TW202334188A - Ｃｎｐ療法 - Google Patents

Abstract

本發明大體上係關於接受C型利尿鈉肽（CNP）療法以治療骨骼發育不良、身材矮小或骨相關病症之患者中的功效的度量。

Description

CNP療法

本發明大體上係關於用於治療骨骼發育不良之c型利尿鈉（CNP）療法，及治療功效之度量。

C型利尿鈉肽（CNP）為廣泛表現於許多組織中之旁分泌生長因子（Prickett等人，《肽（Peptides）》2020; 132:170363），其具有多樣功能，包括調節軟骨內化骨生長、微循環中之血流及壓力、消炎作用、配子成熟以及神經生成及連接性（Kuhn M., 《生理評論（Physiol Rev）》2016; 96:751-804）。在人類中此等因素中最佳定義者為激素在骨骼生長中驅動生長板擴張之關鍵作用。

實驗動物中之研究展示，CNP的局部產生經由其在生長板組織內之特異性受體NPR2起作用，決定生理軟骨內化骨生長（Nakao等人，《科學報告（Sci Rep）》2015; 5:10554）。CNP在兒童生長中之動態作用的研究由於CNP之快速清除及血漿中的極低濃度而具有挑戰性。然而，組織中合成產物（proCNP）的非活性部分胺基端proCNP（NTproCNP）不經歷清除或快速降解。其血漿水平反映兒童及實驗動物在整個生長過程中之線性生長速度變化（Espiner等人，《兒科激素研究（Horm Res Paediatr）》2018; 90:345-357）。值得注意地，在患有影響CNP路徑活性之骨骼生長遺傳性病症的個體中，血漿NTproCNP濃度在細胞內CNP路徑活性降低時升高（Olney等人，《臨床內分泌代謝雜誌（J Clin Endocrinol Metab）》2015; 100:E355-359; Wang等人，《人類突變（Hum Mutat）》2015; 36:474-481）且在細胞內活性增強時降低（Hannema等人，《臨床內分泌代謝雜誌》2013; 98:E1988-1998; Boudin等人，《美國人類遺傳學雜誌（Am J Hum Genet）》2018; 103:288-295; Miura等人PloS one 2012; 7:e42180）。在軟骨發育不全中，FGFR3路徑活性（抑制軟骨內化骨生長）與CNP信號傳導（刺激骨生長）之間的正常互相拮抗（Ozasa等人，《骨骼（Bone）》 2005 36:1056-1064）被FGR3中之功能獲得突變推翻（Yasoda等人《自然醫學（Nature Medicine）》2004 10:80-86），降低細胞內CNP活性，且與血漿中CNP產物之濃度的適度升高相關（Olney等人，《臨床內分泌代謝雜誌》 2015 100:E355-359）。

現對在活動性長骨生長階段期間CNP之反饋調節的動態或意義一無所知。此外，不清楚此類反饋是直接的或是時間依賴於骨骼組織的細胞間生長反應（間接反饋）。直接反饋由細胞自身產物對CNP產生之作用產生，而間接反饋涉及由除分泌肽之彼等細胞以外之細胞介導的更長迴路。然而，在針對嚙齒動物幼畜中之此等重要問題的近期報導中，持續3天以高濃度投與之外源性CNP抑制CNP基因表現，但僅在含有生長板之組織中（Ueda等人，PLoS One 2020, 15:e0240023）。

本發明係關於在5年期的日常治療期間，即時觀測外源性CNP類似物（例如伏索利肽（vosoritide））對軟骨發育不全（Ach）兒童中之內源性CNP產生的影響。回應於CNP治療之內源性CNP水平的分析視給定外源性CNP之劑量及個體生長之狀態而變化。本發明展示，NTproCNP（指示內源性CNP水平）及膠原蛋白X之N端片段（CXM）的水平可用作身材矮小或骨骼發育不良，諸如軟骨發育不全的兒童中的生長速度及內源性CNP療法功效的標記物。較年幼兒童中功效之額外量測包括隨時間推移對顱骨及腦形態之分析。

本文提供一種治療患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小且接受C型利尿鈉肽（CNP）療法之個體的方法，其包含：i）向該個體投與CNP療法；ii）自該個體獲得樣品；iii）量測在（ii）中自該個體收集之樣品中NTproCNP及/或膠原蛋白X之N端片段（CXM）之水平；及iv）更改或改變CNP劑量以使NTproCNP水平在群體之平均NTproCNP之+/- 2 SDS內。

在各種實施例中，若NTproCNP水平增加，則增加CNP療法劑量水平或頻率，或若NTproCNP水平降低，則降低CNP療法劑量水平。

亦提供一種治療患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小且接受C型利尿鈉肽（CNP）療法之個體的方法，其包含：i）向該個體投與CNP療法；ii）自該個體獲得樣品；iii）量測在（ii）中自該個體收集之樣品中膠原蛋白X之N端片段（CXM）之水平；及iv）若膠原蛋白X水平降低，則增加CNP療法劑量水平或頻率。

在各種實施例中，增加該CNP療法劑量增加該個體之平均生長速度（AGV）。在各種實施例中，該個體中之平均生長速度（AGV）在6個月內、在1年或在2年或更長時間內增加。

在各種實施例中，增加CNP療法劑量包含增加給藥頻率或增加給藥量。

在各種實施例中，CNP療法劑量水平增加及NTproCNP水平降低與個體之年生長速度（AGV）增加相關。

在各種實施例中，CNP療法劑量水平增加及NTproCNP水平降低延長該個體中生長板活動持續時間。

在各種實施例中，基於群體分析，NTproCNP水平維持於平均NTproCNP水平的2個標準差之間。在各種實施例中，NTproCNP之水平維持在該群體之平均NTproCNP之+/- 2 SDS之間。在各種實施例中，NTproCNP係個體分組至之群體之平均NTproCNP水平的±0.5、±1.0、±1.5或±2.0個標準差（SDS）。

在各種實施例中，若NTproCNP SDS低於平均值，則將該CNP療法朝向零NTproCNP SDS滴定。在各種實施例中，滴定CNP療法直至零NTproCNP SDS。在各種實施例中，滴定CNP療法直至達成所治療之群體的+0.5、+1.0、+1.5或+2.0 NTproCNP SDS。在各種實施例中，該零NTproCNP SDS預測最佳作用大小。最佳大小作用為基於群體標準之個體之預期平均正常生長速率的度量。

在各種實施例中，該樣品為血液、尿液、血漿、唾液或組織。

在各種實施例中，該個體罹患骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小。在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小選自由以下組成之群：軟骨發育不全、骨關節炎、低磷酸鹽血性佝僂病、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性發育不良、成骨不全、軟骨成長不全、點狀軟骨發育異常、同合子型軟骨發育不全、屈肢骨發育不良（camptomelic dysplasia）、先天性致死型低磷酸酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋骨多指症候群、肢根型點狀軟骨發育異常、揚森型幹骺端發育不良（Jansen-type metaphyseal dysplasia）、先天性脊椎骨骺發育不良（spondyloepiphyseal dysplasia congenita）、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良（Langer-type mesomelic dysplasia）、尼維格型肢中骨發育不良（Nievergelt-type mesomelic dysplasia）、羅比諾氏症候群（Robinow syndrome）、萊因哈特氏症候群（Reinhardt syndrome）、肢端發育不全（acrodysostosis）、周圍骨發育障礙、克尼斯特氏發育不良（Kniest dysplasia）、纖維軟骨增生症、羅伯茨氏症候群（Roberts syndrome）、肢端肢中發育不良、小肢畸形、莫奎氏症候群（Morquio syndrome）、克尼斯特氏症候群、後生營養性發育不良、脊椎骨骺幹骺端發育不良、與NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群（Turner's syndrome）/萊里維爾（Leri Weill））、PTPN11突變（努南氏症候群（Noonan's syndrome））及IGF1R突變有關的病症。

考慮CNP療法治療患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小的個體包含投與CNP變異體、其結合物、鹽或前藥。

在各種實施例中，CNP變異體適用作用於治療特發性身材矮小及其他骨骼發育不良之生長激素的輔助或替代。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）或PTPN11突變（努南氏症候群）引起。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）、PTPN11突變（努南氏症候群）或胰島素生長因子1受體（IGF1R）引起。

在各種實施例中，CNP變異體可用於治療生長板病症及身材矮小，包括家族性身材矮小、顯性家族性身材矮小（其亦稱為顯性遺傳性身材矮小）或特發性身材矮小。在各種實施例中，身材矮小或生長板病症為膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白多醣（ACAN）、印度刺蝟因子（indian hedgehog；IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC或FGFR3之突變的結果。

在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病（RASopathy）之基因中之一或多個突變相關。

在各種實施例中，骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小病症由拉索病引起。在各種實施例中，拉索病為努南氏症候群、科斯特洛症候群（Costello syndrome）、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤或LEOPARD症候群。在一個實施例中，拉索病為遺傳性1型齒齦纖維瘤。

在各種實施例中，CNP變異體可用於治療具有如下之身材矮小的個體：身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0，且至少一個親代之身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體可用於治療身高SDS為-2.0至-3.0之患有身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體可用於治療身高SDS為-2.0至-2.5之患有身材矮小的個體。在各種實施例中，身材矮小與相關於身材矮小之基因，諸如膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白多醣（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰島素生長因子1受體（IGF1R）或其組合中之一或多個突變相關。在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多個突變相關。

在各種實施例中，身材矮小為如藉由多基因風險評分（PRS）所確定之多個基因之突變的結果。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有IGF1R之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPPC之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有SHOX之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX中之一或多者之一或多個突變及低PRS。在各種實施例中，PRS為1或2。在各種實施例中，PRS為1。在各種實施例中，PRS為2。

在各種實施例中，CNP係選自由以下組成之群的CNP變異體：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP37）（SEQ ID NO: 1）；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 2）； GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP53）（SEQ ID NO: 3）；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP53）（SEQ ID NO: 4）；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP53）（SEQ ID NO: 5）；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-53(M48N)]（SEQ ID NO: 6）；LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-52）（SEQ ID NO: 7）； RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-51）（SEQ ID NO: 8）； VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP- 50）（SEQ ID NO: 9）； DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-49）（SEQ ID NO: 10）； TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-48）（SEQ ID NO: 11）； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-47）（SEQ ID NO: 12）； SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-46）（SEQ ID NO: 13）； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-45）（SEQ ID NO: 14）； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-44）（SEQ ID NO: 15）； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-43）（SEQ ID NO: 16）；WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-42）（SEQ ID NO: 17）；ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-41）（SEQ ID NO: 18）；RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-40）（SEQ ID NO: 19）；LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-39）（SEQ ID NO: 20）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 21）；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 22）；EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-36）（SEQ ID NO: 23）；HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-35）（SEQ ID NO: 24）；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 25）；NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-33）（SEQ ID NO: 26）；ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-32）（SEQ ID NO: 27）；RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-31）（SEQ ID NO: 28）；KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-30）（SEQ ID NO: 29）；YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-29）（SEQ ID NO: 30）；KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-28）（SEQ ID NO: 31）；GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-27）（SEQ ID NO: 32）；ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-26）（SEQ ID NO: 33）；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-25）（SEQ ID NO: 34）； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-24）（SEQ ID NO: 35）； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-23）（SEQ ID NO: 36）； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-21）（SEQ ID NO: 37）； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-20）（SEQ ID NO: 38）； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP- 19）（SEQ ID NO: 39）； GCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-18）（SEQ ID NO: 40）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N)]（SEQ ID NO: 41）； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP-37）（SEQ ID NO: 42）； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP-37）（SEQ ID NO: 43）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37(M32N)]（SEQ ID NO: 44）； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 45）； PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 46）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 47）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 48）；及PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO:49）。

在各種實施例中，變異肽進一步包含乙醯基。在各種實施例中，乙醯基位於肽之N端上。在各種實施例中，肽於C端進一步包含OH或NH ₂基團。

在各種實施例中，CNP變異體組合物為延長釋放組合物。在各種實施例中，組合物為持續釋放組合物。在各種實施例中，持續或延長釋放組合物包含CNP變異體前藥。

在各種實施例中，變異肽包含結合部分。在各種實施例中，結合部分在CNP環狀域之殘基上或在除該CNP環狀域之外的位點處。在各種實施例中，結合部分位於離胺酸殘基上。在各種實施例中，結合部分包含一或多個酸部分。在各種實施例中，酸部分為疏水性酸。

在各種實施例中，結合部分包含一或多個與親水性間隔子（spacer）連接之酸部分。在各種實施例中，親水性間隔子為任何胺基酸。在各種實施例中，親水性間隔子為γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，親水性間隔子為OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）。在各種實施例中，親水性間隔子為γ麩胺酸（γGlu）或OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）。在各種實施例中，親水性間隔子為與一或兩個或更多個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）連接之γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，酸部分為脂肪酸。例示性脂肪酸包括短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸或二羧基脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為飽和或不飽和的。考慮C-6至C-20脂肪酸，包括但不限於C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20飽和或不飽和脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為癸酸、十二酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十酸或其二酸。

在各種實施例中，酸部分及親水性間隔子具有結構AEEA-AEEA-γGlu-C18DA。

在各種實施例中，變異體包含一或多個連接子（linker）基團。在各種實施例中，連接子位於CNP環狀域之殘基上或位於除該CNP環狀域之外的位點處。在各種實施例中，連接子位於離胺酸殘基上。

在各種實施例中，連接子為可水解連接子。

在各種實施例中，結合部分為合成聚合基團。在各種實施例中，變異體包含經由可水解連接子與變異體偶合之合成聚合基團。在各種實施例中，合成聚合基團包含親水性聚合物部分。在各種實施例中，親水性聚合物部分包含聚乙二醇（PEG）。在各種實施例中，親水性聚合物部分包含具有6至20個原子鏈長之聚乙二醇（PEG）。

在各種實施例中，該CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP37）（SEQ ID NO: 1）；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 2）；或LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 21）。

在各種實施例中，變異體具有以下結構：PGQEHPQARRYRG AQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 46）或Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 46）。

在各種實施例中，變異體係選自由以下組成之群： Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 46）； Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH ₂（SEQ ID NO: 47）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 48）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH ₂（SEQ ID NO: 48）； Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH ₂（SEQ ID NO: 46）； Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH ₂（SEQ ID NO: 49）；及 Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 49）。

進一步考慮CNP變異體包括本文所述CNP變異體之結合物、鹽或前藥。

在各種實施例中，例如投與CNP變異體之前及之後，在血漿樣品中量測NTproCNP或CXM水平。

在各種實施例中，個體接受7.5 μg/kg與30 μg/kg之間的CNP療法。在各種實施例中，個體接受15 μg/kg或30 μg/kg CNP療法。在各種實施例中，劑量可增加至30 μg/kg或60 μg/kg。

在各種實施例中，NTproCNP及/或CXM在投與之後至少4小時量測。在各種實施例中，在開始CNP療法之後至少3個月或6個月量測NTproCNP及/或CXM水平。在各種實施例中，在開始CNP療法之後至少每3個月、6個月或1年量測NTproCNP及/或CXM水平。在各種實施例中，在開始CNP療法之後，量測NTproCNP及/或CXM水平持續至少3個月、6個月、1年、2年、3年、4年、5年或直至青春期/生長板閉合。

在各種實施例中，將樣品中之NTproCNP水平與開始CNP療法之前獲取的基線量測結果進行比較。在各種實施例中，將樣品中之NTproCNP水平與正常對照患者中的平均水平進行比較。

在各種實施例中，在NTproCNP減少指示該個體中AGV增加時，增加CNP療法劑量或頻率。

在各種實施例中，將樣品中之CXM水平與開始CNP療法之前獲取的基線量測結果進行比較。在各種實施例中，將樣品中之CXM水平與正常對照患者中的平均水平進行比較。

在各種實施例中，該CXM增加指示骨生長增加，且其中當存在提昇AGV之CXM增加時增加CNP劑量頻率或水平。

在各種實施例中，該個體為具有開放生長板且接受15或30 μg/kg每日劑量之兒科個體。在各種實施例中，該個體處於青春期早期且接受增加至30 μg/kg每日或60 μg/kg每日之劑量。在各種實施例中，該個體為嬰兒且接受增加至30 μg/kg每日之劑量。

本發明亦提供一種選擇起始個體之CNP療法之方法，其包含：i）在多個時間點量測該個體之NTproCNP以確立基線NTproCNP水平；ii）測定NTproCNP水平是否指示平均NTproCNP水平±2內的SDS；及iii）當個體NTproCNP水平低於平均NTproCNP SDS時，開始用CNP療法治療。在各種實施例中，個體具有約-2.5、-2.0、-1.5、-1.0或-0.5之NTproCNP SDS。在各種實施例中，調整CNP療法，以使得個體之NTproCNP SDS在CNP療法劑量水平及/或頻率調節之後為約-0.4、-0.3、-0.2、-0.1、0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、.5、.16、1.7、1.8、1.9或2.0。

在某些實施例中，本發明考慮一種選擇起始患有軟骨發育不全之個體之CNP療法之方法，其包含：i）在多個時間點量測該個體之NTproCNP以確立基線NTproCNP水平；ii）測定NTproCNP水平是否指示SDS為零、低於零或高於零；及iii）當個體NTproCNP水平高於零SDS時，開始用CNP療法治療。

在各種實施例中，NTproCNP在CNP療法之前2週、一個月、3個月及6個月時量測，以確立基線NTproCNP水平。在各種實施例中，NTproCNP藉由放射免疫分析量測。

亦提供一種治療患有本文所述之骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之個體的方法，其包含：

i）鑑別個體是否具有與身材矮小有關之基因之功能喪失（LoF）或功能獲得（GoF）變異體；

ii）計算該個體之多基因風險評分（PRS）；

iii）判定該個體是否具有LoF變異體及在底端20%的PRS；及

iv）若該個體具有LoF變異體及在底端20%的PRS，則用CNP變異體治療該個體。

在各種實施例中，個體具有在底端20%、19%、18%、17.5%、17%、16.5%、16%、15.5%、15%、14.5%、14%、13.5%、13%、12.5%、12%、11%、10%、9%、8%、7.5%、7%、6%、5%、4%、3%、2.5%、2%或1%的PRS。在各種實施例中，步驟iii）及iv）為若個體具有LoF變異體及在底端12.5%的PRS，則對個體用CNP變異體。

在各種實施例中，與骨骼發育不良或身材矮小相關之基因係選自由以下組成之群：NPR2、SHOX、PTPN11、COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白多醣（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、NPPC、FGFR3、IGF1R、DTL及妊娠相關血漿蛋白質A2（PAPPA2）。

亦考慮一種治療患有本文所述之骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之個體的方法，其包含：

i）鑑別個體是否具有NPR2功能喪失（LoF）或功能獲得（GoF）變異體；

ii）計算該個體之多基因風險評分（PRS）；

iii）判定該個體是否具有NPR2 LoF變異體及在底端20%的PRS；及

iv）若該個體具有NPR2 LoF變異體及在底端20%的PRS，則用CNP變異體治療該個體。

在各種實施例中，個體具有在底端20%、19%、18%、17.5%、17%、16.5%、16%、15.5%、15%、14.5%、14%、13.5%、13%、12.5%、12%、11%、10%、9%、8%、7.5%、7%、6%、5%、4%、3%、2.5%、2%或1%的PRS。在各種實施例中，步驟iii）及iv）為若個體具有LoF變異體及在底端12.5%的PRS，則對個體用CNP變異體。

在各種實施例中，LoF或GoF變異體藉由生物活性分析測定。在各種實施例中，可以例如使用AlphaForm 3D映射（mapping）或其他蛋白映射工具，基於生物活性及映射至蛋白質的所預測3D結構來預測LoF或GoF變異體。

在各種實施例中，PRS係藉由身高之全基因體關聯研究（GWAS）來計算。PRS係由各自在整個基因體中求和的作用較小之許多常見變異體作用組成的累積基因評分（Choi等人《自然規程（Nat Protoc）》, 2020）。為了計算身高PRS，獲得全基因體關聯研究（GWAS）關聯統計資料以指示與身高的每變異體關聯強度。隨後按GWAS作用大小對各身高相關對偶基因數（0、1或2）進行加權，且對各臨床樣品之整個基因體中的此加權計數進行求和，將此等作用大小應用於獨立樣品，此處為臨床群體。PRS可解釋為具有低PRS之個體攜載低於平均數目之增加身高的基因變異體，且具有高PRS之個體攜載高於平均數目之增加身高的變異體。

在另一態樣中，本文提供一種增加患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之6月齡或更小之個體之面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積之方法，其包含以至少30 μg/kg之劑量投與CNP變異體、其結合物、鹽或前藥。亦提供一種減少患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之6月齡或更小之個體之嬰兒猝死、睡眠呼吸障礙的發生率及枕骨大孔神經外科減壓術的必要性的方法，其包含以至少30 μg/kg之劑量投與CNP變異體、其結合物、鹽或前藥。

在各種實施例中，面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積的該增加藉由磁共振成像（MRI）量測。在各種實施例中，面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積之變化係與基線水平、健康對照個體或未治療對照個體進行比較。

在各種實施例中，該CNP變異體皮下投與。在各種實施例中，CNP變異體每天、每週、每2週、每月或更不頻繁地投與。在各種實施例中，該CNP變異體係以30 μg/kg之劑量投與持續3個月、6個月、1年或更長時間。在各種實施例中，當該個體為約2歲時，CNP變異體之劑量減少至15 μg/kg。

應理解，本文所描述之各特性或實施例或組合為本發明之態樣中之任一者的非限制性說明性實例，且因此意謂可與本文所描述之任何其他特性或實施例或組合進行組合。例如，在用諸如「一個實施例」、「一些實施例」、「某些實施例」、「另外實施例」、「特定例示性實施例」及/或「另一實施例」之語言描述特徵之情況下，此等類型之實施例中之各者均為意欲與本文所描述之任何其他特徵或特徵組合相結合之特徵的非限制性實例，而不必列出每種可能性組合。

此等特性或特性組合應用於本發明之態樣中之任一者。在揭示落入範圍內之值之實例的情況下，考慮此等實例中之任一者作為範圍之可能性端點，考慮到此等端點之間之任何及所有數值，且設想具有上端點及下端點之任何及所有組合。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張於2021年12月7日申請之美國臨時專利申請案第63/286,829號及2022年10月21日申請之美國臨時專利申請案第63/380,509號之優先權，該等申請案以全文引用之方式併入本文中。

本申請案係關於發現骨生長之生物標記物可用於評估CNP療法對患有骨骼發育不良之個體中的骨生長及年生長速度的改善。生物標記物可用於基於生物標記物，諸如NTproCNP及CXM水平確定CNP之給藥功效及修改其給藥時機及/或頻率。提供較年輕兒童中功效之額外量測，包括隨時間推移對顱骨及腦形態之分析。 定義

如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外明確規定，否則不定冠詞「一（a）」及「一（an）」以及定冠詞「該（the）」包括複數以及單數指示物。

術語「約」或「大約」意謂如由一般熟習此項技術者所測定的特定值之可接受誤差，其部分視如何量測或測定該值而定。在某些實施例中，術語「約」或「大約」意謂在1、2、3或4個標準差內。在某些實施例中，術語「約」或「大約」意謂在既定值或範圍的30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.05%內。當術語「約」或「大約」冠於一系列兩個或更多個數值中的第一數值之前時，應理解術語「約」或「大約」適用於該系列中之數值中之各者。

術語「C型利尿鈉肽」或「CNP」係指在C端具有17個胺基酸之環結構的較小單鏈肽（GenBank登錄號NP_077720，對於CNP前驅蛋白NPPC）及其變異體。17-聚體CNP環結構亦稱為CNP 17、CNP環或CNP環狀域。CNP包括活性53個胺基酸之肽（CNP-53）及成熟22個胺基酸之肽（CNP-22），以及兩個肽之間的不同長度之肽。

在各種實施例中，「CNP變異體」與野生型NPPC在相同數目之胺基酸殘基上為至少約40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同源。經進一步考慮CNP變異肽可包含約1至約53、或1至39、或1至38、或1至37、或1至35、或1至34、或1至31、或1至27、或1至22、或10至35、或約15至約37個NPPC多肽殘基。在一個實施例中，CNP變異體可包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35,36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53個源自NPPC多肽之胺基酸的序列。CNP變異體亦包括本文所述之CNP變異體之結合物、鹽或前藥。「CNP療法」係指投與CNP變異體以治療患有如本文所述的骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小的個體。

術語「結合部分」係指與變異肽結合之部分。結合部分包括脂質、脂肪酸、親水性間隔子、合成聚合物、連接子或視情況包括其組合。

術語「有效量」係指足以對個體之健康狀況、病變或疾病產生所要結果或足以用於診斷目的之劑量。所要結果可包含劑量之接受者的主觀或客觀改善。「治療有效量」係指可有效產生所預期的對健康有益的作用的藥劑量。在任何個別情況下之適當「有效」量可由一般熟習此項技術者使用常規實驗來確定。應理解，針對任何具體患者之特定劑量水平及給藥頻率可變化且將取決於多種因素，包括所採用之特定化合物的活性；該化合物之生物可用性、代謝穩定性、排泄速率以及作用時間長度；化合物之投與模式及投與時間；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別以及飲食；以及特定病狀之嚴重程度。

「實質上純的」或「經分離的」意謂目標物種為存在之主要物種（即，按莫耳計，比組合物中之任何其他個別大分子物種更豐富），且實質上純化之部分為其中目標物種占所存在之所有大分子物種之至少約50%（按莫耳計）的組合物。在一個實施例中，實質上純的組合物意謂所關注之物種以莫耳計或重量計占存在於組合物中之大分子物種之至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更多。若組合物基本上由單一大分子物種組成，則將目標物種純化至基本均質（藉由習知偵測方法無法偵測到組合物中之污染物種）。出於此定義之目的，溶劑物種、小分子（＜500道爾頓）、穩定劑（例如BSA）及元素離子物種不視為大分子物種。在一個實施例中，本發明之化合物為實質上純的或經分離的。在另一實施例中，本發明之化合物相對於其生產中所使用之大分子起始材料為實質上純的或經分離的。在又另一實施例中，本發明之醫藥組合物包含與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑且視情況與另一生物活性劑摻合的實質上純的或經分離的CNP變異體。

「治療」係指預防性治療或治療性治療或診斷性治療。在某些實施例中，「治療」係指出於治療、預防或診斷目的而向個體投與化合物或組合物。

「預防性」治療為出於降低產生病變之風險的目的，向未展現疾病之病徵或僅展現疾病之早期病徵的個體所投與之治療。本發明之化合物或組合物可作為預防性治療提供以減少產生病變之可能性或最小化病變（若產生）之嚴重程度。

「治療性」治療為出於減輕或消除病變之病徵或症狀的目的，向展現彼等病徵或症狀之個體所投與之治療。病徵或症狀可為生物化學的、細胞的、組織學的、功能或物理的、主觀或客觀的。本發明之化合物亦可作為治療性治療給出或針對診斷提供。

「診斷」意謂鑑別病理學病狀之存在、程度及/或性質。診斷方法在其特異性及選擇性方面不同。雖然特定診斷方法可能提供不出病狀之確定診斷，但若方法提供輔助診斷之正向指示，則其為足夠的。

「骨相關或軟骨相關的生物標記物」或「骨相關或軟骨相關的標記物」係指水平與例如軟骨轉換、軟骨形成、軟骨生長、骨再吸收、骨形成、骨生長或其組合相關聯而增加或減少的生長因子、酶、蛋白質或其他可偵測的生物物質或部分。此類生物標記物可在投與如本文所描述之CNP變異體之前、期間及/或之後量測。例示性骨相關或軟骨相關的生物標記物包括但不限於CNP、cGMP、II型膠原蛋白及其片段之前肽、II型膠原蛋白及其片段、I型膠原蛋白及其片段之前肽、I型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原（PCNA）、聚集蛋白多醣硫酸軟骨素、膠原蛋白X、膠原蛋白X之N端片段（CXM）及鹼性磷酸酶。可量測任何適當生物樣品中之軟骨相關及骨相關的生物標記物，包括但不限於組織、血液、血清、血漿、腦脊髓液、滑液及尿液。

「醫藥組合物」或「調配物」係指適用於個體動物（包括人類及哺乳動物）中之醫藥用途的組合物。醫藥組合物包含治療有效量之CNP變異體、視情況存在之另一生物活性劑以及視情況存在之醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一實施例中，醫藥組合物涵蓋包含活性成分及構成載劑之惰性成分的組合物，以及直接或間接由任何兩或更多種成分之組合、複合或聚集或由一或多種成分的解離或由一或多種成分的其他類型之反應或相互作用而產生的任何產物。因此，本發明之醫藥組合物涵蓋藉由將本發明化合物與醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑摻和而製得之任何組合物。

「醫藥學上可接受之載劑」係指標準醫藥載劑、緩衝劑及其類似物中之任一者，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、5%右旋糖水性溶液及乳液（例如油/水或水/油乳液）。賦形劑之非限制性實例包括佐劑、黏合劑、填充劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、滑動劑、甜味劑、調味劑及著色劑。適合醫藥載劑、賦形劑以及稀釋劑描述於《雷明頓醫藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》，第19版（馬克出版公司（Mack Publishing Co.）, 伊斯頓（Easton），1995）中。較佳醫藥載劑視投與活性劑之預期模式而定。投與之典型模式包括經腸（例如，經口）或非經腸（例如，皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內注射；或局部、經皮或經黏膜投與）。

「醫藥學上可接受之鹽」為可調配為用於醫藥用途之化合物的鹽，包括但不限於金屬鹽（例如鈉、鉀、鎂、鈣等）及氨或有機胺之鹽。

「醫藥學上可接受的」或「藥理學上可接受的」意謂不為生物學上或以其他方式非所要之材料，亦即可在不導致任何非所要生物效應之情況下或在不以有害方式與含有其之組合物之任何組分或與存在於個體身體之上或之中之任何組分相互作用的情況下向個體投與之材料。

「生理條件」係指動物（例如人類）體內之條件。生理條件包括但不限於體溫以及具有生理學離子強度、pH及酶之水性環境。生理條件亦涵蓋特定個體體內之條件，其不同於大多數個體中存在之「正常」條件，例如其不同於大約37℃之正常人體溫度或不同於大約7.4之正常人血液pH。

「生理pH」或「生理範圍內之pH」意謂大約7.0至8.0（包括端點）範圍內，更通常在大約7.2至7.6（包括端點）範圍內之pH。

如本文所用，術語「個體」涵蓋哺乳動物及非哺乳動物。哺乳動物之實例包括但不限於哺乳動物類之任何成員：人類、非人類靈長類動物，諸如黑猩猩及其他猿及猴物種；農畜，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔、狗及貓；實驗室動物，包括嚙齒動物（諸如大鼠、小鼠及天竺鼠）及其類似者。非哺乳動物之實例包括但不限於鳥類、魚及其類似動物。該術語不指示具體年齡或性別。在各種實施例中，個體為人類。在各種實施例中，個體為兒童或青少年。在各種實施例中，個體為嬰兒。在各種實施例中，個體年齡大於3個月、大於2個月、大於1個月或大於6個月。 C 型利尿鈉肽

C型利尿鈉肽（CNP）（《生物化學與生物物理研究通訊（Biochem. Biophys. Res. Commun.）》, 168: 863-870（1990）（GenBank登錄號NP_077720，對於CNP前驅蛋白NPPC）（《高血壓雜誌（J. Hypertens.）》, 10: 907-912（1992））為具有17個胺基酸之環結構之肽家族（ANP、BNP、CNP）中之小單鏈肽（Levin等人，《新英格蘭醫學雜誌（N. Engl. J. Med.）》, 339: 863-870（1998）））且在多種生物過程中具有重要作用。CNP與利尿鈉肽受體-B（NPR-B、GC-B）相互作用以刺激產生環單磷酸鳥苷（cGMP）（《高血壓雜誌》 10: 1111-1114（1992））。CNP更廣泛表現，包括於中樞神經系統、生殖道、骨及血管內皮中（Gardner等人，《高血壓（Hypertension）》, 49: 419-426（2007））。

在人類中，CNP最初以單鏈126胺基酸前原（pre-pro）多肽形式自利尿鈉肽前驅體C（NPPC）基因產生（Sudoh等人，《生物化學與生物物理研究通訊》, 168: 863-870（1990））。移除信號肽產生原-CNP，且藉由內切蛋白酶弗林蛋白酶（endoprotease furin）進一步裂解產生活性53個胺基酸之肽（CNP-53），其經分泌且藉由未知酶再次裂解以產生成熟的22個胺基酸之肽（CNP-22）（Wu, 《生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）》 278: 25847-852（2003））。CNP-53及CNP-22區別在於其分佈，CNP-53主要在組織中，而CNP-22主要存在於血漿及腦脊髓液中（《受體及信號轉導研究雜誌（J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res.）》, 26: 269-297（2006））。CNP-53及CNP-22與NPR-B類似地結合。

cGMP產生介導之下游信號傳導影響許多不同生物過程，包括軟骨內成骨。舉例而言，小鼠模型中之CNP或NPR-B之基因剔除導致矮化表型之動物具有較短的長骨及脊椎。已鑑別出阻斷適當CNP信號傳導之人類NPR-B突變且其導致侏儒症（Olney等人，《臨床內分泌與代謝雜誌（J. Clin. Endocrinol. Metab.）》 91（4）: 1229-1232（2006）；Bartels等人，《美國人類遺傳學雜誌（Am. J. Hum. Genet.）》 75: 27-34（2004））。相比之下，經工程改造以產生升高水平之CNP的小鼠展現延長的長骨及脊椎。

先前已描述天然CNP基因及多肽。美國專利第5,352,770號揭示自豬腦分離及純化的序列與人類CNP相同之CNP-22以及其治療心臟血管適應症之用途。美國專利第6,034,231號揭示前原CNP（126個胺基酸）之人類基因及多肽以及人類CNP-53基因及多肽。成熟CNP為22個胺基酸之肽（CNP-22）。某些CNP變異體揭示於美國專利8,198,242中，其以引用之方式併入本文中。

在各種實施例中，本發明之CNP包括範圍介於人類CNP-17（hCNP-17）至人類CNP-53（hCNP-53）且具有源自hCNP-53之野生型胺基酸序列的截短CNP，以及其變異體。此類截短CNP肽包括： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP37）（SEQ ID NO: 1）；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 2）； GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP53）（SEQ ID NO: 3）；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP53）（SEQ ID NO: 4）；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP53）（SEQ ID NO: 5）；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-53(M48N)]（SEQ ID NO: 6）；LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-52）（SEQ ID NO: 7）； RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-51）（SEQ ID NO: 8）； VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP- 50）（SEQ ID NO: 9）； DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-49）（SEQ ID NO: 10）； TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-48）（SEQ ID NO: 11）； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-47）（SEQ ID NO: 12）； SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-46）（SEQ ID NO: 13）； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-45）（SEQ ID NO: 14）； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-44）（SEQ ID NO: 15）； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-43）（SEQ ID NO: 16）；WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-42）（SEQ ID NO: 17）；ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-41）（SEQ ID NO: 18）；RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-40）（SEQ ID NO: 19）；LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-39）（SEQ ID NO: 20）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 21）；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 22）；EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-36）（SEQ ID NO: 23）；HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-35）（SEQ ID NO: 24）；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 25）；NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-33）（SEQ ID NO: 26）；ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-32）（SEQ ID NO: 27）；RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-31）（SEQ ID NO: 28）；KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-30）（SEQ ID NO: 29）；YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-29）（SEQ ID NO: 30）；KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-28）（SEQ ID NO: 31）；GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-27）（SEQ ID NO: 32）；ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-26）（SEQ ID NO: 33）；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-25）（SEQ ID NO: 34）； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-24）（SEQ ID NO: 35）； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-23）（SEQ ID NO: 36）； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-21）（SEQ ID NO: 37）； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-20）（SEQ ID NO: 38）； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-19）（SEQ ID NO: 39）； GCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-18）（SEQ ID NO: 40）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N)]（SEQ ID NO: 41）； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP-37）（SEQ ID NO: 42）； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP-37）（SEQ ID NO: 43）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37(M32N)]（SEQ ID NO: 44）； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 45）； PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 46）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 47）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 48）；及PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 49）。

在各種實施例中，CNP變異肽為經修飾之CNP-37或CNP-38肽，視情況具有弗林蛋白酶裂解位點處之突變/取代及/或含有N端處之甘胺酸或脯胺酸-甘胺酸。例示性CNP-37變異體包括但不限於： QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N)；SEQ ID NO: 41]； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP-37；SEQ ID NO: 43）； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP-37；SEQ ID NO: 42）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37(M32N)；SEQ ID NO: 44]； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37；SEQ ID NO:1）； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 45）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37: SEQ ID NO: 2） GQEHPNARKYKGAN PKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 50）； GQEHPNARKYKGAN QKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 51）； GQEHPNARKYKGAN QQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 52）；及 GQEHPNARKYKGAN KPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 53）；

在各種實施例中，本發明之CNP變異體包括PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 46）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 47）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 48）；或PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 49）。

變異肽可進一步包含乙醯基。在各種實施例中，乙醯基位於肽之N端上。在各種實施例中，肽於C端進一步包含OH或NH ₂基團。

變異肽可包含結合部分。在各種實施例中，結合部分在CNP環狀域之殘基上或在除該CNP環狀域之外的位點處。在各種實施例中，結合部分位於離胺酸殘基上。在各種實施例中，結合部分包含一或多個酸部分。在各種實施例中，酸部分為疏水性酸。

在各種實施例中，變異體具有以下結構：PGQEHPQARRY RGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 46）或Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 46）。

在各種實施例中，變異體係選自由以下組成之群： Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 46）； Ac-PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH ₂（SEQ ID NO: 47）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 48）； Ac-PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH ₂（SEQ ID NO: 48）； Ac-PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH ₂（SEQ ID NO: 46）； Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-NH ₂（SEQ ID NO: 49）；及 Ac- PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 49）。

在各種實施例中，CNP變異體為Ac-PGQEHPQARRYRGA QRRGLSRGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 46）。在各種實施例中，CNP變異體為Ac-PGQEHPNARKYK GANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 47）。在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLK(AEEA-AEEA-γGlu-C18DA)LDRIGSMSGLGC-OH（SEQ ID NO: 47）。

經進一步考慮CNP變異體結合至或複合至賦予增加之穩定性或半衰期的部分，例如結合部分。在各種實施例中，結合部分經由非共價鍵複合或藉由共價鍵連接。該部分可經由靜電相互作用與肽非共價連接。可替代地，該部分可經由一或多個連接子部分與肽共價結合。連接子可為可裂解及不可裂解連接子。可裂解連接子可經由酶、親核/鹼性試劑、還原劑、光照射、親電/酸性試劑、有機金屬及金屬試劑或氧化試劑裂解。連接子亦可為自分解型連接子。例示性連接子包括但不限於：N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯（SPDP）、亞胺基硫雜環戊烷（IT）、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如鹽酸二亞胺代己二酸二甲酯）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）、β丙胺酸、4-胺基丁酸（GABA）、2-胺基乙氧基酸（AEA）、胺基乙氧基-2-乙氧基乙酸（AEEA）、5胺基戊酸（AVA）、6-胺基己酸（Abx）、鄰二醇可裂解連接子、三甲基鎖內酯化、對烷氧基苯基胺基甲酸酯、bicin、類肽或bicin型連接子以及如本文所描述之電子連接子。

經考慮連接子連接至CNP環狀域內之CNP變異體之殘基或位於除該CNP環狀域之外的位點處。在各種實施例中，連接子連接至離胺酸殘基。在各種實施例中，連接子連接至CNP環狀域中之離胺酸殘基。

在各種實施例中，CNP變異體經由連接子連接至結合部分。在各種實施例中，連接子經由結合部分之親水性間隔子連接至結合部分。

在各種實施例中，連接子為可水解連接子。

在各種實施例中，連接子為類肽或電子連接子。在各種實施例中，連接子為類肽連接子。在各種實施例中，連接子為電子連接子。在各種實施例中，連接子包含SO ₂部分。例示性連接子繪示於圖7中。經進一步考慮圖7中之連接子藉由R基團上之取代經修飾。舉例而言，bicin型連接子包括如下所述之結構： 。

在各種實施例中，與肽結合之部分為合成聚合物，諸如聚乙二醇、連接子、脂質部分或脂肪酸或其組合。在各種實施例中，CNP變異體與脂肪酸、胺基酸、間隔子及連接子結合。在各種實施例中，CNP變異體與脂肪酸、胺基酸、聚乙二醇間隔子或聚乙二醇衍生物間隔子及連接子結合。在各種實施例中，CNP變異體與脂肪酸、胺基酸、間隔子及連接子結合，其中間隔子包含經取代之C-6至C-20烷基鏈或任何胺基酸或兩者之組合，其中烷基鏈之碳原子可經O、NH、N(C-1至C-6烷基)或羰基中之一或多者置換。

在各種實施例中，CNP變異體與脂肪酸結合。假設脂質技術增加CNP變異體之血清半衰期，允許較低頻率注射及/或經改良之經口遞送。在各種實施例中，脂肪酸為短鏈、中鏈、長鏈脂肪酸或二羧基脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為飽和或不飽和的。在各種實施例中，脂肪酸為C-6至C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為癸酸、十二酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十酸或其二酸。在各種實施例中，脂肪酸與離胺酸殘基結合。

在各種實施例中，經考慮本文所描述之CNP變異體包含如本文所描述之結合部分。經考慮結合部分位於CNP環狀域之殘基上或在除CNP環狀域之外位點處。在各種實施例中，結合部分位於離胺酸殘基上。在各種實施例中，結合部分包含一或多個酸部分。在各種實施例中，酸部分為脂肪酸。例示性CNP變異體及肽結合物描述於國際專利申請案第PCT/US2020/051100號及USSN 17/642,150中，其以全文引用的方式併入本文中。CNP之變異體、結合物及鹽揭示於USSN 17/634,034中，其以引用的方式併入本文中。

在各種實施例中，結合部分包含與親水性間隔子連接之酸部分。在各種實施例中，親水性間隔子為經取代之C-6至C-20烷基鏈或任何胺基酸或兩者之組合，其中烷基鏈之碳原子可經O、NH、N(C-1至C-6烷基)或羰基中之一或多者置換。在各種實施例中，親水性間隔子為任何胺基酸。在各種實施例中，親水性間隔子為γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，親水性間隔子為經取代之C-6至C-20烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔子為經取代之C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔子為經取代之C-9至C-18烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔子為經取代之C-18烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔子為經取代C-9烷基鏈。在各種實施例中，親水性間隔子為一或多個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）基團。在各種實施例中，親水性間隔子為一或兩個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）基團。在各種實施例中，親水性間隔子為OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）。在各種實施例中，間隔子為OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）或γGlu。在各種實施例中，親水性間隔子為與一或多個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）基團連接之γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，親水性間隔子為與一或兩個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）基團（diEG）連接之γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，酸部分及親水性間隔子具有結構AEEA-AEEA-γGlu-C18DA。

在各種實施例中，本發明考慮使用CNP變異體，其包含親水性或水溶性聚合物（例如氧化烷基鏈，其中碳原子可經一或多個氧原子置換，諸如聚乙二醇（PEG）或聚氧化乙烯（PEO）及其類似物）。在各種實施例中，水溶性聚合物之類型（例如均聚物或共聚物；無規、交替或嵌段共聚物；直鏈或分支鏈；單分散或多分散）、鍵（例如可水解或穩定鍵，諸如醯胺、亞胺、縮醛胺、伸烷基或酯鍵）、結合位點（例如在N端、內部及/或C端）及長度（例如約0.2、0.4或0.6 kDa至約2、5、10、25、50或100 kDa）可變化。如此項技術中已知，親水性或水溶性聚合物可藉助於基於N-羥基丁二醯亞胺（NHS）或醛之化學物質或其他化學物質與CNP變異體結合。在各種實施例中，帶負電之PEG-CNP變異體可針對降低腎清除率設計，包括但不限於使用羧化、硫酸化及磷酸化化合物（Caliceti, 《先進藥物遞送評論（Adv. Drug Deliv. Rev.）》, 55: 1261-77（2003）; Perlman, 《臨床內分泌與代謝雜誌（J. Clin. Endo. Metab.）》, 88: 3227-35（2003）; Pitkin, 《抗菌劑和化療（Antimicrob. Ag. Chemo.）》, 29: 440-444（1986）; Vehaskari, 《國際腎學（Kidney Int'l）》, 22: 127-135（1982））。在一個實施例中，PEG（或PEO）部分含有一或多個羧基、一或多個硫酸基及/或一或多個磷酸基。

在另一實施例中，與本文所描述之CNP變異體之N端、C端及/或一或多個內部位點結合之親水性聚合物（例如，PEG或PEO）部分含有一或多個在生理條件下帶正電之官能基。此類部分尤其經設計以改良此類結合之CNP變異體向軟骨組織中之分佈。在一個實施例中，PEG部分含有一或多個一級、二級或三級胺基、四級銨基及/或其他含胺（例如脲）基。 使用 CNP 變異體之方法

軟骨發育不全為纖維母細胞生長因子受體3（FGFR-3）之基因中體染色體顯性突變之結果，此導致軟骨形成異常。FGFR-3對軟骨細胞生長通常具有負調節作用，且因此對骨生長具有負調節作用。在軟骨發育不全中，FGFR-3之突變形式為組成性活性的，其導致骨嚴重縮短。在人類中，FGFR-3之活化突變為遺傳性侏儒症的主要原因。具有活化FGFR-3之小鼠充當軟骨發育不全（骨骼發育不良之最常見形式）之模型，且CNP之過度表現拯救此等動物免遭侏儒症。因此，CNP之功能變異體為治療各種骨骼發育不良的潛在治療劑。

藉由刺激軟骨細胞之基質產生、增殖及分化以及增加長骨生長，本發明之CNP變異體可用於治療罹患骨相關病症，諸如骨骼發育不良或身材矮小之哺乳動物，包括人類。CNP反應性骨相關病症骨骼發育不良及身材矮小病症之非限制性實例包括軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性發育不良、先天性成骨、軟骨成長不全、先天性軟骨發育異常、同合子型軟骨發育不全、先天性軟骨發育異常、屈肢骨發育不良、先天性致死型低磷酸酶症、圍產期致死型先天性成骨、短肋骨多指症候群、軟骨生成減退、肢根型先天性軟骨發育異常、揚森型幹骺端發育不良、先天性脊椎骨骺發育不良、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良、尼維格型肢中骨發育不良、羅比諾氏症候群、萊因哈特氏症候群、肢端發育不全、周圍骨發育障礙、克尼斯特氏發育不良、纖維軟骨增生症、羅伯茨氏症候群、肢端肢中發育不良、小肢畸形、莫奎氏症候群、克尼斯特氏症候群、後生營養性發育不良、及脊椎骨骺幹骺端發育不良、與NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群/萊里維爾）、PTPN11突變（努南氏症候群）及IGF1R突變有關的病症。

方法涵蓋之額外身材矮小及生長板病症包括與膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白多醣（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或IGF1R之突變相關之病症。

此外，CNP變異體適用作用於治療特發性身材矮小及其他骨骼發育不良之生長激素的佐劑或替代物。

生長板病症包括導致身材矮小或骨生長異常且可為涉及骨生長之基因中之基因突變之結果的病症，該基因包括膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白多醣（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或IGF1R。在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多個突變相關。在各種實施例中，患有生長板病症之個體對於生長板基因中之突變為異型接合的。在各種實施例中，突變為功能喪失型突變。在各種實施例中，突變為功能獲得型突變。生長板病症包括但不限於家族性身材矮小、顯性家族性身材矮小（其亦稱為顯性遺傳性身材矮小）或特發性身材矮小。參見例如Plachy等人，《臨床內分泌代謝雜誌》 104: 4273-4281, 2019。

ACAN之突變可引起家族性剝脫性骨軟骨炎及身材矮小且最終引起骨關節炎，其特徵在於由軟骨及有時骨頭在關節處自骨末端脫離引起之骨損傷（或病變）區域。已提出骨生長中之軟骨網狀結構錯亂會損害其生長，導致身材矮小。與ACAN及身材矮小相關之突變包括Val2303Met。參見Stattin等人，《美國人類遺傳學雜誌》 86（2）:126-37, 2010。經考慮具有導致身材矮小之ACAN突變的患者將受益於CNP治療，因為投與可能夠藉由CNP與FGFR3之已知相互作用增加此等患者之身高。

已展示利尿鈉肽系統（包括受體NPR2）涉及軟骨內化骨生長之調節（Vasques等人，《兒科激素研究（Horm Res Pediat）》 82:222-229, 2014）。研究已展示NPR2中之同型接合或複合異型接合功能喪失型突變引起肢端肢中發育不良型Maroteaux（AMDM），其為身材極其矮小之骨骼發育不良（Vasquez等人，2014, 見上文）。有報導暗示異型接合功能喪失型（諸如顯性負性）NPR2突變係身材矮小之原因，而功能獲得型NPR2異型接合突變已被認為係身材高大之原因（Vasquez等人，2014, 見上文）。鑒於CNP與NPR2相互作用以刺激cGMP生成，增加cGMP水平在此等情況下為期望的，且將在管理來自此等疾病及病狀之併發症中具有治療益處。

咸信NPR2之異型接合突變導致特發性身材矮小及其他形式之身材矮小。NPR2基因之突變闡述於下文且描述於以下各者中：Amano等人，《臨床內分泌代謝雜誌》 99:E713-718, 2014；Hisado-Oliva等人，《臨床內分泌代謝雜誌》 100:E1133-1142, 2015及Vasques等人，《臨床內分泌代謝雜誌》 98:E1636-1644, 2013，特此以引用之方式併入。經考慮患有待用如本文所描述之CNP變異體治療之身材矮小的個體具有小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS，且具有至少一個具有小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5之身高SDS的親代，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體可用於治療身高SDS為-2.0至-3.0之患有身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體可用於治療身高SDS為-2.0至-2.5之患有身材矮小的個體。然而，由於NPR2中之原發突變可導致如由小於-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS所定義之身材矮小，因此亦考慮治療任一親代均不患有身材矮小的作為NPR2中之有害突變之異型接合攜帶者的個體。經進一步考慮用CNP治療對於其他生長板基因中之有害突變為異型接合之個體，以改善身材及/或增強骨生長。

NPR2中的例示性突變揭示於國際專利公開案WO 2021/055497中，該公開案以引用之方式併入本文中。

NPPC在骨骼生長中之作用已得到充分證明（Hisado-Oliva等人，《遺傳學藥物（Genetics Medicine）》  20:91-97, 2018）。NPPC基因剔除小鼠展示嚴重不成比例形式之侏儒症，包括四肢縮短及軟骨內成骨（Hisado-Oliva等人，2018, 見上文）。人類全基因體研究已展示NPPC與身高之間的關聯（Hisado-Oliva等人，2018, 見上文）。儘管咸信CNP單倍劑量不足為人類身材矮小之原因，但近來的研究鑑別了身材矮小及雙手短小之家族中之異型接合突變（Hisado-Oliva等人，2018, 見上文）。此等研究觀測到以異型接合狀態量測之cGMP產量顯著降低（Hisado-Oliva等人，2018, 見上文）。NPPC之突變包括引起Gly119Cys改變之355G＞T誤義突變及引起Arg117Gly改變之349C＞G誤義突變。拯救CGMP產生之CNP變異體可在具有異型接合功能喪失型NPPC突變之患者的病症管理中提供治療益處。

萊里-維爾軟骨骨生成障礙（Leri-Weill dyschondrosteosis；LWD）為稀有遺傳病症，其特徵在於前臂及小腿縮短、手腕異常錯位（手腕馬得隆變形（Madelung deformity））及相關的身材矮小。LWD係由位於性染色體之假體染色體區域1（pseudoautosomal region 1；PAR1）上之含身材矮小同源盒（SHOX）基因或其調節元件中之異型接合突變引起。（參見稀有疾病資料庫（Rare Disease Database）及Carmona等人，《人類分子遺傳學（Hum Mol Genet）》 20:1547-1559, 2011）。病症蘭格肢中骨發育不良在存在兩個SHOX突變時產生，且可由各染色體上之突變（同型接合或複合異型接合突變）產生。SHOX突變之子集引起特發性身材矮小。特納氏症候群由於可包括SHOX基因之X染色體上之缺失而產生。SHOX已鑑別為涉及 FGFR3轉錄調節且有助於控制骨生長（Marchini等人，《內分泌綜述（Endocr Rev.）》 37: 417-448, 2016）。SHOX缺乏導致FGFR3信號傳導增加，且一些證據支持SHOX亦與CNP/NPR2直接相互作用（Marchini, 見上文）。鑒於SHOX與FGFR3及骨生長之關聯，經考慮具有同型接合或異型接合SHOX突變之個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療。

拉索病為由Ras/促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase；MAPK）路徑基因中之突變引起的一組罕見遺傳病狀。拉索病為特徵在於經由RAS/MAPK路徑之信號傳導增加的一組病症。此路徑導致RAF/MEK/ERK路徑之下游活化。身材矮小為某些拉索病之典型特徵。舉例而言，CNP信號傳導抑制RAF且使得MEK及ERK活化降低。

本文涵蓋拉索病之治療。與身材矮小相關之拉索病包括努南氏症候群、科斯特洛症候群、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤及LEOPARD症候群。遺傳性1型齒齦纖維瘤亦為本文所涵蓋之拉索病。拉索病患者（包括努南氏症候群、科斯特洛症候群、心臉皮膚症候群、1型神經纖維瘤、LEOPARD症候群、遺傳性1型齒齦纖維瘤）包括具有以下基因中之一或多者中之異型接合變異體的患者：BRAF、CBL、HRAS、KRAS、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MRAS、NF1、NRAS、PPP1CB、PTPN11、RAF1、RRAS、RIT1、SHOC2、SOS1或SOS2（Tajan等人《內分泌評論（Endocr. Rev.）》2018;39（5）:676-700）。

CFC由Ras/MAPK信號傳導路徑中之若干基因，包括K-Ras、B-Raf、Mek1及Mek2之突變引起。科斯特洛症候群，亦稱為顏面皮膚骨骼（FCS）症候群，係由H-Ras基因中之活化突變引起。遺傳性I型齒齦纖維瘤（HGF）係由無七之子同源物1（ Son of Sevenlesshomolog 1；SOS1）基因中之顯性突變引起，該基因編碼作用於小GTP酶之Ras子族的鳥嘌呤核苷酸交換因子（SOS）。I型神經纖維瘤（NF1）係由神經纖維瘤蛋白1基因中之突變引起，該基因編碼Ras/MAPK信號傳導路徑之負調節因子。努南氏症候群（NS）係由若干基因中之一者之突變引起，該等基因包括PTPN11（其編碼SHP2）及SOS1，以及K-Ras及Raf-1。

CNP已證明為拉索病模型中之有效療法。Ono等人產生在II型膠原蛋白生產細胞中缺乏 Nf1之小鼠（Ono等人，《人類分子遺傳學（Hum. Mol. Genet.）》2013;22（15）:3048-62）。此等小鼠展現組成性ERK1/2活化，及軟骨細胞增殖減少，及成熟。向此等小鼠每日注射CNP使得ERK磷酸化降低且校正了身材矮小。使用 Braf突變（p.Q241R）之心臉皮膚症候群之小鼠模型（Inoue等人《人類分子遺傳學》2019;28（1）:74-83）展現相比於野生型減小之體長及減小之生長板寬度與較小的增殖及肥大區域，且投與CNP使得此等動物之體長增加。

多個基因之突變可引起努南氏症候群，其特徵在於身材矮小、心臟缺陷、出血問題及骨骼畸形。PTPN11基因之突變引起努南氏症候群之所有病例之約一半。SOS1基因突變引起額外10%至15%病例，且RAF1及RIT1基因各自占病例之約5%。其他基因之突變各自占少數病例。15%至20%患有此病症之人群的病因為未知的。

PTPN11、SOS1、RAF1及RIT1基因均編碼在RAS/MAPK細胞信號傳導路徑中重要之蛋白質，該路徑對於細胞分裂及生長（增殖）、分化及細胞遷移係必需的。與努南氏症候群相關之基因中之許多突變使所得蛋白質被打開（活化），且此長時間活化改變正常RAS/MAPK信號傳導，其破壞細胞生長及分裂調節，從而導致努南氏症候群之典型特徵。參見例如Chen等人，《美國國家科學院院刊（Proc Natl Acad Sci U S A.）》111（31）:11473-8, 2014, Romano等人，《嬰兒病學（Pediatrics）》. 126（4）:746-59, 2010，及Milosavljević等人，《美國醫學遺傳學雜誌（Am J Med Genet）》170（7）:1874-80, 2016。經考慮具有活化MAPK路徑之突變的個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療，以改善骨生長及身材矮小。亦經考慮具有活化MAPK路徑之突變的個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療，以改善與整個身體之其他細胞（其中NPR2受體表現於其表面上）中之過度活化MAPK路徑相關的其他共患病。

編碼非受體蛋白酪胺酸磷酸酶SHP-2的PTPN11基因之突變導致特徵為身材矮小之病症，諸如努南氏症候群（Musente等人，《歐洲人類遺傳學雜誌（Eur J Hum Genet）》11:201-206（2003）。Musente（見上文）鑑別PTPN11基因中導致身材矮小之許多突變。功能獲得型突變引起經由SHP2之過度活化信號傳導且抑制生長激素誘導之IGF-1釋放，從而使得骨生長減少（Rocca Serra-Nédélec, 《美國國家科學院院刊（PNAS）》 109:4257-4262, 2012）。經考慮具有同型接合或異型接合PTPN11突變之個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療，以改善骨生長及身材矮小。

印度刺蝟因子（IHH）基因（其與軟骨內成骨之調節有關）之突變亦與身材矮小症候群相關（Vasques等人，《臨床內分泌代謝雜誌》103:604-614, 2018）。許多經鑑別之IHH突變以顯性遺傳模式與身材矮小分隔。鑒於IHH與骨生長及骨化之關聯，經考慮具有同型接合或異型接合IHH突變之個體將受益於用如本文所描述之CNP變異體治療。

FGFR3之突變，包括N540K及K650N導致身材矮小及軟骨生成減退。

胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）為具有內在激酶活性之雜四聚體（α2β2）跨膜醣蛋白。已展示IGF1R在產前及產後生長中起作用。已在小於胎齡兒（gestational age children；SGA）及患有家族性身材矮小之個體中鑑別IGF1R之異型接合突變（Kawashima等人，《內分泌雜誌（Endocrine J.）》59:179-185, 2012）。與身材矮小相關之IGF1R突變包括R108Q/K115N、R59T、R709Q、G1050K、R481Q、V599E及G1125A（Kawashima，見上文）。

身高為可受數百個或數千個基因之組合作用影響的高度遺傳性性狀（Wood等人，2014, 《自然遺傳學（Nature Genetics）》, 46:1173-1189）。個體之身材矮小可為此等基因之組合作用的結果，單一基因並非主要貢獻者。鑒於CNP增加正常動物之長度，例如增強骨生長及骨長度之能力，經考慮患有由小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0之身高SDS定義之身材矮小的此類個體可有益地用CNP變異體治療。

在各種實施例中，CNP變異體可用於治療具有如下之身材矮小的個體：身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0、-2.5或-3.0，且至少一個親代之身高SDS為小於-1.0、-1.5、-2.0或-2.5，視情況其中第二親代之身高在正常範圍內。在各種實施例中，CNP變異體可用於治療身高SDS為-2.0至-3.0之患有身材矮小的個體。在各種實施例中，CNP變異體可用於治療身高SDS為-2.0至-2.5之患有身材矮小的個體。在各種實施例中，身材矮小與相關於身材矮小之基因，諸如膠原蛋白（COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白多醣（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、PTPN11、NPR2、NPPC、FGFR3或胰島素生長因子1受體（IGF1R）、DTL、PAPPA2或其組合中之一或多個突變相關。

在各種實施例中，生長板病症或身材矮小與相關於拉索病之基因中之一或多個突變相關。

在各種實施例中，身材矮小為如藉由多基因風險評分（PRS）所確定之多個基因之突變的結果。使用針對身高公佈的最大全基因體關聯研究（GWAS）綜合分析計算身高之多基因風險評分（PRS），該綜合分析不包括來自如WO 2021/055497中所描述之英國生物庫（UK Biobank）項目之任何樣品。可將群組分為五個PRS五分位數（PRS 1為最矮身高，PRS 5為最高身高）。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPR2之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有IGF1R之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有NPPC之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有SHOX之突變及低PRS。在各種實施例中，個體具有FGFR3、IGF1R、NPPC、NPR2及SHOX中之一或多者之一或多個突變及低PRS。在各種實施例中，PRS為1或2。在各種實施例中，PRS為1。在各種實施例中，PRS為2。

另外，CNP變異體可用於治療其他骨相關病狀及病症，諸如佝僂病、低磷酸鹽血性佝僂病[包括X性聯低磷酸鹽血性佝僂病（亦稱為耐維生素D性佝僂病）及體染色體顯性低磷酸鹽血性佝僂病]，及骨質軟化[包括腫瘤誘導之骨質軟化（亦稱為致癌骨質軟化或致癌低磷酸鹽血性骨質軟化）]。

本文揭示一種治療患有本文所述之骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之個體的方法，其包含：

i）鑑別個體是否具有與身材矮小有關之基因之功能喪失（LoF）或功能獲得（GoF）變異體；

ii）計算該個體之多基因風險評分（PRS）；

iii）判定該個體是否具有LoF變異體及在底端20%的PRS；及

iv）若該個體具有LoF變異體及在底端20%的PRS，則用CNP變異體治療該個體。

在各種實施例中，個體具有在底端20%、19%、18%、17.5%、17%、16.5%、16%、15.5%、15%、14.5%、14%、13.5%、13%、12.5%、12%、11%、10%、9%、8%、7.5%、7%、6%、5%、4%、3%、2.5%、2%或1%的PRS。在各種實施例中，步驟iii）及iv）為若個體具有LoF變異體及在底端12.5%的PRS，則對個體用CNP變異體。

與骨骼發育不良或身材矮小相關之例示性基因包括但不限於：NPR2、SHOX、PTPN11、COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白多醣（ACAN）、印度刺蝟因子（IHH）、NPPC、FGFR3、IGF1R、DTL及妊娠相關血漿蛋白質A2（PAPPA2）。

藉由生物活性分析確定與身材矮小相關之基因的LoF或GoF變異體的存在。在各種實施例中，可以例如使用AlphaForm 3D映射或其他蛋白映射工具，基於映射至由基因編碼之蛋白質的所預測3D結構及活性域來預測LoF或GoF變異體。

在例示性方法中，PRS係藉由身高的全基因體關聯研究（GWAS）來計算。

在某些實施例中，本發明之CNP變異體及包含其之組合物及調配物可用於改善骨骼發育不良之一或多種症狀或生理學後果，其中該改善可為絕對生長增加、生長速度增加、定性電腦斷層攝影（qualitative computed tomography；QCT）骨礦物質密度增加、生長板形態改善、長骨生長增加、脊柱形態改善、肘關節活動範圍改善及/或睡眠呼吸暫停減少。就此而言，應注意術語「經改善（improved）」、「改善（improvement）」、「增加」、「降低」及其文法等效術語當相對於疾病病況之症狀或生理學後果使用時均為相對術語，係指用本發明之CNP變異體（或包含其之組合物或調配物）治療後疾病之症狀或生理學後果相較於用本發明之CNP變異體（或包含其之組合物或調配物）治療之前的疾病之相同症狀或生理學後果（即相較於「基線」）的狀態。如上文所描述，「基線」狀態可經由治療之前的個體狀態之量測（其可隨後與治療後之同一個體的狀態相比），或經由罹患共用相同或類似特徵（例如年齡、性別及/或疾病病況或進展）之相同病痛之個體群體的狀態之量測確定。

亦提供一種克服由組成性活性突變型纖維母細胞生長因子受體3（FGFR-3）誘導之細胞生長遏制之方法，其包含使表現組成性活性FGFR-3之細胞與如本文所描述之CNP變異體或組合物接觸。

在又另一實施例中，本發明提供CNP變異體，其在活體外或活體內刺激產生在相同wtCNP22濃度（例如1 μM）下產生之cGMP水平的至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。在再另一實施例中，本發明之CNP變異體在活體外或活體內刺激產生在相同wtCNP22濃度（例如，1 μM）下產生之cGMP水平的至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%。

本發明亦考慮如本文所述之CNP治療的調節將個體生長增強或增加相對於基線變化25%至50%的範圍。在一個實施例中，生長速度之提高或增加為以個體中相對於基線改變至少約25%，更佳至少約40%的年生長速度增加。

經考慮本文所述之CNP變異體中之任一者，包括其結合物、鹽或前藥可用於方法。

在各種實施例中，CNP變異體為PGQEHPNARKYKGAN KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 1）。在各種實施例中，肽進一步包含乙醯基。在各種實施例中，乙醯基位於肽之N端上。在各種實施例中，肽於C端進一步包含OH或NH ₂基團。在各種實施例中，變異體包含一或多個如本文所描述之連接子基團。在各種實施例中，連接子為可水解連接子，例如如本文所描述。

在各種實施例中，CNP變異體係選自由以下組成之群：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 47）；PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 46）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 48）；PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 49）QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N)；SEQ ID NO: 41]；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP-37；SEQ ID NO: 43）；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSM SGLGC（Pro-CNP-37；SEQ ID NO: 42）；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGL KLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37(M32N)；SEQ ID NO: 44]； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-Gly-CNP-37；SEQ ID NO: 45）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37: SEQ ID NO: 2）GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 50）；GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 51）；GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 52）；GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 53）；及LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 21），其中CNP變異體包含結合部分。在各種實施例中，結合部分為合成聚合基團。

在各種實施例中，變異體包含經由可水解連接子與變異體偶合之合成聚合基團。在各種實施例中，合成聚合基團包含親水性聚合物部分。在各種實施例中，親水性聚合物部分包含聚乙二醇（PEG）。在各種實施例中，親水性聚合物部分包含具有6至20個原子鏈長之聚乙二醇（PEG）。在各種實施例中，結合部分包含連接於如本文所描述之親水性間隔子之一或多個酸部分。

在各種實施例中，結合部分包含一或多個與親水性間隔子連接之酸部分。在各種實施例中，親水性間隔子為任何胺基酸。在各種實施例中，親水性間隔子為γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，親水性間隔子為OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）。在各種實施例中，親水性間隔子為γ麩胺酸（γGlu）或OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）。在各種實施例中，親水性間隔子為與一或兩個或更多個OEG（8-胺基-3,6-二氧雜辛酸）連接之γ麩胺酸（γGlu）。在各種實施例中，酸部分為脂肪酸。例示性脂肪酸包括短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸或二羧基脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為飽和或不飽和的。考慮C-6至C-20脂肪酸，包括但不限於C-6、C-8、C-10、C-12、C-14、C-16、C-18或C-20飽和或不飽和脂肪酸。在各種實施例中，脂肪酸為癸酸、十二酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十酸或其二酸。

在各種實施例中，變異體包含一或多個連接子基團。在各種實施例中，連接子位於CNP環狀域之殘基上或位於除該CNP環狀域之外的位點處。在各種實施例中，連接子位於離胺酸殘基上。

藉由各種參數來量測治療功效。在各種實施例中，功效評估為自基線期至干預期按年計算之生長速度的變化。功效亦將評估為如使用CDC生長曲線所量測之自基線至治療結束之身高SDS變化，且生長速度SDS將基於兒童期研究中之骨礦物質密度（Kelly等人,《臨床內分泌與代謝雜誌》2014;99（6）:2104-2112）。

功效亦可使用顱骨及腦形態之分析，例如使用磁共振成像（MRI）來量測。在出生時，軟骨發育不全之兒童由於有缺陷的軟骨內成骨而具有顱骨底及枕骨大孔邊界之異常，導致枕骨大孔狹窄且擠壓穿過其之關鍵神經及血管結構。枕骨大孔狹窄已表明為5歲以下軟骨發育不全兒童中觀測到之猝死風險提高的主要潛在原因（Pauli等人，《兒科雜誌（J Pediatr）》 1984;104:342-8; Hashmi等人，《美國醫學遺傳學雜誌部分A（Am J Med Genet A）》2018;176:2359-64）。顱骨及腦形態分析包括量測用CNP變異體治療之患者，例如小於6月齡的較年輕患者之面部體積、鼻竇體積及枕骨大孔面積的改善。

本文提供一種增加患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之6月齡或更小之個體之面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積之方法，其包含以至少30 μg/kg之劑量投與CNP變異體、其結合物、鹽或前藥。亦提供一種減少患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之6月齡或更小之個體之嬰兒猝死、睡眠呼吸障礙的發生率及枕骨大孔神經外科減壓術的必要性的方法，其包含以至少30 μg/kg之劑量投與CNP變異體、其結合物、鹽或前藥。在各種實施例中，該CNP變異體係以30 μg/kg之劑量投與持續3個月、6個月、1年或更長時間。在各種實施例中，當該個體為約2歲時，CNP變異體之劑量減少至15 μg/kg。

面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積之變化藉由磁共振成像（MRI）量測，且可與基線水平、健康對照個體或未經治療之對照個體相比較。

按指導評估QoLISSY，亦即身材矮小青年之生活品質（身材矮小青年之生活品質-QoLISSY調查表使用者手冊（ Quality of Life in Short Stature Youth - The QoLISSY Questionnaire User ' s Manual.） Lengerich: Pabst Science Publishers; 2013）。 生物標記物

生物標記物係指水平與特定疾病病狀或治療方案相關地增加或減少之可偵測生物物質或部分。在本發明中，生物標記物可在投與如本文所述之CNP變異體之前、期間及/或之後量測。例示性骨相關或軟骨相關的生物標記物包括但不限於NTproCNP、膠原蛋白X之N端片段（CXM）、CNP、cGMP、II型膠原蛋白及其片段之前肽、II型膠原蛋白及其片段、I型膠原蛋白及其片段之前肽、I型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原（PCNA）、聚集蛋白多醣硫酸軟骨素、膠原蛋白X及鹼性磷酸酶。可量測任何適當生物樣品中之軟骨相關及骨相關的生物標記物，包括但不限於組織、血液、血清、血漿、腦脊髓液、滑液及尿液。在一些實施例中，在來自進行活體內功效/藥效學研究之動物及/或來自離體研究之經調節之培養基的血液、血漿或血清中量測生物標記物。

NTproCNP為CNP之胺基端前肽（NTproCNP），其以與CNP的等莫耳比自細胞釋放。CNP之生物學活性形式因肽之快速清除速率，以低濃度見於血漿中。NTproCNP並非經由相同機制清除且發現於循環中之濃度高20倍至50倍（Olney等人，《臨床內分泌學（牛津）（Clin Endocrinol (Oxf)）》2012, 77:416-422）。

經考慮如本文所述之CNP療法對骨生長之作用的評估係相對於NTproCNP水平量測。舉例而言，在樣品中量測NTproCNP水平且更改或改變CNP之劑量以使NTproCNP水平達到群體之平均NTproCNP之+/- 2 SDS內。已在以下公開案中研究不同群體之NTproCNP平均水平，本文中以引用之方式併入：Olney等人（2015）. 《軟骨發育不全、軟骨生成減退及致死性發育不良之個體中C型利尿鈉肽血漿水平升高（C-type natriuretic peptide plasma levels are elevated in subjects with achondroplasia, hypochondroplasia, and thanatophoric dysplasia）》. 《臨床內分泌代謝雜誌》, 100（2）, E355-359; Prickett等人，（2013）. 《成年群體中年齡、表型及心腎功能對血漿C型及B型利尿鈉肽形式之影響（Impact of age, phenotype and cardio-renal function on plasma C-type and B-type natriuretic peptide forms in an adult population）》. 《臨床內分泌學（牛津）》, 78（5）, 783-789; Espiner等人（2018）. 《血漿C型利尿鈉肽：骨骼生長之病症中之新興應用（Plasma C-Type Natriuretic Peptide: Emerging Applications in Disorders of Skeletal Growth）》. 《兒科激素研究》, 90（6）, 345-357; Olney等人（2012）. 《C型利尿鈉肽之胺基端前肽（NTproCNP）預測健康兒童之身高速度（Amino-terminal propeptide of C-type natriuretic peptide (NTproCNP) predicts height velocity in healthy children）》. 《臨床內分泌學（牛津）》, 77（3）, 416-422; Olney等人，（2007）. 《C型利尿鈉肽之胺基端前肽及兒童線性生長：青春期、睪固酮及生長激素之作用（Amino-terminal propeptide of C-type natriuretic peptide and linear growth in children: effects of puberty, testosterone, and growth hormone）》. 《臨床內分泌代謝雜誌》, 92（11）, 4294-4298；及Olney等人（2016）.  《C型利尿鈉肽及其胺基端前肽（NTproCNP）對身材矮小之兒童中之生長激素治療之動態反應（Dynamic response of C-type natriuretic peptide and its aminoterminal propeptide (NTproCNP) to growth hormone treatment in children with short stature）》. 《臨床內分泌學（牛津）》, 85（4）, 561-568。

舉例而言，Olney 2016展示6歲至10歲之間的特發性身材矮小兒童可具有-0.6的平均基線NTproSDS，範圍為-1.0至0.7。Olney 2012報導在生長階段期間健康兒童/青少年中之NTproCNP水平。NTproCNP SDS可基於不同年齡群體之平均NTproCNP水平而計算，且因此亦可計算自此平均值之+/- 2 SDS。軟骨發育不全或軟骨生成減退個體之NTproCNP水平描述於Olney 2015，展示大約3至8歲兒童具有1.4的NTproSDS平均值，範圍為0.4至1.8，而軟骨生成減退個體（年齡6.6至11）具有1.9的平均NTproCNP SDS，範圍為1.8至2.3。本文及以上公開案中描述用於測定NTproSDS水平之方法。

X型膠原蛋白生物標記物（CXM）為X型膠原蛋白之降解片段，其包含X型膠原蛋白之完整三聚非膠原蛋白1（NC1）域。CXM由活動性生長板釋放且樣品中隨個體年齡增加而減少。CXM水平與兒童中之生長速度相關（Coghlan等人，《科學轉化醫學（Sci Transl Med）》 2017, 9（419）:eaan4669）。

骨特異性鹼性磷酸酶（BSAP或BAP）係藉由生長板及礦化骨中之成骨細胞及破骨細胞產生之骨生長生物標記物。BSAP之變化可反映生長板活動、骨生長及/或骨再成型活動。

I型原膠原蛋白之N端前肽（PINP）為在生產I型膠原蛋白期間釋放之潛在藥效學骨生長生物標記物。PINP之變化可反映生長板活動、骨生長及/或骨再成型之變化。

II型膠原蛋白之交聯C端肽（CTXII）為在II型膠原蛋白之降解期間釋放的潛在藥效學骨生長生物標記物。CTXII之變化可反映生長板活動、骨生長、骨再成型及/或關節軟骨再成型之變化。 調配

本發明提供醫藥組合物，包括修飾釋放組合物，其包含本文所描述之CNP變異體，及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑及/或稀釋劑。在某些實施例中，組合物進一步包含一或多種其他生物活性劑（例如蛋白酶、受體酪胺酸激酶及/或清除受體NPR-C之抑制劑）。

本發明提供包含如本文所描述之結合部分之修飾釋放組合物。修飾釋放組合物包括在投藥後延遲遞送藥物（延遲釋放劑量）或持續延長時段遞送藥物（延長釋放劑量）之彼等組合物。本文所提供之CNP肽結合物之各種實施例包括修飾釋放組合物，諸如延長釋放、持續或受控釋放，及延遲釋放。術語「延長釋放組合物」係指以便於製備在投與後之延長時段內可用的活性成分/藥物之方式調配之組合物（美國藥典（US Pharmacopeia））。延長釋放劑量包括持續釋放（SR）或受控釋放（CR）形式。持續釋放經持續時段維持藥物釋放，但未必以恆定速率釋放，而CR經持續時段以幾乎恆定速率維持藥物釋放（《製藥學：藥物遞送及靶向（Pharmaceutics: Drug Delivery and Targeting）》, Yvonne Perrie, Thomas Rades, 醫藥出版社（Pharmaceutical Press）, 2009）。延遲釋放組合物或產物經修飾以在初次投與之後的一定時段內延遲藥物物質之釋放。

在各種實施例中，修飾釋放組合物為延長釋放組合物。在各種實施例中，修飾釋放組合物為持續釋放組合物。在各種實施例中，持續或延長釋放組合物包含CNP前藥。

在各種實施例中，組合物包含賦形劑、稀釋劑或載劑。在各種實施例中，延長釋放組合物包含賦形劑、稀釋劑或載劑。在各種實施例中，賦形劑、稀釋劑或載劑為醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

賦形劑、載劑及稀釋劑之非限制性實例包括媒劑、液體、緩衝劑、等張劑、添加劑、穩定劑、防腐劑、增溶劑、界面活性劑、乳化劑、潤濕劑、佐劑等。組合物可含有液體（例如水、乙醇）；多種緩衝液內容物（例如Tris-HCl、磷酸鹽、乙酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液）之稀釋劑、pH及離子強度；清潔劑及增溶劑（例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80）；抗氧化劑（例如甲硫胺酸、抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉）；防腐劑（例如硫柳汞（Thimerosol）、苯甲醇、間甲酚）；以及膨化物質（例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖）。在醫藥組合物之調配中使用之賦形劑、稀釋劑及載劑為此項技術中已知；參見例如《雷明頓氏醫藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》, 第18版, 第1435-1712頁, 馬克出版公司（Mack Publishing Co.） （賓夕法尼亞州伊斯頓（Easton, Pennsylvania）（1990）），其以全文引用之方式併入本文中。

舉例而言，載劑包括但不限於稀釋劑、媒劑及佐劑，以及植入物載劑，及惰性、無毒固體或液體填充劑及囊封材料，其不與一或多種活性成分反應。載劑之非限制性實例包括磷酸鹽緩衝鹽水、生理鹽水、水以及乳液（例如油/水乳液）。載劑可為含有例如乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物）、植物油及其混合物之溶劑或分散介質。

在一些實施例中，組合物為液體調配物。在某些實施例中，調配物包含濃度在約0.1 mg/ml至約20 mg/ml、或約0.5 mg/ml至約20 mg/ml、或約1 mg/ml至約20 mg/ml、或約0.1 mg/ml至約10 mg/ml、或約0.5 mg/ml至約10 mg/ml、或約0.5至5 mg/ml、或約0.5至3 mg/ml、或約1 mg/ml至約10 mg/ml範圍內之CNP變異體。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為0.8 mg/ml至2 mg/ml。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為0.8 mg/ml。在各種實施例中，CNP變異體之濃度為2.0 mg/ml。在各種實施例中，CNP變異體係由凍乾粉復原。

在其他實施例中，組合物包含緩衝溶液或緩衝劑以將含有CNP之溶液或懸浮液之pH維持在所要範圍內。緩衝溶液之非限制性實例包括磷酸鹽緩衝鹽水、Tris緩衝鹽水以及漢克氏緩衝鹽水（Hank's buffered saline）。緩衝劑包括但不限於乙酸鈉、磷酸鈉及檸檬酸鈉。亦可使用緩衝劑之混合物。在某些實施例中，緩衝劑為乙酸/乙酸鹽或檸檬酸/檸檬酸鹽。組合物中適合的緩衝劑之量部分取決於所使用之特定緩衝劑以及溶液或懸浮液之所要pH。在一些實施例中，緩衝劑之濃度為約10 mM±5 mM。在某些實施例中，組合物之pH為約pH 3至約pH 9、或約pH 3至約pH 7.5、或約pH 3.5至約pH 7、或約pH 3.5至約pH 6.5、或約pH 4至約pH 6、或約pH 4至約pH 5，或為約pH 5.0±1.0。在各種實施例中，pH為約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在各種實施例中，pH為5.5。

在其他實施例中，組合物含有等張調節劑以使溶液或懸浮液等張且與投與更相容。等張劑之非限制性實例包括NaCl、右旋糖、葡萄糖、甘油、山梨糖醇、木糖醇及乙醇。在某些實施例中，等張劑為NaCl。在某些實施例中，NaCl之濃度為約160±20 mM、或約140 mM±20 mM、或約120±20 mM、或約100 mM±20 mM、或約80 mM±20 mM、或約60 mM±20 mM。

在又其他實施例中，組合物包含防腐劑。防腐劑包括但不限於間甲酚及苯甲醇。在某些實施例中，防腐劑濃度為約0.4% ± 0.2%，或約1% ± 0.5%，或約1.5% ± 0.5%，或約2.0% ± 0.5%。

在再其他實施例中，組合物含有抗吸附劑（例如，用以減少CNP變異體吸附至玻璃或塑膠）。抗吸附劑包括但不限於苯甲醇、聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。在某些實施例中，抗吸附劑濃度為約0.001%至約0.5%，或約0.01%至約0.5%，或約0.1%至約1%，或約0.5%至約1%，或約0.5%至約1.5%，或約0.5%至約2%，或約1%至約2%。

在其他實施例中，組合物包含穩定劑。穩定劑之非限制性實例包括甘油、丙三醇、硫甘油、甲硫胺酸以及抗壞血酸及其鹽。在一些實施例中，當穩定劑為硫甘油或抗壞血酸或其鹽時，穩定劑濃度為約0.1%至約1%。在其他實施例中，當穩定劑為甲硫胺酸時，穩定劑之濃度為約0.01%至約0.5%、或約0.01%至約0.2%。在再其他實施例中，當穩定劑為甘油時，穩定劑之濃度為約5%至約100%（純）。

在其他實施例中，組合物含有抗氧化劑。例示性抗氧化劑包括但不限於甲硫胺酸及抗壞血酸。在某些實施例中，抗氧化劑相對於CNP之莫耳比為約0.1:1至約15:1，或約1:1至約15:1，或約0.5:1至約10:1，或約1:1至約10:1或約3:1至約10:1。

醫藥學上可接受之鹽可用於組合物中，包括但不限於無機酸鹽（例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽）、有機酸鹽（例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽）及胺（例如異丙胺、三甲胺、二環己胺、二乙醇胺）鹽。醫藥學上可接受之鹽之充分論述見於《雷明頓氏醫藥科學》, 第18版, 馬克出版公司,（賓夕法尼亞州伊斯頓（1990））中。

醫藥組合物可以各種形式投與，諸如錠劑、膠囊、顆粒、散劑、溶液、懸浮液、乳液、軟膏及經皮貼片。組合物之劑型可調適為組合物之所要投與模式。對於經口投與，組合物可採取例如錠劑或膠囊（包括軟凝膠膠囊）之形式，或可為例如水性或非水性溶液、懸浮液或糖漿。用於經口投與之錠劑及膠囊可包括一或多種常用賦形劑、稀釋劑及載劑，諸如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、澱粉、玉米澱粉、糖精鈉、滑石、纖維素、碳酸鎂及潤滑劑（例如硬脂酸鎂、硬脂醯反丁烯二酸鈉）。必要時，可將調味劑、著色劑及/或甜味劑添加至固體及液體調配物。用於口服調配物之其他視情況存在之成分包括但不限於防腐劑、懸浮劑及增稠劑。口服調配物亦可具有腸溶衣以保護CNP變異體免受胃之酸性環境侵害。製備固體及液體劑型之方法為熟習此項技術者已知或對於熟習此項技術者而言將顯而易見（參見例如上文提及之《雷明頓氏醫藥科學》）。

用於非經腸投與之調配物可製備為例如液體溶液或懸浮液形式、適於在注射之前溶解或懸浮於液體介質中之固體形式或乳液形式。舉例而言，無菌可注射溶液及懸浮液可根據此項技術中已知的技術使用適合稀釋劑、載劑、溶劑（例如緩衝水性溶液、林格氏溶液（Ringer's solution）、等張氯化鈉溶液）、分散劑、潤濕劑、乳化劑、懸浮劑及其類似物調配。另外，可使用無菌不揮發性油、脂肪酯、多元醇及/或其他非活性成分。作為進一步實例，用於非經腸投與之調配物包括可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性無菌注射溶液；以及可含有懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。

例示性CNP調配物描述於美國專利9,907,834及10,646,550中。考慮使用pH在約4至約6範圍內的CNP調配物。

包含CNP變異體之組合物亦可為凍乾調配物。在某些實施例中，凍乾調配物包含緩衝劑及膨化劑，以及視情況存在之抗氧化劑。例示性緩衝液包括但不限於乙酸鹽緩衝液及檸檬酸鹽緩衝液。例示性膨化劑包括但不限於甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、海藻糖及聚維酮（PVP K24）。在某些實施例中，甘露糖醇之量為約3%至約10%，或約4%至約8%，或約4%至約6%。在某些實施例中，蔗糖之量為約6%至約20%，或約6%至約15%，或約8%至約12%。例示性抗氧化劑包括但不限於甲硫胺酸及抗壞血酸。

在各種實施例中，調配物包含檸檬酸、檸檬酸鈉、海藻糖、甘露糖醇、甲硫胺酸、聚山梨醇酯80及視情況存在之注射用無菌水（WFI）。

本發明亦提供套組，其含有例如瓶子、小瓶、安瓿、試管、套筒及/或注射器，其包含液體（例如無菌可注射）調配物或固體（例如凍乾）調配物。套組亦可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑、溶液及/或緩衝液），其用於將固體（例如凍乾）調配物復原為溶液或懸浮液以用於投與（例如藉由注射），包括但不限於復原注射器中的凍乾調配物以用於注射或將濃縮物稀釋至較低濃度。此外，即用型注射溶液及懸浮液可自例如包含含有CNP之組合物的無菌粉末、顆粒或錠劑製備。套組亦可包括散佈裝置（諸如噴霧或注射散佈裝置）、筆式噴射器、自噴射器、無針噴射器、注射器及/或針。

作為非限制性實例，套組可包括具有單腔室或雙腔室之注射器。對於單腔室注射器，該單腔室可含有準備好進行注射之液體CNP調配物，或固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可復原為注射用溶液或懸浮液。對於雙腔室注射器，一個腔室可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑系統、溶液或緩衝液），且另一腔室可含有固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可使用來自第一腔室之媒劑或載劑復原為注射用溶液或懸浮液。

作為另一實例，套組可包括一或多個筆式噴射器或自動噴射器裝置，及雙腔室藥筒。藥筒之一個腔室可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑（例如溶劑系統、溶液或緩衝液），且另一腔室可含有固體（例如凍乾）CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合之溶劑系統（例如甘油）中之液體調配物，其可使用來自第一腔室之媒劑或載劑復原為注射用溶液或懸浮液。藥筒可包含足以在所要時段（例如1天、2天、3天、1週、2週、3週、4週等）內給藥之量的CNP變異體。筆式噴射器或自動噴射器可經調節以投與所要量的來自藥筒之CNP調配物。

另外，包含CNP變異體之醫藥組合物可調配為緩慢釋放、控制釋放或持續釋放系統，用於在所要時段（諸如1週、2週、3週、1個月、2個月或3個月）內維持相對恆定的劑量水平。緩慢釋放、控制釋放及持續釋放調配物可使用例如生物可降解聚合系統{其可包含例如親水性聚合物[例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)]}製備，且可呈例如微粒、微球體或脂質體之形式，如此項技術中已知。 投與及給藥

如本文所用，活性劑（例如CNP變異體）的術語「治療有效量」係指向患者提供治療益處的量。量可能因人而異，並且可能取決於許多因素，包括患者的整體身體狀況。CNP變異體之治療有效量可以容易地由熟習此項技術者使用公開可用的材料及程序確定。舉例而言，用於療法之CNP變異體的量應提供可接受速率的軟骨退化逆轉或軟骨生長增加。

特定個體的給藥頻率可能因各種因素而異，包括所治療的病症以及個體的狀況和對療法反應。在某些實施例中，約每天一次、每兩天一次、每三天一次或每週一次、每週兩次、每週三次、每兩週一次或每月一次向個體投與含有CNP變異體之醫藥組合物。

本文所述之CNP變異體組合物可以治療有效劑量投與有需要之患者以治療、改善或預防骨相關病症及身材矮小病症（例如骨骼發育不良，包括軟骨發育不全、軟骨生成減退等）。考慮用於本文中之CNP變異體可以治療有效劑量向患者投與以治療、改善或預防骨關節炎及其他具有骨關節炎相關症狀的病狀。CNP變異體之安全性及治療功效可藉由細胞培養物或實驗動物中之標準藥理學程序測定，諸如藉由測定LD ₅₀（對於50%之群體致死性的劑量）及ED ₅₀（在50%之群體中治療有效的劑量）。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數且其可表示為比率LD ₅₀/ED ₅₀。展現較大治療指數之活性劑通常係較佳的。

在某些實施例中，本文所描述之CNP變異體組合物以在約3、4、5、6、7、8、9或10 nmol/kg至約300 nmol/kg，或約20 nmol/kg至約200 nmol/kg範圍內之劑量投與。在一些實施例中，CNP組合物以以下劑量投與：約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000 nmol/kg或治療醫師認為適當的其他劑量。在其他實施例中，CNP變異體組合物以如下劑量投與：約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 μg/kg、或約0.5、0.8、1.0、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10 mg/kg或治療醫師認為適當的其他劑量。本文所述之CNP或CNP變異體的劑量可根據本文所述之給藥頻率/投與頻率投與，包括但不限於每日一次、每週2次或3次、每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次等。在各種實施例中，CNP或CNP變異體係每日皮下投與。在各種實施例中，CNP或CNP變異體係每週皮下投與。在各種實施例中，CNP變異體係以2.5 μg/kg/天至60 μg/kg/天、10 μg/kg/天至45 μg/kg/天或15 μg/kg/天至30 μg/kg/day之劑量投與。在各種實施例中，CNP變異體係以15 μg/kg/天之劑量投與。在各種實施例中，CNP變異體係以30 μg/kg/天之劑量投與。

針對特定個體之CNP變異體之給藥/投與頻率可視多種因素而變化，包括所治療病症及病狀及個體對療法之反應。CNP變異體可以每次給藥單次劑量或多次劑量投與。在某些實施例中，如下地投與CNP變異體組合物：以單次劑量或多次劑量，每日一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每4週一次、每6週一次、每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次，或以由治療醫師認為適當的頻率。在各種實施例中，持續3個月、6個月、12個月或更久投與CNP變異體。

在一些實施例中，投與CNP變異體組合物以允許生長期（例如軟骨生成），繼之以恢復期（例如成骨）。舉例而言，CNP組合物可皮下或藉由另一模式每日或每週多次地投與一段時間，接著為無治療期，隨後重複該週期。在一些實施例中，初始治療期（例如每日投與或每週多次投與CNP變異體組合物）持續3天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週。在一相關實施例中，無治療期持續3天、1週、2週、3週或4週。在某些實施例中，CNP變異體組合物之給藥方案為每日一次持續3日，接著停藥3日；或每日一次或每週多次持續1週，接著停藥3天或1週；或每日一次或每週多次持續2週，接著停藥1或2週；或每日一次或每週多次持續3週，接著停藥1、2或3週；或每日一次或每週多次持續4、5、6、7、8、9、10、11或12週，接著停藥1、2、3或4週。

CNP變異體或包含其之醫藥組合物可以多種方式投與個體，諸如藉由皮下注射、關節內、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或鞘內注射。在一個實施例中，CNP變異體藉由單次皮下、關節內、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或鞘內注射投與。

CNP變異體可藉由在目標作用部位（例如異常或退化之關節或軟骨區域）植入儲槽來投與。或者，CNP變異體可在舌頭下舌下投與（例如舌下錠劑）或藉由吸入至肺部（例如吸入劑或氣霧劑噴霧）、藉由遞送至鼻腔（例如鼻內噴霧）、藉由遞送至眼睛（例如滴眼劑）或藉由經皮遞送（例如藉助於皮膚上之貼劑）。CNP變異體還可以微球體、微膠囊、脂質體（不帶電或帶電（例如陽離子））、聚合微粒（例如聚醯胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)）、微乳液及其類似形式經口投與。

另一投與方法為藉由滲透泵（例如Alzet泵）或微泵（例如Alzet微滲透泵），其允許經預定時段控制、連續及/或緩慢釋放遞送CNP變異體或醫藥組合物。滲透泵或微型泵可植入皮下或目標部位附近（例如，四肢的長骨、骨骺等）。

熟習此項技術者顯而易知，CNP變異體或其組合物亦可藉由其他模式投與。CNP變異體或其組合物之最有效投與模式的確定在熟習此項技術者之技能範圍內。

CNP變異體可以適於例如經口（包括經頰及舌下）、經直腸、經鼻、局部、經肺、經陰道或非經腸（包括肌肉內、動脈內、鞘內、皮下、關節內及靜脈內）投與或以適於藉由吸入或吹入投與之醫藥調配物形式投與。視預期投與模式而定，醫藥調配物可呈固體、半固體或液體劑型形式，諸如錠劑、栓劑、丸劑、膠囊、散劑、液體、懸浮液、乳液、乳膏、軟膏、乳劑及其類似物。調配物可以適用於單次投與精確劑量之單位劑型提供。調配物包含有效量之CNP變異體，以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑及/或稀釋劑，以及視情況存在之一或多種其他生物學活性劑。

本發明之額外態樣及細節將自以下實例顯而易知，該等實例旨在說明性而非限制性的。 實例 實例1-NTproCNP之量測

研究1）每日給藥伏索利肽-取決於劑量及持續時間-是否在增加生長速度之階段期間抑制內源性CNP分泌（間接反饋），及2）內源性CNP是否不受先前4小時投與之伏索利肽影響（直接反饋）。

簡言之，在此劑量探索及擴展研究中，35名兒童（5至14歲）在九個研究地點之四個連續群組中登記。參見例如Savarirayan等人《新英格蘭醫學雜誌（N Engl J Med）》 2019, 381:25-35。因為此等個體中僅28名（年齡範圍為5至11歲，12個男性，16個女性）具有血漿NTproCNP之量測結果，所以此處呈現之全部資料僅適用於此子組。在基線篩選之後，四個獨立群組（按性別平衡，但按劑量及劑量遞增的時間區分）接受伏索利肽之每日皮下注射，持續時間長達5.5年。群組1（6名個體，在篩選時年齡範圍為6至10歲）接受2.5 μg/kg/d持續至多10個月，隨後7.5 μg/kg/d持續大約2個月，且其後15 μg/kg/d直至研究完成。群組2（6名個體，年齡範圍5至10歲）在初始6至8個月接受7.5 μg/kg/d，此後遞增至15 μg/kg/d。在整個研究中，群組3（8名個體，年齡範圍6至11歲）及群組4（8名個體，年齡範圍5至8歲）分別接受15 μg/kg/d及30 μg/kg/d。在NTproCNP取樣完成時，群組1之相應年齡（平均值）為13.2歲，群組2為13.7歲，群組3為13.6歲且群組4為11.4歲。除了群組2中之三名個體、群組3中之一名個體及群組4中之兩名個體以外，2年治療之後在全部個體中觀測到青春期發育之跡象。

為了評估與年生長速度（AGV）及或青春期期間之變化的可能相關性，在整個研究中進行連續（注射前）取樣。在篩選（基線）時，隨後在5年時段期間之12個不同時間點收集EDTA抗凝血漿。預期內源性CNP與生長加速之初始階段之間的聯繫（Olney等人，《臨床內分泌學（牛津）》 2016, 85:561-568），在療法之初始2個月期間在所有群組中取樣更頻繁。群組1，群組2中之三名個體第85天亦進行量測，但其他群組不進行，因此不包括於AGV之連續變化之分析中。一年之後取樣頻率降低（在1年、在2年及隨後每半年一次，直至在5.5年最終取樣）。

為了檢查伏索利肽對血漿NTproCNP之可能急劇作用，在研究之前兩年中，九個個別時刻在所有個體中注射之後4小時抽取樣品。在群組1及2名個體中，在第一次注射之後4小時與8小時抽取樣品。在常規早晨注射後4小時抽取所有其他樣品。

所有血漿NTproCNP量測由Christchurch實驗室分析使用其先前確定之正常兒童年齡及性別調整正常範圍（標準差評分，SDS）一式兩份地進行（Olney等人，《臨床內分泌學（牛津）》2012, 77: 416-422）。NTproCNP分析中不存在可偵測的CNP（1-37pro gly）交叉反應性。此分析之偵測極限為1.5 pmol/l，且在18 pmol/l下分別在6及7%分析變異係數內及之間。在6名健康青少年（未公開）值之先前研究中未展示在0900h及1500hr期間食物攝入之日波動或作用的跡象（平均變異係數6.4%），且在短時間間隔下連續日的抽出樣品中無顯著變化。因為年齡及性別均影響正常兒童中NTproCNP之血漿濃度（Prickett等人《兒科研究（Pediatr Res）》 2005 58:334-340），使用來自先前由2個月至20歲之258名正常健康兒童確定之參考範圍的資料（Olney等人，《臨床內分泌學（牛津）》2012; 77:416-422），將所有量測濃度之NTproCNP轉化為SDS。由於血漿NTproCNP之SDS不可用於未經治療之Ach，認為上述方法為用於自不同年齡及性別兒童抽取之此等樣品的最佳比較方法，因為未經治療之Ach中身高速度之速率及青春期時機似乎並非不同於正常非Ach兒童（Merker等人《美國醫學遺傳學雜誌部分A》2018; 176:1723-1734）。

軟骨發育不全個體中基線 NTproCNP 相對於一般群體升高。如AGV SDS所示，當相比於此年齡組之一般群體兒童時（Kelly等人《臨床內分泌代謝雜誌》2014, 99:2104-2112），篩選時血漿NTproCNP之基線值升高（平均SDS 0.66±0.17，P＜0.001），儘管AGV顯著較低（平均3.9±0.3 cm/y）。四個群組在篩選時與年齡、血漿NTproCNP、AGV及AGV SDS相關之相關基線資料以及在療法6個月之後的AGV增加一起展示於表1中。NTproCNP SDS在群組1中較低，且群組4中的年齡較低。如在6個月時評估，接受較高劑量之伏索利肽（分別為15及30 μg/kg/天）之群組3及4展現AGV的顯著及類似增加（兩者P＜0.05）。 表 1.在篩選時的年齡、血漿NTproCNP、SDS、年生長速度（AGV）及AGV-SDS，及在開始療法之後6個月的增加（△）.

	年齡（歲）	NTproCNP （pmol/L）	NTproCNP SDS	AGV （cm/y）	AGV SDS	在6個月時的△AGV（cm/y）
群組1 群組2 群組3 群組4	8.0 ± 0.6 8.4 ± 1.0 8.6 ± 0.6 7.4 ± 0.3	36.2 ± 2.3 45.4 ± 4.0 43.5 ± 3.2 43.6 ± 2.9	0.1 ± 0.3 1.1 ± 0.4 1.0 ± 0.3 0.9 ± 0.3	3.6 ± 0.5 3.2 ± 0.2 4.0 ± 0.9 4.2 ± 0.7	-2.5 ±0.4 -2.6 ± 0.6 -1.5 ± 0.8 -2.1 ± 0.7	0.0 ± 0.6 0.5 ± 0.4 2.1 ± 0.8 2.5 ± 0.9

生長速度急劇變化與 NTproCNP 之抑制有關。關於伏索利肽之生長促進作用，各群組NTproCNP及SDS之動態變化展示於圖1中。每群組按個體之變化展示於圖2中。在初始3個月內群組3及4之AGV之尖銳拐點與NTproCNP SDS在一個月的顯著下降相關（分別為P=0.04及0.004，群組3及4）。此兩組治療之第一年中之較晚時間點，在AGV穩定化時，平均NTproCNP SDS更加可變，但傾向於低於基線（圖1）。群組1及2中一年之後劑量遞增至15 μg/kg/天時，AGV增加與NTproCNP之下降相關（圖1），但劑量遞增過程早期缺乏頻繁取樣使得沒有更詳細的時間變化分析。

NTproCNP 之異常增加。圖1之檢測展示除群組4中之外，與不變NTproCNP相關的第2年至第4年的相對不變AGV。在群組2及3（均接受15 μg/kg劑量）中，平均NTproCNP SDS在所有時間點比篩選時低。在群組1及4中，觀測到若干異常及無法解釋的升高，全部與AGV之變化無關。八名兒童中之三者，在用30 μg/kg/d（群組4）治療3至4年之後觀測到血漿水平之顯著增加（圖2）。此等兒童SDS之增加（分別，前及峰值為3.1、6.7；1.4、3.0；及0.3、1.9）持續至少一年且不與BALP或PINP之變化始終相關聯（圖3）。在兩名個體中，記錄到坦納2期青春期發育，但在最高NTproCNP（138 pmol/L，SDS 6.7）的個體中無青春期發育，直至最後一次量測之後6個月記錄到乳房萌發。在其他個體中觀測到血漿NTproCNP中出現偶然尖峰，其中一些與青春期階段一致（圖2）。相比之下，在一個6.5歲女性兒童（群組1）中，在開始2.5 μg/kg劑量之後約6個月，血漿水平突然升高（圖2）。SDS（在篩選時0.16）在6個月時上升至2.6且剩餘4.5年保持升高，但在10.5歲時不受正常青春期進展影響。與BALP、PINP或AGV無明顯恆定聯繫。

外源性 CNP 作用下之持續生長與 NTproCNP 之持續抑制有關。為了評估實齡或療法持續時間對血漿NTproCNP的任何影響，在一年及研究完成時在SDS之間進行比較。因為群組1-3在一年之後均接受15 μg/kg/d劑量，將值合併。如表2中所示，在相對不變AGV時段期間，隨時間推移觀測到NTproCNP SDS顯著下降（F=14，p=0.002）（圖3）。 表 2.在1至5年療法之後15 μg/kg/天伏索利肽對平均NTproCNP SDS之作用（n=17）

研究年數	NTproCNP SDS
1.0 4.0 4.5 5.0	0.54 ± 0.28 0.32 ± 0.26 0.22 ± 0.29 -0.20 ± 0.21 *

* 與第1年顯著差異（P=0.015）

急性暴露於外源性 CNP 類似物抑制 NTproCNP 產生。僅在群組1及2中研究伏索利肽之第一次注射之影響。在群組1中，2.5 μg/kg/d之後，在注射之後4小時未觀測到NTproCNP變化，在治療之後續10個月進行的六個研究中之任一者中亦未觀測到。在群組2中，初始7.5 μg/k劑量產生顯著下降（前43.3±3.5，後35±2.7 pmol/L，P=0.013，n=8），在注射後8小時，恢復至注射前水平（44.3±4.7 pmol/L）。在此等相同個體中，在開始治療之後一個月觀測到顯著抑制（P=0.02），此時AGV未改變（表1）。所有個體中，來自成對樣品之結果在伏索利肽治療之最初24個月期間的至多八個不同時間點可獲得。因為反應不根據注射劑量而不同（F=0.8，P=0.5），所以合併任何既定時間點之結果以用於統計分析。 表 3.相對於療法持續時間的在伏索利肽之後4小時血漿NTproCNP（pmol/L）之變化（△）

天數	N*	前	後	△	P值
29 43 127 183 365 730	28 25 27 28 22 17	39.9 ± 1.5 40.6 ± 1.5 41.5 ± 2.0 42.4 ± 1.4 40.5 ± 2.2 39.6 ± 2.4	37.5 ± 1.4 40.1 ± 1.6 39.8 ± 1.8 37.3 ± 1.3 36.2 ± 2.2 35.5 ± 2.4	-2.4 ± 1.5 -0.5 ± 1.0 -1.7 ± 1.5 -5.0 ± 1.6 -4.3 ± 1.4 -4.2 ± 1.5	0.12 0.62 0.27 0.003 0.006 0.015

*個體數目

如表3中所示，分析分組資料時發現在療法之前6個月（亦即在第29天、第43天及第127天）內無4小時顯著變化。然而，在各後續時間點，在第183天（P=0.003，n=30）、12個月（P=0.006，n=22）及24個月（P=0.015，n=17）觀測到血漿NTproCNP顯著下降（參見表3）。不管4小時下降自身的顯著性，當檢查與在注射時同時NTproCNP SDS的聯繫時，在篩選（r= -0.71，P＜0.001）；在第29天（r= -0.45，P=0.012）；在第127天（r= -0.42，P=0.02）；在第183天（r= -0.59，P＜0.001，參見圖4）及在24個月（r= -0.36，P=0.10）時鑑別到血漿NTproCNP的下降（△）與注射前血漿NTproCNP SDS的相關性。更高測試前SDS與在4小時血漿NTproCNP之下降強烈相關。此等結果共同支持外源性CNP對CNP產生之直接抑制作用，其若骨骼生長加速，則在初始6個月時段期間未觀測到。

另外，資料表明NTproCNP SDS在基線處顯著增加。其次，在藉由生長促進劑量的伏索利肽之AGV初始加速期間血漿NTproCNP顯著降低提供反饋調節之跡象，其可能為間接的。第三，與臨注射前之血漿NTproCNP SDS成比例的注射伏索利肽之後4小時的血漿NTproCNP下降與直接反饋作用一致。在一些接受較高劑量之個體中，在青春期早期，NTproCNP顯著增加的此等及其他發現為需要進一步研究的重要的新觀測結果。

來自嚙齒動物幼畜、羔羊及兒童之研究支持在血漿中循環水平之CNP產物（CNP及NTproCNP）主要來源於生長板或緊密相關組織的觀點（Espiner 2018，見上文）。投與CNP 1-37 Pro Gly（其與CNP強烈交叉反應，但非NTproCNP分析）對內源性proCNP產生的任何可能影響的量測因此僅使用針對年齡及性別調節的血漿濃度的NTproCNP（SDS）才可行。如先前報導（Olney等人，《臨床內分泌代謝雜誌》100:E355-359,（2015），據證實，在治療之前，Ach健康兒童中之水平顯著增加，且保持如此直至研究之最終階段。值得注意的是，在2至3個月內急劇提高AGV之劑量（群組3及4中15及30 μg/kg/d）期間，NTproCNP SDS顯著下降，與血清膠原蛋白X標記物，即X型膠原蛋白之降解產物遞增之第一跡象一致。接受較低劑量（2.5及7.5 μg/kg/d）之個體中未觀測到此等變化，AGV此時不受影響。有指導性的係比較CNP之此等動態變化與起始日劑量的人類生長激素（HGH）之類似年齡的矮小非Ach兒童中所見者（Olney等人《臨床內分泌學（牛津）》85:561-568, 2016）。在該情況下，AGV之類似拐點與群組3及4之15-30 μg/kg/d伏索利肽治療期間，第29天NTproCNP之增加（平均11 pmol/L，第21天△22%）相比於NTproCNP之同時下降（大約6 pmol/L，範圍3至11 pmol/L，△ -12%）相關。由於CNP產物之生長板濃度藉由生長激素但非外源性CNP明顯增加，因此不同反應不令人驚訝。此等動力學反應可與所募集軟骨細胞穿越擴增生長板之各別區域且填入主要骨松質之估計時間（大約20至22天）相關（Sansone等人，《兒科骨科雜誌（J Pediatr Orthop）》 29:61-67, 2009）。然而，不同於在HGH治療第一年期間高於基線之NTproCNP的持久升高（Olney，2016，見上文），在伏索利肽療法期間濃度之初始顯著抑制較不持久，可能反映了相比於長得多的HGH活性持續時間（至多12小時）伏索利肽之短得多的半衰期（28分鐘）（Olney，2016，見上文）。

綜合而言，當前發現與間接反饋機制一致，其中加速生長板活動或骨樣組織產生之因子減少局部NPPC表現或proCNP至細胞外流體中的分泌，且與在10隻4週齡嚙齒動物幼畜中觀測到的來自外源性CNP之間接負反饋一致。然而，在該研究中，3天連續高劑量靜脈內輸注CNP 53，儘管顯著減少腰椎nppc表現，但不減少雄性大鼠中的血漿NTproCNP（n=6）且與雌性中的小幅下降相關（n=6）。在此短暫暴露於CNP 53中未報導骨骼生長板活動之指數，因此在此情況下軟骨內化骨生長加速與血漿NTproCNP減少之可能的聯繫仍需研究。可預期較大個體組及尤其在開始外源性CNP療法之初始3個月內更適當定時之取樣點之進一步研究可推進關於改變兒童中之骨生長的此等動態變化之理解，且可提供臨床應用。舉例而言，一個月之NTproCNP下降，或Ach中之靶向零NTproCNP SDS，可用於預測最佳作用大小、對生長板活動之作用持續時間及注射之劑量及頻率選擇。最佳作用大小係指基於群體標準之預期平均正常生長速率的度量。

意外地，在初始2年治療之不同時間進行的多個研究中，揭露急劇反饋之有力證據，但僅在外源性療法6個月之後。此時間約束條件可係關於許多所研究兒童中觀測到之早期生長突增。群組3及4中者在此時段展現注射後24小時抽取的減少AGV的血漿NTproCNP的初始尖銳拐點，此可能限制在4小時來自注射劑量的任何減少。任一組在一個月之前均未測試但在第29、43、127或183天（當AVG加速時）未發現來自15或30 μg劑量之抑制影響，但在稍後時間點明確觀測到。群組1或群組2中，前6個月中之AGV未顯著受影響。在前者中，初始劑量在第1天不足以影響生物活性（尿液cGMP）（Savarirayan等人，《新英格蘭醫學雜誌》 381:25-35 2019），或在2小時內持續增加血漿CNP 39（Yasoda，見上文2004），且不影響AGV。所進行之8個研究中之任一者中缺乏4小時抑制因此為出人意料的。另一方面，在第1天觀測到7.5 μg/kg/d（群組2）之後尿液cGMP及峰CNP 39顯著增加以及第4小時NTproCNP顯著抑制，亦在第29天在此群組中觀測到。令人遺憾地，在此等2個群組中之劑量遞增時段期間，取樣頻率不足以評估AGV加速對NTproCNP之任何影響，或在4小時此對反應之可能作用。雖然其他因素，諸如體重增加、青春期、劑量及生物可用性（群組3及4中大得多）（Savarirayan，見上文）及所研究之個體的較少數目需要被考慮，但共同地，研究結果表明間接與直接反饋系統之間的相互作用可導致前6個月4小時伏索利肽之影響降低。發現組合所有組來看，在第183天、第365天及第730天給藥後4小時NTproCNP極顯著下降（表3）。值得注意地，根據NTproCNP SDS評價所有研究中之反應展示急劇的下降（作用大小）強烈取決於給藥時SDS。此發現表明，藉由經由功能性受體（NPR2）恢復細胞內CNP活性，CNP生產與主要抗性水平成比例地減少。可以想像地增加的清除受體NPR3之表現，其減少CNP並增加NTproCNP（相反於NPR3功能喪失（Boudin等人，《美國人類遺傳學雜誌》 103:288-295, 2018），可以解釋所觀測到的研究結果。然而，因為CNP與NTproCNP在未經治療之Ach兒童中類似地增加（Olney，見上文）且NTproCNP/CNP比率正常，所以NPR3的上調不大可能。值得重視地，在野生型嚙齒動物幼畜中未發現直接反饋（Ueda，見上文），其提高抑制的發現（非性別依賴性）可能對其中循環CNP產物高於正常的Ach具有特異性的可能性。在健康正常成年男性中進行之臨床（安全性）研究（BMN 111-101）中，在2.5至15 μg/kg/d範圍內之劑量之後4小時觀測到血漿NTproCNP相對於基線無顯著變化。此表明直接抑制表徵不成熟骨架，但是否受限於Ach需要進一步研究，例如無遺傳病症之兒童，以及SDS接近零之Ach。不管此等發現如何，考慮到與顯著抑制相關之極高濃度（峰值＞350 pmol/L）及病理生理學中所見之水平（2-8 pmol/L），觀測到之直接反饋不大可能促進活體內CNP調節（Olney等人，《臨床內分泌代謝雜誌》100:E355-359, 2015）。 實例2-CXM及其他生物標記物的量測

伏索利肽經由利尿鈉肽受體-B對生長板軟骨細胞起作用以刺激增加之軟骨內化骨生長，在經治療之個體中引起增加之生長速度。在臨床研究中，分析個體血液及尿液樣品以監測推定骨生長生物標記物，包括膠原蛋白II之交聯C端端肽（CTxII）、骨特異性鹼性磷酸酶（BSAP）、膠原蛋白I之N端前肽（PINP）及膠原蛋白X之N端片段（CXM）。關於接受伏索利肽之個體中生長速度之觀測變化分析生物標記物隨時間推移之變化。

X型膠原蛋白生物標記物（CXM；Coghlan 2017）係由活動性生長板釋放之X型膠原蛋白降解片段。產生相對定量生物標記物ECLA且在BioMarin驗證以量測CXM。用含Tween-20之StartingBlock PBS（ThermoFisher Scientific，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆（Waltham, MA, USA））阻斷九十六孔Meso Scale Discovery（MSD）鏈球菌親生物素蛋白盤。在傾析阻斷緩衝液之後，將經生物素標記之抗人類X型膠原蛋白NC1域捕捉SOMA體（SOMAmer）在盤上培育。標準儲備液（分析稀釋劑[AD]中之重組人類X型膠原蛋白NC1域）在AD中連續稀釋，同時血清品質對照樣品（QC）及血清研究樣品在AD中1:100稀釋。洗滌分析盤之後，稀釋之校準物及樣品在盤上培育。在第二次洗滌之後，將經釕標記之小鼠單株抗X型膠原蛋白NC1域IgG偵測抗體在盤上培育。隨後洗滌盤，添加含有界面活性劑之MSD讀取緩衝液T，且在MSD Quickplex儀器上讀取盤。來自各孔之原始信號與各樣品中之X型膠原蛋白濃度成比例。各未知樣品中X型膠原蛋白之濃度藉由使用標準校準物曲線對原始分析信號進行內插來確定。由Watson LIMS進行之標準回歸使用具有1/Y ²之加權因數的4參數邏輯（4-PL）馬魁達（Marquardt）模型。偵測之分析極限係人類血清中914 pg/mL CXM。

量測人類血清中之骨特異性鹼性磷酸酶之酶免疫分析方法在ICON Labs（美國紐約州法明代爾（Farmingdale, NY, USA）；驗證N08-024VR-1,4）驗證。該分析使用經單株抗BAP抗體塗佈之孔以捕捉樣品中之BAP。用磷酸對硝苯酯受質偵測所捕獲之BAP之酶活性。使用SpectraMax分光光度計（Molecular Devices，美國加利福尼亞州聖荷西（San Jose, CA, USA））讀取原始分析信號。藉由內插使用標準校準物曲線及線性曲線擬合來確定各樣品中BAP之濃度。定量之分析極限在純情況下為2 U/L

基於UniQ PINP RIA分析套組（Orion Diagnostica，芬蘭埃斯波（Espoo, Finland））之定量競爭形式放射免疫分析（RIA）方法在ICON Labs（美國紐約州法明代爾；驗證N06-016VR）驗證。已知量之經 ¹²⁵I標記之PINP及樣品中之未知量的未標記PINP競爭多株兔抗PINP IgG抗體上有限數目個高親和力結合位點。塗佈於固體高嶺土粒子上之二級抗兔IgG抗體用於自基質組分分離結合抗體之PINP。結合的 ¹²⁵I-PINP之放射性使用WIZARD自動γ計數器（Perkin Elmer，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）量測。各管中之放射性之量與各樣品中PINP之濃度成反比。藉由內插使用標準校準物曲線及線性回歸曲線擬合來確定各樣品中PINP之濃度。定量下限為純人類血清中5 μg/L PINP。

使用來自ImmunoDiagnostic Systems（英國東博爾登（East Boldon, UK））之CartiLaps ELISA套組的人類尿液中CTXII量測之定量競爭形式ELISA在ICON Labs驗證以支持研究111-202/205（驗證N06-114VR）。該分析係基於小鼠單株抗CTXII抗體與II型膠原蛋白之尿片段或結合於塗佈有鏈球菌親生物素蛋白之微量滴定盤之表面的經生物素標記之合成肽之競爭性結合。最初，經生物素標記之合成肽結合至微量滴定盤之鏈球菌親生物素蛋白塗佈之孔的表面。洗滌之後，將標準物、對照物及含有未標記CTXII之尿液樣品移液至孔中，隨後添加小鼠單株抗CTXII IgG之溶液。洗滌各孔，且添加過氧化酶結合之兔抗小鼠IgG之溶液至孔中。在第二洗滌步驟之後，將四甲基聯苯胺（TMB）發色受質添加至所有孔。用硫酸停止黃色顯色，且在SpectraMax Plus分光光度計（Molecular Devices, 美國加利福尼亞州聖荷西（San Jose, CA, USA））上讀取450 nm下之吸光度。各孔中之原始信號與各樣品中CTXII之濃度反相關。藉由內插使用標準校準物曲線及線性曲線擬合來確定各樣品中CTXII之濃度。定量下限為純尿液中0.60 ng/mL CTXII。

在研究111-202中，患有軟骨發育不全年齡為5至15之兒科個體在前6個月接受2.5、7.5、15或30 μg/kg/天（分別群組1、2、3及4）之伏索利肽。6個月之後，接受15或30 μg/kg/天伏索利肽之個體年生長速度（AGV）觀測到顯著增加，但接受2.5或7.5 μg/kg/天之個體未觀測到（圖5）。6個月之後，群組1及2中個體之劑量濃度增加至15 μg/kg/天，使得AGV增加。

雖然111-202中所分析之所有生物標記物為可變的，但對於所有劑量水平的治療，CXM展現劑量依賴性增加，BSAP似乎隨時間推移而略微增加，且CTxII或P1NP不存在明顯的趨勢或劑量依賴性反應。基於此等結果，BSAP及CXM併入安慰劑對照的III期伏索利肽臨床研究111-301及治療前自然史研究111-901中。

在進入研究111-301之前，在研究111-901中在治療開始之前持續至少6個月及至多15個月，在無治療下監測患有軟骨發育不全年齡為5至15歲之兒科個體。AGV、CXM及BSAP在自然史研究111-901期間及安慰劑對照的雙盲3期研究111-301期間量測。AGV在治療開始之前及在接受安慰劑之個體中相對穩定。相比之下，3個月時AGV在接受伏索利肽之個體中顯著增加（圖6）。類似地，在研究111-301中之經治療個體中CXM水平大大增加，但在接受安慰劑之個體中未增加。經治療個體中之血清BSAP水平增加，但接受安慰劑之個體中亦較小程度增加。

資料表明監測軟骨內化骨生長變化中CXM優於CTxII、PINP及BSAP。來自3期研究之資料清楚地顯示經伏索利肽治療之個體中，血清CXM水平增加與AGV增加相關，但經安慰劑治療之個體中並非如此。經伏索利肽治療之個體中之BSAP似乎存在相對於經安慰劑治療之個體中觀測的一些增加，然而此增加相比於CXM所觀測到的增加相對較小。研究資料證明血清CXM為與AGV變化相關之有用生長板生物標記物。 實例3-與身材矮小之基因原因相關之NPR2變異體的高通量表徵

NPR2變異體之高通量表徵將使得熟習此項技術者能夠較佳地預測新穎變異體，且對於更通常出現之變異體，可改良符合條件的患者之診斷及臨床試驗入選。假設本文中之方法預測身材矮小基因變異體之良性相對於病原性分類，且NPR2變異體活性預測總身高。軟骨發育不全定義為相對於平均值＜2SD之身高。

本文描述評估＞260種NPR2變異體之活性的活體外分析（cGMP）。已在英國生物庫研究中鑑別出NPR2蛋白質改變變異體且描述於Estrada等人（《自然通訊（Nat Commun.）》 2021 12（1）:2224）中。在量測cGMP水平之前，將NPR2表現構築體轉染至HEK293細胞中且3天後，用於無血清DMEM中的0.4 nM IBMX及20 nM CNP處理細胞。cGMP捕獲點ELISA競爭分析（Molecular Devices）用於根據製造商建議量測cGMP。RedLuc用作轉染對照物（圖8A）。圖8B展示多種LoF及GoF變異體之正規化cGMP值。

圖9A展示基於蛋白質之預測結果，變異體活性水平之分析。蛋白質截短變異體（獲得終止及讀框轉移）具有接近零之活性水平，而同義突變具有接近野生型之活性水平。誤義及同框缺失跨越廣泛範圍之活性水平。圖9B展示基於組合註釋依賴性耗乏（CADD）評分（Kircher等人《一種用於估計人類基因變異體之相對病原性的通用框架（ A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants）》《自然-遺傳學（Nat Genet.）》 2014, 46（3）:310-5）的誤義變異體之預測結果的分析，CADD併入進化保守及超過60種其他註釋。圖9C為NPR2變異體之量測功能活性的比較及對攜載其之個體身高的平均影響。此等結果展示，NPR2變異體活性資料預測身高作用大小。

多基因風險評分（PRS）可與表型資料一起使用以鑑別患者群體。可基於遺傳學預測特發性身材矮小（ISS）。圖10A展示僅基於身高之多基因評分之ISS的機率。多基因評分概述對身高具有較小作用之數千個常見變異體之組合作用。此等評分捕捉成人身高之群體變異的43%，但在分佈之極端處預測能力有限。圖10B展示在NPR2功能喪失變異體的情況下，多基因評分之預測能力如何變化。具有NPR2 LoF變異體及底端12.5%之多基因評分的個體的成人ISS可能性接近100%。800人中大致1人具有已表徵且確認低活性水平之NPR2變異體，因此僅基於遺傳學，可預測6,600中至少1人會患有特發性身材矮小。類似程序可應用於對身高具有較大作用之其他基因（ACAN、SHOX、DTL、PAPPA等）。

將選擇變異體映射至3D結構上揭露了干擾之潛在機制。最近大約160種NPR2基因變異體使用先前所述之cGMP定量「捕獲點」分析（Estrada等人，見上文）進行表型表徵。高信賴度功能喪失（LoF）及功能獲得（GoF）變異體之3D模型化可提供對特定胺基酸變化及變異體位置可如何調節NPR2活性的機制洞察。目標為將約35個高信賴度（LoF及GoF）NPR2變異體映射至NPR2內的已知功能域上（2D映射），且隨後將此等變異體映射至α摺疊3D結構上（3D映射）。

NPR2 α摺疊結構獲自最新α摺疊公開文獻（Jumper等人，《自然》596:583-589（2021））。產生表型表徵之「高信賴度」變異體的清單（表4）。表型藉由使用標準曲線確定cGMP水平來計算。此值相對於紅螢光素酶（RedLuciferase）（轉染對照物）正規化。此值藉由將WT設定為1而進一步正規化。平均值係自至少3次各自4個複本的重複實驗計算。 表 4. 表型表徵之「高信賴度」變異體

#	變異體	平均表型	標籤
1	Thr377Asn	0.01061505	LoF
2	Thr861Ile	0.01124389	LoF
3	Arg776Trp	0.01312264	LoF
4	Lys367Glu	0.01438053	LoF
5	Thr907Met*	0.01456005	LoF
6	Arg957Cys	0.01552647	LoF
7	Val965Asp	0.01580358	LoF
8	Gly917Arg*	0.01708254	LoF
9	Leu956Gln	0.02434295	LoF
10	Trp42Arg	0.02880027	LoF
11	Arg957Cys*	0.0295365	LoF
12	Thr297Met*	0.03024853	LoF
13	Ile494Ser*	0.03638488	LoF
14	Glu77Lys	0.04985807	LoF
15	Lys1006Thr	0.05509553	LoF
16	Ser522Pro	0.05673193	LoF
17	Arg601Ser*	0.05948868	LoF
18	Ala48Ser*	0.06785073	LoF
19	Glu389Asp*	0.07079411	LoF
20	Thr861Ile*	0.07977669	LoF
21	Leu1009Val*	0.08469875	LoF
22	Pro301Ser*	0.08477935	LoF
23	Gly209Val*	0.08860852	LoF
24	Lys629Arg	1.49252348	GoF
25	Val553Leu	1.51545857	GoF
26	Arg562Gln*	1.55396206	GoF
27	Arg562Gln	1.62934316	GoF
28	Lys480Asn*	1.68888938	GoF
29	Glu727Gln*	1.70450503	GoF
30	HIS508Asp*	1.74002497	GoF
31	His552Arg	1.7937574	GoF
32	Arg263His*	1.86267462	GoF
33	Gly21Arg*	2.78149183	GoF
34	Glu359Ala*	2.99777785	GoF
35	Ala59Thr	3.73510437	GoF

*  Estrada等人，2021中公開之變異體

變異體基於定位至不同蛋白域分開（細胞外域（ECD）：配體（CNP）結合，激酶同源域（KHD）（結合ATP，GC功能之負調節因子），或鳥苷酸環化酶域（GCD：產生cGMP）。此等變異體映射至α摺疊3D結構上（圖11A）且提供關於一些變異體可藉以改變NPR2活性之可能機制的結論（圖11C-11D）。舉例而言，許多GoF突變似乎在KHD區域中。

本文中之資料表明NPR LoF變異體之存在及底端12.5%之多基因風險評分（PRS）可準確地預測成人中之特發性身材矮小。高信賴度LoF及GoF變異體之本發明3D模型化提供對NPR2活性之此等變異體特異性作用的機制洞察。 實例4-顱骨及腦形態作為CNP療法之功效的度量

CNP療法之功效的額外標記物包括顱骨及腦形態，諸如面部體積、鼻竇體積及枕骨大孔面積之增加。

在進行中的兒童II期CNP療法研究中，一組3至6月齡患者（群組3）以每日30 μg/kg的劑量皮下投與CNP（BMN111），且量測年生長體積變化、身高變化以及顱骨形態。亦參見PCT申請案第PCT/US22/73605號。

藥物動力學研究展示在群組2及3中接受30 μg/kg伏索利肽之參與者之平均暴露高於接受15 μg/kg伏索利肽之群組1中之參與者。 表 5. 研究206之伏索利肽之血漿藥物動力學參數之概述

群組	劑量 （ μ g/kg ）	問診 （天）	數目	中值 [ 範圍 ] T max （ min ）	平均值（ SD ） C max （ pg/mL ）	平均值（ SD ） AUC 0-t （ pg-min/mL ）	平均值（ SD ） t 1/2 （ min ）
1	15	第1天	18	15.0 [4.0, 30.0]	4430（3670）	132,000（97,300）	21.7（7.99）
		第26週	17	15.0 [6.0, 47.0]	5850（3260）	282,000（222,000）	29.2（7.06）
		第52週	16	15.0 [7.0, 31.0]	5640（2740）	258,000（169,000）	29.0（9.12）
2	30	第1天	7	14.0 [4.0, 30.0]	14,500（5950）	547,000（279,000）	33.3（8.41）
		第26週	3	15.0 [6.0, 15.0]	10,100（2970）	407,000（148,000）	21.0（13.1）
		第52週	3	14.0 [13.0, 16.0]	12,900（6260）	672,000（33,4000）	40.1（15.2）
3	30	第1天	11	5.0 [5.0, 14.0]	13,400（5710）	323,000（129,000）	41.1（18.8）
		第26週	6	6.5 [5.0, 15.0]	11,500（4290）	297,000（80,700）	19.2（6.14）
		第52週	8	15.5 [6.0, 17.0]	13,500（6770）	557,000（40,1000）	24.3（6.58）

AUC，0至最後可量測濃度之時間的血漿濃度-時間曲線下面積；SD，標準差；t _{1 / 2}，半衰期；T _max，峰值時間。

磁共振成像（MRI）用於確定伏索利肽對腦及顱骨形態，包括枕骨大孔、腦室及腦實質尺寸之可能治療作用。亦使用其確認進入研究之各患者基於指示臨床上顯著的皮質髓質或脊髓損傷之存在的排除準則（基於篩選期期間獲得之腦MRI的頸髓質狹窄跡象，或病變或解剖學異常之存在）而符合條件。掃描參數在所有臨床地點中標準化且詳述於下表6中。 表 6. MRI參數

參數	描述
上部範圍	顱骨頂點（顱骨上方一片）
下部範圍	頸椎C2（C2下方一片）
序列	搜索 矢狀3D T1加權影像（T1WI） 矢狀3D T2加權影像（T2WI） 矢狀T1及T2之軸切及冠狀重構
面	矢狀
重構（MPR）面	軸切及冠狀
片厚度	1 mm（用1 mm進行重構）
片間隙（間距）	0 mm（用0 mm進行重構）
基質	高度推薦256 × 256
FOV	需要20−25 cm
NEX	1-2
片數	所有面必須具有相同片數（以包括重構）

在基線時（篩選期第-30天至第-1天）及在52週治療之後（+/-7天）或在提前終止問診時，使用標準化採集技術以確保隨時間及跨越地點之一致性，麻醉下對試驗個體進行T1加權及T2加權MRI研究（以1.2 mm片厚度自顱骨頂點至C2）。

在最年輕群組（群組3，3至6月齡兒童）中，如藉由MRI所評估，相對於安慰劑用伏索利肽治療之參與者在52週時具有面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積之較大增加。

群組3（3至6月齡）中之參與者中觀測到的MRI變化值得注意，此係因為認為導致面中發育不全及枕骨大孔狹窄的異常顱面及顱骨底軟骨內成骨，藉由造成睡眠呼吸障礙及腦幹受壓（Hoover-Fong等人），係5歲以下軟骨發育不全兒童所報導猝死率高的主要促成因素（Hecht等人，《美國醫學遺傳學雜誌》1985;20:355-60; Hoover-Fong等人，《骨骼》 2021;146:115872）（在此研究中在1名參與者中觀測到）。鑒於伏索利肽改善軟骨發育不全之小鼠模型中之顱面骨骼及枕骨大孔異常（Lorget等人，《美國人類遺傳學雜誌》2012;91:1108-14）且促進軟骨發育不全兒童中之軟骨內成骨（Savarirayan等人，《柳葉刀（The Lancet）》 2020;396:684-92; Savarirayan等人，《新英格蘭醫學雜誌》 2019;381:25-35），此等MRI變化可能反映伏索利肽對顱面及枕骨大孔生長之直接作用。在長期後續研究（研究208, ClinicalTrials.gov第NCT03989947號）期間將評估此等觀測到之MRI變化是否轉化為此等嬰兒中嬰兒猝死、睡眠呼吸障礙的發生率及枕骨大孔神經外科減壓術的必要性的降低。

顱骨/腦形態之變化可為年輕患者中之功效的較佳度量，此係因為此組中伏索利肽對年生長速度之治療作用不如5歲及更大齡兒童中那麼高。此差異之原因包括在軟骨發育不全之非常年輕兒童中高度可變且快速下降的生長速度，以及一致且準確地量測此等嬰兒之體長的實踐挑戰。對來自群組3之最年輕參與者之生長速度觀測到的治療作用反映了此情況，其中量測結果展示了寬廣的變化性及較大的信賴區間。

另一進行中的研究，其比較處於需要枕骨大孔手術降壓的風險下的小於1歲的軟骨發育不全嬰兒中之當前標準照護相對於CNP變異體（例如伏索利肽）治療，其中亦將直接處理此問題（ClinicalTrials.gov第NCT04554940號）（Savarirayan等人，《科技進展（Sci Prog）》 2021;104:368504211003782）。僅在群組3中之參與者中觀測到此等MRI變化，與以下事實一致：在6月齡之後，枕骨大孔，尤其在橫向平面中之生長為可忽略的（Hecht等人，《美國醫學遺傳學雜誌》1989;32:528-35）。

在3至60月齡之兒童中每天一次皮下投與伏索利肽與大體上呈現輕度的總體不良事件概況相關，且引起身高Z評分增加。3至6月齡兒童中之治療產生增加之臉部及鼻竇體積及增加之枕骨大孔面積。

應理解，本文所描述之本發明之每一實施例可視情況與本文所描述之其他實施例中之任何一或多者組合。本文所引用之每一專利文獻及每一非專利文獻以全文引用之方式併入本文中。

因此，應理解，本發明不限於所揭示之特定實施例，而意欲涵蓋所有修改，該等修改在如由所附申請專利範圍、以上說明書中所定義及/或隨附圖式中所示之本發明之精神及範疇內。因此，僅在隨附申請專利範圍中出現的此類限制應列入本發明中。

圖1A-1C.  按整個研究中之群組的年生長速度（AGV）（圖1A）、血漿NTproCNP濃度（圖1B）及NTproCNP SDS（針對年齡及性別調節）（圖1C）。值為平均值±SE。群組1（6名個體，在篩選時年齡範圍6至10歲）接受2.5 μg/kg/d持續至多10個月（約至第300天），隨後7.5 μg/kg/d持續大約2個月（約至第360天），且其後15 μg/kg/d直至研究完成。群組2（6名個體，年齡範圍5至10）在初始6至8個月（180至240天）接受7.5 μg/kg/d，此後遞增至15 μg/kg/d。在整個研究中，群組3（8名個體，年齡範圍6至11）及群組4（8名個體，年齡範圍5至8）分別接受15 μg/kg/d及30 μg/kg/d。

圖2A-2D.  按群組的NTproCNP濃度隨時間推移之變化。劃定各群組內之個體。字母P指示當個體確定到達坦納（Tanner）2期時問診的時間。群組1（圖2A）（6名個體，在篩選時年齡範圍6至10歲）接受2.5 μg/kg/d持續至多10個月（約至第300天），隨後7.5 μg/kg/d持續大約2個月（約至第360天），且其後15 μg/kg/d直至研究完成。群組2（圖2B）（6名個體，年齡範圍5至10）在初始6至8個月（180至240天）接受7.5 μg/kg/d，此後遞增至15 μg/kg/d。在整個研究中，群組3（圖2C）（8名個體，年齡範圍6至11）及群組4（圖2D）（8名個體，年齡範圍5至8）分別接受15 μg/kg/d及30 μg/kg/d。

圖3.  療法之3至4年三個群組4個體中，骨轉換標記物（bALP、PINP）及血漿NTproCNP之相對於基線（篩選）的倍數變化。各圖區描繪單個個體中之同時分析物濃度。

圖4.  第183天注射之後4小時血漿NTproCNP濃度的變化（△）與同一天注射之前NTproCNP SDS之間的關係。

圖5A-5C.   2期研究111-202隨著時間推移的生長速度及生物標記物結果。在接受2.5、7.5、15或30 μg/kg/天伏索利肽（群組1、2、3及4）之個體中量測年生長速度（AGV）（圖5A）、血清膠原蛋白X生物標記物（CXM）（圖5B）及血清骨特異性鹼性磷酸酶（BSAP）（圖5C）。在治療6個月之後，群組1及2劑量遞增至15 μg/kg/天。AGV或生物標記物相對於基線的變化展示在y軸上，伏索利肽治療之天數展示在x軸上。線表示各群組之平均值，誤差條表示平均標準誤差

圖6A-6C.  自然史研究111-901及3期研究111-301隨著時間推移的生長速度及生物標記物結果。在研究111-901中之未經治療個體及在研究1110301中接受15 μg/kg/天伏索利肽或安慰劑之相同個體中量測年生長速度（AGV）（圖6A）、血清膠原蛋白X生物標記物（CXM）（圖6B）及血清骨特異性鹼性磷酸酶（BSAP）（圖6C）。AGV或血清生物標記物濃度展示在y軸上，研究111-301（伏索利肽或安慰劑治療）開始之月數展示在x軸上。線表示各組之平均值，誤差條表示平均標準誤差

圖7描繪包含結合部分之CNP變異體蛋白的實例。

圖8A繪示捕獲點（catchpoint）分析，其為用於量測cGMP之基於競爭之ELISA分析（molecular devices）。圖8B展示多種NPR2 LoF及GoF變異體之正規化cGMP值。

圖9A-9B：圖9A）基於蛋白質之預測結果，變異體活性水平之分析。圖9B）基於組合註釋依賴性耗乏（Combined Annotation Dependent Depletion，CADD）評分的誤義變異體之預測結果的分析。圖9C） NPR2變異體之量測功能活性的比較及對攜載其之個體身高的平均影響。X軸展示相對於野生型NPR2之log2活性水平（0 =野生型，-1 = ½野生型，-2 = ¼野生型等）。Y軸展示變異體對成人身高之估計作用大小。1個β單位對應於1個標準差（男性約2.5吋，女性約2.2吋）。

圖10A-10B. 基於遺傳學預測特發性身材矮小（ISS）。圖10A展示僅基於身高之多基因評分之ISS的機率，第一圖區展示在NPR2功能喪失變異體的情況下，多基因評分之預測能力如何變化。圖10B展示藉由與NPR2功能喪失變異體之存在組合的多基因風險評分預測ISS。

圖11A-11D.  圖11A. NPR2蛋白質3D模型，AF模型，展示低信賴度區域（黃色及紅色）。圖11B. 如Hannema等人（《臨床內分泌代謝雜誌》98:E1988-98, 2013）中所述之NPR2（二聚體）之各種域的繪圖。圖11C. 位於配體結合域中之變異體清單映射至3D模型上。圖11D. 所有變異體（LoF=紅色，GoF=綠色）之概述及其對NPR2功能之潛在影響。

圖12A-12C. 基線及52週時之磁共振成像展示以下之變化：（圖12A）面部體積；（圖12B）鼻竇體積；及（圖12C）枕骨大孔面積。面部體積（上圖區）、鼻竇體積（中圖區）及枕骨大孔面積（下圖區）之磁共振成像變化。該圖展示MRI結果中自基線至第52週之變化，評價伏索利肽對顱骨形態之作用。盒狀圖顯示第25及第75百分位數（盒邊緣）、中值（中線）、平均值（空心正方形符號）及第2.5及第97.5百分位數（鬚）。點表示離群值。

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Claims (40)

1. 一種治療患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小且接受C型利尿鈉肽（CNP）療法之個體的方法，其包含： i）   向該個體投與CNP療法； ii）  自該個體獲得樣品； iii） 量測在（ii）中自該個體收集之樣品中NTproCNP及/或膠原蛋白X之N端片段（CXM）之水平；及 iv） 更改或改變CNP劑量以使NTproCNP水平在群體之平均NTproCNP之+/- 2 SDS內。
2. 如請求項1之方法，其中若該NTproCNP水平增加，則增加CNP療法劑量水平或頻率，或若該NTproCNP水平降低，則降低CNP療法劑量水平。
3. 一種治療患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小且接受C型利尿鈉肽（CNP）療法之個體的方法，其包含： i）     向該個體投與CNP療法； ii）    自該個體獲得樣品； iii）   量測在（ii）中自該個體收集之樣品中膠原蛋白X之N端片段（CXM）之水平；及 iv）   若膠原蛋白X水平降低，則增加CNP療法劑量水平或頻率。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中增加該CNP療法劑量增加該個體之平均生長速度（AGV）。
5. 如請求項4之方法，其中該個體之該平均生長速度（AGV）在6個月內、在1年或在2年或更長時間內增加。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中增加CNP療法劑量包含增加給藥頻率及/或增加給藥量。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中CNP療法劑量水平增加及NTproCNP水平降低與個體之年生長速度（AGV）提高相關。
8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中CNP療法劑量水平增加及NTproCNP水平降低延長該個體之生長板活動的持續時間。
9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中NTproCNP之水平維持在該群體之該平均NTproCNP之+/- 2 SDS之間。
10. 如請求項1至8中任一項之方法，其中若NTproCNP SDS低於平均值，則將該CNP療法朝向零NTproCNP SDS滴定。
11. 如請求項10之方法，其中該零NTproCNP SDS預測最佳作用大小。
12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該樣品為血液、尿液、血漿、唾液或組織。
13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該個體罹患選自由以下組成之群的骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小：軟骨發育不全、骨關節炎、低磷酸鹽血性佝僂病、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不良、致死性發育不良、成骨不全、軟骨成長不全、點狀軟骨發育異常、同合子型軟骨發育不全、屈肢骨發育不良（camptomelic dysplasia）、先天性致死型低磷酸酶症、圍產期致死型成骨不全、短肋骨多指症候群、肢根型點狀軟骨發育異常、揚森型幹骺端發育不良（Jansen-type metaphyseal dysplasia）、先天性脊椎骨骺發育不良（spondyloepiphyseal dysplasia congenita）、骨發育不全、畸型發育不良、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不良（Langer-type mesomelic dysplasia）、尼維格型肢中骨發育不良（Nievergelt-type mesomelic dysplasia）、羅比諾氏症候群（Robinow syndrome）、萊因哈特氏症候群（Reinhardt syndrome）、肢端發育不全（acrodysostosis）、周圍骨發育障礙、克尼斯特氏發育不良（Kniest dysplasia）、纖維軟骨增生症、羅伯茨氏症候群（Roberts syndrome）、肢端肢中發育不良、小肢畸形、莫奎氏症候群（Morquio syndrome）、克尼斯特氏症候群、後生營養性發育不良、脊椎骨骺幹骺端發育不良、與NPR2突變、SHOX突變（特納氏症候群（Turner's syndrome）/萊里維爾（Leri Weill））、PTPN11突變（努南氏症候群（Noonan's syndrome））及IGF1R突變有關的病症。
14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該CNP為選自由以下組成之群的CNP變異體： PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP37）（SEQ ID NO: 1）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 2）； GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP53）（SEQ ID NO: 3）；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP53）（SEQ ID NO: 4）；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP53）（SEQ ID NO: 5）；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-53(M48N)]（SEQ ID NO: 6）；LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-52）（SEQ ID NO: 7）； RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-51）（SEQ ID NO: 8）； VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP- 50）（SEQ ID NO: 9）； DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-49）（SEQ ID NO: 10）； TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-48）（SEQ ID NO: 11）； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-47）（SEQ ID NO: 12）； SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-46）（SEQ ID NO: 13）； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-45）（SEQ ID NO: 14）； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-44）（SEQ ID NO: 15）； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-43）（SEQ ID NO: 16）；WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-42）（SEQ ID NO: 17）；ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-41）（SEQ ID NO: 18）；RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-40）（SEQ ID NO: 19）；LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-39）（SEQ ID NO: 20）；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 21）；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-37）（SEQ ID NO: 22）；EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-36）（SEQ ID NO: 23）；HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-35）（SEQ ID NO: 24）；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-34）（SEQ ID NO: 25）；NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-33）（SEQ ID NO: 26）；ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-32）（SEQ ID NO: 27）；RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-31）（SEQ ID NO: 28）；KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-30）（SEQ ID NO: 29）；YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-29）（SEQ ID NO: 30）；KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-28）（SEQ ID NO: 31）；GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-27）（SEQ ID NO: 32）；ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-26）（SEQ ID NO: 33）；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-25）（SEQ ID NO: 34）； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-24）（SEQ ID NO: 35）； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-23）（SEQ ID NO: 36）； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-21）（SEQ ID NO: 37）； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-20）（SEQ ID NO: 38）； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP- 19）（SEQ ID NO: 39）； GCFGLKLDRIGSMSGLGC（CNP-18）（SEQ ID NO: 40）； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N)]（SEQ ID NO: 41）； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-CNP-37）（SEQ ID NO: 42）； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-CNP-37）（SEQ ID NO: 43）； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37(M32N)]（SEQ ID NO: 44）； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Met-Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 45）； PGQEHPQARRYRGAQRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 46）；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 47）；PGQEHPNARRYRGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 48）；及PGQEHPQARKYKGAQKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（SEQ ID NO: 49）。
15. 如請求項14之方法，其中該CNP變異體為PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Pro-Gly-CNP37）（SEQ ID NO: 1）；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC（Gly-CNP-37）（SEQ ID NO: 2）；或LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKL DRIGSMSGLGC（CNP-38）（SEQ ID NO: 21）。
16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中NTproCNP或CXM水平在血漿樣品中量測。
17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中該個體接受7.5 μg/kg與30 μg/kg之間的CNP療法。
18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該CNP劑量增加至30 µg/kg。
19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該NTproCNP及/或該CXM在投與之後至少4小時量測。
20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該NTproCNP及/或CXM水平在開始CNP療法之後至少6個月量測。
21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中將樣品中之該NTproCNP水平與開始CNP療法之前獲取的基線量測結果進行比較。
22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中在NTproCNP減少指示該個體之AGV增加時，增加CNP療法劑量或頻率。
23. 如請求項1至18中任一項之方法，其中將樣品中之該CXM水平與開始CNP療法之前獲取的基線量測結果進行比較。
24. 如請求項1至5、12至20或23中任一項之方法，其中該CXM增加指示骨生長增加，且其中當存在提昇AGV之CXM增加時增加CNP劑量頻率或水平。
25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該個體為具有開放生長板且接受15或30 μg/kg每日劑量之兒科個體。
26. 一種選擇起始個體之CNP療法之方法，其包含： i）在多個時間點量測該個體之NTproCNP以確立基線NTproCNP水平； ii）測定NTproCNP水平是否指示SDS為零、低於或高於零；及 iii）當該個體之NTproCNP水平+/- 2 SDS時，開始用CNP療法治療。
27. 一種選擇起始患有軟骨發育不全之個體之CNP療法之方法，其包含： i）在多個時間點量測該個體之NTproCNP以確立基線NTproCNP水平； ii）測定NTproCNP水平是否指示SDS為零或高於零；及 iii）當該個體之NTproCNP水平高於SDS零時，開始用CNP療法治療。
28. 如請求項27之方法，其中NTproCNP在2週、一個月、3個月及6個月時量測，以確立基線NTproCNP水平。
29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中NTproCNP係藉由放射免疫分析量測。
30. 一種治療患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之個體的方法，其包含： [i）鑑別個體是否具有與骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小相關之基因的功能喪失（LoF）或功能獲得（GoF）變異體； ii）計算該個體之身高的多基因風險評分（PRS）； iii）判定該個體是否具有LoF變異體及在底端20%的PRS；及 iv）若該個體具有LoF變異體及在底端20%的PRS，則用CNP變異體治療該個體。
31. 如請求項30之方法，其中該與骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小相關之基因係選自由以下組成之群：NPR2、SHOX、PTPN11、COL2A1、COL11A1、COL9A2、COL10）、聚集蛋白多醣（ACAN）、印度刺蝟因子（indian hedgehog，IHH）、NPPC、FGFR3、IGF1R、DTL及妊娠相關血漿蛋白質A2（PAPPA2）。
32. 如請求項30或31之方法，其中該與骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小相關之基因係NPR2。
33. 一種增加患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之6月齡或更小之個體之面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積之方法，其包含以至少30 μg/kg之劑量投與CNP變異體。
34. 一種減少患有骨相關病症、骨骼發育不良或身材矮小之6月齡或更小之個體之嬰兒猝死、睡眠呼吸障礙及枕骨大孔神經外科減壓術的發生率的方法，其包含以至少30 μg/kg之劑量投與CNP變異體。
35. 如請求項33或34之方法，其中面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積的該增加係藉由磁共振成像（MRI）量測。
36. 如請求項35之方法，其中面部體積、面部鼻竇體積及枕骨大孔面積之變化係與基線水平、健康對照個體或未治療對照個體進行比較。
37. 如請求項33至36中任一項之方法，其中該CNP變異體係皮下投與。
38. 如請求項33至37中任一項之方法，其中CNP變異體係每天、每週、每2週、每月或更不頻繁地投與。
39. 如請求項33至38中任一項之方法，其中該CNP變異體係以30 μg/kg之劑量投與持續3個月、6個月、1年或更長時間。
40. 如請求項33至39中任一項之方法，其中當該個體為約2歲時，CNP變異體之劑量減少至15 μg/kg。