TWI471137B - Ｃ型利鈉胜肽變異體 - Google Patents

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Shinong Long
Michel Claude Vellard
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Augustus O Okhamafe
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Description

C型利鈉胜肽變異體
本揭示案之領域大體而言係關於C型利鈉胜肽(CNP)之變異體、包含CNP變異體之組合物、製造CNP變異體之方法，及使用CNP變異體來治療CNP反應性病症之方法，該等病症包括(但不限於)骨相關病症，諸如骨骼發育不全(例如軟骨發育不全)，及血管平滑肌病症。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2009年10月23日申請之美國臨時申請案第61/254,563號及2009年5月20日申請之美國臨時申請案第61/180,112號的優先權及權益，該等臨時申請案各自之揭示內容係以全文引用的方式併入本文中。
利鈉胜肽家族係由三種結構上相關之胜肽組成：心房利鈉胜肽(ANP)(Genbank寄存編號NP_006163，針對ANP前驅蛋白質NPPA)、腦利鈉胜肽(BNP)(Genbank寄存編號NP_002512，針對BNP前驅蛋白質NPPB)，及C型利鈉胜肽(CNP)(Biochem. Biophys. Res. Commun.,168: 863-870(1990)(GenBank寄存編號NP_077720，針對CNP前驅蛋白質NPPC)(J. Hypertens.,10: 907-912(1992))。此等小型單鏈胜肽(ANP、BNP、CNP)具有一個17個胺基酸的環結構(Levin等人，N. Engl. J. Med.,339: 863-870(1998))且在多個生物過程中具有重要作用。ANP及BNP結合並活化利鈉胜肽受體A(NPR-A)(亦稱為鳥苷酸環化酶A(GC-A))，導致細胞內環單磷酸鳥苷(cGMP)含量升高。同樣，CNP與NPR-B(GC-B)相互作用刺激cGMP之產生(J. Hypertens.,10: 1111-1114(1992))。第三類型之受體NPR-C以高親和力結合各利鈉胜肽且主要用以捕捉來自細胞外代謝區之胜肽且使該等胜肽沈積於溶酶體中，該等胜肽在此處被降解(Science,238: 675-678(1987))。ANP及BNP主要在心臟肌細胞內產生，且咸信其在心血管內穩定中具有重要作用(Science,252: 120-123(1991))。CNP表現較廣泛，包括表現於中樞神經系統、生殖道、骨及血管內皮中(Hypertension,49: 419-426(2007))。
在人類中，CNP最初自呈126個胺基酸單鏈前原多肽形式之利鈉胜肽前驅體C(NPPC)基因產生(Biochem. Biophys. Res. Commun.,168: 863-870(1990))。移除信號胜肽得到原CNP，且藉由內切蛋白酶弗林蛋白酶(furin)之進一步裂解產生53個胺基酸之活性胜肽(CNP-53)，其經分泌且經未知酶再次裂解產生22個胺基酸之成熟胜肽(CNP-22)(Wu,J. Biol. Chem. 278: 25847-852(2003))。CNP-53及CNP-22在其分佈方面不同，其中CNP-53在組織中居主導，而CNP-22主要見於血漿及腦脊髓液中(J. Alfonzo,Recept. Signal. Transduct. Res.,26: 269-297(2006))。軟骨中之主要CNP形式尚未知。CNP-53與CNP-22類似地結合於NPR-B。此外，其均以劑量依賴性方式及類似方式誘導cGMP產生(VT Yeung,Peptides,17: 101-106(1996))。
先前已描述天然CNP基因及多肽。美國專利第5,352,770號揭示來自豬腦之在序列方面與人類CNP一致的經分離及純化之CNP-22，及其在治療心血管適應症中之用途。美國專利第6,034,231號揭示原CNP(126個胺基酸)之人類基因及多肽，及人類CNP-53基因及多肽。
CNP自細胞外間隙之清除係經由迅速降解CNP之膜結合中性內肽酶(NEP)之作用(Biochem. J.,291(Pt 1): 83-88(1993))，及經由結合於CNP且使CNP沈積於溶酶體(CNP在此處降解)中之NPR-C發生。已顯示CNP在正常人類中具有2.6分鐘之活體內半衰期(J. Clin. Endocrinol. Metab.,78: 1428-35(1994))。CNP之低血漿濃度(J. Bone Moner. Res.,19(增刊1)S20(2004))及其與NPR-B在許多組織中共表現表明CNP主要經由自分泌/旁分泌機制起作用。
如上所述，CNP結合並活化利鈉胜肽受體B(NPR-B)(亦稱為鳥苷酸環化酶B(GC-B))，導致細胞內環單磷酸鳥苷(cGMP)含量升高。由cGMP產生所介導之下游信號傳導會影響一系列不同生物過程，包括軟骨內骨化。因此，提高或抑制此路徑中任何組分之含量皆可能會引起骨生長異常。舉例而言，在小鼠模型中剔除CNP或NPR-B產生具有長骨及椎骨較短之矮化表型的動物。已鑑別出人類NPR-B中阻斷適當CNP信號傳導之突變且其導致侏儒症(Olney等人，J. Clin. Endocrinol. Metab. 91(4): 1229-1232(2006)；Bartels等人，Am. J. Hum. Genet. 75: 27-34(2004))。相反，工程改造成產生較高含量之CNP的小鼠呈現延長之長骨及椎骨。
軟骨發育不全係由纖維母細胞生長因子受體3(FGFR-3)基因之體染色體顯性突變(導致軟骨形成異常)引起。FGFR-3通常對軟骨細胞生長及因此骨生長具有負調節作用。在軟骨發育不全中，FGFR-3之突變形式具有組成性活性，其引起骨嚴重縮短。軟骨細胞增殖與分化似乎均受到干擾，導致生長板軟骨顯著較短(P. Krejci等人，J. Cell Sci. 118: 5089-5100(2005))。軟骨內骨化為控制長骨縱向生長之過程。生長板存在四個區域：靜止區、增殖區、肥大區及鈣化區。在生長板中，NPR-B由增殖細胞表現，而NPR-C由肥大細胞表現(Yamashite等人，J. Biochem. 127: 177-179(2000))。在正常軟骨內骨生長中，軟骨細胞組織成柱狀形式且在生長板增殖區中增殖。在軟骨發育不全患者中，此等柱變得紊亂。另外，在肥大區中，細胞變大且最終凋亡(溶解)，導致骨細胞侵入及礦化。軟骨發育不全患者中肥大軟骨細胞及該區之總體大小比正常患者小得多。CNP為軟骨細胞及骨生長之正調節劑NPR-B之促效劑。CNP/NPR-B之下游信號傳導在有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)層面上抑制FGFR-3路徑。在MAPK處之抑制可促進生長板之增殖區及肥大區中軟骨細胞之增殖及分化，使得骨生長。
在人類中，FGFR-3之活化突變為遺傳性侏儒症之主要原因。具有已活化FGFR-3之小鼠充當軟骨發育不全(骨骼發育不全之最常見形式)之模型，且CNP之過度表現拯救此等動物避免矮小。因此，CNP及CNP之功能變異體為治療各種骨骼發育不全之潛在治療劑。
CNP之治療用途目前受限於其短血漿半衰期，該半衰期在人類中活體內顯示為2.6分鐘(J Clin. Endocrinol. Metab.,78: 1428-35(1994))。為提高CNP濃度高於人類血漿中通常所見之固有含量(約5 pM)，在使用全身性投與之CNP的所有人類及動物研究中，必需連續輸注。相較於野生型CNP，具有較長活體內血清半衰期且顯示類似或改良之活性的CNP變異體對於可持續治療策略為重要的。人類血漿中縮短CNP半衰期之兩種機制為中性內肽酶(NEP)造成之降解及利鈉胜肽受體C(NPR-C)造成之清除(Growth Horm. ＆ IGF Res.,16: S6-S14(2006))。據報導，對胜肽進行修飾可增強對內肽酶及外肽酶裂解之抗性(Amino Acids,30: 351-367(2006)；Curr. Opin. Biotech.,17: 638-642(2006))。
已評估CNP之多種類似物及衍生物之生物活性。據報導，藉由以S-甲基Cys取代Cys6 與Cys22 ，胜肽經由Cys6-Cys22二硫鍵之環化顯示對CNP刺激cGMP形成之活性重要(Biochem. Biophys. Res. Comm.,183: 964-969(1992)，亦使用丙胺酸掃描以鑑別對CNP功能性重要之胺基酸)。據報導，活性之額外顯著增強係由胺基酸Leu9 、Lys10 及Leu11 之組合存在所引起。美國專利第5,434,133號描述包含在胺基酸位置6、7、9、11或22具有取代之CNP-22的CNP類似物，其中該胺基酸係選自位置6之Cys或Pmp(五環巰基丙酸)，位置7之Phe、4-氯-Phe、4-氟-Phe、4-硝基-Phe或Cha(3-環己基-Ala)，位置9之Gly、Val、Aib或tLeu，位置11之Leu或Ile，及位置22之Cys或Pmp。
美國專利公開案第2004/0138134號(現為美國專利7,276,481)描述包含CNP-22之胺基酸Cys6 至Cys22 之CNP變異體(「CNP-17」)，其包括位置9、10、11、16、17、19或20之另一天然胺基酸的至少一個取代；具有插入及缺失之CNP變異體，諸如在Cys6 與Phe7 之間NEP裂解之所報導主要位點添加His殘基；及使用此等變異體來增大異常骨中骨生長板之尺寸及延長異常骨的方法。然而，如藉由cGMP產生所量測，此等變異體之活性未得到顯著增強，且如在基於活體外細胞之方法(實例7)中所觀測，幾乎所有變異體之活性均減弱。未提供其它支持性資料，諸如提供活體外穩定性或活體內測定改良之藥物動力學(PK)來證實CNP類似物之所聲稱NEP抗性及NPR-C抗性。美國專利第6,743,425號揭示治療軟骨發育不全之物質，其活化NPR-B/GC-B且為胜肽或低分子量化合物，包括C型利鈉胜肽CNP-22及CNP-53。PCT公開案第WO 94/20534號揭示命名為血管鈉胜肽(vasonatrin peptide/VNP)的CNP-22與ANP之5胺基酸C端的嵌合體，亦即有限數目之胺基酸取代及藉由形成二硫鍵或雙鍵產生的環狀嵌合胜肽。
改良其它利鈉胜肽家族成員之半衰期的方法包括降低ANP對NPR-C之親和力(美國專利第5,846,932號)、利用NPR-C之五肽拮抗劑(WO 00/6163)及共投與NEP抑制劑，諸如塞奧芬(thiorphan)與坎沙曲(candoxatril)(Clin. Exp. Pharma. Physiol.,25: 986-991(1997),Hyperten.,30: 184-190(1997))。WO 2004/047871描述BNP及BNP變異體與聚烷二醇部分、糖部分、聚山梨醇酯部分、聚陽離子部分及其它親水性聚合物部分之共軛物，其據報導顯示獲改良之循環半衰期且據報導適用於治療急性充血性心臟衰竭。
然而，尚無關於製造具有NEP抗性同時保留CNP功能性之CNP的成功策略之公開報導。
本揭示案係關於C型利鈉胜肽(CNP)之變異體，其適用於治療骨相關病症(例如軟骨發育不全)及血管平滑肌病症。本揭示案涵蓋血清半衰期增加(例如由於結合於中性內肽酶(NEP)之能力降低、對NEP之蛋白水解作用的抗性較高及/或對清除利鈉胜肽受體C(NPR-C)之親和力降低)同時保留CNP功能性之CNP變異體。
下文闡述人類CNP-22之野生型序列(在本文中稱為「hCNP22」、「wtCNP22」或「CNP22」)：(N端)Gly1 -Leu2 -Ser3 -Lys4 -Gly5 -Cys6 -Phe7 -Gly8 -Leu9 -Lys10 -Leu11 -Asp12 -Arg13 -Ile14 -Gly15 -Ser16 -Met17 -Ser18 -Gly19 -Leu20 -Gly21 -Cys22 (SEQ ID NO: 1)。
CNP22之位置6至22藉助於Cys6與Cys22之間的二硫鍵形成環狀域。已顯示17個胺基酸之環狀結構對CNP結合於NPR-B重要(Schiller,Biochem. Biophys. Res. Commun.,138: 880-886(1986))。CNP22之位置6至22的胺基酸序列在本文中稱作「CNP17」(SEQ ID NO: 2)。
CNP在許多位點易於被NEP裂解：Cys6-Phe7、Gly8-Leu9、Lys10-Leu11、Arg13-Ile14、Ser16-Met17及Gly19-Leu20。在一實施例中，本揭示案涵蓋一種CNP變異體，其(1)經修飾以使其總體大小或分子量增至例如以下範圍：約2.6 kDa或2.8 kDa至約4 kDa、4.2 kDa、4.4 kDa、4.6 kDa、4.8 kDa、5 kDa、5.2 kDa、5.4 kDa、5.6 kDa、5.8 kDa、6 kDa、6.2 kDa、6.4 kDa或至約7 kDa、7.2 kDa或約8.2 kDa，及/或(2)在某些胺基酸位置經修飾以降低其在1、2、3、4、5或所有6個上列位點對NEP裂解之敏感性。CNP變異體之大小或分子量可藉由多種方式增大，例如藉由將其它胺基酸及/或其它種類之化學(例如天然或合成聚合)基團共軛至胜肽序列之例如N端、C端及/或側鏈，及/或藉由使用天然胺基酸、非天然胺基酸及/或具有較龐大側鏈之胜肽模擬物。視情況進一步使CNP變異體共軛至其它功能或結構部分。視情況與本文所述之任何實施例組合，可將突變(例如取代、添加及/或缺失)引入CNP22之某一(某些)位置以降低CNP變異體對NPR-C之親和力。在不影響NEP抗性或CNP活性之情況下，可進行其它修飾，例如保守性取代，或在此項技術中已知之其它修飾。
在一實施例中，CNP變異體由以下通式表示：(x)-Gly1 -Leu2 -Ser3 -Lys4 -Gly5 -Cys6 -Phe7 -Gly8 -Leu9 -Lys10 -Leu11 -Asp12 -Arg13 -Ile14 -Gly15 -Ser16 -Met17 -Ser18 -Gly19 -Leu20 -Gly21 -Cys22 -(z)(SEQ ID NO: 5)，其中：在對應於一或多個以下CNP殘基之位置：Gly1、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、Lys10、Leu11、Ile14、Gly15、Ser16、Met17、Gly19、Leu20及Gly21，CNP變異體包含一或多個經修飾之胺基酸，其可產生經修飾之胜肽鍵(例如經由使用胜肽鍵電子等排體)；及(x)及(z)獨立地可不存在或可為來源於利鈉多肽(例如NPPC、ANP、BNP)或非利鈉多肽(例如人類血清白蛋白(HSA)、IgG等)之胺基酸序列。
在一實施例中，CNP變異體包括：(1)在對應於CNP22之位置6、7或8(Cys6、Phe7或Gly8)之一的胺基酸位置處之修飾；(2)在位置1-5(Gly1、Leu2、Ser3、Lys4及Gly5)之任何或所有胺基酸的視情況存在之缺失、添加及/或取代；及(3)視情況至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個在對應於位置6-22之位置處的其它修飾(缺失、添加及/或取代)，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個修飾可為保守性取代或本文所述或在此項技術中已知之其它取代。
應瞭解，以編號提及特定胺基酸位置(例如CNP22之位置7)係指任何CNP變異體中對應的胺基酸位置，即使該CNP變異體中之位置編號因前述插入或缺失而發生變化亦如此。舉例而言，對於前五個胺基酸已缺失之CNP變異體，提及「位置7」或「Phe7」將意謂相應位置2。類似地，對於一個胺基酸已添加至N端之CNP變異體，提及「位置7」意謂對應位置8。
在本文所述之任何實施例中，CNP變異體可經由對應於CNP22之6與22之位置之間的共價鍵環化。涵蓋使用此項技術中已知之任何方法形成共價鍵。在另一實施例中，CNP變異體可經由位於胜肽之N端或靠近N端之胺基酸與C端或靠近C端之胺基酸(出於此目的稱為「末端」胺基酸)之間所形成的共價鍵來環化。在一實施例中，在兩個末端胺基酸之側鏈之間或對應於CNP22之6與22之位置的胺基酸之間形成共價鍵。在另一實施例中，在一個末端胺基酸之側鏈與另一末端胺基酸之末端基團之間，或在各末端胺基酸之末端基團之間形成共價鍵。舉例而言，末端胺基酸之間或對應於CNP22之6與22之位置的胺基酸之間所形成的共價鍵可能為頭至尾鍵、側鏈至側鏈鍵、側鏈至頭鍵或側鏈至尾鍵。
在一實施例中，本揭示案提供一種對NEP之親和力降低，及/或對NEP裂解之抗性較大及/或活體內血清半衰期增加，同時保留CNP之功能性(例如刺激cGMP產生)的CNP變異體。NEP由於其活性位點腔隙之尺寸有限而較佳識別小於約3 kDa之受質(Oefner,J. Mol. Biol.,296: 341-349(2000))。在一實施例中，例如藉由添加約0.6 kDa至約5 kDa之胺基酸、親水性或水溶性聚合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或碳水化合物來修飾CNP變異體，以使其總體分子量增至約2.6 kDa或2.8 kDa至約4、4.6、5、5.2、5.8、6、6.4或7 kDa之範圍。在特定例示性實施例中，CNP變異體之分子量在約2.6 kDa與約7 kDa之間，或在約2.8 kDa與6 kDa之間，或在約2.8 kDa與約5.8 kDa之間。在某些實施例中，添加至少約0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6或1.8 kDa，或至多2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8或5 kDa，以使CNP變異體之總體分子量增至例如約2.6或2.8 kDa至約4 kDa、4.2 kDa、4.4 kDa、4.6 kDa、4.8 kDa、5 kDa、5.2 kDa、5.4 kDa、5.6 kDa、5.8 kDa、6 kDa、6.2 kDa、7.2 kDa、8.2 kDa或更高之範圍。在一些實施例中，此等CNP變異體包含與CNP22之胺基酸6-22至少約70%、75%、80%、85%、90%或95%一致或同源之胺基酸序列。在其它實施例中，此等CNP變異體包含1、2、3、4、5、6或7個胺基酸之取代、插入或缺失，其中該或該等胺基酸為另一天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物。儘管預想保守性取代與非保守性取代或插入均可在任何位置進行，但可例如藉由保守性取代開始將修飾引入此項技術中已鑑別與CNP活性或NPR-B結合有關之區域中，而非保守性取代可在先前已顯示容許修飾之彼等區域中進行。
在另一實施例中，CNP變異體包含在Cys6與Cys22之間具有完整環化部分，且具有含有約1-40、1-20、5-40、5-35、10-35、15-35、5-31、10-31或15-31個胺基酸且為來源於CNP多肽及/或非CNP多肽之片段的N端尾及/或C端尾的CNP。在一實施例中，此等CNP變異體之分子量在約2.8 kDa至約4、4.6、5、5.2、5.8、6、6.4或7 kDa之範圍內。此等CNP變異體之非限制性實例包括野生型CNP22；或具有一或多個胺基酸取代(例如K4R取代)之CNP22，其具有來源於以下之N端及/或C端延伸：人類或其它物種之利鈉胜肽前驅體序列(例如ANP、BNP或CNP)；具有胺基酸取代、添加及/或缺失之利鈉胜肽前驅體C(NPPC)變異體(例如該等CNP變異體可為CNP-53之截短形式，其產生分子量在約2.8 kDa與5.8 kDa之間的胜肽)；或其它非CNP多肽，諸如血清白蛋白或IgG蛋白(例如該等CNP變異體可為含有人類或其它物種之血清白蛋白或IgG之片段的CNP嵌合體)。
在一實施例中，總質量特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6 kDa或2.8 kDa至約6 kDa或7 kDa)、經設計以便增強對NEP降解之抗性的CNP變異體係由以下通式表示：(x)-Gly1 -Leu2 -Ser3 -(b)4 -Gly5 -Cys6 -Phe7 -Gly8 -Leu9 -(h)10 -Leu11 -Asp12 -Arg13 -Ile14 -Gly15 -Ser16 -Met17 -Ser18 -Gly19 -Leu20 -Gly21 -Cys22 -(z)(SEQ ID NO: 6)，其中：(x)　為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團之非限制性實例為聚乙二醇(PEG，亦稱為聚環氧乙烷(PEO))，且天然聚合基團之非限制性實例為含有1至35個胺基酸且來源於以下之胺基酸序列：NPPC或其具有取代及/或缺失之變異體、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或胜肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組胺酸之醣蛋白、纖維結合蛋白、血纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素(osteocrin)或纖維母細胞生長因子2(FGF2)；(z)　可不存在或可為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團之非限制性實例為PEG，且天然聚合基團之非限制性實例為來源於利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP或BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)之胺基酸序列；且(b)及(h)可各自獨立地為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或經側鏈上不具有反應性一級胺之任何天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、Gly、6-羥基-正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、Gln、Glu或Ser)置換。在一實施例中，(b)為Arg。在另一實施例中，為改良NEP抗性，(b)不為Gly。在又一實施例中，(h)不為Arg。
來源於NPPC或其變異體之胺基酸序列的非限制性實例包括：Arg；Glu-Arg；Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO:7)；Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO: 8)；Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO: 9)；Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO: 10)；Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO: 11)；Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO: 12)；Gly-Ala-Asn-Arg-Met(SEQ ID NO: 13)；Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(SEQ ID NO: 14)；Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(SEQ ID NO: 15)；Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO: 16)；Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO: 17)；Asp-Leu-Arg-Va1-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-A1a-A1a-Trp-A1a-Arg(SEQID NO：18)；G1n- G1u- His- Pro-Asn-A1a-Arg-Lys-Tyr-Lys-G1y-A1a-Asn-Lys-Lys(SEQID NO：19)；G1n- G1u- His- Pro-Asn-A1a-Arg-Lys-Tyr-Lys-G1y-A1a-Asn-Arg-Arg(SEQID NO：20)；Asp-Leu-Arg-Va1-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-A1a-A1a-Trp-A1a-Arg-Leu-Leu-G1n-G1u-His-Pro-Asn-A1a-Arg-Lys-Tyr-Lys-G1y-A1a-Asn-Lys-Lys(SEQID N O：21)；及Asp-Leu-Arg-Va1-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-A1a-A1a-Trp-A1a-Arg-Leu-Leu-G1n-G1u-His-Pro-Asn-A1a-Arg-Lys-Tyr-Lys-G1y-A1a-Asn-Arg-Arg(SEQID N O：22)。
來源於非CNP多肽(諸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)之胺基酸序列的非限制性實例包括：Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID N O：23)；Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQID N O：24)；Ser-Pro-Lys-Met-Va1-G1n-G1y-Ser-G1y(SEQ ID N O：25)；Met- Va1-G1n-G1y-Ser-G1y(SEQ ID N O：26)；Lys-Va1-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQID N O：27)；Lys-Va1-Leu-Arg-Arg-His(SEQID N O：28)；G1y-G1n-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQID NO：29)；G1y-Va1-Pro-G1n-Va1-Ser-Thr-Ser-Thr(SE Q ID N O：30)；G1y-G1u-Arg-A1a-Phe-Lys-A1a-Trp-A1a-Va1-A1a-Arg-Leu-Ser-G1n(SEQID NO：31)；及G1y-G1n-Pro-Arg-G1u-Pro-G1n-Va1-Tyr- Thr- Leu- Pr o- Pr o- Ser(SEQID NO：32)。
在一實施例中，CNP22或其變異體之N端及/或C端可獨立地共軛至含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、3 6、 37 、 38、 39或40個胺基酸之胺基酸延伸。在一實施例中， 胺基酸延伸來源於NPPC、CNP53、ANP或BNP。在一特定實施例中，胺基酸延伸為G1n- G1u- His- Pro- As n- A1a- Arg- Lys-Tyr-Lys-G1y-A1a-Asn-Lys-Lys(SEQ ID N O： 33)。在一相關實施例中，將此15個胺基酸之延伸添加至N端以提供下式之C NP變異體：G1n-G1u-His-Pro-As n- A1a- Ar g- Lys- Tyr-Lys-G1y-A1a-Asn-Lys-Lys-G1y1 -Leu2 -Ser3 -(b)4- G1y5- Cys6- Phe7-G1y8-Leu9-(h)10-Leu11-Asp1 2-Arg1 3-I1e1 4-G1y15 -Ser1 6-M et1 7-Ser18-G1y19-Leu20-G1y21 -Cys22 -(z)(SEQID N O： 34)。
在一實施例中，CNP變異體包含N端及/或C端共軛至親水性聚合物(例如PEG)以使其總體分子大小增至約2.6kDa 或2 .8kDa至約4、5、6或7kDa之範圍的wtCNP22或其變異體(例如具有添加、缺失及/或取代(諸如K4R取代)之變異體)(SEQID NO：35)。此等CNP變異體視情況在N端及/或C端進一步共軛至包含例如胺基酸、碳水化合物、疏水性酸及/或磷脂之聚合基團，該聚合基團之一非限制性實例為含有1至35個、或5至31個胺基酸之N端胺基酸延伸。在一實施例中，將至少約0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、 1.6或1.8kDa或至多2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、 3.4、 3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8或5kDa之親水性聚合(例如PEG)部分添加至wtCNP22或其變異體之N端及/或C端。
如本文中所示，約0.6kDa或更高之親水性或水溶性PEG(或PEO)聚合物共軛至CNP22或其變異體一般會顯著增強對NEP裂解之抗性。然而，將PEG(即使小至0.6kDa)添加至wtCNP22可能會降低CNP功能性(例如刺激cGMP信號傳導)，且將大於約2kDa或3kDa之PEG添加至CNP22或其變異體可能會以尺寸依賴性方式降低CNP功能活性。但當使約0.6kDa至約1.2kDa或可能達約2kDa之PEG(或PEO)聚合物共軛至具有N端胺基酸延伸之CNP變異體時，CNP功能性得以保留(至少與wtCNP22之功能性相當)，其中至少一個在生理條件下可潛在地帶正電荷的相對較大胺基酸(例如精胺酸)緊接於對應於CNP22之G1y1之位置之前， 諸如GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)、GANPR-CNP22(K4R)(SEQID NO：37)、ER-CNP22(SEQID NO：38)、ER-CNP22(K4R)(SEQID NO：39)、R-CNP22(SEQID NO：40)及R-CNP22(K4R)(SEQIDNO：41)。
因此，在一實施例中，聚乙二醇化CNP變異體在CNP22或其變異體(例如具有K4R取代之變異體)之N端包含含有至少1、2、3、4或5個胺基酸之胺基酸延伸，其中使PEG聚合物共軛至經胺基酸延伸之CNP變異體之N端以產生特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)以便增強對NEP裂解之抗性的總質量。在一實施例中， 為增強CNP之功能性，此等聚乙二醇化且經胺基酸延伸之CNP變異體含有至少一個緊接於對應於CNP22之G1y1之位置之前的在生理條件下可潛在地帶正電荷之相對較大天然或非天然胺基酸。在一特定實施例中，聚乙二醇化且經胺基酸延伸之CNP變異體含有至少一個緊接於對應於CNP22之G1y1之位置之前的精胺酸殘基。
除在N端及/或C端共軛至親水性或水溶性聚合物(諸如PEG(或PEO))之CNP變異體外，本發明亦涵蓋在內部位點共軛至該種聚合物之CNP變異體。本文中為簡明起見，將使用PEG(或PEO)作為親水性或水溶性聚合物之代表性實例。CNP變異體可能在各種位點聚乙二醇化，包括(但不限於)： (1)僅在N端聚乙二醇化；(2)僅在C端聚乙二醇化；(3)僅在內部位點(例如Lys4)聚乙二醇化；(4)在N端與C端皆聚乙二醇化；(5)在N端及內部位點聚乙二醇化；及(6)在C端及內部位點聚乙二醇化。為增強對NEP降解之抗性及保留CNP功能性，在某些實施例中，聚乙二醇化CNP變異體之總質量的特徵在於本文一般描述之範圍，例如在約2.6kDa或2.8kDa至約4、5、6或7kDa之範圍內。在一特定實施例中，CNP17、CNP22、CNP37(下文定義)或其變異體(包括具有胺基酸添加、取代及/或缺失之變異體)僅在N端聚乙二醇化。在另一實施例中，CNP變異體僅在內部位點(例如Lys4)聚乙二醇化。在另一實施例中，CNP變異體在N端及內部位點(例如Lys4)聚乙二醇化。在又一實施例中，為得到更佳功能性，CNP變異體不在環狀域(對應於CNP22之Cys6至Cys22)內之位點(例如Lys10)聚乙二醇化。為防止在內部位點聚乙二醇化，可以在側鏈上不含反應性一級胺基的天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(諸如G1y、 Ser、Arg、Asn、G1n、Asp、G1u或瓜胺酸(Cit))取代Lys4及/或 Lys10。在一特定實施例中，Lys4及/或 Lys10經Arg置換。在另一實施例中，Lys10不經Arg置換。
本揭示案涵蓋使用可在以下方面不同之親水性或水溶性聚合物(例如PEG分子)：類型(例如均聚物或共聚物；無規共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；線性或分支；單分散或多分散)、鍵聯(例如可水解鍵或穩定鍵聯，諸如醯胺、 亞胺、胺、伸烷基或酯鍵)、共軛位點(例如在N端及/或C端，較佳不在CNP之環化區(對應於CNP22之殘基6-22)中之任何殘基處)，及長度(例如約0.2、0.4或0.6kDa至約2、3、4或5kDa)。親水性或水溶性聚合物可藉助於此項技術中已知之基於N-羥基丁二醯亞胺(NHS)或基於醛之化學或其它化學共軛至CNP胜肽。此等CNP變異體可使用以下產生：例如wtCNP-22(2.2kDa)、僅保留wtCNP22之環化區(殘基6-22)的CNP-17、在CNP22之N端及/或C端具有胺基酸延伸之CNP變異體，或具有胺基酸取代、添加及/或缺失之變異體，例如GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)、 GANPR-CNP22(K4R)(SEQID NO：37)、R-CNP22(SEQIDNO：40)、R-CNP22(K4R)(SEQID NO：41)、ER-CNP22(SEQID NO：38)及ER-CNP22(K4R)(SEQID NO：39)。 在一實施例中，總質量之特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6或7kDa)之PEG- CNP變異體含有經由基於NHS或基於醛之化學共軛於N端及/或C端的單分散性線性PEG(或PEO)基團，或經由基於NHS之化學共軛於N端及/或C端的兩臂或三臂分支PEG基團。本揭示案進一步涵蓋經設計以降低腎清除率之帶負電PEG- CNP變異體，包括(但不限於)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物。
在一相關實施例中，本揭示案涵蓋PEG-CNP共軛物，其包含基於NHS或基於醛之式(CH2 CH2 O)n 之PEG，其中n 為12至50之整數，且PEG聚合物之分子量為至多約2.5kDa 。在一特定實施例中，n為12或24。在一實施例中，PEG聚合物之末端羥基經非反應性基團封端。在一特定實施例中，封端基團為烷基，例如低碳烷基，諸如甲基。
在另一實施例中，PEG聚合物或其衍生物具有約0.4kDa 至約2.5kDa或約0.6kDa至約1.5kDa範圍內的聚合物數目平均分子量。
在另一實施例中，使wtCNP或CNP變異體胜肽共軛至包括例如雙膦酸鹽、碳水化合物、疏水性酸(包括脂肪酸)或胺基酸序列之部分。此等胺基酸序列包括例如適用於靶向骨/軟骨之聚Asp或聚G1u，或可來源於具有已闡明骨靶向域之骨蛋白或其衍生物，諸如骨橋蛋白(osteopon tin )、骨鈣化素(osteoca1cin)、涎蛋白(sia1oprotein)等之融合蛋白或胜肽序列。在本文所述之CNP22或其變異體連接至骨或軟骨靶向部分的實施例中，該種部分係設計成促進經修飾之CNP胜肽到達骨生長板之軟骨細胞，該胜肽可在此處結合並活化軟骨細胞上之NPR-B。
在另一實施例中，本揭示案提供具有不太易於被胜肽酶(包括NEP)裂解之胜肽鍵的CNP變異體。本揭示案涵蓋在內肽酶裂解位點包含至少一個經修飾殘基的CNP變異體。在一實施例中，CNP中NEP裂解位點處之Cys6-Phe7胜肽鍵(-C(=O)-NH-)可經任一以下胜肽鍵電子等排體置換：-CH2-NH-，-C(=O)-N(R)-，其中醯胺基係經任何以下R基團烷基化：甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基，-C(=O)-NH-CH2 -，-CH2-S-，-CH2 -S(O)n -，其中n為1或2，-CH2-CH2-，- CH=CH-，-C(=O)-CH2 -，-CH(CN)-NH-，-CH(OH)-CH2 -，-O-C(=O)-NH-，及-NHC(=O)NH-。
在另一實施例中，Phe7經其對映異構體D-Phe取代。在另一實施例中，將D-對映異構體引入wtCNP-22內之一或多個(至多所有22個)位置。在另一實施例中，用β胺基酸(諸如3-胺基-2-苯基丙酸)取代Phe7，此在減小側鏈長度之同時增加主鏈長度。在另一實施例中，本揭示案涵蓋Cys 6位置之Cys類似物，包括(但不限於)高半胱胺酸、青黴胺、2-巰基丙酸及3-巰基丙酸。
即使在Cys6與Phe7之間存在NEP抗性鍵，其它胜肽鍵(包括G1y8-Leu9、Lys10-Leu11、Arg13- I1e14、Ser16- M et17及G1y19-Leu20)亦可能會被NEP水解。因此，本揭示案涵蓋在CNP類似物主鏈中多個位置處含有胜肽鍵電子等排體之CNP類似物。在一實施例中，CNP類似物或變異體在一個以上胜肽酶裂解位點處包含修飾。在另一實施例中，此變異體包含在結合於NEP活性位點中重要之胺基酸殘基處具有取代藉此增強對NEP降解之抗性的CNP。一或多個N EP結合殘基(包括(但不限於)G1y8、G1y15、Ser 18、G1y19及/或G1y21)經較大尺寸之天然或非天然胺基酸殘基置換以降低對NEP活性位點之親和力。在另一實施例中，NEP識別所必需的一或多個疏水性殘基(包括(但不限於)Phe7、 Leu9、Leu11、I1e14、M et17及Leu20)經降低NEP結合之天然或非天然胺基酸及/或胜肽模擬物取代。在另一實施例中，CNP之前五個胺基酸中之一至五個可缺失或經任何其它天然胺基酸或非天然胺基酸或胜肽模擬物取代， 或可將一或多個天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物添加至CNP之前五個位置中之任一位置或所有位置。
在另一實施例中，CNP變異體具有特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa )之總質量，且由下式表示：(x)-G1y1 -Leu2-Ser3-(a)4-G1y5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg1 3-(h)1 4-G1y15 -Ser1 6-(i)1 7-Ser1 8-G1y1 9-(j)20-G1y21-Cys22-(z)(SE QIDNO：46)，其中：(x)可不存在，或可選自由以下組成之群：合成骨靶向化合物，諸如雙膦酸鹽；適用於靶向骨或軟骨之胺基酸序列，諸如聚Asp及聚G1u；來源於具有已闡明骨靶向域之骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等之融合蛋白或胜肽序列)之胺基酸序列；降低腎清除率之聚合或非聚合分子，諸如帶電PEG分子；及延伸，包含例如聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或胺基酸，且其中此等胺基酸延伸可含有例如1至31個，或1至35個，或5至35個，或10至35個，或15至35個胺基酸殘基，且可來源於NPPC、ANP、BNP、其它非CNP多肽或胜肽(諸如血清白蛋白或IgG)，或具有取代、添加及/或缺失之上述多肽之變異體，或其組合；(z)可不存在，或可選自由以下組成之群：適用於靶向骨或軟骨之胺基酸序列，諸如聚Asp及聚G1u；來自骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)之骨靶向域的胺基酸序列；及來源於非CNP多肽或胜肽(諸如ANP或BNP)之胺基酸序列；(a)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基-正白胺酸、 瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg；(b)係選自由Cys、及Cys6與Phe7之間的胜肽鍵電子等排體(諸如Cys-CH2 -NH)組成之群；(c)係選自由以下組成之群：L-Phe；D- Phe ；3- 胺基- 2- 苯基丙酸；Phe之N-烷基化衍生物，其中N- 烷基為甲基、乙基、 正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基；及Phe類似物，其中Phe 類似物之苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、羥基、氰基、直鏈或分支鏈C1-6烷基、 直鏈或分支鏈C1-6 烷氧基、直鏈或分支鏈鹵基-C1-6烷基、C3- 10環烷基、雜環基、C6 -14 芳基及雜芳基(實例包括(但不限於)酪胺酸、3-氯苯丙胺酸、2，3- 氯- 苯丙胺酸、 3-氯-5-氟-苯丙胺酸、2-氯-6-氟- 3- 甲基- 苯丙胺酸)， 或其中Phe類似物之苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙胺酸及2-萘基丙胺酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙胺酸、噻吩基丙胺酸及呋喃基丙胺酸)置換；(d)係選自由以下組成之群：G1y、第三丁基-G1y(tBu- G1y)、Thr、Ser、Va1及 Asn；(e)係選自由以下組成之群：Leu、Ser、Thr 及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu ；(f)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基-正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(f)不為Arg；(g)係選自由以下組成之群：Leu及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-Leu；(h)係選自由以下組成之群：I1e、tBu-G1y、及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-I1e；(i)係選自由以下組成之群：Met、Va1、Asn、β-C1-A1a、2-胺基丁酸(Abu)及2-胺基-異丁酸(Aib)；且(j)係選自由以下組成之群：Leu、正白胺酸(N1e)、高白胺酸(homo1eucine)(H1eu)、Va1、第三丁基-A1a(tBu-A1a)、Ser、Thr、Arg、及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-Leu。
在一實施例中，CNP變異體在位置6、7、8、9、10、11、13、14、16、17、19及/或20中一或多個位置處包含修飾，且可視情況在本文所揭示之任何其它位置處具有修飾。
在本文所述之CNP22或其變異體可連接至疏水性酸之實施例中，CNP胜肽可連接至一或多個疏水性酸。疏水性酸之非限制性實例包括直鏈或分支鏈、飽和或不飽和C5 -C12 羧酸(例如戊酸、庚酸等)及天然脂肪酸。疏水性酸可連接至一或多個胺基酸殘基之N端、C端及/或側鏈。在一實施例中，疏水性酸共軛至N端。在一實施例中，CNP22或其變異體與疏水性酸之共軛法係經過特別設計，以促進經修飾CNP胜肽與血清白蛋白之間的非特異性相互作用，藉此增大CNP胜肽之尺寸並保護其避免被蛋白酶(諸如NEP)裂解。與疏水性酸共軛之CNP胜肽與白蛋白之間的相互作用之設計不能太強，以使經修飾CNP胜肽可擴散穿過軟骨，到達骨生長板之軟骨細胞，且結合及活化NPR- B。
在另一實施例中，本揭示案提供CNP變異體，其在活體外或活體內刺激產生cGMP，其產量為相同濃度wtCNP22(例如1μM)下之cGMP產量的至少約50%、60%、70%、 80%、 90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%，在位置(b)6 、(c)7 及/或(d)8 包含至少一個經修飾胺基酸，且由以下通式表示：(x)-G1y1-Leu2-Ser3-(a)4-G1y5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)1 0-(g)11 -Asp12-Arg13-(h)14-G1y15-Ser1 6-(i)1 7-Ser1 8-G1y1 9-(j)20-G1y21 -Cys22-(z)(SEQID NO：47)，其中：(x)可不存在，或可為含有1至5個胺基酸且來源於如本文所述之利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP或BNP)或非利鈉多肽(例如HSA、IgG、骨靶向蛋白等)的胜肽序列；(z)可不存在，或可選自由以下組成之群：合成骨靶向化合物，諸如雙膦酸鹽；適用於靶向骨/軟骨之胺基酸序列，諸如聚Asp及聚G1u；具有骨靶向域之骨蛋白及其衍生物，諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白之融合蛋白或胜肽序列；降低腎清除率之分子，諸如帶電PEG；及如本文所述增強CNP對NEP介導降解之抗性的分子；(a)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基-正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg；(b)可為Cys或去羧基半胱胺酸，或(b)6-(c)7胜肽鍵(-C(=O)-NH-)可經任一以下胜肽鍵電子等排體置換： -CH2-NH-，-C(=O)-N(R)-，其中醯胺基經任何以下R基團烷基化： 甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基，-C(=O)-NH-CH2 -，-CH2-S-，-CH2 -S(O)n -，其中n為1或2，-CH2-CH2-，- CH=CH- ，-C(=O)-CH2 -，-CH(CN)-NH-，-CH(OH)-CH2 -，-O-C(=O)-NH-，或-NHC(=O)NH-；(c)係選自由以下組成之群：L-Phe；D-Phe；3-胺基-2-苯基丙酸；Phe之胜肽鍵電子等排體，諸如Phe之N-烷基化衍生物，其中N-烷基係選自由甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基及第三丁基組成之群；及Phe類似物，其中Phe類似物之苯環的一或多個鄰位、 間位及/或對位經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、羥基、氰基、直鏈或分支鏈C1-6 烷基、直鏈或分支鏈C1-6 烷氧基、直鏈或分支鏈鹵基-C1-6 烷基、C3-10環烷基、 C6- 14芳基、雜環基及雜芳基(實例包括(但不限於)酪胺酸、3-氯苯丙胺酸、2，3-氯-苯丙胺酸、3- 氯- 5- 氟-苯丙胺酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙胺酸)，或其中Phe 類似物之苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1- 萘基丙胺酸及2-萘基丙胺酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙胺酸、噻吩基丙胺酸及呋喃基丙胺酸)置換；(d)係選自由以下組成之群：G1y、第三丁基-G1y(tBu- G1y)、Va1、Ser、Thr及 Asn；(e)係選自由以下組成之群：Leu、Ser、Thr 、及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu ：(f)為側鏈上不具有反應性一級胺基之任何天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物，包括(但不限於)Arg、G1y、6- 羥基-正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u，其中在一實施例中，(f)不為Arg；(g)係選自由以下組成之群：Leu及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu；(h)係選自由以下組成之群：I1e、tBu-G1y及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- I1e；(i)係選自由以下組成之群：Met、Va1、Asn、β-C1- A1a、 2-胺基丁酸(Abu)及2-胺基-異丁酸(Aib)；且(j)係選自由以下組成之群：Leu、正白胺酸(N1e)、高白胺酸(H1eu)、Va1、第三丁基-A1a(tBu-A1a)、Ser、 Thr、 Arg、及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-Leu。
在另一實施例中，本揭示案涵蓋CNP變異體，其在活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22(例如1μM)下所產生之cGMP量的至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%，具有特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)之總質量以增強對NEP降解之抗性，且由以下通式表示：(x)-(y)-Cys6 -Phe7 -G1y8 -Leu9 -(h)10 -Leu11 -Asp12 -Arg13-I1e14-G1y15- Ser1 6-Met1 7-Ser18 -G1y1 9-Leu2 0-G1y21 -Cys22-(z)(SE Q ID N O：48)，其中：(x)為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團之非限制性實例為聚乙二醇(PEG)，且天然聚合基團之非限制性實例為含有1至35個胺基酸且來源於以下之胺基酸序列：NPPC或其具有取代及/或缺失之變異體、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或胜肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組胺酸之醣蛋白、纖維結合蛋白、血纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素或FGF2；(y)可不存在，或可為一或多個來自G1y1 -Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (對應於CNP22之位置1至5)(SEQ ID NO: 1)之胺基酸及/或在一或多個彼等位置使用天然或非天然胺基酸之取代(例如K4R取代)；(h)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基- 正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(h)不為Arg；且(z)可不存在，或可為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團之非限制性實例為PEG，且天然聚合基團之非限制性實例為來源於利鈉多肽(例如NPPC、CNP、 ANP或BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)之胺基酸序列。
在一實施例中，(x)、(y)與(z)總共含有約10至約40個，或約15至約35個胺基酸。在另一實施例中，(x)為包含1至40個胺基酸或1至20個胺基酸之胺基酸序列。
進一步涵蓋在活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22(例如1μM)下所產生之cGMP量的至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%且包含以下序列之CNP變異體：(y)-Cys6-Phe7-G1y8-Leu9 -Lys10 -Leu11 -Asp12 -Arg13 -I1e14 -G1y15 -Ser16-Met17-Ser18-G1y1 9-Leu20-G1y21 -Cys22(SEQ ID N O：138)，其中：(y)包含一或多個選自Gly1 -Leu2 -Ser3 -Lys4 -Gly5 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸及/或在一或多個彼等位置使用天然或非天然胺基酸之取代(例如K4R取代)，且進一步包含分子量為約0.6 kDa至約5 kDa之親水性或水溶性聚合物。在一實施例中，親水性或水溶性聚合物共軛至此經胺基酸延伸之CNP變異體的N端。在另一實施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG(或PEO)。
在另一實施例中，本揭示案提供在活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22(例如1μM)下所產生之cGMP量之至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%的CNP變異體，其中該等CNP變異體包含含有1至15個胺基酸之N端及/或C端胜肽延伸，且共軛至親水性或水溶性聚合物。在一實施例中，胜肽延伸含有5至10個胺基酸。在一特定實施例中，胜肽延伸含有5個胺基酸。在另一特定實施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG(或PEO)。
在另一實施例中，本揭示案之CNP變異體在活體外或活體內外刺激產生在相同濃度wtCNP22(例如1μM)下所產生之cGMP量之至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或150%，且包含至少一個來源於利鈉胜肽前驅體C(NPPC)之15個胺基酸之片段，其中該片段與含有相同數目胺基酸殘基之野生型NPPC之序列至少70%同源。
在又一實施例中，CNP變異體具有特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)之總質量以便增強NEP抗性，且由下式表示：(x)-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)1 0-(g)11 -Asp1 2-Arg13-(h)14-G1y15-Ser1 6-(i)1 7-Ser1 8-G1y1 9-(j)20-G1y21 -Cys22-(z)(SEQ ID NO：其中：(x)可不存在(亦即，以-NH2 基團為N末端)，或可選自由以下組成之群： 來自胜肽G1y1 -Leu2 -Ser3 -Lys4 -G1y5 (SEQ IDNO：1)之1、2、3、4或5個胺基酸之序列；適用於靶向骨/軟骨之胺基酸序列，諸如聚Asp或聚G1u；來自骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素或涎蛋白)之骨靶向域；降低腎清除率之分子，諸如親水性或水溶性聚合物，包括(但不限於)帶電PEG分子；及包含PEG、碳水化合物、疏水性酸、胺基酸或其組合之部分，其中此等部分可為胺基酸延伸，包括(但不限於)來源於NPPC或非CNP多肽或胜肽(諸如BNP、 ANP、血清白蛋白或IgG)之胺基酸序列；(z)可不存在，或可選自由以下組成之群：適用於靶向骨/軟骨之胺基酸序列，諸如聚Asp或聚G1u；來源於骨靶向蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素或涎蛋白)之胺基酸序列；及來源於如本文所述之NPPC或非CNP多肽或胜肽之胺基酸序列；(b)係選自由以下組成之群：Cys、及Cys6與Phe 7之間的胜肽鍵電子等排體，諸如Cys-CH2 -NH；(c)係選自由以下組成之群：L-Phe；D-Phe ；3- 胺基- 2- 苯基丙酸；Phe之N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基；及Phe類似物，其中Phe類似物之苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、羥基、氰基、直鏈或分支鏈C1-6 烷基、直鏈或分支鏈C1-6 烷氧基、直鏈或分支鏈鹵基-C1 -6 烷基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、雜環基及雜芳基(實例包括(但不限於)酪胺酸、3-氯苯丙胺酸、2，3-氯-苯丙胺酸、3-氯-5-氟-苯丙胺酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙胺酸)，或其中Phe類似物之苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙胺酸及2-萘基丙胺酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙胺酸、噻吩基丙胺酸及呋喃基丙胺酸)置換；(d)係選自由以下組成之群：G1y、第三丁基-G1y(tBu-G1y)、Va1、Ser、Thr及 Asn；(e)係選自由以下組成之群：Leu、Ser、Thr、及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-Leu；(f)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基-正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(f)不為Arg；(g)係選自由以下組成之群：Leu及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-Leu；(h)係選自由以下組成之群：I1e、tBu-G1y及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-I1e；(i)係選自由以下組成之群：Met、Va1、Asn、β-C1-A1a、2-胺基丁酸(Abu)及2-胺基-異丁酸(Aib)；且(j)係選自由以下組成之群：Leu、正白胺酸(N1e)、高白胺酸(H1eu)、Va1、第三丁基-A1a(tBu-A1a)、Ser、Thr、Arg、及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu 。
在另一實施例中，CNP變異體具有特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa )之總質量以便增強NEP抗性，且其由下式表示；(x)-G1y1-Leu2-Ser3-(a)4-G1y5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)1 0-(g)11 -Asp1 2-Arg13-(h)14-(i)15-Ser16-(j)17-Ser1 8-G1y1 9-(k)20-G1y21 -Cys22-(z)(SE QIDNO：50)，其中：(x)及(z)獨立地可不存在，或可選自由以下組成之群：合成骨靶向化合物，諸如雙膦酸鹽；適用於靶向骨/軟骨之胺基酸序列，諸如聚Asp或聚G1u；來源於骨蛋白及其衍生物(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等之融合蛋白或胜肽序列)之骨靶向域的胺基酸序列；降低腎清除率之部分， 包括(但不限於)親水性或水溶性聚合物，諸如帶電PEG分子；及包含例如親水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸及/或胺基酸之部分；(a)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基- 正白胺酸、 瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg；(b)係選自由以下組成之群：Cys、及Cys6與Phe 7之間的胜肽鍵電子等排體，諸如Cys-CH2 -NH；(c)係選自由以下組成之群：L-Phe；D-Phe ；3- 胺基- 2- 苯基丙酸；Phe之N-烷基化衍生物，其中N- 烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基；及Phe類似物，其中Phe類似物之苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、羥基、氰基、直鏈或分支鏈C1-6 烷基、直鏈或分支鏈C1-6 烷氧基、直鏈或分支鏈鹵基-C1-6 烷基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、雜環基及雜芳基(實例包括(但不限於)酪胺酸、3-氯苯丙胺酸、2，3-氯-苯丙胺酸、3- 氯-5-氟-苯丙胺酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙胺酸)，或其中Phe類似物之苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙胺酸及2-萘基丙胺酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙胺酸、噻吩基丙胺酸及呋喃基丙胺酸)置換；(d)係選自由以下組成之群：G1y、第三丁基-G1y、Thr、Ser、Va1及 Asn；(e)係選自由以下組成之群：Leu、Ser、Thr及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-Leu；(f)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基-正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(f)不為Arg；(g)係選自由以下組成之群：Leu、Asn及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-Leu；(h)係選自由以下組成之群：I1e、第三丁基-G1y(tBu-G1y)、Asn及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-I1e；(i)係選自由以下組成之群：G1y、Ar g、Ser 及 As n；(j)係選自由以下組成之群：Met、Va1、Asn 、β- C1- A1a、 2-胺基丁酸(Abu)及2-胺基-異丁酸(Aib)；且(k)係選自由以下組成之群：Leu、正白胺酸(N1e )、高白胺酸(H1eu)、Va1、第三丁基-A1a(tBu-A1a)、Ar g、Thr 、Ser及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu 。
在另一實施例中，CNP變異體可在CNP22之位置1至22中任何一或多個位置具有胺基酸取代。在一實施例中，G1y1經Arg或 G1u取代。在另一實施例中，Lys4經Arg置換。在又一實施例中，G1y5經Arg、G1n 或 Ser取代。在另一實施例中， G1y15經Ser、Asn、Arg 或 Cit取代。在另一實施例中，G1y19經Ser、Arg 或 Asn取代。在另一實施例中，G1y21經 Ser、Thr或 Arg取代。
在一實施例中，CNP變異體係選自由以下組成之群：GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC(使用去羧基- Cys 形成)(SEQID NO：56)、GLSKGC-(N -Me-Phe)- GLKL DRIGSMSGLGC(SEQID NO：57)、GLSKGC-(D-Phe)-GL KL DRIGSMSGLGC(SEQIDNO： 136)、 GLSKGCF-(tBuG)-L KL DRIGSMSGLGC(SEQID NO：58)、GLSKGC-(3-C1-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQID NO： 137)及GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC(使用3-胺基-2-苯基丙酸形成)(SEQIDNO：59)。在另一實施例中， 在本文所述任何CNP變異體中Cys6、Cys 6位置處之去羧基-Cys或另一含氫硫基半胱胺酸類似物與Cys 22之間存在二硫鍵。
在另一實施例中，CNP變異體在CNP22或CNP17之N端及/或C端含有胺基酸延伸，包括(但不限於)：DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQIDNO：4)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，類似物BL)(SEQIDNO：60)；AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CA)(SEQIDNO：61)；AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CB)(SEQIDNO：62)；DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CC)(SEQIDNO：63)；RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：40)；ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：38)；GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：64)；GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：65)；GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：66)；GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：67)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQID NO：144)(在實例及圖中有時命名為「CNP27-HSA」或「HSA-CNP27」)；SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似物CD)(SEQID NO：68)(具有來源於BNP之N端及C端尾之CNP17)。
在另一實施例中，CNP變異體在CNP22之位置4處具有K4R取代。CNP(K4R)變異體之非限制性實例包括：GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物AY)(SEQIDNO：36)；GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CI)(SEQIDNO：37)；RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物AZ)(SEQ IDNO：41)；ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物BA)(SEQIDNO：39)；GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CH)(SEQIDNO：69)；及GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CG)(SEQIDNO：70)。
在一實施例中，具有PEG(或PEO)部分及N端胺基酸延伸的CNP變異體在緊接於對應於CNP22之G1y1的位置之前的位置含有精胺酸。此等聚乙二醇化CNP變異體經設計為增強對NEP降解之抗性、降低與血清白蛋白之結合且增強CNP功能活性(例如活化cGMP信號傳導)。聚乙二醇化CNP變異體之非限制性實例包括PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO： 36)、 PEO24-GANRR-CNP22(SEQID NO：65)、PEO12- GANRR- CNP22(SEQID NO：65)、PEO24-GANPR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：37)、 PEO12-GANPR-CNP22(K4R)(SEQID NO：37)、PEO24- GANPR-CNP22(SEQID NO：37)、PEO12-GANPR-CNP22(SEQIDNO：66)、PEO24-GANQQ-CNP22(SEQID NO：64)、PEO12-GANQQ-CNP22(SEQID NO：64)、PEO24-ER-CNP22(K4R)(SEQID NO：39)、PEO12-ER-CNP22(K4R)(SEQID NO：39)、PEO24-ER-CNP22(SEQID NO：38)、PEO12-ER-CNP22(SEQID NO：38)、PEO24-R-CNP22(K4R)(SEQID NO：41)、PEO12-R-CNP22(K4R)(SEQID NO：41)、PEO24-R-CNP22(SEQID NO：40)及PEO12-R-CNP22(SEQID NO：40)，其中PEO24為單分散性1.2kDaPEG聚合物且PEO12為單分散性0.6kDaPEG聚合物。在一實施例中，PEG(或PEO)聚合物連接至CNP變異體之N端。
其它CNP變異體包括(但不限於)CNP37之衍生物，該等衍生物在弗林蛋白酶裂解位點(加下劃線)具有突變，旨在提高對弗林蛋白酶之活體內抗性，及/或在麩醯胺酸之前具有甘胺酸(加下劃線)，旨在防止形成焦麩醯胺酸(pyrog1utamine)，該等衍生物包括(但不限於)： GQEHPNARKYKGAN PK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CS)(SEQID NO：71)；GQEHPNARKYKGAN QK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CT)(SEQID NO：72)；GQEHPNARKYKGAN QQ GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CU)(SEQIDNO：73)；GQEHPNARKYKGAN KP GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CW)(SEQID NO：74)；GQEHPNARKYKGAN KK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(G1y-CNP37，類似物DB)(SEQID NO：75)；PGQEHPNARKYKGAN KK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-G1y-CNP37)(SEQIDNO：145)。
在另一實施例中，CNP變異體為包含CNP22及N端胜肽片段之嵌合體，其包括(但不限於)：GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CQ)(富含組胺酸之醣蛋白(HRGP)片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO：76)；GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CR)(HRGP片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO：77)；GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CX)(HRGP片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO：78)；GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CF)(IgG1(Fc )片段-CNP22嵌合體)(SEQID NO：79)；GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CY)(人類血清白蛋白(HSA)片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO：80)；GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CE)(HSA片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO：81)；FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CZ)(骨織素「NPRC抑制劑」片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO：82)；及GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物DA)(FGF2「肝素結合域」片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO：83)。
在另一實施例中，CNP變異體為包含N端胜肽片段及CNP22(其中精胺酸取代CNP22之Lys4(「CNP22(K4R)」))之嵌合體，其包括(但不限於)：GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CK)(IgG1 (Fc )片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ IDNO：84)；GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CL)(HSA片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：85)；GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CM)(纖維結合蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：86)；GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CN)(血纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：87)；GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CO)(血纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：88)；及GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CP)(鋅指片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQID NO：89)。
在另一實施例中，CNP變異體為嵌合體或融合蛋白，其包含CNP胜肽或變異體，及可裂解胜肽或蛋白質，或胜肽標籤。例示性可裂解蛋白質或胜肽包括(但不限於)組胺酸(例如六HiS)標籤；TAF12：人類轉錄因子TAF12；KSI： 酮類固醇異構酶；MBP：麥芽糖結合蛋白；β-Ga1：β-半乳糖苷酶；GST：麩胱甘肽-S-轉移酶；Trx：硫氧化還原蛋白(thioredoxin)；CBD：甲殼素結合域；B MPM：B MP- 2突變、SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、鏈球菌蛋白、澱粉結合蛋白、內葡聚糖酶A之纖維素結合域、外葡聚糖酶Cex之纖維素結合域、生物素結合域、recA、F1ag、c-M yc 、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(G1n)、聚(Phe)、聚(Cys)、 綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、青色螢光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體抗原決定基及其片段。
在另一實施例中，CNP變異體可為單體或二聚體。在一相關實施例中，二聚CNP變異體之單體可經由連接子或不經連接子使N端連接至N端，經由連接子或不經連接子使N端連接至C端，或經由連接子或不經連接子使C端連接至C端。
包含IgG片段及CNP22或其變異體之嵌合體經設計為尤其增強對NEP降解之抗性且降低與血清白蛋白之結合。包含HSA之表面片段的CNP嵌合體經設計為尤其降低免疫原性且降低與血清白蛋白之結合。在N端含有富含組胺酸、無離胺酸、無精胺酸之陽離子性序列的HRGP- CNP22及HRGP-CNP22(K4R)嵌合體經設計為尤其增強對蛋白酶之穩定性。含有骨織素片段之嵌合體經設計以在骨生長板處在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)裂解後釋放骨織素片段，其中該片段將抑制清除受體NPR-C。關於包含FGF2肝素結合片段之嵌合體，結合於片段之肝素經設計以保護嵌合體避免降解，藉此提供較長血清半衰期。含有纖維結合蛋白、血纖維蛋白原或鋅指片段之嵌合體係設計為降低與血清白蛋白之結合，以及其它有利特徵。
不希望受理論束縛，與wtCNP22相比對NEP降解之抗性增強且具有類似或改良之功能性(例如結合於NPR-B及刺激cGMP信號傳導)的分子量為約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa之CNP變異體若不緊密結合於血漿蛋白(諸如血清白蛋白)，則可能更有效。不緊密結合於血漿蛋白(例如血清白蛋白)之CNP變異體可更有效地擴散穿過軟骨，到達骨生長板之軟骨細胞，且結合並活化NPR-B以進行cGMP信號傳導。在一實施例中，經設計為降低與血漿蛋白(例如血清白蛋白)之結合的CNP變異體為包含CNP22或其變異體及來自IgG之胜肽片段的嵌合體。在另一實施例中，經設計為降低與血漿蛋白之結合的CNP變異體為包含CNP22或CNP22(K4R)及來自多肽(例如IgG、HSA、纖維結合蛋白、血纖維蛋白原、含鋅指多肽等)之片段的嵌合體。在另一實施例中，經設計為降低與血漿蛋白之結合的CNP變異體包含CNP22或其變異體共軛至親水性或水溶性聚合物。在一實施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG(或PEO)。在另一實施例中，親水性或水溶性聚合物(例如PEG)經在生理條件下賦予聚合物負電荷之一或多個官能基(諸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其組合)官能化。
在本文所揭示之任何實施例中，CNP變異體可具有與野生型CNP22實質上相同或比其更佳的生物活性。舉例而言， CNP變異體例如就與NPR-B(GC-B)相互作用以刺激產生cGMP而言，可保留野生型CNP22活性之至少50%、60%、 70%、80%、90%、95%或更高，或可具有高於CNP22之活性。或者或另外，CNP變異體就調節軟骨內骨生長及軟骨細胞活性而言，可保留野生型CNP22活性之至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，或可具有高於CNP22之活性，包括(但不限於)軟骨細胞增殖、軟骨細胞分化、 有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-1)激酶信號傳導路徑之抑制，及促進軟骨內骨化。在本文所述之任何實施例中，CNP變異體可包含與野生型CNP22之胺基酸6-22或1-22至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、 95%或更高一致或同源的胺基酸序列。
在另一實施例中，本揭示案提供對NPR-C清除受體具有較小親和力，同時保留結合及活化NPR-B之能力的CNP22變異體。本揭示案涵蓋自或可自如實施方式中所述基於同源性之NPR-B/CNP複合物結構模型產生的變異體。在另一實施例中，CNP變異體在位置1、5、8、15、19及21之一或多個G1y位點處具有取代以降低構形可撓性，此可增強其結合於NPR-B超過NPR-C之特異性。對NPR- C之親和力可能降低的CNP變異體包括(但不限於)具有一或多個以下取代之變異體：G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、 G8S、 G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、 I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、L20S、G21S、G21T及G21R。
在另一實施例中，CNP變異體在位置5、7、8、9、 10、 14、15、16、17、19、20及21中一或多個位置處具有修飾及/或取代，且視情況可在本文所揭示之任何其它位置具有修飾及/或取代。在另一實施例中，CNP變異體可視情況例如在N端及/或C端具有共軛或延伸以有助於靶向骨/軟骨、降低腎清除率及/或增強對NEP降解之抗性。此(等)共軛或延伸可包含由以下形成或來源於以下之分子或序列：例如，聚Asp、聚G1u、骨或軟骨靶向胜肽、骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白、PEG、碳水化合物、疏水性酸、NPPC或非CNP多肽或胜肽，或其組合。
在又一實施例中，CNP變異體係藉由標準固相胜肽合成法，用適當時經取代及/或添加之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物來製備。在另一實施例中，CNP變異體係藉由重組合成方法，例如經由含有標籤或載體蛋白之融合蛋白來產生，其中使用標籤或載體蛋白有助於例如偵測、分離及/或純化融合蛋白，且使標籤或載體蛋白自融合蛋白選擇性化學裂解或蛋白水解裂解提供目標CNP變異體。在另一實施例中，CNP變異體之聚乙二醇化係在化學或生物合成之後或作為化學或生物合成之部分進行，其中共軛反應利用基於NHS或基於醛之化學或此項技術中已知之其它化學來進行。在另一實施例中，CNP變異體包含二硫鍵。在一相關實施例中，二硫鍵形成環狀胜肽。在另一實施例中，在對應於CNP22之位置6與22之位置的半胱胺酸殘基之間形成二硫鍵。
進一步涵蓋CNP變異體可共軛至疏水性聚合或非聚合部分， 諸如庚酸、戊酸或脂肪酸。疏水部分可共軛至胺基酸殘基(包括(但不限於)離胺酸、絲胺酸、半胱胺酸或蘇胺酸)之側鏈，或可連接至CNP變異體之N端及/或C端。
在一實施例中，如本文所述之CNP變異體具有在約8至約10.5或約8.5至約10範圍內之pI值。
在另一實施例中，本揭示案提供一種醫藥組合物，其包含CNP變異體、視情況選用之另一生物活性劑，及視情況選用之醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一些實施例中，該等組合物為適於非經腸注射之無菌醫藥組合物。 在一些實施例中，組合物包含實質上純(例如至少約90%或95%純)之CNP變異體。在一些實施例中，該等組合物含有少於約5%、4%、3%、2%、1%或0.5%之污染物，諸如其它人類蛋白質、豬蛋白質，或CNP53或其片段(除所需CNP變異體之外)。在某些實施例中，投與個體該無菌組合物以供治療或預防本文所揭示之任何CNP反應性病狀或病症。
本揭示案之CNP變異體宜保留CNP活性且顯示增加之血清半衰期。保留CNP活性可顯示為：例如保留所需活體內生物作用，或保留在相同濃度(例如1μmCNP胜肽或高於ED80)下CNP22之cGMP刺激活性的至少約50%、60%、70%、 80%、 90%、95%或至少約100%。在一些實施例中，CNP變異體顯示相較於CNP22血清半衰期增至至少約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍。
在一相關實施例中，本文所述之CNP變異體與野生型CNP22相比具有增強之NEP抗性且顯示增加之半衰期。在一實施例中，與野生型CNP22相比，CNP變異體之半衰期增加約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或約100%。
在某些實施例中，本文所述之CNP變異體增加活體外c GMP產生、增加活體內cGMP產生、活體內增加一或多種與軟骨或骨形成或生長相關之生物標記的含量、增強對活體外NEP裂解之抗性、增加血漿或血清活體內半衰期、增強活體內生物可用性，或增加活體內特定骨之長度，或實現此等增加(增強)之組合，與野生型CNP22相比，增至約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4..5倍或約5倍或更多倍。
在另一實施例中，本揭示案提供治療CNP反應性病狀或病症之方法，其包含投與有需要之個體治療有效量之CNP變異體或包含其之組合物。在一實施例中，CNP反應性病症為骨生長病症，包括(但不限於)骨骼發育不全及遺傳性骨骼畸形，諸如與纖維母細胞生長因子受體3(FGFR-3)突變相關之病症。在一特定實施例中，與FGFR-3突變相關之病症為軟骨發育不全。在另一實施例中，CNP反應性病症為與血管平滑肌細胞及組織相關之病症。在另一實施例中，CNP變異體適用於增大骨(例如肢骨)之生長板的尺寸。 在另一實施例中，CNP變異體適用於使骨延長或增強長骨生長。在又一實施例中，CNP變異體適用於增強軟骨細胞之基質產生、增殖及分化。
在某些實施例中，以約5nmo1/kg或10 nmo1/kg至約300nmo1/kg，或約20 nmo1/kg至約200nmo1/kg範圍內的劑量投與本文所述之CNP變異體。在一些實施例中，以約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、 400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000 nmo1/kg之劑量或治療醫師認為適當之其它劑量投與CNP變異體。在其它實施例中，以約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、 500、 550、600、650、700、750或800 μg/kg，或約1 mg/kg、 1.25mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg之劑量或治療醫師認為適當之其它劑量投與CNP變異體。本文所述之CNP變異體之劑量可根據本文所述之給藥頻率/投藥頻率來投與，該等頻率包括(但不限於)每日、每週2或3次、每週、每2週、每3週、每月等。
在另一實施例中，以單次治療或多次劑量形式投與CNP變異體。多次劑量可在療程內每日投與，或分多次劑量投與。在某些實施例中，涵蓋以如下頻率投與CNP變異體：單次劑量或多次劑量、每日、每隔一日、每3日、每週2次、每週3次、每週、每兩週、每3週、每月、每6週、每2個月、每3個月，或治療醫師認為適當之頻率。
在某些實施例中，調節CNP變異體之投與以留出生長期(例如軟骨生成)，接著為恢復期(例如骨生成)。舉例而言，可皮下、靜脈內，或藉由另一模式每日或每週多次投與CNP變異體持續一段時間，接著為無治療時期，接著重複該循環。在一些實施例中，初始治療期(例如每日或每週多次投與CNP變異體)持續3日、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週。在一相關實施例中，無治療時期持續3日、1週、2週、3週或4週。在某些實施例中，CNP變異體之給藥療程為每日給藥持續3日，接著3日不給藥；或每日或每週多次給藥持續1週，接著3日或1週不給藥；或每日或每週多次給藥持續2週，接著1或2週不給藥；或每日或每週多次給藥持續3週，接著1、2或3週不給藥；或每日或每週多次給藥持續4、5、6、7、8、9、10、11或12週，接著1、2、3或4週不給藥。
在其它實施例中，本揭示案提供一種治療CNP反應性病狀或病症之方法，其包含投與個體CNP胜肽或變異體，及監測個體中(例如來自個體之生物樣品中)至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量，其中骨或軟骨相關生物標記之含量增加或降低表明CNP胜肽或變異體對該個體具有治療作用。在一些實施例中，當生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而增加時，該生物標記含量之增加表明CNP胜肽或變異體對該個體具有治療作用。在其它實施例中，當生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而降低時，該生物標記含量之降低表明CNP胜肽或變異體對該個體具有治療作用。
在其它實施例中，治療方法進一步包含調節投與CNP胜肽或變異體之量(或劑量)或頻率，其中：(i)在生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而增加之情況下，若至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量低於目標含量， 則增加投與CNP胜肽或變異體之量(或劑量)或頻率；或(ii)在生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而增加之情況下，若至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量高於目標含量， 則降低投與CNP胜肽或變異體之量(或劑量)或頻率；或(iii)在生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而降低之情況下，若至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量高於目標含量， 則增加投與CNP胜肽或變異體之量(或劑量)或頻率；或(iv)在生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而降低之情況下，若至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量低於目標含量， 則降低投與CNP胜肽或變異體之量(或劑量)或頻率。
預期生物標記之目標含量係指與個體中治療作用及/或在緩解或改善病症或病狀之症狀方面之有益作用相關的生物標記之含量或含量範圍。在某些實施例中，高於或低於目標含量之生物標記含量可能對個體有害。
在其它實施例中，本揭示案涵蓋一種評估投與CNP胜肽或變異體對骨或軟骨形成或生長之影響的方法。在一實施例中，該方法提供分析或量測已投與CNP胜肽或變異體之個體中至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量以評估CNP胜肽或變異體在活體內對骨及軟骨形成及生長之影響。在一相關實施例中，至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量增加可表明投與CNP胜肽或變異體對骨或軟骨形成或生長具有積極影響且為適用於與CNP活性降低相關之骨骼發育不全及其它骨或軟骨相關疾病或病症之治療。例示性骨或軟骨相關生物標記包括(但不限於)CNP(例如內源性含量之CNP-22或CNP-53)、cGMP、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、第I型原膠原之前肽(PINP)及其片段、第I型膠原蛋白及其片段、第II型膠原蛋白之前肽及其片段、第II型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素(aggrecanchondroitin su1fate)及鹼性磷酸酶。
在其它實施例中，本揭示案涵蓋一種評估CNP胜肽或變異體對個體中至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量之影響的方法，其包含分析或量測來自已投與CNP胜肽或變異體之個體的生物樣品中骨或軟骨相關生物標記之含量。在一些實施例中，該方法進一步包含投與個體CNP胜肽或變異體，隨後分析或量測骨或軟骨相關生物標記之含量。
在某些實施例中，至少一種骨或軟骨相關生物標記係選自由以下組成之群：CNP(例如內源性含量之CNP-22或CNP-53)、cGMP、第II型膠原蛋白之前肽及其片段、第II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、第I型原膠原之前肽(PINP)及其片段、第I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及鹼性磷酸酶。
在與骨或軟骨相關生物標記有關之方法(例如治療方法、 診斷方法及分析方法)的一些實施例中，CNP胜肽或變異體為CNP-22、CNP-53，或本文所述之任何CNP胜肽及變異體。在此等方法之某些實施例中，CNP胜肽或變異體不為CNP-22或CNP- 53。
在其它實施例中，本揭示案提供一種重組產生CNP變異體之方法，其包含將包含編碼CNP變異體胜肽之聚核苷酸連接至編碼可裂解胜肽或蛋白質之聚核苷酸的宿主細胞在培養基中在使得由該等聚核苷酸編碼之融合多肽得以表現的條件下培養。在一相關實施例中，宿主細胞經包含編碼CNP變異體胜肽之聚核苷酸連接至編碼可裂解胜肽或蛋白質之聚核苷酸的表現載體轉型。
在一實施例中，載體為質體。在又一實施例中，質體係選自由以下組成之群：pE T-21a、pJexpress、pE T-31b、pET-15b、 pET-32a、pET-41a、pMAL、pQE-30、pET-SUMO、pET-22b及pTYB11。
在某些實施例中，可裂解胜肽或蛋白質包含選自由以下組成之群的多肽：組胺酸標籤、人類轉錄因子TAF12、酮類固醇異構酶、麥芽糖結合蛋白、β-半乳糖苷酶、麩胱甘肽-S-轉移酶、硫氧化還原蛋白、甲殼素結合域，及BMP- 2突變，或其片段。
在一相關實施例中，可裂解胜肽或蛋白質係由裂解劑裂解。在一些實施例中，裂解劑係選自由以下組成之群：甲酸、溴化氰(C N Br)、羥胺、蛋白質自裂解(protein se1fc1eavage)、因子Xa、腸激酶、ProTEV 及 SU M O蛋白酶。其它例示性裂解劑包括(但不限於)鈀、梭菌蛋白酶(c1ostripain)、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸肽酶、Kex2蛋白酶、OmpT蛋白酶、枯草桿菌蛋白(subti1isin)、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、變種枯草桿菌蛋白酶(furi1isin)、Ig A蛋白酶、人類Pace蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(rennin)(凝乳酶(chymosin))、微生物天冬胺酸蛋白酶、木瓜酶、鈣蛋白酶(ca1pain)、木瓜凝乳酶(chy m opapain)、無花果酶(ficin)(無花果蛋白酶(ficain))、鳳梨酶(brome1ain)(菠蘿蛋白酶(brome1ase))、組織蛋白酶B(cathepisin B)、卡斯蛋白酶(caspase)、嗜熱菌蛋白酶(therm o1ysin)、內切蛋白酶Arg-C、內切蛋白酶G1u-C、內切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素(ka11ikrein)及纖維蛋白溶酶。
在某些實施例中，融合多肽表現為可溶蛋白質或包涵體。在一相關實施例中，本揭示案涵蓋自宿主細胞或培養基分離所表現之融合多肽。在另一實施例中，使經分離之融合多肽與如本文所述之裂解劑接觸。
在一實施例中，本揭示案提供一種包含表現載體之細菌宿主細胞，該載體包含編碼CNP變異體胜肽之聚核苷酸連接至編碼可裂解胜肽或蛋白質之聚核苷酸。在一些實施例中，可裂解胜肽或蛋白質係選自由以下組成之群：組胺酸標籤、人類轉錄因子TAF12、酮類固醇異構酶、麥芽糖結合蛋白、β-半乳糖苷酶、麩胱甘肽-S-轉移酶、硫氧化還原蛋白、甲殼素結合域，及BMP-2突變，或其片段。
在另一實施例中，宿主細胞為細菌，諸如大腸桿菌(E.coli)。在一相關實施例中，大腸桿菌細胞係選自由以下組成之群： BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pGro 7、ArcticExpress(D E3)、C41[亦稱作C41(D E3)]、C43[亦稱作C43(DE3)]、Origami B(DE3)、Origami B(DE3)pLys S、KRX及Tuner(DE3)。在另一實施例中，宿主細胞包含如上所述之載體。在一些實施例中，宿主細胞在細胞培養之前經載體轉型。
在某些實施例中，涵蓋在培養基中在適於表現由聚核苷酸編碼之融合多肽的條件下培養宿主細胞。在一實施例中，融合多肽表現為可溶蛋白質或包涵體。在一相關實施例中，自宿主細胞或培養基分離所表現之融合多肽。在又一實施例中，使經分離之融合多肽與如本文所述之裂解劑接觸。
本發明係關於CNP之新穎變異體，其對NEP及/或NPR- C具有降低之親和力，且對NEP之裂解作用及/或NPR- C之清除作用具有降低之敏感性；包含此等CNP變異體之醫藥組合物；及使用此等CNP變異體來治療CNP反應性病症之方法，該等病症包括(但不限於)骨相關病症(諸如軟骨發育不全)及與血管平滑肌細胞及組織相關之病症。
A.定義
除非另作說明，否則本申請案(包括說明書及申請專利範圍)中所用之以下術語具有下文給出之定義。
除非上下文另有明確規定，否則如說明書及隨附申請專利範圍中所用，不定冠詞「一」及定冠詞「該/該等」包括複數個以及單數個指示物。
術語「約」或「大約」意謂如一般技術者所測定之特定值具有可接受之誤差，其部分視量測或測定該值之方式而定。在某些實施例中，術語「約」或「大約」意謂在1、2、3或4個標準偏差內。在某些實施例中，術語「約」或「大約」意謂在指定值或範圍之30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.05%以內。每當術語「約」或「大約」置於一系列兩個或兩個以上數值中之第一個數值之前時，應瞭解術語「約」或「大約」適用於該系列中的每個數值。
術語「環境溫度」及「室溫」在本文中可互換使用且係指周圍環境(例如進行反應或儲存組合物之空間)之溫度。在某些實施例中，環境溫度或室溫為約15℃至約28℃，或約15℃至約25℃，或約20℃至約28℃，或約20℃至約25℃，或約22℃至約28℃，或約22℃至約25℃之範圍。在其它實施例中，環境溫度或室溫為約15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃。
標準化學術語之定義可見於參考著作中，包括Car ey及Sundberg，Advanced Organic Chemistry第3版，A及B卷(P1enum Press，New York1992)。除非另有規定，否則本揭示案之實施可採用在此項技術之技能內的合成有機化學、質譜分析、製備型及分析型層析、蛋白質化學、生物化學、 重組DNA技術及藥理學之某些習知方法。例如參看T.E.Creighton，Proteins：Structures and M o1ecu1ar Properties(W.H.Freeman and Company， 1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(W orth Pub1ishers，Inc.，第4版，2004)；Sambr ook等人，Mo1ecu1ar C1oning：A Laboratory Manua1(第2版，1989)；MethodsIn Enzymo1ogy(S.Co1owick 及 N.Kap1an編，Academic Press，Inc.)；Remington' s Pharmaceutica1 Sciences第18版(Easton，Pennsy1vania：M ack Pub1ishing Company，1990)。
本文中(無論上文或下文)所引用之所有公開案、專利及專利申請案均以全文引用的方式併入本文中。
本文通篇使用以下胺基酸縮寫：
丙胺酸： A1a(A) 精胺酸：Arg(R)
天冬醯胺： Asn(N) 天冬胺酸：Asp(D)
半胱胺酸：Cys(C) 麩醯胺酸：G1n(Q)
麩胺酸： G1u(E) 甘胺酸：G1y(G)
組胺酸： His(H) 異白胺酸：I1e(I)
白胺酸：Leu(L) 離胺酸：Lys(K)
甲硫胺酸：Met(M) 苯丙胺酸：Phe(F)
脯胺酸：Pro(P) 絲胺酸：Ser(S)
蘇胺酸：Thr(T) 色胺酸：Trp(W)
酪胺酸：Tyr(Y) 纈胺酸：Va1(V)
「多肽」及「蛋白質」係指由經由胜肽鍵或胜肽鍵電子等排體連接的胺基酸殘基、其天然存在之相關結構變異體及非天然存在之合成類似物構成的聚合物。合成多肽可例如使用自動化多肽合成器來合成。術語「多肽」及「蛋白質」不限於產物之最小長度。術語「蛋白質」通常指較大多肽。術語「胜肽」通常指較短多肽。因此，胜肽、寡肽、二聚體、多聚體及其類似物均包括於該定義內。該定義涵蓋全長蛋白質與其片段。術語「多肽」及「蛋白質」亦包括多肽或蛋白質之表現後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾。此外，出於本揭示案之目的，「多肽」可包括對原生序列之「修飾」，諸如缺失、添加、取代(其性質上可具有保守性，或可包括用以下取代：人類蛋白質中通常存在之20種胺基酸中之任一者，或任何其它天然或非天然存在之胺基酸或非典型胺基酸)及化學修飾(例如添加胜肽模擬物或以胜肽模擬物取代)。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發，或經由胺基酸之化學修飾以移除或連接化學部分，或可為意外的，諸如經由產生蛋白質之宿主引起之突變，或經由因PCR擴增所致之錯誤。
在本文中使用習知符號來描繪多肽序列：多肽序列之左手端為胺基端；多肽序列之右手端為羧基端。
「 保守性取代」係指多肽中之胺基酸經功能上、結構上或化學上類似之天然或非天然胺基酸取代。在一實施例中，以下群組各自含有彼此可保守性取代之天然胺基酸：(1)胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；(2)冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；(3)冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；(4)胺酸(R)、離胺酸(K)；(5)白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；及(6)丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。
在另一實施例中，以下群組各自含有彼此可保守性取代之天然胺基酸：(1)胺酸(G)、丙胺酸(A)；(2)冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；(3)冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；(4)胺酸(R)、離胺酸(K)；(5)白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)、丙胺酸(A)；(6)丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；及(7)胺酸(S)、蘇胺酸(T)、半胱胺酸(C)。
在另一實施例中，胺基酸可如下所述來分組。
(1)水性： M et、A1a、Va1、Leu、I1e、Phe、Trp；(2)性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、G1n；(3)性：Asp、G1u；(4)性：His、Lys、Arg；(5)響主鏈取向之殘基：G1y、Pro；及(6)族：Trp、Tyr、Phe、His。
在一實施例中，本文所述之胜肽或多肽係使用編碼CNP變異體之聚核苷酸經由重組方式產生。因此，本揭示案涵蓋編碼本文所述之任何CNP變異體的聚核苷酸，包含此等聚核苷酸視情況連接至表現控制序列之宿主細胞或載體，及使用此等聚核苷酸、載體或宿主細胞來產生本揭示案之CNP變異體的方法。由此等聚核苷酸表現之CNP變異體可藉由包括以下之方法產生：在適於表現編碼CNP變異體之聚核苷酸的條件下，使宿主細胞在培養基中生長，及自宿主細胞或培養基分離表現產物。實際表現產物可視任何轉譯後加工而與所編碼之蛋白質產物略微不同。
「聚核苷酸」係指由核苷酸單元構成之聚合物。聚核苷酸包括天然存在之核酸，諸如去氧核糖核酸(「DNA」)及核糖核酸(「RNA」)以及核酸類似物。術語「核酸」通常係指較大聚核苷酸。術語「寡核苷酸」通常係指一般不超過約50個核苷酸之較短聚核苷酸。應瞭解，當將核苷酸序列以DNA序列(亦即A、T、G、C)表示時，核苷酸序列亦涵蓋「U」置換「T」的RNA序列(亦即A、U、G、C)。「cDNA」係指與mRNA互補或一致之呈單股或雙股形式之DNA。
「表現控制序列」係指調控其所可操作地連接之核苷酸序列之表現的核苷酸序列。「可操作地連接」係指兩個部分之間的功能關係，其中一部分之活性(例如調控轉錄之能力)引起對另一部分之作用(例如序列之轉錄)。表現控制序列可包括(例如且不限於)啟動子(例如誘導性或組成性啟動子)、 強化子、轉錄終止子、起始密碼子(亦即ATG)、內含子之拼接信號及終止密碼子的序列。
「重組聚核苷酸」係指具有在天然狀態下並不聯接在一起之序列的聚核苷酸。經擴增或組裝之重組聚核苷酸可包括於適合載體中，且該載體可用於轉型適合宿主細胞。將包含重組聚核苷酸之宿主細胞稱作「重組宿主細胞」。接著於重組宿主細胞中表現基因以產生例如「 重組多肽」。重組聚核苷酸亦可提供非編碼功能(例如啟動子、複製起點、 核糖體結合位點等)。
如本文中所用，「嵌合體」係指包含至少兩個異源聚核苷酸或多肽序列(亦即，來源於不同來源或彼此無關之天然存在之序列)之聚核苷酸或多肽，該等異源聚核苷酸或多肽序列係使用此項技術中通常已知之技術(例如重組表現或化學交聯)直接或間接連接在一起。在一實施例中，異源序列可包含蛋白質或胜肽直接或間接連接至CNP胜肽或變異體，包括可自CNP胜肽或變異體裂解之蛋白質或胜肽。在一相關實施例中，CNP變異體為如本文所述之嵌合體。
在某些實施例中，嵌合體包括包含可裂解載體蛋白或胜肽標籤之CNP融合蛋白。術語「可裂解載體蛋白」或「可裂解胜肽標籤」係指可直接或經由連接子間接融合至異源多肽序列，且可使用使可裂解胜肽或多肽自異源多肽或蛋白質裂解或分離之試劑自異源序列移除的胜肽或多肽序列。在一些實施例中，可裂解載體蛋白或胜肽標籤改良融合蛋白或異源多肽之產生、純化及/或偵測。例示性可裂解載體蛋白及胜肽標籤包括(但不限於)人類轉錄因子TAF12(TAF12)、酮類固醇異構酶(KSI)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、β-半乳糖苷酶(β-Ga1)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、硫氧化還原蛋白(Trx)、甲殼素結合域(CBD)、BMP-2突變(BMPM)、SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、鏈球菌蛋白、澱粉結合蛋白、內葡聚糖酶A之纖維素結合域、外葡聚糖酶Cex之纖維素結合域、生物素結合域、recA、F1ag、c-M yc、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(G1n)、聚(Phe)、聚(Cys)、綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、青色螢光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體抗原決定基及其片段。
「裂解劑」為適用於自異源多肽或蛋白質裂解或分離例如可裂解胜肽或多肽之試劑。例示性裂解劑包括(但不限於)鈀、溴化氰(CNBr)、甲酸、羥胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸激酶(腸肽酶)、Kex2蛋白酶、OmpT蛋白酶、因子Xa蛋白酶、枯草桿菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、furi1isin蛋白酶、IgA蛋白酶、人類Pace蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒3C蛋白酶、 genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(凝乳酶)、微生物天冬胺酸蛋白酶、木瓜酶、 鈣蛋白酶、木瓜凝乳酶、無花果酶(無花果蛋白酶)、鳳梨酶(菠蘿蛋白酶)、組織蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、內切蛋白酶Arg-C、內切蛋白酶G1u- C、內切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纖維蛋白溶酶。
在兩個或兩個以上聚核苷酸或多肽序列之情形中，術語「 一致」或「 一致性」百分比係指當比較及對準以獲得最大對應性時，如使用一種以下序列比較算法或藉由目測來量測，兩個或兩個以上序列或子序列相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基。
在兩個核酸或多肽之情形中，片語「 實質上同源」或「 實質上一致」一般指當比較及對準以獲得最大對應性時，如使用一種以下序列比較算法或藉由目測所量測，兩個或兩個以上序列或子序列具有至少40%、50%、60%、70%、 80%、90%、95%或98%核苷酸或胺基酸殘基一致性。在某些實施例中，實質同源性或一致性存在於長度為至少約25、50、100或150個殘基之序列的區域上。在另一實施例中，該等序列在比較生物聚合物中任一者或兩者之整個長度上實質上同源或一致。
對於序列比較，通常以一個序列充當參考序列，用於與測試序列相比較。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列算法之程式參數。接著由序列比較算法依據所指定之程式參數，計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
供比較之序列的最佳對準可藉由以下來進行：例如Smith及 Waterman，Adv.App1.Math.，2：482(1981)之局部同源性算法、Need1eman及 Wunsch，J.Mo1.Bio1.，48：443(1970)之同源性對準算法、Pearson 及 Lipman，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，85：2444(1988)之相似性搜尋法、此等算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics套裝軟體中之G AP、BESTFIT、FASTA 及 TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，或目測。適用算法之一實例為PILEUP，其使用Feng 及 Doo1itt1e，J.Mo1.Evo1.，35：351-360(1987)之漸進式對準法之簡化形式且類似於Higgins及 Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)所描述之方法。適用於產生序列多重對準之另一算法為C1usta1W(Thompson等人，Nuc1eic Acids Research，22：4673-4680(1994))。適用於測定序列一致性及序列相似性百分比之算法實例為BLAST算法(A1tschu1等人，J.M o1.Bio1.，215：403-410(1990)；Henikoff 及 Henikoff，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，89：10915(1989)；Kar1in 及 A1tschu1，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，90：5873-5787(1993))。執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(Nationa1 Center forBiotechno1ogyInformation)公開獲得。
如下所述，兩個核酸序列或多肽實質上同源或一致之另一指標為： 第一核酸所編碼之多肽可與第二核酸所編碼之多肽發生免疫交叉反應。因此，例如當一多肽與第二多肽不同之處僅在於保守性取代時，該兩種多肽通常實質上一致。如本文所述，兩個核酸序列實質上一致之另一指標為：兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。
「實質上純」或「經分離」意謂目標物質為主要存在物質(亦即以莫耳濃度計，比組合物中任何其它個別大分子物質之豐度高)，且實質上純化之部分為目標物質佔所存在之所有大分子物質之至少約50%(以莫耳濃度計)的組合物。在一實施例中，實質上純之組合物意謂，以莫耳濃度或重量計，相關物質佔組合物中所存在大分子物質之至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高。若組合物基本上由單一大分子物質組成，則目標物質經純化至基本均質(藉由習知偵測方法在組合物中不可偵測到污染物質)。出於此定義之目的，溶劑物質、小分子(<500道爾頓)、穩定劑(例如BSA)及元素離子物質不被視為大分子物質。在一實施例中，本揭示案之化合物為實質上純或經分離。在另一實施例中，本揭示案之化合物相對於其製造中所用之大分子起始物質為實質上純或經分離。在另一實施例中，本揭示案之醫藥組合物包含實質上純或經分離之CNP變異體與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑及視情況與另一生物活性劑混合。
如應用於目標之「天然存在」係指該目標可見於自然界之實情。舉例而言，存在於生物體(包括病毒)中且未經人類在實驗室中有意修飾之多肽或聚核苷酸序列為天然存在的。在一實施例中，「天然存在之」物質具有人類來源。
「野生型」(wt)為提及物種之聚核苷酸、多肽或蛋白質之天然形式(包括序列)的術語。野生型形式有別於自遺傳突變產生之聚核苷酸、多肽或蛋白質之突變形式。
在一實施例中，作為第二多肽之「類似物」或「變異體」或「衍生物」之第一多肽為與該第二多肽具有至少約50%、60%或70%序列同源性但小於100%序列同源性之多肽。此等類似物、變異體或衍生物可包含非天然存在之胺基酸殘基(包括(但不限於)高精胺酸、鳥胺酸、青黴胺及正纈胺酸)以及天然存在之胺基酸殘基。此等類似物、變異體或衍生物亦可由一個或複數個D-胺基酸殘基構成，且亦可含有胜肽模擬物或胜肽鍵電子等排體，諸如兩個或兩個以上胺基酸或胜肽模擬物殘基之間的非胜肽鍵。在另一實施例中，若第一多肽不為第二多肽之已知裂解產物或不為第二多肽之已知前驅體，則即使第一多肽與第二多肽具有100%序列同源性或其具有野生型序列，第一多肽仍為該第二多肽之「類似物」、「變異體」或「衍生物」。
在一實施例中，如本文中所用，術語「來源於」係指多肽或胜肽序列係基於野生型或天然存在之多肽或胜肽序列且可具有天然胺基酸、非天然胺基酸或胜肽模擬物之一或多個缺失、添加及/或取代。在一實施例中，衍生序列與野生型或天然存在之序列共享至少約40%、50%、60%或70%但小於100%之序列相似性。在另一實施例中，衍生物可為多肽之片段，其中該片段與野生型多肽在至少約5、10、 15、 20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之長度上實質上同源(例如至少約70%、75%、80%、85%、90%或95%同源)。在又一實施例中，若多肽具有野生型多肽上所不存在之部分(例如聚合物，諸如PEG)與其直接或間接連接，則即使該兩種多肽之胺基酸序列共享100%同源性，該多肽仍「來源於」該野生型多肽。
如本文中所用，「NPPC來源之」多肽係指來源於利鈉胜肽前驅體C(NPPC)多肽之多肽，其為126個胺基酸之單鏈前原多肽且在裂解後最終產生wtCNP22。將信號胜肽自NPPC移除得到原CNP，且以內切蛋白酶弗林蛋白酶進一步裂解產生53個胺基酸之活性胜肽(CNP-53)，其經分泌且經未知酶再裂解，產生22個胺基酸之成熟胜肽(CNP或CNP-22)。因此，CNP22本身因來源於NPPC而為「NPPC來源之」多肽。在一實施例中，NPPC來源之多肽與野生型NPPC在相同數目之胺基酸殘基上至少約40%、50%、60%、 70%、75%、80%、85%、90%或95%同源。進一步預期，NPPC來源之胜肽可包含NPPC多肽之約1至約53個，或1至37個，或1至35個，或1至31個，或1至27個，或1至22個，或10至35個，或約15至約37個殘基。在一實施例中，NPPC來源之胜肽可包含具有來源於NPPC多肽之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53個胺基酸之序列。
術語「有效量」意謂足以對個體之健康狀況、病理學或疾病產生所需結果或用於診斷目的之劑量。所需結果可包含劑量接受者之主觀或客觀改良。「治療有效量」係指對健康有效產生預定有利作用之藥劑量。任何個別情況下之適當「有效」量均可由一般技術者使用常規實驗來決定。應瞭解，用於任何特定患者之特定劑量濃度及給藥頻率均可改變且將視多種因素而定，包括所用特定化合物之活性；該化合物之生物可用性、代謝穩定性、排泄速率及作用時長；化合物之投與模式及時間；患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食；及特定病狀之嚴重度。
「治療」係指預防性治療或治療性治療或診斷性治療。 在某些實施例中，「治療」係指出於治療、預防或診斷目的投與個體化合物或組合物。
「預防性」治療為出於降低產生病變之風險之目的投與未顯示疾病徵兆或僅顯示疾病早期徵兆之個體的治療。可以預防性治療之形式給予本揭示案之化合物或組合物以降低產生病變之可能性或若已產生則將病變之嚴重度降至最小。
「治療性」治療為投與顯示病變徵兆或症狀之個體以用於減弱或消除彼等徵兆或症狀之目的之治療。該等徵兆或症狀可為生化、細胞、組織、功能或身體、主觀或客觀徵兆或症狀。本揭示案之化合物亦可以治療性治療之形式給予或給予用於診斷。
「 診斷」意謂鑑別病理學病狀之存在、程度及/或性質。診斷方法在其特異性及選擇性方面不同。儘管特定診斷方法可能不提供病狀之確診，但該方法若能提供有助於診斷之正面指示則已足夠。
「 骨或軟骨相關生物標記」或「 骨或軟骨相關標記」係指生長因子、酶、蛋白質或其它可偵測生物物質或部分，其含量與例如軟骨更新(carti1ageturnover)、軟骨形成、軟骨生長、骨吸收、骨形成、骨生長或其組合相關而增加或降低。此等生物標記可在投與如本文所述之CNP變異體之前、 期間及/或之後量測。例示性骨或軟骨相關生物標記包括(但不限於)：CNP、cGMP、第II型膠原蛋白之前肽及其片段、第II型膠原蛋白及其片段、第I型膠原蛋白之前肽及其片段、第I型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及鹼性磷酸酶。 可在任何適當生物樣品(包括(但不限於)組織、血液、血清、血漿、腦脊髓液、滑液及尿)中量測軟骨及骨相關生物標記。在一些實施例中，在來自經歷功效/藥效學活體內研究之動物及/或來自離體研究之條件培養基的血液、血漿或血清中量測生物標記。
在某些實施例中，量測至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量，且可根據所量測生物標記含量來調節投與個體之CNP變異體的投與量或頻率。在一些實施例中，生物標記之含量係「低於目標含量」或「 高於目標含量」。生物標記之目標含量為在接受CNP變異體之個體中觀察到治療作用時生物標記之含量或含量範圍。在某些實施例中，患有CNP反應性病症或病狀之個體的生物標記目標含量為在未受影響之正常個體中觀察到之生物標記的含量或含量範圍。在其它實施例中，為指示治療作用，生物標記之目標含量不需要與在正常個體中觀察到之生物標記的含量或含量範圍相等，但可在未受影響之個體中觀察到的生物標記之「正常」含量或含量範圍之例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%以內。
舉例而言，若生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而增加，則指示治療作用之生物標記的目標含量可高於未經投與CNP變異體之罹患CNP反應性病症之患者中生物標記之含量，且可視情況低於未罹患該病症之個體中生物標記之「正常」含量、大致等於該生物標記之「正常」含量，或高於該生物標記之「正常」含量。在一實施例中，若生物標記之含量低於目標含量，則表明治療作用不足，可能需要增加所投與CNP變異體的投與量或頻率。在一相關實施例中，若生物標記高於目標含量，則表明已投與多於必要量之CNP變異體，可能需要降低所投與CNP變異體的投與量或頻率。
再舉一實例，若生物標記之含量與骨或軟骨形成或生長相關而降低，則指示治療作用之生物標記的目標含量可低於未經投與CNP變異體之罹患CNP反應性病症之患者中生物標記之含量，且可視情況高於未罹患該病症之個體中生物標記之「正常」含量、大致等該生物標記之「正常」含量，或低於該生物標記之「正常」含量。在該種情況下，可能適用上述調節CNP變異體投與量及頻率之相反情況。
「 醫藥組合物」係指在個體動物(包括人類及哺乳動物)中適用於醫藥用途之組合物。醫藥組合物包含治療有效量之CNP變異體、視情況選用之另一生物活性劑，及視情況選用之醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一實施例中，醫藥組合物涵蓋包含以下之組合物：活性成分，及構成載劑之惰性成分，以及經由任何兩種或兩種以上成分之組合、複合或聚集，或經由一或多種成分之解離，或經由一或多種成分之其它類型之反應或相互作用直接或間接產生之任何產物。因此，本揭示案之醫藥組合物涵蓋藉由混合本揭示案之化合物與醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑所製得的任何組合物。
「醫藥學上可接受之載劑」係指任何標準醫藥載劑、緩衝劑及其類似物，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、5%右旋糖水溶液，及乳液(例如油/水或水/油乳液)。賦形劑之非限制性實例包括佐劑、黏合劑、填充劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、 濕潤劑、潤滑劑、滑動劑、甜味劑、調味劑及著色劑。 適合醫藥載劑、賦形劑及稀釋劑描述於Remington ' s Pharmaceutica1 Sciences 第 19版(Mack Pub1ishingCo.，Easton，1995)中。較佳醫藥載劑視活性劑之預定投與模式而定。 典型投與模式包括經腸(例如經口)或非經腸(例如皮下、 肌肉內、靜脈內或腹膜內注射；或表面、經皮或經黏膜投與)。
「醫藥學上可接受之鹽」為可調配為醫藥用化合物之鹽，包括(但不限於)金屬鹽(例如鈉、鉀、鎂、鈣等)及氨或有機胺之鹽。
「醫藥學上可接受」或「藥理學上可接受」意謂並非在生物學上或其它方面不合需要之物質，亦即該物質可投與個體而不會引起任何不合需要之生物作用，或不會以有害方式與含其之組合物中之任何組分或與個體之身體上或體內所存在之任何組分相互作用。
術語「單位劑型」係指適於以單一劑量形式用於人類及動物個體之實體不連續單元，各單元以足以產生所需作用之量計算含有預定量的本揭示案之化合物，視情況與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑或媒劑結合。本揭示案之新穎單位劑型的規格視以下而定：所用特定化合物及欲達成之效果，及宿主中與各化合物相關之藥效學。
「生理狀況」係指動物(例如人類)體內之狀況。生理狀況包括(但不限於)體溫，及生理性離子強度之水性環境、pH值及酶。生理狀況亦涵蓋特定個體體內不同於大多數個體中存在之「正常」狀況的狀況，例如該等狀況不同於約37℃之正常人類體溫或不同於約7.4之正常人類血液pH值。
「生理pH值」或「生理學範圍內之pH值」意謂在包括約7.0至8.0在內之範圍內、較通常在包括約7.2至7.6在內之範圍內之pH值。
如本文中所使用，術語「個體」涵蓋哺乳動物及非哺乳動物。 哺乳動物之實例包括(但不限於)哺乳動物綱之任何成員： 人類、非人類靈長類動物(諸如黑猩猩)，及其它猿及猴物種；農畜，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔、犬及貓；實驗動物，包括齧齒動物，諸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及其類似動物。非哺乳動物之實例包括(但不限於)鳥類、魚及其類似動物。該術語不指定特定年齡或性別。
除非另有指示，否則術語「聚乙二醇」、「PEG」、「聚環氧乙烷」及「 PEO」在本文中可互換使用。經由胺基共軛至與數值n相關之「PEOn」聚合物的CNP胜肽(CNP22或其變異體)一般具有式：CH3 -[-O-CH2 CH2 -]n-C(=O)- NHR，其中n為環氧乙烷單元之數目且R表示胜肽之剩餘部分。「 PEOn」聚合物可視情況在羰基碳與重複之環氧乙烷單元之間具有伸烷基(CH2 )m ，其中m為1至5之整數。該種「 PEOn」(例如PEO12或PEO24)聚合物具有單分散性，亦即，其為具有特定分子量之單一不連續聚合物。類似地，經由胺基共軛至與數值nK相關之「PEGnK」聚合物的CNP胜肽一般具有式： CH3-[-O-CH2CH2 -]p -C(=O)-NHR，其中p為大於1之整數。「PEGnK」聚合物亦可視情況在羰基碳與重複之環氧乙烷單元之間具有伸烷基(CH2 )m ，其中m為1至5之整數。然而，該種「PEGnK」(例如PEG1K、PEG2K、PEG5K或PEG20K)聚合物具有多分散性，亦即含有具有分子量分佈之聚合物的混合物，其中數值nK表示聚合物之數目平均分子量(Mn)(以千道爾頓為單位)。舉例而言，共軛至CNP胜肽之「PEG2K」表示具有數目平均分子量為約2kDa之聚合物的多分散性PEG聚合物。
除非另作明確指示，否則當指定聚合物(例如PEG)之質量範圍(例如以kDa為單位)時，該範圍係指聚合物數目平均分子量之範圍，而非多分散性混合物中多種聚合物之分子量的範圍。
術語「鹵素」、「鹵化物」或「鹵基」係指氟、氯、溴及/或碘。
術語「烷基」係指直鏈或分支鏈飽和單價烴基，其中烷基可視情況經一或多個如本文所述之取代基Q取代。在某些實施例中，烷基為具有1至20個(C1-20 )、1至15個(C1-15 )、1至12個(C1-12 )、1至10個(C1-10 )或1至6(C1-6 )個碳原子之直鏈飽和單價烴基，或具有3至20個(C3-20 )、3至15個(C3-15 )、3至12個(C3-12 )、3至10個(C3-10 )或3至6(C3-6 )個碳原子之分支鏈飽和單價烴基。如本文中所使用，直鏈C1 -6 及分支鏈C3-6 烷基亦稱為「低碳烷基」。烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基(包括所有異構形式，包括正丙基及異丙基)、丁基(包括所有異構形式，包括正丁基、異丁基、第二丁基及第三丁基)、戊基(包括所有異構形式)及己基(包括所有異構形式)。舉例而言，C1-6 烷基係指具有1至6個碳原子之直鏈飽和單價烴基或具有3至6個碳原子之分支鏈飽和單價烴基。
術語「烷氧基」係指-O-烷基。在某些實施例中，烷氧基可視情況經一或多個如本文所述之取代基Q取代。
術語「鹵烷基」係指經一或多個鹵原子取代之烷基。在某些實施例中，鹵烷基係經一、二、三、四、五或六個鹵原子取代。在某些實施例中，鹵烷基可視情況經一或多個如本文所述之其它取代基Q取代。
術語「環烷基」係指可視情況經一或多個如本文所述之取代基Q取代的環狀飽和橋聯及/或非橋聯單價烴基。在某些實施例中，環烷基具有3至20(C3-20 )、3至15(C3-15 )、3至12(C3- 12)、3至10(C3-10 )或3至7(C3-7 )個碳原子。環烷基之實例包括(但不限於)環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、十氫萘基及金剛烷基。
術語「雜環基」或「雜環」係指單環非芳族環系統或含有至少一個非芳族環之多環系統，其中一或多個非芳族環原子為獨立地選自O、S或N之雜原子，且其餘非芳族環原子為碳原子。在某些實施例中，雜環基或雜環基團具有3至20個、3至15個、3至10個、3至8個、4至7個或5至6個環原子。在某些實施例中，雜環基為單環、雙環、三環或四環系統，其可包括稠合或橋聯之環系統，且其中氮或硫原子可視情況經氧化，氮原子可視情況經四級銨化，且一些環可為部分或完全飽和，或為芳族。雜環基可於使得產生穩定化合物之任何雜原子或碳原子處連接至主結構。雜環基團之實例包括(但不限於)吖基、氮呯基、苯并咪基、苯并吲基、苯并異基、苯并異嗪基、苯并二烷基、苯并間二氧雜環戊烯基、苯并喃酮基、苯并喃基、苯并萘并喃基(benzonaphthofurany1)、苯并哌喃酮基、苯并哌喃基、苯并四氫喃基、苯并四氫吩基、苯并二基、苯并基、苯并吩基、苯并三基、苯并硫哌喃基、苯并嗪基、苯并噁基、苯并基、β-咔啉基、咔基、烷基、色酮基、啉基、香豆素基、十氫異喹啉基、二苯并喃基、二氫苯并異嗪基、二氫苯并異嗪基、二氫喃基、二氫哌喃基、二氧戊環基、二氫吡嗪基、二氫吡基、二氫吡基、二氫嘧基、二氫吡咯基、二氧戊環基、1，4-二烷基、喃酮基、喃基、咪基、咪啉基、咪基、咪并吡基、咪并。基、吲基、吲啉基、吲嗪基、吲基、異苯并四氫喃基、異苯并四氫吩基、異苯并吩基、異烷基、異香豆素基、異吲啉基、異吲基、異喹啉基、異啶基、異唑基、異啶基、異唑基、嗎啉基、基、八氫吲基、八氫異吲基、二基、酮基、基、并吡啶基、基、環氧乙烷基(oxirany1)、呸基、基、啡囉啉基(phenathro1iny1)、啡呻基、啡嗪基、啡嗪基、啡嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、4-哌酮基、喋啶基、嘌呤基、吡嗪基、吡基、吡基、噠嗪基、吡啶基、吡并吡基、嘧基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯基、喹啉基、喹啉基、喹啉基、基、四氫喃基(tetrahydrofury1)、四氫喃基(tetrahydrofurany1)、四氫異喹啉基、四氫哌喃基、四氫吩基、四基、二并嘧基、二基、嗎啉基、基、基、吩基、 三嗪基、三基及1，3，5-三烷基。在某些實施例中， 雜環基團可視情況經一或多個如本文所述之取代基Q取代。
術語「芳基」係指含有至少一個芳族烴環之單環芳族基團或多環單價芳族基團。在某些實施例中，芳基具有6至20個(C6- 20)、6至15個(C6-15 )或6至10(C6-10 )個環原子。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基、茀基、薁基、蒽基、菲基、芘基、聯苯及聯三苯。芳基亦指至少一個環為芳族且其它環可為飽和、部分不飽和或芳族之雙環或三環碳環， 例如二氫萘基、茚基、二氫茚基及四氫萘基(萘滿基)。在某些實施例中，芳基可視情況經一或多個如本文所述之取代基Q取代。
術語「雜芳基」係指含有至少一個芳族環之單環芳族基團或多環芳族基團，其中至少一個芳族環含有一或多個獨立地選自O、S及N之雜原子。雜芳基之各環可含有一或兩個O原子、一或兩個S原子及/或一至四個N原子，限制條件為各環中雜原子之總數為四或四以下且各環含有至少一個碳原子。雜芳基可於使得產生穩定化合物之任何雜原子或碳原子處連接至主結構。在某些實施例中，雜芳基具有5至20個、 5至15個或5至10個環原子。單環雜芳基之實例包括(但不限於)吡咯基、吡基、吡啉基、咪基、基、異噁基、基、二基、異基、喃基、吩基、二基、吡基、吡嗪基、嘧基、噠嗪基及三嗪基。雙環雜芳基之實例包括(但不限於)吲基、苯并基、苯并基、苯并吩基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪基、苯并哌喃基、吲嗪基、苯并喃基、異苯并喃基、色酮基、香豆素基、啉基、喹喏啉基、吲基、呤基、吡咯并吡啶基、喃并吡基、吩并吡啶基、二氫異吲基及四氫喹啉基。三環雜芳基之實例包括(但不限於)卡基、苯并吲基、啡囉啉基、吖基、啡基及基。在某些實施例中，雜芳基可視情況經一或多個如本文所述之取代基Q取代。
術語「視情況經取代」意欲意謂基團(包括烷基、烷氧基、鹵烷基、環烷基、雜環基、芳基及雜芳基)可經一或多個取代基Q(在一實施例中，一、二、三或四個取代基Q)取代，其中各Q獨立地選自由以下組成之群：氰基、鹵基、側氧基(oxo)、硝基、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、鹵基-C1-6 烷基、C3-7 環烷基、雜環基、C6-14 芳基、雜芳基、- C(O)Re 、-C(O)ORe 、-C(O)NRf Rg 、-C(NRe )NRf Rg 、-ORe 、- OC(O)Re 、-OC(O)ORe 、-OC(O)NRf Rg 、-OC(=NRe )NRf Rg 、- OS(O)Re 、-OS(O)2 Re 、-OS(O)NRf Rg 、-OS(O)2 NRf Rg 、- NRf Rg、- NRe C(O)Rf 、-NRe C(O)ORf 、-NRe C(O)NRf Rg 、- NRe C(=NRh )NRf Rg 、-NRe S(O)Rf 、-NRe S(O)2 Rf 、- NRe S(O)NRf Rg 、-NRe S(O)2 NRf Rg 、-SRe 、-S(O)Re 、-S(O)2 Re 及-S(O)2 NRf Rg ，其中各Re 、Rf 、Rg 及 Rh 獨立地為氫、C1-6 烷基、C3-7 環烷基、雜環基、C6-14 芳基或雜芳基；或Rf 及Rg 連同其所連接之N原子一起形成雜環基。
B.CNP變異體
CNP22作為治療劑之用途受限於其在血漿中之短半衰期(J.C1in.Endocrino1.M etab.，78：1428-35(1994))。在人類血漿中，CNP22之濃度通常小於5皮莫耳。在人體中，CNP22由NEP及 NPR-C降解且自循環中清除(Gro wthHormone＆IGF Res.，16：S6-S14)。在使用全身性投與之CNP22的所有人類及動物研究中，均已使用連續輸注來增加個體體內之CNP22濃度。具有較長半衰期及至少類似程度功能性之CNP胜肽將有益於基於CNP之治療策略。CNP變異體亦揭示於相關國際申請案第PCT/US08/84270號(以引用的方式明確併入本文中)中。
本揭示案提供對NEP及/或NPR-C具有降低之親和力，且對NEP之裂解及NPR-C之清除作用具有降低之敏感性，但具有與野生型CNP22相比實質上類似或更佳之功能性的CNP變異體。CNP變異體對NEP之裂解及/或NPR- C之清除作用的敏感性降低將使變異體之血漿或血清半衰期增加，藉此增加變異體分佈至目標組織及部位且實現所需藥理學作用之機會。在某些實施例中，與wtCNP22相比，本文所述之CNP變異體對NEP之裂解及/或NPR-C之清除作用的活體外或活體內敏感性至少降至約1/1.5、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、 1/4、 1/4.5或1/5，且與wtC NP22相比，活體內血漿或血清半衰期至少增至約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3..5倍、 4倍、4.5倍或5倍，同時保留wtCNP22功能性之至少約50%、 60%、 70%、80%、90%或100%，或具有wtCNP22功能性至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍大之功能性。可在活體外或活體內研究中就一或多種與軟骨或骨形成或生長相關之生物標記(例如cGMP)的含量、在離體或活體內研究中就特定骨之長度等來評估CNP功能性。
NEP之天然受質較小且利鈉胜肽(約2.2kDa至約3.2kDa)為最大的天然受質。根據X射線結晶學分析，NEP活性位點係深埋於中央腔隙內部，從而有效限制受質分子大小不超過約3kDa(Oefner等人，J.M o1.Bio1.，296：341-349(2000))。基於NPR-B信號傳導研究，CNP-22之變異體(諸如CNP-17(僅保留CNP22之環狀域Cys6-Cys22)及CNP-53(在N端具有31個胺基酸之延伸的CNP-22))仍可類似於2.2kDa wtCNP- 22結合並活化NPR-B。因此，本揭示案涵蓋在CNP22或其變異體之N端及/或C端共軛至天然聚合物(例如胜肽)及/或合成聚合物(例如PEG)之CNP變異體，其顯示NEP抗性增強，但保留結合及活化NPR-B信號傳導受體之能力。
在一實施例中，本揭示案涵蓋由以下通式表示之CNP變異體：(x)-Cys6 -Phe7 -G1y8 -Leu9 -Lys1 0-Leu11 -Asp1 2-Arg13-I1e14-G1y15 -Ser1 6-M et1 7-Ser18 -G1y1 9-Leu20-G1y21 -Cys22-(z)(SE QIDNO：139)，或(x)-G1y1 -Leu2 -Ser3 -Lys4 -G1y5 -Cys6 -Phe7 -G1y8-Leu9-Lys10-Leu11 -Asp1 2-Arg1 3-I1e1 4-G1y1 5-Ser1 6-M et1 7-Ser1 8-G1y19-Leu20-G1y21-Cys22-(z)(SEQIDNO：140)，其中：(x)及(z)各自獨立地為本文所述之天然聚合物(例如含有至少一個胺基酸之胜肽序列)及/或合成聚合物(例如PEG)，使得CNP變異體之總質量的特徵在於本文一般描述之範圍， 例如在約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa 之範圍內。在一實施例中，Cys6至Cys22之殘基形成環狀部分。在一實施例中，(x)及/或(z)包含來源於NPPC或非CNP多肽(例如ANP、BNP、IgG等)之胺基酸延伸，其中該延伸含有1至40個、1至35個、1至31個、5至35個、5至31個或5至15個胺基酸。在另一實施例中，CNP變異體在CNP22之一或多個以下位置包含一或多個另一天然胺基酸、非天然胺基酸、 胜肽模擬物及/或胜肽鍵電子等排體之修飾及/或取代： G1y1、Lys4、G1y5、Cys6、Phe7、G1y8、Leu9、Lys10、 Leu11、 I1e14、G1y15、Ser16、M et17、G1y19、Leu20及G1y21。
在另一實施例中，總質量特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)，經設計為增強對NEP降解之抗性的CNP變異體係由以下通式表示：(x)-Cys6-Phe7-G1y8-Leu9-(h)1 0-Leu11 -Asp1 2-Arg13 -I1e1 4-G1y15-Ser16-M et17-Ser18-G1y1 9-Leu2 0-G1y21 -Cys22 -(z)(SE QIDNO：141)，或(x)-G1y1-Leu2-Ser3-(b)4 -G1y5 -Cys6 -Phe7 -G1y8 -Leu9 -(h)10- Leu11-Asp12-Arg13-I1e1 4-G1y1 5-Ser1 6-M et1 7-Ser1 8-G1y1 9-Leu20-G1y21-Cys22 -(z)(SEQID NO：6)，其中：(x)為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團之非限制性實例為PEG(PEO)，且天然聚合基團之非限制性實例為含有1至35個胺基酸且來源於以下之胺基酸序列：NPPC或其具有取代及/或缺失之變異體、ANP、 BNP，或其它非CNP多肽或胜肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組胺酸之醣蛋白、纖維結合蛋白、血纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素或纖維母細胞生長因子2(FGF2)；(z)可不存在或可為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團之非限制性實例為PEG，且天然聚合基團之非限制性實例為來源於利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP或BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)之胺基酸序列；且(b)及(h)可獨立地為該位置之野生型Lys，或可經由保守性胺基酸取代或經側鏈上不具有反應性一級胺之任何天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6- 羥基- 正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、G1u 或 Ser)置換。在一實施例中，(b)為Arg。在另一實施例中，為提高NEP抗性，(b)不為G1y。在另一實施例中，(h)不為Arg。
來源於NPPC或其變異體之胺基酸序列的非限制性實例包括：Arg，G1u-Arg，G1y-A1a-Asn-Lys-Lys(SEQID N O：7)，G1y-A1a-Asn-Arg-Arg(SEQID N O：8)，G1y-A1a-Asn-Pro-Arg(SEQID N O：9)，G1y-A1a-Asn-G1n-G1n(SEQID N O：10)，G1y-A1a-Asn-Ser-Ser(SEQID N O：11)，G1y-A1a-Asn-Arg-G1n(SEQID N O：12)，G1y-A1a-Asn-Arg-Met(SEQID NO：13)，G1y-A1a-Asn-Arg-Thr(SEQID NO：14)，G1y-A1a-Asn-Arg-Ser(SEQID N O：15)，A1a-A1a-Trp-A1a-Arg-Leu-Leu-G1n- G1u- His- Pro- As n- A1a(SEQIDNO：16)，A1a-A1a-Trp-A1a-Arg-Leu-Leu-G1n- G1u- His- Pro- Asn- A1a- Arg(SEQID NO：17)，Asp- Leu-Arg-Va1-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-A1a-A1a-Trp- A1a- Arg(SEQID NO：18)，G1n-G1u-His-Pro-Asn-A1a-Arg-Lys-Tyr-Lys-G1y- A1a- As n- Lys-Lys(SEQID NO：19)，G1n-G1u-His-Pro-Asn-A1a-Arg-Lys-Tyr-Lys-G1y- A1a- Asn- Arg-Arg(SEQID NO：20)，Asp-Leu-Arg-Va1-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-A1a-A1a-Trp- A1a- Arg- Leu-Leu-G1n-G1u-His-Pro-Asn-A1a-Arg-Lys-Tyr-Lys- G1y- A1a-Asn-Lys-Lys(SEQID NO：21)，及Asp-Leu-Arg-Va1-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-A1a-A1a- Tr p- A1a- Arg-Leu-Leu-G1n-G1u-His-Pro-Asn-A1a-Arg-Lys-Tyr-Lys- G1y- A1a-Asn-Arg-Arg(SEQID NO：22)。
來源於非CNP多肽(諸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)之胺基酸序列的非限制性實例包括：Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID N O：23)；Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQID N O：24)；Ser- Pro-Lys-Met-Va1-G1n-G1y-Ser-G1y(SEQ ID N O：25)；Met- Va1-G1n-G1y-Ser-G1y(SEQ ID N O：26)；Lys-Va1-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQID N O：27)；Lys-Va1-Leu-Arg-Arg-His(SEQID N O：28)；G1y-G1n-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SE QIDNO：29)；G1y-Va1-Pro-G1n-Va1-Ser-Thr-Ser-Thr(SE Q ID N O：30)；G1y-G1u-Arg-A1a-Phe-Lys-A1a-Trp-A1a-Va1-A1a-Arg-Leu-Ser-G1n(SEQID NO：31)；G1y-G1n-Pro-Arg-G1u-Pro-G1n-Va1-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQID NO：32)。
在一實施例中，如本文所述，具有(x)及/或(z)基團之任何CNP變異體之N端(x)基團及/或C端(z)基團獨立地包含含有少量(若存在)天然或非天然酸性胺基酸(例如Asp或G1u)之胺基酸序列。在另一實施例中，(x)及/或(z)富含天然或非天然鹼性胺基酸(例如Lys、Arg或 His)，以維持類似CNP22之pI值(pI8.9)之鹼性pI值。在一實施例中，CNP變異體之pI值在約8至約10.5之範圍內，旨在使得CNP變異體可更容易擴散穿過包圍骨生長板之軟骨細胞的細胞外基質。在較窄之實施例中，CNP變異體之pI值為約8.5至約10.5，或約8.5至約10，或約9至約10。
在另一實施例中，(x)及/或(z)富含天然或非天然極性胺基酸， 旨在增強水溶性。在又一實施例中，(x )及/或(z )含有少量(若存在)天然或非天然疏水性胺基酸(例如A1a 、Va1、 Leu、I1e或 Met)。
在另一實施例中，CNP變異體之N端以至少一個甘胺酸殘基終止，其設計在於增加血清半衰期。在相關實施例中， 為防止形成焦麩醯胺酸，CNP變異體之N端以甘胺酸殘基終止， 或者以麩醯胺酸終止。在一實施例中，(x )基團含有延伸之胺基酸，其N端以至少一個甘胺酸殘基終止。在另一實施例中，(x)及/或(z)不含兩個相鄰天然或非天然鹼性胺基酸(例如Lys-Lys或 Arg-Arg)，旨在降低對弗林蛋白酶裂解的敏感性。在一實施例中，(x)不含緊接於對應於CNP22之G1y1之位置之前的兩個相鄰鹼性胺基酸。
在又一實施例中，CNP變異體之(x)基團及/或(z )基團包含來源於NPPC(例如來源於CNP53)之胺基酸序列。在一實施例中， (x)包含來源於ANP或BNP之N端尾的胺基酸序列。在另一實施例中，(z)包含來源於ANP或BNP之C端尾的胺基酸序列。在另一實施例中，(x)及/或(z )包含來源於非利鈉多肽之胺基酸序列，諸如，例如：IgG、人類血清白蛋白(HSA)、富含組胺酸之醣蛋白、纖維結合蛋白、血纖維蛋白原、含鋅指多肽、FGF-2及骨靶向蛋白(例如骨織素、骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)。
在本文所述之CNP22或其變異體可具有N端(x )基團及/或C端(z )基團之任何實施例中，(x)及/或(z)可獨立地含有來源於骨形態發生蛋白(BMP)之功能域的胺基酸序列。藉由增加CNP變異體之總質量以使其特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6或7kDa之範圍)，來源於BMP之功能域之N端及/或C端胺基酸延伸可增強NEP抗性，且因此增加CNP變異體之血清半衰期。另外，因為某些BMP為誘導骨及軟骨形成之生長因子及細胞因子，所以來源於BMP之功能域的片段可藉由不同於以CNP22或其變異體之環狀域活化NPR-B之鳥苷酸環化酶功能的機制促進軟骨細胞、軟骨或骨生長。促進骨形成及發育、軟骨形成及發育及/或成骨細胞分化之BMP的非限制性實例包括BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7及BMP8a。在一實施例中，CNP22或其變異體之N端及/或C端獨立地共軛至來源於BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7或BMP8a之C端部分中最後140個胺基酸之胺基酸序列。
在一實施例中，CNP變異體在CNP22或CNP17之N端及/或C端含有胺基酸延伸，包括(但不限於)：DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQIDNO：4)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，類似物BL)(SEQIDNO：60)；AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CA)(SEQIDNO：61)；AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CB)(SEQIDNO：62)；DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CC)(SEQIDNO：63)；RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO： 40)；ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO： 38)；GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO： 64)；GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO： 65)；GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO： 66)；GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO： 67)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：144)；及SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似物CD)(具有來源於BNP之N端及C端尾的CNP17)(SEQIDNO： 68)。
在另一實施例中，CNP變異體在CNP22之位置4具有K4R取代。CNP(K4R)變異體之非限制性實例包括：GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物AY)(SEQIDNO：36)；GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CI)(SEQIDNO：37)；RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物AZ)(SEQ IDNO：41)；ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物BA)(SEQIDNO：39)；GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CH)(SEQIDNO：69)；及GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CG)(SEQIDNO：70)。
在其它實施例中，CNP變異體為包含CNP22或其具有胺基酸添加、缺失及/或取代之變異體，及位於CNP胜肽N端之來源於除CNP外之多肽或蛋白質之胜肽片段，或完整非CNP多肽或蛋白質的嵌合體，其中CNP22或其變異體可視情況具有一或多個胺基酸殘基之N端胺基酸延伸。在某些實施例中，CNP嵌合體包含CNP22或其具有一或多個胺基酸殘基之N端胺基酸延伸之變異體。在某些實施例中， CNP嵌合體在緊接於CNP22或其變異體之第一位置(在CNP22之情況下為G1y)之前含有離胺酸-離胺酸(KK)殘基或GANKK殘基。在其它實施例中，CNP嵌合體在緊接於CNP22或其變異體之第一位置之前含有一或兩個不同於離胺酸- 離胺酸之殘基。可緊接於CNP22或其變異體之第一位置之前的殘基之非限制性實例包括KP、PK、PR、PQ、 QK、QQ、RR、SS、GANKP(SEQIDNO：200)、GANPK(SEQIDNO： 201)、GANPR(SEQIDNO：9)、GANPQ(SEQIDNO：202)、 GANQK(SEQID NO：203)、GANQQ(SEQID NO：10)、 GANRR(SEQIDNO：8)及GANSS(SEQIDNO：11)。
在另一實施例中，CNP變異體為包含CNP22及N端胜肽片段之嵌合體，包括(但不限於)：GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CQ)(富含組胺酸之醣蛋白(HRGP)片段- CNP22嵌合體)(SEQIDNO：76)；GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CR)(HRGP片段-CNP22嵌合體)(SEQID NO： 77)；GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CX)(HRGP片段-CNP22嵌合體)(SEQID NO： 78)；GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CF)(IgG1(Fc)片段-CNP22嵌合體)(SEQID NO： 79)；GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CY)(人類血清白蛋白(HSA)片段- CNP22嵌合體)(SEQIDNO：80)；GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CE)(HSA片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO： 81)；FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CZ)(骨織素「 NPRC抑制劑」片段-CNP22嵌合體)(SEQIDNO：82)；及GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物DA)(FGF2「 肝素結合域」片段- CNP22嵌合體)(SEQIDNO：83)。
在另一實施例中，CNP變異體為包含N端胜肽片段及CNP22(其中精胺酸取代CNP22之Lys4(「 CNP22(K4R)」))之嵌合體，包括(但不限於)：GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CK)(IgG1 (Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：84)；GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CL)(HSA片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：85)；GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CM)(纖維結合蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：86)；GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CN)(血纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：87)；GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CO)(血纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQIDNO：88)；及GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CP)(鋅指片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQID NO：89)。
包含IgG及CNP22或其變異體之嵌合體經設計為尤其增強對NEP降解之抗性且減少與血清白蛋白之結合。包含HSA之表面片段的CNP嵌合體經設計為尤其降低免疫原性且減少與血清白蛋白之結合。在N端含有富含組胺酸、 無離胺酸、無精胺酸之陽離子性序列的HRGP-CNP22及HRGP- CNP22(K4R)嵌合體經設計為尤其增強對蛋白酶之穩定性。含有骨織素片段之嵌合體經設計以在骨生長板處在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)裂解後釋放骨織素片段，其中該片段將抑制清除受體NPR-C。關於包含FGF2肝素結合片段之嵌合體，結合於片段之肝素經設計以保護嵌合體避免降解， 藉此提供較長血清半衰期。含有纖維結合蛋白、血纖維蛋白原或鋅指片段之嵌合體經設計為減少與血清白蛋白之結合，以及其它特徵。
不希望受理論束縛，如與wtCNP22相比，對NEP降解之抗性增強且具有類似或改良之功能性(例如結合於NPR- B及刺激cGMP信號傳導)的分子量為約2.6kDa 或2.8kDa 至約6kDa 或7 kDa之CNP變異體若不緊密結合於血漿蛋白(諸如血清白蛋白)， 則可能更有效。不緊密結合於血漿蛋白(例如血清白蛋白)之CNP變異體可更有效地擴散穿過軟骨，到達骨生長板之軟骨細胞，且結合並活化NPR- B以進行c GMP信號傳導。在一實施例中，經設計為減少與血漿蛋白(例如血清白蛋白)之結合的CNP變異體為包含CNP22或其變異體及來自IgG之胜肽片段的嵌合體。在另一實施例中， 經設計為減少與血漿蛋白之結合的CNP變異體為包含CNP22或CNP22(K4R)及來自多肽(例如IgG、HSA、纖維結合蛋白、血纖維蛋白原、含鋅指多肽等)之片段的嵌合體。在另一實施例中，經設計為減少與血漿蛋白之結合的CNP變異體包含CNP22或其變異體共軛至親水性或水溶性聚合物。 在一實施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG(或P EO)。 在另一實施例中，親水性或水溶性聚合物(例如PEG)經一或多個在生理條件下賦予聚合物負電荷之官能基(諸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其組合)官能化。
在另一實施例中，本揭示案之CNP變異體包括介於人類CNP- 17(hCNP-17)至人類CNP-53(hCNP-53)之範圍內， 且具有來源於hCNP-53之野生型胺基酸序列的截短CNP胜肽。此等截短CNP胜肽包括：DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQIDNO：4)；LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQIDNO：146)；RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQIDNO：147)；VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQIDNO：148)；DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQIDNO：149)；TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQIDNO：150)；KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQIDNO：151)；SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQIDNO：152)；RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQIDNO：153)；AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO：154)；AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO：155)；WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO：156)；ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO：157)；RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO：158)；LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO：159)；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP-38)(SEQ ID NO：160)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO：60)；EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO：161)；HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO：162)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO：163)；NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO：164)；ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQIDNO：165)；RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQIDNO：166)；KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQIDNO：167)；YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQIDNO：168)；KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQIDNO：169)；GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQIDNO：170)；ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQIDNO：171)；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQIDNO：172)；KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQID NO：173)；KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQID NO：174)；GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQIDNO：1)；LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQIDNO：175)；SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQIDNO：176)；KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQID NO：177)；GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQID NO：178)；及CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(SEQID NO：2)。
在某些實施例中，CNP變異體不包括CNP- 17、CNP- 22或CNP-53。
在另一實施例中，介於hCNP-17至hCNP-53範圍內之截短CNP胜肽可在特定截短CNP胜肽之任一或多個胺基酸位置含有如本文所述天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(例如胜肽鍵電子等排體)之胺基酸添加、缺失及/或取代。在另一實施例中，具有野生型序列或胺基酸添加、缺失及/或取代之截短CNP胜肽可在N端、C端及/或內部位點共軛至本文所述之任何部分，包括(但不限於)靶向骨或軟骨之部分(例如雙膦酸鹽、靶向骨或軟骨之胜肽序列(例如聚Asp、 聚G1u)、來源於骨蛋白(例如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白)之骨靶向域的胜肽序列)、來源於骨形態發生蛋白(例如BMP2、BMP3、BMP5、BMP7、BMP8a)之功能域的胜肽序列、 來源於利鈉多肽(例如NPPC、ANP、BNP)之胜肽序列、 來源於非利鈉來源多肽(例如血清白蛋白、IgG、富含組胺酸之醣蛋白、纖維結合蛋白、血纖維蛋白原、含鋅指多肽、FGF-2、骨織素)之胜肽序列、降低腎清除率之部分(例如帶負電PEG部分)、親水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物(例如由骨生長板之細胞表面上之受體識別的碳水化合物)、 疏水性酸(例如C5 -C12 羧酸、天然脂肪酸)、磷脂及其組合。在一實施例中，具有野生型序列或胺基酸添加、 缺失及/或取代且視情況在N端、C端及/或內部位點共軛至一或多個部分之截短CNP胜肽具有特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)的總質量。
在另一實施例中，CNP變異體為CNP37之衍生物，該CNP37為QEHPNARKYKGANKK-CNP22(SEQIDNO：60)。CNP37變異體可在CNP37之37個位置中任一或多處含有天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(例如胜肽鍵電子等排體)之胺基酸添加、缺失及/或取代。依據CNP22之編號，CNP37中可進行之取代的非限制性實例包括K4R、G5S、G5R、G8S、K10R、G15S、S16Q、M17N、G19R及其組合。在一實施例中，CNP37衍生物含有天然胺基酸(例如天冬醯胺)或非天然胺基酸或胜肽模擬物對Met17之取代，旨在部分避免甲硫胺酸之硫原子被氧化。在另一實施例中，CNP37變異體含有天然或非天然非鹼性胺基酸或胜肽模擬物對LyS8、Lys10、Lys14及/或 Lys15(依據始於CNP37之N端的編號)之取代，旨在部分減少白蛋白結合。
除胺基酸添加、缺失及/或取代之外或替代胺基酸添加、缺失及/或取代，CNP37衍生物可在N端、C端及/或內部位點共軛至本文所述之任何部分，該等部分包括(但不限於)靶向骨/軟骨之部分(例如骨靶向胜肽域)、降低腎清除率之部分(例如帶負電PEG部分)、親水性聚合物(例如PEG)、包含一或多個胺基酸之胺基酸序列(例如骨織素「NPR-C抑制劑」片段)、碳水化合物(例如由骨生長板之細胞表面上之受體識別之碳水化合物)、疏水性酸(例如C5 -C12 羧酸及天然脂肪酸)，及其組合。
在一實施例中，CNP變異體為經修飾之CNP37胜肽，其在弗林蛋白酶裂解位點具有突變/取代(加下劃線)，旨在提高對弗林蛋白酶之活體內抗性，及/或在N端含有甘胺酸(加下劃線)，旨在提高血漿穩定性及防止形成焦麩醯胺酸。此等CNP37變異體包括(但不限於)：GQEHPNARKYKGAN PK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CS)(SEQIDNO：71)；GQEHPNARKYKGAN QK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CT)(SEQIDNO：72)；GQEHPNARKYKGAN QQ GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CU)(SEQIDNO：73)；GQEHPNARKYKGAN KP GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物CW)(SEQIDNO：74)；GQEHPNARKYKGAN KK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(G1y-CNP37，類似物DB)(SEQID NO：75)；及PGQEHPNARKYKGAN KK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-G1y-CNP37)(SEQID NO：145)。
在另一實施例中，本揭示案之CNP變異體包括可藉由本文所述之融合蛋白方法產生的CNP胜肽及其變異體。可藉由本文所述之融合蛋白方法使用化學或蛋白水解裂解或蛋白質自裂解產生的CNP變異體之非限制性實例包括：GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(G1y-wtCNP53)(SEQID NO：179)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(G1y-wtCNP37)(SEQID NO：75)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP37)(SEQID NO：60)；G HK SEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA片段-wtCNP27)(SEQID NO：144)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4，5，9R)](SEQIDNO：36)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP53(M48N)](SEQIDNO：180)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[G1y-CNP37(M32N)](SEQID NO：181)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQIDNO：182)；GHKSEVAHRFK- GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQID NO：183)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQIDNO：184)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP53)(SEQID NO：185)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-G1y-wtCNP37)(SEQID NO：145)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP37)(SEQID NO：186)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP34)(SEQIDNO：187)；P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-wtCNP27)(SEQID NO：188)；PGAN RR GLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQIDNO：189)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP53)(SEQID NO：190)；MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-G1y-wtCNP37)(SEQID NO：191)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP37)(SEQID NO：192)；M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-wtCNP27)(SEQID NO：193)；MGA NRR GLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQIDNO：194)。
其它CNP變異體(包括介於hCNP-17至hCNP- 53範圍內且具有野生型序列或胺基酸添加、缺失及/或取代之截短CNP胜肽)亦可藉由本文所述之融合蛋白方法產生，只要融合蛋白之化學或蛋白水解裂解之預定位點不存在於目標CNP變異體本身之胺基酸序列內。作為一非限制性實例，可採用本文所述之融合蛋白方法使用甲酸裂解來產生截短wtCNP34。
在其它實施例中，對於具有天冬醯胺(ASn/N)殘基及/或麩醯胺酸(G1n/Q)殘基的本文所述之任何CNP胜肽及CNP變異體，無論其是否具有野生型序列或非天然胺基酸序列，任何Asn殘基及/或任何G1n殘基均可獨立地經任何其它天然或非天然胺基酸取代，包括保守性取代，諸如ASn經取代為G1n。此等取代係部分地旨在最小化或避免天冬醯胺及/或麩醯胺酸發生任何可能脫醯胺作用。任何ASn殘基及/或任何G1n殘基均可獨立地經任何其它天然或非天然胺基酸取代(包括保守性取代，諸如Asn經取代為G1n)之CNP胜肽及變異體的非限制性實例包括wtCNP34、wtCNP37、G1y-wtCNP37 、 Pro-wtCNP37 、 Pro-G1y-wtCNP37、 GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO： 144)、 Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO：188)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)。在某些實施例中，本文所述之CNP胜肽及CNP變異體的天冬醯胺殘基未經麩醯胺酸、天冬胺酸或麩胺酸取代。在某些實施例中，本文所述之CNP胜肽及CNP變異體的麩醯胺酸殘基未經天冬醯胺、天冬胺酸或麩胺酸取代。作為一非限制性實例，Pro-G1y-wtCNP37(PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC)(SEQID NO：145)之天冬醯胺殘基7及/或15可獨立地經任何其它天然或非天然胺基酸(包括麩醯胺酸)取代以避免天冬醯胺殘基脫醯胺為天冬胺酸或異天冬胺酸之任何可能性。在某些實施例中，Pro-G1y-wtCNP37之天冬醯胺殘基7及/或15未經麩醯胺酸、天冬胺酸或麩胺酸取代。
然而應瞭解，本揭示案涵蓋如下CNP變異體：其中任一或多個(至多所有)易於發生脫醯胺或類脫醯胺反應(例如異構化)之殘基均可經由脫醯胺或類脫醯胺反應以任何程度(依據轉化之殘基，至多轉化100%)轉化為其它殘基。在某些實施例中，本揭示案涵蓋CNP變異體，其中：(1)任一或多個(至多所有)天冬醯胺(Asn/N)殘基可經由脫醯胺作用轉化為天冬胺酸或天冬胺酸鹽，及/或轉化為異天冬胺酸或異天冬胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%；或(2)任一或多個(至多所有)麩醯胺酸(G1n/Q)殘基可經由脫醯胺作用轉化為麩胺酸或麩胺酸鹽，及/或轉化為異麩胺酸或異麩胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%；或(3)任一或多個(至多所有)天冬胺酸或天冬胺酸鹽(Asp/D)殘基可經由類脫醯胺反應(亦稱為異構化)轉化為異天冬胺酸或異天冬胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%；或(4)任一或多個(至多所有)麩胺酸或麩胺酸鹽(G1u/E)殘基可經由類脫醯胺反應(亦稱為異構化)轉化為異麩胺酸或異麩胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%；或(5)上述各項之組合。
作為一非限制性實例，本揭示案涵蓋CNP變異體，其中Pro-G1y-wtCNP37[PG QEH PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC](SEQID NO：145)之任一或多個(至多所有)天冬醯胺、麩醯胺酸、天冬胺酸及/或麩胺酸殘基可經由脫醯胺或類脫醯胺反應分別轉化為(1)天冬胺酸/天冬胺酸鹽及/或異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽、(2)麩胺酸/麩胺酸鹽及/或異麩胺酸/異麩胺酸鹽、(3)異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽，及/或(4)異麩胺酸/異麩胺酸鹽，如上所述，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
作為另一實例，本揭示案涵蓋CNP變異體，其中Pro-G1y-(SEQIDNO：145)之任一或多個(至多所有)天冬醯胺及/或wtCNP37[PGQEHPN ARKYKGAN KKGLSKGCFGLKLD RIGSMSGLGC]天冬胺酸殘基可經由脫醯胺或類脫醯胺反應分別轉化為(1)天冬胺酸/天冬胺酸鹽及/或異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽、及/或(2)異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
作為另一實例，本揭示案涵蓋CNP變異體，其中G1y-wtCNP37[G QEH PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：75)]之任一或多個(至多所有)天冬醯胺、麩醯胺酸、天冬胺酸及/或麩胺酸殘基可經由脫醯胺或類脫醯胺反應分別轉化為(1)天冬胺酸/天冬胺酸鹽及/或異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽、(2)麩胺酸/麩胺酸鹽及/或異麩胺酸/異麩胺酸鹽、(3)異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽，及/或(4)異麩胺酸/異麩胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
作為又一實例，本揭示案涵蓋CNP變異體，其中wtCNP37[QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：60)]之任一或多個(至多所有)天冬醯胺、 麩醯胺酸、天冬胺酸及/或麩胺酸殘基可經由脫醯胺或類脫醯胺反應分別轉化為(1)天冬胺酸/天冬胺酸鹽及/或異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽、(2)麩胺酸/麩胺酸鹽及/或異麩胺酸/異麩胺酸鹽、(3)異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽，及/或(4)異麩胺酸/異麩胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
作為另一實例，本揭示案涵蓋CNP變異體，其中HSA- wtCNP27嵌合體GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQID NO：144)之任一或多個(至多所有)天冬醯胺、天冬胺酸及/或麩胺酸殘基可經由脫醯胺或類脫醯胺反應分別轉化為(1)天冬胺酸/天冬胺酸鹽及/或異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽、(2)異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽，及/或(3)異麩胺酸/異麩胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
作為又一實例，本揭示案涵蓋CNP變異體，其中Pro-HSA-wtCNP27嵌合體PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQID NO：188)之任一或多個(至多所有)天冬醯胺、天冬胺酸及/或麩胺酸殘基可經由脫醯胺或類脫醯胺反應分別轉化為(1)天冬胺酸/天冬胺酸鹽及/或異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽、(2)異天冬胺酸/異天冬胺酸鹽，及/或(3)異麩胺酸/異麩胺酸鹽，依據轉化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
另外，本揭示案涵蓋CNP變異體，其中任一或多個(至多所有)甲硫胺酸(Met/M)殘基可氧化為任何化學上可行之氧化形式(例如亞碸及/或碸)，依據氧化之殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
在另一實施例中，CNP變異體包含CNP22或其變異體在N端及/或C端共軛至有助於變異體移位穿過細胞膜或細胞障壁之部分。在一實施例中，CNP變異體在N端及/或C端共軛至有助於輸送變異體穿過細胞膜或細胞障壁(包括經由活性胜肽轉運體)之胜肽序列。
在另一實施例中，使CNP22或其變異體之N端及/或C端共軛至化學部分，諸如天然及/或合成聚合物，以將經修飾之CNP胜肽的總質量增加至本文一般描述之範圍，例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa之範圍。在一實施例中， 化學部分為生物相容性親水性或水溶性天然(例如胜肽、 碳水化合物)或合成(例如PEG(或PEO))聚合物。
在另一實施例中，使CNP22或其變異體之N端及/或C端共軛至PEG(或PEO)聚合物以產生特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa )的總質量。CNP22或其變異體之聚乙二醇化旨在尤其降低免疫原性及藉由降低腎清除率及增強蛋白酶抗性來提高半衰期。PEG部分可連接至本文所述之CNP22或任何變異體之N端及/或C端，該變異體包括(但不限於)CNP-17(CNP22之Cys6-Cys22環化部分)、CNP37，及CNP17、CNP22或CNP37之具有N端及/或C端胺基酸延伸、胺基酸取代及/或胺基酸缺失的變異體。在一實施例中，CNP17、CNP22或CNP37或其變異體之Lys4及/或 Lys10殘基經側鏈上不含反應性一級胺之天然或非天然胺基酸(例如Arg、G1y、Ser 、G1n、 G1u 或 Cit)或胜肽模擬物取代，以排除此等離胺酸殘基的任何可能之聚乙二醇化。在一實施例中，CNP胜肽之Lys4及/或 Lys10殘基經Arg取代。在另一實施例中，Lys 10殘基未經Arg取代。
在另一實施例中，具有PEG(或PEO)部分及位於N端之胺基酸延伸的CNP變異體(包括CNP22及其變異體)在緊接於對應於CNP22之G1y1之位置之前的位置含有精胺酸。此等聚乙二醇化CNP變異體經設計為增強對NEP降解之抗性、減少與血清白蛋白之結合及增強CNP功能活性(例如活化cGMP信號傳導)。聚乙二醇化CNP變異體之非限制性實例包括PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)、PEO24-GANRR-CNP22(SEQID NO：36)、PEO12-GANRR-CNP22(SEQID NO：36)、PEO24-GANPR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：37)、PEO12-GANPR-CNP22(K4R)(SEQID NO：37)、PEO24-GANPR-CNP22(SEQID NO：37)、PEO12-GANPR-CNP22(SEQID NO：37)、PEO24-GANQQ-CNP22(SEQIDNO：64)、PEO12-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO：64)、PEO24-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)、PEO12-ER-CNP22(K4R)(SEQID NO：39)、PEO24-ER-CNP22(SEQIDNO：39)、PEO12-ER-CNP22(SEQID NO：39)、PEO24-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)、PEO12-R-CNP22(K4R)(SEQID NO：41)、PEO24-R-CNP22(SEQID NO：41)及PEO12-R-CNP22(SEQID NO：41)，其中PEO24為單分散性1.2kDaPEG聚合物且PEO12為單分散性0.6kDaPEG聚合物。在一實施例中，PEG(或PEO)聚合物係共軛至CNP變異體之N端。
本揭示案涵蓋使用以下方面可不同之親水性或水溶性聚合物(例如PEG)：類型(例如均聚物或共聚物；無規共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；線性或分支；單分散或多分散)、鍵聯(例如可水解鍵聯或穩定鍵聯，諸如醯胺、亞胺、胺、伸烷基或酯鍵)、共軛位點(例如在N端及/或C端，較佳不在CNP之環化區(對應於CNP22之殘基6-22)中任何殘基處)，及長度(例如約0.2、0.4或0.6kDa至約2、3、 4或5kDa)。親水性或水溶性聚合物可藉助於此項技術中已知之基於N-羥基丁二醯亞胺(NHS)或基於醛之化學或其它化學共軛至CNP胜肽。此等CNP變異體可使用以下產生： 例如wtCNP22(2.2kDa)、僅保留wtCNP22之環化區(殘基6-22)的CNP17、在CNP22或CNP17之N端及/或C端具有胺基酸延伸之CNP變異體，或具有胺基酸取代、添加及/或缺失之變異體，諸如GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO： 36)、 GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)、R- CNP22(SEQID NO：40)、R-CNP22(K4R)(SEQID NO： 41)、ER- CNP22(SEQID NO：38)及ER-CNP22(K4R)(SEQID NO： 39)。 在一實施例中，總質量之特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6或7kDa )之PEG- CNP變異體含有經由基於NHS或基於醛之化學共軛於N端及/或C端的單分散性線性PEG(或PEO)部分，經由基於NHS之化學共軛於N端及/或C端的兩臂或三臂分支PEG部分。本揭示案亦涵蓋經設計以降低腎清除率之帶負電PEG- CNP變異體，包括(但不限於)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物(Ca1iceti，A dv.DrugDe1iv.Rev.，55：1261-77(2003)；Per1man，J.C1in.Endo.M etab.，88：3227-35(2003)；Pit kin，Antimicrob.Ag.Chemo.，29：440-444(1986)；Vehaskari，Kidney Int' 1，22：127-135(1982))。在一實施例中，PEG(或PEO)部分含有羧基、硫酸根及/或磷酸根。
在另一實施例中，本文所述之共軛至CNP變異體之N端、 C端及/或內部位點的PEG(或PEO)部分含有一或多個在生理條件下帶正電荷之官能基。此等PEG部分尤其旨在改良此等聚乙二醇化CNP變異體於軟骨組織之分佈。在一實施例中，此等PEG部分含有一或多個一級、二級或三級胺基、四級銨基及/或其它含胺(例如脲)基團。
在一實施例中，本揭示案涵蓋經由基於NHS或基於醛之化學共軛至式(CH2 CH2 O)n之PEG(或PEO)的CNP22或其變異體，其中n為約6至約100之整數，且PEG聚合物為約0..3kDa 至約5kDa。在另一實施例中，n為約12至約50之整數，且PEG聚合物為約0.6kDa至約2.5kDa。在另一實施例中，n為約12至約24，且PEG聚合物為約0.6kDa至約1.2kDa 。在又一實施例中，PEG聚合物之末端羥基經非反應性基團封端。在一特定實施例中，封端基團為烷基，例如低碳烷基，諸如甲基。
在另一實施例中，本揭示案提供具有一或多個對胜肽酶(包括中性內肽酶(NEP))裂解之敏感性降低之胜肽鍵或胜肽鍵電子等排體的CNP變異體。NEP為裂解較大疏水性殘基之胺基端之受質胜肽鍵的膜結合鋅依賴性內肽酶。因此，將NEP之裂解位點處之胜肽鍵修飾為非天然胜肽鍵或非胜肽鍵可排除NEP裂解或降低NEP裂解之效率。
對於ANP及CNP，報導NEP裂解首先發生於環化區內之Cys6-Phe7鍵，接著發生於遍及結構之其餘部分的其它處。對於BNP，報導裂解首先發生於胜肽N端，接著發生於環狀結構內。儘管報導CNP上之主要NEP裂解位點為Cys6-Phe7鍵，但當將wtCNP22於活體外暴露於NEP消化維持2.5分鐘時，所有可能位點均意外水解，其中Cys 6- Phe 7及G1y8-Leu9胜肽鍵略微最不穩定，如實例2中所述。
NEP之受質特異性主要由兩個受質結合子位點S1'及S2'決定(Oefner等人，J.M o1.Bio1.296：341-349(2000))。S1'位點接受N端胜肽鍵經受水解之較大疏水性P1'殘基(例如Phe、 Leu、 I1e及 Met)。S2' 位點一般優選稱為P2'之較小殘基(例如G1y或Ser)。在CNP之情況下，報導Phe 7為NEP S1'位點之較佳P1' 殘基，而G1y8為S2' 位點之較佳P2'殘基。由於此兩個子位點一起僅可容納特定總側鏈尺寸，因此CNP之P1' -P2' 殘基之總尺寸的任何增大可能會潛在地破壞NEP結合。舉例而言，將氯原子添加於P1' Phe 7芳族環之3位(亦即3-C1-Phe7)可潛在地修飾CNP與 NEP裂解位點(例如在S1' 子位點)之間的相互作用(例如使該等相互作用不穩定)。 將第三丁基添加至較小P2' 殘基G1y8(亦即tBu-G1y8)可潛在地破壞CNP與S2' 子位點之間的相互作用。
因此，在一實施例中，本揭示案之CNP變異體包括P1'- P2' 殘基(諸如Phe7-G1y8)尺寸增大以干擾活性位點處之受質識別，藉此降低對NEP裂解之敏感性的CNP。天然胺基酸、 非天然胺基酸及/或胜肽模擬物部分可取代一或多個較大P1' 疏水性殘基(包括(但不限於)Phe 7、Leu 9、Leu 11、I1e14、 M et17及Leu20)及/或一或多個較小P2' 殘基(包括(但不限於)Cys6、G1y8、G1y15、Ser16及G1y19)。
本揭示案涵蓋在至少一個牽涉於受質識別及/或NEP裂解之殘基處包含至少一個經修飾胺基酸及/或至少一個經修飾胜肽鍵的CNP變異體，其中該等經修飾胺基酸及經修飾胜肽鍵可為天然胺基酸、非天然胺基酸、胜肽模擬物及/或胜肽鍵電子等排體。在一實施例中，CNP上在Cys6與Phe7之間的NEP裂解位點經修飾。在一相關實施例中，Cys6與Phe7之間的胜肽鍵(-C(=O)-NH-)經一個以下胜肽鍵電子等排體置換：-CH2-NH-，-C(=O)-N(R)-，其中醯胺基係經任何以下R基團烷基化：甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基，-C(=O)-NH-CH2 -，-CH2-S-，-CH2 -S(O)n -，其中n為1或2，-CH2-CH2-，- CH=CH- ，-C(=O)-CH2 -，-CH(CN)-NH-，-CH(OH)-CH2 -，-O-C(=O)-NH-，或-NHC(=O)NH-。
在另一實施例中，CNP變異體係由下式表示：(x)-G1y1 -Leu2-Ser3 -Lys4-G1y5-(b)6-(c)7-(d)8-Leu9-Lys1 0-Leu11 -Asp1 2-Arg13 -I1e1 4-G1y15 -Ser1 6-M et1 7-Ser1 8-G1y1 9-Leu20-G1y21 -Cys22 -(z)(SEQIDNO：90)，其中：(x)及(z)獨立地可不存在或可選自由以下組成之群：合成骨靶向化合物，諸如雙膦酸鹽；適用於靶向骨或軟骨之胺基酸序列，例如聚Asp及聚G1u；來源於骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)之骨靶向域的胺基酸序列(Wang等人，Adv.DrugDe1ivery Rev.，57： 1049- 76(2005))；降低腎清除率之聚合分子及非聚合分子，諸如帶負電PEG；及藉由使CNP變異體之總質量增至本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)來增強CNP變異體對NEP降解之抗性的天然聚合物(例如含有胺基酸、脂肪酸及/或碳水化合物之天然聚合物)及合成聚合物(例如PEG)；(b)及(c)可為野生型Cys6及Phe7、另一天然胺基酸或非天然胺基酸，或可含有如本文所述之胜肽鍵電子等排體以增強對NEP裂解之抗性；且(d)可為野生型G1y8，或可為較大天然或非天然(例如t- Bu-G1y)胺基酸或胜肽模擬物以減少與NEP之結合。
在一實施例中，此等CNP變異體在(b)、(c)及/或(d)處含有至少一個經修飾胺基酸。
即使CNP22或其變異體在Cys6-Phe7具有抗NEP之胜肽鍵或胜肽鍵電子等排體，但CNP內之其它胜肽鍵(包括G1y8- Leu9、 Lys10-Leu11、Arg13-I1e14、Ser16-M et17及G1y19- Leu20鍵)亦可能會被裂解。因此，本揭示案涵蓋除Cys6-Phe7鍵外亦在一或多個其它NEP裂解位點具有胜肽鍵電子等排體的CNP變異體，其中該等胜肽鍵電子等排體包括本文所述者。
在另一實施例中，本揭示案涵蓋在Cys6及/或Cys22具有半胱胺酸類似物(包括(但不限於)高半胱胺酸、青黴胺、2-巰基丙酸及3-巰基丙酸)之CNP變異體。在一實施例中，此等CNP變異體具有由野生型Cys6或類似物與Cys22或類似物之間的二硫鍵所形成之環狀域。
在另一實施例中，CNP22或其變異體之一或多個殘基(至多所有殘基)經D-胺基酸取代。以D-胺基酸取代L-胺基酸基本上將側鏈自其原始位置移動約120度，藉此可能破壞CNP胜肽與NEP之結合。在一特定實施例中，Phe7處之L- Phe經其D-對映異構體D-Phe取代。
在又一實施例中，β胺基酸(諸如3-胺基-2-苯基丙酸(或2-苯基-β-丙胺酸))置換野生型α-胺基酸Phe7。使用β-胺基酸將胜肽主鏈長度有效增加一個亞甲基單元。蛋白酶抗性可因受質構形之變化或胺基酸側鏈之間的距離增加而引起。
具有非天然α-胺基酸、β-胺基酸或胜肽鍵電子等排體之CNP22變異體之非限制性實例包括：GLSKGC(CH2 NH)FGLKLDRIGSMSGLGC(類似物A)(SEQIDNO：56)、GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似物B)(SEQIDNO：57)、GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似物E)(SEQIDNO：136)、GLSKGCF-(tBu-G1y)-LKLDRIGSMSGLGC(類似物F)(SEQIDNO：58)、GLSKGC-(3-C1-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似物G)(SEQIDNO：137)，及GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC(類似物H， 使用3-胺基-2-苯基丙酸形成)(SEQIDNO： 59)。
在另一實施例中，CNP變異體具有特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)之總質量，旨在增強對NEP降解之抗性，且該等變異體由下式表示：(x)-G1y1-Leu2-Ser3-(a)4-G1y5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)1 0-(g)11 -Asp12-Arg13-(h)14-G1y15-Ser1 6-(i)1 7-Ser1 8-G1y1 9-(j)20-G1y21 -Cys22-(z)(SEQIDNO：46)，其中：(x)及(z)獨立地可不存在或可選自由以下組成之群：合成骨靶向化合物，諸如雙膦酸鹽；適用於靶向骨或軟骨之胺基酸序列，諸如聚Asp及聚G1u；來源於骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)之骨靶向域的胺基酸序列；降低腎清除率之聚合及非聚合部分，諸如帶負電PEG；含有例如胺基酸、疏水性酸及/或碳水化合物之聚合物；及合成親水性聚合物，諸如PEG；(a)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基.- 正白胺酸、 瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg；(b)係選自由以下組成之群：Cys、及Cys6與Phe7之間的胜肽鍵電子等排體，諸如Cys-CH2 -NH；(c)係選自由以下組成之群：L-Phe；D-Phe；3-胺基-2-苯基丙酸；Phe之N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基；及Phe類似物，其中Phe類似物之苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位係經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、羥基、氰基、直鏈或分支鏈C1-6 烷基、直鏈或分支鏈C1-6 烷氧基、直鏈或分支鏈鹵基-C1-6 烷基、C3-10 環烷基、雜環基、C6-14 芳基及雜芳基(實例包括(但不限於)酪胺酸、3-氯苯丙胺酸、2，3-氯-苯丙胺酸、3-氯-5-氟-苯丙胺酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙胺酸)，或其中Phe類似物之苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙胺酸及2-萘基丙胺酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙胺酸、噻吩基丙胺酸及呋喃基丙胺酸)置換；(d)係選自由以下組成之群：G1y、第三丁基-G1y(tBu-G1y)、Thr、Ser、Va1及 Asn；(e)係選自由以下組成之群：Leu、Ser、Thr及胜肽鍵電子等排體，諸如N-Me-Leu；(f)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基-正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(f)不為Arg；(g)係選自由以下組成之群：Leu及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu；(h)係選自由以下組成之群：I1e、tBu-G1y、及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- I1e；(i)係選自由以下組成之群：Met、Va1、Asn、β- C1- A1a、 2-胺基丁酸(Abu)及2-胺基-異丁酸(Aib)；且(j)係選自由以下組成之群：Leu、正白胺酸(N1e )、高白胺酸(H1eu)、Va1、第三丁基-A1a(tBu-A1a)、Ser 、Thr 、Arg、及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Le u。
在另一實施例中，CNP變異體具有特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)之總質量，旨在增強對NEP裂解之抗性，且高等變異體由下式表示：(x)-G1y1-Leu2-Ser3-(a)4-G1y5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)1 0-(g)11 -Asp1 2-Arg13-(h)14-(i)15-Ser16-(j)17-Ser1 8-G1y1 9-(k)20-G1y21 -Cys22-(z)(SEQIDNO：143)，其中：(x)及(z)獨立地可不存在或可選自由以下組成之群：合成骨靶向化合物，諸如雙膦酸鹽；適用於靶向骨或軟骨之胺基酸序列，諸如聚Asp及聚G1u；來源於骨蛋白及其衍生物(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等之融合蛋白或胜肽序列)之骨靶向域的胺基酸序列；降低腎清除率之部分， 包括(但不限於)親水性或水溶性聚合物，諸如帶電PEG分子；及包含例如PEG、胺基酸、碳水化合物及/或疏水性酸之部分；(a)可為該位置之野生型Lys，或可經保守性胺基酸取代或在側鏈上不具有反應性一級胺之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(包括(但不限於)Arg、G1y、6-羥基-正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n、Ser或 G1u)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg；(b)係選自由以下組成之群：Cys、及Cys6與Phe7之間的胜肽鍵電子等排體，諸如Cys-CH2 -NH；(c)係選自由以下組成之群：L-Phe；D-Phe；3-胺基-2-苯基丙酸；Phe之N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基；及Phe類似物，其中Phe類似物之苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位係經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、羥基、氰基、直鏈或分支鏈C1-6 烷基、直鏈或分支鏈C1 -6 烷氧基、直鏈或分支鏈鹵基-C1-6 烷基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、雜環基及雜芳基(實例包括(但不限於)酪胺酸、3-氯苯丙胺酸、2，3-氯-苯丙胺酸、3-氯-5-氟-苯丙胺酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙胺酸)，或其中Phe類似物之苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙胺酸及2-萘基丙胺酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙胺酸、噻吩基丙胺酸及呋喃基丙胺酸)置換；(d)係選自由以下組成之群：G1y、第三丁基-G1y、Thr、Ser、Va1及 Asn；(e)係選自由以下組成之群：Leu、Ser、Thr 及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu ；(f)係選自由以下組成之群：Lys、Arg、G1y、6- 羥基- 正白胺酸、瓜胺酸(Cit)、G1n 及 Ser；(g)係選自由以下組成之群：Leu、Asn及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu；(h)係選自由以下組成之群：I1e、第三丁基-G1y(tBu- G1y)、Asn及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- I1e ；(i)係選自由以下組成之群：G1y、Arg、Ser 及 As n；(j)係選自由以下組成之群：Met、Va1、Asn、β- C1- A1a、2-胺基丁酸(Abu)及2-胺基-異丁酸(Aib)；且(k)係選自由以下組成之群：Leu、正白胺酸(N1e)、高白胺酸(H1eu)、Va1、第三丁基-A1a(tBu-A1a)、Arg、Thr 、Ser及胜肽鍵電子等排體，諸如N- Me- Leu。
為改良CNP變異體傳遞至骨相關病症(例如骨骼發育不全)之目標部位，可將CNP變異體連接(例如在N端及/或C端)至靶向骨/軟骨之部分。靶向骨/軟骨之部分的非限制性實例包括雙膦酸鹽；羥基磷灰石；葡糖胺；膠原蛋白(例如X型膠原蛋白)；聚Asp；聚G1u；及來源於骨蛋白(諸如骨織素、骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)之骨靶向域的胺基酸序列。
除較不易為NEP裂解之外，CNP變異體亦可能具有降低之對NPR-C清除受體之親和力，同時保留CNP功能性。除NEP介導之降解外，CNP22之半衰期亦受清除受體NPR- C影響，該NPR-C與NPR-B之細胞外胜肽結合域共享58%之序列同源性。CNP22不僅緊密結合於NPR-B(7-30pM親和力)，而且亦緊密結合於NPR-C(11-140 pM)(Bennett，B.D.等人，J.Bio1.Chem.，266：23060-67(1991)；Ko11er K.J.及Goedde1，D.V.，Circu1ation，86：1081-88(1992)；Suga，S.等人，Endocrino1ogy，130：229-39(1992))。儘管NPR-B晶體結構尚有待報導，但NPR-C與NPR-A晶體結構之間的序列同源性以及相似性(He，X.-L.等人，Science，293(5535)：1657-62(2001)；Ogawa，H.等人，J.Bio1.Chem.，279(27)：28625-31(2004)；He，X.-L.，J.Mo1.Bio1.，361(4)：698-714(2006))表明NPR-B可能呈現類似之總體結構摺疊。
因此，依據基於結構之序列比對及以下相關系統之結晶結構來建立NPR-B同源性模型：結合於NPR-C之CNP、結合於NPR-A之ANP，及結合於NPR-C之ANP(He，X.-L.等人，Science，293(5535)：1657-62(2001)；Ogawa，H.等人，J.Bio1.Chem.，279(27)：28625-31(2004)；He，X.-L.，J.Mo1.Bio1.，361(4)：698-714(2006))。依據受體似乎決定所結合胜肽之構形，且就一級結構及功能特性而言NPR-B最接近類似於NPR-A之觀察結果，以NPR-A/ANP晶體結構作為模型來建立NPR-B/CNP同源性模型。使用公開的CNP變異體之信號傳導資料(美國專利第5，434，133號及美國專利申請公開案第2004/0138134A1號)及不再結合於NPR-C之功能性ANP變異體之信號傳導資料(Cunningham，EMBO13(11)2508-15，1994)來改進及解釋NPR-B/CNP模型。
本揭示案涵蓋依據NPR-B/CNP複合物之基於同源性的結構模型，經設計以改良NPR-B選擇性之CNP變異體。組合結合於各種受體之利鈉胜肽之實驗及計算結構資料與公開之功能性資料，產生仍舊結合於NPR-B但可潛在地降低對NPR-C清除受體之親和力的CNP變異體。舉例而言，NPR- C在環結構中於胜肽結合位點中具有獨特插入，從而使得與NPR-A及NPR-B中之各別環殘基相比，該NPR- C之環殘基處於更靠近諸如CNPG1y8(或ANP G1y9)之胜肽殘基的位置。 早期研究表明，ANP中之G9T突變有助於降低對NPR- C之親和力，藉此改良NPR-A選擇性(Cunningham，EMBOJ.，13(11)：2508-15(1994))。因此，產生CNP變異體以用較大殘基(Ser、Va1、Thr或 Asn)置換相應G1y8殘基，以在不影響CNP與NPR-B之結合的情況下，破壞其與NPR- C之結合。此外，依據對受體/胜肽複合物之詳細結構分析，將一或多個突變引入預期與受體特異性殘基相互作用之CNP的 C端(涵蓋G1y15至G1y21)。舉例而言，CNP22中之G19R突變不會引起NPR-B信號傳導活性之顯著損失。然而， 不能在不改變鄰近殘基之構形的情況下，於NPR- C/CNP之可用晶體結構中模擬此突變。此等觀察結果表明， G19R突變可能會選擇性破壞CNP與特定受體(諸如NPR-C)之結合。
在一實施例中，CNP變異體在位置1、5、8、15、19及21之一或多個G1y位點具有取代，以降低構形可撓性且藉此增強受體特異性。對結合於NPR-C及NPR-A之ANP的晶體結構之比較分析(Ogawa，H.等人，J.Bio1.Chem.，279：28625-31(2004)；He，X.-L.，J.Mo1.Bio1.，361：698-714(2006))表明ANP之構形可撓性可在決定受體選擇性方面起到重要作用。
在一實施例中，對NPR-C之親和力可能降低的功能性CNP變異體具有一或多個以下胺基酸取代：G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、L20S、G21S、G21T及G21R。在一實施例中，CNP變異體在位置1、5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、20及/或21具有多點取代，且可視情況在變異體之胜肽序列之任何其它位置具有修飾。
在另一實施例中，可將本文所述之CNP變異體在N端、C端及/或內部位點共軛至部分，直至總質量之特徵在於本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa或2.8kDa至約6kDa或7kDa)，以有助於靶向骨/軟骨、降低NPR-C及腎清除率、增強對NEP降解之抗性，及/或改良CNP功能性。在一實施例中，CNP變異體未在環狀區域(對應於CNP22之Cys6至Cys22)內之位點共軛至聚合部分。可共軛至CNP變異體之聚合或非聚合部分的非限制性實例包括合成骨靶向化合物，諸如雙膦酸鹽；骨/軟骨靶向胜肽序列，諸如聚Asp及聚G1u；來源於骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)之骨靶向域的胜肽序列；來源於骨形態發生蛋白(諸如BMP2、 BMP3、BMP5、BMP7及BMP8a)之功能域的胜肽序列；來源於利鈉來源之多肽(例如NPPC、ANP及BNP)的胜肽序列；其它天然聚合或非聚合部分，諸如碳水化合物、脂肪酸及磷脂；生物相容性合成親水性聚合物，諸如PEG(或PEO)；疏水性聚合或非聚合部分，諸如庚酸及戊酸；及其組合。
例如就刺激cGMP產生及信號傳導而言，本文所述之CNP變異體可具有與CNP22相比實質上類似或更佳之功能活性。 在一實施例中，CNP變異體於活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22(例如1μM)下所產生之c GMP量的至少約50%。在某些實施例中，CNP變異體保留野生型CNP22活體外或活體內之cGMP刺激活性的至少約50%、60%、 70%、80%、90%、95%或100%。在另一實施例中，與CNP22相比，CNP變異體具有改良之cGMP刺激活性。在某些實施例中，CNP變異體於活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22(例如1μm)下所產生之cGMP量的至少約110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%或更高。
本揭示案中視情況排除本文中所參考之任何先前公開案中特定揭示之任何利鈉(例如CNP)胜肽、片段及變異體，及實際產生之任何利鈉(例如CNP)胜肽、片段及變異體，該等先前公開案包括(但不限於)：U.S.5，434，133、U.S.6，034，231、U.S.6，020，168、U.S.6，743，425、U.S.7，276，481、WO94/20534、WO02/047871、WO2005/098490、WO2004/047871、EP 0497368、EP 0466174，及Furuya等人，Biochem.Biophys.Res. Comm. 183: 964-969(1992))。所有此等文獻均以全文引用的方式併入本文中。
在一實施例中，本揭示案視情況排除所有已知野生型CNP- 53、野生型CNP-22、野生型CNP-17、野生型BNP及人類來源及非人類來源之野生型ANP。舉例而言，在一實施例中，本揭示案視情況排除人類CNP-17、人類CNP-22、雞CNP-22(對應於hCNP-22(Leu9Va1))、鱒魚及鰻魚CNP-22(對應於hCNP-22(Leu2Trp、Ser3Asn、Lys4Arg))、蛙CNP22-I(對應於hCNP-22(Leu2Tyr、Lys4Arg、Leu9Va1、Ser16A1a、Met17Phe))、蛙CNP22-II(對應於hCNP-22(Leu2Thr、Ser16A1a))、人類CNP-53，及豬及大鼠CNP-53(對應於hC NP-53(G1n17His、A1a28G1y))。在另一實施例中，本揭示案視情況排除藉由在人類及非人類動物中活體內蛋白水解裂解產生之NPPC、原CNP及CNP-53之片段。在另一實施例中，本揭示案視情況排除野生型人類CNP-53之以下截短片段：CNP-50、CNP-46、CNP-44、CNP-39、CNP- 30、CNP- 29、CNP- 28、CNP-27及CNP-26。
在另一實施例中，本揭示案視情況排除自鯊魚物種皺唇鯊(Triakis scyllia)及小點貓鯊(Scyliorhinus canicula)分離或搜尋到之CNP胜肽及其片段(例如參看M.Takano等人，Zoo1.Sci.，11：451-454(1994))，其包括：RLLKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQIDNO：204)；LKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQIDNO：205)；KDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQIDNO：206)；及GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO： 207)。
在另一實施例中，本揭示案視情況排除自鯊魚物種鼠鯊(Lamna ditropis)分離或搜尋到之CNP胜肽及其片段(例如參看M.Takano等人，Zoo1.Sci.，11：451-454(1994))，其包括：RLLKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQIDNO：208)；LKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQIDNO：209)；KDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQIDNO：210)；FKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-29)(SEQIDNO：211)；及GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO： 212)。
在又一實施例中，本揭示案視情況排除自鯊魚物種白斑角鯊(Squalus acanthias)分離之CNP胜肽及其片段(例如參看M.Takano等人，Zoo1.Sci.，11：451-454(1994))，其包括：RLLQDLSNNPLRFKGRSKKGPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQIDNO：213)；及GPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO：214)。
在另一實施例中，本揭示案視情況排除自青鱂(medaka)及河豚(puffer fish)分離之C NP胜肽，其在K.Inoue等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，100(17)：10079-10084(2003)中命名為「CNP-1」、「CNP-2」、「CNP-3」及「CNP-4」：GWNRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(青鱂及河豚CNP-1)(SEQIDNO：215)；PMVAGGGCFGMKMDRIGSISGLGC(青鱂CNP-2)(SEQ ID NO：216)；GRSSMVGGRGCFGMKIDRIGSISGLGC(河豚CNP-2)(SEQIDNO：217)；GGMRSCFGVRLERIGSFSGLGC(青鱂CNP-3)(SEQ ID NO: 218)；GGLRSCFGVRLARIGSFSGLGC(河豚CNP-3)(SEQID NO：219)；GGSTSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC(青鱂CNP-4)(SEQ IDNO：220)；及GGSSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC(河豚CNP-4)(SEQ IDNO：221)。
在另一實施例中，本揭示案視情況排除自鴨嘴獸(p1atypus)毒液分離之CNP-39及其CNP-22片段，其在G.de P1ater等人，Toxicon.，36(6)：847-857(1998)中命名為「ovCNP-39」及「ovCNP-39(18-39)」：LLHDHPNPRKYKPANKKGLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39)(SEQIDNO：222)；及GLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39(18-39)(SEQ IDNO：223)。
在另一實施例中，本揭示案視情況排除以下如US2007/0197434中特定揭示之胜肽：G1y-Leu-Ser-Lys-G1y-Cys-Phe-G1y-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg- I1e- G1y-A1a-Met-Ser-G1y-Leu-G1y-Cys(SEQID N O：224)；G1y-Leu-Ser-Lys-G1y-Cys-Phe-G1y-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg- I1e- G1y-Ser-G1n-Ser-G1y-Leu-G1y-Cys(SEQ ID N O：225)；G1y-Leu-Ser-Lys-G1y-Cys-Phe-G1y-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-I1e-G1y-Ser-A1a-Ser-G1y-Leu-G1y-Cys(SE Q ID N O：226)；Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-G1y-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-I1e-G1y-Ser-M et-Ser-G1y-Leu-G1y-Cys(SE Q ID N O：227)；G1y-Leu-Ser-Lys-G1y-Cys-Phe-G1y-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-I1e- G1y-Ser-M et-Ser-G1y-Leu-G1y-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQIDNO：228)；及Cys-Phe-G1y-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-I1e-G1y-Ser- G1n- Ser- G1y-Leu-G1y-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQID N O：229)。
在另一實施例中，本揭示案視情況排除US2007/0197434中一般性揭示之SEQIDNO：10之胜肽，其中此等胜肽為在位置4、5、6、11、12、14及/或15具有特定天然胺基酸取代之CNP-17變異體。在又一實施例中，本揭示案視情況排除對應於以下之胜肽：hCNP-53(Ser47A1a)、hCNP-53(Met48G1n)、hCNP-53(Met48A1a)及hCNP-53(C端)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr。
在一實施例中，本揭示案視情況排除如US7，276，481中特定揭示的SEQIDNO：1-4及6-71之胜肽。在另一實施例中，本揭示案視情況排除US7，276，481中一般性揭示之SEQID NO：5之胜肽，其中此等胜肽為在Leu9、Lys10、Leu11、Ser16、Met17、G1y19及/或 Leu20具有至少一個天然胺基酸取代之CNP17變異體。在又一實施例中，視情況排除CNP17或其變異體含有N-Me-Phe7或N-Me-Phe7及N-Me- Leu11之 CNP17變異體。在另一實施例中，本揭示案視情況排除融合或共軛至生長激素(GH)、類胰島素生長因子1(IGF-1)或甲狀腺激素(TH)的如US7，276，481中揭示之SEQIDNO：5之CNP17變異體。在另一實施例中，視情況排除CNP22融合至GH、IGF-1或TH或經由連接子(例如胜肽連接子)連接至GH、IGF-1或TH之CNP22變異體。在又一實施例中，視情況排除CNP17或其變異體在N端或C端共軛至生物素或螢光素之CNP17變異體。
在另一實施例中，本揭示案視情況排除如US5，434，133中特定揭示之化合物第1-27號及SEQIDNO：1-17、22-24、30、31及40-42之胜肽。在另一實施例中，本揭示案視情況排除US5，434，133中一般性揭示之SEQIDNO：18-21及25-29之胜肽。在又一實施例中，本揭示案視情況排除如WO94/20534中特定揭示之SEQIDNO： 1- 4及9之胜肽。
然而， 在一些實施例中，本揭示案仍涵蓋本文中視情況排除之利鈉(例如CNP)胜肽、片段及變異體的使用方法，以及包含此等利鈉(例如CNP)胜肽、片段及變異體之醫藥組合物(包括無菌醫藥組合物)。
C.CNP變異體之合成及純化
在一些實施例中，本文所述之CNP變異體係藉由重組表現， 使用此項技術中已知之某些技術(在某些實施例中)來產生。例如參看Sambrook，Fritsch 及 M aniatis ，M o1ecu1arC1oning：A Laboratory Manua1，第2版。 Co1dSpring HarborLaboratory Press(Co1d Spring Harbor，N.Y.(1989))；DNAC1oning：A Practica1 Approach，第I及第II卷，D.N.G1over編(1985)；及Current Protoco1sin M o1ecu1ar Bio1ogy，JohnWi1ey＆Sons，Inc.(1994)。
在某些實施例中，藉由重組方法產生本文所述之CNP變異體， 該重組方法包含將包含編碼CNP變異體多肽之第一聚核苷酸連接至編碼可裂解胜肽或蛋白質之第二聚核苷酸的宿主細胞在培養基中在使得由該等聚核苷酸編碼之融合多肽得以表現之條件下培養，其中該融合多肽包含CNP變異體多肽直接連接至可裂解胜肽或蛋白質或經由連接子與其間接連接。在一些實施例中，用包含編碼CNP變異體多肽之聚核苷酸連接至編碼可裂解胜肽或蛋白質之聚核苷酸的表現載體來轉型宿主細胞。在某些實施例中，融合多肽表現為可溶蛋白質或包涵體。可自宿主細胞或培養基分離所表現之融合多肽，且可使經分離之融合多肽與裂解劑接觸以釋放CNP變異體。
用以產生CNP變異體之宿主細胞可為細菌、酵母、昆蟲、非哺乳動物脊椎動物或哺乳動物細胞。細菌細胞包括(但不限於)大腸桿菌(E.coli)細胞株及菌株。大腸桿菌細胞株及菌株之非限制性實例包括BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pGro7、ArcticExpress(DE3)、 C41[亦稱作C41(DE3)]、C43[亦稱作C43(DE3)]、Origami B(DE3)、OrigamiB(DE3)pLysS、KRX 及 Tuner(DE3)。在一實施例中，使用BL21(DE3)細胞來產生CNP變異體及CNP融合蛋白。哺乳動物細胞包括(但不限於)倉鼠、猴、黑猩猩、犬、貓、牛、豬、小鼠、大鼠、兔、綿羊及人類細胞。宿主細胞可為永生化細胞(細胞株)或非永生化(原生或次生)細胞，且可為多種細胞類型中之任一種，諸如(但不限於)纖維母細胞、角質細胞、上皮細胞(例如乳腺上皮細胞、腸上皮細胞)、卵巢細胞(例如中國倉鼠卵巢或CHO細胞)、內皮細胞、神經膠質細胞、神經細胞、血液之形成成分(例如淋巴細胞、骨髓細胞)、軟骨細胞及其它骨源性細胞，及此等體細胞類型之前驅體。在適於細胞生長、表現DNA或RNA及鑑別/選擇表現CNP變異體之細胞的條件下培養含有CNP變異體DNA或RNA之宿主細胞。
在一些實施例中，使宿主細胞在約10℃至約40℃，或約20℃至約40℃，或約30℃至約40℃之溫度下生長或培養一段時間。在某些實施例中，使宿主細胞在約20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、35℃或37℃下生長或培養一段時間。在某些實施例中，使宿主細胞在約35℃或37℃下生長或培養一段時間。
使編碼CNP變異體多肽(包括CNP融合蛋白)之重組聚核苷酸於包含含有表現控制序列可操作地連接至待表現核苷酸序列之重組聚核苷酸的表現載體中表現。表現載體包含足夠用於表現之順式作用元件；其它用於表現之元件可由宿主細胞或活體外表現系統供應。表現載體包括此項技術中已知之所有表現載體，包括(但不限於)黏質體、質體(例如裸質體或含於脂質體中之質體)及併有重組聚核苷酸之病毒。經由轉型或轉染將表現載體插入適當宿主細胞中以便表現編碼多肽之聚核苷酸(例如參看Sambrook等人(同上文))。
預期用於產生CNP變異體(包括可裂解CNP融合蛋白)之表現載體的非限制性實例包括pJexpress、pJex press 401、pJexpress404、 pE T-15b、pE T-21a、pET-22b、pE T-31b、pET-32a、 pET-41a、pMAL、pMAL-c2X、pQE-30、pET- SUMO及pTYB11。特定構築體之表現可產生呈包涵體形式之可溶CNP變異體(包括CNP融合蛋白)或不可溶CNP變異體(包括CNP融合蛋白)。
在一些實施例中，使用異丙基β-D-1-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)誘導性載體來增強編碼CNP變異體或CNP融合蛋白之聚核苷酸的表現。在一些實施例中，使宿主細胞在IPTG存在下，在約10℃至約40℃，或約20℃至約40℃，或約30℃至約40℃之溫度下生長或培養一段時間。在某些實施例中，使宿主細胞在IPTG存在下，在約20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、35℃或37℃下生長或培養一段時間。在某些實施例中，使宿主細胞，在1mMIPTG存在下，在約35℃或37℃下生長或培養一段時間。
在其它實施例中，使宿主細胞與濃度為約0.4mM至約2mM，或約0.4mM至約1.5mM，或約0.4mM至約1mM之IPTG一起培養。在某些實施例中，IPTG濃度為約0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mM。在一實施例中，IPTG濃度為約1mM。
在某些實施例中，本文所述之CNP變異體重組表現為包含CNP變異體多肽及可裂解載體蛋白或可裂解標籤(例如胜肽標籤)之融合蛋白，其中該融合蛋白包含CNP變異體多肽直接連接至可裂解載體蛋白或標籤或經由連接子與其間接連接。使用載體蛋白或標籤有助於例如偵測、分離及/或純化融合蛋白。可裂解載體蛋白及標籤包括(但不限於)組胺酸(例如六His)標籤；人類轉錄因子TAF12(TAF12)、TAF12片段、TAF12組蛋白摺疊域、TAF12之突變體及其片段 、 TAF12(C/A) 、 TAF12(D/E) 、 TAF12(4D/4E) 、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A 及 D/E)、TAF12(C/A及4D/4E)、TAF12(C/A及6D/6E)、TAF12(C/A及10D/10E)；酮類固醇異構酶(KSI)；麥芽糖結合蛋白(MBP)；β-半乳糖苷酶(β-Ga1)；麩胱甘肽- S- 轉移酶(GST)；硫氧化還原蛋白(Trx)；甲殼素結合域(CBD)；BMP-2、 BMP-2突變體、BMP-2(C/A)；SUMO；及其突變體及片段。
表現構築體可表現包含CNP變異體及載體蛋白或標籤之融合蛋白。標籤可為賦予融合蛋白適用特性之胺基酸序列。 在一實施例中，標籤為配位體結合域，其可用以藉由將融合蛋白施加至含有該配位體之分離介質來純化融合蛋白。舉例而言，可將包含麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)域之融合蛋白施加至含有連接有麩胱甘肽之分離介質的層析管柱。 作為另一實例，可將包含麥芽糖結合蛋白(MBP)作為標籤之融合蛋白施加至含有麥芽糖之分離介質。作為另一實例，可將包含聚組胺酸標籤之融合蛋白施加至鎳柱，藉此聚組胺酸標籤螯合於鎳柱有助於純化融合蛋白。在另一實施例中，標籤為配位體。舉例而言，融合蛋白可包含麩胱甘肽作為標籤且施加至含有連接有麩胱甘肽- S- 轉移酶之分離介質的層析管柱。適用於融合蛋白之載體蛋白及標籤之非限制性實例包括(但不限於)人類轉錄因子TAF12(TAF12)、酮類固醇異構酶(KSI)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、β-半乳糖苷酶(β-Ga1)、麩胱甘肽- S- 轉移酶(GST)、 硫氧化還原蛋白(Trx)、甲殼素結合域(CBD)、BMP-2突變體(BMPM)、SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、 鏈球菌蛋白、澱粉結合蛋白、內葡聚糖酶A之纖維素結合域、外葡聚糖酶Cex之纖維素結合域、生物素結合域、recA、F1ag、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(G1n)、聚(Phe)、聚(Cys)、綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、青色螢光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體抗原決定基，及其突變體及片段。
為產生目標CNP變異體，載體蛋白或標籤可藉助於化學裂解、蛋白酶裂解或蛋白質自裂解自融合蛋白裂解。例示性化學及蛋白水解裂解劑(裂解位點在括弧中)包括(但不限於)甲酸(Asp-Pro)、溴化氰(CNBr)(Met-X)、羥胺(Asn-G1y)、因子Xa(IEGR-X)(SEQ ID NO：230)、腸激酶(DDDDK-X)(SEQID NO：231)、ProTEV(EXXYXQ-G)(SEQIDNO：232)，及SUMO蛋白酶。由於特定種類化學裂解之性質，因此使用甲酸來進行裂解可產生Pro-CNP，CNBr可產生Met經取代為Asn之 CNP，且羥胺可產生G1y-CNP。或者，藉由使用不表現為融合蛋白之CNP變異體之特定構築體(例如pET-21a-CNP)，可避免化學或蛋白酶裂解。pET-21a-CNP之表現可產生Met-CNP。或某些融合蛋白(例如含有內含肽CBD之融合蛋白)可經歷自裂解來產生CNP。
在其它實施例中，融合蛋白在CNP變異體與載體蛋白或標籤(例如胜肽標籤)之間包含可裂解胜肽連接子。在某些實施例中，可裂解胜肽連接子係選自由以下組成之群：Asp-Pro、Asn-G1y、Met-X、Va1-Asp-Asp-Arg(SEQ ID N O：233)、G1y-Ser-Asp-Arg(SEQ ID N O：234)、I1e-Thr-Asp-Arg(SEQ IDNO：235)、Pro-G1y-Asp-Arg(SEQ ID N O：236)、I1e-G1u-G1y-Arg-X(SEQID NO：230)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X(SEQ ID NO：231)、G1u- X- X-Tyr-X-G1n-G1y(SEQ ID NO：232)、A1a-Phe-Leu-G1y-Pro-G1y-Asp-Arg(SEQIDNO：237)，及MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTGDDDDKHMD(pET-15b連接子)(SEQID NO：95)，其中X表示胺基酸。在一些實施例中，可裂解胜肽連接子係藉由選自由以下組成之群的裂解劑裂解：鈀、溴化氰(CNBr)、甲酸、羥胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、 胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸激酶(腸肽酶)、Kex 2蛋白酶、OmpT蛋白酶、因子Xa蛋白酶、枯草桿菌蛋白、proTEV、 SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、furi1isin蛋白酶、Ig A蛋白酶、人類Pace 蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(凝乳酶)、微生物天冬胺酸蛋白酶、木瓜酶、鈣蛋白酶、木瓜凝乳酶、無花果酶(無花果蛋白酶)、鳳梨酶(菠蘿蛋白酶)、組織蛋白酶B、 卡斯蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、內切蛋白酶Ar g- C、內切蛋白酶G1u-C、內切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纖維蛋白溶酶。
在某些實施例中，可裂解載體蛋白、標籤(例如胜肽標籤)或胜肽連接子係使用甲酸來裂解以自融合蛋白釋放CNP變異體。在一些實施例中，甲酸濃度為約1%至約20%，或約1%至約15%，或約2%至約15%，或約1%至約10%，或約2%至約10%，或約1%至約5%，或約2%至約5%。在某些實施例中，甲酸濃度為約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%。在某些實施例中，甲酸濃度為約2%、5%或10%。
在其它實施例中，在甲酸存在下，在約20℃至約80℃，或約30℃至約75℃，或約40℃至約75℃，或約50℃至約75℃，或約50℃至約70℃，或約55℃至約70℃，或約50℃至約60℃之溫度下進行CNP融合蛋白裂解。在一些實施例中，在甲酸存在下，在約20℃、22℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃下進行裂解。在某些實施例中，在甲酸存在下，在約50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下進行裂解。在某些實施例中，在甲酸存在下，在約55℃或70℃下進行裂解。
在其它實施例中，甲酸存在下CNP融合蛋白之裂解進行約3小時至約48小時，或約5小時至約48小時，或約5小時至約36小時，或約5小時至約24小時，或約5小時至約18小時，或約20小時至約24小時，或約6小時至約10小時之時段。在某些實施例中，甲酸存在下之裂解進行約5小時、6小時、12小時、15小時、18小時、20小時或24小時。
在一些實施例中，CNP融合蛋白之裂解在約2%、5%或10%甲酸存在下，在約55℃下進行約20小時至約36小時，或在約60℃下進行約15小時至約24小時，或在約65℃下進行約10小時至約21小時，或在約70℃下進行約6小時至約18小時。在某些實施例中，CNP融合蛋白之裂解在約2%甲酸存在下，在約55℃下進行約20小時至約24或36小時，或在約60℃下進行約15小時至約24小時，或在約65℃下進行約10小時至約18小時，或在約70℃下進行約6小時至約10小時。
本揭示案提供使用甲酸來裂解CNP融合蛋白以得到高CNP變異體產率之溫和條件。本文所述使用甲酸來裂解融合蛋白之條件亦適用於裂解包含除CNP外之多肽或蛋白質之融合蛋白，其中該等融合蛋白含有Asp-Pro 胜肽鍵。
在其它實施例中，在CNP融合蛋白之化學裂解(例如使用甲酸)或蛋白水解裂解之前，先以緩衝液及/或清潔劑處理可溶性CNP融合蛋白或CNP融合蛋白包涵體。緩衝液之非限制性實例包括B-PER II；經稀釋B-PERII(例如1/20稀釋度)；B-PER；B-PER磷酸鹽緩衝液；含有Tr is 之緩衝液(例如25m M Tris，pH7.5)；含有Tris及 NaC1之緩衝液(例如25mM Tris、150mM NaC1，pH7.9)；及PBS。在一實施例中，緩衝液為B-PERII。清潔劑之非限制性實例包括辛基蔗糖、Triton X-100、Tween-20、NP-40及CA- 630。清潔劑可位於緩衝液中(例如，含1%清潔劑之25mMTr is 緩衝液(pH7.5))。在某些實施例中，清潔劑為Tr iton X- 100或CA-630。
應瞭解，上述任何方法及條件可與上述任何其它方法及條件組合使用來產生本文所揭示之CNP變異體。
在其它實施例中，本文所述之CNP變異體係使用胜肽合成器合成且根據此項技術中已知之方法，例如根據Atherton 及 Sheppard，Solid Phase Peptide Synthesis：aPracticalApproach，IRL Press(Oxford，Eng1and(1989))之方法進行純化。
胜肽可基於例如CNP之以下胜肽序列來合成：G1 LS(K或R)GC6 F7 G8 L(K或R或N1e或6-OH-N1e)LDRIGSMSGLGC22 。
例示性CNP變異體包括(但不限於)：類似物A(GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC)(SEQIDNO： 56)係藉由將C6 之主鏈「-C=O」基團轉化為「-CH2 」基團來製得；類似物B(GLSKGC(N-Me-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(SEQIDNO：57係藉由將F7 之主鏈「-NH」基團轉化為「-N-CH3 」基團來製得；類似物E(GLSKGC(D-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(SEQIDNO：136)係藉由在F7 使用D-Phe來製得；類似物F(GLSKGCF(tBu-G1y)LKLDRIGSMSGLGC)(SEQIDNO：58)係藉由在G8 使用第三丁基-G1y來製得；類似物G(GLSKGC(3-C1-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(SEQIDNO：137)係藉由將氯原子添加至F7 之苯環之間位來製得(類似變異體可藉由以C1、F、Br、OH及/或CH3 對Phe7之苯環進行鄰位、間位及/或對位取代來產生)；且類似物H(GLSKGC[NHCH2 CH(Ph)CO]GLKLDRIGSMSGLGC)(SEQIDNO：59)係藉由在F7 使用(±)-3-(胺基)-2-苯基丙酸來製得。
具有例如胺基酸延伸、天然或非天然胺基酸或胜肽鍵電子等排體之取代，及/或與聚合物或疏水部分之共軛的CNP變異體的實例包括(但不限於)：
類似物J C6-CH2-NH、N-Me-L9、N-Me-L20(SEQIDNO：91)
類似物K N-Me-L9、N-Me-L20(SEQIDNO：92)
類似物L N-Me-L9、N-Me-L11、N-Me-L20(SEQIDNO：93)
類似物M N-Me-L9、N-Me-L11(SEQIDNO：94)
類似物Z K4R、F7Y(SEQIDNO：95)
類似物AA K4R、G8V(SEQIDNO：96)
類似物AB K4R、G8S(SEQIDNO：97)
類似物AC K4R、G8T(SEQIDNO：98)
類似物AD K4R、L9T(SEQIDNO：99)
類似物AE K4R、G15R(SEQIDNO：100)
類似物AF K4R、G15Cit(SEQIDNO：101)
類似物AG K4R、M17V(SEQIDNO：102)
類似物AH K4R(SEQIDNO：35)
類似物AJ K4R、L20V(SEQIDNO：103)
類似物AK K4R、L20t-Bu-A1a(SEQIDNO：104)
類似物AT G1E、K4E(SEQIDNO：105)
類似物AV G1E、K4E-戊酸(連接於N端)(SEQIDNO：106)
類似物AW G1E、K4E-庚酸(連接於N端)(SEQIDNO：107)
類似物AX CNP17(ΔN端)(SEQIDNO：2)
類似物AY GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)
類似物AZ R-CNP22(K4R)(SEQIDNO：41)
類似物BB G1E-庚酸(連接於N端)(SEQIDNO：108)
類似物BC G1E-戊酸(連接於N端)(SEQIDNO：109)
類似物BF K4R、K10Cit(SEQID NO：110)
類似物BG K4R、K10Q(SEQIDNO：111)
類似物BH K4R、K10R(SEQIDNO：112)
類似物BJ K4R、G15N(SEQIDNO：113)
類似物BK K4R、G15S(SEQIDNO：114)
類似物BL CNP-37(SEQIDNO：60)
CNP-53(SEQIDNO：4)
類似物CA AAWARLLQEHPNA-CNP22(SEQIDNO：61)
類似物CB AAWARLLQEHPNAR-CNP22(SEQIDNO：62)
類似物CC DLRVDTKSRAAWAR-CNP22(SEQIDNO：63)
類似物CD SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(N端及C端BNP尾)(SEQIDNO：68)
類似物CE GERAFKAWAVARLSQ-CNP22(HSA-CNP22)(SEQIDNO：81)
類似物CF GQPREPQVYTLPPS-CNP22(SEQIDNO：79)
PEG(24K)-CNP22
PEG(20K)-CNP22
PEG(5K)-CNP22
PEG(2K)-CNP22
PEG(2K)-CNP17
PEG(1K)-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)
PEG(1K)-CNP22
PEO4-(PEO12)3(分支)-CNP22
PEO12- CNP22
PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)
PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)；及SEQIDNO：1至6及34至144，及其包含至多1、2、3、4或5個其它修飾之變異體。
在一實施例中，CNP變異體經由在Cys6 與Cys22 之間形成二硫鍵來環化。Cys6 可為半胱胺酸類似物，諸如高半胱胺酸或青黴胺。在另一實施例中，CNP變異體可藉由頭至尾、 側鏈至側鏈、側鏈至頭或側鏈至尾形成之共價鍵來環化。在一實施例中，在位於或靠近胜肽之N端的胺基酸與位於或靠近胜肽之C端的胺基酸(在此上下文中稱作「末端」胺基酸)之間形成共價鍵。在另一實施例中，在兩個末端胺基酸之側鏈之間形成共價鍵。在另一實施例中，在一個末端胺基酸之側鏈與另一末端胺基酸之末端基團之間，或在兩個末端胺基酸之末端基團之間形成共價鍵。
末端胺與末端羧基之頭至尾環化可使用多種方法來進行，例如使用對硝基苯酯、2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、疊氮化物法、混合酸酐法、HATU、碳化二亞胺(例如DIC、 EDC或DCC)及催化劑(諸如HOBt、HONSu或HoAt)，或樹脂上環化(on-resin cyc1ization)。
另外，環狀結構可經由涉及CNP變異體之胺基酸殘基之側鏈及/或末端胺基酸殘基的橋聯基團形成。橋聯基團為允許胜肽之兩個部分環化的化學部分。橋聯基團之非限制性實例包括醯胺、硫醚、硫酯、二硫化物、脲、胺基甲酸酯、磺醯胺及其類似物。此項技術中已知併入具有此等橋聯基團之單元的多種方法。舉例而言，可在N端胺基或側鏈胺基與C端羧酸或側鏈(例如離胺酸或鳥胺酸之側鏈，及麩胺酸或天冬胺酸之側鏈)羧基之間形成內醯胺橋(亦即環狀醯胺)。可在C端羧基或側鏈羧基與半胱胺酸或半胱胺酸類似物之側鏈硫醇基之間形成硫酯。
或者，可藉由併入羊毛硫胺酸(硫基-二丙胺酸)殘基以連接藉由硫醚鍵共價鍵結在一起之丙胺酸殘基來形成交聯。在另一方法中，諸如二羧酸(例如辛二酸(subericacid/octanedioic acid))之交聯劑可連接胺基酸側鏈之官能基(諸如游離胺基、羥基及硫醇基)。
亦可使用酶催化環化。舉例而言，已報導可使用泰羅雪定(tyrocidine)合成酶之硫酯酶域來環化硫酯前驅體，可使用枯草桿菌蛋白突變體來環化胜肽羥乙酸苯丙胺醯基醯胺酯，且可使用抗體連接酶16G3來環化對硝基苯基酯。關於胜肽環化之回顧，請參看Davies，J.Peptide Sci.，9：471-501(2003)，其係以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，最終環化產物具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或至少約99%之純度。
D.經化學修飾之CNP變異體
CNP22或其變異體之化學修飾可潛在地賦予經修飾CNP胜肽以有利特性，諸如穩定性及半衰期增加及免疫原性降低(有關對治療蛋白之化學修飾的一般論述，請參看Pharmazie，57(1)：5-29(2002))。舉例而言，使天然或合成之聚合或非聚合部分(例如PEG)連接至CNP胜肽以將CNP胜肽之總質量增至本文一般描述之範圍(例如約2.6kDa 或2.8kDa至約6kDa或7kDa之範圍)可降低經修飾胜肽對外肽酶及/或內肽酶(例如NEP)活體內裂解的敏感性。除聚乙二醇化、糖基化及其它化學衍生化程序(例如藉由磷酸化、 醯胺化、羧基化、乙醯化、甲基化及產生酸加成鹽來進行修飾)外，醯胺、酯及N-醯基衍生物亦可潛在地遮蔽免疫原性區域及/或蛋白水解敏感區域(Science，303： 480- 482(2004))。
化學修飾之實例包括(但不限於)用於改良穩定性及蛋白酶抗性且降低免疫原性的Bednarsaki之聚合物添加法及A1tus Corporation之交聯法。Bednarsaki顯示聚合物添加可改良蛋白質之溫度穩定性(J.Am.Chem.Soc.，114(1)：378- 380(1992))，且A1tus Corporation發現戊二醛交聯可改良酶穩定性。
多肽之化學修飾可以非特異性方式(產生衍生物質之混合物)，或以位點特異性方式(例如基於野生型大分子反應性引導之衍生化，及/或使用定點突變誘發與化學修飾之組合的位點選擇性修飾)，或者使用所表現蛋白質連接法來進行(Curr.Opin.Biotechno1.，13(4)：297-303(2002))。
聚乙二醇化CNP變異體
在一實施例中，為增強穩定性(例如對NEP降解之抗性)，使CNP22或其變異體(包括具有胺基酸添加、取代及/或缺失之變異體)共軛至親水性天然或合成聚合物，以將經修飾CNP胜肽之總質量增至約2.6kDa或2.8kDa至約4、5、6、7kDa或7kDa以上之範圍。在某些實施例中，所添加之親水性聚合物具有約0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8kDa或約5kDa之總質量。
在一實施例中，親水性聚合物具有水溶性，以便與其共軛之CNP胜肽在水性(例如生理)環境下不會沈澱出來。此外，親水性聚合物具有生物相容性，亦即不會在活體內引起損傷、毒性或免疫反應。
親水性聚合物可為分支或未分支聚合物。在一實施例中，親水性聚合物未分支。
CNP22或其變異體可能與親水性聚合物在各種位點共軛，包括(但不限於)：(1)僅在N端；(2)僅在C端；(3)僅在內部位點(例如Lys4)；(4)在N端與C端；(5)在N端及內部位點；及(6)在C端及內部位點。在一實施例中，CNP22或其變異體僅在N端共軛至親水性聚合物。在另一實施例中，僅在內部位點(例如Lys4)共軛。在另一實施例中，在N端及內部位點(例如Lys4)共軛。在又一實施例中，為達成更佳功能性，CNP胜肽不在環狀域(對應於CNP22之Cys6至Cys22)內之位點(例如Lys10)共軛至親水性聚合物。若與親水性聚合物之共軛係基於與CNP胜肽上之反應性一級胺基形成鍵，則可藉由以側鏈上不含反應性一級胺基之天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物(諸如G1y、Ser、Arg、Asn 、G1n、Asp、G1u或瓜胺酸(Cit))取代Lys4及/或 Lys10來防止在內部位點(例如Lys4及/或 Lys10)共軛。在一特定實施例中，Lys4及/或 Lys10經Arg置換。在另一實施例中，Lys 10未經Arg置換。
親水性聚合物之非限制性實例包括自帶有羧酸之單體(例如甲基丙烯酸(MA)及丙烯酸(AA))形成的聚合物；聚乙烯醇；自帶有羥基之單體(例如甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)、羥丙基甲基丙烯醯胺，及甲基丙烯酸3-三甲基矽烷基丙酯(TMSPMA))形成之聚合物；聚環氧烷；聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)；聚(乙二醇)(PEG)；聚(丙二醇)；單C1 -C10 烷氧基-PEG(例如單甲氧基-PEG)；三氟乙磺醯基單甲氧基-PEG；芳氧基- PEG；PEG丙烯酸酯(PEGA)；PEG甲基丙烯酸酯；PEG丙醛；雙丁二醯亞胺基碳酸酯PEG；2-甲基丙烯醯氧基乙基- 磷酸膽鹼(MPC)與N-乙烯基吡咯啶酮(VP)之共聚物；羥基官能性聚(N-乙烯基吡咯啶酮)(PVP)；SIS-PEG(SIS為聚苯乙烯-聚異丁烯-聚苯乙烯嵌段共聚物)；聚苯乙烯-PEG；聚異丁烯-PEG；PCL-PEG(PCL為聚己內酯)；PLA-PEG(PLA為聚乳酸)；PMMA-PEG(PMMA為聚(甲基丙烯酸甲酯))；PD MS-PEG(PD MS為聚二甲基氧環己酮(po1ydimethy1oxanone))；PVDF-PEG(PVDF為聚偏二氟乙烯)；PLURONICTM界面活性劑(聚環氧丙烷-共-聚乙二醇)；聚(伸丁二醇)；聚(L-離胺酸-g-乙二醇)(PLL-g-PEG)；聚(L-離胺酸-g-玻糖醛酸)(PLL-g-HA)；聚(L-離胺酸-g-磷醯膽鹼)(PLL-g-PC)；聚(L-離胺酸-g-乙烯基吡咯啶酮)(PLL-g-PVP)；聚(乙亞胺-g-乙二醇)(PEI-g-PEG)；聚(乙亞胺-g-玻糖醛酸)(PEI-g-HA)；聚(乙亞胺-g-磷醯膽鹼)(PEI-g-PC)；聚(乙亞胺-g-乙烯基吡咯啶酮)(PEI-g-PVP)；PLL-共-HA、PLL-共-PC、PLL-共-PVP、PEI-共-PEG、PEI-共-HA、PEI-共-PC、PEI-共-PVP、纖維素及其衍生物(例如羥乙基纖維素)；聚葡萄糖；糊精；玻糖醛酸及其衍生物(例如玻糖醛酸鈉)；彈性蛋白；聚葡萄胺糖；丙烯酸硫酸酯；丙烯酸磺酸酯；丙烯酸胺基苯磺酸酯；甲基丙烯酸硫酸酯；甲基丙烯酸磺酸酯；甲基丙烯酸胺基苯磺酸酯；其聚合物及共聚物；及其組合之聚合物及共聚物。
在一特定實施例中，親水性聚合物為聚(乙二醇)(PEG)，亦稱聚(環氧乙烷)(PEO)。如本文中所用，術語「PEG」或「PEO」涵蓋可用於衍生多肽的PEG之所有形式(分支及未分支)，包括(但不限於)單(C1 -C10 )烷氧基-PEG及芳氧基-PEG。
在一實施例中，PEG-CNP共軛物包含式(CH2 CH2 O)n 之PEG(或PEO)聚合物，其中n為約6至約100之整數，且PEG聚合物為約0.3kDa至約5kDa。在另一實施例中，n為約12至約50之整數，且PEG聚合物為約0.6kDa至約2.5kDa。在另一實施例中，n為約12至約24，且PEG聚合物為約0.6kDa至約1.2kDa。在另一實施例中，PEG聚合物之末端羥基經非反應性基團封端。在一特定實施例中，封端基團為烷基，例如低碳烷基，諸如甲基，以使PEG聚合物以烷氧基終止。在一實施例中，PEG聚合物未分支。在另一實施例中，CNP22或其變異體僅在N端共軛至PEG聚合物。
PEG及PEO視其製備方式而可能包括具有分子量分佈之分子，亦即，其可能具有多分散性。聚合製劑之大小/質量分佈在統計學上可由其重量平均分子量(Mw )及其數目平均分子量(Mn )表徵，其比率係稱作多分散性指數(Mw /Mn)。Mw 及 Mn 可藉由質譜法量測。共軛至大於1.5kDa 之PEG部分的PEG-CNP變異體可因母體PEG分子之多分散性質而顯示分子量範圍。舉例而言，在mPEG2K(Sunbr ightME-020HS，NOFCo.)之情況下，PEG分子之分子量分佈於約1.5kDa至約3kDa之範圍內，多分散性指數為1.036。相反， 使用Pierce Biotechno1ogy(Rockford，I11inois)之M S(PEG)n試劑(n=4、 8、12或24，表示為例如「PEO12」或「PEO24」)共軛至CNP22或其變異體的PEG具有單分散性，具有不連續鏈長及規定分子量。
用於產生包含PEG部分之多肽的方法為此項技術中所已知(例如參看美國專利5，824，784)。製備聚乙二醇化CNP胜肽之方法一般包含以下步驟：(a)使CNP22或其變異體與聚乙二醇化試劑在適於將PEG連接至CNP胜肽(例如在N端)之條件下反應，及(b)獲得反應產物。因為對CNP胜肽進行聚乙二醇化可顯著改變其與NPR-B之結合，所以可視PEG部分之大小及聚乙二醇化之位置而定，探索不同種類之PEG及聚乙二醇化反應條件。可用於對CNP胜肽進行聚乙二醇化之化學包括使用甲氧基-PEG(O-[(N-丁二醯亞胺基氧基羰基)-甲基]-O' -甲基聚乙二醇)之NHS酯對胜肽之反應性一級胺進行醯化。以甲氧基-PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA進行醯化產生消除初始一級胺之任何電荷的醯胺鍵。以符號「PEO12」或「PEO24」表示之PEG-CNP胜肽，以及以符號「PEG1K」、「PEG2K」、「PEG5K」或「PEG20K」表示之胜肽係經由胜肽上之一級胺基與經NHS酯活化、甲氧基封端之PEG試劑反應來進行聚乙二醇化。PEG-CNP變異體亦可藉由其它方法，例如經由涉及胜肽上之一級胺基及PEG醛(諸如PEG-丙醛)或其單C1 -C10 烷氧基或芳氧基衍生物之還原性胺化來製備(參看美國專利5，252，714)。
不同於核糖體蛋白質合成，合成胜肽之合成係自C端進行至N端。因此，Boc-PEG(含有第三丁氧羰基(Boc))為一種將PE G連接至胜肽之C端的方法(R.B.M errifie1d，J.Am.Chem.Soc.，85(14)：2149-2154(1963))。或者可採用Fmoc(茀基甲氧羰基)化學(E.Atherton 及 R.C.Sheppard，Solid Phase Peptide Synthesis..a Practical Approach，IRLPress(Oxford，Eng1and(1989))。
製備PEG-CNP變異體之本發明方法提供聚合物-蛋白質共軛物之實質上均質混合物。純化之後，不連續PEG-CNP製劑對於生物特性之活體外及活體內測試足夠純。如本文中所表明，某些PEG-CNP變異體顯示對NEP裂解之敏感性降低及實質上類似或更佳之功能性(例如刺激cGMP產生)。
如本文所述，使用適當聚乙二醇化試劑/CNP胜肽比率及反應條件進行的CNP22或其變異體之聚乙二醇化反應提供PEG-CNP衍生物。聚乙二醇化之性質及程度可使用例如PAGE及 HPLC分析來測定。在某些實施例中，至少約50%、 60%、 70%、80%、90%、95%或99%之CNP22或其變異體在N端經單聚乙二醇化。為最佳化聚乙二醇化對CNP胜肽之生物特性的有利影響，可改變聚合物長度、構形(例如分支或線性)，及/或PEG部分之官能化(例如添加帶負電基團)。針對NEP抗性、藥物動力學及生物活性(例如結合NPR-B及刺激cGMP產生之能力)對聚乙二醇化CNP變異體進行測試。可例如於活體外在基於大鼠軟骨肉瘤細胞之軟骨發育不全模型中，及於活體內在鼠類軟骨發育不全動物模型中進一步測試顯示獲改良NEP抗性及CNP22之c GMP刺激活性之至少約50%的聚乙二醇化CNP變異體。
E.使用CNP變異體之方法、CNP變異體之醫藥組合物，及投藥途徑
使用CNP變異體之方法
骨相關病症
纖維母細胞生長因子(FGF)在骨形成方面起重要作用，且FGF受體基因(FGFR1、2及3)之突變導致多種遺傳性骨骼畸形(Curr.Bio1.，5：500-507(1995))。特定言之，FGFR- 3之活化突變造成長骨病症，包括軟骨發育不全(人類遺傳性侏儒症之最常見形式)(Nature，371：252-254(1994)；Ce11，78：335-342(1994))，較輕度病症軟骨生成減退(Ann.N.Y、Acad.Sci.，785：182-187(1996))，及較嚴重及新生兒致死性第I型及第II型侏儒症性發育不全(TD)(Hum.Mo1.Genet.，5：509-512(1996)；Nat.Genet.，9：321-328(1995))。過度表現FGF-2且從而活化FGFR-3之小鼠模型顯示長骨縮短及巨頭畸形(M o1.Bio1.Ce11，6：1861-73(1995))。與此模型相符，缺乏FGFR-3之小鼠顯示顯著之骨骼過度生長與較寬生長板(Nature Genet.，12：390-397(1996))。
使用CNP、NPR-B及NPR-C之互補實驗表明胜肽配位體、相應受體與骨生長之間的聯繫。在轉殖基因小鼠中藉由提高血漿濃度之CNP來活化NPR-B引起骨骼過度生長(Nat.Med.，10：80-86(2004))，此在組織學上類似於FGFR-3基因剔除小鼠之生長板軟骨的情形(Nat.Genet.，4：390-397(1996))。在NPR-C基因剔除小鼠中，應消除NPR-C介導之CNP清除；與此預測相符，基因剔除動物顯示延長之長骨及延長之椎骨與脊柱隆凸(Proc.Nat1.Acad.Sci.USA96：7403-08(1999))。相反，CNP基因剔除小鼠因長骨及椎骨較短而矮化(表型在組織學上類似於軟骨發育不全)，且因咬合異常及肺受小胸腔限制而致使死亡率增加(Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，98：4016-4021(2001))。與所提出之CNP作為NPR-B之活化劑的作用相符，NPR-B基因剔除小鼠與CNP基因剔除小鼠具有相同矮化骨骼表型及增加之死亡率(Proc.Nat1.Acad.Sci USA，101：17300-05(2004))。此外，在軟骨中具有活化FGFR-3之軟骨發育不全之小鼠模型中，軟骨細胞中CNP之靶向過度表現對抗侏儒症(Yasoda等人，Nat.Med.，10：80-86(2004))。另外，已顯示CNP在調節軟骨內骨生長及軟骨細胞活性方面起作用，包括(但不限於)軟骨細胞增殖及分化、抑制有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-1)激酶信號傳導路徑及促進軟骨內骨化(Yasoda等人，Nat.Med.，10：80-86(2004))。此等結果表明CNP/NPR-B系統之活化為治療人類軟骨發育不全之潛在治療策略。
本揭示案之CNP變異體藉由刺激基質產生、使軟骨細胞增殖及分化及增強長骨生長而適用於治療罹患骨相關病症(諸如骨骼發育不全)之哺乳動物，包括人類。CNP反應性骨相關病症及骨骼發育不全之非限制性實例包括軟骨發育不全、 軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症、骨軟骨發育不全、 致死性侏儒症性發育不全、骨發生不全、軟骨成長不全、 點狀軟骨發育不全、同型合子軟骨發育不全、點狀軟骨發育不全、屈肢骨發育不全、先天性致死性低磷酸酶症、 週產期致死型骨發生不全、短肋骨多指症候群、軟骨生成減退、近端肢骨短小型點狀軟骨發育不全、詹森型幹骺端發育不全(Jansen-type metaphysea1dysp1asia)、先天性脊柱骨骺發育不全(spondy1oepiphysea1 dysp1asia congenita)、骨生成發育不全(ate1osteogenesis)、畸型發育不全(diastrophic dysp1asia)、先天性短股骨、蘭格型肢中骨發育不全(Langer-type mesome1ic dysp1asia)、列維蓋特型肢中骨發育不全(Nieverge1t-type meso me1ic dysp1asia)、羅賓諾氏症候群(Robinow syndrome)、雷哈特症候群(Re inhar dtsyndro me)、肢端骨發育不全(acrodysostosis)、周邊骨發育不全、尼斯特發育不全(K niest dysp1asia)、纖維軟骨生成(fibrochondrogenesis)、羅伯特症候群(Roberts syndro me)、肢端中間發育不全、小肢畸形、莫基奧症候群(Morquiosyndrome)、尼斯特症候群(Kniestsyndrome)、後生營養性發育不全(metatrophic dysp1asia)及脊柱幹骺端發育不全(spondy1oepimetaphysea1 dysp1asia)。此外，C N P變異體適用作生長激素之輔助物或替代物以便治療特發性身材矮小及其它骨骼發育不全。
另外，CNP變異體適用於治療其它骨相關病狀及病症，諸如佝僂病、低磷酸鹽血性佝僂病[包括X染色體連鎖低磷酸鹽血性佝僂病(亦稱為抗維生素D佝僂病)及體染色體顯性低磷酸鹽血性佝僂病]，及軟骨病[包括腫瘤誘發之軟骨病(亦稱為致癌軟骨病或致癌低磷酸鹽血性軟骨病)]。
本揭示案之CNP變異體亦可用以治療骨關節炎。骨關節炎為關節軟骨之退化性疾病且通常發生於老年人中。骨關節炎涉及軟骨破壞及由關節組件退化所致之骨與軟骨之增生性變化，其中該變化導致繼發性關節炎(例如滑膜炎)。在骨關節炎中，作為軟骨之功能性實體之細胞外基質蛋白質減少，且軟骨細胞數目減少(Arth.Rheum.46(8)：1986-1996(2002))。藉由促進基質產生、軟骨細胞生長及分化，CNP變異體適用於在罹患關節炎(包括骨關節炎)之個體中抗衡FGF-2之不當作用及增加基質合成，藉此治療關節炎，包括骨關節炎。
血管平滑肌病症
CNP及其它血管活性胜肽(包括ANP、BNP及尿舒血管素(urodi1atin))具有血管擴張及利尿特性且在心血管內穩定中起重要作用(J.Cardiovasc.Pharmaco1.，117： 1600- 06(1998)；KidneyInt.，49：1732-37(1996)；A m.J.Physio1.，275：H1826-1833(1998))。CNP廣泛分佈於心血管系統中，尤其以高濃度分佈於血管內皮細胞中(J.Car diovasc .Pharmaco1.，117：1600-06(1998))。CNP為血管平滑肌(尤其在冠狀循環中)之有效鬆弛劑(Biochem.Biophys.Res .Commun.，205：765-771(1994))，且為平滑肌細胞增殖之抑制劑(Biochem.Biophys.Res.Com mun.，177： 927- 931(1991))。儘管CNP之血管擴張作用的效力不如ANP強(約1：100)(Hypertens.Res.，21：7-13(1998)；A m.J.Physio1.，275：L645-L652(1998))，但在發炎性心血管病理學中，CNP mRNA回應於剪切應力而增加(FEBSLett.，373： 108- 110(1995))，且C NP之血漿含量升高(Biochem.Biophys.Res.Commun.，198：1177-1182(1994))。已顯示CNP經由抑制巨噬細胞浸潤於兔之受損頸動脈中來抑制發炎(Circ .Res.，91：1063-1069(2002))，且經由NPR-B/cG MP依賴性路徑直接抑制心臟纖維母細胞增殖(Endocrino1ogy，144：2279-2284(2003))。
CNP之心血管作用係經由NPR亞型NPR- B及NPR- C之活化來介導(Endocrino1ogy，130：229-239(1992))，NPR- C佔活體內表現之NPR的95%(Science，293： 1657- 1662(2001))。CNP/NPR-B路徑在心血管系統中引起cGMP(公認第二信使)升高。NPR-C之C端的37個胺基酸部分具有與異源三聚G蛋白Gi 相互作用之共同序列(J.Bio1.Chem.，274：17587-17592(1999))，已顯示該異源三聚G蛋白Gi 調節腺苷酸環化酶及磷脂酶C活性(J.Bio1.Chem.，276：22064-70(2001)；A m.J.Physio1.，278：G974-980(2000)；J.Bio1.Chem.，271：19324-19329(1996))。CNP經由NPR-C之活化及G蛋白調節之內向性整流K+ 通道之開啟來介導平滑肌超極化及鬆弛(Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，100：1426-1431(2003))。同樣，CNP在心臟纖維母細胞中具有重要抗增殖作用，且經由與NPR-C相互作用藉由使平滑肌細胞超極化來調節局部血液流動及全身血壓(R.Rose及 W.Gi1es，J.Physio1.586：353-366(2008))。
CNP22藉由結合於血管平滑肌細胞上之NPR-B來刺激cGMP之產生，cGMP充當細胞內第二信使以最終使得血管鬆弛。基於CNP之降血壓作用，本揭示案之CNP變異體適用於治療高血壓、充血性心臟衰竭、心原性水腫、腎水腫、肝原性水腫、急性及慢性腎功能不全等。另外，cGMP信號傳導之活化抑制血管平滑肌細胞之生長。因此，本揭示案之CNP變異體可用以治療由血管平滑肌細胞之異常生長所致之病狀或疾病，包括(但不限於)再狹窄及動脈硬化。
上述研究表明，CNP可為用於血管平滑肌鬆弛及重塑之潛在治療候選物。CNP對於某些病症之藥理作用部分地歸因於血管保護作用而非血管擴張活性(A m.J.Respir.Crit.Care Med.，170：1204-1211(2004))。因此，本揭示案之CNP變異體適用於治療CNP可具有血管保護作用之病狀，例如血管平滑肌病症，該血管保護作用包括(但不限於)誘導平滑肌鬆弛及抑制巨噬細胞浸潤於心臟組織中。在一實施例中，使用CNP變異體來治療心臟衰竭，包括(但不限於)急性代償失調性心臟衰竭及急性充血性心臟衰竭。在另一實施例中，使用CNP變異體來治療哮喘、心肌症及冠狀動脈再狹窄(藉由增強平滑肌細胞鬆弛及減少平滑肌細胞增殖)。
CNP變異體之醫藥組合物
在其它實施例中，本揭示案提供醫藥組合物，其包含CNP變異體及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑及/或稀釋劑。在某些實施例中，該等組合物進一步包含一或多種其它生物活性劑(例如蛋白酶、受體酪胺酸激酶及/或清除受體NPR-C之抑制劑)。
在一些實施例中，組合物包含純度為至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之所需CNP變異體。在某些實施例中，組合物含有少於約10%、5%、4%、3%、2%、1%或0.5%大分子污染物，諸如其它哺乳動物(例如人類)蛋白質及其它CNP變異體。
賦形劑、載劑及稀釋劑之非限制性實例包括媒劑、液體、緩衝劑、等張劑、添加劑、穩定劑、防腐劑、增溶劑、界面活性劑、乳化劑、濕潤劑、佐劑等。組合物可含有液體(例如水、乙醇)；各種緩衝劑內容物(例如Tr is- HC1、磷酸鹽、乙酸鹽緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑)、pH值及離子強度之稀釋劑；清潔劑及增溶劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；抗氧化劑(例如甲硫胺酸、抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)；防腐劑(例如硫柳汞(Thimeroso1)、苯甲醇、間甲酚)；及增積物質(bu1king substance)(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖)。在此項技術中已知在醫藥組合物之調配物中使用賦形劑、稀釋劑及載劑；例如參看Remington' s Pharmaceutica1 Sciences，第18版，第1435-1712頁，M ack Pub1ishing Co.(Easton，Pennsy1vania(1990))，其係以其全文引用的方式併入本文中。
舉例而言，載劑包括(但不限於)稀釋劑、媒劑及佐劑，以及植入載劑，及不與活性成分反應之惰性無毒固體或液體填充劑及囊封材料。載劑之非限制性實例包括磷酸鹽緩衝鹽水、生理鹽水、水及乳液(例如油/水乳液)。載劑可為含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物)、植物油及其混合物之溶劑或分散介質。
在一些實施例中，組合物為液體調配物。在某些實施例中，調配物包含濃度範圍為約0.1mg/m1至約20 mg/m1，或約0.5mg/m1至約20 mg/m1，或約1 mg/m1至約20 mg/m1，或約0.1 mg/m1至約10 mg/m1，或約0.5mg/m1至約10mg/m1，或約1mg/m1至約10mg/m1之 CNP變異體。
在其它實施例中，組合物包含緩衝溶液或緩衝劑以維持含CNP之溶液或懸浮液的pH值在所需範圍內。緩衝溶液之非限制性實例包括磷酸鹽緩衝鹽水、Tris緩衝鹽水及亨克氏緩衝鹽水(Hank' s buffered sa1ine)。緩衝劑包括(但不限於)乙酸鈉、磷酸鈉及檸檬酸鈉。亦可使用緩衝劑之混合物。在某些實施例中，緩衝劑為乙酸/乙酸鹽或檸檬酸/檸檬酸鹽。適用於組合物中之緩衝劑之量部分視所用特定緩衝劑及溶液或懸浮液之所需pH值而定。舉例而言，乙酸鹽為在pH5下比在pH6下更有效之pH值緩衝劑，因此在pH5之溶液中可使用比pH6之溶液中所用較少之乙酸鹽。在一些實施例中，緩衝劑具有約10mM±5mM之濃度。在某些實施例中，組合物之pH值為約pH3至約pH7.5，或約pH3.5至約pH7，或約pH3.5至約pH6.5，或約pH4至約pH6，或約pH4至約pH5，或為約pH5.0±1.0。
在其它實施例中，組合物含有等張調節劑以使得溶液或懸浮液等張且更相容以便注射。等張劑之非限制性實例包括NaC1、右旋糖、葡萄糖、丙三醇、山梨糖醇、木糖醇及乙醇。在某些實施例中，等張劑為NaC1。在某些實施例中，NaC1濃度為約160±20mM，或約140mM±20mM，或約120±20mM，或約100mM±20mM，或約80mM±20mM，或約60mM±20mM。
在其它實施例中，組合物包含防腐劑。防腐劑包括(但不限於)間甲酚及苯甲醇。在某些實施例中，防腐劑濃度為約0.4%±0.2%，或約1%±0.5%，或約1.5%±0.5%，或約2.0%±0.5%。
在其它實施例中，組合物含有抗吸附劑(例如以減輕CNP變異體吸附至玻璃或塑膠)。抗吸附劑包括(但不限於)苯甲醇、聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。在某些實施例中，抗吸附劑濃度為約0.001%至約0.5%，或約0.01%至約0.5%，或約0.1%至約1%，或約0.5%至約1%，或約0.5%至約1.5%，或約0.5%至約2%，或約1%至約2%。
在其它實施例中，組合物包含穩定劑。穩定劑之非限制性實例包括丙三醇、甘油、硫甘油、甲硫胺酸及抗壞血酸及其鹽。在一些實施例中，當穩定劑為硫甘油或抗壞血酸或其鹽時，穩定劑濃度為約0.1%至約1%。在其它實施例中，當穩定劑為甲硫胺酸時，穩定劑濃度為約0.01%至約0.5%，或約0.01%至約0.2%。在其它實施例中，當穩定劑為丙三醇時，穩定劑濃度為約5%至約100%(純)。
在其它實施例中，組合物含有抗氧化劑。例示性抗氧化劑包括(但不限於)甲硫胺酸及抗壞血酸。在某些實施例中，抗氧化劑與CNP變異體之莫耳比為約0.1：1至約15：1，或約1：1至約15：1，或約0.5：1至約10：1，或約1：1至約10：1，或約3：1至約10：1。
組合物中可使用醫藥學上可接受之鹽，包括(但不限於)無機酸鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽)、有機酸鹽(例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽)，及胺鹽(例如異丙胺、三甲胺、二環己胺、二乙醇胺)。醫藥學上可接受之鹽的全面討論可見於Remington' s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPub1ishing Company，(Easton，Pennsy1vania(1990))中。
醫藥組合物可以各種形式投與，諸如錠劑、膠囊、顆粒劑、散劑、溶液、懸浮液、乳液、軟膏及經皮貼片。組合物之劑型可據組合物之所需投與模式來調整。對於經口投與，組合物可採用例如錠劑或膠囊(包括軟凝膠膠囊)之形式，或可為例如水性或非水性溶液、懸浮液或糖漿。供經口投與之錠劑及膠囊可包括一或多種常用賦形劑、稀釋劑及載劑，諸如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、澱粉、玉米澱粉、糖精鈉、滑石、纖維素、碳酸鎂及潤滑劑(例如硬脂酸鎂、硬脂醯反丁烯二酸鈉)。必要時，可將調味劑、著色劑及/或甜味劑添加至固體及液體調配物中。用於經口調配物之其它可選成分包括(但不限於)防腐劑、懸浮劑及增稠劑。經口調配物亦可具有腸溶衣以保護CNP變異體不受胃部之酸性環境影響。製備固體及液體劑型之方法為已知，或對熟習此項技術者將顯而易見(例如參看上文所參考之Remington' sPharmaceutica1Sciences)。
供非經腸投與之調配物可製備為例如液體溶液或懸浮液，製備為適於在注射之前溶解或懸浮於液體介質中之固體形式，或製備為乳液。舉例而言，可根據此項技術中已知之技術，使用適合稀釋劑、載劑、溶劑(例如緩衝水溶液、林葛爾氏溶液(Ringer' s so1ution)、等張氯化鈉溶液)、分散劑、濕潤劑、乳化劑、懸浮劑及其類似物來調配無菌可注射溶液及懸浮液。另外，可使用無菌不揮發性油、脂肪酸酯、多元醇及/或其它非活性成分。作為其它實例，供非經腸投與之調配物包括無菌可注射水溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑，及使調配物與預定接受者之血液等張的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可含有懸浮劑及增稠劑。
包含CNP變異體之組合物亦可為凍乾調配物。在某些實施例中，凍乾調配物包含緩衝劑及增積劑，及視情況選用之抗氧化劑。例示性緩衝劑包括(但不限於)乙酸鹽緩衝劑及檸檬酸鹽緩衝劑。例示性增積劑包括(但不限於)甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚維酮(PVPK24)。在某些實施例中，甘露糖醇之量為約3%至約10%，或約4%至約8%，或約4%至約6%。在某些實施例中，蔗糖之量為約6%至約20%，或約6%至約15%，或約8%至約12%。例示性抗氧化劑包括(但不限於)甲硫胺酸及抗壞血酸。
本揭示案亦提供套組，其含有例如包含液體(例如無菌可注射液體)調配物或固體(例如凍乾固體)調配物之瓶、小瓶、安瓿、管、藥筒及/或針筒。該等套組亦可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑(例如溶劑、溶液及/或緩衝液)以便將固體(例如凍乾固體)調配物復原成溶液或懸浮液以便投與(例如藉由注射)，包括(但不限於)在針筒中復原凍乾調配物以便注射或將濃縮物稀釋至較低濃度。此外，可自例如包含含有CNP之組合物的無菌散劑、顆粒劑或錠劑製備臨時注射溶液及懸浮液。套組亦可包括分配裝置，諸如噴霧器，或注射分配裝置、筆式注射器、自動注射器、無針注射器、針筒及/或針。
作為一非限制性實例，套組可包括具有單腔室或雙腔室之針筒。對於單腔室針筒，單腔室可含有備用於注射之液體CNP調配物，或固體(例如凍乾固體)CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合溶劑系統(例如丙三醇)中的液體調配物，其可復原成溶液或懸浮液以便注射。對於雙腔室針筒，一個腔室可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑(例如溶劑系統、溶液或緩衝液)，且另一腔室可含有固體(例如凍乾固體)CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合溶劑系統(例如丙三醇)中的液體調配物，其可使用來自第一腔室之媒劑或載劑復原成溶液或懸浮液以便注射。
作為另一實例，套組可包括一或多個筆式注射器或自動注射器裝置，及雙腔室藥筒。藥筒之一個腔室可含有醫藥學上可接受之媒劑或載劑(例如溶劑系統、溶液或緩衝液)， 且另一腔室可含有固體(例如凍乾固體)CNP調配物或CNP變異體於相對較小量之適合溶劑系統(例如丙三醇)中的液體調配物，其可使用來自第一腔室之媒劑或載劑復原成溶液或懸浮液以便注射。藥筒可包含足以歷經所需時段(例如1日、2日、3日、1週、2週、3週、4週等)給藥之量的CNP變異體。可調節筆式注射器或自動注射器以自藥筒投與所需量之CNP調配物。
另外，可將包含CNP變異體之醫藥組合物調配為緩慢釋放、 控制釋放或持續釋放系統以便歷經所需時段(諸如1週、 2週、3週、1個月、2個月或3個月)維持相對恆定之劑量濃度。如在此項技術中所已知，緩慢釋放、控制釋放及持續釋放調配物可使用例如生物可降解之聚合系統{其可包含例如親水性聚合物[例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)]}來製備，且可採用例如微粒、微球體或脂質體之形式。
給藥劑量及頻率
如本文中所用，術語活性劑(例如CNP變異體)之「治療有效量」係指向患者提供治療益處之量。該量可在個體之間不同及可視許多因素(包括患者之總體身體狀況)而定。熟習此項技術者使用公開可得之材料及程序可容易地確定CNP變異體之治療有效量。舉例而言，基於患有軟骨發育不全之0-17歲兒童(214名女性及189名男性)之生長圖表(其列出年齡別身高(height for age)、頭圍及體節生長(segmenta1growth))，用於療法之CNP變異體之量應得到可接受之生長速率(Horton W A等人，Standard growthcurves for achondrop1asia，J.Pediatr.，93：435-8(1978))。CDC圖表可用以評估年齡別體重及身高別體重或年齡別BMI。亦可量測使用實質上較長療程獲得之次要結果。
血清半衰期長於野生型CNP22之CNP變異體可潛在地以低於CNP22之頻率投與。特定個體之給藥頻率可視多種因素(包括所治療之病症，及個體之狀況及對療法之反應)而變。在某些實施例中，約每日一次、每兩日一次、每三日一次或每週一次投與個體含有CNP變異體之醫藥組合物。在一實施例中，為治療骨相關病症(例如骨骼發育不全，包括軟骨發育不全)，投與患者每日或每週劑量之CNP變異體直至成人為止及/或貫穿成人期。
本文所述之CNP變異體可以治療有效劑量投與患者以治療、 改善或預防骨相關病症(例如骨骼發育不全，包括軟骨發育不全)及CNP可提供血管保護作用之病狀(例如血管平滑肌病症)。可於細胞培養物或實驗動物中藉由標準藥理學程序，諸如藉由測定LD50 (對50%群體致死之劑量)及ED50(在50%群體中治療有效之劑量)來測定CNP變異體之安全性及治療功效。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數且其可以比率LD50 /ED50 形式表示。顯示大治療指數之活性劑通常較佳。
獲自細胞培養分析法及動物研究之資料可用以調配供人類使用之劑量範圍。該劑量通常處於循環濃度(包括ED50 )之範圍內，其中毒性極小或最小。該劑量可視所用劑型及所用投藥途徑而在此範圍內變化。治療有效劑量可由細胞培養分析法及動物研究測定。
在某些實施例中，本文所述之CNP變異體係以約5或10nmo1/kg至約300 nmo1/kg，或約20 nmo1/kg至約200nmo1/kg範圍內的劑量投與。在一些實施例中，以約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、 500、 750、1000、1250、1500、1750或2000 nmo1/kg之劑量或治療醫師認為適當之其它劑量投與CNP變異體。在其它實施例中，以約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或100oμg/kg或約1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、 5、 5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/kg之劑量，或治療醫師認為適當之其它劑量投與CNP變異體。本文所述之CNP變異體的劑量可根據本文所述之給藥頻率/投藥頻率來投與，該等頻率包括(但不限於)每日、每週2或3次、每週、每2週、每3週、每月等。
對於特定個體，給予/投與CNP變異體之頻率可視包括以下之多種因素而變化：所治療之病症、及個體之狀況、及對療法之反應。可以單次劑量或以每次給藥多次劑量之形式投與CNP變異體。在某些實施例中，以如下頻率投與CNP變異體：單次劑量或多次劑量、每日、每隔一日、每3日、每週2次、每週3次、每週、每兩週、每3週、每月、每6週、每2個月、每3個月，或治療醫師認為適當之頻率。
在一些實施例中，投與CNP變異體以便留出生長期(例如軟骨生成)，接著為恢復期(例如骨生成)。舉例而言，可靜脈內、皮下，或藉由另一模式每日或每週多次投與CNP變異體持續一段時間，接著為無治療時期，接著重複該循環。在一些實施例中，初始治療期(例如每日或每週多次投與CNP變異體)持續3日、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週。在一相關實施例中，無治療時期持續3日、1週、2週、3週或4週。在某些實施例中，CNP變異體之給藥療程為每日給藥持續3日，接著3日不給藥；或每日或每週多次給藥持續1週，接著3日或1週不給藥；或每日或每週多次給藥持續2週，接著1或2週不給藥；或每日或每週多次給藥持續3週，接著1、2或3週不給藥；或每日或每週多次給藥持續4、5、6、7、 8、 9、10、11或12週，接著1、2、3或4週不給藥。
投藥模式
可以多種方式(諸如藉由皮下、靜脈內、動脈內、腹膜內、 肌肉內、皮內或鞘內注射)來投與個體CNP變異體或包含其之醫藥組合物。在一實施例中，藉由一日一次單次皮下、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或鞘內注射來投與CNP變異體。
亦可藉由在疾病部位或其附近直接注射來投與CNP變異體。此外，可藉由在目標作用部位(例如異常骨或發育不全骨)植入儲積器來投與CNP變異體。或者，可於舌下方經舌下(例如舌下錠劑)或藉由吸入肺中(例如吸入劑或氣霧劑噴霧)、藉由傳遞至鼻腔中(例如鼻內噴霧)、藉由傳遞至眼內(例如滴眼劑)或藉由經皮傳遞(例如藉助於皮膚貼片)來投與CNP變異體。CNP變異體亦可以微球體、微囊、脂質體(不帶電或帶電(例如陽離子型))、聚合微粒(例如聚醯胺、 聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液及其類似物之形式經口投與。
另一投藥方法係藉由滲透泵(例如A1zet泵)或微型泵(例如A1zet微型滲透泵)來投與，該等泵允許控制、連續及/或緩釋傳遞CNP變異體或醫藥組合物持續預定時期。滲透泵或微型泵可植入目標部位(例如肢幹之長骨、骨骺等)或目標部位附近之皮下。
如上所說明，CNP變異體可用以治療由血管平滑肌細胞異常生長引起之病狀或疾病，包括(但不限於)再狹窄及動脈硬化。為將CNP變異體局部傳遞至患病身體血管(例如血管)，可藉助於植入於患病部位之醫學裝置(例如血管內支架)來傳遞CNP變異體。在一實施例中，將CNP變異體浸漬於安置於血管內支架上之聚合基質或聚合塗層內。在另一實施例中，CNP變異體含於形成於血管內支架體內且由CNP變異體可擴散穿過之多孔聚合膜或聚合層覆蓋的儲集器或通道內。如在此項技術中所已知，聚合基質、塗層、膜或層可包含至少一種生物可降解(例如親水性)聚合物。在另一實施例中，CNP變異體可含於血管內支架體中之微孔內。可自血管內支架藉由爆發式釋放、脈衝釋放、控制釋放或持續釋放或其組合來傳遞CNP變異體。舉例而言，血管內支架可依次以爆發式釋放及持續釋放之方式將CNP變異體局部傳遞至患病部位。持續釋放可持續多達約2週、1個月、2個月、3個月、6個月或1年之時期。
對熟習此項技術者將顯而易見，.CNP變異體或其組合物亦可藉由其它模式投與。CNP變異體或其組合物之最有效投藥模式的決定係在熟習此項技術者之技能範圍內。
CNP變異體可以醫藥調配物形式投與，該等醫藥調配物適用於例如經口(包括頰內及舌下)、經直腸、經鼻、表面、 經肺、 經陰道或非經腸(包括肌肉內、動脈內、鞘內、 皮下及靜脈內)投與，或呈適於藉由吸入或吹入投與之形式。視預定投藥模式而定，醫藥調配物可呈固體、半固體或液體劑型，諸如錠劑、栓劑、丸劑、膠囊、散劑、液體、懸浮液、乳液、乳膏、軟膏、洗劑及其類似物。可以適於單次投與精確劑量之單位劑型提供調配物。該等調配物包含有效量之CNP變異體，及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑及/或稀釋劑，及視情況選用之一或多種其它生物活性劑。
組合療法
在一實施例中，CNP變異體可與一或多種適用於治療、改善或預防CNP反應性病狀或病症(諸如骨相關病症(例如骨骼發育不全)及血管平滑肌病症)之其它活性劑組合使用。其它活性劑可增強CNP變異體之作用及/或除CNP變異體之作用外亦發揮其它藥理學作用。可與本文所述之CNP變異體組合使用之活性劑的非限制性實例為其它利鈉胜肽(例如BNP)， 及胜肽酶及蛋白酶(例如NEP及弗林蛋白酶)、NPR-C及酪胺酸激酶(例如FGFR-3)之抑制劑(例如拮抗劑)。NEP抑制劑可藉由防止CNP變異體之NEP裂解來延長變異體之半衰期。NEP抑制劑之實例包括(但不限於)塞奧芬及坎沙曲。共同使用NPR-C抑制劑亦可經由抑制NPR- C對變異體之清除來延長CNP變異體之半衰期。NPR- C抑制劑之非限制性實例為片段FGIPMDRIGRNPR(SEQID NO：82)，其將在目標部位(例如骨生長板)於FGIPMDRIGRNPR-CNP22嵌合體(類似物CZ)(SEQID NO：82)或包含CNP22之變異體(例如相對於CNP22含有胺基酸取代、添加及/或缺失之變異體)之類似嵌合體的蛋白水解裂解後釋放。共同使用酪胺酸激酶抑制劑可藉由抑制酪胺酸激酶受體FGFR-3(一種軟骨細胞及骨生長之負調節劑)來增強CNP之效果。酪胺酸激酶抑制劑之非限制性實例包括U.S.6，329，375及6，344，459中所揭示者。
為在組合療法中達成適當治療結果，一般將投與個體有效產生所需治療結果(例如恢復骨生長)之組合量之CNP組合物與其它治療劑。此方法可涉及同時投與CNP組合物與其它治療劑。同時投與可藉由投與包括CNP變異體與其它治療劑之單一組合物或藥理學蛋白質調配物來達成。或者，其它治療劑可與CNP變異體之藥理學調配物(例如錠劑、注射液或飲劑)大致在同時分別服用。亦可將CNP變異體調配於適於攝取之食物(諸如核仁巧克力餅(brownies)、薄餅或蛋糕)中。
在其它替代療程中，投與CNP變異體可在投與其它治療劑之前或之後，間隔數分鐘至數小時範圍內之時間進行。在分別投與其它治療劑及CNP組合物之實施例中，一般將確保CNP變異體及其它治療劑係在彼此適當之時間內投與，以使CNP變異體及其它治療劑可對患者發揮協同或加和之有利作用。舉例而言，可在其它治療劑之約0.5-6小時內(之前或之後)投與CNP組合物。在一實施例中，CNP組合物係在其它治療劑之約1小時內(之前或之後)投與。
鑑別及監測患者群體
可建立鑑別適於CNP療法之個體及確定指定患者對CNP療法是否有反應之療程。舉例而言，對於治療骨相關病症， 可量測生長指標，諸如子宮內(inutero)及新生兒之長骨生長量測值，及骨生長生物標記(諸如CNP、cGMP、膠原蛋白II、骨鈣化素及增殖細胞核抗原(PCNA))之量測值。
一種CNP信號傳導標記為cGMP(鳥苷3' ，5' 環狀單磷酸)。在CNP結合並活化其同源受體NPR-B之後，此細胞內信號傳導分子之含量增加。可自CNP暴露後之細胞培養萃取物(活體外)、自CNP暴露後之骨外植體研究(離體)之條件培養基，及皮下、靜脈內或經由此項技術中已知之其它投藥途徑投與CNP之數分鐘內的血漿(活體內)量測提高之cGMP含量。
亦可量測軟骨及骨特異性分析物(或軟骨及骨相關標記)來評估CNP功效。舉例而言，裂解之第II型膠原蛋白之片段為軟骨更新之軟骨特異性標記。第II型膠原蛋白為軟骨之主要有機組分且在軟骨更新之後，第II型膠原蛋白之片段(裂解之膠原蛋白)釋放於循環中，且隨後分泌於尿中。軟骨更新之後形成新骨。
可量測之骨形成的骨特異性生物標記為第I型原膠原之N端前肽(PINP)。因為第I型膠原蛋白為骨基質中之主要有機組分，所以第I型膠原蛋白之合成為骨形成中之重要步驟。在膠原蛋白合成期間，前肽自原膠原分子釋放且可在血清中偵測到。另外，可量測第I型膠原蛋白之片段作為骨吸收標記。
軟骨及骨形成及生長之其它可能生物標記包括聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素(軟骨更新之軟骨特異性標記)、第II型膠原蛋白之前肽(軟骨形成之軟骨特異性標記)、鹼性磷酸酶(骨特異性)及骨鈣化素(骨形成之骨特異性標記)。可使用市售套組，例如在來自功效/藥效學活體內研究及來自離體研究之條件培養基的血清中量測軟骨及骨相關生物標記。
在一實施例中，在已投與CNP變異體之個體中分析或量測至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量以監測CNP變異體在活體內對骨及軟骨形成及生長之作用。舉例而言，至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量增加可表明投與CNP變異體對骨生長具有積極作用且為適用於與CNP活性降低相關之骨骼發育不全及其它骨或軟骨相關疾病或病症之治療。例示性骨或軟骨相關生物標記包括(但不限於)：CNP(例如內源性含量之CNP)、cGMP、第II型膠原蛋白之前肽及其片段、第II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、第I型原膠原之前肽(PINP)及其片段、第I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及鹼性磷酸酶。
在一實施例中，藉由自將投與、正投與或已投與CNP變異體之個體獲得生物樣品來量測生物標記。可使用此項技術中已知之技術來量測生物標記，該等技術包括(但不限於)西方墨點法(Western B1ot)、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)及酶活性分析法。生物樣品可為血液、血清、尿液或其它生物流體。
本揭示案之其它態樣及細節將自以下實例顯而易見，該等實例意欲說明而不具限制性。
F.實例
實例1
CNP變異體之合成
使用本文所述之方法製備CNP變異體。在CNP22之野生型序列之各別胺基酸殘基處，以天然或非天然胺基酸或胜肽模擬物進行取代，如表1-3(展示於實例3中)中所示。在某些變異體中，將額外胺基酸添加至完整野生型CNP22序列或野生型CNP22序列之一部分的N末端及/或C末端(參看表3)。
亦製備PEG(或PEO)部分共軛至CNP22或其變異體之N端的CNP變異體(參看實例3中所示之表4)。聚乙二醇化試劑可獲自表5中所示之商業來源。
購自Pierce Biotechno1ogy(Rockford，I11inois)的PE G(亦稱PEO)聚合物具有單分散性，亦即其含有具有特定分子量之單一不連續聚合物。相反，購自NOF(Nippon Oi1andFat)之PEG聚合物具有多分散性，亦即其含有具有分子量分佈之聚合物混合物。
為將CNP22或其變異體聚乙二醇化，針對各PEG-CNP共軛物最佳化反應及純化條件。根據一般聚乙二醇化程序，反應混合物含有約1mMCNP22或其變異體及含約1至5mMNHS活化之PEG的磷酸鉀緩衝液(pH值在約5.0與6.5之間)。為在胜肽N端選擇性單聚乙二醇化且將內部位點(例如CNP22之Lys4)之聚乙二醇化降至最少，可在更酸性條件下(例如在約5.5與6.5之間的pH值下)進行聚乙二醇化反應以將離胺酸側鏈上之更具鹼性之一級胺基選擇性質子化且因此使其去活化。在室溫下保溫約1至3小時之後，藉由添加水性甘胺酸緩衝液來淬滅聚乙二醇化反應。接著藉由逆相HPLC(針對各PEG-CNP共軛物最佳化)分離反應產物。將分級分離樣品真空離心濃縮(speedvacced)至乾燥，且於1 mMHC1中復原/調配。藉由液相層析-質譜分析(LC/MS)鑑別各PEG-CNP產物且測定各PEG-CNP產物之純度。
實例2A
重組產生CNP變異體
可使用重組技術產生CNP變異體。在某些實施例中，CNP變異體係以包含可裂解胜肽、載體蛋白或標籤之融合蛋白的形式產生。下文揭示重組產生CNP融合蛋白之例示性方法。
材料及方法
將CNP融合蛋白選殖於表現載體中
使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增CNPDNA片段，且以Nde I及BamHI消化擴增之PCR片段，且選殖於pET21a載體(Novagen，Gibbstown，New Jersey)中。藉由D N A2.0合成CNP融合蛋白DNA且將其選殖於不同表現載體(表6)中。
CNP：GQEHPNA RK YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[G1y-CNP37(SEQ ID NO：75)；TAF：人類轉錄因子TAF12；KSI：酮類固醇異構酶；MRP：麥芽糖結合蛋白；Trx：硫氧化還原蛋白
在大腸桿菌中表現CNP融合蛋白
將CNP融合蛋白表現質體轉型至大腸桿菌BL21或BL21(DE3)中。將轉型之細胞塗鋪於含有100 μg/m1卡本西林(carbenici1ine)或50 μg/m1康黴素(kanamycin)之LB培養盤上且在37℃下培育隔夜。挑選一個單一菌落且在37℃下在震盪下於4m1含有100 μg/m1卡本西林或50 μg/m1康黴素之LB培養基中培養。當細菌培養物之OD600 達到0.6時，將1mM異丙基β-D-1-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)添加至細胞培養基中，且在37℃下在震盪下培育培養基3小時。為進行細胞收集，在4000rpm下離心細菌細胞10分鐘且將細胞集結塊儲存於-80℃下。在室溫下以B-PERII細菌萃取試劑(B-PER IIBacteria1Extraction Reagent)(PIERCE，每4m1細菌培養物使用0.4m1)及Benzonase核酸酶(BenzonaseNuc1ease)(Novagen，0.025U/m1)溶解細胞集結塊10分鐘。保存細菌粗萃取物且加以離心以獲得上清液。藉由SDS-PAGE及西方墨點法分析上清液及粗萃取物之CNP融合蛋白表現及溶解度。
以SDS-PAGE及西方墨點法偵測CNP融合蛋白表現
在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯基醯亞胺凝膠電泳(SDS-PA GE)(Invitrogen，Car1sbad，Ca1ifornia，NuPA GE4- 12%Bis-tris凝膠，M ES SDS緩衝液)上對10 μL細胞溶胞物或可溶上清液進行電泳。在室溫下使用20 m1Imperia1蛋白質染料(Thermo Fisher，Rockford，I11inois)將凝膠染色1小時且以水去染色。為進行西方墨點法，將蛋白質用Ge 1b1ot(Invitrogen)轉移至膜。在室溫下在含5%乳汁之TBS緩衝液中阻斷該膜1小時。將兔抗CNP22抗體(1：2500稀釋液)(Bachem，Torrance，Ca1ifornia)添加至膜，接著在室溫下在震盪下保溫該膜2小時，且接著以TBS緩衝液洗滌該膜3次。
將鹼性磷酸鹽(AP)共軛之抗兔IgG(1：5000稀釋液)添加至膜，接著在室溫下在震盪下保溫該膜1小時，且接著以TBS緩衝液洗滌該膜3次。將10 ml WESTERN BLUE穩定化受質(Promega，M adison，Wisconsin)添加至膜，接著在室溫下在震盪下保溫該膜1至5分鐘，且接著以TBS緩衝液洗滌該膜以移除過量染料。
在大腸桿菌BL21中表現TAF-CNP融合蛋白
自儲存在-80℃下之甘油儲備物獲得表現TAF- CNP融合蛋白之細胞(大腸桿菌菌株BL21)且使其在37℃下在震盪下(250rpm)於4m1含有50μg/m1康黴素之LB培養基中生長隔夜。將4m1生長隔夜之細胞培養物轉移至200m1含有50μg/m1康黴素之LB培養基中且在37℃下在震盪下(250rpm)生長。當OD600 達到0.6時，則添加IPTG至1mM之最終濃度以在37℃下在震盪下(250rpm)誘導蛋白質表現3小時。接著在3000rpm下向下旋轉細胞10分鐘且在-80℃下冷凍所得細胞集結塊。
純化TAF-CNP包涵體及甲酸裂解
將細胞集結塊(自200m1培養物)再懸浮於25m1B-PERII緩衝液(PIERCE)中，在冰上將集結塊音波處理10分鐘(50%，1秒，暫停2秒)，在12000rpm下在4℃下離心20分鐘，且接著將集結塊再懸浮於25m1稀釋20倍之B-PERII緩衝液中。重複此操作直至上清液變得澄清(3-5次)。將1mL再懸浮之TAF-CNP包涵體轉移至1.5m1管中且在14000rpm下離心15分鐘。棄去上清液且以10μ188%甲酸溶解集結塊，且接著立即添加490μ1微孔過濾之水。藉由渦動充分混合該集結塊，且在55℃下保溫20至24小時(70℃/6小時為替代條件)。藉由SDS-PAGE及LC/MS(C4RP)分析甲酸裂解產物。
LC/MS樣品製備
自約8mL培養物(約1.5OD)分離包涵體且將集結塊溶解於10μL純甲酸鹽中。立即將再溶解之集結塊稀釋至2%或10%最終甲酸鹽濃度(0.5mL)，且在55℃下保溫21小時(pH2)(次日，在2%甲酸鹽樣品中可見較明顯混濁)。在15000rpm下離心兩個樣品2分鐘。將20μL上清液注入LC/MS(C4RP)裝置中。
結果
在大腸桿菌中表現CNP融合蛋白
在37℃下，以1mMIPTG誘導3小時使所有CNP融合蛋白均在大腸桿菌中表現(圖1)。構築體pJexpress-TAF-CNP、pJexpress-KSI-CNP(M/N)及pE T-31b-KSI-CNP係以包涵體形式表現，而構築體pET-32a-Trx-CNP及pMAL-CNP係以可溶融合蛋白形式表現。使用抗CNP22抗體之西方墨點法證實CNP融合蛋白之表現(圖1)。
藉由甲酸裂解自TAF-CNP包涵體產生CNP
將TAF-CNP包涵體部分純化且在55℃下以2%甲酸處理20至24小時(70℃/6小時為替代條件)。大部分TAF-CNP裂解且在SDS-PAGE上出現具有與G1y-CNP37胜肽類似之大小的一個額外色帶(圖2)。藉由LC/MS(C4RP)進一步分析裂解樣品。LC/MS結果顯示CNP在甲酸裂解之後以可溶形式自TAF-CNP包涵體釋放。LC/MS分析表明CNP融合蛋白之甲酸裂解使得形成環化Pro-G1y-CNP37(M W=4102)。基於分析對蛋白質之量進行計算表明自8mL極低OD培養物製得約60μg甲酸產生之CNP。自小規模(例如約8mL)低OD(例如1.2OD)細胞培養物產生大約8μg/m1CNP，而較大規模(例如約8L)較高OD(例如38OD)細胞培養物之醱酵可產生約1mg/m1CNP。
結論
產生五個表現構築體以表現CNP融合蛋白。所有五個構築體之表現均產生可溶(Trx及 MBP)或不可溶(TAF及KSI)CNP融合蛋白。藉由簡單甲酸裂解程序，可自TAF-CNP包涵體產生約1mg/m1可溶CNP。
實例2B
在大腸桿菌中產生其它CNP變異體
CNP變異體之重組產生可如實例2A中所述進行。在此實例中，用QuikChangeII XL定點突變誘發套組(Stratagene)來產生或利用DNA2.0來合成其它CNP構築體。其它CNP構築體及表現載體列於表7中。
CNP38：GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[G1y-CNP37(SEQID NO：75)]；Pro-CNP38：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-G1y-CNP37](SEQID NO：145)；CNP37：QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：60)；HSA-CNP：GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[HSA-CNP27(SEQIDNO：144)]；Pro-CNP53：PDLRVDTKSRA AWARLLQEHPNA RK YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIG-SMSGLGC(SEQIDNO：185)；CNP34 ：PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：163)；TAF-Pro-CNP38 ：MVLTKKKLQDLVREVCPNEQLDEDVEEMLLQIADDFIESVVTAA-CQL ARHRK SSTLE VKD VQLHLERQWNMWIMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHT-GDDDDKHMDPGQEHPNARKYKGA NKK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQIDNO：196)；TAF：人類轉錄因子TAF12組蛋白摺疊域(HFD)及來自PET-15b載體之連接子；TAF-NL：無連接子之TAF12HFD；TAF12HFD：VLTKKKLQDLVREVCPNEQLDEDVEEMLLQIADDFIESVVTAACQLA-RHRKSSTLEVKDVQLHLERQWNMWI(SEQIDNO：197)；pET-15b連接子：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTGDDDDKHMD(SEQIDNO：195)；TAF(C/A)：TAF中之半胱胺酸變為丙胺酸；TAF(D/E)：TAF中之天冬胺酸變為麩胺酸(編號指示改變哪個胺基酸殘基)；TAF(C/A及 D/E)：TAF中之半胱胺酸及天冬胺酸分別變為丙胺酸及麩胺酸；BMP：含七個C/A(半胱胺酸變為丙胺酸)突變之骨形態發生蛋白2；KSI：酮類固醇異構酶；MBP：麥芽糖結合蛋白；TRX：硫氧化還原蛋白
結果
在37℃下，以1mMIPTG誘導3小時使所有CNP融合蛋白均在大腸桿菌中表現。構築體pJexpress-B M P-Pro-CNP38、pJexpress-TAF-Pro-C NP37 、 pJexpress-B M P-Pro-C NP37、 pJexpress-Pro-HsA-CNP、pJexpress-TAF 及 pJexpress-B MP以包涵體形式表現。使用利用抗CNP抗體之西方墨點法來證實該表現(圖3)。
藉由甲酸裂解自TAF-Pro-CNP38包涵體產生Pro- G1y- CNP37(「Pro-CNP38」)
使用甲酸作為包涵體蛋白質之變性劑且可在最佳化條件下特異性裂解Asp與Pro之間的胜肽鍵。將 TAF- Pro- CNP包涵體如上所述部分純化且在25℃、37℃、42℃及55℃下以50%甲酸處理24小時。大部分TAF-Pro-CNP38裂解，且自37℃、42℃及55℃裂解之SDS-PAGE上展示具有與G1y- CNP37(「CNP38」)胜肽類似之大小的一個額外色帶(圖4A)。 以10MNaOH中和37℃及55℃下之裂解反應且在14，000rpm下離心15分鐘。未裂解TAF-Pro- CNP38、TAF及其它包涵體沈澱於集結塊中。上清液含有可溶Pro- CNP38且藉由LC/MS進一步分析。LC/MS結果展示上清液含有由過量酸性水解產生之非特異性裂解胜肽之混合物。
當在55℃下以2%及10%甲酸處理TAF- Pro- CNP包涵體20小時時，大部分TAF-Pro-CNP38裂解，且在SDS- PAGE上觀察到具有與G1y-CNP37類似之大小的一個額外色帶(圖4B)。藉由LC/MS進一步分析裂解樣品。LC/MS分析展示正確之Pro-CNP38在甲酸裂解之後以可溶形式自TAF- Pro- CNP38包涵體釋放。Pro-CNP38自2%及10%甲酸裂解之產率類似(圖4C)。
用於Pro-Gly-CNP37(「Pro-CNP38」)產生及純化之甲酸裂解及中和
甲酸可溶解及裂解TAF-Pro-CNP38、BMP- Pro- CNP38及其它包涵體。pH值中和使得不可溶之污染蛋白質/胜肽(未裂解之TAF-Pro-CNP38及BMP-Pro-CNP38、TAF、BMP及其它)沈澱。在離心之後，可溶Pro-CNP38保留於上清液中。TAF- Pro- CNP38及BMP-Pro-CNP38在55℃或70℃下在2%甲酸中裂解24小時。以1：1比率之0.5MTris緩衝液中和裂解反應且在14，000rpm下離心15分鐘。結果顯示上清液含有幾乎純的胜肽且在中和後不存在可觀察到的Pro-CNP38之回收損失。此為Pro-CNP38純化之簡單且有效之步驟。
用於Pro-Gly-CNP37(「Pro-CNP38」)產生之TAF-Pro-CNP38包涵體甲酸裂解之不同條件的分析
甲酸可在最佳化條件下特異性裂解Asp與Pro之間的胜肽鍵。若甲酸裂解條件未經最佳化，則可能在Asp與任何其它胺基酸之間發生胜肽鍵的非特異性裂解，或甚至發生任何胜肽鍵之非特異性裂解。TAF-Pro-CNP38包涵體以2%甲酸在42℃、55℃或70℃下裂解6、24或48小時。圖5A展示TAF- Pro-CNP38在70℃下24小時或在55℃下48小時完全裂解。70℃裂解可在17小時內完成(圖5B)。儘管70℃/24小時裂解得到最高產率，但非特異性裂解產物(例如分子量為3142，自Pro-CNP38藉由Asp與 Arg之間胜肽鍵的裂解所產生之胜肽)顯著增加(圖5C)。
當TAF-Pro-CNP38包涵體在甲酸裂解之前經純化或以B-PER II緩衝液處理時，Pro-CNP38產生之產率及純度獲得改良。因為B-PERII緩衝液含有清潔劑辛基硫糖苷且相對昂貴，所以測試其它常用清潔劑或緩衝劑以便大規模產生Pro-CNP38。將TAF-Pro-CNP38包涵體再懸浮於不同清潔劑(辛基蔗糖；Triton x-100；Tween-20；NP-40；CA-630)或緩衝液(B-PER II；B-PERII1/20稀釋液；B- PER；B- PER磷酸鹽緩衝液；25mMtris；150mM NaC1(pH7.9)；25m M tris(pH7.5)；過濾水；PBs)中且在室溫(RT)下保溫24小時。所有清潔劑均以1%存在於25mMtris緩衝液(pH7.5)中。在清潔劑或緩衝液中保溫之後，在55℃下藉由2%甲酸來裂解TAF-Pro-CNP38包涵體22小時。結果顯示BPERII仍顯示良好產率，且使用C A630及Triton X-100亦獲得積極結果。
Pro-Gly-CNP37(「Pro-CNP38」)蛋白水解裂解產物
在Pro-CNP38純化期間，一種未鑑別之蛋白酶(可能為膜相關蛋白酶)將Pro-CNP38胜肽(自BL21菌株產生，MW4102)裂解為兩種胜肽，產生胜肽PGQEHPNAR(MW1004)(SEQIDNO：198)及KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(MW3115)(SEQID NO：199)。不受理論束縛，清潔劑可改良Pro-CNP38之產率及純度的一種可能原因為清潔劑可移除大多數，但可能並非全部該未鑑別之蛋白酶。測試高溫、鹼性pH值及EDTA以鑑別此等試劑是否可抑制蛋白酶裂解。在室溫或120℃下保溫TAF- Pro- CNP38包涵體2小時且在14000rpm下離心15分鐘。將集結塊再懸浮於2%甲酸中且在55℃或70℃下保溫18小時。添加1：1比率之0.5M Tris以中和裂解。在14000rpm下離心中和之樣品5分鐘，且在有或無10mM EDTA(pH10)存在下將上清液在室溫下留置6小時或22小時。藉由LC/MS分析蛋白水解裂解(表8)。
所有在70℃下裂解之樣品(8-12)均顯示有限蛋白水解裂解(Pro-CNP38裂解少於4%)。當在55℃下進行裂解時，幾乎40%Pro-CNP38被蛋白酶裂解(樣品7)。鹼性pH值及EDTA不影響非特異性蛋白水解裂解。高溫(120℃，2小時)非特異性裂解Pro-CNP38。
應注意來自Stratagene之 BL21(DE3)菌株不具有該未鑑別之蛋白酶。
自不同構築體產生Pro-Gly-CNP37(「Pro-CNP38」)及其它CNP變異體：
可藉助於TAF-Pro-CNP38融合蛋白以包涵體形式過表現，接著以甲酸裂解融合蛋白，在大腸桿菌中大規模產生Pro-CNP38。按照本文所述之方法，其它TAF-CNP融合蛋白(TAF-CNP34及TAF-Pro-CNP53)可以包涵體形式表現，且接著以甲酸裂解，以產生CNP變異體CNP34及Pro- CNP53。圖6描繪TAF-CNP34之表現，圖7描繪TAF- Pro- CNP53之表現，圖8描繪TAF-CNP34及TAF-Pro-CNP53之甲酸裂解產物，圖9描繪LC/MS層析圖中CNP-34之峰，且圖10描繪LC/MS層析圖中Pro-CNP53之峰。
使用甲酸可引起在除所靶向Asp-Pro鍵外之胜肽鍵處非特異性裂解。為改良所需甲酸裂解產物之純度及總體力價，將TAF12或其片段中之不同天冬胺酸殘基變為麩胺酸。此外，將TAF12或其片段中之一或多個半胱胺酸殘基變為丙胺酸以防止形成非特異性二硫鍵。所有在TAF12中具有此等突變之TAF-Pro-CNP38融合蛋白均以包涵體形式表現且以甲酸裂解以產生Pro-CNP38。圖7展示TAF- NL- (C/A及6D/6E)-Pro-CNP38及TAF(C/A 及 10D/10E)-Pro-CNP38之表現，圖11展示TAF(C/A及4D/4E)-Pro-CNP38及TAF(4D/4E)-Pro-CNP38之表現，圖12展示TAF(4D/4E)-Pro-CNP38及TAF(C/A及4D/4E)-Pro-CNP38之甲酸裂解產物，且圖13展示TAF-NL-(C/A及6D/6E)-Pro-CNP38及TAF(C/A 及10D/10E)-Pro-CNP38之甲酸裂解產物。表9概括獲自各種TAF-Pro-CNP38構築體之Pro-CNP38的純度(在純化之前)及力價。
* 具有pJexpress-TAF(C/A 及 10D/10E)-Pro-CNP38之細胞生長較緩慢且最終細胞密度(OD600 )相比於其它TAF-Pro-CNP38構築體較低。
藉由醱酵及甲酸裂解大規模產生Pro-Gly-CNP37(「Pro-CNP38」)
使包含pJexpress-TAF-CNP構築體之BL21(DE3)細胞在10公升醱酵罐中於37℃下生長約16-17小時直至OD600 達到64。接著在1mMIPTG存在下在約35-37℃下生長/培養細胞，以誘導TAF-Pro-CNP38融合蛋白表現，持續約7-8小時直至OD600 達到160。醱酵產生9g/L TAF-Pro-CNP38之力價。圖14顯示醱酵中產生之TAF-Pro-CNP38融合蛋白的西方墨點。
將自750mL細胞培養物(來自10L醱酵物)回收之細胞集結塊再懸浮於pH7.4磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，且藉由三次穿過壓力均質機(10，000巴)溶解。在6，500g下離心所得溶胞物10分鐘且棄去上清液。以定子旋轉機(rotostator)將含有不可溶TAF-Pro-CNP38融合蛋白包涵體之集結塊部分再懸浮於500mLPBS中。在6，500g下離心懸浮液10分鐘且棄去上清液。以定子旋轉機將所得包涵體集結塊再懸浮於500mL中且在55℃下保溫30分鐘。將250mL6%甲酸添加至溫熱之包涵體懸浮液中達2%甲酸之最終濃度，且在55℃下保溫20-24小時。在20-24小時之後添加50mL400mMNa2 HPO4 以開始中和甲酸裂解反應，且以50%w/v NaOH滴定所得混合物至pH6.9-7.4且在室溫下留置30分鐘。在中和之後，形成重沈澱物且藉由在6，500g下離心10分鐘來移除。保留上清液且其每公升培養物含有平均1.3g80%純Pro-CNP38。大部分大腸桿菌及TAF相關蛋白質及胜肽保留於集結塊中。
自甲酸裂解及中和上清液產生之可溶Pro- CNP38為80%純且含有線性及環化Pro-CNP38胜肽連同其它產物相關雜質之混合物。無菌過濾含有Pro-CNP38之pH值中性上清液。在pH7-7.4下藉由使用Fractoge1TMAE Hi-CAP管柱(E M D Biosciences)進行陰離子交換層析來進一步純化以移除應結合於該管柱之DNA、內毒素及胜肽污染物。流經之溶離份含有部分環化之Pro-CNP38。將硫酸銅添加至流經溶離份中達10μM之最終濃度且在室溫下保溫1小時。在中性pH值下添加Cu++ 催化胜肽上游離半胱胺酸硫氫基之氧化以形成分子內二硫鍵，產生100%環化Pro-CNP38且無可偵測之線性胜肽。藉由添加水將溶液電導率調節至小於15mS/cm。接著使用SP-瓊脂糖管柱(GE Hea1thcare)及磷酸鈉緩衝液(pH7)進行陽離子交換層析以移除流經物中任何剩餘DNA及內毒素，且進一步純化Pro- CNP38至約95- 96%之純度，其中非產物相關雜質少於0.5%。圖15為來自SP- 瓊脂糖管柱之溶離份的SDS-PAGE；Pro-CNP38之最高濃度見於溶離份22至30。未彙集之溶離份24的逆相HPLC/MS分析表明存在90%Pro-CNP38、5%含氧化甲硫胺酸殘基之Pro- CNP38、3%在G1y-Cys鍵處裂解從而形成CNP-17之Pro-CNP38，及1.6%在環狀域中Asp-Arg鍵處裂解之Pro-CNP38。最終純化後純Pro-CNP38胜肽之產率為每公升細胞培養物獲得0.9g(36%總回收率)。
彙集自五次個別純化收集之Pro-CNP38以供調配。彙集產物含有93.5%Pro-CNP38、3.3%含氧化甲硫胺酸殘基之Pro-CNP38、1.3%脫醯胺Pro-CNP38，及1%在G1y-Cys鍵處裂解從而形成CNP-17之Pro-CNP38。將樣品以50 mM磷酸鈉(pH7)稀釋至10 mS/cm之電導率且將其加載於CM-瓊脂糖管柱(GE-Hea1thcare)上以供濃縮及緩衝液交換。C M-瓊脂糖樹脂之弱陽離子交換特性允許利用弱酸溶液而非典型鹽梯度使胜肽自管柱解離。使Pro-CNP38自CM-瓊脂糖管柱解離所需之酸濃度視管柱負載量而定。在每毫升樹脂負載50 mgPro-CNP38時，10 mM HC1足以使Pro-CNP38溶離。在每毫升樹脂負載9mgPro-CNP38時，溶離需要50mM HC1。當負載量為每毫升樹脂9mgPro-CNP38時，Pro-CNP38溶離於小於一個管柱體積中，其使胜肽顯著濃縮。溶離份含有20.3mg/mL95%純Pro-CNP38，以及3%含氧化甲硫胺酸殘基之Pro-CNP38、1%脫醯胺Pro-CNP38，及少於1%在G1y-Cys鍵處裂解從而形成CNP-17之Pro-CNP38。Pro- CNP38於弱酸中之濃溶液適用於稀釋於適當緩衝液中以用於液體或凍乾調配物。
實例3
活體外利用中性內肽酶對CNP變異體進行裂解
為測定胺基酸取代、胺基酸延伸、主鏈修飾、側鏈修飾及聚乙二醇化對CNP變異體對中性內肽酶(NEP)裂解之敏感性的影響，使用監測未裂解CNP變異體消失之活體外分析法來分析胜肽裂解。
將重組人類NEP(1μg/mL最終濃度)添加至100μM稀釋於0.1 M Tris(pH7)中之CNP變異體中。在37℃下保溫反應混合物持續各種時段，且以EDTA(最終10mM)淬滅反應，接著進行熱變性。縮減反應混合物且接著使用HPLC及質譜來分析反應產物。基於完整CNP變異體隨時間而消失來計算CNP變異體之半衰期。將經消化CNP變異體之結果與平行wtCNP22消化相比較且相對於由1 mg/m1NEP消化之100μMCNP22之結果(t1/ 2=80分鐘)來校正。
表1列出具有主鏈或側鏈修飾之各種CNP變異體之半衰期(依據活體外NEP裂解分析法)。然而，移除類似物L中六個NEP裂解位點中之三個產生實質上更短之半衰期。在所測試之CNP變異體中，類似物N(含有CNP22之所有22個胺基酸之D-對映異構體)及類似物M(在Leu9與Leu11均具有N- 甲基化醯胺鍵)顯示最大的NEP裂解抗性。然而，類似物N與類似物M均不能刺激cGMP產生(參看下文)。
將類似物A、B、E、F、G及H之半衰期互相比較，類似物E及G之半衰期經測定相比於類似物A、B、F及H之半衰期為約1.5倍至約2.5倍長。所有此六種類似物均在Cys6-Phe7鍵處顯示裂解抗性或相對於wtCNP22獲改良之裂解抗性(資料未圖示)。依據半衰期，類似物對1μg/m1NEP之抗性的等級次序為類似物G(3-Cl-Phe)類似物E(D-Phe)>類似物H(「β-2Phe」)、類似物B(N-Me-Phe)及類似物F(t-Bu-G1y)=wtCNP22>類似物A(Cys-CH2 -NH)。類似物E及 G相比於wtCNP22具有約1.5倍長之半衰期。除對Cys6-Phe7鍵裂解之抗性外，類似物B、E、F、G及H亦顯示對1μg/mLNEP存在下G1y8-Leu9鍵裂解之抗性(資料未圖示)。此等結果表明在Cys6與G1y8之間具有主鏈或側鏈修飾之CNP變異體可對NEP裂解Cys6-Phe7鍵及/或 G1y8-Leu9鍵具有抗性，但未必具有改良之對NEP之總體抗性或比CNP22長之半衰期。該等結果似乎與文獻中關於NEP首先裂解CNP22之Cys6-Phe7鍵且接著在其它處裂解之報導相反。
1 藉由利鈉胜肽刺激NIH3T3細胞中之cGMP產生(相對於1μMCNP22存在下之cGMP產生)
2 CNP22之NEP抗性t1/2 平均為80分鐘。由於實驗之間NEP之催化活性存在變化，因此將所有CNP22t1/2 消化均相對於80分鐘來校正，且在各實驗中使用差分係數來計算類似物t1/2 以獲得經調整之t1V2 。ND=未測定
表2列出具有天然及/或非天然胺基酸之取代的各種CNP變異體的半衰期(依據活體外NEP裂解分析法)。在所測試之變異體中，具有K4R及G15S取代之類似物BK及具有K4R及G15N取代之類似物BJ顯示最大NEP裂解抗性。
1 藉由利鈉胜肽刺激NIH3T3細胞中之cGMP產生(相對於1μMCNP22存在下之cGMP產生)
2 CNP22之NEP抗性t1/2 平均為80分鐘。由於實驗之間存在NEP催化活性之變化，因此將所有CNP22t1/2 消化均相對於80分鐘來校正，且在各實驗中使用差分係數來計算類似物t1/2 以獲得經調整之t1/2 。ND=未測定
表3列出具有N端及/或C端修飾(包括胺基酸延伸)之CNP變異體的半衰期(依據活體外NEP裂解分析法)。在所測試之類似物中，類似物AZ、CC、CF、BL、CS、CK及CL、Pro-G1y-CNP37及HSA-CNP27對NEP降解最具抗性。
1 藉由利鈉胜肽刺激NIH3T3細胞中之cGMP產生(相對於1μMCNP22存在下之cGMP產生)
2 CNP22之NEP抗性t1/2 平均為80分鐘。由於實驗之間存在NEP催化活性之變化，因此將所有CNP22t1/2 消化均相對於80分鐘來校正，且在各實驗中使用差分係數來計算類似物t1/2 以獲得經調整之t1/2。.
ND=未測定
表4列出在N端共軛至PEG(或PEO)聚合物之CNP變異體的半衰期(依據活體外NEP裂解分析法)。除與wtCNP22具有相同半衰期之PEO12-GANPR-CNP22(K4R)外，表4中所測試及展示之所有聚乙二醇化CNP變異體均顯示NEP裂解抗性或增強之NEP裂解抗性。具有K4G取代之CNP22的N端聚乙二醇化似乎並不使NEP抗性實質上提高。舉例而言，PEG2K-CNP22(K4G)之NEP裂解抗性僅略強於CNP22(資料未圖示)，而PEG2K-CNP22具有比CNP22長得多的活體外半衰期。
1 藉由利鈉胜肽刺激NIH3T3細胞中之cGMP產生(相對於1μMCNP22存在下之cGMP產生)
2 CNP22之NEP抗性t1/2 平均為80分鐘。由於實驗之間存在NEP催化活性之變化，因此將所有CNP22t1/2 消化均相對於80分鐘來校正，且在各實驗中使用差分係數來計算類似物t1/2 以獲得經調整之t1/2。
ND=未測定
圖16展示CNP22之五種N端聚乙二醇化共軛物之NEP抗性概況。CNP22胜肽共軛至具有遞增質量之PEG(或PEO)聚合物顯示對NEP降解之抗性增強。特定言之，PEO24- CNP22、PEG2K-CNP22及PEG5K-CNP22歷經160分鐘之分析時期對NEP降解具有抗性。
圖17展示具有N端胺基酸延伸之CNP變異體CNP37(類似物BL)、CNP53及GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)之NEP抗性概況。清楚可見，在此活體外分析法中，CNP37與CNP53均對NEP降解具有抗性，而GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)對NEP水解具有與CNP22具有相同的不穩定性。
圖18描繪在N端共軛至PEG(或PEO)部分之CNP17及GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)之NEP抗性概況。GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)之聚乙二醇化極大地改良此CNP變異體之NEP抗性，其中PEO24- GANRR- CNP22(K4R)(SEQID NO：36)歷經160分鐘之分析時期對NEP裂解完全具有抗性。將PEO部分之質量自約0.6kDa(PEO12)增至約1.2kDa(PEO24)改良聚乙二醇化GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)之NEP抗性。以單分散性PEO24部分而非多分散性PEG1K部分對GANRR- CNP22(K4R)(SEQID NO：36)進行聚乙二醇化亦改良NEP抗性。最後，儘管PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)與PEG2K-CNP17具有類似之總質量(注意PEG2K為多分散性)，但前者顯示實質上更佳之NEP抗性。
亦對wtCNP22及CNP變異體G-CNP37、GHKSEVAHRFK- wtCNP27(「CNP27-HSA」，SEQID NO：144)及PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27-PEO12」)(SEQID NO：36)進行NEP抗性分析法。圖19展示G-CNP37及CNP27-HSA對NEP裂解完全具有抗性，且CNP27-PEO12顯示對NEP降解之穩定性比wtCNP22大得多。
實例4
CNP變異體刺激NIH3T3細胞中之cGMP產生
為測定CNP變異體之功能活性，量測暴露於CNP變異體之NIH3T3細胞中GMP之產生。鼠類NIH3T3細胞內源性表現CNP信號傳導受體NPR-B，該NPR-B與人類NPR-B共享98%蛋白質序列一致性。在37℃與5%CO2 下於補充有10%胎牛血清及抗生素之杜貝可改良伊格爾高葡萄糖培養基(high g1ucose Du1becco' s Modified Eag1e Medium)中培養NIH3T3細胞。在信號傳導之前24至48小時，在分析時將細胞以2- 5×105 個細胞/孔之密度於12孔培養盤中繼代。將CNP變異體再懸浮於1mM HC1中達1mg/mL(對於wtCNP22為455μM)之儲備物濃度，且隨後以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)稀釋成30μM之工作儲備溶液。在磷酸鹽緩衝鹽水中製備十倍連續稀釋液。培養基自細胞移除且用0.4mL含有0.75mM異丁基甲基黃嘌呤之PBS/杜貝可改良伊格爾培養基(50/50，v/v)替換。將培養盤在37℃、5%CO2 下培育15分鐘，隨後添加0.2mL含CNP變異體之PBS且在37℃下繼續培育15分鐘。藉由添加0.2mL由 CatchPointcG MP分析套組(M o1ecu1ar Devices)供應之溶解緩衝液來停止反應，且用CatchPointcG MP分析法(Mo1ecu1ar Devices)測定cGMP產量。所有刺激實驗均一式兩份地進行。
表1-4概括分別具有主鏈或側鏈修飾、胺基酸取代、N端胺基酸延伸及/或N端聚乙二醇化之CNP變異體刺激NIH3T3細胞中cGMP產生之能力。在所有四個表中，均將暴露於10nM或1μM CNP變異體之NIH3T3細胞中cGMP產量之值相對於細胞數及1μM wtCNP22存在下之cGMP產量進行校正。
關於表1中之結果，僅位置7具有3-C1-Phe之類似物G在1μm下顯示與wtCNP22實質上相同之NPR-B刺激活性。關於表2，具有胺基酸取代之各種CNP變異體(包括類似物AH、BO、AB、BH、BZ、BX及BR)顯示與wtCNP22實質上類似之NPR-B刺激活性。
考慮表3中之結果，具有N端及/或C端修飾(包括胺基酸延伸)之許多CNP變異體顯示與wtCNP22相當之NPR-B刺激活性。功能性CNP變異體包括類似物BB(其為在N端連接至庚酸之CNP22(G1E))及類似物CD(其為共軛至BNP之N端及C端「尾」之CNP22的環狀域(保留Cys6至Cys22序列之「CNP17」))。圖20說明在活體外分析法中，GANRR- CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)、CNP37(類似物BL)及CNP53所有均具有與wtCNP22類似之NPR-B刺激活性。
表3中值得注意的是，在針對CNP功能性與NEP抗性所分析之CNP變異體中，類似物AZ(R-CNP22(K4R))、類似物CC、類似物CF、類似物BL(CNP37)、類似物DB(G1y-CNP37)及GHKSEVAHRFK-CNP27(HSA-CNP27)(SEQ IDNO：144)所有均具有與CNP22實質上類似之NPR-B刺激活性，同時具有實質上強於CNP22之NEP裂解抗性。
關於表4中之結果，九種N端聚乙二醇化CNP變異體在1μM下刺激cGMP產生至用wtCNP22所達成之量的至少約70%。若干值得關注之態樣呈現於表4中。首先，將GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)在N端用單分散性PEO聚合物(PEO12為約0.6kDa，PEO24為約1.2kDa)聚乙二醇化產生比用多分散性PEG聚合物(PEG1K具有約1kDa之聚合物數目平均分子量(Mn)，PEG2K為約2kDa)聚乙二醇化更佳之NPR-B功能性(亦參看圖21)。第二，將wtCNP22在N端用具有遞增Mn 之多分散性PEG聚合物(PEG1K、PEG2K、PEG5K及PEG20K)聚乙二醇化或用質量較大之單分散性PEO聚合物(PEO12及PEO24)聚乙二醇化相應地降低CNP變異體之NPR-B活化能力(亦參看圖22)。第三，具有N端GANRR(SEQID NO：8)延伸之PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)比PEO24-CNP22及PEO24-CNP22(K4R)刺激更多cGMP產生。亦值得注意的是，在針對CNP功能性與NEP抗性所分析之N端聚乙二醇化CNP變異體中，PPEO12-R-CNP22(K4R)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)所有均具有與CNP22實質上類似之NPR-B刺激活性，同時對NEP降解之抗性比CNP22大得多。
在表1-4中所列且針對CNP功能性與NEP抗性所分析之CNP變異體中，類似物G、BK、AZ、CC、CF、BL及DB、Pro-G1y-CNP37、HSA-CNP27(GHKSEVAHRFK-CNP27)(SEQIDNO：144)、PEG1K-CNP22、(PEO12)-生物素- CNP22、PEO12- R- CNP22(K4R)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)所有均具有與wtCNP22實質上類似之NPR-B刺激活性，同時對NEP降解之抗性實質上大於wtCNP22。
亦對wtCNP22及CNP變異體G- CNP37、GHKSEVAHRFK- wtCNP27(「CNP27-HSA」，SEQID NO：144)、wtCNP29及PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27-PEO12」)(SEQIDNO：36)分析cGMP產量。圖23展示CNP22及所有所分析之CNP變異體在低劑量或高劑量CNP下均誘導產生類似含量之cGMP。
實例5
對NPR-A、NPR-B及NPR-C之結合特異性
信號傳導競爭分析法
為測定CNP變異體對清除受體NPR-C之結合特異性，進行信號傳導競爭分析法。短暫性轉染人類NPR- B或NPR- C之表現質體(各自購自OriGene)且使受體表現於HEK293T細胞中。在轉染後四十小時，收集NPR-B、NPR- C及原生HEK293T細胞，計數且以1：1之比率(NPR-B細胞：競爭細胞(NPR-C或原生HEK293T細胞))塗鋪於12孔或96孔培養盤中。在塗鋪二十小時之後，處理細胞以進行實例4中所述之NPR-B/cGMP刺激分析法。利鈉清除受體NPR-C若存在則預期結合及內化CNP，藉此降低可用於經由NPR-B信號傳導之總體CNP濃度，使得cGMP產生減少及劑量-反應曲線向右偏移。已證實wtCNP22之劑量-反應曲線向右偏移。對NPR-C之親和力降低的CNP變異體預期不誘導劑量-反應曲線向右偏移，或預期其誘導劑量-反應曲線向右較小偏移。此信號傳導競爭分析法類似於Cunningham(美國專利5，846，932；B.Cunningham，EMBO J.13(11)：2508-2515(1994)；H.Jin等人，J.C1in.Invest.98(4)：969-976(1996))先前所述之分析法。
在信號傳導競爭分析法中評估wtCNP-22、Pro-G1y-wtCNP37及ANP經由NPR-B及NPR-A之cGMP刺激活性，及其對於NPR-B相對於NPR-C及對於NPR-A相對於NPR-C之選擇性。將NPR-A、NPR-B及NPR-C個別地短暫性轉染於HEK293T細胞中。在轉染之後三十小時，將細胞塗鋪於96孔培養盤中：(A)20，000個 NPR-B細胞+20，000個模擬物轉染細胞；(B)20，000個NPR-B細胞+20，000個NPR-C細胞；(C)20，000個NPR-A細胞+20，000個模擬物轉染細胞；及(D)20，000個NPR-A細胞+20，000個NPR-C細胞。在塗鋪後二十小時，移除培養基且以無血清培養基：PBS(1：1)+0.75μMIBMX替換歷時15分鐘。對於經由NPR-B之cGMP信號傳導，添加一系列劑量之ANP、CNP-22及Pro-G1y-CNP37且在37℃下培育12分鐘，隨後藉由細胞溶解停止分析。對於經由NPR-A之cGMP信號傳導，在37℃下培育一系列劑量之CNP-22及Pro-G1y-CNP37持續12分鐘，而在37℃下培育一系列劑量之ANP持續6分鐘(因為NPR- A似乎為「快於」NPR-B之鳥苷酸環化酶，所以縮短ANP之培育時間以便在用ANP進行信號傳導時不會過早達到最大程度(耗盡所有細胞GTP))。圖24A及B展示在信號傳導競爭分析法中CNP-22及Pro-G1y-CNP37(「Pro-CNP38」)經由NPR- B以類似劑量-反應曲線，且以比經由NPR-A高得多的程度刺激cGMP產生，且顯示類似的NPR-B相對於NPR-C選擇性之概況。
測定對NPR-A、NPR-B及NPR-C之結合親和力(Ki )
在異源競爭結合分析法中測定CNP變異體對NPR- A、NPR-B及NPR-C之結合親和力(Ki )(美國專利5，846，932；B.Cunningham，E M BO J.13(11)：2508-2515(1994)；H.Jin等人， J.C1in.Invest.98(4)：969-976(1996))。製備來自表現人類NPR-A、 NPR-B或NPR-C之HEK293細胞或另一可適當轉染細胞株(例如海拉細胞(HeLace11))之膜以便進行放射性標記配位體結合分析法。將膜製劑稀釋於適當緩衝液中且添加不同濃度之wtCNP22或CNP變異體(競爭劑)與經I125 標記之wtCNP22(Bachem)。在室溫下保溫樣品以使配位體/受體平衡，且藉由經PVDF濾膜過濾將結合之胜肽與游離胜肽分離。洗滌濾膜，隨後添加閃爍體且藉由閃爍計數器計數。一式兩份量測各濃度競爭劑胜肽之結合。藉由非線性回歸分析及/或程-普魯索夫方程(Cheng- Pruso ffequation)計算C NP變異體之親和力(Ki ，平衡解離常數)及Bmax (受體數)。
顯示對NPR-C之親和力降低的CNP變異體預期對NPR-C所致之清除具有降低之敏感性且因此具有較長血漿或血清半衰期。CNP變異體在循環中之半衰期增加將增強變異體用於治療活性之可用性。
實例6
CNP變異體對大鼠軟骨肉瘤(RCS)細胞生長及RCS細胞中cGMP產生之影響
為評估CNP變異體刺激骨生長之能力，在細胞培養物中藉由以纖維母細胞生長因子2(FGF-2)處理大鼠軟骨肉瘤(RCS)細胞來模擬骨骼發育不全，該纖維母細胞生長因子2活化纖維母細胞生長因子受體3(FGFR-3)且誘導生長停滯(Krejci等人，J.Ce11Sci.，118(21)：5089-5100(2005))。
最佳CNP治療參數可藉由改變CNP濃度(0.05、 0.1、 0..2及0.5μM)，及治療持續時間及間隔(連續；2.5分鐘、 10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時及8小時，一日一次；2.5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時及4小時，一日兩次)來確定。72小時之後，使用自動化細胞計數器對細胞進行計數，且使用阿辛藍(a1cian b1ue)染色估算細胞外基質之量。
接著使用由使用wtCNP22之生長實驗所確定之最佳條件，以CNP變異體處理RCS細胞。藉由競爭性ELISA量測未經處理之RCS細胞、經CNP處理之RCS細胞及經CNP變異體處理之RCS細胞的cGMP濃度。亦監測由用CNP變異體處理所引起之細胞生長及基質合成且將其與由CNP處理所引起之細胞生長及基質合成相比較。
為評估CNP變異體在人類細胞培養系統中之作用，以wtCNP22及CNP變異體處理海藻酸鹽珠粒中之原代再分化人類軟骨細胞，且藉由競爭性ELISA測定cGMP濃度作為有效CNP信號傳導之量度。
本文所述之方法可用以評估CNP變異體活體外刺激大鼠軟骨肉瘤細胞中cGMP產生及大鼠軟骨肉瘤細胞生長之能力。
實例7
大鼠軟骨肉瘤細胞中之劑量反應研究
酪胺酸激酶受體纖維母細胞生長因子受體3(FGFR- 3)(一種軟骨細胞生長之負調節劑)在軟骨發育不全個體中具有組成性活性。以FGF-2刺激FGFR-3受體藉由長久活化Er kMAPK導致生長停滯，且使得基質合成減少及損失基質，以及細胞形狀變化。使大鼠軟骨肉瘤(RCS)細胞連續暴露於纖維母細胞生長因子2(FGF-2)可藉由活化FGFR- 3及誘導生長停滯來在細胞培養物中模擬軟骨發育不全(Kre jc i等人， J.Ce11 Sci.，118(21)：5089-5100(2005))。為測定刺激骨細胞充分生長之CNP變異體之劑量及給藥頻率，使用如實例6中所述之RCS細胞分析法進行劑量反應研究。
將RCS細胞以10×103 個細胞/孔接種於24孔培養盤中，生長24小時，處理72小時，且接著計數。使RCS細胞連續暴露於FGF-2(5ng/mL)以模擬誘導細胞生長停滯之組成性活性FGFR-3(參看圖25中之第5號柱)。連續(72小時)、每日1小時或每日2小時培養野生型CNP22(0.2μM)。每日更換所有刺激劑。與在無CNP22存在下每孔約100×103 個細胞(圖25中之第5號柱)相比，在5.0ng/mLFGF-2存在下使RCS細胞連續暴露於0.2μMCNP22部分逆轉FGF2誘導之生長停滯，使得每孔生長約200×103 個細胞(圖25中之第6號柱)。
一日一次暴露於CNP22(0.2μM)1小時與一日一次暴露於CNP22(0.2μM)2小時均獲得連續CNP22(0.2μM)暴露對軟骨細胞生長之作用的約84%(圖25中之第7號及第8號柱)。此等結果表明細胞生長停滯之逆轉無需將生長停滯之軟骨細胞連續暴露於CNP22。另外，劑量反應研究表明較低劑量之CNP22亦能夠逆轉生長停滯(圖26A)。
此外，細胞外基質之組織及細胞形態分析顯示CNP22處理拮抗FGF2介導之軟骨肉瘤細胞外基質損失且增加基質合成。如由35 S-硫酸鹽及3 H-Pro併入基質中或在基質中減少所評估，暴露於FGF-2減少基質合成且增加降解，而將CNP22添加至FGF-2細胞培養物中增加基質合成且部分抑制FGF-2(圖27A-D)。對與FGF-2及CNP22一起培養之RCS細胞中聚集蛋白聚糖及纖維結合蛋白產生(mRNA及蛋白質)之分析顯示FGF-2降低聚集蛋白聚糖含量且增加纖維結合蛋白含量，該等含量可藉由添加CNP22來抑制(圖28A-C)。FGF-2主要經由Erk來誘導及活化基質加工分子， 且添加CNP22顯示對此活化具有一定程度的影響。
量測生長停滯之其它高產量分析法(諸如結晶紫染色)適用於量測CNP22及其變異體對RCS細胞之作用。
可用本文所述之CNP變異體進行類似劑量反應研究以測定其逆轉FGF2誘導之RCS細胞生長停滯的有效劑量。
實例8A
離體刺激患有輕度軟骨發育不全之小鼠的脛骨及股骨生長
已使用小鼠脛骨器官培養物模型來證明野生型CNP22刺激縱向骨生長之功效。用10-8 、10-7 或10-6 M 之CNP22處理野生型脛骨6日分別使縱向生長增加31%、40%及42%。組織學評估亦顯示肥大區擴展，例如生長板中肥大軟骨細胞之數目及尺寸增加(Agoston等人，B MC De v.Bio 1.7： 18(2007))。在自FGFR3A ch 小鼠分離之脛骨中觀察到類似結果(Yasoda等人，Nat.Med.10：80-86(2004))。
為測定CNP變異體刺激縱向骨生長之功效，在野生型小鼠及在人類FGFR-3基因(FGFR3wt/A ch 異型接合子)中具有G380R突變之轉殖基因小鼠(代表輕度軟骨發育不全之小鼠模型)中的軟骨內骨生長之小鼠器官培養物模型中測試CNP變異體。簡言之，比較野生型CNP22及CNP變異體在自野生型及FGFR3wt/A ch 同窩出生小鼠分離之小鼠胚胎脛骨或新生小鼠脛骨之器官培養物模型中的藥理學活性。評估總體骨生長及生長板內之組織學變化。亦針對細胞內信號傳導之生物標記(cGMP)、軟骨代謝之生物標記(第II型膠原蛋白、其它膠原蛋白、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素)、骨代謝之生物標記(骨鹼性磷酸酶、骨鈣化素、第I型膠原蛋白[C端胜肽、N端胜肽])及炎症之生物標記(介白素-1、介白素- 6、介白素-11)對條件培養基進行評估。
有效CNP變異體可藉由其例如刺激cGMP產生及骨生長(如藉由縱向骨長度增加及生長板肥大區中之細胞擴展所量測)之能力來鑑別。
量測骨生長
在小鼠器官培養物模型中評估wtCNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)刺激縱向股骨生長之功效。對於此等實驗，自2-3日齡野生型小鼠分離股骨且在媒劑、CNP22或CNP變異體存在下於補充有0.2%BSA、0.5m M L-麩醯胺酸、40單位青黴素(penici11in)/毫升及40微克鏈黴素(streptomycin)/毫升之a1phaM E M中培養8日。該處理在第0日開始且此後每兩日加以重複，同時更換培養基。處理之前及處理之後每兩日使用配備1cm目鏡網線(eye-piece reticu1e)之解剖顯微鏡量測骨。使用條件培養基進行生物標記分析。在第8日，將骨於4%三聚甲醛中固定24小時，於5%甲酸中脫鈣24小時，脫水且包埋於石蠟中。將骨切成5μm(微米)切片，接著脫石蠟、復水，且用阿辛藍(pH2.5；M asterTech)染色30分鐘。阿辛藍將軟骨染成藍色。觀測經染色之切片且藉由明視野顯微鏡術拍攝。由影像分析測定生長板軟骨之肥大區的厚度。
圖29說明wtCNP22、 CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)對每兩日經CNP胜肽處理之3日齡野生型小鼠之股骨的縱向生長之作用。將結果相對於處理前(第0日)之量測值校正。一式三份(媒劑)或一式四份(CNP胜肽)進行研究。如圖29中所示，CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)以及CNP22有效刺激縱向股骨生長，其中N端聚乙二醇化之CNP變異體最有效。
亦評估野生型及FGFR3ach 小鼠股骨及脛骨回應於CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27-PEO24」)(SEQID NO：36)之生長。野生型或軟骨發育不全(FGFR3ach )小鼠脛骨之培養物顯示CNP37及PEO24- GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)與媒劑或CNP22相比均增加脛骨縱向生長(圖30及31)。CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)亦刺激野生型小鼠股骨生長(圖32)。此外，CNP22、PEO24- GANRR- CNP22(K4R)(SEQID NO：36)及CNP37與媒劑相比各自增加FGFR3ach 小鼠股骨之縱向生長(圖33)。
此外，評估FGFR3ach 小鼠脛骨之生長板中CNP37之離體分佈。如上所述製備骨樣品。切割石蠟切片且在60℃下熱固定1小時。在37℃下以1%玻尿酸酶進行抗原修復(30分鐘)，接著進行1小時血清阻斷(10%正常山羊血清(Norma1Goat Serum))。在4℃下塗覆CNP22抗體(1：500稀釋液；Peninsu1a LaboratoriesInc.，San Car1os，Ca1ifornia)隔夜。對於免疫偵測，根據製造商建議使用Vectastain ELITEA BC套組(Vector，Bur1ingame，Ca1ifornia)。藉由與D AB受質套組(Vector)一起培育來觀測特異性結合之過氧化酶且使反應進行3分鐘。接著使載片脫水且安置且使用明視野顯微鏡拍攝。對FGFR3ach 小鼠脛骨之生長板中之CNP進行染色顯示在關節及肥大軟骨細胞之區域中CNP免疫反應性增強(圖34)，表明CNP37已傳遞至軟骨細胞。
除骨生長板中CNP變異體之分佈外，亦評估CNP37、CNP22及媒劑對FGFR3ach 及野生型生長板中之細胞(例如增殖區之肥大細胞尺寸及細胞結構(ce11u1aiity))的離體影響。如上所述製備骨樣品，包括阿辛藍染色。以4倍放大倍數拍攝整個近端生長板之影像。自軟骨之骨骺側開始，生長板分為三個區：靜止區(個別小軟骨細胞)、增殖區(平行於骨長軸之堆疊軟骨細胞柱)及肥大區(大軟骨細胞及軟骨細胞之間的薄隔膜)。在此等區域中，藉由ImageJ軟體進行量測，包括每個柱中增殖軟骨細胞之數目及肥大軟骨細胞之密度。使用肥大區之五個不同區域的測試方塊(4×4mm2 )來測定肥大軟骨細胞之密度。藉由1/所測定細胞密度計算肥大軟骨細胞之細胞尺寸。在野生型與FGFR3ach 小鼠中，CNP37及CNP22均增加增殖柱之細胞結構(圖35B及C)。由於與CNP22或CNP37一起培養，因此FGFR3ach 小鼠中之軟骨細胞肥大亦增加(圖36B及C)。
小鼠骨培養物之離體研究表明CNP37已傳遞至生長板且能夠增加軟骨細胞細胞結構及肥大，其與生長板擴展及縱向骨生長相關。為評估骨生長板中CNP37之活體內生物分佈及CNP37對生長板之活體內作用(包括總生長板厚度、肥大區厚度及增殖區之細胞結構)，自如上所述以媒劑或CNP37處理之FGFR3ach 小鼠獲得骨樣品。.對於生物分佈及活體內作用研究，將脛骨固定且儲存於70%乙醇中。對於免疫組織化學，使樣品在5%甲酸中脫鈣2日，脫水且包埋於石蠟中。將骨切成5μm(微米)切片，接著脫石蠟、復水， 且用於如上所述之CNP免疫組織化學。對於細胞影像分析，將骨切成5μm(微米)切片，且接著脫石蠟、復水，且以阿辛藍染色30分鐘(pH2.5；M asterTech)且以蘇木精(Hematoxy1in)及伊紅(Eosin)染色30秒。觀測經染色之切片且藉由明視野顯微鏡術拍攝。使用ImageJ軟體量測生長板厚度及增殖及肥大區。
活體內生物分佈研究表明，類似於離體研究，在以CNP37處理之FGFR3ach 小鼠的脛骨生長板中之關節及肥大軟骨細胞之區域中，CNP免疫反應性增強，表明CNP37活體內傳遞至FGFR3ach 小鼠脛骨之生長板(圖37)。此外，CNP37處理活體內顯著增加FGFR3ach 小鼠脛骨之總生長板厚度、增殖區厚度及肥大區厚度(圖38A-C)。
此等結果表明，在經處理之野生型及軟骨發育不全動物中，本揭示案之CNP變異體滲入野生型及軟骨發育不全動物之生長板中，增加軟骨細胞之數目及尺寸，增加生長板之增殖區及肥大區之厚度，且增加縱向骨生長。因此，CNP變異體適用於在軟骨發育不全個體中刺激骨生長。
量測生物標記
除量測回應於CNP變異體之骨生長之外，回應於CNP變異體而誘導之軟骨及骨形成及生長之生物標記之含量的分析法亦適用於評估CNP變異體對骨生長之作用。
自如上所述之野生型及FGFR3ach 小鼠分離股骨及脛骨。與CNP22或其變異體一起培養骨八日，其中每兩日置換培養基。在第八日，收集培養基且分析生物標記cGMP(環狀鳥苷3' ，5' 環狀單磷酸)及裂解之第II型膠原蛋白之片段(軟骨更新之軟骨特異性標記)。按照製造商方案，使用用於分析cG MP(Cayman Chemica1Co.，Ann Arbor，Michigan)及裂解之第II型膠原蛋白(Carti1aps)(Im m unodiagnosticSystems，Fountain Hi11s，Arizona)的市售酶聯免疫吸附分析法(ELISA)來量測兩種標記。
自暴露於CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27-PEO24」)(SEQID NO：36)後之細胞培養物萃取物量測cGMP及第II型膠原蛋白片段之含量。圖39-42顯示外植野生型及FGFR3ach 小鼠股骨及脛骨暴露於CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)之後，培養基中cGMP之含量之大增(p<0.01)。另外，野生型及FGFR3ach 小鼠股骨暴露於CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)使裂解之第II型膠原蛋白的含量增加，其中經處理之FGFR3ach 小鼠股骨顯示第II型膠原蛋白片段之含量顯著增加(p<0.05)(圖43)。第II型膠原蛋白片段之含量升高表明軟骨基質更新，且在正生長之骨中軟骨更新之後通常為新骨形成。
實例8B
離體刺激患有嚴重軟骨發育不全之小鼠的股骨生長
離體評估CNP變異體對患有嚴重軟骨發育不全之小鼠之骨生長的影響。研究中使用表現具有Y367C突變之人類FGFR-3基因(FGFR3Y367C )之轉殖基因小鼠[S.Pa nnier 等人， Biochim.Biophys.Acta，1792(2)：140-147(2009)]，其代表嚴重軟骨發育不全之小鼠模型。在胚胎第16.5日分離股骨且在1μM Pro-G1y-CNP37存在下培養6日。在第1日及第7日量測骨.長度。該等骨接著以石蠟包埋，切成切片且以蘇木精及伊紅染色以評估組織學變化及細胞形態學。以Pro-G1y-CNP37(「ProCNP38」)處理自FGFR3Y367 C小鼠分離之骨外植體使得生長板中之骨生長及擴展增加(圖44)。與經媒劑處理之野生型股骨相比，來自經媒劑處理6日之FGFR3Y367C 小鼠之股骨顯示縱向生長(growth 1ength- wise )缺乏18%。以1μM Pro-G1y-CNP37處理FGFR3Y367C 小鼠之股骨6日使生長缺乏降至僅11%，亦即將生長缺陷降低約40%。
實例9
CNP變異體之活體外血清/血漿穩定性
在藥物動力學(PK)研究之準備期間，評估CNP變異體於血清及/或血漿中之穩定性。
簡言之，藉由2%三氯乙酸沈澱或1：3血清：乙腈沈澱移除血清或血漿蛋白來分離分析物。將沈澱混合物以14，000rpm渦動五分鐘，且移除上清液之一部分且以水稀釋，隨後轉移至矽烷化自動取樣器小瓶中以供分析。接著藉由逆相高效液相層析(RP-HPLC)及電噴霧電離質譜(ESI-MS)分析血清萃取物。出於定量目的監測顯示對CNP變異體具特異性之單一質量(m/z)。
首先，測定分析物穩定性及回收率。經由分析基質標準物(沈澱後經分析物強化之血清萃取物)最佳化分析(RP-HPLC 及 ESI-MS)參數。最佳化之後，藉由添加(spike)已知濃度之血清樣品且將分析物反應與在類似濃度下製備之基質標準物之反應相比較來測定分析物回收率。亦測定血清萃取物中之分析物穩定性以確保血清沈澱之後及實際分析之前未發生顯著損失。為測試冷凍對血清穩定性之影響，亦進行雙循環冷凍/解凍研究。在此研究中，將CNP變異體添加至血清樣品中且加以分析，隨後在-20℃下冷凍隔夜。接著在室溫下解凍樣品且再分析。重複此過程以進行第二次冷凍/解凍循環。
藉由將10μg/mL濃度之CNP變異體添加至血清/血漿樣品中來測定CNP變異體之血清穩定性。將樣品在37℃水浴中置放三小時之時期。以30分鐘間隔移除血清之雙份等分試樣且加以分析。若分析物明顯快速減少(30分鐘內>50%)，則可以10分鐘時點重複研究。
在用於測定CNP變異體在鼠類血漿中之穩定性的例示性方法中，將CNP變異體(10 μL約2.5-5.0 mg/m1之儲備溶液)、肝素化鼠類血漿(50 μL，Biorec1amation，CD-1 LithHep62231)與5M NaC1(10μL)之混合物在37℃及5%CO2 下保溫0-5小時，且接著用10×蛋白酶抑制劑混合物(15μL，SigmaP2714)淬滅。萃取時，將150μL之 MeOH/0.1%FA添加至85μL反應混合物中，且將所得混合物渦動1分鐘且接著在15℃下離心15分鐘。將75μL上清液添加至300μL0.1%FA水溶液中。對所得混合物之一小部分進行LC/MS分析。
實例10
大鼠及小鼠體內之藥物動力學及c GMP產生
在正常大鼠中進行研究以評估單次靜脈內(i.v.)或皮下(s.c.)投與CNP胜肽之後CNP22及某些CNP變異體之藥物動力學(PK)概況，及血漿cGMP濃度之時程。藉由使用利用抗CNP兔多株抗體之競爭性放射免疫分析法(RIA)來測定血漿CNP免疫反應性。藉由使用市售套組(YAMASA環狀GMP分析套組，YA M ASA Corporation)之RIA測定血漿cGMP濃度- 。
使用7-8週齡之正常雄性大鼠。評估重組野生型CNP22、 CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ IDNO：36)。將20nmo1/kg劑量之各CNP胜肽以於5%甘露醇中之溶液形式一次性經靜脈內注入尾部，或將50nmo1/kg劑量之各CNP胜肽以於0.03mo1/L乙酸緩衝溶液(pH4.0，含有1%(w/v)苯甲醇及10%(w/v)蔗糖)中之溶液形式一次性皮下注入背部。
藉由使用抗CNP兔多株抗體之競爭性RIA測定血漿CNP免疫反應性。製備標準樣品及QC樣品。將50μL標準樣品、 QC樣品及分析樣品分別添加至含有50μLRIA緩衝液之試管中。將經稀釋之抗CNP兔多株抗體(100μL)添加至該等管中。所有管在4℃下保持隔夜。添加125 I-[Tyr 0 ]- CNP22溶液(100μL)及兔IgG溶液(100μL)且在約4℃下留置隔夜。添加1毫升含有10%聚乙二醇之抗兔IgG山羊血清，渦動且在約4℃下留置至少1小時，且接著藉由離心使不可溶部分沈澱。吸出上清液之後，藉由γ計數器量測沈降物中之輻射量(γ線)。一式兩份地量測各樣品，且採用平均值作為測定值。
藉由使用抗cGMP單株抗體之競爭性RIA測定靜脈內給藥之後5、30、60及90分鐘時，或皮下給藥之後5、30、60、120及180分鐘時樣品中之血漿cGMP濃度。製備標準樣品。將100μL分析樣品(用於校準曲線之標準溶液或用於cGMP測定之經稀釋血漿樣品)轉移至試管中。接著將100μL抗cGMP單株抗體溶液及100μL經125 I標記之丁二醯基c GMP酪胺酸甲酯溶液分別添加至管中。所有管均4℃下保持隔夜。添加500μL聚葡萄糖炭溶液之後，渦動管且接著在冰上置放10分鐘。離心反應混合物且將500μL上清液自各樣品轉移至新試管中。藉由γ計數器量測上清液中之輻射量(γ線)。一式兩份地量測各樣品，且採用平均值作為測定值。
對於藥物動力學(PK)分析，採用血漿CNP免疫反應性。使用WINNONLINProfessional(Pharsight Corporation)來進行PK分析。使用PK參數計算CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)在靜脈內投與後之PK概況，該等PK參數諸如為在0小時之濃度(C0 ：外推，pmo1/mL)、總身體清除率(CLt ot ：mL/min/kg)、穩態下之分佈容積(Vdss ：mL/kg)、血漿濃度-時間曲線下之面積(AUC： pmo1.min/mL)、平均滯留時間(MRT：分鐘)及半衰期(T1/2： 分鐘)。使用PK參數計算CNP胜肽在皮下投與後之PK概況， 該等PK參數諸如為最大血漿濃度(Cm ax ：pmo1/mL)、達到Cm ax 之時間(Tm ax ：min)、血漿濃度- 時間曲線下之面積(AUC：pmo1.min/mL)、平均滯留時間(MRT：分鐘)及半衰期(T1/2 ：分鐘)。
在血漿添加回收率實驗中，RIA以類似方式偵測CNP22、 CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ IDNO：36)(資料未圖示)。
採用類似於上述程序之程序研究小鼠中CNP22及其變異體之PK概況及其刺激cGMP產生之能力。
圖45中說明CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)在靜脈內投與三隻大鼠中後之PK概況。如圖45所示，CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)具有比CNP22長得多的半衰期及大得多的生物可用性。 CNP22之半衰期T1/2 (分鐘)為1.42(±0.45)，PEO24- GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)之半衰期為22.3(±1.5)，且CNP37之半衰期為49.5(±28.0)。CNP22之曲線下面積AUC(pmo1.min/mL)為320(±54)，CNP37之曲線下面積為1559(±568)，且PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO： 36)之曲線下面積為2084(±424)。
該三種CNP胜肽在皮下投與三隻大鼠中後之PK概況描繪於圖46中。與CNP22相比，PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)具有長得多的半衰期(78.1分鐘(±16.4)相對於10.0(±5.0))及大得多的生物可用性(60%(±6%)相對於19%(±9%))。
圖47中展示將三種CNP胜肽靜脈內投與三隻大鼠中之後，血漿cGMP濃度之時程。圖47明確說明靜脈內投與CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)在30、60及90分鐘時產生比靜脈內投與CNP22高得多的cGMP血漿含量。
圖48中展示在將三種CNP胜肽皮下投與三隻大鼠中之後，血漿cGMP濃度之時間概況。皮下投與PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)及CNP37產生的cGMP血漿濃度亦實質上高於皮下投與CNP22，且PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)相對於CNP22之差異隨時間增大，而CNP37相對於CNP22之差異隨時間減小。
大鼠研究表明，與wtCNP22相比，CNP變異體CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)具有實質上較長之活體內半衰期，具有實質上較高之活體內生物可用性，且刺激活體內產生實質上較高含量之cGMP持續較長時期。CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)對NEP降解之抗性與較長之活體內血漿半衰期相關，而該較長活體內血漿半衰期又與活體內較長NPR-B/cGMP信號傳導相關。此等結果表明，與CNP22相比，藉由靜脈內或皮下注射(例如每日一次)投與之本揭示案之CNP變異體可更有效地治療CNP反應性病狀或病症，諸如骨相關病症及血管平滑肌病症。
實例11
小鼠體內之藥物動力學研究
為確定CNP變異體具有增強之NEP抗性以供在FGFR3ach 小鼠中進行功效研究(參看實例13)，進行藥物動力學(PK)研究，該研究比較CNP變異體之藥物動力學特性與野生型CNP22之藥物動力學特性。FGFR3ach 小鼠為在FVB小鼠背景上含有單一轉殖基因之輕度軟骨發育不全之突變體小鼠模型。
將野生型CNP22或其變異體以單次靜脈內(i.v.)劑量形式投與6週齡野生型FVB小鼠。使用wtCNP22進行例示性PK研究。將wtCNP22以100 nmo1/kg之單次劑量形式靜脈內投與六週齡FVB/N小鼠。計算CNP22之平均血漿含量，且CNP22之估算半衰期經測定為0.76分鐘至1.03分鐘。
預期對NEP降解顯示較高抗性的CNP變異體在活體內顯示隨時間增加之血清濃度及較長半衰期。
實例12
CNP變異體於野生型小鼠中之功效
在野生型小鼠中評估CNP變異體對骨生長之活體內作用。三週齡FVB野生型雄性小鼠每日接受皮下(s.c.)注射之媒劑 、 G-CNP37(200 nmo1/kg)或PEO12- GANRR- CNP22(K4R)(「CNP27-PEO12」)(SEQID NO：36)(200nmo1/kg)持續5週。至少每週一次量測體重。使用數位測徑規讀數每週至少一次量測尾長，且在處理之後5週使用測徑規量測身長(鼻-肛門長度)、骨長(脛骨、股骨、尺骨及肱骨)、顱骨長(後顱段(posterior crania1 segment)之前部)及腰椎5(LV5)長度。在基線時及在處理5週後採用X射線。
以G-CNP37處理野生型小鼠五週使得體重顯著增加，其中自第9日開始觀察到體重增加(p<0.05)(圖49)。以G-CNP37處理自處理後第二週開始亦使得尾長顯著增加(p<0.01)(圖50)。
表10展示相對於僅以媒劑處理之野生型小鼠的100%值，在經每日一次皮下注射200 nmo1/kg G-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27-PEO12」)(SEQIDNO：36)持續5週之野生型小鼠中，尾長、身(鼻-肛門)長、顱骨(後顱段之前部)長度、骨(股骨、脛骨、肱骨及尺骨)長度及腰椎5(LV5)長度之變化百分比。
* * p<0.01，* p<0.05
與以媒劑處理相比，以G-CNP37處理使得尾長、身(鼻-肛門)長、顱骨長度、近端骨(股骨及肱骨)長度、遠端骨(脛骨)長度及椎骨(腰椎5)長度顯著增加。
與媒劑相比，每日皮下給予較低劑量之Pro-G1y-CNP37(5nmo1/kg、20nmo1/kg或70nmo1/kg)持續五週使得尾長、身(鼻-肛門)長及骨長以劑量依賴性方式增加。表11展示相對於僅以媒劑處理之野生型小鼠之100%值，在每日一次皮下注射5nmo1/kg、20 nmo1/kg或70 nmo1/kg Pro-G1y-CNP37持續5週之野生型小鼠中，尾長、身(鼻-肛門)長及骨(股骨、脛骨、肱骨及尺骨)長之變化百分比。
**p<0.01，*p<0.05
在另一研究中，投與Pro-G1y-CNP37之各種給藥療程持續九週，接著恢復一週。對野生型FVB小鼠皮下給予以下：(1)媒劑，每日，持續九週，接著恢復一週；(2)20nmo1/kgPro-G1y-CNP37，每日，持續一週，接著每週三劑，持續八週，及恢復一週；(3)20nmo1/kgPro-G1y-CNP37，各週交替；或(4)5nmo1/kg Pro-G1y-CNP37，每日，持續九週，接著恢復一週。
在研究結束時在所有處理組(第2、3及4組)中均觀察到尾長、身長及骨長之生長增加。表12展示相對於僅以媒劑處理之野生型小鼠之100%值，在上述給藥療程下經投與Pro-G1y-CNP37(「Pro-CNP38」)之野生型小鼠中，尾長、身(鼻-肛門)長及骨(股骨、脛骨、肱骨及尺骨)長之變化百分比。
**p<0.01，*p<0.05
儘管Pro-G1y-CNP37之所有給藥療程均使所量測之軸向及附肢生長參數增大，但與給藥頻率較低之療程(第2組及第3組)相比，以較低總劑量(第4組)每日給於Pro-G1y-CNP37促進附肢生長(股骨、脛骨、肱骨及尺骨)。
實例13
輕度軟骨發育不全之小鼠模型中之功效
在輕度軟骨發育不全之小鼠模型中，使用表現具有G380R突變之人類FGFR-3基因(FGFR3ach )之轉殖基因小鼠品系來測試CNP變異體增強生長及矯正軟骨發育不全之功效(Wang等人，Proc.Nat1 Acad.Sci.U S A，96(8)：4455-4460(1999)；Naski等人，Deve1opment USA，125：4977-4988(1998)；美國專利第6，265，632號及第6，136，040號)。
將FGFR3ach 小鼠及其野生型同窩出生小鼠在3週齡時麻醉，以藉由Faxitron拍攝橫向全身X射線影像，且依據體重隨機分成以下處理組(n=8隻/組)：(1)野生型/媒劑、(2)FGFR3ach /媒劑、(3)FGFR3ach /CNP37，及(4)FGFR3ach /PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)。小鼠每日一次接受指定測試物品(媒劑或200nmo1/kg CNP變異體)之皮下(s.c.)投與持續5週。使用衛星組(Sate11ite group)(n=3)以證實各測試物品在第1日單次皮下投與後之暴露。將每日皮下接受媒劑注射持續5週之野生型雄性FVB小鼠用作正常生長之對照。
在基線及在研究結束時進行X射線量測以測定頭長、顱骨面積及外耳道(EAM，自外耳通至中耳之耳道)之變化。每週至少一次量測體重及尾長，其中使用數位測徑規來量測尾長，且在處理5週後量測身(鼻-肛門)長。在屍體剖檢時使用數位測徑規量測骨(脛骨、股骨、尺骨及肱骨)長。
在第37日，藉由終端麻醉處死所有小鼠且藉由Fax itron 拍攝完整動物相片及X射線影像。收集左及右脛骨、股骨、肱骨及尺骨且使用數位測徑規量測。處理各骨之左邊部分以用於組織學，且將右邊部分速凍以便歸檔。使用獲自骨之樣品來評估CNP變異體對軟骨內骨生長之影響。
藉由每日一次皮下注射，以CNP37處理FGFR3ach 小鼠持續5週使得身長(圖51)、尾長(圖52)、遠端骨(尺骨及脛骨)長度(圖53A及B)及近端骨(肱骨及股骨)長度(圖54A及B)顯著增加。此外，以CNP37處理使頭長(圖56)、外耳道面積(圖57)及脊柱長度(圖58)(經由延長椎骨體)增加。另外，以CNP37處理矯正FGFR3ach 小鼠之近端肢骨短小(近端肢長度不成比例)，亦即恢復近端骨之成比例生長，如由股骨： 脛骨比率所評估(圖55)。表13概括相對於僅以媒劑處理之FGFR3ach 小鼠之100%值，在每日一次皮下注射200nmo1/kg CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27-PEO24」)(SEQID NO：36)持續5週之FGFR3ach 小鼠中，尾長、體(鼻-肛門)長及骨(股骨、脛骨、肱骨及尺骨)長之變化百分比。
**p<0.01，*p<0.05
此等研究之結果顯示CNP37可刺激脊椎及長骨生長，藉由相對於脛骨優先增加股骨長度來幫助矯正近端肢骨短小，且有助於恢復FGFR3ach 小鼠中之顱面比例。此等結果表明CNP37及可能其它CNP變異體可有效矯正軟骨發育不全症狀及治療患有骨生長缺陷或需要增加骨生長之個體。
實例14
在野生型及軟骨發育不全小鼠中量測生物標記及評估免疫原性在CNP投與之後量測生物標記
在野生型及軟骨發育不全(FGFR3ach )小鼠中量測骨生長生物標記之含量。
如上所述藉由皮下注射媒劑(30mM乙酸/乙酸鹽緩衝液、1%苯甲醇、10%蔗糖，pH4.0)、CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27-PEO24」)(SEQIDNO：36)(各CNP化合物為200nmo1/kg)來每日處理轉殖基因FVBFGFR3ach 小鼠(輕度軟骨發育不全之小鼠模型)持續5週。在研究期間收集血漿及血清。收集之血漿在- 80℃下在10×蛋白酶抑制劑存在下儲存直至分析為止。在第36日，在注射後15分鐘自K2-ETDA血漿收集管量測c GMP含量。在研究結束時(第37日)自最終放血血清量測裂解之第II型膠原蛋白之片段(軟骨相關生物標記)、骨鈣化素(骨相關生物標記)及IgG(與免疫原性有關)。使用市售ELISA套組(Cayman Chemica1Co.，目錄號581021.1)量測cGMP，使用來自Im munodiagnostic Systems之市售套組(目錄號3C A L4000)量測裂解之第II型膠原蛋白(Carti1aps)，且使用來自Bio medica1 Techno1ogiesInc.(Stoughton，M assachusetts)之市售套組量測骨鈣化素。
圖59展示與媒劑相比，以CNP37或PEO24- GANRR- CNP22(K4R)(SEQID NO：36)處理之FGFR3ach 小鼠中之cGMP血漿含量的增加。圖60及61展示投與CNP37使得裂解之第II型膠原蛋白及骨鈣化素之血清含量升高最多。此等結果表明投與FGFR3ach 小鼠CNP胜肽(特定言之CNP37)使得骨生長標記含量增加，表明在以CNP胜肽處理之FGFR3ach 小鼠中骨形成及生長增加。
為評估野生型小鼠中之生物標記，藉由皮下注射媒劑(30mM乙酸/乙酸鹽緩衝液、1%苯甲醇、10%蔗糖，pH4.0)、200nmo1/kgG-CNP37、200nmo1/kgPEO12-GANRR- CNP22(K4R)(「CNP27-PEO12」)(SEQID NO：36)或20nmo1/kg或70 nmo1/kg Pro-G1y-CNP37來每日處理野生型FVB小鼠持續5週。在研究期間收集血漿及血清。收集之血漿在-80℃下在1O×蛋白酶抑制劑存在下儲存直至分析為止。在第36日，在注射後15分鐘自K2-ETDA血漿收集管量測cGMP含量。在研究結束時(第37日)自最終放血血清量測裂解之第II型膠原蛋白、骨特異性鹼性磷酸酶及IgG(與免疫原性有關)之含量。如上所述量測cGMP及裂解之第II型膠原蛋白(Carti1aps)。使用市售套組(Cusabio，目錄號CSB-E11914m)量測骨特異性鹼性磷酸酶。
與媒劑相比，在野生型小鼠中，投與G-CNP37顯著增加(p<0.05)cGMP含量(圖62)及特定言之裂解之第II型膠原蛋白之片段的含量(圖63 )。投與G-CNP37引起之第II型膠原蛋白片段的顯著較高含量指示軟骨基質更新，表明G-CNP37在野生型小鼠中在正生長之骨中刺激新骨形成。
與以媒劑處理之野生型小鼠相比，20nmo1/kg及70nmo1/kg劑量之Pro-G1y-CNP37(「Pro-CNP38」)在投與後15分鐘均顯著增加(p<0.05)血漿cGMP含量(圖64)。與以媒劑處理之小鼠相比，投與較高劑量(70 nmo1/kg)之Pro-G1y-CNP37亦顯著增加(p<0.05)裂解之第II型膠原蛋白之含量(圖65)，表明在野生型小鼠中較高劑量之Pro-G1y-CNP37在新骨形成之前刺激軟骨基質更新。此外，與以媒劑處理之小鼠相比，投與較高劑量(70 nmo1/kg)之Pro-G1y-CNP37增加(p<0.05)骨特異性鹼性磷酸酶之含量(圖66)，表明在野生型小鼠中較高劑量之Pro-G1y-CNP37增強骨重塑。
評估CNP變異體之免疫原性
因為CNP變異體為胜肽衍生物，所以投與胜肽有可能在活體內導致免疫原性反應。為評估在連續投與CNP變異體之後是否發生免疫反應，量測血清抗體含量。
進行IgG分析法以評估使軟骨發育不全FGFR3ach 小鼠暴露於CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(「 CNP27-PEO24」)(SEQID NO：36)5週是否觸發IgG免疫反應。IgG為小鼠及人類血清中之最主要免疫球蛋白，且作為對抗原之二次免疫反應之部分而產生。如下測定對投與CNP胜肽之IgG反應。對96孔板塗佈含100 ng/mLCNP22、 CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ IDNO：36)之BupH PBS緩衝液(Pierce/Thermo，目錄號28372，Rockford，I11inois)。在培育隔夜之後，在室溫下在300rpm震盪下以酪蛋白-PBS阻斷緩衝液(Pierce/Ther mo ，目錄號37528)阻斷板兩小時。在以洗滌緩衝液(含0.05%Tween 之1× PBS)洗滌之後，將來自最終放血之經稀釋血清樣品(以1：25稀釋)添加至板中。亦將陽性對照及陰性對照載入板中。陽性對照為以1：25稀釋之血清(自6隻個別FVB小鼠彙集)與以1：1000稀釋度添加之抗CNP22抗體(Bache m兔抗CNP22IgG，目錄號T-4222)。陰性對照為經稀釋之彙集血清。在培育兩小時之後，洗滌板且將稀釋於阻斷緩衝液中之二次抗體添加至孔中。對於小鼠血清樣品，以1：10，000稀釋度添加抗小鼠IgGFcγ(過氧化酶共軛之親和力純化山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段，目錄號115-035- 071，Jacks onIm munoresearch，West Grove，Pennsy1vania)。對於陽性對照及陰性對照，將抗兔IgG-H RP(Santa Cruz Biotechno1ogy，目錄號SC-2004，Santa Cruz，Ca1ifornia)添加至阻斷緩衝液中。在室溫下在300rpm震盪下培育兩小時之後，以洗滌緩衝液洗滌板。將 100 μL TMB(One-step TMB，Pierce/Thermo，目錄號34022)添加至所有孔中。在室溫下在300rpm震盪下培育板15分鐘。藉由添加100μL2NH2 SO4 來停止比色反應。在450 nm下(Spectramax，Mo1ecu1ar Devices，Sunnyva1e，Ca1ifornia)讀取板且使用SoftM ax Pro軟體(M o1ecu1ar Devices)分析資料。
來自以CNP22或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ IDNO：36)處理之FGFR3ach 小鼠之血清樣品表明任何小鼠中均無陽性Ig.G免疫反應。九隻經CNP37處理之FGFR3ach 小鼠中僅一隻展示弱陽性IgG反應。
亦藉由檢驗如上所述之最終放血血清樣品來評估經投與G-CNP37、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)或Pro-G1y-CNP37之野生型小鼠的免疫原性反應(如藉由血清IgG含量增加所量測)。以PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)或Pro-G1y-CNP37(20或70nmo1/kg)處理之野生型小鼠中無一者顯示陽性IgG免疫反應，且六隻經投與G-CNP37之野生型小鼠中僅一隻顯示弱陽性IgG反應。
在不同CNP給藥療程下量測生物標記
在不同給藥療程下藉由皮下(s.c.)注射媒劑(30mM乙酸/乙酸鹽緩衝液、1%苯甲醇、10%蔗糖，pH4.0)或Pro-G1y-CNP37(「Pro-CNP38」)來每日處理野生型FVB小鼠持續9週。第1組包括經每日皮下注射持續9週接著1週不處理之媒劑處理小鼠。第2組包括每日一次以Pro-G1y-CNP37(20nmo1/kg)處理持續1週，接著每週三劑持續8週，接著1週不處理之小鼠。第3組含有隔週(1、3、5、7及9週)每日一次以Pro-G1y-CNP37(20 nmo1/kg)處理，各週之處理後1週不處理之小鼠。第4組含有每日一次以Pro-G1y- CNP37(5nmo1/kg)處理持續9週接著1週不處理之小鼠。最終，第5組包括每日一次以Pro-G1y-CNP37(5nmo1/kg)處理持續5週而無任何無處理週的小鼠。自小鼠收集最終放血血清，且由此量測裂解之第II型膠原蛋白、總鹼性磷酸酶及總抗體含量。如上所述量測裂解之第II型膠原蛋白含量。藉助於獸醫用診斷實驗室測試設備(Antech)來量測主要來自肝臟及骨之總鹼性磷酸酶含量。
開發總抗體分析法以評估可能之免疫反應。用於總抗體分析法之平台為電致化學發光分析法(ECLA)。ECLA平台利用經生物素標記之藥物(在本文中為生物素-Pro-G1y-CNP37)及經釕標記之藥物(在本文中為Ru-Pro-G1y-CNP37)。經生物素標記之藥物結合於含有電極之經抗生蛋白鏈菌素塗佈之板，且因為釕可經電化學刺激，所以使用經釕標記之藥物作為分析法之偵測組分。藥物特異性抗體(在本文中為CNP特異性抗體)結合於經生物素標記之藥物及經釕標記之藥物且「橋聯」兩種經標記之藥物。在ECLA平台之優勢中，可偵測抗體之任何同型(IgG、IgM等)，且ECLA分析法與物種無關。
如下進行總抗體分析法。用生物素以4：1攻毒比率標記Pro-G1y-CNP37，且用釕以10：1攻毒比率亦單獨標記Pro-G1y-CNP37。藉由添加甘胺酸來淬滅兩個單獨標記反應，且將來自兩個反應之樣品均緩衝液交換為PBS。藉由使用以低濃度及高濃度添加至5%稀釋FVB小鼠血清中之市售抗CNP22抗體(Bachem兔抗CNP22IgG，目錄號T-4222)來製備低及高QC。使用分析稀釋劑(含5%BSA之PBS，MSD目錄號R93AA-1)將小鼠血清樣品稀釋至5%。藉由將經生物素標記之Pro-G1y-CNP37添加至分析稀釋劑中，接著將經釕標記之Pro-G1y-CNP37添加至分析稀釋劑中且接著將兩種溶液組合在一起來製備工作溶液。將25μL低及高QC載入板上作為對照。接著將25μL樣品添加至非結合96孔板中，接著向所有孔中均添加50μL工作溶液。在室溫下在350rpm震盪下將樣品及QC與工作溶液一起保溫2小時。同時，在室溫下在350rpm震盪下以阻斷緩衝液(MSD目錄號R93AA-1)阻斷MSD抗生蛋白鏈菌素板(MSD目錄號L13SA-1)2小時。在兩小時保溫結束時，洗滌MSD抗生蛋白鏈菌素板，且接著將50μL樣品或QC轉移至MSD板中。接著在室溫下在350rpm震盪下保溫板1小時。在1小時保溫結束時，洗滌MSD板且將150μL2×讀取緩衝液(MSD目錄號R92TC-2)添加至板中。使用MSDPR400機讀取板。
所有五組小鼠均顯示實質上相當之裂解之第II型膠原蛋白含量(圖67)。每日一次以5nmo1/kg Pro-G1y-CNP37處理第5組之小鼠持續5週顯著增加(p<0.001)總鹼性磷酸酶含量(圖68)，其指示骨重塑。來自四組以Pro-G1y-CNP37處理之小鼠中每一者之血清樣品在總抗體分析法中不顯示陽性抗體反應。
不受任何理論束縛，關於以下現象存在可能之解釋：為何四組經CNP處理之小鼠與媒劑處理之小鼠相比不顯示統計學上顯著之裂解之第II型膠原蛋白含量的差異，及為何僅第5組中以CNP處理之小鼠與媒劑處理之小鼠相比顯示統計學上顯著之總鹼性磷酸酶含量增加。可能因為在研究中以媒劑處理之小鼠亦在生長，因此裂解之第II型膠原蛋白及鹼性磷酸酶(其為生長之生物標記)亦在以媒劑處理之小鼠中產生。另外，對於第1至第4組之各組中之小鼠存在一週無處理時期，此可能弱化第1-3組中以CNP處理之小鼠與以媒劑處理之小鼠之間裂解之第II型膠原蛋白及總鹼性磷酸酶含量的任何變化。對於第5組中以CNP處理之小鼠不存在無處理時期，且彼等小鼠與以媒劑處理之小鼠相比顯示顯著(p<0.001)較高之總鹼性磷酸酶含量。
實例15
CNP變異體在小鼠中之劑量反應
在野生型FVB小鼠中評估不同劑量之CNP變異體的作用。
對於劑量研究，在兩個單獨研究(S1及S2)中，每日一次皮下投與10隻小鼠之組20及70 nmo1/kg Pro-G1y- wtCNP37(「Pro-CNP38」)持續36次注射。在整個療程中量測尾長及體重。在實驗結束時處死動物且評估骨長。
以媒劑處理之動物的尾長在第36日為約8c m，而以20n mo1/kg Pro-CNP38處理之動物顯示約8.75cm之尾長且以70 nmo1/kg Pro-CNP38處理之動物顯示尾長增至約9.5c m。與以對照處理之動物相比，以任一劑量投與Pro-CNP38均誘導總身長顯著(p<.05)相對增加，表明在20nmo1/kgPro-CNP38下生長速度增加約130%且在70nmo1/kgPro- CNP38下生長速度增加約160%(圖69)。
以Pro- CNP38處理亦顯著增加大多數所評估長骨之骨長以及動物之總鼻-肛門(身長)。表14表示經處理之動物與以媒劑處理之動物相比骨長之相對增加%。
相對增加%，相對於媒劑*p<0.05ANNOVA(杜奈特(Dunnett))亦在投與不同劑量Pro-CNP38之後評估骨礦質密度(BMD)及骨礦質含量(BMC)。結果(圖70)顯示投與70nmo1/kg之 Pro-CNP38顯著降低骨礦質密度(圖70A)且增加骨礦質含量(圖70B)，表明在經處理之動物中存在骨礦化延遲，但礦化過程本身不受CNP處理不利影響。
在經Pro- CNP38或媒劑處理之動物之間器官重量不存在顯著變化。
小鼠中劑量反應之生物分析研究
進行生物分析研究以量測活體內投與不同劑量之Pro-CNP38後CNP活性之標記。分析活體內樣品中的血漿cGMP含量、 第II型膠原蛋白之血清含量及鹼性磷酸酶之血清含量。每日一次皮下投與野生型小鼠20及70 nmo1/kg G1y- wtCNP37(「CNP38」)，20及70nmo1/kg Pro-G1y- wtCNP37(「Pro-CNP38」)及70及200 nmo1/kg GHKSEVAHRFK- wtCNP27(「HSA-CNP27」)(SEQID NO：144)持續36日。在第36日在最後注射之後15分鐘收集血漿且24小時後處死小鼠。 在處死時，收集最終放血血清且用於如先前所述之生物標記分析。
圖71顯示20nmo1/kgCNP38及70nmo1/kg HSA- CNP27顯著增加血漿cGMP(p<0.01)，使血漿cGMP含量分別升至約300pmo1及400pmo1。投與70nmo1/kgCNP38使c GMP增至約500 pmo1(p<0.01)，而投與70 nmo1/kg Pr o- CNP38使cGMP增至約575pmo1(p<0.001)。投與200nmo1/kg HSA- CNP27使cGMP增至約675pmo1(p<0.001)。
CNP變異體亦使裂解之第II型膠原蛋白之血清含量顯著增加(圖72)。20 nmo1/kg CNP38使膠原蛋白增至約9pg/m1(p<0.05)，70 nmo1/kg CNP38使膠原蛋白增至約8pg/m1(p<0.05)，20nmo1/kgPro-CNP38使膠原蛋白增至約12pg/m1(p<0.05)，70 nmo1/kg Pro-CNP38使膠原蛋白增至約16pg/m1(p<0.05)，70nmo1/kg HSA-CNP27使膠原蛋白增至約10pg/m1，且200 nmo1/kg HSA-CNP27使膠原蛋白增至約10pg/m1(p<0.05)。
在投與CNP變異體之後，血清鹼性磷酸酶(AP)含量亦增加(圖73)。20 nmo1/kg CNP38使AP增至約130IU/L，70nmo1/kg CNP38使AP增至約160IU/L(p<0.001)，20nmo1/kgPro-CNP38使AP增至約155IU/L(p<0.001)，70 nmo1/kgPro-CNP38使AP增至約180IU/L(p<0.001)，70 nmo1/kgHSA-CNP27使AP增至約120IU/L，且200 nmo1/kg HSA-CNP27使AP增至約140IU/L(p<0.01)。表15說明總骨特異性AP的百分比。
抗CNP抗體之分析顯示僅HSA-CNP27在小鼠中引發IgG抗體反應。
上述結果說明投與CNP變異體使血清中第II型膠原蛋白及鹼性磷酸酶之濃度增加，表明CNP使與骨生長增加相關之因子增加，且表明投與劑量低至20nmo1/kg之 CNP變異體在活體內亦有效增強骨生長。
不同給藥療程後之cGMP反應
亦在對8-10週齡野生型CD-1小鼠(每個處理組n=3)投與Pro-G1y-wtCNP37(「Pro-CNP38」)之後的不同時間評估生物分析。以200 nmo1/kg之單次皮下劑量給予Pro-CNP38，且在注射後15分鐘、3小時、1日、2日及3日量測血漿、骨骺、皮層骨(已移除骨髓)、肺及腦中之cGMP含量。在K2EDTA上收集血液。收集脛骨及股骨骺及皮層骨、耳翼(earpinna)、腦、腎臟及肺，置於沸水中5分鐘，接著冷凍至-70℃。分析血漿與組織之cGMP(Cayman Che mica 1環狀GMPELISA套組)。
結果顯示，在注射後15分鐘，在血漿(約1300 pmo1/m1)及骨骺(約2.5pmo1/m1/mg)中之cG MP含量增加。到3小時時，血漿含量已大致降低至對照含量，而骨骺中之含量為注射後15分鐘cGMP含量之約1/3，但高於對照含量。皮層骨之含量在15分鐘時增至約0.5pmo1/m1/mg且保持在此含量下3小時。到注射後1日，在所有時點，c GMP之含量均回至對照含量。在肺或腦中，在任何時點均偵測到極少至無cGMP。
亦在經投與Pro-CNP38之多次注射的小鼠中量測c GMP含量。如下給予各組小鼠(n=3)Pro-CNP38：20 nmo1/kg單次劑量， 皮下；200 nmo1/kg單次劑量，皮下；20 nmo1/kg皮下，第0日及第1日；200 nmo1/kg皮下，第0日及第1日；20nmo1/kg皮下，第0日及第3日；200 nmo1/kg皮下，第0日及第3日。在最終劑量之Pro-CNP38後15分鐘處死小鼠且分析cGMP之血漿含量。由於給藥療程不同，因此似乎不存在血漿cGMP信號之調節。亦研究軟骨中之c GMP反應。
NPR-B受體減敏潛力之評估法
組織學分析顯示當每日投與200nmo1/kg之 CNP時，會累積於動物生長板中(依據所增強之CNP免疫反應性)。生長板中此累積或CNP受體之每日刺激有可能減敏CNP受體。
為測定在活體外多次給藥是否減敏NPR-B受體，由正常人類關節軟骨細胞與Pro-G1y-wtCNP37(「Pro-CNP38」)一起培養持續不同時間，且量測cGMP之分泌。
根據供應商(Lonza)推薦，培養自關節軟骨分離之原代正常人類軟骨細胞。在60-80%匯合度時，以1μMPro-CNP38處理軟骨細胞兩次，其中在處理之間逐漸拉長時間(第一次處理在0時間點，接著在初次處理後15分鐘、30分鐘、60分鐘、2小時、3小時、4小時、6小時)。在以下實驗中，該等處理施用兩次，其中在處理之間逐漸拉長時間(第一次處理在0時間點，接著在初次處理後6、16、24、48小時)，或僅施用一次，與第二次處理平行進行(僅在初次反應之6、16、24及48小時時)。處理僅施加15分鐘(短期處理)，或持續實驗之持續時間(長期處理，此時CNP保留於培養基中)。收集細胞溶胞物及條件培養基且分析其總cG M P分泌(Mo1ecu1arDevicesELISA)。
在短期實驗中，以1μM G1y-wtCNP37(「CNP38」)刺激細胞兩次持續15分鐘(短期處理)，或在整個培養中以CNP38刺激兩次(長期處理)。兩次處理之間的時間為15分鐘、30分鐘、60分鐘、2小時、3小時、4小時、6小時。在實驗之最後時間點，藉由僅處理細胞一次獲得cGMP刺激作用之峰值(6小時；在短期實驗中>0.1皮莫耳/孔，且在長期實驗中為0.2皮莫耳/孔)。在短期實驗中，當處理細胞兩次時，若在0時間點且接著又在15分鐘時處理細胞，則反應降至0.1皮莫耳/孔。在短期實驗中，當處理細胞兩次時， 若在0時間點且又在30分鐘、60分鐘、2小時、3小時及4小時時處理細胞，則反應降至約0.5皮莫耳/孔。在長期實驗中，當處理細胞兩次時，若在0時間點及在15分鐘時處理細胞，則反應降至約0.16皮莫耳/孔。在長期實驗中，當處理細胞兩次時，若在0時間點且又在30分鐘、60分鐘、 2小時處理細胞，則反應降至約0.6皮莫耳/孔。在長期實驗中，當處理細胞兩次時，若在0時間點且又在2、4或6小時處理細胞，則反應降至<0.5皮莫耳/孔。
亦進行長期研究。對於短期處理，將1μMCNP38添加至如上所述之細胞培養物中。對於長期處理，在整個如上所述之實驗持續時間中，將1μMCNP38添加至細胞培養物中。 結果顯示，NPR-B受體會在重複每日活體外投與CNP之後減敏，且若在第一劑之後移除CNP，則劑量之間48小時足以恢復對CNP38之最大NPR- B反應的60%，且若在整個實驗中培育CNP則恢復至<40%(圖74)。
為評估在活體內以CNP變異體處理是否使NPR- B受體減敏， 用野生型小鼠進行實驗。在適當之日以媒劑對照或Pro-G1y-wtCNP37(「Pro-CNP38」)以200 nmo1/kg皮下注射8-10週齡之CD-1雄性小鼠。向小鼠每日注射Pro- CNP38持續至多8日，或在研究之第一日、第一及第二日，或第一及第三日向其注射Pro-CNP38。在最終注射之後十五分鐘， 使小鼠(每處理組n=3)深度麻醉且經由開胸術及主動脈套管插入法來放血。經由主動脈套管以PBS自身體沖洗循環血液。收集腎臟及右脛骨、右股骨及左股骨，在水中煮沸5分鐘及/或速凍於液氮中，且儲存於乾冰上或於-70℃冷凍器中直至分析cGMP為止。為評估軟骨中之cGMP產生，解剖遠端股骨及/或近端脛骨，稱重且使用CovarisCryoprep CP02粉碎。使用Covaris E210音波器在5%過氯酸中均質化粉末樣品，且在60%KOH中中和。接著在4℃下在10，000rpm下將樣品離心5分鐘，且將上清液用於cG MP分析法(環狀G MP酶免疫分析套組，Cayman，Michigan)。另外，收集左脛骨，固定於10%正常緩衝福馬林(form a1in)中，且加以儲存以供進一步免疫組織化學分析。
圖75A展示以200 nmo1/kg Pro-CNP38重複每日處理野生型小鼠持續1、4、6、7及8日並不使得cGMP反應減敏。相反，在4日之每日處理後觀察到cGMP反應增強。進一步每日處理產生cGMP反應之平穩狀態(至多8日)。結果表明以200 nmo1/kg Pro-CNP38每日處理野生型小鼠至多8日不使cGMP反應減敏。
亦研究以Pro-CNP38處理野生型小鼠之後，遠端股骨軟骨中cGMP反應之動力學。與對單次處理之cGMP反應相比，一日一次處理小鼠持續兩日增強對Pro-CNP38之cGMP反應(圖75B)。當在第一及第三日，而非在第一及第二日處理小鼠時，第二次處理(在第三日)後之cGMP反應實質上類似於在第一日單次處理之後觀察到之cGMP反應(圖75B)。在此小鼠研究中，結果表明連續數日給藥有利於增強對Pro-CNP38之cGMP反應。
不同組織中之NPR-B活化
為評估CNP變異體對不同組織中NPR- B之可能活化，向野生型雄性CD-1小鼠注射200nmo1/kg G1y- CNP37，且在不同時點在某些組織中量測cGMP反應。各處理組使用兩隻小鼠。各小鼠接受一次G1y-CNP37或媒劑對照之皮下注射。在注射後15、30或60分鐘或3小時，使小鼠深度麻醉且經由開胸術及主動脈套管插入法來放血。藉由用主動脈套管進行PBS沖洗來移除循環血液。收集心臟、肝、肺、腎、 耳翼、主動脈及腦。所有組織均在水中煮沸5分鐘，精細解剖(包括用PBs自股骨皮層沖洗骨髓) 、稱重、在液氮中冷卻，且在生物磨粉機(BioPu1ver izer )中粉碎。用Po 1yt ron， 在6%預冷卻之過氯酸中均質化所得粉末狀樣品， 且以60%KOH中和。接著在10，000rpm及4℃下離心樣品5分鐘， 且將上清液用於cGMP分析法(環狀GMP酶免疫分析套組，Cayman Chemica1 Company，Ann Ar bor ，Michigan)。對於組織重量校正結果。
在遠端股骨(軟骨及骨)、股骨皮層(骨)、耳翼(軟骨)及腎臟中可偵測回應於G1y-CNP37(圖76中之「CNP」)處理之c GMP 分泌(圖76 A-D)。 在處理之後15分鐘觀察到彼等組織中之最大cGMP反應。在研究時點，相對於媒劑對照，肝、 心臟、 肺及腦組織未顯示回應於G1y-CNP37之顯著c GMP分泌(圖76E-H)。結果表明以200nmo1/kg G1y- CNP37處理在軟骨、骨及腎組織中刺激c GMP分泌。
實例16
CNP變異體在猴中之劑量反應
在獼猴中評估CNP變異體Pro-G1y-CNP37對骨生長及骨生長相關生物標記之含量的影響。以每日10或36μg/kgPro- G1y-CNP37每日皮下注射八隻正常幼年獼猴(在正在進行之研究開始時約2.5歲)(每劑量組n=4)。投與四隻此等猴媒劑作為對照。處理總長為6個月。藉由數位X射線及磁共振成像，且藉由外部量測肢幹及身長來獲得生長板擴展及骨生長之多種量度。定期收集血液及尿樣品以用於臨床病理學及量測Pro-G1y-CNP37及生物標記之含量。在終止研究之後，進行總體病理學研究，且在組織學方式評估組織樣品以評估功效及安全性。
正在進行之研究中迄今所得之資料顯示兩種劑量之Pro-G1y-CNP37均使生長板寬度增加(藉由數位X射線)(圖77)、 使左脛骨及右脛骨長度增加(藉由數位X射線)(圖78A及B)、使腿長增加(藉由外部量測)(圖79)、使臂長增加(藉由外部量測)(圖80)、使身長增加(藉由外部量測)(圖81)， 且使鹼性磷酸酶(骨形成之生物標記)之血清含量增加(圖82)。資料表明明Pro-G1y-CNP37在血液動力學可接受之劑量下可在正常幼年獼猴中刺激骨生長。
實例17
CNP變異體在小鼠中對心血管系統之影響
已報導諸如CNP之利鈉胜肽影響心血管系統。Wang等人，(EurJ HeartFai1.9：548-57.2007)描述CNP顯示在大鼠中預防心肌局部缺血/再灌注損傷及改良心肌梗塞後心臟重塑中具有心臟保護作用。Wang顯示過度表現CNP之小鼠的由心肌梗塞所致之心臟肥大之發生率降低。另外，CNP已顯示引起與內皮無關之血管擴張(M. Honing等人，H ypertension，37：1179-1183(2001))及因此可在活體內短暫降低血壓。
為評估CNP變異體對心血管系統之影響，在皮下注射變異體之後研究經麻醉之野生型FVB小鼠中之血壓及心跳速率。
在定義心血管活性之廣泛劑量範圍之試驗性研究之後，進行劑量-反應研究以檢驗三種不同劑量濃度之各CNP變異體的作用。三隻8週齡之雄性FVB小鼠構成各處理組。將劑量皮下投與經麻醉之小鼠，且經由植入之動脈內壓力轉導器監測收縮壓、舒張壓及平均動脈壓(MAP)，以及心跳速率。
實例18
CNP變異體之調配物
進行CNP預調配研究以評估CNP變異體G1y-wtCNP37(「CNP38」)在不同pH值(pH3、4、5、6、7及8)及溫度(5℃、25℃及40℃)下隨時間之穩定性。在該等研究中，CNP38顯示在pH4-6下之穩定性大於其它pH值下之穩定性。CNP38在5℃下在pH 4-6下穩定，在15週後約95%之CNP38得以保留。當溫度升高至25℃時，在pH4下，在15週後約85%之CNP38得以保留，在pH5下，在15週後約85%得以保留，且在pH6下，在15週後約80%得以保留。當溫度升高至40℃時，在pH4下，在15週後約55- 60%之CNP38得以保留，在pH5下，在15週後約65%得以保留，且在pH6下，在15週後約40%得以保留。圖83說明偽一級降解速率常數(Kobs )相對於pH3至8之pH值及在5℃、25℃及40℃下的觀察圖。預調配研究中CNP38之穩定性資料表明CNP調配物之pH值在約4至約6之範圍內。酸性pH值(例如pH約6)可藉由以下來促進CNP變異體穩定：例如最小化或避免天冬醯胺及/或麩醯胺酸殘基之脫醯胺、天冬胺酸殘基之異構化，或CNP變異體藉由其它路徑降解。
可將CNP變異體調配於醫藥載劑中以便投與受例如骨生長病狀影響之個體。在一些實施例中，根據表16中之成分及其量或濃度之任何組合調配CNP變異體之液體調配物。
1 丙三醇係用以最小化或防止CNP變異體之水推動水解、脫醯胺、異構化或裂解。對於凍乾調配物，4-6%或6-20%甘露糖醇或蔗糖可取代NaC1。
在某些實施例中，自根據表17中之成分及其量或濃度之任何組合調配的調配物，製備CNP變異體之凍乾調配物。
1 丙三醇係用以最小化或防止CNP變異體之水推動水解、脫醯胺、異構化或裂解。
在某些實施例中，包含CNP變異體之調配物的pH值為約3-7，或約3-6，或約3.5-6.5，或約4-6，或約4-5，或約4.5.5.5。在一些實施例中，對於pH 4-5.5，適合緩衝劑為乙酸/乙酸鹽(例如乙酸鈉)，且對於pH 5.5-6，適合緩衝劑為檸檬酸/檸檬酸鹽。檸檬酸/檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)亦為在pH 3-6或pH 4-6範圍內之適合緩衝劑。在某些實施例中，緩衝劑在調配物中之濃度為約2-50 mM，或約2-40 mM，或約2-30 mM，或約5-30 mM，或約2-20 mM，或約5-20 mM，或約5-15 mM。
為最小化或避免CNP變異體脫醯胺，可將變異體調配於醫藥學上可接受之有機共溶劑(諸如丙三醇、乙醇及丙二醇)中。因為脫醯胺藉由水解發生，所以以有機共溶劑取代水將使CNP變異體與水之接觸減到最小。若不使用水， 則有機- 水性溶劑系統中一或多種有機溶劑之濃度可為例如約10%至約99%，或約100%。
亦為最小化或避免CNP變異體脫醯胺，可藉由凍乾自調配物移除水。在一些實施例中，凍乾調配物含有以下組分之任何組合：緩衝劑：乙酸鈉及乙酸，或檸檬酸鈉及檸檬酸；等張性/增積劑：甘露糖醇(例如3-10%、2-8%或4-6%)；蔗糖(例如6-20%、5-15%或8-12%)抗氧化劑：甲硫胺酸及/或抗壞血酸，各抗氧化劑與CNP變異體之莫耳比為約0.1：1至約1：1，或約0.5：1至約5： 1，或約1：1至約15：1，或約1：1至約10：1，或約3：：1至約10：1。
亦可藉由將CNP組合物(例如液體調配物或凍乾調配物)儲存在較低溫度下，諸如在約5℃、0℃、-10℃、-20℃、- 30℃、- 40℃、- 50℃、-60。 C、-70℃、-80℃、-90℃或- 100℃下，以最小化或避免脫醯胺。
為最小化或避免CNP變異體中可氧化殘基(例如甲硫胺酸)之氧化，可用一或多種抗氧化劑調配變異體。例示性抗氧化劑包括(但不限於)甲硫胺酸、抗壞血酸及硫甘油。 例如甲硫胺酸殘基之氧化亦可藉由用氮或氬自液體介質(若為液體調配物)清除氧，及/或用氮或氬自容器或包裝清除氧來最小化或防止。
在一些實施例中，為最小化或防止吸附(例如CNP變異體吸附至塑膠或玻璃)，將聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或苯甲醇或其組合添加至CNP調配物中。在某些實施例中，各抗吸附劑之濃度為約0.001%至約0.5%，或約0.01%至約0.5%，或約0.1%至約1%，或約0.5%至約1%，或約0.5%至約1.5%，或約0.5%至約2%，或約1%至約2%。調配物中抗吸附劑之例示性範圍包括(但不限於)約0.001%至約0、5%聚山梨醇酯20、約0.001%至約0.5%聚山梨醇酯80及/或約0.5%至約1.5%苯甲醇。
在某些實施例中，液體CNP調配物包含以下，或凍乾CNP調配物係自包含以下之調配物製備：(1)乙酸/乙酸鹽(例如乙酸鈉)緩衝液，其具有約30mM±5或10mM緩衝劑之濃度及約4±0.5或1之pH值，及(2)濃度為約1%±0.5%之苯甲醇(例如作為防腐劑及/或抗吸附劑)，及視情況選用之(3)濃度為約10%±5%之蔗糖。
實例19
CNP變異體之臨床評估
以下實例提供關於用於在本揭示案之治療方法中臨床評估包含CNP22或其變異體之組合物的參數之指導。如本文所討論，CNP22或其變異體將用於治療CNP反應性病症，包括骨及血管平滑肌之病症。將進行臨床試驗，其將提供CNP22或其變異體之安全劑量、藥物動力學、及替代臨床終點與規定臨床終點之初始反應的評估。試驗將進行最少(但不必限於)24週以便收集關於約100位可評估患者之足夠安全性資訊。試驗之初始劑量將在每週約0.001至約1.0mg/kg間變化，或為任何本文所述之劑量。在此範圍中之初始劑量不產生顯著直接臨床益處的情況下，應在此範圍內增加劑量或必要時增加劑量超出此範圍，且再維持最少(但不必限於)24週之時期以確定安全性且進一步評估功效。
安全性之量測將包括不良事件、過敏反應、全套臨床化學項目(包括腎及肝功能)、尿分析及差示CBC。另外，監測與臨床益處有關之其它參數。本發明之實例亦包括測定CNP22或其變異體之藥物動力學參數，包括吸收、分佈、代謝、排泄，及血液中之半衰期及生物可用性。預期此等分析將將有助於關聯劑量與臨床反應。
方法
患者將經歷基線病史及身體檢查，及一套標準臨床實驗測試(包括CBC、Pane120、CH50及UA)。患者將以每週至門診就診方式緊密追蹤。治療期完成之後一週，患者返回門診以便全面評估。若需要增加劑量，則患者應遵循上述相同時程。將在整個試驗中監測安全性。
診斷及納入準則
患者可為具有潛在CNP反應性病症之診斷病歷之男性或女性。潛在CNP反應性骨相關病症之特定實例為軟骨發育不全，其可藉由遺傳測試及FGFR-3突變或功能異常之其它證據來證明。軟骨發育不全患者之理想年齡範圍為嬰兒(< 1歲)至青春期前(<13歲)。具有以下情形之患者將排除在此研究之外：患者懷孕或正在哺乳；在參加研究之前30日內已接受研究藥物；或患有醫學病狀、嚴重間發性疾病， 或可能會顯著降低研究順應性之其它掩飾情形。
安全性
若在研究過程期間未發生顯著急性或慢性藥物反應，則使用CNP22或其變異體之療法將確定為安全。若臨床檢查、臨床實驗室或其它適當研究中未觀察到顯著異常，則長時間投與該藥物將確定為安全。
已顯示，與野生型CNP22相比，本揭示案之某些CNP變異體在活體外具有高得多的對NEP降解之抗性，在大鼠中具有長得多的血漿半衰期及生物可用性，在大鼠中刺激高得多的cGMP產生量，及/或在軟骨發育不全小鼠中誘導長骨長度及身長顯著較大增長。此外，已顯示在逆轉FGF2誘導之活體外軟骨細胞生長停滯方面，用CNP22進行短持續時間劑量療程處理幾乎與連續CNP22處理同樣有效。此等結果(尤其本文所述者)表明本揭示案之CNP變異體適用於治療CNP反應性病狀或病症(諸如骨相關病症及血管平滑肌病症)。
應瞭解本文所述之揭示內容的每個實施例均可視情況與本文所述之任一或多個其它實施例組合。本文中所引用之每個專利文獻及每個非專利文獻均以全文引用的方式併入本文中。
預期熟習此項技術者可對如本文所述之實施例及說明性實例中所述的揭示內容進行多種修改及變化。因此本揭示案應僅受諸如隨附申請專利範圍中所呈現之限制。
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<223>　合成多肽
<400>　229
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<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成多肽
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<221>　misc_feature
<222>　(5)..(5)
<223>　Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<213>　人工序列
<220>
<223>　合成多肽
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<223>　Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<223>　Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<222>　(5)..(5)
<223>　Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<223>　合成多肽
<400>　237
圖1展示大腸桿菌中CNP融合蛋白之表現(圖1A：考馬斯藍染色，圖1B：西方墨點法)。M：蛋白質標記；T：總細胞溶胞物；S：可溶上清液；P：2μg CNP22；KSI：KSI-CNP(M/N)融合蛋白表現(不可溶)；N：未誘導之KSI-CNP融合蛋白總溶胞物；KSI' ：KSI-P-CNP融合蛋白表現(不可溶)；Trx：Trx-P-CNP融合蛋白表現(可溶)；MBP： MBP-P-CNP融合蛋白表現(可溶)；TAF：TAF-P-CNP融合蛋白表現(不可溶)(BL21)；TAF' ：TAF-P-CNP融合蛋白表現(不可溶)BL21(DE3)，其中CNP為G1y-CNP37；圖2展示TAF-CNP包涵體之甲酸裂解。M：蛋白質標記；1：G1y-CNP37陽性對照；2：未裂解之TAF-CNP包涵體；3：2%甲酸裂解之TAF-CNP包涵體，其中CNP為 G1y-CNP37；圖3A-E描繪大腸桿菌中CNP融合蛋白之表現。M：蛋白質標.記；Tu：未經誘導之總細胞溶胞物；Su：未經誘導之可溶上清液；T：誘導之總細胞溶胞物；S：可溶上清液；C1：CNP22；C：G1y-wtCNP37(「CNP38」)；P：不可溶集結塊。A：KSI：KSI-CNP38(M/N)融合蛋白表現(不可溶)；KSI' ：KSI-Pro-CNP38(Pro-G1y-wtCNP37指定為「Pro-C NP38」)融合蛋白表現(不可溶)；Trx： Trx-Pro-CNP38融合體表現(可溶)；MBP：MBP-Pro-CNP38融合蛋白表現(可溶)；TAF：來自BL21細胞之TAF- Pro- CNP38融合蛋白表現(不可溶)；TAF' ：來自BL21(DE3)細胞之TAF- Pro-CNP38融合蛋白表現(不可溶)。B：TAF- Pro- CNP37及BMP-Pro-CNP37融合蛋白表現。C：BMP-Pro- CNP38融合蛋白及BMP蛋白質表現。D：TAF-Pro-HSA-CNP(「Pro- GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQID NO：188)指定為「Pro- HSA-CNP」)融合蛋白表現。E：TAF-Pro-CNP38融合蛋白及TAF蛋白質表現；圖4A-C描繪TAF-Pro-CNP38包涵體之甲酸裂解。A：TAF-Pro-CNP38包涵體之50%甲酸裂解。M：蛋白質標記；U： 未裂解之TAF-Pro-CNP38包涵體；25℃、37℃、42℃、55℃：TAF-Pro-CNP38包涵體在50%甲酸中在25℃、37℃、42℃或55℃下裂解24小時。37℃-S及55℃- S：來自37℃及55℃下之裂解反應、以10NNaOH中和且在14，o00rpm下離心15分鐘之可溶上清液。B：TAF-Pro- CNP38包涵體之10%及2%甲酸裂解。M：蛋白質標記；U：未裂解之TAF-Pro-CNP38包涵體；C：甲酸裂解之TAF- Pr o- CNP38；S： 無中和下在14，000rpm下離心5分鐘後之可溶上清液；P： 無中和下在14，000rpm下離心5分鐘後之不可溶集結塊；C： 來自TAF-Pro-CNP38包涵體之2%及10%甲酸裂解產物的LC/MS分析；圖5A-C描繪在不同溫度及甲酸裂解時間下TAF- Pro- CNP38包涵體之甲酸裂解。M：蛋白質標記；C：G1y-wtCNP37(「CNP38」)陽性對照；U：未裂解之TAF-Pro-CNP38包涵體。A ：在42℃、55℃或70℃下以2%甲酸裂解6、24或48小時之TAF-Pro-CNP38。B ：在55℃、60℃、65℃或70℃下以2%甲酸裂解17或24小時之TAF-Pro-CNP38。C ：來自TAF-Pro-CNP38包涵體之2%甲酸裂解產物的LC/MS分析；圖6 為TAF-CNP34融合蛋白表現之SDS-PAGE(考馬斯藍染色)。M：蛋白質標記；C：對照[Gly-CNP37(「CNP38」)]；T：總細胞溶胞物；S：上清液；TI：經誘導之總細胞溶胞物；SI：經誘導上清液；圖7 為融合蛋白TAF-NL-(C/A及6D/6E)-Pro-CNP38、TAF(C/A及10D/10E)-Pro-CNP38及TAF-Pro-CNP53表現之SDS-PAGE(考馬斯藍染色)，其中「Pro-CNP38」表示Pro-Gly-CNP37。M：蛋白質標記；C：對照[Gly-CNP37(「CNP38」)]；T：總細胞溶胞物；TI：經誘導之總細胞溶胞物；S：上清液；SI：經誘導上清液；圖8 為融合蛋白TAF-CNP34及TAF-Pro-CNP53之甲酸裂解產物之SDS-PAGE(考馬斯藍染色)。M：蛋白質標記；P：陽性對照[Gly-CNP37(「CNP38」)]；U：未裂解；C：裂解；CS：裂解之上清液；CP：裂解之集結塊；圖9 為展示TAF-CNP3甲酸裂解後CNP-34之峰的LC/MS層析圖。CNP-34單同位素質量計算值為3553.88；圖10 為展示TAF-Pro-CNP53甲酸裂解後Pro-CNP53之峰的LC/MS層析圖。Pro-CNP53單同位素質量計算值為5898.14；圖11為融合蛋白TAF(C/A及4D/4E)-Pro-CNP38及TAF(4D/4E)-Pro-CNP38表現之SDS-PAGE(考馬斯藍染色)，其中「Pro-CNP38」表示Pro-G1y-CNP37。 M：蛋白質標記；C：對照[G1y-CNP37(「CNP38」)]；T：總細胞溶胞物；TI：經誘導之總細胞溶胞物；S：上清液；SI：經誘導上清液；圖12為融合蛋白TAF(4D/4E)-Pro-CNP38及TAF(C/A及4D/4E)-Pro-CNP38之甲酸裂解產物之SDS-PAGE(考馬斯藍染色)，其中「Pro-CNP38」表示Pro-G1y-CNP37。 M：蛋白質標記；P：陽性對照[G1y-CNP37(「CNP38」)]；U：未裂解；C：裂解；CS：裂解之上清液；CP：裂解之集結塊； 圖13為融合蛋白TAF-NL-(C/A及6D/6E)-Pro-CNP38及TAF(C/A 及10D/10E)-Pro-CNP38之甲酸裂解產物之SDS- PAGE(考馬斯藍染色)，其中「Pro-CNP38」表示Pro-G1y- CNP37。M： 蛋白質標記；P：陽性對照[G1y-CNP37(「CNP38」)]；U： 未裂解；C：裂解；CS：裂解之上清液；CP：裂解之集結塊；圖14為在BL21(DE3)細胞之10L醱酵物中產生之TAF- Pro-CNP38融合蛋白的使用抗CNP抗體之西方墨點法，其中在OD60 0=64時及第17小時誘導該等細胞且「Pro- CNP38」表示Pro-G1y-CNP37；圖15為來自較粗Pro-G1y-CNP37(「Pro-CNP38」)產物之SP-瓊脂糖陽離子交換管柱層析之溶離份的SDS-PAGE(考馬斯藍染色)。A：水中之TAF-Pro-CNP38包涵體(IB)；B：甲酸鹽中之IB；C：甲酸鹽中之IB，經中和；D：中和之集結塊；E：中和之上清液；F：TMAEHi-CAP負載；G：流經之TMAE Hi-CAP/SP-瓊脂糖負載；H：流經之SP-瓊脂糖；SP-瓊脂糖溶離份1-47：10微升/泳道；圖16展示N端聚乙二醇化CNP22共軛物在活體外對中性內肽酶(NEP)之抗性程度；圖17描繪在N端具有胺基酸延伸之CNP變異體[「CNP27」為GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)]之NEP抗性程度；圖18說明N端聚乙二醇化CNP17及GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27」)(SEQIDNO：36)之NEP抗性程度；圖19說明wtCNP22及CNP變異體G1y-CNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(圖中之「CNP27-HSA」)(SEQ IDNO：144)及PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(圖中之「CNP27-PEO12」)(SEQIDNO：36)之NEP抗性程度；圖20展示具有N端胺基酸延伸之CNP變異體在NIH3T3細胞中活體外刺激cGMP產生之能力。該等結果係相對於在1μM CNP22存在下產生之cGMP含量。「CNP27」為GANRR-CNP22(K4R)(SEQIDNO：36)；圖21展示N端聚乙二醇化CNP17及GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27」)(SEQID NO：36)在NIH3T3細胞中刺激cGMP產生之能力；圖22說明CNP22之N端聚乙二醇化對cGMP產生之影響；圖23 說明NIH3T3細胞中由wtCNP22及CNP變異體Gly-CNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(「CNP27-HSA」)(SEQ ID NO：144)、wtCNP29及PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(「CNP27-PEO12」)(SEQ ID NO：36)誘導之cGMP產生；圖24A 及B 展示在活體外信號傳導競爭分析法中，CNP-22及Pro-Gly-CNP37(「Pro-CNP38」)經由NPR-B、以類似劑量-反應曲線、且以比經由NPR-A高得多的程度刺激cGMP產生，且顯示NPR-B相對於NPR-C選擇性之類似概況；圖25 顯示每日一次1小時或每日一次2小時將大鼠軟骨肉瘤細胞暴露於CNP22在逆轉FGF2誘導之軟骨細胞生長停滯方面與連續暴露於CNP22具有實質上類似之有效性。自左向右之柱：柱1：對照(無CNP22，無FGF2)；柱2：CNP22(0.2μM)，連續；柱3：每日一次CNP22(0.2μM)，1小時；柱4：每日一次CNP22(0.2μM)，2小時；柱5：FGF2(5ng/ml)，連續；柱6：FGF2+CNP22(0.2μM)，連續；柱7：每日FGF2+CNP22(0.2μM)，1小時；柱8：每日FGF2+CNP22(0.2μM)，2小時；圖26A及B 展示來自對CNP22對FGF2停滯之大鼠軟骨肉瘤(RCS)細胞之影響進行的劑量反應研究之結果；圖27A-D 展示將CNP22添加至藉由FGF2停滯之RCS細胞中增加基質合成且部分抑制FGF2，如由35 S-硫酸鹽及3 H-Pro併入基質中或在基質中減少所評估。A及C圖，合成；B及D圖，降解；A及B圖，35 S量測；C及D圖，3 H量測。統計學上顯著之差異經突出顯示(ANOVA；*p<0.05，**p<0.01)；圖28A-C 展示以FGF2及CNP22培養之RCS細胞中聚集蛋白聚糖及纖維結合蛋白產生之程度(mRNA，圖A及C，及蛋白質，圖B)；圖29 展示CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(圖中之「CNP27-PEO24」)(SEQID NO：36)在離體小鼠器官模型中刺激野生型股骨之縱向生長的功效；圖30展示每兩日以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)處理之2-3日齡野生型小鼠脛骨的縱向骨生長。相對於處理前(第0日)之量測值校正結果。資料以平均值±SEM(n=8)之形式表示；圖31展示每兩日以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)處理之2-3日齡軟骨發育不全FGFR3ach 小鼠脛骨的縱向骨生長。相對於處理前(第0日)之量測值校正結果。資料以平均值±SEM(n=7-8)之形式表示；圖32展示每兩日以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)處理之2-3日齡野生型小鼠股骨的縱向骨生長。相對於處理前(第0日)之量測值校正結果。資料以平均值±SEM(n=8)之形式表示；圖33展示每兩日以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)處理之2-3日齡FGFR3ach 小鼠股骨的縱向骨生長。相對於處理前(第0日)之量測值校正結果。資料以平均值±SEM(n=3-7)之形式表示；圖34A- I描繪每兩日離體處理之FGFR3a ch 小鼠股骨中之CNP37生物分佈。圖A-C說明遠端股骨中之分佈，圖D-F說明關節軟骨細胞中之分佈且圖G-I說明肥大軟骨細胞中之分佈； 圖35A-C描繪在每兩日以CNP22或CNP37處理野生型及FGFR3ach 小鼠股骨持續8日之後生長板中增殖柱之細胞結構。(A)無處理，(B)處理後每柱之細胞數，(C)處理後之形態學研究。圖35C(i)至C(vi)中之圖對應於圖35B中所述之樣品順序。資料以平均值±SEM(n=4-8)之形式表示； 圖36A-C描繪在每兩日以CNP22或CNP37離體處理野生型及FGFR3ach 小鼠股骨持續8日之後的軟骨細胞肥大。(A)無處理，(B)處理後之細胞尺寸，(C)處理後之形態學研究。圖36C(i)至C(vi)中之圖對應於圖36B中所述之樣品順序。資料以平均值±SEM(n=4-9)之形式表示； 圖37A-I描繪經活體內處理之FGFR3ach 小鼠脛骨中之CNP37生物分佈。圖A-C展示遠端股骨中之分佈，圖D- F說明關節軟骨細胞中之分佈且圖G-I說明肥大軟骨細胞中之分佈； 圖38A-C說明CNP37對FGFR3ach 小鼠脛骨生長板之活體內作用： (A)總生長板厚度，(B)增殖區厚度，及(C)肥大區厚度。資料以平均值±SEM(n=7-15)之形式表示； 圖39展示來自以CNP22、CNP37或PEO24- GANRR- CNP22(K4R)(「CNP27-PEO24」)(SEQID NO：36)離體處理之野生型小鼠股骨之條件培養基中的cGMP含量(p<0.01)； 圖40展示來自以CNP22、CNP37或PEO24- GANRR- CNP22(K4R)(SEQID NO：36)離體處理之FGFR3ach 小鼠股骨之條件培養基中的cGMP含量(p<0.01)； 圖41描繪來自以CNP22、CNP37或PEO24- GANRR- CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)離體處理之野生型小鼠脛骨之條件培養基中的cGMP含量(p<0.01)；圖42 展示來自以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)離體處理之FGFR3ach 小鼠脛骨之條件培養基中的cGMP含量(p<0.01)；圖43 顯示使野生型及FGFR3ach 小鼠股骨離體暴露於CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)使條件培養基中裂解之第II型膠原蛋白的含量增加(p<0.05)；圖44 描繪自野生型小鼠及FGFR3Y367C 小鼠(嚴重軟骨發育不全之小鼠模型)分離且以媒劑或1μM Pro-Gly-CNP37(「ProCNP38」)離體處理6日之股骨肥大區，表明Pro-Gly-CNP37處理使得生長板中之骨生長及擴展增強；圖45 展示靜脈內(i.v.)投與20nmol/kg大鼠之CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)在血漿中具有比CNP22長得多的半衰期及高得多的生物可用性；圖46 說明皮下(s.c.)投與50nmol/kg大鼠之PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)在血漿中亦具有比CNP22長得多的半衰期及高得多的生物可用性；圖47 顯示靜脈內投與(20nmol/kg)之CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)在大鼠中刺激比CNP22高得多的cGMP產生量；圖48 展示皮下投與(50nmol/kg)之PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)及(以較低程度)CNP37實質上 比CNP22更有效地在大鼠中刺激cGMP產生；圖49 展示以Gly-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)處理之野生型小鼠的體重量測值；圖50 展示以Gly-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)處理之野生型小鼠的尾長量測值；圖51 說明以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)處理FGFR3ach 小鼠對身長之影響(p=0.02，單尾t-檢驗，不等變異)；圖52 展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)對FGFR3ach 小鼠尾長(經校正)之影響；圖53A 及B 展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)對FGFR3ach 小鼠之遠端長骨(A，尺骨；B，脛骨)長度之影響(p<0.01，單尾t-檢驗，不等變異)；圖54A 及B 展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)對FGFR3ach 小鼠之近端骨(A，肱骨；B，股骨)長度之影響(p<0.01，單尾t-檢驗，不等變異)；圖55 說明投與CNP37矯正近端肢骨短小(近端肢長不成比例)，如由在FGFR3ach 小鼠中觀察到之股骨：脛骨比率所評估(p<0.01，單尾t-檢驗，不等變異)；圖56 展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)對FGFR3ach 小鼠頭長之影響(p<0.01，單尾t-檢驗，不等變異)(第五周)；圖57 展示以CNP37處理FGFR3ach 小鼠使外耳道(EAM)尺寸增加(P=0.03，單尾t-檢驗，不等變異)(第五周)；圖58 展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)對軟骨發育不全小鼠之脊椎長度(經校正)之影響，其表現為椎骨體(例如腰椎5)延伸(第五周)；圖59 展示以CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)處理FGFR3ach 小鼠使得給藥後15分鐘cGMP血漿含量增加；圖60 說明以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)處理5週之FGFR3ach 小鼠中裂解之第II型膠原蛋白的血清含量；圖61 展示以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)處理5週之FGFR3ach 小鼠中骨鈣化素之血清含量；圖62 展示來自以Gly-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)處理之野生型小鼠的給藥後15分鐘之cGMP血漿含量(p<0.05)；圖63 展示以Gly-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)處理5週之野生型小鼠中裂解之第II型膠原蛋白的血清含量；圖64-66 展示在投與野生型小鼠媒劑或20nmol/kg或70nmol/kg Pro-Gly-CNP37(「Pro-CNP38」)之後cGMP、裂解之第II型膠原蛋白及骨特異性鹼性磷酸酶之含量；圖67 及68 描繪在依據不同給藥療程投與媒劑或Pro-Gly-CNP37(「Pro-CNP38」)之後，裂解之第II型膠原蛋白及總鹼性磷酸酶含量； 圖69說明在兩個個別研究(S1及S2)中在第37日相對於第1日， 經Pro-G1y-CNP37(「Pro-CNP38」)及媒劑處理之動物之身長的相對增加； 圖70A 及 B展示在投與Pro-G1y-CNP37(「Pro-CNP38」)之後骨密度(A)及骨礦質含量(B)之變化； 圖71展示第36日在最後一次皮下給予CNP變異體之後15分鐘的血漿cGMP含量，其中在圖71-73中，G1y- wtCNP37為「 CNP38」，Pro-G1y-wtCNP37為「Pro-CNP38」，且GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO：144)為「HSA- CNP27」； 圖72展示以G1y-CNP37、Pro-G1y-C NP37或G HK SEVAHRFK-CNP27(SEQID NO：144)處理之小鼠的裂解之第II型膠原蛋白之血清含量；圖73展示以G1y-CNP37、Pro-G1y-CNP37或G HK SEVAHRFK- CNP27(SEQID NO：144)處理之小鼠的鹼性磷酸酶之血清含量； 圖74A及B描繪在以1μM G1y-CNP37短期(A)或長期(B)處理後cGMP反應之減敏； 圖75A顯示以200nmo1/kgPro-G1y-CNP37(「Pro-CNP38」)每日處理野生型小鼠持續8日不使cGMP反應減敏。圖75B展示一日一次以200 nmo1/kg Pro-G1y-CNP37處理小鼠持續連續兩日增強cGMP反應； 圖76A-D展示以200nmo1/kg G1y-CNP37處理野生型小鼠刺激遠端股骨(軟骨及骨)(A)、股骨皮層(骨)(B)、耳翼(軟骨)(C)及腎臟(D)中之cGMP分泌。圖76E-H展示肝(E)、 心臟(F)、肺(G)及腦(H)組織在所研究時點相對於媒劑對照並未顯示回應於G1y-CNP37的顯著cGMP分泌； 圖77-82展示來自在經每日皮下注射媒劑或10μg/kg或36μg/kg Pro-G1y-CNP37之正常幼年獼猴中正進行的研究之結果。兩種劑量之Pro-G1y-CNP37均具有增加之生長板寬度(圖77)、增加之左脛骨及右脛骨長度(圖78A及B)、增加之腿長(圖79)、增加之臂長(圖80)、增加之身長(圖81)，及增加之鹼性磷酸酶血清含量(圖82)；及 圖83描繪G1y-CNP37調配物之降解速率常數(Kobs )在pH3-8及5℃、25℃及40℃下隨pH值變化的觀察曲線圖。
(無元件符號說明)

Claims (22)

  1. 一種C型利鈉胜肽(CNP)之變異體，其係選自由以下組成之群：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO：182)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO：186)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO：192)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；及MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：191)，其中該CNP變異體可被共軛至選自以下之部分：疏水性酸及適用於骨靶向之1至20個胺基酸之胺基酸序列。
  2. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之CNP變異體，及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
  3. 如請求項2之組合物，其為自包含pH值為約4至約6之檸檬酸/檸檬酸鹽緩衝液或乙酸/乙酸鹽緩衝液之調配物製備的凍乾調配物。
  4. 如請求項3之組合物，其中該凍乾調配物係自進一步包 含(a)等張調節劑及/或增積劑或(b)抗氧化劑之調配物製備。
  5. 如請求項1之CNP變異體，其係用於治療骨相關病症或骨骼發育不全，該骨相關病症或骨骼發育不全係選自由以下組成之群：軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症及同型合子軟骨發育不全。
  6. 如請求項5之CNP變異體，其中該骨相關病症或骨骼發育不全為軟骨發育不全。
  7. 如請求項2至4中任一項之醫藥組合物，其係用於治療骨相關病症或骨骼發育不全，該骨相關病症或骨骼發育不全係選自由以下組成之群：軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症及同型合子軟骨發育不全。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中該骨相關病症或骨骼發育不全為軟骨發育不全。
  9. 一種重組產生CNP變異體之方法，其包括將包含編碼CNP變異體多肽之第一聚核苷酸連接至編碼可裂解胜肽或蛋白質之第二聚核苷酸的宿主細胞，在培養基中，在可以讓該等聚核苷酸編碼之融合多肽表現的條件下培養，其中該融合多肽包含該CNP變異體多肽直接連接至該可裂解胜肽或蛋白質或經由連接子與其間接連接，其中該CNP變異體係選自由以下組成之群：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37 (M32N)](SEQ ID NO：182)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO：186)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO：192)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO：75)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；及MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：191)。
  10. 如請求項9之方法，其中該宿主細胞經表現載體轉型，該表現載體包含編碼該CNP變異體多肽之該聚核苷酸連接至編碼該可裂解胜肽或蛋白質之該聚核苷酸。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該可裂解胜肽或蛋白質係選自由以下組成之群：組胺酸標籤、人類轉錄因子TAF12、TAF12片段、TAF12組蛋白摺疊域、TAF12之突變體及其片段、TAF12(C/A)、TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A及D/E)、TAF12(C/A及4D/4E)、TAF12(C/A及6D/6E)、TAF12(C/A及10D/10E)、酮類固醇異構酶、麥芽糖結合蛋白、ß-半乳糖苷酶、麩胱甘肽-S-轉移酶、硫氧化還原蛋白、甲殼素結合域、BMP-2、BMP-2突變體、BMP-2(C/A)，及其突變體及片段。
  12. 如請求項9或10之方法，其中該宿主細胞為細菌。
  13. 如請求項9或10之方法，其中該融合多肽表現為可溶蛋白質或包涵體。
  14. 如請求項9或10之方法，其進一步包含自該宿主細胞或培養基分離該所表現之融合多肽。
  15. 如請求項14之方法，其進一步包含使該經分離之融合多肽與選自由以下組成之群的裂解劑接觸：甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質自裂解、因子Xa、腸激酶、ProTEV及SUMO蛋白酶。
  16. 一種根據如請求項9至15中任一項之方法產生之CNP變異體，其中該CNP變異體係選自由以下組成之群：QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO：182)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO：186)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO：192)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)；及MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：191)。
  17. 一種包含表現載體之宿主細胞，該載體包含編碼CNP變 異體多肽之第一聚核苷酸連接至編碼可裂解胜肽或蛋白質之第二聚核苷酸，其中該CNP變異體係選自由以下組成之群：QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO：182)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO：186)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO：192)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO：75)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)；及MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：191)。
  18. 如請求項17之宿主細胞，其中在適於表現由該等聚核苷酸編碼之融合多肽之條件下，於培養基中培養該宿主細胞，其中該融合多肽包含該CNP變異體多肽直接連接至該可裂解胜肽或蛋白質或經由連接子與其間接連接。
  19. 一種治療CNP反應性病狀或病症之組合物，其包括CNP胜肽或變異體，其特徵為該組合物係投予至個體且該個體中至少一種骨或軟骨相關生物標記之含量被監 測，其中該至少一種骨或軟骨相關生物標記之該含量增加，表示該CNP胜肽或變異體對該個體或該病狀或病症具有治療作用，其中該CNP變異體為如請求項1者。
  20. 如請求項19之組合物，其中該至少一種骨或軟骨相關生物標記係選自由以下組成之群：CNP、cGMP、第II型膠原蛋白之前肽及其片段、第II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、第I型原膠原之前肽(PINP)及其片段、第I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及鹼性磷酸酶。
  21. 一種組合物，包含如請求項1之變異體，其用於在有需要之個體中增強長骨生長，其中長骨生長被增強。
  22. 一種組合物，包含如請求項1之變異體，其用於在有需要之個體中增強長骨生長或治療軟骨發育不全、軟骨生成減退、身材矮小、侏儒症或同型合子軟骨發育不全。
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