TW202120127A

TW202120127A - 用於延釋組合物之疏水性肽鹽

Info

Publication number: TW202120127A
Application number: TW109127445A
Authority: TW
Inventors: 傑克安吉; 蘇尼爾庫馬波登; 約書亞雷伯; 卡羅亞斯特蘭大; 強納森萊保維斯
Original assignee: 美商拜奧馬林製藥公司
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2021-06-01

Abstract

本發明大體上關於親水性肽之疏水性鹽，其在水溶液中形成低溶解度物質，且當向個體投與時能夠延續或持續釋放肽組分。亦揭示C型利鈉肽之疏水性鹽及其用途。

Description

用於延釋組合物之疏水性肽鹽

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2019年8月12日申請之美國臨時專利申請案第62/885,705號、2019年11月13日申請之美國臨時專利申請案第62/935,052號、2020年1月20日申請之美國臨時專利申請案第62/963,354號、2020年1月23日申請之美國臨時專利申請案第62/964,848號及2020年6月12日申請之美國臨時專利申請案第63/038,652號之優先權，該等申請案以全文引用的方式併入本文中。以引用的方式併入以電子方式提交的材料

作為本發明之一部分的序列表與說明書同時提交為正文檔案。含有序列表之正文檔案之名稱為「54627_Seqlisting.txt」，其創建於2020年8月6日且大小為54,454位元組。序列表之主題以全文引用的方式併入本文中。技術領域

本發明大體上關於親水性肽之疏水性鹽，其在水溶液中形成低溶解度物質，且當向個體投與時能夠延續或持續釋放肽組分。

持續遞送治療劑為期望的，例如以減少劑量數目，或減少個體為達成治療益處可接受之藥物量。然而，藥物中某些類型之活性成分難以調配為持續釋放組合物（例如包覆腸溶衣、劑量反應性膠囊或錠劑，或微球，諸如脂質體或奈米粒子），該等組合物可在活體內某些部位遞送治療劑，或具有某些允許藥物隨時間推移自粒子緩慢逸出之緩慢釋放特性。

本發明係關於包括在溶液中具有低溶解度之帶靜電肽鹽，以使得鹽在水性介質中形成固體或半固體之組合物。此處顯示此類鹽在水溶液中之溶解速率比肽之非鹽形式慢，且可用於延釋治療劑而無需以典型延釋形式重新調配。

本文提供包括帶靜電肽之疏水性鹽的組合物，該鹽包括與疏水性相對離子錯合之帶靜電肽。在各種實施例中，該鹽為疏水性肽鹽。

在各種實施例中，肽鹽中按重量計之肽%為肽鹽中之至少約10重量%肽。在各種實施例中，肽鹽中按重量計之肽為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或更大。在各種實施例中，肽鹽中按重量計之活性肽%為至少約5重量%。在各種實施例中，肽鹽中按重量計之活性肽%為至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或更大。在各種實施例中，相比於鹽中存在之總肽的活性肽%為至少約50%、60%、70%、80%或更大。在各種實施例中，疏水性肽鹽具有緩慢溶解，且不以1 mg/mL立即可溶於1×磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中。

在各種實施例中，疏水性相對離子經由非共價鍵與帶靜電肽錯合。

在各種實施例中，疏水性肽鹽進一步包括與肽-疏水性相對離子錯合物錯合之多價陽離子。在各種實施例中，帶靜電肽、疏水性相對離子及多價陽離子經由非共價鍵錯合。在各種實施例中，與肽-疏水性相對離子錯合物錯合之多價陽離子為金屬陽離子。

在各種實施例中，包含疏水性相對離子之肽鹽具有約0至約10之cLogP，或疏水性相對離子之共軛酸具有-2至5之pKa，或兩者。在各種實施例中，包含疏水性相對離子之肽鹽具有約2至約9之cLogP，或疏水性相對離子之共軛酸具有小於約5之pKa，或兩者。在各種實施例中，包含疏水性相對離子之肽鹽具有約2至約9之cLogP，且疏水性相對離子之共軛酸具有小於約5之pKa。在各種實施例中，包含疏水性相對離子之肽鹽具有約2至約9之cLogP，且疏水性相對離子之共軛酸具有約0至約5之pKa。

在各種實施例中，疏水性相對離子係選自由以下組成之群組：去質子化脂肪酸、去質子化膽酸、萘甲酸鹽及其衍生物、菸鹼酸鹽及其衍生物、烷基磺酸鹽、二烷基磺基丁二酸鹽、磷脂、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽、芳基硫酸鹽、硫酸葡聚糖、烷基苯硫酸鹽、離子型界面活性劑及前述任一者之組合。在各種實施例中，疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸鹽、癸酸鹽、2-萘磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-辛磺酸鹽單水合物、1-癸磺酸鹽、十二烷基硫酸鹽、硫酸葡聚糖及十二烷基苯磺酸鹽。在各種實施例中，疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。在各種實施例中，相對離子選自由以下組成之群：油酸鹽、雙羥萘酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽及多庫酯。

在各種實施例中，多價陽離子之電荷為+2、+3或+4，或更高。在各種實施例中，多價陽離子之電荷為+2、+3或+4。在某些實施例中，多價陽離子之電荷為+2。在某些實施例中，多價陽離子之電荷為+3。在某些實施例中，多價陽離子之電荷為+4。在各種實施例中，陽離子為金屬陽離子。在各種實施例中，陽離子包括選自由以下組成之群組的金屬：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）、鉑（Pt）、銅（Cu）及金（Au）。在各種實施例中，陽離子包括鋅或鈣。在各種實施例中，陽離子為Mg2⁺ 、Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，陽離子為Zn²⁺ 。在各種實施例中，陽離子為Ca²⁺ 。

在各種實施例中，肽鹽呈固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式。在各種實施例中，肽鹽呈固體形式。在各種實施例中，肽鹽呈非晶形式。在各種實施例中，肽鹽呈凝膠形式。在各種實施例中，肽鹽懸浮於凝膠中或連接至凝膠。

在各種實施例中，帶靜電肽為C型利鈉肽（CNP）。在各種實施例中，CNP為CNP變異體。本文涵蓋之CNP及CNP變異體更充分描述於實施方式中。在各種實施例中，CNP與疏水性相對離子錯合以形成疏水性CNP鹽錯合物。在各種實施例中，疏水性CNP鹽進一步包含與CNP-疏水性相對離子錯合物錯合之多價陽離子。在各種實施例中，多價陽離子為金屬陽離子。

在各種實施例中，CNP係選自由以下組成之群組：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）及其鹽。在各種實施例中，適用於形成本文之疏水性CNP鹽之CNP鹽為CNP-乙酸鹽。

在各種實施例中，CNP選自由以下組成之群組：PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 1）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 6）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 6）；PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 5）；及PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 7）。

在各種實施例中，CNP變異肽進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基在肽之N端上。在各種實施例中，乙醯基在肽序列內之胺基酸側鏈上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。

在各種實施例中CNP變異體選自由以下組成之群組： Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）； Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 9）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 10）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 11）； Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 12）； Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 13）；及 Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 14）。

在各種實施例中，疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。在各種實施例中，若存在多價陽離子，則多價陽離子包括鋅或鈣。在各種實施例中，若存在多價陽離子，則多價陽離子包含鎂、鋅或鈣。在各種實施例中，陽離子為Mg2⁺ 、Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，多價陽離子為Zn²⁺ 。在各種實施例中，多價陽離子為Ca²⁺ 。

在各種實施例中，組合物進一步包括賦形劑、稀釋劑或載劑。在各種實施例中，賦形劑、稀釋劑或載劑為醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。亦提供包括本文所述之疏水性鹽組合物的無菌醫藥組合物。

本發明進一步涵蓋包括本文所述之疏水性肽鹽的緩釋組合物。在各種實施例中，緩釋組合物為延釋組合物、持續釋放組合物或延遲釋放組合物。

在各種實施例中，延釋組合物包括疏水性肽鹽，其中肽鹽固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子再懸浮於水溶液或油中。在各種實施例中，水溶液為水、鹽水或緩衝液。

在各種實施例中，油包括三酸甘油酯或脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為飽和或不飽和的。在各種實施例中，脂肪酸為短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸。在各種實施例中，當脂肪酸在三酸甘油酯中時，脂肪酸為飽和或不飽和的，且可為中鏈或長鏈脂肪酸。

在各種實施例中，脂肪酸為C-6至C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為己酸、辛酸、癸酸或十二酸。

在各種實施例中，對於延釋組合物，在pH 7至7.6下，（i）第1天釋放小於約20%之肽；及（ii）每週釋放約90%之肽，或每兩週釋放約90%之肽，或每月釋放約90%之肽。

在各種實施例中，在pH 7至7.6下，第1天釋放小於約20%之肽。進一步預期（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約30%、或約40%、或約50%、或約60%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽，或每兩週釋放約90%之肽，或每月釋放約90%之肽。進一步預期（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約30%、或約40%、或約50%、或約60%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約80%或約90%之肽。

在各種實施例中，（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%或約75%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽，或每兩週釋放約90%之肽，或每月釋放約90%之肽。進一步預期（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%或約75%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約80%或約90%之肽；或者ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約75%、約80%、約85%或約90%之肽。

在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每兩週釋放約90%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每月釋放約90%之肽。進一步預期該釋放可在pH 7.0至7.6、pH 7.1至7.5、pH 7.2至7.4、pH 7.2至7.6或pH 7.0至7.4之pH下。

在各種實施例中，延釋組合物包括賦形劑、稀釋劑或載劑。在各種實施例中，賦形劑、稀釋劑或載劑為醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。在各種實施例中，提供包括延釋組合物之無菌醫藥組合物。

本文亦提供製造如本文所述之疏水性肽鹽組合物，諸如疏水性CNP鹽之方法。離子界面活性劑係作為相對離子之良好候選物，因為極性頭基永久帶電，而與錯合pH無關。調節發生錯合之pH將在肽上產生不同量的電荷，且此允許控制肽:表面活性劑錯合化學計量，且可能控制所得沈澱物的大小。金屬陽離子可用作肽胺基酸之陰離子側鏈的橋鍵，以與陰離子疏水性相對離子結合。陽離子及相對離子向肽中添加之次序及速率對於最小化金屬陽離子與陰離子疏水性相對離子之沈澱重要。

在各種實施例中，本發明涵蓋一種製備包括帶靜電肽鹽之組合物的方法，其包括：a）使水溶液中之帶靜電肽與溶液中之疏水性相對離子接觸；b）以足以使肽及相對離子形成錯合物之方式混合帶靜電肽溶液與疏水性相對離子溶液，其中肽-相對離子錯合物之形成引起包括疏水性肽鹽之固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式之形成。在各種實施例中，肽鹽為疏水性CNP鹽。

在各種實施例中，方法視情況包括在步驟（b）之前，使溶液中之帶靜電肽與水溶液中之多價陽離子接觸，從而形成肽-陽離子錯合物。在各種實施例中，多價陽離子為金屬陽離子。

在各種實施例中，混合係藉由將疏水性相對離子溶液逐滴添加至帶靜電肽溶液進行。在各種實施例中，藉由在添加各滴疏水性相對離子溶液之後渦旋，或此項技術中已知之其他混合方法來混合溶液。

在各種實施例中，方法進一步包括步驟（c）在緩衝液或水中洗滌肽鹽。在各種實施例中，洗滌係在水溶液，例如緩衝液或水中進行。

在各種實施例中，該方法進一步包括步驟（d）藉由離心形成肽鹽離心塊而獲得肽鹽。在各種實施例中，若該鹽呈凝膠形式，則藉由離心或藉由傾析液相，接著凍乾，或其他乾燥方法獲得該鹽。

在各種實施例中，該方法進一步包括步驟（e）自肽鹽離心塊移除水。預期可使用此項技術中已知之技術藉由凍乾或乾燥自離心塊移除水或另一水溶液。

在各種實施例中，該方法進一步包括將離心塊再懸浮於水溶液或油中。在各種實施例中，水溶液為水、鹽水或緩衝液。在各種實施例中，油包括三酸甘油酯或脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為飽和或不飽和的。在各種實施例中，三酸甘油酯中之脂肪酸為飽和或不飽和的，或其組合。

脂肪酸可為油自身或在三酸甘油酯中。在各種實施例中，脂肪酸為短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸。在各種實施例中，當脂肪酸在三酸甘油酯中時，脂肪酸為飽和或不飽和的，且可為中鏈或長鏈脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為C-6至C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為己酸、辛酸、癸酸或十二酸。

在各種實施例中，合成方法預期使用至少一莫耳當量疏水性相對離子:肽中帶正電胺基酸之總數的肽:疏水性相對離子比。在各種實施例中，合成方法中所用之肽:疏水性相對離子比為1:1至1:20，或1:1至1:50。合成方法中所用之肽:相對離子比可為1:2至1:15、1:2至1:10、1:2至1:8、1:3至1:10或1:4至1:10。在各種實施例中，肽:相對離子比為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。在各種實施例中，合成方法中所用之肽:疏水性相對離子比為至少二莫耳當量疏水性相對離子:肽中帶正電胺基酸之總數。在各種實施例中，合成方法中所用之肽:疏水性相對離子比為至少三莫耳當量疏水性相對離子:肽中帶正電胺基酸之總數。

在各種實施例中，合成方法預期使用至少一莫耳當量陽離子:肽中帶負電胺基酸之總數的肽:陽離子比。在各種實施例中，合成方法中所用之肽:陽離子比為1:1至1:10。合成方法中所用之肽:陽離子比可為1:2至1:10、1:3至1:10、1:1至1:5、1:2至1:5或1:2至1:8。在各種實施例中，合成方法中所用之肽:陽離子比為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在各種實施例中，合成方法中所用之肽:陽離子比為至少二莫耳當量陽離子:肽中帶負電胺基酸之總數。在各種實施例中，合成方法中所用之肽:陽離子比為至少三莫耳當量陽離子:肽中帶負電胺基酸之總數。進一步預期上文所述之肽:陽離子及肽:疏水性相對離子比之組合。

例示性比率為肽上每個正電荷一個相對離子。對於多價陽離子，例示性比率為肽中每個負電荷位點大約1個金屬陽離子，及每個負電荷位點2個多價陽離子，或2×莫耳過量。例如，一或兩個多價陽離子，諸如Zn²⁺ 或Ca²⁺ 可與6-8個或更多個（若涉及疏水相互作用）相對離子組合使用。

在各種實施例中，疏水性相對離子係經由非共價鍵錯合。

在各種實施例中，若鹽錯合物進一步包括與肽-相對離子錯合物錯合之多價陽離子，則陽離子係經由鍵錯合。在各種實施例中，帶靜電肽、疏水性相對離子及陽離子經由非共價鍵錯合。

在各種實施例中，CNP係選自由以下組成之群組：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 1）。

亦提供一種治療有需要之個體之骨相關病症或骨骼發育不良之方法，其包括向該個體投與包括C型利鈉肽（CNP）之疏水性鹽的組合物，包含如本文所述之組合物及延釋組合物。

在各種實施例中，骨相關病症或骨骼發育不良選自由以下組成之群組：骨關節炎、低磷酸鹽血性佝僂病、軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性發育不良、成骨不全、軟骨成長不全、點狀軟骨發育異常、純合性軟骨發育不全、點狀軟骨發育異常、屈肢骨發育不良、先天性致死型低磷酸酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋多指症候群、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育異常、揚森型幹骺端發育不良（Jansen-type metaphyseal dysplasia）、先天性脊椎骨骺發育不良、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良（Langer-type mesomelic dysplasia）、尼維格型肢中骨發育不良（Nievergelt-type mesomelic dysplasia）、羅氏症候群（Robinow syndrome）、萊因哈特症候群（Reinhardt syndrome）、肢端發育不全、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良（Kniest dysplasia）、纖維軟骨增生症、羅伯茨症候群（Roberts syndrome）、肢端肢中發育不全、小肢、莫奎氏症候群（Morquio syndrome）、克尼斯特症候群、後生營養性發育不良及脊椎骨骺幹骺端發育不良、NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群（Turner's syndrome）/萊里維爾（Leri Weill））、PTPN11突變（努南氏症候群（Noonan's syndrome））及特發性身材矮小。

在各種實施例中，CNP變異體適用作用於治療特發性身材矮小及其他骨骼發育不良之生長激素的輔助或替代。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）或PTPN11突變（努南氏症候群）引起。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）或PTPN11突變（努南氏症候群）或胰島素生長因子1受體（IGF1R）引起。

在各種實施例中，CNP變異體適用於治療生長板病症及身材矮小，包含家族性身材矮小、顯性家族性身材矮小（其亦稱為顯性遺傳性身材矮小）或特發性身材矮小。在各種實施例中，身材矮小或生長板病症為膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3之突變的結果。

在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多種突變相關。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由拉索病引起。在各種實施例中，拉索病為努南症候群、科斯特洛症候群（Costello syndrome）、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤或LEOPARD症候群。

在一個實施例中，拉索病為遺傳性1型齒齦纖維瘤病。

在各種實施例中，CNP變異體適用於治療生長板病症及身材矮小，包含家族性身材矮小、顯性家族性身材矮小（其亦稱為顯性遺傳性身材矮小）或特發性身材矮小。在各種實施例中，身材矮小或生長板病症為膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰島素生長因子1受體（IGF1R）之突變的結果。

在各種實施例中，身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多種突變相關。

在各種實施例中，CNP變異體適用於治療患有如下之身材矮小的個體：身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0，且至少一個親代之身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療患有身高SDS為-2.0至-3.0之身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療患有身高SDS為-2.0至-2.5之身材矮小的個體。在各種實施例中，身材矮小與相關於身材矮小之基因中之一或多種突變相關，諸如膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰島素生長因子1受體（IGF1R）或其組合。在各種實施例中，身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多種突變相關。

在各種實施例中，身材矮小為如藉由多基因風險評分（PRS）所確定之多個基因中之突變的結果。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有IGF1R之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPPC之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有SHOX之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX中之一或多者之一或多種突變及低PRS。在各種實施例中，PRS為1或2。在各種實施例中，PRS為1。在各種實施例中，PRS為2。

在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 1）。在各種實施例中，肽進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基在肽之N端上。在各種實施例中，乙醯基在肽序列內之胺基酸側鏈上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。在各種實施例中，變異體包括一或多個如本文所述之連接基團。在各種實施例中，連接基團為可水解連接基團。在各種實施例中，變異體為帶靜電CNP肽之疏水性鹽，該鹽包含與疏水性相對離子錯合之帶靜電CNP肽。

本發明亦涵蓋一種在有需要之個體中進行骨延長或增加長骨生長之方法，其包括向該個體投與包括C型利鈉肽（CNP）之鹽的持續釋放組合物，包含如本文所述之組合物及延釋組合物，且其中該投與使骨延長或增加長骨生長。

在各種實施例中，CNP為CNP變異體。在各種實施例中，CNP選自由以下組成之群組： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）；及其醫藥鹽。在各種實施例中，CNP為CNP-乙酸鹽。

在各種實施例中，變異CNP進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基在肽之N端上。在各種實施例中，乙醯基在肽之胺基酸之側基上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。

在各種實施例中，變異體選自由以下組成之群組： Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 8）； Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 9）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 10）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 11）； Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 12）； Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH₂ （SEQ ID NO: 13）；及 Ac-PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 14）。

在各種實施例中，組合物係皮下、皮內、關節內、經口或肌肉內投與。

在各種實施例中，每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次地投與組合物。

在各種實施例中，組合物為延釋組合物。

亦提供在與疏水性相對離子之錯合物中包括CNP的C型利鈉肽（CNP）之疏水性鹽。在各種實施例中，疏水性CNP鹽進一步包括與CNP及疏水性相對離子錯合之陽離子。在各種實施例中，疏水性CNP鹽為純化鹽。在各種實施例中，該鹽具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%純度，或更大。

在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 1）。在各種實施例中，肽進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基在肽之N端上。在各種實施例中，乙醯基在肽之胺基酸之側基上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。在各種實施例中，變異體包括一或多個如本文所述之連接基團。在各種實施例中，連接基團為可水解連接基團。在各種實施例中，肽包括帶靜電肽之疏水性鹽，該鹽包括與疏水性相對離子錯合之帶靜電肽。

本發明係關於親水性肽鹽，其為當置於水溶液中時能夠延釋肽活性成分之固體、半固體凝膠或其他鹽形式。例如，本文中展示出乎意料地，親水性C型利鈉肽（CNP）與帶電、疏水性相對離子錯合在水性條件下產生低溶解度肽鹽。本發明展示肽-疏水性相對離子鹽錯合物自身，包括包含肽-相對離子-陽離子錯合物之鹽可用於緩釋或延釋組合物，而不必將肽錯合物囊封至脂質體或微球/奈米粒子中。此類組合物適用於延釋應用，例如治療如本文所述之骨骼發育不良及骨生長病症。

如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外明確規定，否則不定冠詞「一（a）」及「一（an）」以及定冠詞「該（the）」包含複數以及單數指示物。

術語「約」或「大致」意謂如由一般熟習此項技術者所測定之特定值之可接受誤差，其部分取決於如何量測或測定該值。在某些實施例中，術語「約」或「大致」意謂在1、2、3或4個標準差內。在某些實施例中，術語「約」或「大致」意謂在既定值或範圍的30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.05%內。當術語「約」或「大致」冠於一系列兩個或更多個數值中的第一數值之前時，應理解術語「約」或「大致」適用於所述系列中之每一個數值。

如本文所用之術語「帶靜電肽」係指肽，例如包括帶電胺基酸之5至100個胺基酸之胺基酸串。肽可具有帶正電胺基酸、帶負電胺基酸或兩者之混合物，使得帶靜電肽具有總體淨電荷且能夠與其他帶電部分相互作用，例如具有與相對離子可結合之肽中之帶電粒種相反之帶電粒種的陽離子、陰離子或相對離子。帶靜電肽可具有淨正電荷或淨負電荷。當肽具有淨正電荷時，其可與具有一或多個負電荷之帶電部分相互作用。當肽具有淨負電荷時，其可與具有一或多個正電荷之帶電部分相互作用。

如本文所用之術語「疏水性相對離子」係指一組帶靜電部分，其在本質上為疏水性的且能夠與親水性肽相互作用。在各種實施例中，疏水性相對離子係基於其cLogP值、其共軛酸之pKa值或兩者選擇。在各種實施例中，疏水性相對離子具有約0至約10之cLogP，或其共軛酸具有-2至5之pKa，或兩者。在各種實施例中，疏水性相對離子具有淨負電荷且可與具有淨正電荷之帶靜電肽相互作用。在各種實施例中，疏水性相對離子包含去質子化脂肪酸、去質子化膽酸、萘甲酸鹽及其衍生物、菸鹼酸鹽及其衍生物、烷基磺酸鹽、二烷基磺基丁二酸鹽、磷脂、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽、芳基硫酸鹽、硫酸葡聚糖及烷基苯硫酸鹽。在一些實施例中，疏水性相對離子為兩性離子（例如磷脂醯乙醇胺）。在各種實施例中，疏水性相對離子包含但不限於棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸鹽、癸酸鹽、2-萘磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-辛磺酸鹽單水合物、1-癸磺酸鹽、十二烷基硫酸鹽、硫酸葡聚糖及十二烷基苯磺酸鹽。在一些實施例中，疏水性相對離子具有淨正電荷且可與具有淨負電荷之帶靜電肽相互作用。

如本文所用，術語「肽鹽」或「疏水性肽鹽」係指帶靜電肽與相對離子，例如疏水性相對離子之間的錯合物，以使得該等部分在錯合物中且形成鹽。肽及相對離子可非共價錯合。在各種實施例中，肽-相對離子鹽進一步包括多價陽離子，使得錯合物含有錯合之肽-陽離子-相對離子。肽鹽或疏水性肽鹽係指肽-相對離子錯合物及肽-陽離子-相對離子錯合物兩者。

在各種實施例中，肽及陽離子係非共價錯合。在各種實施例中，肽鹽中之肽、陽離子及疏水性相對離子係經由非共價鍵錯合。

術語「C型利鈉肽」或「CNP」係指在C末端具有17個胺基酸之環結構的小單鏈肽（GenBank寄存編號NP_077720，對於CNP前驅蛋白NPPC）及其變異體。CNP最初產生自利鈉肽前驅體C（NPPC）基因，形式為單鏈126個胺基酸之前原多肽，其經裂解以產生原-CNP，及活性53個胺基酸之肽（CNP-53），其經分泌且藉由未知酶再次裂解以產生成熟的22個胺基酸之肽（CNP-22）。「CNP鹽」或「疏水性CNP鹽」係指分別包括相對離子，諸如疏水性相對離子，且視情況進一步包括多價陽離子，且包括CNP的如本文所述之鹽。

在各種實施例中，「CNP變異體」與野生型NPPC在相同數目之胺基酸殘基上為至少約40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同源。在各種實施例中，CNP變異肽可包含約1至約53，或1至38，或1至37，或1至35，或1至34，或1至33，或1至32，或1至31，或1至27，或1至22，或10至35，或約15至約37個NPPC多肽殘基。在一個實施例中，CNP變異體可包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53個源自NPPC多肽之胺基酸的序列。

本文提供包含本文所述之疏水性肽鹽的緩釋組合物。緩釋組合物包括在投藥後延遲遞送藥物（延遲釋放劑量）或持續延長時段遞送藥物（延續釋放劑量）之彼等組合物。本文提供之肽鹽之各種實施例包括緩釋組合物，諸如延釋、持續或控制釋放，及延遲釋放。術語「延釋組合物」係指以便於製造在投與後之延長時段內可用的活性成分/藥物之方式調配之組合物（美國藥典（US Pharmacopeia））。延釋劑量包括持續釋放（SR）或控制釋放（CR）形式。持續釋放經持續時段維持藥物釋放，但未必以恆定速率，而CR經持續時段以幾乎恆定速率維持藥物釋放（《製藥學：藥物遞送及靶向（Pharmaceutics: Drug Delivery and Targeting）》, Yvonne Perrie, Thomas Rades, Pharmaceutical Press, 2009）。延遲釋放組合物或產物經修改以在初次投與之後的一定時段內延遲藥物物質釋放。

術語「有效量」係指足以對個體之健康狀況、病變或疾病產生所期望的結果或足以用於診斷目的之劑量。所期望的結果可包含劑量之接受者的主觀或客觀改善。「治療有效量」係指可有效產生所預期的對健康有益的效應的藥劑量。在任何個別情況下之適當「有效」量可由一般技術人員使用常規實驗來測定。應理解，針對任何具體患者之特定劑量水準及劑量頻率可變化且將取決於多種因素，包括所採用之特定化合物的活性；生物可用性、代謝穩定性、分泌速率以及所述混合物之作用時間長度；化合物之投與模式及投與時間；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別以及飲食；以及具體病狀之嚴重程度。

「治療」係指防治性治療或治療性治療或診斷性治療。在某些實施例中，「治療」係指出於治療、預防或診斷目的而向個體投與化合物或組合物。

「防治性」治療為出於降低患病理學的風險的目的，向未展示疾病的病徵或僅展示疾病的早期病徵的個體投與治療。本發明之化合物或組合物可作為預防性治療提供以減少患病變之可能性或以使病變（若患有）之嚴重性最小化。

「治療性」治療為出於減輕或消除病理學病徵或症狀的目的，向展示彼等病徵或症狀的個體投與治療。病徵或症狀可為生物化學、細胞、組織學、功能或物理、主觀或客觀的。本發明化合物亦可作為治療性治療給出或針對診斷給出。

「醫藥組合物」或「調配物」係指適於個體動物（包括人類及哺乳動物）中之醫藥用途的組合物。醫藥組合物包括治療有效量之疏水性肽鹽（例如CNP鹽）、視情況選用之另一生物活性劑及視情況選用之醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一實施例中，醫藥組合物涵蓋包含活性成分及構成載劑之惰性成分的組合物，以及直接或間接由任何兩種或更多種成分之組合、複合或聚集或由一或多種成分的解離或由一或多種成分的其他類型之反應或相互作用而產生的任何產物。因此，本發明之醫藥組成物涵蓋藉由將本發明化合物與醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑摻和製得之任何組成物。

「醫藥學上可接受之載劑」係指標準醫藥載劑、緩衝劑及其類似物中之任一者，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、5%右旋糖水溶液及乳液（例如油/水或水/油乳液）。賦形劑之非限制性實例包括佐劑、黏合劑、填充劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、助滑劑、甜味劑、調味劑及著色劑。適合之醫藥載劑、賦形劑及稀釋劑係描述於《雷明頓氏藥物科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》, 第19版(Mack Publishing Co., Easton, 1995)中。較佳醫藥載劑視投與活性劑的預期模式而定。投與之典型模式包括經腸（例如，經口）或非經腸（例如，皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內注射；或局部、經皮或經黏膜投與）。

「醫藥學上可接受之鹽」為可調配為用於醫藥用途之化合物的鹽，包含但不限於金屬鹽（例如鈉、鉀、鎂、鈣等）及氨或有機胺之鹽。

「醫藥學上可接受」或「藥理學上可接受」意謂不為生物學上或其他方面不期望之物質，即可在不導致任何不期望的生物影響情況下或在不以有害方式與含有其之組合物的任何組分或與存在於個體身體之上或之中之任何組分相互作用的情況下向個體投與之物質。

「生理學條件」係指動物（例如人類）體內之條件。生理學條件包含但不限於體溫以及具有生理學離子強度、pH及酶之水性環境。生理學條件亦涵蓋特定個體體內之條件，其不同於大多數個體中存在之「正常」條件，例如其不同於大致37℃之正常人體溫度或不同於大致7.4之正常人血液pH。

如本文所用，術語「個體」涵蓋哺乳動物及非哺乳動物。哺乳動物之實例包含但不限於哺乳動物類之任何成員：人類，非人類靈長類動物，諸如黑猩猩以及其他猿及猴物種；農畜，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔子、狗及貓；實驗室動物，包含嚙齒動物，諸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及其類似物。非哺乳動物之實例包含但不限於鳥類、魚及其類似動物。該術語不指示具體年齡或性別。在各種實施例中，個體為人類。在各種實施例中，個體為兒童或青少年。在各種實施例中，個體為嬰兒。

帶靜電肽及肽鹽

肽治療劑為有吸引力的生物治療劑，但通常由於在溶液中之低穩定性及短半衰期而為不利的（Tang等人, 《歐洲醫藥科學雜誌（Eur J Pharm Sci.）》 102:63-70, 2017）。改良肽治療劑功效之嘗試包含將親水性肽囊封至可生物降解粒子，諸如脂質體或聚合物粒子中之嘗試。然而，由於此等肽之陽離子性質及其與帶負電聚合物之脂質體靜電相互作用之能力，此一直為困難的（Griesser等人, 《國際藥劑學雜誌（Int J Pharmaceutics）》 520:267-274, 2017）。在親水性肽與疏水性部分之間產生疏水性離子對已成為一種用於使得能夠將親水性聚合物更好地囊封至微米粒子或脂質體中之手段（Lu等人, 《分子藥劑學（MOLECULAR PHARMACEUTICS）》 15:216-225, 2018）。當肽中之帶電殘基與疏水性部分中之帶相反電荷離子相互作用時，形成疏水性離子對（Tang等人, 前述）。在某些情況下，其可使得疏水性離子對自溶液中沈澱出來，使其更易於囊封至脂質體或聚合奈米粒子中（Griesser等人, 前述）。

本文中已發現親水性CNP肽與疏水性相對離子之間的疏水性離子複合物產生CNP肽鹽。親水性肽與疏水性相對離子之間的疏水性離子對產生可如下地增強：藉由首先使親水性肽與多價陽離子（例如金屬陽離子）接觸以增強肽與疏水性相對離子之間的相互作用。舉例而言，多價陽離子可與親水性肽之帶負電官能基錯合，從而增加可用於與疏水性相對離子，諸如疏水性陰離子錯合之親水性肽上之正電荷的數目。因此，多價陽離子可將親水性肽之負電荷及疏水性相對離子之負電荷橋接在一起。另外，本發明展示肽-疏水性相對離子鹽錯合物自身可用於緩釋或延釋組合物，而不必將肽錯合物囊封至脂質體或微球/奈米粒子中。

帶靜電肽可為包括帶電胺基酸且具有總淨電荷之5至100個胺基酸之胺基酸串。肽可具有帶正電胺基酸、帶負電胺基酸或兩者之混合物，使得帶靜電肽能夠與其他帶電部分，例如具有與肽中之帶電粒種相反之帶電粒種的陽離子、陰離子或相對離子或其組合相互作用。在各種實施例中，帶靜電肽具有淨正電荷。具有淨正電荷之帶靜電肽可與具有負電荷之疏水性相對離子，諸如具有淨負電荷之疏水性相對離子錯合。在各種實施例中，帶靜電肽具有淨負電荷。具有淨負電荷之帶靜電肽可與具有正電荷之疏水性相對離子，諸如具有淨正電荷之疏水性相對離子錯合。在各種實施例中，帶靜電肽具有至少兩個具有相同電荷類型之胺基酸（例如兩個帶正電胺基酸或兩個帶負電胺基酸）。

親水性肽係指在水溶液中具有高溶解度之肽。本文中涵蓋之親水性肽包括5至100個胺基酸之肽，其具有+3至+15，或+4至+15，或+3至+12，或+4至+12，或+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14或+15之淨電荷。在各種實施例中，親水性肽於水溶液中之溶解度大於10 mg/mL，或溶解度大於5 mg/mL。在各種實施例中，親水性肽亦指在水溶液中具有高溶解度，例如具有小於1之cLogP的肽。

疏水性相對離子

為了產生如本文所述之帶靜電肽鹽，肽與相對離子錯合。在親水性肽之情況下，相對離子為疏水性相對離子。在各種實施例中，疏水性相對離子具有淨負電荷且與具有淨正電荷之親水性肽形成鹽。

預期相對離子經由非共價鍵結與帶電肽錯合。相對離子可經由靜電相互作用與肽非共價結合。

當使用疏水性相對離子時，疏水性相對離子展現約0至約10之cLogP，或其共軛酸展現約-2至約5之pKa，或兩者。在各種實施例中，疏水性相對離子具有約2至約9、約3至8、約4至7、或約5至9之cLogP。在各種實施例中，cLogP為約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在各種實施例中，疏水性相對離子之共軛酸具有約-1至4、0至3、0至5、1至4或2至5之pKa。在各種實施例中，疏水性相對離子之共軛酸具有約-2、-1、0、1、2、3、4或5之pKa。進一步預期具有此等值中之任一者及值之間的範圍之組合的疏水性相對離子。在各種實施例中，疏水性相對離子具有約2至約9之cLogP，或其共軛酸具有小於約5之pKa，或兩者。在各種實施例中，疏水性相對離子具有約2至約9之cLogP，且其共軛酸具有小於約5之pKa。

在各種實施例中，相對離子為陰離子。在各種實施例中，相對離子為兩性離子。在各種實施例中，相對離子為陰離子或兩性離子洗滌劑。在各種實施例中，疏水性相對離子選自由以下組成之群組：去質子化脂肪酸、去質子化膽酸、萘甲酸鹽及其衍生物、菸鹼酸鹽及其衍生物、烷基磺酸鹽、二烷基磺基丁二酸鹽、磷脂、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽、芳基硫酸鹽、硫酸葡聚糖、烷基苯硫酸鹽及離子型界面活性劑。在各種實施例中，疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸、癸酸鈉、2-萘磺酸鈉、1-庚磺酸鈉、1-辛磺酸鈉單水合物、1-癸磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉及十二烷基苯磺酸鈉。在各種實施例中，疏水性相對離子為油酸鹽、雙羥萘酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽或多庫酯。

在各種實施例中，至少一個疏水性相對離子與親水性肽（當不存在多價陽離子時）或與包含親水性肽及多價陽離子之錯合物（當存在陽離子時）錯合。在各種實施例中，至少兩個疏水性相對離子與親水性肽（當不存在陽離子時）或與包括親水性肽及多價陽離子之錯合物（當存在陽離子時）錯合。在各種實施例中，至少三個疏水性相對離子與親水性肽（當不存在陽離子時）或與包括親水性肽及多價陽離子之錯合物（當存在陽離子時）錯合。在各種實施例中，至少四個疏水性相對離子與親水性肽（當不存在陽離子時）或與包括親水性肽及多價陽離子之錯合物（當存在陽離子時）錯合。在各種實施例中，親水性肽之各正電荷與疏水性相對離子錯合。舉例而言，若肽具有四個帶正電胺基酸，則其可與四個疏水性相對離子錯合。類似地，若對於總共六個正電荷，肽具有四個帶正電胺基酸且與兩個陽離子錯合，則肽可與六個疏水性相對離子錯合。在各種實施例中，親水性肽（當不存在陽離子時）或包括親水性肽及多價陽離子之錯合物（當存在陽離子時）之並非全部正電荷與疏水性相對離子錯合。舉例而言，若肽具有四個帶正電胺基酸，則其可與三個疏水性相對離子，或兩個疏水性相對離子，或一個疏水性相對離子錯合。類似地，若對於總共六個正電荷，肽具有四個帶正電胺基酸且與兩個陽離子錯合，則肽可與五個疏水性相對離子，或四個疏水性相對離子，或三個疏水性相對離子，或兩個疏水性相對離子，或一個疏水性相對離子錯合。

多價陽離子

在各種實施例中，肽鹽進一步包括與肽-相對離子錯合物錯合之多價陽離子。預期陽離子經由非共價鍵結與帶電肽錯合。陽離子可經由靜電相互作用與肽非共價結合。

預期多價陽離子具有+2、+3或+4或更高的電荷。在實施例中，陽離子具有+2之電荷。在實施例中，陽離子具有+3之電荷。在實施例中，陽離子具有+4之電荷。在各種實施例中，多價陽離子為金屬陽離子。金屬陽離子包含第II族及第III族金屬之彼等。適合之多價陽離子可包括選自由以下組成之群組的金屬：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）、鉑（Pt）、銅（Cu）及金（Au）。在各種實施例中，多價陽離子包括鎂、鋅或鈣。在各種實施例中，多價陽離子包括鋅或鈣。在實施例中，多價陽離子包括鋅。在實施例中，多價陽離子包括鈣。在各種實施例中，多價陽離子選自由Mg²⁺ 、Zn²⁺ 及Ca²⁺ 組成之群組。在各種實施例中，多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在實施例中，多價陽離子為Zn²⁺ 。在實施例中，多價陽離子為Ca²⁺ 。

在各種實施例中，至少一個多價陽離子與親水性肽錯合。在各種實施例中，至少兩個陽離子與親水性肽錯合。在各種實施例中，至少三個陽離子與親水性肽錯合。在各種實施例中，親水性肽之各負電荷與多價陽離子錯合。舉例而言，若肽具有四個帶負電胺基酸，則其可與四個多價陽離子，或三個多價陽離子，兩個多價陽離子，或一個多價陽離子錯合。

肽鹽

在各種實施例中，肽鹽呈固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式。在各種實施例中，肽鹽呈固體、半固體或凝膠形式。在各種實施例中，肽鹽呈固體或凝膠形式。在各種實施例中，肽鹽呈固體形式。在各種實施例中，肽鹽呈非晶形式。在各種實施例中，肽鹽呈凝膠形式。在各種實施例中，肽鹽懸浮於凝膠中或連接至凝膠。

預期肽鹽呈粒子形式，且尤其呈固體粒子形式。在各種實施例中，粒子為1至10,000微米（μm）、1 μm至2000 μm、2 μm至1000 μm、5 μm至500 μm、10 μm至1000 μm、50 μm至500 μm、100 μm至800 μm、200至600 μm、300 μm至500 μm、100 μm至300 μm、50 μm至100 μm或10 μm至50 μm。在各種實施例中，粒子為奈米粒子。在各種實施例中，奈米粒子為大約5奈米（nm）至1000 nm，8 nm至900 nm，10 nm至800 nm，20 nm至600 nm，50 nm至500 nm，50至400 nm，20至300 nm，300至800 nm或200至600 nm。

在一些實施例中，肽鹽之親水性肽為如本文所述之CNP或CNP變異體，且疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸、癸酸鈉、2-萘磺酸鈉、1-庚磺酸鈉、1-辛磺酸鈉單水合物、1-癸磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉及十二烷基苯磺酸鈉。在一些實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP或CNP變異體，且疏水性相對離子選自由以下組成之群組：油酸鹽、雙羥萘酸鹽、去氧膽酸鹽及癸酸鹽。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-油酸鹽、CNP-雙羥萘酸鹽、CNP-去氧膽酸鹽及CNP-癸酸鹽，在一些實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP或CNP變異體，且疏水性相對離子選自由以下組成之群：油酸鹽、雙羥萘酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽及多庫酯。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-油酸鹽、CNP-雙羥萘酸鹽、CNP-去氧膽酸鹽、CNP-癸酸鹽及CNP-多庫酯。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-油酸鹽、CNP-雙羥萘酸鹽及CNP-多庫酯。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-去氧膽酸鹽、CNP-癸酸鹽及CNP-多庫酯。在各種實施例中，肽鹽選自由CNP-油酸鹽及CNP-雙羥萘酸鹽組成之群。在各種實施例中，肽鹽為CNP-油酸鹽。在各種實施例中，肽鹽為CNP-雙羥萘酸鹽。在各種實施例中，肽鹽為CNP-多庫酯。

在各種實施例中，肽鹽之親水性肽為Pro-Gly CNP37（PG-CNP37），且疏水性相對離子選自由以下組成之群：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸、癸酸鈉、2-萘磺酸鈉、1-庚磺酸鈉、1-辛磺酸鈉單水合物、1-癸磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉及十二烷基苯磺酸鈉。在一些實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之PG-CNP37，且疏水性相對離子選自由以下組成之群組：油酸鹽、雙羥萘酸鹽、去氧膽酸鹽及癸酸鹽。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-油酸鹽、PG-CNP37-雙羥萘酸鹽、PG-CNP37-去氧膽酸鹽及PG-CNP37-癸酸鹽，在一些實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之PG-CNP37，且疏水性相對離子選自由以下組成之群：油酸鹽、雙羥萘酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽及多庫酯。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-油酸鹽、PG-CNP37-雙羥萘酸鹽、PG-CNP37-去氧膽酸鹽、PG-CNP37-癸酸鹽及PG-CNP37-多庫酯。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-油酸鹽、PG-CNP37-雙羥萘酸鹽及PG-CNP37-多庫酯。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-去氧膽酸鹽、PG-CNP37-癸酸鹽及PG-CNP37-多庫酯。在各種實施例中，肽鹽選自由PG-CNP37-油酸鹽及PG-CNP37-雙羥萘酸鹽組成之群。在各種實施例中，肽鹽為PG-CNP37-油酸鹽。在各種實施例中，肽鹽為PG-CNP37-雙羥萘酸鹽。在各種實施例中，肽鹽為PG-CNP37-多庫酯。

在各種實施例中，肽-相對離子鹽進一步包含多價陽離子。在一些實施例中，肽鹽之親水性肽為如本文所述之CNP或CNP變異體；疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸、癸酸鈉、2-萘磺酸鈉、1-庚磺酸鈉、1-辛磺酸鈉單水合物、1-癸磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉及十二烷基苯磺酸鈉；且多價陽離子包括選自由以下組成之群組的金屬：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）、鉑（Pt）、銅（Cu）及金（Au）。在各種實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP，疏水性相對離子選自由以下組成之群組：油酸鹽、雙羥萘酸鹽、去氧膽酸鹽及癸酸鹽；且多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群組：CNP-Ca⁺² (油酸鹽)、CNP-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)、CNP-Ca⁺² (去氧膽酸鹽)、CNP-Ca⁺² (癸酸鹽)、CNP-Zn⁺² (油酸鹽)、CNP-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)、CNP-Zn⁺² (去氧膽酸鹽)及CNP-Zn⁺² (癸酸鹽)。在各種實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP，疏水性相對離子選自由以下組成之群：油酸鹽、雙羥萘酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽及多庫酯；且多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP，疏水性相對離子選自由以下組成之群：油酸鹽、雙羥萘酸鹽及多庫酯；且多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP，疏水性相對離子選自由以下組成之群：去氧膽酸鹽、癸酸鹽及多庫酯；且多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP，疏水性相對離子選自由油酸鹽及雙羥萘酸鹽組成之群；且多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP，疏水性相對離子為油酸鹽；且多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，親水性肽鹽為如本文所述之CNP，疏水性相對離子為雙羥萘酸鹽；且多價陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。

在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群組：CNP-Ca⁺² (油酸鹽)、CNP-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)、CNP-Ca⁺² (去氧膽酸鹽)、CNP-Ca⁺² (癸酸鹽)、CNP-Ca⁺² (多庫酯)、CNP-Zn⁺² (油酸鹽)、CNP-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)、CNP-Zn⁺² (去氧膽酸鹽)、CNP-Zn⁺² (癸酸鹽)及CNP-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Ca⁺² (油酸鹽)、CNP-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)、CNP-Ca⁺² (多庫酯)、CNP-Zn⁺² (油酸鹽)、CNP-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)及CNP-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Ca⁺² (油酸鹽)、CNP-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)及 CNP-Ca⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Ca⁺² (去氧膽酸鹽)、CNP-Ca⁺² (癸酸鹽) 及 CNP-Ca⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Ca⁺² (油酸鹽)及CNP-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)。在各種實施例中，肽鹽為CNP-Ca⁺² (油酸鹽)。在各種實施例中，肽鹽為CNP-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Zn⁺² (油酸鹽)、CNP-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)、CNP-Zn⁺² (去氧膽酸鹽)、CNP-Zn⁺² (癸酸鹽)及CNP-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Zn⁺² (油酸鹽)、CNP-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)及CNP-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Zn⁺² (去氧膽酸鹽)、CNP-Zn⁺² (癸酸鹽)及CNP-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Zn⁺² (油酸鹽)及CNP-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)。在各種實施例中，肽鹽為CNP-Zn⁺² (油酸鹽)。在各種實施例中，肽鹽為CNP-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)。

在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-Ca⁺² (油酸鹽)、PG-CNP37-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)、PG-CNP37-Ca⁺² (去氧膽酸鹽)、PG-CNP37-Ca⁺² (癸酸鹽)、PG-CNP37-Ca⁺² (多庫酯)、PG-CNP37-Zn⁺² (油酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (去氧膽酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (癸酸鹽)及PG-CNP37-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-Ca⁺² (油酸鹽)、PG-CNP37-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)、PG-CNP37-Ca⁺² (多庫酯)、PG-CNP37-Zn⁺² (油酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)及CNP-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-Ca⁺² (油酸鹽)、PG-CNP37-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)及 PG-CNP37-Ca⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：CNP-Ca⁺² (去氧膽酸鹽)、PG-CNP37-Ca⁺² (癸酸鹽) 及 PG-CNP37-Ca⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由PG-CNP37-Ca⁺² (油酸鹽)及PG-CNP37-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)組成之群。在各種實施例中，肽鹽為PG-CNP37-Ca⁺² (油酸鹽)。在各種實施例中，肽鹽為PG-CNP37-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-Zn⁺² (油酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (去氧膽酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (癸酸鹽)及PG-CNP37-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-Zn⁺² (油酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)及PG-CNP37-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由以下組成之群：PG-CNP37-Zn⁺² (去氧膽酸鹽)、PG-CNP37-Zn⁺² (癸酸鹽)及PG-CNP37-Zn⁺² (多庫酯)。在各種實施例中，肽鹽選自由PG-CNP37-Zn⁺² (油酸鹽)及PG-CNP37-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)組成之群。在各種實施例中，肽鹽為PG-CNP37-Zn⁺² (油酸鹽)。在各種實施例中，肽鹽為PG-CNP37-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)。

製備方法

本文亦涵蓋製備包括如本文所述之疏水性肽鹽之組合物的方法。

在各種實施例中，本發明提供一種製備包括帶靜電肽鹽之組合物的方法，其包括：a）使水溶液中之帶靜電肽與溶液中之疏水性相對離子接觸；b）以足以使肽及相對離子形成錯合物之方式混合帶靜電肽溶液與疏水性相對離子溶液，其中肽-相對離子錯合物之形成引起包括肽鹽之固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式之形成。在各種實施例中，當肽-相對離子鹽進一步包括多價陽離子時，方法包括在步驟（b）之前，使溶液中之帶靜電肽與水溶液中之多價陽離子接觸，從而形成肽-陽離子錯合物。肽-陽離子錯合物接著與疏水性相對離子接觸以形成肽-陽離子-相對離子錯合物。

在各種實施例中，本發明提供一種製備包括帶靜電肽鹽之組合物的方法，其包括：a）使溶液中之帶靜電肽與水溶液中之多價陽離子接觸，從而形成肽-陽離子錯合物；b）使水溶液中之肽-陽離子錯合物與溶液中之疏水性相對離子接觸；及c）以足以使肽-陽離子及相對離子形成錯合物之方式混合肽-陽離子錯合物溶液與疏水性相對離子溶液，其中肽-陽離子相對離子錯合物之形成引起包括肽鹽之固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式之形成。

在各種實施例中，混合係藉由將疏水性相對離子溶液逐滴添加至肽溶液進行。藉由在添加各滴疏水性相對離子溶液之後渦旋，或此項技術中已知之其他混合方法來混合溶液。

在各種實施例中，方法進一步包括步驟（c）或（d）在緩衝液或水中洗滌肽鹽。在各種實施例中，洗滌係在水溶液，例如緩衝液或水中進行。

在各種實施例中，該方法進一步包括步驟（d）或（e）藉由離心形成肽鹽離心塊而獲得肽鹽。在各種實施例中，若該鹽呈凝膠形式，則藉由離心或藉由傾析液相，接著凍乾，或其他乾燥方法獲得該鹽。

在各種實施例中，該方法進一步包括步驟（e）或（f）自肽鹽離心塊移除水。預期可使用此項技術中已知之技術藉由凍乾或乾燥自離心塊移除水或另一水溶液。

脂肪酸可為油自身或在三酸甘油酯中。在各種實施例中，脂肪酸為短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸。在各種實施例中，三酸甘油酯中之脂肪酸為飽和或不飽和的，且可為中鏈或長鏈脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為C-6至C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為己酸、辛酸、癸酸或十二酸。

在各種實施例中，方法涵蓋使用至少一莫耳當量之疏水性相對離子，諸如疏水性陰離子，其相對於：1）若存在陽離子，則帶電荷胺基酸之總數，；或2）若不存在陽離子，則正電荷之總數。因此，在各種實施例中，方法涵蓋使用相對於親水性肽中正電荷之總數（當不存在陽離子時），或相對於包括親水性肽及陽離子之錯合物中正電荷之總數（當存在多價陽離子時）至少一當量之疏水性相對離子。此比在本文中稱為肽:疏水性相對離子比。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）中帶正電胺基酸之總數至少一莫耳當量之疏水性相對離子。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:1至1:20，或1:1至1:50。肽:相對離子比可為1:2至1:15、1:2至1:10、1:2至1:8、1:3至1:10或1:4至1:10。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:1。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:2。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:3。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:4。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:5。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:6。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:7。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:8。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:9。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為1:10。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）中帶正電胺基酸之總數至少二莫耳當量之疏水性相對離子。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）中帶正電胺基酸之總數至少三莫耳當量之疏水性相對離子。在各種實施例中，肽:疏水性相對離子比為相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）中帶正電胺基酸之總數至少四莫耳當量之疏水性相對離子。在一些實施例中，肽:疏水性相對離子比為相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）中正電荷之總數小於一莫耳當量之疏水性相對離子。在各種實施例中，肽鹽具有相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）中之正電荷少一莫耳當量之疏水性相對離子。在各種實施例中，肽鹽具有相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）中之正電荷少二莫耳當量之疏水性相對離子。在各種實施例中，肽鹽具有相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）中之正電荷少三莫耳當量之疏水性相對離子。在各種實施例中，方法涵蓋引入例如相對於肽（當不存在陽離子時）或包括肽及陽離子之錯合物（當存在陽離子時）上正電荷之總數0.9、0.8、0.7、0.75、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2或0.1莫耳當量之疏水性相對離子。

在各種實施例中，方法涵蓋包含相對於肽中帶負電胺基酸之總數至少一莫耳當量之陽離子。此比在本文中稱為肽:陽離子比。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:1至1:10。肽:陽離子比可為1:2至1:10、1:3至1:10、1:1至1:5、1:2至1:5或1:2至1:8。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:1。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:2。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:3。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:4。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:5。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:6。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:7。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:8。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:9。在各種實施例中，肽:陽離子比為1:10。在各種實施例中，方法涵蓋包含相對於肽中帶負電胺基酸之總數小於一莫耳當量之陽離子。在各種實施例中，方法涵蓋引入例如相對於肽上負電荷之總數0.9、0.8、0.7、0.75、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2或0.1莫耳當量之陽離子。C 型利鈉肽

C型利鈉肽（CNP）（《生物化學與生物物理研究交流（Biochem.Biophys.Res. Commun.）》, 168: 863-870 (1990) (Genbank寄存編號NP_077720，對於CNP前驅蛋白NPPC) (《高血壓雜誌（J. Hypertens.）》, 10: 907-912 (1992)）為具有17個胺基酸之環結構之肽家族（ANP、BNP、CNP）中之小單鏈肽（Levin等人, 《新英格蘭醫學雜誌（N. Engl. J. Med.）》, 339: 863-870 (1998))）且在多種生物過程中具有重要角色。CNP與利鈉肽受體-B （NPR-B、GC-B）相互作用以刺激產生環鳥苷單磷酸（cGMP）（《高血壓雜誌》 10: 1111-1114 (1992)）。CNP更廣泛表現於包括中樞神經系統、生殖道、骨骼及血管內皮中（《高血壓（Hypertension）》, 49: 419-426 (2007)）。

在人類中，CNP最初以單鏈126個胺基酸之前-原多肽形式產生自利鈉肽前驅體C（NPPC）基因（《生物化學與生物物理研究交流》, 168: 863-870 (1990)）。移除信號肽產生原-CNP，且藉由內切蛋白酶弗林蛋白酶進一步裂解產生活性53個胺基酸之肽（CNP-53），其經分泌且藉由未知酶再次裂解以產生成熟的22個胺基酸之肽（CNP-22）（Wu, 《生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）》 278: 25847-852 (2003)）。CNP-53及CNP-22的不同之處在於其分佈，其中CNP-53在組織中占主導地位，而CNP-22主要發現於血漿及腦脊髓液中（J. Alfonzo, 《受體信號轉導研究（Recept.Signal.Transduct.Res.）》, 26: 269-297 (2006)）。CNP-53及CNP-22均與NPR-B類似地結合。

在各種實施例中，本發明之CNP包含介於人類CNP-17（hCNP-17）至人類CNP-53（hCNP-53）範圍內，且具有源自hCNP-53之野生型胺基酸序列的截短CNP。此類截短CNP肽包含： DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-53）（SEQ ID NO: 56）； LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-52）（SEQ ID NO: 15）； RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-51）（SEQ ID NO: 16）； VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-50）（SEQ ID NO: 17）； DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-49）（SEQ ID NO: 18）； TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-48）（SEQ ID NO: 19）； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-47）（SEQ ID NO: 20）； SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-46）（SEQ ID NO: 21）； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-45）（SEQ ID NO: 22）； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-44）（SEQ ID NO: 23）； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-43）（SEQ ID NO: 24）； WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-42）（SEQ ID NO: 25）； ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-41）（SEQ ID NO: 26）； RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-40）（SEQ ID NO: 27）； LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-39）（SEQ ID NO: 28）； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-36）（SEQ ID NO: 29）； HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-35）（SEQ ID NO: 30）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）； NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-33）（SEQ ID NO: 31）； ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-32）（SEQ ID NO: 32）； RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-31）（SEQ ID NO: 33）； KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-30）（SEQ ID NO: 34）； YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-29）（SEQ ID NO: 35）； KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-28）（SEQ ID NO: 36）； GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-27）（SEQ ID NO: 37）； ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-26）（SEQ ID NO: 38）； NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-25）（SEQ ID NO: 39）； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-24）（SEQ ID NO: 40）； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-23）（SEQ ID NO: 41）； GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-22）（SEQ ID NO: 68）； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-21）（SEQ ID NO: 42）； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-20）（SEQ ID NO: 43）； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-19）（SEQ ID NO: 44）； GCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-18）（SEQ ID NO: 45）；及 CFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-17）（SEQ ID NO: 67）。

在各種實施例中，CNP變異肽為經修飾之CNP-37或CNP-38肽，視情況具有弗林蛋白酶裂解位點（加底線）處之突變/取代及/或含有N端處之甘胺酸或脯胺酸-甘胺酸。例示性CNP-37變異體包含但不限於： QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37（M32N）；SEQ ID NO: 46]； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP-37；SEQ ID NO: 47）； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP-37；SEQ ID NO: 48）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37（M32N）；SEQ ID NO: 49]； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 50）；及 GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37: SEQ ID NO: 51）G QEHPNARKYKGANPK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 52）；G QEHPNARKYKGANQK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 53）；G QEHPNARKYKGANQQ GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 54）；及G QEHPNARKYKGANKP GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 55）。

在其他實施例中，對於具有天冬醯胺（Asn/N）殘基及/或麩醯胺酸（Gln/Q）殘基之本文所述之CNP及CNP變異體中之任一者，無論其是否具有野生型序列或非天然胺基酸序列，任何Asn殘基及/或任何Gln殘基可獨立地經任何其他天然或非天然胺基酸取代，包含保守取代，諸如Asn至Gln。此類取代部分地經設計以最小化或避免天冬醯胺及/或麩醯胺酸之任何潛在去醯胺。

額外CNP肽及變異體係揭示於以引用之方式併入本文中之美國專利8,198,242中。

在各種實施例中，帶靜電肽為C型利鈉肽（CNP）或CNP變異體且親水性肽鹽為CNP或CNP變異體之鹽。在各種實施例中，CNP為如本文所述之CNP變異體。

在各種實施例中，CNP選自由以下組成之群組： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）；及其醫藥鹽。在各種實施例中，CNP為CNP-乙酸鹽。

在各種實施例中，當疏水性肽鹽為疏水性CNP鹽時，疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。在各種實施例中，若存在多價陽離子，則陽離子包括鋅、鎂或鈣。在各種實施例中，若存在陽離子，則陽離子包括鋅。在各種實施例中，陽離子包括鈣。在各種實施例中，若存在多價陽離子，則陽離子為Zn²⁺ 、Mg²⁺ 或Ca²⁺ 。在各種實施例中，若存在陽離子，則陽離子為Zn²⁺ 。在各種實施例中，若存在陽離子，則陽離子為Ca²⁺ 。

在各種實施例中，本發明提供C型利鈉肽之疏水性鹽，其包括與疏水性相對離子錯合之CNP肽。在各種實施例中，鹽進一步包括多價陽離子，視情況金屬陽離子。在各種實施例中，該鹽為純化之CNP鹽。

純化疏水性鹽之方法為此項技術中已知的且涵蓋於本文中。在各種實施例中，疏水性鹽之純度為至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更大。

使用方法

軟骨發育不全為纖維母細胞生長因子受體3（FGFR-3）之基因中常染色體顯性遺傳突變的結果，此導致軟骨形成異常。FGFR-3對軟骨細胞生長通常具有負調節作用，且因此對骨骼生長具有負調節作用。在軟骨發育不全中，FGFR-3之突變形式為組成性活性的，導致骨骼嚴重縮短。在人類中，FGFR-3之活化突變為遺傳性侏儒症的主要起因。具有活化FGFR-3之小鼠用作軟骨發育不全（骨骼發育不良的最常見形式）之模型，且CNP之過度表現拯救此等動物免遭侏儒症。因此，CNP及CNP之功能變異體為治療多種骨骼發育不良的潛在治療劑。

藉由刺激軟骨細胞之基質產生、增殖及分化以及增加長骨生長，本發明之CNP鹽適用於治療罹患骨相關病症（諸如骨骼發育不良）之哺乳動物，包含人類。CNP反應性骨相關病症及骨骼發育不良之非限制性實例包含軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性發育不良、先天性成骨、軟骨成長不全、點狀軟骨發育異常、純合性軟骨發育不全、點狀軟骨發育異常、屈肢骨發育不良、先天性致死型低磷酸酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋骨多指症候群、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育異常、揚森型幹骺端發育不良、先天性脊椎骨骺發育不良、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良、尼維格型肢中骨發育不良、羅氏症候群、萊因哈特症候群、肢端發育不全、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良、纖維軟骨增生症、羅伯茨症候群、肢端肢中發育不全、小肢、莫奎氏症候群、克尼斯特症候群、後生營養性發育不良、脊椎骨骺幹骺端發育不良、NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）及PTPN11突變（努南氏症候群）。

藉由刺激軟骨細胞之基質產生、增殖及分化以及增加長骨生長，本發明之CNP變異體適用於治療罹患骨相關病症（諸如骨骼發育不良）之哺乳動物，包含人類。CNP反應性骨骼相關病症及骨骼發育不良之非限制性實例包括軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性骨發育不良、成骨不全、軟骨成長不全、先天性成骨不全、純合性軟骨發育不全、先天性成骨不全、屈肢骨發育不良、先天性致死型低磷酸酯酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋多指症候群、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育不良、揚森型幹骺端發育不良、先天性脊椎骨骺發育不良、骨發育不全症、扭曲性骨發育不良、先天性股骨短、蘭格型肢中骨發育不良、尼維格型肢中骨發育不良、羅氏症候群、萊因哈特症候群、肢端發育不全、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良、纖維軟骨生成、羅伯茨症候群、肢端肢中發育不全、小肢、莫奎氏症候群、克尼斯特症候群、後生營養發育不良以及脊椎幹骺端發育不良。本文中涵蓋之身材矮小、生長板病症、骨相關病症或骨骼發育不良包含涉及NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）、PTPN11突變（努南氏症候群）及IGF1R突變之病症。

本文中涵蓋之身材矮小、生長板病症、骨相關病症或骨骼發育不良包含涉及NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）及PTPN11突變（努南氏症候群）之病症。

方法涵蓋之額外身材矮小及生長板病症包含涉及膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3之突變的病症。

方法涵蓋之額外身材矮小及生長板病症包含涉及膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或IGF1R之突變的病症。

另外，CNP鹽適用作用於治療特發性身材矮小及其他骨骼發育不良之生長激素的輔助或替代。

生長板病症包含導致身材矮小或骨生長異常及可為涉及骨生長之基因中之基因突變之結果的病症，該基因包含膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3。在各種實施例中，生長板病症包含導致身材矮小或骨生長異常及可為涉及骨生長之基因中之基因突變之結果的病症，該基因包含膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或IGF1R。在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多種突變相關。在各種實施例中，患有生長板病症之個體對於生長板基因中之突變為異型接合的。在各種實施例中，突變為功能損失型突變。在各種實施例中，突變為功能獲得型突變。生長板病症包含但不限於家族性身材矮小、顯性家族性身材矮小（其亦稱為顯性遺傳性身材矮小）或特發性身材矮小。參見例如Plachy等人, 《臨床內分泌代謝雜誌（J Clin Endocrinol Metab）》 104: 4273-4281, 2019。

ACAN之突變可引起家族性剝脫性骨軟骨炎及身材矮小且最終引起骨關節炎，其特徵在於由軟骨及有時骨頭在關節處自骨末端脫離引起之骨損傷（或病變）區域。已提出骨生長中之軟骨網狀結構錯亂會損害其生長，導致身材矮小。與ACAN及身材矮小相關之突變包含Val2303Met。參見Stattin等人《美國人類遺傳學雜誌（Am J Hum Genet）》 86(2):126-37, 2010。預期具有導致身材矮小之ACAN突變的患者將受益於CNP治療，因為投藥可能夠藉由CNP與FGFR3之已知相互作用增加此等患者之身高。

已展示利鈉肽系統（包含受體NPR2）參與軟骨內化骨生長之調節（Vasques等人, 《兒科激素研究（Horm Res Pediat）》 82:222-229, 2014）。研究已展示NPR2中之同型接合或複合異型接合功能損失型突變引起肢端肢中發育不良型Maroteaux（AMDM），其為骨骼具有極其矮小身材之發育不良（Vasquez等人, 2014, 前述）。有報導暗示異型接合功能損失型（諸如顯性負性）NPR2突變係身材矮小之原因，而功能獲得型NPR2異型接合突變已被發現係高大身材之原因（Vasquez等人, 2014, 前述）。鑒於CNP與NPR2相互作用以刺激cGMP生成，增加cGMP水準在此等情況下為期望的，且將在管理來自此等疾病及病況之併發症中具有治療益處。

咸信NPR2之異型接合突變導致特發性身材矮小及其他形式之身材矮小。NPR2基因之突變陳述於下文且描述於以下各者中：Amano等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》 99:E713-718, 2014，Hisado-Oliva等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》 100:E1133-1142, 2015及Vasques等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》 98:E1636-1644, 2013，其以引用之方式併入本文中。預期患有待用如本文所述之CNP變異體治療之身材矮小的個體具有小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS，且具有至少一個具有小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5之身高SDS的親代，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療患有身高SDS為-2.0至-3.0之身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療患有身高SDS為-2.0至-2.5之身材矮小的個體。然而，由於NPR2中之新生突變可導致如小於-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS所定義的身材矮小，因此亦涵蓋治療任一親代均不患有身材矮小的作為NPR2中之有害突變之異型接合攜帶者的個體。進一步預期用CNP治療對於其他生長板基因中之有害突變為異型接合之個體，以改善身材及/或增強骨生長。

可用CNP變異體治療之患者之例示性NPR2突變包含：

疾病	核苷酸	突變	胺基酸變化
身材矮小	1669C＞T	誤義	Arg557Cys
身材矮小	2794C＞T	誤義	Arg932Cys
身材矮小	2905G＞C	誤義	Val969Leu
身材矮小	3058C＞T	誤義	Arg1020Trp
身材矮小	2972A＞G	誤義	Glu991Gly
身材矮小	1262C＞T	誤義	Thr421Met
身材矮小	766G＞T	誤義	Asp256Tyr
身材矮小	1982C＞A	誤義	Thr661Lys
身材矮小	2449G＞A	誤義	Glu817Lys
身材矮小	1517G＞A	誤義	Arg506His
身材矮小	1802G＞C	誤義	Arg601Pro
身材矮小	1481T＞G	誤義	Ile494Ser
身材矮小	142G＞T	誤義	Ala48Ser
身材矮小	1167G＞T	誤義	Glu389Asp
身材矮小	1249C＞G	誤義	Gln417Glu
身材矮小	328C＞T	誤義	Arg110Cys
身材矮小	2455C＞T	誤義	Arg819Cys
身材矮小	788G＞C	誤義	Arg263Pro
身材矮小	226T＞C	誤義	Ser76Pro
身材矮小	2710A＞T	無義	Lys904Term

9:35809194:C:G	Leu1009Val
9:35802761:G:C	Leu615Phe
9:35799645:C:T	Pro301Ser
9:35792928:C:T	Arg174Cys
9:35801728:C:G	His508Asp
9:35792713:T:C	Val102Ala
9:35793980:T:A	Tyr250Ter
9:35807085:C:T	Thr861Ile
9:35793906:A:G	Ile226Val
9:35808558:G:A	Arg921Gln
9:35802741:G:A	Glu609Lys
9:35802594:G:A	Arg601His
9:35808663:T:A	Leu956Gln
9:35808545:G:C	Gly917Arg

NPPC於骨骼生長中之作用為有據可查的。（Hisado-Oliva等人, 《遺傳學醫學（Genetics Medicine）》 20:91-97, 2018）。NPPC敲除小鼠展示嚴重不成比例形式之侏儒症，包含四肢縮短及軟骨內骨化（Hisado-Oliva等人, 2018, 前述）。人類全基因體研究已展示NPPC與身高之間的關聯（Hisado-Oliva等人, 2018, 前述）。儘管咸信CNP單倍劑量不足為人類身材矮小之原因，但近來的研究鑑別了身材矮小且雙手短小之家庭中之異型接合突變（Hisado-Oliva等人, 2018, 前述）。此等研究觀測以異型接合狀態量測之cGMP產量顯著降低（Hisado-Oliva等人, 2018, 前述）。NPPC之突變包含引起Gly119Cys改變之355G＞T誤義突變及引起Arg117Gly改變之349C＞G誤義突變。拯救CGMP生產之CNP變異體可在具有異型接合功能損失型NPPC突變之患者的病症管理中提供治療益處。

萊里-維爾軟骨骨生成障礙（LWD）為稀有遺傳病症，其特徵在於前臂及小腿縮短、手腕異常錯位（手腕馬得隆變形（Madelung deformity））及相關之身材矮小。LWD係由位於性染色體之假常染色體區域1（PAR1）上之含身材矮小同源盒（SHOX）基因或其調節元件中之異型接合突變引起。（參見稀有疾病資料庫及Carmona等人, 《人類分子遺傳學（Hum Mol Genet）》 20:1547-1559, 2011）。病症蘭格肢中骨發育不良在存在兩個SHOX突變時產生，且可由各染色體上之突變（同型接合或複合異型接合突變）產生。SHOX突變之子集引起特發性身材矮小。特納症候群由於可包含SHOX基因之X染色體上之缺失而產生。SHOX已鑑別為參與FGFR3轉錄調節且有助於骨生長控制（Marchini等人, 《內分泌綜述（Endocr Rev.）》 37: 417-448, 2016）。SHOX缺乏導致FGFR3信號傳導增加，且一些證據支持SHOX亦與CNP/NPR2直接相互作用（Marchini, 前述）。鑒於SHOX與FGFR3及骨生長之關聯，預期具有同型接合或異型接合SHOX突變之個體將受益於用如本文所述之CNP變異體治療。

拉索病為由Ras/促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）路徑基因中之突變引起的一組罕見遺傳病症。拉索病為特徵在於經由RAS/MAPK路徑之信號傳導增加的一組病症。此路徑導致RAF/MEK/ERK路徑之下游激活。身材矮小為某些拉索病之典型特徵。例如，CNP信號傳導抑制RAF且使得MEK及ERK活化降低。

本文中涵蓋拉索病治療。與身材矮小相關之拉索病包含努南症候群、科斯特洛症候群、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤及LEOPARD症候群。遺傳性1型齒齦纖維瘤病亦為本文中涵蓋之拉索病。拉索病患者（包含努南症候群、科斯特洛症候群、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤、LEOPARD症候群、遺傳性1型齒齦纖維瘤病）包含具有以下基因中之一或多者中之異型接合變異體的患者：BRAF、CBL、HRAS、KRAS、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MRAS、NF1、NRAS、PPP1CB、PTPN11、RAF1、RRAS、RIT1、SHOC2、SOS1或SOS2（Tajan等人《內分泌綜述》 2018;39(5):676-700）。

CFC由Ras/MAPK信號傳導路徑中之若干基因之突變引起，包含K-Ras、B-Raf、Mek1及Mek2。科斯特洛症候群（亦稱為顏面皮膚骨骼（FCS）症候群）由H-Ras基因中之活化突變引起。遺傳性I型齒齦纖維瘤病（HGF）由SOS1基因（Son of Sevenless 同源物1）中之顯性突變引起，該基因編碼作用於小GTP酶之Ras子族的鳥嘌呤核苷酸交換因子（SOS）。I型神經纖維瘤（NF1）由神經纖維瘤蛋白1基因中之突變引起，該基因編碼Ras/MAPK信號傳導路徑之負調節因子。努南症候群（NS）由若干基因中之一者之突變引起，該等基因包含PTPN11（其編碼SHP2）及SOS1，以及K-Ras及Raf-1。

已表明CNP為拉索病模型中之有效療法。Ono等人產生在II型膠原蛋白生產細胞中缺乏Nf1 之小鼠（Ono等人, 《人類分子遺傳學（Hum. Mol. Genet.）》2013;22(15):3048-62）。此等小鼠展現組成型ERK1/2活化，及軟骨細胞增殖減少，及成熟。向此等小鼠每日注射CNP使得ERK磷酸化降低且校正了身材矮小。使用Braf 突變（p.Q241R）之心臉皮膚症候群之小鼠模型（Inoue等人《人類分子遺傳學》2019;28(1):74-83）展現相比於野生型減小之體長及減小之生長板寬度與較小增生及肥大區域，且投與CNP使得此等動物之體長增加。

多個基因之突變可引起努南症候群，其特徵在於身材矮小、心臟缺陷、出血問題及骨骼畸形。PTPN11基因之突變引起努南症候群之所有病例的大約一半。SOS1基因突變引起額外10至15%病例，且RAF1及RIT1基因各占病例之約5%。其他基因之突變各占少數病例。15至20%患有努南症候群之人群的病因為未知的。

PTPN11、SOS1、RAF1及RIT1基因全部編碼在RAS/MAPK細胞信號傳導路徑中重要之蛋白質，該路徑對於細胞分裂及生長（增殖）、分化及細胞遷移係必需的。與努南症候群相關之基因中之許多突變使所得蛋白質被打開（激活），且此長時間激活改變正常RAS/MAPK信號傳導，其破壞細胞生長及分裂調節，從而導致努南症候群之特性特徵。參見例如Chen等人, 《美國國家科學院院刊（Proc Natl Acad Sci U S A.）》111(31):11473-8, 2014，Romano等人, 《嬰兒病學（Pediatrics.）》126(4):746-59, 2010，及Milosavljević等人, 《美國醫學遺傳學雜誌（Am J Med Genet）》 170(7):1874-80, 2016。預期具有激活MAPK路徑之突變的個體將受益於用如本文所述之CNP變異體治療，以改善骨生長及身材矮小。亦預期具有激活MAPK路徑之突變的個體將受益於用如本文所述之CNP變異體治療，以改善與整個身體之其他細胞（其中NPR2受體表現於其表面上）中之過度活化MAPK路徑相關的其他共患病。

PTPN11基因（其編碼非受體蛋白酪胺酸磷酸酶SHP-2）之突變導致特徵為身材矮小之病症，諸如努南症候群（Musente等人, 《歐洲人類遺傳學雜誌（Eur J Hum Genet） 11:201-206 (2003)。Musente（前述）鑑別PTPN11基因中導致身材矮小之許多突變。功能獲得型突變經由SHP2之過度活化信號傳導且抑制生長激素誘導之IGF-1釋放，從而使得骨生長降低（Rocca Serra-Nédélec, 《美國國家科學院院刊（PNAS）》 109:4257-4262, 2012）。預期具有同型接合或異型接合PTPN11突變的個體將受益於用如本文所述之CNP變異體治療，以改善骨生長及身材矮小。

印度刺蝟因子（IHH）基因（其與軟骨內骨化之調節有關）之突變亦與身材矮小症候群相關（Vasques等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》103:604-614, 2018）。許多鑑別之IHH突變以顯性遺傳模式與身材矮小分隔。鑒於IHH與骨生長及骨化之關聯，預期具有同型接合或異型接合IHH突變之個體將受益於用如本文所述之CNP變異體治療。

FGFR3之突變，包含N540K及K650N導致身材矮小及軟骨生成減退。

胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）為具有內在激酶活性之雜四聚體（α2β2）跨膜醣蛋白。已展示IGF1R在產前及產後生長中起作用。已在小於胎齡兒（SGA）及患有家族性身材矮小之個體中鑑別IGF1R之異型接合突變（Kawashima等人, 《內分泌雜誌（Endocrine J.）》59:179-185, 2012）。與身材矮小相關之IGF1R突變包含R108Q/K115N、R59T、R709Q、G1050K、R481Q、V599E及G1125A（Kawashima，前述）。

身高為可受數百個或數千個基因之組合效應影響的高度遺傳性性狀（Wood等人, 《自然遺傳學》, 46:1173-1189, 2014）。個別身材矮小可為此等基因之組合效應的結果，單個基因並非主要貢獻者。鑒於CNP增加正常動物之長度，例如增強骨生長及骨長度之能力，預期患有由小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS定義之身材矮小的此類個體可有益地用CNP變異體治療。

在各種實施例中，CNP變異體適用於治療患有如下之身材矮小的個體：身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0，且至少一個親代之身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療患有身高SDS為-2.0至-3.0之身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體適用於治療患有身高SDS為-2.0至-2.5之身材矮小的個體。在各種實施例中，身材矮小與相關於身材矮小之基因中之一或多種突變相關，諸如膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白聚糖（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰島素生長因子1受體（IGF1R）或其組合。

另外，CNP鹽適用於治療其他骨相關病況及病症，諸如佝僂病、低磷酸鹽血性佝僂病[包括X連鎖低磷酸鹽血性佝僂病（亦稱為維生素D耐藥性佝僂病）及常染色體顯性低磷酸鹽血性佝僂病]，及骨質軟化[包含腫瘤誘導之骨質軟化（亦稱為致癌骨質軟化或致癌低磷酸鹽血性骨質軟化）]。

本發明之CNP鹽亦可用於治療骨關節炎。骨關節炎為關節軟骨之退化疾病且在老年人中頻繁發生。骨關節炎涉及軟骨破壞及由關節成分退化引起的骨及軟骨之增生性變化，其中該變化導致繼發性關節炎（例如滑膜炎）。在骨關節炎中，細胞外基質蛋白（其為軟骨之功能實體）減少，且軟骨細胞數目減少（《風濕性關節炎（Arth。Rheum.）》46(8): 1986-1996 (2002)）。藉由促進軟骨細胞之基質產生、生長及分化，CNP組合物適用於抵消FGF-2之非所期望的效應，且增加罹患關節炎（包含骨關節炎）之個體的基質合成，由此治療關節炎，包含骨關節炎。

在某些實施例中，本發明之CNP鹽及包括其之組合物及調配物適用於改善骨骼發育不良之一或多種症狀或生理學後果，其中該改善可為絕對生長增加、生長速度增加、定性電腦斷層攝影（QCT）骨礦物質密度增加、生長板形態改善、長骨生長增加、脊柱形態改善、肘關節活動範圍改善及/或睡眠呼吸暫停減少。就此而言，應注意術語「改良」、「增加」、「降低」及其語法等效物當相對於疾病狀態之症狀或生理學後果使用時均為相對術語，係指用本發明之CNP鹽肽（或包含其之組合物或調配物）治療後疾病的症狀或生理學後果相較於用本發明之CNP鹽（或包含其之組合物或調配物）治療之前的疾病的相同症狀或生理學後果（即相較於「基線」）的狀態。如上文所述，「基線」狀態可藉由治療之前的個體狀態之量測（其可隨後與治療後之同一個體的狀態相比），或藉由罹患共用相同或類似特徵（例如年齡、性別及/或疾病狀態或進展）之相同病痛之個體群體的狀態之量測測定。

在另一實施例中，本發明提供CNP變異體之鹽，其活體外或活體內刺激產生相同wtCNP22濃度（例如1 μM）下產生之cGMP水準的至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。在另一實施例中，包括本發明之CNP或CNP變異體之疏水性鹽活體外或活體內刺激產生相同wtCNP22濃度（例如1 μM）下產生之cGMP水準的至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。

預期本文所述之CNP變異體中之任一者適用於方法。

在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37（SEQ ID NO: 1））。在各種實施例中，肽進一步包括乙醯基。在各種實施例中，乙醯基在肽之N端上。在各種實施例中，乙醯基在肽序列內之胺基酸側鏈上。在各種實施例中，肽於C端進一步包括OH或NH₂ 基團。在各種實施例中，變異體包括一或多個如本文所述之連接基團。在各種實施例中，連接基團為可水解連接基團。在各種實施例中，肽包括帶靜電肽鹽，該鹽包括與疏水性相對離子錯合之帶靜電肽。

藉由各種參數來量測治療功效。在各種實施例中，功效係評估為自基線期至干預期按年計算之生長速度變化。功效亦將評估為如使用CDC生長曲線所量測的自基線至治療結束之身高SDS變化，且生長速度SDS將基於兒童研究中之骨礦物質密度（Kelly等人, 《臨床內分泌代謝雜誌》2014;99(6):2104-2112）。

按指導評估QoLISSY，身材矮小青年之生活品質（身材矮小青年之生活品質-QoLISSY 調查表使用者手冊（Quality of Life in Short Stature Youth - The QoLISSY Questionnaire User ' s Manual .）Lengerich: Pabst Science Publishers; 2013）。

醫藥組合物

本發明提供醫藥組合物，包含緩釋組合物，其包括本文所述之肽鹽，及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、及/或稀釋劑。在某些實施例中，組合物進一步包括一或多種其他生物活性劑（例如蛋白酶、受體酪胺酸激酶及/或清除受體NPR-C之抑制劑）。

本發明提供包括如本文所述之疏水性肽鹽的緩釋組合物。在各種實施例中，緩釋組合物為延釋組合物。在各種實施例中，延釋組合物包括疏水性CNP鹽。在各種實施例中，CNP鹽中之疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。在各種實施例中，若存在多價陽離子，則陽離子包括鋅或鈣。在各種實施例中，若存在陽離子，則陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。

沈澱之肽複合物可在形成沈澱之pH條件下顯示延釋特徵。沈澱之肽複合物亦可用於進一步加工為基質，該基質為持續釋放提供額外屏障，諸如緩慢降解微球、水凝膠及其類似物。預期疏水性CNP鹽為固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子，且再懸浮於水溶液或油中。在各種實施例中，水溶液為水、鹽水或緩衝液。在各種實施例中，粒子為1至10,000微米（μm）、1 μm至2000 μm、2 μm至1000 μm、5 μm至500 μm、10 μm至1000 μm、50 μm至500 μm、100 μm至800 μm、200至600 μm、300 μm至500 μm、100 μm至300 μm、50 μm至100 μm或10 μm至50 μm。在各種實施例中，粒子為奈米粒子。在各種實施例中，奈米粒子為大約5奈米（nm）至1000 nm，8 nm至900 nm，10 nm至800 nm，20 nm至600 nm，50 nm至500 nm，50至400 nm，20至300 nm，300至800 nm或200至600 nm。

在各種實施例中，油包括三酸甘油酯或脂肪酸，其可為飽和或不飽和的。如本文所述之三酸甘油酯及脂肪酸亦預期與疏水性CNP鹽組合物一起使用。在各種實施例中，脂肪酸為己酸、辛酸、癸酸或十二酸。在各種實施例中，脂肪酸為己酸、辛酸、癸酸、十二酸或多庫酯。

在各種實施例中，在pH 7至7.6下，第1天釋放小於約20%之肽。進一步預期（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約30%、或約40%、或約50%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽，或每兩週釋放約90%之肽，或每月釋放約90%之肽。進一步預期（i）在pH 7.0至7.6下，第1天釋放小於約30%、或約40%、或約50%、或約60%之肽；及（ii）在pH 7至7.6下，每週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每兩週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每三週釋放約70%、約80%或約90%之肽；或每月釋放約70%、約80%或約90%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每週釋放約90%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每兩週釋放約90%之肽。在各種實施例中，在pH 7至7.6下，每月釋放約90%之肽。進一步預期該釋放可在pH 7.0至7.6、pH 7.1至7.5、pH 7.2至7.4、pH 7.2至7.6或pH 7.0至7.4之pH下。

在各種實施例中，延釋組合物包括賦形劑、稀釋劑或載劑。在各種實施例中，賦形劑、稀釋劑或載劑為醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

賦形劑、載劑及稀釋劑之非限制性實例包含媒劑、液體、緩衝劑、等張劑、添加劑、穩定劑、防腐劑、增溶劑、界面活性劑、乳化劑、濕潤劑、佐劑等。組合物可含有液體（例如水、乙醇）；各種緩衝劑內容物（例如Tris-HCl、磷酸鹽、乙酸鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑）、pH及離子強度之稀釋劑；洗滌劑及增溶劑（例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80）；抗氧化劑（例如甲硫胺酸、抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉）；防腐劑（例如Thimerosol、苯甲醇、間甲酚）；以及膨化物質（例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖）。在醫藥組合物之調配中使用賦形劑、稀釋劑及載劑為此項技術中已知的；參見例如《雷明頓氏藥物科學》, 第18版, 第1435-1712頁, Mack Publishing Co.(Easton, Pennsylvania (1990))，其以全文引用之方式併入本文中。

例如，載劑包含但不限於稀釋劑、媒劑及佐劑，以及植入物載劑，及惰性、無毒固體或液體填充劑及囊封材料，其不與活性成分反應。載劑之非限制性實例包含磷酸鹽緩衝鹽水、生理鹽水、水以及乳液(例如油/水乳液)。載劑可為含有例如乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物）、植物油及其混合物之溶劑或分散介質。

在一些實施例中，組合物為液體調配物。在某些實施例中，調配物包括疏水性CNP鹽，其濃度範圍為約0.1 mg/ml至約20 mg/ml，或約0.5 mg/ml至約20 mg/ml，或約1 mg/ml至約20 mg/ml，或約0.1 mg/ml至約10 mg/ml，或約0.5 mg/ml至約10 mg/ml，或約0.5至5 mg/ml，或約0.5至3 mg/ml，或約1 mg/ml至約10 mg/ml。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為0.8 mg/mL至2 mg/mL。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為0.8 mg/mL。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為2.0 mg/mL。在各種實施例中，CNP變異體由凍乾粉復原。

在其他實施例中，組合物包含緩衝溶液或緩衝劑以將含有CNP之溶液或懸浮液的pH維持於所期望的範圍內。緩衝溶液之非限制性實例包括磷酸鹽緩衝鹽水、Tris緩衝鹽水以及漢克氏緩衝鹽水（Hank's buffered saline）。緩衝劑包含但不限於乙酸鈉、磷酸鈉及檸檬酸鈉。亦可使用緩衝劑之混合物。在某些實施例中，緩衝劑為乙酸/乙酸鹽或檸檬酸/檸檬酸鹽。組合物中適合的緩衝劑之量部分取決於所用之具體緩衝劑以及溶液或懸浮液之所期望的pH。在一些實施例中，緩衝劑之濃度為約10 mM±5 mM。在某些實施例中，組合物之pH為約pH 3至約pH 9，或約pH 3至約pH 7.5，或約pH 3.5至約pH 7，或約pH 3.5至約pH 6.5，或約pH 4至約pH 6，或約pH 4至約pH 5，或為約pH 5.0±1.0。在各種實施例中，pH為約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在各種實施例中，pH為5.5。

在其他實施例中，組合物含有等張調節劑以使溶液或懸浮液等張且與投藥更相容。等張劑之非限制性實例包含NaCl、右旋糖、葡萄糖、甘油、山梨糖醇、木糖醇及乙醇。在某些實施例中，等張劑為NaCl。在某些實施例中，NaCl之濃度為約160±20 mM，或約140 mM±20 mM，或約120±20 mM，或約100 mM±20 mM，或約80 mM±20 mM，或約60 mM±20 mM。

在其他實施例中，組合物包括防腐劑。防腐劑包含但不限於間甲酚及苯甲醇。在某些實施例中，防腐劑之濃度為約0.4%±0.2%，或約1%±0.5%，或約1.5%±0.5%，或約2.0%±0.5%。

在其他實施例中，組合物含有抗吸附劑（例如減少CNP鹽吸附至玻璃或塑膠）。抗吸附劑包含但不限於苯甲醇、聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。在某些實施例中，抗吸附劑之濃度為約0.001%至約0.5%，或約0.01%至約0.5%，或約0.1%至約1%，或約0.5%至約1%，或約0.5%至約1.5%，或約0.5%至約2%，或約1%至約2%。

在其他實施例中，組合物包括穩定劑。穩定劑之非限制性實例包括甘油、丙三醇、硫代甘油、甲硫胺酸以及抗壞血酸及其鹽。在一些實施例中，當穩定劑為硫代甘油或抗壞血酸或其鹽時，穩定劑濃度為約0.1%至約1%。在其他實施例中，當穩定劑為甲硫胺酸時，穩定劑之濃度為約0.01%至約0.5%，或約0.01%至約0.2%。在其他實施例中，當穩定劑為甘油時，穩定劑之濃度為約5%至約100%（純）。

在其他實施例中，組合物含有抗氧化劑。例示性抗氧化劑包含但不限於甲硫胺酸及抗壞血酸。在某些實施例中，抗氧化劑與CNP之莫耳比為約0.1:1至約15:1，或約1:1至約15:1，或約0.5:1至約10:1，或約1:1至約10:1或約3:1至約10:1。

醫藥學上可接受之鹽可用於組合物，包含但不限於無機酸鹽（例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽）、有機酸鹽（例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽）及胺（例如異丙胺、三甲胺、二環己胺、二乙醇胺）鹽。醫藥學上可接受之鹽之徹底論述見於《雷明頓氏醫藥科學》, 第18版, Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990))中。

醫藥組合物可以各種形式投與，諸如錠劑、膠囊、顆粒、粉末、溶液、懸浮液、乳液、軟膏及經皮貼片。組合物之劑型可調適為組合物之所期望的投藥模式。對於經口投與，組合物可採取例如錠劑或膠囊（包含軟凝膠膠囊）之形式，或可例如為水性或非水性溶液、懸浮液或糖漿。用於經口投與之錠劑及膠囊可包含一或多種常用的賦形劑、稀釋劑及載劑，諸如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、澱粉、玉米澱粉、糖精鈉、滑石、纖維素、碳酸鎂及潤滑劑（例如硬脂酸鎂、硬脂醯反丁烯二酸鈉）。必要時，可將調味劑、著色劑及/或甜味劑添加至固體及液體調配物。用於口服調配物之其他視情況存在之成分包含但不限於防腐劑、懸浮劑及增稠劑。口服調配物亦可具有腸溶衣以保護CNP鹽免受胃之酸性環境侵害。製備固體及液體劑型之方法為已知的，或將為熟習此項技術者顯而易見（參見例如上文引用之《雷明頓氏醫藥科學》）。

用於非經腸投與之調配物可例如以液體溶液或懸浮液形式、以適合於在注射之前溶解或懸浮於液體介質中之固體形式或以乳液形式製備。舉例而言，無菌可注射溶液及懸浮液可根據此項技術中已知的技術使用適合稀釋劑、載劑、溶劑（例如緩衝水溶液、林格氏溶液（Ringer's solution）、等張氯化鈉溶液）、分散劑、濕潤劑、乳化劑、懸浮劑及其類似物調配。另外，可使用無菌固定油、脂肪酯、多元醇及/或其他非活性成分。作為其他實例，用於非經腸投與之調配物包含可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性無菌注射溶液；以及可含有懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。

包括疏水性CNP鹽之組合物亦可為凍乾調配物。在某些實施例中，凍乾調配物包括緩衝劑及膨化劑，以及視情況存在之抗氧化劑。例示性緩衝劑包含但不限於乙酸鹽緩衝劑及檸檬酸鹽緩衝劑。例示性膨化劑包含但不限於甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、海藻糖及聚維酮（PVP K24）。在某些實施例中，甘露糖醇之量為約3%至約10%，或約4%至約8%，或約4%至約6%。在某些實施例中，蔗糖之量為約6%至約20%，或約6%至約15%，或約8%至約12%。例示性抗氧化劑包含但不限於甲硫胺酸及抗壞血酸。

在各種實施例中，調配物包括檸檬酸、檸檬酸鈉、海藻糖、甘露糖醇、甲硫胺酸、聚山梨醇酯80及視情況選用之無菌注射用水（WFI）。

本發明亦提供套組，其含有例如包括液體（例如無菌可注射）調配物或固體（例如凍乾）調配物之瓶、小瓶、安瓿、管、藥筒及/或注射器。套組亦可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑、溶液及/或緩衝液），其用於將固體（例如凍乾）調配物復原為溶液或懸浮液以用於投與（例如藉由注射），包含但不限於復原注射器中的凍乾調配物以用於注射或將濃縮物稀釋至較低濃度。此外，即用型注射溶液及懸浮液可自例如包括含有CNP之組合物的無菌粉末、顆粒或錠劑製備。套組亦可包括散佈裝置（諸如噴霧或注射散佈裝置）、筆式噴射器、自噴射器、無針噴射器、注射器及/或針。

作為非限制性實例，套組可包含具有單腔室或雙腔室之注射器。對於單腔室注射器，該單腔室可含有準備好進行注射之液體CNP調配物，或固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP鹽於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可復原為注射用溶液或懸浮液。對於雙腔室注射器，一個腔室可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑系統、溶液或緩衝液），且另一腔室可含有固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP鹽於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可使用來自第一腔室之媒劑或載劑復原為注射用溶液或懸浮液。

作為另一實例，套組可包含一或多個筆式注射器或自動注射器裝置，及雙腔室藥筒。藥筒之一個腔室可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑系統、溶液或緩衝液），且另一腔室可含有固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP鹽於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可使用來自第一腔室之媒劑或載劑復原為注射用溶液或懸浮液。藥筒可包括足以經所期望的時段（例如2天、3天、1週、2週、3週、4週等）給藥之量的CNP鹽。筆式注射器或自動注射器可經調節以投與所期望的量的來自藥筒之CNP調配物。

投藥及給藥

疏水性CNP鹽或包括其之醫藥組合物或調配物可以不同方式向個體投與，諸如皮下、關節內、腹膜內、肌肉內、皮內或經口。在一個實施例中，每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次地投與CNP肽鹽組合物。

疏水性CNP鹽或鹽組合物亦可藉由在目標作用部位（例如異常或退化的關節或軟骨區域）植入藥物儲槽來投與。或者，CNP鹽可藉由經皮遞送（例如藉助於皮膚上之貼片）在舌下（例如舌下錠劑）舌下投與，或以微球、微膠囊、脂質體（不帶電或帶電（例如陽離子））、聚合微米粒子（例如聚醯胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(交酯-乙交酯)）、微乳液及其類似形式經口投與。

本文所述之疏水性CNP鹽組合物可以治療有效劑量向有需要之患者投與，以治療、改善或預防骨相關病症（例如骨骼發育不良，包含軟骨發育不全）。CNP鹽之安全性及治療功效可藉由細胞培養物或實驗動物中之標準藥理學程序測定，諸如藉由測定LD₅₀ （對於50%之群體致死性的劑量）及ED₅₀ （在50%之群體中治療有效的劑量）。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數且其可以比率LD₅₀ /ED₅₀ 表示。展現大的治療指數之活性劑通常較佳。

在某些實施例中，本文所述之疏水性CNP鹽組合物係以約5或10 nmol/kg至約300 nmol/kg，或約20 nmol/kg至約200 nmol/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，CNP鹽組合物係以約5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000 nmol/kg之劑量或治療醫師認為適當之其他劑量投與。在其他實施例中，CNP鹽組合物係以約5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 µg/kg，或約0.5、0.8、1.0、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10 mg/kg之劑量，或治療醫師認為適當之其他劑量投與。本文所述之疏水性CNP鹽之劑量可根據本文所述之給藥頻率/投藥頻率投與，包含但不限於每日、每週2或3次、每週、每2週、每3週、每月等。在各種實施例中，CNP鹽係每日皮下投與。在各種實施例中，CNP鹽係每週皮下投與。在各種實施例中，CNP變異體係以2.5微克/公斤/天至60微克/公斤/天、10微克/公斤/天至45微克/公斤/天或15微克/公斤/天至30微克/公斤/天之劑量進行投與。在各種實施例中，CNP變異體係以15微克/公斤/天之劑量投與。在各種實施例中，CNP變異體係以30微克/公斤/天之劑量投與。

針對特定個體之疏水性CNP鹽之給藥/投藥頻率可視各種因素而變化，包含治療之病症及個體之狀況及對療法之反應。疏水性CNP鹽可以每次給藥單次劑量或多次劑量投與。在某些實施例中，如下地投與疏水性CNP鹽組合物：以單次劑量或多次劑量，每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次，或治療醫師認為適當之頻率。在各種實施例中，持續3個月、6個月、12個月或更久投與CNP變異體。

在一些實施例中，投與疏水性CNP鹽組合物以允許生長期（例如軟骨生成），繼之以恢復期（例如成骨）。例如，CNP鹽組合物可皮下或藉由另一模式每日或每週多次地投與一段時間，接著為無治療時段，接著重複該週期。在一些實施例中，初始治療期（例如每日投與或每週多次投與CNP鹽組合物）持續3天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週。在一個相關實施例中，無治療期持續3天、1週、2週、3週或4週。在某些實施例中，CNP鹽組合物之給藥方案為每日一次持續3天，接著停藥3天；或每日一次或每週多次持續1週，接著停藥3天或1週；或每日一次或每週多次持續2週，接著停藥1或2週；或每日一次或每週多次持續3週，接著停藥1、2或3週；或每日一次或每週多次持續4、5、6、7、8、9、10、11或12週，接著停藥1、2、3或4週。

生物標記

為了治療骨相關病症，可量測生長指標，諸如子宮內及新生兒之長骨生長量測，及量測骨生長生物標記，諸如CNP、cGMP、膠原蛋白II、膠原蛋白X、骨鈣化素及增殖細胞核抗原（PCNA）。

一種CNP信號傳導標記為cGMP（3',5'環單磷酸鳥苷）。此胞內信號傳導分子之含量在CNP結合及活化其同源受體NPR-B之後增加。升高的cGMP含量可量測自CNP暴露之後的細胞培養提取物（活體外）、來自CNP暴露之後的骨外植研究之條件培養基（離體）及在皮下、靜脈內或經由此項技術中已知之其他投與途徑投與CNP幾分鐘內的血漿中（活體內）。

亦可量測軟骨及骨特異性分析物（或軟骨及骨頭相關標記）以評估CNP功效。例如，裂解之II型膠原蛋白的片段為軟骨更新之軟骨特異性標記。II型膠原蛋白為軟骨之主要有機成分且II型膠原蛋白之片段（裂解之膠原蛋白）係釋放至循環中，且隨後在軟骨更新後分泌至尿液中。軟骨更新先於新骨形成。

可量測之骨形成之骨特異性生物標記為I型原膠原（PINP）之N端前肽。合成I型膠原蛋白為骨形成之重要步驟，因為I型膠原蛋白係骨基質中之主要有機組分。在膠原蛋白合成期間，前肽自原膠原分子釋放且可在血清中偵測到。另外，I型膠原蛋白之片段可量測為骨吸收之標記。

軟骨及骨形成及生長之其他潛在生物標記包含聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素（軟骨更新之軟骨特異性標記）、II型膠原蛋白之前肽（軟骨形成之軟骨特異性標記）、鹼性磷酸酶（骨特異性）及骨鈣化素（骨形成之骨特異性標記）。軟骨及骨相關生物標記可例如使用市售套組在血清中量測自功效/藥效學活體內研究，及量測自離體研究之條件培養基。

在一個實施例中，在已投與本文所述之CNP鹽或持續釋放組合物之個體中分析或量測至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量，以便監測CNP組合物對活體內骨及軟骨形成及生長之作用。例如，至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量增加可指示投與CNP鹽或持續釋放組合物對骨生長具有積極作用，且適用於治療骨骼發育不良及與CNP活性降低相關之其他骨或軟骨相關疾病或病症。例示性骨或軟骨相關生物標記包含但不限於CNP（例如CNP之內源性含量）、cGMP、II型膠原蛋白及其片段之前肽、II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原（PCNA）、I型原膠原（PINP）及其片段之前肽、I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及鹼性磷酸酶。

在各種實施例中，藉由自將投與、正投與或已投與CNP鹽或持續釋放組合物之個體獲得生物樣品來量測生物標記。可使用此項技術中已知之技術量測生物標記，包含但不限於西方墨點、酶聯免疫吸附分析（ELISA）及酶活性分析。生物樣品可為血液、血清、尿液或其他生物流體。

本發明之額外態樣及細節自以下實例將顯而易知，所述實例打算為說明性而非限制性的。實例

實例1：產生疏水性CNP鹽

為了確定使親水性肽CNP與疏水性相對離子錯合以使其電荷穩定是否將有效改良CNP調配物以用於治療目的，進行改變CNP與其他離子組分之組合之靜電電荷的實驗。

為了最佳化CNP肽與疏水性相對離子物質之間的靜電錯合，且因此最佳化肽錯合物之受控沈澱，溶液環境應允許使一大群的兩種物質離子化。將兩種溶液之pH調節為10（CNP之pI）與相對離子之酸性pKa（例如實例性相對離子物質油酸之pKa為約4-5）之間的中間值對於肽錯合物沈澱之產率重要。

為了製備疏水性CNP鹽，包括CNP變異體，將CNP-乙酸鹽置於水或緩衝液中。在第一實驗中，製備在水中包含20 mg/mL CNP之儲備溶液。100 mM Tris，pH 9.00亦有效地作為溶劑。將雙羥萘酸二鈉、油酸或多庫酯鈉以相對於CNP上帶相反電荷基團之數目莫耳過量，在此實例中，相對離子相對於CNP為12莫耳過量之濃度置於緩衝液中。CNP在pH 7下具有6個帶正電基團，且此為相比於帶正電基團之數目兩倍過量。發現在緩衝溶液（76 mM乙酸鹽緩衝液pH 4.84及100 mM磷酸鹽緩衝液pH 6.61）中，相對離子不易溶且形成似乎為不溶性或低溶解度相對離子之物於緩衝液中之懸浮液，然而在水中及在100 mM Tris pH 9.00中，相對離子油酸、雙羥萘酸二鈉及多庫酯鈉為可溶的。

當添加金屬陽離子以促進鹽沈澱時，將該金屬陽離子溶解於水中且添加至CNP溶液且不添加至相對離子溶液，觀測到若將該金屬陽離子直接添加至相對離子，則其誘發相對離子溶液之沈澱。金屬陽離子溶液（例如ZnCl₂ ）係以高濃度（＞100 mg/mL）溶解於水中，以使得可將小體積添加至CNP溶液且不顯著改變濃度或pH。可以各種濃度添加金屬陽離子，但在初始實驗中，其以相對於CNP濃度4莫耳過量添加（CNP中存在兩個帶負電胺基酸，且其經添加以使得每莫耳帶負電胺基酸存在2莫耳鋅）。接著將相對離子溶液逐滴添加至含有或不含金屬陽離子之CNP溶液，每次添加後將管在最高設定下渦旋一秒鐘。

在添加足夠的溶液以達到所期望的CNP與相對離子之比之後，將反應管在離心機中以10,000xg離心5分鐘以使鹽沈澱物形成離心塊。離心後，接著移除上清液且添加與移除之上清液等體積的水且將離心塊再懸浮。此次將管以7500xg離心3-5分鐘且可觀測到鹽形成離心塊。離心後，離心塊再次用水洗滌鹽且再懸浮。將管再次離心且移除上清液。接著將內容物移至小瓶（例如6R硼矽酸鹽玻璃小瓶），加塞，冷凍，且凍乾。

接著評估後續鹽粉末於各種緩衝液中之溶解度。起初，將約1 mg粉末稱量至管中且添加適當體積之溶劑以達到1 mg/mL。將管在約37℃下搖動隔夜。發現油酸鹽可溶解於20%乙酸中。雙羥萘酸鹽可溶於二甲亞碸（DMSO）中。

此等實驗展示將高水溶性肽沈澱為尺寸介於5奈米至1毫米直徑範圍內的水不溶性/低溶解度聚集體係可能的。

實例2--CNP鹽之表徵

如同實例1製備CNP之疏水性鹽且測試沈澱及溶解度。表1描述與各種疏水性相對離子錯合之CNP引起固體沈澱或形成。表1

相對離子	反應溶劑	PPT
CNP-油酸鹽	H₂ O	是
CNP-雙羥萘酸鹽	H₂ O	是
CNP-去氧膽酸鹽	H₂ O	是
CNP-癸酸鹽	H₂ O	膠凝
CNP -油酸鹽	Na-Phos	是
CNP -雙羥萘酸鹽	Na-Phos	是
CNP -去氧膽酸鹽	Na-Phos	是
CNP -癸酸鹽	Na-Phos	膠凝
CNP -Ca⁺² (油酸鹽)	H₂ O	是
CNP -Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)	H₂ O	是
CNP -Ca⁺² (去氧膽酸鹽)	H₂ O	是
CNP -Ca⁺² (癸酸鹽)	H₂ O	是
CNP -Zn⁺² (油酸鹽)	H₂ O	是
CNP -Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)	H₂ O	是
CNP -Zn⁺² (去氧膽酸鹽)	H₂ O	是
CNP -Zn⁺² (癸酸鹽)	H₂ O	是

亦對鹽沈澱物進行溶解研究。在37℃下將1 mg CNP鹽再懸浮於50 mL 1× PBS，pH 6.5中，且量測固體溶解及CNP釋放至溶液中，持續7天。不每日更換緩衝液。圖1A-圖1D及圖2展示疏水性鹽溶解比CNP-乙酸鹽組合物慢。

實例3：異型接合NPR2突變對CNP處理有反應

為了確定CNP對患有由NPR2突變引起的身材矮小之個體之效應，開發NPR2突變之細胞模型。分析之例示性NPR2突變闡述於圖5中。具有NPR2基因敲除或該基因中之異型接合功能喪失突變的大鼠軟骨肉瘤（RCS）細胞係藉由使用125ng NPR2變異體將RNP轉染至RCS細胞中或轉染至RCS或HEK293細胞中之野生型NPR2 質體DNA製得。單細胞純系經接種且藉由桑格定序（Sanger sequencing）進行基因分型。細胞模型能夠再現公佈的不同突變之cGMP表型。

藉由在RCS細胞中之NPR2之第一外顯子中產生插入及缺失而產生NPR2純系。NPR2中第一外顯子之序列係藉由下一代定序確認，且陳述於圖4中。藉由在用6nM Pro-Gly CNP37處理後，使用CatchPoint Cyclic-GMP螢光分析進行cGMP刺激分析來測試NPR2突變細胞回應於CNP投與之活性。簡言之，將NIH3T3細胞（ATCC，CRL-1658）及NPR轉染之HEK293細胞以每孔60,000個細胞接種於96孔盤（96孔黑色成像盤，Grenier，#655090）中。RCS（大鼠軟骨肉瘤）細胞係以每孔40,000個細胞接種。培養基為如下：NIH3T3培養基：DMEM高葡萄糖，丙酮酸鹽（Thermo，11995-073）+10% FBS+1× Pen Strep（abbrev P/S，Thermo，目錄號15140122）。NIH3T3為cGMP分析HEK293培養基之對照系統：EMEM+10% FBS+ 1× P/S+1× GMAX。RCS培養基：DMEM+10% FBS+1× Pen Strep。無血清NIH3T3培養基：DMEM+1× P/S，用於以IBMX（CAS 28822-58-4）處理細胞；含BSA之無血清NIH3T3培養基：DMEM+1× P/S+0.5 mg/mL BSA（Thermo，A9418-100G），用於以CNP處理細胞。

細胞係在37℃、5% CO₂ 下培育24小時。對於用CNP變異體處理之細胞，盤在使用之前15分鐘用IBMX（Enzo life sciences，89161-340，1 g）預處理。IBMX為磷酸二酯酶之強效、非特異性抑制劑。IBMX之800 mM儲備溶液在IBMX稀釋培養基（無血清培養基（DMEM+1× PBS與1× PBS 1:1混合）中稀釋為0.75 mM工作儲備液。

對於細胞處理，自培育箱移除細胞，自細胞移除生長培養基且用IBMX處理細胞。將80 µL 0.75 mM IBMX添加至各孔中且將細胞傳回至37℃培育箱中15分鐘。在15分鐘之後，將CNP（40微升/孔）添加至各測試孔且將細胞傳回至37℃培育箱中15分鐘。藉由輕敲將盤混合且在Solentim cell metric上成像以使細胞可視化，及確定是否有任何細胞上浮且接著將其放回37℃培育箱中。

終止反應且藉由添加40 µL溶解緩衝液（來自cGMP套組）使細胞溶解。將盤置於振盪器上5分鐘以完成溶解。細胞溶解物用於cGMP分析。

使用根據製造商之方案製備之cGMP校準劑、兔抗cGMP抗體及HRP-cGMP進行cGMP分析。將40 µL校準劑添加至塗有抗cGMP抗體之盤的孔中，且將40 µL待分析之溶解物添加至適當孔中。將40 µL復原之兔抗cGMP抗體添加至孔中，且將盤置於振盪器上五分鐘以進行混合。將40 µL復原之HRP-cGMP添加至各孔中且在室溫下培育2小時。將盤手動抽吸且用300 µL洗滌緩衝液洗滌4×。將100 µL信號燈紅色受質添加至盤之各孔中，覆蓋且在室溫下保持至少10分鐘，避光。在Spectramax M或類似儀器上以530 nm激發及590 nm發射讀取盤之螢光強度。

圖3展示添加外源性Pro-Gly-CNP37變異體拯救NPR2+/-大鼠軟骨肉瘤細胞模型之cGMP讀數。先前的活化資料報導cGMP EC50在40至360nM範圍內，用於活化PRKG2（Campbell等人, 《ACS化學生物學（ACS Chem Biol）》 12, 2388-2398, 2017)；Vaandrager等人, 《生物化學雜誌（J Biol Chem）》 272, 11816-23, 1997)；Pohler等人, 《歐洲生物化學協會聯合會快報（FEBS Lett）》 374, 419-25, 1995）。在異型接合NPR2基因敲除細胞中，＞0.163nM之CNP劑量能夠達成超出PRKG2活化cGMP之EC50範圍的細胞內濃度（圖1）。而在野生型細胞中，0.040nM之CNP劑量能夠達成相同cGMP濃度。此等結果表明CNP補充可達成PRKG2活化及在具有NPR2功能損失型突變之細胞生長所需的cGMP水準。

此等結果亦表明投與CNP變異體適用於使患有NPR2活性降低之身材矮小的個體恢復骨生長。進一步預期用CNP變異體治療將對在cGMP信號傳導可受損之其他生長板基因中具有突變之個體有益。實例4：鑑別與身材矮小相關之突變

假設展示基因驅動之雙向效應之明確證據的基因更可能代表可在廣泛患者群體中有效調節之治療標靶。為了鑑別為生長之核心調節因子的基因，分析了五個基因清單之交集，包含來自全基因體關聯研究（GWAS）之基因清單。核心生長調節因子將最可能含有具有雙向效應（亦即，身材矮小或骨骼發育不良及身材高大或過生長）的稀有編碼突變。

查詢之資料庫包含：GWAS ，提取了由使用約700,000個個體之大型GWAS身高綜合分析報導之3,290個獨立遺傳變異體中之每一者的2,067個非重複最近基因；HGMD ，查詢來自HGMD版本v2019_2之「allmut」表以尋找標記為「DM」的在相同基因中具有「矮小身材」及「高大身材或過生長」之所有致病變異體；OMIM ，先前描述了涉及生長障礙之OMIM基因之清單且使用以下關鍵詞創建：身材矮小、過生長、骨骼發育不良、短指症。

第一，關於與矮小或高大身材相關之基因查詢人類基因突變資料庫（HGMD版本v2019_2）（Stenson等人, 《人類遺傳學（Hum Genet）》 136:665-677, 2017）。文獻中報導了47種標註有至少一種致病變異體之基因，其引起「身材矮小」。僅20種基因係標註為高大身材或過生長基因。第二，使用258個OMIM基因（248個矮小、20個高大）之手動策劃清單，其係使用以下關鍵詞創建：身材矮小、過生長、骨骼發育不良、短指症（Wood等人, 《自然遺傳學（Nat Genet）》 46:1173-86, 2014）。第三，將此等清單之交集與來自GWAS之基因清單相比。在此等清單之交集處，存在三種已知與身高相關之基因（IGF1R、NPPC、NPR2），且鑑別兩種額外基因（FGFR3、SHOX）。

額外分析使得產生一組新的五個核心基因，其展示顯著降低的身高（β=-0.20，95%CI[-0.26至-0.14]，p=4.04×10-11）及顯著提高的特發性身材矮小（ISS）風險（OR=2.75，95%CI[1.92-3.96]。五個核心基因（FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX）中之每一者在個別地考慮時與身高相關，且在與其他突變組合使用時亦與身材矮小相關。FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX之例示性突變陳述於圖6中。

NPR2及IGF1R中之組合LoF（功能喪失）及誤義變異體亦與ISS風險增加相關（分別為OR=3.31，P=0.001，OR=2.85，P=0.002）。已在具有不同嚴重程度之家族性身材矮小中報導SHOX、IGF1R、NPPC、NPR2中引起蛋白質功能喪失之整體基因缺失及/或突變。

分析展示五個核心基因中之任一者之變異體攜帶者的ISS風險增加大約3倍，且占總ISS群體之6.7%。此外，表明添加外源性CNP之後，NPR2單倍劑量不足之細胞模型中NPR2信號傳導之劑量依賴性拯救。

根據全基因模型（Liu等人, 《細胞（Cell）》 177:1022-1034 e6 (2019)；Boyle等人, 《細胞》 169:1177-1186 (2017)），若此等基因為核心人類生長基因，則其效應應藉由驅動調節網路之多個較弱的常見遺傳變異體調節。為了間接測試此假設，使用針對身高之公佈的最大GWAS綜合分析計算身高之多基因風險評分（PRS），該綜合分析不包含來自UK Biobank項目之任何樣品。群體被分為五個相等大小之（n=6,824）PRS五分位數（PRS 1為最矮身高，PRS 5為最高身高）。PRS評分增加與平均身高之間存在劑量依賴性關係（各PRS五分位數增加之β=0.30）（圖7A）。跨越五個不同PRS背景，五個核心基因中LoF變異體之攜帶者始終比非攜帶者矮。參見圖7。資料表明PRS及稀有蛋白質變異體之組合效應與加性模型一致：多基因效應調節攜帶者及非攜帶者之身高。

使用PRS=3作為參考來計算跨越PRS組之ISS風險。最低PRS組與ISS風險提高相關，且最高PRS組與風險降低相關（對於PRS 1及PRS 5分別為OR=5.43，P=8.58×10-34；OR=0.22，P=4.49×10-7）。評估五個核心基因之稀有編碼變異體對由PRS組分層之ISS的效應。在前三個五分位數中，五個核心基因中之任一者之攜帶者患ISS的風險增加（OR=2.64，P=3.09×10-5；OR=2.17，P=0.04；OR=5.29，P=1.58×10-5；OR=2.72，P=0.09，圖7C-F）。對於每一個別核心基因之攜帶者，觀測到由PRS分層之ISS風險的一致效應方向（圖7C-F）。

另外，主要來自多個具有個別小效應之常見遺傳變異的PRS之加性效應預測資料集中20.1%之身高差異。PRS之此等加性效應似乎對核心基因之稀有編碼變異之攜帶者以及非攜帶者具有類似的量值。此觀測結果指示PRS可為稀有致病變異體之外顯率差異的重要貢獻者（尤其在單倍劑量不足之模型，諸如本文所述之模型中）。支持此想法，觀測到八個具有低NPR2活性之NPR2變異體攜帶者中之兩個具有低-正常身高。此資料表明大部分具有NPR2突變之ISS個體亦可具有多基因背景，使其更易受喪失NPR2活性之致病效應。

此等結果支持基於CNP之治療可在NPR2單倍劑量不足患者群體中有效之觀點。另外，展示普通人群之NPR2攜帶者中cGMP水準與身高之顯著雙向（LoF及GoF）相關性的結果表明用CNP類似物靶向此受體可為用於所有ISS個體之有效療法。

實例5：CNP鹽在活體外之釋放曲線

亦進行疏水性CNP鹽之釋放分析。

簡言之，新鮮製備Pro-Gly-CNP37 Zn雙羥萘酸鹽及Pro-Gly-CNP37 Zn-油酸鹽，且在製備當天置於溶解裝置Pion microDiss中之15 mL培養基中，葉輪以250 RPM旋轉，溫度控制設定點37.4℃。每24小時持續4天，將容器內容物轉移至VWR聚丙烯「Falcon」管，以4000×g快速離心30分鐘，RP-UPLC樣品經獲取/冷凍，且將固體再懸浮於新鮮培養基（15 mL）中。鹽在RP-UPLC上運行以獲得信號，且由與校準曲線比較獲得濃度。藉由比較製備鹽所用之Pro-Gly-CNP37之釋放質量與初始質量獲得釋放鹽%。

圖8A及圖8B以CNP肽鹽之總量的百分比形式展示CNP肽鹽經7天之累積釋放曲線。

使用以上方案運行另一釋放曲線。將約16.6 mg Pro-Gly-CNP37-乙酸鹽（製備鹽之起始物質）或Pro-Gly-CNP37 Zn-雙羥萘酸鹽置於各孔中。CNP鹽經製備、凍乾、密封且在使用之前儲存於4℃下。對於CNP乙酸鹽對照，容器1於1× PBS中，容器5於1× PBS+0.05% PS80中。每24小時持續7天，將容器內容物轉移至VWR聚丙烯「Falcon」管，以4000×g快速離心30分鐘，UPLC樣品經獲取/冷凍，且將固體再懸浮於新鮮培養基（15 mL）中。CNP鹽在RP-UPLC上運行以獲得信號，且由與校準曲線比較獲得濃度。經7天之累積釋放曲線展示於圖9A及圖9B中。

Pro-Gly-CNP-37-多庫酯及Pro-Gly-CNP-37-Zn-多庫酯鹽為新製的，或製備且凍乾，且密封於玻璃小瓶中，隨後用於在Pion中進行溶解。每24小時持續4天，將容器內容物轉移至VWR聚丙烯「Falcon」管，以4000×g快速離心30分鐘，樣品經獲取/冷凍，且將固體再懸浮於新鮮培養基（15 mL）中。鹽在LC-MS上運行以進行定量，且藉由與置於溶解容器中之初始鹽比較獲得釋放鹽%。

圖10A至圖10C展示多庫酯鹽經4天（圖10A）或7天（圖10B及圖10C）之累積釋放曲線。

實例6：CNP鹽在活體內之釋放曲線

接著針對皮下注射CNP鹽之後7天內大鼠之活體內釋放曲線來分析樣品鹽CNP-雙羥萘酸鹽之釋放曲線。

圖11展示Pro-Gly-CNP37經7天自鹽向血漿之釋放曲線。鹽之釋放係觀測為24小時內之初始爆發，以及隨時間推移釋放一些鹽。

本文中之任何單個實施例可補充有來自本文中之任何一或多個其他實施例的一或多個要素。

因此，應理解，本發明不限於揭示之特定實施例，而是意欲涵蓋所有修改，該等修改在由所附申請專利範圍、以上說明書、以下編號段落所定義及/或隨附圖式中所示之本發明之精神及範疇內。

實施例之實例：

段落1. 一種包括帶靜電肽鹽之組合物，該鹽包括與疏水性相對離子錯合之帶靜電肽。

段落2. 如段落1之組合物，其中該疏水性相對離子係經由非共價鍵錯合。

段落3. 如段落1之組合物，其中該疏水性相對離子係經由可裂解連接子與帶靜電肽錯合。

段落4. 如段落1至3中任一項之組合物，其中該鹽進一步包括與肽-相對離子錯合物錯合之陽離子。

段落5. 如段落4之組合物，其中該帶靜電肽、疏水性相對離子及陽離子係經由非共價鍵錯合。

段落6. 如段落4或5之組合物，其中陽離子具有+2、+3或+4之電荷。

段落7. 如段落4至6中任一項之組合物，其中陽離子為金屬陽離子。

段落8. 如段落4至7中任一項之組合物，其中陽離子選自由以下組成之群組：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）、鉑（Pt）、銅（Cu）及金（Au）。

段落9. 如段落1至8中任一項之組合物，其中疏水性相對離子具有約0至約10之cLogP，或約-2至約5之pKa，或兩者。

段落10. 如段落1至9中任一項之組合物，其中疏水性相對離子具有約2至約9之cLogP，及小於約5之pKa。

第11段如段落1至10中任一項之組合物，其中疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸、癸酸鈉、2-萘磺酸鈉、1-庚磺酸鈉、1-辛磺酸鈉單水合物、1-癸磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉。

段落12. 如段落1至11中任一項之組合物，其中肽鹽呈固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式。

段落13. 如段落1至12中任一項之組合物，其中帶靜電肽為C型利鈉肽（CNP）。

段落14. 如段落13之組合物，其中CNP為CNP變異體。

段落15. 如段落13或14之組合物，其中CNP係選自由以下組成之群組： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）及其醫藥鹽。

段落16. 如段落15之組合物，其中CNP為CNP-乙酸鹽。

段落17. 如段落13至16中任一項之組合物，其中疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。

段落18. 如段落13至17中任一項之組合物，其中若存在陽離子，則該陽離子為鋅或鈣。

段落19. 如段落1至18中任一項之組合物，其進一步包括賦形劑、稀釋劑或載劑。

段落20. 如段落19之組合物，其中賦形劑、賦形劑、稀釋劑或載劑為醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

段落21. 一種無菌醫藥組合物，其包括如段落1至20中任一項之組合物。

段落22. 一種包括帶靜電肽鹽之延釋組合物，該鹽包括與疏水性相對離子錯合之帶靜電肽。

段落23. 如段落22之延釋組合物，其中疏水性相對離子係經由非共價鍵錯合。

段落24. 如段落23之延釋組合物，其中疏水性相對離子係經由可裂解連接子與帶靜電肽錯合。

段落25. 如段落22至24中任一項之延釋組合物，其中該鹽進一步包括與肽-相對離子錯合物錯合之陽離子。

段落26. 如段落25之延釋組合物，其中該帶靜電肽、疏水性相對離子及陽離子係經由非共價鍵錯合。

段落27. 如段落26之延釋組合物，其中陽離子具有+2、+3或+4之電荷。

段落28. 如段落25至27中任一項之延釋組合物，其中陽離子為金屬陽離子。

段落29. 如段落25至28中任一項之延釋組合物，其中陽離子選自由以下組成之群組：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）、鉑（Pt）、銅（Cu）及金（Au）。

段落30. 如段落22至29中任一項之延釋組合物，其中疏水性相對離子具有約0至約10之cLogP，或約-2至約5之pKa，或兩者。

段落31. 如段落22至30中任一項之延釋組合物，其中疏水性相對離子具有約2至約9之cLogP，及小於約5之pKa。

段落32. 如段落22至31中任一項之延釋組合物，其中疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸鹽、癸酸鹽、2-萘磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-辛磺酸鹽單水合物、1-癸磺酸鹽、十二烷基硫酸鹽、硫酸葡聚糖及十二烷基苯磺酸鹽。

段落33. 如段落22至32中任一項之延釋組合物，其中CNP鹽呈固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式。

段落34. 如段落22至33中任一項之延釋組合物，其中帶靜電肽為C型利鈉肽（CNP）。

段落35. 如段落34之延釋組合物其中CNP為CNP變異體。

段落36. 如段落34或35之組合物，其中CNP係選自由以下組成之群組： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）；及其醫藥鹽。

段落37. 如段落36之延釋組合物，其中CNP為CNP-乙酸鹽。

段落38. 如段落34至37中任一項之延釋組合物，其中疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。

段落39. 如段落34至38中任一項之延釋組合物，其中若存在陽離子，則該陽離子為鋅或鈣。

段落40. 如段落33至39中任一項之延釋組合物，其中肽鹽固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子再懸浮於水溶液或油中。

段落41. 如段落40之延釋組合物，其中水溶液為水、鹽水或緩衝液。

段落42. 如段落40之延釋組合物，其中油包括三酸甘油酯或脂肪酸。

段落43. 如段落42之延釋組合物，其中脂肪酸為飽和或不飽和的。

段落44. 如段落42或43之延釋組合物，其中脂肪酸為C-6至C-20脂肪酸。

段落45. 如段落42至44中任一項之延釋組合物，其中脂肪酸為己酸、辛酸、癸酸或十二酸。

段落46。如段落22至45中任一項之延釋組合物，其中在pH 7至7.6下，（i）第1天釋放小於20%之肽；及 ii）到第7天釋放約90%之肽，或到第14天釋放約90%之肽，或到第31天釋放約90%之肽。

段落47. 如段落22至46中任一項之延釋組合物，其中在pH 7至7.6下，第1天釋放約小於20%之肽。

段落48.如段落22至47中任一項之延釋組合物，其中在pH 7至7.6下，到第7天釋放約90%之肽。

段落49. 如段落22至47中任一項之延釋組合物，其中在pH 7至7.6下，到第30天釋放約90%之肽。

段落50. 如段落22至49中任一項之延釋組合物，其進一步包括賦形劑、稀釋劑或載劑。

段落51. 如段落50之延釋組合物，其中賦形劑、賦形劑、稀釋劑或載劑為醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

段落52. 一種無菌醫藥組合物，其包括如段落22至51中任一項之延釋組合物。

段落53. 一種製備包括帶靜電肽鹽之組合物的方法，其包括 a）使水溶液中之帶靜電肽與溶液中之疏水性相對離子接觸； b）以足以使肽及相對離子形成錯合物之方式混合帶靜電肽溶液與疏水性相對離子溶液，其中肽-相對離子錯合物之形成引起包括肽鹽之固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式之形成。

段落54. 如段落53之方法，其視情況包括在步驟（b）之前，使溶液中之帶靜電肽與水溶液中之多價陽離子接觸，從而形成肽-陽離子錯合物。

段落55. 如段落53或54之方法，其進一步包括步驟（c）在緩衝液或水中洗滌該肽鹽。

段落56. 如段落55之方法，其進一步包括步驟（d）藉由離心形成肽鹽離心塊而獲得肽鹽。

段落57. 如段落56之方法，其進一步包括步驟（e）自肽鹽離心塊移除水。

段落58. 如段落57之方法，其進一步包括將離心塊再懸浮於水溶液或油中。

段落59. 如段落53至58中任一項之方法，其中肽:疏水性相對離子比為1:1至1:20。

段落60. 如段落54至59中任一項之方法，其中肽:陽離子比為1:1至1:10。

段落61. 如段落53至60中任一項之方法，其中疏水性相對離子係經由非共價鍵或錯合。

段落62. 如段落61之組合物，其中該疏水性相對離子係經由可裂解連接子與帶靜電肽錯合。

段落63. 如段落54至62中任一項之方法，其中若鹽進一步包括與肽-相對離子錯合物錯合之陽離子，則陽離子係經由共價或非共價鍵或其混合物錯合。

段落64. 如段落63之方法，其中陽離子係經由非共價鍵與肽-疏水性相對離子錯合物錯合。

段落65. 如段落63或64之組合物，其中該帶靜電肽、疏水性相對離子及陽離子係經由非共價鍵錯合。

段落66. 如段落54至65中任一項之方法，其中陽離子具有+2、+3或+4之電荷。

段落67. 如段落54至66中任一項之方法，其中陽離子為金屬陽離子。

段落68. 如段落54至67中任一項之方法，其中陽離子選自由以下組成之群組：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）及金（Au）。進一步涵蓋如段落54至67中任一項之方法，其中陽離子選自由以下組成之群：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）、鉑（Pt）、銅（Cu）及金（Au）。

段落69. 如段落46至58中任一項之方法，其中疏水性相對離子具有約0至約10之cLogP，或約-2至約5之pKa，或兩者。

段落70. 如段落53至69中任一項之方法，其中疏水性相對離子具有約2至約9之cLogP，及小於約5之pKa。

段落71. 如段落53至70中任一項之方法，其中疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）及磷脂酸。

段落72. 如段落53至71中任一項之方法，其中帶靜電肽為C型利鈉肽（CNP）。

段落73. 如段落72之方法，其中CNP為CNP變異體。

段落74. 如段落72或73之方法，其中CNP係選自由以下組成之群組： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）；及其鹽。

段落75. 如段落74之方法，其中CNP為CNP-乙酸鹽。

段落76. 如段落72至75中任一項之方法，其中疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。

段落77. 如段落72至76中任一項之方法，其中若存在陽離子，則該陽離子為鋅或鈣。

段落78. 一種治療有需要之個體之骨相關病症或骨骼發育不良之方法，其包括向該個體投與包括如段落1至52中任一項之C型利鈉肽（CNP）之疏水性鹽的組合物。

段落79. 如段落78之方法，其中骨相關病症或骨骼發育不良選自由以下組成之群組：骨關節炎、低磷酸鹽血性佝僂病、軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性發育不良、成骨不全、軟骨成長不全、點狀軟骨發育異常、純合性軟骨發育不全、點狀軟骨發育異常、屈肢骨發育不良、先天性致死型低磷酸酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋多指症候群、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育異常、揚森型幹骺端發育不良、先天性脊椎骨骺發育不良、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良、尼維格型肢中骨發育不良、羅氏症候群、萊因哈特症候群、肢端發育不全、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良、纖維軟骨增生症、羅伯茨症候群、肢端肢中發育不全、小肢、莫奎氏症候群、克尼斯特症候群、後生營養性發育不良及脊椎骨骺幹骺端發育不良、NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）、PTPN11突變（努南氏症候群）、胰島素生長因子1受體（IGF1R）突變及特發性身材矮小。

段落80. 一種在有需要之個體中進行骨延長或增加長骨生長之方法，其包括向該個體投與如段落1至52中任一項之包括C型利鈉肽（CNP）之鹽的延釋組合物，且其中該投與使骨延長或增加長骨生長。

段落81. 如段落78至80中任一項之方法，其中CNP為CNP變異體。

段落82. 如段落78至81中任一項之方法，其中CNP係選自由以下組成之群組： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）；及其鹽。

段落83. 如段落83之方法，其中CNP為CNP-乙酸鹽。

段落84. 如段落78至83中任一項之方法，其中組合物係皮下、皮內、關節內、經口或肌肉內投與。

段落85. 如段落78至84中任一項之方法，其中組合物係每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次地投與。

段落86. 如段落78至85中任一項之方法，其中組合物為延釋組合物。

段落87. 一種C型利鈉肽之鹽，其包括與疏水性相對離子錯合之CNP肽。

段落88. 如段落87之鹽，其中該疏水性相對離子係經由非共價鍵錯合。

段落89. 如段落87或88之鹽，其中疏水性相對離子具有約2至約9之cLogP，或小於約5之pKa，或兩者。

段落90. 如段落87至89中任一項之鹽，其中疏水性相對離子具有約2至約9之cLogP，及小於約5之pKa。

段落91. 如段落87至90中任一項之鹽，其中疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）及磷脂酸。

段落92. 如段落87至91中任一項之鹽，其進一步包括與肽及相對離子錯合之陽離子。

段落93. 如段落92之鹽，其中陽離子係經由非共價鍵錯合。

段落94. 如段落92或93之鹽，其中陽離子具有+2、+3或+4之電荷。

段落95. 如段落92至94中任一項之鹽，其中陽離子為金屬陽離子。

段落96. 如段落92至95中任一項之鹽，其中陽離子選自由以下組成之群組：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）及金（Au）。進一步涵蓋如段落92至95中任一項之鹽，其中陽離子選自由以下組成之群：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）、鉑（Pt）、銅（Cu）及金（Au）。

段落97. 如段落87至96中任一項之鹽，其中CNP鹽呈固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式。

段落98. 如段落87至97中任一項之鹽，其中CNP為CNP變異體。

段落99. 如段落87至98中任一項之鹽，其中CNP係選自由以下組成之群組： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4）；及其醫藥鹽。

段落100. 如段落99之鹽，其中CNP為CNP-乙酸鹽。

段落101. 如段落87至100中任一項之鹽，其中疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。

段落102. 如段落87至101中任一項之鹽，其中若存在陽離子，則該陽離子為鋅或鈣。

段落103. 如段落87至102中任一項之鹽，其為純化的。

無

圖1A-圖1D展示不同疏水性CNP鹽於pH 6.5之水中之溶解曲線。

圖2展示不同疏水性CNP鹽於pH 6.5之水中之溶解曲線。對照為CNP-乙酸鹽。

圖3展示CNP變異體（Pro-Gly-CNP37）對攜有NPR2同型接合或異型接合突變之細胞的效應，如藉由cGMP刺激所量測。

圖4展示轉染至RCS細胞中之NPR2突變純系中第一外顯子之核苷酸及預測之蛋白質序列。

圖5展示關於對CNP之反應分析的例示性NPR2突變。

圖6展示FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX中與身材矮小相關之例示性突變。

圖7A-圖7F說明PRS及稀有編碼變異體對身高之組合效應。圖7A.對身高之效應作為定量性狀，將樣品基於其PRS分為五組，水平線表示高度之25%、50%及75%百分位的小提琴圖。樣品係藉由誤義、功能喪失或無攜帶狀態而分組至五個核心基因中之任一者中。圖7B.由對於「特發性身材矮小」或ISS之勝算比反映的效應。使用PRS=3作為參考之ISS相對於其他PRS組之勝算。圖7C.使用PRS=1作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。圖7D.使用PRS=1非載體作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。圖7E.使用PRS=2非攜帶者作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。圖7F.使用PRS=3非攜帶者作為參考相對於核心基因中具有誤義及/或功能喪失變異體之ISS的勝算。

圖8A展示CNP Zn-雙羥萘酸鹽之釋放曲線。所示之資料為3個孔之平均值。圖8B展示不同CNP肽鹽之釋放曲線。所示之資料為4個孔之平均值。

圖9A-圖9B說明呈累積釋放曲線（圖9A）或釋放%（圖9B）形式之CNP雙羥萘酸鹽之溶解曲線。所示之資料為1×PBS資料之3個孔的平均值，及1× PBS+0.05% PS80資料之2個孔的平均值。

圖10A至圖10C展示凍乾及儲存之後（圖10A），或新製且接著分析（圖10B-圖10C）之多庫酯鹽的溶解曲線。

圖11展示CNP鹽在活體內經7天之釋放曲線。

Claims

一種包括C型利鈉肽（CNP）之疏水性鹽的組合物，該鹽包括與疏水性相對離子錯合之該CNP。
如請求項1之組合物，其中該鹽進一步包括與肽-相對離子錯合物錯合之多價陽離子。
如請求項2之組合物，其中該CNP、疏水性相對離子及陽離子係經由非共價鍵錯合。
如請求項2或3之組合物，其中該陽離子具有+2、+3或+4之電荷。
如請求項2至4中任一項之組合物，其中該陽離子為金屬陽離子。
如請求項2至5中任一項之組合物，其中該陽離子包括選自由以下組成之群組的金屬：鈹（Be）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鍶（Sr）、鋇（Ba）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、硼（B）、鋁（Al）、鎵（Ga）、銦（In）、鉈（Tl）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鈷（Co）、鎳（Ni）、鈦（Ti）、釩（V）、鉑（Pt）、銅（Cu）及金（Au）。
如請求項2至6中任一項之組合物，其中該陽離子包括鋅或鈣。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該疏水性相對離子具有約0至約10之cLogP，或其共軛酸具有約-2至約5之pKa，或兩者。
如請求項1至8中任一項之組合物，其中該疏水性相對離子具有約2至約9之cLogP，且其共軛酸具有小於約5之pKa。
如請求項1至9中任一項之組合物，其中該疏水性相對離子係選自由以下組成之群組：去質子化脂肪酸、去質子化膽酸、離子型界面活性劑、萘甲酸鹽及其衍生物、菸鹼酸鹽及其衍生物、烷基磺酸鹽、二烷基磺基丁二酸鹽、磷脂、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽、芳基硫酸鹽、硫酸葡聚糖、烷基苯硫酸鹽、及前述任一者之組合。
如請求項1至10中任一項之組合物，其中該疏水性相對離子選自由以下組成之群組：棕櫚酸鹽、去氧膽酸鹽、油酸鹽、雙羥萘酸鹽、菸鹼酸鹽、十二烷基硫酸鹽、多庫酯、豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯膽鹼（PC）、磷脂醯絲胺酸（PS）、磷脂醯肌醇（PL）、磷脂酸鹽、癸酸鹽、2-萘磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-辛磺酸鹽單水合物、1-癸磺酸鹽、十二烷基硫酸鹽、硫酸葡聚糖及十二烷基苯磺酸鹽。
如請求項1至11中任一項之組合物，其中該肽鹽呈固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式。
如請求項1至12中任一項之組合物，其中該CNP為CNP變異體。
如請求項1至13中任一項之組合物，其中該CNP係選自由以下組成之群組： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4），及其鹽。
如請求項14之組合物，其中該CNP為CNP-乙酸鹽。
如請求項1至15中任一項之組合物，其中該疏水性相對離子為油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。
如請求項2至16中任一項之組合物，其中陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。
如請求項1至17中任一項之組合物，其進一步包括賦形劑、稀釋劑或載劑。
如請求項18之組合物，其中該賦形劑、稀釋劑或載劑為醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
一種無菌醫藥組合物，其包括如請求項1至19中任一項之組合物。
一種包括C型利鈉肽（CNP）之鹽的延釋組合物，該鹽包括與疏水性相對離子錯合之帶靜電肽。
如請求項21之延釋組合物，其中該鹽進一步包括與肽-相對離子錯合物錯合之陽離子。
如請求項21或22之延釋組合物，其中肽鹽固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子再懸浮於水溶液或油中。
如請求項23之延釋組合物，其中該油包括三酸甘油酯或脂肪酸，視情況其中該脂肪酸為飽和或不飽和的。
如請求項23或24之延釋組合物，其中該脂肪酸為C-6至C-20脂肪酸。
如請求項23至25中任一項之延釋組合物，其中該脂肪酸為己酸、辛酸、癸酸或十二酸。
如請求項23之延釋組合物，其中該水溶液為水、鹽水或緩衝液。
如請求項21至27中任一項之延釋組合物，其中在pH 7至7.6下，（i）第1天釋放小於20%之肽；及（ii）到第7天釋放約90%之肽，或到第14天釋放約90%之肽，或到第31天釋放約90%之肽。
如請求項21至28中任一項之延釋組合物，其進一步包括醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
一種製備包括C型利鈉肽（CNP）之疏水性鹽之組合物的方法，其包括 a）使水溶液中之該CNP與溶液中之疏水性相對離子接觸； b）以足以使該肽及相對離子形成錯合物之方式混合該CNP溶液與該疏水性相對離子溶液，其中肽-相對離子錯合物之形成引起包括CNP鹽之固體、半固體、凝膠、結晶、非晶、奈米粒子、微米粒子、非晶奈米粒子、非晶微米粒子、結晶奈米粒子或結晶微米粒子形式之形成。
如請求項30之方法，其視情況包括在步驟（b）之前，使溶液中之該CNP與水溶液中之多價陽離子接觸，從而形成肽-陽離子錯合物。
如請求項30或31之方法，其進一步包括步驟（c）用緩衝液或水洗滌該疏水性CNP鹽。
如請求項32之方法，其進一步包括步驟（d）藉由離心形成CNP鹽離心塊而獲得該疏水性CNP鹽。
如請求項33之方法，其進一步包括步驟（e）自該CNP鹽離心塊移除水。
如請求項34之方法，其進一步包括將該離心塊再懸浮於水溶液或油中。
如請求項30至35中任一項之方法，其中肽:疏水性相對離子比為1:1至1:20。
如請求項31至36中任一項之方法，其中肽:陽離子比為1:1至1:10。
一種治療有需要之個體之骨相關病症或骨骼發育不良之方法，其包括向該個體投與如請求項1至29中任一項之包括疏水性CNP鹽之組合物。
如請求項38之方法，其中該骨相關病症或骨骼發育不良選自由以下組成之群組：骨關節炎、低磷酸鹽血性佝僂病、軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性發育不良、成骨不全、軟骨成長不全、點狀軟骨發育異常、純合性軟骨發育不全、點狀軟骨發育異常、屈肢骨發育不良、先天性致死型低磷酸酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋多指症候群、軟骨生成減退、肢根型點狀軟骨發育異常、揚森型幹骺端發育不良、先天性脊椎骨骺發育不良、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良、尼維格型肢中骨發育不良、羅氏症候群、萊因哈特症候群、肢端發育不全、周圍骨發育障礙、克尼斯特發育不良、纖維軟骨增生症、羅伯茨症候群、肢端肢中發育不全、小肢、莫奎氏症候群、克尼斯特症候群、後生營養性發育不良及脊椎骨骺幹骺端發育不良、NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）、PTPN11突變（努南氏症候群）、胰島素生長因子1受體（IGF1R）突變及特發性身材矮小。
一種在有需要之個體中進行骨延長或增加長骨生長之方法，其包括向該個體投與如請求項1至29中任一項之包括疏水性CNP鹽之組合物，且其中該投與使骨延長或增加長骨生長。
如請求項38至40中任一項之方法，其中該組合物係皮下、皮內、關節內、經口或肌肉內投與。
如請求項38至41中任一項之方法，其中該組合物係每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次地投與。
如請求項38至42中任一項之方法，其中該組合物為延釋組合物。
一種C型利鈉肽（CNP）之疏水性鹽，其包括與疏水性相對離子錯合之CNP。
如請求項44之疏水性鹽，其進一步包括與該肽及相對離子錯合之陽離子。
如請求項44或45之疏水性鹽，其中該疏水性相對離子選自由以下組成之群組：油酸鹽、去氧膽酸鹽、癸酸鹽、雙羥萘酸鹽、多庫酯或十二烷基硫酸鹽。
如請求項44至46中任一項之疏水性鹽，其中陽離子為Zn²⁺ 或Ca²⁺ 。
如請求項44至46中任一項之疏水性鹽，其中該鹽選自由以下組成之群：CNP-油酸鹽、CNP-雙羥萘酸鹽、CNP-去氧膽酸鹽、CNP-癸酸鹽及CNP-多庫酯。
如請求項45至48中任一項之疏水性鹽，其中該鹽選自由以下組成之群：CNP-Ca⁺² (油酸鹽)、CNP-Ca⁺² (雙羥萘酸鹽)、CNP-Ca⁺² (去氧膽酸鹽)、CNP-Ca⁺² (癸酸鹽)、CNP-Ca⁺² (多庫酯)、CNP-Zn⁺² (油酸鹽)、CNP-Zn⁺² (雙羥萘酸鹽)、CNP-Zn⁺² (去氧膽酸鹽)、CNP-Zn⁺² (癸酸鹽)及CNP-Zn⁺² (多庫酯)。
如請求項44至49中任一項之疏水性鹽，其中該CNP係選自由以下組成之群： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 1）； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 2）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 3）； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 4），及其鹽。
如請求項48之組合物，其中該CNP為CNP-乙酸鹽。
如請求項44至49中任一項之疏水性鹽，其為純化的。