少なくとも１人の親を有する低身長の対象を治療するのに有用であり、任意選択で、２番目の親の身長が通常の範囲内にある。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、－２．０～－３．０の身長ＳＤＳを有する低身長の対象を治療するのに有用である。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、－２．０～－２．５の身長ＳＤＳを有する低身長の対象を治療するのに有用である。様々な実施形態において、低身長は、コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１０）、アグリカン（ＡＣＡＮ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、ＰＴＰＮ１１、ＮＰＲ２、ＮＰＰＣ、ＦＧＦＲ３、またはインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、またはそれらの組み合わせなどの低身長に関連する遺伝子の１つ以上の変異に関連する。様々な実施形態において、成長板障害または低身長は、ＲＡＳ病に関連する遺伝子の１つ以上の変異に関連している。

様々な実施形態において、低身長は、多遺伝子リスクスコア（ＰＲＳ）によって決定されるような複数の遺伝子の変異の結果である。様々な実施形態において、対象は、ＮＰＲ２に変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＦＧＦＲ３に変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＮＰＲ２に変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＩＧＦ１Ｒに変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＮＰＰＣに変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＳＨＯＸに変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２およびＳＨＯＸのうちの１つ以上に１つ以上の変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、ＰＲＳは１または２である。様々な実施形態において、ＰＲＳは１である。様々な実施形態において、ＰＲＳは２である。実施例４に記載されるように、身長について多遺伝子リスクスコア（ＰＲＳ）を計算した。ＰＲＳ１は、最低の身長を指し、ＰＲＳ５は、最高の身長を指す。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ－３７）（配列番号１）である。様々な実施形態において、ペプチドは、アセチル基をさらに含む。様々な実施形態において、アセチル基は、ペプチドのＮ末端上にある。様々な実施形態において、ペプチドは、Ｃ末端にＯＨまたはＮＨ_２基をさらに含む。様々な実施形態において、バリアントは、本明細書に記載されるような１つ以上のリンカー基を含む。様々な実施形態において、リンカーは、加水分解可能なリンカーである。

様々な実施形態において、本開示は、骨を伸ばすこと、または長骨成長を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、本明細書に記載のＣＮＰバリアントを含む組成物を対象に投与することを含み、投与することが、骨を伸ばすか、または長骨成長を増加させる、方法を提供する。

様々な実施形態において、組成物は、皮下、皮内、関節内、経口、または筋肉内に投与される。

様々な実施形態において、組成物は、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または６ヶ月に１回投与される。

様々な実施形態において、組成物は、延長放出組成物である。

本明細書に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物を対象に投与することと、対象における少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルを監視することと、を含む、ＣＮＰ応答性状態または障害を治療する方法がさらに企図され、少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルの増加は、対象または状態もしくは障害に対するＣＮＰペプチドまたはバリアントの治療効果を示す。

構成的に活性な線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ－３）を発現する細胞を、本明細書に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物と接触させることを含む、構成的に活性な変異体ＦＧＦＲ－３によって誘導される細胞増殖停止を克服する方法がさらに企図される。

ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ－Ｂ）を発現する細胞を、本明細書に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物と接触させることを含む、ＮＰＲ－Ｂを発現する細胞におけるｃＧＭＰ産生を刺激する方法がさらに企図される。

様々な実施形態において、方法は、本明細書に記載されるＣＮＰペプチドまたはバリアントの投与の量または頻度を調整することをさらに含み、ｉ）少なくとも１つの骨もしくは軟骨関連バイオマーカーのレベルが目標レベルを下回る場合、ＣＮＰペプチドもしくはバリアントの投与の量もしくは頻度が増加するか、またはｉｉ）少なくとも１つの骨もしくは軟骨関連バイオマーカーのレベルが目標レベルを上回る場合、ＣＮＰペプチドもしくはバリアントの投与の量もしくは頻度が減少する。

様々な実施形態において、少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーは、ＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、Ｉ型コラーゲンＣ－テロペプチド（ＣＴｘ）、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、アグリカンコンドロイチンスルフェート、コラーゲンＸ、ならびにアルカリホスファターゼからなる群から選択される。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ－３７）（配列番号１）である。様々な実施形態において、ペプチドは、アセチル基をさらに含む。様々な実施形態において、アセチル基は、ペプチドのＮ末端上にある。様々な実施形態において、アセチル基は、ペプチド配列内のアミノ酸側鎖上にある。様々な実施形態において、ペプチドは、Ｃ末端にＯＨまたはＮＨ_２基をさらに含む。様々な実施形態において、バリアントは、本明細書に記載されるような１つ以上のリンカー基を含む。様々な実施形態において、リンカーは、加水分解可能なリンカーである。

ペプチドを、Ｆｍｏｃアミノ酸を使用して固相樹脂上で合成することを含む、本明細書に記載のＣＮＰバリアントを作製する方法も提供される。

様々な実施形態において、方法は、樹脂をＮＭＰ／Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＥＡ（１０：１：０．１、ｖ／ｖ／ｖ）と反応させることによってペプチドをアセチル化することを含む。

様々な実施形態において、方法は、ペプチドを、任意選択でリジン残基上にある、コンジュゲート部分にコンジュゲートすることを含む。様々な実施形態において、方法は、リジン上の保護アミノ基を切断すること、ペプチドを２ｘＦｍｏｃ－アミノＰＥＧ（２）と反応させ、続いてアミノ酸と反応させること、続いて脂質または脂肪酸部分のコンジュゲーションを含む。

本明細書に記載のＣＮＰコンジュゲートにおけるペプトイドまたは電子リンカーの使用を示す。 ２４時間の期間にわたるヒト血漿におけるＣＮＰバリアントの安定性を示す。 ２４時間の期間にわたるヒト血漿におけるＣＮＰバリアントの安定性を示す。 異なる培養条件下でのＣＮＰバリアントの安定性を示す。 ｃＧＭＰ刺激によって測定される、ＮＰＲ２ホモ接合またはヘテロ接合変異のいずれかを有する細胞に対するＣＮＰバリアント（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ）の効果を示す。 ＲＣＳ細胞にトランスフェクトされたＮＰＲ２変異体クローンにおける第１のエクソンのヌクレオチドおよび予測されるタンパク質配列を示す。 ＲＣＳ細胞にトランスフェクトされたＮＰＲ２変異体クローンにおける第１のエクソンのヌクレオチドおよび予測されるタンパク質配列を示す。 ＲＣＳ細胞にトランスフェクトされたＮＰＲ２変異体クローンにおける第１のエクソンのヌクレオチドおよび予測されるタンパク質配列を示す。 ＣＮＰへの応答について分析された例示的なＮＰＲ２変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸにおける低身長に関連した例示的な変異を示す。 身長に対するＰＲＳおよびまれなコーディングバリアントの複合効果を示す。図８Ａ．量的形質としての身長への影響、試料はそれらのＰＲＳに基づいて、５つの群に分けられた。バイオリン図は、身長の２５％、５０％、７５％のパーセンタイルを表す水平線で示されている。試料は、５つのコア遺伝子のいずれかでミスセンス、機能喪失、またはなしのステータスを有していることによって群化された。図８Ｂ．「特発性低身長」またはＩＳＳのオッズ比に反映される効果。ＰＲＳ＝３を参照として使用するＩＳＳ対他のＰＲＳ群のオッズ。図８Ｃ．ＰＲＳ＝１を参照として使用するＩＳＳ対コア遺伝子においてミスセンスおよび／または機能喪失バリアントを有するＩＳＳのオッズ。図８Ｄ．ＰＲＳ＝１非キャリアを参照として使用するＩＳＳ対コア遺伝子においてミスセンスおよび／または機能喪失バリアントを有するＩＳＳのオッズ。図８Ｅ．ＰＲＳ＝２非キャリアを参照として使用するＩＳＳ対コア遺伝子においてミスセンスおよび／または機能喪失バリアントを有するＩＳＳのオッズ。図８Ｆ．ＰＲＳ＝３非キャリアを参照として使用するＩＳＳ対コア遺伝子においてミスセンスおよび／または機能喪失バリアントを有するＩＳＳのオッズ。Ｇ．ＰＲＳ＝４非キャリアを参照として使用するＩＳＳ対コア遺伝子においてミスセンスおよび／または機能喪失バリアントを有するＩＳＳのオッズ。

本開示は、骨格異形成症および骨成長障害を治療するのに有用な安定なＣＮＰバリアントに関する。

明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形および単数形の指示対象を含む。

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるかに一部依存する。特定の実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。特定の実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、指定された値または範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．０５％以内を意味する。「約」または「およそ」という用語が、一連の２つ以上の数値の最初の数値の前にあるときはいつでも、「約」または「およそ」という用語は、その一連の数値の各々に適用されることが理解される。

「Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド」または「ＣＮＰ」という用語は、Ｃ末端に１７アミノ酸のループ構造を有する小さな一本鎖ペプチド（ＣＮＰ前駆体タンパク質、ＮＰＰＣに対するＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０７７７２０）、およびそのバリアントを指す。１７－ｍｅｒ ＣＮＰループ構造は、ＣＮＰ １７、ＣＮＰ環、またはＣＮＰ環状ドメインとも呼ばれる。ＣＮＰは、活性５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ－５３）および成熟２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ－２２）、ならびに２つのペプチド間で長さが異なるペプチドを含む。

様々な実施形態において、「ＣＮＰバリアント」は、アミノ酸残基の同じ数にわたって野生型ＮＰＰＣと少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％相同である。ＣＮＰバリアントペプチドは、ＮＰＰＣポリペプチドの約１～約５３、または１～３９、または１～３８、または１～３７、または１～３５、または１～３４、または１～３１、または１～２７、または１～２２、または１０～３５、または約１５～約３７残基を含み得ることがさらに企図される。一実施形態において、ＣＮＰバリアントは、ＮＰＰＣポリペプチドに由来する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、または５３アミノ酸配列を含む。

「コンジュゲート部分」という用語は、バリアントペプチドにコンジュゲートされる部分を指す。コンジュゲート部分は、脂質、脂肪酸、親水性スペーサー、合成ポリマー、リンカー、または任意選択で、それらの組み合わせを含む。

「有効量」という用語は、対象の健康状態、病状、または疾患に関して、または診断目的のために所望の結果を生み出すのに十分な投与量を指す。望ましい結果は、投与量のレシピエントにおける主観的または客観的な改善を含み得る。「治療有効量」は、健康に対して意図される有益な効果を生み出すのに有効な薬剤の量を指す。個々の場合における適切な「有効な」量は、日常的な実験を使用して当業者によって決定され得る。特定の患者の特定の用量レベルおよび投与頻度は変化する可能性があり、使用される特定の化合物の活性、その化合物の生物学的利用能、代謝安定性、排泄率および作用の長さ、化合物の投与の様式および時間、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事、ならびに特定の状態の重大度を含む様々な因子に依存することが理解されよう。

「実質的に純粋な」または「単離された」とは、対象種が、存在する主要な種である（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）ことを意味し、実質的に精製された画分は、対象種が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベース）を含む。一実施形態において、実質的に純粋な組成物は、目的の種が、モルまたは重量ベースで組成物中に存在する高分子種の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上を含むことを意味する。組成物が本質的に単一の高分子種からなる場合、対象種は、本質的な均質性まで精製される（従来の検出方法によって組成物中の汚染種を検出することができない）。この定義の目的では、溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定剤（例えば、ＢＳＡ）、および元素イオン種は、高分子種とはみなされない。一実施形態において、本開示の化合物は、実質的に純粋であるか、または単離されている。別の実施形態において、本開示の化合物は、それらの産生に使用される高分子出発材料に関して実質的に純粋であるか、または単離されている。さらに別の実施形態において、本開示の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤、および任意選択で別の生物学的に活性な薬剤と混合された、実質的に純粋な、または単離されたＣＮＰバリアントを含む。

「治療」とは、予防的治療または治療的治療または診断的治療を指す。特定の実施形態において、「治療」は、治療的、予防的または診断的目的のための対象への化合物または組成物の投与を指す。

「予防的」治療は、病状を発症するリスクを減少させる目的で、疾患の徴候を示さないか、または疾患の初期徴候のみを示す対象に施される治療である。本開示の化合物または組成物は、病状を発症する可能性を低減するため、または病状が発症した場合はその重症度を最小限に抑えるための予防的治療として与えられ得る。

「治療的」治療は、それらの徴候または症状を軽減または排除する目的で、病状の徴候または症状を示す対象に施される治療である。徴候または症状は、生化学的、細胞的、組織学的、機能的または物理的、主観的または客観的である可能性がある。本開示の化合物はまた、治療的治療としてまたは診断のために与えられ得る。

「診断」とは、病的状態の存在、程度、および／または性質を同定することを意味する。診断方法は、その特異性および選択性において異なる。特定の診断方法は状態の確定診断を提供しない場合があるが、方法が診断に役立つ肯定的な兆候を提供する場合はそれで十分である。

「骨または軟骨関連バイオマーカー」または「骨または軟骨関連マーカー」は、成長因子、酵素、タンパク質、または他の検出可能な生物学的物質もしくは部分を指し、そのレベルは、例えば、軟骨代謝回転、軟骨形成、軟骨成長、骨吸収、骨形成、骨成長、またはそれらの組み合わせに関連して増加または減少する。そのようなバイオマーカーは、本明細書に記載されるＣＮＰバリアントの投与前、投与中、および／または投与後に測定され得る。例示的な骨または軟骨関連バイオマーカーには、ＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、Ｉ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アグリカンコンドロイチンスルフェート、コラーゲンＸ、ならびにアルカリホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。軟骨および骨関連バイオマーカーは、組織、血液、血清、血漿、脳脊髄液、滑液、および尿を含むがこれらに限定されない、任意の適切な生物学的試料において測定することができる。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、有効性／薬力学的インビボ研究を受けている動物からの、および／またはエクスビボ研究の馴化培地からの血液、血漿、または血清において測定される。

「薬学的組成物」または「製剤」は、ヒトおよび哺乳動物を含む対象動物における薬学的使用に好適な組成物を指す。薬学的組成物は、治療有効量のＣＮＰバリアント、任意選択で別の生物学的に活性な薬剤、および任意選択で薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む。一実施形態において、薬学的組成物は、有効成分、担体を構成する不活性成分、ならびに任意の２つ以上の成分、または１つ以上の成分の解離、または１つ以上の成分の他のタイプの反応または相互作用からの組み合わせ、錯体形成、または凝集から直接的または間接的に生じる任意の産生物を含む組成物を包含する。したがって、本開示の薬学的組成物は、本開示の化合物と薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤とを混合することによって作製された任意の組成物を包含する。

「薬学的に許容される担体」とは、リン酸緩衝生理食塩水溶液、デキストロースの５％水溶液、およびエマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）などの標準的な薬学的担体、緩衝液などのいずれかを指す。賦形剤の非限定的な例には、アジュバント、結合剤、充填剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、流動促進剤、甘味剤、香味剤、および着色剤が含まれる。好適な薬学的担体、賦形剤および希釈剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。好ましい薬学的担体は、活性薬剤の意図された投与様式に依存する。典型的な投与様式には、経腸（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内注射、または局所、経皮、もしくは経粘膜投与）が含まれる。

「薬学的に許容される塩」は、金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含むがこれらに限定されない、薬学的用途の化合物に配合することができる塩である。

「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」とは、生物学的または他の方法で望ましくない材料を意味し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、それが含まれている、または個体の身体の上または中に存在する任意の成分を含む組成物のまたは成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。

「生理学的状態」とは、動物（例えば、ヒト）の体内の状態を指す。生理学的条件には、体温、および生理学的イオン強度、ｐＨ、および酵素の水性環境が含まれるが、これらに限定されない。生理学的状態はまた、特定の対象の身体の状態を含み、これは、大多数の対象に存在する「通常の」状態とは異なり、例えば、およそ３７℃の通常の人体温度とは異なるか、またはおよそ７．４の通常のヒトの血液ｐＨとは異なる。

「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」とは、およそ７．０～８．０の範囲、より典型的にはおよそ７．２～７．６の範囲のｐＨを意味する。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、哺乳動物クラスの任意のメンバーが含まれるが、これらに限定されない：ヒト、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、および他の類人猿およびサル種、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜、ウサギ、イヌ、およびネコなどの飼育動物、ラット、マウス、およびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物。非哺乳動物の例には、鳥、魚などが含まれるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。様々な実施形態において、対象は、ヒトである。様々な実施形態において、対象は、小児または青年である。様々な実施形態において、対象は、幼児である。様々な実施形態において、対象は、３歳超、２歳超、１歳超、または６ヶ月超である。

Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドバリアント
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６８：８６３－８７０（１９９０）（ＣＮＰ前駆体タンパク質、ＮＰＰＣに対するＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０７７７２０）（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．，１０：９０７－９１２（１９９２））は、１７アミノ酸ループ構造（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３９：８６３－８７０（１９９８））を有するペプチド（ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ）のファミリーにおける小さな一本鎖ペプチドであり、複数の生物学的プロセスにおいて重要な役割を有する。ＣＮＰはナトリウム利尿ペプチド受容体－Ｂ（ＮＰＲ－Ｂ、ＧＣ－Ｂ）と相互作用して、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の生成を刺激する（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．，１０：１１１１－１１１４（１９９２））。ＣＮＰは、中枢神経系、生殖管、骨、血管内皮など、より広く発現している（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，４９：４１９－４２６（２００７））。

天然ＣＮＰ遺伝子およびポリペプチドは、以前に記載されている。米国特許第５，３５２，７７０号は、ヒトＣＮＰと同一の配列のブタ脳から単離および精製されたＣＮＰ－２２、ならびに心血管適応症の治療におけるその使用を開示する。米国特許第６，０３４，２３１号は、ｐｒｅ－ｐｒｏＣＮＰ（１２６アミノ酸）のヒト遺伝子およびポリペプチド、ならびにヒトＣＮＰ－５３遺伝子およびポリペプチドを開示する。成熟ＣＮＰは、２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ－２２）である。特定のＣＮＰバリアントは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１９８，２４２号に開示される。

様々な実施形態において、本開示のＣＮＰは、ヒトＣＮＰ－１７（ｈＣＮＰ－１７）からヒトＣＮＰ－５３（ｈＣＮＰ－５３）までにわたり、ｈＣＮＰ－５３に由来する野生型アミノ酸配列を有する短縮型ＣＮＰを含む。このような短縮されたＣＮＰペプチドには次のものが含まれる。
ＤＬＲＶＤＴＫＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－５３）（配列番号５６）、
ＬＲＶＤＴＫＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－５２）（配列番号１５）、
ＲＶＤＴＫＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－５１）（配列番号１６）、
ＶＤＴＫＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－５０）（配列番号１７）、
ＤＴＫＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４９）（配列番号１８）
ＴＫＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４８）（配列番号１９）、
ＫＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４７）（配列番号２０）、
ＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４６）（配列番号２１）、
ＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４５）（配列番号２２）、
ＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４４）（配列番号２３）、
ＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４３）（配列番号２４）、
ＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４２）（配列番号２５）、
ＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４１）（配列番号２６）、
ＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－４０）（配列番号２７）、
ＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３９）（配列番号２８）、
ＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３８）（配列番号２）、
ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３７）（配列番号３）、
ＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３６）（配列番号２９）、
ＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３５）（配列番号３０）、
ＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３４）（配列番号４）、
ＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３３）（配列番号３１）、
ＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３２）（配列番号３２）、
ＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３１）（配列番号３３）、
ＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－３０）（配列番号３４）、
ＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２９）（配列番号３５）、
ＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２８）（配列番号３６）、
ＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２７）（配列番号３７）、
ＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２６）（配列番号３８）、
ＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２５）（配列番号３９）、
ＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２４）（配列番号４０）、
ＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２３）（配列番号４１）、
ＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２２）（配列番号６８）、
ＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２１）（配列番号４２）、
ＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－２０）（配列番号４３）、
ＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－１９）（配列番号４４）、
ＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－１８）（配列番号４５）、および
ＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＣＮＰ－１７）（配列番号６７）。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントペプチドは、改変されたＣＮＰ－３７またはＣＮＰ－３８ペプチドであり、任意選択で、フューリン切断部位（下線）に変異／置換を有し、かつ／またはＮ末端にグリシンもしくはプロリン－グリシンを含む。例示的なＣＮＰ－３７バリアントには、以下が含まれるが、これらに限定されない：

。

様々な実施形態において、本開示のＣＮＰバリアントは、ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１）、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号６）、ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＫＹＫＧＡＱＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号７）、
ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、および
ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１）を含む。

５３アミノ酸未満を有する本明細書に記載のバリアントのいずれも、ペプチドのＮ末端へのアミノ酸の付加によって伸長することができることがさらに企図される。例えば、ＣＮＰバリアントが、ｗｔ ＣＮＰと比較して変更されたアミノ酸を有する３４、３５、３６、３７、３８、または３９－ｍｅｒである場合、そのようなバリアントは、Ｎ末端で、ＣＮＰ５３からの、または他のペプチドからの野生型または修飾残基のいずれかで伸長することができる。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、アセチル基をさらに含む。様々な実施形態において、アセチル基は、Ｎ末端、Ｃ末端上にあるか、または内部アミノ酸側基に付着される。様々な実施形態において、アセチル基は、ペプチドのＮ末端上にある。

様々な実施形態において、ペプチドバリアントは、Ｃ末端にＯＨまたはＮＨ_２基をさらに含む。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号８）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号９）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１０）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１１）、および
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１２）からなる群から選択される。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、
ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号８）、
ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号９）、
ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１０）、
ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１１）、および
ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１２）
ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＫＹＫＧＡＱＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号７）からなる群から選択される。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号８）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号９）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１０）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１１）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１２）、
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＫＹＫＧＡＱＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１３）、および
Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＫＹＫＧＡＱＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１４）からなる群から選択される。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号８）からなる群から選択される。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１）である。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１）である。

追加の実施形態において、アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）残基および／またはグルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）残基を有する本明細書に記載のＣＮＰバリアントのいずれかについて、それらが野生型配列を有するか非天然アミノ酸配列を有するかにかかわらず、任意のＡｓｎ残基および／または任意のＧｌｎ残基は、ＡｓｎからＧｌｎなどの保存的置換を含む、任意の他の天然または非天然アミノ酸で独立して置換することができる。このような置換は、アスパラギンおよび／またはグルタミンの潜在的な脱アミド化を最小化または回避するように部分的に設計されている。

追加の実施形態において、リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）残基を有する本明細書に記載のＣＮＰバリアントのいずれかについて、それらが野生型配列を有するか非天然アミノ酸配列を有するかにかかわらず、任意のＬｙｓ残基は、ＬｙｓからＡｒｇなどの置換を含む、任意の他の天然または非天然アミノ酸で独立して置換することができる。様々な実施形態において、すべてのリジン残基は、ＣＮＰバリアント環状ドメインにおけるＬｙｓ残基が任意の他の天然または非天然アミノ酸で置換されていないことを除いて、ＬｙｓからＡｒｇなどの置換を含む、任意の他の天然または非天然アミノ酸で独立して置換される。

一実施形態において、ＣＮＰバリアントは、ｗｔＣＮＰ２２ペプチドにおいて指定されるＣｙｓ^６とＣｙｓ^２２との間のジスルフィド結合の形成を介して環化される。Ｃｙｓ^６は、例えば、ホモシステインまたはペニシラミンなどのシステイン類似体であり得る。さらなる実施形態において、ＣＮＰバリアントは、頭－尾、側鎖－側鎖、側鎖－頭、または側鎖－尾に形成される共有結合によって環化することができる。一実施形態において、共有結合は、ペプチドのＮ末端またはその方向のアミノ酸と、ペプチドのＣ末端またはその方向のアミノ酸（この文脈では「末端」アミノ酸と呼ばれる）との間に形成される。別の実施形態において、共有結合は、２つの末端アミノ酸の側鎖間に形成される。さらに別の実施形態において、共有結合は、一方の末端アミノ酸の側鎖と他方の末端アミノ酸の末端基との間、または２つの末端アミノ酸の末端基間に形成される。

末端アミンの末端カルボキシル基への頭－尾環化は、いくつかの方法を使用して、例えば、ｐ－ニトロフェニルエステル、２，４，５－トリクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、アジド法、混合無水物法、ＨＡＴＵ、触媒、例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＮＳｕ、もしくはＨＯＡｔなどでのカルボジイミド（例えば、ＤＩＣ、ＥＤＣ、またはＤＣＣ）、または樹脂上環化を使用して行うことができる。

加えて、環状構造は、ＣＮＰバリアントのアミノ酸残基および／または末端アミノ酸残基の側鎖を含む架橋基を介して形成することができる。架橋基は、ペプチドの２つの部分の環化を可能にする化学部分である。架橋基の非限定的な例には、アミド、チオエーテル、チオエステル、ジスルフィド、尿素、カルバメート、スルホンアミドなどが含まれる。そのような架橋基を有する単位の組み込みのための様々な方法が当該技術分野で知られている。例えば、ラクタム架橋（すなわち、環状アミド）は、側鎖のＮ末端アミノ基またはアミノ基と、側鎖、例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖およびグルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖のＣ末端カルボン酸またはカルボキシル基との間に形成することができる。チオエステルは、側鎖のＣ末端カルボキシル基またはカルボキシル基と、システインまたはシステイン類似体の側鎖のチオール基との間に形成することができる。

あるいは、ランチオニン（チオ－ジアラニン）残基を組み込んで、チオエーテル結合によって共有結合されるアラニン残基を連結することによって、架橋を形成することができる。別の方法では、ジカルボン酸（例えば、スベリン酸（オクタン二酸））などの、架橋剤は、遊離アミノ、ヒドロキシル、およびチオール基などの、アミノ酸側鎖の官能基を連結することができる。

酵素触媒環化も使用することができる。例えば、チロシジン合成酵素のチオエステラーゼドメインを使用して、チオエステル前駆体を環化することができ、スブチリシン変異体を利用して、ペプチドグリコレートフェニルアラニルアミドエステルを環化することができ、抗体リガーゼ１６Ｇ３を使用して、ｐ－ニトロフェニルエステルを環化することができることが報告されている。ペプチド環化の概説については、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．，９：４７１－５０１（２００３）を参照されたい。

特定の実施形態において、最終産生物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の純度を有する。

ペプチドコンジュゲート
ペプチド治療剤は魅力的な生物学的治療剤であるが、安定性が低く、溶液中での半減期が短いために不利になることがよくある（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２：６３－７０，２０１７）。安定性を向上させることによって、かつ／または半減期を増加させることによって、ペプチド治療剤の効力を改善する試みには、親水性ペプチドをリポソームまたはポリマー粒子などの生分解性粒子にカプセル化する試みが含まれる。しかし、これらのペプチドのカチオン性および負に帯電したポリマーのリポソームと静電的に相互作用するそれらの能力のために、これは困難である（Ｇｒｉｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ５２０：２６７－２７４，２０１７）。ペプチドコンジュゲートの生成は、親水性ポリマーの微粒子またはリポソームへのより良いカプセル化を可能にするために使用される１つの手段である（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １５：２１６－２２５，２０１８）。

ペプチドは、５～１００アミノ酸の一連のアミノ酸であり得る。ペプチドは、正に帯電したアミノ酸、負に帯電したアミノ酸、または両方の混合物を有することができ、その結果、ペプチドは、帯電した部分、例えば、ペプチドにおけるものと反対に帯電した種を有するカチオン、アニオン、またはそれらの組み合わせと相互作用することができる。

ペプチドは、増加した安定性または半減期をもたらす部分、例えば、コンジュゲート部分と複合体化されることが企図される。様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、非共有結合を介して複合体化されるか、または共有結合によって付着される。部分は、静電相互作用を介してペプチドと非共有結合的に付着され得る。あるいは、部分は、１つ以上のリンカー部分を介してペプチドに共有結合的に会合され得る。リンカーは、切断可能および切断不可能なリンカーであり得る。切断可能なリンカーは、酵素、求核／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子／酸性試薬、有機金属および金属試薬、または酸化試薬を介して切断され得る。リンカーはまた、自己犠牲リンカーであり得る。例示的なリンカーには、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）、ベータアラニン、４－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、２－アミノエトキシ酸（ＡＥＡ）、アミノエトキシ－２－エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、５アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６－アミノカプロン酸（Ａｂｘ）、ビシナルジオール切断可能リンカー、トリメチルロックラクトン化、ｐ－アルコキシフェニルカルバメート、ビシン、ペプトイド、またはビシン型リンカー、および本明細書に記載される電子リンカーが含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態において、リンカーは、ＣＮＰ環状ドメイン内、またはＣＮＰ環状ドメイン以外の部位でＣＮＰバリアントの残基に付着される。様々な実施形態において、リンカーは、リジン残基に付着される。様々な実施形態において、リンカーは、ＣＮＰ環状ドメインにおけるリジン残基に付着される。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、リンカーを介してコンジュゲート部分に付着される。様々な実施形態において、リンカーは、コンジュゲート部分の親水性スペーサーを介してコンジュゲート部分に付着される。

様々な実施形態において、リンカーは、加水分解可能なリンカーである。

様々な実施形態において、リンカーは、ペプトイドまたは電子リンカーである。様々な実施形態において、リンカーは、ペプトイドリンカーである。様々な実施形態において、リンカーは、電子リンカーである。様々な実施形態において、リンカーは、ＳＯ_２部分を含む。例示的なリンカーを図１に示す。図１のリンカーはＲ基の置換によって修飾されることがさらに企図される。例えば、ビシンタイプのリンカーには、以下に示される構造が含まれる：

。

様々な実施形態において、ペプチドにコンジュゲートされた部分は、ポリエチレングリコール、リンカー、脂質部分もしくは脂肪酸、またはそれらの組み合わせなどの合成ポリマーである。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、脂肪酸、アミノ酸、スペーサー、およびリンカーとコンジュゲートされる。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、脂肪酸、アミノ酸、ポリエチレングリコールスペーサー、またはポリエチレングリコール誘導体スペーサー、およびリンカーとコンジュゲートされる。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、脂肪酸、アミノ酸、スペーサー、およびリンカーとコンジュゲートされ、スペーサーは、置換Ｃ－６～Ｃ－２０アルキル鎖もしくは任意のアミノ酸、または両方の組み合わせを含み、アルキル鎖の炭素原子は、Ｏ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ－１～Ｃ－６アルキル）、またはカルボニル基のうちの１つ以上によって置き換えることができる。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、脂肪酸とコンジュゲートされる。脂質技術は、ＣＮＰバリアントの血清半減期を増加させ、より少ない頻度の注射および／または改善された経口送達を可能にすると仮定される。様々な実施形態において、脂肪酸は、短鎖、中鎖、長鎖脂肪酸、またはジカルボン酸脂肪酸である。様々な実施形態において、脂肪酸は飽和または不飽和である。様々な実施形態において、脂肪酸は、Ｃ－６～Ｃ－２０脂肪酸である。様々な実施形態において、脂肪酸は、Ｃ－６、Ｃ－８、Ｃ－１０、Ｃ－１２、Ｃ－１４、Ｃ－１６、Ｃ－１８またはＣ－２０脂肪酸である。様々な実施形態において、脂肪酸は、デカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、またはそれらの二酸である。様々な実施形態において、脂肪酸は、リジン残基にコンジュゲートされる。

様々な実施形態において、本明細書に記載されるＣＮＰバリアントは、本明細書に記載されるようなコンジュゲート部分を含むことが企図される。コンジュゲート部分は、ＣＮＰ環状ドメインの残基上、またはＣＮＰ環状ドメイン以外の部位にあることが企図される。様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、リジン残基上にある。様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、１つ以上の酸部分を含む。様々な実施形態において、酸部分は、脂肪酸である。

様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、親水性スペーサーに連結された酸部分を含む。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、置換Ｃ－６～Ｃ－２０アルキル鎖もしくは任意のアミノ酸、または両方の組み合わせであり、アルキル鎖の炭素原子は、Ｏ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ－１～Ｃ－６アルキル）、またはカルボニル基のうちの１つ以上によって置き換えることができる。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、任意のアミノ酸である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、ガンマグルタミン酸（γＧｌｕ）である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、置換Ｃ－６～Ｃ－２０アルキル鎖である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、置換Ｃ－６、Ｃ－８、Ｃ－１０、Ｃ－１２、Ｃ－１４、Ｃ－１６、Ｃ－１８、またはＣ－２０アルキル鎖である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、置換Ｃ－９～Ｃ－１８アルキル鎖である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、置換Ｃ－１８アルキル鎖である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、置換Ｃ－９アルキル鎖である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、１つ以上のＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）基である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、１つまたは２つのＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）基である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、ＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）である。様々な実施形態において、スペーサーは、ＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）またはγＧｌｕである。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、１つ以上のＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）基に連結されたガンマグルタミン酸（γＧｌｕ）である。様々な実施形態において、親水性スペーサーは、１つまたは２つのＯＥＧ（８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸）基（ジＥＧ）に連結されたガンマグルタミン酸（γＧｌｕ）である。様々な実施形態において、酸部分および親水性スペーサーは、構造ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡを有する。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、以下の構造を有する：
ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、および

Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号８）。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、構造ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ、Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１）、またはＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１）を有する。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、上記ペプチドのＡｓｎ～Ｇｌｕバリアントを含む。

様々な実施形態において、本開示は、親水性または水溶性ポリマー（例えば、炭素原子を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）などの、１つ以上の酸素原子で置き換えることができる、酸素化アルキル鎖）の使用を企図する。様々な実施形態において、水溶性ポリマーは、タイプ（例えば、ホモポリマーまたはコポリマー；ランダム、交互、またはブロックコポリマー；線状または分岐；単分散または多分散）、連結（例えば、アミド、イミン、アミナール、アルキレン、またはエステル結合などの、例えば、加水分解可能または安定な連結）、コンジュゲーション部位（例えば、Ｎ末端、内部、および／またはＣ末端）、および長さ（例えば、約０．２、０．４、または０．６ｋＤａ～約２、５、１０、２５、５０、または１００ｋＤａ）が変動し得る。親水性または水溶性ポリマーは、当該技術分野で知られるように、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ベースもしくはアルデヒドベースの化学または他の化学によってＣＮＰバリアントにコンジュゲートすることができる。様々な実施形態において、負に帯電したＰＥＧ－ＣＮＰバリアントは、カルボキシル化、硫酸化、およびリン酸化化合物の使用を含むがこれらに限定されない、腎クリアランスの低減のために設計することができる（Ｃａｌｉｃｅｔｉ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５５：１２６１－７７（２００３）、Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．，８８：３２２７－３５（２００３）、Ｐｉｔｋｉｎ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏ．，２９：４４０－４４４（１９８６）、Ｖｅｈａｓｋａｒｉ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ’ｌ，２２：１２７－１３５（１９８２））。一実施形態において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分は、カルボキシル基、硫酸塩基、および／またはリン酸塩基を含有する。

別の実施形態において、本明細書に記載のＣＮＰバリアントのＮ末端、Ｃ末端、および／または内部部位にコンジュゲートされた親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはＰＥＯ）部分は、生理学的条件下で正に帯電した１つ以上の官能基を含有する。そのような部分は、とりわけ、軟骨組織へのそのようなコンジュゲートされたＣＮＰバリアントの分布を改善するように設計される。一実施形態において、ＰＥＧ部分は、１つ以上の一級、二級、もしくは三級アミノ基、四級アンモニウム基、および／または他のアミン含有（例えば、尿素）基を含有する。

作製方法
本明細書に記載されるようなＣＮＰバリアントおよび任意選択でコンジュゲート部分を含む組成物を作製する方法も本明細書で企図される。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、標準的なタンパク質合成化学を使用して合成的に作製される。例えば、ペプチドは、固相樹脂および標準的なＦｍｏｃ化学を使用して段階的に合成される。ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して樹脂から切断され、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製される。

様々な実施形態において、方法は、樹脂をＮＭＰ／Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＥＡと、任意選択で１０：１：０．１、ｖ／ｖ／ｖで反応させることによってペプチドをアセチル化することをさらに含む。

ペプチドが、任意選択でリジン残基上で、コンジュゲート部分にコンジュゲートされる、方法がさらに提供される。リジン上の保護アミノ基を切断すること、ペプチドを２ｘＦｍｏｃ－アミノＰＥＧ（２）と反応させ、続いてアミノ酸と反応させること、続いて脂質または脂肪酸部分のコンジュゲーションを含むステップ。様々な実施形態において、コンジュゲート部分は、１つ以上の脂質または脂肪酸および疎水性スペーサーを含む。

方法は、トリフルオロ酢酸と接触させることによって樹脂からペプチドを切断するステップ、および逆相ＨＰＬＣによってペプチドを精製するステップをさらに提供する。

特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＮＰバリアントは、ＣＮＰバリアントポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培地中で培養することを含む組換えプロセスによって産生され、ポリヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチドの発現をもたらす条件下で切断可能なペプチドまたはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに任意選択で連結される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＣＮＰバリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、任意選択で切断可能なペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結される。特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、可溶性タンパク質として、または封入体として発現される。発現された融合ポリペプチドは、宿主細胞または培養培地から単離することができ、単離された融合ポリペプチドは、切断剤と接触させて、ＣＮＰバリアントを放出することができる。

宿主細胞、発現ベクター、切断可能なペプチド、および培養パラメータの使用を含む、ＣＮＰバリアントペプチドを作製する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許８，１９８，２４２に開示されている。

使用方法
軟骨無形成症は、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ－３）の遺伝子の常染色体優性変異の結果であり、軟骨形成の異常を引き起こす。ＦＧＦＲ－３は通常、軟骨細胞の成長、したがって骨の成長に対して負の調節効果を持っている。軟骨無形成症では、変異型のＦＧＦＲ－３が構成的に活性であり、これにより骨が著しく短縮される。ヒトでは、ＦＧＦＲ－３の変異を活性化することが遺伝性小人症の主な原因である。ＦＧＦＲ－３を活性化したマウスは、骨格異形成症の最も一般的な形態である軟骨無形成症のモデルとして機能し、ＣＮＰの過剰発現はこれらの動物を小人症から救済する。したがって、ＣＮＰの機能的バリアントは、様々な骨格異形成症の治療のための潜在的な治療剤である。

軟骨細胞のマトリックス産生、増殖および分化を刺激し、長骨成長を増加させることにより、本開示のＣＮＰバリアントは、骨格異形成症などの骨関連障害を患うヒトを含む哺乳動物を治療するのに有用である。ＣＮＰ応答性骨関連障害および骨格異形成症の非限定的な例には、軟骨無形成症、軟骨低形成症、低身症、小人症、骨軟骨異形成症、致死性異形成症、先天性骨形成不全症、軟骨無発生症、先天性軟骨異形成症、同型接合性軟骨形成不全症、先天性軟骨異形成症、彎曲肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ症、周産期致死型先天性骨形成不全症（ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｌｅｔｈａｌ ｔｙｐｅ ｏｆ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）、短肋骨多指症症候群、軟骨低形成症、肢根型先天性軟骨異形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端骨異形成症、成長不全性骨形成症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランガー型中脚異形成症、ニーバーゲルト型中脚異形成症、ロビンノウ症候群、ラインハルト症候群、先端骨形成不全症、末梢異形成症、ニースト異形成症、線維軟骨形成症、ロバーツ症候群、遠位中間肢異形成症、短肢症、モルキオ症候群、ニースト症候群、代謝性異形成、および脊椎骨端骨幹端異形成が含まれる。本明細書で企図される低身長、成長板障害、骨関連障害または骨格異形成症には、ＮＰＲ２変異、ＳＨＯＸ変異（ターナー症候群／レリーワイル）、およびＰＴＰＮ１１変異（ヌーナン症候群）に関連する障害が含まれる。

軟骨細胞のマトリックス産生、増殖および分化を刺激し、長骨成長を増加させることにより、本開示のＣＮＰバリアントは、骨格異形成症などの骨関連障害を患うヒトを含む哺乳動物を治療するのに有用である。ＣＮＰ応答性骨関連障害および骨格異形成症の非限定的な例には、軟骨無形成症、軟骨低形成症、低身症、小人症、骨軟骨異形成症、致死性異形成症、先天性骨形成不全症、軟骨無発生症、先天性軟骨異形成症、同型接合性軟骨形成不全症、先天性軟骨異形成症、彎曲肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ症、周産期致死型先天性骨形成不全症、短肋骨多指症症候群、軟骨低形成症、肢根型先天性軟骨異形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端骨異形成症、成長不全性骨形成症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランガー型中脚異形成症、ニーバーゲルト型中脚異形成症、ロビンノウ症候群、ラインハルト症候群、先端骨形成不全症、末梢異形成症、ニースト異形成症、線維軟骨形成症、ロバーツ症候群、遠位中間肢異形成症、短肢症、モルキオ症候群、ニースト症候群、代謝性異形成、および脊椎骨端骨幹端異形成が含まれる。本明細書で企図される低身長、成長板障害、骨関連障害または骨格異形成症には、ＮＰＲ２変異、ＳＨＯＸ変異（ターナー症候群／レリーワイル）、ＰＴＰＮ１１変異（ヌーナン症候群）およびＩＧＦ１Ｒ変異に関連する障害が含まれる。

この方法によって企図される追加の低身長および成長板障害には、コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１０）、アグリカン（ＡＣＡＮ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、ＰＴＰＮ１１、ＮＰＲ２、ＮＰＰＣ、またはＦＧＦＲ３の変異に関連する障害が含まれる。

この方法で企図される追加の低身長および成長板障害には、コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１０）、アグリカン（ＡＣＡＮ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、ＰＴＰＮ１１、ＮＰＲ２、ＮＰＰＣ、ＦＧＦＲ３、またはＩＧＦ１Ｒの変異に関連する障害が含まれる。

さらに、ＣＮＰバリアントは、特発性低身長および他の骨格異形成症を治療するための成長ホルモンの補助剤または代替物として有用である。

成長板障害には、低身長または異常な骨成長をもたらす障害が含まれ、コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１０）、アグリカン（ＡＣＡＮ）、インドヘッジホッグ（ＩＨＨ）、ＰＴＰＮ１１、ＮＰＲ２、ＮＰＰＣ、またはＦＧＦＲ３など、骨成長に関与する遺伝子の遺伝子変異の結果である可能性がある。様々な実施形態において、成長板障害は、低身長または異常な骨成長をもたらし、コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１０）、アグリカン（ＡＣＡＮ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、ＰＴＰＮ１１、ＮＰＲ２、ＮＰＰＣ、ＦＧＦＲ３、またはＩＧＦ１Ｒを含む、骨成長に関与する遺伝子の遺伝子変異の結果である可能性がある障害を含む。様々な実施形態において、成長板障害または低身長は、ＲＡＳ病に関連する遺伝子の１つ以上の変異に関連している。様々な実施形態において、成長板障害を有する対象は、成長板遺伝子の変異についてヘテロ接合性である。様々な実施形態において、変異は、機能喪失変異である。様々な実施形態において、変異は、機能獲得変異である。成長板障害には、家族性低身長、優性遺伝性低身長としても知られている優性家族性低身長、または特発性低身長が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｐｌａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １０４：４２７３－４２８１，２０１９を参照されたい。

ＡＣＡＮの変異は、家族性離断性骨軟骨炎および低身長、最終的には関節の骨の端からの軟骨と時には骨の剥離によって引き起こされる骨損傷（または病変）の領域を特徴とする変形性関節症を引き起こす可能性がある。成長中の骨の無秩序な軟骨ネットワークはそれらの成長を損ない、低身長につながることが示唆されている。ＡＣＡＮおよび低身長に関連する変異にはＶａｌ２３０３Ｍｅｔが含まれる。Ｓｔａｔｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８６（２）：１２６－３７，２０１０を参照されたい。低身長をもたらすＡＣＡＮの変異を有する患者は、投与がＣＮＰとＦＧＦＲ３との既知の相互作用によってこれらの患者の身長を増加させることができる可能性があるため、ＣＮＰによる治療から利益を得ると企図される。

受容体ＮＰＲ２を含むナトリウム利尿ペプチドシステムは、軟骨内骨成長の調節に関与していることが示されている（Ｖａｓｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｒｍ Ｒｅｓ Ｐｅｄｉａｔ ８２：２２２－２２９，２０１４）。研究によると、ＮＰＲ２のホモ接合または複合ヘテロ接合の機能喪失型変異は、非常に低身長の骨格異形成症である遠位中間肢異形成症異形成型マロトー（ＡＭＤＭ）を引き起こすことが示されている（Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４、上記）。低身長の原因としてヘテロ接合性の機能喪失（ドミナントネガティブなど）ＮＰＲ２変異を示唆する報告があるが、機能獲得型ＮＰＲ２ヘテロ接合性変異は高身長の原因であることがわかっている（Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４、上記）。ｃＧＭＰ生成を刺激するためのＣＮＰのＮＰＲ２との相互作用を考慮すると、ｃＧＭＰレベルを増加させることは、これらの状態において望ましく、これらの疾患および状態からの合併症の管理において治療上の利益を有するであろう。

ＮＰＲ２のヘテロ接合変異は、特発性低身長および他の形態の低身長をもたらすと考えられている。ＮＰＲ２遺伝子の変異は、Ａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９９：Ｅ７１３－７１８，２０１４、Ｈｉｓａｄｏ－Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １００：Ｅ１１３３－１１４２， ２０１５およびＶａｓｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９８：Ｅ１６３６－１６４４，２０１３、に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のＣＮＰバリアントで治療される低身長を有する対象は、－１．０、－１．５、－２．０、－２．５、または－３．０未満の身長ＳＤＳを有し、少なくとも１人の親が－１．０、－１．５、－２．０、または－２．５未満の身長ＳＤＳを有し、任意選択で、２番目の親の身長が通常の範囲内にある。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、－２．０～－３．０の身長ＳＤＳを有する低身長の対象を治療するのに有用である。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、－２．０～－２．５の身長ＳＤＳを有する低身長の対象を治療するのに有用である。しかし、ＮＰＲ２のｄｅ ｎｏｖｏ変異は、身長ＳＤＳが－１．５、－２．０、－２．５、または－３．０未満であると定義されるように低身長になる可能性があるため、どちらの親も低身長を有しないＮＰＲ２の有害な変異のヘテロ接合性キャリアの治療も考えられる。さらに企図されるのは、身長を改善し、かつ／または骨成長を増強するために、他の成長板遺伝子の有害な変異についてヘテロ接合である個体をＣＮＰで治療することである。

ＣＮＰバリアントで治療される可能性のある患者における例示的なＮＰＲ２変異には以下が含まれる：

骨格成長におけるＮＰＰＣの役割は、十分に文書化されている（Ｈｉｓａｄｏ－Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０：９１－９７，２０１８）。ＮＰＰＣノックアウトマウスは、手足の短縮および軟骨内骨化など、重度の不均衡な形態の小人症を示した（Ｈｉｓａｄｏ－Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、上記）。ヒトゲノム全体の研究では、ＮＰＰＣと身長との関係が示されている（Ｈｉｓａｄｏ－Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、上記）。ＣＮＰハプロ不全は、ヒトの低身長の原因であると考えられているが、最近の研究では、低身長および手を有する家族のヘテロ接合変異が同定された（Ｈｉｓａｄｏ－Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、上記）。これらの研究では、ヘテロ接合状態で測定した場合、ｃＧＭＰ産生の有意な低減が観察された（Ｈｉｓａｄｏ－Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、上記）。ＮＰＰＣの変異には、Ｇｌｙ１１９Ｃｙｓの変化を引き起こす３５５Ｇ＞Ｔミスセンス変異、およびＡｒｇ１１７Ｇｌｙの変化を引き起こす３４９Ｃ＞Ｇミスセンス変異が含まれる。ＣＧＭＰ産生を救済するＣＮＰバリアントは、ヘテロ接合性の機能喪失型ＮＰＰＣ変異を有する患者の障害の管理に治療上の利益をもたらす可能性がある。

レリーワイル軟骨骨異形成症（ＬＷＤ）は、前腕および下肢の短縮、手首の異常なずれ（手首のマーデルング変形）、ならびに関連する低身長を特徴とするまれな遺伝性疾患である。ＬＷＤは、性染色体の偽常染色体領域１（ＰＡＲ１）にある低身長ホメオボックス含有（ＳＨＯＸ）遺伝子またはその調節要素のヘテロ接合変異によって引き起こされる。（希少疾患データベースおよびＣａｒｍｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２０：１５４７－１５５９，２０１１を参照）。ランガー型中脚異形成は、ＳＨＯＸ変異が２つある場合に発生し、ホモ接合または複合ヘテロ接合変異のいずれかの各染色体上の変異に起因する可能性がある。ＳＨＯＸ変異のサブセットは、特発性低身長を引き起こす。ターナー症候群は、ＳＨＯＸ遺伝子を含む可能性のあるＸ染色体の欠失が原因で発生する。ＳＨＯＸは、ＦＧＦＲ３転写の調節に関与し、骨成長の制御に寄与することが同定されている（Ｍａｒｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ．３７：４１７－４４８，２０１６）。ＳＨＯＸの欠損はＦＧＦＲ３シグナル伝達の増加につながり、ＳＨＯＸがＣＮＰ／ＮＰＲ２とも直接相互作用することを裏付ける証拠がいくつかある（Ｍａｒｃｈｉｎｉ、上記）。ＳＨＯＸとＦＧＦＲ３および骨成長との関連を考えると、ホモ接合性またはヘテロ接合性のＳＨＯＸ変異を有する対象は、本明細書に記載のＣＮＰバリアントによる治療から利益を得ると企図される。

ＲＡＳ病は、Ｒａｓ／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の遺伝子の変異によって引き起こされるまれな遺伝的状態の群である。ＲＡＳ病は、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路を介したシグナル伝達の増加を特徴とする一群の障害である。この経路は、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の下流の活性化につながる。低身長は、特定のＲＡＳ病の特徴である。例えば、ＣＮＰシグナル伝達はＲＡＦを阻害し、ＭＥＫおよびＥＲＫの活性化を低下させる。

本明細書では、ＲＡＳ病の治療が企図されている。低身長に関連するＲＡＳ病には、ヌーナン症候群、コステロ症候群、心臓顔面皮膚症候群、神経線維腫症１型、およびレオパード症候群が含まれる。遺伝性歯肉線維腫症１型も、本明細書で企図されているＲＡＳ病である。ＲＡＳ病患者（ヌーナン症候群、コステロ症候群、心臓顔面皮膚症候群、神経線維腫症１型、レオパード症候群、遺伝性歯肉線維腫症１型を含む）には、以下の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＣＢＬ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＬＺＴＲ１ ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＲＡＳ、ＮＦ１、ＮＲＡＳ、ＰＰＰ１ＣＢ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＦ１、ＲＲＡＳ、ＲＩＴ１、ＳＨＯＣ２、ＳＯＳ１、またはＳＯＳ２のうちの１つ以上にヘテロ接合型バリアントを有する患者が含まれる（Ｔａｊａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０１８；３９（５）：６７６－７００）。

ＣＦＣは、Ｋ－Ｒａｓ、Ｂ－Ｒａｆ、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２など、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路のいくつかの遺伝子の変異によって引き起こされる。コステロ症候群は、顔面皮膚骨格（ＦＣＳ）症候群とも呼ばれ、Ｈ－Ｒａｓ遺伝子の変異を活性化することによって引き起こされる。遺伝性歯肉線維腫症Ｉ型（ＨＧＦ）は、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｓサブファミリーに作用するグアニンヌクレオチド交換因子（ＳＯＳ）をコードするＳＯＳ１遺伝子（Ｓｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓホモログ１）の優性変異によって引き起こされる。神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１）は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の負の調節因子をコードするニューロフィブロミン１遺伝子の変異によって引き起こされる。ヌーナン症候群（ＮＳ）は、ＳＨＰ２をコードするＰＴＰＮ１１、ＳＯＳ１、Ｋ－Ｒａｓ、Ｒａｆ－１など、いくつかの遺伝子の１つに変異が生じることで引き起こされる。

ＣＮＰは、ＲＡＳ病モデルにおいて効果的な療法であることが実証されている。Ｏｎｏらは、ＩＩ型コラーゲン産生細胞においてＮｆ１を欠損したマウスを生成した（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０１３；２２（１５）：３０４８－６２）。これらのマウスは、構成的なＥＲＫ１／２活性化を示し、軟骨細胞の増殖および成熟を減少させた。これらのマウスにＣＮＰを毎日注射すると、ＥＲＫリン酸化が減少し、低身長が矯正された。Ｂｒａｆ変異（ｐ．Ｑ２４１Ｒ）を使用した心臓顔面皮膚症候群のマウスモデル（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０１９；２８（１）：７４－８３）は、野生型と比較して、体長の減少および成長板幅の低減を示し、増殖および肥大部位がより小さく、ＣＮＰ投与は、これらの動物における体長の増加をもたらした。

複数の遺伝子の変異は、低身長、心臓の欠陥、出血の問題、および骨格の奇形を特徴とするヌーナン症候群を引き起こす可能性がある。ＰＴＰＮ１１遺伝子の変異は、ヌーナン症候群の全症例の約半分を引き起こす。ＳＯＳ１遺伝子の変異はさらに１０～１５％を引き起こし、ＲＡＦ１およびＲＩＴ１遺伝子は各々、症例の約５％を占める。他の遺伝子の変異は各々、少数の症例を説明する。この障害を有する人々の１５～２０パーセントのヌーナン症候群の原因は不明である。

ＰＴＰＮ１１、ＳＯＳ１、ＲＡＦ１、およびＲＩＴ１遺伝子はすべて、細胞分裂および成長（増殖）、分化、ならびに細胞移動に必要なＲＡＳ／ＭＡＰＫ細胞シグナル伝達経路で重要なタンパク質をコードする。ヌーナン症候群に関連する遺伝子の変異の多くは、結果として生じるタンパク質をオン（活性）にし、この長期の活性化は、通常のＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達を変化させ、細胞の成長および分裂の調節を妨害し、ヌーナン症候群の特徴をもたらす。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１１１（３１）：１１４７３－８，２０１４、Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１２６（４）：７４６－５９，２０１０、およびＭｉｌｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １７０（７）：１８７４－８０，２０１６を参照されたい。ＭＡＰＫ経路を活性化する変異を有する対象は、骨成長および低身長を改善するために、本明細書に記載されるようなＣＮＰバリアントによる治療から利益を得ると考えられる。ＭＡＰＫ経路を活性化する変異を有する対象は、ＮＰＲ２受容体がその表面に発現される全身の他の細胞における過剰活性ＭＡＰＫ経路に関連する他の併存疾患を改善するために、本明細書に記載のＣＮＰバリアントによる治療から利益を得るであろうことも企図される。

非受容体タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ－２をコードするＰＴＰＮ１１遺伝子の変異は、ヌーナン症候群などの低身長を特徴とする障害を引き起こす（Ｍｕｓｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １１：２０１－２０６（２００３）。Ｍｕｓｅｎｔｅ（上記）は、低身長につながるＰＴＰＮ１１遺伝子の多数の変異を同定している。機能変異の獲得は、ＳＨＰ２を介した過剰活性なシグナル伝達を引き起こし、成長ホルモン誘発性のＩＧＦ－１放出を阻害し、それによって骨成長の低下に寄与する（Ｒｏｃｃａ Ｓｅｒｒａ－Ｎｅｄｅｌｅｃ，ＰＮＡＳ １０９：４２５７－４２６２，２０１２）。ホモ接合性またはヘテロ接合性のＰＴＰＮ１１変異を有する対象は、骨成長および低身長を改善するために、本明細書に記載されるようなＣＮＰバリアントによる治療から利益を得ると企図される。

軟骨内骨化の調節に関連するインディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）遺伝子の変異は、低身長症候群にも関連している（Ｖａｓｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．１０３：６０４－６１４，２０１８）。同定された多くのＩＨＨ変異は、優性遺伝パターンで低身長で分離する。ＩＨＨと骨の成長および骨化との関連を考えると、ホモ接合性またはヘテロ接合性のＩＨＨ変異を有する対象は、本明細書に記載のＣＮＰバリアントによる治療から利益を得ると考えられる。

Ｎ５４０ＫおよびＫ６５０Ｎを含むＦＧＦＲ３の変異は、低身長および軟骨低形成症を引き起こす。

インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）は、固有のキナーゼ活性を有するヘテロ四量体（α２β２）膜貫通型糖タンパク質である。ＩＧＦ１Ｒは、出生前および出生後の成長に役割を果たすことが示されている。ＩＧＦ１Ｒのヘテロ接合変異は、在胎不当過小児（ＳＧＡ）および家族性低身長の個体で同定されている（Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊ．５９：１７９－１８５，２０１２）。低身長に関連するＩＧＦ１Ｒの変異には、Ｒ１０８Ｑ／Ｋ１１５Ｎ、Ｒ５９Ｔ、Ｒ７０９Ｑ、Ｇ１０５０Ｋ、Ｒ４８１Ｑ、Ｖ５９９Ｅ、およびＧ１１２５Ａ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ、上記）が含まれる。

身長は非常に遺伝性の高い形質であり、数百または数千の遺伝子の複合効果によって影響を受ける可能性がある（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４６：１１７３－１１８９）。個体の低身長は、単一の遺伝子が主要な原因ではなく、これらの遺伝子の複合効果の結果である可能性がある。－１．０、－１．５、－２．０、－２．５、または－３．０未満の身長ＳＤＳによって定義される低身長のそのような個体は、正常動物の長さを増加させるＣＮＰの能力を考えると、ＣＮＰバリアントで有益に治療できると企図され、例えば、骨の成長および骨の長さを向上させる。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、－１．０、－１．５、－２．０、－２．５、または－３．０未満の身長ＳＤＳを有し、身長ＳＤＳ－１．０、－１．５、－２．０、または－２．５未満である少なくとも１人の親を有する低身長の対象を治療するのに有用であり、任意選択で、２番目の親の身長が通常の範囲内にある。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、－２．０～－３．０の身長ＳＤＳを有する低身長の対象を治療するのに有用である。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、－２．０～－２．５の身長ＳＤＳを有する低身長の対象を治療するのに有用である。様々な実施形態において、低身長は、コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１０）、アグリカン（ＡＣＡＮ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、ＰＴＰＮ１１、ＮＰＲ２、ＮＰＰＣ、ＦＧＦＲ３、またはインスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、またはそれらの組み合わせなどの低身長に関連する遺伝子の１つ以上の変異に関連する。

様々な実施形態において、成長板障害または低身長は、ＲＡＳ病に関連する遺伝子の１つ以上の変異に関連している。

様々な実施形態において、低身長は、多遺伝子リスクスコア（ＰＲＳ）によって決定されるような複数の遺伝子の変異の結果である。実施例４に記載される英国バイオバンクプロジェクトからの任意の試料を含まない身長に関する公開された最大のＧＷＡＳメタ分析を使用して、身長について多遺伝子リスクスコア（ＰＲＳ）を計算した。コホートは、５つのＰＲＳ五分位数に分割された（ＰＲＳ１が最低の身長、ＰＲＳ５が最高の身長である）。様々な実施形態において、対象は、ＮＰＲ２に変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＦＧＦＲ３に変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＮＰＲ２に変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＩＧＦ１Ｒに変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＮＰＰＣに変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＳＨＯＸに変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、対象は、ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２およびＳＨＯＸのうちの１つ以上に１つ以上の変異を有し、ＰＲＳが低い。様々な実施形態において、ＰＲＳは１または２である。様々な実施形態において、ＰＲＳは１である。様々な実施形態において、ＰＲＳは２である。

加えて、ＣＮＰバリアントは、くる病、低リン酸血症性くる病（Ｘ連鎖低リン酸血症性くる病（ビタミンＤ耐性くる病とも呼ばれる）および常染色体優性低リン酸血症性くる病を含む）、および骨軟化症（腫瘍誘発性骨軟化症（発癌性骨軟化症または発癌性低リン酸血症性骨軟化症とも呼ばれる）を含む）などの他の骨関連状態および障害の治療に有用である。

本開示のＣＮＰバリアントはまた、変形性関節症を治療するために使用することができる。変形性関節症は関節軟骨の変性疾患であり、高齢者に頻繁に発生する。変形性関節症は、関節の構成要素の変性に起因する軟骨の破壊ならびに骨および軟骨の増殖性変化を伴い、その変化は二次性関節炎（例えば、滑膜炎）をもたらす。変形性関節症では、軟骨の機能的実体である細胞外マトリックスタンパク質が低減し、軟骨細胞の数が減少する（Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．４６（８）：１９８６－１９９６（２００２））。軟骨細胞のマトリックス産生、成長および分化を促進することにより、ＣＮＰ組成物は、ＦＧＦ－２の望ましくない効果に対抗し、変形性関節症を含む関節炎を患う対象におけるマトリックス合成を増加させ、それにより変形性関節症を含む関節炎を治療するのに有用である。

特定の実施形態において、本開示の同じものを含むＣＮＰバリアントおよび組成物および製剤は、骨格異形成症の１つ以上の症状または生理学的結果を改善するのに有用であり、改善は、絶対成長の増加、成長速度の増加、定性的コンピューター断層撮影（ＱＣＴ）骨塩密度の増加、成長板形態の改善、長骨成長の増加、脊椎形態の改善、肘関節可動域の改善、および／または睡眠時無呼吸の減少であり得る。これに関して、「改善された」、「改善」、「増加」、「減少」という用語、およびそれらの文法上の同等物はすべて、病状の症状または生理学的結果に関連して使用される場合に、本発明のＣＮＰバリアント（またはそれを含む組成物または製剤）での治療前の疾患の同じ症状または生理学的結果と比較した（すなわち、「ベースライン」と比較した）、本発明のＣＮＰバリアント（またはそれを含む組成物または製剤）での治療後の疾患の症状または生理学的結果の状態を指す相対的な用語であることに留意されたい。上記のように、「ベースライン」状態は、治療前の対象の状態の測定（その後、治療後の同じ対象の状態と比較することができる）、または同じもしくは類似の特徴（例えば、年齢、性別および／または病状もしくは進行）を共有する同じ苦痛に苦しんでいる対象の集団におけるその状態の測定のいずれかによって決定することができる。

構成的に活性な線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ－３）を発現する細胞を、本明細書に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物と接触させることを含む、構成的に活性な変異体ＦＧＦＲ－３によって誘導される細胞増殖停止を克服する方法も提供される。

ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ－Ｂ）を発現する細胞を、本明細書に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物と接触させることを含む、ＮＰＲ－Ｂを発現する細胞におけるｃＧＭＰ産生を刺激する方法がさらに提供される。

さらに別の実施形態において、本開示は、インビトロまたはインビボで、同じ濃度のｗｔＣＮＰ２２（例えば、１ｕＭ）で産生されたｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、または１５０％の産生を刺激するＣＮＰバリアントを提供する。またさらなる実施形態において、本開示のＣＮＰバリアントは、同じ濃度のｗｔＣＮＰ２２（例えば、１ｕＭ）で産生されたｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、または１５０％の産生をインビトロまたはインビボで刺激する。

本明細書に記載のＣＮＰバリアントのいずれかがこの方法において有用であると企図される。

様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ－３７）（配列番号１）である。様々な実施形態において、ペプチドは、アセチル基をさらに含む。様々な実施形態において、アセチル基は、ペプチドのＮ末端上にある。様々な実施形態において、ペプチドは、Ｃ末端にＯＨまたはＮＨ_２基をさらに含む。様々な実施形態において、バリアントは、本明細書に記載されるような１つ以上のリンカー基を含む。様々な実施形態において、リンカーは、加水分解可能なリンカーである。

治療の有効性は、様々なパラメータによって測定される。様々な実施形態において、有効性は、ベースライン期間から介入期間への年間成長速度の変化として評価される。有効性は、ＣＤＣ成長曲線を使用して測定された、ベースラインから治療終了までの身長ＳＤＳの変化としても評価され、成長速度ＳＤＳは、小児期の骨塩密度研究に基づいている（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２０１４；９９（６）：２１０４－２１１２）。

ＱｏＬＩＳＳＹ、低身長の若者の生活の質は、指示どおりに評価される（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ ｉｎ Ｓｈｏｒｔ Ｓｔａｔｕｒｅ Ｙｏｕｔｈ－Ｔｈｅ ＱｏＬＩＳＳＹ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ．Ｌｅｎｇｅｒｉｃｈ：Ｐａｂｓｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；２０１３）。

薬学的組成物
本開示は、本明細書に記載のＣＮＰバリアント、ならびに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、および／または希釈剤を含む、放出調節組成物を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、１つ以上の他の生物学的に活性な薬剤（例えば、プロテアーゼの阻害剤、受容体チロシンキナーゼ、および／またはクリアランス受容体ＮＰＲ－Ｃ）をさらに含む。

本開示は、本明細書に記載されるようなコンジュゲート部分を含む放出調節組成物を提供する。放出調節組成物には、投与後の遅延（遅延放出投与量）または長期間（延長放出投与量）で薬物を送達するものが含まれる。本明細書で提供されるＣＮＰペプチドコンジュゲートの様々な実施形態には、延長放出、徐放または制御放出、および遅延放出などの放出調節組成物が含まれる。「延長放出組成物」という用語は、投与後長期間にわたって有効成分／薬物を利用可能にする様式で配合された組成物を指す（米国薬局方）。延長放出投与量には、徐放（ＳＲ）または制御放出（ＣＲ）の形態が含まれる。徐放は持続的期間にわたって薬物放出を維持するが、必ずしも一定の速度である必要なく、一方ＣＲはほぼ一定の速度で持続的期間にわたって薬物放出を維持する（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｙｖｏｎｎｅ Ｐｅｒｒｉｅ，Ｔｈｏｍａｓ Ｒａｄｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２００９）。遅延放出組成物または製品は、最初の投与後の一定期間、原薬の放出を遅らせるように改変される。

様々な実施形態において、放出調節組成物は、延長放出組成物である。

様々な実施形態において、延長放出組成物について、ｐＨ７～７．６において（ｉ）ペプチドの約２０％未満が１日目までに放出され、（ｉｉ）ペプチドの約９０％が毎週放出されるか、またはペプチドの約９０％が隔週で放出されるか、またはペプチドの約９０％が毎月放出される。

様々な実施形態において、ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約２０％未満が、１日目までに放出される。様々な実施形態において、ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約１０％未満が、１日目までに放出される。さらに、（ｉ）ｐＨ７．０～７．６において、ペプチドの約３０％、または約４０％、または約５０％未満が、１日目までに放出され（ｉｉ）ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約９０％が毎週放出されるか、またはペプチドの約９０％が隔週で放出されるか、またはペプチドの約９０％が毎月放出されることが企図される。さらに、（ｉ）ｐＨ７．０～７．６において、ペプチドの約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％未満が１日目までに放出され、（ｉｉ）ｐＨ７．０～７．６において、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が毎週放出され、またはペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が隔週で放出され、またはペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が３週間ごとに放出され、またはペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が毎月放出されることが企図される。様々な実施形態において、ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約９０％が毎週放出される。様々な実施形態において、ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約９０％が隔週で放出される。様々な実施形態において、ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約９０％が毎月放出される。さらに、放出は、ｐＨ７．０～７．６、ｐＨ７．１～７．５、ｐＨ７．２～７．４、ｐＨ７．２～７．６、またはｐＨ７．０～７．４のｐＨであり得ることが企図される。

様々な実施形態において、（ｉ）ｐＨ７．０～７．６において、約２５％未満、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５％のペプチドが１日目までに放出され、（ｉｉ）ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約９０％が毎週放出されるか、またはペプチドの約９０％が隔週で放出されるか、またはペプチドの約９０％が毎月放出される。さらに、（ｉ）ｐＨ７．０～７．６において、約２５％未満、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５％のペプチドが１日目までに放出され、（ｉｉ）ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が毎週放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が隔週で放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が３週間ごとに放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約８０％、もしくは約９０％が毎月放出されるか、あるいは代替的に、ｉｉ）ｐＨ７～７．６において、ペプチドの約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％が毎週放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％が隔週で放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％が３週間ごとに放出されるか、または、ペプチドの約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％が、毎月放出されることが企図される。

様々な実施形態において、組成物は、賦形剤、希釈剤、または担体を含む。様々な実施形態において、延長放出組成物は、賦形剤、希釈剤または担体を含む。様々な実施形態において、賦形剤、希釈剤または担体は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体である。

賦形剤、担体および希釈剤の非限定的な例には、ビヒクル、液体、緩衝液、等張剤、添加剤、安定剤、防腐剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、湿潤剤、補助剤などが含まれる。組成物は、液体（例えば、水、エタノール）を含むことができる。様々な緩衝液内容物の希釈剤（例えば、トリス－ＨＣｌ、リン酸塩、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液）、ｐＨおよびイオン強度、洗剤および可溶化剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、メチオニン、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、ｍ－クレゾール）、および増量物質（例えば、乳糖、マンニトール、ショ糖）を含むことができる。薬学的組成物の製剤における賦形剤、希釈剤、および担体の使用は、当該技術分野で知られており、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １４３５－１７１２，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９０））を参照されたい。

例えば、担体には、希釈剤、ビヒクルおよびアジュバント、ならびにインプラント担体、ならびに活性成分と反応しない不活性で非毒性の固体または液体充填剤およびカプセル化材料が含まれるが、これらに限定されない。担体の非限定的な例には、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、水、およびエマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）が含まれる。担体は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、およびそれらの混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。

いくつかの実施形態において、組成物は液体製剤である。特定の実施形態において、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、または約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５～５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５～３ｍｇ／ｍｌ、または約１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のＣＮＰバリアントを含む。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、０．８ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬの濃度である。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、０．８ｍｇ／ｍＬの濃度である。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、２．０ｍｇ／ｍＬの濃度である。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、凍結乾燥粉末から再構成される。

さらなる実施形態において、組成物は、ＣＮＰ含有溶液または懸濁液のｐＨを所望の範囲内に維持するための緩衝液または緩衝剤を含む。緩衝液の非限定的な例には、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、およびハンクス緩衝生理食塩水が含まれる。緩衝剤には、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびクエン酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。緩衝剤の混合物も使用することができる。特定の実施形態において、緩衝剤は、酢酸／酢酸塩またはクエン酸／クエン酸塩である。組成物に好適な緩衝剤の量は、使用される特定の緩衝液および溶液または懸濁液の所望のｐＨに部分的に依存する。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、約１０ｍＭ±５ｍＭの濃度を有する。特定の実施形態において、組成物のｐＨは、約ｐＨ３～約ｐＨ９、または約ｐＨ３～約ｐＨ７．５、または約ｐＨ３．５～約ｐＨ７、または約ｐＨ３．５～約ｐＨ６．５、または約ｐＨ４～約ｐＨ６、または約ｐＨ４～約ｐＨ５、または約ｐＨ５．０±１．０である。様々な実施形態において、ｐＨは、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９または６．０である。様々な実施形態において、ｐＨは、５．５である。

他の実施形態において、組成物は、溶液または懸濁液を等張性にし、投与により適合するための等張性調整剤を含む。等張剤の非限定的な例には、ＮａＣｌ、デキストロース、グルコース、グリセリン、ソルビトール、キシリトール、およびエタノールが含まれる。特定の実施形態において、等張剤はＮａＣｌである。特定の実施形態において、ＮａＣｌは、約１６０±２０ｍＭ、または約１４０ｍＭ±２０ｍＭ、または約１２０±２０ｍＭ、または約１００ｍＭ±２０ｍＭ、または約８０ｍＭ±２０ｍＭ、または約６０ｍＭ±２０ｍＭの濃度である。

さらに他の実施形態において、組成物は防腐剤を含む。防腐剤には、ｍ－クレゾールおよびベンジルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、防腐剤は、約０．４％±０．２％、または約１％±０．５％、または約１．５％±０．５％、または約２．０％±０．５％の濃度である。

さらに他の実施形態において、組成物は、（例えば、ガラスまたはプラスチックへのＣＮＰバリアントの吸着を軽減するために）吸着防止剤を含有する。吸着防止剤には、ベンジルアルコール、ポリソルベート２０、およびポリソルベート８０が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、吸着防止剤は、約０．００１％～約０．５％、または約０．０１％～約０．５％、または約０．１％～約１％、または約０．５％～約１％、または約０．５％～約１．５％、または約０．５％～約２％、または約１％～約２％の濃度である。

追加の実施形態において、組成物は安定剤を含む。安定剤の非限定的な例には、グリセリン、グリセロール、チオグリセロール、メチオニン、およびアスコルビン酸ならびにそれらの塩が含まれる。いくつかの実施形態において、安定剤がチオグリセロールまたはアスコルビン酸またはそれらの塩である場合、安定剤は、約０．１％～約１％の濃度である。他の実施形態において、安定剤がメチオニンである場合、安定剤は、約０．０１％～約０．５％、または約０．０１％～約０．２％の濃度である。さらに他の実施形態において、安定剤がグリセリンである場合、安定剤は、約５％～約１００％（ニート）の濃度である。

さらなる実施形態において、組成物は抗酸化剤を含む。例示的な抗酸化剤には、メチオニンおよびアスコルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗酸化剤対ＣＮＰのモル比は、約０．１：１～約１５：１、または約１：１～約１５：１、または約０．５：１～約１０：１、または約１：１～約１０：１または約３：１～約１０：１である。

無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩）、有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩）、およびアミンの塩（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジエタノールアミン）を含むがこれらに限定されない、薬学的に許容される塩を組成物に使用することができる。薬学的に許容される塩の完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９０））にある。

薬学的組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、溶液、懸濁液、乳濁液、軟膏、および経皮パッチなどの様々な形態で投与することができる。組成物の剤形は、組成物の所望の投与様式に合わせて調整することができる。経口投与の場合、組成物は、例えば、錠剤またはカプセル（ソフトゲルカプセルを含む）の形態をとることができ、または、例えば、水溶液または非水溶液、懸濁液またはシロップであり得る。経口投与用の錠剤およびカプセルは、マンニトール、ラクトース、グルコース、スクロース、デンプン、コーンスターチ、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、炭酸マグネシウム、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、フマル酸ステアリルナトリウム）などの１つ以上の通常使用される賦形剤、希釈剤、および担体を使用することができる。必要に応じて、香味料、着色料、および／または甘味料を固体および液体製剤に加えることができる。経口製剤の他の任意の成分には、防腐剤、懸濁剤、および増粘剤が含まれるが、これらに限定されない。経口製剤は、胃の酸性環境からＣＮＰバリアントを保護するために腸溶コーティングを施すこともできる。固体および液体剤形を調製する方法は、この分野の当業者に知られているか、または明らかであろう（例えば、上記で参照されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい）。

非経口投与用の製剤は、例えば、液体溶液または懸濁液として、注射前の液体媒体への可溶化または懸濁液に好適な固体形態として、またはエマルジョンとして調製することができる。例えば、無菌の注射可能な溶液および懸濁液は、好適な希釈剤、担体、溶媒（例えば、緩衝水溶液、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液）、分散剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤などを使用して当技術分野で知られる技術に従って製剤できる。さらに、無菌不揮発油、脂肪酸エステル、ポリオール、および／または他の不活性成分を使用することができる。さらなる例として、非経口投与用の製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる水性無菌注射可能溶液、および水性および非水性の無菌懸濁液が含まれこれには、懸濁剤および増粘剤を含めることができる。

ＣＮＰバリアントを含む組成物はまた、凍結乾燥製剤であり得る。特定の実施形態において、凍結乾燥製剤は、緩衝剤および増量剤、ならびに任意選択で抗酸化剤を含む。例示的な緩衝液には、酢酸塩緩衝液およびクエン酸塩緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。例示的な増量剤には、マンニトール、スクロース、デキストラン、ラクトース、トレハロース、およびポビドン（ＰＶＰ Ｋ２４）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、マンニトールは、約３％～約１０％、または約４％～約８％、または約４％～約６％の量である。特定の実施形態において、スクロースは、約６％～約２０％、または約６％～約１５％、または約８％～約１２％の量である。例示的な抗酸化剤には、メチオニンおよびアスコルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態において、製剤は、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トレハロース、マンニトール、メチオニン、ポリソルベート８０、および任意選択で注射用無菌水（ＷＦＩ）を含む。

本開示はまた、例えば、ボトル、バイアル、アンプル、チューブ、カートリッジ、および／または液体（例えば、無菌注射可能）製剤または固体（例えば、凍結乾燥）製剤を含むシリンジを含むキットを提供する。キットはまた、注射用にまたは濃縮物をより低い濃度に希釈するためのシリンジ内に凍結乾燥製剤を再構築することを含むが、これに限定されない、固形（例えば、凍結乾燥）製剤を投与用の溶液または懸濁液（例えば、注射による）に再構成するための薬学的に許容されるビヒクルまたは担体（例えば、溶媒、溶液および／または緩衝液）を含むことができる。さらに、即時注射溶液および懸濁液は、例えば、ＣＮＰ含有組成物を含む無菌粉末、顆粒、または錠剤から調製することができる。キットには、エアロゾルまたは注射ディスペンシングデバイス、ペンインジェクター、自動インジェクター、無針インジェクター、シリンジ、および／または針などのディスペンシングデバイスも含まれる。

非限定的な例として、キットは、シングルチャンバーまたはデュアルチャンバーを有するシリンジを含むことができる。シングルチャンバーシリンジの場合、シングルチャンバーは、注射の準備ができている液体ＣＮＰ製剤、または注射のための溶液もしくは懸濁液へと再構築することができる比較的少量の好適な溶媒系（例えば、グリセリン）中の固体（例えば、凍結乾燥）ＣＮＰ製剤もしくはＣＮＰバリアントの液体製剤を含有することができる。デュアルチャンバーシリンジの場合、注射のために、一方のチャンバーは薬学的に許容されるビヒクルまたは担体（例えば、溶媒系、溶液、または緩衝液）を含有することができ、他方のチャンバーは、第１のチャンバーからのビヒクルまたは担体を使用して、溶液または懸濁液に再構成することができる比較的少量の好適な溶媒系（例えば、グリセリン）中の固体（例えば、凍結乾燥）ＣＮＰ製剤またはＣＮＰバリアントの液体製剤を含有することができる。

さらなる例として、キットは、１つ以上のペンインジェクターまたは自動インジェクターデバイス、およびデュアルチャンバーカートリッジを含むことができる。注射のために、カートリッジの一方のチャンバーは、薬学的に許容されるビヒクルまたは担体（例えば、溶媒系、溶液、または緩衝液）を含有することができ、他方のチャンバーは、第１のチャンバーからのビヒクルまたは担体を使用して、溶液または懸濁液に再構成することができる比較的少量の好適な溶媒系（例えば、グリセリン）中の固体（例えば、凍結乾燥）ＣＮＰ製剤またはＣＮＰバリアントの液体製剤を含有することができる。カートリッジは、所望の期間（例えば、２日、３日、１週間、２週間、３週間、４週間など）にわたって投薬するのに十分な量のＣＮＰバリアントを含むことができる。ペンインジェクターまたは自動インジェクターは、カートリッジから所望の量のＣＮＰ製剤を投与するように調整できる。

投与および投薬
ＣＮＰバリアント、またはそれらを含む薬学的組成物もしくは製剤は、例えば、皮下、関節内、腹腔内、筋肉内、皮内、または経口などの様々な方法で対象に投与することができる。一実施形態において、ＣＮＰバリアント組成物は、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または６ヶ月に１回投与される。

ＣＮＰバリアントまたはその組成物はまた、作用の標的部位（例えば、異常または変性関節または軟骨領域）でのデポーの移植によって投与することができる。あるいは、ＣＮＰバリアントは、舌下（例えば、舌下錠）で、経皮送達によって（例えば、皮膚上のパッチによって）、またはマイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム（非帯電または帯電（例えば、カチオン性））、高分子微粒子（例えば、ポリアミド、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド－グリコリド））、マイクロエマルジョンなどの形態で経口的に投与することができる。

本明細書に記載のＣＮＰバリアント組成物は、骨関連障害（例えば、軟骨無形成症を含む骨格異形成症）を治療、改善、または予防するために、治療有効用量でそれを必要とする患者に投与することができる。ＣＮＰバリアントの安全性および治療効力は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬理学的手順によって、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％における治療有効用量）を決定することによって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。通常、大きな治療指数を示す活性剤が好ましい。

特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＮＰバリアント組成物は、約３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ｎｍｏｌ／ｋｇ～約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または約２０ｎｍｏｌ／ｋｇ～約２００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＣＮＰ組成物は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、もしくは２０００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量、または治療医師によって適切とみなされる他の用量で投与される。他の実施形態において、ＣＮＰバリアント組成物は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、もしくは１０００μｇ／ｋｇ、または約０．５、０．８、１．０、１．２５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ／ｋｇの用量、または治療医師によって適切とみなされる他の用量で投与される。本明細書に記載のＣＮＰまたはＣＮＰバリアントの用量は、本明細書に記載の投薬頻度／投与の頻度に従って投与することができ、これには、毎日、週に２または３回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月などが含まれるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、ＣＮＰまたはＣＮＰバリアントは、毎日皮下投与される。様々な実施形態において、ＣＮＰまたはＣＮＰバリアントは、毎週皮下投与される。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、２．５μｇ／ｋｇ／日～６０μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日～４５μｇ／ｋｇ／日、または１５μｇ／ｋｇ／日～３０μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、１５μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、３０μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。

特定の対象に対するＣＮＰバリアントの投薬／投与の頻度は、治療される障害ならびに療法に対する対象の状態および応答を含む、様々な因子に応じて変化し得る。ＣＮＰバリアントは、投薬あたり単一の用量でまたは複数の用量で投与することができる。特定の実施形態において、ＣＮＰバリアント組成物は、単一の用量でまたは複数の用量で、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、もしくは６ヶ月に１回、または治療医師によって適切とみなされるように投与される。様々な実施形態において、ＣＮＰバリアントは、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月以上にわたって投与される。

いくつかの実施形態において、ＣＮＰバリアント組成物は、成長期間（例えば、軟骨形成）、その後の回復期間（例えば、骨形成）を可能にするように投与される。例えば、ＣＮＰ組成物は、皮下に、または別の様式によって、ある期間、毎日または週に複数回投与され、治療されない期間が続き、次いでサイクルが繰り返される。いくつかの実施形態において、治療の初期期間（例えば、毎日または週に複数回のＣＮＰバリアント組成物の投与）は、３日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、または１２週間である。関連する実施形態において、無治療の期間は、３日、１週間、２週間、３週間または４週間続く。特定の実施形態において、ＣＮＰバリアント組成物の投薬レジメンは、３日間毎日、その後３日休止、または１週間にわたって毎日もしくは週に複数回、その後３日もしくは１週間休止、または２週間にわたって毎日もしくは週に複数回、その後１週間もしくは２週間休止、または３週間にわたって毎日もしくは週に複数回、その後１、２、もしくは３週間休止、または４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２週間にわたって毎日もしくは週に複数回、その後１、２、３、もしくは４週間休止である。

バイオマーカー
骨関連障害の治療では、子宮内および新生児の長骨成長測定や、ＣＮＰ、ｃＧＭＰ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＸ、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）などの骨成長バイオマーカーの測定など、成長の指標を測定できる。

１つのＣＮＰシグナル伝達マーカーはｃＧＭＰ（グアノシン３’、５’環状モノホスフェート）である。この細胞内シグナル伝達分子のレベルは、ＣＮＰがその同族受容体ＮＰＲ－Ｂに結合して活性化した後に増加する。ｃＧＭＰのレベルの上昇は、ＣＮＰ曝露後の細胞培養抽出物（インビトロ）、ＣＮＰ曝露後の骨外植物研究（エクスビボ）からの馴化培地、およびＣＮＰ皮下、静脈内、または当技術分野で知られている他の投与経路を介しての投与から数分以内の血漿（インビトロ）から測定できる。

軟骨および骨に特異的な分析物（または軟骨および骨に関連するマーカー）を測定して、ＣＮＰの効力を評価することもできる。例えば、切断されたコラーゲンタイプＩＩの断片は、軟骨ターンオーバーの軟骨特異的マーカーである。ＩＩ型コラーゲンは軟骨の主要な有機成分であり、ＩＩ型コラーゲンの断片（切断されたコラーゲン）は循環系に放出され、軟骨ターンオーバーに続いて尿中に分泌される。軟骨の代謝回転は、新しい骨の形成に先行する。

測定可能な骨形成の骨特異的バイオマーカーは、Ｉ型プロコラーゲン（ＰＩＮＰ）のＮ末端プロペプチドである。Ｉ型コラーゲンは骨基質の主要な有機成分であるため、Ｉ型コラーゲンの合成は骨形成の重要なステップである。コラーゲン合成中に、プロペプチドはプロコラーゲン分子から放出され、血清中で検出することができる。さらに、Ｉ型コラーゲンの断片は骨吸収のマーカーとして測定できる。

軟骨および骨の形成および成長に関する他の潜在的なバイオマーカーには、アグリカンコンドロイチンスルフェート（軟骨ターンオーバーの軟骨特異的マーカー）、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチド（軟骨形成の軟骨特異的マーカー）、Ｉ型コラーゲンＣ－テロペプチド（ＣＴｘ）、アルカリホスファターゼ（骨特異的）、およびオステオカルシン（骨形成のための骨特異的マーカー）が含まれる。軟骨および骨に関連するバイオマーカーは、例えば、市販のキットを使用して、効力／薬力学的インビボ研究からの血清中およびエクスビボ研究の馴化培地から測定することができる。

一実施形態において、骨および軟骨の形成およびインビボでの成長に対するＣＮＰ組成物の効果を監視するために、本明細書に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物を投与された対象において、少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルがアッセイまたは測定される。例えば、少なくとも１つの骨または軟骨に関連するバイオマーカーのレベルの増加は、ＣＮＰバリアントまたは組成物の投与が骨の成長にプラスの効果をもたらし、ＣＮＰ活性の低下に関連する骨格異形成症および他の骨または軟骨関連の疾患または障害の有用な治療であることを示し得る。例示的な骨または軟骨関連バイオマーカーには、ＣＮＰ（例えば、内因性レベルのＣＮＰ）、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、Ｉ型コラーゲンＣ－テロペプチド（ＣＴｘ）、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、コラーゲンＸ、アグリカンコンドロイチンスルフェート、ならびにアルカリホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態において、バイオマーカーは、ＣＮＰバリアントが投与される、投与されている、または投与された対象から生物学的試料を得ることによって測定される。バイオマーカーは、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、および酵素活性アッセイを含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている技術を使用して測定することができる。生物学的試料は、血液、血清、尿、または他の体液である可能性がある。

本開示のさらなる態様および詳細は、限定的ではなく例示的であることが意図される以下の実施例から明白であろう。

実施例１：ＣＮＰバリアントの合成
ＣＮＰバリアントペプチドは、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ／Ｐｒｅｌｕｄｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）、Ｖｏｙａｇｅｒ（ＣＥＭ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＳｙｒｏＩＩ（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）シンセサイザーにＣ末端ＣＯＯＨを残す樹脂を使用して固相で合成した。

すべてのＦｍｏｃ－アミノ酸は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）またはＢａｃｈｅｍ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、Ｎ－ｔ－Ｂｏｃ（ＫＷ）、Ｏ－ｔ－Ｂｕ（ＤＥＳＴＹ）、Ｎ－Ｔｒｔ（ＨＮＱ）、Ｓ－Ｔｒｔ（Ｃ）、またはＮ－Ｐｂｆ（Ｒ）基で保護された側鎖官能基を有した。すべてのアミノ酸カップリングステップで、ダブルカップリングを使用した２０分の活性化時間でＮＭＰ中の５倍過剰ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／アミノ酸／ＤＩＰＥＡ（１：１：１：２）を使用した。

ペプチドのアセチル化（Ａｃ）は、樹脂をＮＭＰ／Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＥＡ（１０：１：０．１、ｖ／ｖ／ｖ）と３０分間室温で反応させることによって行った。

部分のコンジュゲーションのために、リジン上の保護アミノ基を切断して反応性基を作製した。標準的なＦｍｏｃ合成を使用して、２ｘＦｍｏｃ－アミノＰＥＧ（２）、続いてグルタミン酸、続いてＣ１８－二酸を反応させた。

完成したペプチドは、ＴＦＡ（４０ｍＬ／ｍｍｏｌ樹脂）と室温で２時間の反応によって樹脂から切断した。粗ペプチドを濾過し、氷冷Ｅｔ_２Ｏで沈殿させ、続いて凍結乾燥および分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）による最終的なで精製を行った。最終産生物および純度を質量分析によって確認した。

ＣＮＰバリアントは、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ ＣＮＰ－３７（ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１））の配列に基づいて生成され、任意選択で異なるアミノ酸残基の変更、および／またはＮ末端でのアセチル化、および／または他の修飾を有し、以下を含む（アミノ酸変更には下線を引く）：

。

完全に還元されたペプチドを、０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で１ｍＭのシステイン（ＳＳ形態）および８ｍＭのシステイン（ＳＨ形態）を含有する、グアニジンＨＣｌを含むか、または含まない、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、室温で撹拌した。さらなるピーク変化が観察されなくなるまで、ジスフィルド形成をＨＰＬＣ分析によって監視した。混合物を、精製のために分取ＲＰ－ＨＰＬＣに充填した。

実施例２：合成されたＣＮＰバリアントの特徴分析
実施例１のように合成されたＣＮＰバリアントを、質量分析およびＵＶ分光法によって分析して、１０日後の純度および安定性を決定した。

安定性は、時間Ｔ０～Ｔ１０にわたる純度のＲＰ－ＨＰＬＣ分析を使用して測定した。簡潔には、ＣＮＰバリアントを緩衝液：５ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１．５％マンニトール、０．７ｍｇ／ｍｌメチオニン、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ５．６で１：５に希釈した。１０μＬの注入量をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ａｅｒｉｓ ＸＢ－Ｃ１８ ＲＰカラム（２μｍ、１００Ａ、２．１ｘ２５０ｍｍ、ｐ／ｎ ００Ｇ－４５０５－ＡＮ）に注入した。ＨＰＬＣ条件は、移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ／０．０５％ＴＦＡ、ｐＨ３ ｗ／ＮＨ_４ＯＨ（約３ｍＭ最終）、移動相Ｂ：７０％Ｈ_２Ｏ中ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ、ｐＨ３ ｗ／ＮＨ_４ＯＨ（約３ｍＭ最終）、および０．２５ｍＬ／分の流速であった。測定は、５５℃のカラム温度およびＵＶ：２１４ｎｍ（ｂｗ ４ｎｍ）、ｒｅｆ ３６０ｎｍ（ｂｗ ２０ｎｍ）、ＵＶ：２８０ｎｍ（ｂｗ ４ｎｍ）、ｒｅｆ ３６０ｎｍ（ｂｗ ２０ｎｍ）で実施した。ＣＮＰバリアントをＰＢＳ、ｐＨ７．４に、３７℃で１０日間保持し、安定性測定値を得た。安定性測定の結果は、以下の表１においてＴ０（０日）またはＴ１０（１０日）で検出されたバリアント％として示す。

ＣＮＰバリアントは、ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ Ｃｙｃｌｉｃ－ＧＭＰ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｂｕｌｋキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｒ８０７５）を使用したｃＧＭＰ刺激アッセイによって活性について試験した。簡潔には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）およびＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレート（９６ウェルブラックイメージングプレート、Ｇｒｅｎｉｅｒ、＃６５５０９０）に６０，０００細胞／ウェルで播種した。培地は次のとおりである。ＮＩＨ３Ｔ３培地：ＤＭＥＭ高グルコース、ピルビン酸塩（Ｔｈｅｒｍｏ、１１９９５－０７３）＋１０％ＦＢＳ＋１ｘＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｐ／Ｓと略記、Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１５１４０１２２）。ＮＩＨ３Ｔ３は、ｃＧＭＰアッセイＨＥＫ２９３培地の対照系であった：ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１ｘＰ／Ｓ＋１ｘＧＭＡＸ。無血清ＮＩＨ３Ｔ３培地：ＩＢＭＸ（ＣＡＳ２８８２２－５８－４）で細胞を処理するためのＤＭＥＭ＋１ｘＰ／Ｓ、ＢＳＡを含む無血清ＮＩＨ３Ｔ３培地：ＣＮＰで細胞を処理するためのＤＭＥＭ＋１ｘＰ／Ｓ＋０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ９４１８－１００Ｇ）。

細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。ＣＮＰバリアントで処理する細胞の場合、プレートを使用の１５分前にＩＢＭＸ（Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８９１６１－３４０、１ｇ）で前処理した。ＩＢＭＸは、ホスホジエステラーゼの強力な非特異的阻害剤である。ＩＢＭＸの８００ｍＭストック溶液をＩＢＭＸ希釈培地（無血清培地（１ｘＰＢＳと１：１で混合したＤＭＥＭ＋１ｘＰＢＳ））で０．７５ｍＭワーキングストックに希釈する。

ＣＮＰバリアントは、次のように調製した：１０ｍｇ／ｍｌのＣＮＰ溶液をＣＮＰ希釈培地（ＤＭＥＭ＋１ｘＰ／Ｓ＋０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）で１：１０００に希釈する。この溶液をさらに希釈して、１００ｎＭのＣＮＰ／ウェルで播種されたＣＮＰ開始溶液を得る。この１００ｎＭのＣＮＰ溶液を、６つの希釈液に１：５でさらに段階希釈して、０．００６４ｎＭ ＣＮＰ／ウェルの下限濃度を得る。これは分析のために７点用量曲線を提供する。

細胞処理のために、細胞をインキュベーターから取り出し、増殖培地を細胞から取り出し、細胞をＩＢＭＸで処理した。８０μＬの０．７５ｍＭ ＩＢＭＸを各ウェルに添加し、細胞を３７℃のインキュベーターに１５分間戻した。１５分後、ＣＮＰ（４０μＬ／ウェル）を各試験ウェルに加え、細胞を３７℃のインキュベーターに１５分間戻す。プレートを穏やかなタッピングによって混合した。プレートをＳｏｌｅｎｔｉｍセルメトリックで画像化して細胞を視覚化し、細胞が浮き上がっているかを決定し、次いで３７℃のインキュベーターに戻した。

反応を停止し、４０μＬの溶解緩衝液（ｃＧＭＰキットから）を添加して細胞を溶解した。プレートをシェーカーに５分間置き、溶解を完了した。細胞溶解物をｃＧＭＰアッセイで使用した。

ｃＧＭＰアッセイは、ｃＧＭＰキャリブレーター、ウサギ抗ｃＧＭＰ抗体、および製造業者のプロトコルに従って調製されたＨＲＰ－ｃＧＭＰを使用して実施された。４０μＬのキャリブレーターを抗ｃＧＭＰ抗体でコーティングされたプレートのウェルに添加し、分析対象のライセート４０μＬを適切なウェルに添加した。４０μＬの再構成ウサギ抗ｃＧＭＰ抗体をすべてのウェルに添加し、プレートをシェーカーに５分間置いて混合した。４０μＬの再構成されたＨＲＰ－ｃＧＭＰを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを手動で吸引し、３００μＬの洗浄緩衝液で４回洗浄した。１００μＬのストップライトレッド基質を各ウェルに添加し、プレートを覆い、光から保護し室温で少なくとも１０分間放置した。プレートは、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍまたは同様の機器で、励起５３０ｎｍおよび発光５９０ｎｍでの蛍光強度について読み取られた。

表１は、ＣＮＰバリアントがｃＧＭＰ産生を刺激することを示し、本明細書に記載の安定なバリアントが骨関連障害を治療するための治療剤として有用であることを示す。

実施例２Ａ：血漿におけるＣＮＰバリアントまたはコンジュゲートの安定性
異なるＣＮＰバリアントまたはＣＮＰコンジュゲートの安定性を、２４時間の期間にわたってヒト血漿における安定性について試験した。簡潔には、２つのＯＥＧスペーサーを使用して、Ｃ１８脂肪酸をガンマグルタミン酸に融合させた（例えば、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ５８：７３７０－７３８０，２０１５を参照されたい）。クロマトグラフィーについて、Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ Ｈクラスは、ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ｕｍ、２．１ｘ１５０ｍｍ、移動相Ａ：水中の１％ＤＭＳＯ ０．１％ギ酸、移動相Ｂ：ＣＡＮ中の１％ＤＭＳＯ ０．１％ギ酸に接続された。質量分析は、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴＲＡＰを使用して実施した。

各ＣＮＰバリアントをヒト血漿Ｌｉヘパリンにおいて２００ｎＭで調製し、試料を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。反応は、０．５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ４で０、１、２、４、８、２４時間でクエンチした。血漿タンパク質をＭｅＯＨ中の０．２％ギ酸で沈殿させ、試料をＷＣＸ ９６ウェルｕＥｌｕｔｉｏｎプレートを使用して調製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ６５００によって分析した。

バリアントＣＮＰ－Ｒは、環部分にないＫ残基がＲ残基に変更されるＣＮＰ３７バリアントを指し、ＣＮＰ Ｑ／Ｒは、Ｎ残基がＱに変更され、環部分にないＫ残基がＲに変更されるＣＮＰ３７バリアントを指す。

図１は、異なるリンカー構造を有するＣＮＰコンジュゲートを示す。図２は、脂質化コンジュゲートが血漿中のＰＥＧ化または非コンジュゲート化ペプチドと比較して血漿中で改善された安定性を有することを示す。

異なるコンジュゲートの安定性も、変動する条件で分析した。簡潔には、上記と同じプロトコルを、３７℃（対照）、３７℃＋０．５ＭのＮａＣｌ、３７℃＋プロテアーゼ阻害剤、または４℃で使用した。図３は、ＰＧ－ＣＮＰ３７およびバリアントがヒト血漿においてタンパク質分解を受けやすいことを示し、ＰＧ－ＣＮＰ３７は、他のバリアントと比較してより大きな安定性を示す。

実施例３：ヘテロ接合型ＮＰＲ２変異はＣＮＰ治療に反応する
ＮＰＲ２変異に起因する低身長の対象に対するＣＮＰの効果を決定するために、ＮＰＲ２変異の細胞モデルが開発された。分析された例示的なＮＰＲ２変異を図６に示す。ＮＰＲ２遺伝子のノックアウトまたはヘテロ接合性の機能喪失変異を有するラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞は、１２５ｎｇのＮＰＲ２バリアントまたはＲＣＳまたはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた野生型ＮＰＲ２プラスミドＤＮＡを使用したＲＣＳ細胞へのＲＮＰトランスフェクションによって作製された。単一細胞クローンを播種し、サンガー配列決定によって遺伝子型を決定した。細胞モデルは、様々な変異の公開されたｃＧＭＰ表現型を再現することができる。

ＮＰＲ２クローンは、ＲＣＳ細胞のＮＰＲ２の最初のエクソンに挿入および削除を作成することによって作成された。ＮＰＲ２の最初のエクソンの配列は、次世代配列決定によって確認され、図５に示されている。ＮＰＲ２変異細胞は、６ｎＭのＰｒｏ－Ｇｌｙ ＣＮＰ３７で処理した後、ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ環状－ＧＭＰ蛍光アッセイを使用したｃＧＭＰ刺激アッセイによってＣＮＰ投与に応答する活性について試験された。ＲＣＳ（ラット軟骨肉腫）細胞は、ＲＣＳ培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１ｘＰｅｎ Ｓｔｒｅｐに４０，０００細胞／ウェルで播種した。図４は、外因性Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ３７バリアントを追加すると、ＮＰＲ２＋／－ラット軟骨肉腫細胞モデルでｃＧＭＰの読み取りが救済されることを示す。

以前の活性化データは、ＰＲＫＧ２の活性化について４０～３６０ｎＭの範囲のｃＧＭＰ ＥＣ５０を報告している（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １２，２３８８－２３９８，２０１７）、Ｖａａｎｄｒａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，１１８１６－２３，１９９７）、Ｐｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３７４，４１９－２５，１９９５）。ヘテロ接合型ＮＰＲ２ノックアウト細胞では、ＣＮＰ用量＞０．１６３ｎＭで、ＰＲＫＧ２活性化ｃＧＭＰのＥＣ５０範囲を超える細胞内濃度を達成できる（図４）。一方、野生型細胞では、０．０４０ｎＭのＣＮＰ用量で同じｃＧＭＰ濃度を達成できる。これらの結果は、ＣＮＰ補給が、ＮＰＲ２の機能喪失型変異を有する細胞におけるＰＲＫＧ２の活性化および増殖に必要なｃＧＭＰレベルを達成できることを示す。

これらの結果はまた、ＣＮＰバリアントの投与が、ＮＰＲ２の活性が低下している低身長の被験者の骨成長を回復するのに有用であることを示唆している。さらに、ＣＮＰバリアントによる治療は、ｃＧＭＰシグナル伝達が損なわれる可能性がある他の成長板遺伝子に変異を有する対象において有益であると考えられる。

実施例４：低身長に関連する変異の同定
遺伝的に駆動される双方向効果の明確な証拠を示す遺伝子は、幅広い患者集団で効果的に調節できる治療標的を表す可能性が高いと仮定されている。成長のコア調節因子である遺伝子を同定するために、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）からの遺伝子のリストを含む、５つの遺伝子リストの共通部分を分析した。コア成長調節因子は、双方向効果（すなわち、低身長または骨格異形成および高身長または過成長）を伴うまれなコーディング変異を含む可能性が最も高いであろう。

照会されたデータベースには次のものが含まれる。ＧＷＡＳ：約７００，０００人の個体を使用した身長の大規模なＧＷＡＳメタ分析によって報告された３，２９０の独立した遺伝的バリアントの各々について２，０６７の非反復の最も近い遺伝子が抽出された。ＨＧＭＤ：ＨＧＭＤバージョンｖ２０１９＿２の「ａｌｌｍｕｔ」テーブルを照会して、同じ遺伝子に「低身長」と「高身長または過成長」のいずれかを持つ「ＤＭ」とラベル付けされたすべての病原性バリアントを探した。ＯＭＩＭ：成長障害に関連するＯＭＩＭ遺伝子のリストは以前に説明されており、低身長、過成長、骨格異形成症、短指症というキーワードを使用して作成された。

最初に、ヒト遺伝子変異データベース（ＨＧＭＤバージョンｖ２０１９＿２）で、低身長または高身長に関連する遺伝子が照会された（Ｓｔｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １３６：６６５－６７７，２０１７）。「低身長」を引き起こすと文献で報告されている少なくとも１つの病原性バリアントと注釈が付けられた４７の遺伝子があった。高身長または過成長遺伝子として注釈が付けられたのは２０個の遺伝子だけであった。次に、キーワード：低身長、過成長、骨格異形成症、短指症を使用して作成された２５８個のＯＭＩＭ遺伝子の手動でキュレートされたリスト（低身長２４８個、高身長２０個）が使用された（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４６：１１７３－８６，２０１４）。三番目に、これらのリストの共通部分をＧＷＡＳの遺伝子リストと比較した。これらのリストの共通部分には、身長に関連することが知られている３つの遺伝子（ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２）があり、さらに２つの遺伝子（ＦＧＦＲ３、ＳＨＯＸ）が同定された。

追加の分析により、身長が大幅に減少し（β＝－０．２０、９５％ＣＩ［－０．２６～－０．１４］、ｐ＝４．０４ｘ１０－１１）、特発性低身長のリスクが大幅に増加（ＩＳＳ）（ＯＲ＝２．７５、９５％ＣＩ［１．９２～３．９６］した５つのコア遺伝子の新しい群が生成された。コア５遺伝子（ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸ）の各々は、個別に検討した場合は身長に関連し、他の変異と組み合わせた場合は低身長にも関連していた。ＦＧＦＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２、およびＳＨＯＸの変異の例を図７に示す。

ＮＰＲ２とＩＧＦ１ＲのＬｏＦ（機能喪失）とミスセンスバリアントとの組み合わせも、ＩＳＳのリスク増加と関連していた（それぞれＯＲ＝３．３１、Ｐ＝０．００１、ＯＲ＝２．８５、Ｐ＝０．００２）。ＳＨＯＸ、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＰＰＣ、ＮＰＲ２のタンパク質機能の喪失を引き起こす遺伝子全体の欠失および／または変異は、様々な程度の重症度の家族性低身長で報告されている。

分析は、５つのコア遺伝子のいずれかのバリアントのキャリアはＩＳＳのリスクがおよそ３倍高く、ＩＳＳの総人口の６．７％を占めることを示す。さらに、外因性ＣＮＰを追加した後のＮＰＲ２ハプロ不全の細胞モデルにおけるＮＰＲ２シグナル伝達の用量依存的な救済が実証された。

オムニジェニックモデル（Ｌｉｕ、ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７７：１０２２－１０３４ ｅ６（２０１９）、Ｂｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６９：１１７７－１１８６（２０１７））によると、これらの遺伝子がコアヒト成長遺伝子である場合、それらの効果は調節ネットワークを駆動する複数のより弱い一般的な遺伝子バリアントによって調節されるべきである。この仮説を間接的に試験するために、英国バイオバンクプロジェクトからの試料を含まない身長に関する公開された最大のＧＷＡＳメタ分析を使用して、身長の多遺伝子リスクスコア（ＰＲＳ）を計算した。コホートは、５つの同じサイズ（ｎ＝６，８２４）のＰＲＳ五分位数に分割された（ＰＲＳ１が最低の身長、ＰＲＳ５が最高の身長）。ＰＲＳスコアの増加と平均身長との間には用量依存的な関係があった（ＰＲＳ五分位の増加ごとにβ＝０．３０）（図８Ａ）。５つのコア遺伝子のＬｏＦバリアントのキャリアは、５つの異なるＰＲＳバックグラウンド全体でキャリアよりも一貫して短かった。図８を参照されたい。データは、ＰＲＳとまれなタンパク質バリアントの複合効果が相加モデルと一致していることを示唆している：多遺伝子性効果は、キャリアおよび非キャリアの両方で身長を調節した。

ＰＲＳ群にわたるＩＳＳのリスクは、ＰＲＳ＝３を参照として使用して計算された。最も低いＰＲＳ群はＩＳＳのリスクの増加と関連し、最も高いＰＲＳ群はリスクの減少と関連していた（ＰＲＳ１およびＰＲＳ５についてそれぞれＯＲ＝５．４３、Ｐ＝８．５８ｘ１０－３４、ＯＲ＝０．２２、Ｐ＝４．４９ｘ１０－７）。５つのコア遺伝子のまれなコーディングバリアントの効果は、ＰＲＳ群によって層別化されたＩＳＳについて評価された。５つのコア遺伝子のいずれかのキャリアは、最初の３つの五分位でＩＳＳのリスクが高かった（ＯＲ＝２．６４、Ｐ＝３．０９ｘ１０－５、ＯＲ＝２．１７、Ｐ＝０．０４、ＯＲ＝５．２９、Ｐ＝１．５８ｘ１０－５、ＯＲ＝２．７２、Ｐ＝０．０９図８Ｃ～Ｆ）。ＰＲＳによって層別化されたＩＳＳリスクに対する各個々のコア遺伝子のキャリアについて、一貫した影響の方向が観察された（図８Ｃ～Ｆ）。

さらに、ＰＲＳの相加効果は、主に個々の小さな効果を伴う複数の一般的な遺伝的変異に由来し、データセットの身長の分散の２０．１％を予測した。ＰＲＳのこれらの相加効果は、コア遺伝子のまれなコーディング変異のキャリアおよび非キャリアに対して同様の大きさを持っているように見えた。この観察結果は、ＰＲＳがまれな病原性バリアントの浸透度の違いに大きく寄与する可能性があることを示す（特に、ここで説明するようなハプロ不全のモデルにおいて）。この考えを支持して、低いＮＰＲ２活性を持つ８つのＮＰＲ２バリアントキャリアのうちの２つが低い通常の身長を有することが観察された。このデータは、ＮＰＲ２に変異を有するほとんどのＩＳＳ個体が、ＮＰＲ２活性を失うという病原性の影響を受けやすくなる多遺伝子性の背景を持っている可能性があることを示唆している。

これらの結果は、ＣＮＰベースの治療がＮＰＲ２ハプロ不全患者集団に有効である可能性があるという考えを支持している。さらに、一般集団のＮＰＲ２キャリアにおけるｃＧＭＰレベルと身長の有意な双方向（ＬｏＦおよびＧｏＦ）相関を示す結果は、この受容体をＣＮＰ類似体で標的化することがすべてのＩＳＳ個体にとって効果的な療法である可能性があることを示唆している。

本明細書に記載される本開示のすべての実施形態は、本明細書に記載される他の実施形態のうちのいずれか１つ以上と任意選択で組み合わされ得ることが理解される。本明細書で引用されるすべての特許文献およびすべての非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲、上記の説明、および／または添付の図面によって定義される本発明の精神および範囲内にあるすべての変更を網羅することを意図していることが理解される。したがって、特許請求の範囲に見られるそのような制限のみが、本発明に課せられるべきである。

Claims (42)

1. ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号５）、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１）、ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号６）、および
   ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＫＹＫＧＡＱＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号７）からなる群から選択されるＣ型ナトリウム利尿ペプチドのバリアント。
2. 前記ペプチドが、アセチル基をさらに含む、請求項１に記載のバリアント。
3. 前記アセチル基が、前記ペプチドのＮ末端上にある、請求項１または２に記載のバリアント。
4. 前記ペプチドが、Ｃ末端にＯＨまたはＮＨ_２基をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
5. コンジュゲート部分を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
6. 前記コンジュゲート部分が、ＣＮＰ環状ドメインの残基上、または前記ＣＮＰ環状ドメイン以外の部位にある、請求項５に記載のバリアント。
7. 前記コンジュゲート部分が、リジン残基上にある、請求項５または６に記載のバリアント。
8. 前記コンジュゲート部分が、酸部分を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載のバリアント。
9. 前記コンジュゲート部分が、親水性スペーサーに連結された酸部分を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載のバリアント。
10. 前記酸部分および前記親水性スペーサーが、構造ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡを有する、請求項８または９のいずれか一項に記載のバリアント。
11. 前記ペプチドが、
    Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号８）、
    Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号９）、
    Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１０）、
    Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＲＹＲＧＡＮＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１１）、および
    Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＱＡＲＲＹＲＧＡＱＲＲＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＮＨ_２（配列番号１２）からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
12. 前記ＣＮＰバリアントが、Ａｃ－ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１）またはＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫ（ＡＥＥＡ－ＡＥＥＡ－γＧｌｕ－Ｃ１８ＤＡ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ－ＯＨ（配列番号１）である、請求項１０または１１のいずれか一項に記載のバリアント。
13. リンカーを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
14. 前記リンカーが、ＣＮＰ環状ドメインの残基上、または前記ＣＮＰ環状ドメイン以外の部位にある、請求項１３に記載のバリアント。
15. 前記リンカーが、加水分解可能なリンカーである、請求項１３または１４のいずれか一項に記載のバリアント。
16. 前記リンカーが、リジン残基上にある、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のバリアント。
17. 前記ＣＮＰバリアントが、前記リンカーを介して前記コンジュゲート部分に連結される、請求項５～１６のいずれか一項に記載のバリアント。
18. 前記リンカーが、前記コンジュゲート部分の前記親水性スペーサーを介して前記コンジュゲート部分に付着される、請求項１７に記載のバリアント。
19. 前記リンカーが、ペプトイドリンカーまたは電子リンカーである、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のバリアント。
20. 前記ペプチドが、合成的に作製される、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
21. 前記ペプチドが、３７℃、ｐＨ７～７．４で１０日間安定である、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
22. 前記ペプチドが、ｃＧＭＰアッセイにおいて０．１～１０ｎｍのＥＣ５０を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
23. 前記ペプチドの４５％超が、３７℃、ｐＨ７．４の水性媒体中で１０日後に検出される、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
24. 前記ペプチドが、１つ以上の脂質、脂肪酸、親水性スペーサー部分、または任意選択で、それらの組み合わせにコンジュゲートされる、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
25. 前記ペプチドが、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＣＮＰ３７、ＣＮＰ－２２、またはＰｒｏ－Ｇｌｙ ＣＮＰおよびＣＮＰ－２２の両方と比較してより長い半減期を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のバリアント。
26. 請求項１～２５のいずれか一項に記載のＣＮＰバリアント、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む、薬学的組成物。
27. 約４～約６のｐＨを有するクエン酸／クエン酸塩緩衝液または酢酸／酢酸塩緩衝液を含む製剤から調製される凍結乾燥製剤である、請求項２６に記載の組成物。
28. 前記凍結乾燥製剤が、マンニトール、スクロース、ソルビトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される等張性調整剤または増量剤をさらに含む製剤から調製される、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記凍結乾燥製剤が、メチオニン、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩形態、チオグリセロール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗酸化剤をさらに含む製剤から調製される、請求項２７～２８のいずれか一項に記載の組成物。
30. 骨関連障害または骨格異形成症の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物を含む組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
31. 前記骨関連障害または骨格異形成症が、骨関節炎、低リン酸血症性くる病、軟骨無形成症、軟骨低形成症、低身症、小人症、骨軟骨異形成症、致死性異形成症、骨形成不全症、軟骨無発生症、点状軟骨異形成症、同型接合性軟骨形成不全症、点状軟骨異形成症、彎曲肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ症、周産期致死型骨形成不全症、短肋骨多指症症候群、軟骨低形成症、肢根型点状軟骨異形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端骨異形成症、成長不全性骨形成症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨症、ランガー型中脚異形成症、ニーバーゲルト型中脚異形成症、ロビンノウ症候群、ラインハルト症候群、先端骨形成不全症、末梢異形成症、ニースト異形成症、線維軟骨形成症、ロバーツ症候群、遠位中間肢異形成症、短肢症、モルキオ症候群、ニースト症候群、複合有機栄養性異形成、および脊椎骨端骨幹端異形成、ＮＰＲ２変異、ＳＨＯＸ変異（ターナー症候群／レリーワイル）、ＰＴＰＮ１１変異（ヌーナン症候群）、インスリン成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）変異、ならびに特発性低身長からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
32. 骨を伸ばすこと、または長骨成長を増加させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記投与することが、骨を伸ばすか、または長骨成長を増加させる、方法。
33. 前記組成物が、皮下、皮内、関節内、経口、または筋肉内投与される、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記組成物が、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または６ヶ月に１回投与される、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記組成物が、延長放出組成物である、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. ＣＮＰ応答性状態または障害を治療する方法であって、
    請求項１～２９のいずれか一項に記載のＣＮＰバリアントまたは組成物を対象に投与することと、
    前記対象における少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルを監視することと、を含み、
    前記少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルの増加が、前記対象または前記状態もしくは障害に対する前記ＣＮＰバリアントの治療効果を示す、方法。
37. 前記ＣＮＰバリアントの投与の量または頻度を調整することをさらに含み、
    ｉ）前記少なくとも１つの骨もしくは軟骨関連バイオマーカーのレベルが目標レベルを下回る場合、前記ＣＮＰバリアントの投与の量もしくは頻度が増加するか、または
    ｉｉ）前記少なくとも１つの骨もしくは軟骨関連バイオマーカーのレベルが目標レベルを上回る場合、前記ＣＮＰバリアントの投与の量もしくは頻度が減少する、請求項３６に記載の方法。
38. 前記少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーが、ＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、Ｉ型コラーゲンＣ－テロペプチド（ＣＴｘ）、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、アグリカンコンドロイチンスルフェート、コラーゲンＸ、ならびにアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項３６または３７に記載の方法。
39. 前記ペプチドを、Ｆｍｏｃアミノ酸を使用して固相樹脂上で合成することを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＣＮＰバリアントを作製する方法。
40. 前記ペプチドが、前記樹脂をＮＭＰ／Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＥＡ（１０：１：０．１、ｖ／ｖ／ｖ）と反応させることによってアセチル化される、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ペプチドが、任意選択でリジン残基上で、脂質部分にコンジュゲートされる、請求項３９または４０に記載の方法。
42. 前記リジン上の前記保護アミノ基を切断すること、前記ペプチドを２ｘＦｍｏｃ－アミノＰＥＧ（２）と反応させ、続いてアミノ酸と反応させること、続いて脂質または脂肪酸部分のコンジュゲーションを含む、請求項４１に記載の方法。

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