KR20220063220A

KR20220063220A - Cnp 변이체 및 이의 접합체

Info

Publication number: KR20220063220A
Application number: KR1020227012110A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 제이. 웬트; 제프리 버구익; 캐롤 에스트라다; 조나단 레보위츠
Original assignee: 바이오마린 파머수티컬 인크.
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2022-05-17
Also published as: PE20220488A1; CO2022004335A2; EP4031183A1; BR112022004697A2; CN114616242A; CA3153730A1; CL2023001727A1; MX2022003184A; IL291179A; WO2021055497A1; JP2022547723A; AU2020349493A1; TW202124422A; US20230192799A1

Abstract

본 개시내용은 일반적으로 골-관련 장애를 치료하기 위한 C형 나트륨이뇨 펩타이드(CNP)의 안정한 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

CNP 변이체 및 이의 접합체

관련 출원의 상호-참조

본 출원은 본원에 그 전체가 참고로 포함된 2019년 9월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/901,093호, 2019년 11월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/935,050호, 2020년 1월 20일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/963,350호, 2020년 1월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/964,852호 및 2020년 6월 12일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/038,667호의 우선권 이익을 주장한다.

전자로 제출된 자료의 참고에 의한 포함

본 개시내용의 일부인 서열 목록은 텍스트 파일로서 본 명세서와 동시에 제출된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 2020년 8월 6일에 작성되고 크기가 54,429바이트인 "54736_Seqlisting.txt"이다. 서열 목록의 대상은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

기술분야

본 개시내용은 일반적으로 C형 나트륨이뇨 펩타이드(CNP: C-type natriuretic peptide)의 변이체, CNP 변이체를 포함하는 약제학적 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. CNP 변이체는 비제한적인 예로서 골-관련 장애, 예컨대 골격 이형성증(예를 들어, 연골무형성증)을 포함하는 CNP에 반응성인 질환의 치료를 위한 치료제로서 유용하다.

C형 나트륨이뇨 펩타이드(CNP)(Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990)(GenBank 수탁 번호 NP_077720, CNP 전구체 단백질에 대해서는, NPPC)(J. Hypertens., 10: 907-912 (1992))는 17-아미노산 루프 구조를 갖는 펩타이드의 패밀리(ANP, BNP, CNP)에서의 작은 단일 사슬 펩타이드이고(Levin 등, N. Engl. J. Med., 339: 863-870 (1998)), 다수의 생물학적 과정에서 중요한 역할을 갖는다. CNP는 나트륨이뇨 펩타이드 수용체-B(NPR-B, GC-B)와 상호작용하여 사이클릭-구아노신 모노포스페이트(cGMP)의 생성을 자극한다(J. Hypertens., 10: 1111-1114 (1992)). CNP는 중추 신경계, 생식관, 골 및 혈관의 내피를 포함하여 더 광범위하게 발현된다(Hypertension, 49: 419-426 (2007)).

인간에서, CNP는 초기에 단일 사슬 126-아미노산 pre-pro 폴리펩타이드로서 나트륨이뇨 펩타이드 전구체 C(NPPC) 유전자로부터 제조된다(Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990)). 신호 펩타이드의 제거는 pro-CNP를 생성하고, 엔도프로테아제 푸린에 의한 추가의 절단은 활성 53-아미노산 펩타이드(CNP-53)를 생성하고, 이는 성숙 22-아미노산 펩타이드(CNP-22)를 생성하기 위해 미지의 효소에 의해 다시 분비되고 절단된다(Wu, J. Biol. Chem. 278: 25847-852 (2003)). CNP-53이 조직에서 우세하며 CNP-53 및 CNP-22는 이의 분포가 다르지만, CNP-22는 혈장 및 뇌척수액에서 주로 발견된다(J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res., 26: 269-297 (2006)). CNP-53 및 CNP-22 둘 다는 NPR-B에 유사하게 결합한다.

cGMP 생성에 의해 매개된 하류 신호전달은 연골내 골화를 포함하는 생물학적 과정의 다양한 어레이에 영향을 미친다. 예를 들어, 마우스 모델에서의 CNP 또는 NPR-B 중 어느 하나의 넉아웃은 더 짧은 긴 골 및 척추를 갖는 소인증 표현형을 갖는 동물을 생성시킨다. 적절한 CNP 신호전달을 차단하는 인간 NPR-B에서의 돌연변이가 확인되었고, 소인증을 생성시킨다(Olney, 등, J. Clin. Endocrinol. Metab. 91(4): 1229-1232 (2006); Bartels, 등, Am. J. Hum. Genet. 75: 27-34 (2004)). 그에 반해서, 상승된 수준의 CNP를 생성하도록 조작된 마우스는 길어진 긴 골 및 척추를 나타낸다.

CNP(CNP22)의 치료학적 용도는 이의 짧은 혈장 반감기에 의해 제한되고, 이는 인간에서 생체내 2.6분인 것으로 나타났다(J Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). 더 긴 생체내 혈청 반감기를 갖고 야생형 CNP의 활성과 유사한 또는 개선된 활성을 나타내는 CNP 변이체는 지속 가능한 치료학적 전략에 중요하다.

본 개시내용은 수성 배지에서 증가된 순환 반감기 및 안정성을 갖는 C형 나트륨이뇨 펩타이드(CNP)의 신규의 변이체, 이러한 CNP 변이체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 비제한적인 예로서 골-관련 장애, 예컨대 연골무형성증을 포함하는 CNP에 반응성인 장애를 치료하기 위해 이러한 CNP 변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

다양한 실시형태에서, 본 개시내용은

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (서열 번호 5);

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (서열 번호 1);

PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 6); 및

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 5)로 이루어진 군으로부터 선택된 C형 나트륨이뇨 펩타이드(CNP)의 변이체를 제공한다.

다양한 실시형태에서, 본 개시내용은

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 5);

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (서열 번호 1);

PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 6);

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 5); 및

PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (서열 번호 7)로 이루어진 군으로부터 선택된 C형 나트륨이뇨 펩타이드(CNP)의 변이체를 제공한다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 아세틸 기를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 아세틸 기는 펩타이드의 N 말단 위에 있다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 C 말단에서의 OH 또는 NH₂ 기를 추가로 포함한다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 접합체 모이어티를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 CNP 사이클릭 도메인의 잔기 위에 또는 CNP 사이클릭 도메인이 아닌 부위에서 있다. 다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 리신 잔기 위에 있다. 다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 하나 이상의 산 모이어티를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 산 모이어티는 소수성 산이다.

다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 친수성 스페이서에 연결된 하나 이상의 산 모이어티를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 임의의 아미노산이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 감마 글루탐산(γGlu)이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산)이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 감마 글루탐산(γGlu) 또는 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산)이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 1개 또는 2개 이상의 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산)에 연결된 감마 글루탐산(γGlu)이다. 다양한 실시형태에서, 산 모이어티는 지방산이다. 예시적인 지방산은 짧은 사슬, 중간 사슬 또는 긴 사슬 지방산, 또는 디카복실릭 지방산을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 지방산은 포화 또는 불포화이다. 비제한적인 예로서 포화 또는 불포화된 C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, C-16, C-18 또는 C-20 지방산을 포함하는 C-6 내지 C-20 지방산이 고려된다. 다양한 실시형태에서, 지방산은 데칸산, 도데칸산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산 또는 이들의 이산이다.

다양한 실시형태에서, 산 모이어티 및 친수성 스페이서는 구조 AEEA-AEEA-γGlu-C18DA를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 산 모이어티 및 친수성 스페이서는 하기 구조를 갖는다:

상기 식 중, "

"은 CNP 변이체에 대한 부착점을 나타낸다. 다양한 실시형태에서, "

"은 가수분해 가능한 링커에 대한 부착점을 나타내고, 여기서 가수분해 가능한 링커는 CNP 변이체에 부착된다. 다양한 실시형태에서, 가수분해 가능한 링커는 온전한 CNP 변이체를 방출할 수 있다.

다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티를 갖는 CNP 변이체는 변형 방출 조성물의 성분이다. 다양한 실시형태에서, 변형 방출 조성물은 서방형 조성물이다. 다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티 및 가수분해 가능한 링커를 포함하는 CNP 변이체는 CNP 변이체를 방출할 수 있고, 여기서 pH 7 내지 7.6에서 (i) 약 20% 미만의 CNP 변이체는 1일에 방출되고; (ii) 약 90%의 CNP 변이체는 주마다 방출되거나, 약 90%의 CNP 변이체는 2주마다 방출되거나, 약 90%의 CNP 변이체는 달마다 방출된다.

다양한 실시형태에서, (i) pH 7.0 내지 7.6에서 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70% 또는 약 75% 미만의 펩타이드는 1일에 방출되고; (ii) pH 7 내지 7.6에서 약 90%의 펩타이드는 주마다 방출되거나, 약 90%의 펩타이드는 2주마다 방출되거나, 약 90%의 펩타이드는 달마다 방출된다. (i) pH 7.0 내지 7.6에서 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60% 약 65%, 약 70% 또는 약 75% 미만의 펩타이드가 1일에 방출되고; (ii) pH 7 내지 7.6에서 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 2주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 3주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 달마다 방출되거나; 대안적으로 ii) pH 7 내지 7.6에서 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%의 펩타이드가 주마다 방출되거나; 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%의 펩타이드가 2주마다 방출되거나; 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%의 펩타이드가 3주마다 방출되거나; 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%의 펩타이드가 달마다 방출된다는 것이 추가로 고려된다.

다양한 실시형태에서에서, 변이체는

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC(서열 번호 5), 또는

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8)의 구조를 갖는다.

다양한 실시형태에서에서, 변이체는

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8);

Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 9);

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 10);

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 11);

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 12);

Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 13); 및

Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 14)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 실시형태에서, 변이체는 하나 이상의 링커 기를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 링커는 CNP 사이클릭 도메인의 잔기 위에 또는 CNP 사이클릭 도메인이 아닌 부위에서 있다. 다양한 실시형태에서, 링커는 리신 잔기 위에 있다.

다양한 실시형태에서, 링커는 가수분해 가능한 링커이다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 링커를 통해 접합체 모이어티에 부착된다. 다양한 실시형태에서, 링커는 접합체 모이어티의 친수성 스페이서를 통해 접합체 모이어티에 부착된다. 다양한 실시형태에서, 링커는 아미노에톡시-2-에톡시 아세트산(AEEA)이다. 다양한 실시형태에서, 링커는 비신-타입 또는 펩토이드 링커이고, 이것은 비신(비스-2-하이드록시에틸글리신아미드)로서 유사한 절단 기전을 갖지만, 대신에 비대칭 N-알킬 펩타이드, 즉 펩토이드를 통해 절단하는 링커를 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 링커는 비효소적 β-제거에 기초한 전자 링커이다. 다양한 실시형태에서, 전자 링커는 SO₂ 모이어티를 포함한다. CNP 접합체에 예시된 것과 같은 링커의 예는 도 1에 도시되어 있다. 또한 Santi, 등, Proc Natl Acad Sci USA 109:6211-6216, 2012)를 참조한다.

다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 합성 중합체 기이다. 다양한 실시형태에서, 변이체는 가수분해 가능한 링커를 통해 변이체에 커플링된 합성 중합체 기를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 합성 중합체 기는 친수성 중합체 모이어티를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 친수성 중합체 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 친수성 중합체 모이어티는 6개 내지 20개의 원자 사슬 길이를 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 합성으로 제조된다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.0 내지 7.6에서 10일 동안 안정하다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.0 내지 7.4에서 적어도 10일 동안 안정하다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.2 내지 7.6에서 적어도 10일 동안 안정하다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 탈아미드화에 안정하다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 산화에 안정하다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 탈아미드화, 및/또는 산화, 또는 이들의 조합에 안정하다. 다양한 실시형태에서, 메티오닌은 노르-류신에 의해 대체된다. 다양한 실시형태에서, 10일 후 탈아미드화가 아주 적거나 검출 가능한 탈아미드화가 없다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.0 내지 7.6에서 약 10일의 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.0 내지 7.4에서 약 10일의 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.2 내지 7.6에서 약 10일의 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.0 내지 7.6에서 적어도 10일의 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.0 내지 7.4에서 적어도 10일의 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 약 37℃, pH 7.2 내지 7.6에서 적어도 10일의 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 반감기는 적어도 약 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 30일 또는 초과이다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 cGMP 검정에서 0.1 내지 10 nM의 EC50을 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 cGMP 검정에서 0.1 내지 25 nM의 EC50을 갖는다.

다양한 실시형태에서, 45% 초과의 변이체 펩타이드는 생리학적 조건, 예를 들어 약 37℃, pH 7.0 내지 7.6에서 수성 배지에서 10일 후 검출된다. 다양한 실시형태에서, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 변이체 펩타이드는 생리학적 조건, 예를 들어 약 37℃, pH 7.0 내지 7.6에서 수성 배지에서 10일 후 검출된다.

다양한 실시형태에서, 45% 초과의 변이체 펩타이드는 37℃, pH 7.4에서 수성 배지에서 10일 후 검출된다. 다양한 실시형태에서, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 변이체 펩타이드는 37℃, pH 7.4에서 수성 배지에서 10일 후 검출된다.

다양한 실시형태에서, 45% 초과의 변이체 펩타이드는 생리학적 조건, 예를 들어 약 37℃, pH 7.0 내지 7.6에서 혈장에서 10일 후 검출된다. 다양한 실시형태에서, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 변이체 펩타이드는 생리학적 조건, 예를 들어 약 37℃, pH 7.0 내지 7.6에서 혈장에서 10일 후 검출된다.

다양한 실시형태에서, 45% 초과의 변이체 펩타이드는 37℃, pH 7.4에서 혈장에서 10일 후 검출된다. 다양한 실시형태에서, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과의 변이체 펩타이드는 37℃, pH 7.4에서 혈장에서 10일 후 검출된다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 지질, 지방산, 친수성 스페이서 또는 링커, 또는 선택적으로 이들의 조합에 접합된다. 다양한 실시형태에서, 링커는 친수성 중합체 모이어티이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 중합체 모이어티는 합성 친수성 중합체 모이어티이다.

다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 Pro-Gly-CNP37과 비교하여 더 긴 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 CNP-22와 비교하여 더 긴 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 Pro-Gly-CNP37 및/또는 CNP-22와 비교하여 더 긴 반감기를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 변이체 펩타이드는 시험관내 및/또는 생체내 Pro-Gly-CNP37 및/또는 CNP-22와 비교하여 더 긴 반감기를 갖는다.

본 개시내용은 본원에 기재된 CNP 변이체 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.

다양한 실시형태에서, 상기 조성물은 약 4 내지 약 6의 pH를 갖는 시트르산/시트레이트 완충액 또는 아세트산/아세테이트 완충액을 포함하는 제형으로부터 제조된 동결건조된 제형이다. 다양한 실시형태에서, 동결건조된 제형은 등장성-조정제 또는 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 트레할로스, 폴리소르베이트 80, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 벌크화제를 추가로 포함하는 제형으로부터 제조된다. 다양한 실시형태에서, 동결건조된 제형은 메티오닌, 아스코르브산, 아스코르브산의 염 형태, 티오글리세롤, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항산화제를 추가로 포함하는 제형으로부터 제조된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체 조성물은 0.8 mg 내지 10 mg의 재구성을 위한 동결건조된 분말로서 공급된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체 조성물은 재구성을 위해 0.8-mg 또는 2-mg의 동결건조된 무보존제 분말로서 공급된다.

다양한 실시형태에서, 상기 조성물은 서방형 조성물이다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(BMN111)(서열 번호 1)이다.

본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 골-관련 장애 또는 골격 이형성증을 치료하는 방법이 또한 제공된다.

다양한 실시형태에서, 골-관련 장애 또는 골격 이형성증은 골관절염, 저인산혈 구루병, 연골무형성증, 연골형성저하증, 저신장, 소인증, 골연골이형성증, 치사성 이형성증, 불완전 골형성, 연골무발생증, 점상 연골형성이상, 동형접합 연골무형성증, 점상 연골형성이상, 굴지 형성이상, 선천성 치사성 저인산증, 불완전 골형성의 신생아 치사형, 단늑골 다지 증후군, 연골형성저하증, 점상 연골형성이상의 지근형, 얀센형 골간단 이형성증, 선천성 척추골단 이형성증, 불완전골형성증, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 랑거형 중간지골 이형성증, 니버겔트형 중간지골 이형성증, 로비노 증후군(Robinow syndrome), 라인하르트 증후군(Reinhardt syndrome), 선단이골증, 말초 이골증, 니스트 이형성증, 섬유연골형성, 로버트 증후군(Roberts syndrome), 사지말단 중간지골 이형성증, 소지증, 모르키오 증후군(Morquio syndrome), 니스트 증후군(Kniest syndrome), 유가영양 이형성증 및 척추골단골간단 이형성증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 특발성 저신장 및 다른 골격 이형성증을 치료하기 위한 성장 호르몬에 부가물 또는 대안으로서 유용하다.

다양한 실시형태에서, 골-관련 장애, 골격 이형성증 또는 저신장 장애는 NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/래리 웨일(Leri Weill)) 또는 PTPN11 돌연변이(누난 증후군(Noonan's syndrome))로부터 생긴다.

다양한 실시형태에서, 골-관련 장애, 골격 이형성증 또는 저신장 장애는 NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/래리 웨일) 또는 PTPN11 돌연변이(누난 증후군) 또는 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R: insulin growth factor 1 receptor)로부터 생긴다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 가족성 저신장, 우성 유전 저신장으로도 공지된 우성 가족성 저신장 또는 특발성 저신장을 포함하는 저신장 및 성장판 장애를 치료하는 데 유용하다. 다양한 실시형태에서, 저신장 또는 성장판 장애는 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인도 고슴도치(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC 또는 FGFR3에서의 돌연변이의 결과이다.

다양한 실시형태에서, 성장판 장애 또는 저신장은 RAS질병과 연관된 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다.

다양한 실시형태에서, 골-관련 장애, 골격 이형성증 또는 저신장 장애는 RAS질병으로부터 생긴다. 다양한 실시형태에서, RAS질병은 누난 증후군, 코스텔로 증후군, 심장-얼굴-피부 증후군, 신경섬유종증 1형 또는 레오파드 증후군(LEOPARD syndrome)이다.

일 실시형태에서, RAS질병은 유전성 치은 섬유종증 1형이다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 가족성 저신장, 우성 유전 저신장으로도 공지된 우성 가족성 저신장 또는 특발성 저신장을 포함하는 저신장 및 성장판 장애를 치료하는 데 유용하다. 다양한 실시형태에서, 저신장 또는 성장판 장애는 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인도 고슴도치(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3 또는 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R)에서의 돌연변이의 결과이다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 -1.0, -1.5, -2.0, -2.5 또는 -3.0 미만의 키 SDS를 갖고, -1.0, -1.5, -2.0 또는 -2.5 미만의 키 SDS를 갖는 적어도 1명의 부모를 갖는 저신장을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하고, 선택적으로 제2 부모는 정상 범위 내의 키를 갖는다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 -2.0 내지 -3.0의 키 SDS를 갖는 저신장을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 -2.0 내지 -2.5의 키 SDS를 갖는 저신장을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 실시형태에서, 저신장은 저신장과 연관된 유전자, 예컨대 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인도 고슴도치(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3 또는 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R), 또는 이들의 조합에서의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다. 다양한 실시형태에서, 성장판 장애 또는 저신장은 RAS질병과 연관된 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다.

다양한 실시형태에서, 저신장은 다유전성 위험 점수(PRS: polygenic risk score)에 의해 결정된 것과 같은 다수의 유전자에서의 돌연변이의 결과이다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 NPR2에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 FGFR3에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 NPR2에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 IGF1R에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 NPPC에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 SHOX에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX 중 하나 이상에서의 하나 이상의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, PRS는 1 또는 2이다. 다양한 실시형태에서, PRS는 1이다. 다양한 실시형태에서, PRS는 2이다. 다유전성 위험 점수(PRS)는 실시예 4에 기재된 것처럼 키에 대해 계산되었다. PRS 1은 가장 작은 키, PRS 5개의 가장 큰 키를 지칭한다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(서열 번호 1)이다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 아세틸 기를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 아세틸 기는 펩타이드의 N 말단 위에 있다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 C 말단에서 OH 또는 NH₂ 기를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 변이체는 상기 기재된 것과 같은 하나 이상의 링커 기를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 링커는 가수분해 가능한 링커이다.

다양한 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CNP 변이체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 골의 신장 또는 긴 골 성장의 증가를 필요로 하는 대상체에서 골을 신장시키거나 긴 골 성장을 증가시키는 방법을 제공하고, 투여는 골을 신장시키거나 긴 골 성장을 증가시킨다.

다양한 실시형태에서, 상기 조성물은 피하로, 진피내로, 관절내로, 경구로 또는 근육내로 투여된다.

일 실시형태에서, CNP 변이체 조성물은 매일 1회, 주마다 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여된다.

다양한 실시형태에서, 상기 조성물은 서방형 조성물이다.

본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계 및 대상체에서 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준을 모니터링하는 단계를 포함하는 CNP-반응성 병태 또는 장애를 치료하는 방법이 추가로 고려되고, 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준의 증가는 대상체 또는 병태 또는 장애에 대한 CNP 펩타이드 또는 변이체의 치료학적 효과를 나타낸다.

구성적으로 활성인 FGFR-3을 발현하는 세포를 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 구성적으로 활성인 돌연변이체 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR-3)에 의해 유도된 세포 성장 정지를 극복하는 방법이 추가로 고려된다.

NPR-B를 발현하는 세포를 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 B(NPR-B)를 발현하는 세포에서 cGMP 제조를 자극하는 방법이 추가로 고려된다.

다양한 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 것과 같은 CNP 펩타이드 또는 변이체의 투여의 양 또는 빈도를 조정하는 단계를 추가로 포함하고, i) 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준이 표적 수준보다 낮으면 CNP 펩타이드 또는 변이체의 투여의 양 또는 빈도는 증가하거나; ii) 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준이 표적 수준보다 높으면 CNP 펩타이드 또는 변이체의 투여의 양 또는 빈도는 감소한다.

다양한 실시형태에서, 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커는 CNP, cGMP, 콜라겐 II형의 프로펩타이드 및 이의 단편, 콜라겐 II형 및 이의 단편, 콜라겐 I형 C-텔로펩타이드(CTx), 오스테오칼신, 증식 세포 핵 항원(PCNA: proliferating cell nuclear antigen), I형 프로콜라겐의 프로펩타이드(PINP) 및 이의 단편, 콜라겐 I형 및 이의 단편, 아그레칸 콘드로이틴 황산염, 콜라겐 X 및 알칼리 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(서열 번호 1)이다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 아세틸 기를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 아세틸 기는 펩타이드의 N 말단 위에 있다. 다양한 실시형태에서, 아세틸 기는 펩타이드 서열 내에서 아미노산 측쇄 위에 있다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 C 말단에서 OH 또는 NH₂ 기를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 변이체는 상기 기재된 것과 같은 하나 이상의 링커 기를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 링커는 가수분해 가능한 링커이다.

Fmoc 아미노산을 사용하여 고상 수지에서 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 CNP 변이체를 제조하는 방법이 또한 제공된다.

다양한 실시형태에서, 상기 방법은 수지를 NMP/Ac₂O/DIEA(10:1:0.1, v/v/v)와 반응시킴으로써 펩타이드를 아세틸화하는 단계를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 방법은 펩타이드를, 선택적으로 리신 잔기 위에, 접합체 모이어티에 접합하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 상기 방법은 리신에서 보호성 아미노 기를 절단하는 단계, 펩타이드를 2x Fmoc-아미노 PEG(2), 이어서 아미노산과 반응시킨 후, 지질 또는 지방산 모이어티를 접합시키는 단계를 포함한다.

도 1은 본원에 기재된 CNP 접합체에서의 펩토이드 또는 전자 링커의 사용을 예시한다.
도 2는 24시간의 기간에 걸친 인간 혈장에서의 CNP 변이체의 안정성을 보여준다.
도 3은 상이한 배양 조건 하에 CNP 변이체의 안정성을 보여준다.
도 43은 cGMP 자극에 의해 측정된 것과 같이 NPR2 동형접합성 또는 이형접합성 돌연변이 중 어느 하나를 보유하는 세포에 대한 CNP 변이체(Pro-Gly-CNP)의 효과를 보여준다.
도 5는 RCS 세포로 형질주입된 NPR2 돌연변이체 클론에서의 제1 엑손의 뉴클레오타이드 및 예측된 단백질 서열을 보여준다.
도 6은 CNP에 대한 반응에 대해 분석된 예시적인 NPR2 돌연변이를 보여준다.
도 7은 FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX에서의 저신장과 연관된 예시적인 돌연변이를 보여준다.
도 8은 키에 대한 PRS 및 희귀 코딩 변이체의 조합 효과를 예시한다. 도 8a. 정량적 특질로서 키에 대한 효과, 샘플은 이의 PRS에 기초하여 5개의 그룹으로 나눠지고, 수평선을 갖는 바이올린-선도는 키의 25%, 50% 및 75% 백분위를 나타낸다. 샘플은 임의의 5개의 코어 유전자에서 미스센스, 기능 소실 또는 무의 상태를 보유함으로써 그룹화된다. 도 8b. "특발성 저신장" 또는 ISS에 대해 오즈비에서 반영된 효과. 기준품으로서 PRS = 3 대 다른 PRS 그룹을 사용한 ISS에 대한 오즈. 도 8c. 코어 유전자에서 기준품으로서 PRS = 1 대 미스센스 및/또는 기능 소실 변이체를 갖는 것을 사용한 ISS에 대한 오즈. 도 8d. 코어 유전자에서 기준품으로서 PRS = 1 비보균자 대 미스센스 및/또는 기능 소실 변이체를 갖는 것을 사용한 ISS에 대한 오즈. 도 8e. 코어 유전자에서 기준품으로서 PRS = 2 비보균자 대 미스센스 및/또는 기능 소실 변이체를 갖는 것을 사용한 ISS에 대한 오즈. 도 8f. 코어 유전자에서 기준품으로서 PRS = 3 비보균자 대 미스센스 및/또는 기능 소실 변이체를 갖는 것을 사용한 ISS에 대한 오즈. g. 코어 유전자에서 기준품으로서 PRS = 4 비보균자 대 미스센스 및/또는 기능 소실 변이체를 갖는 것을 사용한 ISS에 대한 오즈.

본 개시내용은 골격 이형성증 및 골 성장 장애를 치료하는 데 유용한 안정한 CNP 변이체에 관한 것이다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 것과 같이, "일" 및 "하나"와 같은 부정관사 및 "이"와 같은 정관사는, 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한, 복수 지시대상뿐만 아니라 단수 지시대상을 포함한다.

"약" 또는 "대략"이라는 용어는 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지에 따라 부분적으로 달라지는 당업자에 의해 결정된 것과 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 오류를 의미한다. 소정의 실시형태에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 1, 2, 3, 또는 4 표준 편차 내를 의미한다. 소정의 실시형태에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 소정의 값 또는 범위의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.05% 내를 의미한다. "약" 또는 "대략"이라는 용어가 2개 이상의 숫자 값의 시리즈에서 제1 숫자 값에 앞설 때마다, "약" 또는 "대략"이라는 용어가 그 시리즈에서의 숫자 값의 각각의 것에 적용된다고 이해된다.

"C형 나트륨이뇨 펩타이드" 또는 "CNP"라는 용어는 C 말단 끝에서 17-아미노산 루프 구조를 갖는 작은 단일 사슬 펩타이드(CNP 전구체 단백질에 대한 GenBank 수탁 번호 NP_077720, NPPC) 및 이의 변이체를 지칭한다. 17합체 CNP 루프 구조는 CNP 17, CNP 고리 또는 CNP 사이클릭 도메인이라고도 칭한다. CNP는 활성 53-아미노산 펩타이드(CNP-53) 및 성숙 22-아미노산 펩타이드(CNP-22) 및 2개의 펩타이드들 사이의 변하는 길이의 펩타이드를 포함한다.

다양한 실시형태에서, "CNP 변이체"는 동일한 수의 아미노산 잔기에 걸쳐 야생형 NPPC에 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성이다. CNP 변이체 펩타이드가 약 1개 내지 약 53개, 또는 1개 내지 39개, 또는 1개 내지 38개, 또는 1개 내지 37개, 또는 1개 내지 35개, 또는 1개 내지 34개, 또는 1개 내지 31개, 또는 1개 내지 27개, 또는 1개 내지 22개, 또는 10개 내지 35개, 또는 약 15개 내지 약 37개의 NPPC 폴리펩타이드의 잔기를 포함할 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 일 실시형태에서, CNP 변이체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개 또는 53개의 NPPC 폴리펩타이드로부터 유래된 아미노산의 서열을 포함할 수 있다.

"접합체 모이어티"라는 용어는 변이체 펩타이드에 접합된 모이어티를 지칭한다. 접합체 모이어티는 지질, 지방산, 친수성 스페이서, 합성 중합체, 링커, 또는 선택적으로, 이들의 조합을 포함한다.

"유효량"이라는 용어는 대상체의 건강 상태, 병리학 또는 질환에 대해 또는 진단학적 목적을 위해 원하는 결과를 효과를 생성하기에 충분한 투여량을 지칭한다. 원하는 결과는 투여량의 수혜자에서 주관적 개선 또는 객관적 개선을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 건강에 대한 의도된 유리한 효과를 생성하기에 효과적인 물질의 양을 지칭한다. 임의의 개별 사례에서의 적절한 "유효"량은 일상 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 수준 및 투여 빈도가 변할 수 있고, 사용된 특정 화합물의 활성; 생체이용률, 대사 안정성, 그 화합물의 배설률 및 작용 길이; 화합물의 투여의 방식 및 시간; 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 및 특정 병태의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이라고 이해될 것이다.

"실질적으로 순수한" 또는 "단리된"은 대상 종이 존재하는 주요 종이라는 것을 의미하고(즉, 몰 기준으로, 상기 조성물에서 임의의 다른 개별 거대분자 종보다 더 풍부), 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 기준으로)를 포함하는 조성물이다. 일 실시형태에서, 실질적으로 순수한 조성물은 관심 있는 종이 몰 또는 중량 기준으로 상기 조성물에 존재하는 거대분자 종의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 초과를 포함한다는 것을 의미한다. 상기 조성물이 단일 거대분자 종으로 본질적으로 이루어지면 대상 종은 필수 동종성으로 정제된다(오염물질 종은 종래의 검출 방법에 의해 상기 조성물에서 검출될 수 없음). 용매 종, 작은 분자(500 달톤 미만), 안정화제 (예를 들어 BSA) 및 원소 이온 종은 이 정의의 목적을 위해 거대분자 종인 것으로 여겨지지 않는다. 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 실질적으로 순수하거나 단리된다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 이의 제조에 사용된 거대분자 출발 재료와 관련하여 실질적으로 순수하거나 단리된다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제, 및 선택적으로 다른 생물학적 활성제와 혼합된 실질적으로 순수하거나 단리된 CNP 변이체를 포함한다.

"치료"는 예방학적 치료 또는 치료학적 치료 또는 진단학적 치료를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, "치료"는 치료학적 목적, 예방학적 목적 또는 진단학적 목적을 위한 대상체에 대한 화합물 또는 조성물의 투여를 지칭한다.

"예방학적" 치료는 병리학 발생의 위험을 감소시킬 목적을 위해 질환의 징후를 나타내지 않거나 오직 조기 질환 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다. 본 개시내용의 화합물 또는 조성물은 병리학 발생 가능성을 감소시키거나 발생하면 병리학의 중증도를 최소화하는 예방학적 치료로서 주어질 수 있다.

"치료학적" 치료는 병리학의 징후 또는 증상을 감소시키거나 제거하기 위한 목적을 위해 이 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다. 징후 또는 증상은 생화학적, 세포학적, 조직학적, 기능적 또는 신체적, 주관적 또는 객관적일 수 있다. 본 개시내용의 화합물은 또한 치료학적 치료로서 또는 진단을 위해 주어질 수 있다.

"진단학적"은 병리학적 병태의 존재, 정도 및/또는 성질을 확인하는 것을 의미한다. 진단학적 방법은 이의 특이성 및 선택도가 다르다. 특정 진단학적 방법이 병태의 확정적인 진단을 제공할 수는 없지만, 이것은 상기 방법이 진단을 돕는 긍정적인 표시를 제공하면 충분하다.

"골-연관 또는 연골-연관 바이오마커" 또는 "골-연관 또는 연골-연관 마커"는 예를 들어 연골 전환, 연골 형성, 연골 성장, 골 재흡수, 골 형성, 골 성장, 또는 이들의 조합과 연관되어 수준이 증가하거나 감소하는 성장 인자, 효소, 단백질, 또는 다른 검출 가능한 생물학적 물질 또는 모이어티를 지칭한다. 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체의 투여 전에, 동안에 및/또는 후에 이러한 바이오마커가 측정될 수 있다. 예시적인 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커는 CNP, cGMP, 콜라겐 II형의 프로펩타이드 및 이의 단편, 콜라겐 II형 및 이의 단편, 콜라겐 I형의 프로펩타이드 및 이의 단편, 콜라겐 I형 및 이의 단편, 오스테오칼신, 증식 세포 핵 항원(PCNA), 아그레칸 콘드로이틴 황산염, 콜라겐 X 및 알칼리 포스파타제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비제한적인 예로서 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 활액 및 뇨를 포함하는 임의의 적절한 생물학적 샘플에서 연골-연관 및 골-연관 바이오마커가 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 효능/약동학적 생체내 연구를 겪은 동물로부터의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 및/또는 생체외 연구의 조건 배지로부터 측정된다.

"약제학적 조성물" 또는 "제형"은 인간 및 포유류를 포함하는 대상 동물에서 약제학적 용도에 적합한 조성물을 지칭한다. 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 CNP 변이체, 선택적으로 다른 생물학적 활성제, 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함한다. 실시형태에서, 약제학적 조성물은 활성 성분(들), 및 담체를 구성하는 불활성 성분(들)뿐만 아니라 성분들의 임의의 2개 이상의 조합, 복합체화 또는 응집으로부터, 또는 성분들 중 하나 이상의 해리로부터, 또는 성분들 중 하나 이상의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생긴 임의의 생성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 개시내용의 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합함으로써 제조된 임의의 조성물을 포함한다.

"약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 표준 약제학적 담체, 완충액 등, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 덱스트로스의 5% 수성 용액, 및 에멀션(예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀션)을 지칭한다. 부형제의 비제한적인 예는 아쥬반트, 결합제, 충전제, 희석제, 붕괴제, 유화제, 습윤제, 활택제, 유동화제, 감미료, 향미료 및 착색제를 포함한다. 적합한 약제학적 담체, 부형제 및 희석제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)에 기재되어 있다. 바람직한 약제학적 담체는 활성제의 의도된 투여 방식에 따라 달라진다. 통상적인 투여 방식은 장관(예를 들어, 경구) 또는 비경구(예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주사; 또는 국소, 경피 또는 점막경유 투여)를 포함한다.

"약제학적으로 허용 가능한 염"은 비제한적인 예로서 금속 염(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는 약제학적 용도를 위한 화합물로 제형화될 수 있는 염이다.

"약제학적으로 허용 가능한" 또는 "약물학적으로 허용 가능한"이란 생물학적으로 또는 달리 바람직한 재료가 의도되고, 즉 그 재료는 임의의 원치 않는 생물학적 효과를 야기하지 않으면서 또는 이것이 함유된 조성물의 임의의 성분 또는 개체의 신체 상에 또는 내에 존재하는 임의의 성분과 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에 투여될 수 있다.

"생리학적 병태"는 동물(예를 들어, 인간)의 신체에서의 병태를 지칭한다. 생리학적 병태는 체온 및 생리학적 이온 농도의 수성 환경, pH 및 효소를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 생리학적 병태는 또한 대부분의 대상체에 존재하는 "정상" 조건과 다른, 예를 들어 대략 37℃의 정상 인간 체온과 다르거나 대략 7.4의 정상 인간 혈액 pH와 다른 특정 대상체의 신체에서의 상태를 포함한다.

"생리학적 pH" 또는 "생리학적 범위에서의 pH"에 의해 대략 7.0 내지 8.0(포함)의 범위, 더 통상적으로 대략 7.2 내지 7.6(포함)의 범위의 pH가 의도된다.

본원에 사용된 것과 같이, "대상체"라는 용어는 포유류 및 비포유류를 포함한다. 포유류의 예는 임의의 수의 포유류 종: 인간, 비인간 영장류, 예컨대 침팬치, 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 토끼, 개 및 고양이와 같은 가축 동물; 설치류, 예컨대 래트, 마우스 및 기니아 피그 등을 포함하는 실험실 동물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비포유류의 예는 조류, 어류 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 아동 또는 청소년이다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 유아이다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 3세 초과, 2세 초과, 1세 초과 또는 6개월령 초과이다.

C형 나트륨이뇨 펩타이드 변이체

천연 CNP 유전자 및 폴리펩타이드는 이전에 기재되어 있다. 미국 특허 제5,352,770호는 인간 CNP에 대한 서열에서 동일한 돼지 뇌로부터 단리되고 정제된 CNP-22 및 심혈관 적응증을 치료하는 데 있어서의 이의 용도를 개시한다. 미국 특허 제6,034,231호는 pre-proCNP(126개의 아미노산)의 인간 유전자 및 폴리펩타이드 및 인간 CNP-53 유전자 및 폴리펩타이드를 개시한다. 성숙 CNP는 22-아미노산 펩타이드(CNP-22)이다. 소정의 CNP 변이체는 미국 특허 제8,198,242호에 개시되어 있고, 이는 본원에 참고로 포함된다.

다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 CNP는 hCNP-53으로부터 유래된 야생형 아미노산 서열을 갖는 인간 CNP-17(hCNP-17)로부터 인간 CNP-53(hCNP-53)으로의 범위의 절두된 CNP를 포함한다. 이러한 절두된 CNP 펩타이드는

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC

(CNP-53)(서열 번호 56);

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC

(CNP-52)(서열 번호 15);

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC

(CNP-51)(서열 번호 16);

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(서열 번호17);

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(서열 번호 18)

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(서열 번호 19);

KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(서열 번호 20);

SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(서열 번호 21);

RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(서열 번호 22);

AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(서열 번호 23);

AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(서열 번호 24);

WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(서열 번호 25);

ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(서열 번호 26);

RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(서열 번호 27);

LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(서열 번호 28);

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열 번호 2);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열 번호 3);

EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(서열 번호 29);

HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(서열 번호 30);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열 번호 4);

NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(서열 번호 31);

ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(서열 번호 32);

RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(서열 번호 33);

KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(서열 번호 34);

YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(서열 번호 35);

KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(서열 번호 36);

GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(서열 번호 37);

ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(서열 번호 38);

NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(서열 번호 39);

KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(서열 번호 40);

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(서열 번호 41);

GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(서열 번호 68);

LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(서열 번호 42);

SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(서열 번호 43);

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(서열 번호 44);

GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(서열 번호 45); 및

CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(서열 번호 67)를 포함한다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체 펩타이드는 선택적으로 푸린 절단 부위에서 돌연변이(들)/치환(들)(밑줄 표시)을 갖고/갖거나, N 말단에서 글리신 또는 프롤린-글리신을 함유하는 변형된 CNP-37 또는 CNP-38 펩타이드이다. 예시적인 CNP-37 변이체는

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-37(M32N); 서열 번호 46];

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP-37; 서열 번호 47);

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP-37; 서열 번호 48);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP-37(M32N); 서열 번호 49];

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열 번호 1);

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP-37; 서열 번호 50);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP-37: 서열 번호 51)

GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 52);

GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 53);

GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 54); 및

GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호55)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 CNP 변이체는

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 5);

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 1);

PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 6);

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 5);

PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 7);

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC(서열 번호 5); 및

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC(서열 번호 1)를 포함한다.

53개 미만의 아미노산을 갖는 본원에 기재된 임의의 변이체가 펩타이드의 N 말단 끝에 대한 아미노산의 첨가에 의해 연장될 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 예를 들어, CNP 변이체가 wt CNP와 비교하여 변경된 아미노산을 갖는 34합체, 35합체, 36합체, 37합체, 38합체 또는 39합체이면, 이러한 변이체는 CNP53 또는 다른 펩타이드로부터의 야생형 또는 변형된 잔기 중 어느 하나에 의해 N 말단 끝에서 연장될 수 있다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 아세틸 기를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 아세틸 기는 N 말단, C 말단에 있거나, 내부 아미노산 측기에 부착된다. 다양한 실시형태에서, 아세틸 기는 펩타이드의 N 말단에 있다.

다양한 실시형태에서, 펩타이드 변이체는 C 말단에서 OH 또는 NH₂ 기를 추가로 포함한다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8),

Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 9),

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 10),

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 11), 및

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 12)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8),

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 9),

PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 10),

PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 11), 및

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 12)

PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 7)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8),

Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 9),

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 10),

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 11),

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 12);

Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 13); 및

Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 14)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 1)이다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 1)이다.

추가 실시형태에서, 아스파라긴(Asn/N) 잔기(들) 및/또는 글루타민(Gln/Q) 잔기(들)를 갖는 본원에 기재된 임의의 CNP 변이체에 대해, 이들이 야생형 서열 또는 비천연 아미노산 서열을 갖든지, 임의의 Asn 잔기(들) 및/또는 임의의 Gln 잔기(들)는 Asn에서 Gln으로와 같은 보존적 치환을 포함하는 임의의 다른 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산에 의해 독립적으로 치환될 수 있다. 이러한 치환(들)은 부분적으로 아스파라긴 및/또는 글루타민의 임의의 잠재적인 탈아미드화를 최소화하거나 피하도록 설계된다.

추가 실시형태에서, 리신(Lys/K) 잔기(들)를 갖는 본원에 기재된 임의의 CNP 변이체에 대해, 이들이 야생형 서열 또는 비천연 아미노산 서열을 갖든지, 임의의 Lys 잔기(들)는 Lys에서 Arg으로와 같은 치환을 포함하는 임의의 다른 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산에 의해 독립적으로 치환될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 모두 리신 잔기는, CNP 변이체 사이클릭 도메인에서의 Lys 잔기가 임의의 다른 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산에 의해 치환되지 않는 것을 제외하고는, Lys에서 Arg으로와 같은 치환을 포함하는 임의의 다른 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산에 의해 독립적으로 치환된다.

일 실시형태에서, CNP 변이체는 wtCNP22펩타이드에서 지정된 것과 같이 Cys⁶과 Cys²² 사이의 디설파이드 결합의 형성을 통해 고리화된다. Cys⁶은 예를 들어 호모시스테인 또는 페니실라민과 같은 시스테인 유사체일 수 있다. 추가의 실시형태에서, CNP 변이체는 머리-대-꼬리, 측쇄-대-측쇄, 측쇄-대-머리, 또는 측쇄-대-꼬리 형성된 공유 결합에 의해 고리화될 수 있다. 실시형태에서, 공유 결합은 N 말단에서의 또는 이를 향한 아미노산과 펩타이드의 C 말단에서의 또는 이를 향한 아미노산(이 맥락에서의 "말단" 아미노산이라 칭함) 사이에 형성된다. 다른 실시형태에서, 공유 결합은 2개의 말단 아미노산의 측쇄 사이에 형성된다. 또 다른 실시형태에서, 공유 결합은 1개의 말단 아미노산의 측쇄와 다른 말단 아미노산의 말단 기 사이에, 또는 2개의 말단 아미노산의 말단 기 사이에 형성된다.

말단 카복실 기에 대한 말단 아민의 머리-대-꼬리 고리화는 다수의 방법, 예를 들어 p-니트로페닐 에스테르, 2,4,5-트리클로로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 아지드 방법, 혼합 무수물 방법, HATU, 카보디이미드(예를 들어, DIC, EDC 또는 DCC)와 HOBt, HONSu 또는 HOAt와 같은 촉매, 또는 수지 위의 고리화(on-resin cyclization)를 사용하여 수행될 수 있다.

게다가, 사이클릭 구조는 CNP 변이체의 아미노산 잔기 및/또는 말단 아미노산 잔기의 측쇄를 수반하는 브리징 기를 통해 형성될 수 있다. 브리징 기는 펩타이드의 2개의 위치의 고리화를 허용하는 화학 모이어티이다. 브리징 기의 비제한적인 예는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 디설파이드, 우레아, 카바메이트, 설폰아미드 등을 포함한다. 다양한 방법은 이러한 브리징 기를 갖는 단위의 혼입을 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 락탐 브리지(즉, 사이클릭 아미드)는 N 말단 아미노 기 또는 측쇄에서의 아미노 기와 C 말단 카복실산 또는 측쇄, 예를 들어 리신 또는 오르니틴의 측쇄 및 글루탐산 또는 아스파르트산의 측쇄에서의 카복실 기 사이에 형성될 수 있다. 티오에스테르는 C 말단 카복실 기 또는 측쇄에서의 카복실 기와 시스테인 또는 시스테인 유사체의 측쇄에서의 티올 기 사이에 형성될 수 있다.

대안적으로, 티오에테르 결합에 의해 함께 공유 결합된 알라닌 잔기를 연결하기 위해 란티오닌(티오-디알라닌)을 혼입함으로써 가교결합이 형성될 수 있다. 다른 방법에서, 가교결합제, 예컨대 디카복실산(예를 들어, 수베르산(옥탄디온산))은 아미노산 측쇄의 작용기, 예컨대 유리 아미노, 하이드록실 및 티올 기를 연결할 수 있다.

효소 촉매화된 고리화를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 티오에스테르 전구체를 고리화하도록 티로시딘 합성효소의 티오에스터라제 도메인이 사용될 수 있고, 펩타이드 글리콜레이트 페닐알라닐아미드 에스테르를 고리화하도록 수브틸리신 돌연변이체가 사용될 수 있고, p-니트로페닐에스테르를 고리화하도록 항체 리가제 16G3이 사용될 수 있다고 보고되었다. 펩타이드 고리화의 검토를 위해, Davies, J. Peptide Sci., 9: 471-501 (2003)을 참조하고, 이것은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

소정의 실시형태에서, 최종 생성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99%의 순도를 갖는다.

펩타이드 접합체

펩타이드 치료제는 매력적인 생물학적 치료제이지만, 대개 용액 중에 낮은 안정성 및 짧은 반감기에 의해 불리해진다(Tang 등, Eur J Pharm Sci. 102:63-70, 2017). 안정성을 향상시키고/시키거나 반감기를 증가시킴으로써 펩타이드 치료제의 효능을 개선하기 위한 시도는 리포솜 또는 중합체 입자와 같은 생체분해성 입자로 친수성 펩타이드를 캡슐화하기 위한 시도를 포함한다. 그러나, 이는 이들 펩타이드의 양이온성 성질 및 음으로 하전된 중합체의 리포솜과 정전 상호작용하는 이의 능력으로 인해 어렵다(Griesser 등, Int J Pharmaceutics 520:267-274, 2017). 펩타이드 접합체의 생성은 마이크로입자 또는 리포솜으로의 친수성 중합체의 더 양호한 캡슐화가 가능하게 하도록 사용된 하나의 수단이었다(Lu 등, Mol. Pharmaceutics 15:216-225, 2018).

펩타이드는 5개 내지 100개의 아미노산의 스트링일 수 있다. 펩타이드가 펩타이드에서의 하전된 종의 반대인 하전된 종을 갖는 하전된 모이어티, 예를 들어 양이온, 음이온 또는 이들의 조합과 상호작용할 수 있도록, 펩타이드는 양으로 하전된 아미노산, 음으로 하전된 아미노산, 또는 둘 다의 혼합물을 가질 수 있다.

펩타이드가 증가된 안정성 또는 반감기를 부여하는 모이어티, 예를 들어 접합체 모이어티에 복합체화된다는 것이 고려된다. 다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 비공유 결합을 통해 복합체화되거나 공유 결합에 의해 부착된다. 그 모이어티는 정전 상호작용을 통해 펩타이드와 비공유로 부착될 수 있다. 대안적으로, 그 모이어티는 하나 이상의 링커 모이어티를 통해 펩타이드에 공유로 회합될 수 있다. 링커는 절단 가능한 링커 및 절단 불가능한 링커일 수 있다. 절단 가능한 링커는 효소, 친핵성/염기성 시약, 환원제, 광-조사, 친전자성/산성 시약, 유기 금속 시약 및 금속 시약, 또는 산화 시약을 통해 절단될 수 있다. 링커는 또한 자가-희생 링커일 수 있다. 예시적인 링커는 N-숙신이미딜-3-(2-피리디디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수버레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스 (p-아지도벤질) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤질)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 토일렌 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠), 베타 알라닌, 4-아미노부티르산(GABA), 2-아미노에톡시 산(AEA), 아미노에톡시-2-에톡시 아세트산(AEEA), 5 아미노발레르산(AVA), 6-아미노카프로산(Abx), 이웃한 디올 절단 가능한 링커, 트리메틸 잠금 락톤화, p-알콕시페닐 카바메이트, 비신, 펩토이드 또는 비신형 링커, 및 본원에 기재된 것과 같은 전자 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

다양한 실시형태에서, 링커는 CNP 사이클릭 도메인 내의 CNP 변이체의 잔기에 또는 CNP 사이클릭 도메인 이외의 부위에서 부착된다. 다양한 실시형태에서, 링커는 리신 잔기에 부착된다. 다양한 실시형태에서, 링커는 CNP 사이클릭 도메인에서의 리신 잔기에 부착된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 링커를 통해 접합체 모이어티에 부착된다. 다양한 실시형태에서, 링커는 접합체 모이어티의 친수성 스페이서를 통해 접합체 모이어티에 부착된다.

다양한 실시형태에서, 링커는 가수분해 가능한 링커이다.

다양한 실시형태에서, 링커는 펩토이드 또는 전자 링커이다. 다양한 실시형태에서, 링커는 펩토이드 링커이다. 다양한 실시형태에서, 링커는 전자 링커이다. 다양한 실시형태에서, 링커는 SO₂ 모이어티를 포함한다. 예시적인 링커는 도 1에 예시되어 있다. 도 1에서의 링커가 R 기에서 치환에 의해 변형된다는 것이 추가로 고려된다. 예를 들어, 비신형 링커는 하기 도시된 것과 같은 구조를 포함한다:

.

다양한 실시형태에서, 펩타이드에 접합된 모이어티는 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 링커, 지질 모이어티 또는 지방산, 또는 이들의 조합이다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 지방산, 아미노산, 스페이서 및 링커와 접합된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 지방산, 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 스페이서 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체 스페이서 및 링커와 접합된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 지방산, 아미노산, 스페이서 및 링커와 접합되고, 스페이서는 치환된 C-6 내지 C-20 알킬 사슬 또는 임의의 아미노산, 또는 둘 다의 조합을 포함하고, 알킬 사슬의 탄소 원자는 O, NH, N(C-1 내지 C-6 알킬) 또는 카보닐 기 중 하나 이상에 의해 대체될 수 있다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 지방산과 접합된다. 지질 기술은 CNP 변이체의 혈청 반감기를 증가시켜 덜 빈번한 주사 및/또는 개선된 경구 전달을 허용한다고 가정된다. 다양한 실시형태에서, 지방산은 짧은 사슬, 중간 사슬, 긴 사슬 지방산, 또는 디카복실릭 지방산이다. 다양한 실시형태에서, 지방산은 포화 또는 불포화이다. 다양한 실시형태에서, 지방산은 C-6 내지 C-20 지방산이다. 다양한 실시형태에서, 지방산은 C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, C-16, C-18 또는 C-20 지방산이다. 다양한 실시형태에서, 지방산은 데칸산, 도데칸산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산 또는 이들의 이산이다. 다양한 실시형태에서, 지방산은 리신 잔기에 접합된다.

다양한 실시형태에서, 본원에 기재된 CNP 변이체가 본원에 기재된 것과 같은 접합체 모이어티를 포함한다는 것이 고려된다. 접합체 모이어티가 CNP 사이클릭 도메인의 잔기 위에 또는 CNP 사이클릭 도메인이 아닌 부위에서 있다는 것이 고려된다. 다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 리신 잔기 위에 있다. 다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 하나 이상의 산 모이어티를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 산 모이어티는 지방산이다.

다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 친수성 스페이서에 연결된 산 모이어티를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 치환된 C-6 내지 C-20 알킬 사슬 또는 임의의 아미노산, 또는 둘 다의 조합이고, 알킬 사슬의 탄소 원자는 O, NH, N(C-1 내지 C-6 알킬) 또는 카보닐 기 중 하나 이상에 의해 대체될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 임의의 아미노산이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 감마 글루탐산(γGlu)이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 치환된 C-6 내지 C-20 알킬 사슬이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 치환된 C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, C-16, C-18 또는 C-20 알킬 사슬이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 치환된 C-9 내지 C-18 알킬 사슬이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 치환된 C-18 알킬 사슬이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 치환된 C-9 알킬 사슬이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 하나 이상의 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산) 기이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 1개 또는 2개의 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산) 기이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산)이다. 다양한 실시형태에서, 스페이서는 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산) 또는 γGlu이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 하나 이상의 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산) 기에 연결된 감마 글루탐산(γGlu)이다. 다양한 실시형태에서, 친수성 스페이서는 1개 또는 2개의 OEG(8-아미노-3,6-디옥사옥탄산) 기(diEG)에 연결된 감마 글루탐산(γGlu)이다. 다양한 실시형태에서, 산 모이어티 및 친수성 스페이서는 구조 AEEA-AEEA-γGlu-C18DA를 갖는다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8)의 구조를 갖는다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC, Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 1), 또는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 1)의 구조를 갖는다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 상기 펩타이드의 Asn에서의 Glu 변이체를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 본 개시내용은 친수성 중합체 또는 수용성 중합체(예를 들어, 산소화된 알킬 사슬(여기서, 탄소 원자는 하나 이상의 산소 원자에 의해 대체될 수 있음), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 등)의 사용을 고려한다. 다양한 실시형태에서, 수용성 중합체는 유형이 변할 수 있다(예를 들어, 동종중합체 또는 공중합체; 랜덤 공중합체, 교호 공중합체 또는 블록 공중합체; 선형 또는 분지형; 다분산성 또는 다분산성), 연결(예를 들어, 아미드, 이민, 아미날, 알킬렌 또는 에스테르 결합과 같은 예를 들어 가수분해 가능한 연결 또는 안정한 연결), 접합 부위(예를 들어, N 말단, 내부, 및/또는 C 말단에서), 및 길이(예를 들어, 약 0.2, 0.4 또는 0.6 kDa 내지 약 2, 5, 10, 25, 50 또는 100 kDa). 친수성 중합체 또는 수용성 중합체는 당업자에게 공지된 것처럼 N-하이드록시 숙신이미드(NHS)계 또는 알데하이드계 화학물질 또는 다른 화학물질에 의해 CNP 변이체에 접합될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 음으로 하전된 PEG-CNP 변이체는 비제한적인 예로서 카복실화된 화합물, 설페이트화된 화합물 및 포스포릴화된 화합물의 사용을 포함하는 감소된 신장 청소율에 대해 설계될 수 있다(Caliceti, Adv. Drug Deliv. Rev., 55: 1261-77 (2003); Perlman, J. Clin. Endo. Metab., 88: 3227-35 (2003); Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo., 29: 440-444 (1986); Vehaskari, Kidney Int'l, 22: 127-135 (1982)). 일 실시형태에서, PEG(또는 PEO) 모이어티는 카복실 기(들), 설페이트 기(들), 및/또는 포스페이트 기(들)를 함유한다.

다른 실시형태에서, 본원에 기재된 CNP 변이체의 N 말단, C 말단 및/또는 내부 부위(들)에 접합된 친수성 중합체(예를 들어, PEG 또는 PEO) 모이어티는 생리학적 조건 하에 양으로 하전된 하나 이상의 작용기를 함유한다. 이러한 모이어티는 특히 연골 조직에 대한 이러한 접합된 CNP 변이체의 분포를 개선하도록 설계된다. 일 실시형태에서, PEG 모이어티는 하나 이상의 1차, 2차 또는 3차 아미노 기, 4차 암모늄 기, 및/또는 다른 아민-함유(예를 들어, 우레아) 기를 함유한다.

제조 방법

CNP 변이체 및 선택적으로 본원에 기재된 것과 같은 접합체 모이어티를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 본원에 또한 고려된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 표준 단백질 합성 화학을 사용하여 합성으로 제조된다. 예를 들어, 펩타이드는 고상 수지 및 표준 Fmoc 화학을 사용하여 단계별로 합성된다. 펩타이드는 트리-플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 수지로부터 절단되고, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 정제된다.

다양한 실시형태에서, 상기 방법은 수지를 NMP/Ac₂O/DIEA와 선택적으로 10:1:0.1, v/v/v로 반응시킴으로써 펩타이드를 아세틸화하는 단계를 추가로 포함한다.

펩타이드가, 선택적으로 리신 잔기 위에, 접합체 모이어티에 접합되는 방법이 추가로 제공된다. 리신에서 보호성 아미노 기를 절단하는 단계, 펩타이드를 2x Fmoc-아미노 PEG(2), 이어서 아미노산과 반응시킨 후, 지질 또는 지방산 모이어티를 접합시키는 단계를 포함하는 단계. 다양한 실시형태에서, 접합체 모이어티는 하나 이상의 지질 또는 지방산 및 소수성 스페이서를 포함한다.

상기 방법은 수지로부터의 펩타이드를 트리-플루오로아세트산과 접촉시켜 절단하는 단계 및 역상-HPLC에 의해 펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 제공한다.

소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 CNP 변이체는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 융합 폴리펩타이드를 발현시키는 조건 하에 절단 가능한 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 연결된 CNP 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 재조합 공정에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 절단 가능한 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 연결된 CNP 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된다. 소정의 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 가용성 단백질로서 또는 봉입체로서 발현된다. 발현된 융합 폴리펩타이드는 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 단리될 수 있고, 단리된 융합 폴리펩타이드는 CNP 변이체를 방출하도록 절단제와 접촉할 수 있다.

숙주 세포, 발현 벡터, 절단 가능한 펩타이드 및 배양 매개변수의 사용을 포함하는 CNP 변이체 펩타이드를 제조하는 방법은 미국 특허 제8,198,242호에 개시되어 있고, 이것은 본원에 참고로 포함된다.

사용 방법

연골무형성증은 연골 형성의 비정상을 야기하는 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR-3)에 대한 유전자에서의 상염색체 우성 돌연변이의 결과이다. FGFR-3은 보통 연골세포 성장 및 그러므로 골 성장에 음성의 조절 효과를 갖는다. 연골무형성증에서, FGFR-3의 돌연변이된 형태는 구성적으로 활성이고, 이는 골을 심하게 짧아지게 한다. 인간에서, FGFR-3의 활성화 돌연변이는 유전 소인증의 주요 원인이다. 활성화된 FGFR-3을 갖는 마우스는 골격 이형성증의 가장 흔한 형태인 연골무형성증의 모델로서 작용하고, CNP의 과발현은 이들 동물이 소인증을 모면하게 한다. 따라서, CNP의 기능적 변이체는 다양한 골격 이형성증의 치료를 위한 잠재적인 치료제이다.

기질 제조, 연골세포의 증식 및 분화를 자극하고 긴 골 성장을 증가시킴으로써, 본 개시내용의 CNP 변이체는 골-관련 장애, 예컨대 골격 이형성증을 겪는 인간을 포함하는 포유류를 치료하는 데 유용하다. CNP-반응성 골-관련 장애 및 골격 이형성증의 비제한적인 예는 연골무형성증, 연골형성저하증, 저신장, 소인증, 골연골이형성증, 치사성 이형성증, 선천성 골형성, 연골무발생증, 선천성 연골형성이상, 동형접합 연골무형성증, 선천성 연골형성이상, 굴지 형성이상, 선천성 치사성 저인산증, 선천성 골형성의 신생아 치사형, 단늑골 다지 증후군, 연골형성저하증, 선천성 연골형성이상의 지근형, 얀센형 골간단 이형성증, 선천성 척추골단 이형성증, 불완전골형성증, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 랑거형 중간지골 이형성증, 니버겔트형 중간지골 이형성증, 로비노 증후군, 라인하르트 증후군, 선단이골증, 말초 이골증, 니스트 이형성증, 섬유연골형성, 로버트 증후군, 사지말단 중간지골 이형성증, 소지증, 모르키오 증후군, 니스트 증후군, 유가영양 이형성증 및 척추골단골간단 이형성증을 포함한다. 본원에 고려되는 저신장, 성장판 장애, 골-관련 장애 또는 골격 이형성증은 NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/래리 웨일) 및 PTPN11 돌연변이(누난 증후군)와 관련된 장애를 포함한다.

기질 제조, 연골세포의 증식 및 분화를 자극하고 긴 골 성장을 증가시킴으로써, 본 개시내용의 CNP 변이체는 골-관련 장애, 예컨대 골격 이형성증을 겪는 인간을 포함하는 포유류를 치료하는 데 유용하다. CNP-반응성 골-관련 장애 및 골격 이형성증의 비제한적인 예는 연골무형성증, 연골형성저하증, 저신장, 소인증, 골연골이형성증, 치사성 이형성증, 선천성 골형성, 연골무발생증, 선천성 연골형성이상, 동형접합 연골무형성증, 선천성 연골형성이상, 굴지 형성이상, 선천성 치사성 저인산증, 선천성 골형성의 신생아 치사형, 단늑골 다지 증후군, 연골형성저하증, 선천성 연골형성이상의 지근형, 얀센형 골간단 이형성증, 선천성 척추골단 이형성증, 불완전골형성증, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 랑거형 중간지골 이형성증, 니버겔트형 중간지골 이형성증, 로비노 증후군, 라인하르트 증후군, 선단이골증, 말초 이골증, 니스트 이형성증, 섬유연골형성, 로버트 증후군, 사지말단 중간지골 이형성증, 소지증, 모르키오 증후군, 니스트 증후군, 유가영양 이형성증 및 척추골단골간단 이형성증을 포함한다. 본원에 고려되는 저신장, 성장판 장애, 골-관련 장애 또는 골격 이형성증은 NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/래리 웨일), PTPN11 돌연변이(누난 증후군) 및 IGF1R 돌연변이와 관련된 장애를 포함한다.

상기 방법에 의해 고려되는 추가 저신장 및 성장판 장애는 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인도 고슴도치(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC 또는 FGFR3에서의 돌연변이와 관련된 장애를 포함한다.

상기 방법에 의해 고려되는 추가 저신장 및 성장판 장애는 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인도 고슴도치(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3 또는 IGF1R에서의 돌연변이와 관련된 장애를 포함한다.

추가로, CNP 변이체는 특발성 저신장 및 다른 골격 이형성증을 치료하기 위한 성장 호르몬에 부속물 또는 대안으로서 유용하다.

성장판 장애는 저신장 또는 비정상 골 성장을 생성시키고 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인도 고슴도치(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC 또는 FGFR3을 포함하는 골 성장에 관여된 유전자에서의 유전 돌연변이의 결과일 수 있는 장애를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 성장판 장애는 저신장 또는 비정상 골 성장을 생성시키고 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인도 고슴도치(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3 또는 IGF1R을 포함하는 골 성장에 관여된 유전자에서의 유전 돌연변이의 결과일 수 있는 장애를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 성장판 장애 또는 저신장은 RAS질병과 연관된 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다. 다양한 실시형태에서, 성장판 장애를 갖는 대상체는 성장판 유전자에서의 돌연변이에 대해 이형접합성이다. 다양한 실시형태에서, 돌연변이는 기능 소실 돌연변이이다. 다양한 실시형태에서, 돌연변이는 기능 이득 돌연변이이다. 성장판 장애는 가족성 저신장, 우성 유전된 저신장으로도 공지된 우성 가족성 저신장 또는 특발성 저신장을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, Plachy 등, J Clin Endocrinol Metab 104: 4273-4281, 2019를 참조한다.

ACAN에서의 돌연변이는 가족성 이단성 골연골염 및 저신장 및 결국에는 연골의 박리에 의해 생기는 골 손상(또는 병변)의 부위와 때때로 관절에서의 골의 끝으로부터의 골을 특징으로 하는 골관절염을 생성시킨다. 성장하는 골에서의 와해된 연골망이 이의 성장을 손상시켜 저신장으로 이어진다고 제시되어 있다. ACAN 및 저신장과 연관된 돌연변이는 Val2303Met를 포함한다. Stattin 등, Am J Hum Genet 86(2):126-37, 2010을 참조한다. 투여가 CNP와 FGFR3의 공지된 상호작용에 의해 이들 환자에서 키를 증가시킬 수 있으므로 저신장을 생성시키는 ACAN에서의 돌연변이를 갖는 환자가 CNP에 의한 치료로부터 이익일 것이라는 것이 고안된다.

수용체 NPR2를 포함하는 나트륨이뇨 펩타이드 시스템이 연골내 골 성장의 조절에 관여된다고 밝혀졌다(Vasques 등, Horm Res Pediat 82:222-229, 2014). 연구는 NPR2에서의 동형접합성 또는 합성 이형접합성 기능 소실 돌연변이가 극도로 저신장을 갖는 골격 이형성증인 사지말단 중간지골 이형성증 유형 마르토(AMDM: acromesomelic dysplasia type Maroteaux)를 야기한다는 것을 나타냈다(상기 Vasquez 등, 2014, 문헌). 저신장의 원인으로서 이형접합성 기능 소실(예컨대, 우성 음성) NPR2 돌연변이를 시사하는 보고가 있고, 여기서 기능 이득 NPR2 이형접합성 돌연변이는 고신장의 원인인 것으로 밝혀졌다(상기 Vasquez 등, 2014 문헌). cGMP 생성을 자극하기 위한 CNP의 NPR2와의 상호작용의 검토에서, 증가하는 cGMP 수준은 이들 병태에서 바람직하고, 이들 질환 및 병태로부터의 합병증의 관리에서 치료학적 이익을 가질 것이다.

NPR2의 이형접합성 돌연변이는 특발성 저신장 및 저신장의 다른 형태를 발생시킨다고 여겨진다. NPR2 유전자에서의 돌연변이가 하기 기재되어 있고, 본원에 참고로 포함된 Amano 등, J Clin Endocrinol Metab 99:E713-718, 2014, Hisado-Oliva 등, J Clin Endocrinol Metab 100:E1133-1142, 2015 및 Vasques 등, J Clin Endocrinol Metab 98:E1636-1644, 2013에 기재되어 있다. 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체에 의해 치료되는 저신장을 갖는 대상체가 -1.0, -1.5, -2.0, -2.5 또는 -3.0 미만의 키 SDS를 갖고, -1.0, -1.5, -2.0 또는 -2.5 미만의 키 SDS를 갖는 적어도 1명의 부모를 갖고, 선택적으로 제2 부모가 정상 범위 내의 키를 갖는다는 것이 고려된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 -2.0 내지 -3.0의 키 SDS를 갖는 저신장을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 -2.0 내지 -2.5의 키 SDS를 갖는 저신장을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 그러나, NPR2에서의 신생 돌연변이가 -1.5, -2.0, -2.5 또는 -3.0 미만의 키 SDS에 의해 정의된 것과 같은 저신장을 생성시킬 수 있으므로, 어느 부모도 저신장을 갖지 않는 NPR2에서의 해로운 돌연변이의 이형접합성 보균자인 개체의 치료가 또한 고려된다. 신장을 개선하고/하거나 골 성장을 향상시키기 위해 CNP에 의한 다른 성장판 유전자에서의 해로운 돌연변이에 대해 이형접합성인 개체의 치료가 추가로 고려된다.

CNP 변이체에 의해 치료될 수 있는 환자에서의 예시적인 NPR2 돌연변이는 하기를 포함한다:

골격 성장에서의 NPPC의 역할은 잘 기록되어 있다(Hisado-Oliva 등, Genetics Medicine 20:91-97, 2018). NPPC 넉아웃 마우스는 사지 짧아짐 및 연골내 골화를 포함하는 소인증의 심각한 비균등 형태를 보여주었다(상기 Hisado-Oliva 등, 2018 문헌). 인간 게놈 수준 연구는 NPPC와 키 사이의 연관을 나타냈다(상기 Hisado-Oliva 등, 2018, 문헌). CNP 반수체기능부전이 인간에서 저신장의 원인인 것으로 여겨지지만, 최근의 연구는 저신장 및 짧은 손을 갖는 가족에서 이형접합성 돌연변이를 확인하였다(상기 Hisado-Oliva 등, 2018, 문헌). 이들 연구는 이형접합성 상태에서 측정된 것과 같은 상당한 cGMP 생성의 감소를 관찰하였다(상기 Hisado-Oliva 등, 2018 문헌). NPPC에서의 돌연변이는 Gly119Cys 변경을 야기하는 355G>T 미스센스 돌연변이 및 Arg117Gly 변경을 야기하는 349C>G 미스센스 돌연변이를 포함한다. cGMP 생성을 면하게 하는 CNP 변이체는 이형접합성 기능 소실 NPPC 돌연변이를 갖는 환자에서 장애의 관리에서 치료 이익을 제공할 수 있다.

래리 웨일 연골뼈형성이상증(LWD: Leri-Weill dyschondrosteosis)은 전완 및 하퇴의 짧아짐, 비정상 손목 정렬불량(손목의 마델룽 변형) 및 연관된 저신장을 특징으로 하는 희귀 유전 장애이다. LWD는 저신장 호메오박스 함유(SHOX) 유전자 또는 성 염색체의 유사상염색체 영역 1(PAR1)에 위치한 이의 조절 요소에서의 이형접합성 돌연변이에 의해 아기된다. (the Rare Disease Database and Carmona 등, Hum Mol Genet 20:1547-1559, 2011을 참조한다). 장애 랑게르 중간지골 이형성증은 2개의 SHOX 돌연변이가 있을 때 생기고, 동형접합성 또는 합성 이형접합성 돌연변이 중 어느 하나인 각각의 염색체에서의 돌연변이로부터 생길 수 있다. SHOX 돌연변이의 하위집단은 특발성 저신장을 생성시킨다. 터너 증후군은 SHOX 유전자를 포함할 수 있는 X 염색체에서의 결실로 인해 생긴다. SHOX는 FGFR3　전사의 조절 및 골 성장의 제어에 대한 기여에 관여되면서 확인되었다(Marchini 등, Endocr Rev. 37: 417-448, 2016). SHOX 결핍증은 증가된 FGFR3 신호전달을 야기하고, SHOX가 또한 CNP/NPR2와의 직접적인 상호작용을 갖는다는 것을 뒷받침하기 위한 약간의 증거가 있다(상기 Marchini 문헌). SHOX와 FGFR3 및 골 성장의 연관을 고려하면, 동형접합성 또는 이형접합성 SHOX 돌연변이를 갖는 대상체가 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체에 의한 치료로부터 이익일 것이라는 것이 고려된다.

RAS질병은 Ras/미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 경로의 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된 희귀 유전 병태의 그룹이다. RAS질병은 RAS/MAPK 경로를 통한 증가된 신호전달을 특징으로 하는 장애의 그룹이다. 이 경로는 RAF/MEK/ERK 경로의 하류 활성화를 야기한다. 저신장은 소정의 RAS질병의 특징적인 특징이다. 예를 들어, CNP 신호전달은 RAF를 억제하고, MEK 및 ERK 활성화를 감소시킨다.

RAS질병의 치료가 본원에서 고려된다. 저신장과 연관된 RAS질병은 누난 증후군, 코스텔로 증후군, 심장-얼굴-피부 증후군, 신경섬유종증 1형 및 LEOPARD 증후군을 포함한다. 유전성 치은 섬유종증 1형은 또한 본원에 고려되는 RAS질병이다. RAS질병 환자(누난 증후군, 코스텔로 증후군, 심장-얼굴-피부 증후군, 신경섬유종증 1형, LEOPARD 증후군, 유전성 치은 섬유종증 1형을 포함)는 BRAF, CBL, HRAS, KRAS, LZTR1, MAP2K1, MAP2K2, MRAS, NF1, NRAS, PPP1CB, PTPN11, RAF1, RRAS, RIT1, SHOC2, SOS1 또는 SOS2의 유전자들 중 하나 이상에서 이형접합성 변이체를 갖는 환자를 포함한다(Tajan 등 Endocr. Rev. 2018;39(5):676-700).

CFC는 K-Ras, B-Raf, Mek1 및 Mek2를 포함하는 Ras/MAPK 신호전달 경로에서의 몇몇 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다. 얼굴피부골격(FCS) 증후군이라고도 칭하는 코스텔로 증후군은 H-Ras 유전자에서의 활성화 돌연변이에 의해 야기된다. 유전성 치은 섬유종증 I형(HGF)은 SOS1 유전자에서의 우성 돌연변이에 의해 야기되고(선 오브 세븐리스 동족체 1(Son of Sevenless homolog 1)), 이는 작은 GTPase의 Ras 슈퍼패밀리에 작용하는 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(SOS: guanine nucleotide exchange factor)를 암호화한다. 신경섬유종증 I형(NF1)은 Ras/MAPK 신호전달 경로의 음성 조절자를 암호화하는 뉴로피브로민 1 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다. 누난 증후군(NS)은 SHP2 및 SOS1뿐만 아니라 K-Ras 및 Raf-1을 암호화하는 PTPN11을 포함하는 몇몇 유전자 중 하나에서의 돌연변이에 의해 야기된다.

CNP는 RAS질병 모델에서 효과적인 치료인 것으로 입증되었다. Ono 등은 II형 콜라겐 생성 세포에서 Nf1이 결핍된 마우스를 생성하였다(Ono 등, Hum. Mol. Genet. 2013;22(15):3048-62). 이들 마우스는 구성적 ERK1/2 활성화, 및 감소된 연골세포 증식 및 성숙을 입증하였다. 이들 마우스에서의 CNP의 매일의 주사는 ERK 인산화를 감소시키고 저신장을 보정하였다. Braf 돌연변이(p.Q241R)를 사용한 심장-얼굴-피부 증후군의 마우스 모델(Inoue 등 Hum. Mol. Genet. 2019;28(1):74-83)은 야생형과 비교하여 더 적은 증식성 및 비후성 구역과 함께 신체 길이의 감소 및 성장판 폭의 감소를 나타냈고, CNP 투여는 이들 동물에서 신체 길이를 증가시켰다.

다수의 유전자에서의 돌연변이는 저신장, 심장 결함, 출현 문제 및 골격 기형을 특징으로 하는 누난 증후군을 야기할 수 있다. PTPN11 유전자에서의 돌연변이는 누난 증후군의 모든 사례의 대략 절반을 야기한다. SOS1 유전자 돌연변이는 추가 10% 내지 15%를 야기하고, RAF1 및 RIT1 유전자는 각각 사례의 약 5%를 차지한다. 다른 유전자에서의 돌연변이는 각각 적은 수의 사례를 차지한다. 이 장애를 갖는 사람의 15% 내지 20%에서의 누난 증후군의 원인은 미지이다.

PTPN11, SOS1, RAF1 및 RIT1 유전자는 모두 세포 분열 및 성장(증식), 분화, 및 세포 이동에 필요한 RAS/MAPK 세포 신호전달 경로에 중요한 단백질을 암호화한다. 누난 증후군과 연관된 유전자에서의 많은 돌연변이가 생성된 단백질이 자극되게 하고(활성), 이 연장된 활성화는 정상 RAS/MAPK 신호전달을 변경하고, 이는 세포 성장 및 분열의 조절을 파괴하여 누난 증후군의 특징적인 특징으로 이어진다. 예를 들어, Chen 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 111(31):11473-8, 2014, Romano 등, Pediatrics. 126(4):746-59, 2010 및

등, Am J Med Genet 170(7):1874-80, 2016을 참조한다. MAPK 경로를 활성화하는 돌연변이를 갖는 대상체가 골 성장 및 저신장을 개선하기 위해 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체에 의한 치료로부터 이익일 것이라는 것이 고려된다. MAPK 경로를 활성화하는 돌연변이를 갖는 대상체가 신체에 걸쳐 다른 세포에서 과활성 MAPK 경로와 연관된 다른 공존이환을 개선하기 위해 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체에 의한 치료로부터 이익일 것이라는 것이 고려되고, 여기서 NPR2 수용체는 이의 표면에서 발현된다.

비수용체 단백질 티로신 포스파타제 SHP-2를 암호화하는 PTPN11 유전자에서의 돌연변이는 누난 증후군과 같은 저신장을 특징으로 하는 장애를 야기한다(Musente 등, Eur J Hum Genet 11:201-206 (2003)). Musente(상기)는 저신장으로 이어지는 PTPN11 유전자에서의 많은 돌연변이를 확인한다. 기능 획득 돌연변이는 SHP2를 통한 과활성 신호전달로 이어지고, 성장 호르몬-유도된 IGF-1 방출을 억제하고, 이로써 골 성장의 감소에 기여한다(Rocca Serra--

, PNAS 109:4257-4262, 2012). 동형접합성 또는 이형접합성 PTPN11 돌연변이를 갖는 대상체가 골 성장 및 저신장을 개선하기 위해 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체에 의한 치료로부터 이익일 것이라는 것이 고려된다.

연골내 골화의 조절과 관련된 인도 고슴도치(IHH) 유전자에서의 돌연변이는 저신장 증후군과 또한 연관되었다(Vasques 등, J Clin Endocrinol Metab. 103:604-614, 2018). 확인된 많은 IHH 돌연변이는 우성 유전 패턴에서의 저신장과 구별된다. IHH의 골 성장 및 골화와의 연관을 고려하면, 동형접합성 또는 이형접합성 IHH 돌연변이를 갖는 대상체가 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체에 의한 치료로부터 이익일 것이라는 것이 고려된다.

N540K 및 K650N을 포함하는 FGFR3에서의 돌연변이는 저신장 및 연골형성저하증으로 이어진다.

인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R)는 고유 키나제 활성을 갖는 이종사합체(α2β2) 막관통 당단백질이다. IGF1R은 출생전 및 출생후 성장에서 역할을 갖는 것으로 나타났다. IGF1R에서의 이형접합성 돌연변이는 가족성 저신장을 갖는 부당 경량아 아동(SGA: Small for gestational age) 및 개체에 대해 확인되었다(Kawashima 등, Endocrine J. 59:179-185, 2012). 저신장과 연관된 IGF1R에서의 돌연변이는 R108Q/K115N, R59T, R709Q, G1050K, R481Q, V599E 및 G1125A를 포함한다(상기 Kawashima 문헌).

키는 수백 또는 수천개의 유전자의 조합 효과에 의해 영향을 받을 수 있는 매우 유전적인 특질이다(Wood 등, 2014, Nature Genetics, 46:1173-1189). 개체에서의 저신장은 주요 기여자인 단일 유전자 없이 이들 유전자의 조합 효과의 결과일 수 있다. -1.0, -1.5, -2.0, -2.5 또는 -3.0 미만의 키 SDS에 의해 정의된 저신장을 갖는 이러한 개체가 정상 동물의 길이를 증가시키는, 예를 들어 골 성장 및 골의 길이를 향상시키는 CNP의 능력을 고려하면 CNP 변이체에 의해 유리하게 치료될 수 있다는 것이 고려된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 -1.0, -1.5, -2.0, -2.5 또는 -3.0 미만의 키 SDS를 갖고, -1.0, -1.5, -2.0 또는 -2.5 미만의 키 SDS를 갖는 적어도 1명의 부모를 갖는 저신장을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하고, 선택적으로 제2 부모는 정상 범위 내의 키를 갖는다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 -2.0 내지 -3.0의 키 SDS를 갖는 저신장을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 -2.0 내지 -2.5의 키 SDS를 갖는 저신장을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 실시형태에서, 저신장은 저신장과 연관된 유전자, 예컨대 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인도 고슴도치(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3 또는 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R), 또는 이들의 조합에서의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다.

다양한 실시형태에서, 저신장은 다유전성 위험 점수(PRS)에 의해 결정된 것과 같은 다수의 유전자의 돌연변이의 결과이다. 다유전성 위험 점수(PRS)는 실시예 4에 기재된 것과 같이 UK Biobank 프로젝트로부터의 임의의 샘플을 포함하지 않는 키에 대한 가장 큰 공개된 GWAS 메타-분석을 사용하여 키에 대해 계산되었다. 코호트를 5개의 PRS 사분위(PRS 1은 가장 낮은 키이고, PRS 5는 가장 큰 키임)로 나눴다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 NPR2에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 FGFR3에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 NPR2에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 IGF1R에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 NPPC에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 SHOX에서의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX 중 하나 이상에서의 하나 이상의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 실시형태에서, PRS는 1 또는 2이다. 다양한 실시형태에서, PRS는 1이다. 다양한 실시형태에서, PRS는 2이다.

게다가, CNP 변이체는 다른 골-관련 병태 및 장애, 예컨대 구루병, 저인산혈 구루병[X-연관 저인산혈 구루병(비타민 D-저항성 구루병이라고도 칭함) 및 상염색체 우성 저인산혈 구루병을 포함] 및 골연화증[종양-유도된 종양성 골연화증(종양발생 골연화증 또는 종양발생 저인산혈 골연화증이라고도 칭함)을 포함]을 치료하는 데 유용하다.

본 개시내용의 CNP 변이체는 또한 골관절염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 골관절염은 관절 연골의 퇴행성 질환이고, 노인에서 자주 발생한다. 골관절염은, 속발성 관절염(예를 들어, 활막염)을 생성시키는 변화로, 관절 구조의 퇴행으로부터 생기는 골 및 연골의 증식성 변화 및 연골의 파괴를 수반한다. 골관절염에서 연골의 기능적 실체인 세포외 기질 단백질은 감소되고, 연골세포의 수는 감소한다(Arth. Rheum. 46(8): 1986-1996 (2002)). 기질 제조, 연골세포의 성장 및 분화를 촉진함으로써, CNP 조성물은 FGF-2의 원치 않는 효과에 대응하고 골관절염을 포함하는 관절염을 겪는 대상체에서 기질 합성을 증가시키는 데 유용하고, 이로써 골관절염을 포함하는 관절염을 치료한다.

소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 CNP 변이체 및 이를 포함하는 조성물 및 제형은 골격 이형성증의 증상(들) 또는 생리학적 결과 중 하나 이상을 개선하는 데 유용하고, 개선은 절대 성장의 증가, 성장 속도의 증가, 정량적 컴퓨터 단층촬영(QCT) 골 무기질 밀도의 증가, 성장판 형태의 개선, 긴 골 성장의 증가, 척추 형태의 개선, 팔꿈치 관절 운동 범위의 개선 및/또는 수면 무호흡의 감소일 수 있다. 이와 관련하여, "개선된", "개선", "증가한다", "감소한다"와 같은 용어 및 이의 문법 균등물이 질환 상태의 증상 또는 생리학적 결과와 관련하여 사용될 때 본 발명의 CNP 변이체(또는 이를 포함하는 조성물 또는 제형)에 의한 치료 전의 질환의 동일한 증상 또는 생리학적 결과와 비교하여(즉, "기준선"과 비교하여) 본 발명의 CNP 변이체(또는 이를 포함하는 조성물 또는 제형)에 의한 치료 후의 질환의 증상 또는 생리학적 결과의 상태를 지칭하는 모든 상대 용어라는 것이 주목된다. 상기 기재된 것과 같이, "기준선" 상태는 치료 전의 대상체에서의 상태의 측정을 통해(후속하여 치료 후의 동일한 대상체에서의 상태와 비교될 수 있음), 또는 동일한 또는 유사한 특징(예를 들어, 연령, 성별 및/또는 질환 상태 또는 진행)을 공유하는 동일한 고통을 겪는 대상체의 집단에서의 그 상태의 측정을 통해 결정될 수 있다.

구성적으로 활성인 FGFR-3을 발현하는 세포를 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 구성적으로 활성인 돌연변이체 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR-3)에 의해 유도된 세포 성장 정지를 극복하는 방법이 또한 제공된다.

NPR-B를 발현하는 세포를 본원에 기재된 것과 같은 CNP 변이체 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 나트륨이뇨 펩타이드 수용체 B(NPR-B)를 발현하는 세포에서 cGMP 제조를 자극하는 방법이 추가로 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 시험관내 또는 생체내 wtCNP22의 동일한 농도(예를 들어, 1 uM) 하에 생성된 cGMP 수준의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% 또는 150%의 생성을 자극하는 CNP 변이체를 제공한다. 더 추가의 실시형태에서, 본 개시내용의 CNP 변이체는 시험관내 또는 생체내 wtCNP22의 동일한 농도(예를 들어, 1 uM) 하에 생성된 cGMP 수준의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% 또는 150%의 생성을 자극한다.

본원에 기재된 임의의 CNP 변이체가 상기 방법에서 유용하다고 고려된다.

다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(서열 번호 1)이다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 아세틸 기를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 아세틸 기는 펩타이드의 N 말단에 있다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 C 말단에서 OH 또는 NH₂ 기를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 변이체는 상기 기재된 것과 같은 하나 이상의 링커 기를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 링커는 가수분해 가능한 링커이다.

다양한 매개변수에 의해 치료의 효능이 측정된다. 다양한 실시형태에서, 효능은 기준선 기간으로부터 중재 기간까지 연간 성장 속도의 변화로서 평가된다. 효능은 또한 CDC 성장 곡선을 사용하여 측정된 것처럼 기준선으로부터 치료 종료까지 키 SDS의 변화로서 평가될 것이고, 성장 속도 SDS는 골 무기질 밀도 아동 연구(Bone Mineral Density in Childhood Study)에 기초할 것이다(Kelly 등, J. Clin. Endocrinol. Metab. 2014;99(6):2104-2112).

QoLISSY, 저신장 청년에서의 삶의 질(Quality of Life in Short Stature Youth)이 지시된 것처럼 평가된다(Quality of Life in Short Stature Youth - The QoLISSY Questionnaire User's Manual. Lengerich: Pabst Science Publishers; 2013).

약제학적 조성물

본 개시내용은 본원에 기재된 CNP 변이체, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포함하는 변형 방출 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 다른 생물학적 활성제(예를 들어, 프로테아제의 억제제, 수용체 티로신 키나제 및/또는 제거 수용체 NPR-C)를 추가로 포함한다.

본 개시내용은 본원에 기재된 것과 같은 접합체 모이어티를 포함하는 변형 방출 조성물을 제공한다. 변형 방출 조성물은 이의 투여 후(지연-방출 투여량) 또는 연장된 시간 기간 동안(서방형 투여량) 지연으로 약물을 전달하는 것을 포함한다. 본원에 제공된 CNP 펩타이드 접합체의 다양한 실시형태는 변형-방출 조성물, 예컨대 서방형, 지속형 또는 제어 방출 및 지연 방출을 포함한다. "서방형 조성물"이라는 용어는 투여 후 연장된 시간 기간에 걸쳐 이용 가능한 활성 성분/약물을 제조하는 방식으로 제형화된 조성물을 지칭한다. 서방형 투여량은 지속-방출(SR) 또는 제어-방출(CR) 형식을 포함하고(미국 약전), 여기서 지속 방출은 반드시 일정한 속도는 아니지만 지속된 기간에 걸쳐 약물 방출을 유지하지만, CR은 거의 일정한 속도에서 지속된 기간에 걸쳐 약물 방출을 유지한다(Pharmaceutics: Drug Delivery and Targeting, Yvonne Perrie, Thomas Rades, Pharmaceutical Press, 2009). 지연-방출 조성물 또는 생성물은 초기 투여 후 약간의 시간 기간 동안 약물 물질의 방출을 지연시키도록 변형된다.

다양한 실시형태에서, 변형 방출 조성물은 서방형 조성물이다.

다양한 실시형태에서, 서방형 조성물에 대해, pH 7 내지 7.6에서 (i) 약 20% 미만의 펩타이드는 1일에 방출되고; (ii) 약 90%의 펩타이드는 주마다 방출되거나, 약 90%의 펩타이드는 2주마다 방출되거나, 약 90%의 펩타이드는 달마다 방출된다.

다양한 실시형태에서, 약 20% 미만의 펩타이드는 pH 7 내지 7.6에서 1일에 방출된다. 다양한 실시형태에서, 약 10% 미만의 펩타이드는 pH 7 내지 7.6에서 1일에 방출된다. (i) pH 7.0 내지 7.6에서 약 30% 또는 약 40% 또는 약 50% 미만의 펩타이드가 방출되고; (ii) pH 7 내지 7.6에서 약 90%의 펩타이드가 주마다 방출되거나, 약 90%의 펩타이드가 2주마다 방출되거나, 약 90%의 펩타이드가 달마다 방출된다는 것이 추가로 고려된다. (i) pH 7.0 내지 7.6에서 약 30% 또는 약 40% 또는 약 50% 또는 약 60% 미만의 펩타이드가 방출되고; (ii) pH 7 내지 7.6에서 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 2주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 3주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 달마다 방출된다는 것이 추가로 고려된다. 다양한 실시형태에서, 약 90%의 펩타이드는 pH 7 내지 7.6에서 주마다 방출된다. 다양한 실시형태에서, 약 90%의 펩타이드는 pH 7 내지 7.6에서 2주마다 방출된다. 다양한 실시형태에서, 약 90%의 펩타이드는 pH 7 내지 7.6에서 달마다 방출된다. 방출이 pH 7.0 내지 7.6, pH 7.1 내지 7.5, pH 7.2 내지 7.4, pH 7.2 내지 7.6, 또는 pH 7.0 내지 7.4의 pH에 있을 수 있다는 것이 추가로 고려된다.

다양한 실시형태에서, (i) pH 7.0 내지 7.6에서 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70% 또는 약 75% 미만의 펩타이드는 1일에 방출되고; (ii) pH 7 내지 7.6에서 약 90%의 펩타이드는 주마다 방출되거나, 약 90%의 펩타이드는 2주마다 방출되거나, 약 90%의 펩타이드는 달마다 방출된다. (i) 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60% 약 65%, 약 70% 또는 약 75% 미만의 펩타이드가 pH 7.0 내지 7.6에서 1일에 방출되고; (ii) pH 7 내지 7.6에서 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 2주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 3주마다 방출되거나; 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 펩타이드가 달마다 방출되거나; 대안적으로 ii) pH 7 내지 7.6에서 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%의 펩타이드가 주마다 방출되거나; 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%의 펩타이드가 2주마다 방출되거나; 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%의 펩타이드가 3주마다 방출되거나; 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 또는 약 90%의 펩타이드가 달마다 방출된다는 것이 추가로 고려된다.

다양한 실시형태에서, 상기 조성물은 부형제, 희석제 또는 담체를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 서방형 조성물은 부형제, 희석제 또는 담체를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 부형제, 희석제 또는 담체는 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체이다.

부형제, 담체 및 희석제의 비제한적인 예는 비히클, 액체, 완충액, 등장화제, 첨가제, 안정화제, 보존제, 가용화제, 계면활성제, 유화제, 습윤제, 아쥬반트 및 기타 등등을 포함한다. 상기 조성물은 액체(예를 들어, 물, 에탄올); 다양한 완충액 함량의 희석제(예를 들어 Tris-HCl, 포스페이트, 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액), pH 및 이온 농도; 세제 및 가용화제(예를 들어 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80); 항산화제(예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, 나트륨 메타바이설파이트); 보존제(예를 들어 티메로솔, 벤질 알코올, m-크레솔); 및 벌킹 물질(예를 들어 락토스, 만니톨, 수크로스)을 함유할 수 있다. 약제학적 조성물의 제형에서의 부형제, 희석제 및 담체의 사용은 당해 분야에 공지되어 있고; 예를 들어 본원에 그 전체가 참고로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, pages 1435-1712, Mack Publishing Co. (Easton, Pennsylvania (1990))를 참조한다.

예를 들어, 담체는 제한 없이 희석제, 비히클 및 아쥬반트뿐만 아니라 활성 성분(들)과 반응하지 않는 임플란트 담체, 및 불활성, 비독성 고체 또는 액체 충전제 및 캡슐화 재료를 포함한다. 담체의 비제한적인 예는 인산염 완충 식염수, 생리학적 식염수, 물 및 에멀션(예를 들어, 오일/물 에멀션)을 포함한다. 담체는 예를 들어 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 및 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 조성물은 액체 제형이다. 소정의 실시형태에서, 상기 제형은 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 또는 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 0.5 내지 5 mg/ml, 또는 약 0.5 내지 3 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 농도 범위로 CNP 변이체를 포함한다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 0.8 mg/mL 내지 2 mg/mL의 농도로 있다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 0.8 mg/mL의 농도로 있다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 2.0 mg/mL의 농도로 있다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 동결건조된 분말로부터 재구성된다.

추가의 실시형태에서, 상기 조성물은 원하는 범위 내에 CNP 함유 용액 또는 현탁액의 pH를 유지시키도록 완충액 용액 또는 완충제를 포함한다. 완충액 용액의 비제한적인 예은 인산염 완충 식염수, Tris 완충 식염수 및 Hank 완충 식염수를 포함한다. 완충제는 제한 없이 아세트산나트륨, 인산나트륨 및 시트르산나트륨을 포함한다. 완충제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 완충제는 아세트산/아세테이트 또는 시트르산/시트레이트이다. 조성물에 적합한 완충제의 양은 부분적으로 사용된 특정 완충액 및 용액 또는 현탁액의 원하는 pH에 따라 달라진다. 일부 실시형태에서, 완충제는 약 10 mM ± 5 mM의 농도를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 조성물의 pH는 약 pH 3 내지 약 pH 9, 또는 약 pH 3 내지 약 pH 7.5, 또는 약 pH 3.5 내지 약 pH 7, 또는 약 pH 3.5 내지 약 pH 6.5, 또는 약 pH 4 내지 약 pH 6, 또는 약 pH 4 내지 약 pH 5이거나, 약 pH 5.0 ± 1.0에 있다. 다양한 실시형태에서, pH는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다양한 실시형태에서, pH는 5.5이다.

다른 실시형태에서, 상기 조성물은 용액 또는 현탁액이 등장성이 되게 하고 투여에 더 적합하게 하는 등장성-조정제를 함유한다. 등장화제의 비제한적인 예는 NaCl, 덱스트로스, 글루코스, 글리세린, 소르비톨, 자일리톨 및 에탄올을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 등장화제는 NaCl이다. 소정의 실시형태에서, NaCl은 약 160 ± 20 mM , 또는 약 140 mM ± 20 mM, 또는 약 120 ± 20 mM , 또는 약 100 mM ± 20 mM, 또는 약 80 mM ± 20 mM, 또는 약 60 mM ± 20 mM의 농도로 있다.

또 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 보존제를 포함한다. 보존제는 m-크레솔 및 벤질 알코올을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, 보존제는 약 0.4% ± 0.2% 또는 약 1% ± 0.5% 또는 약 1.5% ± 0.5% 또는 약 2.0% ± 0.5%의 농도로 있다.

더 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 (예를 들어, 유리 또는 플라스틱에 대한 CNP 변이체의 흡수를 완화하기 위해) 항흡착제를 함유한다. 항흡착제는 제한 없이 벤질 알코올, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 항흡착제는 약 0.001% 내지 약 0.5% 또는 약 0.01% 내지 약 0.5% 또는 약 0.1% 내지 약 1% 또는 약 0.5% 내지 약 1% 또는 약 0.5% 내지 약 1.5% 또는 약 0.5% 내지 약 2% 또는 약 1% 내지 약 2%의 농도로 있다.

추가 실시형태에서, 상기 조성물은 안정화제를 포함한다. 안정화제의 비제한적인 예는 글리세린, 글리세롤, 티오글리세롤, 메티오닌 및 아스코르브산 및 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 안정화제가 티오글리세롤 또는 아스코르브산 또는 이의 염일 때, 안정화제는 약 0.1% 내지 약 1%의 농도로 있다. 다른 실시형태에서, 안정화제가 메티오닌일 때, 안정화제는 약 0.01% 내지 약 0.5% 또는 약 0.01% 내지 약 0.2%의 농도로 있다. 더 다른 실시형태에서, 안정화제가 글리세린일 때, 안정화제는 약 5% 내지 약 100%(니트)의 농도로 있다.

추가의 실시형태에서, 상기 조성물은 항산화제를 함유한다. 예시적인 항산화제는 제한 없이 메티오닌 및 아스코르브산을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 항산화제 대 CNP의 몰비는 약 0.1:1 내지 약 15:1, 또는 약 1:1 내지 약 15:1, 또는 약 0.5:1 내지 약 10:1, 또는 약 1:1 내지 약 10:1 또는 약 3:1 내지 약 10:1이다.

약제학적으로 허용 가능한 염은 제한 없이 광산 염(예를 들어, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염), 유기 산의 염(예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트, 메실레이트, 토실레이트), 및 아민의 염(예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디사이클로헥실아민, 디에탄올아민)을 포함하는 조성물에 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염의 완전한 토의는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990))에서 발견된다.

약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 과립, 산제, 용액, 현탁액, 에멀션, 연고 및 경피 패치와 같은 다양한 형태로 투여될 수 있다. 상기 조성물의 투여 형태는 상기 조성물의 원하는 투여 방식에 맞춤될 수 있다. 경구 투여를 위해, 상기 조성물은 예를 들어 정제 또는 캡슐(소프트겔 캡슐을 포함)의 형태를 취할 수 있거나, 예를 들어 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 시럽일 수 있다. 경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은 하나 이상의 흔히 사용된 부형제, 희석제 및 담체, 예컨대 만니톨, 락토스, 글루코스, 수크로스, 전분, 옥수수 전분, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰로스, 탄산마그네슘 및 활택제(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 나트륨 스테아릴 푸마레이트)를 포함할 수 있다. 향미료, 착색제 및/또는 감미료는 원하는 경우 고체 및 액체 제형에 첨가될 수 있다. 경구 제형을 위한 다른 선택적인 성분은 제한 없이 보존제, 현탁제 및 증점제를 포함한다. 경구 제형은 또한 위의 산성 조건으로부터 CNP 변이체를 보호하기 위해 장용 코팅을 가질 수 있다. 고체 및 액체 투여 형태를 제조하는 방법은 공지되어 있거나, 당업자에게 자명할 것이다(예를 들어, 상기 언급된 Remington's Pharmaceutical Sciences를 참조한다).

비경구 투여를 위한 제형은 예를 들어 액체 용액 또는 현탁액으로서, 가용화에 적합한 고체 형태로서 또는 주사 전에 액체 매질 중의 현탁액, 또는 에멀션으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 멸균 주사용 용액 및 현탁액은 적합한 희석제, 담체, 용매(예를 들어, 완충 수성 용액, 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액), 분산제, 습윤제, 유화제, 현탁제 등을 사용하여 당해 분야에 공지된 기법에 따라 제형화될 수 있다. 게다가, 멸균 고정유, 지방 에스테르, 폴리올 및/또는 다른 불활성 성분이 사용될 수 있다. 추가의 예로서, 비경구 투여를 위한 제형은 항산화제, 완충액, 정균제 및 제형이 의도된 수혜자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 멸균 주사용 용액; 및 현탁제 및 증점제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다.

CNP 변이체를 포함하는 조성물은 또한 동결건조된 제형일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 동결건조된 제형은 완충액 및 벌크화제 및 선택적으로 항산화제를 포함한다. 예시적인 완충액은 제한 없이 아세테이트 완충액 및 시트레이트 완충액을 포함한다. 예시적인 벌크화제는 제한 없이 만니톨, 수크로스, 덱스트란, 락토스, 트레할로스 및 포비돈(PVP K24)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 만니톨은 약 3% 내지 약 10% 또는 약 4% 내지 약 8% 또는 약 4% 내지 약 6%의 양으로 있다. 소정의 실시형태에서, 수크로스는 약 6% 내지 약 20% 또는 약 6% 내지 약 15% 또는 약 8% 내지 약 12%의 양으로 있다. 예시적인 항산화제는 메티오닌 및 아스코르브산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

다양한 실시형태에서, 상기 제형은 시트르산, 시트르산나트륨, 트레할로스, 만니톨, 메티오닌, 폴리소르베이트 80 및 선택적으로 주사용 멸균수(WFI: water for injection)를 포함한다.

본 개시내용은 또한 액체(예를 들어, 멸균 주사제) 제형 또는 고체(예를 들어, 동결건조된) 제형을 포함하는 예를 들어 병, 바이알, 앰플, 관, 카트리지 및/또는 주사기를 함유하는 키트를 제공한다. 키트는 제한 없이 주사를 위한 또는 더 낮은 농도로 농축액을 희석하기 위한 주사기에서 동결건조된 제형을 재구성하는 것을 포함하는 투여(예를 들어, 주사에 의한)를 위한 용액 또는 현탁액으로 고체(예를 들어, 동결건조된) 제형을 재구성하기 위한 약제학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매, 용액 및/또는 완충액)를 또한 함유할 수 있다. 더욱이, 즉시 주사 용액 및 현탁액은 CNP 함유 조성물을 포함하는 예를 들어 멸균 분말, 과립 또는 정제로부터 제조될 수 있다. 키트는 또한 분배 장치, 예컨대 에어로졸 또는 주사 분배 장치, 펜 인젝터, 오토인젝터, 무침 인젝터, 주사기 및/또는 침을 포함할 수 있다.

비제한적인 예로서, 키트는 단일 챔버 또는 이중 챔버를 갖는 주사기를 포함할 수 있다. 단일 챔버 주사기에 대해, 단일 챔버는 주사를 위한 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 작은 양의 적합한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린)에서의 주사에 준비된 액체 CNP 제형, 또는 고체(예를 들어, 동결건조된) CNP 제형 또는 CNP 변이체의 액체 제형을 함유할 수 있다. 이중 챔버 주사기에 대해, 1개의 챔버는 약제학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매 시스템, 용액 또는 완충액)를 함유할 수 있고, 다른 챔버는 제1 챔버로부터의 비히클 또는 담체를 사용하여 주사를 위한 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 작은 양의 적합한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린)에서의 고체(예를 들어, 동결건조된) CNP 제형 또는 CNP 변이체의 액체 제형을 함유할 수 있다.

추가의 예로서, 키트는 하나 이상의 펜 인젝터 또는 오토인젝터 장치 및 이중-챔버 카트리지를 포함할 수 있다. 카트리지의 하나의 챔버는 약제학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매 시스템, 용액 또는 완충액)를 함유할 수 있고, 다른 챔버는 제1 챔버로부터의 비히클 또는 담체를 사용하여 주사를 위한 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 작은 양의 적합한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린)에서의 고체(예를 들어, 동결건조된) CNP 제형 또는 CNP 변이체의 액체 제형을 함유할 수 있다. 카트리지는 원하는 시간 기간(예를 들어, 2일, 3일, 1주, 2주, 3주, 4주 등)에 걸쳐 투약에 충분한 CNP 변이체의 양을 포함할 수 있다. 펜 인젝터 또는 오토인젝터는 카트리지로부터 CNP 제형의 원하는 양을 투여하도록 조정될 수 있다.

투여 및 투약

CNP 변이체, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물 또는 제형은 예를 들어 피하로, 관절내로, 복강내로, 근육내로, 진피내로 또는 경구로와 같은 다양한 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, CNP 변이체 조성물은 매일 1회, 주마다 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여된다.

CNP 변이체 또는 이의 조성물은 또한 표적 작용 부위(예를 들어, 비정상 또는 퇴행 관절 또는 연골 부위)에서의 데포의 이식에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, CNP 변이체는 혀 밑에 설하로(예를 들어, 설하 정제), 경피 전달에 의해(예를 들어, 피부에서의 패치에 의해) 또는 마이크로구, 마이크로캡슐, 리포솜(비하전된 또는 하전된(예를 들어, 양이온성)), 중합체 마이크로입자(예를 들어, 폴리아미드, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리(락타이드-글리콜라이드)), 마이크로에멀션의 형태로 경구로 등에 의해 투여될 수 있다.

본원에 기재된 CNP 변이체 조성물은 골-관련 장애(예를 들어, 연골무형성증를 포함하는 골격 이형성증)를 치료하거나 완화하거나 예방하기 위한 치료학적 유효 용량에서 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. CNP 변이체의 안전성 및 치료학적 효능은 예를 들어 LD₅₀(집단의 50%에 치사인 용량) 및 ED₅₀(집단의 50%에 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정함으로써 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약물학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고, 이것은 LD₅₀ /ED₅₀인 비율로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 활성제가 보통 바람직하다.

소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 CNP 변이체 조성물은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 nmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 또는 약 20 nmol/kg 내지 약 200 nmol/kg의 범위의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, CNP 조성물은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 또는 2000 nmol/kg의 용량 또는 주치의에 의해 적절하다고 여겨지는 다른 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, CNP 변이체 조성물은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 μg/kg, 또는 약 0.5, 0.8, 1.0, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg/kg의 용량, 또는 주치의에 의해 적절하다고 여겨지는 다른 용량으로 투여된다. 본원에 기재된 CNP 또는 CNP 변이체의 용량은 제한 없이 매일, 주마다 2회 또는 3회, 주마다, 2주마다, 3주마다, 달마다 등을 포함하는 본원에 기재된 투약 빈도/투여 빈도에 따라 투여될 수 있다. 다양한 실시형태에서, CNP 또는 CNP 변이체는 피하로 매일 투여된다. 다양한 실시형태에서, CNP 또는 CNP 변이체는 피하로 주마다 투여된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 2.5 μg/kg/일 내지 60 μg/kg/일, 10μg/kg/일 내지 45 μg/kg/일, 또는 15μg/kg/일 내지 30 μg/kg/일의 용량으로 투여된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 15 μg/kg/일의 용량으로 투여된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 30 μg/kg/일의 용량으로 투여된다.

특정 대상체를 위한 CNP 변이체의 투약/투여의 빈도는 치료되는 장애 및 치료에 대한 대상체의 컨디션 및 반응을 포함하는 다양한 인자에 따라 변할 수 있다. CNP 변이체는 단일 용량으로 또는 투여마다 다수의 용량으로 투여될 수 있다. 소정의 실시형태에서, CNP 변이체 조성물은 단일 용량으로 또는 다수의 용량으로, 매일 1회, 주마다 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회, 또는 주치의에 의해 적절하다고 여겨지는 대로 투여된다. 다양한 실시형태에서, CNP 변이체는 3개월, 6개월, 12개월 또는 초과 동안 투여된다.

일부 실시형태에서, CNP 변이체 조성물은 성장 기간(예를 들어, 연골형성), 이어서 회복 기간(예를 들어, 골형성)을 허용하도록 투여된다. 예를 들어, CNP 조성물은 피하로 또는 매일 다른 방식으로 또는 시간 기간에 걸쳐 주마다 다회 투여될 수 있고, 무치료의 기간이 이어지고, 이후 사이클이 반복된다. 일부 실시형태에서, 치료(예를 들어, 매일 또는 주마다 다회 CNP 변이체 조성물의 투여)의 초기 기간은 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 동안이다. 관련된 실시형태에서, 무치료의 기간은 3일, 1주, 2주, 3주 또는 4주 지속한다. 소정의 실시형태에서, CNP 변이체 조성물의 투여 섭생은 3일 동안 매일, 이어서 3일 휴약; 또는 1주 동안 매일 또는 주마다 다회, 이어서 3일 또는 1주 휴약; 또는 2주 동안 매일 또는 주마다 다회, 이어서 1주 또는 2주 휴약; 또는 3주 동안 매일 또는 주마다 다회, 이어서 1주, 2주 또는 3주 휴약; 또는 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 동안 매일 또는 주마다 다회, 이어서 1주, 2주, 3주 또는 4주 휴약이다.

바이오마커

골-관련 장애의 치료를 위해, 예컨대 자궁내 및 신생아의 긴 골 성장 측정 및 골 성장 바이오마커 예컨대 CNP, cGMP, 콜라겐 II, 콜라겐 X, 오스테오칼신 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 측정과 같은 성장의 표시자가 측정될 수 있다.

하나의 CNP 신호전달 마커는 cGMP(구아노신 3',5' 사이클릭 모노포스페이트)이다. 이 세포내 신호잔달 분자의 수준은 CNP가 이의 동족 수용체 NPR-B에 결합하고 이를 활성화한 후 증가한다. 상승된 cGMP 수준은 CNP 노출 후 세포 배양 추출물(시험관내), CNP 노출 후 골 이식외 연구(생체외)로부터의 조건 배지로부터 측정될 수 있고, 피하로, 정맥내로 또는 당해 분야에 공지된 다른 투여 경로를 통해 CNP 투여의 분 내에 혈장(생체내)에서 측정될 수 있다.

연골 및 골-특이적 분석물질(또는 연골-연관 및 골-연관 마커)은 CNP 효능을 평가하도록 또한 측정될 수 있다. 예를 들어, 절단된 콜라겐 II형의 단편은 연골 전환을 위한 연골-특이적 마커이다. II형 콜라겐은 연골의 주요 유기 구성성분이고, II형 콜라겐(절단된 콜라겐)의 단편은 연골 전환 후에 순환으로 방출되고 후속하여 뇨로 분비된다. 연골 전환은 새로운 골 형성을 진행시킨다.

측정될 수 있는 골 형성에 대한 골-특이적 바이오마커는 I형 프로콜라겐의 N 말단 프로펩타이드(PINP)이다. I형 콜라겐이 골 기질에서 주요 유기 성분이므로, I형 콜라겐의 합성은 골 형성에서 중요한 단계이다. 콜라겐 합성 동안, 프로펩타이드는 프로콜라겐 분자로부터 방출되고, 혈청에서 검출될 수 있다. 게다가, 콜라겐 I형의 단편은 골 재흡수를 위한 마커로서 측정될 수 있다.

연골 및 골 형성 및 성장을 위한 다른 잠재적 바이오마커는 아그레칸 콘드로이틴 황산염(연골 전환을 위한 연골-특이적 마커), II형 콜라겐의 프로펩타이드(연골 형성을 위한 연골-특이적 마커), 콜라겐 I형 C-텔로펩타이드(CTx), 알칼리 포스파타제(골-특이적) 및 오스테오칼신(골 형성을 위한 골-특이적 마커)을 포함한다. 연골-연관 및 골-연관 바이오마커는 예를 들어 효능/약동학적 생체내 연구로부터의 혈청에서 측정될 수 있고, 상업적으로 구입 가능한 키트를 사용하여 생체외 연구의 조건 배지로부터 측정될 수 있다.

일 실시형태에서, 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준은 생체내 골 및 연골 형성 및 성장에 대한 CNP 조성물의 효과를 모니터링하기 위해 본원에 기재된 CNP 변이체 또는 조성물이 투여된 대상체에서 평가되고 측정된다. 예를 들어, 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준의 증가는 CNP 변이체 또는 조성물의 투여가 골 성장에 긍정적인 효과를 갖고 골격 이형성증 및 CNP 활성의 감소와 연관된 다른 골-관련 또는 연골-관련 질환 또는 장애에 유용한 치료라는 것을 나타낼 수 있다. 예시적인 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커는 CNP(예를 들어, CNP의 내인성 수준), cGMP, 콜라겐 II형의 프로펩타이드 및 이의 단편, 콜라겐 II형 및 이의 단편, 콜라겐 I형 C-텔로펩타이드(CTx), 오스테오칼신, 증식 세포 핵 항원(PCNA), I형 프로콜라겐의 프로펩타이드(PINP) 및 이의 단편, 콜라겐 I형 및 이의 단편, 콜라겐 X, 아그레칸 콘드로이틴 황산염 및 알칼리 포스파타제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

다양한 실시형태에서, 바이오마커는 CNP 변이체가 투여될 것이거나 투여되고 있거나 투여된 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득함으로써 측정된다. 바이오마커는 비제한적인 예로서 웨스턴 블롯, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA: enzyme linked immunosorbant assay) 및 효소 활성 검정을 포함하는 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 뇨 또는 다른 생물학적 유체일 수 있다.

본 개시내용의 추가 양태 및 상세내용은 하기 실시예로부터 자명할 것이고, 이 실시예는 제한보다는 예시인 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1: CNP 변이체의 합성

Symphony/Prelude(Protein Technologies Inc., 미국), Voyager(CEM GmbH, 독일) 또는 SyroII(MultiSyntech, 독일) 합성장치에 C 말단 COOH를 남기는 수지를 사용하여 고상에서 CNP 변이체 펩타이드를 합성하였다.

모든 Fmoc-아미노산은 N-t-Boc(KW), O-t-Bu(DESTY), N-Trt(HNQ), S-Trt(C) 또는 N-Pbf(R) 기로 보호된 측쇄 작용기에 의해 Biosolve(네덜란드) 또는 Bachem GmbH(독일)로부터 구매하였다. 모든 아미노산 커플링 단계에 대해 이중 커플링을 사용한 20분 활성화 시간에 의해 NMP 중의 5배 초과의 HBTU/HOBt/아미노산/DIPEA(1:1:1:2)를 사용하였다.

실온에서 30분 동안 수지를 NMP/Ac2O/DIEA(10:1:0.1, v/v/v)와 반응시킴으로써 펩타이드의 아세틸화(Ac)를 수행하였다.

모이어티의 접합을 위해, 리신에서의 보호성 아미노 기는 반응성 기를 생성하도록 절단되었다. 표준 Fmoc 합성은 2x Fmoc-아미노 PEG(2), 이어서 글루탐산, 이어서 C18-이산을 반응시키도록 사용되었다.

실온에서 2시간 동안 TFA(40 mL/mmol 수지)와 반응시킴으로써 수지로부터 완료된 펩타이드를 절단하였다. 미정제 펩타이드를 여과시키고, 아주 차가운 Et₂O에 의해 침전하고, 이후 동결건조 및 궁극적으로 분취용 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의한 정제가 이어졌다. 최종 생성물 및 순도는 질량 분광법에 의해 확인되었다.

CNP 변이체는 선택적으로 상이한 아미노산 잔기에서의 변경 및/또는 N 말단에서의 아세틸화 및/또는 다른 변형을 갖는 Pro-Gly CNP-37(PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 1))의 서열에 기초하여 생성되었고, (밑줄 표시된 아미노산 변경)을 포함한다:

CNP-8: Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8),

CNP-5: Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(서열 번호 9),

CNP-6: Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 10),

CNP-7: Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(서열 번호 11), CNP-9: Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(서열 번호 12),

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8), 및

PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 7).

완전 환원된 펩타이드를 0.1 mg/mL의 최종 농도에서 1 mM 시스테인(SS-형태) 및 8 mM 시스테인(SH-형태)을 함유하는 구아니딘 HCl을 갖거나 갖지 않는 0.1 M Tris-완충액(pH 8.0)에 용해시키고 실온에서 교반하였다. 추가 피크 변경이 관찰되지 않을 때까지 HPLC-분석에 의해 디설파이드 형성을 모니터링하였다. 정제를 위해 분취용 RP-HPLC에서 혼합물을 로딩하였다.

실시예 2: 합성된 CNP 변이체의 규명

10일 후 순도 및 안정성을 결정하기 위해 질량 분석법 및 UV 분광학에 의해 실시예 1에서처럼 합성된 CNP 변이체를 분석하였다.

시간 T0 내지 T10에 걸쳐 순도의 RP-HPLC 분석을 사용하여 안정성을 측정하였다. 간단하게, CNP 변이체를 완충액: 5 mM 시트레이트, 6% 수크로스, 1.5% 만니톨, 0.7 mg/ml 메티오닌 및 0.005% tween80, pH 5.6에서 1:5 희석하였다. 10 μL 주사 부피를 Phenomenex Aeris XB-C18 RP 칼럼(2 μm, 100A, 2.1 x 250 mm; p/n 00G-4505-AN)에 주입하고, HPLC 조건은 이동상 A: H₂O/0.05% TFA, pH 3 w/NH₄OH(약 3 mM 최종), 이동상 B: H₂O/0.05% TFA 중의 70% CH₃CN, pH 3 w/NH₄OH(약 3mM 최종) 및 0.25 mL/분의 유속이었다. 55℃의 칼럼 온도 및 UV: 214 nm(bw 4 nm); ref 360 nm(bw 20 nm), UV: 280 nm(bw 4 nm); ref 360 nm(bw 20 nm)에 의해 측정을 수행하였다. CNP 변이체를 37℃에서 PBS, pH 7.4 중에 10일 유지시키고, 안정성 측정을 얻었다. 안정성 측정의 결과는 T0(0일) 또는 T10(10일)에 검출된 % 변이체로서 하기 표 1에 기재되어 있다.

CatchPoint Cyclic-GMP Fluorescent Assay Bulk 키트(Molecular Devices, R8075)를 사용하여 cGMP 자극 검정에 의해 활성에 대해 CNP 변이체를 시험하였다. 간단하게, NIH3T3 세포(ATCC, CRL-1658) 및 HEK293 세포를 96웰 플레이트(96웰 검정 영상화 플레이트, Grenier, 655090호)에서 60,000 세포/웰로 시딩하였다. 배양 배지는 하기와 같았다: NIH3T3 배양 배지: DMEM 고 글루코스, 피루베이트(Thermo, 11995-073) + 10% FBS + 1x Pen Strep(P/S로 약칭됨, Thermo, 카탈로그 15140122호). NIH3T3은 cGMP 검정 HEK293 배양 배지: EMEM + 10% FBS + 1x P/S + 1x GMAX. 무혈청 NIH3T3 배지: IBMX(CAS 28822-58-4)에 의한 세포의 치료를 위한 DMEM + 1x P/S; BSA를 갖는 무혈청 NIH3T3 배지: CNP에 의한 세포의 치료를 위한 DMEM + 1x P/S + 0.5 mg/mL BSA(Thermo, A9418-100G)에 대한 제어 시스템이였다.

37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 세포를 항온처리하였다. CNP 변이체에 의해 치료되는 세포에 대해, 플레이트는 사용 전 15분에 IBMX에 의해 전치료되었다(Enzo life sciences, 89161-340, 1g). IBMX는 포스포디에스터라제의 강력한 비특이적 억제제이다. IBMX의 800 mM 스톡 용액을 0.75 mM 워킹 스톡으로 IBMX 희석 배지(무혈청 배지(1x PBS와 1:1 희석된 DMEM + 1x PBS)에 희석하였다.

CNP 변이체를 하기와 같이 제조하였다: 10 mg/ml의 CNP 용액 1:1000을 CNP 희석 배지(DMEM + 1x P/S + 0.5 mg/mL BSA)에 희석한다. 이 용액은 100 nM CNP/웰에서 플레이팅된 CNP 출발 용액을 얻기 위해 추가로 희석된다. 이 100 nM CNP 용액을 0.0064 nM CNP /웰의 더 낮은 최종 농도를 얻기 위해 6 희석을 위해 추가로 1:5 연속 희석한다. 이는 분석에 대한 7점 용량 곡선을 제공한다.

세포 치료를 위해, 항온처리기로부터 세포를 제거하고, 세포로부터 성장 배지를 제거하고, IBMX에 의해 세포를 치료하였다. 80 μL의 0.75 mM IBMX를 각각의 웰에 첨가하고, 세포는 15분 동안 37℃ 항온처리기로 돌아갔다. 15분 후, CNP(40 μL/웰)를 각각의 시험 웰에 첨가하고, 세포는 15분 동안 37℃ 항온처리기로 돌아갔다. 플레이트를 부드럽게 두들겨 혼합하였다. 세포를 가시화하도록 플레이트를 Solentim 세포 메트릭에서 영상화하고, 어떤 세포 부유물이 있는지를 결정하고, 이후 37℃ 항온처리기에 다시 배치하였다.

반응을 중단시키고, (cGMP 키트로부터) 40 μL의 용해 완충액을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 플레이트를 5분 동안 진탕기에 배치하여 용해를 완료하였다. cGMP 검정에 세포 용해물을 사용하였다.

제조사의 프로토콜에 따라 제조된 cGMP 보정자, 토끼 항-cGMP 항체 및 HRP-cGMP를 사용하여 cGMP 검정을 수행하였다. 40 μL의 보정자를 항-cGMP 항체 코팅된 플레이트의 웰에 첨가하고, 분석되는 40 μL의 용해물을 적절한 웰에 첨가하였다. 40 μL의 재구성된 토끼 항-cGMP 항체를 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 혼합을 위해 5분 진탕기에 배치하였다. 40 μL의 재구성된 HRP-cGMP를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 항온처리하였다. 플레이트를 수동으로 호기시키고, 300 μL의 세척 완충액에 의해 4x 세척하였다. 100 μL의 스탑라이트 레드 기질(stoplight red substrate)을 각각 웰에 첨가하고, 플레이트를 덮고, 실온에서 적어도 10분 동안 정치시키고, 광으로부터 보호하였다. 여기 530 nm 및 방출 590 nm에서 Spectramax M 또는 유사한 장치에서 형광 강도에 대해 플레이트를 판독하였다.

표 1은 CNP 변이체가 cGMP 생성을 자극한다는 것을 보여주고, 이는 본원에 기재된 안정한 변이체가 골-관련 장애를 치료하기 위한 치료제로서 유용하다는 것을 제시한다.

실시예 2A: 혈장에서의 CNP 변이체 또는 접합체의 안정성

상이한 CNP 변이체 또는 CNP 접합체의 안정성은 24시간 기간에 걸쳐 인간 혈장에서 안정성에 대해 시험되었다. 간단하게, C18 지방산은 2개의 OEG 스페이서를 사용하여 감마 글루탐산에 융합되었다(예를 들어, Lau 등, J. Med. Chem 58:7370-7380, 2015 참조). 크로마토그래피를 위해, BEH C18 1.7 um, 2.1 x 150 mm에 의해 연결된 Waters UPLC H-Class; 이동상 A: 물 중의 1% DMSO 0.1% 포름산; 이동상 B: CAN 중의 1% DMSO 0.1% 포름산. 질량 분광법은 AB Sciex QTRAP를 사용하여 수행되었다.

각각의 CNP 변이체를 Human Plasma Li Heparin에서 200 nM에서 제조하고, 샘플을 37℃ 5% CO₂에서 항온처리하였다. 반응물을 0.5 M 시트르산나트륨 pH 4에 의해 0시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간 켄칭하였다. 혈장 단백질을 MeOH 중의 0.2% 포름산에 의해 침전시키고, 샘플을 WCX 96웰 uElution 플레이트를 사용하여 제조하고, LC-MS/MS 6500에 의해 분석하였다.

변이체 CNP-R은 고리 부분에 없는 K 잔기가 R 잔기로 변경되는 CNP37 변이체를 지칭하고, CNP Q/R은 N 잔기가 Q로 변경되고, 고리 위치에 있지 않은 K 잔기가 R로 변경되는 CNP37 변이체를 지칭한다.

도 1은 상이한 링커 구조를 갖는 CNP 접합체를 예시한다. 도 2는 지질화된 접합체가 혈장에서 PEG화된 또는 비접합된 펩타이드와 비교하여 혈장에서 개선된 안정성을 갖는다는 것을 보여준다.

변하는 조건에서 상이한 접합체의 안정성을 또한 분석하였다. 간단하게, 상기와 동일한 프로토콜을 37℃(대조군), 37℃+ 0.5M NaCl, 37℃ + 프로테아제 억제제 또는 4℃에서 사용하였다. 도 3은 PG-CNP37 및 변이체가 인간 혈장에서의 단백질분해에 민감하다는 것을 보여주고, PG-CNP37은 다른 변이체와 비교하여 더 큰 안정성을 보여준다.

실시예 3: 이형접합성 NPR2 돌연변이는 CNP 치료에 반응성이다

NPR2 돌연변이로부터 생긴 저신장을 갖는 대상체에서 CNP의 효과를 결정하기 위해, NPR2 돌연변이의 세포 모델을 개발하였다. 분석된 예시적인 NPR2 돌연변이는 도 6에 기재되어 있다. 125 ng의 NPR2 변이체를 사용한 RCS 세포로의 RNP 형질주입 또는 RCS 또는 HEK293 세포로 형질주입된 야생형 NPR2 플라스미드 DNA에 의해 NPR2 유전자의 넉아웃 또는 이것에서의 이형접합성 기능 소실 돌연변이를 갖는 래트 연골육종(RCS) 세포를 만들었다. 단일 세포 클론을 시딩하고, Sanger 시퀀싱에 의해 유전자형분석하였다. 세포 모델은 상이한 돌연변이의 공개된 cGMP 표현형을 재생성할 수 있다.

RCS 세포에서 NPR2의 제1 엑손에서 삽입 및 결실을 생성함으로써 NPR2 클론을 생성하였다. NPR2에서의 제1 엑손의 서열은 차세대 시퀀싱에 의해 확인되었고, 도 5에 제시되어 있다. 6 nM의 Pro-Gly CNP37에 의한 치료 후 CatchPoint Cyclic-GMP Fluorescent Assay를 사용하여 cGMP 자극 검정에 의해 CNP 투여에 대한 반응에서의 활성에 대해 NPR2 돌연변이체 세포를 시험하였다. RCS(래트 연골육종) 세포를 RCS 배양 배지: DMEM + 10% FBS + 1x Pen Strep에서 40,000 세포/웰로 시딩하였다. 도 4는 외인성 Pro-Gly-CNP37 변이체의 첨가가 NPR2 +/- 래트 연골육종 세포 모델에서 cGMP 판독을 구제한다는 것을 보여준다.

과거의 활성화 데이터는 PRKG2의 활성화에 대한 40 내지 360 nM의 범위의 cGMP EC50을 보고한다(Campbell 등, ACS Chem Biol 12, 2388-2398, 2017); Vaandrager 등, J Biol Chem 272, 11816-23, 1997); Pohler 등, FEBS Lett 374, 419-25, 1995). 이형접합성 NPR2 넉아웃 세포에서, 0.163 nM 초과의 CNP 용량은 PRKG2 활성화 cGMP를 위해 EC50 범위를 초과하는 세포내 농도를 달성할 수 있다(도 4). 반면에, 야생형 세포에서 0.040 nM의 CNP 용량은 동일한 cGMP 농도를 달성할 수 있다. 이 결과는 CNP 보충이 NPR2의 기능 소실 돌연변이를 갖는 세포에서 PRKG2 활성화 및 성장에 필요한 cGMP 수준을 달성할 수 있다는 것을 입증한다.

이 결과는 또한 CNP 변이체의 투여가 NPR2의 활성이 감소된 저신장을 갖는 대상체에서 골 성장을 복원하는 데 유용하다는 것을 제시한다. CNP 변이체에 의한 치료가 cGMP 신호전달이 손상될 수 있는 다른 성장판 유전자에서 돌연변이를 갖는 대상체에서 유리할 것이라는 것이 추가로 고려된다.

실시예 4: 저신장과 연관된 돌연변이의 확인

유전-유래된 이방향성 효과의 명확한 증거를 보여주는 유전자가 넓은 환자 집단에서 효과적으로 조절될 수 있는 치료학적 표적을 보다 더 나타낼 것이라는 것이 가정된다. 성장의 코어 조절자인 유전자를 확인하기 위해, 게놈 수준 연관 연구(GWAS)로부터의 유전자의 목록을 포함하는 5개의 유전자 목록의 교차 지점이 분석되었다. 코어 성장 조절자는 이방향성 효과(즉, 저신장 또는 골격 이형성증 및 고신장 또는 과성장)를 갖는 희귀 코딩 돌연변이를 함유할 가능성이 가장 높다.

쿼리된 데이터베이스는 하기를 포함한다: 약 700,000명의 개체를 사용한 키의 대형 GWAS 메타-분석에 의해 보고된 3,290개의 독립 유전 변이체의 각각에 대한 GWAS 2,067개 비반복 가장 가까운 유전자가 추출되었음; HGMD. HGMD 버전 v2019_2로부터의 HGMD "allmut" 표는 동일한 유전자에서 "저신장" 및 "고신장 또는 과성장" 중 어느 하나를 갖는 "DM"으로 표지된 모두 병원균성 변이체에 고대하며 쿼리되었음; OMIM. 성장 장애와 관련된 OMIM 유전자의 목록은 이전에 기재되어 있고 저신장, 과성장, 골격 이형성증, 단지증의 키워드를 사용하여 생성되었다.

처음에, Human Gene Mutation Database(HGMD 버전 v2019_2)는 저신장 또는 고신장과 연관된 유전자에 대해 쿼리되었다(Stenson 등, Hum Genet 136:665-677, 2017). "저신장"을 야기하는 것으로 문헌에 보고된 적어도 하나의 병원균 변이체에 의해 주석화된 47개의 유전자가 있었다. 불과 20개의 유전자가 고신장 또는 과성장 유전자로서 주석화되었다. 둘째로, 저신장, 과성장, 골격 이형성증, 단지증의 키워드를 사용하여 생성된 258개의 OMIM 유전자(248개의 저신장, 20개는 고신장)의 수동으로 큐레이팅된 목록이 사용되었다(Wood 등, Nat Genet 46:1173-86, 2014). 셋째로, 이들 목록의 교차지점은 GWAS로부터의 유전자의 목록과 비교되었다. 이들 목록의 교차지점에서 키와 연관된 것으로 공지된 3개의 유전자(IGF1R, NPPC, NPR2)가 있고, 2개의 추가 유전자(FGFR3, SHOX)가 확인되었다.

추가 분석은 유의미하게 감소된 키(β = -0.20, 95% CI[-0.26 내지 -0.14], p = 4.04x10-11) 및 특발성 저신장에 대해 유의미하게 증가된 위험(ISS)(OR = 2.75, 95% CI[1.92 내지 3.96]을 나타내는 5개의 코어 유전자의 새로운 그룹을 생성시켰다. 코어 5개 유전자(FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX)의 각각은 개별적으로 고려될 때 키와 연관되었고, 또한 다른 돌연변이와 조합으로 취해질 때 저신장과 연관된다. FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX에서의 예시적인 돌연변이는 도 7에 기재되어 있다.

NPR2 및 IGF1R에서의 조합 LoF(기능 소실) 및 미스센스 변이체는 또한 ISS에 대한 증가된 위험과 연관되었다(각각 OR = 3.31, P = 0.001, OR = 2.85, P = 0.002). SHOX, IGF1R, NPPC, NPR2에서 전체 유전자 결실 및/또는 단백질 기능 소실을 야기하는 돌연변이는 다양한 정도의 중증도에 의해 가족성 저신장에서 보고되었다.

분석은 임의의 5개의 코어 유전자에서의 변이체의 보균자가 ISS에 대한 대략 3배 증가된 위험에 있고, 총 ISS 집단의 6.7%를 차지한다는 것을 보여준다. 더욱이, 외인성 CNP의 첨가 후 NPR2 반수체기능부전의 세포 모델에서의 NPR2 신호전달의 용량 의존적 구제가 입증되었다.

전유전자성 모델(Liu, 등, Cell 177:1022-1034 e6 (2019); Boyle 등, Cell 169:1177-1186 (2017))에 따르면, 이 유전자가 코어 인간 성장 유전자이면, 이의 효과는 조절 네트워크를 유발하는 다수의 더 약한 흔한 유전 변이체에 의해 조절되어야 한다. 이 가정을 간접적으로 시험하기 위해, UK Biobank 프로젝트로부터의 임의의 샘플을 포함하지 않는 키에 대한 가장 큰 공개된 GWAS 메타-분석을 사용하여 키에 대해 다유전성 위험 점수(PRS)가 계산되었다. 코호트를 5개의 동등한-크기(n = 6,824)의 PRS 사분위(PRS 1은 가장 낮은 키이고, PRS 5는 가장 큰 키임)로 나눴다. 증가하는 PRS 점수와 평균 키 사이의 용량 의존적 관계가 있었다(각각의 PRS 사분위 증가당 β = 0.30)(도 8a). 5개의 코어 유전자에서의 LoF 변이체의 보균자는 5개의 상이한 PRS 배경에 걸쳐 비보균자보다 일관되게 더 짧았다. 도 8을 참조한다. 데이터는 PRS 및 희귀 단백질 변이체의 조합 효과가 상가 모델과 일치한다는 것을 제시한다: 다유전자 효과는 보균자 및 비보균자 둘 다에서 키를 조정하였다.

기준품으로서 PRS = 3을 사용하여 PRS 그룹에 걸친 ISS에 대한 위험을 게산하였다. 가장 낮은 PRS 그룹은 ISS에 대한 증가된 위험과 연관되었고, 가장 높은 PRS 그룹은 감소된 위험과 연관되었다(각각 PRS 1 및 PRS 5에 대해 OR = 5.43, P = 8.58 x 10-34; OR = 0.22, P = 4.49 x 10-7). PRS 그룹에 의해 계층화된 ISS에 대해 5개의 코어 유전자의 희귀 코딩 변이체의 효과를 평가하였다. 임의의 5개의 코어 유전자의 보균자는 제1 3 사분위에서 ISS에 대한 증가된 위험에 있었다(OR = 2.64, P = 3.09 x 10-5; OR = 2.17, P = 0.04; OR = 5.29, P = 1.58 x 10-5; OR = 2.72, P = 0.09 도 8c 내지 도 8f). PRS에 의해 계층화된 ISS 위험에 대한 각각의 개별 코어 유전자의 보균자에 대해 일치된 효과 방향이 관찰되었다(도 8c 내지 도 8f).

추가로, 개별적인 작은 효과에 의한 다수의 일반 유전 변이로부터 보통 생기는 PRS의 상가 효과는 데이터세트에서 키에서의 변이의 20.1%를 예측하였다. PRS의 이 상가 효과는 코어 유전자의 희귀 코딩 변이의 보균자에서뿐만 아니라 비보균자에서 유사한 규모를 갖는 것으로 보였다. 이 관찰은 PRS가 희귀 병원균성 변이체(특히 여기 기재된 것과 같은 반수체기능부전의 모델에서)의 침투의 차이에서의 강한 기여자일 수 있다는 것을 나타낸다. 이 데이터를 뒷받침하여, 낮은 NPR2 활성을 갖는 8명의 NPR2 변이체 보균자 중 2명이 낮은 키-정상 키를 갖는다는 것이 관찰되었다. 이 데이터는 NPR2에서의 돌연변이를 보유하는 대부분의 ISS 개체가 또한 이들이 NPR2 활성 소실의 병원균성 효과에 더 민감하게 하는 다유전성 배경을 가질 수 있다는 것을 제시한다.

이 결과는 CNP-기반 치료가 NPR2 반수체기능부전 환자 집단에서 효과적이었다는 아이디어를 뒷받침한다. 추가로, 일반 집단의 NPR2 보균자에서의 cGMP 수준 및 키의 상당한 이작용성(LoF 및 GoF) 상관관계를 보여주는 결과는 CNP 유사체에 의해 이 수용체를 표적화하는 것이 모든 ISS 개체에 대한 효과적인 치료일 것이라는 것을 제시한다.

본원에 기재된 개시내용의 모든 실시형태는 본원에 기재된 다른 실시형태의 임의의 하나 이상과 선택적으로 조합될 수 있다고 이해된다. 본원에 인용된 모든 특허 문헌 및 모든 비특허 문헌은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

따라서, 본 발명이 개시된 특정 실시형태에 제한되지 않고, 첨부된 청구항; 상기 설명에 의해 정의되고/되거나 첨부된 도면에 도시된 것과 같이 본 발명의 사상 및 범위 내에 있는 모든 변형을 포괄하도록 의도된다고 이해된다. 결과적으로 첨부된 청구항에 보이는 것과 같은 오직 이러한 제한이 본 개시내용에 있어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Biomarin Pharmaceutical Inc. <120> CNP VARIANTS AND CONJUGATES THEREOF <130> 30610/54736 <150> US 62/901,093 <151> 2019-09-16 <150> US 62/935,050 <151> 2019-11-13 <150> US 62/963,350 <151> 2020-01-20 <150> US 62/964,852 <151> 2020-01-23 <150> US 62/038,667 <151> 2020-06-12 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 2 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 2 Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly 1 5 10 15 Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 20 25 30 Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 4 Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys 1 5 10 15 Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu 20 25 30 Gly Cys <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 5 Pro Gly Gln Glu His Pro Gln Ala Arg Arg Tyr Arg Gly Ala Gln Arg 1 5 10 15 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 6 Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Arg Tyr Arg Gly Ala Asn Arg 1 5 10 15 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 7 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 7 Pro Gly Gln Glu His Pro Gln Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Gln Lys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N -terminal Acetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> C -terminal OH <400> 8 Pro Gly Gln Glu His Pro Gln Ala Arg Arg Tyr Arg Gly Ala Gln Arg 1 5 10 15 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 9 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N -terminal Acetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> C -terminal NH2 <400> 9 Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N -terminal Acetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> C -terminal OH <400> 10 Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Arg Tyr Arg Gly Ala Asn Arg 1 5 10 15 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N -terminal Acetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> C -terminal NH2 <400> 11 Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Arg Tyr Arg Gly Ala Asn Arg 1 5 10 15 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N -terminal Acetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> C -terminal NH2 <400> 12 Pro Gly Gln Glu His Pro Gln Ala Arg Arg Tyr Arg Gly Ala Gln Arg 1 5 10 15 Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N -terminal Acetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> C -terminal NH2 <400> 13 Pro Gly Gln Glu His Pro Gln Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Gln Lys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N -terminal Acetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> C -terminal OH <400> 14 Pro Gly Gln Glu His Pro Gln Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Gln Lys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 15 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 15 Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln 1 5 10 15 Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu 20 25 30 Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser 35 40 45 Gly Leu Gly Cys 50 <210> 16 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 16 Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu 1 5 10 15 His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser 20 25 30 Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly 35 40 45 Leu Gly Cys 50 <210> 17 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 17 Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His 1 5 10 15 Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys 20 25 30 Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu 35 40 45 Gly Cys 50 <210> 18 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 18 Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro 1 5 10 15 Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly 20 25 30 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 35 40 45 Cys <210> 19 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 19 Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn 1 5 10 15 Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys 20 25 30 Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 45 <210> 20 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 20 Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala 1 5 10 15 Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe 20 25 30 Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 45 <210> 21 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 21 Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg 1 5 10 15 Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly 20 25 30 Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 45 <210> 22 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 22 Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys 1 5 10 15 Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu 20 25 30 Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 45 <210> 23 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 23 Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr 1 5 10 15 Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys 20 25 30 Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 <210> 24 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 24 Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 20 25 30 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 <210> 25 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 25 Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly 1 5 10 15 Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp 20 25 30 Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 <210> 26 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 26 Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala 1 5 10 15 Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg 20 25 30 Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 <210> 27 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 27 Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn 1 5 10 15 Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile 20 25 30 Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 40 <210> 28 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 28 Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 29 Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu 1 5 10 15 Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser 20 25 30 Gly Leu Gly Cys 35 <210> 30 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 30 His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser 1 5 10 15 Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly 20 25 30 Leu Gly Cys 35 <210> 31 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 31 Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly 1 5 10 15 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 20 25 30 Cys <210> 32 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 32 Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys 1 5 10 15 Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 30 <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 33 Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe 1 5 10 15 Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 34 Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly 1 5 10 15 Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 30 <210> 35 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 35 Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu 1 5 10 15 Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 36 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 36 Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys 1 5 10 15 Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 37 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 37 Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 38 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 38 Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 39 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 39 Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg 1 5 10 15 Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 25 <210> 40 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 40 Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile 1 5 10 15 Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 41 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 42 Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 1 5 10 15 Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 43 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 43 Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser 1 5 10 15 Gly Leu Gly Cys 20 <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 44 Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly 1 5 10 15 Leu Gly Cys <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 45 Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu 1 5 10 15 Gly Cys <210> 46 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 46 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly 1 5 10 15 Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 47 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 47 Met Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 48 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 48 Pro Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 49 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 49 Gly 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<211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 53 Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Gln Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 54 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 54 Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Gln Gln 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 55 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 55 Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Pro 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 56 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 56 Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly 20 25 30 Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 35 40 45 Ser Gly Leu Gly Cys 50 <210> 57 <211> 667 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 57 atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60 ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120 gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180 cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240 ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300 tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360 actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420 cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480 aattggactg ctcgggctgc tttgctgtat ctggatgctc gcacagatga ccggccccac 540 tacttcacca tcgagggggt gtttgaggcc ctgcagggca gcaacctcag tgtgcaacac 600 caggtgtata cccgagagcc aggtggccct gagcaagcca cccacttcat cagagccaac 660 gggcgca 667 <210> 58 <211> 667 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 58 atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60 ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120 gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180 cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240 ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300 tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360 actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420 cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480 aattggactg ctcgggctgc tttgctgtat ctggatgctc gcacagatga ccggccccac 540 tacttcacca tcgagggggt gtttgaggcc ctgcagggca gcaacctcag tgtgcaacac 600 caggtgtata cccgagagcc aggtggccct gagcaagcca cccacttcat cagagccaac 660 gggcgca 667 <210> 59 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 59 atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60 ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120 gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180 cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240 ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300 tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360 actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420 cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480 acaattggac tgctcgggct gctttgctgt atctggatgc tcgcacagat gaccggcccc 540 actacttcac catcgagggg gtgtttgagg ccctgcaggg cagcaacctc agtgtgcaac 600 accaggtgta tacccgagag ccaggtggcc ctgagcaagc cacccacttc atcagagcca 660 acgggcgca 669 <210> 60 <211> 668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 60 atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60 ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120 gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180 cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240 ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300 tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360 actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420 cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480 aattggactg ctcgggctgc tttgctgtat ctggatgctc gcacagatga ccggccccac 540 tacttcacca tccgaggggg tgtttgaggc cctgcagggc agcaacctca gtgtgcaaca 600 ccaggtgtat acccgagagc caggtggccc tgagcaagcc acccacttca tcagagccaa 660 cgggcgca 668 <210> 61 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 61 atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60 ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120 gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180 cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240 ccggggtgtt tgaggccctg cagggcagca acctcagtgt gcaacaccag gtgtataccc 300 gagagccagg tggccctgag caagccaccc acttcatcag agccaacggg cgca 354 <210> 62 <211> 1047 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 62 Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro 20 25 30 Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala 35 40 45 Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu 50 55 60 Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Pro Leu Arg Ala Val Asp Leu Lys Leu Tyr His Asp Pro Asp Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Pro Gly Cys Val Tyr Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Ala 100 105 110 Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly 115 120 125 Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro 130 135 140 Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu Phe Val Val Thr Leu His Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ala Arg Ala Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Thr Asp 165 170 175 Asp Arg Pro His Tyr Phe Thr Ile Glu Gly Val Phe Glu Ala Leu Gln 180 185 190 Gly Ser Asn Leu Ser Val Gln His Gln Val Tyr Thr Arg Glu Pro Gly 195 200 205 Gly Pro Glu Gln Ala Thr His Phe Ile Arg Ala Asn Gly Arg Ile Val 210 215 220 Tyr Ile Cys Gly Pro Leu Glu Met Leu His Glu Ile Leu Leu Gln Ala 225 230 235 240 Gln Arg Glu Asn Leu Thr Asn Gly Asp Tyr Val Phe Phe Tyr Leu Asp 245 250 255 Val Phe Gly Glu Ser Leu Arg Ala Gly Pro Thr Arg Ala Thr Gly Arg 260 265 270 Pro Trp Gln Asp Asn Arg Thr Gln Glu Gln Ala Gln Ala Leu Arg Glu 275 280 285 Ala Phe Gln Thr Val Leu Val Ile Thr Tyr Arg Glu Pro Pro Asn Pro 290 295 300 Glu Tyr Gln Glu Phe Gln Asn Arg Leu Leu Ile Arg Ala Arg Glu Asp 305 310 315 320 Phe Gly Val Glu Leu Ala Pro Ser Leu Met Asn Leu Ile Ala Gly Cys 325 330 335 Phe Tyr Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Gln Val Leu Asn Glu Thr Ile 340 345 350 Gln Glu Gly Gly Thr Arg Glu Asp Gly Leu Arg Ile Val Glu Lys Met 355 360 365 Gln Gly Arg Arg Tyr His Gly Val Thr Gly Leu Val Val Met Asp Lys 370 375 380 Asn Asn Asp Arg Glu Thr Asp Phe Val Leu Trp Ala Met Gly Asp Leu 385 390 395 400 Glu Ser Gly Asp Phe Gln Pro Ala Ala His Tyr Ser Gly Ala Glu Lys 405 410 415 Gln Ile Trp Trp Thr Gly Arg Pro Ile Pro Trp Val Lys Gly Ala Pro 420 425 430 Pro Leu Asp Asn Pro Pro Cys Ala Phe Asp Leu Asp Asp Pro Ser Cys 435 440 445 Asp Lys Thr Pro Leu Ser Thr Leu Ala Ile Val Ala Leu Gly Thr Gly 450 455 460 Ile Thr Phe Ile Met Phe Gly Val Ser Ser Phe Leu Ile Phe Arg Lys 465 470 475 480 Leu Met Leu Glu Lys Glu Leu Ala Ser Met Leu Trp Arg Ile Arg Trp 485 490 495 Glu Glu Leu Gln Phe Gly Asn Ser Asp Arg Tyr His Lys Gly Ala Gly 500 505 510 Ser Arg Leu Thr Leu Ser Leu Arg Gly Ser Ser Tyr Gly Ser Leu Met 515 520 525 Thr Ala His Gly Lys Tyr Gln Ile Phe Ala Asn Thr Gly His Phe Lys 530 535 540 Gly Asn Val Val Ala Ile Lys His Val Asn Lys Lys Arg Ile Glu Leu 545 550 555 560 Thr Arg Gln Val Leu Phe Glu Leu Lys 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Phe Gly Gln Ile Lys Gly 770 775 780 Phe Ile Arg Arg Phe Asn Lys Glu Gly Gly Thr Ser Ile Leu Asp Asn 785 790 795 800 Leu Leu Leu Arg Met Glu Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Glu Lys Leu Val 805 810 815 Glu Glu Arg Thr Gln Ala Tyr Leu Glu Glu Lys Arg Lys Ala Glu Ala 820 825 830 Leu Leu Tyr Gln Ile Leu Pro His Ser Val Ala Glu Gln Leu Lys Arg 835 840 845 Gly Glu Thr Val Gln Ala Glu Ala Phe Asp Ser Val Thr Ile Tyr Phe 850 855 860 Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Ala Leu Ser Ala Glu Ser Thr Pro Met 865 870 875 880 Gln Val Val Thr Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Thr Cys Phe Asp Ala Ile 885 890 895 Ile Asp Asn Phe Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr 900 905 910 Met Val Val Ser Gly Leu Pro Gly Arg Asn Gly Gln Arg His Ala Pro 915 920 925 Glu Ile Ala Arg Met Ala Leu Ala Leu Leu Asp Ala Val Ser Ser Phe 930 935 940 Arg Ile Arg His Arg Pro His Asp Gln Leu Arg Leu Arg Ile Gly Val 945 950 955 960 His Thr Gly Pro Val Cys Ala Gly Val Val Gly Leu Lys Met Pro Arg 965 970 975 Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser 980 985 990 Asn Gly Gln Ala Leu Lys Ile His Val Ser Ser Thr Thr Lys Asp Ala 995 1000 1005 Leu Asp Glu Leu Gly Cys Phe Gln Leu Glu Leu Arg Gly Asp Val 1010 1015 1020 Glu Met Lys Gly Lys Gly Lys Met Arg Thr Tyr Trp Leu Leu Gly 1025 1030 1035 Glu Arg Lys Gly Pro Pro Gly Leu Leu 1040 1045 <210> 63 <211> 1047 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 63 Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro 20 25 30 Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala 35 40 45 Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu 50 55 60 Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Pro Leu Arg Ala Val Asp Leu Lys Leu Tyr His Asp Pro Asp Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Pro Gly Cys Val Tyr Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Ala 100 105 110 Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly 115 120 125 Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro 130 135 140 Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu Phe Val Val Thr Leu His Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ala Arg Ala Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Thr Asp 165 170 175 Asp Arg Pro His Tyr Phe Thr Ile Glu Gly Val Phe Glu Ala Leu Gln 180 185 190 Gly Ser Asn Leu Ser Val Gln His Gln Val Tyr Thr Arg Glu Pro Gly 195 200 205 Gly Pro Glu Gln Ala Thr His Phe Ile Arg Ala Asn Gly Arg Ile Val 210 215 220 Tyr Ile Cys Gly Pro Leu Glu Met Leu His Glu Ile Leu Leu Gln Ala 225 230 235 240 Gln Arg Glu Asn Leu Thr Asn Gly Asp Tyr Val Phe Phe Tyr Leu Asp 245 250 255 Val Phe Gly Glu Ser Leu Arg Ala Gly Pro Thr Arg Ala Thr Gly Arg 260 265 270 Pro Trp Gln Asp Asn Arg Thr Gln Glu Gln Ala Gln Ala Leu Arg Glu 275 280 285 Ala Phe Gln Thr Val Leu Val Ile Thr Tyr Arg Glu Pro Pro Asn Pro 290 295 300 Glu Tyr Gln Glu Phe Gln Asn Arg Leu Leu Ile Arg Ala Arg Glu Asp 305 310 315 320 Phe Gly Val Glu Leu Ala Pro Ser Leu Met Asn Leu Ile Ala Gly Cys 325 330 335 Phe Tyr Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Gln Val Leu Asn Glu Thr Ile 340 345 350 Gln Glu Gly Gly Thr Arg Glu Asp Gly Leu Arg Ile Val Glu Lys Met 355 360 365 Gln Gly Arg Arg Tyr His Gly Val Thr Gly Leu Val Val Met Asp Lys 370 375 380 Asn Asn Asp Arg Glu Thr Asp Phe Val Leu Trp Ala Met Gly Asp Leu 385 390 395 400 Glu Ser Gly Asp Phe Gln Pro Ala Ala His Tyr Ser Gly Ala Glu Lys 405 410 415 Gln Ile Trp Trp Thr Gly Arg Pro Ile Pro Trp Val Lys Gly Ala Pro 420 425 430 Pro Leu Asp Asn Pro Pro Cys Ala Phe Asp Leu Asp Asp Pro Ser Cys 435 440 445 Asp Lys Thr Pro Leu Ser Thr Leu Ala Ile Val Ala Leu Gly Thr Gly 450 455 460 Ile Thr Phe Ile Met Phe Gly Val Ser Ser Phe Leu Ile Phe Arg Lys 465 470 475 480 Leu Met Leu Glu Lys Glu Leu Ala Ser Met Leu Trp Arg Ile Arg Trp 485 490 495 Glu Glu Leu Gln Phe Gly Asn Ser Asp Arg Tyr His Lys Gly Ala Gly 500 505 510 Ser Arg Leu Thr Leu Ser Leu Arg Gly Ser Ser Tyr Gly Ser Leu Met 515 520 525 Thr Ala His Gly Lys Tyr Gln Ile Phe Ala Asn Thr Gly His Phe Lys 530 535 540 Gly Asn Val Val Ala Ile Lys His Val Asn Lys Lys Arg Ile Glu Leu 545 550 555 560 Thr Arg Gln Val Leu Phe Glu Leu Lys His Met Arg Asp Val Gln Phe 565 570 575 Asn His Leu Thr Arg Phe Ile Gly Ala Cys Ile Asp Pro Pro Asn Ile 580 585 590 Cys Ile Val Thr Glu Tyr Cys Pro Arg Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu 595 600 605 Glu Asn Asp Ser Ile Asn Leu Asp Trp Met Phe Arg Tyr Ser Leu Ile 610 615 620 Asn Asp Leu Val Lys Gly Met Ala Phe Leu His Asn Ser Ile Ile Ser 625 630 635 640 Ser His Gly Ser Leu Lys Ser Ser Asn Cys Val Val Asp Ser Arg Phe 645 650 655 Val Leu Lys Ile Thr Asp Tyr Gly Leu Ala Ser Phe Arg Ser Thr Ala 660 665 670 Glu Pro Asp Asp Ser His Ala Leu Tyr Ala Lys Lys Leu Trp Thr Ala 675 680 685 Pro Glu Leu Leu Ser Gly Asn Pro Leu Pro Thr Thr Gly Met Gln Lys 690 695 700 Ala Asp Val Tyr Ser Phe Ala Ile Ile Leu Gln Glu Ile Ala Leu Arg 705 710 715 720 Ser Gly Pro Phe Tyr Leu Glu Gly Leu Asp Leu Ser Pro Lys Glu Ile 725 730 735 Val Gln Lys Val Arg Asn Gly Gln Arg Pro Tyr Phe Arg Pro Ser Ile 740 745 750 Asp Arg Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Val Leu Leu Met Glu Arg Cys 755 760 765 Trp Ala Gln Asp Pro Thr Glu Arg Pro Asp Phe Gly Gln Ile Lys Gly 770 775 780 Phe Ile Arg Arg Phe Asn Lys Glu Gly Gly Thr Ser Ile Leu Asp Asn 785 790 795 800 Leu Leu Leu Arg Met Glu Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Glu Lys Leu Val 805 810 815 Glu Glu Arg Thr Gln Ala Tyr Leu Glu Glu Lys Arg Lys Ala Glu Ala 820 825 830 Leu Leu Tyr Gln Ile Leu Pro His Ser Val Ala Glu Gln Leu Lys Arg 835 840 845 Gly Glu Thr Val Gln Ala Glu Ala Phe Asp Ser Val Thr Ile Tyr Phe 850 855 860 Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Ala Leu Ser Ala Glu Ser Thr Pro Met 865 870 875 880 Gln Val Val Thr Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Thr Cys Phe Asp Ala Ile 885 890 895 Ile Asp Asn Phe Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr 900 905 910 Met Val Val Ser Gly Leu Pro Gly Arg Asn Gly Gln Arg His Ala Pro 915 920 925 Glu Ile Ala Arg Met Ala Leu Ala Leu Leu Asp Ala Val Ser Ser Phe 930 935 940 Arg Ile Arg His Arg Pro His Asp Gln Leu Arg Leu Arg Ile Gly Val 945 950 955 960 His Thr Gly Pro Val Cys Ala Gly Val Val Gly Leu Lys Met Pro Arg 965 970 975 Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser 980 985 990 Asn Gly Gln Ala Leu Lys Ile His Val Ser Ser Thr Thr Lys Asp Ala 995 1000 1005 Leu Asp Glu Leu Gly Cys Phe Gln Leu Glu Leu Arg Gly Asp Val 1010 1015 1020 Glu Met Lys Gly Lys Gly Lys Met Arg Thr Tyr Trp Leu Leu Gly 1025 1030 1035 Glu Arg Lys Gly Pro Pro Gly Leu Leu 1040 1045 <210> 64 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 64 Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro 20 25 30 Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala 35 40 45 Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu 50 55 60 Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Pro Leu Arg Ala Val Asp Leu Lys Leu Tyr His Asp Pro Asp Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Pro Gly Cys Val Tyr Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Ala 100 105 110 Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly 115 120 125 Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro 130 135 140 Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu Phe Val Val Thr Leu His Gly His Phe 145 150 155 160 Thr Ile Gly Leu Leu Gly Leu Leu Cys Cys Ile Trp Met Leu Ala Gln 165 170 175 Met Thr Gly Pro Thr Thr Ser Pro Ser Arg Gly Cys Leu Arg Pro Cys 180 185 190 Arg Ala Ala Thr Ser Val Cys Asn Thr Arg Cys Ile Pro Glu Ser Gln 195 200 205 Val Ala Leu Ser Lys Pro Pro Thr Ser Ser Glu Pro Thr Gly Ala Leu 210 215 220 Cys Ile Ser Ala Ala Arg Trp Arg Cys Phe Met Arg Ser Cys Phe Arg 225 230 235 240 Pro Arg Gly Arg Thr 245 <210> 65 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Seuqence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 65 Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro 20 25 30 Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala 35 40 45 Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu 50 55 60 Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Pro Leu Arg Ala Val Asp Leu Lys Leu Tyr His Asp Pro Asp Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Pro Gly Cys Val Tyr Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Ala 100 105 110 Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly 115 120 125 Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro 130 135 140 Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu Phe Val Val Thr Leu His Gly His Phe 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ala Arg Ala Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Thr Asp 165 170 175 Asp Arg Pro His Tyr Phe Thr Ile Arg Gly Gly Val 180 185 <210> 66 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 66 Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro 20 25 30 Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala 35 40 45 Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu 50 55 60 Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Pro Gly Cys Leu Arg Pro Cys Arg Ala Ala Thr Ser Val Cys Asn Thr 85 90 95 Arg Cys Ile Pro Glu Ser Gln Val Ala Leu Ser Lys Pro Pro Thr Ser 100 105 110 Ser Glu Pro Thr Gly Ala Leu Cys Ile Ser Ala Ala Arg Trp Arg Cys 115 120 125 Phe Met Arg Ser Cys Phe Arg Pro Arg Gly Arg Thr 130 135 140 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 67 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 68 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 68 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20

Claims

C형 나트륨이뇨 펩타이드의 변이체로서,
PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 5);
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 1);
PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 6); 및
PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열 번호 7)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변이체.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 아세틸 기를 추가로 포함하는, 변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아세틸 기는 펩타이드의 N 말단에 있는, 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 C 말단에서 OH 또는 NH₂ 기를 추가로 포함하는, 변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체 모이어티를 포함하는, 변이체.
제5항에 있어서, 상기 접합체 모이어티는 CNP 사이클릭 도메인의 잔기 위에 또는 CNP 사이클릭 도메인이 아닌 부위에서 있는, 변이체.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 접합체 모이어티는 리신 잔기 위에 있는, 변이체.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체 모이어티는 산 모이어티를 포함하는, 변이체.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체 모이어티는 친수성 스페이서에 연결된 산 모이어티를 포함하는, 변이체.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 산 모이어티 및 친수성 스페이서는 구조 AEEA-AEEA-γGlu-C18DA를 갖는, 변이체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는
Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 8);
Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 9);
Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 10);
Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 11); 및
Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열 번호 12)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변이체.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 CNP 변이체는 Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 1) 또는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH(서열 번호 1)인, 변이체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 링커를 포함하는, 변이체.
제13항에 있어서, 상기 링커는 CNP 사이클릭 도메인의 잔기 위에 또는 CNP 사이클릭 도메인이 아닌 부위에서 있는, 변이체.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 링커는 가수분해 가능한 링커인, 변이체.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 리신 잔기 위에 있는, 변이체.
제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP 변이체는 링커를 통해 접합체 모이어티에 연결된, 변이체.
제17항에 있어서, 상기 링커는 접합체 모이어티의 친수성 스페이서를 통해 접합체 모이어티에 부착된, 변이체.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 펩토이드 링커 또는 전자 링커인, 변이체.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 합성으로 제조된, 변이체.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 37℃, pH 7 내지 7.4에서 10일 동안 안정한, 변이체.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 cGMP 검정에서 0.1 내지 10 nm의 EC50을 갖는, 변이체.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 45% 초과의 펩타이드는 37℃, pH 7.4에서 수성 배지에서 10일 후 검출되는, 변이체.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 하나 이상의 지질, 지방산, 친수성 스페이서 모이어티 또는 선택적으로 이들의 조합에 접합된, 변이체.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 Pro-Gly-CNP37, CNP-22, 또는 Pro-Gly CNP 및 CNP-22 둘 다와 비교하여 더 긴 반감기를 갖는, 변이체.
약제학적 조성물로서,
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 CNP 변이체, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제26항에 있어서, 약 4 내지 약 6의 pH를 갖는 시트르산/시트레이트 완충액 또는 아세트산/아세테이트 완충액을 포함하는 제형으로부터 제조된 동결건조된 제형인, 조성물.
제27항에 있어서, 상기 동결건조된 제형은 등장성-조정제 또는 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 벌크화제를 추가로 포함하는 제형으로부터 제조된, 조성물.
제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 동결건조된 제형은 메티오닌, 아스코르브산, 아스코르브산의 염 형태, 티오글리세롤, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항산화제를 추가로 포함하는 제형으로부터 제조된, 조성물.
골-관련 장애 또는 골격 이형성증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 골-관련 장애 또는 골격 이형성증을 치료하는 방법으로서,
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 CNP 변이체를 포함하는 조성물 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 골-관련 장애 또는 골격 이형성증은 골관절염, 저인산혈 구루병, 연골무형성증, 연골형성저하증, 저신장, 소인증, 골연골이형성증, 치사성 이형성증, 불완전 골형성, 연골무발생증, 점상 연골형성이상, 동형접합 연골무형성증, 점상 연골형성이상, 굴지 형성이상, 선천성 치사성 저인산증, 불완전 골형성의 신생아 치사형, 단늑골 다지 증후군, 연골형성저하증, 점상 연골형성이상의 지근형, 얀센형 골간단 이형성증, 선천성 척추골단 이형성증, 불완전골형성증, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 랑거형 중간지골 이형성증, 니버겔트형 중간지골 이형성증, 로비노 증후군(Robinow syndrome), 라인하르트 증후군(Reinhardt syndrome), 선단이골증, 말초 이골증, 니스트 이형성증(Kniest dysplasia), 섬유연골형성, 로버트 증후군(Roberts syndrome), 사지말단 중간지골 이형성증, 소지증, 모르키오 증후군(Morquio syndrome), 니스트 증후군(Kniest syndrome), 유가영양 이형성증 및 척추골단골간단 이형성증, NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/래리 웨일(Leri Weill)), PTPN11 돌연변이(누난 증후군(Noonan's syndrome)), 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R: insulin growth factor 1 receptor) 돌연변이 및 특발성 저신장으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
골의 신장 또는 긴 골 성장의 증가를 필요로 하는 대상체에서 골을 신장시키거나 긴 골 성장을 증가시키는 방법으로서,
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 CNP 변이체를 포함하는 조성물 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 투여는 골을 신장시키거나 긴 골 성장을 증가시키는, 방법.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 피하로, 진피내로, 관절내로, 경구로 또는 근육내로 투여되는, 방법.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 매일 1회, 주마다 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여되는, 방법.
제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 서방형 조성물인, 조성물.
CNP-반응성 병태 또는 장애를 치료하는 방법으로서,
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 CNP 변이체 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계, 및
상기 대상체에서 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준을 모니터링하는 단계를 포함하며,
적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준의 증가는 대상체 또는 병태 또는 장애에 대한 CNP 변이체의 치료학적 효과를 나타내는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 CNP 변이체의 투여의 양 또는 빈도를 조정하는 단계를 추가로 포함하고,
i) 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준이 표적 수준보다 낮으면 CNP 변이체의 투여의 양 또는 빈도는 증가하거나;
ii) 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준이 표적 수준보다 높으면 CNP 변이체의 투여의 양 또는 빈도는 감소하는, 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커는 CNP, cGMP, 콜라겐 II형의 프로펩타이드 및 이의 단편, 콜라겐 II형 및 이의 단편, 콜라겐 I형 C-텔로펩타이드(CTx), 오스테오칼신, 증식 세포 핵 항원(PCNA: proliferating cell nuclear antigen), I형 프로콜라겐의 프로펩타이드(PINP) 및 이의 단편, 콜라겐 I형 및 이의 단편, 아그레칸 콘드로이틴 황산염, 콜라겐 X 및 알칼리 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 CNP 변이체를 제조하는 방법으로서,
Fmoc 아미노산을 사용하여 고상 수지에서 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는, 방법.
제39항에 있어서, 상기 펩타이드는 수지를 NMP/Ac₂O/DIEA(10:1:0.1, v/v/v)와 반응시킴으로써 아세틸화되는, 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 펩타이드는, 선택적으로 리신 잔기 위에, 지질 모이어티에 접합된, 방법.
제41항에 있어서, 상기 리신에서 보호성 아미노 기를 절단하는 단계, 상기 펩타이드를 2x Fmoc-아미노 PEG(2), 이어서 아미노산과 반응시킨 후, 지질 또는 지방산 모이어티를 접합시키는 단계를 포함하는, 방법.