TW202124422A - Cnp變異體及其共軛物 - Google Patents

Abstract

一般而言，本揭示案係關於C型利尿鈉肽（C-type natriuretic peptide；CNP）之穩定變異體及其治療骨相關病症之用途。

Description

CNP變異體及其共軛物

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2019年9月16日申請之美國臨時專利申請案第62/901,093號、2019年11月13日申請之美國臨時專利申請案第62/935,050號、2020年1月20日申請之美國臨時專利申請案第62/963,350號、2020年1月23日申請之美國臨時專利申請案第62/964,852號及2020年6月12日申請之美國臨時專利申請案第63/038,667號之優先權，該等申請案以全文引用之方式併入本文中。以引用之方式併入以電子方式提交的材料

作為本揭示案之一部分的序列表與說明書同時提交為正文檔案。含有序列表之正文檔案之名稱為「54736_Seqlisting.txt」，其創建於2020年8月6日且大小為54,429位元組。序列表之主題以全文引用之方式併入本文中。__

一般而言，本揭示案係關於C型利尿鈉肽（C-type natriuretic peptide；CNP）之變異體、包括CNP變異體之醫藥組合物及使用方法。CNP變異體可用作治療劑，用於治療對CNP起反應之疾病，包含（但不限於）骨相關病症，諸如骨骼發育不良（例如，軟骨發育不全）。

C型利尿鈉肽（CNP）（《生物化學與生物物理研究交流（Biochem.Biophys.Res. Commun.）》, 168: 863-870（1990）（Genbank寄存編號NP_077720，對於CNP前驅蛋白NPPC）（《高血壓雜誌（J. Hypertens.）》, 10: 907-912（1992））為具有17個胺基酸之環結構之肽家族（ANP、BNP、CNP）中之小單鏈肽（Levin等人, 《新英格蘭醫學雜誌（N. Engl. J. Med.）》, 339: 863-870（1998））且在多種生物過程中具有重要角色。CNP與利尿鈉肽受體-B（NPR-B、GC-B）相互作用以刺激產生環鳥苷單磷酸（cyclic-guanosine monophosphate；cGMP）（《高血壓雜誌》 10: 1111-1114（1992））。CNP為廣泛表現的，包含表現於中樞神經系統、生殖道、骨及血管內皮中（《高血壓（Hypertension）》, 49: 419-426（2007））。

在人類中，CNP最初以單鏈126個胺基酸之前-原多肽形式產生自利尿鈉肽前驅體C（natriuretic peptide precursor C；NPPC）基因（《生物化學與生物物理研究交流》, 168: 863-870（1990））。移除信號肽產生原-CNP，且藉由內切蛋白酶弗林蛋白酶（endoprotease furin）進一步裂解產生活性53個胺基酸之肽（CNP-53），其經分泌且藉由未知酶再次裂解以產生成熟的22個胺基酸之肽（CNP-22）（Wu, 《生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）》 278: 25847-852（2003））。CNP-53及CNP-22的不同之處在於其分佈，其中CNP-53在組織中占主導地位，而CNP-22主要發現於血漿及腦脊髓液中（J. Alfonzo, 《受體信號轉導研究（Recept.Signal.Transduct.Res.）》, 26: 269-297（2006））。CNP-53及CNP-22均與NPR-B類似地結合。

cGMP產生介導之下游信號傳導影響許多不同生物過程，包含軟骨內骨化。舉例而言，小鼠模型中之CNP或NPR-B之基因敲除導致矮化表型之動物具有較短的長骨及脊椎。已經鑑別出阻斷正常CNP信號傳導的人類NPR-B突變且其導致侏儒症（Olney等人, 《臨床內分泌與代謝雜誌（J. Clin. Endocrinol. Metab.）》91（4）: 1229-1232（2006）；Bartels等人, 《美國人類遺傳學雜誌（Am. J. Hum. Genet.）》75: 27-34（2004））。相比之下，經工程改造以產生升高含量之CNP的小鼠展現延長的長骨及脊椎。

CNP（CNP22）之治療用途受其短血漿半衰期限制，該短血漿半衰期已在人類活體內顯示為2.6分鐘（《臨床內分泌與代謝雜誌》, 78: 1428-35（1994））。具有更長活體內血清半衰期且展示與野生型CNP類似或改良之活性的CNP變異體對於可持續治療策略係重要的。

本揭示案涉及在水性介質中具有增加的循環半衰期及穩定性之C型利尿鈉肽（CNP）之新穎變異體、包括此類CNP變異體之醫藥組合物，以及使用此類CNP變異體治療對CNP起反應之病症的方法，該等病症包含（但不限於）骨相關病症，例如軟骨發育不全。

在各種實施例中，本揭示案提供選自由以下組成之群組的C型利尿鈉肽（CNP）之變異體：PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 1）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 6）；以及PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）。

在各種實施例中，本揭示案提供選自由以下組成之群組的C型利尿鈉肽（CNP）之變異體：PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 1）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 6）；PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）；以及PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 7）。

在各種實施例中，變異肽進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基位於肽之N端上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。

在各種實施例中，變異肽包括共軛部分。在各種實施例中，共軛部分在CNP環狀域之殘基上或在除該CNP環狀域之外的位點處。在各種實施例中，共軛部分位於離胺酸殘基上。在各種實施例中，共軛部分包括一或多個酸部分。在各種實施例中，酸部分為疏水性酸。

在各種實施例中，共軛部分包括一或多個與親水性間隔基連接之酸部分。在各種實施例中，親水性間隔基為任何胺基酸。在各種實施例中，親水性間隔基為γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，親水性間隔基為OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）。在各種實施例中，親水性間隔基為γ麩胺酸（γGlu）或OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）。在各種實施例中，親水性間隔基為與一或兩個或更多個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）連接之γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，酸部分為脂肪酸。例示性脂肪酸包含短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸或二羧基脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為飽和或不飽和的。考慮C-6至C-20脂肪酸，包含（但不限於）C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20飽和或不飽和脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為癸酸、十二酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十酸或其二酸。

在各種實施例中，酸部分及親水性間隔基具有結構AEEA-AEEA-γGlu-C18DA。在各種實施例中，酸部分及親水性間隔基具有結構：

，其中「

」表示與CNP變異體之連接點。在各種實施例中，「

」表示與可水解連接子之連接點，其中可水解連接子連接至CNP變異體。在各種實施例中，可水解連接子能夠釋放完整CNP變異體。

在各種實施例中，具有接共軛部分之CNP變異體為緩釋組合物之組分。在各種實施例中，緩釋組合物為延釋組合物。在各種實施例中，包括共軛部分及可水解連接子之CNP變異體能夠釋放CNP變異體，其中在pH 7至7.6下，（i）第1天釋放小於約20%之CNP變異體；且（ii）每週釋放約90%之CNP變異體，或每兩週釋放約90%之CNP變異體，或每月釋放約90%之CNP變異體。

在各種實施例中，（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%或約75%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽、或每兩週釋放約90%之肽、或每月釋放約90%之肽。經進一步考慮（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%或約75%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約80%或約90%之肽；或可替代地ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽。

在各種實施例中，變異體具有以下結構：PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）或Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）。

在各種實施例中，變異體係選自由以下組成之群組： Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）； Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 9）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 10）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 11）； Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 12）； Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 13）；以及 Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 14）。

在各種實施例中，變異體包括一或多個連接子基團。在各種實施例中，連接子位於CNP環狀域之殘基上或位於除該CNP環狀域之外的位點處。在各種實施例中，連接子位於離胺酸殘基上。

在各種實施例中，連接子為可水解連接子。

在各種實施例中，CNP變異體經由連接子連接至共軛部分。在各種實施例中，連接子經由共軛部分之親水性間隔基連接至共軛部分。在各種實施例中，連接子為胺基乙氧基-2-乙氧基乙酸（AEEA）。在各種實施例中，連接子為bicin型連接子或類肽連接子，其係指具有與bicin（雙-2-羥乙基甘胺醯胺）類似之裂解機制，但替代地經由不對稱N-烷基肽（亦即類肽）裂解的連接子。在各種實施例中，連接子為基於非酶β消除之電子連接子。在各種實施例中，電子連接子包括SO₂ 部分。如CNP共軛物中所說明之連接子之實例闡述於圖1中。亦參見Santi等人, 《美國科學院院刊（Proc Natl Acad Sci USA）》109:6211-6216, 2012）。

在各種實施例中，共軛部分為合成聚合基團。在各種實施例中，變異體包括經由可水解連接子與變異體偶合之合成聚合基團。在各種實施例中，合成聚合基團包括親水性聚合物部分。在各種實施例中，親水性聚合物部分包括聚乙二醇（PEG）。在各種實施例中，親水性聚合物部分包括具有6至20個原子鏈長之聚乙二醇（PEG）。

在各種實施例中，變異肽係以合成方式製備的。

在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.0至7.6下穩定10天。在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.0至7.4下穩定至少10天。在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.2至7.6下穩定至少10天。

在各種實施例中，變異肽對脫醯胺作用為穩定的。在各種實施例中，變異肽對氧化為穩定的。在各種實施例中，變異肽對脫醯胺作用及/或氧化或其組合為穩定的。在各種實施例中，甲硫胺酸經正白胺酸置換。在各種實施例中，10天後幾乎無或無可偵測之脫醯胺作用。

在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.0至7.6下具有約10天之半衰期。在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.0至7.4下具有約10天之半衰期。在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.2至7.6下具有約10天之半衰期。在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.0至7.6下具有至少10天之半衰期。在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.0至7.4下具有至少10天之半衰期。在各種實施例中，變異肽在約37℃、pH 7.2至7.6下具有至少10天之半衰期。在各種實施例中，半衰期為至少約15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、30天或更長時間。

在各種實施例中，在cGMP分析中，變異肽具有0.1至10 nM之EC50。在各種實施例中，在cGMP分析中，變異肽具有0.1至25 nM之EC50。

在各種實施例中，在生理條件，例如約37℃、pH 7.0至7.6下，在水性介質中10天之後，偵測到大於45%之變異肽。在各種實施例中，在生理條件，例如約37℃、pH 7.0至7.6下，在水性介質中10天之後，偵測到大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之變異肽。

在各種實施例中，在37℃、pH 7.4下，在水性介質中10天之後，偵測到大於45%之變異肽。在各種實施例中，在37℃、pH 7.4下，在水性介質中10天之後，偵測到大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之變異肽。

在各種實施例中，在生理條件，例如約37℃、pH 7.0至7.6下，在血漿中10天之後，偵測到大於45%之變異肽。在各種實施例中，在生理條件，例如約37℃、pH 7.0至7.6下，在血漿中10天之後，偵測到大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之變異肽。

在各種實施例中，在37℃、pH 7.4下，在血漿中10天之後，偵測到大於45%之變異肽。在各種實施例中，在37℃、pH 7.4下，在血漿中10天之後，偵測到大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之變異肽。

在各種實施例中，變異肽與脂質、脂肪酸、親水性間隔基或連接子或視情況與其組合共軛。在各種實施例中，連接子為親水性聚合物部分。在各種實施例中，親水性聚合物部分為合成親水性聚合物部分。

在各種實施例中，與Pro-Gly-CNP37相比，變異肽具有更長的半衰期。在各種實施例中，與CNP-22相比，變異肽具有更長的半衰期。在各種實施例中，與Pro-Gly-CNP37及/或CNP-22相比，變異肽具有更長的半衰期。在各種實施例中，與活體外及/或活體內之Pro-Gly-CNP37及/或CNP-22相比，變異肽具有更長的半衰期。

本揭示案進一步提供一種醫藥組合物，其包括本文所描述之CNP變異體及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。

在各種實施例中，組合物為由包括pH為約4至約6的檸檬酸/檸檬酸鹽緩衝液或乙酸/乙酸鹽緩衝液的調配物製備的凍乾調配物。在各種實施例中，凍乾調配物係由進一步包括等張調節劑或選自由以下組成之群組的增積劑之調配物製備：甘露糖醇、蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、聚山梨醇酯80及其組合。在各種實施例中，該凍乾調配物係由進一步包括選自由以下組成之群組的抗氧化劑之調配物製備：甲硫胺酸、抗壞血酸、抗壞血酸之鹽形式、硫甘油及其組合。在各種實施例中，CNP變異體組合物以凍乾粉末形式供應，用於自0.8 mg復原至10 mg。在各種實施例中，CNP變異體組合物以0.8 mg或2 mg凍乾無防腐劑之復原用粉末形式供應。

在各種實施例中，組合物為延釋組合物。

在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37）（BMN111）（EQ ID NO: 1）。

亦提供一種治療有需要之個體之骨相關病症或骨骼發育不良之方法，其包括向個體投與包括如本文所描述之CNP變異體之組合物。

在各種實施例中，骨相關病症或骨骼發育不良係選自由以下組成之群組：骨關節炎（osteoarthritis）、低磷酸鹽血性佝僂病（hypophosphatemic ricket）、軟骨發育不全（achondroplasia）、軟骨生成減退（hypochondroplasia）、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良（osteochondrodysplasias）、致死性發育不良、成骨不全（osteogenesis imperfecta）、軟骨成長不全（achondrogenesis）、點狀軟骨發育異常（chondrodysplasia punctata）、純合性軟骨發育不全（homozygous achondroplasia）、點狀軟骨發育異常、屈肢骨發育不良（camptomelic dysplasia）、先天性致死型低磷酸酶症（congenital lethal hypophosphatasia）、圍產期致死型成骨不全（perinatal lethal type of osteogenesis imperfecta）、短肋多指症候群（short-rib polydactyly syndromes）、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育異常（rhizomelic type of chondrodysplasia punctata）、揚森型幹骺端發育不良（Jansen-type metaphyseal dysplasia）、先天性脊椎骨骺發育不良（spondyloepiphyseal dysplasia congenita）、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良（Langer-type mesomelic dysplasia）、尼維格型肢中骨發育不良（Nievergelt-type mesomelic dysplasia）、羅氏症候群（Robinow syndrome）、萊因哈特症候群（Reinhardt syndrome）、肢端發育不全（acrodysostosis）、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良（Kniest dysplasia）、纖維軟骨增生症、羅伯茨症候群（Roberts syndrome）、肢端肢中發育不良、小肢、莫奎氏症候群（Morquio syndrome）、克尼斯特症候群（Kniest syndrome）、後生營養性發育不良及脊椎骨骺幹骺端發育不良（spondyloepimetaphyseal dysplasia）。

在各種實施例中，CNP變異體適用作用於治療特發性身材矮小及其他骨骼發育不良之生長激素的輔助或替代。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾（Turner's syndrome/Leri Weill））或PTPN11突變（努南氏症候群（Noonan's syndrome））引起。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）或PTPN11突變（努南氏症候群）或胰島素生長因子1受體（insulin growth factor 1 receptor；IGF1R）引起。

在各種實施例中，CNP變異體適用於治療生長板病症及身材矮小，包含家族性身材矮小、顯性家族性身材矮小（其亦稱為顯性遺傳性身材矮小）或特發性身材矮小。在各種實施例中，身材矮小或生長板病症為膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（indian hedgehog；IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3之突變的結果。

在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病（RASopathy）之基因中之一或多個突變相關。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由拉索病引起。在各種實施例中，拉索病為努南氏症候群、科斯特洛症候群（Costello syndrome）、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤或LEOPARD症候群。

在一個實施例中，拉索病為遺傳性1型齒齦纖維瘤病。

在各種實施例中，CNP變異體適用於治療生長板病症及身材矮小，包含家族性身材矮小、顯性家族性身材矮小（其亦稱為顯性遺傳性身材矮小）或特發性身材矮小。在各種實施例中，身材矮小或生長板病症為膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰島素生長因子1受體（IGF1R）之突變的結果。

在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多個突變相關。

在各種實施例中，CNP變異體適用於治療具有如下之身材矮小的個體：身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0，且至少一個親代之身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療具有身高SDS為-2.0至-3.0之身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療具有身高SDS為-2.0至-2.5之身材矮小的個體。在各種實施例中，身材矮小與相關於身材矮小之基因中之一或多個突變相關，諸如膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰島素生長因子1受體（IGF1R）或其組合。在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多個突變相關。

在各種實施例中，身材矮小為如藉由多基因風險評分（PRS）所確定之多個基因之突變的結果。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有IGF1R之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPPC之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有SHOX之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX中之一或多者之一或多個突變及低PRS。在各種實施例中，PRS為1或2。在各種實施例中，PRS為1。在各種實施例中，PRS為2。如實例4所描述來計算身高之多基因風險評分（PRS）。PRS 1係指最矮身高，PRS 5係指最高身高。

在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 1）。在各種實施例中，肽進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基位於肽之N端上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。在各種實施例中，變異體包括一或多個如本文所描述之連接子基團。在各種實施例中，連接子為可水解連接子。

在各種實施例中，本揭示案提供一種在有需要之個體中進行骨延長或增加長骨生長之方法，其包括向個體投與包括本文所描述之CNP變異體之組合物，且其中該投與使骨延長或增加長骨生長。

在各種實施例中，組合物經皮下、皮內、關節內、經口或肌肉內投與。

在各種實施例中，每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次地投與組合物。

在各種實施例中，組合物為延釋組合物。

經進一步考慮一種治療CNP反應性病狀或病症之方法，其包括向個體投與如本文所描述之CNP變異體或組合物，及監測個體之至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量，其中至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量增加指示CNP肽或變異體對個體或病狀或病症之治療作用。

經進一步考慮一種克服由組成性活性突變型纖維母細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3；FGFR-3）誘導之細胞生長遏制之方法，其包括使表現組成性活性FGFR-3之細胞與如本文所描述之CNP變異體或組合物接觸。

經進一步考慮一種在表現利尿鈉肽受體B（NPR-B）之細胞中刺激cGMP產生之方法，其包括使表現NPR-B之細胞與如本文所描述之CNP變異體或組合物接觸。

在各種實施例中，方法進一步包括調節如本文所描述之CNP肽或變異體之投與量或頻率，其中i）若至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量低於目標含量，則CNP肽或變異體之投與量或頻率增加；或ii）若至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量高於目標含量，則減少CNP肽或變異體之投與量或頻率。

在各種實施例中，至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記係選自由以下組成之群組：CNP、cGMP、II型膠原蛋白及其片段之前肽、II型膠原蛋白及其片段、I型膠原蛋白C端肽（CTx）、骨鈣化素、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen；PCNA）、I型原膠原之前肽（PINP）及其片段之前肽、I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）、膠原蛋白X及鹼性磷酸酶。

在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 1）。在各種實施例中，肽進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基位於肽之N端上。在各種實施例中，乙醯基位於肽序列內之胺基酸側鏈上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。在各種實施例中，變異體包括一或多個如本文所描述之連接子基團。在各種實施例中，連接子為可水解連接子。

亦提供一種製備本文所描述之CNP變異體之方法，其包括使用Fmoc胺基酸於固相樹脂上合成肽。

在各種實施例中，方法包括藉由使樹脂與NMP/Ac2O/DIEA（10:1:0.1，v/v/v）反應而使肽乙醯化。

在各種實施例中，該方法包括使肽與視情況存在於離胺酸殘基上之共軛部分共軛。在各種實施例中，該方法包括使離胺酸上之保護性胺基裂解、使肽與2× Fmoc-胺基PEG(2)反應，接著與胺基酸反應，接著使脂質或脂肪酸部分共軛。

本揭示案係關於適用於治療骨骼發育不良及骨生長病症之穩定CNP變異體。

如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外明確規定，否則不定冠詞「一（a/an）」以及定冠詞「該（the）」包含複數以及單數指示物。

術語「約（about）」或「大致（approximately）」意謂如由本領域中一般熟習此項技術者所測定之特定值之可接受誤差，其部分取決於如何量測或測定該值。在某些實施例中，術語「約」或「大致」意謂在1、2、3或4個標準差內。在某些實施例中，術語「約」或「大致」意謂在給定值或範圍的30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.05%內。當術語「約」或「大致」冠於一系列兩個或更多個數值中的第一數值之前時，應理解術語「約」或「大致」適用於該系列中之數值中之每一者。

術語「C型利尿鈉肽」或「CNP」係指在C末端具有17個胺基酸之環結構的較小單鏈肽（GenBank寄存編號NP_077720，對於CNP前驅蛋白NPPC）及其變異體。17-聚體CNP環結構亦稱為CNP 17、CNP環或CNP環狀域。CNP包含活性53個胺基酸之肽（CNP-53）及成熟22個胺基酸之肽（CNP-22），以及兩個肽之間的不同長度之肽。

在各種實施例中，「CNP變異體」與野生型NPPC在相同數目之胺基酸殘基上為至少約40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同源。經進一步考慮CNP變異肽可包括約1至約53、或1至39、或1至38、或1至37、或1至35、或1至34、或1至31、或1至27、或1至22、或10至35、或約15至約37個NPPC多肽殘基。在一個實施例中，CNP變異體可包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35,36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53個源自NPPC多肽之胺基酸的序列。

術語「共軛部分」係指與變異肽共軛之部分。共軛部分包含脂質、脂肪酸、親水性間隔基、合成聚合物、連接子或視情況包含其組合。

術語「有效量」係指足以對個體之健康狀況、病變或疾病產生所要結果或足以用於診斷目的之劑量。所要結果可包括劑量之接受者的主觀或客觀改善。「治療有效量」係指可有效產生所預期的對健康有益的效果的藥劑量。在任何個別情況下之適當「有效」量可由本領域中一般熟習此項技術者使用常規實驗來測定。應理解，針對任何具體患者之特定劑量水準及劑量頻率可變化且將取決於多種因素，包含所採用之特定化合物的活性；生物可用性、代謝穩定性、分泌速率以及該化合物之作用時間長度；化合物之投與模式及投與時間；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別以及飲食；以及特定病狀之嚴重程度。

「實質上純的」或「經分離的」意謂目標物質為存在之主要物質（即，按莫耳計，比組合物中之任何其他個別大分子物質更豐富），且基本上純化之部分為其中目標物質占所存在之所有大分子物質之至少約50%（按莫耳計）的組合物。在一個實施例中，實質上純的組合物意謂所關注之物質以莫耳計或重量計占存在於組合物中之大分子物質之至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更多。若組合物基本上由單一大分子物質組成，則將目標物質純化至基本均質（藉由習知偵測方法無法偵測到組合物中之污染物質）。出於此定義之目的，溶劑物質、小分子（＜500道爾頓）、穩定劑（例如BSA）及元素離子物質不視為大分子物質。在一個實施例中，本揭示案之化合物為實質上純的或經分離的。在另一實施例中，本揭示案之化合物相對於其生產中所使用之大分子起始物質為實質上純的或經分離的。在又另一實施例中，本揭示案之醫藥組合物包括與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑且視情況與另一生物活性劑摻合的實質上純的或經分離的CNP變異體。

「治療」係指防治性治療或治療性治療或診斷性治療。在某些實施例中，「治療」係指出於治療、預防或診斷目的而向個體投與化合物或組合物。

「預防性」治療為出於降低產生病變之風險的目的，向未展現疾病的病徵或僅展現疾病的早期病徵的個體投與治療。本揭示案之化合物或組合物可作為預防性治療提供以減少產生病變之可能性或最小化病變（若產生）之嚴重程度。

「治療性」治療為出於減輕或消除病變之病徵或症狀的目的，向展現彼等病徵或症狀之個體投與治療。病徵或症狀可為生物化學、細胞、組織學、功能或物理、主觀或客觀的。本揭示案之化合物亦可作為治療性治療給出或針對診斷提供。

「診斷」意謂鑑別病理學病狀之存在、程度及/或性質。診斷方法在其特異性及選擇性方面不同。儘管特定診斷方法可能不提供病狀之確定診斷，但若該方法提供輔助診斷之正向指示，則其為足夠的。

「骨相關或軟骨相關的生物標記」或「骨相關或軟骨相關的標記」係指含量與例如軟骨轉換、軟骨形成、軟骨生長、骨再吸收、骨形成、骨生長或其組合相關聯而增加或減少的生長因子、酶、蛋白質或其他可偵測的生物物質或部分。此類生物標記可在投與如本文所描述之CNP變異體之前、期間及/或之後量測。例示性骨相關或軟骨相關的生物標記包含（但不限於）CNP、cGMP、II型膠原蛋白及其片段之前肽、II型膠原蛋白及其片段、I型膠原蛋白及其片段之前肽、I型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原（PCNA）、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素、膠原蛋白X及鹼性磷酸酶。可量測任何適當生物樣品中之軟骨相關及骨相關的生物標記，包含（但不限於）組織、血液、血清、血漿、腦脊髓液、滑液及尿液。在一些實施例中，在來自進行活體內功效/藥效學研究之動物及/或來自離體研究之經調節之培養基的血液、血漿或血清中量測生物標記。

「醫藥組合物」或「調配物」係指適用於個體動物（包含人類及哺乳動物）中之醫藥用途的組合物。醫藥組合物包括治療有效量之CNP變異體、視情況存在之另一生物活性劑以及視情況存在之醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一實施例中，醫藥組合物涵蓋包括一或多種活性成分及構成載劑之一或多種惰性成分的組合物，以及直接或間接由任何兩種或更多種成分之組合、複合或聚集或由一或多種以上成分的解離或由一或多種成分的其他類型之反應或相互作用而產生的任何產物。因此，本揭示案之醫藥組合物涵蓋藉由將本揭示案之化合物與醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑摻和製得之任何組合物。

「醫藥學上可接受之載劑」係指標準醫藥學載劑、緩衝劑及其類似者中之任一者，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、5%右旋糖水溶液及乳液（例如油/水或水/油乳液）。賦形劑之非限制性實例包含佐劑、黏合劑、填充劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、助滑劑、甜味劑、調味劑及著色劑。適合的醫藥學載劑、賦形劑及稀釋劑描述於《雷明頓氏醫藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》, 第19版（馬克出版公司（Mack Publishing Co.）, Easton, 1995）中。較佳醫藥學載劑視活性劑之預期投與模式而定。典型投與模式包含經腸（例如，經口）或非經腸（例如，皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內注射；或局部、經皮或經黏膜投與）。

「醫藥學上可接受之鹽」為可調配成用於醫藥學用途之化合物的鹽，包含（但不限於）金屬鹽（例如鈉、鉀、鎂、鈣等）以及氨或有機胺之鹽。

「醫藥學上可接受的」或「藥理學上可接受的」意謂不為生物學上或以其他方式非所要之物質，亦即可在不導致任何非所要生物效應之情況下或在不以有害方式與含有其之組合物之任何組分或與存在於個體身體之上或之中之任何組分相互作用的情況下向個體投與之物質。

「生理條件」係指動物（例如人類）體內之條件。生理條件包含（但不限於）體溫以及具有生理離子強度、pH及酶之水性環境。生理條件亦涵蓋特定個體體內與大部分個體中存在之「正常」條件不同之條件，例如與大致37℃之正常人體體溫不同或與大致7.4的正常人類血液pH不同。

「生理pH」或「生理範圍內之pH」意謂大致7.0至8.0（包含端點）範圍內，更典型地在大致7.2至7.6（包含端點）範圍內之pH。

如本文所用，術語「個體」涵蓋哺乳動物及非哺乳動物。哺乳動物之實例包含（但不限於）哺乳動物類之任何成員：人類、非人類靈長類動物，諸如黑猩猩以及其他猿及猴物種；農畜，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔子、狗及貓；實驗室動物，包含嚙齒動物，諸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及類似動物。非哺乳動物之實例包含（但不限於）鳥類、魚及類似動物。術語並不指示特定年齡或性別。在各種實施例中，個體為人類。在各種實施例中，個體為兒童或青少年。在各種實施例中，個體為嬰兒。在各種實施例中，個體年齡大於3個月、大於2個月、大於1個月或大於6個月。C 型利尿鈉肽變異體

C型利尿鈉肽（CNP）（《生物化學與生物物理研究交流》, 168: 863-870（1990）（Genbank寄存編號NP_077720，對於CNP前驅蛋白NPPC）（《高血壓雜誌》, 10: 907-912（1992））為具有17個胺基酸之環結構之肽家族（ANP、BNP、CNP）中之小單鏈肽（Levin等人, 《新英格蘭醫學雜誌》, 339: 863-870（1998））且在多種生物過程中具有重要角色。CNP與利尿鈉肽受體-B（NPR-B、GC-B）相互作用以刺激產生環鳥苷單磷酸（cGMP）（《高血壓雜誌》 10: 1111-1114（1992））。CNP更廣泛表現包含於中樞神經系統、生殖道、骨及血管內皮中（《高血壓》, 49: 419-426（2007））。

先前已描述天然CNP基因及多肽。美國專利第5,352,770號揭示自豬腦分離及純化的序列與人類CNP相同之CNP-22以及其治療心臟血管適應症之用途。美國專利第6,034,231號揭示前-原CNP（126個胺基酸）之人類基因及多肽以及人類CNP-53基因及多肽。成熟CNP為22個胺基酸之肽（CNP-22）。某些CNP變異體揭示於美國專利8,198,242中，其以引用之方式併入本文中。

在各種實施例中，本揭示案之CNP包含範圍介於人類CNP-17（hCNP-17）至人類CNP-53（hCNP-53）且具有源自hCNP-53之野生型胺基酸序列的截短CNP。此類截短CNP肽包含： DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC （CNP-53）（SEQ ID NO: 56）； LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC （CNP-52）（SEQ ID NO: 15）； RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC （CNP-51）（SEQ ID NO: 16）； VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-50）（SEQ ID NO: 17）； DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-49）（SEQ ID NO: 18） TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-48）（SEQ ID NO: 19）； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-47）（SEQ ID NO: 20）； SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-46）（SEQ ID NO: 21）； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-45）（SEQ ID NO: 22）； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-44）（SEQ ID NO: 23）； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-43）（SEQ ID NO: 24）； WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-42）（SEQ ID NO: 25）； ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-41）（SEQ ID NO: 26）； RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-40）（SEQ ID NO: 27）； LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-39）（SEQ ID NO: 28）； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-36）（SEQ ID NO: 29）； HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-35）（SEQ ID NO: 30）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）； NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-33）（SEQ ID NO: 31）； ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-32）（SEQ ID NO: 32）； RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-31）（SEQ ID NO: 33）； KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-30）（SEQ ID NO: 34）； YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-29）（SEQ ID NO: 35）； KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-28）（SEQ ID NO: 36）； GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-27）（SEQ ID NO: 37）； ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-26）（SEQ ID NO: 38）； NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-25）（SEQ ID NO: 39）； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-24）（SEQ ID NO: 40）； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-23）（SEQ ID NO: 41）； GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-22）（SEQ ID NO: 68）； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-21）（SEQ ID NO: 42）； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-20）（SEQ ID NO: 43）； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-19）（SEQ ID NO: 44）； GCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-18）（SEQ ID NO: 45）；及 CFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-17）（SEQ ID NO: 67）。

在各種實施例中，CNP變異肽為經修飾之CNP-37或CNP-38肽，視情況具有弗林蛋白酶裂解位點（加底線）處之一或多個突變/一或多個取代及/或含有N端處之甘胺酸或脯胺酸-甘胺酸。例示性CNP-37變異體包含（但不限於）： QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37（M32N）；SEQ ID NO: 46]； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP-37；SEQ ID NO: 47）； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP-37；SEQ ID NO: 48）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37（M32N）；SEQ ID NO: 49]； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1）； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 50）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37: SEQ ID NO:51）G QEHPNARKYKGANPK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO:52）；G QEHPNARKYKGANQK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO:53）；G QEHPNARKYKGANQQ GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO:54）；及G QEHPNARKYKGANKP GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO:55）；

在各種實施例中，本揭示案之CNP變異體包含PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 1）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 6）；PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）；PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC （SEQ ID NO: 7）； PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO:5）；及 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 1）。

經進一步考慮本文所描述之具有少於53個胺基酸之任何變異體可藉由向肽之N-末端添加胺基酸來延伸。舉例而言，若與wt CNP相比，CNP變異體為具有經改變之胺基酸的34-聚體、35-聚體、36-聚體、37-聚體、38-聚體或39-聚體，則此類變異體可在具有野生型或來自CNP53或來自其他肽之經修飾殘基的N-末端上延伸。

在各種實施例中，CNP變異體進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基位於N端、C端上或連接至內部胺基酸側基。在各種實施例中，乙醯基位於肽之N端上。

在各種實施例中，肽變異體於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。

在各種實施例中，CNP變異體係選自由以下組成之群組： Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）， Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 9）、 Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 10）， Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 11）及 Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 12）。

在各種實施例中，CNP變異體係選自由以下組成之群組： PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）， PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 9）， PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 10）， PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 11）及 PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 12） PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 7）。

在各種實施例中，CNP變異體係選自由以下組成之群組： Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）， Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 9）， Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 10）， Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 11）， Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 12）； Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 13）；以及 Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 14）。

在各種實施例中，CNP變異體係選自由Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）組成之群組。在各種實施例中，CNP變異體為Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 1）。在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 1）。

在額外實施例中，對於具有一或多個天冬醯胺（Asn/N）殘基及/或一或多個麩醯胺酸（Gln/Q）殘基的本文所描述之CNP變異體中之任一者，不論其是否具有野生型序列或非天然胺基酸序列，任何一或多個Asn殘基及/或任何一或多個Gln殘基可獨立地經任何其他天然或非天然胺基酸取代，包含保守取代，諸如Asn至Gln。一或多個此類取代部分地經設計以最小化或避免天冬醯胺及/或麩醯胺酸之任何潛在脫醯胺作用。

在額外實施例中，對於具有一或多個離胺酸（Lys/K）殘基的本文所描述之CNP變異體中之任一者，無論其是否具有野生型序列或非天然胺基酸序列，任何一或多個Lys殘基可獨立地經任何其他天然或非天然胺基酸取代，包含諸如Lys至Arg之取代。在各種實施例中，除了CNP變異體環狀域中之Lys殘基未經任何其他天然或非天然胺基酸取代以外，所有離胺酸殘基獨立地經任何其他天然或非天然胺基酸取代，包含諸如Lys至Arg之取代。

在一個實施例中，CNP變異體經由在Cys⁶ 與Cys²² 之間形成雙硫鍵而環化，如wtCNP22肽中所指示。Cys⁶ 可為半胱胺酸類似物，諸如高半胱胺酸或青黴胺。在另一實施例中，CNP變異體可藉由形成頭對尾、側鏈對側鏈、側鏈對頭或側鏈對尾之共價鍵而環化。在一實施例中，共價鍵形成於在N端處或朝向N端的胺基酸與在肽之C端處或朝向肽之C端的胺基酸（在此情形下稱為「末端」胺基酸）之間。在另一實施例中，共價鍵形成於兩個末端胺基酸之側鏈之間。在另一實施例中，共價鍵形成於一個末端胺基酸之側鏈與另一末端胺基酸之端基之間，或兩個末端胺基酸之端基之間。

末端胺與末端羧基之頭對尾環化可使用多種方法進行，例如使用對硝苯基酯、2,4,5-三氯苯基酯、五氟苯基酯、疊氮方法、混合酸酐方法、HATU、碳化二亞胺（例如DIC、EDC或DCC）與諸如HOBt、HONSu或HOAt之催化劑或樹脂上環化。

另外，環狀結構可經由涉及CNP變異體之胺基酸殘基及/或末端胺基酸殘基之側鏈的橋基形成。橋基為使得肽之兩個部分環化之化學部分。橋基之非限制性實例包含醯胺、硫醚、硫酯、二硫化物、脲、胺基甲酸酯、磺醯胺及其類似者。本領域中已知多種用於併入具有此類橋基之單元的方法。舉例而言，內醯胺橋（亦即，環醯胺）可形成於N端胺基或側鏈上之胺基與C端羧酸或側鏈上之羧基之間，例如離胺酸或鳥胺酸之側鏈及麩胺酸或天冬胺酸之側鏈。硫酯可形成於C端羧基或側鏈上之羧基與半胱胺酸或半胱胺酸類似物之側鏈上之硫醇基之間。

可替代地，可藉由併入羊毛硫胺酸（硫-二丙胺酸）殘基以連接藉由硫醚鍵共價鍵結在一起之丙胺酸殘基來形成交聯。在另一方法中，交聯劑，諸如二羧酸（例如，辛二酸（suberic acid/octanedioic acid））可連接胺基酸側鏈之官能基，諸如游離胺基、羥基及硫醇基。

亦可使用酶催化之環化。舉例而言，已報導泰羅雪定（tyrocidine）合成酶之硫酯酶域可用於環化硫酯前驅體，枯草桿菌蛋白酶（subtilisin）突變可用於環化乙醇酸肽苯丙胺醯胺酯，且抗體接合酶16G3可用於環化對硝苯基酯。對於肽環化之綜述，參見Davies, J. 《肽科學（Peptide Sci.》, 9: 471-501（2003），其以全文引用之方式併入本文中。

在某些實施例中，最終產物具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或至少約99%之純度。肽共軛物

肽治療劑為有吸引力的生物治療劑，但通常由於在溶液中之低穩定性及短半衰期而為不利的（Tang等人, 《歐洲醫藥科學雜誌（Eur J Pharm Sci.）》 102:63-70, 2017）。藉由增強穩定性及/或延長半衰期來嘗試改良肽治療劑之功效，包含嘗試將親水性肽囊封至諸如脂質體或聚合物粒子之可生物降解粒子中。然而，由於此等肽之陽離子性質及其與帶負電聚合物之脂質體靜電相互作用之能力，此一直為困難的（Griesser等人, 《國際醫藥學雜誌（Int J Pharmaceutics）》 520:267-274, 2017）。肽共軛物之產生已成為用於能夠更好地將親水性聚合物囊封至微粒或脂質體中之一種方式（Lu等人, 《分子醫藥學（Mol. Pharmaceutics）》15:216-225, 2018）。

肽可為5至100個胺基酸之一串胺基酸。肽可具有帶正電胺基酸、帶負電胺基酸或兩者之混合物，使得肽能夠與帶電部分，例如具有與肽中之帶電物質相反之帶電物質的陽離子、陰離子或其組合相互作用。

經考慮肽與賦予增加之穩定性或半衰期之部分（例如共軛部分）錯合。在各種實施例中，共軛部分經由非共價鍵錯合或藉由共價鍵連接。該部分可經由靜電相互作用與肽非共價連接。可替代地，該部分可經由一或多個連接子部分與肽共價結合。連接子可為可裂解及不可裂解連接子。可裂解連接子可經由酶、親核/鹼性試劑、還原劑、光照射、親電/酸性試劑、有機金屬及金屬試劑或氧化試劑裂解。連接子亦可為自分解型連接子。例示性連接子包含（但不限於）：N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯（SPDP）、亞胺基硫雜環戊烷（IT）、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如鹽酸二亞胺代己二酸二甲酯）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）、β丙胺酸、4-胺基丁酸（GABA）、2-胺基乙氧基酸（AEA）、胺基乙氧基-2-乙氧基乙酸（AEEA）、5胺基戊酸（AVA）、6-胺基己酸（Abx）、鄰二醇可裂解連接子、三甲基鎖內酯化、對烷氧基苯基胺基甲酸酯、bicin、類肽或bicin型連接子以及如本文所描述之電子連接子。

在各種實施例中，連接子連接至CNP環狀域內之CNP變異體之殘基上或位於除該CNP環狀域之外的位點處。在各種實施例中，連接子連接至離胺酸殘基。在各種實施例中，連接子連接至CNP環狀域中之離胺酸殘基。

在各種實施例中，CNP變異體經由連接子連接至共軛部分。在各種實施例中，連接子經由共軛部分之親水性間隔基連接至共軛部分。

在各種實施例中，連接子為可水解連接子。

在各種實施例中，連接子為類肽或電子連接子。在各種實施例中，連接子為類肽連接子。在各種實施例中，連接子為電子連接子。在各種實施例中，連接子包括SO₂ 部分。例示性連接子說明於圖1中。經進一步考慮圖1中之連接子係藉由R基團上之取代，例如藉由_____來修飾。[若存在，請提供其他經考慮之修改 ]

在各種實施例中，與肽共軛之部分為合成聚合物，諸如聚乙二醇、連接子、脂質部分或脂肪酸或其組合。在各種實施例中，CNP變異體與脂肪酸、胺基酸、間隔基及連接子共軛。在各種實施例中，CNP變異體與脂肪酸、胺基酸、聚乙二醇間隔基或聚乙二醇衍生物間隔基及連接子共軛。在各種實施例中，CNP變異體與脂肪酸、胺基酸、間隔基及連接子共軛，其中間隔基包括經取代之C-6至C-20烷基鏈或任何胺基酸或兩者之組合，其中烷基鏈之碳原子可經O、NH、N(C-1至C-6烷基)或羰基中之一或多者置換。

在各種實施例中，CNP變異體與脂肪酸共軛。假設脂質技術增加CNP變異體之血清半衰期，允許較低頻率注射及/或經改良之經口遞送。在各種實施例中，脂肪酸為短鏈、中鏈、長鏈脂肪酸或二羧基脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為飽和或不飽和的。在各種實施例中，脂肪酸為C-6至C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為癸酸、十二酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十酸或其二酸。在各種實施例中，脂肪酸與離胺酸殘基共軛。

在各種實施例中，經考慮本文所描述之CNP變異體包括如本文所描述之共軛部分。經考慮共軛部分位於CNP環狀域之殘基上或在除CNP環狀域之外位點處。在各種實施例中，共軛部分位於離胺酸殘基上。在各種實施例中，共軛部分包括一或多個酸部分。在各種實施例中，酸部分為脂肪酸。

在各種實施例中，共軛部分包括與親水性間隔基連接之酸部分。在各種實施例中，親水性間隔基為經取代之C-6至C-20烷基鏈或任何胺基酸或兩者之組合，其中烷基鏈之碳原子可經O、NH、N(C-1至C-6烷基)或羰基中之一或多者置換。在各種實施例中，親水性間隔基為任何胺基酸。在各種實施例中，親水性間隔基為γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，親水性間隔基為經取代之C-6至C-20烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔基為經取代之C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔基為經取代之C-9至C-18烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔基為經取代之C-18烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔基為經取代C-9烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔基為一或多個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）基團。在各種實施例中，親水性間隔基為一或兩個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）基團。在各種實施例中，親水性間隔基為OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）。在各種實施例中，間隔基為OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）或γGlu。在各種實施例中，親水性間隔基為與一或多個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）基團連接之γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，親水性間隔基為與一或兩個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）基團（diEG）連接之γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，酸部分及親水性間隔基具有結構AEEA-AEEA-γGlu-C18DA。

在各種實施例中，CNP變異體具有以下結構： PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5），或

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）。在各種實施例中，CNP變異體具有結構PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK (AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC、Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 1），或PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 1）。在各種實施例中，CNP變異體包括上述肽之Asn至Glu變異體。

在各種實施例中，本揭示案涵蓋親水性或水溶性聚合物（例如氧化烷基鏈，其中碳原子可經一或多個氧原子置換，諸如聚乙二醇（PEG）或聚氧化乙烯（PEO）及其類似者）之用途。在各種實施例中，水溶性聚合物之類型（例如均聚物或共聚物；無規、交替或嵌段共聚物；直鏈或分支鏈；單分散或多分散）、鍵（例如可水解或穩定鍵，諸如醯胺、亞胺、縮醛胺、伸烷基或酯鍵）、共軛位點（例如在N端、內部及/或C端）及長度（例如約0.2、0.4或0.6 kDa至約2、5、10、25、50或100 kDa）可變化。如本領域中已知，親水性或水溶性聚合物可藉助於基於N-羥基丁二醯亞胺（NHS）或醛之化學物質或其他化學物質與CNP變異體共軛。在各種實施例中，帶負電PEG-CNP變異體可經設計用於降低腎清除率，包含（但不限於）使用羧化、硫酸化及磷酸化之化合物（Caliceti, 《先進藥物遞送評論（Adv. Drug Deliv.Rev.）》, 55: 1261-77（2003）；Perlman, 《臨床內分泌與代謝雜誌》, 88: 3227-35（2003）；Pitkin, 《抗菌劑與化療（Antimicrob. Ag. Chemo.）》, 29: 440-444（1986）；Vehaskari, 《國際腎臟雜誌（Kidney Int'l）》, 22: 127-135（1982））。在一個實施例中，PEG（或PEO）部分含有一或多個羧基、一或多個硫酸基及/或一或多個磷酸基。

在另一實施例中，與本文所描述之CNP變異體之N端、C端及/或一或多個內部位點共軛之親水性聚合物（例如，PEG或PEO）含有一或多個在生理條件下帶正電之官能基。此類部分尤其經設計以改良此類共軛之CNP變異體向軟骨組織中之分佈。在一個實施例中，PEG部分含有一或多個一級、二級或三級胺基、四級銨基及/或其他含胺（例如脲）基。製備方法

本文亦涵蓋製備包括CNP變異體且視情況包括如本文所描述之共軛部分之組合物的方法。

在各種實施例中，CNP變異體係使用標準蛋白質合成化學方法以合成方式製得。舉例而言，使用固相樹脂及標準Fmoc化學方法逐步合成肽。肽係使用三氟乙酸（TFA）自樹脂裂解且藉由逆相高效液相層析（RP-HPLC）純化。

在各種實施例中，該方法進一步包括藉由使樹脂與NMP/Ac2O/DIEA視情況以10:1:0.1，v/v/v反應而將肽乙醯化。

進一步提供一種方法，其中肽與視情況存在於離胺酸殘基上之共軛部分共軛。步驟包括使離胺酸上之保護性胺基裂解、使肽與2× Fmoc-胺基PEG(2)反應接著與胺基酸反應，接著使脂質或脂肪酸部分共軛。在各種實施例中，共軛部分包括一或多種脂質或脂肪酸及疏水性間隔基。

該方法進一步提供藉由與三氟乙酸接觸自樹脂裂解肽之步驟，及藉由逆相HPLC純化肽之步驟。

在某些實施例中，本文所描述之CNP變異體係藉由重組方法產生，該重組方法包括在引起由多核苷酸編碼之融合多肽之表現的條件下在培養基中培養宿主細胞，該宿主細胞包括編碼CNP變異體多肽之第一多核苷酸，視情況與編碼可裂解肽或蛋白質之第二多核苷酸連接。在一些實施例中，宿主細胞用包括編碼CNP變異體多肽之多核苷酸的表現載體轉型，該多核苷酸視情況與編碼可裂解肽或蛋白質之多核苷酸連接。在某些實施例中，融合多肽表現為可溶性蛋白質或包涵體。經表現之融合多肽可自宿主細胞或培養物分離，且經分離之融合多肽可與裂解劑接觸以釋放CNP變異體。

製備CNP變異肽之方法，包含使用宿主細胞、表現載體、可裂解肽以及培養物參數，揭示於美國專利8,198,242中，其特此以引用之方式併入。使用方法

軟骨發育不全為纖維母細胞生長因子受體3（FGFR-3）之基因中常染色體顯性突變之結果，此導致軟骨形成異常。FGFR-3對軟骨細胞生長通常具有負調節作用，且因此對骨生長具有負調節作用。在軟骨發育不全中，FGFR-3之突變形式為組成性活性的，其導致骨嚴重縮短。在人類中，FGFR-3之活化突變為遺傳性侏儒症的主要原因。具有活化FGFR-3之小鼠充當軟骨發育不全（骨骼發育不良之最常見形式）之模型，且CNP之過度表現拯救此等動物免遭侏儒症。因此，CNP之功能變異體為治療多種骨骼發育不良之潛在治療劑。

藉由刺激軟骨細胞之基質產生、增殖及分化以及增加長骨生長，本揭示案之CNP變異體適用於治療罹患骨相關病症（諸如骨骼發育不良）之哺乳動物，包含人類。CNP反應性骨相關病症及骨骼發育不良之非限制性實例包含軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性骨發育不良、成骨不全、軟骨成長不全、先天性成骨不全、純合性軟骨發育不全、先天性成骨不全、屈肢骨發育不良、先天性致死型低磷酸酯酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋多指症候群、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育不良、揚森型幹骺端發育不良、先天性脊椎骨骺發育不良、骨發育不全、扭曲性骨發育不良、先天性股骨短、蘭格型肢中骨發育不良、尼維格型肢中骨發育不良、羅氏症候群、萊因哈特症候群、肢端發育不全、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良、纖維軟骨生成、羅伯茨症候群、肢端肢中發育不良、小肢、莫奎氏症候群、克尼斯特症候群、後生營養發育不良及脊椎骨骺幹骺端發育不良。本文涵蓋之身材矮小、生長板病症、骨相關病症或骨骼發育不良包含與NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）及PTPN11突變（努南氏症候群）相關之病症。

藉由刺激軟骨細胞之基質產生、增殖及分化以及增加長骨生長，本揭示案之CNP變異體適用於治療罹患骨相關病症（諸如骨骼發育不良）之哺乳動物，包含人類。CNP反應性骨相關病症及骨骼發育不良之非限制性實例包含軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性骨發育不良、成骨不全、軟骨成長不全、先天性成骨不全、純合性軟骨發育不全、先天性成骨不全、屈肢骨發育不良、先天性致死型低磷酸酯酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋多指症候群、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育不良、揚森型幹骺端發育不良、先天性脊椎骨骺發育不良、骨發育不全、扭曲性骨發育不良、先天性股骨短、蘭格型肢中骨發育不良、尼維格型肢中骨發育不良、羅氏症候群、萊因哈特症候群、肢端發育不全、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良、纖維軟骨生成、羅伯茨症候群、肢端肢中發育不良、小肢、莫奎氏症候群、克尼斯特症候群、後生營養發育不良及脊椎骨骺幹骺端發育不良。本文涵蓋之身材矮小、生長板病症、骨相關病症或骨骼發育不良包含與NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）、PTPN11突變（努南氏症候群）以及IGF1R突變相關之病症。

方法涵蓋之額外身材矮小及生長板病症包含與膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3之突變相關之病症。

方法涵蓋之額外身材矮小及生長板病症包含與膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或IGF1R之突變相關之病症。

此外，CNP變異體適用作用於治療特發性身材矮小及其他骨骼發育不良之生長激素的佐劑或替代物。

生長板病症包含導致身材矮小或骨生長異常及可為涉及骨生長之基因中之基因突變之結果的病症，該基因包含膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3。在各種實施例中，生長板病症包含導致身材矮小或骨生長異常及可為涉及骨生長之基因中之基因突變之結果的病症，該基因包含膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或IGF1R。在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多個突變相關。在各種實施例中，患有生長板病症之個體對於生長板基因中之突變為異型接合的。在各種實施例中，突變為功能損失型突變。在各種實施例中，突變為功能獲得型突變。生長板病症包含但不限於家族性身材矮小、顯性家族性身材矮小（其亦稱為顯性遺傳性身材矮小）或特發性身材矮小。參見例如Plachy等人, 《臨床內分泌代謝雜誌（J Clin Endocrinol Metab）》 104: 4273-4281, 2019。

ACAN之突變可引起家族性剝脫性骨軟骨炎及身材矮小且最終引起骨關節炎，其特徵在於由軟骨及有時骨頭在關節處自骨末端脫離引起之骨損傷（或病變）區域。已提出骨生長中之軟骨網狀結構錯亂會損害其生長，導致身材矮小。與ACAN及身材矮小相關之突變包含Val2303Met。參見Stattin等人 《美國人類遺傳學雜誌（Am J Hum Genet）》 86(2):126-37, 2010。經考慮具有導致身材矮小之ACAN突變的患者將受益於CNP治療，因為投與可能夠藉由CNP與FGFR3之已知相互作用增加此等患者之身高。

已展示利尿鈉肽系統（包含受體NPR2）參與軟骨內化骨生長之調節（Vasques等人, 《兒科激素研究（Horm Res Pediat）》 82:222-229, 2014）。研究已展示NPR2中之同型接合或複合異型接合功能損失型突變引起肢端肢中發育不良型Maroteaux（AMDM），其為骨骼具有極其身材矮小之發育不良（Vasquez等人, 2014, 見上文）。有報導暗示異型接合功能損失型（諸如顯性負性）NPR2突變係身材矮小之原因，而功能獲得型NPR2異型接合突變已被認為係身材高大之原因（Vasquez等人, 2014, 見上文）。鑒於CNP與NPR2相互作用以刺激cGMP生成，增加cGMP含量在此等情況下為期望的，且將在管理來自此等疾病及病狀之併發症中具有治療益處。

咸信NPR2之異型接合突變導致特發性身材矮小及其他形式之身材矮小。NPR2基因之突變闡述於下文且描述於以下各者中：Amano等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》 99:E713-718, 2014；Hisado-Oliva等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》 100:E1133-1142, 2015及Vasques等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》 98:E1636-1644, 2013，特此以引用之方式併入。經考慮患有待用如本文所描述之CNP變異體治療之身材矮小的個體具有小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS，且具有至少一個具有小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5之身高SDS的親代，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療具有身高SDS為-2.0至-3.0之身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療具有身高SDS為-2.0至-2.5之身材矮小的個體。然而，由於NPR2中之新生突變可導致如由小於-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS所定義之身材矮小，因此亦涵蓋治療任一親代均不患有身材矮小的作為NPR2中之有害突變之異型接合攜帶者的個體。經進一步考慮用CNP治療對於其他生長板基因中之有害突變為異型接合之個體，以改善身材及/或增強骨生長。

可用CNP變異體治療之患者之例示性NPR2突變包含：

疾病	核苷酸	突變	胺基酸變化
身材矮小	1669C＞T	誤義	Arg557Cys
身材矮小	2794C＞T	誤義	Arg932Cys
身材矮小	2905G＞C	誤義	Val969Leu
身材矮小	3058C＞T	誤義	Arg1020Trp
身材矮小	2972A＞G	誤義	Glu991Gly
身材矮小	1262C＞T	誤義	Thr421Met
身材矮小	766G＞T	誤義	Asp256Tyr
身材矮小	1982C＞A	誤義	Thr661Lys
身材矮小	2449G＞A	誤義	Glu817Lys
身材矮小	1517G＞A	誤義	Arg506His
身材矮小	1802G＞C	誤義	Arg601Pro
身材矮小	1481T＞G	誤義	Ile494Ser
身材矮小	142G＞T	誤義	Ala48Ser
身材矮小	1167G＞T	誤義	Glu389Asp
身材矮小	1249C＞G	誤義	Gln417Glu
身材矮小	328C＞T	誤義	Arg110Cys
身材矮小	2455C＞T	誤義	Arg819Cys
身材矮小	788G＞C	誤義	Arg263Pro
身材矮小	226T＞C	誤義	Ser76Pro
身材矮小	2710A＞T	無義	Lys904Term

9:35809194:C:G	Leu1009Val
9:35802761:G:C	Leu615Phe
9:35799645:C:T	Pro301Ser
9:35792928:C:T	Arg174Cys
9:35801728:C:G	His508Asp
9:35792713:T:C	Val102Ala
9:35793980:T:A	Tyr250Ter
9:35807085:C:T	Thr861Ile
9:35793906:A:G	Ile226Val
9:35808558:G:A	Arg921Gln
9:35802741:G:A	Glu609Lys
9:35802594:G:A	Arg601His
9:35808663:T:A	Leu956Gln
9:35808545:G:C	Gly917Arg

NPPC在骨骼生長中之作用已得到充分證明（Hisado-Oliva等人，《遺傳學藥物（Genetics Medicine）》  20:91-97, 2018）。NPPC基因敲除小鼠展示嚴重不成比例形式之侏儒症，包含四肢縮短及軟骨內骨化（Hisado-Oliva等人, 2018, 見上文）。人類全基因體研究已展示NPPC與身高之間的關聯（Hisado-Oliva等人, 2018, 見上文）。儘管咸信CNP單倍劑量不足為人類身材矮小之原因，但近來的研究鑑別了身材矮小及雙手短小之家族中之異型接合突變（Hisado-Oliva等人, 2018, 見上文）。此等研究觀測到以異型接合狀態量測之cGMP產量顯著降低（Hisado-Oliva等人, 2018, 見上文）。NPPC之突變包含引起Gly119Cys改變之355G＞T誤義突變及引起Arg117Gly改變之349C＞G誤義突變。拯救CGMP產生之CNP變異體可在具有異型接合功能損失型NPPC突變之患者的病症管理中提供治療益處。

萊里-維爾軟骨骨生成障礙（Leri-Weill dyschondrosteosis；LWD）為稀有遺傳病症，其特徵在於前臂及小腿縮短、手腕異常錯位（手腕馬得隆變形（Madelung deformity））及相關的身材矮小。LWD係由位於性染色體之假常染色體區域1（pseudoautosomal region 1；PAR1）上之含身材矮小同源盒（SHOX）基因或其調節元件中之異型接合突變引起。（參見稀有疾病資料庫及Carmona等人, 《人類分子遺傳學（Hum Mol Genet）》 20:1547-1559, 2011）。病症蘭格肢中骨發育不良在存在兩個SHOX突變時產生，且可由各染色體上之突變（同型接合或複合異型接合突變）產生。SHOX突變之子集引起特發性身材矮小。特納氏症候群由於可包含SHOX基因之X染色體上之缺失而產生。SHOX已鑑別為參與FGFR3轉錄調節且有助於骨生長控制（Marchini等人, 《內分泌綜述（Endocr Rev.）》 37: 417-448, 2016）。SHOX缺乏導致FGFR3信號傳導增加，且一些證據支持SHOX亦與CNP/NPR2直接相互作用（Marchini, 見上文）。鑒於SHOX與FGFR3及骨生長之關聯，經考慮具有同型接合或異型接合SHOX突變之個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療。

拉索病為由Ras/促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase；MAPK）路徑基因中之突變引起的一組罕見遺傳病狀。拉索病為特徵在於經由RAS/MAPK路徑之信號傳導增加的一組病症。此路徑導致RAF/MEK/ERK路徑之下游活化。身材矮小為某些拉索病之典型特徵。舉例而言，CNP信號傳導抑制RAF且使得MEK及ERK活化降低。

本文涵蓋拉索病之治療。與身材矮小相關之拉索病包含努南氏症候群、科斯特洛症候群、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤及LEOPARD症候群。遺傳性1型齒齦纖維瘤病亦為本文所涵蓋之拉索病。拉索病患者（包含努南氏症候群、科斯特洛症候群、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤、LEOPARD症候群、遺傳性1型齒齦纖維瘤病）包含具有以下基因中之一或多者中之異型接合變異體的患者：BRAF、CBL、HRAS、KRAS、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MRAS、NF1、NRAS、PPP1CB、PTPN11、RAF1、RRAS、RIT1、SHOC2、SOS1或SOS2（Tajan等人 《內分泌綜述》 2018;39(5):676-700）。

CFC係由Ras/MAPK信號傳導路徑中之若干基因之突變引起，包含K-Ras、B-Raf、Mek1及Mek2。科斯特洛症候群（亦稱為顏面皮膚骨骼（FCS）症候群）係由H-Ras基因中之活化突變引起。遺傳性I型齒齦纖維瘤病（HGF）係由Sevenless同源物1之子代（Son of Sevenless homolog 1；SOS1）基因中之顯性突變引起，該基因編碼作用於小GTP酶之Ras子族的鳥嘌呤核苷酸交換因子（SOS）。I型神經纖維瘤（NF1）係由神經纖維瘤蛋白1基因中之突變引起，該基因編碼Ras/MAPK信號傳導路徑之負調節因子。努南氏症候群（NS）係由若干基因中之一者之突變引起，該等基因包含PTPN11（其編碼SHP2）及SOS1，以及K-Ras及Raf-1。

CNP已證明為拉索病模型中之有效療法。Ono等人產生在II型膠原蛋白生產細胞中缺乏Nf1之小鼠（Ono等人, 《人類分子遺傳學（Hum. Mol. Genet.）》2013;22(15):3048-62）。此等小鼠展現組成性ERK1/2活化，及軟骨細胞增殖減少，及成熟。向此等小鼠每日注射CNP使得ERK磷酸化降低且校正了身材矮小。使用Braf突變（p.Q241R）之心臉皮膚症候群之小鼠模型（Inoue等人 《人類分子遺傳學》2019;28(1):74-83）展現相比於野生型減小之體長及減小之生長板寬度與較小的增殖及肥大區域，且投與CNP使得此等動物之體長增加。

多個基因之突變可引起努南氏症候群，其特徵在於身材矮小、心臟缺陷、出血問題及骨骼畸形。PTPN11基因之突變引起努南氏症候群之所有病例之約一半。SOS1基因突變引起額外10%至15%病例，且RAF1及RIT1基因各自占病例之約5%。其他基因之突變各自占少數病例。15%至20%患有此病症之人群的病因為未知的。

PTPN11、SOS1、RAF1及RIT1基因均編碼在RAS/MAPK細胞信號傳導路徑中重要之蛋白質，該路徑對於細胞分裂及生長（增殖）、分化及細胞遷移係必需的。與努南氏症候群相關之基因中之許多突變使所得蛋白質被打開（活化），且此長時間活化改變正常RAS/MAPK信號傳導，其破壞細胞生長及分裂調節，從而導致努南氏症候群之典型特徵。參見例如Chen等人, 《美國國家科學院院刊（Proc Natl Acad Sci U S A.）》111(31):11473-8, 2014，Romano等人, 《嬰兒病學（Pediatrics.）》126(4):746-59, 2010，及Milosavljević等人, 《美國醫學遺傳學雜誌（Am J Med Genet）》 170(7):1874-80, 2016。經考慮具有活化MAPK路徑之突變的個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療，以改善骨生長及身材矮小。亦經考慮具有活化MAPK路徑之突變的個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療，以改善與整個身體之其他細胞（其中NPR2受體表現於其表面上）中之過度活化MAPK路徑相關的其他共患病。

PTPN11基因（其編碼非受體蛋白酪胺酸磷酸酶SHP-2）之突變導致特徵在於身材矮小之病症，諸如努南氏症候群（Musente等人, 《歐洲人類遺傳學雜誌（Eur J Hum Genet）》 11:201-206（2003）。Musente（見上文）鑑別PTPN11基因中導致身材矮小之許多突變。功能獲得型突變經由SHP2之過度活化信號傳導且抑制生長激素誘導之IGF-1釋放，從而使得骨生長降低（Rocca Serra-Nédélec, 《美國國家科學院院刊（PNAS）》 109:4257-4262, 2012）。經考慮具有同型接合或異型接合PTPN11突變之個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療，以改善骨生長及身材矮小。

印度刺蝟因子（IHH）基因（其與軟骨內骨化之調節有關）之突變亦與身材矮小症候群相關（Vasques等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》103:604-614, 2018）。許多經鑑別之IHH突變以顯性遺傳模式與身材矮小分隔。鑒於IHH與骨生長及骨化之關聯，經考慮具有同型接合或異型接合IHH突變之個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療。

FGFR3之突變，包含N540K及K650N導致身材矮小及軟骨生成減退。

胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）為具有內在激酶活性之雜四聚體（α2β2）跨膜醣蛋白。已展示IGF1R在產前及產後生長中起作用。已在小於胎齡兒（gestational age children；SGA）及患有家族性身材矮小之個體中鑑別IGF1R之異型接合突變（Kawashima等人, 《內分泌雜誌（Endocrine J.）》59:179-185, 2012）。與身材矮小相關之IGF1R突變包含R108Q/K115N、R59T、R709Q、G1050K、R481Q、V599E及G1125A（Kawashima，見上文）。

身高為可受數百個或數千個基因之組合效應影響的高度遺傳性性狀（Wood等人, 2014, 《自然遺傳學》, 46:1173-1189）。個體之身材矮小可為此等基因之組合效應的結果，單一基因並非主要貢獻者。鑒於CNP增加正常動物之長度，例如增強骨生長及骨長度之能力，經考慮患有由小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS定義之身材矮小的此類個體可有益地用CNP變異體治療。

在各種實施例中，CNP變異體適用於治療具有如下之身材矮小的個體：身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0，且至少一個親代之身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療具有身高SDS為-2.0至-3.0之身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療具有身高SDS為-2.0至-2.5之身材矮小的個體。在各種實施例中，身材矮小與相關於身材矮小之基因中之一或多個突變相關，諸如膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰島素生長因子1受體（IGF1R）或其組合。

在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多個突變相關。

在各種實施例中，身材矮小為如藉由多基因風險評分（PRS）所確定之多個基因之突變的結果。使用針對身高之公佈的最大GWAS綜合分析計算身高之多基因風險評分（PRS），該綜合分析不包含來自如實例4中所描述之UK生物庫項目之任何樣品。將群組分為五個PRS五分位數（PRS 1為最矮身高，PRS 5為最高身高）。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有IGF1R之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPPC之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有SHOX之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX中之一或多者之一或多個突變及低PRS。在各種實施例中，PRS為1或2。在各種實施例中，PRS為1。在各種實施例中，PRS為2。

另外，CNP變異體適用於治療其他骨相關病狀及病症，諸如佝僂病、低磷酸鹽血性佝僂病[包含X連鎖低磷酸鹽血性佝僂病（亦稱為維生素D耐藥性佝僂病）及常染色體顯性低磷酸鹽血性佝僂病]，及骨質軟化[包含腫瘤誘導之骨質軟化（亦稱為致癌骨質軟化或致癌低磷酸鹽血性骨質軟化）]。

本揭示案之CNP變異體亦可用於治療骨關節炎。骨關節炎為關節軟骨之退化疾病且在老年人中頻繁發生。骨關節炎涉及軟骨破壞及由關節組分退化引起的骨及軟骨之增殖性變化，其中該變化導致繼發性關節炎（例如滑膜炎）。在骨關節炎中，細胞外基質蛋白（其為軟骨之功能實體）減少，且骨關節炎中之軟骨細胞數目減少（《風濕性關節炎（Arth.Rheum.）》46(8): 1986-1996（2002））。藉由促進軟骨細胞之基質產生、生長及分化，CNP組合物適用於抵消FGF-2之非所要效應，且增加罹患關節炎（包含骨關節炎）之個體的基質合成，由此治療關節炎，包含骨關節炎。

在某些實施例中，本揭示案之CNP變異體及包括其之組合物及調配物適用於改善骨骼發育不良之一或多種症狀或生理學後果，其中該改善可為絕對生長增加、生長速度增加、定性電腦斷層攝影（qualitative computed tomography；QCT）骨礦物質密度增加、生長板形態改善、長骨生長增加、脊柱形態改善、肘關節活動範圍改善及/或睡眠呼吸暫停減少。就此而言，應注意術語「經改善（improved）」、「改善（improvement）」、「增加」、「降低」及其文法等效術語當相對於疾病病況之症狀或生理學後果使用時均為相對術語，係指用本發明之CNP變異體（或包括其之組合物或調配物）治療後疾病之症狀或生理學後果相較於用本發明之CNP變異體（或包括其之組合物或調配物）治療之前的疾病之相同症狀或生理學後果（即相較於「基線」）的狀態。如上文所描述，「基線」狀態可經由治療之前的個體狀態之量測（其可隨後與治療後之同一個體的狀態相比），或經由罹患共用相同或類似特徵（例如年齡、性別及/或疾病病況或進展）之相同病痛之個體群體的狀態之量測確定。

亦提供一種克服由組成性活性突變型纖維母細胞生長因子受體3（FGFR-3）誘導之細胞生長遏制之方法，其包括使表現組成性活性FGFR-3之細胞與如本文所描述之CNP變異體或組合物接觸。

進一步提供一種刺激表現利尿鈉肽受體B（NPR-B）之細胞中的cGMP產生之方法，其包括使表現NPR-B之細胞與如本文所描述之CNP變異體或組合物接觸。

在又另一實施例中，本揭示案提供CNP變異體，其在活體外或活體內刺激產生在相同wtCNP22濃度（例如1 μM）下產生之cGMP含量的至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。在再另一實施例中，本揭示案之CNP變異體在活體外或活體內刺激產生在相同wtCNP22濃度（例如，1 μM）下產生之cGMP含量的至少約50%、60%、70%、80%、90%、、100%、110%、120%、130%、140%或150%。

經考慮本文所描述之CNP變異體中之任一者適用於該等方法中。

在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 1）。在各種實施例中，肽進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基位於肽之N端上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。在各種實施例中，變異體包括一或多個如本文所描述之連接子基團。在各種實施例中，連接子為可水解連接子。

藉由各種參數來量測治療功效。在各種實施例中，功效評估為自基線期至干預期按年計算之生長速度的變化。功效亦將評估為如使用CDC生長曲線所量測之自基線至治療結束之身高SDS變化，且生長速度SDS將基於兒童研究中之骨礦物質密度（Kelly等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》2014;99(6):2104-2112）。

按指導評估QoLISSY，身材矮小青年之生活品質（身材矮小青年之生活品質 -QoLISSY 調查表使用者手冊 （Quality of Life in Short Stature Youth - The QoLISSY Questionnaire User ' s Manual. ）Lengerich: Pabst科學出版社（Pabst Science Publishers）; 2013）。醫藥組合物

本揭示案提供醫藥組合物，包含緩釋組合物，其包括本文所描述之CNP變異體，及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑及/或稀釋劑。在某些實施例中，組合物進一步包括一或多種其他生物活性劑（例如蛋白酶、受體酪胺酸激酶及/或清除受體NPR-C之抑制劑）。

本揭示案提供包括如本文所描述之共軛部分之緩釋組合物。緩釋組合物包含在投藥後延遲遞送藥物（延遲釋放劑量）或持續延長時段遞送藥物（延釋劑量）之彼等組合物。本文所提供之CNP肽共軛物之各種實施例包含緩釋組合物，諸如延釋、持續或受控釋放，及延遲釋放。術語「延釋組合物」係指以便於製備在投與後之延長時段內可用的活性成分/藥物之方式調配之組合物（美國藥典（US Pharmacopeia））。延釋劑量包含持續釋放（SR）或受控釋放（CR）形式。持續釋放經持續時段維持藥物釋放，但未必以恆定速率，而CR經持續時段以幾乎恆定速率維持藥物釋放（《製藥學：藥物遞送及靶向（Pharmaceutics: Drug Delivery and Targeting）》, Yvonne Perrie, Thomas Rades, 醫藥出版社（Pharmaceutical Press）, 2009）。延遲釋放組合物或產物經修改以在初次投與之後的一定時段內延遲藥物物質之釋放。

在各種實施例中，緩釋組合物為延釋組合物。

在各種實施例中，對於延釋組合物，在pH 7至7.6下，（i）第1天釋放小於約20%之肽；及（ii）每週釋放約90%之肽，或每兩週釋放約90%之肽，或每月釋放約90%之肽。

在各種實施例中，在pH 7至7.6下，第1天釋放小於約20%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，第1天釋放小於約10%之肽。經進一步考慮（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約30%、或約40%、或約50%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽，或每兩週釋放約90%之肽，或每月釋放約90%之肽。經進一步考慮（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約30%、或約40%、或約50%、或約60%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約80%或約90%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每兩週釋放約90%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每月釋放約90%之肽。經進一步考慮該釋放可在pH 7.0至7.6、pH 7.1至7.5、pH 7.2至7.4、pH 7.2至7.6或pH 7.0至7.4之pH下。

在各種實施例中，（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%或約75%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽、或每兩週釋放約90%之肽、或每月釋放約90%之肽。經進一步考慮（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%或約75%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約80%或約90%之肽；或可替代地ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽。

在各種實施例中，組合物包括賦形劑、稀釋劑或載劑。在各種實施例中，延釋組合物包括賦形劑、稀釋劑或載劑。在各種實施例中，賦形劑、稀釋劑或載劑為醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

賦形劑、載劑及稀釋劑之非限制性實例包含媒劑、液體、緩衝劑、等張劑、添加劑、穩定劑、防腐劑、增溶劑、界面活性劑、乳化劑、潤濕劑、佐劑等。組合物可含有液體（例如水、乙醇）；多種緩衝液內容物（例如Tris-HCl、磷酸鹽、乙酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液）之稀釋劑、pH及離子強度；清潔劑及增溶劑（例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80）；抗氧化劑（例如甲硫胺酸、抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉）；防腐劑（例如硫柳汞（Thimerosol）、苯甲醇、間甲酚）；以及膨化物質（例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖）。在醫藥組合物之調配中使用之賦形劑、稀釋劑及載劑為本領域中已知的；參見例如《雷明頓氏藥物科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》, 第18版, 第1435-1712頁, 馬克出版公司（Mack Publishing Co.）（Easton, Pennsylvania（1990）），其以全文引用之方式併入本文中。

舉例而言，載劑包含（但不限於）稀釋劑、媒劑及佐劑，以及植入物載劑，及惰性、無毒固體或液體填充劑及囊封材料，其不與一或多種活性成分反應。載劑之非限制性實例包含磷酸鹽緩衝鹽水、生理鹽水、水以及乳液（例如油/水乳液）。載劑可為含有例如乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似者）、植物油及其混合物之溶劑或分散介質。

在一些實施例中，組合物為液體調配物。在某些實施例中，調配物包括濃度在約0.1 mg/ml至約20 mg/ml、或約0.5 mg/ml至約20 mg/ml、或約1 mg/ml至約20 mg/ml、或約0.1 mg/ml至約10 mg/ml、或約0.5 mg/ml至約10 mg/ml、或約0.5至5 mg/ml、或約0.5至3 mg/ml、或約1 mg/ml至約10 mg/ml範圍內之CNP變異體。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為0.8 mg/mL至2 mg/mL。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為0.8 mg/mL。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為2.0 mg/mL。在各種實施例中，CNP變異體係由凍乾粉復原。

在其他實施例中，組合物包括緩衝溶液或緩衝劑以將含有CNP之溶液或懸浮液之pH維持在所要範圍內。緩衝溶液之非限制性實例包含磷酸鹽緩衝鹽水、Tris緩衝鹽水及漢克氏緩衝鹽水（Hank's buffered saline）。緩衝劑包含（但不限於）乙酸鈉、磷酸鈉及檸檬酸鈉。亦可使用緩衝劑之混合物。在某些實施例中，緩衝劑為乙酸/乙酸鹽或檸檬酸/檸檬酸鹽。組合物中適合的緩衝劑之量部分取決於所使用之特定緩衝劑以及溶液或懸浮液之所要pH。在一些實施例中，緩衝劑之濃度為約10 mM±5 mM。在某些實施例中，組合物之pH為約pH 3至約pH 9、或約pH 3至約pH 7.5、或約pH 3.5至約pH 7、或約pH 3.5至約pH 6.5、或約pH 4至約pH 6、或約pH 4至約pH 5，或為約pH 5.0±1.0。在各種實施例中，pH為約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在各種實施例中，pH為5.5。

在其他實施例中，組合物含有等張調節劑以使溶液或懸浮液等張且與投與更相容。等張劑之非限制性實例包含NaCl、右旋糖、葡萄糖、甘油、山梨糖醇、木糖醇及乙醇。在某些實施例中，等張劑為NaCl。在某些實施例中，NaCl之濃度為約160±20 mM、或約140 mM±20 mM、或約120±20 mM、或約100 mM±20 mM、或約80 mM±20 mM、或約60 mM±20 mM。

在又其他實施例中，組合物包括防腐劑。防腐劑包含（但不限於）間甲酚及苯甲醇。在某些實施例中，防腐劑之濃度為約0.4%±0.2%、或約1%±0.5%、或約1.5%±0.5%、或約2.0%±0.5%。

在再其他實施例中，組合物含有抗吸附劑（例如，用以減少CNP變異體吸附至玻璃或塑膠）。抗吸附劑包含（但不限於）苯甲醇、聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。在某些實施例中，抗吸附劑之濃度為約0.001%至約0.5%、或約0.01%至約0.5%、或約0.1%至約1%、或約0.5%至約1%、或約0.5%至約1.5%、或約0.5%至約2%、或約1%至約2%。

在其他實施例中，組合物包括穩定劑。穩定劑之非限制性實例包含甘油、丙三醇、硫甘油、甲硫胺酸以及抗壞血酸及其鹽。在一些實施例中，當穩定劑為硫甘油或抗壞血酸或其鹽時，穩定劑濃度為約0.1%至約1%。在其他實施例中，當穩定劑為甲硫胺酸時，穩定劑之濃度為約0.01%至約0.5%、或約0.01%至約0.2%。在再其他實施例中，當穩定劑為甘油時，穩定劑之濃度為約5%至約100%（純）。

在其他實施例中，組合物含有抗氧化劑。例示性抗氧化劑包含（但不限於）甲硫胺酸及抗壞血酸。在某些實施例中，抗氧化劑與CNP之莫耳比為約0.1:1至約15:1、或約1:1至約15:1、或約0.5:1至約10:1、或約1:1至約10:1或約3:1至約10:1。

醫藥學上可接受之鹽可用於組合物中，包含（但不限於）無機酸鹽（例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽）、有機酸鹽（例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽）及胺（例如異丙胺、三甲胺、二環己胺、二乙醇胺）鹽。醫藥學上可接受之鹽之充分論述見於《雷明頓氏醫藥科學》, 第18版, 馬克出版公司,（Easton, Pennsylvania（1990））中。

醫藥組合物可以各種形式投與，諸如錠劑、膠囊、顆粒、散劑、溶液、懸浮液、乳液、軟膏及經皮貼片。組合物之劑型可調適為組合物之所要投與模式。對於經口投與，組合物可採取例如錠劑或膠囊（包含軟凝膠膠囊）之形式，或可為例如水性或非水性溶液、懸浮液或糖漿。用於經口投與之錠劑及膠囊可包含一或多種常用賦形劑、稀釋劑及載劑，諸如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、澱粉、玉米澱粉、糖精鈉、滑石、纖維素、碳酸鎂及潤滑劑（例如硬脂酸鎂、硬脂醯反丁烯二酸鈉）。必要時，可將調味劑、著色劑及/或甜味劑添加至固體及液體調配物。用於口服調配物之其他視情況存在之成分包含（但不限於）防腐劑、懸浮劑及增稠劑。口服調配物亦可具有腸溶衣以保護CNP變異體免受胃之酸性環境侵害。製備固體及液體劑型之方法為已知的，或將為本領域中熟習此項技術者顯而易見的（參見例如上文引用之《雷明頓氏醫藥科學》）。

用於非經腸投與之調配物可製備為例如液體溶液或懸浮液形式、適於在注射之前溶解或懸浮於液體介質中之固體形式或乳液形式。舉例而言，無菌可注射溶液及懸浮液可根據本領域中已知的技術使用適合的稀釋劑、載劑、溶劑（例如緩衝水溶液、林格氏溶液（Ringer's solution）、等張氯化鈉溶液）、分散劑、潤濕劑、乳化劑、懸浮劑及其類似者調配。另外，可使用無菌不揮發性油、脂肪酯、多元醇及/或其他非活性成分。作為其他實例，用於非經腸投與之調配物包含可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性無菌注射溶液；以及可含有懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。

包括CNP變異體之組合物亦可為凍乾調配物。在某些實施例中，凍乾調配物包括緩衝劑及膨化劑，以及視情況存在之抗氧化劑。例示性緩衝液包含（但不限於）乙酸鹽緩衝液及檸檬酸鹽緩衝液。例示性膨化劑包含（但不限於）甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚維酮（PVP K24）。在某些實施例中，甘露糖醇之量為約3%至約10%、或約4%至約8%、或約4%至約6%。在某些實施例中，蔗糖之量為約6%至約20%、或約6%至約15%、或約8%至約12%。例示性抗氧化劑包含（但不限於）甲硫胺酸及抗壞血酸。

在各種實施例中，調配物包括檸檬酸、檸檬酸鈉、海藻糖、甘露糖醇、甲硫胺酸、聚山梨醇酯80及視情況存在之注射用無菌水（WFI）。

本揭示案亦提供套組，其含有例如瓶子、小瓶、安瓿、試管、套筒及/或注射器，其包括液體（例如無菌可注射）調配物或固體（例如凍乾）調配物。套組亦可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑、溶液及/或緩衝液），其用於將固體（例如凍乾）調配物復原為溶液或懸浮液以用於投與（例如藉由注射），包含（但不限於）復原注射器中之凍乾調配物以用於注射或將濃縮物稀釋至較低濃度。此外，即用型注射溶液及懸浮液可自例如包括含有CNP之組合物的無菌粉末、顆粒或錠劑製備。套組亦可包含施配裝置（諸如噴霧或注射施配裝置）、筆式噴射器、自噴射器、無針噴射器、注射器及/或針。

作為非限制性實例，套組可包含具有單腔室或雙腔室之注射器。對於單腔室注射器，該單腔室可含有準備好進行注射之液體CNP調配物，或固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可復原為注射用溶液或懸浮液。對於雙腔室注射器，一個腔室可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑系統、溶液或緩衝液），且另一腔室可含有固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可使用來自第一腔室之媒劑或載劑復原為注射用溶液或懸浮液。

作為另一實例，套組可包含一或多個筆式噴射器或自動噴射器裝置，及雙腔室藥筒。藥筒之一個腔室可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑系統、溶液或緩衝液），且另一腔室可含有固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可使用來自第一腔室之媒劑或載劑復原為注射用溶液或懸浮液。藥筒可包括足以在所要時段（例如2天、3天、1週、2週、3週、4週等）內給藥之量的CNP變異體。筆式噴射器或自動噴射器可經調節以投與所要量的來自藥筒之CNP調配物。投與及給藥

CNP變異體或包括其之醫藥組合物或調配物可以不同方式向個體投與，諸如皮下、關節內、腹膜內、肌肉內、皮內或經口。在一個實施例中，每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次地投與CNP變異體組合物。

CNP變異體或其組合物亦可藉由在目標作用部位（例如異常或退化的關節或軟骨區域）植入藥物儲槽來投與。可替代地，CNP變異體可藉由經皮遞送（例如藉助於皮膚上之貼片）在舌下（例如舌下錠劑）以舌下方式投與，或以微球、微膠囊、脂質體（不帶電或帶電（例如陽離子））、聚合微粒（例如聚醯胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)、微乳液及其類似形式經口投與。

本文所描述之CNP變異體組合物可以治療有效劑量向有需要之患者投與，以治療、改善或預防骨相關病症（例如骨骼發育不良，包含軟骨發育不全）。CNP變異體之安全性及治療功效可藉由細胞培養物或實驗動物中之標準藥理學程序測定，諸如藉由測定LD₅₀ （對於50%之群體致死性的劑量）及ED₅₀ （在50%之群體中治療有效的劑量）。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數且其可以比率LD₅₀ /ED₅₀ 表示。展現較大治療指數之活性劑通常係較佳的。

在某些實施例中，本文所描述之CNP變異體組合物以在約3、4、5、6、7、8、9或10 nmol/kg至約300 nmol/kg，或約20 nmol/kg至約200 nmol/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，CNP組合物以約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000 nmol/kg或由治療醫師認為適當的其他劑量投與。在其他實施例中，CNP變異體組合物以約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 µg/kg，或約0.5、0.8、1.0、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10 mg/kg，或由治療醫師認為適當的其他劑量投與。本文所描述之CNP或CNP變異體之劑量可根據本文所描述之給藥頻率/投與頻率投與，包含（但不限於）每日一次、每週2次或3次、每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次等。在各種實施例中，CNP或CNP變異體係每日皮下投與。在各種實施例中，CNP或CNP變異體係每週皮下投與。在各種實施例中，CNP變異體係以2.5 µg/kg/天至60 µg/kg/天、10 µg/kg/天至45 µg/kg/天或15 µg/kg/天至30 µg/kg/day之劑量投與。在各種實施例中，CNP變異體係以15 µg/kg/天之劑量投與。在各種實施例中，CNP變異體係以30 µg/kg/天之劑量投與。

針對特定個體之CNP變異體之給藥/投與頻率可視多種因素而變化，包含所治療病症及病狀及個體對療法之反應。CNP變異體可以每次給藥單次劑量或多次劑量投與。在某些實施例中，如下地投與CNP變異體組合物：以單次劑量或多次劑量，每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次，或以由治療醫師認為適當的頻率。在各種實施例中，持續3個月、6個月、12個月或更久投與CNP變異體。

在一些實施例中，投與CNP變異體組合物以允許生長期（例如軟骨生成），繼之以恢復期（例如成骨）。舉例而言，CNP組合物可皮下或藉由另一模式每日或每週多次地投與一段時間，接著為無治療期，隨後重複該週期。在一些實施例中，初始治療期（例如每日投與或每週多次投與CNP變異體組合物）持續3天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週。在一相關實施例中，無治療期持續3天、1週、2週、3週或4週。在某些實施例中，CNP變異體組合物之給藥方案為每日一次持續3日，接著停藥3日；或每日一次或每週多次持續1週，接著停藥3天或1週；或每日一次或每週多次持續2週，接著停藥1或2週；或每日一次或每週多次持續3週，接著停藥1、2或3週；或每日一次或每週多次持續4、5、6、7、8、9、10、11或12週，接著停藥1、2、3或4週。生物標記

為了治療骨相關病症，可量測生長指標，諸如子宮內及新生兒之長骨生長量測，及量測骨生長生物標記，諸如CNP、cGMP、膠原蛋白II、膠原蛋白X、骨鈣化素及增殖細胞核抗原（PCNA）。

一種CNP信號傳導標記為cGMP（3',5'環狀單磷酸鳥苷）。此胞內信號傳導分子之含量在與CNP結合及活化其同源受體NPR-B之後增加。升高的cGMP含量可在CNP暴露之後自細胞培養提取物（活體外）、來自CNP暴露之後的骨外植研究之經調節之培養基（離體）及在皮下、靜脈內或經由本領域中已知之其他投與途徑投與CNP幾分鐘內的血漿內（活體內）量測。

亦可量測軟骨及骨特異性分析物（或軟骨及骨相關標記）以評估CNP功效。舉例而言，裂解之II型膠原蛋白的片段為軟骨更新之軟骨特異性標記。II型膠原蛋白為軟骨之主要有機成分且II型膠原蛋白之片段（裂解之膠原蛋白）係釋放至循環中，且隨後在軟骨更新後分泌至尿液中。軟骨更新先於新骨形成。

可量測之骨形成之骨特異性生物標記為I型原膠原（PINP）之N端前肽。I型膠原蛋白之合成為骨形成中之重要步驟，因為I型膠原蛋白係骨基質中之主要有機組分。在膠原蛋白合成期間，前肽自原膠原分子釋放且可在血清中偵測到。另外，I型膠原蛋白之片段可量測為骨再吸收之標記。

軟骨及骨形成及生長之其他潛在生物標記包含聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素（軟骨更新之軟骨特異性標記）、II型膠原蛋白之前肽（軟骨形成之軟骨特異性標記）、I型膠原蛋白C端肽（CTx）、鹼性磷酸酶（骨特異性）及骨鈣化素（骨形成之骨特異性標記）。軟骨及骨相關生物標記可使用市售套組例如在來自功效/藥效學活體內研究，及來自離體研究之經調節之培養基之血清中量測。

在一個實施例中，在已投與本文所描述之CNP變異體或組合物之個體中分析或量測至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量，以便監測CNP組合物對活體內骨及軟骨形成及生長之作用。舉例而言，至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量增加可指示投與CNP變異體或組合物對骨生長具有積極作用，且適用於治療骨骼發育不良及與CNP活性降低相關之其他骨相關或軟骨相關的疾病或病症。例示性骨相關或軟骨相關的生物標記包含（但不限於）CNP（例如CNP之內源性含量）、cGMP、II型膠原蛋白及其片段之前肽、II型膠原蛋白及其片段、I型膠原蛋白C端肽（CTx）、骨鈣化素、增殖細胞核抗原（PCNA）、I型原膠原之前肽（PINP）及其片段之前肽、I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及鹼性磷酸酶。

在各種實施例中，藉由自將投與、正投與或已投與CNP變異體之個體獲得生物樣品來量測生物標記。可使用本領域中已知的技術量測生物標記，包含（但不限於）西方墨點（Western Blot）、酶聯免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbant assay；ELISA）及酶活性分析。生物樣品可為血液、血清、尿液或其他生物流體。

本揭示案之額外態樣及細節將自以下實例顯而易知，該等實例旨在說明性而非限制性的。 實例 實例1：CNP變異體之合成

CNP變異肽係使用將在Symphony/Prelude（Protein Technologies Inc., 美國）、Voyager（CEM GmbH, 德國）或SyroII（MultiSyntech, 德國）合成器上留下C端COOH的樹脂在固相上合成。

側鏈官能基經N-t-Boc（KW）、N-Trt (HNQ)、S-Trt (C)或N-Pbf (R)基團保護之所有Fmoc-胺基酸均購自Biosolve（荷蘭）或Bachem GmbH（德國）。對於每個胺基酸偶合步驟，在NMP中使用5倍過量之HBTU/HOBt/胺基酸/DIPEA（1:1:1:2），其中採用使用雙偶合之20分鐘活化時間。

肽之乙醯化（Ac）係藉由使樹脂與NMP/Ac2O/DIEA（10:1:0.1，v/v/v）在室溫下反應30分鐘來進行。

對於部分之共軛，離胺酸上之保護性胺基經裂解以產生反應性基團。標準Fmoc合成用於使2× Fmoc-胺基PEG(2)反應，接著與麩胺酸反應，接著與C18-二酸反應。

在室溫下，藉由與TFA（40 mL/mmol樹脂）反應2小時使完整肽自樹脂裂解。過濾粗肽，用冰冷的Et2O沈澱，接著凍乾且最終藉由製備型逆相高效液相層析（RP-HPLC）純化。最終產物及純度藉由質譜分析確認。

CNP變異體係基於Pro-Gly CNP-37（PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 1））之序列產生，視情況具有不同胺基酸殘基之變化及/或N端之乙醯化，及/或其他修飾，且包含（以下加底線的胺基酸變化）： CNP-8：Ac-PGQEHPQ ARR YR GAQRR GLSR GCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）， CNP-5：Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2（SEQ ID NO: 9）， CNP-6：Ac-PGQEHPNARR YR GANRR GLSR GCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 10）， CNP-7：Ac-PGQEHPNARR YR GANRR GLSR GCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2（SEQ ID NO: 11）、CNP-9：Ac-PGQEHPQ ARR YR GAQRR GLSR GCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2（SEQ ID NO: 12）， Ac-PGQEHPQARR YR GAQRR GLSR GCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）以及 PGQEHPQ ARK YK GAQKK GLSK GCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 7）。

將完全還原之肽溶解於具有或不具有鹽酸胍之0.1 M Tris-緩衝液（pH 8.0）中且在室溫下攪拌，該緩衝液以0.1 mg/mL之最終濃度含有1 mM半胱胺酸（SS-形式）及8 mM半胱胺酸（SH-形式）。藉由HPLC-分析監測二硫化物形成，直至不再觀測到進一步的峰值變化。將混合物裝載於製備型RP-HPLC上以進行純化。 實例2：合成之CNP變異體之表徵

藉由質譜分析及UV光譜法來分析如實例1中所合成之CNP變異體，以確定10天後之純度及穩定性。

穩定性係使用歷經時間T0至T10之RP-HPLC純度分析來量測。簡言之，將CNP變異體在以下緩衝液中以1:5稀釋：5 mM檸檬酸鹽、6%蔗糖、1.5%甘露糖醇、0.7 mg/ml甲硫胺酸及0.005% tween80，pH 5.6，將10 µL之注射體積注入Phenomenex Aeris XB-C18 RP管柱（2 µm，100A，2.1 × 250 mm；p/n 00G-4505-AN）HPLC條件為：流動相A：H₂ O/0.05% TFA，pH 3 w/NH₄ OH（最終約3mM），流動相B：70% CH₃ CN於H₂ O/0.05% TFA中，pH 3 w/NH₄ OH（最終約3mM）及0.25mL/分鐘之流動速率。量測係用55℃之管柱溫度及UV：214 nm（bw 4 nm）；ref 360 nm（bw 20 nm），UV：280 nm（bw 4 nm）；ref 360 nm（bw 20 nm）進行。CNP變異體在PBS（pH 7.4）中在37℃下保持10天且獲得穩定性量測結果。穩定性量測之結果在以下表1中展示為在T0（0天）或T10（10天）所偵測之變異體%。 表1

肽	T0 ， %	T10 ， %	EC50 ， T0 ， nm
Pro-Gly CNP37	76.7	39.5	1.7
CNP-5	83	47	3
CNP-6	90	58	0.4
CNP-7	77	53	2.1
CNP-8	91	88	0.2
CNP-9	92	77	0.9

CNP變異體係藉由cGMP刺激分析使用CatchPoint Cyclic-GMP螢光分析主體套組（Fluorescent Assay Bulk kit）（Molecular Devices，R8075）來測試活性。簡言之，將NIH3T3細胞（ATCC，CRL-1658）及HEK293細胞以每孔60,000個細胞接種於96孔盤（96孔黑色成像盤，Grenier，#655090）中。培養基為如下：NIH3T3培養基：DMEM高葡萄糖，丙酮酸鹽（Thermo，11995-073）+10% FBS+1× Pen Strep（縮寫為P/S，Thermo，目錄號15140122）。NIH3T3為cGMP分析HEK293培養基之對照系統：EMEM+10% FBS+ 1×P/S+1×GMAX。無血清NIH3T3培養基：DMEM+1×P/S，用於以IBMX（CAS 28822-58-4）處理細胞；含BSA之無血清NIH3T3培養基：DMEM+1×P/S+0.5 mg/mL BSA（Thermo，A9418-100G），用於以CNP處理細胞。

細胞係在37℃、5% CO₂ 下培育24小時。對於用CNP變異體處理之細胞，板在使用之前15分鐘用IBMX（Enzo life sciences，89161-340，1 g）預處理。IBMX為磷酸二酯酶之強效、非特異性抑制劑。IBMX之800 mM儲備溶液在IBMX稀釋培養基（無血清培養基（DMEM+1×PBS與1×PBS 1:1混合）中稀釋為0.75 mM工作儲備液。

CNP變異體係如下製備：在CNP稀釋培養基（DMEM+1×P/S+0.5 mg/mL BSA）中以1:1000稀釋10 mg/ml CNP溶液。進一步稀釋此溶液以獲得CNP起始溶液，其以100 nM CNP/孔塗鋪。此100 nM CNP溶液進一步以1:5連續稀釋六份稀釋液，以獲得0.0064 nM CNP/孔之下端濃度。此提供用於分析之7點劑量曲線。

對於細胞處理，自培育箱移除細胞，自細胞及用IBMX處理之細胞移除生長培養基。將80 µL 0.75 mM IBMX添加至各孔中且將細胞返回至37℃培育箱中15分鐘。在15分鐘之後，將CNP（40 µL/孔）添加至各測試孔且將細胞返回至37℃培育箱中15分鐘。藉由輕敲混合該盤。使盤在Solentim細胞度量上成像以使細胞可視化，並且確定是否有任何細胞上浮且隨後將其放回37℃培育箱中。

終止反應且藉由添加40 µL溶解緩衝液（來自cGMP套組）使細胞溶解。將盤置於振盪器上5分鐘以完全溶解。細胞溶解物用於cGMP分析。

使用根據製造商方案製備之cGMP校準劑、兔抗cGMP抗體及HRP-cGMP進行cGMP分析。將40 µL校準劑添加至塗有抗cGMP抗體之盤的孔中，且將40 µL待分析之溶解物添加至適當孔中。將40 µL經復原之兔抗cGMP抗體添加至所有孔中，且將盤置放於振盪器上五分鐘以進行混合。將40 µL經復原之HRP-cGMP添加至各孔中且在室溫下培育2小時。將盤手動抽吸且用300 µL洗滌緩衝液洗滌4次。將100 µL信號燈紅色受質添加至各孔中，該盤經覆蓋且在室溫下避光保持至少10分鐘。在Spectramax M或類似儀器上，在530 nm激發及590 nm發射下讀取盤之螢光強度。

表1展示CNP變異體刺激cGMP產生，表明本文所描述之穩定變異體適用作治療骨相關病症之治療劑。

實例2A：CNP變異體或共軛物於血漿中之穩定性

歷經24小時時段測試不同CNP變異體或CNP共軛物在人類血漿中之穩定性。簡言之，___\[ 請描述方案，使用何種脂質， C18?] CNP-R係指CNP37變異體，其中環部分中不存在之K殘基改變為R殘基，且CNP Q/R係指CNP37變異體，其中N殘基改變為Q且環部分中不存在之K殘基改變為CONRR \[請確認]。

圖1說明具有不同連接子結構之CNP共軛物。

圖2展示與血漿中之聚乙二醇化或非共軛肽相比，脂化共軛物在血漿中之穩定性經改良。

亦在不同條件下分析不同共軛物之穩定性。簡言之，請描述方案 ] 圖3展示請描述重要性 實例3：異型接合NPR2突變對CNP處理有反應

為了確定CNP對患有由NPR2突變引起的身材矮小之個體之效應，開發NPR2突變之細胞模型。所分析之例示性NPR2突變闡述於圖6中。具有NPR2基因敲除或該基因中之異型接合功能喪失突變的大鼠軟骨肉瘤（rat chondrosarcoma；RCS）細胞係藉由使用125 ng NPR2變異體將RNP轉染至RCS細胞中或轉染至RCS或HEK293細胞中之野生型NPR2 質體DNA製得。單細胞純系經接種且藉由桑格定序（Sanger sequencing）進行基因分型。細胞模型能夠再現公佈的不同突變之cGMP表型。

藉由在RCS細胞中之NPR2之第一外顯子中產生插入及缺失而產生NPR2純系。NPR2中第一外顯子之序列係藉由下一代定序確認，且闡述於圖5中。藉由在用6nM Pro-Gly CNP37處理後，使用CatchPoint Cyclic-GMP螢光分析進行cGMP刺激分析來測試NPR2突變細胞回應於CNP投與之活性。將大鼠軟骨肉瘤（RCS）細胞以每孔40,000個細胞接種於RCS培養基中：DMEM+10% FBS+1× Pen Strep。圖4展示添加外源性Pro-Gly-CNP37變異體拯救NPR2+/-大鼠軟骨肉瘤細胞模型之cGMP讀數。

前述活化資料報導cGMP EC50在40至360 nM範圍內，用於活化PRKG2（Campbell等人, 《ACS化學生物學（ACS Chem Biol）》 12, 2388-2398, 2017）；Vaandrager等人, 《生物化學雜誌（J Biol Chem）》 272, 11816-23, 1997)；Pohler等人, 《歐洲生物化學協會聯合會快報（FEBS Lett）》 374, 419-25, 1995）。在異型接合NPR2基因敲除細胞中，＞0.163 nM之CNP劑量能夠達成超出PRKG2活化cGMP之EC50範圍的細胞內濃度（圖4）。而在野生型細胞中，0.040 nM之CNP劑量能夠達成相同的cGMP濃度。此等結果表明CNP補充可達成PRKG2活化及在具有NPR2功能損失型突變之細胞生長所需的cGMP含量。

此等結果亦表明投與CNP變異體適用於使患有NPR2活性降低之身材矮小的個體恢復骨生長。經進一步考慮用CNP變異體治療將對在cGMP信號傳導可受損之其他生長板基因中具有突變之個體有益。 實例4：與身材矮小相關之突變之鑑別

假設展示基因驅動之雙向效應之明確證據的基因更可能代表可在廣泛患者群體中有效調節之治療目標。為了鑑別為生長之核心調節因子的基因，分析了五個基因清單之交集，包含來自全基因體關聯研究（genome-wide association study；GWAS）之基因清單。核心生長調節因子將最可能含有具有雙向效應（亦即，身材矮小或骨骼發育不良及身材高大或過生長）的稀有編碼突變。

查詢之資料庫包含：GWAS，提取了由使用約700,000個個體之大型GWAS身高綜合分析報導之3,290個獨立遺傳變異體中之每一者的2,067個非重複最近基因；HGMD，查詢來自HGMD版本v2019_2之「allmut」表以尋找標記為「DM」的在相同基因中具有「身材矮小」及「身材高大或過生長」之所有致病變異體；OMIM，先前描述了與生長病症相關之OMIM基因之清單且使用以下關鍵詞創建：身材矮小、過生長、骨骼發育不良、短指症。

首先，關於與身材矮小或身材高大相關之基因查詢人類基因突變資料庫（HGMD版本v2019_2）（Stenson等人, 《人類遺傳學（Hum Genet）》 136:665-677, 2017）。文獻中報導了47種標註有至少一種致病變異體之基因，其引起「身材矮小」。僅20種基因係標註為身材高大或過生長基因。第二，使用258個OMIM基因（248個矮小、20個高大）之手動策劃清單，其係使用以下關鍵詞創建：身材矮小、過生長、骨骼發育不良、短指症（Wood等人, 《自然遺傳學（Nat Genet）》 46:1173-86, 2014）。第三，將此等清單之交集與來自GWAS之基因清單進行比較。在此等清單之交集處，存在三種已知與身高相關之基因（IGF1R、NPPC、NPR2），且鑑別出兩種額外基因（FGFR3、SHOX）。

額外分析使得產生一組新的五個核心基因，其展示顯著降低的身高（β=-0.20，95%CI[-0.26至-0.14]，p=4.04×10-11）及顯著提高的特發性身材矮小（ISS）風險（OR=2.75，95%CI[1.92-3.96]。五個核心基因（FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX）中之每一者在個別地考慮時與身高相關，且在與其他突變組合使用時亦與身材矮小相關。FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX之例示性突變闡述於圖7中。

NPR2及IGF1R中之組合功能喪失（loss of function；LoF）及誤義變異體亦與ISS風險增加相關（分別為OR=3.31，P=0.001，OR=2.85，P=0.002）。已在具有不同嚴重程度之家族性身材矮小中報導SHOX、IGF1R、NPPC、NPR2中引起蛋白質功能喪失之整體基因缺失及/或突變。

分析展示五個核心基因中之任一者之變異體攜帶者的ISS風險增加大致3倍，且占總ISS群體之6.7%。此外，表明添加外源性CNP之後，NPR2單倍劑量不足之細胞模型中NPR2信號傳導之劑量依賴性拯救。

根據全基因模型（Liu等人, 《細胞（Cell）》 177:1022-1034 e6（2019）；Boyle等人, 《細胞》 169:1177-1186（2017）），若此等基因為核心人類生長基因，則其效應應藉由驅動調節網路之多個較弱的常見遺傳變異體調節。為了間接測試此假設，使用針對身高之公佈的最大GWAS綜合分析計算身高之多基因風險評分（PRS），該綜合分析不包含來自UK生物庫項目之任何樣品。將群組分為五個相等大小之（n=6,824）PRS五分位數（PRS 1為最矮身高，PRS 5為最高身高）。PRS評分增加與平均身高之間存在劑量依賴性關係（各PRS五分位數增加之β=0.30）（圖8A）。跨越五個不同PRS背景，五個核心基因中LoF變異體之攜帶者始終比非攜帶者矮。參見圖8。資料表明PRS及稀有蛋白質變異體之組合效應與加法模型一致：多基因效應調節攜帶者及非攜帶者之身高。

使用PRS=3作為參考來計算跨越PRS組之ISS風險。最低PRS組與ISS風險提高相關，且最高PRS組與風險降低相關（對於PRS 1及PRS 5分別為OR=5.43，P=8.58×10-34；OR=0.22，P=4.49×10-7）。評估五個核心基因之稀有編碼變異體對由PRS組分層之ISS的效應。在前三個五分位數中，五個核心基因中之任一者之攜帶者患ISS之風險增加（OR=2.64，P=3.09×10-5；OR=2.17，P=0.04；OR=5.29，P=1.58×10-5；OR=2.72，P=0.09，圖8C-F）。對於各個別核心基因之攜帶者，觀測到由PRS分層之ISS風險的一致效應方向（圖8C-F）。

此外，主要來自多個具有個別小效應之常見遺傳變異的PRS之累加效應預測資料集中20.1%之身高差異。PRS之此等累加效應似乎對核心基因之稀有編碼變化形式之攜帶者以及非攜帶者具有類似的量值。此觀測結果指示PRS可為稀有致病變異體之外顯率差異的重要貢獻者（尤其在單倍劑量不足之模型，諸如本文所描述之模型中）。支持此想法，觀測到八個具有低NPR2活性之NPR2變異體攜帶者中之兩個具有低-正常身高。此資料表明大部分具有NPR2突變之ISS個體亦可具有多基因背景，使其更易受喪失NPR2活性之致病效應。

此等結果支持基於CNP之治療可在NPR2單倍劑量不足患者群體中有效之觀點。此外，展示普通人群之NPR2攜帶者中cGMP含量與身高之顯著雙向（LoF及GoF）相關性的結果表明用CNP類似物靶向此受體可為用於所有ISS個體之有效療法。

應理解，本文所描述之本揭示案之每一實施例可視情況與本文所描述之其他實施例中之任何一或多者組合。本文所引用之每一專利文獻及每一非專利文獻以全文引用之方式併入本文中。

因此，應理解，本發明不限於所揭示之特定實施例，而意欲涵蓋所有修改，該等修改在如由所附申請專利範圍、以上說明書中所定義及/或隨附圖式中所示之本發明之精神及範疇內。因此，僅在隨附申請專利範圍中呈現的此類限制應列入本揭示案中。

無

圖1說明本文所描述之CNP共軛物中之類肽或電子連接子之用途。

圖2展示CNP變異體於人類血漿中歷經24小時之時段的穩定性。

圖3展示CNP變異體在不同培養條件下之穩定性。

圖43展示CNP變異體（Pro-Gly-CNP）對攜帶NPR2同型接合或異型接合突變之細胞的作用，如藉由cGMP刺激所量測。

圖5展示轉染至RCS細胞中之NPR2突變純系中第一外顯子之核苷酸及預測之蛋白質序列。

圖6展示關於對CNP之反應分析的例示性NPR2突變。

圖7展示FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX中與身材矮小相關之例示性突變。

圖8說明PRS及稀有編碼變異體對身高之組合影響。圖8A.對身高之影響作為定量性狀，將樣品基於其PRS分為五組，水平線表示高度之25%、50%及75%百分位的小提琴圖。樣品係藉由誤義、功能喪失或無攜帶狀態而分組至五個核心基因中之任一者中。圖8B.由對於「特發性身材矮小」或ISS之勝算比反映的影響。使用PRS=3作為參考相對於其他PRS組之ISS的勝算。圖8C.使用PRS=1作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。圖8D.使用PRS=1非攜帶者作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。圖8E.使用PRS=2非攜帶者作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。圖8F.使用PRS=3非攜帶者作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。G.使用PRS=4非攜帶者作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。

Claims (42)

1. 一種C型利尿鈉肽之變異體，其係選自由以下組成之群組：PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 1）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 6）；以及 PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 7）。
2. 如請求項1之變異體，其中該肽進一步包括乙醯基。
3. 如請求項1或2之變異體，其中該乙醯基位於該肽之N端上。
4. 如前述請求項中任一項之變異體，其中該肽在C端進一步包括OH或NH₂ 基團。
5. 如前述請求項中任一項之變異體，其包括共軛部分。
6. 如請求項5之變異體，其中該共軛部分位於CNP環狀域之殘基上或位於除該CNP環狀域之外的位點處。
7. 如請求項5或6之變異體，其中該共軛部分位於離胺酸殘基上。
8. 如請求項5至7中任一項之變異體，其中該共軛部分包括酸部分。
9. 如請求項5至8中任一項之變異體，其中該共軛部分包括與親水性間隔基連接之酸部分。
10. 如請求項8或9中任一項之變異體，其中該酸部分及該親水性間隔基具有結構AEEA-AEEA-γGlu-C18DA。
11. 如前述請求項中任一項之變異體，其中該肽係選自由以下組成之群組： Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）； Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 9）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 10）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 11）；以及 Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 12）。
12. 如請求項10或11中任一項之變異體，其中該CNP變異體為Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA) LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 1）或PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 1）。
13. 如前述請求項中任一項之變異體，其包括連接子。
14. 如請求項13之變異體，其中該連接子位於該CNP環狀域之殘基上或位於除該CNP環狀域之外的位點處。
15. 如請求項13或14中任一項之變異體，其中該連接子為可水解連接子。
16. 如請求項13至15中任一項之變異體，其中該連接子位於離胺酸殘基上。
17. 如請求項5至16中任一項之變異體，其中該CNP變異體經由該連接子與該共軛部分連接。
18. 如請求項17之變異體，其中該連接子經由該共軛部分之親水性間隔基連接至該共軛部分。
19. 如請求項13至18中任一項之變異體，其中該連接子為類肽連接子或電子連接子。
20. 如前述請求項中之任一項之變異體，其中該肽係以合成方式製備的。
21. 如前述請求項中任一項之變異體，其中該肽在37℃、pH 7至7.4下穩定10天。
22. 如前述請求項中任一項之變異體，其中該肽在cGMP分析中具有0.1至10 nm之EC50。
23. 如前述請求項中任一項之變異體，其中在37℃、pH 7.4下於水性介質中10天後偵測到超過45%之該肽。
24. 如前述請求項中任一項之變異體，其中該肽與一或多個脂質、脂肪酸、親水性間隔基部分或視情況與其組合共軛。
25. 如前述請求項中任一項之變異體，其中與Pro-Gly-CNP37、CNP-22或Pro-Gly CNP及CNP-22兩者相比，該肽具有更長的半衰期。
26. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至25中任一項之CNP變異體及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
27. 如請求項26之組合物，其為由包括pH為約4至約6之檸檬酸/檸檬酸鹽緩衝液或乙酸/乙酸鹽緩衝液之調配物製備的凍乾調配物。
28. 如請求項27之組合物，其中該凍乾調配物係由進一步包括等張調節劑或選自由以下組成之群組的增積劑之調配物製備：甘露糖醇、蔗糖、山梨糖醇及其組合。
29. 如請求項27至28中任一項之組合物，其中該凍乾調配物係由進一步包括選自由以下組成之群組的抗氧化劑之調配物製備：甲硫胺酸、抗壞血酸、抗壞血酸之鹽形式、硫甘油及其組合。
30. 一種治療有需要之個體之骨相關病症或骨骼發育不良之方法，其包括向該個體投與包括CNP變異體之組合物或如請求項1至29中任一項之組合物。
31. 如請求項30之方法，其中該骨相關病症或骨骼發育不良係選自由以下組成之群組：骨關節炎（osteoarthritis）、低磷酸鹽血性佝僂病（hypophosphatemic ricket）、軟骨發育不全（achondroplasia）、軟骨生成減退（hypochondroplasia）、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良（osteochondrodysplasias）、致死性發育不良、成骨不全（osteogenesis imperfecta）、軟骨成長不全（achondrogenesis）、點狀軟骨發育異常（chondrodysplasia punctata）、純合性軟骨發育不全（homozygous achondroplasia）、點狀軟骨發育異常、屈肢骨發育不良（camptomelic dysplasia）、先天性致死型低磷酸酶症（congenital lethal hypophosphatasia）、圍產期致死型成骨不全（perinatal lethal type of osteogenesis imperfecta）、短肋多指症候群（short-rib polydactyly syndromes）、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育異常（rhizomelic type of chondrodysplasia punctata）、揚森型幹骺端發育不良（Jansen-type metaphyseal dysplasia）、先天性脊椎骨骺發育不良（spondyloepiphyseal dysplasia congenita）、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良（Langer-type mesomelic dysplasia）、尼維格型肢中骨發育不良（Nievergelt-type mesomelic dysplasia）、羅氏症候群（Robinow syndrome）、萊因哈特症候群（Reinhardt syndrome）、肢端發育不全（acrodysostosis）、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良（Kniest dysplasia）、纖維軟骨增生症、羅伯茨症候群（Roberts syndrome）、肢端肢中發育不良、小肢、莫奎氏症候群（Morquio syndrome）、克尼斯特症候群（Kniest syndrome）、後生營養性發育不良及脊椎骨骺幹骺端發育不良（spondyloepimetaphyseal dysplasia）、NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾（Turner's syndrome/Leri Weill））、PTPN11突變（努南氏症候群（Noonan's syndrome））、胰島素生長因子1受體（insulin growth factor 1 receptor；IGF1R）突變以及特發性身材矮小。
32. 一種在有需要之個體中進行骨延長或增加長骨生長之方法，其包括向該個體投與包括CNP變異體之組合物或如請求項1至29中任一項之組合物，且其中該投與使骨延長或增加長骨生長。
33. 如請求項30至32中任一項之方法，其中該組合物係皮下、皮內、關節內、經口或肌肉內投與。
34. 如請求項30至33中任一項之方法，其中該組合物係每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次地投與。
35. 如請求項30至34中任一項之方法，其中該組合物為延釋組合物。
36. 一種治療CNP反應性病狀或病症之方法，該方法包括 向個體投與如請求項1至29中任一項之CNP變異體或組合物，以及 監測該個體中之至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量， 其中該至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量之增加指示CNP變異體對該個體或該病狀或病症之治療作用。
37. 如請求項36之方法，其進一步包括調節該CNP變異體之投與量或頻率，其中 i）若至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量低於目標含量，則增加該CNP變異體之該投與量或頻率；或 ii）若至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記之含量高於目標含量，則減少該CNP變異體之該投與量或頻率。
38. 如請求項36或37之方法，其中該至少一種骨相關或軟骨相關的生物標記係選自由以下組成之群組：CNP、cGMP、II型膠原蛋白及其片段之前肽、II型膠原蛋白及其片段、I型膠原蛋白C端肽（CTx）、骨鈣化素、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen；PCNA）、I型原膠原之前肽（PINP）及其片段之前肽、I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）、膠原蛋白X及鹼性磷酸酶。
39. 一種製備如請求項1至25中任一項之CNP變異體的方法，該方法包括使用Fmoc胺基酸於固相樹脂上合成該肽。
40. 如請求項39之方法，其中該肽藉由使該樹脂與NMP/Ac2O/DIEA（10:1:0.1，v/v/v）反應而乙醯化。
41. 如請求項39或40之方法，其中該肽與視情況存在於離胺酸殘基上之脂質部分共軛。
42. 如請求項41之方法，其包括使該離胺酸上之保護性胺基裂解、使該肽與2× Fmoc-胺基PEG(2)反應，接著與胺基酸反應，接著使該脂質或脂肪酸部分共軛。

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