CN114423447A - 用于延释组合物的疏水性肽盐 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及亲水性肽的疏水性盐，其在水溶液中形成低溶解度物质，且当向个体施用时能够延续或持续释放肽组分。还公开了C型利钠肽的疏水性盐和其用途。

Description

用于延释组合物的疏水性肽盐
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月12日提交的美国临时专利申请第62/885,705号、2019年11月13日提交的美国临时专利申请第62/935,052号、2020年1月20日提交的美国临时专利申请第62/963,354号、2020年1月23日提交的美国临时专利申请第62/964,848号和2020年6月12日提交的美国临时专利申请第63/038,652号的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
以引用的方式并入以电子方式提交的材料
作为本发明的一部分的序列表与说明书同时提交为文本文件。含有序列表的文本文件的名称为“54627_Seqlisting.txt”，其创建于2020年8月6日且大小为54,454字节。序列表的主题以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及亲水性肽的疏水性盐，其在水溶液中形成低溶解度物质，且当向个体施用时能够延续或持续释放肽组分。
背景技术
持续递送治疗剂为期望的，例如以减少剂量数量，或减少个体为实现治疗益处可接受的药物量。然而，药物中某些类型的活性成分难以调配为持续释放组合物(例如包覆肠溶衣、剂量反应性胶囊或片剂，或微球，如脂质体或纳米粒子)，所述组合物可在体内某些部位递送治疗剂，或具有某些允许药物随时间推移从粒子缓慢逸出的缓慢释放特性。
发明内容
本发明涉及包括在溶液中具有低溶解度的带静电肽盐，以使得盐在水性介质中形成固体或半固体的组合物。此处显示此类盐在水溶液中的溶解速率比肽的非盐形式慢，且可用于延释治疗剂而无需以典型延释形式重新调配。
本文提供包括带静电肽的疏水性盐的组合物，所述盐包括与疏水性相对离子络合的带静电肽。在各种实施例中，所述盐为疏水性肽盐。
在各种实施例中，肽盐中按重量计的肽％为肽盐中的至少约10重量％肽。在各种实施例中，肽盐中按重量计的肽为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更大。在各种实施例中，肽盐中按重量计的活性肽％为至少约5重量％。在各种实施例中，肽盐中按重量计的活性肽％为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或更大。在各种实施例中，相比于盐中存在的总肽的活性肽％为至少约50％、60％、70％、80％或更大。在各种实施例中，疏水性肽盐具有缓慢溶解，且不以1mg/mL立即可溶于1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
在各种实施例中，疏水性相对离子经由非共价键与带静电肽络合。
在各种实施例中，疏水性肽盐进一步包括与肽-疏水性相对离子络合物络合的多价阳离子。在各种实施例中，带静电肽、疏水性相对离子和多价阳离子经由非共价键络合。在各种实施例中，与肽-疏水性相对离子络合物络合的多价阳离子为金属阳离子。
在各种实施例中，包含疏水性相对离子的肽盐具有约0至约10的cLogP，或疏水性相对离子的共轭酸具有-2至5的pKa，或两者。在各种实施例中，包含疏水性相对离子的肽盐具有约2至约9的cLogP，或疏水性相对离子的共轭酸具有小于约5的pKa，或两者。在各种实施例中，包含疏水性相对离子的肽盐具有约2至约9的cLogP，且疏水性相对离子的共轭酸具有小于约5的pKa。在各种实施例中，包含疏水性相对离子的肽盐具有约2至约9的cLogP，且疏水性相对离子的共轭酸具有约0至约5的pKa。
在各种实施例中，疏水性相对离子选自由以下组成的组：去质子化脂肪酸、去质子化胆酸、萘甲酸盐和其衍生物、烟酸盐和其衍生物、烷基磺酸盐、二烷基磺基丁二酸盐、磷脂、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基硫酸盐、硫酸葡聚糖、烷基苯硫酸盐、离子型表面活性剂和前述任一种的组合。在各种实施例中，疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸盐、癸酸盐、2-萘磺酸盐、1-庚磺酸盐、1-辛磺酸盐单水合物、1-癸磺酸盐、十二烷基硫酸盐、硫酸葡聚糖和十二烷基苯磺酸盐。在各种实施例中，疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。在各种实施例中，相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、双羟萘酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐和多库酯。
在各种实施例中，多价阳离子的电荷为+2、+3或+4，或更高。在各种实施例中，多价阳离子的电荷为+2、+3或+4。在某些实施例中，多价阳离子的电荷为+2。在某些实施例中，多价阳离子的电荷为+3。在某些实施例中，多价阳离子的电荷为+4。在各种实施例中，阳离子为金属阳离子。在各种实施例中，阳离子包括选自由以下组成的组的金属：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)、铂(Pt)、铜(Cu)和金(Au)。在各种实施例中，阳离子包括锌或钙。在各种实施例中，阳离子为Mg2+、Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，阳离子为Zn2+。在各种实施例中，阳离子为Ca2+。
在各种实施例中，肽盐呈固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式。在各种实施例中，肽盐呈固体形式。在各种实施例中，肽盐呈非晶形式。在各种实施例中，肽盐呈凝胶形式。在各种实施例中，肽盐悬浮于凝胶中或连接至凝胶。
在各种实施例中，带静电肽为C型利钠肽(CNP)。在各种实施例中，CNP为CNP变体。本文涵盖的CNP和CNP变体更充分描述于具体实施方式中。在各种实施例中，CNP与疏水性相对离子络合以形成疏水性CNP盐络合物。在各种实施例中，疏水性CNP盐进一步包含与CNP-疏水性相对离子络合物络合，形成CNP-阳离子-疏水性相对离子盐络合物的多价阳离子。在各种实施例中，多价阳离子为金属阳离子。
在各种实施例中，CNP选自由以下组成的组：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ IDNO:3)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)和其盐。在各种实施例中，适用于形成本文的疏水性CNP盐的CNP盐为CNP-乙酸盐。
在各种实施例中，CNP选自由以下组成的组：PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:5)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:1)；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:6)；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:6)；PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ IDNO:5)；和PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:7)。
在各种实施例中，CNP变异肽进一步包括乙酰基。在各种实施例中，乙酰基在肽的N端上。在各种实施例中，乙酰基在肽序列内的氨基酸侧链上。在各种实施例中，肽在C端进一步包括OH或NH2基团。
在各种实施例中CNP变体选自由以下组成的组：
Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(SEQ ID NO:8)；
Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(SEQ ID NO:9)；
Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(SEQ ID NO:10)；
Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(SEQ ID NO:11)；
Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(SEQ ID NO:12)；
Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(SEQ ID NO:13)；和
Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(SEQ ID NO:14)。
在各种实施例中，疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。在各种实施例中，如果存在多价阳离子，则多价阳离子包括锌或钙。在各种实施例中，如果存在多价阳离子，则多价阳离子包含镁、锌或钙。在各种实施例中，阳离子为Mg2+、Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，多价阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，多价阳离子为Zn2+。在各种实施例中，多价阳离子为Ca2+。
在各种实施例中，组合物进一步包括赋形剂、稀释剂或载剂。在各种实施例中，赋形剂、稀释剂或载剂为药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。还提供包括本文所述的疏水性盐组合物的无菌药物组合物。
本发明进一步涵盖包括本文所述的疏水性肽盐的缓释组合物。在各种实施例中，缓释组合物为延释组合物、持续释放组合物或延迟释放组合物。
在各种实施例中，延释组合物包括疏水性肽盐，其中肽盐固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子再悬浮于水溶液或油中。在各种实施例中，水溶液为水、盐水或缓冲液。
在各种实施例中，油包括三酸甘油酯或脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为饱和或不饱和的。在各种实施例中，脂肪酸为短链、中链或长链脂肪酸。在各种实施例中，当脂肪酸在三酸甘油酯中时，脂肪酸为饱和或不饱和的，且可为中链或长链脂肪酸。
在各种实施例中，脂肪酸为C-6至C-20脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸或十二酸。
在各种实施例中，对于延释组合物，在pH 7至7.6下，(i)第1天释放小于约20％的肽；和(ii)每周释放约90％的肽，或每两周释放约90％的肽，或每月释放约90％的肽。
在各种实施例中，在pH 7至7.6下，第1天释放小于约20％的肽。进一步预期(i)在pH 7.0至7.6下，第1天释放小于约30％、或约40％、或约50％、或约60％的肽；和(ii)在pH 7至7.6下，每周释放约90％的肽，或每两周释放约90％的肽，或每月释放约90％的肽。进一步预期(i)在pH 7.0至7.6下，第1天释放小于约30％、或约40％、或约50％、或约60％的肽；和(ii)在pH 7至7.6下，每周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每两周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每三周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每月释放约70％、约80％或约90％的肽。
在各种实施例中，(i)在pH 7.0至7.6下，第1天释放小于约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％或约75％的肽；和(ii)在pH 7至7.6下，每周释放约90％的肽，或每两周释放约90％的肽，或每月释放约90％的肽。进一步预期(i)在pH 7.0至7.6下，第1天释放小于约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％或约75％的肽；和(ii)在pH 7至7.6下，每周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每两周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每三周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每月释放约70％、约80％或约90％的肽；或者ii)在pH 7至7.6下，每周释放约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的肽；或每两周释放约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的肽；或每三周释放约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的肽；或每月释放约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的肽。
在各种实施例中，在pH 7至7.6下，每周释放约90％的肽。在各种实施例中，在pH 7至7.6下，每两周释放约90％的肽。在各种实施例中，在pH 7至7.6下，每月释放约90％的肽。进一步预期所述释放可在pH 7.0至7.6、pH 7.1至7.5、pH 7.2至7.4、pH 7.2至7.6或pH 7.0至7.4的pH下。
在各种实施例中，延释组合物包括赋形剂、稀释剂或载剂。在各种实施例中，赋形剂、稀释剂或载剂为药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。在各种实施例中，提供包括延释组合物的无菌药物组合物。
本文还提供制造如本文所述的疏水性肽盐组合物，如疏水性CNP盐的方法。离子表面活性剂被作为相对离子的良好候选物，因为极性头基永久带电，而与络合pH无关。调节发生络合的pH将在肽上产生不同量的电荷，且此允许控制肽:表面活性剂络合化学计量，且可能控制所得沉淀物的大小。金属阳离子可用作肽氨基酸的阴离子侧链的桥键，以与阴离子疏水性相对离子结合。阳离子和相对离子向肽中添加的次序和速率对于最小化金属阳离子与阴离子疏水性相对离子的沉淀重要。
在各种实施例中，本发明涵盖一种制备包括带静电肽盐的组合物的方法，其包括：a)使水溶液中的带静电肽与溶液中的疏水性相对离子接触；b)以足以使肽和相对离子形成络合物的方式混合带静电肽溶液与疏水性相对离子溶液，其中肽-相对离子络合物的形成引起包括疏水性肽盐的固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式的形成。在各种实施例中，肽盐为疏水性CNP盐。
在各种实施例中，方法任选地包括在步骤(b)之前，使溶液中的带静电肽与水溶液中的多价阳离子接触，从而形成肽-阳离子络合物。在各种实施例中，多价阳离子为金属阳离子。
在各种实施例中，混合通过将疏水性相对离子溶液逐滴添加至带静电肽溶液进行。在各种实施例中，通过在添加各滴疏水性相对离子溶液之后涡旋，或本领域中已知的其它混合方法来混合溶液。
在各种实施例中，方法进一步包括步骤(c)在缓冲液或水中洗涤肽盐。在各种实施例中，洗涤在水溶液，例如缓冲液或水中进行。
在各种实施例中，所述方法进一步包括步骤(d)通过离心形成肽盐离心块而获得肽盐。在各种实施例中，如果所述盐呈凝胶形式，则通过离心或通过倾析液相，接着冻干，或其它干燥方法获得所述盐。
在各种实施例中，所述方法进一步包括步骤(e)从肽盐离心块去除水。预期可使用本领域中已知的技术通过冻干或干燥从离心块去除水或另一水溶液。
在各种实施例中，所述方法进一步包括将离心块再悬浮于水溶液或油中。在各种实施例中，水溶液为水、盐水或缓冲液。在各种实施例中，油包括三酸甘油酯或脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为饱和或不饱和的。在各种实施例中，三酸甘油酯中的脂肪酸为饱和或不饱和的，或其组合。
脂肪酸可为油自身或在三酸甘油酯中。在各种实施例中，脂肪酸为短链、中链或长链脂肪酸。在各种实施例中，当脂肪酸在三酸甘油酯中时，脂肪酸为饱和或不饱和的，且可为中链或长链脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为C-6至C-20脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸或十二酸。
在各种实施例中，合成方法预期使用至少一摩尔当量疏水性相对离子:肽中带正电氨基酸的总数的肽:疏水性相对离子比。在各种实施例中，合成方法中所用的肽:疏水性相对离子比为1:1至1:20，或1:1至1:50。合成方法中所用的肽:相对离子比可为1:2至1:15、1:2至1:10、1:2至1:8、1:3至1:10或1:4至1:10。在各种实施例中，肽:相对离子比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。在各种实施例中，合成方法中所用的肽:疏水性相对离子比为至少二摩尔当量疏水性相对离子:肽中带正电氨基酸的总数。在各种实施例中，合成方法中所用的肽:疏水性相对离子比为至少三摩尔当量疏水性相对离子:肽中带正电氨基酸的总数。
在各种实施例中，合成方法预期使用至少一摩尔当量阳离子:肽中带负电氨基酸的总数的肽:阳离子比。在各种实施例中，合成方法中所用的肽:阳离子比为1:1至1:10。合成方法中所用的肽:阳离子比可为1:2至1:10、1:3至1:10、1:1至1:5、1:2至1:5或1:2至1:8。在各种实施例中，合成方法中所用的肽:阳离子比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在各种实施例中，合成方法中所用的肽:阳离子比为至少二摩尔当量阳离子:肽中带负电氨基酸的总数。在各种实施例中，合成方法中所用的肽:阳离子比为至少三摩尔当量阳离子:肽中带负电氨基酸的总数。进一步预期上文所述的肽:阳离子和肽:疏水性相对离子比的组合。
示例性比率为肽上每个正电荷一个相对离子。对于多价阳离子，示例性比率为肽中每个负电荷位点大约1个金属阳离子，和每个负电荷位点2个多价阳离子，或2×摩尔过量。例如，一或两个多价阳离子，如Zn2+或Ca2+可与6-8个或更多个(如果涉及疏水相互作用)相对离子组合使用。
在各种实施例中，疏水性相对离子经由非共价键络合。
在各种实施例中，如果盐络合物进一步包括与肽-相对离子络合物络合的多价阳离子，则阳离子经由键络合。在各种实施例中，带静电肽、疏水性相对离子和阳离子经由非共价键络合。
在各种实施例中，CNP选自由以下组成的组：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO:1)。
还提供一种治疗有需要的个体的骨相关病症或骨骼发育不良的方法，其包括向所述个体施用包括C型利钠肽(CNP)的疏水性盐的组合物，包含如本文所述的组合物和延释组合物。
在各种实施例中，骨相关病症或骨骼发育不良选自由以下组成的组：骨关节炎、低磷酸盐血性佝偻病、软骨发育不全、软骨生成减退、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性发育不良、成骨不全、软骨成长不全、点状软骨发育异常、纯合性软骨发育不全、点状软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酶症、围产期致死型成骨不全、短肋多指综合征、软骨生成减退、肢根型点状软骨发育异常、扬森型干骺端发育不良(Jansen-typemetaphyseal dysplasia)、先天性脊椎骨骺发育不良、骨发育不全、畸型发育不良、先天性短股骨、兰格型肢中骨发育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼维格型肢中骨发育不良(Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、罗氏综合征(Robinow syndrome)、莱因哈特综合征(Reinhardt syndrome)、肢端发育不全、周围骨发育障碍、克尼斯特发育不良(Kniest dysplasia)、纤维软骨增生症、罗伯茨综合征(Roberts syndrome)、肢端肢中发育不全、小肢、莫奎氏综合征(Morquio syndrome)、克尼斯特综合征、后生营养性发育不良和脊椎骨骺干骺端发育不良、NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征(Turner's syndrome)/莱里维尔(Leri Weill))、PTPN11突变(努南氏综合征(Noonan's syndrome))和特发性身材矮小。
在各种实施例中，CNP变体适用作用于治疗特发性身材矮小和其它骨骼发育不良的生长激素的辅助或替代。
在各种实施例中，骨相关病症、骨骼发育不良或身材矮小病症由NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱里维尔)或PTPN11突变(努南氏综合征)引起。
在各种实施例中，骨相关病症、骨骼发育不良或身材矮小病症由NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱里维尔)或PTPN11突变(努南氏综合征)或胰岛素生长因子1受体(IGF1R)引起。
在各种实施例中，CNP变体适用于治疗生长板病症和身材矮小，包含家族性身材矮小、显性家族性身材矮小(其也称为显性遗传性身材矮小)或特发性身材矮小。在各种实施例中，身材矮小或生长板病症为胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度刺猬因子(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3的突变的结果。
在各种实施例中，生长板病症或身材矮小与相关于拉索病的基因中的一种或多种突变相关。
在各种实施例中，骨相关病症、骨骼发育不良或身材矮小病症由拉索病引起。在各种实施例中，拉索病为努南综合征、科斯特洛综合征(Costello syndrome)、心脸皮肤综合征、1型神经纤维瘤或LEOPARD综合征。
在一个实施例中，拉索病为遗传性1型齿龈纤维瘤病。
在各种实施例中，CNP变体适用于治疗生长板病症和身材矮小，包含家族性身材矮小、显性家族性身材矮小(其也称为显性遗传性身材矮小)或特发性身材矮小。在各种实施例中，身材矮小或生长板病症为胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度刺猬因子(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰岛素生长因子1受体(IGF1R)的突变的结果。
在各种实施例中，身材矮小与相关于拉索病的基因中的一种或多种突变相关。
在各种实施例中，CNP变体适用于治疗患有如下的身材矮小的个体：身高SDS为小于-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0，且至少一个亲代的身高SDS为小于-1.0、-1.5、-2.0或-2.5，任选地其中第二亲代的身高在正常范围内。在各种实施例中，CNP变体适用于治疗患有身高SDS为-2.0至-3.0的身材矮小的个体。在各种实施例中，CNP变体适用于治疗患有身高SDS为-2.0至-2.5的身材矮小的个体。在各种实施例中，身材矮小与相关于身材矮小的基因中的一种或多种突变相关，如胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度刺猬因子(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰岛素生长因子1受体(IGF1R)或其组合。在各种实施例中，身材矮小与相关于拉索病的基因中的一种或多种突变相关。
在各种实施例中，身材矮小为如通过多基因风险评分(PRS)所确定的多个基因中的突变的结果。在各种实施例中，个体具有NPR2的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有FGFR3的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有NPR2的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有IGF1R的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有NPPC的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有SHOX的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2和SHOX中的一个或多个的一种或多种突变和低PRS。在各种实施例中，PRS为1或2。在各种实施例中，PRS为1。在各种实施例中，PRS为2。
在各种实施例中，CNP变体为PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO:1)。在各种实施例中，肽进一步包括乙酰基。在各种实施例中，乙酰基在肽的N端上。在各种实施例中，乙酰基在肽序列内的氨基酸侧链上。在各种实施例中，肽在C端进一步包括OH或NH2基团。在各种实施例中，变体包括一个或多个如本文所述的连接基团。在各种实施例中，连接基团为可水解连接基团。在各种实施例中，变体为带静电CNP肽的疏水性盐，所述盐包含与疏水性相对离子络合的带静电CNP肽。
本发明还涵盖一种在有需要的个体中进行骨延长或增加长骨生长的方法，其包括向所述个体施用包括C型利钠肽(CNP)的盐的持续释放组合物，包含如本文所述的组合物和延释组合物，且其中所述施用使骨延长或增加长骨生长。
在各种实施例中，CNP为CNP变体。在各种实施例中，CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)；
和其药物盐。在各种实施例中，CNP为CNP-乙酸盐。
在各种实施例中，CNP选自由以下组成的组：PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:5)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:1)；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:6)；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:6)；PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ IDNO:5)；和PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:7)。
在各种实施例中，CNP变体进一步包括乙酰基。在各种实施例中，乙酰基在肽的N端上。在各种实施例中，乙酰基在肽的氨基酸的侧基上。在各种实施例中，肽在C端进一步包括OH或NH2基团。
在各种实施例中，变体选自由以下组成的组：
Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(SEQ ID NO:8)；
Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(SEQ ID NO:9)；
Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(SEQ ID NO:10)；
Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(SEQ ID NO:11)；
Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(SEQ ID NO:12)；
Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH2(SEQ ID NO:13)；和
Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH(SEQ ID NO:14)。
在各种实施例中，组合物经皮下、皮内、关节内、经口或肌肉内施用。
在各种实施例中，每日一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每4周一次、每6周一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次地施用组合物。
在各种实施例中，组合物为延释组合物。
还提供在与疏水性相对离子的络合物中包括CNP的C型利钠肽(CNP)的疏水性盐。在各种实施例中，疏水性CNP盐进一步包括与CNP和疏水性相对离子络合的阳离子。在各种实施例中，疏水性CNP盐为纯化盐。在各种实施例中，所述盐具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％纯度，或更大。
在各种实施例中，疏水性盐包括选自由以下组成的组的疏水性相对离子：油酸盐、脱氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。在各种实施例中，疏水性盐包括Zn2+或Ca2+的阳离子。
在各种实施例中，疏水性盐选自由以下组成的组：CNP-油酸盐、CNP-双羟萘酸盐、CNP-脱氧胆酸盐、CNP-癸酸盐和CNP-多库酯。在各种实施例中，疏水性盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(油酸盐)、CNP-Ca+2(双羟萘酸盐)、CNP-Ca+2(脱氧胆酸盐)、CNP-Ca+2(癸酸盐)、CNP-Ca+2(多库酯)、CNP-Zn+2(油酸盐)、CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)、CNP-Zn+2(脱氧胆酸盐)、CNP-Zn+2(癸酸盐)和CNP-Zn+2(多库酯)。
在各种实施例中，疏水性盐包括选自由以下组成的组的CNP：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)、LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)，和其盐。在各种实施例中，疏水性盐包括CNP，其为CNP-乙酸盐。
在各种实施例中，CNP变体为PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37)(SEQ ID NO:1)。在各种实施例中，肽进一步包括乙酰基。在各种实施例中，乙酰基在肽的N端上。在各种实施例中，乙酰基在肽的氨基酸的侧基上。在各种实施例中，肽在C端进一步包括OH或NH2基团。在各种实施例中，变体包括一个或多个如本文所述的连接基团。在各种实施例中，连接基团为可水解连接基团。在各种实施例中，肽包括带静电肽的疏水性盐，所述盐包括与疏水性相对离子络合的带静电肽。
本公开还提供包括如本文所述的疏水性肽盐，例如疏水性CNP盐的组合物，用于治疗如本文所述的骨骼发育不良或骨相关病症。在某些实施例中，本公开提供包括如本文所述的疏水性肽盐，例如疏水性CNP盐的组合物的用途，其用于制备供治疗如本文所述的骨骼发育不良或骨相关病症用的药剂。在各种实施例中，疏水性肽盐为如本文所述的疏水性CNP盐。
应理解，本文所述的每个特征或实施例或组合是本发明任何方面的非限制性说明性实例，并且因此，意指可与本文所述的任何其它特征或实施例或组合进行组合。例如，在用如“一个实施例”、“一些实施例”、“某些实施例”、“另外的实施例”、“特定示例性实施例”和/或“另一实施例”的类的语言描述特征的情况下，这些类型的实施例中的每一个是旨在与本文所述的任何其它特征或特征组合进行组合的特征的非限制性实例，但不必列出每个可能的组合。此类特征或特征组合适用于本发明的任何方面。在公开属于范围内的值的实例的情况下，这些实例中的任一个均涵盖为范围的可能端点，涵盖此类端点之间的任何和所有数值，并且涵盖较高和较低端点的任何和所有组合。
本文的标题是为了方便读者而不是限制性的。根据具体实施方式和/或附图和/或权利要求书，本发明的其它方面、实施例和变型将显而易知。
附图说明
图1A-图1D展示不同疏水性CNP盐于pH 6.5的水中的溶解曲线。
图2展示不同疏水性CNP盐于pH 6.5的水中的溶解曲线。对照为CNP-乙酸盐。
图3展示CNP变体(Pro-Gly-CNP37)对携有NPR2同型接合或异型接合突变的细胞的效应，如通过cGMP刺激所测量。
图4展示转染至RCS细胞中的NPR2突变克隆中第一外显子的核苷酸和预测的蛋白质序列。
图5展示关于对CNP的反应分析的示例性NPR2突变。
图6展示FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2和SHOX中与身材矮小相关的示例性突变。
图7A-图7F说明PRS和稀有编码变体对身高的组合效应。图7A.对身高的效应作为定量性状，将样品基于其PRS分为五组，水平线表示高度的25％、50％和75％百分位的小提琴图。样品通过误义、功能丧失或无携带状态而分组至五个核心基因中的任一个中。图7B.由对于“特发性身材矮小”或ISS的胜算比反映的效应。使用PRS＝3作为参考的ISS相对于其它PRS组的胜算。图7C.使用PRS＝1作为参考相对于核心基因中具有误义和/或功能丧失变体的ISS的胜算。图7D.使用PRS＝1非载体作为参考相对于核心基因中具有误义和/或功能丧失变体的ISS的胜算。图7E.使用PRS＝2非携带者作为参考相对于核心基因中具有误义和/或功能丧失变体的ISS的胜算。图7F.使用PRS＝3非携带者作为参考相对于核心基因中具有误义和/或功能丧失变体的ISS的胜算。
图8A展示CNP Zn-双羟萘酸盐的释放曲线。所示的数据为3个孔的平均值。图8B展示不同CNP肽盐的释放曲线。所示的数据为4个孔的平均值。
图9A-图9B说明呈累积释放曲线(图9A)或释放％(图9B)形式的CNP双羟萘酸盐的溶解曲线。所示的数据为1×PBS数据的3个孔的平均值，和1×PBS+0.05％PS80数据的2个孔的平均值。
图10A至图10C展示冻干和储存之后(图10A)，或新制且接着分析(图10B-图10C)的多库酯盐的溶解曲线。
图11展示CNP盐在体内经7天的释放曲线。
具体实施方式
本发明涉及亲水性肽盐，其为当置于水溶液中时能够延释肽活性成分的固体、半固体凝胶或其它盐形式。例如，本文中展示出乎意料地，亲水性C型利钠肽(CNP)与带电、疏水性相对离子络合在水性条件下产生低溶解度肽盐。本发明展示肽-疏水性相对离子盐络合物自身，包括包含肽-相对离子-阳离子络合物的盐可用于缓释或延释组合物，而不必将肽络合物囊封至脂质体或微球/纳米粒子中。此类组合物适用于延释应用，例如治疗如本文所述的骨骼发育不良和骨生长病症。
如本说明书和随附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确规定，否则不定冠词“一(a)”和“一(an)”以及定冠词“所述(the)”包含复数以及单数指示物。
术语“约”或“大致”意指如由本领域普通技术人员所测定的特定值的可接受误差，其部分取决于如何测量或测定所述值。在某些实施例中，术语“约”或“大致”意指在1、2、3或4个标准差内。在某些实施例中，术语“约”或“大致”意指在既定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。当术语“约”或“大致”冠于一系列两个或更多个数值中的第一数值之前时，应理解术语“约”或“大致”适用于所述系列中的每一个数值。
如本文所用的术语“带静电肽”是指肽，例如包括带电氨基酸的5至100个氨基酸的氨基酸串。肽可具有带正电氨基酸、带负电氨基酸或两者的混合物，使得带静电肽具有总体净电荷且能够与其它带电部分相互作用，例如具有与相对离子可结合的肽中的带电粒种相反的带电粒种的阳离子、阴离子或相对离子。带静电肽可具有净正电荷或净负电荷。当肽具有净正电荷时，其可与具有一个或多个负电荷的带电部分相互作用。当肽具有净负电荷时，其可与具有一个或多个正电荷的带电部分相互作用。
如本文所用的术语“疏水性相对离子”是指一组带静电部分，其在本质上为疏水性的且能够与亲水性肽相互作用。在各种实施例中，疏水性相对离子基于其cLogP值、其共轭酸的pKa值或两者选择。在各种实施例中，疏水性相对离子具有约0至约10的cLogP，或其共轭酸具有-2至5的pKa，或两者。在各种实施例中，疏水性相对离子具有净负电荷且可与具有净正电荷的带静电肽相互作用。在各种实施例中，疏水性相对离子包含去质子化脂肪酸、去质子化胆酸、萘甲酸盐和其衍生物、烟酸盐和其衍生物、烷基磺酸盐、二烷基磺基丁二酸盐、磷脂、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基硫酸盐、硫酸葡聚糖、离子表面活性剂和烷基苯硫酸盐。在一些实施例中，疏水性相对离子为两性离子(例如磷脂酰乙醇胺)。在各种实施例中，疏水性相对离子包含但不限于棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸盐、癸酸盐、2-萘磺酸盐、1-庚磺酸盐、1-辛磺酸盐单水合物、1-癸磺酸盐、十二烷基硫酸盐、硫酸葡聚糖和十二烷基苯磺酸盐。在一些实施例中，疏水性相对离子具有净正电荷且可与具有净负电荷的带静电肽相互作用。
如本文所用，术语“肽盐”或“疏水性肽盐”是指带静电肽与相对离子，例如疏水性相对离子之间的络合物，以使得所述部分在络合物中且形成盐。肽和相对离子可非共价络合。在各种实施例中，肽-相对离子盐进一步包括多价阳离子，使得络合物含有络合的肽-阳离子-相对离子。肽盐或疏水性肽盐是指肽-相对离子络合物和肽-阳离子-相对离子络合物两者。
在各种实施例中，肽和阳离子非共价络合。在各种实施例中，肽盐中的肽、阳离子和疏水性相对离子经由非共价键络合。
术语“C型利钠肽”或“CNP”是指在C末端具有17个氨基酸的环结构的小单链肽(GenBank登录号NP_077720，对于CNP前驱蛋白NPPC)和其变体。CNP最初产生自利钠肽前体C(NPPC)基因，形式为单链126个氨基酸的前原多肽，其经裂解以产生原-CNP，和活性53个氨基酸的肽(CNP-53)，其经分泌且通过未知酶再次裂解以产生成熟的22个氨基酸的肽(CNP-22)。“CNP盐”或“疏水性CNP盐”是指分别包括相对离子，如疏水性相对离子，且任选地进一步包括多价阳离子，且包括CNP或CNP变体的如本文所述的盐。
在各种实施例中，“CNP变体”与野生型NPPC在相同数量的氨基酸残基上为至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源。在各种实施例中，CNP变异肽可包含约1至约53，或1至38，或1至37，或1至35，或1至34，或1至33，或1至32，或1至31，或1至27，或1至22，或10至35，或约15至约37个NPPC多肽残基。在一个实施例中，CNP变体可包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53个源自NPPC多肽的氨基酸的序列。
本文提供包含本文所述的疏水性肽盐的缓释组合物。缓释组合物包括在投药后延迟递送药物(延迟释放剂量)或持续延长时段递送药物(延续释放剂量)的那些组合物。本文提供的肽盐的各种实施例包括缓释组合物，如延释、持续或控制释放，和延迟释放。术语“延释组合物”是指以便于制造在施用后的延长时段内可用的活性成分/药物的方式调配的组合物(美国药典(US Pharmacopeia))。延释剂量包括持续释放(SR)或控制释放(CR)形式。持续释放在持续时段内维持药物释放，但未必以恒定速率，而CR在持续时段内以几乎恒定速率维持药物释放(《制药学：药物递送和靶向(Pharmaceutics:Drug Delivery andTargeting)》,Yvonne Perrie,Thomas Rades,Pharmaceutical Press,2009)。延迟释放组合物或产物经修改以在初次施用之后的一定时段内延迟药物物质释放。
术语“有效量”是指足以对个体的健康状况、病变或疾病产生所期望的结果或足以用于诊断目的的剂量。所期望的结果可包含剂量的接受者的主观或客观改善。“治疗有效量”是指可有效产生所预期的对健康有益的效应的药剂量。在任何个别情况下的适当“有效”量可由一般技术人员使用常规实验来测定。应理解，针对任何具体患者的特定剂量水准和剂量频率可变化且将取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性；生物可用性、代谢稳定性、分泌速率以及所述混合物的作用时间长度；化合物的施用模式和施用时间；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别以及饮食；以及具体病状的严重程度。
“治疗”是指防治性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。在某些实施例中，“治疗”是指出于治疗、预防或诊断目的而向个体施用化合物或组合物。
“防治性”治疗为出于降低患病理学的风险的目的，向未展示疾病的病征或症状或仅展示疾病的早期病征的个体施用治疗。本发明的化合物或组合物可作为预防性治疗提供以减少患病变的可能性或以使病变(如果患有)的严重性最小化。
“治疗性”治疗为出于减轻或消除病理学病征或症状的目的，向展示那些病征或症状的个体施用治疗。病征或症状可为生物化学、细胞、组织学、功能或物理、主观或客观的。本发明化合物还可作为治疗性治疗给出或针对诊断给出。
“药物组合物”或“调配物”是指适于个体动物(包括人类和哺乳动物)中的医药用途的组合物。药物组合物包括治疗有效量的疏水性肽盐(例如CNP盐)、任选的另一生物活性剂和任选的药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。在一个实施例中，药物组合物涵盖包含活性成分和构成载剂的惰性成分的组合物，以及直接或间接由任何两种或更多种成分的组合、复合或聚集或由一种或多种成分的解离或由一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用而产生的任何产物。因此，本发明的医药组成物涵盖通过将本发明化合物与药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂掺和制得的任何组成物。
“药学上可接受的载剂”是指标准医药载剂、缓冲剂和其类似物中的任一者，如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖水溶液和乳液(例如油/水或水/油乳液)。赋形剂的非限制性实例包括佐剂、粘合剂、填充剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、助滑剂、甜味剂、调味剂和着色剂。合适的医药载剂、赋形剂和稀释剂描述于《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第19版(Mack Publishing Co.,Easton,1995)中。优选的医药载剂视施用活性剂的预期模式而定。施用的典型模式包括经肠(例如，经口)或非经肠(例如，皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射；或局部、经皮或经粘膜施用)。
“药学上可接受的盐”为可调配为用于医药用途的化合物的盐，包含但不限于金属盐(例如钠、钾、镁、钙等)和氨或有机胺的盐。
“药学上可接受”或“药理学上可接受”意指不为生物学上或其它方面不期望的物质，即可在不导致任何不期望的生物影响情况下或在不以有害方式与含有其的组合物的任何组分或与存在于个体身体的上或的中的任何组分相互作用的情况下向个体施用的物质。
“生理学条件”是指动物(例如人类)体内的条件。生理学条件包含但不限于体温以及具有生理学离子强度、pH和酶的水性环境。生理学条件还涵盖特定个体体内的条件，其不同于大多数个体中存在的“正常”条件，例如其不同于大致37℃的正常人体温度或不同于大致7.4的正常人血液pH。
如本文所用，术语“个体”涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包含但不限于哺乳动物类的任何成员：人类，非人类灵长类动物，如黑猩猩以及其它猿和猴物种；农畜，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，如兔子、狗和猫；实验室动物，包含啮齿动物，如大鼠、小鼠和天竺鼠，和其类似物。非哺乳动物的实例包含但不限于鸟类、鱼和其类似动物。所述术语不指示具体年龄或性别。在各种实施例中，个体为人类。在各种实施例中，个体为儿童或青少年。在各种实施例中，个体为婴儿。
带静电肽和肽盐
肽治疗剂为有吸引力的生物治疗剂，但通常由于在溶液中的低稳定性和短半衰期而为不利的(Tang等人,《欧洲医药科学杂志(Eur J Pharm Sci.)》102:63-70,2017)。改进肽治疗剂功效的尝试包含将亲水性肽囊封至可生物降解粒子，如脂质体或聚合物粒子中的尝试。然而，由于这些肽的阳离子性质和其与带负电聚合物的脂质体静电相互作用的能力，这一直是困难的(Griesser等人,《国际药剂学杂志(Int J Pharmaceutics)》520:267-274,2017)。在亲水性肽与疏水性部分之间产生疏水性离子对已成为一种用于使得能够将亲水性聚合物更好地囊封至微米粒子或脂质体中的手段(Lu等人,《分子药剂学(MOLECULARPHARMACEUTICS)》15:216-225,2018)。当肽中的带电残基与疏水性部分中的带相反电荷离子相互作用时，形成疏水性离子对(Tang等人,前述)。在某些情况下，其可使得疏水性离子对从溶液中沉淀出来，使其更易于囊封至脂质体或聚合纳米粒子中(Griesser等人,前述)。
本文中已发现亲水性CNP肽与疏水性相对离子之间的疏水性离子复合物产生CNP肽盐。亲水性肽与疏水性相对离子之间的疏水性离子对产生可如下地增强：通过首先使亲水性肽与多价阳离子(例如金属阳离子)接触以增强肽与疏水性相对离子之间的相互作用。举例来说，多价阳离子可与亲水性肽的带负电官能基络合，从而增加可用于与疏水性相对离子，如疏水性阴离子络合的亲水性肽上的正电荷的数量。因此，多价阳离子可将亲水性肽的负电荷和疏水性相对离子的负电荷桥接在一起。另外，本发明展示肽-疏水性相对离子盐络合物或肽-阳离子-疏水性相对离子盐络合物自身可用于缓释或延释组合物，而不必将肽络合物囊封至脂质体或微球/纳米粒子中。
带静电肽可为包括带电氨基酸且具有总净电荷的5至100个氨基酸的氨基酸串。肽可具有带正电氨基酸、带负电氨基酸或两者的混合物，使得带静电肽能够与其它带电部分，例如具有与肽中的带电粒种相反的带电粒种的阳离子、阴离子或相对离子或其组合相互作用。在各种实施例中，带静电肽具有净正电荷。具有净正电荷的带静电肽可与具有负电荷的疏水性相对离子，如具有净负电荷的疏水性相对离子络合。在各种实施例中，带静电肽具有净负电荷。具有净负电荷的带静电肽可与具有正电荷的疏水性相对离子，如具有净正电荷的疏水性相对离子络合。在各种实施例中，带静电肽具有至少两个具有相同电荷类型的氨基酸(例如两个带正电氨基酸或两个带负电氨基酸)。
亲水性肽是指在水溶液中具有高溶解度的肽。本文中涵盖的亲水性肽包括5至100个氨基酸的肽，其具有+3至+15，或+4至+15，或+3至+12，或+4至+12，或+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14或+15或这些数字之间的任何范围的净电荷。在各种实施例中，亲水性肽于水溶液中的溶解度大于10mg/mL，或溶解度大于5mg/mL。在各种实施例中，亲水性肽还指在水溶液中具有高溶解度，例如具有小于1的cLogP的肽。
疏水性相对离子
为了产生如本文所述的带静电肽盐，肽与相对离子络合。在亲水性肽的情况下，相对离子为疏水性相对离子。在各种实施例中，疏水性相对离子具有净负电荷且与具有净正电荷的亲水性肽形成盐。
预期相对离子经由非共价键结与带电肽络合。相对离子可经由静电相互作用与肽非共价结合。
当使用疏水性相对离子时，疏水性相对离子展现约0至约10的cLogP，或其共轭酸展现约-2至约5的pKa，或两者。在各种实施例中，疏水性相对离子具有约2至约9、约3至8、约4至7、或约5至9的cLogP。在各种实施例中，cLogP为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在各种实施例中，疏水性相对离子的共轭酸具有约-1至4、0至3、0至5、1至4或2至5的pKa。在各种实施例中，疏水性相对离子的共轭酸具有约-2、-1、0、1、2、3、4或5的pKa。进一步预期具有这些值中的任一者和值之间的范围的组合的疏水性相对离子。在各种实施例中，疏水性相对离子具有约2至约9的cLogP，或其共轭酸具有小于约5的pKa，或两者。在各种实施例中，疏水性相对离子具有约2至约9的cLogP，且其共轭酸具有小于约5的pKa。
在各种实施例中，相对离子为阴离子。在各种实施例中，相对离子为两性离子。在各种实施例中，相对离子为阴离子或两性离子洗涤剂。在各种实施例中，疏水性相对离子选自由以下组成的组：去质子化脂肪酸、去质子化胆酸、萘甲酸盐和其衍生物、烟酸盐和其衍生物、烷基磺酸盐、二烷基磺基丁二酸盐、磷脂、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基硫酸盐、硫酸葡聚糖、烷基苯硫酸盐和离子型表面活性剂。在各种实施例中，疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸、癸酸钠、2-萘磺酸钠、1-庚磺酸钠、1-辛磺酸钠单水合物、1-癸磺酸钠、十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠。在各种实施例中，疏水性相对离子为油酸盐、双羟萘酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐或多库酯。
在各种实施例中，至少一个疏水性相对离子与亲水性肽(当不存在多价阳离子时)或与包含亲水性肽和多价阳离子的络合物(当存在阳离子时)络合。在各种实施例中，至少两个疏水性相对离子与亲水性肽(当不存在阳离子时)或与包括亲水性肽和多价阳离子的络合物(当存在阳离子时)络合。在各种实施例中，至少三个疏水性相对离子与亲水性肽(当不存在阳离子时)或与包括亲水性肽和多价阳离子的络合物(当存在阳离子时)络合。在各种实施例中，至少四个疏水性相对离子与亲水性肽(当不存在阳离子时)或与包括亲水性肽和多价阳离子的络合物(当存在阳离子时)络合。在各种实施例中，亲水性肽的各正电荷与疏水性相对离子络合。举例来说，如果肽具有四个带正电氨基酸，则其可与四个疏水性相对离子络合。类似地，如果对于总共六个正电荷，肽具有四个带正电氨基酸且与两个阳离子络合，则肽可与六个疏水性相对离子络合。在各种实施例中，亲水性肽(当不存在阳离子时)或包括亲水性肽和多价阳离子的络合物(当存在阳离子时)的并非全部正电荷与疏水性相对离子络合。举例来说，如果肽具有四个带正电氨基酸，则其可与三个疏水性相对离子，或两个疏水性相对离子，或一个疏水性相对离子络合。类似地，如果对于总共六个正电荷，肽具有四个带正电氨基酸且与两个阳离子络合，则肽可与五个疏水性相对离子，或四个疏水性相对离子，或三个疏水性相对离子，或两个疏水性相对离子，或一个疏水性相对离子络合。
多价阳离子
在各种实施例中，肽盐进一步包括与肽-相对离子络合物络合的多价阳离子。预期阳离子经由非共价键结与带电肽络合。阳离子可经由静电相互作用与肽非共价结合。
预期多价阳离子具有+2、+3或+4或更高的电荷。在实施例中，阳离子具有+2的电荷。在实施例中，阳离子具有+3的电荷。在实施例中，阳离子具有+4的电荷。在各种实施例中，多价阳离子为金属阳离子。金属阳离子包含第II族和第III族金属的那些。合适的多价阳离子可包括选自由以下组成的组的金属：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)、铂(Pt)、铜(Cu)和金(Au)。在各种实施例中，多价阳离子包括镁、锌或钙。在各种实施例中，多价阳离子包括锌或钙。在各种实施例中，多价阳离子包括锌。在各种实施例中，多价阳离子包括钙。在各种实施例中，多价阳离子选自由Mg2+、Zn2+和Ca2+组成的组。在各种实施例中，多价阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，多价阳离子为Zn2+。在各种实施例中，多价阳离子为Ca2+。
在各种实施例中，至少一个多价阳离子与亲水性肽络合。在各种实施例中，至少两个阳离子与亲水性肽络合。在各种实施例中，至少三个阳离子与亲水性肽络合。在各种实施例中，亲水性肽的各负电荷与多价阳离子络合。举例来说，如果肽具有四个带负电氨基酸，则其可与四个多价阳离子，或三个多价阳离子，两个多价阳离子，或一个多价阳离子络合。
肽盐
在各种实施例中，肽盐呈固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式。在各种实施例中，肽盐呈固体、半固体或凝胶形式。在各种实施例中，肽盐呈固体或凝胶形式。在各种实施例中，肽盐呈固体形式。在各种实施例中，肽盐呈非晶形式。在各种实施例中，肽盐呈凝胶形式。在各种实施例中，肽盐悬浮于凝胶中或连接至凝胶。
预期肽盐呈粒子形式，且尤其呈固体粒子形式。在各种实施例中，粒子为1至10,000微米(μm)、1μm至2000μm、2μm至1000μm、5μm至500μm、10μm至1000μm、50μm至500μm、100μm至800μm、200μm至600μm、300μm至500μm、100μm至300μm、50μm至100μm或10μm至50μm。在各种实施例中，粒子为纳米粒子。在各种实施例中，纳米粒子为5纳米(nm)至1000nm、8nm至900nm、10nm至800nm、20nm至600nm、50nm至500nm、50nm至400nm、20nm至300nm、300nm至800nm、200nm至600nm、100nm至300nm或50nm至200nm。
在一些实施例中，肽盐的亲水性肽为如本文所述的CNP或CNP变体，且疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸、癸酸钠、2-萘磺酸钠、1-庚磺酸钠、1-辛磺酸钠单水合物、1-癸磺酸钠、十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠。在一些实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP或CNP变体，且疏水性相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、双羟萘酸盐、去氧胆酸盐和癸酸盐。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-油酸盐、CNP-双羟萘酸盐、CNP-去氧胆酸盐和CNP-癸酸盐，在一些实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP或CNP变体，且疏水性相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、双羟萘酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐和多库酯。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-油酸盐、CNP-双羟萘酸盐、CNP-去氧胆酸盐、CNP-癸酸盐和CNP-多库酯。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-油酸盐、CNP-双羟萘酸盐和CNP-多库酯。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-去氧胆酸盐、CNP-癸酸盐和CNP-多库酯。在各种实施例中，肽盐选自由CNP-油酸盐和CNP-双羟萘酸盐组成的组。在各种实施例中，肽盐为CNP-油酸盐。在各种实施例中，肽盐为CNP-双羟萘酸盐。在各种实施例中，肽盐为CNP-多库酯。
在各种实施例中，肽盐的亲水性肽为Pro-Gly CNP37(PG-CNP37)，且疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸、癸酸钠、2-萘磺酸钠、1-庚磺酸钠、1-辛磺酸钠单水合物、1-癸磺酸钠、十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠。在一些实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的PG-CNP37，且疏水性相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、双羟萘酸盐、去氧胆酸盐和癸酸盐。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-油酸盐、PG-CNP37-双羟萘酸盐、PG-CNP37-去氧胆酸盐和PG-CNP37-癸酸盐，在一些实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的PG-CNP37，且疏水性相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、双羟萘酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐和多库酯。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-油酸盐、PG-CNP37-双羟萘酸盐、PG-CNP37-去氧胆酸盐、PG-CNP37-癸酸盐和PG-CNP37-多库酯。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-油酸盐、PG-CNP37-双羟萘酸盐和PG-CNP37-多库酯。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-去氧胆酸盐、PG-CNP37-癸酸盐和PG-CNP37-多库酯。在各种实施例中，肽盐选自由PG-CNP37-油酸盐和PG-CNP37-双羟萘酸盐组成的组。在各种实施例中，肽盐为PG-CNP37-油酸盐。在各种实施例中，肽盐为PG-CNP37-双羟萘酸盐。在各种实施例中，肽盐为PG-CNP37-多库酯。
在各种实施例中，肽-相对离子盐进一步包含多价阳离子。在一些实施例中，肽盐的亲水性肽为如本文所述的CNP或CNP变体；疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸、癸酸钠、2-萘磺酸钠、1-庚磺酸钠、1-辛磺酸钠单水合物、1-癸磺酸钠、十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠；且多价阳离子包括选自由以下组成的组的金属：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)、铂(Pt)、铜(Cu)和金(Au)。在各种实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP，疏水性相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、双羟萘酸盐、去氧胆酸盐和癸酸盐；且多价阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(油酸盐)、CNP-Ca+2(双羟萘酸盐)、CNP-Ca+2(去氧胆酸盐)、CNP-Ca+2(癸酸盐)、CNP-Zn+2(油酸盐)、CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)、CNP-Zn+2(去氧胆酸盐)和CNP-Zn+2(癸酸盐)。在各种实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP，疏水性相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、双羟萘酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐和多库酯；且多价阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP，疏水性相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、双羟萘酸盐和多库酯；且多价阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP，疏水性相对离子选自由以下组成的组：去氧胆酸盐、癸酸盐和多库酯；且多价阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP，疏水性相对离子选自由油酸盐和双羟萘酸盐组成的组；且多价阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP，疏水性相对离子为油酸盐；且多价阳离子为Zn2+或Ca2+。在各种实施例中，亲水性肽盐为如本文所述的CNP，疏水性相对离子为双羟萘酸盐；且多价阳离子为Zn2+或Ca2 +。
在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(油酸盐)、CNP-Ca+2(双羟萘酸盐)、CNP-Ca+2(去氧胆酸盐)、CNP-Ca+2(癸酸盐)、CNP-Ca+2(多库酯)、CNP-Zn+2(油酸盐)、CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)、CNP-Zn+2(去氧胆酸盐)、CNP-Zn+2(癸酸盐)和CNP-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(油酸盐)、CNP-Ca+2(双羟萘酸盐)、CNP-Ca+2(多库酯)、CNP-Zn+2(油酸盐)、CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)和CNP-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(油酸盐)、CNP-Ca+2(双羟萘酸盐)和CNP-Ca+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(去氧胆酸盐)、CNP-Ca+2(癸酸盐)和CNP-Ca+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(油酸盐)和CNP-Ca+2(双羟萘酸盐)。在各种实施例中，肽盐为CNP-Ca+2(油酸盐)。在各种实施例中，肽盐为CNP-Ca+2(双羟萘酸盐)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Zn+2(油酸盐)、CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)、CNP-Zn+2(去氧胆酸盐)、CNP-Zn+2(癸酸盐)和CNP-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Zn+2(油酸盐)、CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)和CNP-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Zn+2(去氧胆酸盐)、CNP-Zn+2(癸酸盐)和CNP-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Zn+2(油酸盐)和CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)。在各种实施例中，肽盐为CNP-Zn+2(油酸盐)。在各种实施例中，肽盐为CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)。
在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-Ca+2(油酸盐)、PG-CNP37-Ca+2(双羟萘酸盐)、PG-CNP37-Ca+2(去氧胆酸盐)、PG-CNP37-Ca+2(癸酸盐)、PG-CNP37-Ca+2(多库酯)、PG-CNP37-Zn+2(油酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(双羟萘酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(去氧胆酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(癸酸盐)和PG-CNP37-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-Ca+2(油酸盐)、PG-CNP37-Ca+2(双羟萘酸盐)、PG-CNP37-Ca+2(多库酯)、PG-CNP37-Zn+2(油酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(双羟萘酸盐)和CNP-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-Ca+2(油酸盐)、PG-CNP37-Ca+2(双羟萘酸盐)和PG-CNP37-Ca+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(去氧胆酸盐)、PG-CNP37-Ca+2(癸酸盐)和PG-CNP37-Ca+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由PG-CNP37-Ca+2(油酸盐)和PG-CNP37-Ca+2(双羟萘酸盐)组成的组。在各种实施例中，肽盐为PG-CNP37-Ca+2(油酸盐)。在各种实施例中，肽盐为PG-CNP37-Ca+2(双羟萘酸盐)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-Zn+2(油酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(双羟萘酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(去氧胆酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(癸酸盐)和PG-CNP37-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-Zn+2(油酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(双羟萘酸盐)和PG-CNP37-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由以下组成的组：PG-CNP37-Zn+2(去氧胆酸盐)、PG-CNP37-Zn+2(癸酸盐)和PG-CNP37-Zn+2(多库酯)。在各种实施例中，肽盐选自由PG-CNP37-Zn+2(油酸盐)和PG-CNP37-Zn+2(双羟萘酸盐)组成的组。在各种实施例中，肽盐为PG-CNP37-Zn+2(油酸盐)。在各种实施例中，肽盐为PG-CNP37-Zn+2(双羟萘酸盐)。
制备方法
本文还涵盖制备包括如本文所述的疏水性肽盐的组合物的方法。
在各种实施例中，本发明提供一种制备包括带静电肽盐的组合物的方法，其包括：a)使水溶液中的带静电肽与溶液中的疏水性相对离子接触；b)以足以使肽和相对离子形成络合物的方式混合带静电肽溶液与疏水性相对离子溶液，其中肽-相对离子络合物的形成引起包括肽盐的固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式的形成。在各种实施例中，当肽-相对离子盐进一步包括多价阳离子时，方法包括在步骤(b)之前，使溶液中的带静电肽与水溶液中的多价阳离子接触，从而形成肽-阳离子络合物。肽-阳离子络合物接着与疏水性相对离子接触以形成肽-阳离子-相对离子络合物。
在各种实施例中，本发明提供一种制备包括带静电肽盐的组合物的方法，其包括：a)使溶液中的带静电肽与水溶液中的多价阳离子接触，从而形成肽-阳离子络合物；b)使水溶液中的肽-阳离子络合物与溶液中的疏水性相对离子接触；和c)以足以使肽-阳离子和相对离子形成络合物的方式混合肽-阳离子络合物溶液与疏水性相对离子溶液，其中肽-阳离子相对离子络合物的形成引起包括肽盐的固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式的形成。
在各种实施例中，混合通过将疏水性相对离子溶液逐滴添加至肽溶液进行。通过在添加各滴疏水性相对离子溶液之后涡旋，或本领域中已知的其它混合方法来混合溶液。
在各种实施例中，方法进一步包括步骤(c)或(d)在缓冲液或水中洗涤肽盐。在各种实施例中，洗涤在水溶液，例如缓冲液或水中进行。
在各种实施例中，所述方法进一步包括步骤(d)或(e)通过离心形成肽盐离心块而获得肽盐。在各种实施例中，如果所述盐呈凝胶形式，则通过离心或通过倾析液相，接着冻干，或其它干燥方法获得所述盐。
在各种实施例中，所述方法进一步包括步骤(e)或(f)自肽盐离心块去除水。预期可使用本领域中已知的技术通过冻干或干燥从离心块去除水或另一水溶液。
在各种实施例中，所述方法进一步包括将离心块再悬浮于水溶液或油中。在各种实施例中，水溶液为水、盐水或缓冲液。在各种实施例中，油包括三酸甘油酯或脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为饱和或不饱和的。在各种实施例中，三酸甘油酯中的脂肪酸为饱和或不饱和的，或其组合。
脂肪酸可为油自身或在三酸甘油酯中。在各种实施例中，脂肪酸为短链、中链或长链脂肪酸。在各种实施例中，三酸甘油酯中的脂肪酸为饱和或不饱和的，且可为中链或长链脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为C-6至C-20脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各种实施例中，脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸或十二酸。
在各种实施例中，方法涵盖使用至少一摩尔当量的疏水性相对离子，如疏水性阴离子，其相对于：1)如果存在阳离子，则带电荷氨基酸的总数，；或2)如果不存在阳离子，则正电荷的总数。因此，在各种实施例中，方法涵盖使用相对于亲水性肽中正电荷的总数(当不存在阳离子时)，或相对于包括亲水性肽和阳离子的络合物中正电荷的总数(当存在多价阳离子时)至少一当量的疏水性相对离子。此比在本文中称为肽:疏水性相对离子比。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)中带正电氨基酸的总数至少一摩尔当量的疏水性相对离子。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:1至1:20，或1:1至1:50。肽:相对离子比可为1:2至1:15、1:2至1:10、1:2至1:8、1:3至1:10或1:4至1:10。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:1。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:2。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:3。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:4。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:5。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:6。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:7。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:8。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:9。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为1:10。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)中带正电氨基酸的总数至少二摩尔当量的疏水性相对离子。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)中带正电氨基酸的总数至少三摩尔当量的疏水性相对离子。在各种实施例中，肽:疏水性相对离子比为相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)中带正电氨基酸的总数至少四摩尔当量的疏水性相对离子。在一些实施例中，肽:疏水性相对离子比为相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)中正电荷的总数小于一摩尔当量的疏水性相对离子。在各种实施例中，肽盐具有相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)中的正电荷少一摩尔当量的疏水性相对离子。在各种实施例中，肽盐具有相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)中的正电荷少二摩尔当量的疏水性相对离子。在各种实施例中，肽盐具有相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)中的正电荷少三摩尔当量的疏水性相对离子。在各种实施例中，方法涵盖引入例如相对于肽(当不存在阳离子时)或包括肽和阳离子的络合物(当存在阳离子时)上正电荷的总数0.9、0.8、0.7、0.75、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2或0.1摩尔当量的疏水性相对离子。
在各种实施例中，方法涵盖包含相对于肽中带负电氨基酸的总数至少一摩尔当量的阳离子。此比在本文中称为肽:阳离子比。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:1至1:10。肽:阳离子比可为1:2至1:10、1:3至1:10、1:1至1:5、1:2至1:5或1:2至1:8。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:1。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:2。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:3。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:4。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:5。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:6。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:7。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:8。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:9。在各种实施例中，肽:阳离子比为1:10。在各种实施例中，方法涵盖包含相对于肽中带负电氨基酸的总数小于一摩尔当量的阳离子。在各种实施例中，方法涵盖引入例如相对于肽上负电荷的总数0.9、0.8、0.7、0.75、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2或0.1摩尔当量的阳离子。
C型利钠肽
C型利钠肽(CNP)(《生物化学与生物物理研究交流(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》,168:863-870(1990)(Genbank登录号NP_077720，对于CNP前驱蛋白NPPC)(《高血压杂志(J.Hypertens.)》,10:907-912(1992))为具有17个氨基酸的环结构的肽家族(ANP、BNP、CNP)中的小单链肽(Levin等人,《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》,339:863-870(1998)))且在多种生物过程中具有重要角色。CNP与利钠肽受体-B(NPR-B、GC-B)相互作用以刺激产生环鸟苷单磷酸(cGMP)(《高血压杂志》10:1111-1114(1992))。CNP更广泛表现于包括中枢神经系统、生殖道、骨骼和血管内皮中(《高血压(Hypertension)》,49:419-426(2007))。
在人类中，CNP最初以单链126个氨基酸的前-原多肽形式产生自利钠肽前体C(NPPC)基因(《生物化学与生物物理研究交流》,168:863-870(1990))。去除信号肽产生原-CNP，且通过内切蛋白酶弗林蛋白酶进一步裂解产生活性53个氨基酸的肽(CNP-53)，其被分泌且通过未知酶再次裂解以产生成熟的22个氨基酸的肽(CNP-22)(Wu,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》278:25847-852(2003))。CNP-53和CNP-22的不同之处在于其分布，其中CNP-53在组织中占主导地位，而CNP-22主要发现于血浆和脑脊髓液中(J.Alfonzo,《受体信号转导研究(Recept.Signal.Transduct.Res.)》,26:269-297(2006))。CNP-53和CNP-22均与NPR-B类似地结合。
在各种实施例中，本发明的CNP包含介于人类CNP-17(hCNP-17)至人类CNP-53(hCNP-53)范围内，且具有源自hCNP-53的野生型氨基酸序列的截短CNP。此类截短CNP肽包含：
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ IDNO:56)；
LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ IDNO:15)；
RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ IDNO:16)；
VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO:17)；
DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO:18)；
TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO:19)；
KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO:20)；
SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO:21)；
RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO:22)；
AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO:23)；
AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO:24)；
WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO:25)；
ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO:26)；
RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO:27)；
LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO:28)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO:29)；
HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO:30)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)；
NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO:31)；
ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO:32)；
RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO:33)；
KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO:34)；
YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO:35)；
KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO:36)；
GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO:37)；
ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO:38)；
NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO:39)；
KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO:40)；
KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO:41)；
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO:68)；
LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO:42)；
SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO:43)；
KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO:44)；
GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO:45)；和
CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(SEQ ID NO:67)。
在各种实施例中，CNP变异肽为经修饰的CNP-37或CNP-38肽，任选地具有弗林蛋白酶裂解位点(加下划线)处的突变/取代和/或含有N端处的甘氨酸或脯氨酸-甘氨酸。示例性CNP-37变体包含但不限于：
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-37(M32N)；SEQ ID NO:46]；
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP-37；SEQ ID NO:47)；
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP-37；SEQ ID NO:48)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP-37(M32N)；SEQ ID NO:49]；
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:50)；和
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP-37:SEQ ID NO:51)
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:52)；
GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:53)；
GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:54)；和
GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:55)。
在各种实施例中，CNP选自由以下组成的组：PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:5)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:1)；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:6)；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:6)；PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ IDNO:5)；和PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO:7)。
在各种实施例中，CNP变异肽进一步包括乙酰基。在各种实施例中，乙酰基在肽的N端上。在各种实施例中，乙酰基在肽序列内的氨基酸侧链上。在各种实施例中，肽在C端进一步包括OH或NH2基团。
在其它实施例中，对于具有天冬酰胺(Asn/N)残基和/或谷氨酰胺(Gln/Q)残基的本文所述的CNP和CNP变体中的任一者，无论其是否具有野生型序列或非天然氨基酸序列，任何Asn残基和/或任何Gln残基可独立地经任何其它天然或非天然氨基酸取代，包含保守取代，如Asn至Gln。此类取代部分地经设计以最小化或避免天冬酰胺和/或谷氨酰胺的任何潜在去酰胺。
额外CNP肽和变体公开于以引用的方式并入本文中的美国专利8,198,242中。
在各种实施例中，带静电肽为C型利钠肽(CNP)或CNP变体且亲水性肽盐为CNP或CNP变体的盐。在各种实施例中，CNP为如本文所述的CNP变体。
在各种实施例中，CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)；
和其药物盐。在各种实施例中，CNP为CNP-乙酸盐。
在各种实施例中，当疏水性肽盐为疏水性CNP盐时，疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。在各种实施例中，如果存在多价阳离子，则阳离子包括锌、镁或钙。在各种实施例中，如果存在阳离子，则阳离子包括锌。在各种实施例中，阳离子包括钙。在各种实施例中，如果存在多价阳离子，则阳离子为Zn2+、Mg2 +或Ca2+。在各种实施例中，如果存在阳离子，则阳离子为Zn2+。在各种实施例中，如果存在阳离子，则阳离子为Ca2+。
在各种实施例中，本发明提供C型利钠肽的疏水性盐，其包括与疏水性相对离子络合的CNP肽。在各种实施例中，盐进一步包括多价阳离子，任选地金属阳离子。在各种实施例中，所述盐为纯化的CNP盐。
纯化疏水性盐的方法为本领域中已知的且涵盖于本文中。在各种实施例中，疏水性盐的纯度为至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大。
使用方法
软骨发育不全为成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)的基因中常染色体显性遗传突变的结果，此导致软骨形成异常。FGFR-3对软骨细胞生长通常具有负调节作用，且因此对骨骼生长具有负调节作用。在软骨发育不全中，FGFR-3的突变形式为组成性活性的，导致骨骼严重缩短。在人类中，FGFR-3的活化突变为遗传性侏儒症的主要起因。具有活化FGFR-3的小鼠用作软骨发育不全(骨骼发育不良的最常见形式)的模型，且CNP的过度表现拯救这些动物免遭侏儒症。因此，CNP和CNP的功能变体为治疗多种骨骼发育不良的潜在治疗剂。
通过刺激软骨细胞的基质产生、增殖和分化以及增加长骨生长，本发明的CNP盐适用于治疗罹患骨相关病症(如骨骼发育不良)的哺乳动物，包含人类。CNP反应性骨相关病症和骨骼发育不良的非限制性实例包含软骨发育不全、软骨生成减退、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性发育不良、先天性成骨、软骨成长不全、点状软骨发育异常、纯合性软骨发育不全、点状软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酶症、围产期致死型成骨不全、短肋骨多指综合征、软骨生成减退、肢根型点状软骨发育异常、扬森型干骺端发育不良、先天性脊椎骨骺发育不良、骨发育不全、畸型发育不良、先天性短股骨、兰格型肢中骨发育不良、尼维格型肢中骨发育不良、罗氏综合征、莱因哈特综合征、肢端发育不全、周围骨发育障碍、克尼斯特发育不良、纤维软骨增生症、罗伯茨综合征、肢端肢中发育不全、小肢、莫奎氏综合征、克尼斯特综合征、后生营养性发育不良、脊椎骨骺干骺端发育不良、NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱里维尔)和PTPN11突变(努南氏综合征)。
通过刺激软骨细胞的基质产生、增殖和分化以及增加长骨生长，本发明的CNP变体适用于治疗罹患骨相关病症(如骨骼发育不良)的哺乳动物，包含人类。CNP反应性骨骼相关病症和骨骼发育不良的非限制性实例包括软骨发育不全、软骨生成减退、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性骨发育不良、成骨不全、软骨成长不全、先天性成骨不全、纯合性软骨发育不全、先天性成骨不全、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋多指综合征、软骨生成减退、肢根型点状软骨发育不良、扬森型干骺端发育不良、先天性脊椎骨骺发育不良、骨发育不全症、扭曲性骨发育不良、先天性股骨短、兰格型肢中骨发育不良、尼维格型肢中骨发育不良、罗氏综合征、莱因哈特综合征、肢端发育不全、周围骨发育障碍、克尼斯特发育不良、纤维软骨生成、罗伯茨综合征、肢端肢中发育不全、小肢、莫奎氏综合征、克尼斯特综合征、后生营养发育不良以及脊椎干骺端发育不良。本文中涵盖的身材矮小、生长板病症、骨相关病症或骨骼发育不良包含涉及NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱里维尔)、PTPN11突变(努南氏综合征)和IGF1R突变的病症。
本文中涵盖的身材矮小、生长板病症、骨相关病症或骨骼发育不良包含涉及NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱里维尔)和PTPN11突变(努南氏综合征)的病症。
方法涵盖的额外身材矮小和生长板病症包含涉及胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度刺猬因子(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3的突变的病症。
方法涵盖的额外身材矮小和生长板病症包含涉及胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度刺猬因子(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或IGF1R的突变的病症。
另外，CNP盐适用作用于治疗特发性身材矮小和本文所述的其它骨骼发育不良的生长激素的辅助或替代。
生长板病症包含导致身材矮小或骨生长异常和可为涉及骨生长的基因中的基因突变的结果的病症，所述基因包含胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度刺猬因子(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3。在各种实施例中，生长板病症包含导致身材矮小或骨生长异常和可为涉及骨生长的基因中的基因突变的结果的病症，所述基因包含胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度刺猬因子(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或IGF1R。在各种实施例中，生长板病症或身材矮小与相关于拉索病的基因中的一种或多种突变相关。在各种实施例中，患有生长板病症的个体对于生长板基因中的突变为异型接合的。在各种实施例中，突变为功能损失型突变。在各种实施例中，突变为功能获得型突变。生长板病症包含但不限于家族性身材矮小、显性家族性身材矮小(其也称为显性遗传性身材矮小)或特发性身材矮小。参见例如Plachy等人,《临床内分泌代谢杂志(J Clin Endocrinol Metab)》104:4273-4281,2019。
ACAN的突变可引起家族性剥脱性骨软骨炎和身材矮小且最终引起骨关节炎，其特征在于由软骨和有时骨头在关节处自骨末端脱离引起的骨损伤(或病变)区域。已提出骨生长中的软骨网状结构错乱会损害其生长，导致身材矮小。与ACAN和身材矮小相关的突变包含Val2303Met。参见Stattin等人《美国人类遗传学杂志(Am J Hum Genet)》86(2):126-37,2010。预期具有导致身材矮小的ACAN突变的患者将受益于CNP治疗，因为投药可能够通过CNP与FGFR3的已知相互作用增加这些患者的身高。
已展示利钠肽系统(包含受体NPR2)参与软骨内化骨生长的调节(Vasques等人,《儿科激素研究(Horm Res Pediat)》82:222-229,2014)。研究已展示NPR2中的同型接合或复合异型接合功能损失型突变引起肢端肢中发育不良型Maroteaux(AMDM)，其为骨骼具有极其矮小身材的发育不良(Vasquez等人,2014,前述)。有报道暗示异型接合功能损失型(如显性负性)NPR2突变是身材矮小的原因，而功能获得型NPR2异型接合突变已被发现是高大身材的原因(Vasquez等人,2014,前述)。鉴于CNP与NPR2相互作用以刺激cGMP生成，增加cGMP水准在这些情况下为期望的，且将在管理来自这些疾病和病况的并发症中具有治疗益处。
咸信NPR2的异型接合突变导致特发性身材矮小和其它形式的身材矮小。NPR2基因的突变陈述于下文且描述于以下各者中：Amano等人,《临床内分泌代谢杂志》99:E713-718,2014，Hisado-Oliva等人,《临床内分泌代谢杂志》100:E1133-1142,2015和Vasques等人,《临床内分泌代谢杂志》98:E1636-1644,2013，其以引用的方式并入本文中。预期患有待用如本文所述的CNP变体治疗的身材矮小的个体具有小于-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0的身高SDS，且具有至少一个具有小于-1.0、-1.5、-2.0或-2.5的身高SDS的亲代，任选地其中第二亲代的身高在正常范围内。在各种实施例中，CNP变体适用于治疗患有身高SDS为-2.0至-3.0的身材矮小的个体。在各种实施例中，CNP变体适用于治疗患有身高SDS为-2.0至-2.5的身材矮小的个体。然而，由于NPR2中的新生突变可导致如小于-1.5、-2.0、-2.5或-3.0的身高SDS所定义的身材矮小，因此还涵盖治疗任一亲代均不患有身材矮小的作为NPR2中的有害突变的异型接合携带者的个体。进一步预期用CNP治疗对于其它生长板基因中的有害突变为异型接合的个体，以改善身材和/或增强骨生长。
可用CNP变体治疗的患者的示例性NPR2突变包含：
Figure BDA0003548210110000331
Figure BDA0003548210110000341
NPPC于骨骼生长中的作用为有据可查的。(Hisado-Oliva等人,《遗传学医学(Genetics Medicine)》20:91-97,2018)。NPPC敲除小鼠展示严重不成比例形式的侏儒症，包含四肢缩短和软骨内骨化(Hisado-Oliva等人,2018,前述)。人类全基因体研究已展示NPPC与身高之间的关联(Hisado-Oliva等人,2018,前述)。尽管咸信CNP单倍剂量不足为人类身材矮小的原因，但近来的研究鉴别了身材矮小且双手短小的家庭中的异型接合突变(Hisado-Oliva等人,2018,前述)。这些研究观测以异型接合状态测量的cGMP产量显著降低(Hisado-Oliva等人,2018,前述)。NPPC的突变包含引起Gly119Cys改变的355G>T误义突变和引起Arg117Gly改变的349C>G误义突变。拯救CGMP生产的CNP变体可在具有异型接合功能损失型NPPC突变的患者的病症管理中提供治疗益处。
莱里-维尔软骨骨生成障碍(LWD)为稀有遗传病症，其特征在于前臂和小腿缩短、手腕异常错位(手腕马得隆变形(Madelung deformity))和相关的身材矮小。LWD由位于性染色体的假常染色体区域1(PAR1)上的含身材矮小同源盒(SHOX)基因或其调节元件中的异型接合突变引起。(参见稀有疾病数据库和Carmona等人,《人类分子遗传学(Hum MolGenet)》20:1547-1559,2011)。病症兰格肢中骨发育不良在存在两个SHOX突变时产生，且可由各染色体上的突变(同型接合或复合异型接合突变)产生。SHOX突变的子集引起特发性身材矮小。特纳综合征由于可包含SHOX基因的X染色体上的缺失而产生。SHOX已鉴别为参与FGFR3转录调节且有助于骨生长控制(Marchini等人,《内分泌综述(Endocr Rev.)》37:417-448,2016)。SHOX缺乏导致FGFR3信号传导增加，且一些证据支持SHOX还与CNP/NPR2直接相互作用(Marchini,前述)。鉴于SHOX与FGFR3和骨生长的关联，预期具有同型接合或异型接合SHOX突变的个体将受益于用如本文所述的CNP变体治疗。
拉索病为由Ras/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路径基因中的突变引起的一组罕见遗传病症。拉索病为特征在于经由RAS/MAPK路径的信号传导增加的一组病症。此路径导致RAF/MEK/ERK路径的下游激活。身材矮小为某些拉索病的典型特征。例如，CNP信号传导抑制RAF且使得MEK和ERK活化降低。
本文中涵盖拉索病治疗。与身材矮小相关的拉索病包含努南综合征、科斯特洛综合征、心脸皮肤综合征、1型神经纤维瘤和LEOPARD综合征。遗传性1型齿龈纤维瘤病也是本文中涵盖的拉索病。拉索病患者(包含努南综合征、科斯特洛综合征、心脸皮肤综合征、1型神经纤维瘤、LEOPARD综合征、遗传性1型齿龈纤维瘤病)包含具有以下基因中的一个或多个中的异型接合变体的患者：BRAF、CBL、HRAS、KRAS、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MRAS、NF1、NRAS、PPP1CB、PTPN11、RAF1、RRAS、RIT1、SHOC2、SOS1或SOS2(Tajan等人《内分泌综述》2018；39(5):676-700)。
CFC由Ras/MAPK信号传导路径中的若干基因的突变引起，包含K-Ras、B-Raf、Mek1和Mek2。科斯特洛综合征(也称为颜面皮肤骨骼(FCS)综合征)由H-Ras基因中的活化突变引起。遗传性I型齿龈纤维瘤病(HGF)由SOS1基因(Son of Sevenless同源物1)中的显性突变引起，所述基因编码作用于小GTP酶的Ras子族的鸟嘌呤核苷酸交换因子(SOS)。I型神经纤维瘤(NF1)由神经纤维瘤蛋白1基因中的突变引起，所述基因编码Ras/MAPK信号传导路径的负调节因子。努南综合征(NS)由若干基因中的一个的突变引起，所述基因包含PTPN11(其编码SHP2)和SOS1，以及K-Ras和Raf-1。
已表明CNP为拉索病模型中的有效疗法。Ono等人产生在II型胶原蛋白生产细胞中缺乏Nf1的小鼠(Ono等人,《人类分子遗传学(Hum.Mol.Genet.)》2013；22(15):3048-62)。这些小鼠展现组成型ERK1/2活化，和软骨细胞增殖减少，和成熟。向这些小鼠每日注射CNP使得ERK磷酸化降低且校正了身材矮小。使用Braf突变(p.Q241R)的心脸皮肤综合征的小鼠模型(Inoue等人《人类分子遗传学》2019；28(1):74-83)展现相比于野生型减小的体长和减小的生长板宽度与较小增生和肥大区域，且施用CNP使得这些动物的体长增加。
多个基因的突变可引起努南综合征，其特征在于身材矮小、心脏缺陷、出血问题和骨骼畸形。PTPN11基因的突变引起努南综合征的所有病例的大约一半。SOS1基因突变引起额外10至15％病例，且RAF1和RIT1基因各占病例的约5％。其它基因的突变各占少数病例。15至20％患有努南综合征的人群的病因为未知的。
PTPN11、SOS1、RAF1和RIT1基因全部编码在RAS/MAPK细胞信号传导路径中重要的蛋白质，所述路径对于细胞分裂和生长(增殖)、分化和细胞迁移是必需的。与努南综合征相关的基因中的许多突变使所得蛋白质被打开(激活)，且此长时间激活改变正常RAS/MAPK信号传导，其破坏细胞生长和分裂调节，从而导致努南综合征的特性特征。参见例如Chen等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A.)》111(31):11473-8,2014，Romano等人,《婴儿病学(Pediatrics.)》126(4):746-59,2010，和
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等人,《美国医学遗传学杂志(Am J Med Genet)》170(7):1874-80,2016。预期具有激活MAPK路径的突变的个体将受益于用如本文所述的CNP变体治疗，以改善骨生长和身材矮小。还预期具有激活MAPK路径的突变的个体将受益于用如本文所述的CNP变体治疗，以改善与整个身体的其它细胞(其中NPR2受体表现于其表面上)中的过度活化MAPK路径相关的其它共患病。
PTPN11基因(其编码非受体蛋白酪胺酸磷酸酶SHP-2)的突变导致特征为身材矮小的病症，如努南综合征(Musente等人,《欧洲人类遗传学杂志(Eur J Hum Genet)11:201-206(2003)。Musente(前述)鉴别PTPN11基因中导致身材矮小的许多突变。功能获得型突变经由SHP2的过度活化信号传导且抑制生长激素诱导的IGF-1释放，从而使得骨生长降低(Rocca Serra-Nédélec,《美国国家科学院院刊(PNAS)》109:4257-4262,2012)。预期具有同型接合或异型接合PTPN11突变的个体将受益于用如本文所述的CNP变体治疗，以改善骨生长和身材矮小。
印度刺猬因子(IHH)基因(其与软骨内骨化的调节有关)的突变也与身材矮小综合征相关(Vasques等人,《临床内分泌代谢杂志》103:604-614,2018)。许多鉴别的IHH突变以显性遗传模式与身材矮小分隔。鉴于IHH与骨生长和骨化的关联，预期具有同型接合或异型接合IHH突变的个体将受益于用如本文所述的CNP变体治疗。
FGFR3的突变，包含N540K和K650N导致身材矮小和软骨生成减退。
胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)为具有内在激酶活性的杂四聚体(α2β2)跨膜糖蛋白。已展示IGF1R在产前和产后生长中起作用。已在小于胎龄儿(SGA)和患有家族性身材矮小的个体中鉴别IGF1R的异型接合突变(Kawashima等人,《内分泌杂志(Endocrine J.)》59:179-185,2012)。与身材矮小相关的IGF1R突变包含R108Q/K115N、R59T、R709Q、G1050K、R481Q、V599E和G1125A(Kawashima，前述)。
身高为可受数百个或数千个基因的组合效应影响的高度遗传性性状(Wood等人,《自然遗传学》,46:1173-1189,2014)。个别身材矮小可为这些基因的组合效应的结果，单个基因并非主要贡献者。鉴于CNP增加正常动物的长度，例如增强骨生长和骨长度的能力，预期患有由小于-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0的身高SDS定义的身材矮小的此类个体可有益地用CNP变体治疗。
在各种实施例中，CNP变体适用于治疗患有如下的身材矮小的个体：身高SDS为小于-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0，且至少一个亲代的身高SDS为小于-1.0、-1.5、-2.0或-2.5，任选地其中第二亲代的身高在正常范围内。在各种实施例中，CNP变体适用于治疗患有身高SDS为-2.0至-3.0的身材矮小的个体。在各种实施例中，CNP变体适用于治疗患有身高SDS为-2.0至-2.5的身材矮小的个体。在各种实施例中，身材矮小与相关于身材矮小的基因中的一种或多种突变相关，如胶原蛋白(COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10)、聚集蛋白聚糖(ACAN)、印度刺猬因子(IHH)、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰岛素生长因子1受体(IGF1R)或其组合。
在各种实施例中，身材矮小与相关于拉索病的基因中的一种或多种突变相关。
在各种实施例中，身材矮小为如通过多基因风险评分(PRS)所确定的多个基因中的突变的结果。在各种实施例中，个体具有NPR2的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有FGFR3的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有NPR2的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有IGF1R的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有NPPC的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有SHOX的突变和低PRS。在各种实施例中，个体具有FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2和SHOX中的一个或多个的一种或多种突变和低PRS。在各种实施例中，PRS为1或2。在各种实施例中，PRS为1。在各种实施例中，PRS为2。
另外，CNP盐适用于治疗其它骨相关病况和病症，如佝偻病、低磷酸盐血性佝偻病[包括X连锁低磷酸盐血性佝偻病(也称为维生素D耐药性佝偻病)和常染色体显性低磷酸盐血性佝偻病]，和骨质软化[包含肿瘤诱导的骨质软化(也称为致癌骨质软化或致癌低磷酸盐血性骨质软化)]。
本发明的CNP盐还可用于治疗骨关节炎。骨关节炎为关节软骨的退化疾病且在老年人中频繁发生。骨关节炎涉及软骨破坏和由关节成分退化引起的骨和软骨的增生性变化，其中所述变化导致继发性关节炎(例如滑膜炎)。在骨关节炎中，细胞外基质蛋白(其为软骨的功能实体)减少，且软骨细胞数量减少(《风湿性关节炎(Arth。Rheum.)》46(8):1986-1996(2002))。通过促进软骨细胞的基质产生、生长和分化，CNP组合物适用于抵消FGF-2的非所期望的效应，且增加罹患关节炎(包含骨关节炎)的个体的基质合成，由此治疗关节炎，包含骨关节炎。
在某些实施例中，本发明的CNP盐和包括其的组合物和调配物适用于改善骨骼发育不良的一种或多种症状或生理学后果，其中所述改善可为绝对生长增加、生长速度增加、定性计算机断层摄影(QCT)骨矿物质密度增加、生长板形态改善、长骨生长增加、脊柱形态改善、肘关节活动范围改善和/或睡眠呼吸暂停减少。就此而言，应注意术语“改进”、“增加”、“降低”和其语法等效物当相对于疾病状态的症状或生理学后果使用时均为相对术语，是指用本发明的CNP盐(或包含其的组合物或调配物)治疗后疾病的症状或生理学后果相较于用本发明的CNP盐(或包含其的组合物或调配物)治疗之前的疾病的相同症状或生理学后果(即相较于“基线”)的状态。如上文所述，“基线”状态可通过治疗之前的个体状态的测量(其可随后与治疗后的同一个体的状态相比)，或通过罹患共用相同或类似特征(例如年龄、性别和/或疾病状态或进展)的相同病痛的个体群体的状态的测量测定。
在另一实施例中，本发明提供CNP变体的盐，其在体外或体内刺激产生相同wtCNP22浓度(例如1μM)下产生的cGMP水准的至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％。在另一实施例中，包括本发明的CNP或CNP变体的疏水性盐在体外或体内刺激产生相同wtCNP22浓度(例如1μM)下产生的cGMP水准的至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％。
预期本文所述的CNP变体中的任一种适用于方法。
在各种实施例中，CNP变体为PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37(SEQ ID NO:1))。在各种实施例中，肽进一步包括乙酰基。在各种实施例中，乙酰基在肽的N端上。在各种实施例中，乙酰基在肽序列内的氨基酸侧链上。在各种实施例中，肽在C端进一步包括OH或NH2基团。在各种实施例中，变体包括一个或多个如本文所述的连接基团。在各种实施例中，连接基团为可水解连接基团。在各种实施例中，肽包括带静电肽盐，所述盐包括与疏水性相对离子络合的带静电肽。
通过各种参数来测量治疗功效。在各种实施例中，功效被评估为自基线期至干预期按年计算的生长速度变化。功效还将评估为如使用CDC生长曲线所测量的自基线至治疗结束的身高SDS变化，且生长速度SDS将基于儿童研究中的骨矿物质密度(Kelly等人,《临床内分泌代谢杂志》2014；99(6):2104-2112)。
按指导评估QoLISSY，身材矮小青年的生活质量(身材矮小青年的生活质量-QoLISSY问卷用户手册(Quality of Life in Short Stature Youth-The QoLISSYQuestionnaire User's Manual.)Lengerich:Pabst Science Publishers；2013)。
药物组合物
本发明提供药物组合物，包含缓释组合物，其包括本文所述的肽盐，和一种或多种药学上可接受的赋形剂、和/或稀释剂。在某些实施例中，组合物进一步包括一种或多种其它生物活性剂(例如蛋白酶、受体酪胺酸激酶和/或清除受体NPR-C的抑制剂)。
本发明提供包括如本文所述的疏水性肽盐的缓释组合物。在各种实施例中，缓释组合物为延释组合物。在各种实施例中，延释组合物包括疏水性CNP盐。在各种实施例中，CNP盐中的疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。在各种实施例中，如果存在多价阳离子，则阳离子包括锌或钙。在各种实施例中，如果存在阳离子，则阳离子为Zn2+或Ca2+。
沉淀的肽复合物可在形成沉淀的pH条件下显示延释特征。沉淀的肽复合物还可用于进一步加工为基质，所述基质为持续释放提供额外屏障，如缓慢降解微球、水凝胶和其类似物。预期疏水性CNP盐为固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子，且再悬浮于水溶液或油中。在各种实施例中，水溶液为水、盐水或缓冲液。在各种实施例中，粒子为1至10,000微米(μm)、1μm至2000μm、2μm至1000μm、5μm至500μm、10μm至1000μm、50μm至500μm、100μm至800μm、200至600μm、300μm至500μm、100μm至300μm、50μm至100μm或10μm至50μm。在各种实施例中，粒子为纳米粒子。在各种实施例中，纳米粒子为大约5纳米(nm)至1000nm，8nm至900nm，10nm至800nm，20nm至600nm，50nm至500nm，50至400nm，20至300nm，300至800nm或200至600nm。
在各种实施例中，油包括三酸甘油酯或脂肪酸，其可为饱和或不饱和的。如本文所述的三酸甘油酯和脂肪酸还预期与疏水性CNP盐组合物一起使用。在各种实施例中，脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸或十二酸。在各种实施例中，脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸、十二酸或多库酯。
在各种实施例中，对于延释组合物，在pH 7至7.6下，(i)第1天释放小于约20％的肽；和(ii)每周释放约90％的肽，或每两周释放约90％的肽，或每月释放约90％的肽。
在各种实施例中，在pH 7至7.6下，第1天释放小于约20％的肽。进一步预期(i)在pH 7.0至7.6下，第1天释放小于约30％、或约40％、或约50％的肽；和(ii)在pH 7至7.6下，每周释放约90％的肽，或每两周释放约90％的肽，或每月释放约90％的肽。进一步预期(i)在pH 7.0至7.6下，第1天释放小于约30％、或约40％、或约50％、或约60％的肽；和(ii)在pH7至7.6下，每周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每两周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每三周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每月释放约70％、约80％或约90％的肽。在各种实施例中，在pH 7至7.6下，每周释放约90％的肽。在各种实施例中，在pH 7至7.6下，每两周释放约90％的肽。在各种实施例中，在pH 7至7.6下，每月释放约90％的肽。进一步预期所述释放可在pH 7.0至7.6、pH 7.1至7.5、pH 7.2至7.4、pH 7.2至7.6或pH 7.0至7.4的pH下。
在各种实施例中，(i)在pH 7.0至7.6下，第1天释放小于约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％或约75％的肽；和(ii)在pH 7至7.6下，每周释放约90％的肽，或每两周释放约90％的肽，或每月释放约90％的肽。进一步预期(i)在pH 7.0至7.6下，第1天释放小于约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％或约75％的肽；和(ii)在pH 7至7.6下，每周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每两周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每三周释放约70％、约80％或约90％的肽；或每月释放约70％、约80％或约90％的肽；或者ii)在pH 7至7.6下，每周释放约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的肽；或每两周释放约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的肽；或每三周释放约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的肽；或每月释放约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的肽。
在各种实施例中，延释组合物包括赋形剂、稀释剂或载剂。在各种实施例中，赋形剂、稀释剂或载剂为药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
赋形剂、载剂和稀释剂的非限制性实例包含媒剂、液体、缓冲剂、等张剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、湿润剂、佐剂等。组合物可含有液体(例如水、乙醇)；各种缓冲剂内容物(例如Tris-HCl、磷酸盐、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂)、pH和离子强度的稀释剂；洗涤剂和增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；抗氧化剂(例如甲硫胺酸、抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)；防腐剂(例如Thimerosol、苯甲醇、间甲酚)；以及膨化物质(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖)。在药物组合物的调配中使用赋形剂、稀释剂和载剂为本领域中已知的；参见例如《雷明顿氏药物科学》,第18版,第1435-1712页,Mack PublishingCo.(Easton,Pennsylvania(1990))，其以全文引用的方式并入本文中。
例如，载剂包含但不限于稀释剂、媒剂和佐剂，以及植入物载剂，和惰性、无毒固体或液体填充剂和囊封材料，其不与活性成分反应。载剂的非限制性实例包含磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水以及乳液(例如油/水乳液)。载剂可为含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇和其类似物)、植物油和其混合物的溶剂或分散介质。
在一些实施例中，组合物为液体调配物。在某些实施例中，调配物包括疏水性CNP盐，其浓度范围为约0.1mg/ml至约20mg/ml，或约0.5mg/ml至约20mg/ml，或约1mg/ml至约20mg/ml，或约0.1mg/ml至约10mg/ml，或约0.5mg/ml至约10mg/ml，或约0.5至5mg/ml，或约0.5至3mg/ml，或约1mg/ml至约10mg/ml。在各种实施例中，CNP变体的浓度为0.8mg/mL至2mg/mL。在各种实施例中，CNP变体的浓度为0.8mg/mL。在各种实施例中，CNP变体的浓度为2.0mg/mL。在各种实施例中，CNP变体由冻干粉复原。
在其它实施例中，组合物包含缓冲溶液或缓冲剂以将含有CNP的溶液或悬浮液的pH维持于所期望的范围内。缓冲溶液的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水以及汉克氏缓冲盐水(Hank's buffered saline)。缓冲剂包含但不限于乙酸钠、磷酸钠和柠檬酸钠。还可使用缓冲剂的混合物。在某些实施例中，缓冲剂为乙酸/乙酸盐或柠檬酸/柠檬酸盐。组合物中合适的缓冲剂的量部分取决于所用的具体缓冲剂以及溶液或悬浮液的所期望的pH。在一些实施例中，缓冲剂的浓度为约10mM±5mM。在某些实施例中，组合物的pH为约pH 3至约pH 9，或约pH 3至约pH 7.5，或约pH 3.5至约pH 7，或约pH 3.5至约pH 6.5，或约pH 4至约pH 6，或约pH 4至约pH 5，或为约pH 5.0±1.0。在各种实施例中，pH为约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在各种实施例中，pH为5.5。
在其它实施例中，组合物含有等张调节剂以使溶液或悬浮液等张且与投药更相容。等张剂的非限制性实例包含NaCl、右旋糖、葡萄糖、甘油、山梨糖醇、木糖醇和乙醇。在某些实施例中，等张剂为NaCl。在某些实施例中，NaCl的浓度为约160±20mM，或约140mM±20mM，或约120±20mM，或约100mM±20mM，或约80mM±20mM，或约60mM±20mM。
在其它实施例中，组合物包括防腐剂。防腐剂包含但不限于间甲酚和苯甲醇。在某些实施例中，防腐剂的浓度为约0.4％±0.2％，或约1％±0.5％，或约1.5％±0.5％，或约2.0％±0.5％。
在其它实施例中，组合物含有抗吸附剂(例如减少CNP盐吸附至玻璃或塑料)。抗吸附剂包含但不限于苯甲醇、聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。在某些实施例中，抗吸附剂的浓度为约0.001％至约0.5％，或约0.01％至约0.5％，或约0.1％至约1％，或约0.5％至约1％，或约0.5％至约1.5％，或约0.5％至约2％，或约1％至约2％。
在其它实施例中，组合物包括稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括甘油、丙三醇、硫代甘油、甲硫胺酸以及抗坏血酸和其盐。在一些实施例中，当稳定剂为硫代甘油或抗坏血酸或其盐时，稳定剂浓度为约0.1％至约1％。在其它实施例中，当稳定剂为甲硫胺酸时，稳定剂的浓度为约0.01％至约0.5％，或约0.01％至约0.2％。在其它实施例中，当稳定剂为甘油时，稳定剂的浓度为约5％至约100％(纯)。
在其它实施例中，组合物含有抗氧化剂。示例性抗氧化剂包含但不限于甲硫胺酸和抗坏血酸。在某些实施例中，抗氧化剂与CNP的摩尔比为约0.1:1至约15:1，或约1:1至约15:1，或约0.5:1至约10:1，或约1:1至约10:1或约3:1至约10:1。
药学上可接受的盐可用于组合物，包含但不限于无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐)、有机酸盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐)和胺(例如异丙胺、三甲胺、二环己胺、二乙醇胺)盐。药学上可接受的盐的彻底论述见于《雷明顿氏医药科学》,第18版,Mack Publishing Company,(Easton,Pennsylvania(1990))中。
药物组合物可以各种形式施用，如片剂、胶囊、颗粒、粉末、溶液、悬浮液、乳液、软膏和经皮贴片。组合物的剂型可调适为组合物的所期望的投药模式。对于经口施用，组合物可采取例如片剂或胶囊(包含软凝胶胶囊)的形式，或可例如为水性或非水性溶液、悬浮液或糖浆。用于经口施用的片剂和胶囊可包含一种或多种常用的赋形剂、稀释剂和载剂，如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米淀粉、糖精钠、滑石、纤维素、碳酸镁和润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酰反丁烯二酸钠)。必要时，可将调味剂、着色剂和/或甜味剂添加至固体和液体调配物。用于口服调配物的其它任选的成分包含但不限于防腐剂、悬浮剂和增稠剂。口服调配物还可具有肠溶衣以保护CNP盐免受胃的酸性环境侵害。制备固体和液体剂型的方法为已知的，或将为本领域技术人员显而易见(参见例如上文引用的《雷明顿氏医药科学》)。
用于非经肠施用的调配物可例如以液体溶液或悬浮液形式、以适合于在注射之前溶解或悬浮于液体介质中的固体形式或以乳液形式制备。举例来说，无菌可注射溶液和悬浮液可根据本领域中已知的技术使用适合稀释剂、载剂、溶剂(例如缓冲水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)、等张氯化钠溶液)、分散剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂和其类似物调配。另外，可使用无菌固定油、脂肪酯、多元醇和/或其它非活性成分。作为其它实例，用于非经肠施用的调配物包含可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者血液等张的溶质的水性无菌注射溶液；以及可含有悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。
包括疏水性CNP盐的组合物还可以是冻干调配物。在某些实施例中，冻干调配物包括缓冲剂和膨化剂，以及任选的抗氧化剂。示例性缓冲剂包含但不限于乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。示例性膨化剂包含但不限于甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、海藻糖和聚维酮(PVP K24)。在某些实施例中，甘露糖醇的量为约3％至约10％，或约4％至约8％，或约4％至约6％。在某些实施例中，蔗糖的量为约6％至约20％，或约6％至约15％，或约8％至约12％。示例性抗氧化剂包含但不限于甲硫胺酸和抗坏血酸。
在各种实施例中，调配物包括柠檬酸、柠檬酸钠、海藻糖、甘露糖醇、甲硫胺酸、聚山梨醇酯80和任选的无菌注射用水(WFI)。
本发明还提供试剂盒，其含有例如包括液体(例如无菌可注射)调配物或固体(例如冻干)调配物的瓶、小瓶、安瓿、管、药筒和/或注射器。试剂盒还可含有药学上可接受的媒剂或载剂(例如溶剂、溶液和/或缓冲液)，其用于将固体(例如冻干)调配物复原为溶液或悬浮液以用于施用(例如通过注射)，包含但不限于复原注射器中的冻干调配物以用于注射或将浓缩物稀释至较低浓度。此外，即用型注射溶液和悬浮液可自例如包括含有CNP的组合物的无菌粉末、颗粒或片剂制备。试剂盒还可包括散布装置(如喷雾或注射散布装置)、笔式喷射器、自喷射器、无针喷射器、注射器和/或针。
作为非限制性实例，试剂盒可包含具有单腔室或双腔室的注射器。对于单腔室注射器，所述单腔室可含有准备好进行注射的液体CNP调配物，或固体(例如冻干)CNP调配物或CNP盐于相对较小量的合适的溶剂系统(例如甘油)中的液体调配物，其可复原为注射用溶液或悬浮液。对于双腔室注射器，一个腔室可含有药学上可接受的媒剂或载剂(例如溶剂系统、溶液或缓冲液)，且另一腔室可含有固体(例如冻干)CNP调配物或CNP盐于相对较小量的合适的溶剂系统(例如甘油)中的液体调配物，其可使用来自第一腔室的媒剂或载剂复原为注射用溶液或悬浮液。
作为另一实例，试剂盒可包含一个或多个笔式注射器或自动注射器装置，和双腔室药筒。药筒的一个腔室可含有药学上可接受的媒剂或载剂(例如溶剂系统、溶液或缓冲液)，且另一腔室可含有固体(例如冻干)CNP调配物或CNP盐于相对较小量的合适的溶剂系统(例如甘油)中的液体调配物，其可使用来自第一腔室的媒剂或载剂复原为注射用溶液或悬浮液。药筒可包括足以经所期望的时段(例如2天、3天、1周、2周、3周、4周等)给药的量的CNP盐。笔式注射器或自动注射器可经调节以施用所期望的量的来自药筒的CNP调配物。
投药和给药
疏水性CNP盐或包括其的药物组合物或调配物可以不同方式向个体施用，如皮下、关节内、腹膜内、肌肉内、皮内或经口。在一个实施例中，每日一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每4周一次、每6周一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次地施用CNP肽盐组合物。
疏水性CNP盐或盐组合物还可通过在目标作用部位(例如异常或退化的关节或软骨区域)植入药物储槽来施用。或者，CNP盐可通过经皮递送(例如通过皮肤上的贴片)在舌下(例如舌下片剂)舌下施用，或以微球、微胶囊、脂质体(不带电或带电(例如阳离子))、聚合微米粒子(例如聚酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(交酯-乙交酯))、微乳液和其类似形式经口施用。
本文所述的疏水性CNP盐组合物可以治疗有效剂量向有需要的患者施用，以治疗、改善或预防骨相关病症(例如骨骼发育不良，包含软骨发育不全)。CNP盐的安全性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药理学程序测定，如通过测定LD50(对于50％的群体致死性的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比为治疗指数且其可以比率LD50/ED50表示。展现大的治疗指数的活性剂通常为优选的。
在某些实施例中，本文所述的疏水性CNP盐组合物以约3或10nmol/kg至约300nmol/kg，或约20nmol/kg至约200nmol/kg，或约3nmol/kg至约100nmol/kg范围内的剂量施用。在一些实施例中，CNP盐组合物以约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的剂量或治疗医师认为适当的其它剂量施用。在其它实施例中，CNP盐组合物以约5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg/kg，或约0.5、0.8、1.0、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/kg的剂量，或治疗医师认为适当的其它剂量施用。本文所述的疏水性CNP盐的剂量可根据本文所述的给药频率/投药频率施用，包含但不限于每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。在各种实施例中，CNP盐每日皮下施用。在各种实施例中，CNP盐每周皮下施用。在各种实施例中，CNP变体以2.5微克/千克/天至60微克/千克/天、10微克/千克/天至45微克/千克/天或15微克/千克/天至30微克/千克/天的剂量进行施用。在各种实施例中，CNP变体以15微克/千克/天的剂量施用。在各种实施例中，CNP变体以30微克/千克/天的剂量施用。
针对特定个体的疏水性CNP盐的给药/投药频率可视各种因素而变化，包含治疗的病症和个体的状况和对疗法的反应。疏水性CNP盐可以每次给药单次剂量或多次剂量施用。在某些实施例中，如下地施用疏水性CNP盐组合物：以单次剂量或多次剂量，每日一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每4周一次、每6周一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次，或治疗医师认为适当的频率。在各种实施例中，持续3个月、6个月、12个月或更久施用CNP变体。
在一些实施例中，施用疏水性CNP盐组合物以允许生长期(例如软骨生成)，继的以恢复期(例如成骨)。例如，CNP盐组合物可皮下或通过另一模式每日或每周多次地施用一段时间，接着为无治疗时段，接着重复所述周期。在一些实施例中，初始治疗期(例如每日施用或每周多次施用CNP盐组合物)持续3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一个相关实施例中，无治疗期持续3天、1周、2周、3周或4周。在某些实施例中，CNP盐组合物的给药方案为每日一次持续3天，接着停药3天；或每日一次或每周多次持续1周，接着停药3天或1周；或每日一次或每周多次持续2周，接着停药1或2周；或每日一次或每周多次持续3周，接着停药1、2或3周；或每日一次或每周多次持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接着停药1、2、3或4周。
生物标记
为了治疗骨相关病症，可测量生长指标，如子宫内和新生儿的长骨生长测量，和测量骨生长生物标记，如CNP、cGMP、胶原蛋白II、胶原蛋白X、骨钙化素和增殖细胞核抗原(PCNA)。
一种CNP信号传导标记为cGMP(3',5'环单磷酸鸟苷)。此胞内信号传导分子的含量在CNP结合和活化其同源受体NPR-B之后增加。升高的cGMP含量可测量自CNP暴露之后的细胞培养提取物(体外)、来自CNP暴露之后的骨外植研究的条件培养基(离体)和在皮下、静脉内或经由本领域中已知的其它施用途径施用CNP几分钟内的血浆中(体内)。
还可测量软骨和骨特异性分析物(或软骨和骨头相关标记)以评估CNP功效。例如，裂解的II型胶原蛋白的片段为软骨更新的软骨特异性标记。II型胶原蛋白为软骨的主要有机成分且II型胶原蛋白的片段(裂解的胶原蛋白)释放至循环中，且随后在软骨更新后分泌至尿液中。软骨更新先于新骨形成。
可测量的骨形成的骨特异性生物标记为I型原胶原(PINP)的N端前肽。合成I型胶原蛋白为骨形成的重要步骤，因为I型胶原蛋白是骨基质中的主要有机组分。在胶原蛋白合成期间，前肽自原胶原分子释放且可在血清中侦测到。另外，I型胶原蛋白的片段可测量为骨吸收的标记。
软骨和骨形成和生长的其它潜在生物标记包含聚集蛋白聚糖硫酸软骨素(软骨更新的软骨特异性标记)、II型胶原蛋白的前肽(软骨形成的软骨特异性标记)、碱性磷酸酶(骨特异性)和骨钙化素(骨形成的骨特异性标记)。软骨和骨相关生物标记可例如使用市售试剂盒在血清中测量自功效/药效学体内研究，和测量自离体研究的条件培养基。
在一个实施例中，在已施用本文所述的CNP盐或持续释放组合物的个体中分析或测量至少一种骨或软骨相关生物标记的含量，以便监测CNP组合物对体内骨和软骨形成和生长的作用。例如，至少一种骨或软骨相关生物标记的含量增加可指示施用CNP盐或持续释放组合物对骨生长具有积极作用，且适用于治疗骨骼发育不良和与CNP活性降低相关的其它骨或软骨相关疾病或病症。示例性骨或软骨相关生物标记包含但不限于CNP(例如CNP的内源性含量)、cGMP、II型胶原蛋白和其片段的前肽、II型胶原蛋白和其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、I型原胶原(PINP)和其片段的前肽、I型胶原蛋白和其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素和碱性磷酸酶。
在各种实施例中，通过自将施用、正施用或已施用CNP盐或持续释放组合物的个体获得生物样品来测量生物标记。可使用本领域中已知的技术测量生物标记，包含但不限于蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(ELISA)和酶活性分析。生物样品可为血液、血清、尿液或其它生物流体。
本发明的额外方面和细节从以下实例将显而易知，所述实例打算为说明性而非限制性的。
实例
实例1：产生疏水性CNP盐
为了确定使亲水性肽CNP与疏水性相对离子络合以使其电荷稳定是否将有效改进CNP调配物以用于治疗目的，进行改变CNP与其它离子组分的组合的静电电荷的实验。
为了最佳化CNP肽与疏水性相对离子物质之间的静电络合，且因此优化肽络合物的受控沉淀，溶液环境应允许使一大群的两种物质离子化。将两种溶液的pH调节为10(CNP的pI)与相对离子的酸性pKa(例如实例性相对离子物质油酸的pKa为约4-5)之间的中间值对于肽络合物沉淀的产率重要。
为了制备疏水性CNP盐，包括CNP变体，将CNP-乙酸盐置于水或缓冲液中。在第一实验中，制备在水中包含20mg/mL CNP的储备溶液。100mM Tris，pH 9.00也有效地作为溶剂。将双羟萘酸二钠、油酸或多库酯钠以相对于CNP上带相反电荷基团的数量摩尔过量，在此实例中，相对离子相对于CNP为12摩尔过量的浓度置于缓冲液中。CNP在pH 7下具有6个带正电基团，且此为相比于带正电基团的数量两倍过量。发现在缓冲溶液(76mM乙酸盐缓冲液pH4.84和100mM磷酸盐缓冲液pH 6.61)中，相对离子不易溶且形成似乎为不溶性或低溶解度相对离子的物于缓冲液中的悬浮液，然而在水中和在100mM Tris pH 9.00中，相对离子油酸、双羟萘酸二钠和多库酯钠为可溶的。
当添加金属阳离子以促进盐沉淀时，将所述金属阳离子溶解于水中且添加至CNP溶液且不添加至相对离子溶液，观测到如果将所述金属阳离子直接添加至相对离子，则其诱发相对离子溶液的沉淀。金属阳离子溶液(例如ZnCl2)以高浓度(>100mg/mL)溶解于水中，以使得可将小体积添加至CNP溶液且不显著改变浓度或pH。可以各种浓度添加金属阳离子，但在初始实验中，其以相对于CNP浓度4摩尔过量添加(CNP中存在两个带负电氨基酸，且其经添加以使得每摩尔带负电氨基酸存在2摩尔锌)。接着将相对离子溶液逐滴添加至含有或不含金属阳离子的CNP溶液，每次添加后将管在最高设定下涡旋一秒钟。
在添加足够的溶液以达到所期望的CNP与相对离子的比之后，将反应管在离心机中以10,000xg离心5分钟以使盐沉淀物形成离心块。离心后，接着去除上清液且添加与去除的上清液等体积的水且将离心块再悬浮。此次将管以7500xg离心3-5分钟且可观测到盐形成离心块。离心后，离心块再次用水洗涤盐且再悬浮。将管再次离心且去除上清液。接着将内容物移至小瓶(例如6R硼硅酸盐玻璃小瓶)，加塞，冷冻，且冻干。
接着评估后续盐粉末于各种缓冲液中的溶解度。起初，将约1mg粉末称量至管中且添加适当体积的溶剂以达到1mg/mL。将管在约37℃下摇动过夜。发现油酸盐可溶解于20％乙酸中。双羟萘酸盐可溶于二甲亚砜(DMSO)中。
这些实验展示将高水溶性肽沉淀为尺寸介于5纳米至1毫米直径范围内的水不溶性/低溶解度聚集体是可能的。
实例2--CNP盐的表征
如同实例1制备CNP的疏水性盐且测试沉淀和溶解度。表1描述与各种疏水性相对离子络合的CNP引起固体沉淀或形成。
表1
相对离子 反应溶剂 PPT
CNP-油酸盐 H<sub>2</sub>O 是
CNP-双羟萘酸盐 H<sub>2</sub>O 是
CNP-去氧胆酸盐 H<sub>2</sub>O 是
CNP-癸酸盐 H<sub>2</sub>O 胶凝
CNP-油酸盐 Na-Phos 是
CNP-双羟萘酸盐 Na-Phos 是
CNP-去氧胆酸盐 Na-Phos 是
CNP-癸酸盐 Na-Phos 胶凝
CNP-Ca<sup>+2</sup>(油酸盐) H<sub>2</sub>O 是
CNP-Ca<sup>+2</sup>(双羟萘酸盐) H<sub>2</sub>O 是
CNP-Ca<sup>+2</sup>(去氧胆酸盐) H<sub>2</sub>O 是
CNP-Ca<sup>+2</sup>(癸酸盐) H<sub>2</sub>O 是
CNP-Zn<sup>+2</sup>(油酸盐) H<sub>2</sub>O 是
CNP-Zn<sup>+2</sup>(双羟萘酸盐) H<sub>2</sub>O 是
CNP-Zn<sup>+2</sup>(去氧胆酸盐) H<sub>2</sub>O 是
CNP-Zn<sup>+2</sup>(癸酸盐) H<sub>2</sub>O 是
还对盐沉淀物进行溶解研究。在37℃下将1mg CNP盐再悬浮于50mL 1×PBS，pH6.5中，且测量固体溶解和CNP释放至溶液中，持续7天。不每日更换缓冲液。图1A-图1D和图2展示疏水性盐溶解比CNP-乙酸盐组合物慢。
实例3：异型接合NPR2突变对CNP处理有反应
为了确定CNP对患有由NPR2突变引起的身材矮小的个体的效应，开发NPR2突变的细胞模型。分析的示例性NPR2突变阐述于图5中。具有NPR2基因敲除或所述基因中的异型接合功能丧失突变的大鼠软骨肉瘤(RCS)细胞是通过使用125ng NPR2变体将RNP转染至RCS细胞中或转染至RCS或HEK293细胞中的野生型NPR2质体DNA制得。单细胞克隆经接种且通过桑格测序(Sanger sequencing)进行基因分型。细胞模型能够再现公布的不同突变的cGMP表型。
通过在RCS细胞中的NPR2的第一外显子中产生插入和缺失而产生NPR2克隆。NPR2中第一外显子的序列是通过下一代测序确认，且陈述于图4中。通过在用6nM Pro-GlyCNP37处理后，使用CatchPoint Cyclic-GMP荧光分析进行cGMP刺激分析来测试NPR2突变细胞回应于CNP施用的活性。简单来说，将NIH3T3细胞(ATCC，CRL-1658)和NPR转染的HEK293细胞以每孔60,000个细胞接种于96孔板(96孔黑色成像板，Grenier，#655090)中。RCS(大鼠软骨肉瘤)细胞以每孔40,000个细胞接种。培养基为如下：NIH3T3培养基：DMEM高葡萄糖，丙酮酸盐(Thermo，11995-073)+10％FBS+1×Pen Strep(abbrev P/S，Thermo，目录号15140122)。NIH3T3为cGMP分析HEK293培养基的对照系统：EMEM+10％FBS+1×P/S+1×GMAX。RCS培养基：DMEM+10％FBS+1×Pen Strep。无血清NIH3T3培养基：DMEM+1×P/S，用于以IBMX(CAS 28822-58-4)处理细胞；含BSA的无血清NIH3T3培养基：DMEM+1×P/S+0.5mg/mL BSA(Thermo，A9418-100G)，用于以CNP处理细胞。
细胞在37℃、5％CO2下培育24小时。对于用CNP变体处理的细胞，板在使用之前15分钟用IBMX(Enzo life sciences，89161-340，1g)预处理。IBMX为磷酸二酯酶的强效、非特异性抑制剂。IBMX的800mM储备溶液在IBMX稀释培养基(无血清培养基(DMEM+1×PBS与1×PBS 1:1混合)中稀释为0.75mM工作储备液。
对于细胞处理，自培育箱去除细胞，自细胞去除生长培养基且用IBMX处理细胞。将80μL 0.75mM IBMX添加至各孔中且将细胞传回至37℃培育箱中15分钟。在15分钟之后，将CNP(40微升/孔)添加至各测试孔且将细胞传回至37℃培育箱中15分钟。通过轻敲将板混合且在Solentim cell metric上成像以使细胞可视化，和确定是否有任何细胞上浮且接着将其放回37℃培育箱中。
终止反应且通过添加40μL溶解缓冲液(来自cGMP试剂盒)使细胞溶解。将板置于振荡器上5分钟以完成溶解。细胞溶解物用于cGMP分析。
使用根据制造商的方案制备的cGMP校准剂、兔抗cGMP抗体和HRP-cGMP进行cGMP分析。将40μL校准剂添加至涂有抗cGMP抗体的板的孔中，且将40μL待分析的溶解物添加至适当孔中。将40μL复原的兔抗cGMP抗体添加至孔中，且将板置于振荡器上五分钟以进行混合。将40μL复原的HRP-cGMP添加至各孔中且在室温下培育2小时。将板手动抽吸且用300μL洗涤缓冲液洗涤4×。将100μL信号灯红色底物添加至板的各孔中，覆盖且在室温下保持至少10分钟，避光。在Spectramax M或类似仪器上以530nm激发和590nm发射读取板的荧光强度。
图3展示添加外源性Pro-Gly-CNP37变体拯救NPR2+/-大鼠软骨肉瘤细胞模型的cGMP读数。先前的活化数据报道cGMP EC50在40至360nM范围内，用于活化PRKG2(Campbell等人,《ACS化学生物学(ACS Chem Biol)》12,2388-2398,2017)；Vaandrager等人,《生物化学杂志(J Biol Chem)》272,11816-23,1997)；Pohler等人,《欧洲生物化学协会联合会快报(FEBS Lett)》374,419-25,1995)。在异型接合NPR2基因敲除细胞中，>0.163nM的CNP剂量能够实现超出PRKG2活化cGMP的EC50范围的细胞内浓度(图1)。而在野生型细胞中，0.040nM的CNP剂量能够实现相同cGMP浓度。这些结果表明CNP补充可实现PRKG2活化和在具有NPR2功能损失型突变的细胞生长所需的cGMP水平。
这些结果还表明施用CNP变体适用于使患有NPR2活性降低的身材矮小的个体恢复骨生长。进一步预期用CNP变体治疗将对在cGMP信号传导可受损的其它生长板基因中具有突变的个体有益。
实例4：鉴别与身材矮小相关的突变
假设展示基因驱动的双向效应的明确证据的基因更可能代表可在广泛患者群体中有效调节的治疗标靶。为了鉴别为生长的核心调节因子的基因，分析了五个基因清单的交集，包含来自全基因体关联研究(GWAS)的基因清单。核心生长调节因子将最可能含有具有双向效应(即，身材矮小或骨骼发育不良和身材高大或过生长)的稀有编码突变。
查询的数据库包含：GWAS，提取了由使用约700,000个个体的大型GWAS身高综合分析报道的3,290个独立遗传变体中的每一个的2,067个非重复最近基因；HGMD，查询来自HGMD版本v2019_2的“allmut”表以寻找标记为“DM”的在相同基因中具有“矮小身材”和“高大身材或过生长”的所有致病变体；OMIM，先前描述了涉及生长障碍的OMIM基因的清单且使用以下关键词创建：身材矮小、过生长、骨骼发育不良、短指症。
第一，关于与矮小或高大身材相关的基因查询人类基因突变数据库(HGMD版本v2019_2)(Stenson等人,《人类遗传学(Hum Genet)》136:665-677,2017)。文献中报道了47种标注有至少一种致病变体的基因，其引起“身材矮小”。仅20种基因被标注为高大身材或过生长基因。第二，使用258个OMIM基因(248个矮小、20个高大)的手动策划清单，其使用以下关键词创建：身材矮小、过生长、骨骼发育不良、短指症(Wood等人,《自然遗传学(NatGenet)》46:1173-86,2014)。第三，将这些清单的交集与来自GWAS的基因清单相比。在这些清单的交集处，存在三种已知与身高相关的基因(IGF1R、NPPC、NPR2)，且鉴别两种额外基因(FGFR3、SHOX)。
额外分析使得产生一组新的五个核心基因，其展示显著降低的身高(β＝-0.20，95％CI[-0.26至-0.14]，p＝4.04×10-11)和显著提高的特发性身材矮小(ISS)风险(OR＝2.75，95％CI[1.92-3.96]。五个核心基因(FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2和SHOX)中的每一者在个别地考虑时与身高相关，且在与其它突变组合使用时也与身材矮小相关。FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2和SHOX的示例性突变陈述于图6中。
NPR2和IGF1R中的组合LoF(功能丧失)和误义变体也与ISS风险增加相关(分别为OR＝3.31，P＝0.001，OR＝2.85，P＝0.002)。已在具有不同严重程度的家族性身材矮小中报道SHOX、IGF1R、NPPC、NPR2中引起蛋白质功能丧失的整体基因缺失和/或突变。
分析展示五个核心基因中的任一者的变体携带者的ISS风险增加大约3倍，且占总ISS群体的6.7％。此外，表明添加外源性CNP之后，NPR2单倍剂量不足的细胞模型中NPR2信号传导的剂量依赖性拯救。
根据全基因模型(Liu等人,《细胞(Cell)》177:1022-1034e6(2019)；Boyle等人,《细胞》169:1177-1186(2017))，如果这些基因为核心人类生长基因，则其效应应通过驱动调节网路的多个较弱的常见遗传变体调节。为了间接测试此假设，使用针对身高的公布的最大GWAS综合分析计算身高的多基因风险评分(PRS)，所述综合分析不包含来自UKBiobank项目的任何样品。群体被分为五个相等大小的(n＝6,824)PRS五分位数(PRS 1为最矮身高，PRS 5为最高身高)。PRS评分增加与平均身高之间存在剂量依赖性关系(各PRS五分位数增加的β＝0.30)(图7A)。跨越五个不同PRS背景，五个核心基因中LoF变体的携带者始终比非携带者矮。参见图7。数据表明PRS和稀有蛋白质变体的组合效应与加性模型一致：多基因效应调节携带者和非携带者的身高。
使用PRS＝3作为参考来计算跨越PRS组的ISS风险。最低PRS组与ISS风险提高相关，且最高PRS组与风险降低相关(对于PRS 1和PRS 5分别为OR＝5.43，P＝8.58×10-34；OR＝0.22，P＝4.49×10-7)。评估五个核心基因的稀有编码变体对由PRS组分层的ISS的效应。在前三个五分位数中，五个核心基因中的任一者的携带者患ISS的风险增加(OR＝2.64，P＝3.09×10-5；OR＝2.17，P＝0.04；OR＝5.29，P＝1.58×10-5；OR＝2.72，P＝0.09，图7C-F)。对于每一个别核心基因的携带者，观测到由PRS分层的ISS风险的一致效应方向(图7C-F)。
另外，主要来自多个具有个别小效应的常见遗传变异的PRS的加性效应预测数据集中20.1％的身高差异。PRS的这些加性效应似乎对核心基因的稀有编码变异的携带者以及非携带者具有类似的量值。此观测结果指示PRS可为稀有致病变体的外显率差异的重要贡献者(尤其在单倍剂量不足的模型，如本文所述的模型中)。支持此想法，观测到八个具有低NPR2活性的NPR2变体携带者中的两个具有低-正常身高。此数据表明大部分具有NPR2突变的ISS个体还可具有多基因背景，使其更易受丧失NPR2活性的致病效应。
这些结果支持基于CNP的治疗可在NPR2单倍剂量不足患者群体中有效的观点。另外，展示普通人群的NPR2携带者中cGMP水准与身高的显著双向(LoF和GoF)相关性的结果表明用CNP类似物靶向此受体可为用于所有ISS个体的有效疗法。
实例5：CNP盐在体外的释放曲线
还进行疏水性CNP盐的释放分析。
简单来说，新鲜制备Pro-Gly-CNP37 Zn双羟萘酸盐和Pro-Gly-CNP37 Zn-油酸盐，且在制备当天置于溶解装置Pion microDiss中的15mL培养基中，叶轮以250RPM旋转，温度控制设定点37.4℃。每24小时持续4天，将容器内容物转移至VWR聚丙烯“Falcon”管，以4000×g快速离心30分钟，RP-UPLC样品经获取/冷冻，且将固体再悬浮于新鲜培养基(15mL)中。盐在RP-UPLC上运行以获得信号，且由与校准曲线比较获得浓度。通过比较制备盐所用的Pro-Gly-CNP37的释放质量与初始质量获得释放盐％。
图8A和图8B以CNP肽盐的总量的百分比形式展示CNP肽盐经7天的累积释放曲线。
使用以上方案运行另一释放曲线。将约16.6mg Pro-Gly-CNP37-乙酸盐(制备盐的起始物质)或Pro-Gly-CNP37 Zn-双羟萘酸盐置于各孔中。CNP盐经制备、冻干、密封且在使用之前储存于4℃下。对于CNP乙酸盐对照，容器1于1×PBS中，容器5于1×PBS+0.05％PS80中。每24小时持续7天，将容器内容物转移至VWR聚丙烯“Falcon”管，以4000×g快速离心30分钟，UPLC样品经获取/冷冻，且将固体再悬浮于新鲜培养基(15mL)中。CNP盐在RP-UPLC上运行以获得信号，且由与校准曲线比较获得浓度。7天内的累积释放曲线展示于图9A和图9B中。
Pro-Gly-CNP-37-多库酯和Pro-Gly-CNP-37-Zn-多库酯盐为新制的，或制备且冻干，且密封于玻璃小瓶中，随后用于在Pion中进行溶解。每24小时持续4天，将容器内容物转移至VWR聚丙烯“Falcon”管，以4000×g快速离心30分钟，样品经获取/冷冻，且将固体再悬浮于新鲜培养基(15mL)中。盐在LC-MS上运行以进行定量，且通过与置于溶解容器中的初始盐比较获得释放盐％。
图10A至图10C展示多库酯盐在4天(图10A)或7天(图10B和图10C)内的累积释放曲线。
实例6：CNP盐在体内的释放曲线
接着针对皮下注射CNP盐之后7天内大鼠的体内释放曲线来分析样品盐CNP-双羟萘酸盐的释放曲线。
图11展示Pro-Gly-CNP37经7天自盐向血浆的释放曲线。盐的释放观测为24小时内的初始爆发，以及随时间推移释放一些盐。
本文中的任何单个实施例可补充有来自本文中的任何一个或多个其它实施例的一个或多个要素。
因此，应理解，本发明不限于公开的特定实施例，而是意图涵盖所有修改，所述修改在由所附权利要求书、以上说明书、以下编号段落所定义和/或随附图式中所示的本发明的精神和范畴内。
实施例的实例：
段落1.一种包括带静电肽盐的组合物，所述盐包括与疏水性相对离子络合的带静电肽。
段落2.根据段落1所述的组合物，其中所述疏水性相对离子经由非共价键络合。
段落3.根据段落1所述的组合物，其中所述疏水性相对离子经由可裂解连接子与带静电肽络合。
段落4.根据段落1至3中任一项所述的组合物，其中所述盐进一步包括与肽-相对离子络合物络合的阳离子。
段落5.根据段落4所述的组合物，其中所述带静电肽、疏水性相对离子和阳离子经由非共价键络合。
段落6.根据段落4或5所述的组合物，其中阳离子具有+2、+3或+4的电荷。
段落7.根据段落4至6中任一项所述的组合物，其中阳离子为金属阳离子。
段落8.根据段落4至7中任一项所述的组合物，其中阳离子选自由以下组成的组：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)、铂(Pt)、铜(Cu)和金(Au)。在一个替代实施例中，提供根据段落4至7中任一项所述的组合物，其中阳离子选自由以下组成的组：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)和金(Au)。
段落9.根据段落1至8中任一项所述的组合物，其中疏水性相对离子具有约0至约10的cLogP，或约-2至约5的pKa，或两者。
段落10.根据段落1至9中任一项所述的组合物，其中疏水性相对离子具有约2至约9的cLogP，和小于约5的pKa。
段落11.根据段落1至10中任一项所述的组合物，其中疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸、癸酸钠、2-萘磺酸钠、1-庚磺酸钠、1-辛磺酸钠单水合物、1-癸磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠。在一个替代实施例中，提供根据段落1至10中任一项所述的组合物，其中疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、脱氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)磷脂酸、癸酸钠、2-萘磺酸钠、1-庚磺酸盐钠1-辛磺酸钠单水合物、1-癸磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠和离子表面活性剂。
段落12.根据段落1至11中任一项所述的组合物，其中肽盐呈固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式。
段落13.根据段落1至12中任一项所述的组合物，其中带静电肽为C型利钠肽(CNP)。
段落14.根据段落13所述的组合物，其中CNP为CNP变体。
段落15.根据段落13或14所述的组合物，其中CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)和其药物盐。
段落16.根据段落15所述的组合物，其中CNP为CNP-乙酸盐。
段落17.根据段落13至16中任一项所述的组合物，其中疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。
段落18.根据段落13至17中任一项所述的组合物，其中如果存在阳离子，则所述阳离子为锌或钙。
段落19.根据段落1至18中任一项所述的组合物，其进一步包括赋形剂、稀释剂或载剂。
段落20.根据段落19所述的组合物，其中赋形剂、稀释剂或载剂为药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
段落21.一种无菌药物组合物，其包括根据段落1至20中任一项所述的组合物。
段落22.一种包括带静电肽盐的延释组合物，所述盐包括与疏水性相对离子络合的带静电肽。
段落23.根据段落22所述的延释组合物，其中疏水性相对离子经由非共价键络合。
段落24.根据段落23所述的延释组合物，其中疏水性相对离子经由可裂解连接子与带静电肽络合。
段落25.根据段落22至24中任一项所述的延释组合物，其中所述盐进一步包括与肽-相对离子络合物络合的阳离子。
段落26.根据段落25所述的延释组合物，其中所述带静电肽、疏水性相对离子和阳离子经由非共价键络合。
段落27.根据段落26所述的延释组合物，其中阳离子具有+2、+3或+4的电荷。
段落28.根据段落25至27中任一项所述的延释组合物，其中阳离子为金属阳离子。
段落29.根据段落25至28中任一项所述的延释组合物，其中阳离子选自由以下组成的组：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)、铂(Pt)、铜(Cu)和金(Au)。
段落30.根据段落22至29中任一项所述的延释组合物，其中疏水性相对离子具有约0至约10的cLogP，或约-2至约5的pKa，或两者。
段落31.根据段落22至30中任一项所述的延释组合物，其中疏水性相对离子具有约2至约9的cLogP，和小于约5的pKa。
段落32.根据段落22至31中任一项所述的延释组合物，其中疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸盐、癸酸盐、2-萘磺酸盐、1-庚磺酸盐、1-辛磺酸盐单水合物、1-癸磺酸盐、十二烷基硫酸盐、硫酸葡聚糖和十二烷基苯磺酸盐。
段落33.根据段落22至32中任一项所述的延释组合物，其中CNP盐呈固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式。
段落34.根据段落22至33中任一项所述的延释组合物，其中带静电肽为C型利钠肽(CNP)。
段落35.根据段落34所述的延释组合物其中CNP为CNP变体。
段落36.根据段落34或35所述的组合物，其中CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)；
和其药物盐。
段落37.根据段落36所述的延释组合物，其中CNP为CNP-乙酸盐。
段落38.根据段落34至37中任一项所述的延释组合物，其中疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。
段落39.根据段落34至38中任一项所述的延释组合物，其中如果存在阳离子，则所述阳离子为锌或钙。
段落40.根据段落33至39中任一项所述的延释组合物，其中肽盐固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子再悬浮于水溶液或油中。
段落41.根据段落40所述的延释组合物，其中水溶液为水、盐水或缓冲液。
段落42.根据段落40所述的延释组合物，其中油包括三酸甘油酯或脂肪酸。
段落43.根据段落42所述的延释组合物，其中脂肪酸为饱和或不饱和的。
段落44.根据段落42或43所述的延释组合物，其中脂肪酸为C-6至C-20脂肪酸。
段落45.根据段落42至44中任一项所述的延释组合物，其中脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸或十二酸。
段落46.根据段落22至45中任一项所述的延释组合物，其中在pH 7至7.6下，(i)第1天释放小于20％的肽；和
ii)到第7天释放约90％的肽，或到第14天释放约90％的肽，或到第31天释放约90％的肽。
段落47.根据段落22至46中任一项所述的延释组合物，其中在pH 7至7.6下，第1天释放约小于20％的肽。
段落48.根据段落22至47中任一项所述的延释组合物，其中在pH 7至7.6下，到第7天释放约90％的肽。
段落49.根据段落22至47中任一项所述的延释组合物，其中在pH 7至7.6下，到第30天释放约90％的肽。
段落50.根据段落22至49中任一项所述的延释组合物，其进一步包括赋形剂、稀释剂或载剂。
段落51.根据段落50所述的延释组合物，其中赋形剂、赋形剂、稀释剂或载剂为药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
段落52.一种无菌药物组合物，其包括根据段落22至51中任一项所述的延释组合物。
段落53.一种制备包括带静电肽盐的组合物的方法，其包括
a)使水溶液中的带静电肽与溶液中的疏水性相对离子接触；
b)以足以使肽和相对离子形成络合物的方式混合带静电肽溶液与疏水性相对离子溶液，其中肽-相对离子络合物的形成引起包括肽盐的固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式的形成。
段落54.根据段落53所述的方法，其任选地包括在步骤(b)之前，使溶液中的带静电肽与水溶液中的多价阳离子接触，从而形成肽-阳离子络合物。
段落55.根据段落53或54所述的方法，其进一步包括步骤(c)在缓冲液或水中洗涤所述肽盐。
段落56.根据段落55所述的方法，其进一步包括步骤(d)通过离心形成肽盐离心块而获得肽盐。
段落57.根据段落56所述的方法，其进一步包括步骤(e)从肽盐离心块去除水。
段落58.根据段落57所述的方法，其进一步包括将离心块再悬浮于水溶液或油中。
段落59.根据段落53至58中任一项所述的方法，其中肽:疏水性相对离子比为1:1至1:20。
段落60.根据段落54至59中任一项所述的方法，其中肽:阳离子比为1:1至1:10。
段落61.根据段落53至60中任一项所述的方法，其中疏水性相对离子经由非共价键或络合。
段落62.根据段落61所述的组合物，其中所述疏水性相对离子经由可裂解连接子与带静电肽络合。
段落63.根据段落54至62中任一项所述的方法，其中如果盐进一步包括与肽-相对离子络合物络合的阳离子，则阳离子经由共价或非共价键或其混合物络合。
段落64.根据段落63所述的方法，其中阳离子经由非共价键与肽-疏水性相对离子络合物络合。
段落65.根据段落63或64所述的组合物，其中所述带静电肽、疏水性相对离子和阳离子经由非共价键络合。
段落66.根据段落54至65中任一项所述的方法，其中阳离子具有+2、+3或+4的电荷。
段落67.根据段落54至66中任一项所述的方法，其中阳离子为金属阳离子。
段落68.根据段落54至67中任一项所述的方法，其中阳离子选自由以下组成的组：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)和金(Au)。进一步涵盖根据段落54至67中任一项所述的方法，其中阳离子选自由以下组成的组：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)、铂(Pt)、铜(Cu)和金(Au)。
段落69.根据段落46至58中任一项所述的方法，其中疏水性相对离子具有约0至约10的cLogP，或约-2至约5的pKa，或两者。
段落70.根据段落53至69中任一项所述的方法，其中疏水性相对离子具有约2至约9的cLogP，和小于约5的pKa。
段落71.根据段落53至70中任一项所述的方法，其中疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)和磷脂酸。
段落72.根据段落53至71中任一项所述的方法，其中带静电肽为C型利钠肽(CNP)。
段落73.根据段落72所述的方法，其中CNP为CNP变体。
段落74.根据段落72或73所述的方法，其中CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)；
和其盐。
段落75.根据段落74所述的方法，其中CNP为CNP-乙酸盐。
段落76.根据段落72至75中任一项所述的方法，其中疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。
段落77.根据段落72至76中任一项所述的方法，其中如果存在阳离子，则所述阳离子为锌或钙。
段落78.一种治疗有需要的个体的骨相关病症或骨骼发育不良的方法，其包括向所述个体施用包括根据段落1至52中任一项所述的C型利钠肽(CNP)的疏水性盐的组合物。
段落79.根据段落78所述的方法，其中骨相关病症或骨骼发育不良选自由以下组成的组：骨关节炎、低磷酸盐血性佝偻病、软骨发育不全、软骨生成减退、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性发育不良、成骨不全、软骨成长不全、点状软骨发育异常、纯合性软骨发育不全、点状软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酶症、围产期致死型成骨不全、短肋多指综合征、软骨生成减退、肢根型点状软骨发育异常、扬森型干骺端发育不良、先天性脊椎骨骺发育不良、骨发育不全、畸型发育不良、先天性短股骨、兰格型肢中骨发育不良、尼维格型肢中骨发育不良、罗氏综合征、莱因哈特综合征、肢端发育不全、周围骨发育障碍、克尼斯特发育不良、纤维软骨增生症、罗伯茨综合征、肢端肢中发育不全、小肢、莫奎氏综合征、克尼斯特综合征、后生营养性发育不良和脊椎骨骺干骺端发育不良、NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱里维尔)、PTPN11突变(努南氏综合征)、胰岛素生长因子1受体(IGF1R)突变和特发性身材矮小。
段落80.一种在有需要的个体中进行骨延长或增加长骨生长的方法，其包括向所述个体施用根据段落1至52中任一项所述的包括C型利钠肽(CNP)的盐的延释组合物，且其中所述施用使骨延长或增加长骨生长。
段落81.根据段落78至80中任一项所述的方法，其中CNP为CNP变体。
段落82.根据段落78至81中任一项所述的方法，其中CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)；
和其盐。
段落83.根据段落83所述的方法，其中CNP为CNP乙酸盐。
段落84.根据段落78至83中任一项所述的方法，其中组合物经皮下、皮内、关节内、经口或肌肉内施用。
段落85.根据段落78至84中任一项所述的方法，其中组合物每日一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每4周一次、每6周一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次地施用。
段落86.根据段落78至85中任一项所述的方法，其中组合物为延释组合物。
段落87.一种C型利钠肽的盐，其包括与疏水性相对离子络合的CNP肽。
段落88.根据段落87所述的盐，其中所述疏水性相对离子经由非共价键络合。
段落89.根据段落87或88所述的盐，其中疏水性相对离子具有约2至约9的cLogP，或小于约5的pKa，或两者。
段落90.根据段落87至89中任一项所述的盐，其中疏水性相对离子具有约2至约9的cLogP，和小于约5的pKa。
段落91.根据段落87至90中任一项所述的盐，其中疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)和磷脂酸。
段落92.根据段落87至91中任一项所述的盐，其进一步包括与肽和相对离子络合的阳离子。
段落93.根据段落92所述的盐，其中阳离子经由非共价键络合。
段落94.根据段落92或93所述的盐，其中阳离子具有+2、+3或+4的电荷。
段落95.根据段落92至94中任一项所述的盐，其中阳离子为金属阳离子。
段落96.根据段落92至95中任一项所述的盐，其中阳离子选自由以下组成的组：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)和金(Au)。进一步涵盖根据段落92至95中任一项所述的盐，其中阳离子选自由以下组成的组：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)、铂(Pt)、铜(Cu)和金(Au)。
段落97.根据段落87至96中任一项所述的盐，其中CNP盐呈固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式。
段落98.根据段落87至97中任一项所述的盐，其中CNP为CNP变体。
段落99.根据段落87至98中任一项所述的盐，其中CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)；和其药物盐。
段落100.根据段落99所述的盐，其中CNP为CNP-乙酸盐。
段落101.根据段落87至100中任一项所述的盐，其中疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。
段落102.根据段落87至101中任一项所述的盐，其中如果存在阳离子，则所述阳离子为锌或钙。
段落103.根据段落87至102中任一项所述的盐，其为纯化的。
段落104.一种包括根据段落1至52或87至103中任一项所述的疏水性盐的组合物，其用于治疗骨相关病症或骨骼发育不良，或用于骨延长或增加长骨生长。
段落105.一种包括根据段落1至52或87至103中任一项所述的疏水性盐的组合物的用途，其用于制备供治疗骨相关病症或骨骼发育不良，或供骨延长或增加长骨生长用的药剂。
段落106.根据段落104或105所述的组合物或用途，其中所述组合物为延释组合物。
序列表
<110> Biomarin Pharmaceutical Inc.
<120> 用于延释组合物的疏水性肽盐
<130> 30610/54627
<150> US 62/885,705
<151> 2019-08-12
<150> US 62/935,052
<151> 2019-11-13
<150> US 62/963,354
<151> 2020-01-20
<150> US 62/964,848
<151> 2020-01-23
<150> US 62/038,652
<151> 2020-06-12
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
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<211> 38
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
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Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20 25 30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly
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Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20 25 30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Gly Cys
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<223> 合成多肽
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Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
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Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
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Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln
1 5 10 15
Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu
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Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
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Gly Leu Gly Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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50
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His
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Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys
20 25 30
Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu
35 40 45
Gly Cys
50
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro
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Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly
20 25 30
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
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Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala
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Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe
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Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<220>
<223> 合成多肽
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Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg
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Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys
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Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu
20 25 30
Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr
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Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys
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Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys
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Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
20 25 30
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly
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Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp
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Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<211> 41
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala
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Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg
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Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn
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Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
20 25 30
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys
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Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
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<220>
<223> 合成多肽
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Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu
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Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
20 25 30
Gly Leu Gly Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser
1 5 10 15
Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly
20 25 30
Leu Gly Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly
1 5 10 15
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
20 25 30
Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys
1 5 10 15
Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20 25 30
<210> 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe
1 5 10 15
Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20 25 30
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly
1 5 10 15
Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20 25 30
<210> 35
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu
1 5 10 15
Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20 25
<210> 36
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys
1 5 10 15
Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20 25
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<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1 5 10 15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20 25
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20 25
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg
1 5 10 15
Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20 25
<210> 40
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
1 5 10 15
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210> 41
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
1 5 10 15
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<211> 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Ser Gly Leu Gly Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
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1 5 10 15
Gly Leu Gly Cys
20
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
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1 5 10 15
Leu Gly Cys
<210> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu
1 5 10 15
Gly Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
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Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Met Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
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Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
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Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
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Met Ser Gly Leu Gly Cys
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<400> 52
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Pro Lys
1 5 10 15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20 25 30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210> 53
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 53
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Gln Lys
1 5 10 15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20 25 30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210> 54
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 54
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Gln Gln
1 5 10 15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20 25 30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210> 55
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Pro
1 5 10 15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20 25 30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210> 56
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu
1 5 10 15
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly
20 25 30
Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
35 40 45
Ser Gly Leu Gly Cys
50
<210> 57
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 57
atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60
ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120
gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180
cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240
ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300
tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360
actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420
cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480
aattggactg ctcgggctgc tttgctgtat ctggatgctc gcacagatga ccggccccac 540
tacttcacca tcgagggggt gtttgaggcc ctgcagggca gcaacctcag tgtgcaacac 600
caggtgtata cccgagagcc aggtggccct gagcaagcca cccacttcat cagagccaac 660
gggcgca 667
<210> 58
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 58
atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60
ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120
gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180
cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240
ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300
tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360
actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420
cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480
aattggactg ctcgggctgc tttgctgtat ctggatgctc gcacagatga ccggccccac 540
tacttcacca tcgagggggt gtttgaggcc ctgcagggca gcaacctcag tgtgcaacac 600
caggtgtata cccgagagcc aggtggccct gagcaagcca cccacttcat cagagccaac 660
gggcgca 667
<210> 59
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 59
atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60
ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120
gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180
cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240
ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300
tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360
actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420
cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480
acaattggac tgctcgggct gctttgctgt atctggatgc tcgcacagat gaccggcccc 540
actacttcac catcgagggg gtgtttgagg ccctgcaggg cagcaacctc agtgtgcaac 600
accaggtgta tacccgagag ccaggtggcc ctgagcaagc cacccacttc atcagagcca 660
acgggcgca 669
<210> 60
<211> 668
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 60
atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60
ggggcacgga acctgacgct ggcggtggtg ctgccagaac acaacctgag ctatgcctgg 120
gcctggccac gggtgggtcc tgctgtggca ctggctgtgg aggcgctggg ccgggcactg 180
cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240
ccactgcgcg ctgtggatct caagctgtac catgaccccg accttctgtt gggccctggt 300
tgtgtgtacc ctgctgcctc tgtggctcgc tttgcctcgc actggcacct tcccctcctg 360
actgcgggtg cagtggcctc tggctttgca gctaagaatg agcattatcg taccctggtt 420
cgcactggcc cctctgcgcc caagctgggt gagttcgtag tgacattaca cgggcacttc 480
aattggactg ctcgggctgc tttgctgtat ctggatgctc gcacagatga ccggccccac 540
tacttcacca tccgaggggg tgtttgaggc cctgcagggc agcaacctca gtgtgcaaca 600
ccaggtgtat acccgagagc caggtggccc tgagcaagcc acccacttca tcagagccaa 660
cgggcgca 668
<210> 61
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 61
atggcactgc catccctgct actggtggtg gcagccctgg caggtggggt gcgtcctccg 60
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cccgtggacc tgcggtttgt cagctccgaa ctagacggcg cctgctctga gtacctggca 240
ccggggtgtt tgaggccctg cagggcagca acctcagtgt gcaacaccag gtgtataccc 300
gagagccagg tggccctgag caagccaccc acttcatcag agccaacggg cgca 354
<210> 62
<211> 1047
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 62
Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro
20 25 30
Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala
35 40 45
Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu
50 55 60
Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala
65 70 75 80
Pro Leu Arg Ala Val Asp Leu Lys Leu Tyr His Asp Pro Asp Leu Leu
85 90 95
Leu Gly Pro Gly Cys Val Tyr Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Ala
100 105 110
Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly
115 120 125
Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro
130 135 140
Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu Phe Val Val Thr Leu His Gly His Phe
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ala Arg Ala Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Thr Asp
165 170 175
Asp Arg Pro His Tyr Phe Thr Ile Glu Gly Val Phe Glu Ala Leu Gln
180 185 190
Gly Ser Asn Leu Ser Val Gln His Gln Val Tyr Thr Arg Glu Pro Gly
195 200 205
Gly Pro Glu Gln Ala Thr His Phe Ile Arg Ala Asn Gly Arg Ile Val
210 215 220
Tyr Ile Cys Gly Pro Leu Glu Met Leu His Glu Ile Leu Leu Gln Ala
225 230 235 240
Gln Arg Glu Asn Leu Thr Asn Gly Asp Tyr Val Phe Phe Tyr Leu Asp
245 250 255
Val Phe Gly Glu Ser Leu Arg Ala Gly Pro Thr Arg Ala Thr Gly Arg
260 265 270
Pro Trp Gln Asp Asn Arg Thr Gln Glu Gln Ala Gln Ala Leu Arg Glu
275 280 285
Ala Phe Gln Thr Val Leu Val Ile Thr Tyr Arg Glu Pro Pro Asn Pro
290 295 300
Glu Tyr Gln Glu Phe Gln Asn Arg Leu Leu Ile Arg Ala Arg Glu Asp
305 310 315 320
Phe Gly Val Glu Leu Ala Pro Ser Leu Met Asn Leu Ile Ala Gly Cys
325 330 335
Phe Tyr Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Gln Val Leu Asn Glu Thr Ile
340 345 350
Gln Glu Gly Gly Thr Arg Glu Asp Gly Leu Arg Ile Val Glu Lys Met
355 360 365
Gln Gly Arg Arg Tyr His Gly Val Thr Gly Leu Val Val Met Asp Lys
370 375 380
Asn Asn Asp Arg Glu Thr Asp Phe Val Leu Trp Ala Met Gly Asp Leu
385 390 395 400
Glu Ser Gly Asp Phe Gln Pro Ala Ala His Tyr Ser Gly Ala Glu Lys
405 410 415
Gln Ile Trp Trp Thr Gly Arg Pro Ile Pro Trp Val Lys Gly Ala Pro
420 425 430
Pro Leu Asp Asn Pro Pro Cys Ala Phe Asp Leu Asp Asp Pro Ser Cys
435 440 445
Asp Lys Thr Pro Leu Ser Thr Leu Ala Ile Val Ala Leu Gly Thr Gly
450 455 460
Ile Thr Phe Ile Met Phe Gly Val Ser Ser Phe Leu Ile Phe Arg Lys
465 470 475 480
Leu Met Leu Glu Lys Glu Leu Ala Ser Met Leu Trp Arg Ile Arg Trp
485 490 495
Glu Glu Leu Gln Phe Gly Asn Ser Asp Arg Tyr His Lys Gly Ala Gly
500 505 510
Ser Arg Leu Thr Leu Ser Leu Arg Gly Ser Ser Tyr Gly Ser Leu Met
515 520 525
Thr Ala His Gly Lys Tyr Gln Ile Phe Ala Asn Thr Gly His Phe Lys
530 535 540
Gly Asn Val Val Ala Ile Lys His Val Asn Lys Lys Arg Ile Glu Leu
545 550 555 560
Thr Arg Gln Val Leu Phe Glu Leu Lys His Met Arg Asp Val Gln Phe
565 570 575
Asn His Leu Thr Arg Phe Ile Gly Ala Cys Ile Asp Pro Pro Asn Ile
580 585 590
Cys Ile Val Thr Glu Tyr Cys Pro Arg Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu
595 600 605
Glu Asn Asp Ser Ile Asn Leu Asp Trp Met Phe Arg Tyr Ser Leu Ile
610 615 620
Asn Asp Leu Val Lys Gly Met Ala Phe Leu His Asn Ser Ile Ile Ser
625 630 635 640
Ser His Gly Ser Leu Lys Ser Ser Asn Cys Val Val Asp Ser Arg Phe
645 650 655
Val Leu Lys Ile Thr Asp Tyr Gly Leu Ala Ser Phe Arg Ser Thr Ala
660 665 670
Glu Pro Asp Asp Ser His Ala Leu Tyr Ala Lys Lys Leu Trp Thr Ala
675 680 685
Pro Glu Leu Leu Ser Gly Asn Pro Leu Pro Thr Thr Gly Met Gln Lys
690 695 700
Ala Asp Val Tyr Ser Phe Ala Ile Ile Leu Gln Glu Ile Ala Leu Arg
705 710 715 720
Ser Gly Pro Phe Tyr Leu Glu Gly Leu Asp Leu Ser Pro Lys Glu Ile
725 730 735
Val Gln Lys Val Arg Asn Gly Gln Arg Pro Tyr Phe Arg Pro Ser Ile
740 745 750
Asp Arg Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Val Leu Leu Met Glu Arg Cys
755 760 765
Trp Ala Gln Asp Pro Thr Glu Arg Pro Asp Phe Gly Gln Ile Lys Gly
770 775 780
Phe Ile Arg Arg Phe Asn Lys Glu Gly Gly Thr Ser Ile Leu Asp Asn
785 790 795 800
Leu Leu Leu Arg Met Glu Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Glu Lys Leu Val
805 810 815
Glu Glu Arg Thr Gln Ala Tyr Leu Glu Glu Lys Arg Lys Ala Glu Ala
820 825 830
Leu Leu Tyr Gln Ile Leu Pro His Ser Val Ala Glu Gln Leu Lys Arg
835 840 845
Gly Glu Thr Val Gln Ala Glu Ala Phe Asp Ser Val Thr Ile Tyr Phe
850 855 860
Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Ala Leu Ser Ala Glu Ser Thr Pro Met
865 870 875 880
Gln Val Val Thr Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Thr Cys Phe Asp Ala Ile
885 890 895
Ile Asp Asn Phe Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr
900 905 910
Met Val Val Ser Gly Leu Pro Gly Arg Asn Gly Gln Arg His Ala Pro
915 920 925
Glu Ile Ala Arg Met Ala Leu Ala Leu Leu Asp Ala Val Ser Ser Phe
930 935 940
Arg Ile Arg His Arg Pro His Asp Gln Leu Arg Leu Arg Ile Gly Val
945 950 955 960
His Thr Gly Pro Val Cys Ala Gly Val Val Gly Leu Lys Met Pro Arg
965 970 975
Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser
980 985 990
Asn Gly Gln Ala Leu Lys Ile His Val Ser Ser Thr Thr Lys Asp Ala
995 1000 1005
Leu Asp Glu Leu Gly Cys Phe Gln Leu Glu Leu Arg Gly Asp Val
1010 1015 1020
Glu Met Lys Gly Lys Gly Lys Met Arg Thr Tyr Trp Leu Leu Gly
1025 1030 1035
Glu Arg Lys Gly Pro Pro Gly Leu Leu
1040 1045
<210> 63
<211> 1047
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro
20 25 30
Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala
35 40 45
Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu
50 55 60
Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala
65 70 75 80
Pro Leu Arg Ala Val Asp Leu Lys Leu Tyr His Asp Pro Asp Leu Leu
85 90 95
Leu Gly Pro Gly Cys Val Tyr Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Ala
100 105 110
Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly
115 120 125
Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro
130 135 140
Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu Phe Val Val Thr Leu His Gly His Phe
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ala Arg Ala Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Thr Asp
165 170 175
Asp Arg Pro His Tyr Phe Thr Ile Glu Gly Val Phe Glu Ala Leu Gln
180 185 190
Gly Ser Asn Leu Ser Val Gln His Gln Val Tyr Thr Arg Glu Pro Gly
195 200 205
Gly Pro Glu Gln Ala Thr His Phe Ile Arg Ala Asn Gly Arg Ile Val
210 215 220
Tyr Ile Cys Gly Pro Leu Glu Met Leu His Glu Ile Leu Leu Gln Ala
225 230 235 240
Gln Arg Glu Asn Leu Thr Asn Gly Asp Tyr Val Phe Phe Tyr Leu Asp
245 250 255
Val Phe Gly Glu Ser Leu Arg Ala Gly Pro Thr Arg Ala Thr Gly Arg
260 265 270
Pro Trp Gln Asp Asn Arg Thr Gln Glu Gln Ala Gln Ala Leu Arg Glu
275 280 285
Ala Phe Gln Thr Val Leu Val Ile Thr Tyr Arg Glu Pro Pro Asn Pro
290 295 300
Glu Tyr Gln Glu Phe Gln Asn Arg Leu Leu Ile Arg Ala Arg Glu Asp
305 310 315 320
Phe Gly Val Glu Leu Ala Pro Ser Leu Met Asn Leu Ile Ala Gly Cys
325 330 335
Phe Tyr Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Gln Val Leu Asn Glu Thr Ile
340 345 350
Gln Glu Gly Gly Thr Arg Glu Asp Gly Leu Arg Ile Val Glu Lys Met
355 360 365
Gln Gly Arg Arg Tyr His Gly Val Thr Gly Leu Val Val Met Asp Lys
370 375 380
Asn Asn Asp Arg Glu Thr Asp Phe Val Leu Trp Ala Met Gly Asp Leu
385 390 395 400
Glu Ser Gly Asp Phe Gln Pro Ala Ala His Tyr Ser Gly Ala Glu Lys
405 410 415
Gln Ile Trp Trp Thr Gly Arg Pro Ile Pro Trp Val Lys Gly Ala Pro
420 425 430
Pro Leu Asp Asn Pro Pro Cys Ala Phe Asp Leu Asp Asp Pro Ser Cys
435 440 445
Asp Lys Thr Pro Leu Ser Thr Leu Ala Ile Val Ala Leu Gly Thr Gly
450 455 460
Ile Thr Phe Ile Met Phe Gly Val Ser Ser Phe Leu Ile Phe Arg Lys
465 470 475 480
Leu Met Leu Glu Lys Glu Leu Ala Ser Met Leu Trp Arg Ile Arg Trp
485 490 495
Glu Glu Leu Gln Phe Gly Asn Ser Asp Arg Tyr His Lys Gly Ala Gly
500 505 510
Ser Arg Leu Thr Leu Ser Leu Arg Gly Ser Ser Tyr Gly Ser Leu Met
515 520 525
Thr Ala His Gly Lys Tyr Gln Ile Phe Ala Asn Thr Gly His Phe Lys
530 535 540
Gly Asn Val Val Ala Ile Lys His Val Asn Lys Lys Arg Ile Glu Leu
545 550 555 560
Thr Arg Gln Val Leu Phe Glu Leu Lys His Met Arg Asp Val Gln Phe
565 570 575
Asn His Leu Thr Arg Phe Ile Gly Ala Cys Ile Asp Pro Pro Asn Ile
580 585 590
Cys Ile Val Thr Glu Tyr Cys Pro Arg Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu
595 600 605
Glu Asn Asp Ser Ile Asn Leu Asp Trp Met Phe Arg Tyr Ser Leu Ile
610 615 620
Asn Asp Leu Val Lys Gly Met Ala Phe Leu His Asn Ser Ile Ile Ser
625 630 635 640
Ser His Gly Ser Leu Lys Ser Ser Asn Cys Val Val Asp Ser Arg Phe
645 650 655
Val Leu Lys Ile Thr Asp Tyr Gly Leu Ala Ser Phe Arg Ser Thr Ala
660 665 670
Glu Pro Asp Asp Ser His Ala Leu Tyr Ala Lys Lys Leu Trp Thr Ala
675 680 685
Pro Glu Leu Leu Ser Gly Asn Pro Leu Pro Thr Thr Gly Met Gln Lys
690 695 700
Ala Asp Val Tyr Ser Phe Ala Ile Ile Leu Gln Glu Ile Ala Leu Arg
705 710 715 720
Ser Gly Pro Phe Tyr Leu Glu Gly Leu Asp Leu Ser Pro Lys Glu Ile
725 730 735
Val Gln Lys Val Arg Asn Gly Gln Arg Pro Tyr Phe Arg Pro Ser Ile
740 745 750
Asp Arg Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Val Leu Leu Met Glu Arg Cys
755 760 765
Trp Ala Gln Asp Pro Thr Glu Arg Pro Asp Phe Gly Gln Ile Lys Gly
770 775 780
Phe Ile Arg Arg Phe Asn Lys Glu Gly Gly Thr Ser Ile Leu Asp Asn
785 790 795 800
Leu Leu Leu Arg Met Glu Gln Tyr Ala Asn Asn Leu Glu Lys Leu Val
805 810 815
Glu Glu Arg Thr Gln Ala Tyr Leu Glu Glu Lys Arg Lys Ala Glu Ala
820 825 830
Leu Leu Tyr Gln Ile Leu Pro His Ser Val Ala Glu Gln Leu Lys Arg
835 840 845
Gly Glu Thr Val Gln Ala Glu Ala Phe Asp Ser Val Thr Ile Tyr Phe
850 855 860
Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Ala Leu Ser Ala Glu Ser Thr Pro Met
865 870 875 880
Gln Val Val Thr Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Thr Cys Phe Asp Ala Ile
885 890 895
Ile Asp Asn Phe Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr
900 905 910
Met Val Val Ser Gly Leu Pro Gly Arg Asn Gly Gln Arg His Ala Pro
915 920 925
Glu Ile Ala Arg Met Ala Leu Ala Leu Leu Asp Ala Val Ser Ser Phe
930 935 940
Arg Ile Arg His Arg Pro His Asp Gln Leu Arg Leu Arg Ile Gly Val
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
Asn Gly Gln Ala Leu Lys Ile His Val Ser Ser Thr Thr Lys Asp Ala
995 1000 1005
Leu Asp Glu Leu Gly Cys Phe Gln Leu Glu Leu Arg Gly Asp Val
1010 1015 1020
Glu Met Lys Gly Lys Gly Lys Met Arg Thr Tyr Trp Leu Leu Gly
1025 1030 1035
Glu Arg Lys Gly Pro Pro Gly Leu Leu
1040 1045
<210> 64
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 64
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Pro Arg Gly Arg Thr
245
<210> 65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 65
Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
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100 105 110
Ser His Trp His Leu Pro Leu Leu Thr Ala Gly Ala Val Ala Ser Gly
115 120 125
Phe Ala Ala Lys Asn Glu His Tyr Arg Thr Leu Val Arg Thr Gly Pro
130 135 140
Ser Ala Pro Lys Leu Gly Glu Phe Val Val Thr Leu His Gly His Phe
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ala Arg Ala Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Thr Asp
165 170 175
Asp Arg Pro His Tyr Phe Thr Ile Arg Gly Gly Val
180 185
<210> 66
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 66
Met Ala Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Val Arg Pro Pro Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Leu Pro
20 25 30
Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Trp Ala Trp Pro Arg Val Gly Pro Ala
35 40 45
Val Ala Leu Ala Val Glu Ala Leu Gly Arg Ala Leu Pro Val Asp Leu
50 55 60
Arg Phe Val Ser Ser Glu Leu Asp Gly Ala Cys Ser Glu Tyr Leu Ala
65 70 75 80
Pro Gly Cys Leu Arg Pro Cys Arg Ala Ala Thr Ser Val Cys Asn Thr
85 90 95
Arg Cys Ile Pro Glu Ser Gln Val Ala Leu Ser Lys Pro Pro Thr Ser
100 105 110
Ser Glu Pro Thr Gly Ala Leu Cys Ile Ser Ala Ala Arg Trp Arg Cys
115 120 125
Phe Met Arg Ser Cys Phe Arg Pro Arg Gly Arg Thr
130 135 140
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 67
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
1 5 10 15
Cys
<210> 68
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
1 5 10 15
Met Ser Gly Leu Gly Cys
20

Claims (54)

1.一种包括C型利钠肽(CNP)的疏水性盐的组合物，所述盐包括与疏水性相对离子络合的所述CNP。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述盐进一步包括与肽-相对离子络合物络合的多价阳离子。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述CNP、疏水性相对离子和阳离子经由非共价键络合。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述阳离子具有+2、+3或+4的电荷。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的组合物，其中所述阳离子为金属阳离子。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的组合物，其中所述阳离子包括选自由以下组成的组的金属：铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)、锌(Zn)、镉(Cd)、硼(B)、铝(Al)、镓(Ga)、铟(In)、铊(Tl)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、钛(Ti)、钒(V)、铂(Pt)、铜(Cu)和金(Au)。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中所述阳离子包括锌或钙。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述疏水性相对离子具有约0至约10的cLogP，或其共轭酸具有约-2至约5的pKa，或两者。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述疏水性相对离子具有约2至约9的cLogP，且其共轭酸具有小于约5的pKa。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述疏水性相对离子选自由以下组成的组：去质子化脂肪酸、去质子化胆酸、离子型表面活性剂、萘甲酸盐和其衍生物、烟酸盐和其衍生物、烷基磺酸盐、二烷基磺基丁二酸盐、磷脂、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基硫酸盐、硫酸葡聚糖、烷基苯硫酸盐、和前述任一种的组合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述疏水性相对离子选自由以下组成的组：棕榈酸盐、去氧胆酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、烟酸盐、十二烷基硫酸盐、多库酯、豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PL)、磷脂酸盐、癸酸盐、2-萘磺酸盐、1-庚磺酸盐、1-辛磺酸盐单水合物、1-癸磺酸盐、十二烷基硫酸盐、硫酸葡聚糖和十二烷基苯磺酸盐。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述肽盐呈固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述CNP为CNP变体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)，和其盐。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述CNP为CNP-乙酸盐。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述疏水性相对离子为油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的组合物，其中阳离子为Zn2+或Ca2+。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其进一步包括赋形剂、稀释剂或载剂。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述赋形剂、稀释剂或载剂为药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
20.一种无菌药物组合物，其包括根据权利要求1至19中任一项所述的组合物。
21.一种包括C型利钠肽(CNP)的盐的延释组合物，所述盐包括与疏水性相对离子络合的带静电肽。
22.根据权利要求21所述的延释组合物，其中所述盐进一步包括与肽-相对离子络合物络合的阳离子。
23.根据权利要求21或22所述的延释组合物，其中肽盐固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子再悬浮于水溶液或油中。
24.根据权利要求23所述的延释组合物，其中所述油包括三酸甘油酯或脂肪酸，任选地其中所述脂肪酸为饱和或不饱和的。
25.根据权利要求23或24所述的延释组合物，其中所述脂肪酸为C-6至C-20脂肪酸。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的延释组合物，其中所述脂肪酸为己酸、辛酸、癸酸或十二酸。
27.根据权利要求23所述的延释组合物，其中所述水溶液为水、盐水或缓冲液。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的延释组合物，其中在pH 7至7.6下，
(i)第1天释放小于20％的肽；和
(ii)到第7天释放约90％的肽，或到第14天释放约90％的肽，或到第31天释放约90％的肽。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的延释组合物，其进一步包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
30.一种制备包括C型利钠肽(CNP)的疏水性盐的组合物的方法，其包括
a)使水溶液中的所述CNP与溶液中的疏水性相对离子接触；
b)以足以使所述肽和相对离子形成络合物的方式混合所述CNP溶液与所述疏水性相对离子溶液，其中肽-相对离子络合物的形成引起包括CNP盐的固体、半固体、凝胶、结晶、非晶、纳米粒子、微米粒子、非晶纳米粒子、非晶微米粒子、结晶纳米粒子或结晶微米粒子形式的形成。
31.根据权利要求30所述的方法，其任选地包括在步骤(b)之前，使溶液中的所述CNP与水溶液中的多价阳离子接触，从而形成肽-阳离子络合物。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其进一步包括步骤(c)用缓冲液或水洗涤所述疏水性CNP盐。
33.根据权利要求32所述的方法，其进一步包括步骤(d)通过离心形成CNP盐离心块而获得所述疏水性CNP盐。
34.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括步骤(e)从所述CNP盐离心块去除水。
35.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括将所述离心块再悬浮于水溶液或油中。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中肽:疏水性相对离子比为1:1至1:20。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中肽:阳离子比为1:1至1:10。
38.一种治疗有需要的个体的骨相关病症或骨骼发育不良的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求1至29或44至52中任一项所述的包括疏水性CNP盐的组合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述骨相关病症或骨骼发育不良选自由以下组成的组：骨关节炎、低磷酸盐血性佝偻病、软骨发育不全、软骨生成减退、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性发育不良、成骨不全、软骨成长不全、点状软骨发育异常、纯合性软骨发育不全、点状软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酶症、围产期致死型成骨不全、短肋多指综合征、软骨生成减退、肢根型点状软骨发育异常、扬森型干骺端发育不良、先天性脊椎骨骺发育不良、骨发育不全、畸型发育不良、先天性短股骨、兰格型肢中骨发育不良、尼维格型肢中骨发育不良、罗氏综合征、莱因哈特综合征、肢端发育不全、周围骨发育障碍、克尼斯特发育不良、纤维软骨增生症、罗伯茨综合征、肢端肢中发育不全、小肢、莫奎氏综合征、克尼斯特综合征、后生营养性发育不良和脊椎骨骺干骺端发育不良、NPR2突变、SHOX突变(特纳氏综合征/莱里维尔)、PTPN11突变(努南氏综合征)、胰岛素生长因子1受体(IGF1R)突变和特发性身材矮小。
40.一种在有需要的个体中进行骨延长或增加长骨生长的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求1至29或44至52中任一项所述的包括疏水性CNP盐的组合物，且其中所述施用使骨延长或增加长骨生长。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述组合物经皮下、皮内、关节内、经口或肌肉内施用。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述组合物每日一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每4周一次、每6周一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次地施用。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述组合物为延释组合物。
44.一种C型利钠肽(CNP)的疏水性盐，其包括与疏水性相对离子络合的CNP。
45.根据权利要求44所述的疏水性盐，其进一步包括与所述肽和相对离子络合的阳离子。
46.根据权利要求44或45所述的疏水性盐，其中所述疏水性相对离子选自由以下组成的组：油酸盐、去氧胆酸盐、癸酸盐、双羟萘酸盐、多库酯或十二烷基硫酸盐。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的疏水性盐，其中阳离子为Zn2+或Ca2+。
48.根据权利要求44至46中任一项所述的疏水性盐，其中所述盐选自由以下组成的组：CNP-油酸盐、CNP-双羟萘酸盐、CNP-去氧胆酸盐、CNP-癸酸盐和CNP-多库酯。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的疏水性盐，其中所述盐选自由以下组成的组：CNP-Ca+2(油酸盐)、CNP-Ca+2(双羟萘酸盐)、CNP-Ca+2(去氧胆酸盐)、CNP-Ca+2(癸酸盐)、CNP-Ca+2(多库酯)、CNP-Zn+2(油酸盐)、CNP-Zn+2(双羟萘酸盐)、CNP-Zn+2(去氧胆酸盐)、CNP-Zn+2(癸酸盐)和CNP-Zn+2(多库酯)。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的疏水性盐，其中所述CNP选自由以下组成的组：
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO:2)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO:3)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO:4)，和其盐。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的疏水性盐，其中所述CNP为CNP-乙酸盐。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的疏水性盐，其为纯化的。
53.一种包括根据权利要求1至29或44至52中任一项所述的疏水性CNP盐的组合物，其用于治疗骨相关病症或骨骼发育不良，或用于骨延长或增加长骨生长。
54.一种包括根据权利要求1至29或44至52中任一项所述的疏水性CNP盐的组合物的用途，其用于制备供治疗骨相关病症或骨骼发育不良，或供骨延长或增加长骨生长用的药剂。
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