KR20220045206A

KR20220045206A - 연장 방출형 조성물을 위한 소수성 펩티드 염

Info

Publication number: KR20220045206A
Application number: KR1020227007960A
Authority: KR
Inventors: 제이크 앙; 수닐 쿠마 바투; 조슈아 래버; 캐롤 에스트라다; 조나단 레보위츠; 조이스 초우
Original assignee: 바이오마린 파머수티컬 인크.
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2022-04-12
Also published as: CN114423447A; JP2022544382A; WO2021030411A1; US20220280647A1; MX2022001857A; BR112022002582A2; IL290468A; EP4013453A1; AU2020328539A1; CA3150733A1

Abstract

본 개시내용은, 일반적으로, 수용액에서 저용해도 물질을 형성하고 대상체에 투여될 때 펩티드 성분의 연장 또는 지속 방출이 가능한 친수성 펩티드의 소수성 염에 관한 것이다. C형 나트륨이뇨 펩티드의 소수성 염 및 이의 용도 또한 개시된다.

Description

연장 방출형 조성물을 위한 소수성 펩티드 염

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된, 2019년 8월 12일에 출원된 미국 가특허출원 제62/885,705호, 2019년 11월 13일에 출원된 미국 가특허출원 제62/935,052호, 2020년 1월 20일에 출원된 미국 가특허출원 제62/963,354호, 2020년 1월 23일에 출원된 미국 가특허출원 제62/964,848호, 및 2020년 6월 12일에 출원된 미국 가특허출원 제63/038,652호의 우선권 이익을 주장한다.

전자적으로 제출된 자료의 참조 포함

본 개시내용의 일부인 서열 목록은 명세서와 함께 텍스트 파일로 제출된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 2020년 8월 6일에 생성된 "54627_Seqlisting.txt"이며 크기는 54,454 바이트이다. 서열 목록의 대상(subject matter)은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.

개시내용의 분야

본 개시내용은, 일반적으로, 수용액에서 저용해도 물질을 형성하고 대상체에 투여될 때 펩티드 성분의 연장(extended) 또는 지속(sustained) 방출이 가능한 친수성 펩티드의 소수성 염에 관한 것이다.

지속 전달형 치료제는, 예를 들어, 투약 횟수를 감소시키거나, 대상체가 투여받을 수 있는 약물의 양을 감소시켜 치료적 이점을 달성하는 것이 바람직하다. 그러나, 약물의 특정 유형의 활성 성분은 체내 특정 부위에 치료제를 전달할 수 있거나 약물이 시간 경과에 따라 입자로부터 서서히 빠져나가도록 하는 특정 서방성(slow release) 특성을 갖는 지속 방출형 조성물(예를 들어, 장용 코팅된 용량 반응성(dose responsive) 캡슐 또는 정제, 또는 리포솜 또는 나노입자와 같은 미소구체)로 제형화하기 어렵다.

본 개시내용은 염이 수성 매질에서 고체 또는 반고체를 형성하도록 용액에서 저용해도를 갖는 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 염은 수용액에서 비-염(non-salt) 형태의 펩티드보다 용해 속도가 더 느리며, 전형적인 연장 방출형 제형으로 재제형화할 필요 없이 연장 방출형 치료제에 사용될 수 있음이 본원에 나타나 있다.

정전기적으로 하전된 펩티드의 소수성 염을 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 상기 염은 소수성 반대이온과 복합체화된 정전기적으로 하전된 펩티드를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 염은 소수성 펩티드 염이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염 중 펩티드의 중량%는 상기 펩티드 염 중 적어도 약 10 중량%의 펩티드이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염 중 펩티드의 중량은 적어도 약 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 60 중량%, 70 중량% 또는 그 이상이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염 중 활성 펩티드의 중량%는 적어도 약 5 중량%이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염 중 활성 펩티드의 중량%는 약 5 중량%, 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량% 또는 그 이상이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 염에 존재하는 총 펩티드와 비교하여 활성 펩티드 %는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 펩티드 염은 용해가 느리며, 1x 포스페이트 완충 식염수(phosphate buffered saline; PBS)에서 1 mg/mL로 즉시 용해되지 않는다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 비공유 결합을 통해 상기 정전기적으로 하전된 펩티드에 복합체화된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 펩티드 염은 상기 펩티드-소수성 반대이온 복합체에 복합체화된 다가(polyvalent) 양이온을 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드, 소수성 반대이온, 및 다가 양이온은 비공유 결합을 통해 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드-소수성 반대이온 복합체에 복합체화된 다가 양이온은 금속 양이온이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온을 포함하는 펩티드 염은 약 0 내지 약 10의 cLogP를 갖거나, 상기 소수성 반대이온의 짝산은 -2 내지 5의 pKa를 갖거나, 둘 모두이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온을 포함하는 펩티드 염은 약 2 내지 약 9의 cLogP를 갖거나, 상기 소수성 반대이온의 짝산은 약 5 미만의 pKa를 갖거나, 둘 모두이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온을 포함하는 펩티드 염은 약 2 내지 약 9의 cLogP를 갖고, 상기 소수성 반대이온의 짝산은 약 5 미만의 pKa를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온을 포함하는 펩티드 염은 약 2 내지 약 9의 cLogP를 갖고, 상기 소수성 반대이온의 짝산은 약 0 내지 약 5의 pKa를 갖는다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 탈양성자화된 지방산, 탈양성자화된 담즙산, 나프토에이트(naphthoate) 및 이의 유도체, 니코티네이트(nicotinate) 및 이의 유도체, 알킬 설포네이트, 디알킬 설포숙시네이트, 인지질, 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬벤젠 설포네이트, 알킬 설페이트, 아릴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 알킬벤젠 설페이트, 이온성 계면활성제, 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트(docusate), 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine; PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC), 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol; PL), 포스파티데이트(phosphatidate), 데카노에이트, 2-나프탈렌설포네이트, 1-헵탄설포네이트, 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 1-데칸설포네이트, 도데실 설페이트, 덱스트란 설페이트, 및 도데실 벤젠설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트 및 도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 +2, +3 또는 +4, 또는 그 이상의 전하를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 +2, +3 또는 +4의 전하를 갖는다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 +2의 전하를 갖는다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 +3의 전하를 갖는다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 +4의 전하를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 금속 양이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 백금(Pt), 구리(Cu) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 아연 또는 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 Mg² ⁺, Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 Zn² ⁺이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 Ca² ⁺이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 고체 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 비정질 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 겔 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 겔에 현탁되거나 연결된다(linked).

다양한 구현예들에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드는 C형 나트륨이뇨 펩티드(C-type natriuretic peptide; CNP)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 CNP 변이체이다. 본원에서 고려되는 CNP 및 CNP 변이체는 상세한 설명에서 보다 자세하게 기재된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 상기 소수성 반대이온에 복합체화되어 소수성 CNP 염 복합체를 형성한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 CNP 염은 상기 CNP-소수성 반대이온 복합체에 복합체화된 다가 양이온을 추가 포함하여 CNP-양이온-소수성 반대이온 염 복합체를 형성한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 금속 양이온이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열식별번호:1) LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열식별번호:2); QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3); PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4) 및 이들의 염.

다양한 구현예들에 있어서, 본원에서 상기 소수성 CNP 염을 형성하는 데 유용한 CNP 염은 CNP-아세테이트이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:5); PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:1); PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:6); PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:6); PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:5); 및 PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:7)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체 펩티드는 아세틸기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드의 N-말단 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드 서열 내의 아미노산 측쇄 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 C-말단에 OH 또는 NH₂기를 추가 포함한다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열식별번호:8);

Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열식별번호:9);

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열식별번호:10);

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열식별번호:11);

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열식별번호:12);

Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열식별번호:13); 및

Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열식별번호:14)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트이다. 다양한 구현예들에 있어서, 다가 양이온이 존재하는 경우, 상기 다가 양이온은 아연 또는 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 다가 양이온이 존재하는 경우, 상기 다가 양이온은 마그네슘, 아연 또는 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 Mg² ⁺, Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 Ca² ⁺이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 부형제, 희석제 또는 담체를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 부형제, 희석제 또는 담체는 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체이다. 또한, 본원에 기재된 소수성 염 조성물을 포함하는 멸균 약제학적 조성물이 제공된다.

본 개시내용에 의해 추가 고려되는 것은 본원에 기재된 소수성 펩티드 염을 포함하는 변형 방출형(modified release) 조성물이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 변형 방출형 조성물은 연장 방출형 조성물, 지속 방출형 조성물 또는 지연 방출형(delayed release) 조성물이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 연장 방출형 조성물은 소수성 펩티드 염을 포함하며, 여기에서 상기 펩티드 염 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자는 수용액 또는 오일에 재현탁된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 수용액은 물, 식염수, 또는 완충액이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 오일은 트리글리세리드 또는 지방산을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 포화되거나 불포화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산이 트리글리세리드 내에 존재할 때, 상기 지방산은 포화되거나 불포화되며, 중쇄 또는 장쇄 지방산일 수 있다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 C-6 내지 C-20 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, C-16, C-18, 또는 C-20 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 또는 도데칸산이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 연장 방출형 조성물의 경우, (i) 펩티드의 약 20% 미만이 1일차까지 방출되고; 및 (ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 매주 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 격주로 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 매월 방출된다.

다양한 구현예들에 있어서, pH 7 내지 7.6에서 펩티드의 약 20% 미만이 1일차까지 방출된다. (i) pH 7.0 내지 7.6에서, 펩티드의 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60% 미만이 1일차까지 방출되고; 및 (ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 매주 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 격주로 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 매월 방출되는 것이 추가 고려된다. (i) pH 7.0 내지 7.6에서, 펩티드의 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60% 미만이 1일차까지 방출되고; 및 (ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 매주 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 격주로 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 3주마다 방출거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 매월 방출되는 것이 추가 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, (i) pH 7.0 내지 7.6에서, 펩티드의 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 또는 약 75% 미만이 1일차까지 방출되고; 및 (ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 매주 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 격주로 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 매월 방출된다. (i) pH 7.0 내지 7.6에서, 펩티드의 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60% 약 65%, 약 70%, 또는 약 75% 미만이 1일차까지 방출되고; 및 (ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 매주 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 격주로 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 3주마다 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 매월 방출되거나; 또는 대안적으로 ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90%가 매주 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90%가 격주로 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90%가 3주마다 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90%가 매월 방출되는 것이 추가 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 매주 방출된다. 다양한 구현예들에 있어서, pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 격주로 방출된다. 다양한 구현예들에 있어서, pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 매월 방출된다. 상기 방출은 pH 7.0 내지 7.6, pH 7.1 내지 7.5, pH 7.2 내지 7.4, pH 7.2 내지 7.6, 또는 pH 7.0 내지 7.4일 수 있는 것으로 추가 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 연장 방출형 조성물은 부형제, 희석제 또는 담체를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 부형제, 희석제 또는 담체는 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 연장 방출형 조성물을 포함하는 멸균 약제학적 조성물이 제공된다.

또한, 소수성 CNP 염과 같은, 본원에 기재된 소수성 펩티드 염 조성물의 제조 방법이 본원에 제공된다. 이온성 계면활성제는 극성 헤드기(headgroup)가 복합체화 pH에 관계없이 영구적으로 하전되기 때문에 반대이온으로서 좋은 후보이다. 복합체화가 발생하는 pH의 조정은 펩티드 상의 전하량을 상이하게 하며 이는 펩티드:계면활성제 복합체화 화학량론의 제어를 가능하게 하여 생성되는 침전물 크기에 대한 제어를 가능하게 한다. 금속 양이온은 펩티드 아미노산의 음이온성 측쇄를 음이온성 소수성 반대이온에 결합하는 가교로서 사용될 수 있다. 상기 펩티드에 대한 양이온 및 반대이온 첨가의 순서와 속도는 금속 양이온과 음이온성 소수성 반대이온의 침전을 최소화하는 데 중요하다.

다양한 구현예들에 있어서, 본 개시내용은 a) 수용액 중의 정전기적으로 하전된 펩티드를 용액 중의 소수성 반대이온과 접촉시키는 단계; b) 상기 펩티드 및 반대이온이 복합체를 형성하기에 충분한 방식으로 상기 정전기적으로 하전된 펩티드 용액을 상기 소수성 반대이온 용액과 혼합하는 단계를 포함하는, 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 포함하는 조성물의 제조 방법을 고려하며, 여기에서, 상기 펩티드-반대이온 복합체의 형성은 상기 소수성 펩티드 염을 포함하는 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태의 형성을 초래한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 소수성 CNP 염이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 선택적으로 단계 (b) 전에, 상기 용액 중의 정전기적으로 하전된 펩티드를 수용액 중의 다가 양이온과 접촉시켜 펩티드-양이온 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 금속 양이온이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 혼합은 상기 소수성 반대이온 용액을 상기 정전기적으로 하전된 펩티드 용액에 적가(dropwise addition)하여 수행된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 용액들은 소수성 반대이온 용액의 각 점적(drop)을 첨가한 후 와류(vortexing)에 의해 혼합되거나, 기술분야에서 공지된 혼합을 위한 다른 수단에 의해 혼합된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 상기 펩티드 염을 완충액 또는 물에서 세척하는 단계를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 세척은 수용액, 예를 들어, 완충액 또는 물에서 수행된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 단계 (d) 원심분리에 의해 상기 펩티드 염을 수득하여 펩티드 염 펠릿을 형성하는 단계를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 염이 겔 형태인 경우, 상기 염은 원심분리에 의해 또는 액상을 따라낸 후(decanting) 동결건조 또는 기타 건조 방법에 의해 수득된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 단계 (e) 상기 펩티드 염 펠릿으로부터 물을 제거하는 단계를 추가 포함한다. 동결건조 또는 기술분야에 공지된 기술을 사용하는 건조에 의해 상기 펠릿으로부터 물 또는 또 다른 수용액이 제거될 수 있는 것으로 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 상기 펠릿을 수용액 또는 오일에 재현탁시키는 것을 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 수용액은 물, 식염수, 또는 완충액이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 오일은 트리글리세리드 또는 지방산을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 포화되거나 불포화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 트리글리세리드 내 지방산은 포화 또는 불포화되거나, 이들의 조합이다.

상기 지방산은 상기 오일 자체이거나 트리글리세리드 내에 존재할 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산이 트리글리세리드 내에 존재할 때, 상기 지방산은 포화되거나 불포화되며, 중쇄 또는 장쇄 지방산일 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 C-6 내지 C-20 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, C-16, C-18 또는 C-20 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 또는 도데칸산이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법은 상기 펩티드 내 양으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 1몰 당량의 소수성 반대이온의 펩티드:소수성 반대이온 비율을 사용하는 것을 고려한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법에 사용되는 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:1 내지 1:20, 또는 1:1 내지 1:50이다. 상기 합성 방법에 사용되는 펩티드: 반대이온 비율은 1:2 내지 1:15, 1:2 내지 1:10, 1:2 내지 1:8, 1:3 내지 1:10, 또는 1:4 내지 1:10일 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드: 반대이온 비율은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법에 사용되는 펩티드:소수성 반대이온 비율은 상기 펩티드 내 양으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 2몰 당량의 소수성 반대이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법에 사용되는 펩티드:소수성 반대이온 비율은 상기 펩티드 내 양으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 3몰 당량의 소수성 반대이온이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법은 상기 펩티드 내 음으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 1몰 당량의 양이온의 펩티드: 양이온 비율을 사용하는 것을 고려한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법에 사용되는 펩티드:양이온 비율은 1:1 내지 1:10이다. 상기 합성 방법에 사용되는 펩티드:양이온 비율은 1:2 내지 1:10, 1:3 내지 1:10, 1:1 내지 1:5, 1:2 내지 1:5, 또는 1:2 내지 1:8일 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법에 사용되는 펩티드:양이온 비율은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법에서 사용되는 펩티드:양이온 비율은 상기 펩티드 내 음으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 2몰 당량의 양이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 합성 방법에 사용되는 펩티드:양이온 비율은 상기 펩티드 내 음으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 3몰 당량의 양이온이다. 상기 기재된 펩티드:양이온 및 펩티드:소수성 반대이온 비율들의 조합이 추가 고려된다.

예시적인 비율은 펩티드 상의 양전하당 1개의 반대이온이다. 상기 다가 양이온의 경우, 예시적인 비율은 상기 펩티드 내 음전하 부위당 대략 1개의 금속 양이온, 및 음전하 부위당 2개의 다가 양이온, 또는 2X 몰 과량이다. 예를 들어, Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺와 같은 1개 또는 2개의 다가 양이온은 6-8개의 반대이온과 조합하여 사용할 수 있으며, 소수성 상호작용이 수반되는 경우 그 이상을 사용할 수 있다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 비공유 결합을 통해 복합체화된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 염 복합체가 상기 펩티드-반대이온 복합체에 복합체화된 다가 양이온을 추가 포함하는 경우, 상기 양이온은 비공유 결합을 통해 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드, 소수성 반대이온, 및 양이온은 비공유 결합을 통해 복합체화된다.

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(서열식별번호:1).

C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 소수성 염을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 골-관련 장애 또는 골격 이형성증(skeletal dysplasia)의 치료 방법이 또한 제공되며, 이는 본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 연장 방출형 조성물을 포함한다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 골-관련 장애 또는 골격 이형성증은 골관절염(osteoarthritis), 저인산염혈증 구루병(hypophosphatemic ricket), 연골무형성증(achondroplasia), 연골형성저하증(hypochondroplasia), 저신장증(short stature), 왜소증(dwarfism), 골연골이형성증(osteochondrodysplasias), 치사성 이형성증(thanatophoric dysplasia), 골형성부전증(osteogenesis imperfecta), 연골무발생증(achondrogenesis), 점상연골형성부전증(chondrodysplasia punctata), 동형접합 연골무형성증(homozygous achondroplasia), 점상연골형성부전증(chondrodysplasia punctata), 굴지이형성증(camptomelic dysplasia), 선천성 치사성 저인산증(congenital lethal hypophosphatasia), 주산기 치사 유형의 골형성부전증(perinatal lethal type of osteogenesis imperfecta), 짧은 늑골 다지 증후군(short-rib polydactyly syndromes), 연골형성저하증(hypochondroplasia), 지근 유형의 점상연골형성부전증(rhizomelic type of chondrodysplasia punctata), 얀센 유형의 골간단연골이형성증(Jansen-type metaphyseal dysplasia), 선천성 척추골단이형성증(spondyloepiphyseal dysplasia congenita), 불완전골형성증(atelosteogenesis), 이영양성 이형성증(diastrophic dysplasia), 선천성 짧은 대퇴골(congenital short femur), 랑거 유형 전완부 이형성증(Langer-type mesomelic dysplasia), 니버겔트 유형 전완부 이형성증(Nievergelt-type mesomelic dysplasia), 로비노 증후군(Robinow syndrome), 라인하르트 증후군(Reinhardt syndrome), 선단이골증(acrodysostosis), 말초 이골증(peripheral dysostosis), 니스트 이형성증(Kniest dysplasia), 섬유연골형성증(fibrochondrogenesis), 로버츠 증후군(Roberts syndrome), 전완하퇴말단이형성증(acromesomelic dysplasia), 소지증(micromelia), 모르키오 증후군(Morquio syndrome), 니스트 증후군(Kniest syndrome), 영양위축성이형성증(metatropic dysplasia), 및 척추골단골간단이형성증(spondyloepimetaphyseal dysplasia), NPR2 돌연변이(NPR2 mutation), SHOX 돌연변이(SHOX mutation)(터너 증후군(Turner's syndrome)/레리 웨일(Leri Weill)), PTPN11 돌연변이(PTPN11 mutations)(누난 증후군(Noonan's syndrome)), 및 특발성 저신장증(idiopathic short stature)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 특발성 저신장증 및 기타 골격 이형성증을 치료하기 위한 성장 호르몬의 보조제(adjunct) 또는 대안으로서 유용하다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 골-관련 장애, 골격 이형성증 또는 저신장 장애는 NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/레리 웨일), 또는 PTPN11 돌연변이(누난 증후군)에서 비롯된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 골-관련 장애, 골격 이형성증 또는 저신장 장애는 NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/레리 웨일), 또는 PTPN11 돌연변이(누난 증후군), 또는 인슐린 성장 인자 1 수용체(insulin growth factor 1 receptor; IGF1R)에서 비롯된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 성장판 장애 및 가족성 저신장증, 우성 유전성 저신장증으로도 공지된 우성 가족성 저신장증, 또는 특발성 저신장증을 비롯한, 저신장증을 치료하는 데 유용하다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 저신장증 또는 성장판 장애는 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(aggrecan; ACAN), 인디언 헷지호그(indian hedgehog; IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, 또는 FGFR3의 돌연변이의 결과이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 성장판 장애 또는 저신장증은 신경발달질환(RASopathy)과 연관된 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 골-관련 장애, 골격 이형성증 또는 저신장 장애는 신경발달질환에서 비롯된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 신경발달질환은 누난 증후군, 코스텔로 증후군(Costello syndrome), 심장-얼굴-피부 증후군(Cardiofaciocutaneous syndrome), 신경섬유종증 제1형(Neurofibromatosis Type 1), 또는 다발성 흑자 증후군(LEOPARD syndrome)이다.

일 구현예에 있어서, 상기 신경발달질환은 유전성 치은 섬유종증 제1형(hereditary gingival fibromatosis type 1)이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 성장판 장애 및 가족성 저신장증, 우성 유전성 저신장증으로도 공지된 우성 가족성 저신장증, 또는 특발성 저신장증을 비롯한, 저신장증을 치료하는 데 유용하다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 저신장증 또는 성장판 장애는 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인디언 헷지호그(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3, 또는 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R)의 돌연변이의 결과이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 저신장증은 신경발달질환과 연관된 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 -1.0, -1.5, -2.0, -2.5, 또는 -3.0 미만의 신장(height) SDS를 갖고, -1.0, -1.5, -2.0 또는 -2.5 미만의 신장 SDS을 갖는 적어도 1명의 부모를 갖는 저신장증을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하며, 선택적으로 여기에서 두 번째 부모(second parent)는 정상 범위 내의 신장을 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 -2.0 내지 -3.0의 신장 SDS를 갖는 저신장증을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 -2.0 내지 -2.5의 신장 SDS를 갖는 저신장증을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 저신장증은 저신장증과 연관된 유전자, 예컨대, 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인디언 헷지호그(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3, 또는 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R), 또는 이들의 조합들의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 저신장증은 신경발달질환과 연관된 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 저신장증은 다유전자 위험 점수(polygenic risk score; PRS)에 의해 결정되는 다중 유전자의 돌연변이의 결과이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 NPR2의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 FGFR3의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 NPR2의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 IGF1R의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 NPPC의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 SHOX의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 하나 이상의 FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX의 하나 이상의 돌연변이, 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 PRS는 1 또는 2이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 PRS는 1이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 PRS는 2이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(서열식별번호:1)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 아세틸기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드의 N-말단 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드 서열 내의 아미노산 측쇄 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 상기 C-말단에 OH 또는 NH₂기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 변이체는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 링커기(linker group)를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 링커는 가수분해성 링커이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 변이체는 정전기적으로 하전된 CNP 펩티드의 소수성 염이며, 상기 염은 소수성 반대이온과 복합체화된 정전기적으로 하전된 CNP 펩티드를 포함한다.

본 개시내용은 또한 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 염을 포함하는 지속 방출형 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 골 연장 또는 장골 성장 증가 방법을 고려하며, 여기에서 상기 투여는 본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 연장 방출형 조성물을 포함하며, 골을 연장시키거나 장골 성장을 증가시킨다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 CNP 변이체이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열식별번호:1) LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열식별번호:2);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4); 및 이들의 약제학적 염. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 CNP-아세테이트이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 아세틸기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드의 N-말단 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드의 아미노산의 측기(side group) 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 상기 C-말단에 OH 또는 NH₂기를 추가 포함한다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 변이체는

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열식별번호:8);

Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂;(서열식별번호:9)

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(서열식별번호:10);

Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열식별번호:11);

Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열식별번호:12);

Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂(서열식별번호:13); 및

다양한 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 피하, 피부내, 관절내, 경구, 또는 근육내 투여된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 1일 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 연장 방출형 조성물이다.

또한, 소수성 반대이온과 복합체를 형성하는 CNP를 포함하는 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 소수성 염이 제공된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 CNP 염은 CNP 및 소수성 반대이온과 복합체를 형성하는 양이온을 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 CNP 염은 정제된 염이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 염은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 순도, 또는 그 이상을 갖는다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 염은 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 반대이온을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 소수성 염은 Zn²⁺ 또는 Ca² ⁺의 양이온을 포함한다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 염은 CNP-올레이트, CNP-파모에이트, CNP-디옥시콜레이트, CNP-데카노에이트 및 CNP-도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 염은 CNP-Ca⁺²(올레이트), CNP-Ca⁺²(파모에이트), CNP-Ca⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Ca⁺²(데카노에이트), CNP-Ca⁺²(도큐세이트), CNP-Zn⁺²(올레이트), CNP-Zn⁺²(파모에이트), CNP-Zn⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Zn⁺²(데카노에이트), 및 CNP-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 염은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 CNP를 포함한다: PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열식별번호:1), LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열식별번호:2); QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3); PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4), 및 이들의 염. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 염은 CNP-아세테이트인 CNP를 포함한다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(서열식별번호:1)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 아세틸기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드의 N-말단 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드의 아미노산의 측기 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 상기 C-말단에 OH 또는 NH₂기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 변이체는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 링커기를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 링커는 가수분해성 링커이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 정전기적으로 하전된 펩티드의 소수성 염을 포함하며, 상기 염은 소수성 반대이온과 복합체화된 정전기적으로 하전된 펩티드를 포함한다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 골격 이형성증 또는 골-관련 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 소수성 펩티드 염, 예를 들어, 소수성 CNP 염을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예들에 있어서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 골격 이형성증 또는 골-관련 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 소수성 펩티드 염, 예를 들어, 소수성 CNP 염을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 소수성 CNP 염이다.

본원에 기재된 각각의 특징 또는 구현예, 또는 조합은 본 발명의 임의의 양태의 비제한적이고 예시적인 실시예이며, 그 자체로 본원에 기재된 임의의 다른 특징 또는 구현예, 또는 조합과 조합될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특징이 "일 구현예", "일부 구현예들", "특정 구현예들", "추가 구현예", "특정 예시적인 구현예들", 및/또는 "또 다른 구현예"와 같은 언어로 기재되는 경우, 각각의 이러한 유형의 구현예들은 모든 가능한 조합을 열거할 필요 없이 본원에 기재된 임의의 다른 특징, 또는 특징들의 조합과 조합되도록 의도된 특징의 비제한적 실시예이다. 이러한 특징 또는 특징의 조합은 본 발명의 임의의 양태에 적용된다. 범위 내에 속하는 값의 실시예가 개시되는 경우, 이러한 실시예 중 임의의 것이 범위의 가능한 엔드포인트로서 고려되고, 이러한 엔드포인트들 사이의 임의의 모든 수치가 고려되며, 상한 및 하한 엔드포인트들의 임의의 모든 조합들이 구상된다.

본원의 표제는 독자의 편의를 위한 것이며 제한을 의도하는 것이 아니다. 본 발명의 추가적인 양태들, 구현예들, 및 변형들은 상세한 설명 및/또는 도면 및/또는 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1a 내지 도 1d는 pH 6.5의 물에서 상이한 소수성 CNP 염들의 용해 프로파일을 나타낸다.
도 2는 pH 6.5의 물에서 상이한 소수성 CNP 염들의 용해 프로파일을 나타낸다. 대조군은 CNP-아세테이트이다.
도 3은 cGMP 자극에 의해 측정된 바와 같은, NPR2 동형접합 또는 이형접합(heterozygous) 돌연변이를 보유하는 세포에 대한 CNP 변이체(Pro-Gly-CNP37)의 효과를 나타낸다.
도 4는 RCS 세포로 형질감염된(transfected) NPR2 돌연변이 클론에서 제 1 엑손(first exon)의 뉴클레오티드 및 예측된 단백질 서열을 나타낸다.
도 5는 CNP에 대한 반응에 대해 분석된 예시적인 NPR2 돌연변이를 나타낸다.
도 6은 FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX의 저신장증과 연관된 예시적인 돌연변이를 나타낸다.
도 7a 내지 도 7f는 신장에 대한 PRS 및 희귀 코딩 변이체(rare coding variant)의 조합된 효과를 예시한다. 도 7a. 정량적 특성으로서 신장에 대한 효과, 샘플은 그것의 PRS를 기반으로 5개의 그룹으로 나누어짐, 신장의 25%, 50% 및 75% 백분위수를 나타내는 수평선을 갖는 바이올린-플롯(violin-plot). 샘플은 5개의 핵심 유전자 중 임의의 것에서의 미스센스(missense), 기능 상실(loss of function) 또는 없음(None)의 보유 상태에 따라 그룹화되었다. 도 7b. "특발성 저신장증" 또는 ISS에 대한 오즈비(Odds ratio)에 반영된 효과. PRS = 3을 참조로서 사용하는 ISS에 대한 오즈 대 나머지 PRS 그룹들의 ISS에 대한 오즈. 도 7c. PRS = 1을 참조로서 사용하는 ISS에 대한 오즈 대 핵심 유전자에 미스센스 및/또는 기능 상실 변이체를 갖는 경우의 ISS에 대한 오즈. 도 7d. PRS = 1 비보인자(non-carrier)를 참조로서 사용하는 ISS에 대한 오즈 대 핵심 유전자에 미스센스 및/또는 기능 상실 변이체를 갖는 경우의 ISS에 대한 오즈. 도 7e. PRS = 2 비보인자를 참조로서 사용하는 ISS에 대한 오즈 대 핵심 유전자에 미스센스 및/또는 기능 상실 변이체를 갖는 경우의 ISS에 대한 오즈. 도 7f. PRS = 3 비보인자를 참조로서 사용하는 ISS에 대한 오즈 대 핵심 유전자에 미스센스 및/또는 기능 상실 변이체를 갖는 경우의 ISS에 대한 오즈.
도 8a는 CNP Zn-파모에이트 염의 방출 프로파일을 나타낸다. 나타낸 데이터는 3개의 웰의 평균이다. 도 8b는 상이한 CNP 펩티드 염들의 방출 프로파일을 나타낸다. 나타낸 데이터는 4개의 웰의 평균이다.
도 9a 내지 도 9b는 누적 방출 프로파일(도 9a) 또는 방출 %(도 9b)로서 CNP 파모에이트 염들의 용해 프로파일을 예시한다. 나타낸 데이터는 1xPBS 데이터의 경우 3개의 웰의 평균이고, 1x PBS+0.05% PS80 데이터의 경우 2개의 웰의 평균이다.
도 10a 내지 도 10c는 동결건조 및 보관 후(도 10a), 또는 신선하게 제조한 후 분석된(도 10b 내지 도 10c) 도큐세이트 염의 용해 프로파일을 나타낸다.
도 11은 체내에서 7일 동안의 CNP 염의 방출 프로파일을 나타낸다.

본 개시내용은 수용액에 넣었을 때 펩티드 활성 성분의 연장 방출이 가능한 고체, 반고체 겔 또는 기타 염 형태인 친수성 펩티드의 염에 관한 것이다. 예를 들어, 예기치 않게, 친수성 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)와 하전된 소수성 반대이온의 복합체화는 수성 조건 하에서 저용해도 펩티드 염을 생성한다는 것이 본원에 나타나 있다. 본 개시내용은 펩티드-반대이온-양이온 복합체를 포함하는 염을 비롯한, 상기 펩티드-소수성 반대이온 염 복합체 자체가 상기 펩티드 복합체를 리포솜 또는 미소구체/나노입자로 캡슐화할 필요 없이 변형 또는 연장 방출형 조성물에서 사용될 수 있음을 나타낸다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 골격 이형성증 및 골 성장 장애를 치료하는 데 있어 연장 방출 적용에 유용하다.

명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 부정관사 "a"와 "an" 및 정관사 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수뿐만 아니라 복수의 지시대상을 포함한다.

용어 "약" 또는 "대략"은 값이 측정되거나 결정되는 방식에 부분적으로 의존하는, 통상의 기술자에 의해 결정되는 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 오차를 의미한다. 특정 구현예들에 있어서, 용어 "약" 또는 "대략"은 1, 2, 3, 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다. 특정 구현예들에 있어서, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.05% 이내를 의미한다. 용어 "약" 또는 "대략"이 일련의 2개 이상의 수치 중 첫 번째 수치에 선행할 때마다, 용어 "약" 또는 "대략"은 해당 일련의 수치의 각각에 적용되는 것으로 이해된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "정전기적으로 하전된 펩티드"는 하전된 아미노산을 포함하는 펩티드, 예를 들어, 5개 내지 100개의 아미노산의 일련의(a string of) 아미노산을 지칭한다. 상기 펩티드는 양으로 하전된 아미노산, 음으로 하전된 아미노산, 또는 이 둘의 혼합물을 가져 상기 정전기적으로 하전된 펩티드가 전체 순 전하(net charge)를 가질 수 있게 되고 다른 하전된 모이어티(moiety), 예를 들어, 양이온, 음이온 또는 결합할 수 있는 펩티드의 하전된 종(charged species)과 반대의 종을 갖는 반대이온과 상호작용할 수 있게 된다. 상기 정전기적으로 하전된 펩티드는 순 양전하 또는 순 음전하를 가질 수 있다. 상기 펩티드가 순 양전하를 가질 때, 이는 하나 이상의 음전하를 갖는 하전된 모이어티와 상호작용할 수 있다. 상기 펩티드가 순 음전하를 가질 때, 이는 하나 이상의 양전하를 갖는 하전된 모이어티와 상호작용할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "소수성 반대이온"은 본질적으로 소수성이고 친수성 펩티드와 상호작용할 수 있는 정전기적으로 하전된 모이어티의 그룹을 지칭한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 그것의 cLogP 값, 그것의 짝산의 pKa 값, 또는 둘 모두를 기반으로 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 소수성 반대이온은 약 0 내지 약 10의 cLogP, 또는 약 -2 내지 약 5의 그것의 짝산의 pKa, 또는 둘 모두를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 순 음전하를 갖고 순 양전하를 갖는 정전기적으로 하전된 펩티드와 상호작용할 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 소수성 반대이온은 탈양성자화된 지방산, 탈양성자화된 담즙산, 나프토에이트 및 이의 유도체, 니코티네이트 및 이의 유도체, 알킬 설포네이트, 디알킬 설포숙시네이트, 인지질, 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬벤젠 설포네이트, 알킬 설페이트, 아릴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 이온성 계면활성제, 및 알킬벤젠 설페이트를 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 양쪽성이온(zwitterion)(예를 들어, 포스파티딜에탄올아민)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 소수성 반대이온은 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL), 포스파티데이트, 데카노에이트, 2-나프탈렌설포네이트, 1-헵탄설포네이트, 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 1-데칸설포네이트, 도데실 설페이트, 덱스트란 설페이트, 및 도데실 벤젠설포네이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 순 양전하를 갖고 순 음전하를 갖는 정전기적으로 하전된 펩티드와 상호작용할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "펩티드 염" 또는 "소수성 펩티드 염"은 모이어티가 복합체 내에 존재하여 염을 형성하는, 정전기적으로 하전된 펩티드와 반대이온, 예를 들어, 소수성 반대이온 사이의 복합체를 지칭한다. 상기 펩티드 및 반대이온은 비공유적으로 복합체화될 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드-반대이온 염은 다가 양이온을 추가 포함하여, 상기 복합체가 복합체 내에 펩티드-양이온-반대이온을 함유하도록 한다. 펩티드 염 또는 소수성 펩티드 염은 펩티드-반대이온 복합체 및 펩티드-양이온-반대이온 복합체 모두를 지칭한다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 및 양이온은 비공유적으로 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염 내의 펩티드, 양이온, 및 소수성 반대이온은 비공유 결합을 통해 복합체화된다.

용어 "C형 나트륨이뇨 펩티드" 또는 "CNP"는 C-말단부(C-terminal end)에 17-아미노산 루프 구조를 갖는 작은 단일쇄 펩티드(GenBank Accession No. NP_077720), CNP 전구체 단백질의 경우, NPPC) 및 이의 변이체를 지칭한다. CNP는 초기에 나트륨이뇨 펩티드 전구체 C(natriuretic peptide precursor C; NPPC) 유전자로부터 단일쇄 126-아미노산 프리-프로 폴리펩티드로 생성되며, 이는 절단되어 프로-CNP, 및 활성 53-아미노산 펩티드(CNP-53)를 생성하고, 이는 미지의 효소에 의해 분비되고 다시 절단되어 성숙한(mature) 22-아미노산 펩티드(CNP-22)를 생성한다. "CNP 염" 또는 "소수성 CNP 염"은 각각, 소수성 반대이온과 같은 반대이온을 포함하고, 선택적으로, 다가 양이온을 추가 포함하며, CNP 또는 CNP 변이체를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 염을 지칭한다.

다양한 구현예들에 있어서, "CNP 변이체"는 동일한 수의 아미노산 잔기에 대해 야생형(wild type) NPPC와 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상동성이다. 다양한 구현예들에 있어서, CNP 변이체 펩티드는 상기 NPPC 폴리펩티드의 약 1개 내지 약 53개, 또는 1개 내지 38개, 또는 1개 내지 37개, 또는 1개 내지 35개, 또는 1개 내지 34개, 또는 1개 내지 33개, 또는 1개 내지 32개, 또는 1개 내지 31개, 또는 1개 내지 27개, 또는 1개 내지 22개, 또는 10개 내지 35개, 또는 약 15개 내지 약 37개의 잔기를 포함할 수 있다. 일 구현예에 있어서, CNP 변이체는 상기 NPPC 폴리펩티드로부터 유래된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 44개, 43개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 또는 53개의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 소수성 펩티드 염을 포함하는 변형 방출형 조성물이 본원에 제공된다. 변형-방출형 조성물은 그것의 투여 후 지연을 갖거나(지연-방출형 투약) 장기간 동안(연장-방출형 투약) 약물을 전달하는 조성물을 포함한다. 본원에 제공되는 펩티드 염의 다양한 구현예들은 연장 방출형, 지속 또는 제어 방출형(controlled release), 및 지연 방출형과 같은 변형-방출형 조성물을 포함한다. 용어 연장 방출형 조성물"은 투여 후 연장된 기간 동안 활성 성분/약물을 이용할 수 있도록 하는 방식으로 제형화된 조성물을 지칭한다(미국 약전). 연장-방출형 투약은 지속-방출(sustained-release; SR) 또는 제어-방출(controlled-release; CR) 형태를 포함한다. 지속 방출은 지속 기간 동안 약물 방출을 유지하지만 반드시 일정한 속도는 아닌 반면, CR은 거의 일정한 속도로 지속 기간 동안 약물 방출을 유지한다(Pharmaceutics: Drug Delivery and Targeting, Yvonne Perrie, Thomas Rades, Pharmaceutical Press, 2009). 지연-방출형 조성물 또는 생성물은 초기 투여 후 일정 기간 동안 약물 물질의 방출을 지연시키도록 변형된다.

용어 "유효량"은 대상체의 건강 상태, 병, 또는 질병에 대해 또는 진단 목적으로 바람직한 결과를 생성하기에 충분한 투약량을 지칭한다. 바람직한 결과는 투약량에 대한 수용자의 주관적 또는 객관적인 개선을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 건강에 대해 의도되는 유익한 효과를 생성하는 데 효과적인 제제의 양을 지칭한다. 임의의 개별적인 경우에서 적절한 "유효"량은 통상적인 실험을 사용하여 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 수준 및 투약 빈도는 다양할 수 있으며 이용되는 특정 화합물의 활성; 해당 화합물의 생체이용률, 대사 안정성, 배설 속도 및 작용 기간; 화합물의 투여 방식 및 시간; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식단; 및 특정 상태의 심각도를 비롯한 다양한 요인에 의존할 것임이 이해될 것이다.

"치료"는 예방적 치료 또는 치료적 치료 또는 진단적 치료를 지칭한다. 특정 구현예들에 있어서, "치료"는 치료적, 예방적 또는 진단적 목적을 위해 대상체에 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.

"예방적" 치료는 병의 진행 위험을 감소시킬 목적으로, 질병의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 질병의 초기 징후만을 나타내는 대상체에 시행되는 치료이다. 본 개시내용의 화합물 또는 조성물은 병이 진행될 가능성을 감소시키거나 진행된 경우 병의 중증도를 최소화하기 위해 예방적 치료로서 제공될 수 있다.

"치료적" 치료는 병의 징후 또는 증상을 감소 또는 제거할 목적으로 이러한 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에 시행되는 치료이다. 상기 징후 또는 증상은 생화학적, 세포적, 조직학적, 기능적 또는 물리적, 주관적 또는 객관적일 수 있다. 본 개시내용의 화합물은 또한 치료적 치료로서 또는 진단을 위해 제공될 수 있다.

"약제학적 조성물" 또는 "제형"은 인간 및 포유동물을 비롯한, 대상 동물에서의 약제학적 용도에 적합한 조성물을 지칭한다. 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 소수성 펩티드 염, 예를 들어, CNP 염, 선택적으로 또 다른 생물학적 활성제, 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 약제학적 조성물은 활성 성분(들), 및 담체를 구성하는 불활성 성분(들)을 포함하는 조성물뿐만 아니라 임의의 둘 이상의 성분들의 조합, 복합체화 또는 응집, 또는 하나 이상의 성분의 해리, 또는 하나 이상의 성분의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 개시내용의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하여(admixing) 제조되는 임의의 조성물을 포함한다.

"약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 표준 약제학적 담체, 완충액 등, 예컨대, 포스페이트 완충 식염수 용액, 덱스트로스의 5% 수용액, 및 에멀젼(예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼)을 지칭한다. 부형제의 비제한적 예는 애주번트(adjuvant), 결합제, 충전제, 희석제, 붕해제, 유화제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 감미제, 향미제, 및 착색제를 포함한다. 적합한 약제학적 담체, 부형제 및 희석제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)에 기재되어 있다. 바람직한 약제학적 담체는 활성제의 의도되는 투여 방식에 의존한다. 전형적인 투여 방식은 경장(enteral)(예를 들어, 경구) 또는 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주사; 또는 국소, 경피(transdermal), 또는 경점막(transmucosal) 투여)를 포함한다.

"약제학적으로 허용가능한 염"은 금속 염(예를 들어, 소듐, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하나 이에 제한되지 않는 약제학적 용도를 위한 화합물로 제형화될 수 있는 염이다.

"약제학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"은 생물학적이지 않거나 또는 그렇지 않으면 바람직하지 않은 물질, 즉 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나 그것이 함유된 조성물의 임의의 성분 또는 개체의 신체 상 또는 신체 내에 존재하는 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 개체에 투여될 수 있는 물질을 의미한다.

"생리학적 상태"는 동물(예를 들어, 인간)의 신체 상태를 지칭한다. 생리학적 상태는 체온과 생리학적 이온 강도, pH 및 효소의 수성 환경을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생리학적 상태는 또한 대부분의 대상체에 존재하는 "정상" 상태와 상이한, 예를 들어, 대략 37℃의 정상 인간 체온과 상이하거나 대략 7.4의 정상 인간 혈액 pH와 상이한 특정 대상체의 신체 상태를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 포유동물 및 비포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는 하기 포유동물강(mammalian class) 중 임의의 구성을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 인간, 비인간 영장류, 예컨대, 침팬지, 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 사육동물(farm animal), 예컨대, 소, 말, 양, 염소, 돼지; 가축, 예컨대, 토끼, 개, 및 고양이; 설치류를 비롯한 실험동물, 예컨대, 랫트, 마우스 및 기니피그 등. 비포유동물의 예는 조류, 어류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 인간이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 아동 또는 청소년이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 유아이다.

정전기적으로 하전된 펩티드 및 펩티드 염

펩티드 치료제는 매력적인 생물학적 치료제이지만, 종종 용액에서의 낮은 안정성 및 짧은 반감기로 인한 단점을 가진다(Tang 등, Eur J Pharm Sci. 102:63-70, 2017). 펩티드 치료제의 효능을 개선하려는 시도는 친수성 펩티드를 리포솜 또는 중합체 입자와 같은 생분해성 입자로 캡슐화하는 시도를 포함한다. 그러나, 이는 이러한 펩티드의 양이온성 성질 및 음으로 하전된 중합체의 리포솜과 정전기적으로 상호작용하는 그것의 능력으로 인해 어려움을 겪었다(Griesser 등, Int J Pharmaceutics 520:267-274, 2017). 친수성 펩티드와 소수성 모이어티 사이의 소수성 이온 쌍의 생성은 친수성 중합체를 마이크로입자 또는 리포솜으로 보다 잘 캡슐화할 수 있도록 하는 한 가지 수단이었다(Lu 등, Mol. Pharmaceutics 15:216-225, 2018). 소수성 이온 쌍은 펩티드 내의 하전된 잔기가 소수성 모이어티 내의 반대로 하전된 이온과 상호작용할 때 형성된다(Tang 등, 상기 참조). 특정 경우들에서, 이는 용액에서 소수성 이온 쌍의 침전으로 이어져 리포솜 또는 중합체성 나노입자로 캡슐화하는 것을 보다 쉽도록 할 수 있다(Griesser 등, 상기 참조).

친수성 CNP 펩티드와 소수성 반대이온 사이의 소수성 이온 복합체가 CNP 펩티드 염을 생성한다는 것이 본원에서 밝혀졌다. 친수성 펩티드와 소수성 반대이온 사이의 소수성 이온 쌍의 생성은 먼저 상기 친수성 펩티드를 다가 양이온(예를 들어, 금속 양이온)과 접촉시켜 상기 펩티드와 소수성 반대이온 사이의 상호작용을 향상시킴으로써 향상될 수 있다. 예를 들어, 상기 다가 양이온은 상기 친수성 펩티드의 음으로-하전된 작용기와 복합체화되어 소수성 음이온과 같은 상기 소수성 반대이온과의 복합체화에 이용가능한 상기 친수성 펩티드 상의 양전하 수를 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 다가 양이온은 상기 친수성 펩티드의 음전하와 상기 소수성 반대이온의 음전하를 함께 가교할 수 있다. 추가적으로, 본 개시내용은 상기 펩티드-소수성 반대이온 염 복합체 또는 펩티드-양이온-소수성 반대이온 염 복합체 자체가 상기 펩티드 복합체를 리포솜 또는 미소구체/나노입자로 캡슐화할 필요 없이 변형 또는 연장 방출형 조성물에서 사용될 수 있음을 나타낸다.

정전기적으로 하전된 펩티드는 하전된 아미노산을 포함하고 전체 순 전하를 갖는 5개 내지 100개의 아미노산의 일련의 아미노산일 수 있다. 상기 펩티드는 양으로 하전된 아미노산, 음으로 하전된 아미노산, 또는 이 둘의 혼합물을 가질 수 있어, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드는 다른 하전된 모이어티, 예를 들어, 양이온, 음이온 또는 상기 펩티드 내의 하전된 종과 반대의 종을 갖는 반대이온 또는 이들의 조합과 상호작용할 수 있게 된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드는 순 양전하를 갖는다. 순 양전하를 갖는 정전기적으로 하전된 펩티드는 순 음전하를 갖는 소수성 반대이온과 같은, 음전하를 갖는 소수성 반대이온과 복합체화될 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드는 순 음전하를 갖는다. 순 음전하를 갖는 정전기적으로 하전된 펩티드는 순 양전하를 갖는 소수성 반대이온과 같은, 양전하를 갖는 소수성 반대이온과 복합체화될 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드는 동일한 유형의 전하를 갖는 적어도 2개의 아미노산(예를 들어, 2개의 양으로 하전된 아미노산 또는 2개의 음으로 하전된 아미노산)을 갖는다.

친수성 펩티드는 수용액에서 고용해도를 갖는 펩티드를 지칭한다. 본원에서 고려되는 친수성 펩티드는 +3 내지 +15, 또는 +4 내지 +15, 또는 +3 내지 +12, 또는 +4 내지 +12, 또는 +3, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, 또는 +15 또는 이러한 수들 사이의 임의의 범위의 순 전하를 갖는, 5개 내지 100개의 아미노산의 펩티드를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드는 수용액에서 10 mg/mL 초과의 용해도, 또는 5 mg/mL 초과 용해도를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 친수성 펩티드는 또한 수용액에서 고용해도를 갖는, 예를 들어, 1 미만의 cLogP를 갖는 펩티드를 지칭한다.

소수성 반대이온

본원에 기재된 바와 같은 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 생성하기 위해, 상기 펩티드는 반대이온과 복합체화된다. 친수성 펩티드의 경우, 상기 반대이온은 소수성 반대이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 순 음전하를 가지며 순 양전하를 갖는 친수성 펩티드와 염을 형성한다.

상기 반대이온은 비공유 결합을 통해 상기 하전된 펩티드에 복합체화되는 것으로 고려된다. 상기 반대이온은 정전기적 상호작용을 통해 상기 펩티드와 비공유적으로 회합될(non-covalently associated) 수 있다.

소수성 반대이온이 사용될 때, 상기 소수성 반대이온은 약 0 내지 약 10의 cLogP를 나타내거나, 그것의 짝산은 약 -2 내지 약 5의 pKa를 나타내거나, 또는 둘 모두이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 약 2 내지 약 9, 약 3 내지 8, 약 4 내지 7, 또는 약 5 내지 9의 cLogP를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 cLogP는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온의 짝산은 약 -1 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 5, 1 내지 4 또는 2 내지 5의 pKa를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온의 짝산은 약 -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5의 pKa를 갖는다. 이들 값 및 값들 사이의 범위 중 임의의 것의 조합을 갖는 소수성 반대이온이 추가 고려된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 약 2 내지 약 9의 cLogP를 갖거나, 그것의 짝산은 약 5 미만의 pKa를 갖거나, 둘 모두이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 약 2 내지 약 9의 cLogP를 갖고, 그것의 짝산은 약 5 미만의 pKa를 갖는다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 반대이온은 음이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 반대이온은 양쪽성이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 반대이온은 음이온성 또는 양쪽성이온성 세제(detergent)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 탈양성자화된 지방산, 탈양성자화된 담즙산, 나프토에이트 및 이의 유도체, 니코티네이트 및 이의 유도체, 알킬 설포네이트, 디알킬 설포숙시네이트, 인지질, 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬벤젠 설포네이트, 알킬 설페이트, 아릴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 알킬벤젠 설페이트, 및 이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL), 포스파티드산, 소듐 데카노에이트, 소듐 2-나프탈렌설포네이트, 소듐 1-헵탄설포네이트, 소듐 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 소듐 1-데칸설포네이트, 소듐 도데실 설페이트, 및 소듐 도데실 벤젠설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트 또는 도큐세이트이다.

다양한 구현예들에 있어서, 적어도 1개의 소수성 반대이온은 상기 친수성 펩티드(다가 양이온이 존재하지 않을 때) 또는 상기 친수성 펩티드와 다가 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때)에 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 적어도 2개의 소수성 반대이온은 상기 친수성 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 상기 친수성 펩티드와 다가 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때)에 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 적어도 3개의 소수성 반대이온은 상기 친수성 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 상기 친수성 펩티드와 다가 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때)에 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 적어도 4개의 소수성 반대이온은 상기 친수성 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 상기 친수성 펩티드와 다가 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때)에 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드의 각 양전하는 소수성 반대이온에 복합체화된다. 예를 들어, 펩티드가 4개의 양으로 하전된 아미노산을 갖는 경우, 이는 4개의 소수성 반대이온에 복합체화할 수 있다. 유사하게, 상기 펩티드가 4개의 양으로 하전된 아미노산을 갖고 2개의 양이온에 복합체화되어 양전하가 총 6개인 경우, 상기 펩티드는 6개의 소수성 반대이온에 복합체화할 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 상기 친수성 펩티드와 다가 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때)의 모든 양전하가 소수성 반대이온에 복합체화되는 것은 아니다. 예를 들어, 펩티드가 4개의 양으로 하전된 아미노산을 갖는 경우, 이는 3개의 소수성 반대이온, 또는 2개의 소수성 반대이온, 또는 1개의 소수성 반대이온에 복합체화할 수 있다. 유사하게, 상기 펩티드가 4개의 양으로 하전된 아미노산을 갖고 2개의 양이온에 복합체화되어 양전하가 총 6개인 경우, 상기 펩티드는 5개의 소수성 반대이온, 또는 4개의 소수성 반대이온, 또는 3개의 소수성 반대이온, 또는 2개의 소수성 반대이온, 또는 1개의 소수성 반대이온에 복합체화할 수 있다.

다가 양이온

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 상기 펩티드-반대이온 복합체에 복합체화된 다가 양이온을 추가 포함한다. 상기 양이온은 비공유 결합을 통해 하전된 펩티드에 복합체화되는 것으로 고려된다. 상기 양이온은 정전기적 상호작용을 통해 상기 펩티드와 비공유적으로 회합될 수 있다.

상기 다가 양이온은 +2, +3 또는 +4 또는 그 이상의 전하를 갖는 것으로 고려된다. 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 +2의 전하를 갖는다. 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 +3의 전하를 갖는다. 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 +4의 전하를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 금속 양이온이다. 금속 양이온은 II족 및 III족 금속의 양이온을 포함한다. 적합한 다가 양이온은 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 백금(Pt), 구리(Cu) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 포함할 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 마그네슘, 아연, 또는 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 아연 또는 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 아연을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 Mg² ⁺, Zn² ⁺, 및 Ca² ⁺로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 Zn²⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 다가 양이온은 Ca² ⁺이다.

다양한 구현예들에 있어서, 적어도 1개의 다가 양이온이 상기 친수성 펩티드에 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 적어도 2개의 양이온이 상기 친수성 펩티드에 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 적어도 3개의 양이온이 상기 친수성 펩티드에 복합체화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드의 각 음전하는 다가 양이온에 복합체화된다. 예를 들어, 펩티드가 4개의 음으로 하전된 아미노산을 갖는 경우, 이는 4개의 다가 양이온, 또는 3개의 다가 양이온, 또는 2개의 다가 양이온, 또는 1개의 다가 양이온에 복합체화할 수 있다.

펩티드 염

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 고체, 반고체, 또는 겔 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 고체 또는 겔 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 고체 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 비정질 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 겔 형태이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 겔에 현탁되거나 연결된다.

상기 펩티드 염은 입자 형태, 특히, 고체 입자인 것으로 고려된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 입자는 1 내지 10,000 마이크로미터(um), 1 um 내지 2000 um, 2 um 내지 1000 um, 5 um 내지 500 um, 10 um 내지 1000 um, 50 um 내지 500 um, 100 um 내지 800 um, 200 um 내지 600 um, 300 um 내지 500 um, 100 um 내지 300 um, 50 um 내지 100 um, 또는 10 um 내지 50 um이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 입자는 나노입자이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 나노입자는 5 나노미터(nm) 내지 1000 nm, 8 nm 내지 900 nm, 10 nm 내지 800 nm, 20 nm 내지 600 nm, 50 nm 내지 500 nm, 50 nm 내지 400 nm, 20 내지 300 nm, 300 내지 800 nm, 200 내지 600 nm, 100 nm 내지 300 nm 또는 50 nm 내지 200 nm이다.

일부 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염의 친수성 펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 CNP 또는 CNP 변이체이고, 상기 소수성 반대이온은 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL), 포스파티드산, 소듐 데카노에이트, 소듐 2-나프탈렌설포네이트, 소듐 1-헵탄설포네이트, 소듐 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 소듐 1-데칸설포네이트, 소듐 도데실 설페이트, 및 소듐 도데실 벤젠설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP 또는 CNP 변이체이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 디옥시콜레이트, 및 데카노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-올레이트, CNP-파모에이트, CNP-디옥시콜레이트, 및 CNP-데카노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP 또는 CNP 변이체이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트 및 도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-올레이트, CNP-파모에이트, CNP-디옥시콜레이트, CNP-데카노에이트 및 CNP-도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-올레이트, CNP-파모에이트, 및 CNP-도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-디옥시콜레이트, CNP-데카노에이트 및 CNP-도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-올레이트 및 CNP-파모에이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-올레이트이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-파모에이트이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-도큐세이트이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염의 친수성 펩티드는 Pro-Gly CNP37(PG-CNP37)이고, 상기 소수성 반대이온은 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL), 포스파티드산, 소듐 데카노에이트, 소듐 2-나프탈렌설포네이트, 소듐 1-헵탄설포네이트, 소듐 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 소듐 1-데칸설포네이트, 소듐 도데실 설페이트, 및 소듐 도데실 벤젠설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 PG-CNP37이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 디옥시콜레이트, 및 데카노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-올레이트, PG-CNP37-파모에이트, PG-CNP37-디옥시콜레이트, 및 PG-CNP37-데카노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 PG-CNP37이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트 및 도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-올레이트, PG-CNP37-파모에이트, PG-CNP37-디옥시콜레이트, PG-CNP37-데카노에이트 및 PG-CNP37-도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-올레이트, PG-CNP37-파모에이트, 및 PG-CNP37-도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-디옥시콜레이트, PG-CNP37-데카노에이트 및 PG-CNP37-도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-올레이트 및 PG-CNP37-파모에이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-올레이트이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-파모에이트이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-도큐세이트이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드-반대이온 염은 다가 양이온을 추가 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염의 친수성 펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 CNP 또는 CNP 변이체이고; 상기 소수성 반대이온은 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL), 포스파티드산, 소듐 데카노에이트, 소듐 2-나프탈렌설포네이트, 소듐 1-헵탄설포네이트, 소듐 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 소듐 1-데칸설포네이트, 소듐 도데실 설페이트, 및 소듐 도데실 벤젠설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 다가 양이온은 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 백금(Pt), 구리(Cu) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 디옥시콜레이트, 및 데카노에이트로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(올레이트), CNP-Ca⁺²(파모에이트), CNP-Ca⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Ca⁺²(데카노에이트), CNP-Zn⁺²(올레이트), CNP-Zn⁺²(파모에이트), CNP-Zn⁺²(디옥시콜레이트) 및 CNP-Zn⁺²(데카노에이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트 및 도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 파모에이트, 및 도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP이고, 상기 소수성 반대이온은 디옥시콜레이트, 데카노에이트 및 도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트 및 파모에이트로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 다가 양이온은 Zn²⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP이고, 상기 소수성 반대이온은 올레이트이고; 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 친수성 펩티드 염은 본원에 기재된 바와 같은 CNP이고, 상기 소수성 반대이온은 파모에이트이고; 상기 다가 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(올레이트), CNP-Ca⁺²(파모에이트), CNP-Ca⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Ca⁺²(데카노에이트), CNP-Ca⁺²(도큐세이트), CNP-Zn⁺²(올레이트), CNP-Zn⁺²(파모에이트), CNP-Zn⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Zn⁺²(데카노에이트), 및 CNP-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(올레이트), CNP-Ca⁺²(파모에이트), CNP-Ca⁺²(도큐세이트), CNP-Zn⁺²(올레이트), CNP-Zn⁺²(파모에이트), 및 CNP-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(올레이트), CNP-Ca⁺²(파모에이트), 및 CNP-Ca⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Ca⁺²(데카노에이트), 및 CNP-Ca⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(올레이트) 및 CNP-Ca⁺²(파모에이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(올레이트)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(파모에이트)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Zn⁺²(올레이트), CNP-Zn⁺²(파모에이트), CNP-Zn⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Zn⁺²(데카노에이트), 및 CNP-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Zn⁺²(올레이트), CNP-Zn⁺²(파모에이트), 및 CNP-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Zn⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Zn⁺²(데카노에이트), 및 CNP-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Zn⁺²(올레이트) 및 CNP-Zn⁺²(파모에이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Zn⁺²(올레이트)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Zn⁺²(파모에이트)이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Ca⁺²(올레이트), PG-CNP37-Ca⁺²(파모에이트), PG-CNP37-Ca⁺²(디옥시콜레이트), PG-CNP37-Ca⁺²(데카노에이트), PG-CNP37-Ca⁺²(도큐세이트), PG-CNP37-Zn⁺²(올레이트), PG-CNP37-Zn⁺²(파모에이트), PG-CNP37-Zn⁺²(디옥시콜레이트), PG-CNP37-Zn⁺²(데카노에이트), 및 PG-CNP37-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Ca⁺²(올레이트), PG-CNP37-Ca⁺²(파모에이트), PG-CNP37-Ca⁺²(도큐세이트), PG-CNP37-Zn⁺²(올레이트), PG-CNP37-Zn⁺²(파모에이트), 및 CNP-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Ca⁺²(올레이트), PG-CNP37-Ca⁺²(파모에이트), 및 PG-CNP37-Ca⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 CNP-Ca⁺²(디옥시콜레이트), PG-CNP37-Ca⁺²(데카노에이트), 및 PG-CNP37-Ca⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Ca⁺²(올레이트) 및 PG-CNP37-Ca⁺²(파모에이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Ca⁺²(올레이트)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Ca⁺²(파모에이트)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Zn⁺²(올레이트), PG-CNP37-Zn⁺²(파모에이트), PG-CNP37-Zn⁺²(디옥시콜레이트), PG-CNP37-Zn⁺²(데카노에이트), 및 PG-CNP37-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Zn⁺²(올레이트), PG-CNP37-Zn⁺²(파모에이트), 및 PG-CNP37-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Zn⁺²(디옥시콜레이트), PG-CNP37-Zn⁺²(데카노에이트), 및 PG-CNP37-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Zn⁺²(올레이트) 및 PG-CNP37-Zn⁺²(파모에이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Zn⁺²(올레이트)이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 PG-CNP37-Zn⁺²(파모에이트)이다.

제조 방법

본원에 기재된 바와 같은 소수성 펩티드 염을 포함하는 조성물의 제조 방법이 또한 본원에서 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, 본 개시내용은 a) 수용액 중의 정전기적으로 하전된 펩티드를 용액 중의 소수성 반대이온과 접촉시키는 단계; b) 상기 펩티드 및 반대이온이 복합체를 형성하기에 충분한 방식으로 상기 정전기적으로 하전된 펩티드 용액을 상기 소수성 반대이온 용액과 혼합하는 단계를 포함하는, 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 펩티드-반대이온 복합체의 형성은 상기 펩티드 염을 포함하는 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태의 형성을 초래한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드-반대이온 염이 다가 양이온을 추가 포함할 때, 상기 방법은 단계 (b) 전에, 상기 용액 중의 정전기적으로 하전된 펩티드를 수용액 중의 다가 양이온과 접촉시켜 펩티드-양이온 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 그 후 상기 펩티드-양이온 복합체는 소수성 반대이온과 접촉하여 펩티드-양이온-반대이온 복합체를 형성한다.

다양한 구현예들에 있어서, 본 개시내용은 (a) 용액 중의 정전기적으로 하전된 펩티드를 수용액 중의 다가 양이온과 접촉시켜 펩티드-양이온 복합체를 형성하는 단계, b) 상기 수용액 중의 펩티드-양이온 복합체를 용액 중의 소수성 반대이온과 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 펩티드-양이온 및 반대이온이 복합체를 형성하기에 충분한 방식으로 상기 펩티드-양이온 복합체 용액을 상기 소수성 반대이온 용액과 혼합하는 단계를 포함하는, 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 펩티드-양이온 반대이온 복합체의 형성은 상기 펩티드 염을 포함하는 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태의 형성을 초래한다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 혼합은 상기 소수성 반대이온 용액을 상기 펩티드 용액에 적가하여 수행된다. 상기 용액들은 소수성 반대이온 용액의 각 점적을 첨가한 후 와류에 의해 혼합되거나, 기술분야에 공지된 혼합을 위한 다른 수단에 의해 혼합된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 또는 (d) 상기 펩티드 염을 완충액 또는 물에서 세척하는 단계를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 세척은 수용액, 예를 들어, 완충액 또는 물에서 수행된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 단계 (d) 또는 (e) 원심분리에 의해 상기 펩티드 염을 수득하여 펩티드 염 펠릿을 형성하는 단계를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 염이 겔 형태인 경우, 상기 염은 원심분리에 의해 또는 액상을 따라낸 후 동결건조 또는 기타 건조 방법에 의해 수득된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 단계 (e) 또는 (f) 상기 펩티드 염 펠릿으로부터 물을 제거하는 단계를 추가 포함한다. 동결건조 또는 기술분야에 공지된 기술을 사용하는 건조에 의해 상기 펠릿으로부터 물 또는 또 다른 수용액이 제거될 수 있는 것으로 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 상기 펠릿을 수용액 또는 오일에 재현탁시키는 것을 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 수용액은 물, 식염수, 또는 완충액이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 오일은 트리글리세리드 또는 지방산을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 포화되거나 불포화된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 트리글리세리드 내 지방산은 포화 또는 불포화되거나, 또는 이들의 조합이다.

상기 지방산은 상기 오일 자체이거나 또는 트리글리세리드 내에 존재할 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 트리글리세리드 내 지방산은 포화 또는 불포화되고, 중쇄 또는 장쇄 지방산일 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 C-6 내지 C-20 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 C-6, C-8, C-10, C-12, C-14, C-16, C-18 또는 C-20 지방산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 또는 도데칸산이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 하기에 대한 적어도 1몰 당량의 소수성 음이온과 같은 소수성 반대이온의 사용을 고려한다: 1) 양이온이 존재하는 경우 하전된 아미노산의 총 수; 또는 2) 양이온이 존재하지 않는 경우 양전하의 총 수. 따라서, 다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 양이온이 존재하지 않을 때 친수성 펩티드 내의 양전하의 총 수, 또는 다가 양이온이 존재할 때 친수성 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체 내의 양전하의 총 수에 대한 적어도 1당량의 소수성 반대이온의 사용을 고려한다. 상기 비율은 본원에서 펩티드:소수성 반대이온 비율로 지칭된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 내의 양으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 1몰 당량의 소수성 반대이온이다. 다양한 구현예들에 있어서 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:1 내지 1:20, 또는 1:1 내지 1:50이다. 상기 펩티드: 반대이온 비율은 1:2 내지 1:15, 1:2 내지 1:10, 1:2 내지 1:8, 1:3 내지 1:10, 또는 1:4 내지 1:10일 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:1이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:2이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:3이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:4이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:5이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:6이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:7이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:8이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:9이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 1:10이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 내의 양으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 2몰 당량의 소수성 반대이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 내의 양으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 3몰 당량의 소수성 반대이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 내의 양으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 4몰 당량의 소수성 반대이온이다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율은 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 내의 양전하의 총 수에 대한 1몰 당량 미만의 소수성 반대이온이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 내의 양전하에 대한 1몰 당량 미만의 소수성 반대이온을 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 내의 양전하에 대한 2몰 당량 미만의 소수성 반대이온을 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드 염은 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 내의 양전하에 대한 3몰 당량 미만의 소수성 반대이온을 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 상기 펩티드(양이온이 존재하지 않을 때) 또는 펩티드와 양이온을 포함하는 복합체(양이온이 존재할 때) 상의 양전하의 총 수에 대해, 예를 들어, 0.9, 0.8, 0.7, 0.75, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.25, 0.2 또는 0.1몰 당량의 소수성 반대이온을 도입하는 것을 고려한다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 펩티드 내의 음으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 적어도 1몰 당량의 양이온을 포함하는 것을 고려한다. 상기 비율은 본원에서 펩티드:양이온 비율로 지칭된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:1 내지 1:10이다. 상기 펩티드:양이온 비율은 1:2 내지 1:10, 1:3 내지 1:10, 1:1 내지 1:5, 1:2 내지 1:5, 또는 1:2 내지 1:8이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:1이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:2이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:3이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:4이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:5이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:6이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:7이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:8이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:9이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율은 1:10이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 펩티드 내의 음으로 하전된 아미노산의 총 수에 대한 1몰 당량 미만의 양이온을 포함하는 것을 고려한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 방법은 펩티드 상의 음전하의 총 수에 대해, 예를 들어, 0.9, 0.8, 0.7, 0.75, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.25, 0.2 또는 0.1몰 당량의 양이온을 도입하는 것을 고려한다.

C형 나트륨이뇨 펩티드

C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)(Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870(1990))(GenBank Accession No. NP_077720, CNP 전구체 단백질의 경우, NPPC)(J. Hypertens., 10: 907-912 (1992))는 17-아미노산 루프 구조를 갖는 펩티드 계열(ANP, BNP, CNP)의 작은 단일쇄 펩티드이며(Levin 등, N. Engl. J. Med. , 339: 863-870 (1998)) 여러 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다. CNP는 나트륨이뇨 펩티드 수용체-B(NPR-B, GC-B)와 상호작용하여 고리형-구아노신 모노포스페이트(cyclic- guanosine monophosphate; cGMP)의 생성을 자극한다(J. Hypertens., 10: 1111-1114 (1992)). CNP는 중추신경계, 생식관(reproductive tract), 골 및 혈관 내피(endothelium of blood vessel)를 비롯하여, 보다 광범위하게 발현된다(Hypertension, 49: 419-426 (2007)).

인간에서, CNP는 초기에 나트륨이뇨 펩티드 전구체 C(NPPC) 유전자로부터 단일쇄 126-아미노산 프리-프로 폴리펩티드로 생성된다(Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870(1990)). 신호 펩티드를 제거하면 프로-CNP가 생성되고, 엔도프로테아제 푸린(endoprotease furin)에 의한 추가 절단은 활성 53-아미노산 펩티드(CNP-53)를 생성하며, 이는 미지의 효소에 의해 분비되고 다시 절단되어 성숙한 22-아미노산 펩티드를 생성한다(CNP-22) (Wu, J. Biol. Chem. 278: 25847-852 (2003)). CNP-53과 CNP-22는 그 분포가 상이하며, CNP-53은 조직에서 우세한 반면, CNP-22는 주로 혈장과 뇌척수액에서 발견된다(J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res., 26: 269- 297(2006)). CNP-53과 CNP-22는 모두 NPR-B에 유사하게 결합한다.

다양한 구현예들에 있어서, 본 개시내용의 CNP는 인간 CNP-17(hCNP-17) 내지 인간 CNP-53(hCNP-53) 범위의 절두된(truncated) CNP를 포함하며, hCNP-53으로부터 유래된 야생형 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 절두된 CNP 펩티드는 하기를 포함한다:

DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC

(CNP-53)(서열식별번호:56);

LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC

(CNP-52)(서열식별번호:15);

RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC

(CNP-51)(서열식별번호:16);

VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(서열식별번호17:);

DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(서열식별번호:18)

TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(서열식별번호:19);

KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(서열식별번호:20);

SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(서열식별번호:21);

RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(서열식별번호:22);

AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(서열식별번호:23);

AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(서열식별번호:24);

WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(서열식별번호:25);

ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(서열식별번호:26);

RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(서열식별번호:27);

LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(서열식별번호:28);

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열식별번호:2);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);

EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(서열식별번호:29);

HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(서열식별번호:30);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4);

NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(서열식별번호:31);

ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(서열식별번호:32);

RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(서열식별번호:33);

KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(서열식별번호:34);

YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(서열식별번호:35);

KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(서열식별번호:36);

GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(서열식별번호:37);

ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(서열식별번호:38);

NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(서열식별번호:39);

KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(서열식별번호:40);

KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(서열식별번호:41);

GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(서열식별번호:68);

LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(서열식별번호:42);

SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(서열식별번호:43);

KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(서열식별번호:44);

GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(서열식별번호:45); 및

CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(서열식별번호:67).

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체 펩티드는 변형된 CNP-37 또는 CNP-38 펩티드이며, 선택적으로 푸린 절단 부위(밑줄친 부분)에 돌연변이(들)/치환(들)을 갖고/갖거나, N-말단에 글리신 또는 프롤린-글리신을 함유한다. 예시적인 CNP-37 변이체는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-37(M32N); 서열식별번호:46];

MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP-37; 서열식별번호:47);

PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP-37; 서열식별번호:48);

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP-37 (M32N); 서열식별번호:49];

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열식별번호:1);

MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP-37; 서열식별번호:50); 및

GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP-37: 서열식별번호:51)

GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:52);

GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:53);

GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:54); 및

GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:55).

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는

PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:5); PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:1); PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:6); PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:6); PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:5); 및 PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(서열식별번호:7)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체 펩티드는 아세틸기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드의 상기 N-말단 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드 서열 내의 아미노산 측쇄 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 상기 C-말단에 OH 또는 NH₂기를 추가 포함한다.

추가적인 구현예들에 있어서, 아스파라긴(Asn/N) 잔기(들) 및/또는 글루타민(Gln/Q) 잔기(들)를 갖는 본원에 기재된 임의의 CNP 및 CNP 변이체의 경우, 이들이 야생형 서열 또는 비천연 아미노산 서열을 갖는지 여부와 관계없이, 임의의 Asn 잔기(들) 및/또는 임의의 Gln 잔기(들)는 Asn을 Gln으로와 같은 보존적 치환을 비롯한, 임의의 다른 천연 또는 비천연 아미노산으로 독립적으로 치환될 수 있다. 이러한 치환(들)은 아스파라긴 및/또는 글루타민의 임의의 잠재적인 탈아미드화를 부분적으로 최소화하거나 방지하도록 설계되었다.

추가적인 CNP 펩티드 및 변이체는 본원에 참조로서 포함된, 미국 특허 제8,198,242호에 개시되어 있다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드는 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP) 또는 CNP 변이체이고 상기 친수성 펩티드 염은 CNP 또는 CNP 변이체의 염이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 본원에 기재된 바와 같은 CNP 변이체이다.

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4);

및, 이들의 약제학적 염. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP는 CNP-아세테이트이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 펩티드 염이 소수성 CNP 염일 때, 상기 소수성 반대이온은 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트이다. 다양한 구현예들에 있어서, 다가 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온은 아연, 마그네슘 또는 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온은 아연을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 양이온은 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 다가 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온은 Zn² ⁺, Mg² ⁺, 또는 Ca² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온은 Zn² ⁺이다. 다양한 구현예들에 있어서, 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온은 Ca² ⁺이다.

다양한 구현예들에 있어서, 본 개시내용은 소수성 반대이온과 복합체를 형성하는 CNP 펩티드를 포함하는 C형 나트륨이뇨 펩티드의 소수성 염을 제공한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 염은 다가 양이온, 선택적으로 금속 양이온을 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 염은 정제된 CNP 염이다.

소수성 염의 정제 방법은 기술분야에 공지되어 있으며 본원에서 고려된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 소수성 염은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상의 순도를 갖는다.

사용 방법

연골무형성증은 연골 형성의 이상을 유발하는, 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(fibroblast growth factor receptor 3; FGFR-3) 유전자의 상염색체 우성 돌연변이의 결과이다. FGFR-3은 일반적으로 연골세포 성장, 및 이에 따른 골 성장에 부정적인 조절 효과를 갖는다. 연골무형성증에서, FGFR-3의 돌연변이 형태가 구성적으로 활성화되며(constitutively active), 이로 인해 골이 심하게 단축된다. 인간에서 FGFR-3의 활성화 돌연변이는 유전적 왜소증의 주요 원인이다. FGFR-3이 활성화된 마우스는 가장 흔한 형태의 골격 이형성증인 연골무형성증의 모델 역할을 하며, CNP의 과발현은 이러한 동물들을 왜소증으로부터 구제한다. 따라서, CNP 및 CNP의 기능적 변이체(functional variant)는 다양한 골격 이형성증의 치료를 위한 잠재적 치료제이다.

연골세포의 기질(matrix) 생성, 증식 및 분화를 자극하고 장골 성장을 증가시킴으로써, 본 개시내용의 CNP 염은 골격 이형성증과 같은 골-관련 장애를 겪는 인간을 비롯한 포유동물을 치료하는 데 유용하다. CNP-반응성 골-관련 장애 및 골격 이형성증의 비제한적 예는 연골무형성증, 연골형성저하증, 저신장증, 왜소증, 골연골이형성증, 치사성 이형성증, 선천성 골형성증(osteogenesis congenita), 연골무발생증, 선천성 연골이형성증(chondrodysplasia congenit), 동형접합 연골무형성증, 선천성 연골이형성증, 굴지이형성증, 선천성 치사성 저인산증, 주산기 치사 유형의 선천성 골형성증(perinatal lethal type of osteogenesis congenita), 짧은 늑골 다지 증후군, 연골형성저하증, 지근 유형의 선천성 연골이형성증(rhizomelic type of chondrodysplasia congenit), 얀센 유형의 골간단연골이형성증, 선천성 척추골단이형성증, 불완전골형성증, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 랑거 유형 전완부 이형성증, 니버겔트 유형 전완부 이형성증, 로비노 증후군, 라인하르트 증후군, 선단이골증, 말초 이골증, 니스트 이형성증, 섬유연골형성증, 로버츠 증후군, 전완하퇴말단이형성증, 소지증, 모르키오 증후군, 니스트 증후군, 영양위축성이형성증, 척추골단골간단이형성증, NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/레리 웨일), 및 PTPN11 돌연변이(누난 증후군)를 포함한다.

연골세포의 기질(matrix) 생성, 증식 및 분화를 자극하고 장골 성장을 증가시킴으로써, 본 개시내용의 CNP 변이체는 골격 이형성증과 같은 골-관련 장애를 겪는 인간을 비롯한 포유동물을 치료하는 데 유용하다. CNP-반응성 골-관련 장애 및 골격 이형성증의 비제한적 예는 연골무형성증, 연골형성저하증, 저신장증, 왜소증, 골연골이형성증, 치사성 이형성증, 선천성 골형성증, 연골무발생증, 선천성 연골이형성증, 동형접합 연골무형성증, 선천성 연골이형성증, 굴지이형성증, 선천성 치사성 저인산증, 주산기 치사 유형의 선천성 골형성증, 짧은 늑골 다지 증후군, 연골형성저하증, 지근 유형의 선천성 연골이형성증, 얀센 유형의 골간단연골이형성증, 선천성 척추골단이형성증, 불완전골형성증, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 랑거 유형 전완부 이형성증, 니버겔트 유형 전완부 이형성증, 로비노 증후군, 라인하르트 증후군, 선단이골증, 말초 이골증, 니스트 이형성증, 섬유연골형성증, 로버츠 증후군, 전완하퇴말단이형성증, 소지증, 모르키오 증후군, 니스트 증후군, 영양위축성이형성증, 및 척추골단골간단이형성증을 포함한다. 본원에서 고려되는 저신장증, 성장판 장애, 골-관련 장애 또는 골격 이형성증은 NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/레리 웨일), PTPN11 돌연변이(누난 증후군) 및 IGF1R 돌연변이와 관련된 장애를 포함한다.

본원에서 고려되는 저신장증, 성장판 장애, 골-관련 장애 또는 골격 이형성증은 NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/레리 웨일), 및 PTPN11 돌연변이(누난 증후군)와 관련된 장애를 포함한다.

상기 방법에 의해 고려되는 추가적인 저신장증 및 성장판 장애는 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인디언 헷지호그(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, 또는 FGFR3의 돌연변이와 관련된 장애를 포함한다.

상기 방법에 의해 고려되는 추가적인 저신장증 및 성장판 장애는 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인디언 헷지호그(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3, 또는 IGF1R의 돌연변이와 관련된 장애를 포함한다.

추가로, 상기 CNP 염은 특발성 저신장증 및 본원에 기재된 기타 골격 이형성증을 치료하기 위한 성장 호르몬의 보조제 또는 대안으로서 유용하다.

성장판 장애는 저신장증 또는 비정상적인 골 성장을 초래하며 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인디언 헷지호그(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, 또는 FGFR3을 비롯한, 골 성장에 관여하는 유전자의 유전적 돌연변이의 결과일 수 있는 장애를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 성장판 장애는 저신장증 또는 비정상적인 골 성장을 초래하며 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인디언 헷지호그(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3, 또는 IGF1R을 비롯한, 골 성장에 관여하는 유전자의 유전적 돌연변이의 결과일 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 성장판 장애 또는 저신장증은 신경발달질환과 연관된 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다. 다양한 구현예들에 있어서, 성장판 장애를 가진 대상체는 성장판 유전자의 돌연변이에 대해 이형접합성이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 돌연변이는 기능-상실 돌연변이이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 돌연변이는 기능-획득 돌연변이이다. 성장판 장애는 가족성 저신장증, 우성 유전성 저신장증으로도 공지된 우성 가족성 저신장증, 또는 특발성 저신장증을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Plachy 등의 J Clin Endocrinol Metab 104: 4273-4281, 2019를 참조한다.

ACAN의 돌연변이는 가족성 이단성 골연골염(familial osteochondritis dissecan) 및 저신장증 및 궁극적으로 골관절염을 발생시킬 수 있으며, 이는 관절에서 골의 말단으로부터 연골 및 때때로 골의 분리(detachment)에 의해 야기되는 골 손상(또는 병변) 영역을 특징으로 한다. 성장하는 골의 조직화되지 않은 연골 네트워크가 그 성장을 방해하여 저신장증으로 이어진다는 것이 제기되어 왔다. ACAN 및 저신장증과 연관된 돌연변이는 Val2303Met를 포함한다. Stattin 등의 Am J Hum Genet 86(2):126-37, 2010을 참조한다. ACAN 내 돌연변이로 인한 저신장증을 가진 환자는 투여가 CNP와 FGFR3의 공지된 상호작용에 의해 이들 환자들의 신장을 증가시킬 수 있어 CNP를 이용한 치료에서 이점을 얻을 것으로 고려된다.

수용체 NPR2를 비롯한, 나트륨이뇨 펩티드 시스템은 연골내 골 성장의 조절에 관여하는 것으로 나타났다(Vasques 등, Horm Res Pediat 82:222-229, 2014). 연구는 NPR2의 동형접합 또는 복합 이형접합 기능-상실 돌연변이가 심각한 저신장증을 갖는 골격 이형성증인 마로토형 전완하퇴말단이형성증(AMDM)을 유발함을 나타냈다(Vasquez 등, 2014, 상기 참조). 이형접합 기능-상실(예컨대, 우성 음성) NPR2 돌연변이가 저신장증의 원인임을 시사하는 보고서들이 존재하는 반면, 기능-획득 NPR2 이형접합 돌연변이는 고신장증(tall stature)의 원인으로 밝혀졌다(Vasquez 등, 2014, 상기 참조). CNP가 NPR2와 상호작용하여 cGMP 생성을 자극한다는 점에서, cGMP 수준을 증가시키는 것은 이러한 상태에서 바람직하며 이러한 질병 및 상태로 인한 합병증 관리에 치료적 이점을 갖는다.

NPR2의 이형접합 돌연변이는 특발성 저신장증 및 기타 형태의 저신장증을 초래하는 것으로 여겨진다. NPR2 유전자의 돌연변이는 하기에 제시되어 있으며 Amano 등의 J Clin Endocrinol Metab 99:E713-718, 2014, Hisado-Oliva 등의 J Clin Endocrinol Metab 100:E1133-1142, 2015 및 Vasques 등의 J Clin Endocrinol Metab 98:E1636-1644, 2013에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 기재된 바와 같은 CNP 변이체를 이용하여 치료되는 저신장증을 갖는 대상체는 -1.0, -1.5, -2.0, -2.5, 또는 -3.0 미만의 신장 SDS를 갖고, -1.0, -1.5, -2.0 또는 -2.5 미만의 신장 SDS를 갖는 적어도 1명의 부모를 갖는 것으로 고려되며, 선택적으로 여기에서 두 번째 부모는 정상 범위 내의 신장을 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 -2.0 내지 -3.0의 신장 SDS를 갖는 저신장증을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 -2.0 내지 -2.5의 신장 SDS를 갖는 저신장증을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하다. 그러나, NPR2의 신생 돌연변이(de novo mutation)가 -1.5, -2.0, -2.5, 또는 -3.0 미만의 신장 SDS로 정의되는 바와 같은 저신장증을 초래할 수 있으므로, 부모 중 어느 쪽도 저신장증을 갖지 않는, NPR2의 유해한 돌연변이(deleterious mutation)의 이형접합 보인자인 개체의 치료 또한 고려된다. 신장을 개선하고/하거나 골 성장을 향상시키기 위해 CNP를 이용하는 기타 성장판 유전자의 유해한 돌연변이에 대한 이형접합성인 개체의 치료가 추가 고려된다.

CNP 변이체를 이용하여 치료될 수 있는 환자에서의 예시적인 NPR2 돌연변이는 하기를 포함한다:

골격 성장에서 NPPC의 역할은 잘 문서화되어 있다. (Hisado-Oliva 등, Genetics Medicine 20:91-97, 2018). NPPC 녹아웃 마우스(knock out mouse)는 사지(limb)의 단축 및 연골내 골화(endochondral ossification)를 비롯한 심각한 불균형 형태의 왜소증을 나타냈다(Hisado-Oliva 등, 2018, 상기 참조). 인간 게놈 광범위 연구는 NPPC와 신장 사이의 관련성을 나타냈다(Hisado-Oliva 등, 2018, 상기 참조). CNP 반가불충분성(haploinsufficiency)이 인간의 저신장증의 원인으로 여겨져왔으나, 최근 연구는 저신장증 및 단지(short hands)를 가진 가족에서 이형접합 돌연변이를 확인하였다(Hisado-Oliva 등, 2018, 상기 참조). 이러한 연구는 이형접합 상태에서 측정되는 cGMP 생성의 상당한 감소를 관찰하였다(Hisado-Oliva 등, 2018, 상기 참조). NPPC의 돌연변이는 Gly119Cys 변화를 초래하는 355G>T 미스센스 돌연변이 및 Arg117Gly 변화를 초래하는 349C>G 미스센스 돌연변이를 포함한다. CGMP 생성을 구제하는 CNP 변이체는 이형접합 기능-상실 NPPC 돌연변이를 갖는 환자의 장애 관리에서 치료적 이점을 제공할 수 있다.

레리-웨일 연골골형성이상증(Leri-Weill dyschondrosteosis; LWD)은 전완부(forearm) 및 하퇴부(lower leg)의 단축, 손목의 비정상적 오정렬(손목의 마델룽 변형(Madelung deformity)), 및 연관된 저신장을 특징으로 하는 희귀 유전 장애이다. LWD는 성 염색체의 의사상동염색체 영역 1(pseudoautosomal region 1; PAR1) 상에 위치한 저신장 호메오박스-함유(short stature homeobox-containing; SHOX) 유전자 또는 그것의 조절 인자의 이형접합 돌연변이에 의해 발생한다. (희귀 질환 데이터베이스 및 Carmona 등, Hum Mol Genet 20:1547-1559, 2011 참조). 랑거 전완부 이형성증 장애는 2개의 SHOX 돌연변이가 존재할 때 발생하며, 동형접합 또는 복합 이형접합 돌연변이인 각 염색체 상의 돌연변이에서 비롯될 수 있다. SHOX 돌연변이의 서브세트는 특발성 저신장증을 발생시킨다. 터너 증후군은 SHOX 유전자를 포함할 수 있는 X 염색체의 결실로 인해 발생한다. SHOX는 FGFR3 전사 조절에 관여하는 것으로 확인되었으며 골 성장 제어에 기여한다(Marchini 등, Endocr Rev. 37: 417-448, 2016). SHOX 결핍은 FGFR3 신호전달을 증가시키며, SHOX가 CNP/NPR2와도 직접적인 상호작용을 갖는다는 것을 뒷받침하는 몇 가지 증거가 존재한다(Marchini, 상기 참조). SHOX와 FGFR3 및 골 성장과의 연관성을 고려할 때, 동형접합 또는 이형접합 SHOX 돌연변이를 갖는 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 CNP 변이체를 이용한 치료에서 이점을 얻을 것으로 고려된다.

신경발달질환은 Ras/미토겐-활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 경로 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 희귀 유전적 상태의 그룹이다. 신경발달질환은 RAS/MAPK 경로를 통한 증가된 신호전달을 특징으로 하는 장애 그룹이다. 상기 경로는 RAF/MEK/ERK 경로의 다운스트림 활성화(downstream activation)로 이어진다. 저신장증은 특정 신경발달질환의 특징적 특성이다. 예를 들어, CNP 신호절달은 RAF를 억제하고 MEK 및 ERK 활성화를 감소시킨다.

신경발달질환의 치료가 본원에서 고려된다. 저신장증과 연관된 신경발달질환은 누난 증후군, 코스텔로 증후군, 심장-얼굴-피부 증후군, 신경섬유종증 제1형, 및 다발성 흑자 증후군을 포함한다. 유전성 치은 섬유종증 제1형은 또한 본원에서 고려되는 신경발달질환이다. 신경발달질환 환자(누난 증후군, 코스텔로 증후군, 심장-얼굴-피부 증후군, 신경섬유종증 제1형, 다발성 흑자 증후군, 유전성 치은 섬유종증 제1형 포함)는 하기 유전자 중 하나 이상에 이형접합 변이체를 갖는 환자를 포함한다: BRAF, CBL, HRAS, KRAS, LZTR1, MAP2K1, MAP2K2, MRAS, NF1, NRAS, PPP1CB, PTPN11, RAF1, RRAS, RIT1, SHOC2, SOS1, 또는 SOS2(Tajan 등. Endocr. Rev. 2018;39(5):676-700).

CFC는 K-Ras, B-Raf, Mek1 및 Mek2를 비롯한, Ras/MAPK 신호전달 경로의 여러 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다. 얼굴피부골격(faciocutaneoskeletal; FCS) 증후군이라고도 지칭되는 코스텔로 증후군은 H-Ras 유전자의 돌연변이 활성화에 의해 유발된다. 유전성 치은 섬유종증 제I형(HGF)은 작은 GTP아제의 Ras 하위계열에 작용하는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(SOS)를 암호화하는, SOS1 유전자(Son of Sevenless 동족체 1)의 우성 돌연변이에 의해 유발된다. 신경섬유종증 제1형(NF1)은 Ras/MAPK 신호전달 경로의 음성 조절자를 암호화하는, 뉴로피브로민 1 유전자(neurofibromin 1 gene)의 돌연변이에 의해 유발된다. 누난 증후군(NS)은 K-Ras 및 Raf-1뿐만 아니라 SHP2, 및 SOS1을 암호화하는, PTPN11을 비롯한, 여러 유전자 중 하나의 돌연변이에 의해 유발된다.

CNP는 신경발달질환 모델에서 효과적인 치료법으로 입증되었다. Ono 등은 제II형 콜라겐 생성 세포에서 Nf1이 결핍된 마우스를 생성하였다(Ono 등, Hum. Mol. Genet. 2013;22(15):3048-62). 이들 마우스들은 구성적 ERK1/2 활성화, 및 감소된 연골세포 증식, 및 성숙을 입증하였다. 이들 마우스들에 CNP를 매일 주사하면 ERK 인산화가 감소하고 저신장증이 교정되었다. Braf 돌연변이(p.Q241R)를 사용한 심장-얼굴-피부 증후군의 마우스 모델(Inoue 등. Hum. Mol. Genet. 2019;28(1):74-83)은 야생형과 비교하여 더 작은 증식층(proliferative zone) 및 비대층(hypertrophic zone)과 함께 감소된 성장판 폭 및 감소된 체장(body length)을 나타내었으며, CNP 투여는 이들 동물들에서 체장을 증가시켰다.

다중 유전자의 돌연변이는 저신장, 심장 결함, 출혈 문제, 및 골격 기형(skeletal malformation)을 특징으로 하는 누난 증후군을 유발할 수 있다. PTPN11 유전자의 돌연변이는 누난 증후군의 전체 케이스의 약 절반을 유발한다. SOS1 유전자 돌연변이는 10% 내지 15%를 추가적으로 유발하며, RAF1 및 RIT1 유전자는 각각 케이스의 약 5%를 차지한다. 기타 유전자의 돌연변이는 각각 케이스의 소수를 차지한다. 상기 장애를 가진 사람들 중 15% 내지 20%는 누난 증후군의 원인이 알려지지 않았다.

PTPN11, SOS1, RAF1, 및 RIT1 유전자는 모두 세포 분열 및 성장(증식), 분화, 및 세포 이동에 필요한, RAS/MAPK 세포 신호전달 경로에서 중요한 단백질을 암호화한다. 누난 증후군과 연관된 유전자의 많은 돌연변이로 인해 생성되는 단백질이 작동되며(turned on)(활성) 이러한 장기간의 활성화가 정상 RAS/MAPK 신호전달을 변경하며, 이는 세포 성장 및 분열의 조절을 방해하여 누난 증후군의 특징적인 특성으로 이어진다. 예를 들어, Chen 등의 Proc Natl Acad Sci U S A. 111(31):11473-8, 2014, Romano 등의 Pediatrics. 126(4):746-59, 2010, 및

등의 Am J Med Genet 170(7):1874-80, 2016을 참조한다. MAPK 경로를 활성화하는 돌연변이를 갖는 대상체는 골 성장 및 저신장증을 개선하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 CNP 변이체를 이용한 치료에서 이점을 얻을 것으로 고려된다. MAPK 경로를 활성화하는 돌연변이를 갖는 대상체는 NPR2 수용체가 그 표면 상에서 발현되는 신체 전체의 다른 세포에서 과활성 MAPK 경로와 연관된 다른 동반이환(comorbidity)을 개선하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 CNP 변이체를 이용한 치료에서 이점을 얻을 것으로 또한 고려된다.

비수용체 단백질 티로신 포스파타제 SHP-2를 암호화하는 PTPN11 유전자의 돌연변이는 누난 증후군과 같은 저신장을 특징으로 하는 장애로 이어진다(Musente 등, Eur J Hum Genet 11:201-206 (2003). Musente(상기 참조)는 저신장증으로 이어지는 PTPN11 유전자의 수많은 돌연변이를 확인한다. 기능 획득 돌연변이는 SHP2를 통한 과민성 신호전달로 이어지며 성장 호르몬-유도 IGF-1 방출을 억제하여 골 성장 감소에 기여한다(

, PNAS 109:4257-4262, 2012) 동형접합 또는 이형접합 PTPN11 돌연변이를 갖는 대상체는 골 성장 및 저신장증을 개선하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 CNP 변이체를 이용한 치료에서 이점을 얻을 것으로 고려된다.

연골내 골화의 조절과 관련된, 인디언 헷지호그(IHH) 유전자의 돌연변이 또한 저신장 증후군과 연관이 있다(Vasques 등, J Clin Endocrinol Metab. 103:604-614, 2018). 확인된 많은 IHH 돌연변이는 우성 유전 패턴에서 저신장증과 분리된다. IHH와 골 성장 및 골화와의 연관성을 고려할 때, 동형접합 또는 이형접합 IHH 돌연변이를 갖는 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 CNP 변이체를 이용한 치료에서 이점을 얻을 것으로 고려된다.

N540K 및 K650N을 비롯한, FGFR3의 돌연변이는 저신장증 및 연골형성저하증으로 이어진다.

인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(Insulin-like growth factor 1 receptor; IGF1R)는 내인성(intrinsic) 키나아제 활성을 갖는 이형사량체(heterotetrameric)(α2β2) 막관통 당단백질(transmembrane glycoprotein)이다. IGF1R은 출생 전 및 출생 후 성장에 역할을 하는 것으로 나타났다. IGF1R의 이형접합 돌연변이는 부당경량아(Small for gestational age children; SGA) 및 가족성 저신장증을 가진 개체에서 확인되었다(Kawashima 등, Endocrine J. 59:179-185, 2012). 저신장증과 연관된 IGF1R의 돌연변이는 R108Q/K115N, R59T, R709Q, G1050K, R481Q, V599E, 및 G1125A를 포함한다(Kawashima, 상기 참조).

신장은 수백 또는 수천 개의 유전자들의 조합 효과에 의해 영향을 받을 수 있는 고도로 유전적인 형질이다(Wood 등, Nature Genetics, 46:1173-1189, 2014). 개체의 저신장증은 단일 유전자가 주요 기여자가 아닌, 이러한 유전자들의 조합 효과의 결과일 수 있다. -1.0, -1.5, -2.0, -2.5, 또는 -3.0 미만의 신장 SDS에 의해 정의되는 저신장증을 가진 이러한 개체는 CNP가 정상 동물의 길이를 증가, 예를 들어, 골 성장 및 골 길이를 향상시키는 능력을 고려할 때 CNP 변이체를 이용하여 유리하게 치료될 수 있는 것으로 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 -1.0, -1.5, -2.0, -2.5, 또는 -3.0 미만의 신장 SDS를 갖고, -1.0, -1.5, -2.0 또는 -2.5 미만의 신장 SDS를 갖는 적어도 1명의 부모를 갖는 저신장증을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하며, 선택적으로 여기에서 두 번째 부모는 정상 범위 내의 신장을 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 -2.0 내지 -3.0의 신장 SDS를 갖는 저신장증을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 -2.0 내지 -2.5의 신장 SDS를 갖는 저신장증을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 저신장증은 저신장증과 연관된 유전자, 예컨대, 콜라겐(COL2A1, COL11A1, COL9A2, COL10), 아그레칸(ACAN), 인디언 헷지호그(IHH), PTPN11, NPR2, NPPC, FGFR3, 또는 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R), 또는 이들의 조합들의 하나 이상의 돌연변이와 연관된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 저신장증은 다유전자 위험 점수(PRS)에 의해 결정된 바와 같은 다중 유전자의 돌연변이의 결과이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 NPR2의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 FGFR3의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 NPR2의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 IGF1R의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 NPPC의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 SHOX의 돌연변이 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 대상체는 FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이, 및 낮은 PRS를 갖는다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 PRS는 1 또는 2이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 PRS는 1이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 PRS는 2이다.

또한, 상기 CNP 염은 기타 골-관련 상태 및 장애, 예컨대, 구루병, 저인산염혈증 구루병[X-염색체 연관 저인산염혈증 구루병(비타민 D 내성 구루병으로도 지칭됨) 및 상염색체 우성 저인산염혈증 구루병 포함], 및 골연화증(osteomalacia)[종양-유도 골연화증(종양성 골연화증 또는 종양성 저인산염혈증 골연화증으로도 지칭됨) 포함]을 치료하는 데 유용하다.

본 개시내용의 CNP 염은 또한 골관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 골관절염은 관절 연골의 퇴행성 질환으로 노인들에게 주로 발생한다. 골관절염은 관절 구조(articular component)의 퇴행에서 비롯된 연골의 파괴 및 뼈와 연골의 증식성 변화를 수반하며, 이러한 변화로 인해 이차성 관절염(secondary arthritis)(예를 들어, 활막염(synovitis))이 초래된다. 골관절염에서 연골의 기능적 실체인 세포외 기질 단백질이 감소하였고, 연골세포의 수가 감소한다(Arth. Rheum. 46(8): 1986-1996 (2002)). 연골세포의 기질 생성, 성장 및 분화를 촉진함으로써, 상기 CNP 조성물은 골관절염을 비롯한 관절염을 앓고 있는 대상체에서 FGF-2의 바람직하지 않은 효과를 상쇄하고 기질 합성을 증가시켜 골관절염을 비롯한 관절염을 치료하는 데 유용하다.

특정 구현예들에 있어서, 본 개시내용의 CNP 염 및 이를 포함하는 조성물 및 제형은 골격 이형성증의 증상(들) 또는 생리학적 결과 중 하나 이상을 개선하는 데 유용하며, 여기에서 상기 개선은 절대 성장 증가, 성장 속도 증가, 정량적 컴퓨터 단층촬영(qualitative computed tomography; QCT) 골밀도(bone mineral density) 증가, 성장판 형태 개선, 장골 성장 증가, 척추 형태 개선, 팔꿈치 관절 운동 범위 개선 및/또는 수면 무호흡(sleep apnea) 감소일 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "개선된", "개선", "증가하다", "감소하다" 및 이들의 문법적 등가물은 모두 질병 상태의 증상 또는 생리학적 결과와 관련하여 사용될 때, 본 발명의 CNP 염(또는 이를 포함하는 조성물 또는 제형)을 이용하여 치료하기 전 질병의 증상 또는 생리학적 결과와 비교하여(즉, "기준선"과 비교하여) 본 발명의 CNP 염(또는 이를 포함하는 조성물 또는 제형)을 이용한 치료 후 질병의 동일한 증상 또는 생리학적 결과의 상태를 지칭하는 상대적 용어이다. 상기에서 기재한 바와 같이, "기준선" 상태는 치료 이전 대상체의 상태 측정(이는 이후에 치료 후 동일한 대상체의 상태와 비교될 수 있음)을 통해, 또는 동일하거나 유사한 특징(예를 들어, 연령, 성별 및/또는 질병 상태 또는 진행)을 공유하는 동일한 고통을 겪고 있는 대상체의 모집단의 해당 상태의 측정을 통해 결정될 수 있다.

또 다른 구현예들에 있어서, 본 개시내용은 시험관내 또는 체내에서 동일한 농도의 wtCNP22(예를 들어, 1uM) 하에 생성되는 cGMP 수준의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% 또는 150%의 생성을 자극하는 CNP 변이체의 염을 제공한다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 개시내용의 CNP 또는 CNP 변이체를 포함하는 소수성 염은 시험관내 또는 체내에서 동일한 농도의 wtCNP22(예를 들어, 1uM) 하에 생성되는 cGMP 수준의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% 또는 150%의 생성을 자극한다.

본원에 기재된 임의의 CNP 변이체는 상기 방법에 유용한 것으로 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37(서열식별번호:1))이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 아세틸기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드의 N-말단 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 아세틸기는 상기 펩티드 서열 내의 아미노산 측쇄 상에 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 상기 C-말단에 OH 또는 NH₂기를 추가 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 변이체는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 링커기를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 링커는 가수분해성 링커이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 펩티드는 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 포함하며, 상기 염은 소수성 반대이온과 복합체화된 정전기적으로 하전된 펩티드를 포함한다.

치료의 효능은 다양한 매개변수에 의해 측정된다. 다양한 구현예들에 있어서, 효능은 기준선 기간으로부터 개입(intervention) 기간까지의 연간 성장 속도의 변화로서 평가된다. 효능은 또한 CDC 성장 곡선을 사용하여 측정되는 기준선으로부터 치료 종료까지의 신장 SDS의 변화로서 평가될 것이고, 성장 속도 SDS는 아동기 연구에서의 골밀도를 기반으로 할 것이다(Kelly 등, J. Clin . Endocrinol.Metab.2014;99(6):2104-2112).

저신장증 청소년의 삶의 질인 QoLISSY(Quality of Life in Short Stature Youth)는 지시된 바와 같이 평가된다(Quality of Life in Short Stature Youth - The QoLISSY Questionnaire User's Manual. Lengerich: Pabst Science Publishers; 2013).

약제학적 조성물

본 개시내용은 본원에 기재된 펩티드 염, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 변형 방출형 조성물을 비롯한, 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 다른 생물학적 활성제(예를 들어, 프로테아제 억제제, 수용체 티로신 키나아제, 및/또는 청소 수용체(clearance receptor) NPR-C)를 추가 포함한다.

본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 소수성 펩티드 염을 포함하는 변형 방출형 조성물을 제공한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 변형 방출형 조성물은 연장 방출형 조성물이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 연장 방출형 조성물은 소수성 CNP 염을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 염의 소수성 반대이온은 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트이다. 다양한 구현예들에 있어서, 다가 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온은 아연 또는 칼슘을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온은 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺이다.

침전된 펩티드 복합체는 침전이 형성된 pH 조건 하에서 연장 방출 특징을 나타낼 수 있다. 침전된 펩티드 복합체는 또한 저분해성(slow degrading) 미소구체, 하이드로겔 등과 같은 지속 방출을 위한 추가적인 장벽을 제공하는 기질으로의 추가 처리에 사용될 수 있다. 상기 소수성 CNP 염은 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자이고, 수용액 또는 오일에 재현탁되는 것으로 고려된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 수용액은 물, 식염수, 또는 완충액이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 입자는 1 내지 10,000 마이크로미터(um), 1 um 내지 2000 um, 2 um 내지 1000 um, 5 um 내지 500 um, 10 um 내지 1000 um, 50 um 내지 500 um, 100 um 내지 800 um, 200 내지 600 um, 300 um 내지 500 um, 100 um 내지 300 um, 50 um 내지 100 um, 또는 10 um 내지 50 um이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 입자는 나노입자이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 나노입자는 대략 5 나노미터(nm) 내지 1000 nm, 8 nm 내지 900 nm, 10 nm 내지 800 nm, 20 nm 내지 600 nm, 50 nm 내지 500 nm, 50 내지 400 nm, 20 내지 300 nm, 300 내지 800 nm 또는 200 내지 600 nm이다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 오일은 포화 또는 불포화될 수 있는, 트리글리세리드 또는 지방산을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 트리글리세리드 및 지방산은 또한 상기 소수성 CNP 염 조성물과 함께 사용하기 위해 고려된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 또는 도데칸산이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 지방산은 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산 또는 도큐세이트이다.

다양한 구현예들에 있어서, pH 7 내지 7.6에서 펩티드의 약 20% 미만이 1일차까지 방출된다. (i) pH 7.0 내지 7.6에서, 펩티드의 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50% 미만이 1일차까지 방출되고; 및 (ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 매주 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 격주로 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 매월 방출되는 것이 추가 고려된다. (i) pH 7.0 내지 7.6에서, 펩티드의 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60% 미만이 1일차까지 방출되고; 및 (ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 매주 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 격주로 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 3주마다 방출되거나; 펩티드의 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 매월 방출되는 것이 추가 고려된다. 다양한 구현예들에 있어서, pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 매주 방출된다. 다양한 구현예들에 있어서, pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 격주로 방출된다. 다양한 구현예들에 있어서, pH 7 내지 7.6에서 펩티드의 약 90%가 매월 방출된다. 상기 방출은 pH 7.0 내지 7.6, pH 7.1 내지 7.5, pH 7.2 내지 7.4, pH 7.2 내지 7.6, 또는 pH 7.0 내지 7.4일 수 있는 것으로 추가 고려된다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 연장 방출형 조성물은 부형제, 희석제 또는 담체를 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 부형제, 희석제 또는 담체는 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체이다.

부형제, 담체 및 희석제의 비제한적인 예는 비히클, 액체, 완충액, 등장화제(isotonicity agent), 첨가제, 안정화제, 보존제, 가용화제, 계면활성제, 유화제, 습윤제, 애주번트 등을 포함한다. 상기 조성물은 액체(예를 들어, 물, 에탄올); 다양한 완충액 함량의 희석제(예를 들어, 트리스-HCl, 포스페이트, 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액), pH 및 이온 강도; 세제 및 가용화제(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80); 항산화제(예를 들어, 메티오닌, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트(sodium metabisulfite)); 보존제(예를 들어, 티메로솔(Thimerosol), 벤질 알코올, m-크레솔); 및 증량 물질(bulking substance)(예를 들어, 락토스, 만니톨, 수크로스)을 함유할 수 있다. 약제학적 조성물의 제형화에서 상기 부형제, 희석제 및 담체의 사용은 기술분야에 공지되어 있으며; 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, pages 1435-1712, Mack Publishing Co. (Easton, Pennsylvania (1990))을 참조하되, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.

예를 들어, 담체는 제한 없이 희석제, 비히클 및 애주번트뿐만 아니라 이식물 담체(implant carrier), 및 불활성, 무독성 고체 또는 액체 충전제 및 활성 성분(들)과 반응하지 않는 캡슐화 물질을 포함한다. 담체의 비제한적인 예는 포스페이트 완충 식염수, 생리 식염수, 물, 및 에멀젼(예를 들어, 오일/물 에멀젼)을 포함한다. 담체는, 예를 들어, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 및 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매(dispersing medium)일 수 있다.

일부 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 액체 제형이다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 제형은 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 또는 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 0.5 내지 5 mg/ml, 또는 약 0.5 내지 3 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 농도 범위의 소수성 CNP 염을 포함한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 0.8 mg/mL 내지 2 mg/mL의 농도로 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 0.8 mg/mL의 농도에서 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 2.0 mg/mL의 농도에서 존재한다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 동결건조된 분말로부터 재구성된다.

추가 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 완충 용액 또는 완충제를 포함하여 CNP-함유 용액 또는 현탁액의 pH를 바람직한 범위 내로 유지한다. 완충 용액의 비제한적 예는 포스페이트 완충 식염수, 트리스 완충 식염수, 및 행크 완충 식염수(Hank's buffered saline)를 포함한다. 완충제는 제한 없이 소듐 아세테이트, 소듐 포스페이트, 및 소듐 시트레이트를 포함한다. 완충제의 혼합물 또한 사용될 수 있다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 완충제는 아세트산/아세테이트 또는 시트르산/시트레이트이다. 조성물에서 적합한 완충제의 양은 사용되는 특정 완충액 및 용액 또는 현탁액의 바람직한 pH에 부분적으로 의존한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 완충제는 약 10 mM ± 5 mM의 농도를 갖는다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 조성물의 pH는 약 pH 3 내지 약 pH 9, 또는 약 pH 3 내지 약 pH 7.5, 또는 약 pH 3.5 내지 약 pH 7, 또는 약 pH 3.5 내지 약 pH 6.5, 또는 약 pH 4 내지 약 pH 6, 또는 약 pH 4 내지 약 pH 5, 또는 약 pH 5.0 ± 1.0이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 pH는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 pH는 5.5이다.

다른 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 등장성-조절제를 함유하여 용액 또는 현탁액을 등장성으로 만들고 투여에 보다 호환성이 되도록 한다. 등장화제의 비제한적인 예는 NaCl, 덱스트로스, 글루코스, 글리세린, 소르비톨, 자일리톨, 및 에탄올을 포함한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 등장화제는 NaCl이다. 특정 구현예들에 있어서, NaCl은 약 160 ± 20 mM, 또는 약 140 mM ± 20 mM, 또는 약 120 ± 20 mM, 또는 약 100 mM ± 20 mM, 또는 약 80 mM ± 20 mM, 또는 약 60 mM ± 20 mM의 농도로 존재한다.

또 다른 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 보존제를 포함한다. 보존제는 m-크레솔 및 벤질 알코올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 보존제는 약 0.4% ± 0.2%, 또는 약 1% ± 0.5%, 또는 약 1.5% ± 0.5%, 또는 약 2.0% ± 0.5%의 농도로 존재한다.

또 다른 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 (예를 들어, 유리 또는 플라스틱에 대한 CNP 염의 흡착을 완화하기 위해) 흡착방지제를 함유한다. 흡착방지제는 제한 없이 벤질 알코올, 폴리소르베이트 20, 및 폴리소르베이트 80을 포함한다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 흡착방지제는 약 0.001% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.1% 내지 약 1%, 또는 약 0.5% 내지 약 1%, 또는 약 0.5% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.5% 내지 약 2%, 또는 약 1% 내지 약 2%의 농도로 존재한다.

추가적인 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 안정화제를 포함한다. 안정화제의 비제한적 예는 글리세린, 글리세롤, 티오글리세롤, 메티오닌, 및 아스코르브산 및 이들의 염을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 안정화제가 티오글리세롤 또는 아스코르브산 또는 이들의 염일 때, 상기 안정화제는 약 0.1% 내지 약 1%의 농도로 존재한다. 다른 구현예들에 있어서, 상기 안정화제가 메티오닌일 때, 상기 안정화제는 약 0.01% 내지 약 0.5%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.2%의 농도로 존재한다. 또 다른 구현예들에 있어서, 상기 안정화제가 글리세린일 때, 상기 안정화제는 약 5% 내지 약 100%(순수)의 농도로 존재한다.

추가 구현예들에 있어서, 상기 조성물은 항산화제를 함유한다. 예시적인 항산화제는 제한 없이 메티오닌 및 아스코르브산을 포함한다. 특정 구현예들에 있어서, 항산화제 대 CNP의 몰 비율은 약 0.1:1 내지 약 15:1, 또는 약 1:1 내지 약 15:1, 또는 약 0.5:1 내지 약 10:1, 또는 약 1:1 내지 약 10:1 또는 약 3:1 내지 약 10:1이다.

약제학적으로 허용가능한 염이 상기 조성물에 사용될 수 있으며, 이는 제한 없이 무기산 염(예를 들어, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트), 유기산의 염(예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트, 메실레이트, 토실레이트), 및 아민의 염(예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디사이클로헥실아민, 디에탄올아민)을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염에 대한 철저한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990))에서 찾을 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 다양한 형태, 예컨대, 정제, 캡슐, 과립, 분말, 용액, 현탁액, 에멀젼, 연고, 및 경피 패치로 투여될 수 있다. 상기 조성물의 투약 형태는 상기 조성물의 바람직한 투여 방식에 맞춰질 수 있다. 경구 투여의 경우, 상기 조성물은, 예를 들어, 정제 또는 캡슐(소프트겔 캡슐 포함)의 형태를 취할 수 있거나, 예를 들어, 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 시럽일 수 있다. 경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은 하나 이상의 일반적으로 사용되는 부형제, 희석제 및 담체, 예컨대, 만니톨, 락토스, 글루코스, 수크로스, 전분, 옥수수 전분, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트, 및 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 푸마레이트)를 포함할 수 있다. 바람직한 경우, 향미제, 착색제 및/또는 감미제가 고체 및 액체 제형에 첨가될 수 있다. 경구 제형을 위한 기타 선택적인 성분은 제한 없이 보존제, 현탁제, 및 증점제를 포함한다. 경구 제형은 또한 장용 코팅을 가져 위의 산성 환경으로부터 상기 CNP 염을 보호할 수 있다. 고체 및 액체 투약 형태의 제조 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있거나, 자명할 것이다(예를 들어, 상기 참조된 Remington's Pharmaceutical Sciences 참조).

비경구 투여용 제형은, 예를 들어, 액체 용액 또는 현탁액, 주사 이전 액체 매질에서의 가용화 또는 현탁에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 멸균 주사가능 용액 및 현탁액은 적합한 희석제, 담체, 용매(예를 들어, 완충 수용액, 링거 용액(Ringer's solution), 등장성 소듐 클로라이드 용액), 분산제, 습윤제, 유화제, 현탁제 등을 사용하는 기술분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 또한, 멸균 고정 오일(sterile fixed oil), 지방 에스테르, 폴리올 및/또는 기타 비활성 성분이 사용될 수 있다. 추가 예로서, 비경구 투여를 위한 제형은 항산화제, 완충액, 정균제(bacteriostat), 및 상기 제형을 의도되는 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질; 및 현탁제 및 증점제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 함유할 수 있는 수성 멸균 주사가능 용액을 포함한다.

소수성 CNP 염을 포함하는 조성물은 또한 동결건조된 제형일 수 있다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 동결건조된 제형은 완충액 및 증량제, 및 선택적으로 항산화제를 포함한다. 예시적인 완충액은 제한 없이 아세테이트 완충액 및 시트레이트 완충액을 포함한다. 예시적인 증량제는 제한 없이 만니톨, 수크로스, 덱스란, 락토스, 트레할로스, 및 포비돈(PVP K24)을 포함한다. 특정 구현예들에 있어서, 만니톨은 약 3% 내지 약 10%, 또는 약 4% 내지 약 8%, 또는 약 4% 내지 약 6%의 양으로 존재한다. 특정 구현예들에 있어서, 수크로스는 약 6% 내지 약 20%, 또는 약 6% 내지 약 15%, 또는 약 8% 내지 약 12%의 양으로 존재한다. 예시적인 항산화제는 메티오닌 및 아스코르브산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

다양한 구현예들에 있어서, 상기 제형은 시트르산, 소듐 시트레이트, 트레할로스, 만니톨, 메티오닌, 폴리소르베이트 80, 및 선택적으로 주사용 멸균수(water for injection; WFI)를 포함한다.

본 개시내용은 또한 액체(예를 들어, 멸균 주사가능함) 제형 또는 고체(예를 들어, 동결건조됨) 제형을 포함하는, 예를 들어, 병, 바이알, 앰플, 튜브, 카트리지 및/또는 시린지(syringe)를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 약제학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매, 용액 및/또는 완충액)를 포함하여 고체(예를 들어, 동결건조됨) 제형을 투여(예를 들어, 주사에 의함)용 용액 또는 현탁액으로 재구성할 수 있으며, 이는 제한 없이 주사용 또는 농축물을 더 낮은 농도로 희석하기 위해 시린지 내 동결건조된 제형을 재구성하는 것을 포함한다. 또한, 임시(extemporaneous) 주사 용액 및 현탁액은, 예를 들어, CNP-함유 조성물을 포함하는 멸균 분말, 과립, 또는 정제로부터 제조될 수 있다. 상기 키트는 또한 분배 장치, 예컨대, 에어로졸 또는 주사 분배 장치, 펜 주사기, 자동주사기, 무바늘 주사기, 시린지, 및/또는 바늘을 포함할 수 있다.

비제한적인 예로서, 키트는 단일 챔버 또는 이중 챔버를 갖는 시린지를 포함할 수 있다. 단일-챔버 시린지의 경우, 상기 단일 챔버는 주사용으로 준비된 액체 CNP 제형, 또는 주사용 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 소량의 적합한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린) 내의 고체(예를 들어, 동결건조됨) CNP 제형 또는 CNP 염의 액체 제형을 포함할 수 있다. 이중-챔버 시린지의 경우, 한 챔버는 약제학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매 시스템, 용액 또는 완충액)를 포함할 수 있고, 나머지 챔버는 첫 번째 챔버로부터의 비히클 또는 담체를 사용하여 주사용 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 소량의 적합한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린) 내의 고체(예를 들어, 동결건조됨) CNP 제형 또는 CNP 염의 액체 제형을 포함할 수 있다.

추가 예로서, 키트는 하나 이상의 펜 주사기 또는 자동주사기 장치, 및 이중-챔버 카트리지를 포함할 수 있다. 카트리지의 한 챔버는 약제학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체(예를 들어, 용매 시스템, 용액 또는 완충액)를 포함할 수 있고, 나머지 챔버는 첫 번째 챔버로부터의 비히클 또는 담체를 사용하여 주사용 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 비교적 소량의 적합한 용매 시스템(예를 들어, 글리세린) 내의 고체(예를 들어, 동결건조됨) CNP 제형 또는 CNP 염의 액체 제형을 포함할 수 있다. 카트리지는 바람직한 기간(예를 들어, 2일, 3일, 1주, 2주, 3주, 4주 등) 동안 투약하기에 충분한 양의 CNP 염을 포함할 수 있다. 상기 펜 주사기 또는 자동주사기는 카트리지로부터 바람직한 양의 CNP 제형을 투여하도록 조정될 수 있다.

투여 및 투약

상기 소수성 CNP 염, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물 또는 제형은, 예를 들어, 피하, 관절내, 복강내, 근육내, 피부내 또는 경구와 같은 다양한 방식으로 대상체에 투여될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 CNP 펩티드 염 조성물은 1일 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여된다.

상기 소수성 CNP 염 또는 염 조성물은 또한 표적 작용 부위(예를 들어, 비정상적이거나 퇴행된 관절 또는 연골 영역)에 데포(depot)를 이식하여 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 CNP 염은 경피 전달(예를 들어, 피부 상의 패치를 통해)에 의해 혀 아래에서 설하 투여되거나(예를 들어, 설하 정제) 미소구체, 마이크로캡슐, 리포솜(하전되지 않거나 하전됨(예를 들어, 양이온성)), 중합체성 마이크로입자(예를 들어, 폴리아미드, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리(락티드-글리콜리드)), 마이크로에멀젼 등의 형태로 경구 투여될 수 있다.

본원에 기재된 소수성 CNP 염 조성물은 골-관련 장애(예를 들어, 연골무형성증을 비롯한, 골격 이형성증)를 치료, 개선 또는 예방하기 위해 치료적 유효량으로 이를 필요로 하는 환자에 투여될 수 있다. 상기 CNP 염의 안전성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약리학적 절차, 예컨대, 예를 들어, LD₅₀(50%의 모집단에 치명적인 용량) 및 ED₅₀(50%의 모집단의 치료적으로 유효한 용량)을 결정하여 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수(therapeutic index)이며 LD₅₀/ED₅₀의 비율로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 활성제가 보통 바람직하다.

특정 구현예들에 있어서, 본원에 기재된 소수성 CNP 염 조성물은 약 3 또는 10 nmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 또는 약 20 nmol/kg 내지 약 200 nmol/kg, 또는 약 3 nmol/kg 내지 100 nmol/kg 범위의 용량으로 투여된다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 CNP 염 조성물은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 또는 2000 nmol/kg의 용량 또는 치료 의사가 적절하다고 간주하는 기타 용량으로 투여된다. 다른 구현예들에 있어서, 상기 CNP 염 조성물은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 μg/kg, 또는 약 0.5, 0.8, 1.0, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg/kg의 용량, 또는 치료 의사가 적절하다고 간주하는 기타 용량으로 투여된다. 본원에 기재된 소수성 CNP 염의 용량은 제한 없이 매일, 주당 2회 또는 3회, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월 등을 비롯한, 본원에 기재되는 투약 빈도/투여 빈도에 따라 투여될 수 있다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 염은 매일 피하 투여된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 염은 매주 피하 투여된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 2.5 μg/kg/일 내지 60 μg/kg/일, 10 μg/kg/일 내지 45 μg/kg/일, 또는 15 μg/kg/일 내지 30 μg/kg/일의 용량으로 투여된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 15 μg/kg/일의 용량으로 투여된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 30 μg/kg/일의 용량으로 투여된다.

특정 대상체에 대한 소수성 CNP 염의 투약/투여 빈도는 치료되는 장애 및 치료법에 대한 대상체의 상태 및 반응을 비롯한, 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 상기 소수성 CNP 염은 투약 시 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 소수성 CNP 염 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량으로, 매일 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회, 또는 치료 의사가 적절하다고 간주하는 바에 따라 투여된다. 다양한 구현예들에 있어서, 상기 CNP 변이체는 3개월, 6개월, 12개월 또는 그 이상 동안 투여된다.

일부 구현예들에 있어서, 소수성 CNP 염 조성물은 성장 기간(예를 들어, 연골형성)에 이어 회복 기간(예를 들어, 골형성)을 허용하도록 투여된다. 예를 들어, 상기 CNP 염 조성물은 일정 기간 동안 매일 또는 주당 다중 회 피하 또는 또 다른 방식으로 투여되고, 이어서 무치료 기간이 이어지며, 그 후 주기가 반복될 수 있다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 치료의 초기 기간(예를 들어, 상기 CNP 염 조성물을 매일 또는 주당 다중 회 투여)은 3일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 동안이다. 관련된 구현예에 있어서, 상기 무치료 기간은 3일, 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 지속된다. 특정 구현예들에 있어서, 상기 CNP 염 조성물의 투약 요법은 3일 동안 매일에 이은 3일의 휴지기; 또는 1주 동안 매일 또는 주당 다중 회에 이은 3일 또는 1주의 휴지기; 또는 2주 동안 매일 또는 주당 다중 회에 이은 1주 또는 2주의 휴지기; 또는 3주 동안 매일 또는 주당 다중 회에 이은 1, 2 또는 3주의 휴지기; 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주 동안 매일 또는 주당 다중 회에 이은 1, 2, 3 또는 4주의 휴지기이다.

바이오마커

골-관련 장애의 치료를 위해, 자궁(utero) 및 신생아(neonatal)에서의 장골 성장 측정 및 CNP, cGMP, 콜라겐 II, 콜라겐 X, 오스테오칼신, 및 증식 세포 핵 항원(Proliferating Cell Nuclear Antigen; PCNA)과 같은 골 성장 바이오마커의 측정과 같은 성장 지표가 측정될 수 있다.

한 CNP 신호전달 마커는 cGMP(구아노신 3',5' 고리형 모노포스페이트)이다. 상기 세포내 신호전달 분자의 수준은 CNP가 그것의 동족 수용체(cognate receptor) NPR-B에 결합하여 이를 활성화한 후 증가한다. cGMP의 상승된 수준은 CNP 노출 후 세포 배양 추출물(시험관내), CNP 노출 후 골 외식편(ex-plant) 연구(체외)의 조정 배지(conditioned media), 및 CNP의 피하, 정맥내, 또는 기술분야에 공지된 다른 투여 경로를 통한 투여 후 수 분 이내 혈장(체내)에서 측정될 수 있다.

연골 및 골-특이적 분석물(또는 연골-연관 및 골-연관 마커)이 또한 측정되어 CNP 효능을 평가할 수 있다. 예를 들어, 절단된 제II형 콜라겐의 단편은 연골 교체(cartilage turnover)에 대한 연골-특이적 마커이다. 제II형 콜라겐은 연골의 주요 유기 구성성분이며 제II형 콜라겐의 단편(절단된 콜라겐)은 방출되어 순환되며, 연골 교체에 이어 후속적으로 소변으로 분비된다. 연골 교체는 신규한 골 형성에 선행한다.

측정될 수 있는 골 형성에 대한 골-특이적 바이오마커는 제I형 프로콜라겐의 N-말단 프로펩티드(PINP)이다. 제I형 콜라겐은 골 기질의 주요 유기 성분이기 때문에 상기 제I형 콜라겐의 합성은 골 형성의 중요한 단계이다. 콜라겐 합성 동안, 프로펩티드는 프로콜라겐 분자로부터 방출되어 혈청에서 검출될 수 있다. 또한, 제I형 콜라겐의 단편은 골 흡수(resorption)에 대한 마커로 측정될 수 있다.

연골 및 골 형성 및 성장에 대한 다른 잠재적 바이오마커는 아그레칸 콘드로이틴 설페이트(aggrecan chondroitin sulfate)(연골 교체에 대한 연골-특이적 마커), 제II형 콜라겐의 프로펩티드(연골 형성에 대한 연골-특이적 마커), 알칼리성 포스파타제(골-특이적) 및 오스테오칼신(골 형성을 위한 골-특이적 마커)을 포함한다. 연골-연관 및 골-연관 바이오마커는, 예를 들어, 시판되는 키트를 사용하여 효능/약력학 체내 연구 및 체외 연구의 조정 배지로부터 혈청에서 측정될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 본원에 기재된 CNP 염 또는 지속 방출형 조성물을 투여받은 대상체의 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커의 수준을 분석하거나 측정하여 체내 골 및 연골 형성 및 성장에 대한 상기 CNP 조성물의 효과를 모니터링한다. 예를 들어, 적어도 하나의 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커 수준의 증가는 CNP 염 또는 지속 방출형 조성물의 투여가 골 성장에 긍정적인 영향을 미치고 골격 이형성증 및 감소된 CNP 활성과 연관된 기타 골-관련 또는 연골-관련 질환 또는 장애에 대한 유용한 치료임을 나타낼 수 있다. 예시적인 골-연관 또는 연골-연관 바이오마커는 CNP(예를 들어, CNP의 내인성 수준), cGMP, 제II형 콜라겐의 프로펩티드 및 이의 단편, 제II형 콜라겐 및 이의 단편, 오스테오칼신, 증식 세포 핵 항원(PCNA), 제I형 프로콜라겐의 프로펩티드(PINP) 및 이의 단편, 제I형 콜라겐 및 이의 단편, 아그레칸 콘드로이틴 설페이트, 및 알칼리성 포스파타제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

다양한 구현예들에 있어서, 바이오마커는 CNP 염 또는 지속 방출형 조성물이 투여될 것이거나, 투여 중이거나 투여된 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하여 측정된다. 바이오마커는 웨스턴 블롯(Western Blot), 효소 결합 면역흡착 검사(enzyme linked immunosorbant assay; ELISA), 및 효소 활성 검사를 포함하나, 이에 제한되지 않는 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 소변, 또는 기타 생물학적 유체일 수 있다.

본 개시내용의 추가적인 양태 및 세부사항은 제한하려는 것보다는 예시적인 것으로 의도되는, 하기 실시예들로부터 명백할 것이다.

실시예

실시예 1: 소수성 CNP 염의 생성

친수성 펩티드 CNP와 소수성 반대이온을 복합체화하여 그 전하를 안정화시키는 것이 치료적 목적을 위한 CNP의 제형을 개선하는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해, 다른 이온성 성분과 조합하여 CNP의 정전기적 전하를 변경하는 실험이 수행되었다.

CNP 펩티드와 소수성 반대이온 종 사이의 정전기적 복합체화를 최적화하고, 이에 따른 펩티드 복합체의 침전을 제어하기 위해, 용액 환경은 두 종의 더 큰 모집단이 이온화될 수 있도록 해야 한다. 10(CNP의 pI)과 상기 반대이온의 산성 pKa(예를 들어, 실시예 반대이온 종 올레산의 pKa는 ~4-5) 사이의 중간 값으로의 두 용액들의 pH 조정은 펩티드 복합체 침전의 수율에 중요하다.

CNP 변이체를 비롯한, 소수성 CNP 염을 제조하기 위해, CNP-아세테이트를 물 또는 완충액에 넣는다. 첫 번째 실험에서, 물에 20 mg/mL로 CNP를 포함하는 스톡 용액을 제조하였다. 100 mM 트리스, pH 9.00 또한 용매로서 효과적이다. 디소듐 파모산, 올레산, 또는 소듐 도큐세이트를 CNP 상의 반대로 하전된 기의 수에 대해 몰 과량, 이 경우 CNP에 대해 12몰 과량의 반대이온의 농도로 완충액에 넣었다. CNP는 pH 7에서 6개의 양으로 하전된 기를 가지며, 이는 양으로 하전된 기의 수에 대하여 2배 과량이다. 완충 용액(76 mM 아세테이트 완충액 pH 4.84 및 100 mM 포스페이트 완충액 pH 6.61)에서 상기 반대이온은 쉽게 용해되지 않고 완충액에서 불용성 또는 저용해도 반대이온으로 보이는 현탁액을 형성하나, 물 및 100 mM 트리스 pH 9.00 반대이온 올레산, 디소듐 파모산, 및 소듐 도큐세이트에서는 용해성이었다.

염 침전을 용이하게 하기 위해 금속 양이온을 첨가하였을 때, 상기 금속 양이온은 물에 용해되어 상기 CNP 용액에 첨가되고 상기 반대이온 용액에는 첨가되지 않았으며, 상기 금속 양이온이 상기 반대이온에 직접 첨가되는 경우 상기 반대이온 용액의 침전이 유도되는 것이 관찰되었다. 상기 금속 양이온 용액(예를 들어, ZnCl₂)을 고농도(>100 mg/mL)로 물에 용해시켜 상기 CNP 용액에 작은 부피를 첨가해도 농도 또는 pH가 유의적으로 변화되지 않도록 하였다. 상기 금속 양이온은 다양한 농도로 첨가할 수 있으나, 초기 실험에서는 CNP 농도에 대해 4몰 과량으로 첨가하였다(CNP에는 2개의 음으로 하전된 아미노산이 존재하며 이를 음으로 하전된 아미노산 몰당 2몰의 아연이 존재하도록 첨가하였다). 그 후 상기 반대이온 용액을 금속 양이온 점적을 함유하거나 함유하지 않는 상기 CNP 용액에 첨가하고, 모든 첨가가 완료된 후 1초 동안 가장 높은 설정에서 튜브를 와류시켰다.

바람직한 CNP 대 반대이온의 비율로 충분한 용액을 첨가한 후, 상기 반응 튜브를 5분 동안 10,000xg의 원심분리기에서 회전시켜 염 침전물을 펠릿화하였다. 회전 후, 상층액을 제거하고 제거된 상층액과 동일한 부피의 물을 첨가하여 펠릿을 재현탁시켰다. 이번에는 상기 튜브를 3-5분 동안 7500xg로 회전시켜 상기 염이 펠렛화되는 것을 관찰할 수 있었다. 회전 후, 상기 염 펠릿을 다시 물로 세척하고 재현탁시켰다. 상기 튜브를 다시 회전시키고 상층액을 제거하였다. 그 후 내용물을 바이알(예를 들어, 6R 보로실리케이트(borosilicate) 유리 바이알)로 이동시키고, 마개를 닫고, 동결시키고, 동결건조시켰다.

이어서, 다양한 완충액에서의 용해도에 대해 결과적인(subsequent) 염 분말을 평가하였다. 초기에, ~1 mg의 분말을 튜브에서 칭량하고(weighted) 적절한 부피의 용매를 첨가하여 1 mg/mL가 되도록 하였다. 상기 튜브를 약 37℃에서 밤새 흔들어(rocking) 두었다. 올레이트 염이 20% 아세트산에 용해될 수 있음을 발견하였다. 파모에이트 염은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해되었다.

이들 실험들은 고수용성 펩티드의 직경 5 나노미터 내지 1 밀리미터 범위의 크기를 갖는 수불용성/저용해도 응집체로의 침전이 가능함을 나타낸다.

실시예 2 - CNP 염의 특징규명

CNP의 소수성 염을 실시예 1에서와 같이 제조하여 침전 및 용해도에 대해 테스트하였다. 표 1은 다양한 소수성 반대이온과 복합체화된 CNP가 침전 또는 고체 형성을 초래함을 기재한다.

상기 염 침전물을 사용하여 용해 연구 또한 수행하였다. 1 mg CNP 염을 37℃에서 50 mL 1X PBS, pH 6.5에 재현탁시켜 고체의 용해 및 CNP의 용액으로의 방출에 대해 7일 동안 측정하였다. 완충액은 매일 교체하지 않았다. 도 1a 내지 도 1d 및 도 2는 소수성 염의 용해가 CNP-아세테이트 조성물에 대한 용해보다 더 느렸다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 이형접합 NPR2 돌연변이는 CNP 치료에 반응성임

NPR2 돌연변이에서 비롯된 저신장증을 가진 대상체에 대한 CNP의 효과를 결정하기 위해, NPR2 돌연변이의 세포 모델을 개발하였다. 분석된 예시적인 NPR2 돌연변이는 도 5에 제시되어 있다. RCS 또는 HEK293 세포로 형질감염된 125ng NPR2 변이체 또는 야생형 NPR2 플라스미드 DNA를 사용하여 RCS 세포로의 RNP 형질감염에 의해 NPR2 유전자의 녹아웃, 또는 NPR2 유전자 내 이형접합 기능 상실 돌연변이를 갖는 랫트 연골육종(Rat chondrosarcoma; RCS) 세포를 제조하였다. 단일 세포 클론을 시딩하고(seeded) 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)으로 유전자형을 지정하였다(genotyped). 세포 모델은 상이한 돌연변이의 공개된 cGMP 표현형(phenotype)을 재현할 수 있다.

RCS 세포에서 NPR2의 제 1 엑손에 삽입 및 결실을 생성하여 NPR2 클론을 생성하였다. 상기 NPR2의 제 1 엑손의 서열은 차세대 염기서열 분석에 의해 확인되었으며 이는 도 4에 제시되어 있다. 6nM의 Pro-Gly CNP37을 이용하여 처리한 후 CatchPoint Cyclic-GMP 형광 분석을 사용하여 cGMP 자극 분석에 의해 NPR2 돌연변이 세포의 CNP 투여에 대한 활성을 테스트하였다. 간단히 말해서, NIH3T3 세포(ATCC, CRL-1658) 및 NPR-형질감염된 HEK293 세포를 96-웰 플레이트(96-웰 블랙 이미징 플레이트, Grenier, #655090)에 60,000개 세포/웰로 시딩하였다. RCS(랫트 연골육종) 세포를 40,000개 세포/웰로 시딩하였다. 배양 배지는 하기와 같았다: NIH3T3 배양 배지: DMEM 고농도 글루코스, 피루베이트(Thermo, 11995-073) + 10% FBS + 1x Pen Strep(약어 P/S, Thermo, cat# 15140122). NIH3T3은 cGMP 분석에 대한 제어 시스템이었다. HEK293 배양 배지: EMEM + 10% FBS + 1x P/S + 1x GMAX. RCS 배양 배지: DMEM + 10% FBS + 1x Pen Strep. 무혈청 NIH3T3 배지: IBMX(CAS 28822-58-4)를 이용하여 세포를 처리하기 위한 DMEM + 1x P/S; BSA를 갖는 무혈청 NIH3T3 배지: CNP를 이용하여 세포를 처리하기 위한 DMEM + 1x P/S + 0.5 mg/mL BSA(Thermo, A9418-100G).

세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. CNP 변이체를 이용하여 처리되는 세포의 경우, 플레이트를 사용 15분 전에 IBMX(Enzo life sciences, 89161-340, 1g)를 이용하여 전처리하였다. IBMX는 포스포디에스테라아제의 강력한 비특이적 억제제이다. IBMX의 800 mM 스톡 용액을 IBMX 희석 배지(무혈청 배지(DMEM + 1x PBS와 1x PBS가 1:1 혼합됨)에서 0.75 mM 작업 스톡(working stock)으로 희석한다.

세포 처리를 위해, 인큐베이터에서 세포를 제거하고, 세포에서 성장 배지를 제거하고 IBMX를 이용하여 세포를 처리하였다. 80 μL 0.75 mM IBMX를 각 웰에 첨가하고 세포를 15분 동안 37℃ 인큐베이터로 복귀시켰다. 15분 후 CNP(40 μL/웰)를 각 테스트 웰에 첨가하고 세포를 15분 동안 37℃ 인큐베이터로 복귀시켰다. 플레이트를 부드럽게 두드려 혼합하고 Solentim cell metric 상에서 이미지화하여 세포를 시각화하여 임의의 세포 리프팅(cell lifting)이 존재하는지 결정한 후 다시 37℃ 인큐베이터에 넣었다.

반응을 중단하고 40 μL의 용해 완충액(cGMP 키트로부터)을 첨가하여 세포를 용해시켰다(lysed). 플레이트를 5분 동안 진탕기(shaker)에 두어 용해를 완료하였다. 세포 용해물은 cGMP 분석에 사용되었다.

상기 cGMP 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 제조된 cGMP 캘리브레이터(cGMP calibrator), 토끼 항-cGMP 항체 및 HRP-cGMP를 사용하여 수행하였다. 항-cGMP 항체가 코팅된 플레이트(plated)의 웰에 40 μL의 캘리브레이터를 첨가하고, 적절한 웰에 분석하고자 하는 40 μL의 용해물을 첨가하였다. 40 μL의 재구성된 토끼 항-cGMP 항체를 혼합을 위해 5분 동안 진탕기 상에 둔 모든 웰 및 플레이트에 첨가하였다. 40 μL의 재구성된 HRP-cGMP를 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 수동으로 흡인하고(aspirated) 300 μL 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 100 μL의 stoplight red 기질(substrate)을 각 웰, 플레이트에 첨가하고 커버하여 빛으로부터 보호된 실온에서 적어도 10분 동안 방치하였다. 여기 530 nm 및 590 nm에서의 방출에서, Spectramax M 또는 유사한 기기 상에서 형광 강도에 대해 상기 플레이트를 판독하였다.

도 3은 외인성 Pro-Gly-CNP37 변이체의 첨가가 NPR2 +/- 랫트 연골육종 세포 모델에서 cGMP 판독치(readout)를 구제함을 나타낸다. 이전 활성화 데이터는 PRKG2의 활성화에 대해 40 내지 360nM 범위의 cGMP EC50을 보고한다(Campbell 등, ACS Chem Biol 12, 2388-2398, 2017); Vaandrager 등, J Biol Chem 272, 11816-23, 1997); Pohler 등, FEBS Lett 374, 419-25, 1995). 이형접합 NPR2 녹아웃 세포에서, >0.163nM의 CNP 용량은 PRKG2 활성화 cGMP에 대한 EC50 범위를 초과하는 세포내 농도를 달성할 수 있다(도 1). 반면, 야생형 세포에서 0.040nM의 CNP 용량은 동일한 cGMP 농도를 달성할 수 있다. 이러한 결과는 CNP 보충이 NPR2의 기능 상실 돌연변이를 갖는 세포에서 PRKG2 활성화 및 성장에 필요한 cGMP 수준을 달성할 수 있음을 입증한다.

이러한 결과는 또한 CNP 변이체의 투여가 NPR2의 활성이 감소되어 저신장증을 가진 대상체의 골 성장을 회복시키는 데 유용하다는 것을 시사한다. CNP 변이체를 이용한 치료는 cGMP 신호전달이 손상될 수 있는 다른 성장판 유전자에 돌연변이를 갖는 대상체에서 이점이 있을 것으로 추가 고려된다.

실시예 4: 저신장증과 연관된 돌연변이의 확인

유전적으로-유발된 양방향 효과의 명확한 증거를 나타내는 유전자가 광범위한 환자 모집단에서 효과적으로 조정될 수 있는 치료 표적을 나타낼 가능성이 더 크다는 가설이 존재한다. 성장의 핵심 조절자인 유전자를 확인하기 위해, 전장유전체연관분석(genome-wide association study; GWAS)의 유전자 목록을 비롯한, 5개의 유전자 목록의 교차점(intersection)을 분석하였다. 핵심 성장 조절자는 양방향 효과(즉, 저신장증 또는 골격 이형성 및 고신장증 또는 과성장)를 갖는 희귀 코딩 돌연변이를 포함할 가능성이 가장 크다.

쿼리된(queried) 데이터베이스는 하기를 포함한다: GWAS ~700,000명의 개체를 사용하여 신장에 대한 대규모 GWAS 메타-분석에 의해 보고된 3,290개의 독립적인 유전적 변이체 각각에 대한 2,067개의 반복되지 않는 가장 가까운 유전자가 추출되었다; HGMD HGMD 버전 v2019_2의 "allmut" 테이블은 동일한 유전자에서 "저신장증" 및 "고신장증 또는 과성장"을 갖는 "DM"으로 표지된 모든 병원성 변이체를 찾기 위해 쿼리되었다; OMIM 성장 장애와 관련된 OMIM 유전자 목록은 이전에 기재되었으며 하기 키워드를 사용하여 생성되었다: 저신장증, 과성장, 골격 이형성증, 단지증(brachydactyly).

첫째, 저신장증 또는 고신장증과 연관된 유전자에 대해 인간 유전자 돌연변이 데이터베이스(Human Gene Mutation Database)(HGMD 버전 v2019_2)가 쿼리되었다(Stenson 등, Hum Genet 136:665-677, 2017). "저신장증"을 유발하는 것으로 문헌에 보고된 적어도 하나의 병원성 변이체로 주석처리된(annotated) 47개의 유전자가 존재하였다. 20개의 유전자만이 고신장증 또는 과성장 유전자로서 주석처리되었다. 둘째, 하기 키워드를 사용하여 생성된 258개의 OMIM 유전자의 수동으로 선별된 목록을 사용하였다(저신장(short) 248개, 고신장(tall) 20개): 저신장증, 과성장, 골격 이형성증, 단지증(Wood 등, Nat Genet 46:1173-86, 2014). 셋째, 이러한 목록의 교차점을 GWAS의 유전자 목록과 비교하였다. 이러한 목록의 교차점에는 신장과 연관된 것으로 공지된 3개의 유전자(IGF1R, NPPC, NPR2)가 존재하였고 2개의 추가적인 유전자(FGFR3, SHOX)가 확인되었다.

추가적인 분석은 유의적으로 감소된 신장(β=-0.20, 95%CI [-0.26 내지 -0.14], p=4.04x10-11) 및 특발성 저신장증(ISS)에 대한 유의적으로 증가된 위험(OR=2.75, 95%CI [1.92 - 3.96]을 나타낸 5개의 핵심 유전자의 신규한 그룹의 생성으로 이어졌다. 각각의 핵심 5개 유전자(FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX)는 개별적으로 고려하였을 때 신장과 연관되었으며, 다른 돌연변이와 조합되어 취해질 때 저신장증과도 연관되었다. FGFR3, IGF1R, NPPC, NPR2 및 SHOX에서의 예시적인 돌연변이는 도 6에 제시되어 있다.

NPR2 및 IGF1R에서 조합된 LoF(기능 상실) 및 미스센스 변이체는 또한 ISS에 대한 증가된 위험과 연관되었다(각각, OR=3.31, P=0.001, OR=2.85, P=0.002). SHOX, IGF1R, NPPC, NPR2에서 단백질 기능의 상실을 유발하는 전체 유전자 결실 및/또는 돌연변이가 다양한 중증도의 가족성 저신장증에서 보고되었다.

분석은 5개의 핵심 유전자 중 임의의 것의 변이체의 보인자에서 ISS에 대한 위험이 대략 3배 증가하며 이는 총 ISS 모집단의 6.7%를 차지한다는 것을 나타낸다. 또한, 외인성 CNP를 첨가한 후 NPR2 반가불충분성의 세포 모델에서 NPR2 신호 전달의 용량-의존적 구제가 입증되었다.

옴니제닉(omnigenic) 모델(Liu, 등, Cell 177:1022-1034 e6 (2019); Boyle 등, Cell 169:1177-1186 (2017))에 따르면, 이들 유전자가 핵심 인간 성장 유전자인 경우, 그것의 효과는 조절 네트워크를 구동하는 다수의 약한 공통 유전적 변이체에 의해 조정되어야 한다. 상기 가설을 간접적으로 테스트하기 위해, UK Biobank project로부터 임의의 샘플을 포함하지 않는 신장에 대한 가장 큰 공개된 GWAS 메타-분석을 사용하여 신장에 대한 다유전자 위험 점수(PRS)를 계산하였다. 코호트(cohort)를 5개의 동일한 크기(n=6,824)의 PRS 5분위수로 나누었다(PRS 1은 가장 작은 신장, PRS 5는 가장 큰 신장임). 증가하는 PRS 점수와 평균 신장 사이에는 용량-의존적 관계가 존재하였다(각 PRS 5분위수 증가 당 β=0.30)(도 7a). 5개의 핵심 유전자 중 LoF 변이체의 보인자는 5개의 상이한 PRS 백그라운드에 대해 비보인자보다 일관되게 더 작았다. 도 7을 참조한다. 데이터는 PRS와 희귀 단백질 변이체의 조합 효과가 추가적인 모델과 일치함을 시사한다: 다유전자 효과는 보인자와 비보인자 모두에서 신장을 조정하였다.

PRS 그룹에 대하여 ISS에 대한 위험은 PRS=3을 참조로 사용하여 계산되었다. 가장 낮은 PRS 그룹은 ISS에 대한 위험 증가와 연관되었고 가장 높은 PRS 그룹은 위험 감소와 연관되었다(각각 PRS 1 및 PRS 5의 경우 OR=5.43, P=8.58x10-34; OR=0.22, P=4.49x10-7). 5개의 핵심 유전자의 희귀 코딩 변이체의 효과를 PRS 그룹으로 계층화된 ISS에 대해 평가하였다. 5개의 핵심 유전자 중 임의의 것의 보인자는 처음 3개의 5분위수에서 ISS에 대한 위험이 증가하였다(OR=2.64, P=3.09x10-5; OR=2.17, P=0.04; OR=5.29, P=1.58x10-5; OR=2.72, P=0.09 도 7c 내지 도 7f). PRS로 계층화된 ISS 위험에 대한 각 개별적인 핵심 유전자의 보인자에 대해 일관된 방향의 효과가 관찰되었다(도 7c 내지 도 7f).

또한, PRS의 추가적인 효과는 대부분 개별적인 작은 효과를 갖는 다수의 공통 유전적 변이에서 기인하며, 데이터세트에서 20.1%의 신장 변동이 예측되었다. PRS의 이러한 추가적인 효과는 핵심 유전자의 희귀 코딩 변이의 비보인자뿐만 아니라 보인자에 대해서도 유사한 크기를 갖는 것으로 보였다. 상기 관찰은 PRS가 희귀 병원성 변이체(특히 본원에 기재된 것과 같은 반가불충분성 모델에서)의 침투도 차이에 강력한 기여자가 될 수 있음을 나타낸다. 상기 아이디어를 뒷받침하며, NPR2 활성이 낮은 8명의 NPR2 변이체 보인자 중 2명이 저-정상(low-normal) 신장을 갖는 것으로 관찰되었다. 상기 데이터는 NPR2에 돌연변이를 보유하는 대부분의 ISS 개체가 또한 NPR2 활성을 잃는 병원성 효과에 그들을 보다 취약하게 만드는 다유전적 백그라운드를 가질 수 있음을 시사한다.

이러한 결과는 CNP-기반 치료가 NPR2 반가불충분성 환자 모집단에서 효과적일 수 있다는 생각을 뒷받침한다. 또한, 일반적인 모집단의 NPR2 보인자에서 cGMP 수준과 신장의 유의적인 양방향(LoF 및 GoF) 상관관계를 나타내는 결과는 CNP 유사체로 상기 수용체를 표적화하는 것이 모든 ISS 개체에게 효과적인 요법이 될 수 있음을 시사한다.

실시예 5: 시험관내 CNP 염의 방출 프로파일

소수성 CNP 염의 방출 분석 또한 수행하였다. 간단히 말해서, Pro-Gly-CNP37 Zn 파모에이트, 및 Pro-Gly-CNP37 Zn-올레이트를 신선하게 제조하여 제조 당일, 15 mL 배지에서, 250 RPM으로 임펠러가 회전하고, 온도 제어 설정점이 37.4℃인 용해 장치 Pion microDiss에 두었다. 4일 동안 24시간마다 용기 내용물을 VWR 폴리프로필렌 "Falcon" 튜브로 이동시켜, 4000 x g에서 30분 동안 회전침강시키고(spun down), RP-UPLC 샘플을 채취/동결침강시키고(frozen down), 고체를 신선한 배지(15 mL)에 재현탁시켰다. 상기 염을 RP-UPLC에서 실행하여(run on) 신호를 수득하였고, 농도는 검량선(calibration curve)과 비교하여 수득되었다. 방출된 염의 백분율은 방출된 질량을 염 제조에 사용된 초기 질량 Pro-Gly-CNP37과 비교하여 수득되었다.

도 8a 및 도 8b는 CNP 펩티드 염의 총량의 백분율로서, 7일 동안의 CNP 펩티드 염의 누적 방출 프로파일을 나타낸다.

상기 프로토콜을 사용하여 추가적인 방출 프로파일을 실행하였다. ~16.6 mg의 Pro-Gly-CNP37-아세테이트(염을 제조하기 위한 출발 물질) 또는 Pro-Gly-CNP37 Zn-파모에이트 염을 각 웰에 두었다. CNP 염을 제조하여 동결건조하고 밀봉하여 사용하기 전 4℃에서 보관하였다. CNP 아세테이트 대조군의 경우, 1x PBS의 용기 1, 1x PBS+0.05% PS80의 용기 5이다. 7일 동안 24시간마다 용기 내용물을 VWR 폴리프로필렌 "Falcon" 튜브로 이동시켜, 4000 x g에서 30분 동안 회전침강시키고, UPLC 샘플을 채취/동결침강시키고, 고체를 신선한 배지(15 mL)에 재현탁시켰다. CNP 염을 RP-UPLC에서 실행하여 신호를 수득하였고 농도는 검량선과 비교하여 수득되었다. 7일 동안의 누적 방출 프로파일은 도 9a 및 도 9b에 나타나 있다.

Pro-Gly-CNP-37-도큐세이트 및 Pro-Gly-CNP-37-Zn-도큐세이트 염을 신선하게 제조하거나, 제조 및 동결건조하여, 용해용 Pion에서 사용하기 전에 유리 바이알에 밀봉하였다. 4일 동안 24시간마다 용기 내용물을 VWR 폴리프로필렌 "Falcon" 튜브로 이동시켜, 4000 x g에서 30분 동안 회전침강시키고, 샘플을 채취/동결침강시키고, 고체를 신선한 배지(15 mL)에 재현탁시켰다. 염을 LC-MS에서 실행하여 정량화하고, 방출된 염 %는 용해 용기에 두었던 초기 염과 비교되었다.

도 10a 내지 도 10c는 4일(도 10a) 또는 7일(도 10b 및 도 10c)에 대하여 도큐세이트 염의 누적 방출 프로파일을 나타낸다.

실시예 6: 체내 CNP 염의 방출 프로파일

샘플 염, CNP-파모에이트의 방출 프로파일을 CNP 염의 피하 주사 후 7일 동안 랫트의 체내 방출 프로파일에 대해 분석하였다.

도 11은 7일 동안 염으로부터 혈장으로의 Pro-Gly-CNP37의 방출 프로파일을 나타낸다. 염의 방출은 시간 경과에 따른 약간의 염 방출과 함께 24시간 동안 초기 돌발 방출(burst)로서 관찰되었다.

본원의 임의의 단일 구현예는 본원의 임의의 하나 이상의 다른 구현예로부터의 하나 이상의 요소로 보충될 수 있다.

따라서, 본 발명은 개시된 특정 구현예들로 제한되는 것이 아닌, 첨부된 청구범위; 상기 설명; 번호가 매겨진 하기 단락들에 의해 정의되고/되거나 첨부 도면에 나타낸 본 발명의 사상 및 범위 내에 존재하는 모든 변형을 포함하도록 의도된 것으로 이해된다.

구현예들의 예:

단락 1. 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 포함하는 조성물로서, 상기 염이 소수성 반대이온과 복합체화된 정전기적으로 하전된 펩티드를 포함하는 것인, 조성물.

단락 2. 단락 1에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 조성물.

단락 3. 단락 1에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 절단가능한 링커를 통해 상기 정전기적으로 하전된 펩티드에 복합체화되는 것인, 조성물.

단락 4. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 염이 상기 펩티드-반대이온 복합체에 복합체화된 양이온을 추가 포함하는 것인, 조성물.

단락 5. 단락 4에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드, 소수성 반대이온, 및 양이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 조성물.

단락 6. 단락 4 또는 단락 5에 있어서, 상기 양이온이 +2, +3 또는 +4의 전하를 갖는 것인, 조성물.

단락 7. 단락 4 내지 단락 6 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 금속 양이온인, 조성물.

단락 8. 단락 4 내지 단락 7 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 백금(Pt), 구리(Cu) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물. 대안적인 구현예에 있어서, 상기 양이온이 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단락 4 내지 단락 7 중 어느 한 단락의 조성물이 제공된다.

단락 9. 단락 1 내지 단락 8 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 0 내지 약 10의 cLogP, 또는 약 -2 내지 약 5의 pKa, 또는 둘 모두를 갖는 것인, 조성물.

단락 10. 단락 1 내지 단락 9 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 2 내지 약 9의 cLogP, 및 약 5 미만의 pKa를 갖는 것인, 조성물.

단락 11. 단락 1 내지 단락 10 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL) 포스파티드산, 소듐 데카노에이트, 소듐 2-나프탈렌설포네이트, 소듐 1-헵탄설포네이트 소듐 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 소듐 1-데칸설포네이트, 소듐 도데실 설페이트, 소듐 도데실 벤젠설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물. 대안적인 구현예에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL) 포스파티드산, 소듐 데카노에이트, 소듐 2-나프탈렌설포네이트, 소듐 1-헵탄설포네이트 소듐 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 소듐 1-데칸설포네이트, 소듐 도데실 설페이트, 소듐 도데실 벤젠설포네이트 및 이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단락 1 내지 단락 10 중 어느 한 단락의 조성물이 제공된다.

단락 12. 단락 1 내지 단락 11 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 펩티드 염이 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태인, 조성물.

단락 13. 단락 1 내지 단락 12 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드가 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)인, 조성물.

단락 14. 단락 13에 있어서, 상기 CNP가 CNP 변이체인, 조성물.

단락 15. 단락 13 또는 단락 14에 있어서, 상기 CNP가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물:

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4) 및

이들의 약제학적 염.

단락 16. 단락 15에 있어서, 상기 CNP가 CNP-아세테이트인, 조성물.

단락 17. 단락 13 내지 단락 16 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트인, 조성물.

단락 18. 단락 13 내지 단락 17 중 어느 한 단락에 있어서, 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온이 아연 또는 칼슘인, 조성물.

단락 19. 단락 1 내지 단락 18 중 어느 한 단락에 있어서, 부형제, 희석제 또는 담체를 추가 포함하는, 조성물.

단락 20. 단락 19에 있어서, 상기 부형제, 희석제 또는 담체가 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체인, 조성물.

단락 21. 단락 1 내지 단락 20 중 어느 한 단락의 조성물을 포함하는 멸균 약제학적 조성물.

단락 22. 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 포함하는 연장 방출형 조성물로서, 상기 염이 소수성 반대이온과 복합체화된 정전기적으로 하전된 펩티드를 포함하는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 23. 단락 22에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 24. 단락 23에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 절단가능한 링커를 통해 상기 정전기적으로 하전된 펩티드에 복합체화되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 25. 단락 22 내지 단락 24 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 염이 상기 펩티드-반대이온 복합체에 복합체화된 양이온을 추가 포함하는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 26. 단락 25에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드, 소수성 반대이온, 및 양이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 27. 단락 26에 있어서, 상기 양이온이 +2, +3 또는 +4의 전하를 갖는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 28. 단락 25 내지 단락 27 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 금속 양이온인, 연장 방출형 조성물.

단락 29. 단락 25 내지 단락 28 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트 (Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 백금(Pt), 구리(Cu) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 30. 단락 22 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 0 내지 약 10의 cLogP, 또는 약 -2 내지 약 5의 pKa, 또는 둘 모두를 갖는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 31. 단락 22 내지 단락 30 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 2 내지 약 9의 cLogP, 및 약 5 미만의 pKa를 갖는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 32. 단락 22 내지 단락 31 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL), 포스파티데이트, 데카노에이트, 2-나프탈렌설포네이트, 1-헵탄설포네이트, 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 1-도데칸설포네이트, 도데실 설페이트, 덱스트란 설페이트, 및 도데실 벤젠설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 33. 단락 22 내지 단락 32 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CNP 염이 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태인, 연장 방출형 조성물.

단락 34. 단락 22 내지 단락 33 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드가 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)인, 연장 방출형 조성물.

단락 35. 단락 34에 있어서, 상기 CNP가 CNP 변이체인, 연장 방출형 조성물.

단락 36. 단락 34 또는 단락 35에 있어서, 상기 CNP가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물:

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4); 및,

이들의 약제학적 염.

단락 37. 단락 36에 있어서, 상기 CNP가 CNP-아세테이트인, 연장 방출형 조성물.

단락 38. 단락 34 내지 단락 37 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트인, 연장 방출형 조성물.

단락 39. 단락 34 내지 단락 38 중 어느 한 단락에 있어서, 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온이 아연 또는 칼슘인, 연장 방출형 조성물.

단락 40. 단락 33 내지 단락 39 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 펩티드 염 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자가 수용액 또는 오일에 재현탁되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 41. 단락 40에 있어서, 상기 수용액이 물, 식염수, 또는 완충액인, 연장 방출형 조성물.

단락 42. 단락 40에 있어서, 상기 오일이 트리글리세리드 또는 지방산을 포함하는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 43. 단락 42에 있어서, 상기 지방산이 포화 또는 불포화된 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 44. 단락 42 또는 단락 43에 있어서, 상기 지방산이 C-6 내지 C-20 지방산인, 연장 방출형 조성물.

단락 45. 단락 42 내지 단락 44 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 지방산이 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 또는 도데칸산인, 연장 방출형 조성물.

단락 46. 단락 22 내지 단락 45 중 어느 한 단락에 있어서, (i) 펩티드의 20% 미만이 1일차까지 방출되고; 및

ii) pH 7 내지 7.6에서, 펩티드의 약 90%가 7일차까지 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 14일차까지 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 31일차까지 방출되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 47. 단락 22 내지 단락 46 중 어느 한 단락에 있어서, pH 7 내지 7.6에서 펩티드의 약 20% 미만이 1일차까지 방출되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 48. 단락 22 내지 단락 47 중 어느 한 단락에 있어서, pH 7 내지 7.6에서 펩티드의 약 90%가 7일차까지 방출되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 49. 단락 22 내지 단락 47 중 어느 한 단락에 있어서, pH 7 내지 7.6에서 펩티드의 약 90%가 30일차까지 방출되는 것인, 연장 방출형 조성물.

단락 50. 단락 22 내지 단락 49 중 어느 한 단락에 있어서, 부형제, 희석제 또는 담체를 추가 포함하는, 연장 방출형 조성물.

단락 51. 단락 50에 있어서, 상기 부형제, 부형제, 희석제 또는 담체가 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체인, 연장 방출형 조성물.

단락 52. 단락 22 내지 단락 51 중 어느 한 단락의 연장 방출형 조성물을 포함하는 멸균 약제학적 조성물.

단락 53. 정전기적으로 하전된 펩티드의 염을 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,

a) 수용액 중의 정전기적으로 하전된 펩티드를 용액 중의 소수성 반대이온과 접촉시키는 단계;

b) 상기 펩티드 및 반대이온이 복합체를 형성하기에 충분한 방식으로 상기 정전기적으로 하전된 펩티드 용액을 상기 소수성 반대이온 용액과 혼합하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 펩티드-반대이온 복합체의 형성이 상기 펩티드 염을 포함하는 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태의 형성을 초래하는 것인, 방법.

단락 54. 단락 53에 있어서, 선택적으로 단계 (b) 전에, 상기 용액 중의 정전기적으로 하전된 펩티드를 수용액 중의 양이온과 접촉시켜 펩티드-양이온 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.

단락 55. 단락 53 또는 단락 54에 있어서, 단계 (c) 상기 펩티드 염을 완충액 또는 물에서 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

단락 56. 단락 55에 있어서, 단계 (d) 원심분리에 의해 상기 펩티드 염을 수득하여 펩티드 염 펠릿을 형성하는 단계를 추가 포함하는, 방법.

단락 57. 단락 56에 있어서, 단계 (e) 상기 펩티드 염 펠릿으로부터 물을 제거하는 단계를 추가 포함하는, 방법.

단락 58. 단락 57에 있어서, 상기 펠릿을 수용액 또는 오일에 재현탁시키는 것을 추가 포함하는, 방법.

단락 59. 단락 53 내지 단락 58 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율이 1:1 내지 1:20인, 방법.

단락 60. 단락 54 내지 단락 59 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율이 1:1 내지 1:10인, 방법.

단락 61. 단락 53 내지 단락 60 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 방법.

단락 62. 단락 61에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 절단가능한 링커를 통해 상기 정전기적으로 하전된 펩티드에 복합체화되는 것인, 조성물.

단락 63. 단락 54 내지 단락 62 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 염이 상기 펩티드-반대이온 복합체에 복합체화된 양이온을 추가 포함하는 경우, 상기 양이온이 공유 또는 비공유 결합, 또는 이들의 혼합을 통해 복합체화되는 것인, 방법.

단락 64. 단락 63에 있어서, 상기 양이온이 비공유 결합을 통해 상기 펩티드-소수성 반대이온 복합체에 복합체화되는 것인, 방법.

단락 65. 단락 63 또는 단락 64에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드, 소수성 반대이온, 및 양이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 조성물.

단락 66. 단락 54 내지 단락 65 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 +2, +3 또는 +4의 전하를 갖는 것인, 방법.

단락 67. 단락 54 내지 단락 66 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 금속 양이온인, 방법.

단락 68. 단락 54 내지 단락 67 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법. 상기 양이온이 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 백금(Pt), 구리(Cu) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단락 54 내지 단락 67 중 어느 한 단락의 방법이 추가 고려된다.

단락 69. 단락 46 내지 단락 58 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 0 내지 약 10의 cLogP, 또는 약 -2 내지 약 5의 pKa, 또는 둘 모두를 갖는 것인, 방법.

단락 70. 단락 53 내지 단락 69 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 2 내지 약 9의 cLogP, 및 약 5 미만의 pKa를 갖는 것인, 방법.

단락 71. 단락 53 내지 단락 70 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL) 및 포스파티드산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.

단락 72. 단락 53 내지 단락 71 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 정전기적으로 하전된 펩티드가 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)인, 방법.

단락 73. 단락 72에 있어서, 상기 CNP가 CNP 변이체인, 방법.

단락 74. 단락 72 또는 단락 73에 있어서, 상기 CNP가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법:

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열식별번호:1)

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열식별번호:2);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4);

및, 이들의 염.

단락 75. 단락 74에 있어서, 상기 CNP가 CNP-아세테이트인, 방법.

단락 76. 단락 72 내지 단락 75 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트인, 방법.

단락 77. 단락 72 내지 단락 76 중 어느 한 단락에 있어서, 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온이 아연 또는 칼슘인, 방법.

단락 78. 단락 1 내지 단락 52 중 어느 한 단락의 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 소수성 염을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 골-관련 장애 또는 골격 이형성증의 치료 방법.

단락 79. 단락 78에 있어서, 상기 골-관련 장애 또는 골격 이형성증이 골관절염, 저인산염혈증 구루병, 연골무형성증, 연골형성저하증, 저신장증, 왜소증, 골연골이형성증, 치사성 이형성증, 골형성부전증, 연골무발생증, 점상연골형성부전증, 동형접합 연골무형성증, 점상연골형성부전증, 굴지이형성증, 선천성 치사성 저인산증, 주산기 치사 유형의 골형성부전증, 짧은 늑골 다지 증후군, 연골형성저하증, 지근 유형의 점상연골형성부전증, 얀센 유형의 골간단연골이형성증, 선천성 척추골단이형성증, 불완전골형성증, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 랑거 유형 전완부 이형성증, 니버겔트 유형 전완부 이형성증, 로비노 증후군, 라인하르트 증후군, 선단이골증, 말초 이골증, 니스트 이형성증, 섬유연골형성증, 로버츠 증후군, 전완하퇴말단이형성증, 소지증, 모르키오 증후군, 니스트 증후군, 영양위축성이형성증, 척추골단골간단이형성증, NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/레리 웨일), PTPN11 돌연변이(누난 증후군), 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R) 돌연변이, 및 특발성 저신장증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.

단락 80. 단락 1 내지 단락 52 중 어느 한 단락의 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 염을 포함하는 연장 방출형 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 골 연장 또는 장골 성장 증가 방법으로서, 상기 투여가 골을 연장시키거나 장골 성장을 증가시키는 것인, 방법.

단락 81. 단락 78 내지 단락 80 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CNP가 CNP 변이체인, 방법.

단락 82. 단락 78 내지 단락 81 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CNP가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법:

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4);

및, 이들의 염.

단락 83. 단락 83에 있어서, 상기 CNP가 CNP 아세테이트인, 방법.

단락 84. 단락 78 내지 단락 83 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 조성물이 피하, 피내, 관절내, 경구, 또는 근육내 투여되는 것인, 방법.

단락 85. 단락 78 내지 단락 84 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 조성물이 1일 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여되는 것인, 방법.

단락 86. 단락 78 내지 단락 85 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 조성물이 연장 방출형 조성물인, 방법.

단락 87. 소수성 반대이온과 복합체를 형성하는 CNP 펩티드를 포함하는 C형 나트륨이뇨 펩티드의 염.

단락 88. 단락 87에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 염.

단락 89. 단락 87 또는 단락 88에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 2 내지 약 9의 cLogP, 또는 약 5 미만의 pKa, 또는 둘 모두를 갖는 것인, 염.

단락 90. 단락 87 내지 단락 89 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 2 내지 약 9의 cLogP, 및 약 5 미만의 pKa를 갖는 것인, 염.

단락 91. 단락 87 내지 단락 90 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL) 및 포스파티드산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 염.

단락 92. 단락 87 내지 단락 91 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 펩티드 및 반대이온과 복합체화된 양이온을 추가 포함하는, 염.

단락 93. 단락 92에 있어서, 상기 양이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 염.

단락 94. 단락 92 또는 단락 93에 있어서, 상기 양이온이 +2, +3 또는 +4의 전하를 갖는 것인, 염.

단락 95. 단락 92 내지 단락 94 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 금속 양이온인, 염.

단락 96. 단락 92 내지 단락 95 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 양이온이 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 염. 상기 양이온이 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 백금(Pt), 구리(Cu) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단락 92 내지 단락 95 중 어느 한 단락의 염이 추가 고려된다.

단락 97. 단락 87 내지 단락 96 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CNP 염이 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태인, 염.

단락 98. 단락 87 내지 단락 97 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CNP가 CNP 변이체인, 염.

단락 99. 단락 87 내지 단락 98 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CNP가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 염:

PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열식별번호:1)

LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열식별번호:2);

QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);

PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4); 및,

이들의 약제학적 염.

단락 100. 단락 99에 있어서, 상기 CNP가 CNP-아세테이트인, 염.

단락 101. 단락 87 내지 단락 100 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트인, 염.

단락 102. 단락 87 내지 단락 101 중 어느 한 단락에 있어서, 양이온이 존재하는 경우, 상기 양이온이 아연 또는 칼슘인, 염.

단락 103. 단락 87 내지 단락 102 중 어느 한 단락에 있어서, 정제된 것인, 염.

단락 104. 골-관련 장애 또는 골격 이형성증을 치료하는 데 사용되거나, 골을 연장시키거나 또는 장골 성장을 증가시키기 위한 단락 1 내지 단락 52 또는 단락 87 내지 단락 103 중 어느 한 단락의 소수성 염을 포함하는 조성물.

단락 105. 골-관련 장애 또는 골격 이형성증을 치료하기 위한 약제의 제조, 또는 골을 연장시키거나 골 성장을 증가시키기 위한 단락 1 내지 단락 52 또는 단락 87 내지 단락 103 중 어느 한 단락의 소수성 염을 포함하는 조성물의 용도.

단락 106. 단락 104 또는 단락 105에 있어서, 상기 조성물이 연장 방출형 조성물인, 조성물 또는 용도.

SEQUENCE LISTING <110> Biomarin Pharmaceutical Inc. <120> Hydrophobic Peptide Salts for Extended Release Compositions <130> 30610/54627 <150> US 62/885,705 <151> 2019-08-12 <150> US 62/935,052 <151> 2019-11-13 <150> US 62/963,354 <151> 2020-01-20 <150> US 62/964,848 <151> 2020-01-23 <150> US 62/038,652 <151> 2020-06-12 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 2 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 2 Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 20 25 30 Met Ser Gly Leu Gly Cys 35 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 Gln 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ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120 gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180 cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240 ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300 tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360 actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420 cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480 aattggactg ctcgggctgc tttgctgtat ctggatgctc gcacagatga ccggccccac 540 tacttcacca tccgaggggg tgtttgaggc cctgcagggc agcaacctca gtgtgcaaca 600 ccaggtgtat acccgagagc caggtggccc tgagcaagcc acccacttca tcagagccaa 660 cgggcgca 668 <210> 61 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 61 atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60 ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120 gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180 cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240 ccggggtgtt tgaggccctg cagggcagca acctcagtgt gcaacaccag gtgtataccc 300 gagagccagg tggccctgag caagccaccc acttcatcag agccaacggg cgca 354 <210> 62 <211> 1047 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 62 Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro 20 25 30 Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala 35 40 45 Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu 50 55 60 Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Pro Leu Arg Ala Val Asp Leu Lys Leu Tyr His Asp Pro Asp Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Pro Gly Cys Val Tyr Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Ala 100 105 110 Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly 115 120 125 Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro 130 135 140 Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu 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745 750 Asp Arg Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Val Leu Leu Met Glu Arg Cys 755 760 765 Trp Ala Gln Asp Pro Thr Glu Arg Pro Asp Phe Gly Gln Ile Lys Gly 770 775 780 Phe Ile Arg Arg Phe Asn Lys Glu Gly Gly Thr Ser Ile Leu Asp Asn 785 790 795 800 Leu Leu Leu Arg Met Glu Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Glu Lys Leu Val 805 810 815 Glu Glu Arg Thr Gln Ala Tyr Leu Glu Glu Lys Arg Lys Ala Glu Ala 820 825 830 Leu Leu Tyr Gln Ile Leu Pro His Ser Val Ala Glu Gln Leu Lys Arg 835 840 845 Gly Glu Thr Val Gln Ala Glu Ala Phe Asp Ser Val Thr Ile Tyr Phe 850 855 860 Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Ala Leu Ser Ala Glu Ser Thr Pro Met 865 870 875 880 Gln Val Val Thr Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Thr Cys Phe Asp Ala Ile 885 890 895 Ile Asp Asn Phe Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr 900 905 910 Met Val Val Ser Gly Leu Pro Gly Arg Asn Gly Gln Arg His Ala Pro 915 920 925 Glu Ile Ala Arg Met Ala Leu Ala Leu Leu Asp Ala Val Ser Ser Phe 930 935 940 Arg Ile Arg His Arg Pro His Asp Gln Leu Arg Leu Arg Ile Gly Val 945 950 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Tyr Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Ala 100 105 110 Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly 115 120 125 Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro 130 135 140 Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu Phe Val Val Thr Leu His Gly His Phe 145 150 155 160 Thr Ile Gly Leu Leu Gly Leu Leu Cys Cys Ile Trp Met Leu Ala Gln 165 170 175 Met Thr Gly Pro Thr Thr Ser Pro Ser Arg Gly Cys Leu Arg Pro Cys 180 185 190 Arg Ala Ala Thr Ser Val Cys Asn Thr Arg Cys Ile Pro Glu Ser Gln 195 200 205 Val Ala Leu Ser Lys Pro Pro Thr Ser Ser Glu Pro Thr Gly Ala Leu 210 215 220 Cys Ile Ser Ala Ala Arg Trp Arg Cys Phe Met Arg Ser Cys Phe Arg 225 230 235 240 Pro Arg Gly Arg Thr 245 <210> 65 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Seuqence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 65 Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro 20 25 30 Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala 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Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu 50 55 60 Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Pro Gly Cys Leu Arg Pro Cys Arg Ala Ala Thr Ser Val Cys Asn Thr 85 90 95 Arg Cys Ile Pro Glu Ser Gln Val Ala Leu Ser Lys Pro Pro Thr Ser 100 105 110 Ser Glu Pro Thr Gly Ala Leu Cys Ile Ser Ala Ala Arg Trp Arg Cys 115 120 125 Phe Met Arg Ser Cys Phe Arg Pro Arg Gly Arg Thr 130 135 140 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 67 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 68 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 68 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20

Claims

C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 소수성 염을 포함하는 조성물로서, 상기 염이 소수성 반대이온과 복합체화된 CNP를 포함하는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 염이 상기 펩티드-반대이온 복합체에 복합체화된 다가 양이온을 추가 포함하는 것인, 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 CNP, 소수성 반대이온, 및 양이온이 비공유 결합을 통해 복합체화되는 것인, 조성물.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 양이온이 +2, +3 또는 +4의 전하를 갖는 것인, 조성물.
제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온이 금속 양이온인, 조성물.
제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온이 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba), 아연(Zn), 카드뮴(Cd), 붕소(B), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 철(Fe), 망간(Mn), 코발트(Co), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 백금(Pt), 구리(Cu) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 포함하는 것인, 조성물.
제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온이 아연 또는 칼슘을 포함하는 것인, 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 0 내지 약 10의 cLogP를 갖거나, 그것의 짝산이 약 -2 내지 약 5의 pKa를 갖거나, 둘 모두인, 조성물.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 약 2 내지 약 9의 cLogP를 갖고, 그것의 짝산이 약 5 미만의 pKa를 갖는 것인, 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 탈양성자화된 지방산, 탈양성자화된 담즙산, 이온성 계면활성제, 나프토에이트 및 이의 유도체, 니코티네이트 및 이의 유도체, 알킬 설포네이트, 디알킬 설포숙시네이트, 인지질, 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬벤젠 설포네이트, 알킬 설페이트, 아릴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 알킬벤젠 설페이트, 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 팔미테이트, 디옥시콜레이트, 올레이트, 파모에이트, 니코티네이트, 도데실 설페이트, 도큐세이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PL), 포스파티데이트, 데카노에이트, 2-나프탈렌설포네이트, 1-헵탄설포네이트, 1-옥탄설포네이트 모노하이드레이트, 1-데칸설포네이트, 도데실 설페이트, 덱스트란 설페이트, 및 도데실 벤젠설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 염이 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태인, 조성물.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP가 CNP 변이체인, 조성물.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물:
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열식별번호:1)
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열식별번호:2);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4), 및 이들의 염.
제 14항에 있어서, 상기 CNP가 CNP-아세테이트인, 조성물.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트인, 조성물.
제 2항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온이 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺인, 조성물.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 부형제, 희석제 또는 담체를 추가 포함하는, 조성물.
제 18항에 있어서, 상기 부형제, 희석제 또는 담체가 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체인, 조성물.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 멸균 약제학적 조성물.
C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 염을 포함하는 연장 방출형 조성물로서, 상기 염이 소수성 반대이온과 복합체화된 정전기적으로 하전된 펩티드를 포함하는 것인, 연장 방출형 조성물.
제 21항에 있어서, 상기 염이 상기 펩티드-반대이온 복합체에 복합체화된 양이온을 추가 포함하는 것인, 연장 방출형 조성물.
제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 펩티드 염 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자가 수용액 또는 오일에 재현탁되는 것인, 연장 방출형 조성물.
제 23항에 있어서, 상기 오일이 트리글리세리드 또는 지방산을 포함하고, 선택적으로 상기 지방산이 포화 또는 불포화된 것인, 연장 방출형 조성물.
제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 지방산이 C-6 내지 C-20 지방산인, 연장 방출형 조성물.
제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방산이 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 또는 도데칸산인, 연장 방출형 조성물.
제 23항에 있어서, 상기 수용액이 물, 식염수, 또는 완충액인, 연장 방출형 조성물.
제 21항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서,
pH 7에서 7.6에서,
(i) 펩티드의 20% 미만이 1일차까지 방출되고; 및
(ii) 펩티드의 약 90%가 7일차까지 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 14일차까지 방출되거나, 펩티드의 약 90%가 31일차까지 방출되는 것인, 연장 방출형 조성물.
제 21항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 추가 포함하는, 연장 방출형 조성물.
C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 소수성 염을 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
a) 수용액 중의 CNP를 용액 중의 소수성 반대이온과 접촉시키는 단계;
b) 상기 펩티드 및 반대이온이 복합체를 형성하기에 충분한 방식으로 상기 CNP 용액을 상기 소수성 반대이온 용액과 혼합하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 펩티드-반대이온 복합체의 형성이 상기 CNP 염을 포함하는 고체, 반고체, 겔, 결정질, 비정질, 나노입자, 마이크로입자, 비정질 나노입자, 비정질 마이크로입자, 결정질 나노입자 또는 결정질 마이크로입자 형태의 형성을 초래하는 것인, 방법.
제 30항에 있어서, 선택적으로 단계 (b) 전에, 상기 용액 중의 CNP를 수용액 중의 다가 양이온과 접촉시켜 펩티드-양이온 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
제 30항 또는 제 31항에 있어서, 단계 (c) 상기 소수성 CNP 염을 완충액 또는 물로 세척하는 단계를 추가 포함하는, 방법.
제 32항에 있어서, 단계 (d) 원심분리에 의해 상기 소수성 CNP 염을 수득하여 CNP 염 펠릿을 형성하는 단계를 추가 포함하는, 방법.
제 33항에 있어서, 단계 (e) 상기 CNP 염 펠릿으로부터 물을 제거하는 단계를 추가 포함하는, 방법.
제 34항에 있어서, 상기 펠릿을 수용액 또는 오일에 재현탁시키는 것을 추가 포함하는, 방법.
제 30항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드:소수성 반대이온 비율이 1:1 내지 1:20인, 방법.
제 31항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드:양이온 비율이 1:1 내지 1:10인, 방법.
제 1항 내지 제 29항 또는 제 44항 내지 제 52항 중 어느 한 항의 소수성 CNP 염을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 골-관련 장애 또는 골격 이형성증의 치료 방법.
제 38항에 있어서, 상기 골-관련 장애 또는 골격 이형성증이 골관절염, 저인산염혈증 구루병, 연골무형성증, 연골형성저하증, 저신장증, 왜소증, 골연골이형성증, 치사성 이형성증, 골형성부전증, 연골무발생증, 점상연골형성부전증, 동형접합 연골무형성증, 점상연골형성부전증, 굴지이형성증, 선천성 치사성 저인산증, 주산기 치사 유형의 골형성부전증, 짧은 늑골 다지 증후군, 연골형성저하증, 지근 유형의 점상연골형성부전증, 얀센 유형의 골간단연골이형성증, 선천성 척추골단이형성증, 불완전골형성증, 이영양성 이형성증, 선천성 짧은 대퇴골, 랑거 유형 전완부 이형성증, 니버겔트 유형 전완부 이형성증, 로비노 증후군, 라인하르트 증후군, 선단이골증, 말초 이골증, 니스트 이형성증, 섬유연골형성증, 로버츠 증후군, 전완하퇴말단이형성증, 소지증, 모르키오 증후군, 니스트 증후군, 영양위축성이형성증, 및 척추골단골간단이형성증, NPR2 돌연변이, SHOX 돌연변이(터너 증후군/레리 웨일), PTPN11 돌연변이(누난 증후군), 인슐린 성장 인자 1 수용체(IGF1R) 돌연변이, 및 특발성 저신장증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제 1항 내지 제 29항 또는 제 44항 내지 제 52항 중 어느 한 항의 소수성 CNP 염을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 골 연장 또는 장골 성장 증가 방법으로서, 상기 투여가 골을 연장시키거나 장골 성장을 증가시키는 것인, 방법.
제 38항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 피하, 피내, 관절내, 경구, 또는 근육내 투여되는 것인, 방법.
제 38항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 1일 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여되는 것인, 방법.
제 38항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 연장 방출형 조성물인, 방법.
소수성 반대이온과 복합체를 형성하는 CNP를 포함하는 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)의 소수성 염.
제 44항에 있어서, 상기 펩티드 및 반대이온과 복합체화된 양이온을 추가 포함하는, 소수성 염.
제 44항 또는 제 45항에 있어서, 상기 소수성 반대이온이 올레이트, 디옥시콜레이트, 데카노에이트, 파모에이트, 도큐세이트 또는 도데실 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 소수성 염.
제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온이 Zn² ⁺ 또는 Ca² ⁺인, 소수성 염.
제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염이 CNP-올레이트, CNP-파모에이트, CNP-디옥시콜레이트, CNP-데카노에이트 및 CNP-도큐세이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 소수성 염.
제 45항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염이 CNP-Ca⁺²(올레이트), CNP-Ca⁺²(파모에이트), CNP-Ca⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Ca⁺²(데카노에이트), CNP-Ca⁺²(도큐세이트), CNP-Zn⁺²(올레이트), CNP-Zn⁺²(파모에이트), CNP-Zn⁺²(디옥시콜레이트), CNP-Zn⁺²(데카노에이트), 및 CNP-Zn⁺²(도큐세이트)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 소수성 염.
제 44항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 소수성 염:
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37; 서열식별번호:1)
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(서열식별번호:2);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(서열식별번호:3);
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(서열식별번호:4), 및 이들의 염.
제 44항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CNP가 CNP-아세테이트인, 소수성 염.
제 44항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 것인, 소수성 염.
골-관련 장애 또는 골격 이형성증을 치료하는 데 사용되거나, 골을 연장시키거나 장골 성장을 증가시키기 위한 제 1항 내지 제 29항 또는 제 44항 내지 제 52항 중 어느 한 항의 소수성 CNP 염을 포함하는 조성물.
골-관련 장애 또는 골격 이형성증을 치료하기 위한 약제의 제조, 또는 골을 연장시키거나 또는 장골 성장을 증가시키기 위한 제 1항 내지 제 29항 또는 제 44항 내지 제 52항 중 어느 한 항의 소수성 CNP 염을 포함하는 조성물의 용도.