JP5718909B2 - Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドの変異体 - Google Patents

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Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／２５４，５６３号、および２００９年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／１８０，１１２号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
（開示の分野）
本開示の分野は、一般的に、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体、ＣＮＰ変異体を含む組成物、ＣＮＰ変異体を調製する方法、ならびに骨格異形成症（例えば、軟骨無形成症）などの骨関連障害および血管平滑筋障害を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰに対して反応性を示す障害を治療するためにＣＮＰ変異体を用いる方法に関する。
（開示の背景）
ナトリウム利尿ペプチドファミリーは、次の３つの構造的に関連するペプチドからなっている：心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＰ＿００６１６３、ＡＮＰ前駆体タンパク質ＮＰＰＡ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＰ＿００２１５、ＢＮＰ前駆体タンパク質ＮＰＰＢ）およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）（非特許文献１、（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＰ＿０７７７２０、ＣＮＰ前駆体タンパク質ＮＰＰＣ）（Ｊ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、１０巻、９０７〜９１２頁（１９９２年））。これらの小さい一本鎖ペプチド（ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰ）は、１７アミノ酸ループ構造を有し（Ｌｅｖｉｎら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３３９巻、８６３〜８７０頁（１９９８年））、複数の生物学的過程において重要な役割を有する。ＡＮＰおよびＢＮＰは、グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣ−Ａ）とも呼ばれているナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合し、活性化して、より高い細胞内サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルをもたらす。同様に、ＣＮＰは、ＮＰＲ−Ｂ（ＧＣ−Ｂ）と相互作用して、ｃＧＭＰの産生を刺激する（非特許文献２）。第３のタイプの受容体ＮＰＲ−Ｃは、ナトリウム利尿ペプチドのそれぞれに高い親和力で結合し、細胞外コンパートメントからペプチドを捕捉するために主として機能し、上記ペプチドをリソソーム内に蓄積させ、そこでそれらが分解される（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻、６７５〜６７８頁（１９８７年））。ＡＮＰおよびＢＮＰは、主として心臓の筋肉細胞内で産生され、心血管恒常性に重要な役割を有すると考えられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻、１２０〜１２３頁（１９９１年））。ＣＮＰは、中枢神経系内、生殖器官内、骨内および血管内皮内を含めた、より広い範囲で発現される（非特許文献３）。
ヒトにおいて、ＣＮＰは、最初にナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）遺伝子により一本鎖１２６アミノ酸プレプロポリペプチドとして産生される（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１６８巻、８６３〜８７０頁（１９９０年））。シグナルペプチドの除去により、プロＣＮＰが生成し、エンドプロテアーゼであるフューリンによるさらなる切断により、活性な５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−５３）が生成し、これが分泌され、未知の酵素による切断を再び受けて、成熟２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−２２）が生成する（Ｗｕ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７８巻、２５８４７〜８５２頁（２００３年））。ＣＮＰ−５３とＣＮＰ−２２は、それらの分布が異なり、ＣＮＰ−５３は組織中で優勢であるが、ＣＮＰ−２２は主として血漿および脳脊髄液中に認められる（Ｊ． Ａｌｆｏｎｚｏ、Ｒｅｃｅｐｔ． Ｓｉｇｎａｌ． Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ． Ｒｅｓ．、２６巻、２６９〜２９７頁（２００６年））。軟骨中の優勢なＣＮＰの形は不明である。ＣＮＰ−５３とＣＮＰ−２２は、両方ともＮＰＲ−Ｂに同様に結合する。さらに、それらは両方とも用量依存的かつ同様の様態でｃＧＭＰの産生を誘導する（ＶＴ Ｙｅｕｎｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１７巻、１０１〜１０６頁（１９９６年））。
天然ＣＮＰ遺伝子およびポリペプチドは、以前に記載された。米国特許第５，３５２，７７０号は、ヒトＣＮＰと配列が同一のブタ脳から分離され、精製されたＣＮＰ−２２および心血管適応症の治療におけるその使用を開示している。米国特許第６，０３４，２３１号は、プロＣＮＰ（１２６アミノ酸）のヒト遺伝子およびポリペプチドならびにヒトＣＮＰ−５３の遺伝子およびポリペプチドを開示している。
細胞外間隙からのＣＮＰのクリアランスは、ＣＮＰを速やかに分解する、膜結合中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）の作用（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２９１巻（Ｐｔ１）、８３〜８８頁（１９９３年））と、ＣＮＰに結合し、かつＣＮＰをリソソーム中に蓄積させる（そこでＣＮＰが分解される）ＮＰＲ−Ｃとを介して起こる。ＣＮＰは、正常人において２．６分のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することが示された（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．、７８巻、１４２８〜３５頁（１９９４））。ＣＮＰの血漿濃度が低いこと（Ｊ． Ｂｏｎｅ． Ｍｏｎｅｒ． Ｒｅｓ．、１９（補１）巻、Ｓ２０頁（２００４年））および多くの組織においてそれがＮＰＲ−Ｂと共発現することから、ＣＮＰは、主としてオートクリン／パラクリンメカニズムにより機能することが示唆される。
上記のように、ＣＮＰは、グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）とも呼ばれているナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）に結合し、活性化して、より高い細胞内サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルをもたらす。ｃＧＭＰの産生により媒介される下流シグナリングは、軟骨内骨化を含む種々の生物学的過程に影響を及ぼす。したがって、この経路におけるいずれかの成分の上昇または抑制は、異常な骨成長につながる可能性がある。例えば、マウスモデルにおけるＣＮＰまたはＮＰＲ−Ｂのノックアウトは、より短縮した長骨および椎骨を伴う矮小化表現型を有する動物をもたらす。適切なＣＮＰシグナリングを遮断するヒトＮＰＲ−Ｂの変異が同定され、小人症をもたらす（Ｏｌｎｅｙら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．、９１巻（４号）、１２２９〜１２３２頁（２００６年）、Ｂａｒｔｅｌｓら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅｔ．、７５巻、２７〜３４頁（２００４年））。これに対して、ＣＮＰのレベルの上昇をもたらすように遺伝子工学により改変したマウスは、延長した長骨および椎骨を示す。
軟骨無形成症は、軟骨形成の異常を引き起こす、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）の遺伝子における常染色体優性変異の結果である。ＦＧＦＲ−３は、通常、軟骨細胞の成長、そして、したがって、骨の成長に対する負の調節効果を有する。軟骨無形成症において、ＦＧＦＲ−３の変異形は、構成的に活性であり、骨の著しい短縮をもたらす。軟骨細胞の増殖および分化は、妨げられ、著しく短い成長板軟骨につながる（Ｐ． Ｋｒｅｊｃｉら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１１８巻、５０８９〜５１００頁（２００５年））。軟骨内骨化は、長骨の縦方向の成長を調節する過程である。成長板には、静止、増殖、肥大および石灰化帯という４つの帯域が存在する。成長板において、ＮＰＲ−Ｂは増殖性細胞により発現されるが、ＮＰＲ−Ｃは肥大性細胞により発現される（Ｙａｍａｓｈｉｔｅら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２７巻、１７７〜１７９頁（２０００年））。正常な軟骨内骨成長において、軟骨細胞は、柱に組織化し、成長板の増殖帯において増殖する。これらの柱は、軟骨無形成症患者では組織崩壊している。さらに、肥大帯は、細胞が大きくなり、最終的にアポトーシスされ（溶解し）、骨細胞の侵入および鉱質化につながる場所である。肥大軟骨細胞および肥大帯の全体的な大きさは、軟骨無形成症患者において正常患者よりはるかに小さい。ＣＮＰは、軟骨細胞および骨の成長の正の調節因子であるＮＰＲ−Ｂのアゴニストである。ＣＮＰ／ＮＰＲ−Ｂの下流シグナリングは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のレベルにおけるＦＧＦＲ−３経路を阻害する。ＭＡＰＫにおける阻害は、成長板の増殖帯および肥大帯における軟骨細胞の増殖および分化を促進し、骨の成長をもたらす。
ヒトにおいて、ＦＧＦＲ−３の活性化変異が遺伝的小人症の主な原因である。活性化ＦＧＦＲ−３を有するマウスは、骨格異形成の最も一般的な形である軟骨無形成症のモデルとしての役割を果たし、ＣＮＰの過剰発現は、これらの動物を小人症から救出するものである。したがって、ＣＮＰおよびＣＮＰの機能的変異体は、種々の骨格異形成の治療のための可能な治療薬である。
ＣＮＰの治療における使用は、ヒトにおいてｉｎ ｖｉｖｏで２．６分であることが示された（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．、７８巻、１４２８〜３５頁（１９９４年））、その短い血漿半減期により現在のところ制限されている。ヒト血漿中に一般的に認められる内在性レベル（約５ｐＭ）以上にＣＮＰ濃度を高くするために、全身投与ＣＮＰを用いたすべてのヒトおよび動物試験において持続注入が必要であった。より長いｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を有し、野生型ＣＮＰと同様または改善された活性を示すＣＮＰ変異体は、持続可能な治療戦略のために重要である。ＣＮＰの半減期をヒト血漿中において短縮させる２つのメカニズムは、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）による分解およびナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）によるクリアランスである（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍ． ＆ ＩＧＦ Ｒｅｓ．、１６巻、Ｓ６〜Ｓ１４頁（２００６年））。ペプチドの改変により、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼ切断に対する抵抗性を改善することができると報告されている（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、３０巻、３５１〜３６７頁（２００６年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、６３８〜６４２頁（２００６年））。
ＣＮＰの種々の類似体および誘導体の生物学的活性が評価された。Ｃｙｓ６およびＣｙｓ２２の代わりにＳ−メチルＣｙｓを用いることにより、Ｃｙｓ６−Ｃｙｓ２２ジスルフィド結合によるペプチドの環化が、ｃＧＭＰの産生の刺激におけるＣＮＰの活性に重要であることが報告により示された（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．、１８３巻、９６４〜９６９頁（１９９２年）、ＣＮＰの機能性に重要なアミノ酸を同定するためにアラニンスキャニングも用いる）。活性のさらなる有意な増大は、アミノ酸Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０およびＬｅｕ１１の組み合わせられた存在に起因すると報告されている。米国特許第５，４３４，１３３号は、アミノ酸が６位におけるＣｙｓまたはＰｍｐ（ペンタシクロメルカプトプロピオン酸）、７位におけるＰｈｅ、４−クロロＰｈｅ、４−フルオロＰｈｅ、４−ニトロＰｈｅまたはＣｈａ（３−シクロヘキシルＡｌａ）、９位におけるＧｌｙ、Ｖａｌ、ＡｉｂまたはｔＬｅｕ、１１位におけるＬｅｕまたはＩｌｅ、および２２位におけるＣｙｓまたはＰｍｐから選択される、アミノ酸６、７、９、１１または２２位における置換を有するＣＮＰ−２２を含むＣＮＰ類似体を記載している。
米国特許公開第２００４／０１３８１３４号（現在は米国特許第７，２７６，４８１号）は、９、１０、１１、１６、１７、１９または２０位における他の天然アミノ酸の少なくとも１つの置換を含む、ＣＮＰ−２２のアミノ酸Ｃｙｓ６〜Ｃｙｓ２２を含むＣＮＰ変異体（「ＣＮＰ−１７」）、Ｃｙｓ６とＰｈｅ７との間の報告されたＮＥＰ切断の主要な部位におけるＨｉｓ残基の付加などの挿入および欠失によるＣＮＰ変異体、ならびに異常な骨における骨成長板のサイズの増加および異常な骨の延長のためのそのような変異体を使用する方法を述べている。しかし、ｃＧＭＰの生成により測定される活性の有意な増加はこれらの変異体において得られず、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞を用いた方法で認められたように、活性はほぼすべての変異体で低下した（実施例６）。さらに、ＣＮＰ類似体の主張されたＮＥＰ抵抗性およびＮＰＲ−Ｃ抵抗性を実証する、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性または薬物動態（ＰＫ）の改善のｉｎ ｖｉｖｏでの測定などの裏づけデータは提供されなかった。米国特許第６，７４３，４２５号は、ＮＰＲ−Ｂ／ＧＣ−Ｂを活性化し、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドＣＮＰ−２２およびＣＮＰ−５３を含む、ペプチドまたは低分子量化合物である軟骨無形成症の治療用の物質を開示している。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２０５３４は、ジスルフィドまたは二重結合の形成に起因する限られた数のアミノ酸置換および環状キメラペプチドである、バソナトリンペプチド（ｖａｓｏｎａｔｒｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＶＮＰ）と呼ばれるＣＮＰ−２２およびＡＮＰの５アミノ酸Ｃ末端のキメラを開示している。
他のナトリウム利尿ペプチドファミリーメンバーの半減期を改善するためのアプローチは、ＮＰＲ−Ｃに対するＡＮＰの親和性を低下させること（米国特許第５，８４６，９３２号）、ＮＰＲ−Ｃのペンタペプチドアンタゴニストを利用すること（ＷＯ００／６１６３１）およびチオルファンおよびカンドキサトリルなどのＮＥＰ阻害剤を併用投与すること（Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２５巻、９８６〜９９１頁（１９９７年）、Ｈｙｐｅｒｔｅｎ．、３０巻、１８４〜１９０頁（１９９７年））などである。ＷＯ２００４／０４７８７１は、ＢＮＰおよびＢＮＰ変異体と、ポリアルキレングリコール部分、糖部分、ポリソルベート部分、ポリカチオン性部分および循環中の半減期の改善を示すと報告され、急性鬱血性心不全の治療に有用であると報告されている他の親水性ポリマー部分との結合体を開示している。
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１６８巻、８６３〜８７０頁（１９９０年） Ｊ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、１０巻、１１１１〜１１１４頁（１９９２年） Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、４９巻、４１９〜４２６頁（２００７年）
しかし、その機能性を保持すると同時に、ＮＥＰに対して抵抗性のあるＣＮＰを調製することに成功した戦略に関する公表された報告は存在していなかった。
本開示は、骨関連障害（例えば、軟骨無形成症）および血管平滑筋障害の治療に有用であるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体に関する。本開示は、ＣＮＰの機能性を保持すると同時に、例えば、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）に結合する能力の低下、ＮＥＰによるタンパク質分解に対するより大きい抵抗性および／またはクリアランスナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲ−Ｃ）に対する親和性の低下の結果としての長い血清半減期を有するＣＮＰ変異体を含む。
ヒトＣＮＰ−２２（本明細書では「ｈＣＮＰ２２」、「ｗｔＣＮＰ２２」または「ＣＮＰ２２」と呼ぶ）の野生型配列を下に示す。
（Ｎ末端）Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２（配列番号１）
ＣＮＰ２２の６〜２２位は、Ｃｙｓ６とＣｙｓ２２との間のジスルフィド結合により環状ドメインを形成している。１７アミノ酸環状構造は、ＮＰＲ−ＢへのＣＮＰの結合に重要であることが示された（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１３８巻、８８０〜８８６頁（１９８６年））。ＣＮＰ２２の６〜２２位のアミノ酸配列は、本明細書では「ＣＮＰ１７」と呼ぶ（配列番号２）。
ＣＮＰは、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７、Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１、Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４、Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７およびＧｌｙ１９−Ｌｅｕ２０などの多くの部位におけるＮＥＰ切断を受けやすい。１つの実施形態において、本開示は、（１）その全体的なサイズもしくは分子量を、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａから約４ｋＤａ、４．２ｋＤａ、４．４ｋＤａ、４．６ｋＤａ、４．８ｋＤａ、５ｋＤａ、５．２ｋＤａ、５．４ｋＤａ、５．６ｋＤａ、５．８ｋＤａ、６ｋＤａ、６．２ｋＤａ、６．４ｋＤａまでもしくは約７ｋＤａ、７．２ｋＤａもしくは約８．２ｋＤａまでの範囲に増加させるために改変され、かつ／または（２）上に示した部位の１、２、３、４、５つもしくは６つすべてにおけるＮＥＰ切断に対するその感受性を低下させるために改変されているＣＮＰ変異体を含む。ＣＮＰ変異体のサイズまたは分子量は、様々な手段により、例えば、追加のアミノ酸および／または他の種類の化学（例えば、天然もしくは合成ポリマー）基を例えばＮ末端、Ｃ末端および／または側鎖におけるペプチド配列に結合させることにより、かつ／またはよりかさばった側鎖を有する天然アミノ酸、非天然アミノ酸および／またはペプチド模倣体を用いることにより、増加させることができる。ＣＮＰ変異体は、他の機能または構造部分に必要に応じてさらに結合させることができる。本明細書で記載する実施形態のいずれかと必要に応じて組み合わせて、（１つ以上の）変異（例えば、（１つ以上の）置換、（１つ以上の）付加および／または（１つ以上の）欠失）をＣＮＰ２２の特定の（１つ以上の）位置に導入して、ＮＰＲ−Ｃに対するＣＮＰ変異体の親和性を低下させることができる。ＮＥＰ抵抗性またはＣＮＰ活性に影響を及ぼすことのないさらなる改変、例えば、保存的置換、または当技術分野で公知の他の改変を行うことができる。
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、次の一般式：（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号５）により表すことができ、ここで、
ＣＮＰ変異体は、次のＣＮＰ残基：Ｇｌｙ１、Ｌｙｓ４、Ｇｌｙ５、Ｃｙｓ６、Ｐｈｅ７、Ｇｌｙ８、Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１６、Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｌｅｕ２０およびＧｌｙ２１の１つ以上に対応する位置における改変ペプチド結合（例えば、ペプチド結合イソスターの使用による）をもたらす可能性がある１つ以上の改変アミノ酸を含み、
（ｘ）および（ｚ）は、独立に、非存在であってよく、またはナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＡＮＰ、ＢＮＰ）もしくは非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩｇＧ等）であってよい。
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、（１）ＣＮＰ２２の６、７または８位（Ｃｙｓ６、Ｐｈｅ７またはＧｌｙ８）の１つに対応するアミノ酸位置における改変、（２）１〜５位におけるアミノ酸（Ｇｌｙ１、Ｌｅｕ２、Ｓｅｒ３、Ｌｙｓ４およびＧｌｙ５）のいずれかまたはすべての必要に応じて欠失、付加および／または置換ならびに（３）６〜２２位に対応する位置における必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までのさらなる改変（欠失、付加および／または置換）（そのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個が保存的置換または本明細書で記載するもしくは当技術分野で公知の他の置換であってよい）を含む。
数による特定のアミノ酸位置への言及（例えば、ＣＮＰ２２の７位）は、当該ＣＮＰ変異体における当該位置の数が先行する挿入または欠失のために変化したとしても、いずれかのＣＮＰ変異体における対応するアミノ酸位置を意味する。例えば、「７位」または「Ｐｈｅ７」への言及は、最初の５つのアミノ酸が欠失したＣＮＰ変異体の対応する２位を意味する。同様に、「７位」への言及は、１つのアミノ酸がＮ末端に付加されたＣＮＰ変異体の対応する８位を意味する。
本明細書で記載する実施形態のいずれかにおいて、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の６および２２に対応する位置の間の共有結合により環化させることができる。当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて共有結合を形成させることが考えられる。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、該ペプチドのＮ末端におけるまたはＮ末端の方にあるアミノ酸とＣ末端におけるまたはＣ末端の方にあるアミノ酸との間に形成される共有結合により環化させることができる（この目的のために「末端」アミノ酸と呼ぶ）。１つの実施形態において、共有結合は、２つの末端アミノ酸の側鎖またはＣＮＰ２２の６および２２の対応する位置におけるアミノ酸の間で形成させる。他の実施形態において、共有結合は、１つの末端アミノ酸の側鎖と他の末端アミノ酸の末端基との間で、または各末端アミノ酸の末端基との間で形成させる。例えば、ヘッド−テール、側鎖−側鎖、側鎖−ヘッド、または側鎖−テール結合が、末端アミノ酸の間、またはＣＮＰ２２の６および２２の対応する位置におけるアミノ酸の間で形成される共有結合について可能である。
１つの実施形態において、本開示は、ＣＮＰの機能性（例えば、ｃＧＭＰの産生の刺激）を保持すると同時に、ＮＥＰに対する低い親和性、および／またはＮＥＰによる切断に対するより大きい抵抗性および／または長いｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を有するＣＮＰ変異体を提供する。ＮＥＰは、その活性部位の空洞のサイズが限られているため、約３ｋＤａより小さい物質を選択的に認識する（Ｏｅｆｎｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９６巻、３４１〜３
４９頁（２０００年））。１つの実施形態において、例えば、約０．６〜約５ｋＤａのアミノ酸、親水性もしくは水溶性ポリマー、疎水性酸（脂肪酸を含む）および／または糖を付加することにより、全体的な分子量を例えば、約２．６もしくは２．８ｋＤａから約４、４．６、５、５．２、５．８、６、６．４もしくは約７ｋＤａまでの範囲に増加させるためにＣＮＰ変異体を改変する。特定の具体例としての実施形態において、ＣＮＰ変異体は、約２．６ｋＤａ〜約７ｋＤａ、または約２．８ｋＤａ〜６ｋＤａ、または約２．８ｋＤａ〜５．８ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体の総分子量を、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａから約４ｋＤａ、４．２ｋＤａ、４．４ｋＤａ、４．６ｋＤａ、４．８ｋＤａ、５ｋＤａ、５．２ｋＤａ、５．４ｋＤａ、５．６ｋＤａ、５．８ｋＤａ、６ｋＤａ、６．２ｋＤａ、７．２ｋＤａ、８．２ｋＤａもしくはより高い値までの範囲まで増加させるために、少なくとも約０．６、０．８、１、１．２、１．４、１．６もしくは１．８ｋＤａ、または２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８もしくは５ｋＤａまでを加える。いくつかの実施形態において、そのようなＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２のアミノ酸６〜２２と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一または相同であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、そのようなＣＮＰ変異体は、他の天然または非天然アミノ酸またはペプチド模倣体との１、２、３、４、５、６もしくは７個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。保存的および非保存的置換または挿入がいずれかの位置において想像されるが、非保存的置換は、改変に耐性があることが以前に示された領域において行うことができるが、改変の導入は、例えば、ＣＮＰ活性またはＮＰＲ−Ｂ結合に関与すると当技術分野で同定された領域における保存的置換によって始まる可能性がある。
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｃｙｓ６とＣｙｓ２２の間の完全な環化部分、ならびに約１〜４０、１〜２０、５〜４０、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、５〜３１、１０〜３１、もしくは１５〜３１個のアミノ酸を含み、ＣＮＰポリペプチドおよび／または非ＣＮＰポリペプチド由来の断片であるＮ末端および／またはＣ末端テールを有するＣＮＰを含む。１つの実施形態において、そのようなＣＮＰ変異体は、約２．８ｋＤａ〜約４、４．６、５、５．２、５．８、６、６．４または７ｋＤａの範囲の分子量を有する。そのようなＣＮＰ変異体の非限定的な例としては、ヒトもしくは他の種のナトリウム利尿ペプチド前駆体配列（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰもしくはＣＮＰ）由来のＮ末端および／またはＣ末端延長部分を有する、野生型ＣＮＰ２２または１つ以上のアミノ酸置換（例えば、Ｋ４Ｒ置換）を有するＣＮＰ２２、アミノ酸置換、付加および／または欠失を有するナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）変異体（例えば、ＣＮＰ変異体は、約２．８ｋＤａ〜５．８ｋＤａの分子量を有するペプチドをもたらすＣＮＰ−５３の短縮体であってよい）、あるいは例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧタンパク質などの他の非ＣＮＰポリペプチド（例えば、ＣＮＰ変異体は、ヒトもしくは他の種の血清アルブミンまたはＩｇＧの断片を含むＣＮＰキメラであってよい）などがある。
１つの実施形態において、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大を意図した、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有するＣＮＰ変異体は、以下の一般式
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ｂ）４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号６）により表され、式中、
（ｘ）は、合成もしくは天然ポリマー基、またはその組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）とも呼ばれる）であり、天然ポリマー基の非限定的な例は、１〜３５アミノ酸を含み、ＮＰＰＣまたは置換および／もしくは欠失を有するその変異体、ＡＮＰ、ＢＮＰ、あるいは例えば、血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたは線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）などの他の非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド由来のアミノ酸配列であり、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは合成または天然ポリマー基、またはその組合せであってよく、合成ポリマー基の非限定的な例は、ＰＥＧであり、天然ポリマー基の非限定的な例は、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰもしくはＢＮＰ）または非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、血清アルブミンもしくはＩｇＧ）由来のアミノ酸配列であり、
（ｂ）および（ｈ）は、独立にそれぞれ、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＧｌｕもしくはＳｅｒを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよい。１つの実施形態において、（ｂ）はＡｒｇである。他の実施形態において、ＮＥＰ抵抗の改善のために、（ｂ）はＧｌｙでない。他の実施形態において、（ｈ）はＡｒｇでない。
ＮＰＰＣまたはその変異体由来のアミノ酸配列の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
Figure 0005718909
Figure 0005718909
 。
例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ、血清アルブミンおよびＩｇＧなどの非ＣＮＰポリペプチド由来のアミノ酸配列の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
Figure 0005718909
 。
１つの実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、独立に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のアミノ酸を含むアミノ酸延長部分に結合させることができる。１つの実施形態において、アミノ酸延長部分は、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ５３、ＡＮＰまたはＢＮＰ由来である。特定の実施形態において、アミノ酸延長部分は、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３３）である。関連実施形態において、この１５アミノ酸延長部分をＮ末端に付加して、式Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ｂ）４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号３４）のＣＮＰ変異体を得る。
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、それらの全体的な分子サイズを約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａから約４、５、６もしくは７ｋＤａまでの範囲に増加させるためにＮ末端および／またはＣ末端において親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に結合させたｗｔＣＮＰ２２またはその変異体（例えば、（１つ以上の）付加、（１つ以上の）欠失および／または例えば、Ｋ４Ｒ置換などの（１つ以上の）置換を有する）（配列番号３５）を含む。そのようなＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端において、例えば、アミノ酸、糖、疎水性酸および／またはリン脂質を含むポリマー基に必要に応じてさらに結合される。その非限定的な例は、１〜３５、または５〜３１個のアミノ酸を含むＮ末端アミノ酸延長部分である。１つの実施形態において、少なくとも約０．４、０．６、０．８、１、１．２、１．４、１．６もしくは１．８ｋＤａ、または約２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８もしくは５ｋＤａまでの親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）部分をｗｔＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端に付加させる。
本明細書で示すように、ＣＮＰ２２またはその変異体への約０．６ｋＤａまたはそれ以上の親水性または水溶性ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーの結合により、ＮＥＰ切断に対する抵抗性が著しく増加する。しかし、ｗｔＣＮＰ２２に０．６ｋＤａと小さくてもＰＥＧを付加させると、ＣＮＰの機能性（例えば、ｃＧＭＰシグナリングの刺激）が低下する可能性があり、ＣＮＰ２２またはその変異体に約２または３ｋＤａを超えるＰＥＧを付加させると、ＣＮＰの機能活性がサイズ依存的に低下する可能性がある。しかし、約０．６ｋＤａから約１．２ｋＤａまで、または場合によっては約２ｋＤａまでのＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーを、例えば、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）、ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３７）、ＥＲ−ＣＮＰ２２（配列番号３８）、ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）、Ｒ−ＣＮＰ２２（配列番号４０）およびＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）などの、生理的条件下で場合によっては正に荷電する可能性のある少なくとも１つの比較的に大きいアミノ酸（例えば、アルギニン）がＣＮＰ２２のＧｌｙに対応する位置の直前にある、Ｎ末端アミノ酸延長部分を有するＣＮＰ変異体に結合される場合、ＣＮＰの機能性（ｗｔＣＮＰ２２の機能性と少なくとも同等の）が保持される。
したがって、１つの実施形態において、ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはその変異体（例えば、Ｋ４Ｒ置換を有するもの）のＮ末端に少なくとも１、２、３、４または５個のアミノ酸を含むアミノ酸延長部分を含んでおり、この場合に、ＰＥＧポリマーは、ＮＥＰ切断に対する抵抗性の増大のための例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を得るためにアミノ酸延長ＣＮＰ変異体のＮ末端に結合させる。１つの実施形態において、ＣＮＰの機能性の向上のために、そのようなペグ化アミノ酸延長ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２のＧｌｙに対応する位置の直前にある、生理的条件下で場合によっては正に荷電する可能性のある少なくとも１つの比較的に大きい天然または非天然アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペグ化アミノ酸延長ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２のＧｌｙに対応する位置の直前に少なくとも１つのアルギニン残基を含む。
Ｎ末端および／またはＣ末端において例えばＰＥＧ（もしくはＰＥＯ）などの親水性もしくは水溶性ポリマーに結合したＣＮＰ変異体に加えて、本開示は、内部部位においてそのようなポリマーに結合したＣＮＰ変異体を含む。ここで簡潔さの目的のために、ＰＥＧ（もしくはＰＥＯ）は、親水性もしくは水溶性ポリマーの代表的な例として用いることとする。（１）Ｎ末端のみにおけるＰＥＧ化、（２）Ｃ末端のみにおけるＰＥＧ化、（３）内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）のみにおけるＰＥＧ化、（４）Ｎ末端およびＣ末端におけるＰＥＧ化、（５）Ｎ末端および内部部位におけるＰＥＧ化、ならびに（６）Ｃ末端および内部部位におけるＰＥＧ化を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰ変異体のＰＥＧ化の種々の部位が可能である。ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大およびＣＮＰの機能性の保持のために、特定の実施形態において、ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体の総質量は、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約４、５、６もしくは７ｋＤａまでの範囲の本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる。特定の実施形態において、ＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７（下で定義する）またはその変異体（アミノ酸付加、置換および／または欠失を有するものを含む）は、Ｎ末端においてのみＰＥＧ化されている。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）のみにおいてＰＥＧ化されている。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）においてＰＥＧ化されている。他の実施形態において、より良好な機能性を得るために、ＣＮＰ変異体は、環状ドメイン内（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６〜Ｃｙｓ２２に対応する）の部位（例えば、Ｌｙｓ１０）においてＰＥＧ化させない。内部部位におけるＰＥＧ化を防ぐために、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０は、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕまたはシトルリン（Ｃｉｔ）などの側鎖に反応性第一級アミノ基を含まない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体で置換することができる。特定の実施形態において、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０をＡｒｇで置換する。他の実施形態において、Ｌｙｓ１０をＡｒｇで置換しない。
本開示は、種類（例えば、ホモポリマーまたはコポリマー；ランダム、交互またはブロックコポリマー；線状または分枝；単分散性または多分散性）、結合（例えば、アミド、イミン、アミナール、アルキレンまたはエステル結合などの加水分解性または安定結合）、結合部位（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端における；好ましくはＣＮＰの環化領域における残基（ＣＮＰ２２の残基６〜２２に対応する）のいずれにおけるものでない）、ならびに長さ（例えば、約０．２、０．４または０．６ｋＤａ〜約２、３、４または５ｋＤａ）が異なっていてよい親水性または水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ分子）の使用を意図する。親水性または水溶性ポリマーは、当技術分野で公知であるような、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）もしくはアルデヒドベースの化学または他の化学によりＣＮＰペプチドに結合させることができる。そのようなＣＮＰ変異体は、例えば、ｗｔＣＮＰ−２２（２．２ｋＤａ）、ｗｔＣＮＰ２２の環化領域（残基６〜２２）のみを保持するＣＮＰ−１７、ＣＮＰ２２のＮ末端および／またはＣ末端におけるアミノ酸延長部分を有するＣＮＰ変異体、あるいはアミノ酸置換、付加および／または欠失を有する変異体、例えば、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ） （配列番号３６）， ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ） （配列番号３７）， Ｒ−ＣＮＰ２２ （配列番号４０）， Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ） （配列番号４１）， ＥＲ−ＣＮＰ２２ （配列番号３８） ａｎｄ ＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ） （配列番号３９）を用いて生成させることができる。１つの実施形態において、例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有するＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、ＮＨＳもしくはアルデヒドベースの化学によりＮ末端および／またはＣ末端において結合した単分散性線状ＰＥＧ（ＰＥＯ）基、あるいはＮＨＳベースの化学によりＮ末端および／またはＣ末端において結合した２アームもしくは３アーム分枝ＰＥＧ基を含む。本開示は、カルボキシル化、硫酸化およびリン酸化化合物を含むが、これらに限定されない、腎クリアランスの減少を意図した負に荷電したＰＥＧ−ＣＮＰ変異体をさらに意図する。
関連実施形態において、本開示は、ｎが１２〜５０の整数であり、ＰＥＧポリマーが分子量約２．５ｋＤａまでのものである、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのＮＨＳまたはアルデヒドベースのＰＥＧを含むＰＥＧ−ＣＮＰ結合体を意図する。特定の実施形態において、ｎは１２または２４である。１つの実施形態において、ＰＥＧポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基でキャップされている。特定の実施形態において、キャッピング基は、アルキル基、例えば、メチルなどの低級アルキル基である。
さらなる実施形態において、ＰＥＧポリマーまたはその誘導体は、約０．４ｋＤａ〜約２．５ｋＤａ、または約０．６ｋＤａ〜約１．５ｋＤａの範囲のポリマー数平均分子量を有する。
さらなる実施形態において、ｗｔＣＮＰまたはＣＮＰ変異体ペプチドを、例えば、ビスホスホネート、糖、疎水性酸（脂肪酸など）またはアミノ酸配列などの部分に結合させる。そのようなアミノ酸配列は、例えば骨／軟骨ターゲティングに有用なポリＡｓｐまたはポリＧｌｕなどであるか、あるいは例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの解明された骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質またはその誘導体であってよい。ＣＮＰ２２またはその変異体が骨もしくは軟骨ターゲティング部分に結合している本明細書で記載する実施形態において、ペプチドが軟骨細胞上のＮＰＲ−Ｂに結合し、活性化することができる場合、そのような部分は、改変ＣＮＰペプチドを骨成長板の軟骨細胞に到達させることを促進するように設計されている。
他の実施形態において、本開示は、ＮＥＰを含むペプチダーゼによる切断を受けにくいペプチド結合を有するＣＮＰ変異体を提供する。本開示は、エンドペプチダーゼ切断の部位に少なくとも１つの改変残基を含むＣＮＰ変異体を含む。１つの実施形態において、ＣＮＰにおけるＮＥＰ切断部位のＣｙｓ６−Ｐｈｅ７ペプチド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は、以下のペプチド結合イソスターのいずれかで置換することができる。
−ＣＨ２−ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−（ここで、アミド基が次のＲ基のいずれかによりアルキル化されている：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル）、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、
−ＣＨ２−Ｓ、
ｎが１または２である−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）ｎ−、
−ＣＨ２−ＣＨ２−、
−ＣＨ＝ＣＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−、
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
他の実施形態において、Ｐｈｅ７をその鏡像異性体Ｄ−Ｐｈｅで置換する。他の実施形態において、Ｄ鏡像異性体をｗｔＣＮＰ−２２内の１つまたは２２位置すべてまでの複数の位置に導入する。さらなる実施形態において、３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸などのβ−アミノ酸でＰｈｅ７を置換し、これにより、側鎖の長さを減少させると同時に、主鎖の長さを増加させる。他の実施形態において、本開示は、ホモシステイン、ペニシラミン、２−メルカプトプロピオン酸および３−メルカプトプロピオン酸を含むが、これらに限定されない、Ｃｙｓ６位置におけるＣｙｓ類似体を意図する。
Ｃｙｓ６とＰｈｅ７の間のＮＥＰ抵抗性結合の存在下でさえも、Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１、Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４、Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７およびＧｌｙ１９−Ｌｅｕ２０などの他のペプチド結合は、ＮＥＰにより加水分解され得る。したがって、本開示は、ＣＮＰ類似体の主鎖における複数の位置にペプチド結合イソスターを含むＣＮＰ類似体を含む。１つの実施形態において、ＣＮＰ類似体または変異体は、複数のペプチダーゼ切断部位に改変を含む。さらなる実施形態において、そのような変異体は、ＮＥＰ活性部位に対する結合に重要なアミノ酸残基における置換を有し、それにより、ＮＥＰ分解に対する抵抗を増大させるＣＮＰを含む。Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１８、Ｇｌｙ１９および／またはＧｌｙ２１を含むが、これらに限定されない１つ以上のＮＥＰ結合性残基をより大きいサイズの天然または非天然アミノ酸残基で置換して、ＮＥＰ活性部位に対する親和性を低下させる。他の実施形態において、Ｐｈｅ７、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｍｅｔ１７およびＬｅｕ２０を含むが、これらに限定されない、ＮＥＰ認識に必須の１つ以上の疎水性残基を、ＮＥＰ結合性を減少させる天然もしくは非天然アミノ酸および／またはペプチド模倣体で置換する。他の実施形態において、ＣＮＰの最初の５個のアミノ酸の１〜５個を欠失させるか、または他の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣体で置換することができ、あるいは１つ以上の天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体をＣＮＰの最初の５つの位置のいずれか１つまたはすべてに付加することができる。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰに対する抵抗性の増大のための約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−（ｉ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｊ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４６）により表され、式中、
（ｘ）は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物；例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなどの骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの解明された骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質由来のアミノ酸配列；例えば、荷電ＰＥＧ分子などの腎クリアランスを減少させるポリマーまたは非ポリマー分子；ならびに例えば、ポリマー（例えば、ＰＥＧｓ）、糖、疎水性酸（脂肪酸を含む）および／またはアミノ酸を含む延長部分からなる群から選択されてよく、そのようなアミノ酸延長部分は、例えば、１〜３１、もしくは１〜３５、もしくは５〜３５、もしくは１０〜３５、もしくは１５〜３５個のアミノ酸残基を含んでいてよく、ＮＰＰＣ、ＡＮＰ、ＢＮＰ、例えば、血清アルブミンもしくはＩｇＧなどの他の非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド、あるいは置換、付加および／または欠失、またはその組合せを有する前述のポリペプチドの変異体由来であってよく、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなどの骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨タンパク質の骨ターゲティングドメインのアミノ酸配列、ならびに例えば、ＡＮＰまたはＢＮＰなどの非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド由来のアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、
（ａ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換、またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ａ）はＡｒｇであり、
（ｂ）は、Ｃｙｓおよび例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨなどのＣｙｓ６とＰｈｅ７の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つ以上のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されている（例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない）か、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環を他のアリール基（非限定的な例は１−および２−ナフチルアラニンなどである）またはヘテロアリール（非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである）で置換することができる、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ｆ）はＡｒｇでなく、
（ｇ）は、Ｌｅｕおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−Ｇｌｙおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｒｅｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９および／または２０位の１つ以上における改変を含み、本明細書で開示した他の位置のいずれかにおける改変を必要に応じて有していてよい。
ＣＮＰ２２またはその変異体を疎水性酸に結合させることができる、本明細書で記載する実施形態において、ＣＮＰペプチドを１つ以上の疎水性酸に結合させることができる。疎水性酸の非限定的な例としては、直鎖または分枝飽和または不飽和Ｃ５〜Ｃ１２カルボン酸（例えば、ペンタン酸、ヘプタン酸等）および天然脂肪酸などがある。疎水性酸は、１つ以上のアミノ酸残基のＮ末端、Ｃ末端および／または側鎖に結合させることができる。１つの実施形態において、疎水性酸をＮ末端に結合させる。１つの実施形態において、疎水性酸へのＣＮＰ２２またはその変異体の結合は、とりわけ、改変ＣＮＰペプチドと血清アルブミンとの非特異的相互作用を促進し、それにより、ＣＮＰペプチドのサイズを増加させ、例えば、ＮＥＰなどのプロテアーゼによる切断からそれを保護するように設計する。疎水性酸結合ＣＮＰペプチドとアルブミンの間の相互作用は、改変ＣＮＰペプチドが軟骨を通して拡散し、骨成長板の軟骨細胞に到達し、ＮＰＲ−Ｂに結合し、活性化することができるように、強すぎないように設計する。
さらなる実施形態において、本開示は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、もしくは約１５０％の産生をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで刺激し、（ｂ）６、（ｃ）７および／または（ｄ）８位に少なくとも１つの改変アミノ酸を含み、以下の式
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−（ｉ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｊ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４７）により表されるＣＮＰ変異体を提供し、式中、
（ｘ）は、非存在であってよく、あるいは、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰもしくはＢＮＰ）または本明細書で述べたような非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＨＳＡ、ＩｇＧ、骨ターゲティングタンパク質等）に由来する１〜５個のアミノ酸を含むペプチド配列であってよく、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物；例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなどの骨／軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の融合タンパク質またはペプチド配列などの、骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質およびその誘導体；例えば、荷電ＰＥＧｓなどの腎クリアランスを減少させる分子；ならびに本明細書で述べたようなＮＥＰ媒介性分解に対するＣＮＰの抵抗性を増大させる分子からなる群から選択されてよく、
（ａ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ａ）はＡｒｇであり、
（ｂ）は、Ｃｙｓまたは脱カルボキシシステインであってよく、あるいは（ｂ）６−（ｃ）７ペプチド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は、以下のペプチド結合イソスター
−ＣＨ２−ＮＨ−；
アミド基が次のＲ基：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−；
−ＣＨ２−Ｓ−、
ｎが１または２である、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）ｎ−；
−ＣＨ２−ＣＨ２−；
−ＣＨ＝ＣＨ−；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−；
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−；または
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
のいずれか１つで置換されていてよく、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルからなる群から選択される、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体などの、Ｐｈｅのペプチド結合イソスター；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つ以上のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されている（例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない）か、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環を他のアリール基（非限定的な例は１−および２−ナフチルアラニンなどである）またはヘテロアリール（非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである）で置換することができる、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体であり、１つの実施形態において（ｆ）はＡｒｇでなく、
（ｇ）は、Ｌｅｕおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−Ｇｌｙおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、本開示は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、もしくは約１５０％の産生をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで刺激し、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大のための例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
（ｘ）−（ｙ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４８）により表され、
（ｘ）は、合成もしくは天然ポリマー基、またはその組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、天然ポリマー基の非限定的な例は、１〜３５個のアミノ酸を含み、ＮＰＰＣまたは置換および／もしくは欠失を有するその変異体、ＡＮＰ、ＢＮＰ、または例えば、血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたはＦＧＦ２などの非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド由来のアミノ酸配列であり、
（ｙ）は、非存在であってよく、あるいは、Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５（ＣＮＰ２２の１〜５位に対応する）（配列番号１）の１つ以上のアミノ酸および／または天然もしくは非天然アミノ酸を用いたそれらの位置の１つ以上における置換（例えば、Ｋ４Ｒ置換）であってよく、
（ｈ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換、またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ｈ）はＡｒｇでなく、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは合成または天然ポリマー基、またはその組合せであってよく、合成ポリマー基の非限定的な例は、ＰＥＧであり、天然ポリマー基の非限定的な例は、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰもしくはＢＮＰ）または非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、血清アルブミンもしくはＩｇＧ）由来のアミノ酸配列である。
１つの実施形態において、（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）は、ともに約１０〜約４０個、または約１５〜約３５個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、（ｘ）は、１〜４０個のアミノ酸、または１〜２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である。
ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、もしくは約１５０％の産生をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで刺激し、以下の式
（ｙ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２（配列番号１３８）を含むＣＮＰ変異体がさらに意図され、式中、
（ｙ）は、Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５（配列番号１）から選択される１つ以上のアミノ酸および／または天然もしくは非天然アミノ酸を用いたそれらの位置の１つ以上における置換（例えば、Ｋ４Ｒ置換）を含み、０．６ｋＤａ〜約５ｋＤａの分子量の親水性もしくは水溶性ポリマーをさらに含む。１つの実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーをそのようなアミノ酸延長ＣＮＰ変異体のＮ末端に結合させる。特定の実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーは、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。
他の実施形態において、本開示は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、もしくは約１５０％の産生をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで刺激するＣＮＰ変異体を提供し、該ＣＮＰ変異体は、１〜１５個のアミノ酸を含むＮ末端および／またはＣ末端ペプチド延長部分を含み、親水性もしくは水溶性ポリマーに結合している。１つの実施形態において、ペプチド延長部分は、５〜１０個のアミノ酸を含む。他の特定の実施形態において、ペプチド延長部分は、５個のアミノ酸を含む。他の特定の実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーは、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。
さらなる実施形態において、本開示のＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１μＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、もしくは約１５０％の産生をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで刺激し、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）由来の少なくとも１５個のアミノ酸断片を含み、該断片は、同じ数のアミノ酸残基を含む野生型ＮＰＰＣの配列と少なくとも７０％相同である。
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ抵抗性の増加のために例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
（ｘ）−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−（ｉ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｊ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４９）により表され、式中、
（ｘ）は、非存在であって（すなわち、−ＮＨ２基を有するＮ末端）、あるいはＧｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５（配列番号１）からの１、２、３、４または５個のアミノ酸の配列；例えば、ポリＡｓｐまたはポリＧｌｕなどの骨／軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨タンパク質の骨ターゲティングドメイン；荷電ＰＥＧ分子を含むが、これに限定されない、親水性もしくは水溶性ポリマーなどの腎クリアランスを減少させる分子；およびＰＥＧ、糖、疎水性酸、アミノ酸またはその組合せを含む部分からなる群から選択されてよく、そのような部分は、ＮＰＰＣまたは例えば、ＢＮＰ、ＡＮＰ、血清アルブミンもしくはＩｇＧなどの非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド由来のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されないアミノ酸延長部分であってよく、
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは例えば、ポリＡｓｐまたはポリＧｌｕなどの骨／軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨ターゲティングタンパク質由来のアミノ酸配列；および本明細書で述べたような、ＮＰＰＣまたは非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド由来のアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、
（ｂ）は、Ｃｙｓおよび例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨなどのＣｙｓ６とＰｈｅ７の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つ以上のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されている（例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない）か、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環を他のアリール基（非限定的な例は１−および２−ナフチルアラニンなどである）またはヘテロアリール（非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである）で置換することができる、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ｆ）はＡｒｇでなく、
（ｇ）は、Ｌｅｕおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−Ｇｌｙおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｒｅｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ抵抗性の増加のために例えば、約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−（ｉ）１５−Ｓｅｒ１６−（ｊ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｋ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号５０）により表され、式中、
（ｘ）および（ｚ）は、独立に、非存在であってよく、あるいは例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物；例えば、ポリＡｓｐまたはポリＧｌｕなどの骨／軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列；例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質由来のアミノ酸配列およびその誘導体；例えば、荷電ＰＥＧ分子などの親水性または水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない、腎クリアランスを減少させる部分；ならびに例えば、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、糖、疎水性酸および／またはアミノ酸を含む部分などの合成骨ターゲティング化合物からなる群から選択されてよく、
（ａ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ａ）はＡｒｇであり、
（ｂ）は、Ｃｙｓおよび例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨなどのＣｙｓ６とＰｈｅ７の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルである、ＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つ以上のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１−６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されている（例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロ−フェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない）か、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環を他のアリール基（非限定的な例は１−および２−ナフチルアラニンなどである）またはヘテロアリール基（非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである）で置換することができる、Ｐｈｅ類似体からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｆ）は、上記位置における野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはＡｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＧｌｕを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、１つの実施形態において（ｆ）はＡｒｇでなく、
（ｇ）は、Ｌｅｕ、Ａｓｎおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ａｓｎおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
（ｉ）は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎからなる群から選択され、
（ｊ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ベータ−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ
）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され、
（ｋ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒおよび例えば、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の１〜２２位のいずれかの１つ以上の位置における（１つ以上の）アミノ酸置換を有し得る。１つの実施形態において、Ｇｌｙ１がＡｒｇまたはＧｌｕで置換されている。他の実施形態において、Ｌｙｓ４がＡｒｇで置換されている。他の実施形態において、Ｇｌｙ５がＡｒｇ、ＧｌｎまたはＳｅｒで置換されている。他の実施形態において、Ｇｌｙ１５がＳｅｒ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＣｉｔで置換されている。さらなる実施形態において、Ｇｌｙ１９がＳｅｒ、ＡｒｇまたはＡｓｎで置換されている。他の実施形態において、Ｇｌｙ２１がＳｅｒ、ＴｈｒまたはＡｒｇで置換されている。
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、
Figure 0005718909
 からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ジスルフィド結合が、Ｃｙｓ６、脱カルボキシＣｙｓまたはＣｙｓ６位における他のスルフヒドリル含有システイン類似体と本明細書で記載するいずれかのＣＮＰ変異体のＣｙｓ２２との間に存在する。
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ１７のＮ末端および／またはＣ末端における
Figure 0005718909
 を含むが、これらに限定されないアミノ酸延長部分を含む。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の４位におけるＫ４Ｒ置換を有する。ＣＮＰ（Ｋ４Ｒ）変異体の非限定的な例としては、
Figure 0005718909
 などがある。
１つの実施形態において、Ｎ末端にＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分およびアミノ酸延長部分を有するＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前の位置にアルギニンを含む。そのようなＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大、血清アルブミンに対する結合の減少およびＣＮＰ機能活性の増大（例えば、ｃＧＭＰシグナリングの活性化）のために設計されている。そのようなＰＥＧ化ＣＮＰ変異体の非限定的な例としては、
Figure 0005718909
 などがあり、ＰＥＯ２４は、単分散性の１．２ｋＤａのＰＥＧポリマーであり、ＰＥＯ１２は、単分散性の０．６ｋＤａのＰＥＧポリマーである。１つの実施形態において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーは、ＣＮＰ変異体のＮ末端に付加されている。
さらなるＣＮＰ変異体は、
Figure 0005718909
 を含むが、これらに限定されない、フューリンプロテアーゼに対するｉｎ ｖｉｖｏでの抵抗性を改善するために設計された、フューリン切断部位（下線部）において変異（複数可）を有し、かつ／またはピログルタミンの生成を妨げるように設計された、グルタミンに先行するグリシン（下線部）を有するＣＮＰ３７の誘導体を含むが、これらに限定されない。
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、
ＧＨＨＳＨＥＱＨＰＨＧＡＮＱＱＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＱ）（ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７６）；
ＧＡＨＨＰＨＥＨＤＴＨＧＡＮＱＱＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＲ）（ＨＲＧＰ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７７）；
ＧＨＨＳＨＥＱＨＰＨＧＡＮＰＲＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＸ）（ＨＲＧＰ断片−ＣＮＰ２２キ
メラ）（配列番号７８）；
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＦ）（ＩｇＧ１（Ｆｃ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７９）；
ＧＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＧＡＮＰＲＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＹ）（ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８０）；
ＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＥ）（ＨＳＡ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８１）；
ＦＧＩＰＭＤＲＩＧＲＮＰＲＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＺ）（オステオクリン「ＮＰＲ Ｃ阻害剤」断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８２）；および
ＧＫＲＴＧＱＹＫＬＧＳＫＴＧＰＧＰＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＤＡ）（ＦＧＦ２「ヘパリン結合ドメイン」断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８３）
を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰ２２およびＮ末端ペプチド断片を含むキメラである。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＫ）（ＩｇＧ１（Ｆｃ）断片−ＣＮ
Ｐ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８４）；
ＧＶＰＱＶＳＴＳＴＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＬ）（ＨＳＡ断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８５）
ＧＱＰＳＳＳＳＱＳＴＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＭ）（フィブロネクチン断片−ＣＮ
Ｐ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８６）；
ＧＱＴＨＳＳＧＴＱＳＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＮ）（フィブリノーゲン断片−ＣＮ
Ｐ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８７）；
ＧＳＴＧＱＷＨＳＥＳＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＯ）（フィブリノーゲン断片−ＣＮ
Ｐ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８８）；およびＧＳＳＳＳＳＳＳＳＳＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＰ）（亜鉛フィンガー断片−ＣＮＰ
２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８９）
を含むが、これらに限定されない、Ｎ末端ペプチド断片およびアルギニンがＣＮＰ２２のＬｙｓ４と置換されているＣＮＰ２２（「ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）」）を含むキメラである。
更に他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰペプチドもしくは変異体、および切断可能なペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドタグを含む、キメラもしくは融合タンパク質である。具体例としての切断可能タンパク質もしくはペプチドは、ヒスチジン（例えば、ヘキサ−Ｈｉｓ）タグ；ＴＡＦ１２：ヒト転写因子ＴＡＦ１２；ＫＳＩ：ケトステロイドイソメラーゼ；ＭＢＰ：マルトース結合タンパク質；β−Ｇａｌ：β−ガラクトシダーゼ；ＧＳＴ：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；Ｔｒｘ：チオレドキシン；ＣＢＤ：キチン結合ドメイン；ＢＭＰＭ：ＢＭＰ−２変異、ＳＵＭＯ、ＣＡＴ、ＴｒｐＥ、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌タンパク質、デンプン結合タンパク質、エンドグルカナーゼＡのセルロース結合ドメイン、エキソグルカナーゼＣｅｘのセルロース結合ドメイン、ビオチン結合ドメイン、ｒｅｃＡ、Ｆｌａｇ、ｃ−Ｍｙｃ、ポリＨｉｓ、ポリＡｒｇ、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｎ、ポリＰｈｅ、ポリＣｙｓ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体エピトープおよびその断片を含むが、これらに限定されない。
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、単量体または二量体であってよい。関連実施形態において、二量体ＣＮＰ変異体の単量体は、リンカーを介して、またはリンカーなしにＮ末端をＮ末端に、リンカーを介して、またはリンカーなしにＮ末端をＣ末端に、あるいはリンカーを介して、またはリンカーなしにＣ末端をＣ末端に結合させることができる。
ＩｇＧおよびＣＮＰ２２またはその変異体を含むキメラは、とりわけ、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増大および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。ＨＳＡの表面断片を含むＣＮＰキメラは、とりわけ、免疫原性の減少および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。陽イオン性、ヒスチジンリッチ、非リシン、非アルギニンである配列をＮ末端に含むＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２およびＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラは、とりわけ、プロテアーゼに対する安定性の増大のために設計されている。オステオクリン断片を含むキメラは、プロテアーゼ（例えば、フューリン）切断により、オステオクリン断片を骨成長板において放出し、そこで該断片がクリアランス受容体ＮＰＲ−Ｃを阻害するように計画されている。ＦＧＦ２ヘパリン結合断片を含むキメラに関しては、断片に結合したヘパリンは、キメラを分解から保護し、それにより、より長い血清半減期を与えるように計画されている。フィブロネクチン、フィブリノーゲンまたは亜鉛フィンガー断片を含むキメラは、他の有利な特徴の中で特に、血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。
理論に束縛されるものではないが、ｗｔＣＮＰ２２と比較してＮＥＰ分解に対する高い抵抗性または改善された機能性（例えば、ＮＰＲ−Ｂへの結合およびｃＧＭＰシグナリングの刺激）を有する約２．６ｋＤａもしくは２．８ｋＤａ〜約６もしくは７ｋＤａの分子量のＣＮＰ変異体は、血清アルブミンなどの血漿タンパク質に強固に結合しなければ、より有効である可能性がある。血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン）に強固に結合しないＣＮＰ変異体は、軟骨を通して拡散し、骨成長板の軟骨細胞に到達し、ＮＰＲ−Ｂに結合し、ｃＧＭＰシグナリングのためにそれを活性化するのにより有効である可能性がある。１つの実施形態において、血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン）に対する結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはその変異体およびＩｇＧのペプチド断片を含むキメラである。他の実施形態において、血漿タンパク質に対する結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）およびポリペプチド（例えば、ＩｇＧ、ＨＳＡ、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド等）の断片を含むキメラである。他の実施形態において、血漿タンパク質に対する結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、親水性または水溶性ポリマーに結合したＣＮＰ２２またはその変異体を含む。１つの実施形態において、親水性または水溶性ポリマーは、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。他の実施形態において、親水性または水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、例えば、カルボキシル、硫酸もしくはリン酸基、またはその組合せなどの生理的条件下でポリマーに負電荷を与える１つ以上の官能基により官能基化されている。
本明細書で開示する実施形態のいずれかにおいて、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ２２と実質的に同じまたはそれより良好な生物学的活性を有する可能性がある。例えば、ＣＮＰ変異体は、例えば、ｃＧＭＰの産生を刺激するためのＮＰＲ−Ｂ（ＧＣ−Ｂ）との相互作用に関して、野生型ＣＮＰ２２の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を保持する可能性があり、あるいは、ＣＮＰ２２より大きい活性を有する可能性がある。あるいは、またはさらに、ＣＮＰ変異体は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞分化、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼ／ＭＥＫ（Ｒａｆ−１）キナーゼシグナリング経路の阻害、および軟骨内骨化の促進を含むが、これらに限定されない、軟骨内骨成長および軟骨細胞活性の調節に関して、野生型ＣＮＰ２２の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を保持する可能性があり、あるいは、ＣＮＰ２２より大きい活性を有する可能性がある。本明細書で開示する実施形態のいずれかにおいて、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ２２のアミノ酸６〜２２または１〜２２と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を含む可能性がある。
さらなる実施形態において、本発明は、ＮＰＲ−Ｂに結合し、それを活性化する能力を保持すると同時に、ＮＰＲ−Ｃクリアランス受容体に対するより低い親和性を有するＣＮＰ２２の変異体を提供する。本発明は、詳細な説明で記載するようなＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰ複合体の相同性に基づく構造モデルから生成させた、または生成させることができる変異体を含む。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＮＰＲ−Ｃと比べてＮＰＲ−Ｂに対する結合に関するそれらの特異性を増大させる可能性がある、立体配座の柔軟性を減少させるための１、５、８、１５、１９および２１位における１つ以上のＧｌｙ部位における置換を有する。ＮＰＲ−Ｃに対する潜在的に低い親和性を有するＣＮＰの変異体は、次の置換の１つ以上を有するものを含むが、それらに限定されない：Ｇ１Ｒ、Ｇ１Ｅ、Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｑ、Ｇ５Ｓ、Ｆ７Ｙ、Ｇ８Ｔ、Ｇ８Ｓ、Ｇ８Ｖ、Ｇ８Ｎ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ｋ１０Ｃｉｔ、Ｋ１０Ｑ、Ｋ１０Ｓ、Ｉ１４Ｎ、Ｇ１５Ｒ、Ｇ１５Ｓ、Ｇ１５Ｎ、Ｇ１５Ｃｉｔ、Ｓ１６Ｑ、Ｍ１７Ｖ、Ｍ１７Ｎ、Ｇ１９Ｓ、Ｇ１９Ｒ、Ｇ１９Ｎ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２０Ｓ、Ｇ２１Ｓ、Ｇ２１ＴおよびＧ２１Ｒ。
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、５、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１９、２０および２１位の１つ以上における改変および／または置換を有し、また本明細書で開示した他の位置のいずれかにおける改変および／または置換を必要に応じて有していてよい。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、例えば、骨／軟骨ターゲティングを促進し、腎クリアランスを減少させ、かつ／またはＮＥＰ分解に対する抵抗性を増大させるためにＮおよび／またはＣ末端に（１つ以上の）結合部分または（１つ以上の）延長部分を必要に応じて有していてよい。そのような（１つ以上の）結合部分または（１つ以上の）延長部分は、例えば、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｕ、骨もしくは軟骨ターゲティングペプチド、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質、ＰＥＧｓ、糖、疎水性酸、ＮＰＰＣもしくは非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド、またはその組合せから形成される、または由来する分子または配列を含んでいてよい。
さらに他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、標準的な固相ペプチド合成法により調製し、適切な場合、天然もしくは非天然アミノ酸（複数可）またはペプチド模倣体（複数可）で置換し、かつ／または付加する。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、例えば、タグまたはキャリアタンパク質を含む融合タンパク質を経る組換え合成法により作製する。この場合、タグまたはキャリアタンパク質を用いることにより、例えば、融合タンパク質の検出、単離および／または精製が促進され、融合タンパク質からのタグまたはキャリアタンパク質の選択的な化学的またはタンパク質分解切断により、標的ＣＮＰ変異体が得られる。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体のＰＥＧ化は、化学もしくは生物学的合成の後に、またはその一部で起こり、該結合反応は、ＮＨＳベースのもしくはアルデヒドベースの化学反応、または当技術分野で公知の他の化学反応により行わせる。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ジスルフィド結合を含む。関連実施形態において、ジスルフィド結合は、環状ペプチドを形成する。特定の実施形態において、ジスルフィド結合は、ＣＮＰ２２の６および２２位に対応する位置におけるシステイン残基の間に形成される。
ＣＮＰ変異体を、例えば、ヘプタン酸、ペンタン酸または脂肪酸などの疎水性ポリマーまたは非ポリマー部分に結合させることができることがさらに意図される。疎水性部分は、リシン、セリン、トレオニンを含むが、これらに限定されないアミノ酸残基の側鎖に結合させることができ、あるいは、ＣＮＰ変異体のＮ末端および／またはＣ末端に結合させることができる。
１つの実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、約８〜約１０．５または約８．５〜約１０の範囲のｐＩを有する。
さらなる実施形態において、本開示は、ＣＮＰ変異体を、他の生物学的に活性な作用物質を必要に応じて、および薬学的に許容される賦形剤、キャリアまたは希釈剤を必要に応じて含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、該組成物は、非経口注射に適する滅菌の医薬組成物である。いくつかの実施形態において、該組成物は、例えば、少なくとも約９０％または９５％純粋な、実質的に純粋なＣＮＰ変異体を含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、他のヒトタンパク質、ブタタンパク質またはＣＮＰ５３もしくはその断片（所望のＣＮＰ変異体以外）などの約５％、４％、３％、２％、１％または０．５％未満の夾雑物を含む。特定の実施形態において、該滅菌組成物は、本明細書で開示するＣＮＰ反応性の状態または障害のいずれかを治療または予防のために被験体に投与する。
本開示のＣＮＰ変異体は、有利なことにＣＮＰ活性を保持し、血清半減期の延長を示す。ＣＮＰ活性の保持は、例えば、所望のｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的作用の保持、または同じ濃度（例えば、１ｕＭのＣＮＰペプチドまたはＥＤ８０を超える）のもとでＣＮＰ２２のｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは少なくとも約１００％の保持として示すことができる。いくつかの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２と比較して血清半減期の少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍または４０倍の延長を示す。
関連実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ２２と比較して高いＮＥＰ抵抗性および長い半減期を示す。１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体の半減期は、野生型ＣＮＰ２２と比較して約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％長い。
特定の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃＧＭＰ産生を増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏでのｃＧＭＰ産生を増加させ、軟骨もしくは骨の形成もしくは成長に関連する１つ以上のバイオマーカーのレベルをｉｎ ｖｉｖｏで増加させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＥＰ切断に対する抵抗性を増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏでの血漿もしくは血清半減期を延長させ、ｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的利用能を増加させ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの特定の骨の長さを増加させ、あるいは野生型ＣＮＰ２２と比較して約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、もしくは約５倍、またはそれを超えるそのような増加の組合せをもたらす。
他の実施形態において、本開示は、治療上有効な量のＣＮＰ変異体または前述のものを含む組成物をそれを必要とする被験体に投与することを含む、ＣＮＰに反応性を示す状態または障害を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＣＮＰに反応性を示す障害は、骨格異形成症および線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）変異に伴う障害などの遺伝的骨格奇形を含むが、これらに限定されない骨成長の障害である。特定の実施形態において、（１つ以上の）ＦＧＦＲ−３変異に伴う障害は、軟骨無形成症である。他の実施形態において、ＣＮＰに反応性を示す障害は、血管平滑筋細胞および組織に関連する障害である。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、骨（例えば、肢骨）の成長板のサイズを増加させるのに有用である。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、骨を延長または長骨の成長を増大させるのに有用である。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、軟骨細胞のマトリックス産生、増殖および分化を増大させるのに有用である。
特定の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、約５もしくは１０ｎｍｏｌ／ｋｇから約３００ｎｍｏｌ／ｋｇまで、または約２０ｎｍｏｌ／ｋｇから約２００ｎｍｏｌ／ｋｇまでの範囲の用量で投与する。いくつかの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０もしくは２０００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量または担当医が適切と考える他の用量で投与する。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０もしくは８００ｕｇ／ｋｇもしくは約１ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇの用量または担当医が適切と考える他の用量で投与する。本明細書で記載するＣＮＰ変異体の用量は、毎日、週２または３回、週１回、２週間ごと、３週間ごと、月１回などを含む、本明細書で記載する投薬頻度／投与の頻度に従って投与することができる。
他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、単一治療または複数用量で投与する。複数用量は、毎日、または治療過程にわたって複数用量で投与することができる。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、単一用量でまたは複数用量で、毎日、２日ごと、３日ごと、週２回、週３回、週１回、２週間ごと、３週間ごと、月１回、６週間ごと、２ヵ月ごと、３ヵ月ごともしくは担当医が適切と考えるように投与することが意図される。
特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体の投与は、成長（例えば、軟骨形成）の期間と続く回復期間（例えば、骨形成）を考慮に入れて調節する。例えば、ＣＮＰ変異体は、一定の期間にわたり毎日または１週当たり複数回、皮下、静脈内に、または他の方法により投与し、続いて無治療の期間をおくことができ、次にこのサイクルを繰り返す。いくつかの実施形態において、治療の最初の期間（例えば、毎日または１週当たり複数回のＣＮＰ変異体の投与）は、３日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間である。関連実施形態において、無治療の期間は、３日間、１週間、２週間、３週間または４週間続く。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体の投薬計画は、３日間毎日の後３日間無投与；または１週間にわたり毎日もしくは１週間にわたり１週当たり複数回の後３日間もしくは１週間無投与；または２週間にわたり毎日もしくは２週間にわたり１週当たり複数回の後１もしくは２週間無投与；または３週間にわたり毎日もしくは３週間にわたり１週当たり複数回の後１、２もしくは３週間無投与；または４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２週間にわたり毎日もしくは４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２週間にわたり１週当たり複数回の後１、２、３もしくは４週間無投与である。
さらなる実施形態において、本開示は、ＣＮＰペプチドもしくは変異体を被験体に投与するステップと、被験体における（例えば、被験体からの生物学的試料中の）少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルをモニターするステップとを含み、骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルの増加または低下が被験体におけるＣＮＰペプチドもしくは変異体の治療効果を示す、ＣＮＰ反応性の状態または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、バイオマーカーのレベルが骨もしくは軟骨形成または成長に伴って増加する場合、当バイオマーカーのレベルの増加は、被験体におけるＣＮＰペプチドもしくは変異体の治療効果を示す。他の実施形態において、バイオマーカーのレベルが骨もしくは軟骨形成または成長に伴って低下する場合、当バイオマーカーのレベルの低下は、被験体におけるＣＮＰペプチドもしくは変異体の治療効果を示す。
さらなる実施形態において、治療方法は、ＣＮＰペプチドもしくは変異体の投与の量（もしくは用量）または頻度を調節するステップをさらに含み、
（ｉ）少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルが標的レベルを下回っており、該バイオマーカーのレベルが骨もしくは軟骨形成または成長に伴って増加する場合、ＣＮＰペプチドもしくは変異体の投与の量（もしくは用量）または頻度を増加させる；あるいは
（ｉｉ）少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルが標的レベルを上回っており、該バイオマーカーのレベルが骨もしくは軟骨形成または成長に伴って増加する場合、ＣＮＰペプチドもしくは変異体の投与の量（もしくは用量）または頻度を減少させる；あるいは
（ｉｉｉ）少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルが標的レベルを上回っており、該バイオマーカーのレベルが骨もしくは軟骨形成または成長に伴って低下する場合、ＣＮＰペプチドもしくは変異体の投与の量（もしくは用量）または頻度を増加させる；あるいは
（ｉｖ）少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルが標的レベルを下回っており、該バイオマーカーのレベルが骨もしくは軟骨形成または成長に伴って低下する場合、ＣＮＰペプチドもしくは変異体の投与の量（もしくは用量）または頻度を減少させる。
バイオマーカーの標的レベルは、被験体における治療効果および／または障害もしくは状態の症状を軽減もしくは改善する有益な効果に関連するバイオマーカーのレベルもしくはレベルの範囲を指すすることを意図する。特定の実施形態において、標的レベルを上回るまたは下回るバイオマーカーのレベルは、被験体に対して有害であり得る。
他の実施形態において、本開示は、骨もしくは軟骨形成または成長に対するＣＮＰペプチドもしくは変異体の投与の効果を評価する方法を意図する。１つの実施形態において、該方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの骨および軟骨形成および成長に対するＣＮＰペプチドもしくは変異体の効果を評価するためにＣＮＰペプチドもしくは変異体を投与した被験体における少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定することを提供する。関連実施形態において、少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルの増加は、ＣＮＰペプチドもしくは変異体の投与が、骨もしくは軟骨形成または成長に正の効果を有し、骨格異形成症およびＣＮＰ活性の低下に関連する他の骨または軟骨関連疾患または障害の治療に有用であることを示し得る。具体例としての骨または軟骨関連バイオマーカーは、ＣＮＰ（例えば、内在レベルのＣＮＰ−２２またはＣＮＰ−５３）、ｃＧＭＰ、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、アグリカンコンドロイチン硫酸、ならびにアルカリホスファターゼを含むが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、本開示は、ＣＮＰペプチドもしくは変異体を投与した被験体からの生物学的試料中の骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定するステップを含む、被験体における少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルに対するＣＮＰペプチドもしくは変異体の効果を評価する方法を意図する。いくつかの実施形態において、該方法は、骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定する前にＣＮＰペプチドもしくは変異体を被験体に投与するステップをさらに含む。
特定の実施形態において、該少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーは、ＣＮＰ（例えば、内在レベルのＣＮＰ−２２またはＣＮＰ−５３）、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、アグリカンコンドロイチン硫酸、ならびにアルカリホスファターゼからなる群から選択される。
骨または軟骨関連バイオマーカーに関連する方法（例えば、治療、診断およびアッセイ方法）のいくつかの実施形態において、ＣＮＰペプチドもしくは変異体は、ＣＮＰ−２２、ＣＮＰ−５３または本明細書で記載するＣＮＰペプチドもしくは変異体のいずれかである。そのような方法の特定の実施形態において、ＣＮＰペプチドもしくは変異体は、ＣＮＰ−２２でもＣＮＰ−５３でもない。
他の実施形態において、本開示は、切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結された、ＣＮＰ変異体ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現をもたらす条件下で培地中で培養するステップを含む、ＣＮＰ変異体の組換え産生の方法を提供する。関連実施形態において、宿主細胞を、切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結された、ＣＮＰ変異体ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換する。
１つの実施形態において、該ベクターは、プラスミドである。さらに他の実施形態において、プラスミドは、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＥＴ−３１ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−３２ａ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ、ｐＱＥ−３０、ｐＥＴ−ＳＵＭＯ、ｐＥＴ−２２ｂおよびｐＴＹＢ１１からなる群から選択される。
特定の実施形態において、切断可能なペプチドもしくはタンパク質は、ヒスチジンタグ、ヒト転写因子ＴＡＦ１２、ケトステロイドイソメラーゼ、マルトース結合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、キチン結合ドメインおよびＢＭＰ−２変異またはその断片からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
関連実施形態において、切断可能なペプチドもしくはタンパク質は、切断剤により切断する。いくつかの実施形態において、切断剤は、ギ酸、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、自己切断型タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｌｆ ｃｌｅａｖａｇｅ）、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ＰｒｏＴＥＶおよびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される。さらなる具体例としての切断剤として、パラジウム、クロストリパイン、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、Ｋｅｘ２プロテアーゼ、ＯｍｐＴプロテアーゼ、ズブチリシン、Ｖ８プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼ、フリリシンプロテアーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ、ヒトＰａｃｅプロテアーゼ、コラゲナーゼ、Ｎｉａプロテアーゼ、ポリオウイルス２Ａｐｒｏプロテアーゼ、ポリオウイルス３Ｃプロテアーゼ、ゲネナーゼ、フューリン、エラスターゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、レンニン（キモシン）、微生物アスパラギン酸プロテアーゼ、パパイン、カルパイン、キモパパイン、フィシン（フィカイン）、ブロメライン（ブロメラーゼ）、カテスピシンＢ、カスパーゼ、サーモライシン、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、カリクレインおよびプラスミンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、可溶性タンパク質として、または封入体として発現する。関連実施形態において、本開示は、発現ポリペプチドを宿主細胞または培地から単離することを意図する。さらなる実施形態において、本明細書で記載するように、単離した融合ポリペプチドを切断剤と接触させる。
１つの実施形態において、本開示は、発現ベクターを含む細菌宿主細胞を提供し、前記ベクターは、切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結された、ＣＮＰ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、切断可能なペプチドもしくはタンパク質は、ヒスチジンタグ、ヒト転写因子ＴＡＦ１２、ケトステロイドイソメラーゼ、マルトース結合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、キチン結合ドメインおよびＢＭＰ−２変異またはその断片からなる群から選択される。
他の実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌である。関連実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧｒｏ７、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、Ｃ４１［Ｃ４１（ＤＥ３）とも呼ばれている］、Ｃ４３［Ｃ４３（ＤＥ３）とも呼ばれている］、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＫＲＸおよびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）からなる群から選択される。またさらなる実施形態において、宿主細胞は、上記のようなベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細胞培養の前に該ベクターで形質転換する。
特定の実施形態において、宿主細胞は、ポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現に適する条件下で培地中で培養することが意図される。１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、可溶性タンパク質として、または封入体として発現する。関連実施形態において、発現した融合ポリペプチドを宿主細胞または培地から単離する。また他の実施形態において、本明細書で記載するように、単離した融合ポリペプチドを切断剤と接触させる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
Figure 0005718909
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Figure 0005718909
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からなる群から選択されるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体。
（項目２）
ＣＮＰ変異体および薬学的に許容される賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物。
（項目３）
凍結乾燥製剤である、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記凍結乾燥製剤を、約４から約６までのｐＨを有する緩衝液を含む製剤から調製する、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記緩衝液がクエン酸／クエン酸塩緩衝液または酢酸／酢酸塩緩衝液である、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記凍結乾燥製剤を、等張性調節剤および／または増量剤をさらに含む製剤から調製する、項目４または５に記載の組成物。
（項目７）
前記等張性調節剤および／または前記増量剤がマンニトール、スクロース、ソルビトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記凍結乾燥製剤を、抗酸化剤をさらに含む製剤から調製する、項目４から７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記抗酸化剤がメチオニン、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩の形態、チオグリセロールおよびそれらの組合せからなる群から選択される、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記ＣＮＰ変異体が項目１に記載のＣＮＰ変異体である、項目２から９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
骨関節症、低リン酸血症性くる病、軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、低身長症、骨軟骨異形成症、致死性異形成症、骨形成不全症、軟骨無発生症、点状軟骨異形成症、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨異形成症、弯曲肢異形成症、先天性致死性低リン酸血症、周生期致死型骨形成不全症、短肋骨多指症候群、低軟骨形成症、近節短縮型点状軟骨異形成症、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨形成不全症、捻曲性骨異形成症、先天性大腿骨短縮症、ランガー型中間肢異形成症、ニーバーゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、ラインハルド症候群、先端異骨症、末梢性骨形成不全症、クニースト異形成症、線維軟骨形成、ロバーツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニースト症候群、変容性骨異形成症および脊椎骨端骨幹端異形成症からなる群から選択される骨関連障害または骨格異形成症の治療で使用するための項目１に記載のＣＮＰ変異体または項目２から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１２）
前記骨関連障害または骨格異形成症が軟骨無形成症である、項目１１に記載のＣＮＰ変異体または医薬組成物。
（項目１３）
高血圧、再狭窄、アテローム動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性腎不全および慢性腎不全からなる群から選択される血管平滑筋障害の治療で使用するための項目１に記載のＣＮＰ変異体または項目２から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１４）
切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに連結されたＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該第１および該第２のポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現をもたらす条件下で培地で培養するステップを含み、該融合ポリペプチドが該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に直接的に連結された、またはリンカーを介して該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に間接的に連結された該ＣＮＰ変異体ポリペプチドを含む、ＣＮＰ変異体の組換え産生の方法。
（項目１５）
前記宿主細胞が、前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする前記第２のポリヌクレオチドに連結された前記ＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする前記第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換されている、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導ベクターを用いて、前記融合ポリペプチドをコードする前記第１および前記第２のポリヌクレオチドの発現を増大させる、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
前記宿主細胞を約０．４ｍＭ〜約１．５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で約２０℃〜約４０℃の温度で一定の期間培養する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ベクターがプラスミドである、項目１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記プラスミドがｐＪｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＥＴ−２２ｂ、ｐＥＴ−３１ｂ、ｐＥＴ−３２ａ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＱＥ−３０、ｐＥＴ−ＳＵＭＯおよびｐＴＹＢ１１からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質がヒスチジンタグ、ヒト転写因子ＴＡＦ１２、ＴＡＦ１２断片、ＴＡＦ１２ヒストン折りたたみドメイン、ＴＡＦ１２の突然変異体およびその断片、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ）、ＴＡＦ１２（Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（１０Ｄ／１０Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）、ケトステロイドイソメラーゼ、マルトース結合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、キチン結合ドメイン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２突然変異体、ＢＭＰ−２（Ｃ／Ａ）ならびにそれらの突然変異体および断片からなる群から選択される、項目１４から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質がヒト転写因子ＴＡＦ１２、ＴＡＦ１２断片、ＴＡＦ１２ヒストン折りたたみドメイン、ＴＡＦ１２の突然変異体およびその断片、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ）、ＴＡＦ１２（Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（１０Ｄ／１０Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）およびＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質が切断剤により切断される、項目１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記切断剤がギ酸、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、自己切断タンパク質、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ＰｒｏＴＥＶおよびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記宿主細胞が細菌宿主細胞である、項目１４から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記細菌宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧｒｏ７、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＫＲＸおよびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）からなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＢＬ２１（ＤＥ３）である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記融合ポリペプチドを可溶性タンパク質または封入体として発現させる、項目１４から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記発現した融合ポリペプチドを前記宿主細胞または培地から単離するステップをさらに含む、項目１４から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記単離した融合ポリペプチドを、ギ酸、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、自己切断タンパク質、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ＰｒｏＴＥＶおよびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される切断剤と接触させるステップをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記切断剤がギ酸である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記単離した融合ポリペプチドを切断剤と接触させる前記ステップを約１％〜約１０％ギ酸の存在下で約５０℃〜約７０℃の温度で行う、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
ギ酸の存在下で接触させる前記ステップを約５時間から約３６時間の期間にわたり行う、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
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からなる群から選択されるＣＮＰ変異体を産生させる、項目１４から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
ＣＮＰ−２２またはＣＮＰ−５３を産生しない、項目１４から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
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からなる群から選択される、項目１４から３３のいずれか一項に記載の方法により産生されるＣＮＰ変異体。
（項目３７）
切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに連結されたＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目３８）
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質がヒスチジンタグ、ヒト転写因子ＴＡＦ１２、ＴＡＦ１２断片、ＴＡＦ１２ヒストン折りたたみドメイン、ＴＡＦ１２の突然変異体およびその断片、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ）、ＴＡＦ１２（Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（１０Ｄ／１０Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）、ケトステロイドイソメラーゼ、マルトース結合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、キチン結合ドメイン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２突然変異体、ＢＭＰ−２（Ｃ／Ａ）ならびにそれらの突然変異体および断片からなる群から選択される、項目３７に記載の宿主細胞。
（項目３９）
前記宿主細胞が細菌宿主細胞である、項目３７または３８に記載の宿主細胞。
（項目４０）
前記細菌宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目３９に記載の宿主細胞。
（項目４１）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧｒｏ７、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＫＲＸおよびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）からなる群から選択される、項目４０に記載の宿主細胞。
（項目４２）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＢＬ２１（ＤＥ３）である、項目４１に記載の宿主細胞。
（項目４３）
前記ベクターがプラスミドである、項目３７から４２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目４４）
前記プラスミドがｐＪｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＥＴ−２２ｂ、ｐＥＴ−３１ｂ、ｐＥＴ−３２ａ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＱＥ−３０、ｐＥＴ−ＳＵＭＯおよびｐＴＹＢ１１からなる群から選択される、項目４３に記載の宿主細胞。
（項目４５）
細胞培養前に前記ベクターで形質転換される、項目３７から４４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目４６）
前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質に直接的に連結された、またはリンカーを介して該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に間接的に連結された前記ＣＮＰ変異体ポリペプチドを含み、前記第１および前記第２のポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現に適する条件下で培地中で培養される、項目３７から４５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目４７）
前記融合ポリペプチドが可溶性タンパク質または封入体として発現される、項目４６に記載の宿主細胞。
（項目４８）
前記宿主細胞または培地から前記発現した融合ポリペプチドが単離される、項目４６または４７に記載の宿主細胞。
（項目４９）
前記単離した融合ポリペプチドが、ギ酸、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、自己切断タンパク質、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ＰｒｏＴＥＶおよびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される切断剤と接触される、項目４８に記載の宿主細胞。
（項目５０）
前記ＣＮＰ変異体ポリペプチドがＣＮＰ−２２でもＣＮＰ−５３でもない、項目３７から４９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目５１）
ＣＮＰペプチドまたは変異体が投与されている被験体からの生物学的試料中の少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイするステップを含む、被験体における少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルに対するＣＮＰペプチドまたは変異体の効果を評価する方法。
（項目５２）
前記少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイする前に前記ＣＮＰペプチドまたは変異体を前記被験体に投与するステップをさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
ＣＮＰ反応性の状態もしくは障害を治療する方法であって、
ＣＮＰペプチドまたは変異体を被験体に投与するステップと、
該被験体における少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルをモニターするステップとを含み、
該少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルの増加が該被験体または該状態もしくは障害に対する該ＣＮＰペプチドまたは変異体の治療効果を示す、方法。
（項目５４）
前記ＣＮＰペプチドまたは変異体の投与の量または頻度を調節するステップをさらに含み、
ｉ）前記少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルが標的レベルを下回っている場合、前記ＣＮＰペプチドまたは変異体の投与の量または頻度を増加させ、
ｉｉ）該少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルが標的レベルを上回っている場合、該ＣＮＰペプチドまたは変異体の投与の量または頻度を減少させる、
項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーがＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、アグリカンコンドロイチン硫酸ならびにアルカリホスファターゼからなる群から選択される、項目５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記ＣＮＰペプチドまたは変異体が
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からなる群から選択される、項目５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記ＣＮＰペプチドまたは変異体がＣＮＰ−２２でもＣＮＰ−５３でもない、項目５６に記載の方法。
図１は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＮＰ融合タンパク質の発現を示す図である（図１Ａ：クマシーブルー染色、図１Ｂ：ウェスタンブロット）。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｔ：全細胞溶解物；Ｓ：可溶性上清；Ｐ：２ｕｇのＣＮＰ２２；ＫＳＩ：ＫＳＩ−ＣＮＰ（Ｍ／Ｎ）融合タンパク質の発現（不溶性）；Ｎ：非誘導性ＫＳＩ−ＣＮＰ融合タンパク質全溶解物；ＫＳＩ’：ＫＳＩ−Ｐ−ＣＮＰ融合タンパク質の発現（不溶性）；Ｔｒｘ：Ｔｒｘ−Ｐ−ＣＮＰ融合タンパク質の発現（可溶性）；ＭＢＰ：ＭＢＰ−Ｐ−ＣＮＰ融合タンパク質の発現（可溶性）；ＴＡＦ：ＴＡＦ−Ｐ−ＣＮＰ融合タンパク質の発現（不溶性）（ＢＬ２１）；ＴＡＦ’：ＣＮＰがＧｌｙ−ＣＮＰ３７の場合、ＴＡＦ−Ｐ−ＣＮＰ融合タンパク質の発現（不溶性）ＢＬ２１（ＤＥ３）。 図２は、ＴＡＦ−ＣＮＰ封入体のギ酸切断を示す図である。Ｍ：タンパク質マーカー；１：Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７陽性対照；２：未切断ＴＡＦ−ＣＮＰ封入体；３：ＣＮＰがＧｌｙ−ＣＮＰ３７の場合、２％ギ酸により切断されたＴＡＦ−ＣＮＰ封入体。 図３Ａ〜Ｅは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＮＰ融合タンパク質の発現を表す図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｔｕ：全非誘導性細胞溶解物；Ｓｕ：非誘導性可溶性上清；Ｔ：全誘導性細胞溶解物；Ｓ：可溶性上清；Ｃｌ：ＣＮＰ２２；Ｃ：Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）；Ｐ：不溶性ペレット。Ａ：ＫＳＩ：ＫＳＩ−ＣＮＰ３８（Ｍ／Ｎ）融合タンパク質の発現（不溶性）；ＫＳＩ’：ＫＳＩ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７は「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」と呼ばれる）融合タンパク質の発現（不溶性）；Ｔｒｘ：Ｔｒｘ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合発現（可溶性）；ＭＢＰ：ＭＢＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の発現（可溶性）；ＴＡＦ：ＢＬ２１細胞からのＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の発現（不溶性）；ＴＡＦ’：ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からのＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の発現（不溶性）。Ｂ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７およびＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７融合タンパク質の発現。Ｃ：ＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質およびＢＭＰタンパク質の発現。Ｄ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＨＳＡ−ＣＮＰ（Ｐｒｏ−ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７）（配列番号１８８）は「Ｐｒｏ−ＨＳＡ−ＣＮＰ」と呼ばれる）融合タンパク質の発現。Ｅ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質およびＴＡＦタンパク質の発現。 図３Ａ〜Ｅは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＮＰ融合タンパク質の発現を表す図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｔｕ：全非誘導性細胞溶解物；Ｓｕ：非誘導性可溶性上清；Ｔ：全誘導性細胞溶解物；Ｓ：可溶性上清；Ｃｌ：ＣＮＰ２２；Ｃ：Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）；Ｐ：不溶性ペレット。Ａ：ＫＳＩ：ＫＳＩ−ＣＮＰ３８（Ｍ／Ｎ）融合タンパク質の発現（不溶性）；ＫＳＩ’：ＫＳＩ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７は「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」と呼ばれる）融合タンパク質の発現（不溶性）；Ｔｒｘ：Ｔｒｘ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合発現（可溶性）；ＭＢＰ：ＭＢＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の発現（可溶性）；ＴＡＦ：ＢＬ２１細胞からのＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の発現（不溶性）；ＴＡＦ’：ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からのＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の発現（不溶性）。Ｂ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７およびＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７融合タンパク質の発現。Ｃ：ＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質およびＢＭＰタンパク質の発現。Ｄ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＨＳＡ−ＣＮＰ（Ｐｒｏ−ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７）（配列番号１８８）は「Ｐｒｏ−ＨＳＡ−ＣＮＰ」と呼ばれる）融合タンパク質の発現。Ｅ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質およびＴＡＦタンパク質の発現。 図４Ａ〜Ｃは、ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体のギ酸切断を表す図である。Ａ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体の５０％ギ酸切断。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｕ：未切断ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体；２５℃、３７℃、４２℃、５５℃、：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体は、５０％ギ酸中で２５℃、３７℃、４２℃または５５℃において２４時間切断された。３７℃−Ｓおよび５５℃−Ｓ：１０ＮのＮａＯＨを用いて中和され、１４，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離された、３７℃および５５℃における切断反応による可溶性上清。Ｂ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体の１０％および２％ギ酸切断。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｕ：未切断ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体；Ｃ：ギ酸により切断されたＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８；Ｓ：中和せずに１４，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離された後の可溶性上清；Ｐ：中和せずに１４，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離された後の不溶性ペレット。Ｃ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体から２％および１０％ギ酸により切断された産物のＬＣ／ＭＳ分析。 図５Ａ〜Ｃは、様々な温度および時間におけるギ酸切断のＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体のギ酸切断を表す図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｃ：Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）陽性対照；Ｕ：未切断ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体。Ａ：４２℃、５５℃または７０℃において６、２４または４８時間、２％ギ酸により切断されたＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８。Ｂ：５５℃、６０℃、６５℃または７０℃において１７または２４時間２％ギ酸により切断されたＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８。Ｃ：ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体から２％ギ酸により切断された産物のＬＣ／ＭＳ分析。 図６は、ＴＡＦ−ＣＮＰ３４融合タンパク質の発現についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色）の図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｃ：対照［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）］；Ｔ：全細胞溶解物；Ｓ：上清；ＴＩ：誘導された全細胞溶解物；ＳＩ：誘導された上清。 図７は、「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」がＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を意味する、融合タンパク質のＴＡＦ−ＮＬ−（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８、ＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ５３の発現に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色）の図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｃ：対照［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）］；Ｔ：全細胞溶解物；ＴＩ：誘導された全細胞溶解物；Ｓ：上清；ＳＩ：誘導された上清。 図８は、融合タンパク質のＴＡＦ−ＣＮＰ３４およびＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ５３のギ酸切断の産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色）の図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｐ：陽性対照［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）］；Ｕ：未切断；Ｃ：切断；ＣＳ：切断上清；ＣＰ：切断ペレット。 図９は、ＴＡＦ−ＣＮＰ３４のギ酸切断後のＣＮＰ−３４のピークを示すＬＣ／ＭＳクロマトグラムの図である。 図１０は、ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ５３のギ酸切断後のＰｒｏ−ＣＮＰ５３のピークを示すＬＣ／ＭＳクロマトグラムの図である。 図１１は、「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」がＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を意味する、融合タンパク質のＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＴＡＦ（４Ｄ／４Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の発現についての、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色）の図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｃ：対照［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）］；Ｔ：全細胞溶解物；ＴＩ：誘導された全細胞溶解物；Ｓ：上清；ＳＩ：誘導された上清。 図１２は、「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」がＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を意味する、融合タンパク質のＴＡＦ（４Ｄ／４Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８ギ酸切断の産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色）の図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｐ：陽性対照［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）］；Ｕ：未切断；Ｃ：切断；ＣＳ：切断上清；ＣＰ：切断ペレット。 図１３は、「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」がＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を意味する、融合タンパク質のＴＡＦ−ＮＬ−（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８のギ酸切断の産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色）の図である。Ｍ：タンパク質マーカー；Ｐ：陽性対照［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）］；Ｕ：未切断；Ｃ：切断；ＣＳ：切断上清；ＣＰ：切断ペレット。 図１４は、細胞がＯＤ６００＝６４に、および１７時間目に誘導され、「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」がＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を意味する場合、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の１０Ｌの発酵において産生される、ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の抗ＣＮＰ抗体を使用するウェスタンブロットの図である。 図１５は、より粗なＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）産物の、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換カラムクロマトグラフィー溶出液画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色）の図である。Ａ：水中ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体（ＩＢ）；Ｂ：ギ酸塩中ＩＢ；Ｃ：中和された、ギ酸塩中ＩＢ；Ｄ：中和されたペレット；Ｅ：中和された上清；Ｆ：ＴＭＡＥ Ｈｉ−ＣＡＰロード；Ｇ：ＴＭＡＥ Ｈｉ−ＣＡＰ通過画分／ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅロード；Ｈ：ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ通過画分；ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液画分１〜４７：１０ｕＬ／レーン。 図１６は、Ｎ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ２２結合の、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏの耐性の程度を示す図である。 図１７は、Ｎ末端にアミノ酸の伸長を有するＣＮＰ変異体［「ＣＮＰ２７」はＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）である］のＮＥＰ耐性の程度を表す図である。 図１８は、Ｎ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ１７およびＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７」）（配列番号３６）のＮＥＰ耐性の程度を例示する図である。 図１９は、ｗｔＣＮＰ２２ならびにＣＮＰ変異体のＧｌｙ−ＣＮＰ３７、ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（図中「ＣＮＰ２７−ＨＳＡ」）（配列番号１４４）およびＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（図中「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ１２」）（配列番号３６）のＮＥＰ耐性の程度を例示する図である。 図２０は、Ｎ末端にアミノ酸の伸長を有するＣＮＰ変異体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＩＨ３Ｔ３においてｃＧＭＰ産生を刺激する能力を示す図である。結果は、１ｕＭのＣＮＰ２２存在下で産生されたｃＧＭＰのレベルに比例する。「ＣＮＰ２７」はＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）である。 図２１は、Ｎ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ１７およびＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７」）（配列番号３６）の、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてｃＧＭＰ産生を刺激する能力を表示する図である。 図２２は、ｃＧＭＰ産生に対するＣＮＰ２２のＮ末端ＰＥＧ化の効果を例示する図である。 図２３は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてｗｔＣＮＰ２２ならびにＣＮＰ変異体のＧｌｙ−ＣＮＰ３７、ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（「ＣＮＰ２７−ＨＳＡ」）（配列番号１４４）、ｗｔＣＮＰ２９およびＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ１２」）（配列番号３６）によって誘導された、ｃＧＭＰ産生を例示する図である。 図２４ＡおよびＢは、ＣＮＰ−２２およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）が同様の用量反応曲線を有し、ＮＰＲ−Ａを介するよりもはるかに高い程度にＮＰＲ−Ｂを介してｃＧＭＰの産生を刺激し、ｉｎ ｖｉｔｒｏのシグナル伝達競合アッセイにおいてＮＰＲ−Ｂ対ＮＰＲ−Ｃの選択性に関して同様のプロファイルを示したことを示す図である。 図２５は、ラット軟骨肉腫細胞を、１日１回１時間または１日１回２時間、ＣＮＰ２２に曝露することが、ＦＧＦ２誘導性の軟骨細胞成長停止の逆転においてＣＮＰ２２への連続曝露と実質的に同様の有効性を有することを実証する図である。 図２６ＡおよびＢは、ＦＧＦ２により停止されたラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞に対する、ＣＮＰ２２効果の用量反応研究からの結果を示す図である。 図２７Ａ〜Ｄは、３５Ｓ−硫酸塩および３Ｈ−Ｐｒｏのマトリックスへの組み込みまたはマトリックスからの減少によって評価されるように、ＣＮＰ２２を、ＦＧＦ２により停止されたＲＣＳ細胞に加えることによりマトリックスの合成が増加され、ＦＧＦ２が一部阻害されることを示す図である。パネルＡおよびＣ、合成；ＢおよびＤ、分解；ＡおよびＢ、３５Ｓの測定；ＣおよびＤ、３Ｈの測定。統計的有意差は強調されている（ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。 図２８Ａ〜Ｃは、ＦＧＦ２およびＣＮＰ２２と一緒に培養されたＲＣＳ細胞における、アグリカンおよびフィブロネクチンの産生レベル（ｍＲＮＡ、パネルＡおよびＣおよびタンパク質、パネルＢ）を示す図である。 図２９は、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（図中「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ２４」）（配列番号３６）の、ｅｘ ｖｉｖｏのマウス器官モデルにおける野生型大腿骨の縦成長（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ）の刺激についての有効性を示す図である。 図３０は、２日ごとにＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置された２〜３日齢の野生型マウスの脛骨の、骨の縦成長を示す図である。結果は、処置前（０日目）の測定値に対して正規化される。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８）として表される。 図３１は、２日ごとにＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置された２〜３日齢の軟骨発育不全のＦＧＦＲ３ａｃｈマウス脛骨の、骨の縦成長を示す図である。結果は、処置前（０日目）の測定値に対して正規化される。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝７〜８）として表される。 図３２は、２日ごとにＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置された２〜３日齢の野生型マウス大腿骨の、骨の縦成長を示す図である。結果は、処置前（０日目）の測定値に対して正規化される。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８）として表される。 図３３は、２日ごとにＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置された２〜３日齢のＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの大腿骨の、骨の縦成長を示す図である。結果は、処置前（０日目）の測定値に対して正規化される。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３〜７）として表される。 図３４Ａ〜Ｉは、ｅｘ ｖｉｖｏで２日ごとに処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの大腿骨におけるＣＮＰ３７の生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を表す図である。パネルＡ〜Ｃは大腿骨遠位における分布を例示し、パネルＤ〜Ｆは関節軟骨細胞における分布を例示し、パネルＧ〜Ｉは、肥大軟骨細胞における分布を例示する。 図３５Ａ〜Ｃは、野生型およびＦＧＦＲ３ａｃｈマウス大腿骨を、２日ごとに８日間、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ３７を用いて処置した後の、成長板における増殖列（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）の細胞充実性を表す図である。（Ａ）未処置、（Ｂ）処置後の細胞数／カラム、（Ｃ）処置後の形態学的研究。図３５（ｉ）からＣ（ｖｉ）におけるパネルは、図３５Ｂに提示される試料の順番に対応する。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４〜８）として表される。 図３６Ａ〜Ｃは、野生型およびＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの大腿骨を、２日ごとに８日間、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ３７を用いてｅｘ ｖｉｖｏで処置した後の、軟骨細胞肥大を表す図である。（Ａ）未処置、（Ｂ）処置後の細胞サイズ、（Ｃ）処置後の形態学的研究。図３６（ｉ）からＣ（ｖｉ）におけるパネルは、図３６Ｂに提示される試料の順番に対応する。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４〜９）として表される。 図３７Ａ〜Ｉは、ｉｎ ｖｉｖｏで処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウス脛骨におけるＣＮＰ３７の生体内分布を表す図である。パネルＡ〜Ｃは大腿骨遠位における分布を示し、パネルＤ〜Ｆは関節軟骨細胞における分布を例示し、パネルＧ〜Ｉは肥大軟骨細胞における分布を例示する。 図３８Ａ〜Ｃは、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウス脛骨成長板に対するＣＮＰ３７のｉｎ ｖｉｖｏの効果を例示する図である：（Ａ）全成長板の厚み、（Ｂ）増殖域の厚み、および（Ｃ）肥大域の厚み。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝７〜１５）として表される。 図３９は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ２４」）（配列番号３６）を用いてｅｘ ｖｉｖｏで処置された野生型マウス大腿骨由来の、ならし培地におけるｃＧＭＰレベルを示す図である（ｐ＜０．０１）。 図４０は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いてｅｘ ｖｉｖｏで処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウス大腿骨由来の、ならし培地におけるｃＧＭＰレベルを示す図である（ｐ＜０．０１）。 図４１は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いてｅｘ ｖｉｖｏで処置された野生型マウス脛骨由来の、ならし培地におけるｃＧＭＰレベルを表す図である（ｐ＜０．０１）。 図４２は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いてｅｘ ｖｉｖｏで処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウス脛骨由来の、ならし培地におけるｃＧＭＰレベルを表す図である（ｐ＜０．０１）。 図４３は、野生型およびＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの大腿骨を、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）にｅｘ ｖｉｖｏで曝露することにより、ならし培地において切断されたＩＩ型コラーゲンのレベルが増加したことを実証する図である（ｐ＜０．０５）。 図４４は、野生型マウスおよびＦＧＦＲ３Ｙ３６７Ｃマウス（重症の軟骨無形成症のマウスモデル）から単離され、媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）または１ｕＭのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＰｒｏＣＮＰ３８」）を用いて６日間ｅｘ ｖｉｖｏで処置された大腿骨の肥大域を表し、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７処置が成長板における骨成長および拡大をもたらしたことを実証する図である。 図４５は、ラットに静脈内（ｉ．ｖ．）投与されたＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）が、血漿内において、ＣＮＰ２２よりはるかに長い半減期およびはるかに高い生物学的利用能を有することを示す図である。 図４６は、ラットに皮下（ｓ．ｃ．）投与されたＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）が、血漿内において、ＣＮＰ２２よりはるかに長い半減期およびはるかに高い生物学的利用能を有することを例示する図である。 図４７は、ｉ．ｖ．投与されたＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）が、ラットにおいてＣＮＰ２２よりはるかに高いレベルのｃＧＭＰ産生を刺激することを実証する図である。 図４８は、ｓ．ｃ．投与されたＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）およびより少ない程度にＣＮＰ３７が、ラットにおけるｃＧＭＰ産生の刺激においてＣＮＰ２２より実質的に有効であることを示す図である。 図４９は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７またはＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置された野生型マウスの体重測定値を示す図である。 図５０は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７またはＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置された野生型マウスの尾長測定値を示す図である。 図５１は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの処置の、体長に対する効果を例示する図である（ｐ＝０．０２、片側ｔ検定、不等分散）。 図５２は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）の、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける尾長に対する効果を示す図である。 図５３ＡおよびＢは、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）の、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける遠位長骨長（Ａ、尺骨；Ｂ、脛骨）に対する効果を示す図である（ｐ＜０．０１、片側ｔ検定、不等分散）。 図５４ＡおよびＢは、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）の、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける近位骨長（Ａ、上腕骨；Ｂ、大腿骨）に対する効果を示す図である（ｐ＜０．０１、片側ｔ検定、不等分散）。 図５５は、ＣＮＰ３７の投与により、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおいて観察される大腿骨：脛骨の比によって評価される、近節短縮（ｒｈｉｚｏｍｅｌｉａ）（近位肢の長さの不均衡）が矯正される図である（ｐ＜０．０１、片側ｔ検定、不等分散）。 図５６は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）の、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける頭長に対する効果を示す図である（ｐ＜０．０１、片側ｔ検定、不等分散）。 図５７は、ＣＮＰ３７を用いたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの処置により、外耳道（ＥＡＭ）のサイズが増加することを示す図である（Ｐ＝０．０３、片側ｔ検定、不等分散）。 図５８は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）の、椎体（例えば、第５腰椎）の伸長として発現される、軟骨無形成症マウスにおける脊髄長に対する効果を示す図である。 図５９は、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの処置により、投薬１５分後のｃＧＭＰ血漿レベルの増加がもたらされることを示す図である。 図６０は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて５週間処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける、切断されたＩＩ型コラーゲンの血清レベルを例示する図である。 図６１は、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて５週間処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける、オステオカルシンの血清レベルを例示する図である。 図６２は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置された野生型マウスからの、投薬１５分後のｃＧＭＰ血漿レベルを示す図である（ｐ＜０．０５）。 図６３は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７またはＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて５週間処置された野生型マウスにおける、切断されたＩＩ型コラーゲンの血清レベルを例示する図である。 図６４〜６６は、野生型マウスに媒体または２０ｎｍｏｌ／ｋｇもしくは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を投与後の、ｃＧＭＰ、切断されたＩＩ型コラーゲンおよびアルカリホスファターゼのレベルを表示する図である。 図６４〜６６は、野生型マウスに媒体または２０ｎｍｏｌ／ｋｇもしくは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を投与後の、ｃＧＭＰ、切断されたＩＩ型コラーゲンおよびアルカリホスファターゼのレベルを表示する図である。 図６４〜６６は、野生型マウスに媒体または２０ｎｍｏｌ／ｋｇもしくは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を投与後の、ｃＧＭＰ、切断されたＩＩ型コラーゲンおよびアルカリホスファターゼのレベルを表示する図である。 図６７および６８は、異なる投薬計画の下で媒体またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を投与後の、切断されたＩＩ型コラーゲンおよび全アルカリホスファターゼのレベルを表す図である。 図６７および６８は、異なる投薬計画の下で媒体またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を投与後の、切断されたＩＩ型コラーゲンおよび全アルカリホスファターゼのレベルを表す図である。 図６９は、２つの別々の研究（Ｓ１およびＳ２）における、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）および媒体により処置された動物の体長における、３７日目対１日目の相対的増加を例示する図である。 図７０ＡおよびＢは、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）の投与後の、骨無機質密度（Ａ）および骨無機質量（Ｂ）の変化を示す図である。 図７１は、３６日目のＣＮＰ変異体の最終皮下投薬１５分後の血漿ｃＧＭＰレベルを示す図であり、図７１から７３において、Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７は「ＣＮＰ３８」であり、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７は「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」であり、ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（配列番号１４４）は「ＨＳＡ−ＣＮＰ２７」である。 図７２は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７またはＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ＣＮＰ２７（配列番号１４４）を用いて処置されたマウスからの、切断されたＩＩ型コラーゲンの血清レベルを示す図である。 図７３は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７またはＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ＣＮＰ２７（配列番号１４４）を用いて処置されたマウスからの、アルカリホスファターゼの血清レベルを示す図である。 図７４ＡおよびＢは、１ｕＭのＧｌｙ−ＣＮＰ３７を用いた（Ａ）急性処置後または（Ｂ）慢性処置後のｃＧＭＰ反応の脱感作を表す図である。 図７５Ａは、８日間の、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を用いた野生型マウスの毎日の治療が、ｃＧＭＰ反応を脱感作しなかったことを実証する図である。図７５Ｂは、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を用いた一日１回連続２日間のマウスの処置が、ｃＧＭＰ反応を高めることを示す図である。 図７６Ａ〜Ｄは、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧｌｙ−ＣＮＰ３７を用いた野生型マウスの処置により、大腿骨遠位（軟骨および骨）（Ａ）、大腿皮質（骨）（Ｂ）、耳介（軟骨）（Ｃ）および腎臓（Ｄ）においてｃＧＭＰの分泌が刺激されたことを示す図である。図７６Ｅ〜Ｈは、肝臓（Ｅ）、心臓（Ｆ）、肺（Ｇ）および脳（Ｈ）の組織が、研究した時点では媒体対照と比較してＧｌｙ−ＣＮＰ３７に反応して感知可能なｃＧＭＰ分泌を示さなかったことを示す図である。 図７７〜８２は、媒体または１０もしくは３６ｕｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日皮下注射された、正常な若年カニクイザルにおいて継続中の研究の結果を示す図である。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の両方の投与量は、成長板の幅を増加させ（図７７）、左右の脛骨長を増加させ（図７８ＡおよびＢ）、脚長を増加させ（図７９）、腕長を増加させ（図８０）、体長を増加させ（図８１）、アルカリホスファターゼの血清レベルを増加させた（図８２）。 図７７〜８２は、媒体または１０もしくは３６ｕｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日皮下注射された、正常な若年カニクイザルにおいて継続中の研究の結果を示す図である。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の両方の投与量は、成長板の幅を増加させ（図７７）、左右の脛骨長を増加させ（図７８ＡおよびＢ）、脚長を増加させ（図７９）、腕長を増加させ（図８０）、体長を増加させ（図８１）、アルカリホスファターゼの血清レベルを増加させた（図８２）。 図７７〜８２は、媒体または１０もしくは３６ｕｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日皮下注射された、正常な若年カニクイザルにおいて継続中の研究の結果を示す図である。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の両方の投与量は、成長板の幅を増加させ（図７７）、左右の脛骨長を増加させ（図７８ＡおよびＢ）、脚長を増加させ（図７９）、腕長を増加させ（図８０）、体長を増加させ（図８１）、アルカリホスファターゼの血清レベルを増加させた（図８２）。 図７７〜８２は、媒体または１０もしくは３６ｕｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日皮下注射された、正常な若年カニクイザルにおいて継続中の研究の結果を示す図である。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の両方の投与量は、成長板の幅を増加させ（図７７）、左右の脛骨長を増加させ（図７８ＡおよびＢ）、脚長を増加させ（図７９）、腕長を増加させ（図８０）、体長を増加させ（図８１）、アルカリホスファターゼの血清レベルを増加させた（図８２）。 図７７〜８２は、媒体または１０もしくは３６ｕｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日皮下注射された、正常な若年カニクイザルにおいて継続中の研究の結果を示す図である。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の両方の投与量は、成長板の幅を増加させ（図７７）、左右の脛骨長を増加させ（図７８ＡおよびＢ）、脚長を増加させ（図７９）、腕長を増加させ（図８０）、体長を増加させ（図８１）、アルカリホスファターゼの血清レベルを増加させた（図８２）。 図７７〜８２は、媒体または１０もしくは３６ｕｇ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日皮下注射された、正常な若年カニクイザルにおいて継続中の研究の結果を示す図である。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の両方の投与量は、成長板の幅を増加させ（図７７）、左右の脛骨長を増加させ（図７８ＡおよびＢ）、脚長を増加させ（図７９）、腕長を増加させ（図８０）、体長を増加させ（図８１）、アルカリホスファターゼの血清レベルを増加させた（図８２）。 図８３は、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の形成に関するｐＨ３〜８および５℃、２５℃および４０℃における分解速度定数（Ｋｏｂｓ）対ｐＨの観察プロットを表す図である。
本開示は、ＮＥＰおよび／またはＮＰＲ−Ｃに対する低い親和性、ＮＥＰによる切断および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対する低い感受性を有するＣＮＰの新規な変異体、そのようなＣＮＰ変異体を含む医薬組成物、ならびに軟骨無形成症などの骨関連障害および血管平滑筋細胞および組織に関連する障害を含むが、これらに限定されない、ＣＮＰに反応性を示す障害を治療するためにそのようなＣＮＰ変異体を使用する方法に関する。
Ａ．定義
特に断らない限り、本明細書および特許請求の範囲を含む本願書で用いる以下の用語は、下に示す定義を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いているように、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、文脈上他の状態が明確でない限り、複数ならびに単数の言及した事柄を含む。
「約」または「おおよそ」という用語は、値を測定または求める方法に一部依存する、当業者が測定する個々の値の許容できる誤差を意味する。特定の実施形態において、「約」または「おおよそ」という用語は、１、２、３または４標準偏差以内を意味する。特定の実施形態において、「約」または「おおよそ」という用語は、所定の値または範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．０５％以内を意味する。「約」または「おおよそ」という用語が２つ以上の数値の一組の最初の数値に先行する場合には、「約」または「おおよそ」という用語は、その組の数値のそれぞれ１つずつに適用されることが理解される。
「環境温度」および「室温」という用語は、本明細書では同義で用い、周囲環境（例えば、反応を行わせる、または組成物を保存する部屋）の温度を意味する。特定の実施形態において、環境温度または室温は、約１５℃から約２８℃まで、または約１５℃から約２５℃まで、または約２０℃から約２８℃まで、または約２０℃から約２５℃まで、または約２２℃から２８℃まで、または約２２℃から約２５℃までの範囲にある。他の実施形態において、環境温度または室温は、約１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃または２８℃である。
標準的な化学用語の定義は、ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ＡおよびＢ巻（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）を含む参考図書に見いだすことができる。本開示の実施は、特に示さない限り、当該分野の技術の範囲内の合成有機化学、質量分析、分取および分析用クロマトグラフィー、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術ならびに薬理学の特定の従来の方法を用いるものであり得る。例えば、Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、１９９３年）；Ａ． Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．、第４版、２００４年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ． ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋ’ａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）を参照のこと。
本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、上か下かにかかわりなく、それらの全体として参照により組み込まれている。
以下のアミノ酸の略語を本文を通して用いる。
Figure 0005718909
 「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合またはペプチド結合イソスターにより結合した、アミノ酸残基からなるポリマー、関連する天然に存在する変異体およびその合成非天然類似体を意味する。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、生成物の最小の長さに限定されない。「タンパク質」という用語は、一般的に大きいポリペプチドを意味する。「ペプチド」という用語は、一般的に短いポリペプチドを意味する。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などは、当定義に含まれる。全長タンパク質およびその断片は、当定義に含まれる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質の発現後改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本開示の目的のために、「ポリペプチド」は、天然配列への欠失、付加、置換（本質的に保存的であってよく、あるいはヒトタンパク質に一般的に存在する２０アミノ酸のいずれか、または他の天然もしくは非天然もしくは非定型アミノ酸による置換を含んでいてよい）および化学改変（例えば、ペプチド模倣体の付加またはそれによる置換）を含み得る。これらの改変は、部位特異的変異誘発または化学構成成分を除去もしくは結合させるためのアミノ酸の化学改変によるような意図的なものであったり、あるいはタンパク質を産生する宿主により生ずる変異またはＰＣＲ増幅による過誤によるような偶発的なものであり得る。
ポリペプチド配列を示すために本明細書では従来の表記法を用い、ポリペプチド配列の左端は、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端は、カルボキシル末端である。
「保存的置換」は、機能的、構造的または化学的に類似な天然または非天然アミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を意味する。１つの実施形態において、以下の群は、それぞれ互いに保存的置換である天然アミノ酸を含む。
（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
他の実施形態において、以下の群は、それぞれ互いに保存的置換である天然アミノ酸を含む。
（１）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；および
（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）。
他の実施形態において、アミノ酸は、下に示すように分類することができる。
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）主鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
１つの実施形態において、本明細書で記載するペプチドまたはポリペプチドは、ＣＮＰ変異体をエンコードするポリヌクレオチドを用いて組換え手段により生成させる。したがって、本発明は、本明細書で記載するＣＮＰ変異体のいずれかをエンコードするポリヌクレオチド、発現制御配列に必要に応じて連結された、そのようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞またはベクター、および本開示のＣＮＰ変異体を生成させるためのそのようなポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を用いる方法を含む。そのようなポリヌクレオチドにより発現されるＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ変異体をエンコードするポリヌクレオチドの発現に適する条件下で培地中で宿主細胞を増殖させる段階、および発現産物を宿主または培地から分離する段階を含む方法により産生させることができる。実際の発現産物は、翻訳後処理によってエンコードされたタンパク質産物とわずかに異なる可能性がある。
「ポリヌクレオチド」は、核酸単位により構成されているポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）などの天然に存在する核酸ならびに核酸類似体を含む。「核酸」という用語は、一般的に大きいポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的に約５０ヌクレオチド以下の短いポリヌクレオチドを一般的に意味する。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）により表す場合、ヌクレオチド配列は、「Ｔ」を「Ｕ」で置換したＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことは理解される。「ｃＤＮＡ」は、一本鎖または二本鎖形のｍＲＮＡと相補的または同一であるＤＮＡを意味する。
「発現制御配列」は、それに作用できるように連結されるヌクレオチド配列の発現を調節するヌクレオチド配列を意味する。「作用できるように連結される」は、１つの部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が他の部分に対する作用（例えば、配列の転写）をもたらす、２つの部分の間の機能上の関係を意味する。発現制御配列は、例えば、かつ制限なしに、プロモーター（例えば、誘導または構成）、エンハンサー、転写ターミネータ、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナルおよび停止コドンを含み得る。
「組換えポリヌクレオチド」は、天然では結合しない配列を有するポリヌクレオチドを意味する。増幅または集合組換えポリヌクレオチドを適切なベクターに含めることができ、ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換することができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。次いで、遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させて、例えば、「組換えポリペプチド」を産生させる。組換えポリヌクレオチドは、非コーディング機能（例えば、プロモーター、複製の起点、リボソーム結合部位等）も果たすことができる。
「キメラ」は、本明細書で用いているように、当技術分野で一般的に公知の技術、例えば、組換え発現または化学的架橋を用いて直接的または間接的に結合または連結させた少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列（すなわち、異なる源由来または天然に存在する配列として互いに関連していない）を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。１つの実施形態において、異種配列は、ＣＮＰペプチドもしくは変異体から切断することができるタンパク質もしくはペプチドを含む、ＣＮＰペプチドもしくは変異体に直接的または間接的に連結させたタンパク質もしくはペプチドを含み得る。関連実施形態において、ＣＮＰ変異体は、本明細書で記載するようなキメラである。
特定の実施形態において、キメラは、切断可能なキャリアタンパク質もしくはペプチドタグを含むＣＮＰ融合タンパク質を含む。「切断可能なキャリアタンパク質」または「切断可能なペプチドタグ」という用語は、異種ポリペプチド配列に直接的に、またはリンカーを介して間接的に融合させることができ、異種ポリペプチドもしくはタンパク質から切断可能なペプチドもしくはポリペプチドを切断または分離する剤を用いて異種配列から除去できるペプチドもしくはポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態において、切断可能なキャリアタンパク質もしくはペプチドタグは、融合タンパク質または異種ポリペプチドの生成、精製および／または検出を改善する。具体例としての切断可能なキャリアタンパク質およびペプチドタグは、ヒト転写因子ＴＡＦ１２（ＴＡＦ１２）、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、ＢＭＰ−２変異（ＢＭＰＭ）、ＳＵＭＯ、ＣＡＴ、ＴｒｐＥ、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌タンパク質、デンプン結合タンパク質、エンドグルカナーゼＡのセルロース結合ドメイン、エキソグルカナーゼＣｅｘのセルロース結合ドメイン、ビオチン結合ドメイン、ｒｅｃＡ、Ｆｌａｇ、ｃ−Ｍｙｃ、ポリＨｉｓ、ポリＡｒｇ、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｎ、ポリＰｈｅ、ポリＣｙｓ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体エピトープおよびその断片を含むが、これらに限定されない。
「切断剤」は、例えば、切断可能なペプチドもしくはポリペプチドを異種ポリペプチドもしくはタンパク質から切断または分離するのに有用な剤である。具体例としての切断剤は、パラジウム、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ギ酸、ヒドロキシルアミン、クロストリパイン、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）、Ｋｅｘ２プロテアーゼ、ＯｍｐＴプロテアーゼ、Ｘａ因子プロテアーゼ、ズブチリシン、プロＴＥＶ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼ、フリリシンプロテアーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ、ヒトＰａｃｅプロテアーゼ、コラゲナーゼ、Ｎｉａプロテアーゼ、ポリオウイルス２Ａｐｒｏプロテアーゼ、ポリオウイルス３Ｃプロテアーゼ、ゲネナーゼ、フューリン、エラスターゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、レンニン（キモシン）、微生物アスパラギン酸プロテアーゼ、パパイン、カルパイン、キモパパイン、フィシン（フィカイン）、ブロメライン（ブロメラーゼ）、カテスピシンＢ、カスパーゼ、サーモライシン、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、カリクレインおよびプラスミンを含むが、これらに限定されない。
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における「同一」または「同一性」の割合という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定した、または目視検査により、最大の一致について比較し、アライメントしたときに、同じである、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の指定の割合を有する２つ以上の配列もしくは部分配列を意味する。
２つの核酸またはポリペプチドにおける「実質的に相同」または「実質的に同一」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定した、または目視検査により、最大の一致について比較し、アライメントしたときに、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列もしくは部分配列を一般的に意味する。特定の実施形態において、実質的な相同性または同一性は、長さが少なくとも約２５、５０、１００または１５０残基である配列の領域にわたって存在する。他の実施形態において、配列は、いずれかまたは両比較生体高分子の全長にわたって実質的に相同または同一である。
配列の比較の場合、一般的に１つの配列が、試験配列を比較する参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要な場合に部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。配列比較アルゴリズムは、次に、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して（１つ以上の）試験配列の配列同一性の割合を計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２巻、４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁（１９７０年）の相同性アライメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、または目視検査により行うことができる。有用なアルゴリズムの１例は、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、３５巻、３５１〜３６０（１９８７年）の漸進的アライメント法の簡略化を用いるＰＩＬＥＵＰであり、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻、１５１〜１５３頁（１９８９年）により記載された方法と類似している。配列の多重アライメントを発生させるのに有用な他のアルゴリズムは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻、４６７３〜４６８０頁（１９９４年））である。配列同一性の割合および配列類似性を測定するのに適するアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜４１０頁（１９９０年）；ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻、１０９１５頁（１９８９年）；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻、５８７３〜５７８７頁（１９９３年））。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公式に入手可能である。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に相同または同一であるというさらなる徴候は、第１の核酸によりエンコードされるポリペプチドが、下で記載するように、第２の核酸によりエンコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみが異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと一般的に実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという他の徴候は、２つの分子が、下で記載するように、緊縮条件下で互いにハイブリッド形成することである。
「実質的に純粋な」または「分離された」は、対象となる種が存在する優勢な種である（すなわち、モル基準で、組成物中の他の個々の巨大分子種より豊富である）ことであり、実質的に精製された画分は、対象となる種が存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む、組成物である。１つの実施形態において、実質的に純粋な組成物は、問題とする種がモルまたは重量基準で組成物中に存在する巨大分子種の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上を含むことを意味する。組成物が単一巨大分子種から本質的になっている場合、対象となる種は、本質的な均質性になるまで精製されている（混入物種が従来の検出方法により組成物中に検出することができない）。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定化剤（例えば、ＢＳＡ）および元素イオン種は、この定義の目的のために巨大分子種とみなされない。１つの実施形態において、本開示の化合物は、実質的に純粋または分離されている。他の実施形態において、本発明の化合物は、それらの産生に用いられる巨大分子出発物質に関して実質的に純粋または分離されている。他の実施形態において、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、キャリアまたは希釈剤、および必要に応じて、他の生物学的に活性な物質と混合された実質的に純粋または分離されたＣＮＰ変異体を含む。
物体に適用される「天然に存在する」は、物体を天然で見いだすことができることを意味する。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、実験室で人間により意図的に改変されなかったポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。１つの実施形態において、「天然に存在する」物質は、ヒト由来のものである。
「野生型」（ｗｔ）は、種におけるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列を含む、天然形態を意味する用語である。野生型形態は、（１つ以上の）遺伝的変異により生ずるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の変異型と区別される。
１つの実施形態において、第２のポリペプチドの「類似体」または「変異体」または「誘導体」である第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドとの少なくとも約５０％、６０％または７０％の配列相同性を有するが、１００％未満の配列相同性を有するポリペプチドである。そのような類似体、変異体または誘導体は、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミンおよびノルバリンを制限なしに含む天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸残基により構成されていてよい。そのような類似体、変異体または誘導体は、１つ以上のＤ−アミノ酸残基により構成されていてもよく、またペプチド模倣体または２つもしくはそれ以上のアミノ酸もしくはペプチド模倣体残基間の非ペプチド結合などのペプチド結合イソスターを含んでいてもよい。他の実施形態において、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドの公知の切断生成物でなく、または第２のポリペプチドの公知の前駆体でない場合、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと１００％の配列相同性を有するか、または野生型配列を有していたとしても、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドの「類似体」または「変異体」または「誘導体」である。
１つの実施形態において、「に由来する」という用語は、本明細書で用いているように、野生型または天然に存在するポリペプチドまたはペプチド配列に基づき、１つ以上の欠失、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチド模倣体による付加および／または置換を有していてよい、ポリペプチドまたはペプチド配列を意味する。１つの実施形態において、誘導体配列は、野生型または天然に存在する配列と少なくとも約４０％、５０％、６０％または７０％の、しかし１００％未満の配列類似性を共有している。他の実施形態において、誘導体は、ポリペプチドの断片であってよく、断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸の長さにわたって野生型ポリペプチドと実質的に相同である（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％相同）。他の実施形態において、ポリペプチドが野生型ポリペプチドに存在しない、それに結合した部分（例えばＰＥＧなどの、例えばポリマー）を直接的に、または間接的に有する場合、両ポリペプチドがそれらのアミノ酸配列における１００％の相同性を共有しているとしても、ポリペプチドは、野生型ポリペプチド「に由来」する。
本明細書で用いているように、「ＮＰＰＣ由来」ポリペプチドは、一本鎖１２６アミノ酸プレプロポリペプチドであり、切断により、最終的にｗｔＣＮＰ２２をもたらす、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ（ＮＰＰＣ）ポリペプチドに由来するポリペプチドである。ＮＰＰＣからの単一ペプチドの除去により、プロＣＮＰが生成し、エンドプロテアーゼであるフューリンによるさらなる切断により、活性な５３アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ−５３）が生成し、これが分泌され、未知の酵素により再び切断して、成熟２２アミノ酸ペプチド（ＣＮＰ、またはＣＮＰ−２２）が生成する。したがって、ＣＮＰ２２自体は、ＮＰＰＣに由来することにより、「ＮＰＰＣ由来」ポリペプチドである。１つの実施形態において、ＮＰＰＣ由来ポリペプチドは、同じ数のアミノ酸残基にわたり野生型ＮＰＰＣと少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％相同である。ＮＰＰＣ由来ペプチドは、ＮＰＰＣポリペプチドの約１〜約５３、または１〜３７、または１〜３５、または１〜３１、または１〜２７、または１〜２２、または１０〜３５、または約１５〜約３７残基を含むことがさらに意図される。１つの実施形態において、ＮＰＰＣ由来ポリペプチドは、ＮＰＰＣポリペプチドに由来する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３アミノ酸の配列を含んでいてよい。
「有効な量」という用語は、被験体の健康状態、病状もしくは疾患に関する、または診断目的のための所望の結果をもたらすのに十分な用量を意味する。所望の結果は、用量の受容者における主観的または客観的な改善を含んでいてよい。「治療上有効な量」は、健康に対する意図する有用な効果をもたらすのに有効な薬剤の量を意味する。あらゆる個別の例における適切な「有効な」量は、常法による実験を用いて当業者が決定することができる。個々の患者に対する個別の用量および投与頻度は、異なる可能性があり、用いる個々の化合物の活性；当化合物の生物学的利用能、代謝安定性、排泄速度および作用の持続時間；該化合物の投与の方法および時間；患者の年齢、体重、一般的健康状態、性および食事；ならびに個々の状態の重症度などの様々な因子に依存することは理解されよう。
「治療」は、予防的治療または治療処置または診断的治療を意味する。特定の実施形態において、「治療」は、治療、予防または診断の目的のために被験体に化合物または組成物を投与することを意味する。
「予防的」治療は、健康異常を発現するリスクを低減する目的のために、疾患の徴候を示さない、または疾患の初期の徴候を示す被験体に適用する処置である。本開示の化合物または組成物は、健康異常を発現する可能性を低減するため、または発現した場合に健康異常の重症度を最小限にするために予防処置として投与することができる。
「治療」処置は、健康異常の徴候または症状を示す被験体に対して、それらの徴候または症状を減弱させるまたは消失させる目的のために適用する治療である。徴候または症状は、生化学的、細胞、組織学的、機能的もしくは物理的、主観的または客観的であってよい。本開示の化合物は、治療処置として、または診断のために投与することもできる。
「診断」は、健康異常の状態の存在、程度および／または性質を特定することを意味する。診断方法は、それらの特異性および選択性が異なっている。特定の診断方法は状態の明確な診断を可能にしないことがあるが、該方法が診断の助けとなる陽性徴候を示すならば、十分である。
「骨または軟骨関連バイオマーカー」または「骨または軟骨関連マーカー」は、レベルが、例えば、軟骨代謝回転、軟骨形成、軟骨成長、骨吸収、骨形成、骨成長またはそれらの組合せに関連して増加または低下する成長因子、酵素、タンパク質または他の検出可能な生物学的物質もしくは構成成分を意味する。そのようなバイオマーカーは、本明細書で記載するＣＮＰ変異体の投与前、投与の間および／または投与後に測定することができる。具体例としての骨または軟骨関連バイオマーカーは、ＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、Ｉ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、アグリカンコンドロイチン硫酸、ならびにアルカリホスファターゼを含むが、これらに限定されない。軟骨および骨関連バイオマーカーは、組織、血液、血清、血漿、脳脊髄液、滑膜液および尿を含むが、これらに限定されない適切な生物学的試料で測定することができる。いくつかの実施形態において、該バイオマーカーは、有効性／薬力学的ｉｎ ｖｉｖｏ試験を受けている動物からの血液、血漿もしくは血清で、および／またはｅｘ ｖｉｖｏ試験のならし培地から測定する。
特定の実施形態において、少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルを測定し、測定されたバイオマーカーのレベルに応じて被験体に投与するＣＮＰ変異体の投与の量または頻度を調節することができる。いくつかの実施形態において、バイオマーカーのレベルは、「標的レベルを下回る」または「標的レベルを上回る」。バイオマーカーの標的レベルは、ＣＮＰ変異体の投与を受けている被験体に治療効果が認められるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲である。特定の実施形態において、ＣＮＰ反応性障害もしくは状態を有する被験体におけるバイオマーカーの標的レベルは、正常な非罹患被験体に認められるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲である。他の実施形態において、治療効果を示すためには、バイオマーカーの標的レベルは、正常な被験体に認められるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲と同等である必要はないが、「正常」レベルまたは非罹患被験体に認められるバイオマーカーのレベルの範囲の例えば、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％以内であってよい。
例えば、バイオマーカーのレベルが骨もしくは軟骨形成または成長に関連して増加する場合、治療効果を示すバイオマーカーの標的レベルは、ＣＮＰ変異体を投与しなかったＣＮＰ反応性障害に罹患している患者におけるバイオマーカーのレベルより高い可能性があり、当障害に罹患していない被験体におけるバイオマーカーの「正常」レベル（複数可）より低い、ほぼ「正常」レベル（複数可）である、または「正常」レベル（複数可）より高いことが場合によってあり得る。１つの実施形態において、バイオマーカーのレベルが標的レベルを下回っている場合、それは、投与されるＣＮＰ変異体の投与の量または頻度の増加を必要とし得る、不十分な治療効果を示す。関連実施形態において、バイオマーカーが標的レベルを上回っている場合、それは、投与されるＣＮＰ変異体の投与の量または頻度の減少を必要とし得る、必要より多くのＣＮＰ変異体が投与されたことを示す。
他の例として、バイオマーカーのレベルが骨もしくは軟骨形成または成長に関連して低下する場合、治療効果を示すバイオマーカーの標的レベルは、ＣＮＰ変異体を投与しなかったＣＮＰ反応性障害に罹患している患者におけるバイオマーカーのレベルより低い可能性があり、当障害に罹患していない被験体におけるバイオマーカーの「正常」レベル（複数可）より高い、ほぼ「正常」レベル（複数可）である、または「正常」レベル（複数可）より低いことが場合によってあり得る。そのような場合、ＣＮＰ変異体の投与の量および頻度の上の調節の逆のことが当てはまる可能性がある。
「医薬組成物」は、ヒトおよび哺乳動物を含む被験体動物における薬学的用途に適する組成物を意味する。医薬組成物は、治療上有効な量のＣＮＰ変異体、必要に応じて他の生物学的に活性な物質、および必要に応じて薬学的に許容される賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含む。１つの実施形態において、医薬組成物は、（１つ以上の）有効成分およびキャリアを構成する（１つ以上の）不活性成分、ならびに２つ以上の成分の組合せ、錯体形成または凝集により、あるいは１つ以上の成分の解離により、あるいは１つ以上の成分の他の種類の反応または相互作用により、直接または間接的に生ずる生成物を含む。したがって、本開示の医薬組成物は、本開示の化合物と薬学的に許容される賦形剤、キャリアまたは希釈剤とを混合することにより調製されるあらゆる組成物を含む。
「薬学的に許容されるキャリア」は、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロースの５％水溶液および乳剤（例えば、油／水または水／油型乳剤）などの標準的な医薬用キャリア、緩衝剤などのいずれかを意味する。賦形剤の非限定的な例は、アジュバント、結合剤、増量剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、流動促進剤、甘味剤、香味剤および着色剤などである。適切な医薬用キャリア、賦形剤および希釈剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、１９９５年）に記載されている。好ましい医薬用キャリアは、活性薬の投与方法に依存する。一般的な投与方法は、経腸（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内注射；または局所、経皮または経粘膜投与）などである。
「薬学的に許容される塩」は、金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）およびアンモニアもしくは有機アミンの塩を含むが、これらに限定されない、医薬用の複合物に製剤化することができる塩である。
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、生物学的に、または他の点で望ましくない物質を意味する。すなわち、該物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、あるいはそれが含まれる組成物の成分のいずれかと、または個体の身体上または体内に存在するいずれかの成分と有害な様態で相互作用することなく、個体に投与することができる。
「単位剤形」という用語は、各単位が、あらかじめ定められた量の計算された本開示の化合物を所望の効果をもたらすのに十分な量で、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリアまたは媒体と共に含む、ヒトおよび動物被験体用の単位用量として適する物理的に不連続な単位を意味する。本開示の新規な単位剤形の仕様は、用いられる個々の化合物、達成されるべき効果、および宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
「生理的条件」は、動物（例えば、ヒト）の体内の条件を意味する。生理的条件は、体温ならびに生理的イオン強度、ｐＨおよび酵素の水性環境を含むが、これらに限定されない。生理的条件はまた、大多数の被験体に存在する「正常な」条件と異なる、例えば、約３７℃の正常なヒト体温と異なる、または約７．４の正常なヒト血液ｐＨと異なる特定の被験体の体内の条件を含む。
「生理的ｐＨ」または「生理的範囲内のｐＨ」は、約７．０〜８．０（７．０と８．０を含む）の範囲、より一般的には約７．２〜７．６（７．２と７．６を含む）の範囲のｐＨを意味する。
本明細書で用いているように、「被験体」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を含む。哺乳動物の例は、哺乳類綱のメンバー：ヒト、チンパンジーなどのヒト以外の霊長類、および他の無尾サルおよびサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物；ウサギ、イヌおよびネコなどの家畜；ラット、マウスおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などを含むが、これらに限定されない。非哺乳動物の例は、鳥、魚などを含むが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性を表さない。
「ポリエチレングリコール」、「ＰＥＧ」、「ポリエチレンオキシド」および「ＰＥＯ」という用語は、特に示さない限り、本明細書では同義で用いる。数ｎに関連する「ＰＥＯｎ」ポリマーにアミノ基を介して結合したＣＮＰペプチド（ＣＮＰ２２またはその変異体）は、一般的に式ＣＨ３−［−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−］ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＲを有し、ｎは、エチレンオキシド単位の数であり、Ｒは、ペプチドの残りを表す。「ＰＥＯｎ」ポリマーは、アルキレン基（ＣＨ２）ｍを必要に応じて有していてよく、ｍは、カルボニル炭素と反復エチレンオキシド単位との間の１〜５の整数である。そのような「ＰＥＯｎ」（例えば、ＰＥＯ１２またはＰＥＯ２４）ポリマーは、単分散性、すなわち、特定の分子量の単一の分離した分子である。同様に、数ｎＫに関連する「ＰＥＧｎＫ」ポリマーにアミノ基を介して結合したＣＮＰペプチドは、一般的に式ＣＨ３−［−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−］ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＲを有し、ｐは、１より大きい整数である。「ＰＥＧｎＫ」ポリマーもアルキレン基（ＣＨ２）ｍを必要に応じて有していてよく、ｍは、カルボニル炭素と反復エチレンオキシド単位との間の１〜５の整数である。しかし、そのような「ＰＥＧｎＫ」（例えば、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ５ＫまたはＰＥＧ２０Ｋ）ポリマーは、多分散性、すなわち、分子量の分布を有するポリマーの混合物を含み、数ｎＫは、キロダルトン単位のポリマー数平均分子量（Ｍｎ）を表す。例えば、ＣＮＰペプチドに結合している「ＰＥＧ２Ｋ」は、約２ｋＤａのポリマー数平均分子量を有する多分散性ＰＥＧポリマーである。
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の質量の範囲が与えられている場合（例えば、ｋＤａ単位の）、範囲は、特に示さない限り、ポリマー数平均分子量の範囲を意味するのであって、多分散性混合物中の複数のポリマーの分子量の範囲を意味するものではない。
「ハロゲン」、「ハロゲン化物」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素および／またはヨウ素を意味する。
「アルキル」という用語は、線状または分枝飽和一価炭化水素遊離基を意味し、アルキルは、本明細書で記載するように１つ以上の置換基Ｑで必要に応じて置換されていてよい。特定の実施形態において、アルキルは、１〜２０個（Ｃ１−２０）、１〜１５個（Ｃ１−１５）、１〜１２個（Ｃ１−１２）、１〜１０個（Ｃ１−１０）または１〜６個（Ｃ１−６）の炭素原子を有する線状飽和一価炭化水素遊離基であるか、または３〜２０個（Ｃ３−２０）、３〜１５個（Ｃ３−１５）、３〜１２個（Ｃ３−１２）、３〜１０個（Ｃ３−１０）または３〜６個（Ｃ３−６）の炭素原子を有する分枝飽和一価炭化水素遊離基である。本明細書で用いているように、線状Ｃ１−６および分枝Ｃ３−６アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピルを含むすべての異性体を含む）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含むすべての異性体を含む）、ペンチル（すべての異性体を含む）ならびにヘキシル（すべての異性体を含む）を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｃ１−６アルキルは、１〜６個の炭素原子の線状飽和一価炭化水素遊離基または３〜６個の炭素原子の分枝飽和一価炭化水素遊離基を意味する。
「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル基を意味する。特定の実施形態において、アルコキシ基は、本明細書で記載するように１つ以上の置換基Ｑで必要に応じて置換されていてよい。
「ハロアルキル」という用語は、１つ以上のハロゲン原子で置換されているアルキル基を意味する。特定の実施形態において、ハロアルキル基は、１、２、３，４，５または６個のハロゲン原子で置換されている。特定の実施形態において、ハロアルキル基は、本明細書で記載するように１つ以上のさらなる置換基Ｑで必要に応じて置換されていてよい。
「シクロアルキル」という用語は、本明細書で記載するように１つ以上のさらなる置換基Ｑで必要に応じて置換されていてよい、環状飽和架橋および／または非架橋一価炭化水素遊離基を意味する。特定の実施形態において、シクロアルキルは、３〜２０個（Ｃ３−２０）、３〜１５個（Ｃ３−１５）、３〜１２個（Ｃ３−１２）、３〜１０個（Ｃ３−１０）または３〜７個（Ｃ３−７）の炭素原子を有する。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカリニルおよびアダマンチルを含むが、これらに限定されない。
「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式」という用語は、単環式非芳香環系または１つ以上の非芳香環を含む多環式系を意味し、１つ以上の非芳香環原子は、Ｏ、ＳまたはＮから独立に選択されるヘテロ原子であり、残りの非芳香環原子は、炭素原子である。特定の実施形態において、ヘテロシクリルまたはヘテロ環式基は、３〜２０個、３〜１５個、３〜１０個、３〜８個、４〜７個または５〜６個の環原子を有する。特定の実施形態において、ヘテロシクリルは、縮合または架橋環系を含んでいてよく、窒素または硫黄原子が必要に応じて酸化されていてよく、窒素原子が必要に応じて第四級化されていてよく、一部の環が部分的もしくは完全に飽和されているか、または芳香族であってよい、単環式、二環式、三環式または四環式環系である。ヘテロシクリルは、主構造に、安定な化合物の形成をもたらすヘテロ原子または炭素原子において結合していてよい。ヘテロ環式基の例は、アクリジニル、アゼピニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソオキサジニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾピラニル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオピラニル、ベンゾオキサジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロマニル、クロモニル、シンノリニル、クマリニル、デカヒドロイソキノリニル、ジベンゾフラニル、ジヒドロベンゾイソチアジニル、ジヒドロベンゾイソオキサジニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピラニル、ジオキソラニル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジオキソラニル、１，４−ジチアニル、フラノニル、フラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、イソクロマニル、イソクマリニル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、オキサジアゾリル、オキサゾリジノニル、オキサゾリジニル、オキサゾロピリジニル、オキサゾリル、オキシラニル、ペルイミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノオキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、プテリジニル、プリニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリドピリジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、キノオキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチエニル、テトラゾリル、チアジアゾロピリミジニル、チアジアゾリル、チアモルホリニル、チアゾリジニル、チアゾリル、チエニル、トリアジニル、トリアゾリルおよび１，３，５−トリチアニルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヘテロ環式基は、本明細書で記載するように１つ以上の置換基Ｑで必要に応じて置換されていてよい。
「アリール」という用語は、単環式芳香族基または少なくとも１つの芳香族炭化水素環を含む多環式一価芳香族基を意味する。特定の実施形態において、アリールは、６〜２０個（Ｃ６−２０）、６〜１５個（Ｃ６−１５）または６〜１０個（Ｃ６−１０）の環原子を有する。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アズレニル、アントリル、フェナントリル、ピレニル、ビフェニルおよびテルフェニルを含むが、これらに限定されない。アリールは、二環式または三環式炭素環も意味し、環の少なくとも１つは、芳香族であり、他は、飽和、部分的に不飽和または芳香族、例えば、ジヒドロナフチル、インデニル、インダニルおよびテトラヒドロナフチル（テトラリニル）であってよい。特定の実施形態において、アリール基は、本明細書で記載するように１つ以上の置換基Ｑで必要に応じて置換されていてよい。
「ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１つの芳香環がＯ、ＳおよびＮから独立に選択される１つ以上のヘテロ原子を含む、単環式芳香族基または多環式芳香族基を意味する。ヘテロアリール基の各環は、１つもしくは２個のＯ原子、１つもしくは２個のＳ原子および／または１〜４個のＮ原子を含んでいてよく、ただし、各環におけるヘテロ原子の総数は、４個またはそれ未満であり、各環は、少なくとも１個の炭素原子を含む。ヘテロアリールは、主構造に、安定な化合物の形成をもたらすヘテロ原子または炭素原子において結合していてよい。特定の実施形態において、ヘテロアリールは、５〜２０個、５〜１５個または５〜１０個の環原子を有する。単環式ヘテロアリール基の例は、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニルおよびトリアジニルを含むが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリール基の例は、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロモニル、クマリニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、プリニル、ピロロピリジニル、フロピリジニル、チエノピリジニル、ジヒドロイソインドリルおよびテトラヒドロキノリニルを含むが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリール基の例は、カルバゾリル、ベンゾインドリル、フェナントロリニル、アクリジニル、フェナントリジニルおよびキサンテニルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヘテロアリール基は、本明細書で記載するように１つ以上の置換基Ｑで必要に応じて置換されていてよい。
「必要に応じて置換された」は、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールなどの基が１つ以上の置換基Ｑ（１つの実施形態において、１つ、２つ、３つまたは４つの置換基Ｑ）で置換されていてよいことを意味し、各Ｑは、シアノ、ハロ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリール、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−Ｃ（ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＣ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｅ、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）Ｒｆ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＯＲｆ、−ＮＲｅＣ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＣ（＝ＮＲｈ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）Ｒｆ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２Ｒｆ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）ＮＲｆＲｇ、−ＮＲｅＳ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇ、−ＳＲｅ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｅおよび−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｆＲｇからなる群から独立に選択され、各Ｒｅ、Ｒｆ、ＲｇおよびＲｈは、独立に水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリールもしくはヘテロアリールであり、またはＲｆおよびＲｇは、それらが結合しているＮ原子と一緒になってヘテロシクリルを形成している。
Ｂ．ＣＮＰ変異体
ＣＮＰ２２の治療薬としての使用は、血漿中でのその半減期の短さから限られている（Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．、７８巻：１４２８〜３５頁（１９９４年））。ヒト血漿中で、ＣＮＰ２２の濃度は通常５ピコモル未満である。ＣＮＰ２２は、ヒトにおいてＮＥＰおよびＮＰＲ−Ｃにより分解され、循環から取り除かれる。（ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ ＆ ＩＧＦ Ｒｅｓ．、１６巻：Ｓ６〜Ｓ１４頁）。全身投与されたＣＮＰ２２を使用したすべてのヒトおよび動物の研究において、被験体中のＣＮＰ２２濃度を上昇させるために持続注入が使用されている。長い半減期および少なくとも同様のレベルの機能性を有するＣＮＰペプチドは、ＣＮＰに基づく治療戦略に有益であると思われる。 ＣＮＰ変異体はまた、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０８／８４２７０（具体的に本明細書中に参考として援用される）に開示される。
本開示は、ＮＥＰおよび／またはＮＰＲ−Ｃに対する低い親和性、ならびにＮＥＰによる切断および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対する低い感受性を有するが、野生型ＣＮＰ２２と同様またはより良好な機能性を実質的に有するＣＮＰ変異体を提供する。ＮＥＰによる切断および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対するＣＮＰ変異体の低い感受性は、該変異体の血漿もしくは血清半減期を延長させ、それにより、該変異体が標的組織および部位に分布し、所望の薬理作用を達成する機会を増加させることになる。特定の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２の機能性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％を保持する、またはｗｔＣＮＰ２２より少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍もしくは５倍大きい機能性を有すると同時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＮＥＰによる切断および／またはＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対する、ｗｔＣＮＰ２２と比較して少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍または５倍低い感受性を有し、ｗｔＣＮＰ２２と比較して少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍または５倍長いｉｎ ｖｉｖｏでの血漿もしくは血清半減期を有する。ＣＮＰの機能性は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ試験における軟骨もしくは骨形成または成長に関連する１つ以上のバイオマーカー（例えば、ｃＧＭＰ）のレベル、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ試験における特定の骨の長さなどにより評価することができる。
ＮＥＰの天然基質は低分子であり、ナトリウム利尿ペプチド（約２．２から約３．２ｋＤａ）は最も高分子の天然基質である。Ｘ線結晶解析によれば、ＮＥＰの活性部位は、中心腔内部に深く埋もれており、基質分子のサイズは、約３ｋＤａ以下に効果的に制限される（Ｏｅｆｎｅｒら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９６巻：３４１〜３４９頁（２０００年））。ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達の研究に基づいて、ＣＮＰ−１７（ＣＮＰ２２の環状ドメインのＣｙｓ６〜Ｃｙｓ２２のみを保有する）およびＣＮＰ−５３（Ｎ末端において３１個のアミノ酸延長を有するＣＮＰ−２２）などのＣＮＰ−２２の変異体は、なお２．２ｋＤａのｗｔＣＮＰ−２２と同様にＮＰＲ−Ｂに結合でき、ＮＰＲ−Ｂを活性化できる。したがって、本開示は、ＣＮＰ２２変異体あるいはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端において天然ポリマー（例えばペプチド）および／または合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に結合したＣＮＰ変異体を包含し、これらはＮＥＰ耐性の上昇を示すが、ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達受容体に結合し、活性化する能力を保有している。
一実施形態において、本開示は、一般式：
（ｘ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１３９）、または
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１４０）、
で表されるＣＮＰ変異体を包含し、式中、
（ｘ）および（ｚ）は、本明細書に記載のように、個々に独立して天然ポリマー（例えば、少なくとも１個のアミノ酸を含有するペプチド配列）および／または合成ポリマー（例えばＰＥＧ）であり、ＣＮＰ変異体の総質量が、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする。一実施形態において、残基Ｃｙｓ６からＣｙｓ２２は、環状部分を形成する。ある実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、ＮＰＰＣまたは非ＣＮＰポリペプチド（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＩｇＧなど）に由来するアミノ酸延長を含み、この延長は、１から４０、１から３５、１から３１、５から３５、５から３１または５から１５個のアミノ酸を含有する。別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の以下の位置：Ｇｌｙ１、Ｌｙｓ４、Ｇｌｙ５、Ｃｙｓ６、Ｐｈｅ７、Ｇｌｙ８、Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１６、Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｌｅｕ２０およびＧｌｙ２１の１つ以上に、別の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣体および／またはペプチド結合イソスターによる１つ以上の改変および／または置換を含む。
別の実施形態において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量を有するＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ分解に対する耐性を増加させるために設計され、以下の一般式：
（ｘ）−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１４１）、または
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ｂ）４−Ｇｌｙ５−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９−（ｈ）１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号６）、で表され、式中、
（ｘ）は、合成ポリマーまたは天然ポリマーの基あるいはそれらの組合せであり、合成ポリマー基の限定されない例はＰＥＧ（またはＰＥＯ）であり、天然ポリマー基の限定されない例は、１から３５個のアミノ酸を含有し、置換および／または欠失を有するＮＰＰＣもしくはその変異体に由来するアミノ酸配列、ＡＮＰ、ＢＮＰあるいは他の非ＣＮＰ（ポリ）ペプチド、例えば血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたは線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）である。
（ｚ）は、非存在であってよく、あるいは合成ポリマーまたは天然ポリマーの基あるいはそれらの組合せであってよく、合成ポリマー基の限定されない例はＰＥＧであり、天然ポリマー基の限定されない例は、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＣＮＰ、ＡＮＰまたはＢＮＰ）または非ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧ）に由来するアミノ酸配列であり、
（ｂ）および（ｈ）は、独立して、上記位置で野生型Ｌｙｓであってもよく、あるいは保存的アミノ酸置換により置き換えられていてもよく、あるいは天然または非天然のアミノ酸あるいは限定するものではないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒを含む、側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体であってもよい。一実施形態において、（ｂ）はＡｒｇである。別の実施形態において、ＮＥＰ耐性の改善のために、（ｂ）はＧｌｙではない。さらに別の実施形態において、（ｈ）はＡｒｇではない。
ＮＰＰＣまたはその変異体に由来するアミノ酸配列の限定されない例は、
Figure 0005718909
 を含む。
非ＣＮＰポリペプチド、例えばＡＮＰ、ＢＮＰ、血清アルブミンおよびＩｇＧなどに由来するアミノ酸配列の限定されない例は、
Figure 0005718909
 を含む。
ある実施形態において（ｘ）および／または（ｚ）の基を有する任意のＣＮＰ変異体の、Ｎ末端（ｘ）基および／またはＣ末端（ｚ）基は、本明細書において記載のように、もしあれば、少数の酸性の天然または非天然アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を含有するアミノ酸配列を独立して含む。別の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、ＣＮＰ２２（ｐＩ８．９）のｐＩと同様のアルカリのｐＩを維持するために、塩基性の天然または非天然アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ）に富んでいる。一実施形態において、ＣＮＰ変異体のｐＩは約８から約１０．５の範囲であり、ＣＮＰ変異体が骨成長板の軟骨細胞周辺の細胞外マトリックスを介してより容易に拡散できるように設計される。より狭い範囲の実施形態において、ＣＮＰ変異体のｐＩは約８．５から約１０．５または約８．５から約１０または約９から約１０である。
まだ別の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は極性の天然または非天然アミノ酸に富んでおり、水溶解度を増加するために設計される。さらに別の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、もしあれば、少数の疎水性の天然または非天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔ）を含有する。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体のＮ末端は少なくとも１個のグリシン残基で終結し、血清半減期を増加するために設計される。関連する実施形態において、ピログルタミン酸の形成を防ぐために、ＣＮＰ変異体のＮ末端は、グルタミン酸で終結しない場合、グリシン残基で終結する。一実施形態において、（ｘ）基はＮ末端が少なくとも１個のグリシン残基で終結するアミノ酸の延長を含有する。別の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、２つの隣接する塩基性の天然または非天然アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ−ＬｙｓまたはＡｒｇ−Ａｒｇ）を含有せず、プロテアーゼのフューリンによる切断に対する感受性が減少するように設計される。ある実施形態において、（ｘ）は、ＣＮＰ２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前に２つの隣接する塩基性アミノ酸を含有しない。
さらに別の実施形態において、ＣＮＰ変異体の（ｘ）基および／または（ｚ）基は、ＮＰＰＣに由来するアミノ酸配列（例えば、ＣＮＰ５３由来）を含む。ある実施形態において、（ｘ）は、ＡＮＰまたはＢＮＰのＮ末端テールに由来するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、（ｚ）は、ＡＮＰまたはＢＮＰのＣ末端テールに由来するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、非ナトリウム利尿ポリペプチド、例えば、ＩｇＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、ＦＧＦ−２および骨ターゲティングタンパク質、（例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など）に由来するアミノ酸配列を含む。
ＣＮＰ２２またはその変異体が、Ｎ末端（ｘ）基および／またはＣ末端（ｚ）基を有する、本明細書に記載の任意の実施形態において、（ｘ）および／または（ｚ）は、独立して、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の機能的ドメインに由来するアミノ酸配列を含有することができる。ＢＭＰの機能的ドメインに由来するＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸延長は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とするＣＮＰ変異体の総質量を増加することによって、ＮＥＰ耐性およびしたがってＣＮＰ変異体の血清半減期を増加させることができる。さらに、特定のＢＭＰは、骨および軟骨の形成を誘導する成長因子およびサイトカインであるので、ＢＭＰの機能的ドメインに由来する断片は、ＣＮＰ２２またはその変異体の環状ドメインによりＮＰＲ−Ｂのグアニル酸シクラーゼ機能の活性化とは異なる機序により、軟骨細胞、軟骨または骨の成長を促進できる。骨の形成および発達、軟骨の形成および発達、および／または骨芽細胞分化を促進するＢＭＰの限定されない例は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８ａを含む。ある実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８ａのＣ末端部分の最後の１４０個のアミノ酸に由来するアミノ酸配列と独立して結合する。
一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ１７のＮ末端および／またはＣ末端におけるアミノ酸延長は、限定するものではないが、
Figure 0005718909
 を含む。
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２の４位においてＫ４Ｒ置換を有する。ＣＮＰ（Ｋ４Ｒ）変異体の限定されない例は、
Figure 0005718909
 を含む。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはアミノ酸付加（複数可）、欠失（複数可）および／もしくは置換（複数可）を有するその変異体、ならびにＣＮＰ以外のポリペプチドもしくはタンパク質由来、またはＣＮＰペプチドのＮ末端までの全非ＣＮＰポリペプチドもしくはタンパク質由来のペプチド断片を含むキメラであり、ＣＮＰ２２もしくはその変異体は、１つ以上のアミノ酸残基のＮ末端アミノ酸延長部分を必要に応じて有していてよい。特定の実施形態において、ＣＮＰキメラは、１つ以上のアミノ酸残基のＮ末端アミノ酸延長部分を有するＣＮＰ２２またはその変異体を含む。特定の実施形態において、ＣＮＰキメラは、ＣＮＰ２２（ＣＮＰ２２の場合Ｇｌｙ）またはその変異体の第１位の直前にリシン−リシン（ＫＫ）残基またはＧＡＮＫＫ残基を含む。他の実施形態において、ＣＮＰキメラは、ＣＮＰ２２またはその変異体の第１位の直前にリシン−リシンと異なる１つもしくは２つの残基を含む。ＣＮＰ２２またはその変異体の第１位の直前にあり得る残基の非限定的な例としては、次のものが挙げられる：
Figure 0005718909
 。
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２およびＮ末端ペプチド断片を含むキメラであり、限定するものではないが、
ＧＨＨＳＨＥＱＨＰＨＧＡＮＱＱＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＱ）（ヒスチジンリッチ糖タンパク
質（ＨＲＧＰ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７６）；
ＧＡＨＨＰＨＥＨＤＴＨＧＡＮＱＱＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＲ）（ＨＲＧＰ断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７７）；
ＧＨＨＳＨＥＱＨＰＨＧＡＮＰＲＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＸ）（ＨＲＧＰ断片−ＣＮＰ２２キ
メラ）（配列番号７８）；
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＦ）（ＩｇＧ１（Ｆｃ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号７９）；
ＧＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＧＡＮＰＲＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＹ）（ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８０）；
ＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＥ）（ＨＳＡ断片−ＣＮＰ２２キメ
ラ）（配列番号８１）；
ＦＧＩＰＭＤＲＩＧＲＮＰＲＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＺ）（オステオクリン「ＮＰＲ Ｃ阻害剤」断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８２）；および
ＧＫＲＴＧＱＹＫＬＧＳＫＴＧＰＧＰＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＤＡ）（ＦＧＦ２「ヘパリン結合ドメイン」断片−ＣＮＰ２２キメラ）（配列番号８３）
を含む。
まだ別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端ペプチド断片およびアルギニンがＣＮＰ２２のＬｙｓ４と置換されたＣＮＰ２２（「ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）」）を含むキメラであり、限定するものではないが、
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＫ）（ＩｇＧ１（Ｆｃ）断片−ＣＮ
Ｐ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８４）；
ＧＶＰＱＶＳＴＳＴＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＬ）（ＨＳＡ断片−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８５）；
ＧＱＰＳＳＳＳＱＳＴＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＭ）（フィブロネクチン断片−ＣＮ
Ｐ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８６）；
ＧＱＴＨＳＳＧＴＱＳＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＮ）（フィブリノーゲン断片−ＣＮ
Ｐ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８７）；
ＧＳＴＧＱＷＨＳＥＳＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＯ）（フィブリノーゲン断片−ＣＮ
Ｐ２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８８）；および
ＧＳＳＳＳＳＳＳＳＳＧＡＮＱＱＧＬＳＲＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（類似体ＣＰ）（亜鉛フィンガー断片−ＣＮＰ
２２（Ｋ４Ｒ）キメラ）（配列番号８９）
を含む。
ＩｇＧおよびＣＮＰ２２またはその変異体を含むキメラは、とりわけ、ＮＥＰ分解に対する耐性の増加および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計される。ＨＳＡの表面断片を含むＣＮＰキメラは、とりわけ、免疫原性の減少および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計される。陽イオン性、ヒスチジンリッチ、非リジン、非アルギニンである配列をＮ末端に含有するＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２およびＨＲＧＰ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）のキメラは、とりわけ、プロテアーゼに対する安定性の増加のために設計される。オステオクリン断片を含有するキメラは、プロテアーゼ（例えば、フューリン）による切断に対して、この断片がクリアランス受容体のＮＰＲ−Ｃを阻害すると思われる骨成長板において、オステオクリン断片を放出するために設計される。ＦＧＦ２ヘパリン結合断片を含むキメラに関して、断片に結合するヘパリンは、キメラを分解から保護するために設計され、その結果、より長い血清半減期を提供する。フィブロネクチン、フィブリノーゲンまたは亜鉛フィンガー断片を含有するキメラは、他の特徴に加えて血清アルブミンに対する結合を減少させるために設計される。
理論に縛られることを意図するものではないが、ＮＥＰ分解に対する耐性が増加し、ｗｔＣＮＰ２２と比較して同様または改善された機能性（例えば、ＮＰＲ−Ｂに対する結合およびｃＧＭＰシグナル伝達の刺激）を有する、分子量約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａのＣＮＰ変異体は、血清アルブミンなどの血漿タンパク質と堅く結合しない場合、より有効であり得る。血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン）と堅く結合しないＣＮＰ変異体は、軟骨を介した骨成長板の軟骨細胞に至る拡散およびｃＧＭＰシグナル伝達のためのＮＰＲ−Ｂへの結合および活性化においてより有効であり得る。一実施形態において、血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン）への結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはその変異体およびＩｇＧ由来のペプチド断片を含むキメラである。別の実施形態において、血漿タンパク質との結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）およびポリペプチド（例えば、ＩｇＧ、ＨＳＡ、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチドなど）由来の断片を含むキメラである。まだ別の実施形態において、血漿タンパク質との結合の減少のために設計されたＣＮＰ変異体は、親水性または水溶性のポリマーに結合したＣＮＰ２２またはその変異体を含む。一実施形態において、親水性または水溶性のポリマーはＰＥＧ（またはＰＥＯ）である。別の実施形態において、親水性または水溶性のポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、生理的条件下でポリマーに負の電荷を付与する、１つ以上の官能基、例えばカルボキシル基、硫酸基またはリン酸基あるいはそれらの組合せにより官能化される。
さらなる実施形態において、本開示のＣＮＰ変異体は、ヒトＣＮＰ−１７（ｈＣＮＰ−１７）からヒトＣＮＰ−５３（ｈＣＮＰ−５３）までにおよび、ｈＣＮＰ−５３由来の野生型アミノ酸配列を有する短縮型ＣＮＰペプチドを含む。そのような短縮型ＣＮＰペプチドは、次のものを含む：
Figure 0005718909
Figure 0005718909
Figure 0005718909
 。
特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ−１７、ＣＮＰ−２２およびＣＮＰ−５３を含まない。
他の実施形態において、ｈＣＮＰ−１７からｈＣＮＰ−５３までに及ぶ短縮型ＣＮＰペプチドは、特定の短縮型ＣＮＰペプチドの任意の１つ以上のアミノ酸位置で、本明細書で記載するように、天然もしくは非天然アミノ酸（複数可）またはペプチド模倣体（複数可）（例えば、ペプチド結合イソスター（複数可））によるアミノ酸付加（複数可）、欠失（複数可）および／または置換（複数可）を含み得る。さらに他の実施形態において、野生型配列またはアミノ酸付加（複数可）、欠失（複数可）および／もしくは置換（複数可）を有する短縮型ＣＮＰペプチドは、骨または軟骨ターゲティング部分（例えば、ビスホスフォネート、骨または軟骨ターゲティングペプチド配列（例えば、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｕ）、骨タンパク質（例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質）の骨ターゲティングドメイン由来のペプチド配列、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ）の機能ドメイン由来のペプチド配列、ナトリウム利尿ポリペプチド（例えば、ＮＰＰＣ、ＡＮＰ、ＢＮＰ）由来のペプチド配列、非ナトリウム利尿起源のポリペプチド（例えば、血清アルブミン、ＩｇＧ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、ＦＧＦ−２、オステオクリン）由来のペプチド配列、腎クリアランスを減少させる部分（例えば、負に荷電したＰＥＧ部分）、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、炭水化物（例えば、骨成長板における細胞の表面上の受容体により認識される炭水化物）、疎水性酸（例えば、Ｃ５〜Ｃ１２カルボン酸、天然脂肪酸）、リン脂質およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない、本明細書で述べた部分のいずれかにＮ末端、Ｃ末端および／または内部部位（複数可）において結合させることができる。１つの実施形態において、野生型配列またはアミノ酸付加（複数可）、欠失（複数可）および／もしくは置換（複数可）を有し、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部部位（複数可）における１つ以上の部分に必要に応じて結合されている短縮型ＣＮＰペプチドは、本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量、例えば、約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａまでの総質量を有する。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体はＣＮＰ３７の誘導体であり、これは、ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫ−ＣＮＰ２２（配列番号６０）である。ＣＮＰ３７変異体は、ＣＮＰ３７の３７位のいずれか１つ以上において、アミノ酸の付加、欠失および／または天然または非天然アミノ酸またはペプチド模倣体（例えば、ペプチド結合イソスター）との置換を含有し得る。ＣＮＰ３７において実施され得る置換の限定されない例は、ＣＮＰ２２のナンバリングに基づいて、Ｋ４Ｒ、Ｇ５Ｓ、Ｇ５Ｒ、Ｇ８Ｓ、Ｋ１０Ｒ、Ｇ１５Ｓ、Ｓ１６Ｑ、Ｍ１７Ｎ、Ｇ１９Ｒおよびそれらの組合せを含む。ある実施形態において、ＣＮＰ３７誘導体は、メチオニンの硫黄原子の酸化を避けるために一部設計された、Ｍｅｔ１７と、天然（例えば、アスパラギン）または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を含有する。別の実施形態において、ＣＮＰ３７変異体は、アルブミン結合を減少させるため一部に設計された、（ＣＮＰ３７のＮ末端からのナンバリングに基づいて）Ｌｙｓ８、Ｌｙｓ１０、Ｌｙｓｌ４および／またはＬｙｓ１５と、非塩基性の天然または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を含有する。
さらにまたは代替的には、アミノ酸の付加、欠失、および／または置換のために、ＣＮＰ３７誘導体は、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部部位において、本明細書に記載の任意の部分に結合でき、これらは限定するものではないが、骨または軟骨ターゲティング部分（例えば、骨ターゲティングペプチドドメイン）、腎クリアランスを減少させる部分（例えば、負に荷電したＰＥＧ部分）、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、１つ以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列（例えば、オステオクリン「ＮＰＲ−Ｃ阻害因子」断片）、糖（例えば、骨成長板の細胞表面上の受容体によって認識される糖）、疎水性の酸（例えば、Ｃ５〜Ｃ１２のカルボン酸および天然脂肪酸）およびそれらの組合せを含む。
１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、フューリンプロテアーゼに対するｉｎ ｖｉｖｏ抵抗性を改善するために設計された、フューリン切断部位（下線部）における変異（複数可）／置換（複数可）を有し、かつ／または血漿安定性を改善し、ピログルタミンの生成を妨げるために設計された、Ｎ末端にグリシン（下線部）を含む改変ＣＮＰ３７ペプチドである。そのようなＣＮＰ３７変異体は、以下のものを含むが、それらに限定されない：
Figure 0005718909
 。
さらなる実施形態において、本開示のＣＮＰ変異体は、本明細書で記載する融合タンパク質法により製造することができるＣＮＰペプチドおよびその変異体を含む。化学的切断もしくはタンパク質分解切断または自己切断タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖａｇｅ）を用いて、本明細書で記載する融合タンパク質法により製造することができるＣＮＰ変異体の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：
Figure 0005718909
Figure 0005718909
 。
ｈＣＮＰ−１７からｈＣＮＰ−５３までにおよび、野生型配列またはアミノ酸付加（複数可）、欠失（複数可）および／もしくは置換（複数可）を有する短縮型ＣＮＰペプチドを含む他のＣＮＰ変異体も、融合タンパク質の化学的もしくはタンパク質分解切断の意図される部位が標的ＣＮＰ変異体自体のアミノ酸配列内に存在しない限り、本明細書で記載する融合タンパク質法により製造することができる。非限定的な例として、本明細書で記載する融合タンパク質法は、ギ酸切断を用いて短縮型ｗｔＣＮＰ３４を製造するのに用いることができる。
さらなる実施形態において、アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）残基（複数可）および／またはグルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）残基（複数可）を有する本明細書で記載するＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体のいずれかについて、それらが野生型配列または非天然アミノ酸配列を有するかどうかにかかわりなく、任意のＡｓｎ残基（複数可）および／または任意のＧｌｎ残基（複数可）は、例えばＡｓｎのＧｌｎへの保存的置換を含めて、任意の他の天然もしくは非天然アミノ酸で独立に置換することができる。そのような置換（複数可）は、アスパラギンおよび／またはグルタミンの脱アミド化のいかなる可能性を最小限にするまたは避けるために一部は設計されている。例えばＡｓｎのＧｌｎへの保存的置換を含めて、任意のＡｓｎ残基（複数可）および／または任意のＧｌｎ残基（複数可）を任意の他の天然もしくは非天然アミノ酸で独立に置換することができるＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体の非限定的な例としては、ｗｔＣＮＰ３４、ｗｔＣＮＰ３７、Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７、Ｐｒｏ−ｗｔＣＮＰ３７、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７、ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（配列番号１４４）、Ｐｒｏ−ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（配列番号１８８）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）、およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体のアスパラギン残基は、グルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されていない。特定の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰペプチドおよびＣＮＰ変異体のグルタミン残基は、アスパラギン、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されていない。非限定的な例として、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号１４５）のアスパラギン残基７および／または１５は、アスパラギン残基（複数可）のアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸への脱アミド化のいかなる可能性も避けるために、グルタミンを含む任意の他の天然または非天然アミノ酸で独立に置換することができる。特定の実施形態において、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７のアスパラギン残基７および／または１５は、グルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されていない。
しかし、本開示は、脱アミド化または脱アミド化様反応（例えば、異性化）を受けやすい、いずれか１つ以上（最大ですべて）の残基を、変換される残基につき１００％の変換までのいずれかの程度に脱アミド化または脱アミド化様反応により他の残基（複数可）に変換することができるＣＮＰ変異体を包含する。特定の実施形態において、本開示は、以下のＣＮＰ変異体を包含する：
（１）いずれか１つ以上（最大ですべて）のアスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化によりアスパラギン酸もしくはアスパルテートおよび／またはイソアスパラギン酸もしくはイソアスパルテートに変換することができる；あるいは
（２）いずれか１つ以上（最大ですべて）のグルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化によりグルタミン酸もしくはグルタメートおよび／またはイソグルタミン酸もしくはイソグルタメートに変換することができる；あるいは
（３）いずれか１つ以上（最大ですべて）のアスパラギン酸もしくはアスパルテート（Ａｓｐ／Ｄ）残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化様反応（異性化とも呼ばれている）によりイソアスパラギン酸もしくはイソアスパルテートに変換することができる；あるいは
（４）いずれか１つ以上（最大ですべて）のグルタミン酸もしくはグルタメート（Ｇｌｕ／Ｅ）残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化様反応（異性化とも呼ばれている）によりイソグルタミン酸もしくはイソグルタメートに変換することができる；あるいは
（５）上の組合せ。
非限定的な例として、本開示は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７［ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ］（配列番号１４５）のいずれか１つ以上（最大ですべて）のアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基を、上記のように、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化または脱アミド化様反応によりそれぞれ（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／またはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）グルタミン酸／グルタメートおよび／またはイソグルタミン酸／イソグルタメート、（３）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、および／または（４）イソグルタミン酸／イソグルタメートに変換することができるＣＮＰ変異体を包含する。
さらなる例として、本開示は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７［ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ］（配列番号１４５）のいずれか１つ以上（最大ですべて）のアスパラギンおよび／またはアスパラギン酸残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化または脱アミド化様反応によりそれぞれ（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／またはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、および／または（２）イソアスパラギン酸／イソアスパルテートに変換することができるＣＮＰ変異体を包含する。
他の例として、本開示は、Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７［ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号７５）］のいずれか１つ以上（最大ですべて）のアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化または脱アミド化様反応によりそれぞれ（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／またはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）グルタミン酸／グルタメートおよび／またはイソグルタミン酸／イソグルタメート、（３）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、および／または（４）イソグルタミン酸／イソグルタメートに変換することができるＣＮＰ変異体を包含する。
さらに他の例として、本開示は、ｗｔＣＮＰ３７［ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号６０）］のいずれか１つ以上（最大ですべて）のアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化または脱アミド化様反応によりそれぞれ（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／またはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）グルタミン酸／グルタメートおよび／またはイソグルタミン酸／イソグルタメート、（３）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、および／または（４）イソグルタミン酸／イソグルタメートに変換することができるＣＮＰ変異体を包含する。
さらなる例として、ＨＳＡ−ｗｔＣＮＰ２７キメラ、ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１４４）のいずれか１つ以上（最大ですべて）のアスパラギン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化または脱アミド化様反応によりそれぞれ（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／またはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、および／または（３）イソグルタミン酸／イソグルタメートに変換することができるＣＮＰ変異体を包含する。
なおさらなる例として、Ｐｒｏ−ＨＳＡ−ｗｔＣＮＰ２７キメラ、ＰＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（配列番号１８８）のいずれか１つ以上（最大ですべて）のアスパラギン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基を、変換される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで脱アミド化または脱アミド化様反応によりそれぞれ（１）アスパラギン酸／アスパルテートおよび／またはイソアスパラギン酸／イソアスパルテート、（２）イソアスパラギン酸／イソアスパルテート、および／または（３）イソグルタミン酸／イソグルタメートに変換することができるＣＮＰ変異体を包含する。
さらに、本開示は、いずれか１つ以上（最大ですべて）のメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）残基を、酸化される残基につき約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の変換まで化学的に実現できる酸化形（例えば、スルホキシドおよび／またはスルホン）に酸化することができるＣＮＰ変異体を包含する。
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端において細胞膜または細胞障壁を越えた変異体の転座を容易にする部分に結合したＣＮＰ２２またはその変異体を含む。一実施形態において、ＣＮＰ変異体はＮ末端および／またはＣ末端において、活性ペプチド輸送体経由を含む、細胞膜または細胞障壁を越えた変異体の輸送を容易にするペプチド配列に結合する。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端は、化学的部分、例えば、天然および／または合成のポリマーなどに結合し、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲である改変ＣＮＰペプチドの総質量を増加させる。一実施形態において化学的部分は、生体適合性のある、親水性または水溶性の天然ポリマー（例えば、ペプチド、糖）または合成ポリマー（例えばＰＥＧ（またはＰＥＯ））である。
特定の実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端はＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーに結合し、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量をもたらす。ＣＮＰ２２またはその変異体のＰＥＧ化は、とりわけ、免疫原性の低下および腎クリアランスの減少による半減期の改善およびプロテアーゼ耐性の増加のために設計される。ＰＥＧ部分は、限定するものではないが、ＣＮＰ−１７（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６〜Ｃｙｓ２２の環状部分）、ＣＮＰ３７およびＮ末端および／またはＣ末端にアミノ酸延長、アミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失を有するＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ３７の変異体を含む、ＣＮＰ２２または本明細書に記載の任意の変異体のＮ末端および／またはＣ末端に結合できる。ある実施形態において、ＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ３７あるいはそれらの変異体のＬｙｓ４および／またはＬｙｓ１０残基は、天然または非天然アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＣｉｔ）または側鎖に反応性第一級アミンを含有しないペプチド模倣体により置換され、これらのリジン残基のＰＥＧ化の可能性はいずれも排除される。一実施形態において、ＣＮＰペプチドのＬｙｓ４および／またはＬｙｓ１０残基は、Ａｒｇにより置換される。別の実施形態において、Ｌｙｓ１０残基は、Ａｒｇにより置換されない。
さらなる実施形態において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分およびＮ末端におけるアミノ酸延長部分を有するＣＮＰ変異体（ＣＮＰ２２およびその変異体を含む）は、ＣＮＰ２２のＧｌｙ１に対応する位置の直前の位置にアルギニンを含む。そのようなＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ分解に対する抵抗性の増加、血清アルブミンへの結合の低下およびＣＮＰ機能活性（例えば、ｃＧＭＰシグナル伝達の活性化）の増大のために設計されている。ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体の非限定的な例としては、ＰＥＯ２４が単分散性１．２ｋＤａ ＰＥＧポリマーであり、ＰＥＯ１２が単分散性０．６ｋＤａ ＰＥＧポリマーである、
Figure 0005718909
 が挙げられる。１つの実施形態において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーは、ＣＮＰ変異体のＮ末端に結合されている。
本開示は、型（例えば、ホモポリマーまたはコポリマー；ランダムコポリマー、交互コポリマーまたはブロックコポリマー；線状または分枝；単分散または多分散）、結合（例えば、加水分解性またはアミド、イミン、アミナール（ａｍｉｎａｌ）、アルキレンまたはエステル結合などの安定性の結合）、結合部位（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端、（ＣＮＰ２２の残基６〜２２に対応する）ＣＮＰの環状領域中の任意の残基ではないことが好ましい）および長さ（例えば、約０．２、０．４または０．６ｋＤａから約２、３、４または５ｋＤａ）を変化させることができる親水性または水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の使用を企図する。親水性または水溶性ポリマーは、Ｎ−ヒドロキシ酸スクシンイミド（ＮＨＳ）あるいはアルデヒドに基づく化学物質または他の化学物質を用いてＣＮＰペプチドに結合でき、このことは当分野において公知である。このようなＣＮＰ変異体は、例えばｗｔＣＮＰ２２（２．２ｋＤａ）、ｗｔＣＮＰ２２の環状領域（残基６〜２２）のみを保有するＣＮＰ１７、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ１７のＮ末端および／またはＣ末端にアミノ酸延長を有するＣＮＰ変異体あるいはアミノ酸の置換、付加および／または欠失を有する変異体、例えば、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）、ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ） （配列番号３７）、Ｒ−ＣＮＰ２２（配列番号４０）、Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号４１）、ＥＲ−ＣＮＰ２２（配列番号３８）、およびＥＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３９）などを使用して作製できる。ある実施形態において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量を有するＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、ＮＨＳまたはアルデヒドに基づく化学物質を介してＮ末端および／またはＣ末端に結合する、単分散の線状ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分あるいはＮＨＳに基づく化学物質を介してＮ末端および／またはＣ末端に結合する、２アームまたは３アームの分枝ＰＥＧ部分を含有する。本開示は、腎クリアランスの減少のために設計された、負に荷電したＰＥＧ−ＣＮＰ変異体もまた包含し、限定するものではないが、カルボキシ化、硫酸化およびリン酸化化合物を含む（Ｃａｌｉｃｅｔｉ、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．、５５巻：１２６１〜７７頁（２００３年）； Ｐｅｒｌｍａｎ， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏ． Ｍｅｔａｂ．、８８巻：３２２７〜３５頁（２００３年）；Ｐｉｔｋｉｎ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇ． Ｃｈｅｍｏ．、２９巻：４４０〜４４４頁（１９８６年）；Ｖｅｈａｓｋａｒｉ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ’ｌ、２２巻：１２７〜１３５頁（１９８２年））。一実施形態において、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分は、カルボキシル基、硫酸基および／またはリン酸基を含有する。
他の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体のＮ末端、Ｃ末端および／または内部部位（複数可）に結合したＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分は、生理的条件下で正に荷電する１つ以上の官能基を含む。そのようなＰＥＧ部分は、とりわけ、そのようなＰＥＧ化ＣＮＰ変異体の軟骨組織への分布を改善するために設計されている。１つの実施形態において、そのようなＰＥＧ部分は、１つ以上の第一級、第二級もしくは第三級アミノ基、第四級アンモニウム基および／または他のアミン含有（例えば、尿素）基を含む。
ある実施形態において、本開示は、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのＰＥＧ（またはＰＥＯ）に、ＮＨＳまたはアルデヒドに基づく化学物質を介して結合するＣＮＰ２２またはその変異体を包含し、式中、ｎは約６から約１００までの整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．３ｋＤａから約５ｋＤａまでである。別の実施形態において、ｎは、約１２から約５０までの整数であり、ＰＥＧポリマーは約０．６ｋＤａから約２．５ｋＤａまでである。まだ別の実施形態において、ｎは、約１２から約２４までであり、ＰＥＧポリマーは約０．６ｋＤａから約１．２ｋＤａまでである。さらに別の実施形態において、ＰＥＧポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基により覆われている。特定の実施形態において、末端を覆っている基はアルキル基、例えばメチルなどの低分子アルキル基である。
さらなる実施形態において、本開示は、１つ以上のペプチド結合または中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）を含むペプチダーゼによる切断に対する感受性が減少したペプチド結合イソスターを有するＣＮＰ変異体を提供する。ＮＥＰは、高分子疎水性残基のアミノ末端において、基質のペプチド結合を切断する、膜結合亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。したがって、非天然のペプチドまたは非ペプチド結合に対する、ＮＥＰに関する切断部位におけるペプチド結合の改変は、ＮＥＰ切断の有効性をなくす、または減少させることができる。
ＡＮＰおよびＣＮＰに関しては、ＮＥＰによる切断が、まず環状領域内のＣｙｓ６−Ｐｈｅ７結合に発生し、その後構造の残りの他のいたるところにおいて発生することが報告されている。ＢＮＰに関しては、切断はまずペプチドのＮ末端において発生し、その後環状構造内において発生することが報告されている。ＣＮＰ上の第１のＮＥＰ切断部位は、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合であることが報告されているが、ｗｔＣＮＰ２２がｉｎ ｖｉｔｒｏで２．５分ＮＥＰ消化に曝露された場合、すべての候補部位は予想に反して加水分解され、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７およびＧｌｙ８−Ｌｅｕ９のペプチド結合は、実施例２に記載のように、若干最も不安定であった。
ＮＥＰの基質特異性は、２つの基質結合サブ部位、Ｓ１’およびＳ２’により主に決定される（Ｏｅｆｎｅｒ ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６巻：３４１〜３４９頁（２０００年））。Ｓ
１’部位は、Ｎ末端ペプチド結合が加水分解される高分子の疎水性Ｐ１’残基（例えば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＭｅｔ）を受容する。Ｓ２’部位は、一般的により低分子の残基が好ましく、Ｐ２’（例えば、ＧｌｙまたはＳｅｒ）と呼ばれる。ＣＮＰの場合、Ｐｈｅ７は、ＮＥＰのＳ１’部位に関して好ましいＰ１’残基であるが、一方Ｇｌｙ８は、Ｓ２’部位に関して好ましいＰ２’残基であることが報告されている。これらの２つのサブ部位は、特定の総サイズの側鎖とだけ一緒になって適合するので、ＣＮＰのＰ１’−Ｐ２’残基の総サイズの増加はいずれもＮＥＰ結合を崩壊させ得る可能性がある。例えば、Ｐ１’ Ｐｈｅ７芳香族環の３位における塩素原子の付加（すなわち、３−Ｃｌ−Ｐｈｅ７）は、ＣＮＰと、ＮＥＰ切断部位、例えばＳ１’サブ部位との間の相互作用を改変（例えば、安定性を損なう）し得る可能性がある。３級ブチル基の、より低分子のＰ２’残基のＧｌｙ８への付加（すなわちｔＢｕ−Ｇｌｙ８）は、ＣＮＰと、Ｓ２’サブ部位との相互作用を崩壊し得る可能性がある。
したがって、一実施形態において、本開示のＣＮＰ変異体は、活性部位において基質認識に干渉し、ＮＥＰ切断に対する感受性を減少させるために、Ｐｈｅ７−Ｇｌｙ８などのサイズが大きくなったＰ１’−Ｐ２’残基を有するＣＮＰを含む。天然アミノ酸、非天然アミノ酸および／またはペプチド模倣体部分は、限定するものではないが、Ｐｈｅ７、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１１、Ｉｌｅ１４、Ｍｅｔ１７およびＬｅｕ２０を含む、１つ以上の大きなＰ１’疎水性残基および／または限定するものではないが、Ｃｙｓ６、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１６およびＧｌｙ１９を含む、１つ以上のより小さなＰ２’残基に置換される。
本開示は、基質認識および／またはＮＥＰよる切断に関連する少なくとも１つの残基に、少なくとも１つの改変アミノ酸および／または少なくとも１つの改変ペプチド結合を含むＣＮＰ変異体を包含し、改変アミノ酸および改変ペプチド結合は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣体および／またはペプチド結合イソスターであり得る。一実施形態において、Ｃｙｓ６とＰｈｅ７との間のＣＮＰ上のＮＥＰ切断部位は改変される。関連する実施形態において、Ｃｙｓ６とＰｈｅ７との間のペプチド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は、以下のペプチド結合イソスター：
−ＣＨ２−ＮＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−、式中、アミド基は以下の任意のＲ基によりアルキル化される：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、
−ＣＨ２−Ｓ−、
−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）ｎ−、式中ｎは１または２である、
−ＣＨ２−ＣＨ２−、
−ＣＨ＝ＣＨ−、
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、
−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−、
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または
−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−
の１つと置き換えられる。
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、式：
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−Ｌｙｓ４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号９０）で表され、
式中、
（ｘ）および（ｚ）は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート；骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕ；骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など（Ｗａｎｇら、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、５７巻：１０４９〜７６頁（２００５年）
）；腎クリアランスを減少させるポリマー分子および非ポリマー分子、例えば、負に荷電したＰＥＧなど；ならびに天然ポリマー（例えば、アミノ酸、脂肪酸および／または糖を含有するもの）およびＣＮＰ変異体の総質量を、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲に増加させることによってＮＥＰ分解に対するＣＮＰ変異体の耐性を増加させる合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）；からなる群から選択されてもよく；
（ｂ）および（ｃ）は、野生型Ｃｙｓ６およびＰｈｅ７、別の天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってもよく、あるいはＮＥＰ切断に対する耐性を増加させるために本明細書に記載のペプチド結合イソスターを含有してもよく；
（ｄ）は、野生型Ｇｌｙ８であってもよく、あるいはＮＥＰへの結合を減少させるためにより高分子の天然または非天然（例えば、ｔ−Ｂｕ−Ｇｌｙ）アミノ酸またはペプチド模倣体であってもよい。
一実施形態において、このようなＣＮＰ変異体は、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）に少なくとも１つの改変アミノ酸を含有する。
Ｇｌｙ８−Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０−Ｌｅｕ１１、Ａｒｇ１３−Ｉｌｅ１４、Ｓｅｒ１６−Ｍｅｔ１７およびＧｌｙ１９−Ｌｅｕ２０の各結合を含む、ＣＮＰ内の他のペプチド結合は、ＣＮＰ２２またはその変異体がＮＥＰ耐性ペプチド結合またはペプチド結合イソスターをＣｙｓ６−Ｐｈｅ７に有していたとしても、切断され得る。したがって、本開示は、ペプチド結合イソスターを、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７に加えて１つ以上の他のＮＥＰ切断部位に有するＣＮＰ変異体を包含し、ペプチド結合イソスターは、本明細書に記載のものを含む。
別の実施形態において、本開示は、限定するものではないが、ホモシステイン、ペニシラミン、２−メルカプトプロピオン酸および３−メルカプトプロピオン酸を含む、システイン類似体を、Ｃｙｓ６および／またはＣｙｓ２２に有するＣＮＰ変異体を包含する。ある実施形態において、このようなＣＮＰ変異体は、野生型Ｃｙｓ６または類似体とＣｙｓ２２または類似体との間のジスルフィド結合により形成された環状ドメインを有する。
まだ別の実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体の１つまたはすべての残基までの複数の残基は、Ｄ−アミノ酸により置換される。Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸による置換は、側鎖をそのもともとの位置から本質的に約１２０°動かし、その結果、ＣＮＰペプチドとＮＥＰとの結合を崩壊させる可能性がある。具体的な実施形態において、Ｐｈｅ７のＬ−Ｐｈｅは、そのＤ−光学異性体のＤ−Ｐｈｅで置換される。
さらに別の実施形態において、βアミノ酸、例えば、３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸（または２−フェニル−β−アラニン）により、野生型αアミノ酸のＰｈｅ７が置き換えられる。βアミノ酸の使用は、１つのメチレン単位によりペプチド骨格の長さを有効に延長する。プロテアーゼ耐性は、基質立体配座の変化またはアミノ酸側鎖間の距離の増加によりもたらされ得る。
非天然α−アミノ酸、β−アミノ酸またはペプチド結合イソスターを有するＣＮＰ２２の変異体の限定されない例は、
Figure 0005718909
 を含む。
さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量を有し、ＮＥＰ分解に対する耐性を増加するために設計され、式：
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−Ｇｌｙ１５−Ｓｅｒ１６−（ｉ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｊ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号４６）で表され、式中、
（ｘ）および（ｚ）は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート；骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなど；骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など；腎クリアランスを減少させるポリマー部分および非ポリマー部分、例えば、負に荷電したＰＥＧなど；アミノ酸、疎水性酸および／または糖を含有するポリマー；ならびに合成親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧなど；からなる群から選択されてもよく；
（ａ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕを含み、ここで一実施形態において、（ａ）はＡｒｇであり；
（ｂ）は、ＣｙｓおよびＣｙｓ６とＰｈｅ７との間のペプチド結合イソスター、例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨからなる群から選択され；
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであるＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つ以上のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１〜６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１〜６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリールおよびヘテロアリール（限定するものではないが、例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロフェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含む）からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環が、別のアリール基（限定されない例は、１−および２−ナフチルアラニンを含む）またはヘテロアリール基（限定されない例は、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンを含む）により置き換えられ得るＰｈｅ類似体；からなる群から選択され、
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され；
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｆ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕを含み、一実施形態において、（ｆ）はＡｒｇではない；
（ｇ）は、Ｌｅｕおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔＢｕ−ＧｌｙおよびＮ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｉ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、β−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され；
（ｊ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量を有し、ＮＥＰ切断に対する耐性を増加するために設計され、式：
（ｘ）−Ｇｌｙ１−Ｌｅｕ２−Ｓｅｒ３−（ａ）４−Ｇｌｙ５−（ｂ）６−（ｃ）７−（ｄ）８−（ｅ）９−（ｆ）１０−（ｇ）１１−Ａｓｐ１２−Ａｒｇ１３−（ｈ）１４−（ｉ）１５−Ｓｅｒ１６−（ｊ）１７−Ｓｅｒ１８−Ｇｌｙ１９−（ｋ）２０−Ｇｌｙ２１−Ｃｙｓ２２−（ｚ）（配列番号１４３）で表され、式中、
（ｘ）および（ｚ）は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネートなど；骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなど；骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列およびそれらの誘導体、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質などの融合タンパク質またはペプチド配列；限定するものではないが、親水性または水溶性ポリマー例えば、荷電ＰＥＧ分子などを含む、腎クリアランスを減少させる部分、ならびに、例えばＰＥＧ、アミノ酸、糖および／または疎水性の酸を含む部分；からなる群から選択されてもよく；
（ａ）は、上記位置において野生型Ｌｙｓであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＧｌｕを含み、一実施形態において、（ａ）はＡｒｇであり；
（ｂ）は、ＣｙｓおよびＣｙｓ６とＰｈｅ７との間のペプチド結合イソスター、例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＮＨからなる群から選択され；
（ｃ）は、Ｌ−Ｐｈｅ；Ｄ−Ｐｈｅ；３−アミノ−２−フェニルプロピオン酸；Ｎ−アルキル基が、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであるＰｈｅのＮ−アルキル化誘導体、；ならびにＰｈｅ類似体のベンゼン環の１つ以上のオルト、メタおよび／またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝Ｃ１〜６アルキル、線状もしくは分枝Ｃ１〜６アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリール（限定するものではないが、例は、チロシン、３−クロロフェニルアラニン、２，３−クロロフェニルアラニン、３−クロロ−５−フルオロ−フェニルアラニン、２−クロロ−６−フルオロ−３−メチル−フェニルアラニンを含む）からなる群から選択される１つ以上の置換基により置換されているか、あるいはＰｈｅ類似体のベンゼン環が、別のアリール基（限定されない例は、１−および２−ナフチルアラニンを含む）またはヘテロアリール基（限定されない例は、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンを含む）により置き換えられ得るＰｈｅ類似体；からなる群から選択され、；
（ｄ）は、Ｇｌｙ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＶａｌおよびＡｓｎからなる群から選択され；
（ｅ）は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｆ）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、６−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン（Ｃｉｔ）、ＧｌｎおよびＳｅｒからなる群から選択され；
（ｇ）は、Ｌｅｕ、Ａｓｎおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｈ）は、Ｉｌｅ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｇｌｙ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）、Ａｓｎおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｉｌｅなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され；
（ｉ）は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＳｅｒおよびＡｓｎからなる群から選択され；
（ｊ）は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、β−Ｃｌ−Ａｌａ、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）および２−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択され；
（ｋ）は、Ｌｅｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモロイシン（Ｈｌｅｕ）、Ｖａｌ、ｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａ（ｔＢｕ−Ａｌａ）、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒおよび例えばＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
ＣＮＰ変異体の、骨関連障害（例えば、骨系統疾患）の標的部位への送達を改善するために、ＣＮＰ変異体は、骨または軟骨ターゲティング部位に（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端で）結合することができる。骨または軟骨ターゲティング部位の限定されない例は、ビスホスホネート；ヒドロキシアパタイト；グルコサミン；コラーゲン（例えば、Ｘ型コラーゲン）；ポリＡｓｐ；ポリＧｌｕ；および骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質などを含む。
ＮＥＰ切断に対する感受性が低下することに加えて、ＣＮＰ変異体は、ＮＰＲ−Ｃクリアランス受容体に対する親和性が低下する可能性があるが、一方、ＣＮＰの機能性は保有する。ＮＥＰにより仲介される分解のほかに、ＣＮＰ２２の半減期は、クリアランス受容体のＮＰＲ−Ｃにより影響され、ＮＰＲ−Ｂの細胞外ペプチド結合ドメインと５８％の配列相同性を共有する。ＣＮＰ２２は、ＮＰＲ−Ｂ（親和性７〜３０ｐＭ）と堅く結合するだけではなく、ＮＰＲ−Ｃ（１１〜１４０ｐＭ）とも堅く結合する（Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｂ．Ｄ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２３０６０〜６７頁（１９９１年）；Ｋｏｌｌｅｒ Ｋ． Ｊ．＆ Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｄ．Ｖ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８６巻：１０８１〜８８頁（１９９２年）；Ｓｕｇａ， Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３０巻：２２９〜３９頁（１９９２年））。ＮＰＲ−Ｂの結晶構造は未だに報告されていないにもかかわらず、ＮＰＲ−ＣとＮＰＲ−Ａとの結晶構造の間の配列相同性ならびに類似性（Ｈｅ，Ｘ． −Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻（５５３５号）：１６５７〜６２頁（２００１年）；Ｏｇａｗａ， Ｈ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７９巻（２７号）：２８６２５〜３１
頁（２００４年）；Ｈｅ，Ｘ．−Ｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３６１巻（４号）：６９８〜７１４頁（
２００６年））は、ＮＰＲ−Ｂにより、全体的な構造の折りたたみが類似であると推定されることを示唆している。
したがって、ＮＰＲ−Ｂ相同モデルは、構造に基づく配列アライメントおよび以下の関連系：ＮＰＲ−Ｃに結合したＣＮＰ、ＮＰＲ−Ａに結合したＡＮＰおよびＮＰＲ−Ｃに結合したＡＮＰ、の結晶構造に基づいて構築された（Ｈｅ， Ｘ．−Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻（５５３５号）：１６５７〜６２頁（２００１年）；Ｏｇａｗａ， Ｈ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９巻（２７号）：２８６２５〜３１頁（２００４年）；Ｈｅ， Ｘ．−Ｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３６１巻（４号）：６９８〜７１４頁（２００６年））。受容体が、結合したペプチドの立体配座を決定すると思われるという観察およびＮＰＲ−Ｂが一次構造および機能特性に関して最もＮＰＲ−Ａに近いという観察に基づいて、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰの相同モデルを、ＮＰＲ−Ａ／ＡＮＰ結晶構造をモデルとして用いて構築した。ＣＮＰ変異体の公開されたシグナル伝達データ（米国特許第５，４３４，１３３号および米国特許出願第２００４／０１３８１３４Ａ１号）およびもはやＮＰＲ−Ｃに結合していないＡＮＰ変異体の公開されたシグナル伝達データ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、ＥＭＢＯ１３巻（１１号）２５０８〜１５頁、１９９４年）を使用して、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰモデルを改良し、解明した。
本開示は、ＮＰＲ−Ｂ／ＣＮＰ複合体の相同性に基づく構造モデルに基づいて、ＮＰＲ−Ｂの選択性の改善のために設計されたＣＮＰ変異体を包含する。公開され機能データを有する様々な受容体に結合したナトリウム利尿ペプチドの、実験的構造データおよびコンピュータ的な構造データを組み合わせることにより、ＮＰＲ−Ｂに結合し続けるが、ＮＰＲ−Ｃクリアランス受容体に対する親和性が低下し得る可能性のあるＣＮＰ変異体を作製した。例えば、ＮＰＲ−Ｃは、ペプチド結合部位のループ構造中に唯一の挿入を有し、そのループ残基を、ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｂ中のそれぞれのループ残基と比較して、ＣＮＰ Ｇｌｙ８（またはＡＮＰ Ｇｌｙ９）のようなペプチド残基により近く配置している。先行する研究は、ＡＮＰにおけるＧ９Ｔ変異が、ＮＰＲ−Ｃに対する親和性の低下に寄与し、その結果、ＮＰＲ−Ａの選択性が改善されることを示した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３巻（１１号）：２５０８〜１５頁（１９９４年））。したがって、ＣＮＰ変異体を、対応するＧｌｙ８残基を、より高分子の残基（Ｓｅｒ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＡｓｎ）に置き換えて作製し、ＣＮＰとＮＰＲ−Ｃとの結合を、ＮＰＲ−Ｂに対する結合に影響を与えることなく崩壊させた。さらに、１つ以上の変異を、受容体／ペプチド複合体の詳細な構造解析に基づいて、受容体特異的残基と相互作用することが予測される、Ｇｌｙ１５からＧｌｙ２１を包含するＣＮＰのＣ末端に導入した。例えば、ＣＮＰ２２中のＧ１９Ｒの変異は、ＮＰＲ−Ｂシグナル伝達活性の有意な喪失をもたらさない。しかし、この変異は、近隣残基の立体配座を変えることなく、ＮＰＲ−Ｃ／ＣＮＰの利用可能な結晶構造にモデル化できない。これらの観察は、Ｇ１９Ｒの変異が、ＣＮＰと、特定の受容体、例えばＮＰＲ−Ｃとの結合を選択的に崩壊させ得ることを示唆する。
ある実施形態において、ＣＮＰ変異体は、１、５、８、１５、１９および２１位の１つ以上のＧｌｙ部位に置換を有し、立体配座の柔軟性を低下させ、その結果受容体の特異性を増加させる。ＮＰＲ−ＣおよびＮＰＲ−Ａに結合したＡＮＰの結晶構造の比較分析（Ｏｇａｗａ， Ｈ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７９巻：２８６２５〜３１頁（２００４年）；Ｈｅ，Ｘ．−Ｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６１巻：６９８〜７１４頁（２００６年））は、ＡＮＰの立体配座の柔軟性が、受容体の選択性の決定において非常に重要な役割を果たし得ることを示す。
一実施形態において、ＮＰＲ−Ｃに対する親和性が低下した可能性のある、機能性ＣＮＰ変異体は、以下のアミノ酸置換の１つ以上を有する：Ｇ１Ｒ、Ｇ１Ｅ、Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｑ、Ｇ５Ｓ、Ｆ７Ｙ、Ｇ８Ｔ、Ｇ８Ｓ、Ｇ８Ｖ、Ｇ８Ｎ、Ｌ９Ｓ、Ｌ９Ｔ、Ｋ１０Ｃｉｔ、Ｋ１０Ｑ、Ｋ１０Ｓ、Ｉ１４Ｎ、Ｇ１５Ｒ、Ｇ１５Ｓ、Ｇ１５Ｎ、Ｇ１５Ｃｉｔ、Ｓ１６Ｑ、Ｍ１７Ｖ、Ｍ１７Ｎ、Ｇ１９Ｓ、Ｇ１９Ｒ、Ｇ１９Ｎ、Ｌ２０Ｖ、Ｌ２０Ｒ、Ｌ２０Ｔ、Ｌ２０Ｓ、Ｇ２１Ｓ、Ｇ２１ＴおよびＧ２１Ｒ。ある実施形態において、ＣＮＰ変異体は、１、５、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７、１９、２０および／または２１位にマルチポイントの置換を有し、場合により変異体のペプチド配列の任意の他の位置に改変を有することができる。
さらなる実施形態において、本明細書に記載のＣＮＰ変異体は、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部部位において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲であることを特徴とする総質量までの部分に結合し、骨／軟骨ターゲティングを容易にし、ＮＰＲ−Ｃおよび腎クリアランスを減少させ、ＮＥＰ分解に対する耐性を増加させ、および／またはＣＮＰの機能性を改善させることができる。一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、環状領域（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６からＣｙｓ２２に対応する）内のポリマー部分に結合されない。ＣＮＰ変異体に結合できるポリマー部分または非ポリマー部分の限定されない例は、合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート；骨／軟骨ターゲティングペプチド配列、例えば、ポリＡｓｐおよびポリＧｌｕなど；骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するペプチド配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など；骨形成タンパク質の機能ドメインに由来するペプチド配列、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８ａなど；ナトリウム利尿起源のポリペプチドに由来するペプチド配列、例えば、ＮＰＰＣ、ＡＮＰおよびＢＮＰなど；他の天然ポリマーまたは非ポリマー部分、例えば、糖、脂肪酸およびリン脂質；生体適合性合成親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）など；疎水性のポリマー部分または非ポリマー部分、例えば、ヘプタン酸およびペンタン酸；およびそれらの組合せを含む。
本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、例えば、ｃＧＭＰ産生およびシグナル伝達の刺激に関して、ＣＮＰ２２と実質的に同様またはより良好な機能活性を有し得る。１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１ｕＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約５０％の産生をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで刺激する。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、野生型ＣＮＰ２２のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのｃＧＭＰ刺激活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を保持している。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２と比較して改善されたｃＧＭＰ刺激活性を有する。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２の同じ濃度（例えば、１ｕＭ）のもとで産生されるｃＧＭＰレベルの少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％またはそれを超える産生をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで刺激する。
米国特許第５，４３４，１３３号、米国特許第６，０３４，２３１号、米国特許第６，０２０，１６８号、米国特許第６，７４３，４２５号、米国特許第７，２７６，４８１号、国際公開第９４／２０５３４号、国際公開第０２／０４７８７１号、国際公開第２００５／０９８４９０号、国際公開第２００４／０４７８７１号、欧州特許第０４９７３６８号、欧州特許第０４６６１７４号およびＦｕｒｕｙａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．、１８３巻、９６４〜９６９頁（１９９２年）を含むが、これらに限定されない、本明細書で参照した以前の刊行物のいずれかにおける、具体的に開示されたナトリウム利尿（例えば、ＣＮＰ）ペプチド、断片および変異体のいずれか、および実際に製造されたナトリウム利尿（例えば、ＣＮＰ）ペプチド、断片および変異体のいずれかは、本開示から必要に応じて除外される。そのようなすべての文書は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれている。
１つの実施形態において、本開示は、ヒト起源および非ヒト起源のすべての公知の野生型ＣＮＰ−５３、野生型ＣＮＰ−２２、野生型ＣＮＰ−１７、野生型ＢＮＰおよび野生型ＡＮＰを必要に応じて除外する。例えば、一実施形態において、本開示は、ヒトＣＮＰ−１７、ヒトＣＮＰ−２２、ニワトリＣＮＰ−２２（ｈＣＮＰ−２２（Ｌｅｕ９Ｖａｌ）に対応する）、マスおよびウナギＣＮＰ−２２（ｈＣＮＰ−２２（Ｌｅｕ２Ｔｒｐ、Ｓｅｒ３Ａｓｎ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ）に対応する）、カエルＣＮＰ２２−Ｉ（ｈＣＮＰ−２２（Ｌｅｕ２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｅｕ９Ｖａｌ、Ｓｅｒ１６Ａｌａ、Ｍｅｔ１７Ｐｈｅ）に対応する）、カエルＣＮＰ２２−ＩＩ（ｈＣＮＰ−２２（Ｌｅｕ２Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１６Ａｌａ）に対応する）、ヒトＣＮＰ−５３ならびにブタおよびラットＣＮＰ−５３（ｈＣＮＰ−５３（Ｇｌｎ１７Ｈｉｓ、Ａｌａ２８Ｇｌｙ）に対応する）を必要に応じて除外する。他の実施形態において、本開示は、ヒトおよび非ヒト動物においてｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解切断により産生されるＮＰＰＣ、プロＣＮＰおよびＣＮＰ−５３の断片を必要に応じて除外する。さらにまた他の実施形態において、野生型ヒトＣＮＰ−５３の次の短縮型断片を本開示から必要に応じて除外する：ＣＮＰ−５０、ＣＮＰ−４６、ＣＮＰ−４４、ＣＮＰ−３９、ＣＮＰ−３０、ＣＮＰ−２９、ＣＮＰ−２８、ＣＮＰ−２７およびＣＮＰ−２６。
さらなる実施形態において、本開示は、以下のものを含む、サメ種Ｔｒｉａｋｉｓ ｓｃｙｌｌｉａおよびＳｃｙｌｉｏｒｈｉｎｕｓ ｃａｎｉｃｕｌａから単離または探索されたＣＮＰペプチドおよびそれらの断片（例えば、Ｍ． Ｔａｋａｎｏら、Ｚｏｏｌ． Ｓｃｉ．、１１巻、４５１〜４５４頁（１９９４年）参照）を必要に応じて除外する：
Figure 0005718909
 。
他の実施形態において、以下のものを含む、サメ種Ｌａｍｎａ ｄｉｔｒｏｐｉｓから単離または探索されたＣＮＰペプチドおよびそれらの断片（例えば、Ｍ． Ｔａｋａｎｏら、Ｚｏｏｌ． Ｓｃｉ．、１１巻、４５１〜４５４頁（１９９４年）参照）を本開示から必要に応じて除外する：
Figure 0005718909
 。
さらに他の実施形態において、以下のものを含む、サメ種Ｓｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｉａｓから単離されたＣＮＰペプチドおよびそれらの断片（例えば、Ｍ． Ｔａｋａｎｏら、Ｚｏｏｌ． Ｓｃｉ．、１１巻、４５１〜４５４頁（１９９４年）参照）を本開示から必要に応じて除外する：
Figure 0005718909
 。
さらなる実施形態において、本開示は、Ｋ． Ｉｎｏｕｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、１００巻（１７号）、１００７９〜１００８４頁（２００３年）において「ＣＮＰ−１」、「ＣＮＰ−２」、「ＣＮＰ−３」および「ＣＮＰ−４」と呼ばれているメダカおよびフグから単離された以下のＣＮＰペプチドを必要に応じて除外する：
Figure 0005718909
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なおさらなる実施形態において、Ｇ． ｄｅ Ｐｌａｔｅｒら、Ｔｏｘｉｃｏｎ．、３６巻（６号）、８４７〜８５７頁（１９９８年）において「ｏｖＣＮＰ−３９」および「ｏｖＣＮＰ−３９（１８〜３９）」と呼ばれているｐｌａｔｙｐｕｓ ｖｅｎｏｍから単離された以下のＣＮＰ−３９およびそのＣＮＰ−２２断片を本開示から必要に応じて除外する：
Figure 0005718909
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他の実施形態において、本開示は、米国特許公開第２００７／０１９７４３４号に具体的に開示されている以下のペプチドを必要に応じて除外する：
Figure 0005718909
 。
なおさらなる他の実施形態において、本開示は、米国特許公開第２００７／０１９７４３４号に一般的に開示されている配列番号１０のペプチドを必要に応じて除外し、そのようなペプチドは、４、５、６、１１、１２、１４および／または１５位に特定の天然アミノ酸置換（複数可）を有するＣＮＰ−１７変異体である。さらに他の実施形態において、ｈＣＮＰ−５３（Ｓｅｒ４７Ａｌａ）、ｈＣＮＰ−５３（Ｍｅｔ４８Ｇｌｎ）、ｈＣＮＰ−５３（Ｍｅｔ４８Ａｌａ）およびｈＣＮＰ−５３（Ｃ末端）−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒに対応するペプチドを必要に応じて除外する。
ある実施形態において、本開示は、米国特許第７，２７６，４８１号に具体的に開示の配列番号１〜４および６〜７１のペプチドを、場合により除外する。別の実施形態において、本開示は、米国特許第７，２７６，４８１号に一般的に開示された配列番号５のペプチドを場合により除外し、このようなペプチドは、Ｌｅｕ９、Ｌｙｓ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１６、Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９および／またはＬｅｕ２０において少なくとも１つの天然アミノ酸置換を有するＣＮＰ１７変異体である。さらに別の実施形態において、ＣＮＰ１７またはその変異体がＮ−Ｍｅ−Ｐｈｅ７またはＮ−Ｍｅ−Ｐｈｅ７とＮ−Ｍｅ−Ｌｅｕ１１とを含有するＣＮＰ１７変異体を、場合により除外する。さらなる実施形態において、本開示は、米国特許第７，２７６，４８１号に開示の、配列番号５のＣＮＰ１７変異体を場合により除外し、これらは成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）または甲状腺ホルモン（ＴＨ）に融合または結合する。さらに別の実施形態において、ＣＮＰ２２がＧＨ、ＩＧＦ−１またはＴＨと融合する、あるいはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介してＧＨ、ＩＧＦ−１またはＴＨに結合する、ＣＮＰ２２変異体を、場合により除外する。さらに別の実施形態において、ＣＮＰ１７またはその変異体が、Ｎ末端またはＣ末端においてビオチンまたはフルオレセインに結合するＣＮＰ１７変異体を、場合により排除する。
さらなる実施形態において、本開示は、米国特許第５，４３４，１３３号に具体的に開示された、化合物番号１〜２７および配列番号１〜１７、２２〜２４、３０、３１および４０〜４２のペプチドを、場合により除外する。別の実施形態において、本開示は、米国特許第５，４３４，１３３号に一般的に開示された配列番号１８〜２１および２５〜２９のペプチドを場合により除外する。さらに別の実施形態において、本開示は、ＷＯ９４／２０５３４号に具体的に開示された配列番号１〜４および９のペプチドを、場合により除外する。
しかし、一部の実施形態において、本開示は、本明細書において場合により除外されたナトリウム利尿（例えば、ＣＮＰ）ペプチド、断片および変異体の使用方法、ならびにナトリウム利尿（例えば、ＣＮＰ）ペプチド、断片および変異体を含む医薬組成物（滅菌医薬組成物を含む）は、依然として包含する。
Ｃ．ＣＮＰ変異体の合成および精製
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＮＰ変異体は、特定の実施形態における当該分野において公知の特定の技術を使用して、組換え体の発現を介して生産される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ およびＩＩ巻、Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ、編（１９８５年）；およびＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９４年）を参照されたい。
特定の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに連結された、ＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現をもたらす条件下で培地中で培養するステップを含む組換え法により産生させるものであり、該融合ポリペプチドは、切断可能なペプチドもしくはタンパク質に直接的に連結された、またはリンカーを介してそれに間接的に連結されたＣＮＰ変異体ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞を、切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結された、ＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換する。特定の実施形態において、該融合ポリペプチドを可溶性タンパク質として、または封入体として発現させる。発現した融合ポリペプチドを宿主細胞または培地から単離することができ、単離した融合ポリペプチドを切断剤と接触させて、ＣＮＰ変異体を遊離させることができる。
ＣＮＰ変異体を産生させるのに用いる宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、非哺乳類脊椎動物または哺乳類細胞であってよい。細菌細胞は、限定するものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞系および株を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞系および株の非限定的な例として、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧｒｏ７、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、Ｃ４１［Ｃ４１（ＤＥ３）とも呼ぶ］、Ｃ４３［Ｃ４３（ＤＥ３）とも呼ぶ］、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＫＲＸおよびＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）が挙げられる。一実施形態において、ＣＮＰ変異体およびＣＮＰ融合タンパク質は、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いて産生させる。哺乳類細胞は、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヒト細胞を含むが、これらに限定されない。宿主細胞は、不死化細胞（細胞系）または非不死化（初代または第二代）細胞であってよく、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはＣＨＯ細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の有形成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、軟骨細胞および他の骨由来細胞ならびにこれらの体細胞型の前駆体を含むが、これらに限定されない。ＣＮＰ変異体ＤＮＡまたはＲＮＡを含む宿主細胞をその細胞の増殖、ＤＮＡまたはＲＮＡの発現およびＣＮＰ変異体を発現する細胞の同定／選択に適する条件下で培養する。
いくつかの実施形態において、宿主細胞を約１０℃〜約４０℃、または約２０℃〜約４０℃、または約３０℃〜約４０℃の温度で一定の期間増殖または培養する。特定の実施形態において、宿主細胞を約２０℃、２２℃、２５℃、２８℃、３０℃、３５℃または３７℃で一定の期間増殖または培養する。特定の実施形態において、宿主細胞を約３５℃または３７℃で一定の期間にわたり増殖または培養する。
ＣＮＰ変異体ポリペプチド（ＣＮＰ融合タンパク質を含む）をコードする組換えポリヌクレオチドを、発現させるべきヌクレオチド配列に作用できるように連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターで発現させる。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系により供給することができる。発現ベクターは、限定するものではないが、組換えポリヌクレオチドを取り込むコスミド、プラスミド（例えば、裸またはリポソームに含まれている）およびウイルスを含む、当技術分野で公知のすべてのものを含む。発現ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために形質転換またはトランスフェクションにより適切な宿主細胞に挿入する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）参照）。
切断可能ＣＮＰ融合タンパク質を含む、ＣＮＰ変異体の産生のために意図される発現ベクターの非限定的な例として、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−２１ａ、ｐＥＴ−２２ｂ、ｐＥＴ−３１ｂ、ｐＥＴ−３２ａ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＱＥ−３０、ｐＥＴ−ＳＵＭＯおよびｐＴＹＢ１１が挙げられる。特定の構築物の発現により、可溶性ＣＮＰ変異体（ＣＮＰ融合タンパク質を含む）または封入体の形の不溶性ＣＮＰ変異体（ＣＮＰ融合タンパク質を含む）が発生し得る。
いくつかの実施形態において、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導ベクターを用いて、ＣＮＰ変異体またはＣＮＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（複数可）の発現を増大させる。いくつかの実施形態において、宿主細胞をＩＰＴＧの存在下で約１０℃〜約４０℃、または約２０℃〜約４０℃、または約３０℃〜約４０℃の温度で一定の期間増殖または培養する。特定の実施形態において、宿主細胞をＩＰＴＧの存在下で約２０℃、２２℃、２５℃、２８℃、３０℃、３５℃または３７℃で一定の期間増殖または培養する。特定の実施形態において、宿主細胞を１ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で約３５℃または３７℃で一定の期間にわたり増殖または培養する。
さらなる実施形態において、宿主細胞を約０．４ｍＭ〜約２ｍＭ、または約０．４ｍＭ〜約１．５ｍＭ、または約０．４ｍＭ〜約１ｍＭの濃度のＩＰＴＧとともに培養する。特定の実施形態において、ＩＰＴＧは、約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２ｍＭの濃度である。一実施形態において、ＩＰＴＧの濃度は、約１ｍＭである。
特定の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ変異体ポリペプチドおよび切断可能なキャリアタンパク質または切断可能タグ（例えば、ペプチドタグ）を含む融合タンパク質として組換えにより発現させるものであり、該融合タンパク質は、切断可能なキャリアタンパク質もしくはタグに直接的に連結された、またはリンカーを介してそれに間接的に連結されたＣＮＰ変異体ポリペプチドを含む。キャリアタンパク質もしくはタグを使用することにより、例えば、融合タンパク質の検出、単離および／または精製が容易となる。切断可能なキャリアタンパク質およびタグは、ヒスチジン（例えば、ｈｅｘａ−Ｈｉｓ）タグ；ヒト転写因子ＴＡＦ１２（ＴＡＦ１２）、ＴＡＦ１２断片、ＴＡＦ１２ヒストン折りたたみドメイン、ＴＡＦ１２の突然変異体およびその断片、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ）、ＴＡＦ１２（Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（１０Ｄ／１０Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）；ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）；β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；チオレドキシン（Ｔｒｘ）；キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）；ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２突然変異体、ＢＭＰ−２（Ｃ／Ａ）；ＳＵＭＯ；ならびに突然変異体およびそれらの断片を含むが、これらに限定されない。
発現構築物は、ＣＮＰ変異体およびキャリアタンパク質またはタグを含む融合タンパク質を発現させ得る。タグは、融合タンパク質に有用な特性を付与するアミノ酸配列であり得る。１つの実施形態において、タグは、リガンドを含む分離媒体に融合タンパク質を適用することによって融合タンパク質を精製するのに用いることができるリガンド結合ドメインである。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインを含む融合タンパク質をグルタチオン結合分離媒体を含むクロマトグラフィカラムに適用することができる。他の例として、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をタグとして含む融合タンパク質をマルトースを含む分離媒体に適用することができる。さらなる例として、ポリヒスチジンタグを含む融合タンパク質をニッケルカラムに加え、それによるニッケルカラムへのポリヒスチジンタグのキレート化により、融合タンパク質の精製を促進することができる。他の実施形態において、タグは、リガンドである。例えば、融合タンパク質は、グルタチオンをタグとして含み、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ結合分離媒体を含むクロマトグラフィカラムに適用することができる。融合タンパク質に用いるためのキャリアタンパク質およびタグの非限定的な例として、ヒト転写因子ＴＡＦ１２（ＴＡＦ１２）、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、ＢＭＰ−２変異（ＢＭＰＭ）、ＳＵＭＯ、ＣＡＴ、ＴｒｐＥ、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌タンパク質、デンプン結合タンパク質、エンドグルカナーゼＡのセルロース結合ドメイン、エキソグルカナーゼＣｅｘのセルロース結合ドメイン、ビオチン結合ドメイン、ｒｅｃＡ、Ｆｌａｇ、ポリＨｉｓ、ポリＡｒｇ、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｎ、ポリＰｈｅ、ポリＣｙｓ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体エピトープおよび突然変異体ならびにその断片が挙げられる。
標的ＣＮＰ変異体を得るために、化学的切断、プロテアーゼ切断または自己切断タンパク質により、キャリアタンパク質またはタグを融合タンパク質から切断することができる。具体例としての化学的およびタンパク質分解切断剤（カッコ内は切断部位）は、ギ酸（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）、臭化シアン（ＣＮＢｒ）（Ｍｅｔ−Ｘ）、ヒドロキシルアミン（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）、Ｘａ因子（ＩＥＧＲ−Ｘ）（配列番号２３０）、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ−Ｘ）（配列番号２３１）、ＰｒｏＴＥＶ（ＥＸＸＹＸＱ−Ｇ）（配列番号２３２）およびＳＵＭＯプロテアーゼを含むが、これらに限定されない。化学的切断の特殊な性質のため、ギ酸を用いる切断は、Ｐｒｏ−ＣＮＰを発生させ得、ＣＮＢｒは、ＭｅｔのＡｓｎへの置換を有するＣＮＰを発生させ得、ヒドロキシルアミンは、Ｇｌｙ−ＣＮＰを発生させ得る。あるいは、化学的またはプロテアーゼ切断は、融合タンパク質としてでないＣＮＰ変異体を発現する特定の構築物（例えば、ｐＥＴ−２１ａ−ＣＮＰ）を用いることによって避けることができる。ｐＥＴ−２１ａ−ＣＮＰの発現により、Ｍｅｔ−ＣＮＰが生じ得る。または特定の融合タンパク質（例えば、インテリン−ＣＢＤを含むもの）は、自己切断を受けて、ＣＮＰを発生させ得る。
さらなる実施形態において、融合タンパク質は、ＣＮＰ変異体とキャリアタンパク質またはタグ（例えば、ペプチドタグ）との間に切断可能なペプチドリンカーを含む。特定の実施形態において、切断可能なペプチドリンカーは、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｓｎ−Ｇｌｙ、Ｍｅｔ−Ｘ、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２３３）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２３４）、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２３５）、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２３６）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ（配列番号２３０）、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｘ（配列番号２３１）、Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号２３２）、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２３７）、およびＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＴＧＤＤＤＤＫＨＭＤ （ｐＥＴ−１５ｂ ｌｉｎｋｅｒ）（配列番号９５）からなる群から選択され、Ｘは、アミノ酸を表す。いくつかの実施形態において、切断可能なペプチドリンカーは、パラジウム、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ギ酸、ヒドロキシルアミン、クロストリパイン、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）、Ｋｅｘ２プロテアーゼ、ＯｍｐＴプロテアーゼ、Ｘａ因子プロテアーゼ、ズブチリシン、プロＴＥＶ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼ、フリリシンプロテアーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ、ヒトＰａｃｅプロテアーゼ、コラゲナーゼ、Ｎｉａプロテアーゼ、ポリオウイルス２Ａｐｒｏプロテアーゼ、ポリオウイルス３Ｃプロテアーゼ、ゲネナーゼ、フューリン、エラスターゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、レンニン（キモシン）、微生物アスパラギン酸プロテアーゼ、パパイン、カルパイン、キモパパイン、フィシン（フィカイン）、ブロメライン（ブロメラーゼ）、カテスピシンＢ、カスパーゼ、サーモライシン、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ、カリクレインおよびプラスミンからなる群から選択される切断剤により切断される。
特定の実施形態において、切断可能なキャリアタンパク質、タグ（例えば、ペプチドタグ）またはペプチドリンカーをギ酸を用いて切断して、融合タンパク質からＣＮＰ変異体を遊離させる。いくつかの実施形態において、ギ酸は、約１％〜約２０％、または約１％〜約１５％、または約２％〜約１５％、または約１％〜約１０％、または約２％〜約１０％、または約１％〜約５％、または約２％〜約５％の濃度である。特定の実施形態において、ギ酸は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の濃度である。特定の実施形態において、ギ酸は、約２％、５％または１０％の濃度である。
さらなる実施形態において、ギ酸の存在下でのＣＮＰ融合タンパク質の切断は、約２０℃〜約８０℃、または約３０℃〜約７５℃、または約４０℃〜約７５℃、または約５０℃〜約７５℃、または約５０℃〜約７０℃、または約５５℃〜約７０℃、または約５０℃〜約６０℃の温度で実施する。いくつかの実施形態において、ギ酸の存在下での切断は、約２０℃、２２℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃または８０℃で実施する。特定の実施形態において、ギ酸の存在下での切断は、約５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃で実施する。特定の実施形態において、ギ酸の存在下での切断は、約５５℃または７０℃で実施する。
さらなる実施形態において、ギ酸の存在下でのＣＮＰ融合タンパク質の切断は、約３時間〜約４８時間、または約５時間〜約４８時間、または約５時間〜約３６時間、または約５時間〜約２４時間、または約５時間〜約１８時間、または約２０時間〜約２４時間、または約６時間〜約１０時間の期間にわたり実施する。特定の実施形態において、ギ酸の存在下での切断は、約５時間、６時間、１２時間、１５時間、１８時間、２０時間または２４時間実施する。
いくつかの実施形態において、ＣＮＰ融合タンパク質の切断は、約２％、５％または１０％ギ酸の存在下で、約５５℃で約２０時間〜約３６時間、または約６０℃で約１５時間〜約２４時間、または約６５℃で約１０時間〜約２１時間、または約７０℃で約６時間〜約１８時間実施する。特定の実施形態において、ＣＮＰ融合タンパク質の切断は、約２％ギ酸の存在下で、約５５℃で約２０時間〜約２４もしくは３６時間、または約６０℃で約１５時間〜約２４時間、または約６５℃で約１０時間〜約１８時間、または約７０℃で約６時間〜約１０時間実施する。
本開示は、ＣＮＰ変異体の高い収量を得るためのギ酸を用いるＣＮＰ融合タンパク質の切断のための温和な条件を提供する。融合タンパク質の切断のための本明細書で記載する条件は、ＣＮＰ以外のポリペプチドまたはタンパク質を含み、Ａｓｐ−Ｐｒｏペプチド結合を含む融合タンパク質の切断のためにも適している。
さらなる実施形態において、可溶性ＣＮＰ融合タンパク質またはＣＮＰ融合タンパク質封入体は、ＣＮＰ融合タンパク質の化学的切断（例えば、ギ酸を用いた）またはタンパク質分解切断の前に緩衝液および／または洗剤で処理する。緩衝液の非限定的な例として、Ｂ−ＰＥＲＩＩ；希釈Ｂ−ＰＥＲＩＩ（例えば、１／２０希釈）；Ｂ−ＰＥＲ；Ｂ−ＰＥＲリン酸緩衝液；トリスを含む緩衝液（例えば、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５）；トリスおよびＮａＣｌを含む緩衝液（例えば、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．９）；ならびにＰＢＳが挙げられる。一実施形態において、緩衝液はＢ−ＰＥＲＩＩである。洗剤の非限定的な例として、オクチルスクロース、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ−４０およびＣＡ−６３０が挙げられる。洗剤は、緩衝液中に存在してよい（例えば、２５ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５中１％洗剤）。特定の実施形態において、洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＣＡ−６３０であってよい。
上記の方法および条件のいずれかを本明細書で開示するＣＮＰ変異体を作製するために上記の他の方法および条件のいずれかと組み合わせて用いることができることが理解される。
他の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、当技術分野で公知の方法に従って、例えば、ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８９年））の方法に従って、ペプチド合成装置を用いて合成し、精製する。
ペプチドは、例えば、ＣＮＰの以下のペプチド配列：Ｇ１ＬＳ（ＫまたはＲ）ＧＣ６Ｆ７Ｇ８Ｌ（ＫまたはＲまたはＮｌｅまたは６−ＯＨ−ＮＩｅ）ＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ２２に基づいて合成できる。
例示的ＣＮＰ変異体は、限定するものではないが、
類似体Ａ（ＧＬＳＫＧＣ（ＣＨ２ＮＨ）ＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号５６）、骨格のＣ６の「−Ｃ＝Ｏ」基を「−ＣＨ２」基に変換することによって作製した；
類似体Ｂ（ＧＬＳＫＧＣ（Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ）ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号５７）、骨格のＦ７の「−ＮＨ」基を「−Ｎ−ＣＨ３」基に変換することによって作製した；
類似体Ｅ（ＧＬＳＫＧＣ（Ｄ−Ｐｈｅ）ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号１３６）、Ｆ７のＤ−Ｐｈｅを使用して作製した；
類似体Ｆ（ＧＬＳＫＧＣＦ（ｔＢｕ−Ｇｌｙ）ＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号５８）、Ｇ８のｔｅｒｔｉａｒｙ−ブチル−Ｇｌｙを使用して作製した；
類似体Ｇ（ＧＬＳＫＧＣ（３−Ｃｌ−Ｐｈｅ）ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号１３７）、Ｆ７のフェニル環のメタの位置に塩素原子を付加することによって作製した（同様の変異体を、Ｐｈｅ７のフェニル環のオルト、メタおよび／またはパラをＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、ＯＨおよび／またはＣＨ３で置換することによって作製できる）；および
類似体Ｈ（ＧＬＳＫＧＣ［ＮＨＣＨ２ＣＨ（Ｐｈ）ＣＯ］ＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ）（配列番号５９）、Ｆ７の（±）−３−（アミノ）−２−フェニルプロピオン酸を使用して作製した、
を含む。
例えば、天然または非天然アミノ酸またはペプチド結合イソスターによるアミノ酸の延長、置換および／またはポリマーまたは疎水性部分との結合を有する、ＣＮＰ変異体の例は、限定するものではないが、
Figure 0005718909
 および
１、２、３、４、または５までのさらなる改変を含む、配列番号１から６および３４から１４４およびそれらの変異体
を含む。
一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、Ｃｙｓ６とＣｙｓ２２との間にジスルフィド結合を形成することを介して環化される。Ｃｙｓ６は、例えば、ホモシステインまたはペニシラミンなどのシステイン類似体であり得る。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体はヘッド−テール、側鎖−側鎖、側鎖−ヘッドまたは側鎖−テールにより形成された共有結合により環化できる。ある実施形態において、共有結合は、ペプチドのＮ末端の、またはＮ末端の前のアミノ酸と、Ｃ末端のまたはＣ末端の前のアミノ酸（本文脈において、「末端」アミノ酸と称される）との間に形成される。別の実施形態において、共有結合は、２つの末端アミノ酸の側鎖の間に形成される。まだ別の実施形態において、共有結合は、１つの末端アミノ酸の側鎖と、他の末端アミノ酸の末端基との間、あるいは２つの末端アミノ酸の末端基の間に形成される。
末端アミンと末端カルボキシル基とのヘッド−テール環化は、多くの方法、例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、アジド法、混合無水物法、ＨＡＴＵ、ＨＯＢｔ、ＨＯＮＳｕまたはＨｏＡｔなどの触媒を用いたカルボジイミド（例えば、ＤＩＣ、ＥＤＣまたはＤＣＣ）または樹脂上環化を使用して実施できる。
さらに、環状構造は、ＣＮＰ変異体のアミノ酸残基および／または末端アミノ酸残基の側鎖を含む架橋基を介して形成されてもよい。架橋基は、ペプチドの２つの部分を環化できる化学的部分である。架橋基の限定されない例は、アミド、チオエステル、ジスルフィド、尿素、カーバメート、スルホンアミドなどを含む。このような架橋基を有する単位の組み込みに関する様々な方法が、当分野において公知である。例えば、ラクタム架橋（すなわち、環状アミド）は、Ｎ末端アミノ基または側鎖上のアミノ基と、Ｃ末端カルボン酸または側鎖、例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖およびグルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖上のカルボキシル基との間に形成できる。チオエステルは、Ｃ末端カルボキシル基または側鎖上のカルボキシル基と、システインまたはシステイン類似体の側鎖上のチオール基との間に形成できる。
代替的には、架橋はランチオニン（チオジアラニン）残基を組み込み、チオエステル結合により共有結合されるアラニン残基と連結することによって形成できる。別の方法において、架橋剤、例えば、ジカルボン酸（例えば、スベリン酸（オクタン二酸））は、アミノ酸側鎖の官能基、例えば、遊離のアミノ基、ヒドロキシル基、およびチオール基を連結できる。
酵素により触媒された環化もまた使用できる。例えば、チロシジン合成酵素のチオエステラーゼドメインを使用して、チオエステル前駆体を環化でき、スブチリシン突然変異体を利用して、ペプチドグリコール酸フェニルアラニルアミドエステルを環化でき、抗体リガーゼ１６Ｇ３を用いてｐ−ニトロフェニルエステルを環化できることが報告されている。ペプチドの環化の概説に関しては、Ｄａｖｉｅｓ、Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．、９巻：４７１〜５０１
頁（２００３年）を参照されたく、その全体は参照により本明細書に援用される。
特定の実施形態において、最終環化産物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも約９９％の純度を有する。
Ｄ．化学改変ＣＮＰ変異体
ＣＮＰ２２またはその変異体の化学改変により、改変ＣＮＰペプチドに有利な特性、例えば、安定性および半減期の増加、免疫原性の低下などをもたらし得る可能性がある（治療用タンパク質の化学改変の一般的議論に関しては、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７巻（１号）：５〜２９頁（２００２年）を参照されたい）。例えば、ＣＮＰペプチドの総質量を、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約６または７ｋＤａの範囲に増加させるために、天然または合成のポリマー部分または非ポリマー部分（例えば、ＰＥＧ）と、ＣＮＰペプチドとの結合により、改変ペプチドの、エキソペプチダーゼおよび／またはエンドペプチダーゼ（例えば、ＮＥＰ）によるｉｎ ｖｉｖｏの切断に対する感受性を低下させることができる。ＰＥＧ化、グリコシル化および他の化学誘導化手法、例えば、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化による改変に加えて、および酸付加塩、アミド、エステルおよびＮアシル誘導体の生成は、免疫原性領域および／またはタンパク質分解感受性領域をマスクできる可能性もある（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻：４８０〜４８２頁（２００４年））。
化学改変の例は、限定するものではないが、安定性およびプロテアーゼ耐性の改善ならびに免疫原性の低下のためのＢｅｄｎａｒｓａｋｉのポリマー付加法およびＡｌｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの架橋法を含む。Ｂｅｄｎａｒｓａｋｉは、ポリマー付加が、タンパク質の温度安定性を改善できることを示し（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１１４巻（１号）
：３７８〜３８０頁（１９９２年））、Ａｌｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、グルタルアルデヒド架橋が酵素安定性を改善できることを発見した。
ポリペプチドの化学改変は、非特異的方法（誘導化種の混合をもたらす）または部位特異的方法（例えば、野生型巨大分子の反応性特異的誘導化および／または部位特異的変異誘発および化学改変の組合せを使用する部位選択改変に基づく）で、あるいは、発現タンパク質連結方法を使用して実施できる（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３巻（４号）：２
９７〜３０３頁（２００２年））。
ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体
一実施形態において、安定性（例えば、ＮＥＰ分解に対する耐性）の増加のために、ＣＮＰ２２またはその変異体（アミノ酸の付加、置換および／または欠失を有する変異体を含む）を親水性の天然または合成のポリマーに結合し、改変ＣＮＰペプチドの総質量を、約２．６ｋＤａまたは２．８ｋＤａから約４、５、６、７またはそれより大きいｋＤａの範囲に増加させる。特定の実施形態において、付加された親水性ポリマーは、約０．６、０．８、１、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８、または約５ｋＤａの総質量を有する。
ある実施形態において、親水性ポリマーは、結合したＣＮＰペプチドが水性（例えば、生理的）環境中で沈殿しないように水溶性である。さらに、親水性ポリマーは生体適合性である、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏで損傷、毒性または免疫反応を起こさない。
親水性ポリマーは、分枝または非分枝であってよい。一実施形態において、親水性ポリマーは分枝ではない。
親水性ポリマーに対するＣＮＰ２２またはその変異体の様々な結合部位は、限定するものではないが、：（１）Ｎ末端のみ；（２）Ｃ末端のみ；（３）内部部位のみ（例えば、Ｌｙｓ４）；（４）Ｎ末端およびＣ末端の両方；（５）Ｎ末端および内部部位；ならびに（６）Ｃ末端および内部部位、を含む。一実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体は、Ｎ末端のみにおいて親水性ポリマーに結合される。別の実施形態において、結合は内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）のみである。なお別の実施形態において、結合はＮ末端および内部部位（例えば、Ｌｙｓ４）である。さらに別の実施形態において、より優れた機能性のためにＣＮＰペプチドは、環状ドメイン内（ＣＮＰ２２のＣｙｓ６からＣｙｓ２２に対応する）の部位（例えば、Ｌｙｓ１０）において親水性ポリマーと結合しない。親水性ポリマーとの結合が、ＣＮＰペプチド上の反応性第一級アミノ基との結合形成に基づく場合、内部部位（例えば、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０）における結合は、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０を、天然または非天然アミノ酸または側鎖（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕまたはシトルリン（Ｃｉｔ））に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体と置換することによって妨害できる。特定の実施形態において、Ｌｙｓ４および／またはＬｙｓ１０は、Ａｒｇと置き換えることができる。別の実施形態において、Ｌｙｓ１０は、Ａｒｇと置き換えることはできない。
親水性ポリマーの限定されない例は、カルボン酸担持モノマー（例えば、メタクリル酸（ＭＡ）およびアクリル酸（ＡＡ））から形成されるポリマー、ポリビニルアルコール、ヒドロキシル担持モノマー（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよび３−トリメチルシリルプロピルメタクリレート（ＴＭＳＰＭＡ））から形成されるポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、モノ−Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ−ＰＥＧ（例えば、モノメトキシ−ＰＥＧ）、トレシルモノメトキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧアクリレート（ＰＥＧＡ）、ＰＥＧメタクリレート、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ｂｉｓ−スクシンイミジルカルボネートＰＥＧ、２−メタクリロイルオキシエチル−ホスホリルコリン（ＭＰＣ）およびＮ−ビニルピロリドン（ＶＰ）のコポリマー、ヒドロキシ官能性ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ＳＩＳ−ＰＥＧ（ＳＩＳは、ポリスチレン−ポリイソブチレン−ポリスチレンブロックコポリマーである）、ポリスチレン−ＰＥＧ、ポリイソブチレン−ＰＥＧ、ＰＣＬ−ＰＥＧ（ＰＣＬは、ポリカプロラクトンである）、ＰＬＡ−ＰＥＧ（ＰＬＡは、ポリ乳酸である）、ＰＭＭＡ−ＰＥＧ（ＰＭＭＡは、ポリ（メチルメタクリレート）である）、ＰＤＭＳ−ＰＥＧ（ＰＤＭＳは、ポリジメチルオキサノン）、ＰＶＤＦ−ＰＥＧ（ＰＶＤＦは、ポリフッ化ビニリデンである）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＴＭ界面活性剤（ポリプロピレンオキシド−ｃｏ−ポリエチレングリコール）、ポリ（テトラメチレングリコール）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−エチレングリコール）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ヒアルロン酸）（ＰＬＬ−ｇ−ＨＡ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ホスホリルコリン）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＣ）、ポリ（Ｌ−リジン−ｇ−ビニルピロリドン）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＶＰ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−エチレングリコール）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＥＧ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ヒアルロン酸）（ＰＥＩ−ｇ−ＨＡ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ホスホリルコリン）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＣ）、ポリ（エチルイミン−ｇ−ビニルピロリドン）（ＰＥＩ−ｇ−ＰＶＰ）、ＰＬＬ−ｃｏ−ＨＡ、ＰＬＬ−ｃｏ−ＰＣ、ＰＬＬ−ｃｏ−ＰＶＰ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＥＧ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＨＡ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＣ、ＰＥＩ−ｃｏ−ＰＶＰ、セルロースおよびその誘導体（例えば、ヒドロキシエチルセルロース）、デキストラン、デキストリン、ヒアルロン酸およびその誘導体（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）、エラスチン、キトサン、アクリル硫酸、アクリルスルホン酸、アクリルスルファミン酸、メタクリル硫酸、メタクリルスルホン酸、メタクリルスルファミン酸、それらのポリマーおよびコポリマーならびにそれらの組合せのポリマーおよびコポリマーを含む。
特定の実施形態において、親水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）とも呼ばれる。本明細書において使用する場合、「ＰＥＧ」または「ＰＥＯ」という用語はＰＥＧのすべての形態、分枝および非分枝を包含し、これらはポリペプチドを誘導化するために使用でき、限定するものではないが、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧおよびアリールオキシ−ＰＥＧを含む。
一実施形態において、ＰＥＧ−ＣＮＰ結合体は、式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーを含み、式中、ｎは約６から約１００までの整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．３ｋＤａから約５ｋＤａである。別の実施形態において、ｎは約１２から約５０までの整数であり、ＰＥＧポリマーは、約０．６ｋＤａから約２．５ｋＤａである。なお別の実施形態において、ｎは約１２から約２４までであり、ＰＥＧポリマーは、約０．６ｋＤａから約１．２ｋＤａである。さらなる実施形態において、ＰＥＧポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基により覆われている。特定の実施形態において、末端を覆っている基はアルキル基、例えばメチルなどの低分子アルキル基であるので、ＰＥＧポリマーはアルコキシ基で終結する。ある実施形態において、ＰＥＧポリマーは非分枝である。別の実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体は、ＰＥＧポリマーとＮ末端のみで結合する。
ＰＥＧおよびＰＥＯは、分子量の分散した分子を含む可能性があり、すなわち、それらが調製される手法によって、多分散である可能性がある。ポリマー調製物のサイズ／質量分布は、その重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）によって統計的に特徴づけることができ、その比は、多分散指数（Ｍｗ／Ｍｎ）と呼ばれる。ＭｗおよびＭｎは、質量分光法によって測定できる。１．５ｋＤａより大きいＰＥＧ部分に結合したＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、親ＰＥＧ分子の多分散性により、様々な分子量を示すことがある。例えば、ｍＰＥＧ２Ｋ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−０２０ＨＳ、ＮＯＦ Ｃｏ．）の場合、ＰＥＧ分子の分子量は、約１．５ｋＤａから約３ｋＤａの範囲にわたって分散しており、多分散指数は１．０３６である。それに反して、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によるＭＳ（ＰＥＧ）ｎ試薬（ｎ＝４、８、１２または２４、例えば「ＰＥＯ１２」または「ＰＥＯ２４」として表示される）を使用して、ＣＮＰ２２またはその変異体に結合したＰＥＧは単分散であり、個別の鎖長および規定分子量を有する。
ＰＥＧ部分を含むポリペプチドの作製方法は、当分野において公知である（例えば、米国特許第５，８２４，７８４号を参照されたい）。ＰＥＧ化ＣＮＰペプチドの調製方法は、（ａ）ＣＮＰペプチド（例えばＮ末端において）にＰＥＧを結合するために適切な条件下でＰＥＧ化試薬を使用して、ＣＮＰ２２またはその変異体を反応させるステップ、および（ｂ）反応産物を得るステップ、を一般的に含む。ＣＮＰペプチドのＰＥＧ化は、ＰＥＧ部分のサイズおよびＰＥＧ化の位置次第でＮＰＲ−Ｂに対するその結合を有意に改変できるので、様々な種類のＰＥＧおよびＰＥＧ化の反応条件を調査できる。ＣＮＰペプチドのＰＥＧ化に使用できる化学は、メトキシ−ＰＥＧ（Ｏ−［（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）のＮＨＳ−エステルを使用する、ペプチドの反応性第一級アミンのアシル化を含む。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳまたはメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡを用いたアシル化は、元の第一級アミンの任意の電荷を排除するアミド連結をもたらす。記号「ＰＥＯ１２」または「ＰＥＯ２４」と名付けられるＰＥＧ−ＣＮＰペプチドならびに記号「ＰＥＧ１Ｋ」、「ＰＥＧ２Ｋ」、「ＰＥＧ５Ｋ」または「ＰＥＧ２０Ｋ」と名付けられたＰＥＧ−ＣＮＰペプチドは、ＮＨＳエステル活性化の、メトキシ末端キャップ化ＰＥＧ試薬を用いた、ペプチド上の第一級アミノ基の反応を介したＰＥＧ化である。ＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、他の方法、例えば、ペプチド上の第一級アミノ基およびＰＥＧアルデヒド、例えば、ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドなど、あるいはそれらのモノ−Ｃ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体に関与する還元アミノ化により調製できる（米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。
リボソームタンパク質合成とは異なって、合成ペプチドの合成は、Ｃ末端からＮ末端へと進む。したがって、（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含有する）Ｂｏｃ−ＰＥＧは、ＰＥＧを、ペプチドのＣ末端に結合する１つの方法である（Ｒ． Ｂ． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８５巻（１４号）：２１４９〜２１５４頁（１９６３年））
。代替的には、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）化学を用いることができる（Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ および Ｒ．Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ （１９８９年））。
ＰＥＧ−ＣＮＰ変異体を調製するための本方法は、ポリマー−タンパク質結合体の実質的に均一な混合物を提供する。精製後、個別のＰＥＧ−ＣＮＰ調製物は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで生物特性を試験するために十分に純粋である。本明細書において実証されるように、特定のＰＥＧ−ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ切断に対する感受性の低下および実質的に同様またはより優れた機能性（例えば、ｃＧＭＰ産生の刺激）を示す。
本明細書に記載のように、適切なＰＥＧ化試薬／ＣＮＰペプチドの比および反応条件を使用する、ＣＮＰ２２またはその変異体のＰＥＧ化反応は、ＰＥＧ−ＣＮＰ誘導体を提供する。ＰＥＧ化の特性および範囲は、例えば、ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ解析を使用して確定できる。特定の実施形態において、ＣＮＰ２２またはその変異体の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、Ｎ末端においてモノＰＥＧ化される。ＣＮＰペプチドの生物特性についての、ＰＥＧ化の有益な効果を最適化するために、ポリマーの長さ、立体配座（例えば、分枝または線状）および／またはＰＥＧ部分の官能化（例えば、負に荷電した基の付加）を変化させることができる。ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＮＥＰ耐性、薬物動態および生物活性（例えば、ＮＰＲ−Ｂに対する結合能およびｃＧＭＰ生成の刺激能）に関して試験される。ＮＥＰ耐性の改善およびＣＮＰ２２のｃＧＭＰ−刺激活性の少なくとも約５０％を示すＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、例えば、ラットの軟骨肉腫細胞に基づく軟骨無形成症モデルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで、およびマウス軟骨無形成症動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで、さらに試験され得る。
Ｅ．ＣＮＰ変異体の使用法、ＣＮＰ変異体の医薬組成物および投与経路
ＣＮＰ変異体の使用法
骨関連障害
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、骨形成において重要な役割を果たし、ＦＧＦ受容体遺伝子（ＦＧＦＲ１、２および３）における変異は、様々な遺伝性骨格形成異常を引き起こす（Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．、５巻：５００〜５０７頁（１９９５年））。特に、ＦＧＦＲ−３における変異の活性化は、ヒト遺伝性小人症の最も一般的な形態の軟骨無形成症（Ｎａｔｕｒｅ、３７１巻：２５２〜２５４頁（１９９４年）；Ｃｅｌｌ、７８巻：３３５〜３４２頁（１９９４年））、より軽症の軟骨低形成症（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、７８５巻：１８２〜１８７頁（１９９６年））およびより重篤な新生致死の致死性骨異形成（ＴＤ）Ｉ型およびＩＩ型（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．、５巻：５０９〜５１２頁（１９９６年）；Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、９巻：３２１〜３２８頁（１９９５年））を含む長骨の障害に関与する。ＦＧＦ−２を過剰発現し、ＦＧＦＲ−３を連続活性化するマウスモデルは、長骨の短縮および大頭を示す（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ、６巻：１８６１〜７３頁（１９９５年））。このモデルに一致して、マウスのＦＧＦＲ−３における欠損は、成長板が広くなる著しい骨格の過剰成長を示す（ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．、１２巻：３９０〜３９７頁（１９９６年））。
ＣＮＰ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃを用いた補足実験により、受容体に対応するペプチドリガンドと、骨成長との間の関連性が示唆される。トランスジェニックマウス中のＣＮＰの血漿濃度の上昇によるＮＰＲ−Ｂの活性化は、ＦＧＦＲ−３ノックアウトマウスの成長板軟骨の過剰成長（Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、４巻：３９０〜３９７頁（１９９６年））と組織学的に類似の、骨格の過剰成長（Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１０巻：８０〜８６頁（２００４年））を引き起こす。ＮＰＲ−Ｃノックアウトマウスにおいて、ＣＮＰのＮＰＲ−Ｃ−仲介クリアランスは、除外されるべきであり、この予測に一致して、ノックアウト動物は、長骨の延長および脊柱後弯症を伴う椎骨の延長を示す（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９６巻：７４０３〜０８頁（１９９９年））。反対に、ＣＮＰノックアウトマウスは、長骨および椎骨の短縮、軟骨無形成症の表現型と組織学的に類似の表現型により発育が止まり、不正咬合および小型の胸部による肺の制限の結果として死亡率が増加する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９８巻：４０１６〜４０２１頁（２００１年））。ＮＰＲ−Ｂの活性化因子としてのＣＮＰの提唱された役割に一致して、ＮＰＲ−Ｂノックアウトマウスは、ＣＮＰノックアウトマウスと同じ発育が停止した骨格表現型および死亡率の増加を有する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０１巻：１７３００〜０５頁（２００４年））。さらに、軟骨においてＦＧＦＲ−３が活性化された、軟骨無形成症のマウスモデルにおいて、軟骨細胞中のＣＮＰのターゲティングされた過剰発現は、小人症と反対に作用する（Ｙａｓｏｄａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０巻：８０〜８６頁（２００４年））。さらに、ＣＮＰは、限定するものではないが、軟骨細胞の増殖および分化、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ／ＭＥＫ（Ｒａｆ−１）キナーゼシグナル伝達経路の阻害および軟骨内骨化の促進（Ｙａｓｏｄａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０巻：８０〜８６頁（２００４年））を含む、軟骨内骨成長および軟骨細胞活性の制御において役目を果たすことが示されている。これらの結果は、ＣＮＰ／ＮＰＲ−Ｂ系の活性化が、ヒト軟骨無形成症の治療のための治療戦略である可能性を示唆している。
軟骨細胞のマトリックス産生、増殖および分化を刺激し、長骨の成長を増大させることにより、本開示のＣＮＰ変異体は、骨格異形成症などの骨関連障害に罹患しているヒトを含む哺乳動物を治療するのに有用である。ＣＮＰ反応性の骨関連障害および骨格異形成症の非限定的な例として、軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、低身長症、骨軟骨異形成症、致死性異形成症、骨形成不全症、軟骨無発生症、点状軟骨異形成症、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨異形成症、弯曲肢異形成症、先天性致死性低リン酸血症、周生期致死型骨形成不全症、短肋骨多指症候群、低軟骨形成症、近節短縮型点状軟骨異形成症、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨形成不全症、捻曲性骨異形成症、先天性大腿骨短縮症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｓｈｏｒｔ ｆｅｍｕｒ）、ランガー型中間肢異形成症、ニーバーゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、ラインハルド症候群、先端異骨症、末梢性骨形成不全症、クニースト異形成症、線維軟骨形成、ロバーツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニースト症候群、変容性骨異形成症（ｍｅｔａｔｒｏｐｈｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）および脊椎骨端骨幹端異形成症（ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｍｅｔａｐｈｙｓｅａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）が挙げられる。さらに、ＣＮＰ変異体は、特発性低身長および他の骨格異形成症を治療するための成長ホルモンの補助または代替物として有用である。
さらに、ＣＮＰ変異体は、くる病、低リン酸血症性くる病［Ｘ連鎖低リン酸血症性くる病（ビタミンＤ抵抗性くる病とも呼ばれている）および常染色体優性低リン酸血症性くる病を含む］ならびに骨軟化症［腫瘍誘発性骨軟化症（腫瘍性骨軟化症または腫瘍性低リン酸血症性骨軟化症とも呼ばれている）を含む］などの他の骨関連状態および障害を治療するのに有用である。
本開示のＣＮＰ変異体は、骨関節症を治療するのにも用いることができる。骨関節症は、関節軟骨の変性疾患であり、高齢者に頻繁に起こる。骨関節症は、関節成分の変性に起因する軟骨の破壊ならびに骨および軟骨の増殖性変化を伴い、変化は、二次性関節炎（例えば、滑膜炎）をもたらす。骨関節症においては軟骨の機能性構成要素である細胞外マトリックスタンパク質が減少し、軟骨細胞の数が減少している（Ａｒｔｈ． Ｒｈｅｕｍ．、４６巻（８号）、１９８６〜１９９６頁（２００２年））。軟骨細胞のマトリックス産生、増殖および分化を促進することにより、ＣＮＰ変異体は、ＦＧＦ−２の望ましくない作用に対抗し、骨関節症を含む関節炎に罹患している被験体におけるマトリックス合成を増加させ、それにより、骨関節症を含む関節炎を治療するのに有用である。
血管平滑筋の障害
ＣＮＰおよび他の血管作用ペプチド（ＡＮＰ、ＢＮＰおよびウロジラチンを含む）は血管拡張および利尿特性を有し、心血管の恒常性において重要な役割を果たす（Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１１７巻：１６００〜０６頁（１９９８年）；Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、４９巻：１７３２〜３７頁（１９９６年）；Ａｍ．Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７５巻：Ｈ１８２６〜１８３３頁（１９９８年））。ＣＮＰは、心血管系において広範囲に分布し、特に、血管内皮細胞において高濃度である（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１１７巻：１６００〜０６頁（１９９８年））。ＣＮＰは、血管平滑筋、特に冠循環においての強力な弛緩薬であり（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２０５巻：７６５〜７７１頁（１９９４年））、平滑筋細胞増殖の阻害剤である（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１７７巻：９２７〜９３１頁（１９９１年））。ＣＮＰの血管拡張効果はＡＮＰの血管拡張効果より低いが（約１：１００）（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．Ｒｅｓ．、２１巻：７〜１３頁（１９９８年）、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７５巻：Ｌ６４５〜Ｌ６５２頁（１９９８年））、ＣＮＰｍＲＮＡはせん断応力に対する応答において増加し（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．、３７３巻：１０８〜１１０頁（１９９５年））、ＣＮＰの血漿レベルは、炎症性心血管病理において上昇する （Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８巻：１１７７〜１１８２頁（１９９４年））。ＣＮＰは、ウサギの負傷した頸動脈においてマクロファージの侵入の阻害を介して炎症を抑制し（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、９１巻：１０６３〜１０６９頁（２００２年））、ＮＰＲ−Ｂ／ｃＧＭＰ−依存性経路を介して心臓線維芽細胞増殖を直接阻害する（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４４巻：２２７９〜２２８４頁（２００
３年））ことが示されている。
ＣＮＰの心血管作用は、ＮＰＲサブタイプ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃの活性化を介して仲介され（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３０巻：２２９〜２３９頁（１９９２年））、後者はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるＮＰＲの９５％を占める（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻：１６５７〜１６６２頁（２００１年））。ＣＮＰ／ＮＰＲ−Ｂ経路は、心血管系の安定した第２メッセンジャーであるｃＧＭＰの上昇をもたらす。Ｃ末端由来のＮＰＲ−Ｃの３７−アミノ酸部分は、ヘテロ三量体のＧタンパク質Ｇｉと相互作用するコンセンサス配列を有し（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４巻：１７５８７〜１７５９２頁（１９９９年））、これはアデニル酸シクラーゼおよびホスホリパーゼＣの活性を制御することが示されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７６巻：２２０６４〜７０頁（２００１年）；Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７８巻：Ｇ９７４〜９８０頁（２０００年）；Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１巻：１９３２４〜１９３２９頁（
１９９６年））。ＣＮＰは、ＮＰＲ−Ｃの活性化を介して、平滑筋の過分極および弛緩ならびにＧタンパク質により制御された、内部修正Ｋ＋チャネルの開放を仲介する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１００巻：１４２６〜１４３１頁（２００３年））。同様に、ＣＮＰは、心臓線維芽細胞において重要な抗増殖効果を有し、ＮＰＲ−Ｃとの相互作用を介して、平滑筋細胞の過分極化によって局所血流および全身血圧を制御する（Ｒ．Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｗ． Ｇｉｌｅｓ， Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．５８６巻：３５３〜３６６頁（２００８年））。
血管平滑筋細胞上のＮＰＲ−Ｂに結合することにより、ＣＮＰ２２は、細胞内二次メッセンジャーとして作用するｃＧＭＰの産生を刺激して、血管の弛緩を最終的に引き起こす。ＣＮＰの降圧作用に基づいて、本開示のＣＮＰ変異体は、高血圧、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性および慢性腎不全などを治療するのに有用である。さらに、ｃＧＭＰシグナル伝達の活性化により、血管平滑筋細胞の増殖が抑制される。したがって、本開示のＣＮＰ変異体は、再狭窄およびアテローム動脈硬化症を含むが、これらに限定されない、血管平滑筋細胞の異常な増殖によって引き起こされる状態または疾患を治療するのに用いることができる。
上記の研究から、ＣＮＰが血管平滑筋の弛緩およびリモデリングに対する潜在的な治療薬候補であり得ることが示唆される。特定の障害についてのＣＮＰの薬理作用は、血管拡張活性でなく、血管保護作用に一部帰せられた（Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、１７０巻、１２０４〜１２１１頁（２００４年））。したがって、本開示のＣＮＰ変異体は、状態、例えば、限定するものではないが、ＣＮＰが、血管平滑筋弛緩を誘導し、マクロファージの心臓組織内への浸潤を抑制することを含む、血管保護作用を有し得る血管平滑筋障害を治療するのに有用である。１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、急性非代償性心不全および急性鬱血性心不全を含むが、これらに限定されない心不全を治療するのに用いられる。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、喘息、心筋症および冠動脈の再狭窄を治療する（平滑筋細胞弛緩を増加させ、平滑筋細胞の増殖を減少させることにより）のに用いられる。
ＣＮＰ変異体の医薬組成物
さらなる実施形態において、本開示は、ＣＮＰ変異体ならびに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、キャリアおよび／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、該組成物は、１つ以上の他の生物学的に活性な薬剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤および／またはクリアランス受容体ＮＰＲ−Ｃ阻害剤）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、該組成物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度の所望のＣＮＰ変異体を含む。特定の実施形態において、該組成物は、約１０％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％未満の他の哺乳類（例えば、ヒト）タンパク質および他のＣＮＰ変異体などの巨大分子夾雑物を含む。
賦形剤、キャリアおよび希釈剤の非限定的な例として、媒体、液体、緩衝液、等張化剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、湿潤剤、アジュバントが挙げられる。該組成物は、液体（例えば、水、エタノール）；様々な緩衝液成分（例えば、トリス−ＨＣｌ、リン酸塩、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）；抗酸化剤（例えば、メチオニン、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）；保存剤（例えば、チメロゾール、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール）；および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース）を含んでいてよい。医薬組成物の製剤化における賦形剤、希釈剤およびキャリアの使用は、当技術分野において公知である。例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１４３５〜１７１２頁、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９０年））を参照のこと。
例えば、キャリアとしては、限定するものではないが、希釈剤、媒体およびアジュバント、ならびに有効成分（複数可）と反応しないインプラントキャリアならびに不活性非毒性の固体増量剤または液体増量剤およびカプセル封入材料が挙げられる。キャリアの非限定的な例として、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、水および乳剤（例えば、油／水型乳剤）が挙げられる。キャリアは、溶媒または例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油およびそれらの混合物を含む分散媒であってよい。
いくつかの実施形態において、該組成物は、液体製剤である。特定の実施形態において、該組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、または約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲内のＣＮＰ変異体を含む。
さらなる実施形態において、該組成物は、ＣＮＰ含有溶液または懸濁液のｐＨを所望の範囲内に維持するための緩衝液または緩衝剤を含む。緩衝液の非限定的な例として、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ハンクス緩衝生理食塩水が挙げられる。緩衝剤としては、限定するものではないが、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムが挙げられる。緩衝剤の混合物も用いることができる。特定の実施形態において、緩衝剤は、酢酸／酢酸塩またはクエン酸／クエン酸塩である。組成物中の適切な緩衝剤の量は、用いる特定の緩衝液および溶液または懸濁液の所望のｐＨに一部依存する。例えば、酢酸塩は、ｐＨ６よりｐＨ５でより効果的なｐＨ緩衝剤であり、したがって、ｐＨ６の溶液におけるより少ない酢酸塩をｐＨ５の溶液に用いることができる。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、約１０ｍＭ±５ｍＭの濃度を有する。特定の実施形態において、組成物のｐＨは、約ｐＨ３〜約ｐＨ７．５、または約ｐＨ３．５〜約ｐＨ７、または約ｐＨ３．５〜約ｐＨ６．５、または約ｐＨ４〜約ｐＨ６、または約ｐＨ４〜約ｐＨ５であるか、または約ｐＨ５．０±１．０である。
他の実施形態において、該組成物は、溶液または懸濁液を等張性とし、注射により適合性にするための等張性調節剤を含む。等張化剤の非限定的な例として、ＮａＣｌ、デキストロース、グルコース、グリセリン、ソルビトール、キシリトールおよびエタノールが挙げられる。特定の実施形態において、等張化剤は、ＮａＣｌである。特定の実施形態において、ＮａＣｌは、約１６０±２０ｍＭ、または約１４０ｍＭ±２０ｍＭ、または約１２０±２０ｍＭ、または約１００ｍＭ±２０ｍＭ、または約８０ｍＭ±２０ｍＭ、または約６０ｍＭ±２０ｍＭの濃度である。
さらにまた他の実施形態において、該組成物は、保存剤を含む。保存剤は、ｍ−クレゾールおよびベンジルアルコールを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、保存剤は、約０．４％±０．２％、または約１％±０．５％、または約１．５％±０．５％、または約２．０％±０．５％の濃度である。
さらに他の実施形態において、該組成物は、吸着防止剤（例えば、ガラスまたはプラスチックへのＣＮＰ変異体の吸着を減少させるため）を含む。吸着防止剤としては、限定するものではないが、ベンジルアルコール、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０が挙げられる。特定の実施形態において、吸着防止剤は、約０．００１％〜約０．５％、または約０．０１％〜約０．５％、または約０．１％〜約１％、または約０．５％〜約１％、または約０．５％〜約１．５％、または約０．５％〜約２％、または約１％〜約２％の濃度である。
さらなる実施形態において、該組成物は、安定化剤を含む。安定化剤の非限定的な例として、グリセリン、グリセロール、チオグリセロール、メチオニンならびにアスコルビン酸およびその塩が挙げられる。いくつかの実施形態において、安定化剤がチオグリセロールまたはアスコルビン酸もしくはその塩である場合、安定化剤は、約０．１％〜約１％の濃度である。他の実施形態において、安定化剤がメチオニンである場合、安定化剤は、約０．０１％〜約０．５％、または約０．０１％〜約０．２％の濃度である。さらに他の実施形態において、安定化剤がグリセリンである場合、安定化剤は、約５％〜約１００％（ニート）の濃度である。
さらなる実施形態において、該組成物は、抗酸化剤を含む。具体例としての抗酸化剤としては、限定するものではないが、メチオニンおよびアスコルビン酸が挙げられる。特定の実施形態において、抗酸化剤のＣＮＰ変異体に対するモル比は、約０．１：１〜約１５：１、または約１：１〜約１５：１、または約０．５：１〜約１０：１、または約１：１〜約１０：１、または約３：１〜約１０：１である。
限定するものではないが、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩）、有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩）およびアミンの塩（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジエタノールアミン）を含む薬学的に許容される塩を組成物に用いることができる。薬学的に許容される塩の十分な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９０年））に見いだされる。
医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤および経皮パッチなどの様々な形態で投与することができる。組成物の剤形は、組成物の所望の投与方法に合わせて調合することができる。経口投与のために、該組成物は、例えば、錠剤またはカプセル剤（軟ゲルカプセル剤を含む）の形をなしてよく、あるいは例えば、水性もしくは非水性液剤、懸濁剤またはシロップ剤であってよい。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、マンニトール、ラクトース、グルコース、スクロース、デンプン、トウモロコシデンプン、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、炭酸マグネシウムなどの１つ以上の一般的に用いられている賦形剤、希釈剤およびキャリア、ならびに滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム）を含んでいてよい。所望の場合、香味剤、着色剤および／または甘味剤を固体製剤および液体製剤に加えることができる。経口製剤用の他の必要に応じた成分としては、限定するものではないが、保存剤、懸濁化剤および増粘剤が挙げられる。経口製剤は、胃の酸性環境からＣＮＰ変異体を保護するための腸溶性コーティングも有していてよい。固体剤形および液体剤形を調製する方法は、公知であるか、あるいは当業者には明らかである（例えば、上で参考文献として引用した、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照）。
非経口投与用の製剤は、例えば、溶液もしくは懸濁液として、注射前に液体媒体に可溶化もしくは懸濁するのに適する固体形態として、または乳剤として調製することができる。例えば、滅菌注射用液剤および懸濁剤は、適切な希釈剤、キャリア、溶媒（例えば、緩衝水溶液、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液）、分散剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤などを用いて当技術分野で公知の技術により製剤化することができる。さらに、滅菌固定油、脂肪エステル、ポリオールおよび／または他の不活性成分を用いることができる。さらなる例として、非経口投与用の製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および該製剤を意図するレシピエントの血液と等張性にする溶質を含んでいてよい、水性滅菌注射用液剤、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでいてよい、水性および非水性滅菌懸濁剤が挙げられる。
ＣＮＰ変異体を含む組成物は、凍結乾燥製剤であってもよい。特定の実施形態において、凍結乾燥製剤は、緩衝剤および増量剤を、ならびに必要に応じて、抗酸化剤を含む。具体例としての緩衝剤としては、限定するものではないが、酢酸緩衝剤およびクエン酸緩衝剤が挙げられる。具体例としての増量剤としては、限定するものではないが、マンニトール、スクロース、デキスラン、ラクトース、トレハロースおよびポビドン（ＰＶＰＫ２４）が挙げられる。特定の実施形態において、マンニトールは、約３％〜約１０％、または約４％〜約８％、または約４％〜約６％の量である。特定の実施形態において、スクロースは、約６％〜約２０％、または約６％〜約１５％、または約８％〜約１２％の量である。具体例としての抗酸化剤は、メチオニンおよびアスコルビン酸を含むが、これらに限定されない。
本開示はまた、例えば、液体（例えば、滅菌注射用）製剤または固体（例えば、凍結乾燥）製剤を含むビン、バイアル、アンプル、管、カートリッジおよび／または注射器を含むキットを提供する。キットはまた、限定するものではないが、注射のために凍結乾燥製剤を注射器内で再構成することを含む、投与（例えば、注射による）のために固体（例えば、凍結乾燥）製剤を液剤もしくは懸濁剤に再構成するための、または濃縮物をより低い濃度に希釈するための薬学的に許容される媒体もしくはキャリア（例えば、溶媒、溶液および／または緩衝液）を含んでいてよい。さらに、即時調合注射液剤および懸濁剤は、例えば、ＣＮＰ含有組成物を含む滅菌散剤、顆粒剤または錠剤から調製することができる。キットはまた、エアゾールもしくは注射ディスペンシングデバイス、ペン型注入器、自動注入器、無針注入器、注射器および／または針などのディスペンシングデバイスを含んでいてよい。
非限定的な例として、キットは、シングルチャンバーまたはデュアルチャンバーを有する注射器を含んでいてよい。シングルチャンバー型注射器については、シングルチャンバーは、注射できる状態の液体ＣＮＰ製剤、あるいは注射用の液剤もしくは懸濁剤に再構成することができる固体（例えば、凍結乾燥）ＣＮＰ製剤または比較的少量の適切な溶媒系（例えば、グリセリン）中ＣＮＰ変異体の液体製剤を含むことができる。デュアルチャンバー型注射器については、１つのチャンバーは、薬学的に許容される媒体またはキャリア（例えば、溶媒系、溶液もしくは緩衝液）を含むことができ、他のチャンバーは、第１のチャンバーからの媒体またはキャリアを用いて注射用の液剤もしくは懸濁剤に再構成することができる固体（例えば、凍結乾燥）ＣＮＰ製剤または比較的少量の適切な溶媒系（例えば、グリセリン）中ＣＮＰ変異体の液体製剤を含むことができる。
さらなる例として、キットは、１つ以上のペン型注入器または自動注入器デバイスおよびデュアルチャンバー型カートリッジを含んでいてよい。カートリッジの１つのチャンバーは、薬学的に許容される媒体またはキャリア（例えば、溶媒系、溶液もしくは緩衝液）を含むことができ、他のチャンバーは、第１のチャンバーからの媒体またはキャリアを用いて注射用の液剤もしくは懸濁剤に再構成することができる固体（例えば、凍結乾燥）ＣＮＰ製剤または比較的少量の適切な溶媒系（例えば、グリセリン）中ＣＮＰ変異体の液体製剤を含むことができる。カートリッジは、所望の期間（例えば、１日間、２日間、３日間、１週間、２週間、３週間、４週間など）にわたって投薬するのに十分な量のＣＮＰ変異体を含むことができる。ペン型注入器または自動注入器は、カートリッジから所望の量のＣＮＰ製剤を投与するように調節することができる。
さらに、ＣＮＰ変異体を含む医薬組成物は、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間または３ヵ月間などの所望の期間にわたって比較的に一定のレベルの用量を維持するための徐放、放出制御または持続放出システムとして製剤化することができる。徐放製剤、放出制御製剤または持続放出製剤は、例えば、生分解性ポリマーシステム｛例えば、親水性ポリマー［例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−グリコリド）］を含み得る｝を用いて調製することができ、当技術分野で公知である、例えば、微小粒子、ミクロスフェアまたはリポソームの形態をなすことができる。
用量および投与頻度
本明細書において使用する場合、活性物質（例えば、ＣＮＰ変異体）の「治療有効量」という用語は、患者に治療的有用性を提供する量を指す。この量は、個人ごとに変化してよく、患者の全生理的状態を含む多くの因子に依存することができる。ＣＮＰ変異体の治療有効量は、公的に入手可能な材料および手法を使用して、当業者により容易に確定できる。例えば、治療に使用するＣＮＰ変異体の量は、０〜１７歳の軟骨無形成症の小児（２１４例の女児および１８９例の男児）に関する、年齢に対する身長、頭囲および部分的成長が記載された成長表に基づく成長の許容率が示されるべきである（Ｈｏｒｔｏｎ ＷＡ ら、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｆｏｒ ａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ．、９３巻：４３５〜８頁（１９７８年））。ＣＤＣ表は、年齢に対する体重および身長に対する体重または年齢に対するＢＭＩを評価するために使用できる。事実上、より慢性である過程を有する二次的な結果もまた測定できる。
野生型ＣＮＰ２２より長い血清半減期を有するので、ＣＮＰ変異体は、ＣＮＰ２２より投与の頻度を少なくできる可能性がある。特定の個人のための投与頻度は、治療すべき障害ならびに治療に対する個人の病態および応答を含む様々な因子に依存して変えることができる。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体を含有する医薬組成物は、１日に約１回、２日に１回、３日に１回または週に１回被験体に投与される。一実施形態において、骨関連障害（例えば、軟骨無形成症を含む骨格形成異常）の治療のために、ＣＮＰ変異体の毎日の用量または毎週の用量を、成人になるまで、および／または成人の間、患者に投与する。
本明細書に記載のＣＮＰ変異体を、治療有効用量で患者に投与し、骨関連障害（例えば、軟骨無形成症を含む骨格形成異常）および病態（例えば、血管平滑筋障害）を、治療、改善または予防でき、ＣＮＰは、血管保護効果を提供できる。ＣＮＰ変異体の安全性および治療効力は、細胞培養または実験動物において標準的な薬理学的手法によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定することによって決定できる。毒性と、治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表される。高い治療指数を示す活性物質が、普通好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを使用して、ヒトにおいて使用する用量範囲を処方できる。容量は、普通、ＥＤ５０を含み、毒性がほとんどないまたは最小である循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化する可能性がある。治療有効用量は、細胞培養アッセイおよび動物実験から決定できる。
特定の実施形態において、本明細書で記載するＣＮＰ変異体は、約５もしくは１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、または約２０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲内の用量で投与する。いくつかの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０もしくは２０００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量または担当医が適切と考える他の用量で投与する。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしくは１０００ｕｇ／ｋｇまたは約１、１．２５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０ｍｇ／ｋｇの用量あるいは担当医が適切と考える他の用量で投与する。本明細書で記載するＣＮＰ変異体の用量は、限定するものではないが、毎日、週２回または３回、週１回、２週間ごと、３週間ごと、月１回などを含む、本明細書で記載する投薬頻度／投与の頻度に従って投与することができる。
個々の被験体についてのＣＮＰ変異体の投薬／投与の頻度は、治療する障害ならびに状態および療法に対する被験体の反応を含む様々な因子によって変化し得る。ＣＮＰ変異体は、単一用量または投薬当たり複数用量で投与することができる。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、単一用量で、または複数用量で、毎日、２日ごと、３日ごと、週２回、週３回、週１回、隔週、３週ごと、月１回、６週ごと、２ヵ月ごと、３ヵ月ごとに、または担当医が適切と考えるように投与する。
いくつかの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、成長（例えば、軟骨形成）の期間とそれに続く回復期間（例えば、骨形成）が準備されるように投与する。例えば、ＣＮＰ変異体は、ある期間にわたり毎日または週に複数回、静脈内、皮下または他の方法により投与した後、無治療期間をおき、次いで、このサイクルを繰り返す。いくつかの実施形態において、治療の最初の期間（例えば、毎日または週に複数回のＣＮＰ変異体の投与）は、３日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間である。関連実施形態において、無治療の期間は、３日間、１週間、２週間、３週間または４週間続く。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体の投薬計画は、３日間にわたり毎日の後、３日間無投与；または１週間にわたり毎日もしくは１週間にわたり週に複数回の後、３日間もしくは１週間無投与；または２週間にわたり毎日もしくは２週間にわたり週に複数回の後、１もしくは２週間無投与；または３週間にわたり毎日もしくは３週間にわたり週に複数回の後、１、２もしくは３週間無投与；または４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２週間にわたり毎日もしくは４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２週間にわたり週に複数回の後、１、２、３もしくは４週間無投与である。
投与方法
ＣＮＰ変異体またはそれらを含む医薬組成物は、例えば、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または髄腔内注射によるなどの種々の方法で被験体に投与することができる。一実施形態において、ＣＮＰ変異体は、１日に１回、単一の皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または髄腔内注射により投与する。
ＣＮＰ変異体はまた、疾患の部位またはその近くへの直接注射により投与することができる。さらに、ＣＮＰ変異体は、作用の標的部位（例えば、異常骨または異形成骨）におけるデポー剤の埋め込みにより投与することができる。あるいは、ＣＮＰ変異体は、舌の下に舌下（例えば、舌下錠）に、または肺内への吸入（例えば、吸入器もしくはエアゾール噴霧器）により、鼻腔内への送達（例えば、鼻内噴霧器）により、眼内への送達（例えば、点眼剤）により、または経皮送達（例えば、皮膚上へのパッチにより）により投与することができる。ＣＮＰ変異体は、マイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム（非荷電または荷電の（例えば、陽イオンの））、ポリマー微小粒子（例えば、ポリアミド、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−グリコリド））、マイクロエマルジョンなどの形態で経口投与することもできる。
さらなる投与方法は、所定の期間にわたるＣＮＰ変異体または医薬組成物の制御された連続的かつ／または徐放送達を可能にする、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚｅｔポンプ）またはミニポンプ（例えば、Ａｌｚｅｔミニ浸透圧ポンプ）によるものである。浸透圧ポンプまたはミニポンプは、皮下に、または標的部位（例えば、四肢の長骨、骨端など）の近くに埋め込むことができる。
上で説明したように、ＣＮＰ変異体は、再狭窄およびアテローム動脈硬化症を含むが、これらに限定されない、血管平滑筋細胞の異常な増殖によって引き起こされた状態または疾患を治療するのに用いることができる。罹患した体内の管（例えば、血管）へのＣＮＰ変異体の局所的送達のために、ＣＮＰ変異体は、罹患部位に埋め込まれた医療器具（例えば、ステント）により送達することができる。１つの実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ステント一面に処理したポリマーマトリックスまたはポリマーコーティングに含浸されている。他の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ステントの本体に形成され、ＣＮＰ変異体が拡散することができる多孔質ポリマー膜または層によって被覆されたリザバーまたはチャネルに含まれている。ポリマーマトリックス、コーティング、膜または層は、当技術分野で公知である、少なくとも１つの生分解性（例えば、親水性）ポリマーを含んでいてよい。さらなる実施形態において、ＣＮＰ変異体は、ステントの本体におけるミクロ孔に含ませることができる。ＣＮＰ変異体は、バースト放出、パルス放出、制御放出もしくは持続放出、またはそれらの組合せによりステントから送達させることができる。例えば、ステントは、バースト放出とそれに続く持続放出で罹患部位にＣＮＰ変異体を局所的に送達することができる。持続放出は、約２週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、６ヵ月間または１年間の期間にわたり得る。
ＣＮＰ変異体またはその組成物を他の方法によっても投与することができることは、当業者には明らかである。ＣＮＰ変異体またはその組成物の最も有効な投与方法の決定は、当業者の技術の範囲内である。
ＣＮＰ変異体は、例えば、経口（口内および舌下を含む）、直腸、鼻、局所、肺、膣もしくは非経口（筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下および静脈内を含む）投与に適する医薬製剤として、または吸入もしくは吹入による投与に適する形態で投与することができる。意図する投与方法に依存して、医薬製剤は、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤などのような固体剤形、半固体剤形または液体剤形の形態であってよい。製剤は、正確な用量の単回投与に適する単位剤形で提供することができる。製剤は、有効量のＣＮＰ変異体、ならびに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、キャリアおよび／または希釈剤を、ならびに必要に応じて、１つ以上の他の生物学的に活性な剤を含む。
併用治療
一実施形態において、ＣＮＰ変異体は治療に有用な１種または複数種の他の活性物質を組み合わせて使用して、例えば、骨関連障害（例えば、骨格形成異常）および血管平滑筋障害などのＣＮＰ応答性病態または障害を改善または予防できる。他の活性物質は、ＣＮＰ変異体の効果を増強でき、かつ／またはＣＮＰ変異体の効果に加えて、他の薬理学的効果を発揮できる。本明細書に記載のＣＮＰ変異体と組み合わせて使用できる活性物質の限定されない例は、他のナトリウム利尿ペプチド（例えば、ＢＮＰ）、ならびにペプチダーゼおよびプロテアーゼ（例えば、ＮＥＰおよびフューリン）、ＮＰＲ−Ｃおよびチロシンキナーゼ（例えば、ＦＧＦＲ−３）の阻害剤（例えば、拮抗薬）である。ＣＮＰ変異体のＮＥＰ切断を予防することによって、ＮＥＰ阻害剤は変異体の半減期を増加できる。ＮＥＰ阻害剤の例は、限定するものではないが、チオルファンおよびカンドキサトリルを含む。ＮＰＲ−Ｃ阻害剤の同時使用もまた、ＮＰＲ−Ｃによる変異体のクリアランスの阻害を介してＣＮＰ変異体の半減期を増加できる。ＮＰＲ−Ｃ阻害剤の限定されない例は、断片ＦＧＩＰＭＤＲＩＧＲＮＰＲ（配列番号８２）であり、これは、ＦＧＩＰＭＤＲＩＧＲＮＰＲ−ＣＮＰ２２キメラ（類似体ＣＺ）（配列番号８２）またはＣＮＰ２２の変異体（例えば、ＣＮＰ２２に関してアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含有する変異体）を含む類似のキメラのタンパク質分解切断についての標的部位（例えば、骨成長板）において放出される。チロシンキナーゼ阻害剤の同時使用は、軟骨細胞および骨成長の負の制御因子であるチロシンキナーゼ受容体ＦＧＦＲ−３を阻害することによって、ＣＮＰ療法の効果を強化することができる。チロシンキナーゼ阻害剤の限定されない例は、米国特許第６，３２９，３７５号および第６，３４４，４５９号に開示されたチロシンキナーゼ阻害剤を含む。
併用治療において適切な治療結果を達成するために、所望の治療結果（例えば、骨成長の回復）を生み出すために有効な量で組み合わせたＣＮＰ組成物および他の治療薬を、一般に被験体に投与する。この過程は、ＣＮＰ組成物および他の治療薬を同時に投与するステップを含むことができる。同時投与は、ＣＮＰ変異体および他の治療薬の双方を含む単一組成物または薬理学的タンパク質製剤を投与することによって達成することができる。代替的には、他の治療薬を、ＣＮＰ変異体の薬理学的製剤（例えば、錠剤、注射または飲み物）とほぼ同時に別々に摂取できる。ＣＮＰ変異体はさらに、接種に適したブラウニー、パンケーキまたはケーキなどの食品に処方することもできる。
他の選択肢において、ＣＮＰ変異体の投与は、数分から数時間の範囲の間隔で他の治療薬の投与の前後に実施できる。他の治療薬およびＣＮＰ組成物を別々に投与する実施形態において、一般的に、ＣＮＰ変異体および他の治療薬の双方が、相乗的または相加的に、患者において有益な効果を発揮できるように、ＣＮＰ変異体および他の治療薬を、互いに適切な時間内に投与することを確実にする。例えば、ＣＮＰ組成物を、他の治療薬の（前後）約０．５〜６時間内に投与できる。一実施形態において、ＣＮＰ組成物を、他の治療薬の（前後）約１時間内に投与する。
患者集団の特定およびモニター
ＣＮＰ療法に適切な被験体を特定し、所与の患者がＣＮＰ療法に応答するかどうかを決定するプロトコルを確立できる。例えば、骨関連障害の治療のために、子宮内および新生児の長骨成長の測定ならびにＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＣｏｌｌａｇｅｎＩＩ、オステオカルシンおよび増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）などの骨成長のバイオマーカーの測定などの成長の指標を測定できる。
１つのＣＮＰシグナル伝達マーカーは、ｃＧＭＰ（グアノシン３’，５’サイクリック一リン酸）である。この細胞内シグナル伝達分子のレベルは、ＣＮＰが同種受容体ＮＰＲ−Ｂに結合し、それを活性化した後に上昇する。ｃＧＭＰのレベルの上昇は、ＣＮＰ曝露後の細胞培養抽出物（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、ＣＮＰ曝露後の骨外植片試験からのならし培地（ｅｘ ｖｉｖｏ）、および皮下、静脈内または当技術分野で公知の他の投与経路によるＣＮＰの投与の数分以内の血漿（ｉｎ ｖｉｖｏ）において測定することができる。
軟骨および骨特異的分析対象物（または軟骨および骨関連マーカー）もＣＮＰの有効性を評価するために測定することができる。例えば、切断されたＩＩ型コラーゲンの断片は、軟骨代謝回転の軟骨特異的マーカーである。ＩＩ型コラーゲンは、軟骨の主な有機成分であり、ＩＩ型コラーゲンの断片（切断コラーゲン）は、軟骨代謝回転の後に循環中に放出され、その後に尿中に分泌される。軟骨代謝回転は、新たな骨形成より先に起こる。
測定することができる骨形成の骨特異的バイオマーカーは、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端プロペプチド（ＰＩＮＰ）である。Ｉ型コラーゲンは骨マトリックスにおける主な有機成分であるので、Ｉ型コラーゲンの合成は、骨形成における重要なステップである。コラーゲン合成の間に、プロペプチドが、プロコラーゲン分子から放出され、血清中で検出することができる。さらに、Ｉ型コラーゲンの断片を骨吸収のマーカーとして測定することができる。
軟骨および骨の形成および成長の他の潜在的ななバイオマーカーとして、アグリカンコンドロイチン硫酸（軟骨代謝回転の軟骨特異的マーカー）、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチド（軟骨形成の軟骨特異的マーカー）、アルカリホスファターゼ（骨特異的）およびオステオカルシン（骨形成の骨特異的マーカー）が挙げられる。軟骨および骨関連バイオマーカーは、例えば、有効性／薬力学的ｉｎ ｖｉｖｏ試験からの血清において、およびｅｘ ｖｉｖｏ試験のならし培地から、市販のキットを用いて測定することができる。
１つの実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏでの骨および軟骨の形成および成長に対するＣＮＰ変異体の効果をモニターするために、ＣＮＰ変異体を投与した被験体における少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定する。例えば、少なくとも１つの骨または軟骨関連バイオマーカーのレベルの増加は、ＣＮＰ変異体の投与が、骨成長に対して正の効果を有し、ＣＮＰ活性の低下に関連する骨格異形成症および他の骨または軟骨関連疾患もしくは障害の治療に有用であることを示すものである。具体例としての骨または軟骨関連バイオマーカーとしては、ＣＮＰ（例えば、ＣＮＰの内因性レベル）、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、アグリカンコンドロイチン硫酸、ならびにアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、バイオマーカーは、ＣＮＰ変異体を投与する予定、投与している、または投与した被験体から生物学的試料を得ることによって測定する。バイオマーカーは、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および酵素活性アッセイを含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の手法を用いて測定することができる。生物学的試料は、血液、血清、尿または他の生物学的液体であってよい。
本開示の追加の態様および詳細は、以下の実施例により明らかであり、これらは限定ではなく例示目的である。
（実施例１）
ＣＮＰ変異体の合成
ＣＮＰ変異体を、本明細書に記載の方法を使用して調製した。表１〜３（実施例３に示す）に示すように、天然または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を、ＣＮＰ２２の野生型配列のそれぞれのアミノ酸残基において実施した。特定の変異体において、さらなるアミノ酸を、野生型ＣＮＰ２２配列の全体または一部のＮ末端および／またはＣ末端に付加した（表３を参照されたい）。
さらに、ＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分がＣＮＰ２２またはその変異体のＮ末端に結合したＣＮＰ変異体を調製した（実施例２に示す表４を参照されたい）。ＰＥＧ化試薬は、表５に示す商業的供給源から得ることができる。
Figure 0005718909
 Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から購入したＰＥＧ（ＰＥＯとも呼ばれる）ポリマーは単分散である、すなわち、それらは特定の分子量の単一分離ポリマーを含有する。対照的に、ＮＯＦ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｏｉｌ ａｎｄ Ｆａｔ）から購入したＰＥＧポリマーは、多分散である、すなわち、それらは分子量の分散したポリマーの混合物を含有する。
ＣＮＰ２２またはその変異体をＰＥＧ化するために、反応条件および精製条件を、ＰＥＧ−ＣＮＰの結合ごとに最適化する。一般的なＰＥＧ化手法に従って、反応混合物は、約１ｍＭのＣＮＰ２２またはその変異体および約１から５ｍＭのＮＨＳ−活性化ＰＥＧを、ｐＨが約５．０から６．５の間のリン酸カリウム緩衝液中に含有する。ペプチドのＮ末端において選択的にモノＰＥＧ化し、内部部位（例えば、ＣＮＰ２２のＬｙｓ４）においてＰＥＧを最小化するために、ＰＥＧ化反応を、より酸性の条件下（例えば約５．５から６．５の間のｐＨ）において実施し、リジン側鎖上のより塩基性の第一級アミノ基を選択的にプロトン化し、したがって非活性化することができる。室温において１〜３時間インキュベート後、水性グリシン緩衝液を加えることによって、ＰＥＧ化反応を停止させる。その後、反応産物を、各ＰＥＧ−ＣＮＰ結合体に関して最適化した逆相ＨＰＬＣによって分離する。分画試料を、スピードバックで乾燥させ、１ｍＭのＨＣｌ中で再構成／製剤化する。各ＰＥＧ−ＣＮＰ産物の特定および純度は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって決定する。
（実施例２Ａ）
ＣＮＰ変異体の組換え体作製
ＣＮＰ変異体は、組換え技術を使用して作製できる。特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体は、切断可能なペプチド、キャリアタンパク質またはタグを含む融合タンパク質として作製される。ＣＮＰ融合タンパク質を組換え的に作製する例示的方法を、以下に開示する。
材料および方法
発現ベクターへのＣＮＰ融合タンパク質のクローニング
ＣＮＰ ＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅し、増幅されたＰＣＲ断片を、Ｎｄｅ ＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）内にクローニングした。ＣＮＰ融合タンパク質のＤＮＡを、ＤＮＡ２．０によって合成し、異なる発現ベクター内にクローニングした（表６）。
Figure 0005718909
 ＣＮＰ： ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ ［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７ （配列番号： ７５）； ＴＡＦ： ヒト転写因子ＴＡＦ１２； ＫＳＩ： ケトステロイドイソメラーゼ； ＭＢＰ： マルトース結合タンパク質； Ｔｒｘ： チオレドキシン
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＮＰ融合タンパク質の発現
ＣＮＰ融合タンパク質の発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１またはＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換した。形質転換細胞を、１００ｕｇ／ｍｌのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎｅ）または５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢプレートにプレーティングし、３７℃において一晩インキュベートした。１つの単一コロニーを採集し、４ｍｌの１００ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンまたは５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で３７℃において振とうしながら培養した。細菌培養物のＯＤ６００が０．６に達したとき、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を細胞培地に加え、培地を３７℃において３時間、振とうしながらインキュベートした。細胞を収穫するために、細菌細胞を、４０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離し、細胞ペレットを−８０℃において保存した。細胞ペレットを、Ｂ−ＰＥＲ ＩＩ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ、０．４ｍｌ／４ｍｌ細菌培養物）およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、０．０２５Ｕ／ｍｌ）を用いて、室温で１０分間溶解した。細菌粗抽出物を蓄え、遠心分離して上清を得た。上清および粗抽出物を、ＣＮＰ融合タンパク質の発現および溶解度に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによってアッセイした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを用いたＣＮＰ融合タンパク質発現の検出
１０ｕＬの細胞溶解物または可溶性上清を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ Ｇｅｌ、ＭＥＳ ＳＤＳ緩衝液）にかけた。このゲルを、２０ｍｌのＩｍｐｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用して室温で１時間染色し、水を用いて脱染した。ウェスタンブロットのために、タンパク質をＧｅｌ ｂｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて膜に転写した。この膜を、５％ミルクを含むＴＢＳ緩衝液中で、室温において１時間ブロックした。ウサギ抗ＣＮＰ２２抗体（１：２５００希釈）（Ｂａｃｈｅｍ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を膜に加え、次いで、これを振とうしながら室温において２時間インキュベートし、その後膜を、ＴＢＳ緩衝液を用いて３回洗浄した。
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体化抗ウサギＩｇＧ（１：５０００希釈）を膜に加え、次いで、これを振とうしながら室温において１時間インキュベートし、その後膜を、ＴＢＳ緩衝液を用いて３回洗浄した。１０ｍｌのＷＥＳＴＥＲＮ ＢＬＵＥ（登録商標）Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を膜に加え、次いでこれを、振とうしながら室温において１〜５分間インキュベートし、その後膜を、ＴＢＳ緩衝液を用いて洗浄し、過剰な染色を除去した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１におけるＴＡＦ−ＣＮＰ融合タンパク質の発現
ＴＡＦ−ＣＮＰ融合タンパク質を発現する細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢＬ２１株）を、−８０℃において保存したグリセロールストックから得、４ｍｌの５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で３７℃において一晩、振とう（２５０ｒｐｍ）しながら成長させた。４ｍｌの一晩成長させた細胞培養物を２００ｍｌの５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に移し、３７℃において、振とう（２５０ｒｐｍ）しながら成長させた。ＯＤ６００が０．６に達したとき、次いで、ＩＰＴＧを、最終濃度１ｍＭになるように加え、３７℃において振とう（２５０ｒｐｍ）しながら３時間、タンパク質発現を誘導した。その後細胞を、３０００ｒｐｍにおいて１０分間遠沈させ、得られた細胞ペレットを−８０℃において凍結した。
ＴＡＦ−ＣＮＰ封入体の精製およびギ酸切断
細胞ペレット（２００ｍｌ培養物から）を、２５ｍｌのＢ−ＰＥＲ ＩＩ緩衝液（ＰＩＥＲＣＥ）に再懸濁し、ペレットを、氷上で１０分間超音波処理し（５０％、１秒、停止２秒）、４℃で１２０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離し、その後ペレットを２５ｍｌの２０×希釈Ｂ−ＰＥＲ ＩＩ緩衝液に再懸濁した。これを、上清が透明になるまで繰り返した（３〜５回）。１ｍＬの再懸濁されたＴＡＦ−ＣＮＰ封入体を１．５ｍｌのチューブに移し、１４０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１０ｕｌの８８％ギ酸に溶解し、その後４９０ｕｌのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過した水を直ちに加えた。ペレットをボルテックスによって十分混合し、５５℃で２０から２４時間インキュベートした（７０℃／６時間が代替の条件である）。ギ酸切断の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳ（Ｃ４ＲＰ）によってアッセイした。
ＬＣ／ＭＳ試料の調製
封入体を約８ｍＬの培養物（約１．５ＯＤ）から単離し、ペレットを１０ｕＬのギ酸塩中で可溶化した。再可溶化したペレットを、２％または１０％の最終ギ酸塩濃度（０．５ｍＬ）に直ちに希釈し、５５℃で２１時間インキュベートした（ｐＨ２）（翌日、２％ギ酸塩の試料において濁りはより明らかであった）。両方の試料を、１５０００ｒｐｍにおいて２分間遠心分離した。２０ｕＬの上清を、ＬＣ／ＭＳ（Ｃ４ＲＰ）装置に注入した。
結果
ＣＮＰ融合タンパク質はＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された。
すべてのＣＮＰ融合タンパク質は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３７℃で３時間誘導したＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された（図１）。構築物のｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＴＡＦ−ＣＮＰ、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＫＳＩ−ＣＮＰ（Ｍ／Ｎ）およびｐＥＴ−３１ｂ−ＫＳＩ−ＣＮＰは封入体として発現されたが、一方、構築物ｐＥＴ−３２ａ−Ｔｒｘ−ＣＮＰおよびｐＭＡＬ−ＣＮＰは可溶性融合タンパク質として発現された。抗ＣＮＰ２２抗体を使用したウェスタンブロットにより、ＣＮＰ融合タンパク質の発現が確認された（図１）。
ＣＮＰは、ギ酸切断によりＴＡＦ−ＣＮＰ封入体から作製された。
ＴＡＦ−ＣＮＰ封入体を、部分的に精製し、２％ギ酸を用いて５５℃で２０から２４時間処理した（７０℃／６時間が代替の条件である）。ＴＡＦ−ＣＮＰの大部分は切断され、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７ペプチドと同様のサイズを有する１つの追加のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥに現れた（図２）。切断された試料を、ＬＣ／ＭＳ（Ｃ４ＲＰ）によってさらに分析した。ＬＣ／ＭＳの結果は、ＣＮＰが、ギ酸切断後にＴＡＦ−ＣＮＰ封入体から可溶性形態で放出されたことを示した。ＬＣ／ＭＳ分析は、ＣＮＰ融合タンパク質のギ酸切断が環化Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（ＭＷ＝４１０２）の形成をもたらしたことを示した。分析に基づくタンパク質量の計算は、約６０ｕｇのギ酸により作製されたＣＮＰが、８ｍＬの非常に低いＯＤ培養物から生成されたことを示唆した。小規模（例えば約８ｍＬ）の低ＯＤ（例えば１．２ＯＤ）の細胞培養物から、およそ８ｕｇ／ｍｌのＣＮＰが作製されたが、一方、大規模（例えば約８Ｌ）のより高いＯＤ（例えば３８ＯＤ）の細胞培養物の発酵により、およそ１ｍｇ／ｍｌのＣＮＰが作製され得る。
結論
５つの発現構築物を作製し、ＣＮＰ融合タンパク質を発現させた。５つの構築物すべての発現により、可溶性（ＴｒｘおよびＭＢＰ）または不溶性（ＴＡＦおよびＫＳＩ）ＣＮＰ融合タンパク質が作製された。およそ１ｍｇ／ｍｌの可溶性ＣＮＰが、単純なギ酸切断手順によりＴＡＦ−ＣＮＰ封入体から作製され得る。
（実施例２Ｂ）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるさらなるＣＮＰ変異体の作製
ＣＮＰ変異体の組換え作製は、実施例２Ａに記載のように実施した。この実施例において、さらなるＣＮＰ構築物を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作製、またはＤＮＡ２．０によって合成した。さらなるＣＮＰ構築物および発現ベクターを表７に記載する。
Figure 0005718909
Figure 0005718909
 ＣＮＰ３８： ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ ［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７ （配列番号７５）］；
Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８： ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ ［Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７］ （配列番号１４５）；
ＣＮＰ３７： ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ （配列番号６０）；
ＨＳＡ−ＣＮＰ： ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ ［ＨＳＡ−ＣＮＰ２７ （配列番号１４４）］；
Ｐｒｏ−ＣＮＰ５３： ＰＤＬＲＶＤＴＫＳＲＡＡＷＡＲＬＬＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧ−ＳＭＳＧＬＧＣ （配列番号１８５）；
ＣＮＰ３４： ＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ （配列番号１６３）；
ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８： ＭＶＬＴＫＫＫＬＱＤＬＶＲＥＶＣＰＮＥＱＬＤＥＤＶＥＥＭＬＬＱＩＡＤＤＦＩＥＳＶＶＴＡＡ−ＣＱＬＡＲＨＲＫＳＳＴＬＥＶＫＤＶＱＬＨＬＥＲＱＷＮＭＷＩＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＴ−ＧＤＤＤＤＫＨＭＤＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ （配列番号１９６）；
ＴＡＦ： ヒト転写因子ＴＡＦ１２ヒストンフォールドドメイン（ＨＦＤ）およびｐＥＴ−１５ｂベクター由来リンカー；
ＴＡＦ−ＮＬ： リンカーを含まないＴＡＦ１２ ＨＦＤ；
ＴＡＦ１２ ＨＦＤ： ＶＬＴＫＫＫＬＱＤＬＶＲＥＶＣＰＮＥＱＬＤＥＤＶＥＥＭＬＬＱＩＡＤＤＦＩＥＳＶＶＴＡＡＣＱＬＡ−ＲＨＲＫＳＳＴＬＥＶＫＤＶＱＬＨＬＥＲＱＷＮＭＷＩ （配列番号１９７）；
ｐＥＴ−１５ｂ リンカー： ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＴＧＤＤＤＤＫＨＭＤ （配列番号１９５）；
ＴＡＦ（Ｃ／Ａ）： ＴＡＦ中のシステインがアラニンに変化している；
ＴＡＦ（Ｄ／Ｅ）： ＴＡＦ中のアスパラギン酸がグルタミン酸に変化している（数字はどのアミノ酸残基が変化しているかを示す）
ＴＡＦ（Ｃ／Ａ ＆ Ｄ／Ｅ）： ＴＡＦ中のシステインおよびアスパラギン酸がそれぞれアラニンおよびグルタミン酸に変化している；
ＢＭＰ： ７つのＣ／Ａ（システインからアラニン）変異を有する骨形態形成タンパク質２；
ＫＳＩ： ケトステロイドイソメラーゼ； ＭＢＰ： マルトース結合タンパク質； ＴＲＸ： チオレドキシン
結果
すべてのＣＮＰ融合タンパク質は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３７℃で３時間誘導されたＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された。構築物のｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−Ｐｒｏ−ＨＳＡ−ＣＮＰ、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＴＡＦおよびｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＢＭＰは封入体として発現された。抗ＣＮＰ抗体を使用したウェスタンブロットにより、発現が確認された（図３）。
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を、ギ酸切断によってＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体から作製した。
ギ酸を封入体タンパク質の変性剤として使用し、最適条件下でＡｓｐとＰｒｏとの間のペプチド結合を特異的に切断できる。ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ封入体を、上記のように部分的に精製し、５０％ギ酸を用いて２５℃、３７℃、４２℃および５５℃において２４時間処理した。ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の大部分は切断され、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）ペプチドと同様のサイズの１つの追加のバンドが、３７℃、４２℃および５５℃の切断でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にあらわれた（図４Ａ）。３７℃および５５℃における切断反応を１０ＭのＮａＯＨを用いて中和し、１４，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離した。未切断のＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８、ＴＡＦおよび他の封入体をペレットに沈殿させた。上清は可溶性Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を含有し、ＬＣ／ＭＳによってさらに分析された。ＬＣ／ＭＳの結果は、過剰の酸加水分解によって作製された非特異的切断ペプチドの混合物を含有したことを示した。
ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ封入体を、２％および１０％ギ酸を用いて、５５℃で２０時間処理した場合、ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の大部分が切断され、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７と同様のサイズを有する１つの追加のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に観察された（図４Ｂ）。切断試料を、ＬＣ／ＭＳによってさらに分析した。ＬＣ／ＭＳ分析により、ギ酸切断後、目的のＰｒｏ−ＣＮＰ３８が、ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体から可溶性形態で放出されたことが示された。２％と１０％ギ酸切断からのＰｒｏ−ＣＮＰ３８の収量は、同様であった（図４Ｃ）。
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）作製および精製のためのギ酸切断および中和
ギ酸は、ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８、ＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８および他の封入体を溶解し切断できる。ｐＨの中和は、不溶性の混入したタンパク質／ペプチド（未切断ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８、ＴＡＦ、ＢＭＰなど）の沈殿をもたらす。可溶性Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８は、遠心分離後上清中に留まる。ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＢＭＰ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を、２％ギ酸中で５５℃または７０℃で２４時間切断した。切断反応を、１：１の比の０．５ＭのＴｒｉｓ緩衝液を用いて中和し、１４，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離した。結果は、上清がほとんど純粋なペプチドを含有し、中和に関するＰｒｏ−ＣＮＰ３８の回収損失は観察されなかったことを示した。これは、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の精製のための単純かつ有効なステップである。
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）作製のためのＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体のギ酸切断に関する様々な条件の分析
ギ酸は、最適条件下でＡｓｐとＰｒｏとの間のペプチド結合を特異的に切断できる。ギ酸切断条件が最適でない場合、Ａｓｐと任意の他のアミノ酸との間のペプチド結合の非特異的切断、または任意のペプチド結合の非特異的切断さえも起こり得る。ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体を、２％ギ酸を用いて、４２℃、５５℃または７０℃で６、２４または４８時間切断した。図５Ａは、ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８が７０℃で２４時間または５５℃で４８時間において完全に切断されたことを示す。７０℃の切断は、１７時間以内で完了され得る（図５Ｂ）。７０℃／２４ｈの切断は最も高い収量をもたらすが、非特異的切断産物（例えば、ＡｓｐとＡｒｇとの間のペプチド結合の切断によってＰｒｏ−ＣＮＰ３８から作製される、分子量３１４２を有するペプチド）が劇的に増加した（図５Ｃ）。
ギ酸切断前にＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体を精製するか、またはＢ−ＰＥＲＩＩ緩衝液を用いて処理した場合、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８作製の収量および純度は改善された。Ｂ−ＰＥＲＩＩ緩衝液は洗剤のオクチルチオグルコシドを含有し、比較的高価であるので、他の一般的に使用される洗剤または緩衝液を、大規模な、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８作製のために試験した。ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体を、異なる洗剤（Ｏｃｔｙｌｓｕｃｒｏｓｅ；Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；Ｔｗｅｅｎ−２０；ＮＰ−４０；ＣＡ−６３０）または緩衝液（Ｂ−ＰＥＲＩＩ；Ｂ−ＰＥＲＩＩ １／２０希釈物；Ｂ−ＰＥＲ；Ｂ−ＰＥＲリン酸緩衝液；２５ｍＭのｔｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．９；２５ｍＭのｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；濾過水；ＰＢＳ）に再懸濁し、室温（ＲＴ）で２４時間インキュベートした。すべての洗剤は、２５ｍＭのｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中１％であった。洗剤または緩衝液中でインキュベートした後で、ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体を２％ギ酸によって５５℃で２２時間切断した。結果は、ＢＰＥＲＩＩが優れた収量を示し続けさらに、ＣＡ６３０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により陽性結果を得たことを示した。
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）タンパク質性分解切断産物
おそらく膜結合プロテアーゼである１つの未特定のプロテアーゼが、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の精製の間にＰｒｏ−ＣＮＰ３８ペプチド（ＢＬ２１株から産生された、ＭＷ４１０２）を２つのペプチドに切断し、ペプチドのＰＧＱＥＨＰＮＡＲ（ＭＷ１００４）（配列番号１９８）およびＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（ＭＷ３１１５）（配列番号１９９）をもたらした。理論に縛られるものではないが、洗剤がＰｒｏ−ＣＮＰ３８の収量および純度を改善し得る１つの考えられる理由は、洗剤が、おそらくすべてではないが大部分の未特定のプロテアーゼを除去できることである。高温、塩基性ｐＨおよびＥＤＴＡを試験し、これらの因子がプロテアーゼの切断を阻害できるかどうかを特定した。ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８封入体を、ＲＴまたは１２０℃で２時間インキュベートし、１４０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離した。ペレットを２％ギ酸に再懸濁し、５５℃または７０℃で１８時間インキュベートした。１：１の比の０．５ＭのＴｒｉｓを加え、切断を中和した。中和試料を１４０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離し、上清を、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ１０と共に、またはＥＤＴＡは加えずに６時間または２２時間ＲＴで放置した。タンパク質分解性切断を、ＬＣ／ＭＳによってアッセイした（表８）。
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 ７０℃において切断されたすべての試料（８〜１２）が、限定的な（Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の切断は４％未満）タンパク質分解性切断を示した。切断を５５℃において実施される場合（試料７）、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８のほぼ４０％がプロテアーゼによって切断された。塩基性ｐＨおよびＥＤＴＡは非特異的タンパク質分解性切断に影響を与えなかった。高温（１２０℃で２時間）では、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８が非特異的に切断された。
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによるＢＬ２１（ＤＥ３）株は未特定のプロテアーゼを有さないことに留意するべきである。
様々な構築物からのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）および他のＣＮＰ変異体の作製：
Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８は、封入体としてのＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の過剰発現およびその後の融合タンパク質のギ酸切断を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて大規模に作製できる。本明細書に記載の方法に従って、他のＴＡＦ−ＣＮＰ融合タンパク質（ＴＡＦ−ＣＮＰ３４およびＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ５３）を封入体として発現させ、その後ギ酸を用いて切断し、ＣＮＰ変異体のＣＮＰ３４およびＰｒｏ−ＣＮＰ５３を作製した。図６は、ＴＡＦ−ＣＮＰ３４の発現を表し、図７はＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ５３の発現を表し、図８はＴＡＦ−ＣＮＰ３４およびＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ５３のギ酸切断の産物を表し、図９はＬＣ／ＭＳのクロマトグラムにおけるＣＮＰ−３４のピークを表し、図１０はＬＣ／ＭＳのクロマトグラムにおけるＰｒｏ−ＣＮＰ５３に関するピークを表す。
ギ酸の使用は、標的であるＡｓｐ−Ｐｒｏ結合以外のペプチド結合（複数可）における非特異的切断（複数可）をもたらし得る。所望のギ酸切断産物の純度および全力価を改善するために、ＴＡＦ１２またはそれらの断片中のアスパラギン酸の異なる残基をグルタミン酸に変化させた。さらに、ＴＡＦ１２またはそれらの断片中の１つ以上のシステイン残基をアラニンに変化させ、非特異的ジスルフィド結合の形成を阻止した。ＴＡＦ１２にこのような変異を有するすべてのＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質を封入体として発現させ、ギ酸を用いて切断し、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を作製した。図７は、ＴＡＦ−ＮＬ−（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の発現を示し、図１１はＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＴＡＦ（４Ｄ／４Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の発現を示し、図１２はＴＡＦ（４Ｄ／４Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８のギ酸切断産物を示し、図１３はＴＡＦ−ＮＬ−（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８のギ酸切断産物を示す。表９は、様々なＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８構築物から得られたＰｒｏ−ＣＮＰ３８の純度（精製前）および力価をまとめたものである。
Figure 0005718909
 ＊他のＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８構築物と比較して、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＴＡＦ（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を有する細胞はより緩慢に成長し、最終細胞密度（ＯＤ６００）はより低かった。
発酵およびギ酸切断によるＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）の大規模作製
ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ−ＴＡＦ−ＣＮＰ構築物を含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１０リットルの発酵槽において３７℃で約１６〜１７時間、ＯＤ６００が６４に達するまで成長させた。次いで、細胞を、１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で約３５〜３７℃において成長／培養し、ＯＤ６００が１６０に達するまで約７〜８時間ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質の発現を誘導した。発酵により力価９ｇ／ＬのＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８が作製された。図１４は、発酵において作製されたＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質のウェスタンブロットを表示する。
１０Ｌの発酵からの７５０ｍＬ細胞培養物から回収された細胞ペレットを、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に再懸濁し、高圧ホモジナイザー（１０，０００バール（ｂａｒ））を３回通すことによって溶解した。得られた溶解物を、６，５００ｇにおいて１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。不溶性ＴＡＦ−Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８融合タンパク質封入体を含有するペレット画分を、ロートステーター（ｒｏｔｏｓｔａｔｏｒ）を用いて５００ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。懸濁液を、６，５００ｇにおいて１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。得られた封入体のペレットを、ロートステーターを用いて５００ｍＬの水に再懸濁し、５５℃で３０分間インキュベートした。２５０ｍＬの６％ギ酸を、暖めた封入体懸濁液に最終濃度２％ギ酸になるように加え、５５℃で２０〜２４時間インキュベートした。２０〜２４時間後、５０ｍＬの４００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を加え、ギ酸切断反応の中和を開始し、得られた混合物を５０％ｗ／ｖのＮａＯＨでｐＨ６．９〜７．４まで滴定し、室温で３０分間放置した。中和により重い沈殿物が形成され、６，５００ｇにおいて１０分間の遠心分離によって除去した。上清を保持し、上清は平均１．３ｇ／Ｌ培養物の８０％純粋なＰｒｏ−ＣＮＰ３８を含有した。Ｅ．ｃｏｌｉの大部分ならびにＴＡＦ関連タンパク質およびペプチドがペレット中に残存していた。
ギ酸切断および中和した上清から得られた可溶性Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８は、８０％純粋であり、他の産物に関連する夾雑物と一緒に線状および環化Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８ペプチドの混合物を含有した。Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を含有するｐＨが中性の上清を、濾過滅菌した。カラムに結合するＤＮＡ、エンドトキシンおよびペプチド混入物質を除去するために、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ Ｈｉ−ＣＡＰカラム（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製を、ｐＨ７〜７．４において実施した。通過画分は、部分的に環化されたＰｒｏ−ＣＮＰ３８を含有した。最終濃度１０ｕＭになるように硫酸銅を通過画分に加え、室温で１時間インキュベートした。中性ｐＨにおけるＣｕ＋＋の添加は、ペプチド上の遊離のシステインスルフヒドリル基の酸化を触媒し、分子内ジスルフィド結合を形成し、１００％環化されたＰｒｏ−ＣＮＰ３８をもたらし、検出可能な線状ペプチドは形成されなかった。溶液の伝導度を、水を加えることによって１５ｍＳ／ｃｍ未満に調整した。次いで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーを実施し、通過液中に残存するどのようなＤＮＡおよびエンドトキシンも除去し、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を、約９５〜９６％の純度であり、非産物関連夾雑物０．５％未満までさらに精製した。図１５は、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出液画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、最も高濃度のＰｒｏ−ＣＮＰ３８は、画分２２から３０において発見された。プールされない画分２４の逆相ＨＰＬＣ／ＭＳ分析は、９０％のＰｒｏ−ＣＮＰ３８、酸化されたメチオニン残基を有する５％のＰｒｏ−ＣＮＰ３８、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ結合で切断され、ＣＮＰ−１７を形成した３％のＰｒｏ−ＣＮＰ３８および環状ドメイン中のＡｓｐ−Ａｒｇ結合で切断された１．６％のＰｒｏ−ＣＮＰ３８の存在を示した。最終精製における純粋Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８ペプチドの収量は、０．９ｇ／Ｌ細胞培養物であった（３６％の全回収）。
５つの別々の精製から回収されたＰｒｏ−ＣＮＰ３８を、製剤化のためにプールした。プールした産物は、９３．５％のＰｒｏ−ＣＮＰ３８、酸化されたメチオニン残基を有する３．３％のＰｒｏ−ＣＮＰ３８、１．３％の脱アミド化Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＧｌｙ−Ｃｙｓ結合で切断され、ＣＮＰ−１７を形成した１％のＰｒｏ−ＣＮＰ３８を含有した。試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を用いて伝導度１０ｍＳ／ｃｍに希釈し、濃縮および緩衝液交換のためにＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂の弱い陽イオン交換特性により、ペプチドは、典型的な塩勾配ではなく弱酸性溶液によりカラムから解離できる。ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムからＰｒｏ−ＣＮＰ３８が解離するために必要とされる酸濃度は、カラムのローディングに依存する。５０ｍｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８／ｍＬ樹脂において、１０ｍＭのＨＣｌは、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の溶出のために十分であった。９ｍｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８／ｍＬ樹脂において、５０ｍＭのＨＣｌが溶出に必要であった。ローディングが９ｍｇ Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８／ｍＬ樹脂であった場合、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８は１カラム容積未満で溶出され、これはペプチドを著しく濃縮した。溶出液画分は、２０．３ｍｇ／ｍＬの９５％純粋なＰｒｏ−ＣＮＰ３８を、酸化されたメチオニン残基を有する３％のＰｒｏ−ＣＮＰ３８、１％の脱アミド化Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８およびＧｌｙ−Ｃｙｓ結合で切断され、ＣＮＰ−１７を形成した１％未満のＰｒｏ−ＣＮＰ３８と一緒に含有した。弱酸中のＰｒｏ−ＣＮＰ３８の濃縮溶液は、液体製剤または凍結乾燥製剤のどちらにとっても、適切な緩衝液への希釈に適している。
（実施例３）
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏでの中性エンドペプチダーゼによるＣＮＰ変異体の切断
アミノ酸置換、アミノ酸伸長、骨格の改変、側鎖の改変およびＰＥＧ化の、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）切断に対するＣＮＰ変異体の感受性に関する効果を決定するために、非切断ＣＮＰ変異体の消失をモニターするｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ペプチド切断アッセイを実施した。
組換えヒトＮＥＰ（最終濃度１ｕｇ／ｍＬ）を、０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７で希釈した１００ｕＭのＣＮＰ変異体に加えた。反応混合物を、３７℃において様々な期間インキュベートし、反応を、ＥＤＴＡ（最終濃度１０ｍＭ）を用いて停止させ、その後熱変性させた。反応混合物を還元し、その後反応産物をＨＰＬＣおよび質量分析を使用して分析した。ＣＮＰ変異体の半減期を、無傷のＣＮＰ変異体の、時間に伴う消失に基づき計算した。消化されたＣＮＰ変異体に関する結果を、並行するｗｔＣＮＰ２２消化と比較し、１ｍｇ／ｍＬのＮＥＰにより消化された１００ｕＭ ＣＮＰ２２に関する結果（ｔ１／２＝８０分）に対して正規化した。
表１に、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＥＰ切断アッセイに基づく、骨格または側鎖に改変を有する様々なＣＮＰ変異体の半減期を載せる。類似体Ｌの６つのＮＥＰ切断部位のうち３つを除去したにもかかわらず、実質的により短い半減期をもたらした。試験したＣＮＰ変異体のうち、ＣＮＰ２２の２２のアミノ酸すべてのＤ−鏡像異性体を含有する類似体Ｎ、およびＬｅｕ９およびＬｅｕ１１の両方にＮメチル化アミド結合を有する類似体Ｍは、ＮＥＰ切断に対する最も強い耐性を示した。しかし、類似体ＮおよびＭは両方ともｃＧＭＰの産生を刺激できなかった（以下を参照されたい）。
類似体Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨの半減期を互いに比較すると、類似体Ａ、Ｂ、ＦおよびＨに関する半減期と比較して、類似体ＥおよびＧに関する半減期は約１．５〜約２．５倍長いことが決定された。これら６つの類似体はすべて、ｗｔＣＮＰ２２と比較してＣｙｓ６−Ｐｈｅ７結合における切断に対して耐性を示した、または耐性が改善されていた（データ非掲載）。１ｕｇ／ｍｌのＮＥＰに対する類似体の耐性の、半減期に基づく順位序列は、類似体Ｇ（３−Ｃｌ−Ｐｈｅ）≧類似体Ｅ（Ｄ−Ｐｈｅ）＞類似体Ｈ（「ベータ−２Ｐｈｅ」）、類似体Ｂ（Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ）および類似体Ｆ（ｔ−Ｂｕ−Ｇｌｙ）＝ｗｔＣＮＰ２２＞類似体Ａ（ＣｙＳ−ＣＨ２−ＮＨ）である。類似体ＥおよびＧは、ｗｔＣＮＰ２２と比較して約１．５倍長い半減期を有する。Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合の切断に対する耐性を除いて、類似体Ｂ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは、１ｕｇ／ｍＬのＮＥＰの存在下でＧｌｙ８−Ｌｅｕ９結合の切断に対する耐性もまた示した（データ非掲載）。これらの結果は、Ｃｙｓ６とＧｌｙ８との間に骨格または側鎖の改変を有するＣＮＰ変異体が、Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ７結合および／またはＧｌｙ８−Ｌｅｕ９結合のＮＥＰ切断に耐え得るが、必ずしもＮＥＰに対するすべての耐性が改善するとは限らず、またＣＮＰ２２より長い半減期を有するとは限らないことを示す。結果は、ＮＥＰがまずＣＮＰ２２のＣｙｓ６−Ｐｈｅ７結合を切断し、その後別の場所を切断するという文献の報告と対照的であるとようである。
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 １ １ｕＭ ＣＮＰ２２の存在下のｃＧＭＰ産生と比較した、ナトリウム利尿ペプチドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｃＧＭＰ産生の刺激
２ ＣＮＰ２２ ＮＥＰ耐性のｔ１／２は平均すると８０分であった。実験間のＮＥＰ触媒活性の変動のため、すべてのＣＮＰ２２の消化のｔ１／２を８０分に対して正規化し、差分係数を、個々の実験の類似体のｔ１／２を計算するために使用し、調整されたｔ１／２を得た。
ＮＤ＝未決定
表２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＥＰ切断アッセイに基づく、天然および／または非天然アミノ酸での置換を有する様々なＣＮＰ変異体の半減期を記載する。被験変異体のうち、ＮＥＰ切断に対する最も高い耐性は、Ｋ４ＲおよびＧ１５Ｓの置換を有する類似体ＢＫおよびＫ４ＲおよびＧ１５Ｎの置換を有する類似体ＢＪにより示された。
Figure 0005718909
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 １ １ｕＭ ＣＮＰ２２の存在下のｃＧＭＰ産生と比較した、ナトリウム利尿ペプチドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｃＧＭＰ産生の刺激
２ ＣＮＰ２２ ＮＥＰ耐性のｔ１／２は平均すると８０分であった。実験間のＮＥＰ触媒活性の変動のため、すべてのＣＮＰ２２の消化のｔ１／２を８０分に対して正規化し、差分係数を、個々の実験の類似体のｔ１／２を計算するために使用し、調整されたｔ１／２を得た。
ＮＤ＝未決定
表３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＥＰ切断アッセイに基づく、アミノ酸伸長を含むＮ末端および／またはＣ末端の改変を有するＣＮＰ変異体の半減期を記載する。試験した類似体のうち、類似体ＡＺ、ＣＣ、ＣＦ、ＢＬ、ＣＳ、ＣＫおよびＣＬ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７およびＨＳＡ−ＣＮＰ２７が、ＮＥＰ分解に対して最も耐性が高かった。
Figure 0005718909
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 １ １ｕＭ ＣＮＰ２２の存在下のｃＧＭＰ産生と比較した、ナトリウム利尿ペプチドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｃＧＭＰ産生の刺激
２ ＣＮＰ２２ ＮＥＰ耐性のｔ１／２は平均すると８０分であった。実験間のＮＥＰ触媒活性の変動のため、すべてのＣＮＰ２２の消化のｔ１／２を８０分に対して正規化し、差分係数を、個々の実験の類似体のｔ１／２を計算するために使用し、調整されたｔ１／２を得た。
ＮＤ＝未決定
表４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＥＰ切断アッセイに基づく、Ｎ末端においてＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーに結合したＣＮＰ変異体の半減期を記載する。試験し、表４に記載したすべてのＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＰＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）を除いて、ＮＥＰ切断に対する耐性あるいは増強した耐性を示し、それらはｗｔＣＮＰ２２と同じ半減期を有した。Ｋ４Ｇの置換を有するＣＮＰ２２のＮ末端ＰＥＧ化は、ＮＥＰ耐性の実質的改善をもたらすようにはみえない。例えば、ＰＥＧ２Ｋ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｇ）は、ＣＮＰ２２よりＮＥＰ切断に対してわずかに耐性が高いだけであるが（データ非掲載）、一方ＰＥＧ２Ｋ−ＣＮＰ２２はＣＮＰ２２よりはるかに長い、ｉｎ ｖｉｔｒｏの半減期を有した。
Figure 0005718909
 １ １ｕＭ ＣＮＰ２２の存在下のｃＧＭＰ産生と比較した、ナトリウム利尿ペプチドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｃＧＭＰ産生の刺激
２ ＣＮＰ２２ ＮＥＰ耐性のｔ１／２は平均すると８０分であった。実験間のＮＥＰ触媒活性の変動のため、すべてのＣＮＰ２２の消化のｔ１／２を８０分に対して正規化し、差分係数を、個々の実験の類似体のｔ１／２を計算するために使用し、調整されたｔ１／２を得た。
ＮＤ＝未決定
図１６は、ＣＮＰ２２の５つのＮ末端ＰＥＧ化結合物のＮＥＰ耐性プロファイルを示す。ＰＥＧ（またはＰＥＯ）ポリマーに結合したＣＮＰ２２ペプチドは、ポリマーの質量が大きくなるほど、ＮＥＰ分解に対する耐性の増加を示した。特に、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２２、ＰＥＧ２Ｋ−ＣＮＰ２２およびＰＥＧ５Ｋ−ＣＮＰ２２は、１６０分のアッセイ期間にわたってＮＥＰ分解に対して耐性であった。
図１７は、Ｎ末端アミノ酸伸長を有するＣＮＰ変異体のＣＮＰ３７（類似体ＢＬ）、ＣＮＰ５３およびＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号：３６）のＮＥＰ耐性プロファイルを表示する。明らかに理解可能なように、ＣＮＰ３７およびＣＮＰ５３の両方がこのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＮＥＰ分解に対して耐性であり、一方ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）はＮＥＰの加水分解に対してＣＮＰ２２と同じ不安定性を有した。
図１８は、Ｎ−末端においてＰＥＧ（またはＰＥＯ）部分と結合したＣＮＰ１７およびＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のＮＥＰ耐性プロファイルを表す。ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のＰＥＧ化は、このＣＮＰ変異体のＮＥＰ耐性を大幅に改善し、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号：３６）は、１６０分間のアッセイ期間にわたってＮＥＰ切断に対して完全に耐性であった。ＰＥＯ部分の質量が約０．６ｋＤａ（ＰＥＯ１２）から約１．２ｋＤａ（ＰＥＯ２４）に増加することにより、ＰＥＧ化ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のＮＥＰ耐性は改善された。多分散したＰＥＧ１Ｋ部分よりもむしろ単分散したＰＥＯ２４部分とのＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のＰＥＧ化が、ＮＥＰ耐性をさらに改善した。最終的に、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）およびＰＥＧ２Ｋ−ＣＮＰ１７の両方が同様の総質量を有するが（ＰＥＧ２Ｋが多分散していることに留意されたい）、前者は実質的により優れたＮＥＰ耐性を示した。
ＮＥＰ耐性アッセイを、ｗｔＣＮＰ２２ならびにＣＮＰ変異体のＧ−ＣＮＰ３７、ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（「ＣＮＰ２７−ＨＳＡ」、配列番号１４４）およびＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ１２」）（配列番号３６）に関してさらに実施した。図１９は、Ｇ−ＣＮＰ３７およびＣＮＰ２７−ＨＳＡがＮＥＰ切断に対して完全に耐性であったこと、およびＣＮＰ２７−ＰＥＯ１２が、ｗｔＣＮＰ２２と比較してＮＥＰ分解に対してはるかに高い安定性を示したことを示す。
（実施例４）
ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｃＧＭＰ産生のＣＮＰ変異体刺激
ＣＮＰ変異体の機能活性を決定するために、ｃＧＭＰの産生を、ＣＮＰ変異体に曝露されたＮＩＨ３Ｔ３細胞において測定した。ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ヒトＮＰＲ−Ｂと９８％タンパク質配列同一性を共有するＣＮＰシグナル伝達受容体であるＮＰＲ−Ｂを内因的に発現する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を補充した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地において、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。シグナル伝達の２４時間から４８時間前、アッセイの時点に、細胞を、１２ウェルプレートに２〜５×１０５細胞の密度／ウェルで継代した。ＣＮＰ変異体を、ストック濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように１ｍＭ ＨＣｌ中で再懸濁し（ｗｔＣＮＰ２２については４５５ｕＭ）、その後、３０ｕＭの作業用ストック溶液に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて希釈した。１０倍連続希釈物を、リン酸緩衝生理食塩水で調製した。培地を細胞から除去し、０．７５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｉｎｅ）を含有する０．４ｍＬのＰＢＳ／ダルベッコ変法イーグル培地（５０／５０、ｖ／ｖ）と取り換えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベートし、その後、０．２ｍＬのＰＢＳ中ＣＮＰ変異体を添加し、３７℃で１５分間インキュベーションを続けた。反応を、ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ ｃＧＭＰアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により供給された０．２ｍＬの溶解緩衝液を添加することによって停止し、ｃＧＭＰの産生を、ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ ｃＧＭＰアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて決定した。すべての刺激実験は、２重に実施した。
表１〜４に、それぞれ、骨格または側鎖の改変、アミノ酸置換、Ｎ末端アミノ酸伸長および／またはＮ末端ＰＥＧ化を有するＣＮＰ変異体の、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてｃＧＭＰ産生を刺激する能力をまとめる。４つの全ての表において１０ｎＭまたは１ｕＭのＣＮＰ変異体に曝露されたＮＩＨ３Ｔ３細胞のｃＧＭＰ産生の値を、細胞数および１ｕＭのｗｔＣＮＰ２２の存在下のｃＧＭＰ産生に対して正規化する。
表１の結果を見ると、７位に３−Ｃｌ−Ｐｈｅを有する類似体Ｇだけが、１ｕＭにおいてｗｔＣＮＰ２２と実質的に同じＮＰＲ−Ｂ刺激活性を表示した。表２に関しては、類似体ＡＨ、ＢＯ、ＡＢ、ＢＨ、ＢＺ、ＢＸおよびＢＲを含む、アミノ酸置換を有する様々なＣＮＰ変異体が、ｗｔＣＮＰ２２と実質的に同様のＮＰＲ−Ｂ刺激活性を示した。
表３の結果を見ると、アミノ酸伸長を含む、Ｎ末端および／またはＣ末端改変を有する多数のＣＮＰ変異体が、ｗｔＣＮＰ２２に匹敵するＮＰＲ−Ｂ刺激活性を示した。機能性ＣＮＰ変異体は、Ｎ末端においてへプタン酸と結合したＣＮＰ２２（Ｇ１Ｅ）である類似体ＢＢおよびＢＮＰのＮ末端およびＣ末端の「尾部」に結合したＣＮＰ２２の環状ドメイン（Ｃｙｓ６からＣｙｓ２２配列を保有する「ＣＮＰ１７」）である類似体ＣＤを含む。図２０は、ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＣＮＰ３７（配列番号３６）（類似体ＢＬ）およびＣＮＰ５３がすべて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてｗｔＣＮＰ２２同様のＮＰＲ−Ｂ刺激活性を有したことを例示する。
表３で注目するべきことは、ＣＮＰの機能性およびＮＥＰ耐性の両方に関してアッセイされたＣＮＰ変異体のうち、類似体ＡＺ（Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ））、類似体ＣＣ、類似体ＣＦ、類似体ＢＬ（ＣＮＰ３７）、類似体ＤＢ（Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）およびＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ＣＮＰ２７（ＨＳＡ−ＣＮＰ２７）（配列番号１４４）はすべて、ＣＮＰ２２と実質的に同様のＮＰＲ−Ｂ刺激活性を有したが、ＣＮＰ２２よりＮＥＰ切断に対して耐性が実質的に高かったということである。
表４の結果に関しては、１ｕＭにおける９個のＮ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体は、ｗｔＣＮＰ２２によって達成されるレベルの少なくとも約７０％までｃＧＭＰ産生を刺激した。いくつかの注目に値する点が表４に見られる。まず、単分散したＰＥＯポリマー（ＰＥＯ１２は約０．６ｋＤａ、ＰＥＯ２４は約１．２ｋＤａ）を用いたＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のＮ末端ＰＥＧ化は、多分散したＰＥＧポリマー（ＰＥＧｌＫは、およそ１ｋＤａのポリマー数平均分子量（Ｍｎ）を有し、ＰＥＧ２Ｋはおよそ２ｋＤａを有する）を用いるよりも優れたＮＰＲ−Ｂの機能性をもたらした（さらに図２１を参照されたい）。第２に、増加したＭｎをもつ多分散したＰＥＧポリマー（ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ５ＫおよびＰＥＧ２０Ｋ）を用いた、またはより質量の大きい単分散したＰＥＯポリマー（ＰＥＯ１２およびＰＥＯ２４）を用いたｗｔＣＮＰ２２のＮ末端ＰＥＧ化は、対応してＣＮＰ変異体のＮＰＲ−Ｂ活性化能力を減少させた（図２２をさらに参照されたい）。第３に、Ｎ末端のＧＡＮＲＲ（配列番号８）伸長を有するＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）は、ＰＥＯ２４−ＣＮＰ２２およびＰＥＯ２４−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）よりも強くｃＧＭＰ産生を刺激した。ＣＮＰの機能性およびＮＥＰ耐性の両方に関してアッセイされたＮ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体のうち、ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）はすべて、ＣＮＰ２２と実質的に同様のＮＰＲ−Ｂ刺激活性を有したが、ＣＮＰ２２よりＮＥＰ分解に対して耐性がはるかに高かったことも注目するべきである。
表１〜４に記載し、ＣＮＰの機能性およびＮＥＰ耐性の両方に関してアッセイされたＣＮＰ変異体のうち、類似体Ｇ、ＢＫ、ＡＺ、ＣＣ、ＣＦ、ＢＬおよびＤＢ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７、ＨＳＡ−ＣＮＰ２７（ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ＣＮＰ２７）（配列番号１４４）、ＰＥＧ１Ｋ−ＣＮＰ２２、（ＰＥＯ１２）−ビオチン−ＣＮＰ２２、ＰＥＯ１２−Ｒ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）、およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）はすべて、ｗｔＣＮＰ２２と実質的に同様のＮＰＲ−Ｂ刺激活性を有したが、ｗｔＣＮＰ２２よりＮＥＰ切断に対して実質的に耐性が高かった。
ｃＧＭＰ産生アッセイを、ｗｔＣＮＰ２２およびＣＮＰ変異体のＧ−ＣＮＰ３７、ＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（「ＣＮＰ２７−ＨＳＡ」、配列番号１４４）、ｗｔＣＮＰ２９およびＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ１２」）（配列番号３６）に関してさらに実施した。図２３は、アッセイしたＣＮＰ２２およびすべてのＣＮＰ変異体は、低用量または高用量のＣＮＰのどちらでも、同様のｃＧＭＰレベルの産生を誘導したことを示す。
（実施例５）
ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃに関する結合特異性
シグナル伝達競合アッセイ
クリアランス受容体ＮＰＲ−Ｃに関するＣＮＰ変異体の結合特異性を決定するために、シグナル伝達競合アッセイを実施する。ヒトＮＰＲ−ＢまたはＮＰＲ−Ｃのための発現プラスミド（それぞれＯｒｉＧｅｎｅから購入）を、一時的にトランスフェクトし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において受容体を発現させる。トランスフェクションの４０時間後、ＮＰＲ−Ｂ、ＮＰＲ−Ｃおよび天然のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を収穫し、カウントし、１２ウェルプレートまたは９６ウェルプレートに１：１（ＮＰＲ−Ｂ細胞：競合細胞（ＮＰＲ−Ｃまたは天然ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のどちらか））の比率でプレーティングした。プレーティングの２０時間後、細胞を、実施例４に記載のＮＰＲ−Ｂ／ｃＧＭＰ刺激アッセイ用に処理した。存在する場合、ナトリウム利尿クリアランス受容体のＮＰＲ−Ｃは、ＣＮＰと結合し、ＣＮＰを内在化し、その結果、ＮＰＲ−Ｂを介したシグナル伝達に利用可能なＣＮＰ濃度が全体的に減少し、ｃＧＭＰ産生の低下をもたらし、用量反応曲線が右に移行することが予測される。用量反応曲線における右方向への移行は、ｗｔＣＮＰ２２に関して検証された。ＮＰＲ−Ｃに対する親和性が減少したＣＮＰ変異体は、用量反応曲線における右側への移行を誘導することが予測されないか、またはより小さな移行の誘導が予測される。このシグナル伝達競合アッセイは、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍによって既に記載されたアッセイと同様である（米国特許第５，８４６，９３２号；Ｂ． Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ． １３巻（１１号）：２５０８〜２５１５頁（１９９４年）；Ｈ． Ｊｉｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９８巻（４号）：９６９〜９７６頁（１９９６年））。
ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ａを介したｗｔＣＮＰ−２２、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７およびＡＮＰのｃＧＭＰ刺激活性ならびにＮＰＲ−Ｂ対ＮＰＲ−Ｃに対するそれらの選択性およびＮＰＲ−Ａ対ＮＰＲ−Ｃに対するそれらの選択性を、シグナル伝達競合アッセイにおいて評価した。ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に、個別に一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後、細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした：（Ａ）２０，０００ＮＰＲ−Ｂ細胞＋２０，０００モックトランスフェクト細胞；（Ｂ）２０，０００ＮＰＲ−Ｂ細胞＋２０，０００ＮＰＲ−Ｃ細胞；（Ｃ）２０，０００ＮＰＲ−Ａ細胞＋２０，０００モックトランスフェクト細胞；および（Ｄ）２０，０００ＮＰＲ−Ａ細胞＋２０，０００ＮＰＲ−Ｃ細胞。プレーティングの２０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＰＢＳ（１：１）＋０．７５ｕＭのＩＢＭＸに１５分間置き換えた。ＮＰＲ−Ｂを介したｃＧＭＰシグナル伝達については、ＡＮＰ、ＣＮＰ−２２およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７に関する用量のシリーズを加え、３７℃で１２分間インキュベートし、その後細胞溶解によってアッセイを止めた。ＮＰＲ−Ａを介したｃＧＭＰシグナル伝達については、ＣＮＰ−２２およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７に関する用量シリーズを３７℃で１２分間インキュベートしたが、一方ＡＮＰに関する用量のシリーズは３７℃において６分間インキュベートした（ＮＰＲ−Ａは、ＮＰＲ−Ｂより「高速」のグアニル酸シクラーゼ（ｇｕａｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）であるようなので、ＡＮＰによるシグナル伝達の場合、速すぎて最高点に達する（すべての細胞ＧＴＰを使い尽くす）ことがないようにＡＮＰに関するインキュベーション時間を短くした）。図２４ＡおよびＢは、ＣＮＰ−２２およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）が、同様の用量反応曲線を有するＮＰＲ−Ｂを介したｃＧＭＰ産生を、ＮＰＲ−Ａを介するよりもはるかに大きい程度に刺激し、シグナル伝達競合アッセイにおいてＮＰＲ−Ｂ対ＮＰＲ−Ｃの選択性に関して同様のプロファイルを示したことを示す。
ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃに対する結合親和性（Ｋｉ）の決定
ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃに対するＣＮＰ変異体の結合親和性（Ｋｉ）を、異種競合結合アッセイ（米国特許第５，８４６，９３２号；Ｂ． Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ． １３巻（１１号）：２５０８〜２５１５頁（１９９４年）；Ｈ． Ｊｉｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９８巻（４号）：９６９〜９７６頁（１９９６年））において決定する。ＨＥＫ２９３細胞またはヒトＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−ＢまたはＮＰＲ−Ｃを発現する、別の適切にトランスフェクト可能な細胞系（例えばＨｅＬａ細胞）由来の膜を、放射標識リガンド結合アッセイのために調製する。膜調製品を適切な緩衝液で希釈し、様々な濃度のｗｔＣＮＰ２２またはＣＮＰ変異体（競合体）を、Ｉ１２５標識ｗｔＣＮＰ２２（Ｂａｃｈｅｍ）と一緒に加える。試料を室温でインキュベートし、リガンド／受容体を平衡させ、結合したペプチドを、ＰＶＤＦフィルター膜を介した濾過によって遊離のペプチドと分離する。フィルターを洗浄し、その後シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を加え、シンチレーションカウンターによりカウントする。結合を、個々の濃度の競合体ペプチドに関して二重に測定する。ＣＮＰ変異体の親和性（Ｋｉ、平衡解離定数）およびＢｍａｘ（受容体数）を、非線形回帰分析および／またはＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの等式によって計算する。
ＮＰＲ−Ｃへの親和性の減少を示すＣＮＰ変異体は、ＮＰＲ−Ｃによるクリアランスに対する感受性の減少、したがってより長い血漿半減期または血清半減期が予測される。循環中のＣＮＰ変異体の半減期の増加は、治療活性のための変異体の可用性を増加するものである。
（実施例６）
ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞の成長およびＲＣＳ細胞におけるｃＧＭＰ産生についてのＣＮＰ変異体の効果
骨成長を刺激するＣＮＰ変異体の能力を評価するために、ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞を線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）により治療することによって、細胞培養において骨格形成異常を刺激し、線維芽細胞増殖因子２は、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）を活性化し、成長の停止を誘導する（Ｋｒｅｊｃｉ ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１１８巻（２１号）：５０８９〜５１００頁（２００５年））。
最適なＣＮＰ治療のパラメーターは、ＣＮＰ濃度（０．０５、０．１、０．２および０．５ｕＭ）ならびに治療期間および間隔（連続；１日１回、２．５分、１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、および８時間、；１日２回、２．５分、１０分、３０分、１時間、２時間、および４時間）を変えることによって決定される。７２時間後、細胞を、自動細胞計測器を使用して計測し、細胞外マトリックスの量を、アルシアンブルー染色を使用して評価する。
その後、ｗｔＣＮＰ２２を用いた成長実験により決定された最適条件を使用して、ＲＣＳ細胞をＣＮＰ変異体で処理する。ｃＧＭＰの濃度を、未処理ＲＣＳ細胞、ＣＮＰで処理したＲＣＳ細胞およびＣＮＰ変異体で処理したＲＣＳ細胞に関して、競合ＥＬＩＳＡによって測定する。ＣＮＰ変異体による処理によりもたらされた細胞成長およびマトリックスの合成をさらにモニターし、ＣＮＰ処理によりもたらされた細胞成長およびマトリックスの合成と比較する。
ヒト細胞培養系におけるＣＮＰ変異体の効果を評価するために、アルギン酸ビーズ中の初代再分化ヒト軟骨細胞を、ｗｔＣＮＰ２２およびＣＮＰ変異体を用いて処理し、ｃＧＭＰ濃度を、有効なＣＮＰシグナル伝達の指標として競合的ＥＬＩＳＡによって決定する。
本明細書に記載の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのｃＧＭＰ産生およびラット軟骨肉腫細胞の成長を刺激する、ＣＮＰ変異体の能力を評価するために用いることができる。
（実施例７）
ラット軟骨肉腫細胞における用量反応研究
軟骨細胞成長の負の制御因子であるチロシンキナーゼ受容体の線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）は、軟骨無形成症被験体において構成的に（ｃｏｎｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）作動している。ＦＧＦ−２によるＦＧＦＲ−３受容体の刺激は、Ｅｒｋ ＭＡＰＫの活性化延長により成長停止を起こし、マトリックス合成の減少およびマトリックスの喪失を起こし、ならびに細胞形態の変化を起こす。ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞の線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）への連続曝露は、ＦＧＦＲ−３を活性化することによって、細胞培養物において軟骨無形成を刺激し、成長停止を誘導する（Ｋｒｅｊｃｉら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ、１１８巻（２１号）：５０８９〜５１００頁（２００５年））。骨細胞の十分な成長を刺激するＣＮＰ変異体の用量および投薬の頻度を決定するために、用量反応研究を、実施例６に記載のＲＣＳ細胞アッセイを使用して実施した。
ＲＣＳ細胞を、２４ウェルプレートに１０×１０３細胞／ウェルで播種し、２４時間成長させ、７２時間処理し、その後カウントした。ＲＣＳ細胞を、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍＬ）に連続して曝露し、構成的に活性なＦＧＦＲ−３を刺激し、構成的に活性なＦＧＦＲ−３が細胞成長の停止を誘導した（図２５の５番バーを参照されたい）。野生型ＣＮＰ２２（０．２ｕＭ）を、連続（７２時間）、毎日１時間または毎日２時間培養した。すべての刺激剤は毎日取り換えた。ＣＮＰ２２が不在のおよそ１００×１０３細胞／ウェル（図２５の５番バー）と比較して、５．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２の存在下におけるＲＣＳ細胞の０．２ｕＭ ＣＮＰ２２への連続曝露は、ＦＧＦ２−誘導性成長停止を部分的に逆転し、およそ２００×１０３細胞／ウェルの成長をもたらした（図２５の６番バー）。
１日に１回１時間のＣＮＰ２２（０．２ｕＭ）への曝露および１日に１回２時間のＣＮＰ２２（０．２ｕＭ）への曝露は両方とも、軟骨細胞成長に対する連続ＣＮＰ２２（０．２ｕＭ）曝露の効果の約８４％を達成した（図２５の７番および８番のバー）。これらの結果は、成長が停止した軟骨細胞のＣＮＰ２２への連続曝露は、細胞成長停止の逆転にとって必要ではないことを実証する。さらに用量反応研究は、より低用量のＣＮＰ２２が成長停止を逆転できることを実証する（図２６Ａ）。
さらに、細胞外マトリックスの組織学的分析および細胞形態学的分析は、ＣＮＰ２２処理が、軟骨肉腫の細胞外マトリックスのＦＧＦ２により媒介される喪失と拮抗し、マトリックス合成を増加させたことを示した。３５Ｓ硫酸塩および３Ｈ−Ｐｒｏのマトリックスへの組み込み、またはマトリックスからの減少によって評価されるように、ＦＧＦ−２への曝露はマトリックス合成を減少させ、分解を増加させたが、ＦＧＦ−２細胞培養物にＣＮＰ２２を加えることにより、マトリックス合成が増加し、部分的にＦＧＦ−２を阻害した（図２７Ａ〜Ｄ）。ＦＧＦ−２およびＣＮＰ２２と一緒に培養されたＲＣＳ細胞におけるアグリカンおよびフィブロネクチンの産生（ｍＲＮＡおよびタンパク質）の分析により、ＦＧＦ−２はアグリカンのレベルを低下させ、フィブロネクチンのレベルを上昇させ、このことはＣＮＰ２２を加えることによって阻害されたことが示された（図２８Ａ〜Ｃ）。ＦＧＦ−２は、主にＥｒｋを介してマトリックス処理分子を誘導および活性化し、ＣＮＰ２２を加えることにより、この活性化に対するいくらかの効果が示される。
成長停止を測定するためのさらなるハイスループットアッセイ、例えばクリスタルバイオレット染色は、ＲＣＳ細胞に対するＣＮＰ２２およびそれらの変異体の効果を測定するために有用である。
同様の用量反応研究が、本明細書に記載のＣＮＰ変異体を用いて実施でき、ＲＣＳ細胞のＦＧＦ２誘導性成長停止を逆転するためのそれらの有効用量を決定できる。
（実施例８Ａ）
軽度の軟骨無形成症マウス由来の脛骨および大腿骨の成長のＥｘ Ｖｉｖｏ刺激
マウス脛骨の器官培養モデルを使用して、骨の縦成長の刺激における野生型ＣＮＰ２２の有効性を実証した。野生型脛骨を、１０−８、１０−７または１０−６ＭのＣＮＰ２２を用いて６日間処置することによって、骨の縦成長がそれぞれ３１％、４０％および４２％増加した。組織学的評価により、肥大域の拡大、例えば、成長板中の肥大軟骨細胞の数およびサイズの増加がさらに示された（Ａｇｏｓｔｏｎら、ＢＭＣ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．７巻：１８頁（２００７年））。同様の発見が、ＦＧＦＲ３Ａｃｈマウスから単離された脛骨において観察された（Ｙａｓｏｄａら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１０巻：８０〜８６頁（２００４年））。
骨の縦成長の刺激におけるＣＮＰ変異体の有効性を決定するために、ＣＮＰ変異体を、野生型マウスおよび軽度の軟骨無形成症のマウスモデルを表す、ヒトＦＧＦＲ−３遺伝子にＧ３８０Ｒ変異を有するトランスジェニックマウス（ＦＧＦＲ３ｗｔ／Ａｃｈヘテロ接合体）における軟骨内の骨成長のマウス器官培養モデルにおいて試験した。簡潔に言うと、野生型ＣＮＰ２２およびＣＮＰ変異体の薬理学的活性を、野生型およびＦＧＦＲ３ｗｔ／Ａｃｈの同腹仔から単離した胚性脛骨または新生仔マウスの脛骨の器官培養モデルにおいて比較した。成長板内の全体的な骨の成長および組織学的変化を評価した。ならし培地を、細胞内シグナル伝達のバイオマーカー（ｃＧＭＰ）、軟骨代謝のバイオマーカー（ＩＩ型コラーゲン、他のコラーゲン、アグリカンコンドロイチン硫酸）、骨代謝のバイオマーカー（骨アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン［Ｃ−テロペプチド、Ｎ−テロペプチド］）および炎症のバイオマーカー（インターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−１１）に関してさらに評価する。
有効なＣＮＰ変異体を、例えば、ｃＧＭＰの産生を刺激するそれらの能力ならびに骨の縦の長さの増加によって測定した骨成長および成長板の肥大域における細胞の拡大によって特定する。
骨成長の測定
ｗｔＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）の、大腿骨の縦成長の刺激における有効性を、マウス器官培養モデルにおいて評価した。これらの実験のために、２〜３日齢の野生型マウスから大腿骨を単離し、０．２％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＬ−グルタミン、４０ユニットのペニシリン／ｍＬおよび４０ｕｇのストレプトマイシン／ｍＬを補充したアルファＭＥＭにおいて、８日間、媒体、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ変異体の存在下で培養した。処理を０日目に開始し、その後２日ごとに、培地を取り換える際に反復した。骨を、１ｃｍの接眼レンズ十字線を装着した解剖顕微鏡を使用して、処理前およびその後２日ごとに測定した。バイオマーカーの分析のためにならし培地を使用した。８日目に、骨を４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定し、５％ギ酸中で２４時間脱灰し、脱水し、パラフィンで包埋した。骨を５ｕｍ（ミクロン）に切片化し、次いでこれを脱パラフィンし、再水和し、Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ（ｐＨ２．５；ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ）を用いて３０分間染色した。Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅは軟骨を青く染色する。染色された切片を可視化し、明視野顕微鏡により撮影した。成長板軟骨の肥大域の厚みを画像分析によって決定した。
図２９は、ｗｔＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）の、ＣＮＰペプチドを用いて２日ごとに処置された、３日齢の野生型マウスの大腿骨の縦成長に対する効果を例示する。結果は、処置前（０日目）の測定値に対して正規化した。この研究は、３重（媒体）または４重（ＣＮＰペプチド）で実施した。図２９に示すように、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）ならびにＣＮＰ２２は、大腿骨の縦成長の刺激において有効であり、Ｎ末端ＰＥＧ化ＣＮＰ変異体が最も有効であった。
ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ２４」）（配列番号３６）に反応した、野生型およびＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの大腿骨および脛骨の成長をさらに評価した。野生型または軟骨無形成症（ＦＧＦＲ３ａｃｈ）マウスのどちらかの脛骨の培養により、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）は、媒体またはＣＮＰ２２と比較して、両方とも脛骨の縦成長を増加させたことが示された（図３０および３１）。ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）はさらに野生型マウスの大腿骨の成長を刺激した（図３２）。さらに、ＣＮＰ２２、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）およびＣＮＰ３７はそれぞれ、媒体と比較してＦＧＦＲ３ａｃｈマウス大腿骨の縦成長を増加させた（図３３）。
さらに、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウス脛骨の成長板におけるＣＮＰ３７のｅｘ ｖｉｖｏの分布を評価した。骨試料を上記のように調製した。パラフィン切片を切り、６０℃で１時間熱固定した。１％ヒアルロニダーゼを用いた３７℃における抗原回復（３０分間）、次いで１時間の血清ブロック（１０％正常ヤギ血清）を実施した。ＣＮＰ２２抗体（１：５００希釈；Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、４℃で一晩適用した。免疫検出のために、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、製造業者の推奨に従って使用した。特異結合したペルオキシダーゼを、ＤＡＢ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ）と一緒にインキュベートすることにより可視化し、その反応物を３分間顕色させた。その後、スライドを脱水し、標本にし、明視野顕微鏡を使用して撮影した。ＦＧＦＲ３ａｃｈマウス脛骨の成長板中のＣＮＰに関する染色は、ＣＮＰの免疫反応性が関節軟骨細胞および肥大軟骨細胞の領域において増加し（図３４）、このことはＣＮＰ３７が軟骨細胞に送達されたことを示した。
骨成長板におけるＣＮＰ変異体の分布に加えて、ＦＧＦＲ３ａｃｈおよび野生型の成長板中の細胞に対するＣＮＰ３７、ＣＮＰ２２および媒体のｅｘ ｖｉｖｏ効果、例えば、肥大細胞のサイズおよび増殖領域の細胞充実性をさらに評価した。Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ染色を含め、上記のように骨試料を調製した。近位成長板全体の画像を、４×の大きさで撮影した。軟骨の骨端側から出発して、成長板を３つの領域：休止域（個別の小型軟骨細胞）、増殖域（骨の長軸と平行な積み重ねた軟骨細胞の列）および肥大域（大型軟骨細胞およびその軟骨細胞間の薄い中隔）に分ける。これらの領域において、列あたりの増殖軟骨細胞の数および肥大軟骨細胞の密度を含む測定値を、ＩｍａｇｅＪソフトウエアによって得た。肥大域の５つの異なる領域における試験四角（４×４ｍｍ２）を使用して、肥大軟骨細胞の密度を決定した。肥大軟骨細胞の細胞サイズを、１割る決定された細胞密度により計算した（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ １ ｏｖｅｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）。増殖列の細胞充実性は、野生型およびＦＧＦＲ３ａｃｈマウス両方においてＣＮＰ３７およびＣＮＰ２２によって増加された（図３５ＢおよびＣ）。ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける軟骨細胞の肥大もまた、ＣＮＰ２２またはＣＮＰ３７と一緒の培養の結果として増加した（図３６ＢおよびＣ）。
マウス骨の培養のＥｘ ｖｉｖｏ研究は、ＣＮＰ３７が成長板に送達され、成長板拡大および骨の縦成長に関連する軟骨細胞の細胞充実性および肥大を増加させ得ることを示した。ｉｎ ｖｉｖｏの骨成長板におけるＣＮＰ３７の生体内分布および成長板（成長板全部の厚み、肥大域の厚みおよび増殖域の細胞充実性を含む）に対するＣＮＰ３７のｉｎ ｖｉｖｏ効果を評価するために、骨試料を、上記のように媒体またはＣＮＰ３７を用いて処置したＦＧＦＲ３ａｃｈマウスから得た。生体内分布およびｉｎ ｖｉｖｏ効果の研究のために、脛骨を固定し、７０％エタノール中で保存した。免疫組織化学のために、試料を５％ギ酸中で２日間脱灰し、脱水し、パラフィン中に包埋した。骨を５ｕｍ（ミクロン）に切片化し、次いでこれを脱パラフィンし、再水和し、上記のようにＣＮＰの免疫組織化学のために使用した。細胞の画像分析のために、骨を５μｍ（ミクロン）に切片化し、次いでこれを脱パラフィンし、再水和し、Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ（ｐＨ２．５；ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ）を用いて３０分間およびＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎを用いて３０秒間染色した。染色された切片を可視化し、明視野顕微鏡により撮影した。成長板ならびに増殖域および肥大域の厚みを、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して測定した。
ｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布研究は、ｅｘ ｖｉｖｏ研究と同様に、ＣＮＰの免疫反応性が、ＣＮＰ３７を用いて処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの脛骨成長板において関節軟骨細胞および肥大軟骨細胞の領域において増加したことを実証し、このことはＣＮＰ３７が、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＧＦＲ３ａｃｈマウス脛骨の成長板に送達されたことを示した（図３７）。さらに、ＣＮＰ３７処置は、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウス脛骨の成長板全体の厚み、増殖域および肥大域の厚みをｉｎ ｖｉｖｏで著しく増加させた（図３８Ａ〜Ｃ）。
これらの結果は、開示のＣＮＰ変異体が野生型および軟骨無形成症の動物の成長板に浸透し、軟骨細胞の数およびサイズを増加させ、成長板の増殖域および肥大域の厚みを増加させ、処置された野生型および軟骨無形成症の動物において骨の縦成長を増加させることを実証する。したがってＣＮＰ変異体は、軟骨無形成症被験体における骨の成長の刺激にとって有用である。
バイオマーカーの測定
ＣＮＰ変異体に反応した骨成長の測定に加えて、ＣＮＰ変異体に反応して誘導された軟骨および骨の形成および成長に関するバイオマーカーのレベルのアッセイは、骨成長に対するＣＮＰ変異体の効果を評価する上で有用である。
大腿骨および脛骨を、上記のように、野生型およびＦＧＦＲ３ａｃｈマウスから単離した。骨を、ＣＮＰ２２またはそれらの変異体と一緒に８日間培養し、培地を２日ごとに交換した。８日目に、培地を回収し、バイオマーカーのｃＧＭＰ（環状グアノシン３’、５’環状モノリン酸）および軟骨代謝回転の軟骨特異的マーカーである切断されたＩＩ型コラーゲンの断片に関して分析した。両方のマーカーを、ｃＧＭＰ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）および切断ＩＩ型コラーゲン（Ｃａｒｔｉｌａｐｓ）（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｕｎｔａｉｎ Ｈｉｌｌｓ、Ａｒｉｚｏｎａ）に関して市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って測定した。
ｃＧＭＰおよびＩＩ型コラーゲン断片のレベルを、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ２４」）（配列番号３６）に曝露後、細胞培養抽出物から測定した。図３９〜４２は、外植された野生型およびＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの大腿骨および脛骨をＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）に曝露した後の、培地中のｃＧＭＰのレベルの大幅な増加（ｐ＜０．０１）を示す。さらに、野生型およびＦＧＦＲ３ａｃｈマウス大腿骨をＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）に曝露することにより、切断されたＩＩ型コラーゲンのレベルが増加し、処理されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウス大腿骨は、ＩＩ型コラーゲン断片レベルの有意な増加（ｐ＜０．０５）を示した（図４３）。ＩＩ型コラーゲン断片のレベルの上昇は、軟骨マトリックスの代謝回転を示し、通常、軟骨代謝回転は成長する骨において、新しい骨の形成に先行する。
（実施例８Ｂ）
重度の軟骨無形成症マウス由来の大腿骨の成長のｅｘ ｖｉｖｏ刺激
重度の軟骨無形成症マウス由来の骨の成長に対するＣＮＰ変異体の効果をｅｘ ｖｉｖｏで評価した。この研究において、重度の軟骨無形成症のマウスモデルを表す、Ｙ３６７Ｃ変異を有するヒトＦＧＦＲ−３遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（ＦＧＦＲ３Ｙ３６７Ｃ）を使用した［Ｓ． Ｐａｎｎｉｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１７９２巻（２号）：１４０〜１４７頁（２００９年）］。大腿骨を胎生期１６．５日目に単離し、１ｕＭのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の存在下で６日間培養した。骨長を、１日目および７日目に測定した。次いで骨をパラフィン包埋し、切片化しヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色し、組織学的変化および細胞形態を評価した。ＦＧＦＲ３Ｙ３６７Ｃマウスから単離した骨外植片のＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「ＰｒｏＣＮＰ３８」）を用いた処置は、骨成長の増加および成長板における拡大をもたらした（図４４）。媒体を用いて６日間処置したＦＧＦＲ３Ｙ３６７Ｃマウス由来の大腿骨は、媒体を用いて処置した野生型の大腿骨と比較して、縦成長において１８％の欠損を示した。ＦＧＦＲ３Ｙ３６７Ｃマウス由来大腿骨の、１ｕＭのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を用いた６日間の処置は、成長欠損をまさに１１％に減少させた、すなわち、成長欠陥をおよそ４０％減少させた。
（実施例９）
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＣＮＰ変異体の血清／血漿における安定性
薬物動態（ＰＫ）研究のための調製において、血清および／または血漿におけるＣＮＰ変異体の安定性を評価する。
簡潔に言うと、検体を、２％トリクロロ酢酸沈殿または１：３の血清：アセトニトリル沈殿のいずれかによって、血清または血漿のタンパク質を除去することによって単離する。沈降混合物を、１４，０００ｒｐｍで５分間ボルテックスにかけ、上清部分を除去し、水で希釈し、その後分析用のシラン処理したオートサンプラーバイアルに移す。次いで、血清抽出物を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析する。ＣＮＰ変異体に関して特異的であることが示された、単一質量（ｍ／ｚ）を、定量目的でモニターする。
まず、分析安定性および回収率を決定する。分析（ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ）パラメーターを、マトリックス標準（検体の後期沈殿により強化された血清抽出物）の分析を介して最適化する。最適化後、分析回収率を、公知の濃度の血清試料をスパイクし、検体反応と、同様の濃度で調製したマトリックス標準の反応とを比較することによって決定する。血清抽出物中の検体安定性をさらに決定し、血清沈殿の後および実際の分析の前に有意な損失がないことを確実にする。血清安定性についての凍結の効果を試験するために、２周期の凍結／解凍研究もまた実施する。この研究において、血清試料を、ＣＮＰ変異体をスパイクし、分析後、−２０℃において一晩凍結する。次いで、試料を室温において解凍し、再分析する。この過程を、第２の凍結／解凍周期のために反復する。
ＣＮＰ変異体の血清安定性を、血清／血漿試料に、ＣＮＰ変異体を１０ｕｇ／ｍＬの濃度でスパイクすることによって決定する。試料を３７℃のウォーターバスに、３時間配置する。３０分間隔で血清のアリコートを２重に取り出し、分析する。検体の急速な損失（３０分の間に５０％を超える）が明らかな場合、研究を１０分の時点で反復してもよい。
マウス血漿中におけるＣＮＰ変異体の安定性を決定する例示的方法において、ＣＮＰ変異体（約２．５〜５．０ｍｇ／ｍＬのストック溶液の１０ｕＬ）、ヘパリン化マウス血漿（５０ｕＬ、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、ＣＤ−１ Ｌｉｔｈ Ｈｅｐ ６２２３１）および５ＭのＮａＣｌ（１０ｕＬ）の混合物を、３７℃、５％ＣＯ２において、０〜５時間インキュベートし、次いで、１０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（１５ｕＬ、ＳｉｇｍａＰ２７１４）を用いて反応を停止させる。抽出のために、１５０ｕＬのＭｅＯＨ／０．１％のＦＡを８５ｕＬの反応混合物に加え、得られた混合物を１分間ボルテックスにかけ、次いで１５℃で１５分間遠心分離器にかけた。７５ｕＬの上清を３００ｕＬの０．１％の水性ＦＡに加える。得られた混合物の少量を、ＬＣ／ＭＳによる分析に供する。
（実施例１０）
ラットおよびマウスにおける薬物動態およびｃＧＭＰ産生
正常なラットにおいて研究を実施し、ＣＮＰペプチドの単回の静脈内（ｉ．ｖ．）投与または皮下（ｓ．ｃ．）投与後の、ＣＮＰ２２および特定のＣＮＰ変異体の薬物動態（ＰＫ）プロファイルおよび血漿ｃＧＭＰ濃度の継時変化を評価した。血漿ＣＮＰの免疫活性を、抗ＣＮＰウサギポリクロナール抗体を用いた競合放射免疫測定（ＲＩＡ）を使用して決定した。血漿ｃＧＭＰ濃度を、市販のキット（ＹＡＭＡＳＡ ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＹＡＭＡＳＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＲＩＡにより決定した。
７〜８週齢の正常なオスのラットを使用した。組換え野生型ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を評価した。個々のＣＮＰペプチドの２０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量を、５％マンニトール中の溶液として、尾の静脈に１回注射、または個々のＣＮＰペプチドの５０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量を、ｌ％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコールおよび１０％（ｗ／ｖ）スクロースを含む０．０３ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０中の溶液として、背中に１回皮下注射した。
血漿ＣＮＰ免疫活性を、抗ＣＮＰウサギポリクロナール抗体を使用して、競合ＲＩＡにより決定した。標準およびＱＣ試料を調製した。５０ｕＬの標準、ＱＣおよびアッセイ試料を、５０ｕＬのＲＩＡ緩衝液を含有する試験管にそれぞれ加えた。希釈した抗ＣＮＰウサギポリクロナール抗体（１００ｕＬ）を管に加えた。ＡＵ管を、一晩４℃に保った。１２５Ｉ−［Ｔｙｒ０］−ＣＮＰ２２溶液（１００ｕＬ）およびウサギＩｇＧ溶液（１００ｕＬ）を加え、およそ４℃において一晩放置した。１０％ポリエチレングリコールを含有する１ミリリットルの抗ウサギＩｇＧヤギ血清を加え、ボルテックスにかけ、およそ４℃において少なくとも１時間放置し、次いで、不溶性分画を、遠心分離により沈殿させた。上清の吸引後、堆積物中の放射線（γ線）量を、ガンマカウンターにより測定した。各試料を２重に測定し、平均を決定値として採用した。
ｉ．ｖ．投与後５、３０、６０および９０分、またはｓ．ｃ．投与後５、３０、６０、１２０および１８０分の試料中の血漿ｃＧＭＰ濃度を、抗ｃＧＭＰモノクロナール抗体を使用して競合ＲＩＡにより決定した。標準試料を調製した。１００ｕＬのアッセイ試料（較正曲線のための標準溶液またはｃＧＭＰ決定のための希釈血漿試料）を、試験管に移した。次いで、１００ｕＬの抗ｃＧＭＰモノクロナール抗体溶液および１００ｕＬの１２５Ｉ標識スクシニルｃＧＭＰチロシンメチルエステル溶液を、それぞれ管に加えた。すべての管を、一晩４℃に保った。５００ｕＬのデキストランチャコール溶液を加えた後、管をボルテックスにかけ、次いで、氷上に１０分間配置した。反応混合物を、遠心分離器にかけ、５００ｕＬの上清を、各試料から新しい試験管に移した。上清中の放射線（γ線）の量を、γカウンターにより測定した。各試料を２重に測定し、平均を決定値として採用した。
血漿ＣＮＰ免疫活性を、薬物動態（ＰＫ）分析のために用いた。ＰＫ分析を、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。ｉ．ｖ．投与後の、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のＰＫプロファイルを、０時間の濃度（Ｃ０：外挿法、ｐｍｏｌ／ｍＬ）、全身クリアランス（ＣＬｔｏｔ：ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）、定常状態における分布容積（Ｖｄｓｓ：ｍＬ／ｋｇ）、血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ：ｐｍｏｌ−分／ｍＬ）、平均滞留時間（ＭＲＴ：分）および半減期（Ｔ１／２：分）などのＰＫパラメーターを使用して計算した。ｓ．ｃ．投与後のＣＮＰペプチドのＰＫプロファイルは、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ：ｐｍｏｌ／ｍＬ）、Ｃｍａｘに至るまでの時間（Ｔｍａｘ：分）、血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ：ｐｍｏｌ−分／ｍＬ）、平均滞留時間（ＭＲＴ：分）および半減期（Ｔ１／２：分）などのＰＫパラメーターを使用して計算した。
血漿スパイク回収実験において、ＲＩＡはＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を同様に検出した（データ非掲載）。
上記の手順と同様の手順を用いて、ＣＮＰ２２およびそれらの変異体のＰＫプロファイルならびにｃＧＭＰ産生を刺激するそれらの能力をマウスにおいて研究した。
３匹のラットにおける、ｉ．ｖ．投与後のＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のＰＫプロファイルを、図４５に示す。図４５に示すように、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）は、ＣＮＰ２２よりはるかに長い半減期およびはるかに高い生物学的利用能を有した。半減期、Ｔ１／２（分）は、ＣＮＰ２２に関しては１．４２（±０．４５）、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）に関しては２２．３（±１．５）およびＣＮＰ３７に関しては４９．５（±２８．０）であった。曲線下面積、ＡＵＣ（ｐｍｏｌ・分／ｍＬ）は、ＣＮＰ２２に関しては３２０（±５４）、ＣＮＰ３７に関しては１５５９（±５６８）およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）に関しては２０８４（±４２４）であった。
３匹のラットにおける、ｓ．ｃ．投与後の３種のＣＮＰペプチドのＰＫプロファイルを、図４６に示す。ＣＮＰ２２と比較して、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）は、はるかに長い半減期（７８．１分（±１６．４）対１０．０（±５．０））およびはるかに高い生物学的利用能（６０％（±６％）対１９％（±９％））を有した。
３匹のラットにおける、３種のＣＮＰペプチドのｉ．ｖ．投与後の血漿ｃＧＭＰ濃度の経時変化を図４７に表す。図４７は、ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のｉ．ｖ．投与が、ＣＮＰ２２のｉ．ｖ．投与よりも、３０、６０および９０分においてｃＧＭＰのはるかに高い血漿レベルをもたらしたことを明らかに実証する。
３匹のラットにおける３種のＣＮＰペプチドのｓ．ｃ．投与後の血漿ｃＧＭＰ濃度の時間プロファイルを、図４８に示す。ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号：３６）およびＣＮＰ３７の皮下投与もまた、ＣＮＰ２２のｓ．ｃ．投与よりも実質的に高いｃＧＭＰの血漿濃度をもたらし、ＣＮＰ２２に対する差は、ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）に関しては時間とともに増加するが、ＣＮＰ３７に関しては時間とともに減少していた。
ラットの研究は、ｗｔＣＮＰ２２と比較して、ＣＮＰ変異体のＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）は、ｉｎ ｖｉｖｏで実質的により長い半減期を有し、ｉｎ ｖｉｖｏで実質的により高い生物学的利用能を有し、ｉｎ ｖｉｖｏで長期間実質的により高いレベルのｃＧＭＰの産生を刺激したことを示している。ＣＮＰ３７およびＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）のＮＥＰ分解に対する耐性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのより長い血漿半減期に相関し、これは、同様にｉｎ ｖｉｖｏの長期のＮＰＲ−Ｂ／ｃＧＭＰシグナル伝達に相関する。これらの結果は、ＣＮＰ２２と比較して、ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．注射によって投与された本開示のＣＮＰ変異体（例えば、１日１回）は、ＣＮＰ反応性の状態および障害、例えば骨関連障害および血管平滑筋障害の治療においてより有効であり得ることを示している。
（実施例１１）
マウスにおける薬物動態研究
ＦＧＦＲ３ａｃｈマウス（実施例１３を参照されたい）における有効性研究のための、ＮＥＰ耐性の増加を有するＣＮＰ変異体を決定するために、ＣＮＰ変異体と野生型ＣＮＰ２２との薬物動態特性を比較する薬物動態（ＰＫ）研究を実施する。ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスは、ＦＶＢマウスのバックグラウンドに単一のトランス遺伝子を含有する、軽度の軟骨無形成症の突然変異体マウスモデルである。
野生型ＣＮＰ２２またはそれらの変異体を、単回静脈内（ｉ．ｖ．）用量として、６週齢の野生型ＦＶＢマウスに投与する。例示的ＰＫ研究を、ｗｔＣＮＰ２２を使用して実施した。６週齢のＦＶＢ／Ｎマウスに、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回用量でｗｔＣＮＰ２２に静脈内投与した。ＣＮＰ２２の平均血漿レベルを計算し、ＣＮＰ２２の推定半減期を、０．７６分から１．０３分であると見積もった。
ＮＥＰ分解に対するより高い耐性を表示するＣＮＰ変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏで時間とともに血清濃度の増加およびより長い半減期を示すことが予測される。
（実施例１２）
野生型マウスにおけるＣＮＰ変異体の有効性
骨成長に対するＣＮＰ変異体のｉｎ ｖｉｖｏ効果を野生型マウスにおいて評価した。３週齢のＦＶＢ野生型雄マウスに、媒体、Ｇ−ＣＮＰ３７（２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）またはＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ１２」）（配列番号３６）（２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）のいずれかを５週間、毎日皮下（ｓ．ｃ．）注射した。体重を、少なくとも週に１回測定した。尾長を、デジタル読み取りキャリパーを使用して少なくとも週に１回測定し、体長（鼻から肛門までの長さ）、骨長（脛骨、大腿骨、尺骨および上腕骨）、頭蓋長（前頭セグメントから後頭セグメント）および第５腰椎（ＬＶ５）の長さを、処置の５週間後にキャリパーを使用して測定した。Ｘ線写真を、ベースラインおよび処置後５週間において撮った。
Ｇ−ＣＮＰ３７を用いた野生型マウスの５週間の処置は、有意な体重増加をもたらし、体重増加の開始は９日目に観察された（ｐ＜０．０５）（図４９）。Ｇ−ＣＮＰ３７を用いた処置は、尾長の有意な増加をさらにもたらし、処置後第２週に始まった（ｐ＜０．０１）（図５０）。
表１０は、媒体だけで処置された野生型マウスを１００％とした値に対する、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧ−ＣＮＰ３７またはＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ１２」）（配列番号３６）のいずれかを５週間、１日１回ｓ．ｃ注射された野生型マウスの、尾長、体長（鼻から肛門までの長さ）、頭蓋長（前頭蓋から後頭蓋部分）、骨長（大腿骨、脛骨、上腕骨および尺骨）および第５腰椎（ＬＶ５）の長さのパーセント変化を示す。
Figure 0005718909
 ＊＊ｐ＜０．０１， ＊ｐ＜０．０５
Ｇ−ＣＮＰ３７を用いた処置は、媒体を用いた処置と比較して、尾長、体長（鼻から肛門までの長さ）、頭蓋長、近位骨長（大腿骨および上腕骨）、遠位骨長（脛骨）および脊椎骨長（第５腰椎）の有意な増加をもたらした。
５ｎｍｏｌ／ｋｇ、２０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで、毎日、５週間、ｓ．ｃ．投薬された低用量のＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７は、媒体と比較して、尾長、体長（鼻から肛門までの長さ）および骨長において用量依存性増加をもたらした。表１１は、５ｎｍｏｌ／ｋｇ、２０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を、１日１回、５週間、ｓ．ｃ．注射された野生型マウスにおける、媒体だけで処置された野生型マウスを１００％とした値に対する、尾長、体長（鼻から肛門までの長さ）および骨長（大腿骨、脛骨、上腕骨および尺骨）のパーセント変化を示す。
Figure 0005718909
 ＊＊ｐ＜０．０１， ＊ｐ＜０．０５
別の研究において、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の様々な投薬計画で９週間投与し、その後１週間回復させた。野生型ＦＶＢマウスに、
（１）媒体を毎日９週間、その後１週間の回復；
（２）２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日１週間、その後週に３用量を８週間および１週間の回復；
（３）２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を隔週；または
（４）５ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日９週間、その後１週間の回復
でｓ．ｃ．投薬した。
尾長、体長および骨長の成長増加を、研究の終わりにすべての処置群（２、３および４群）において観察した。表１２は、上記の投薬計画の下でＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を投与された野生型マウスにおける、媒体だけで処置されたｗｔマウスを１００％とした値に対する、尾長、体長（鼻から肛門までの長さ）および骨長（大腿骨、脛骨、上腕骨および尺骨）のパーセント変化を示す。
Figure 0005718909
 ＊＊ｐ＜０．０１， ＊ｐ＜０．０５
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７のすべての投薬計画は、測定された軸性および四肢の成長パラメーターを増加させたが、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の毎日の投薬は、頻度の少ない投薬計画（２および３群）と比較して、合計レベルが低用量（４群）において四肢（大腿骨、脛骨、上腕骨および尺骨）の成長が促進された。
（実施例１３）
軽度の軟骨無形成症マウスモデルにおける有効性
成長の促進および軟骨無形成症の矯正におけるＣＮＰ変異体の有効性を、軽度の軟骨無形成症のマウスモデルにおいて、Ｇ３８０Ｒ変異を有するヒトＦＧＦＲ−３遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（ＦＧＦＲ３ａｃｈ）の株を使用して試験した（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻（８号）：４４５５〜４４６０頁（１９９９年）；Ｎａｓｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＵＳＡ、１２５巻：４９７７〜４９８８頁（１９９８年）；米国特許第６，２６５，６３２号および第６，１３６，０４０号）。
３週齢において、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスおよびそれらの野生型同腹仔に麻酔をかけ、Ｆａｘｉｔｒｏｎによって、側面全身Ｘ線画像を撮影し、体重によって以下の処置群にランダム化した（ｎ＝８／群）：（１）野生型／媒体、（２）ＦＧＦＲ３ａｃｈ／媒体、（３）ＦＧＦＲ３ａｃｈ／ＣＮＰ３７および（４）ＦＧＦＲ３ａｃｈ／ＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）。マウスに、指定の被験物質（媒体または２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＣＮＰ変異体）の５週間の１日１回の皮下（ｓ．ｃ．）投与を施した。サテライト群（ｎ＝３）を使用して、１日目の単回皮下投与の後の個々の被験物質の曝露を確認した。媒体のｓ．ｃ．注射を毎日、５週間受けた野生型雄ＦＶＢマウスを、正常成長の対照として使用した。
ベースラインおよび研究の終わりにおいてＸ線測定を実施し、頭長、頭蓋面積および外耳道（ＥＡＭ、外耳から中耳へ走る外耳道）の変化を決定した。体重および尾長を、デジタルキャリパーを使用して少なくとも週に１回測定し、尾長および体長（鼻から肛門までの長さ）を処置の５週間後に測定した。骨長（脛骨、大腿骨、尺骨および上腕骨）を剖検においてデジタルキャリパーを使用して測定した。
３７日目に、すべてのマウスを終末麻酔によって犠牲にし、全動物の写真およびＸ線画像を、Ｆａｘｉｔｒｏｎによって撮影した。左右の脛骨、大腿骨、上腕骨および尺骨を回収し、デジタルキャリパーを使用して測定した。各骨の左部分を、組織学用に処置し、右部分をアーカイブのために急速凍結した。骨から得た試料を使用して、ＣＮＰ変異体の軟骨性骨成長に対する効果を評価した。
１日１回のｓ．ｃ．注射、５週間によるＣＮＰ３７を用いたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの処置は、体長（図５１）、尾長（図５２）、遠位骨長（尺骨および脛骨）（図５３ＡおよびＢ）および近位骨長（上腕骨および大腿骨）（図５４ＡおよびＢ）の有意な増加をもたらした。さらに、ＣＮＰ３７を用いた処置は、頭長（図５６）、外耳道（図５７）の面積および椎体の伸長を介して脊椎骨長（図５８）を増加させた。さらに、ＣＮＰ３７を用いた処置は、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスの近節短縮（近位肢の長さの不均衡）を矯正した、すなわち、大腿骨：脛骨比によって評価される近位骨の比例成長を回復した（図５５）。表１３に、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ２４」）（配列番号３６）のいずれかを、１日１回、５週間、ｓ．ｃ．投与されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける、媒体だけで処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスを１００％とした値に対する、尾長、体長（鼻から肛門までの長さ）および骨長（大腿骨、脛骨、上腕骨および尺骨）のパーセント変化をまとめる。
Figure 0005718909
 ＊＊ｐ＜０．０１， ＊ｐ＜０．０５
これらの研究の結果は、ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおいて、ＣＮＰ３７が脊椎骨および長骨の成長を刺激し、脛骨より大腿骨の長さを優先的に増加させることによって近節短縮の矯正を助け、頭蓋顔面比率の回復を助け得ることを示す。これらの結果は、ＣＮＰ３７および潜在的に他のＣＮＰ変異体が、軟骨無形成症の症状の矯正および骨成長に欠陥を有する被験体または骨成長の増加を必要とする被験体の治療に有効であり得ることを示す。
（実施例１４）
野生型および軟骨無形成症マウスにおけるバイオマーカーの測定および免疫原性の評価
ＣＮＰ投与後のバイオマーカーの測定
骨成長バイオマーカーのレベルを、野生型および軟骨無形成症（ＦＧＦＲ３ａｃｈ）マウスにおいて測定した。
トランスジェニックＦＶＢ ＦＧＦＲ３ａｃｈマウス（軽度の軟骨無形成症のマウスモデル）を、上記のように、媒体（３０ｍＭの酢酸／酢酸塩緩衝液、１％ベンジルアルコール、１０％スクロース、ｐＨ４．０）、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ２４」）（配列番号３６）のいずれかを、個々のＣＮＰ化合物に関して２００ｎｍｏｌ／ｋｇで、皮下注射によって毎日、５週間処置した。血漿および血清を研究の間回収した。収穫した血漿を、１０×プロテアーゼ阻害剤と一緒に−８０℃において分析まで保存した。ｃＧＭＰレベルを、３６日目に注射１５分後にＫ２−ＥＴＤＡ血漿回収チューブから測定した。切断されたＩＩ型コラーゲンの断片（軟骨関連バイオマーカー）、オステオカルシン（骨関連バイオマーカー）およびＩｇＧ（免疫原性に関する）を、研究の終わり（３７日目）に、最終採血血清から測定した。ｃＧＭＰを、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、カタログ番号５８１０２１．１）を使用して測定し、切断されたＩＩ型コラーゲン（Ｃａｒｔｉｌａｐｓ）をＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓによる市販のキット（カタログ番号３ＣＡＬ４０００）を使用して測定し、オステオカルシンをＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）による市販のキットを使用して測定した。
図５９は、媒体と比較した、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置したＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおけるｃＧＭＰの血漿レベルの増加を示す。図６０および６１は、ＣＮＰ３７の投与が、切断されたＩＩ型コラーゲンおよびオステオカルシンの血清レベルの最も高い上昇をもたらしたことを示す。これらの結果は、ＣＮＰペプチド、特にＣＮＰ３７のＦＧＦＲ３ａｃｈマウスへの投与が、骨成長マーカーのレベルの増加をもたらすことを示し、このことはＣＮＰペプチドで処置されたＦＧＦＲ３ａｃｈマウスにおける骨の形成および成長の増加を示唆する。
野生型マウス中のバイオマーカーの評価のために、野生型ＦＶＢマウスを、媒体（３０ｍＭの酢酸／酢酸塩緩衝液、１％ベンジルアルコール、１０％スクロース、ｐＨ４．０）、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧ−ＣＮＰ３７、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ１２」）（配列番号３６）または２０ｎｍｏｌ／ｋｇもしくは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７のいずれかを用いて皮下注射によって毎日、５週間処置した。血漿および血清を研究の間回収した。収穫した血漿を、１０×プロテアーゼ阻害剤と一緒に−８０℃において分析まで保存した。ｃＧＭＰレベルを、３６日目に注射１５分後にＫ２−ＥＴＤＡ血漿回収チューブから測定した。切断されたＩＩ型コラーゲン、骨特異的アルカリホスファターゼおよびＩｇＧ（免疫原性に関する）を、研究の終わり（３７日目）に、最終採血血清から測定した。ｃＧＭＰおよび切断されたＩＩ型コラーゲン（Ｃａｒｔｉｌａｐｓ）を上記のように測定した。骨特異的アルカリホスファターゼを、市販のキット（Ｃｕｓａｂｉｏ、カタログ番号ＣＳＢ−Ｅｌ１９１４ｍ）を使用して測定した。
Ｇ−ＣＮＰ３７の投与は、媒体と比較して、野生型マウスにおいてｃＧＭＰのレベルを有意に増加させ（図６２）（ｐ＜０．０５）、特に切断されたＩＩ型コラーゲン断片のレベルを増加させた（図６３）。Ｇ−ＣＮＰ３７の投与からもたらされたＩＩ型コラーゲン断片の有意に高いレベルは、軟骨マトリックスの代謝回転を示し、このことはＧ−ＣＮＰ３７が野生型マウスにおいて、骨成長における新しい骨の形成を刺激したことを示唆する。
２０および７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）の用量は両方とも、媒体を用いて処置した野生型マウスと比較して、投与後１５分の血漿ｃＧＭＰを有意に増加させた（ｐ＜０．０５）（図６４）。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の高用量（７０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の投与は、媒体処置マウスと比較して、切断されたＩＩ型コラーゲンのレベルもまた有意に増加させ（ｐ＜０．０５）（図６５）、このことは高用量のＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７が、野生型マウスにおいて新しい骨の形成前に軟骨マトリックスの代謝回転を刺激したことを示唆する。さらに、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の高用量（７０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の投与は、媒体処置マウスと比較して、骨特異的アルカリホスファターゼのレベルを増加させ（ｐ＜０．０５）（図６６）、このことは高用量のＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７が野生型マウスにおいて骨のリモデリングを増加させたことを示唆する。
ＣＮＰ変異体の免疫原性の評価
ＣＮＰ変異体はペプチド誘導体であるので、そのペプチドの投与がｉｎ ｖｉｖｏで免疫原性反応をもたらす可能性がある。ＣＮＰ変異体の連続投与後に免疫反応が起こるかどうかを評価するために、血清抗体レベルの測定を実施した。
ＩｇＧアッセイを実施し、軟骨無形成症ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスを、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（「ＣＮＰ２７−ＰＥＯ２４」）（配列番号３６）に５週間曝露することによってＩｇＧの免疫反応を誘発した。ＩｇＧは、マウスおよびヒトの血清において最も優勢な免疫グロブリンであり、抗原に対する二次免疫反応の一部として産生される。ＣＮＰペプチドの投与に対するＩｇＧ反応を、以下のように決定した。９６ウェルプレートを、ＢｕｐＨ ＰＢＳ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２８３７２、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）中１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＰ２２、ＣＮＰ３７またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いてコーティングした。一晩のインキュベーション後、プレートを、Ｃａｓｅｉｎ−ＰＢＳブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３７５２８）を用いて２時間、室温において、３００ｒｐｍで振とうしながらブロックした。洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む１×ＰＢＳ）を用いて洗浄後、希釈した最終採血由来の血清試料（１：２５希釈）をプレートに加えた。陽性および陰性対照をプレートにさらに載せた。陽性対照は、抗ＣＮＰ２２抗体（Ｂａｃｈｅｍのウサギ抗ＣＮＰ２２ ＩｇＧ、カタログ番号Ｔ−４２２２）を１：１０００希釈で加えた１：２５希釈の血清（６匹の個別のＦＶＢマウスからプールした）であった。陰性対照は、希釈したプール血清であった。インキュベーション２時間後、プレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体をウェルに加えた。マウス血清試料のために、抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ（ペルオキシダーゼ結合−アフィニピュア（ａｆｆｉｎｉ−ｐｕｒｅ）ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片、カタログ番号１１５−０３５−０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を、１：１０，０００希釈で加えた。陽性対照および陰性対照のために、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＳＣ−２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をブロッキング緩衝液に加えた。３００ｒｐｍで振とうしながら室温で２時間のインキュベート後、プレートを洗浄緩衝液を用いて洗浄した。１００ｕＬのＴＭＢ（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２２）をすべてのウェルに加えた。プレートを、３００ｒｐｍで振とうしながら室温で１５分間インキュベートした。比色反応を、１００ｕＬの２ＮのＨ２ＳＯ４を加えることによって停止させた。プレートを、４５０ｎｍ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において読み、データをＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。
ＣＮＰ２２またはＰＥＯ２４−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）を用いて処置したＦＧＦＲ３ａｃｈマウス由来の血清試料は、いずれのマウスにおいても陽性のＩｇＧ免疫反応を示さなかった。９匹のＣＮＰ３７処置ＦＧＦＲ３ａｃｈマウスのうち１匹だけがわずかに陽性のＩｇＧ反応を示した。
血清ＩｇＧレベルの増加により測定した、Ｇ−ＣＮＰ３７、ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を投与した野生型マウスの免疫原性反応を、上記のように最終採血血清試料を調べることによってさらに評価した。ＰＥＯ１２−ＧＡＮＲＲ−ＣＮＰ２２（Ｋ４Ｒ）（配列番号３６）またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（２０または７０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を用いて処置した野生型マウスは、陽性のＩｇＧ免疫反応を示したものはなく、Ｇ−ＣＮＰ３７を投与された６匹の野生型マウスのうち１匹だけが、わずかに陽性のＩｇＧ反応を示した。
様々なＣＮＰ投薬計画下のバイオマーカーの測定
野生型ＦＶＢマウスを、様々な投薬計画下で、媒体（３０ｍＭの酢酸／酢酸塩緩衝液、１％ベンジルアルコール、１０％スクロース、ｐＨ４．０）またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、毎日、９週間処置した。１群は、媒体を９週間、毎日皮下注射され、その後１週間は処置しなかった、媒体処置マウスを含んだ。２群は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を用いて１日に１回、１週間、その後週に３用量、８週間処置し、その後１週間は処置しなかったマウスを含んだ。３群は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を用いて１日に１回、隔週（１、３、５、７および９週目）に処置し、各処置の週の後の１週間は処置しなかったマウスを含有した。４群は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を用いて１日に１回、９週間処置し、その後１週間は処置しなかったマウスを含有した。最後に、５群は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を用いて１日に１回、５週間処置し、処置しない週がなかったマウスを含んだ。最終採血血清をマウスから回収し、切断されたＩＩ型コラーゲン、全アルカリホスファターゼおよび全抗体レベルを、それらから測定した。切断されたＩＩ型コラーゲンレベルを、上記のように測定した。主に肝臓および骨に由来する全アルカリホスファターゼレベルを、獣医学診断研究所試験施設（Ａｎｔｅｃｈ）の支援により測定した。
全抗体アッセイを進展させ、潜在的免疫反応を評価した。全抗体アッセイに使用するプラットフォームは、電気化学発光アッセイ（ＥＣＬＡ）であった。ＥＣＬＡプラットフォームは、ビオチン標識薬剤（ここではビオチン−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）およびルテニウム標識薬剤（ここでは、Ｒｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）を利用する。ビオチン標識薬剤は、電極を含有するストレプトアビジンコーティングプレートと結合し、そしてルテニウムは電気化学的に刺激され得るので、ルテニウム標識薬剤は、アッセイの検出成分として機能する。薬剤特異的抗体（ここでは、ＣＮＰ−特異的抗体）は、ビオチン標識薬剤およびルテニウム標識薬剤と結合し、２つの標識薬剤を「架橋する」。ＥＣＬＡプラットフォームの利益の１つは、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭなど）の任意のアイソタイプを検出でき、ＥＣＬＡアッセイが種非依存性であることである。
全抗体アッセイを以下のように実施した。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を４：１のチャレンジ比（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｒａｔｉｏ）でビオチンを用いて標識し、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７もまた、１０：１のチャレンジ比でルテニウムを用いて別々に標識した。両方の別々標識反応を、グリシンを添加することによって停止させ、両方の反応からの試料を、ＰＢＳに緩衝液交換した。低濃度および高濃度のＱＣを、５％に希釈したＦＶＢマウス血清に低濃度および高濃度で加えた市販の抗ＣＮＰ２２抗体（Ｂａｃｈｅｍ、ウサギ抗ＣＮＰ２２ ＩｇＧ、カタログ番号Ｔ−４２２２）を使用して、調製した。マウス血清試料を、アッセイ希釈剤（ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、ＭＳＤカタログ番号Ｒ９３ＡＡ−１）を使用して５％に希釈した。作業溶液を、ビオチン標識Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７をアッセイ希釈剤に加え、その後ルテニウム標識Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７をアッセイ希釈剤に加え、その後、その２種の溶液を１つに組み合わせることによって調製した。２５ｕＬの低濃度および高濃度ＱＣを、対照としてプレートに載せた。次いで、２５ｕＬの試料を、非結合９６ウェルプレートに加え、その後、５０ｕＬの作業溶液をすべてのウェルに加えた。試料およびＱＣを、３５０ｒｐｍで振とうしながら、室温で２時間作業溶液と一緒にインキュベートした。その間に、ＭＳＤストレプトアビジンプレート（ＭＳＤ カタログ番号Ｌ１３ＳＡ−１）を、３５０ｒｐｍで振とうしながら、室温で２時間、ブロッキング緩衝液（ＭＳＤ カタログ番号Ｒ９３ＡＡ−１）を用いてブロックした。２時間のインキュベーションの終わりに、ＭＳＤストレプトアビジンプレートを洗浄し、その後、５０ｕＬの試料またはＱＣをＭＳＤプレートに移した。次いで、このプレートを、３５０ｒｐｍで振とうしながら、室温で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの終わりに、ＭＳＤプレートを洗浄し、１５０ｕＬの２×リード緩衝液（ＭＳＤ カタログ番号Ｒ９２ＴＣ−２）をプレートに加えた。そのプレートを、ＭＳＤ ＰＲ４００機器を使用して読み取った。
マウスの５つの群すべてが実質的に同様の、切断されたＩＩ型コラーゲンレベルを示した（図６７）。５ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を１日１回、５週間用いた５群におけるマウスの処置は、骨のリモデリングの指標である全アルカリホスファターゼレベルを有意に増加させた（ｐ＜０．００１）（図６８）。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を用いて処置したマウスの４つの群それぞれに由来する血清試料は、全抗体アッセイにおいて陽性の抗体反応を示さなかった。
いかなる理論にも縛られるものではないが、ＣＮＰ処置マウスの４つの群が、切断されたＩＩ型コラーゲンレベルにおいて媒体処置マウスと比較して統計的有意差を示さなかった理由、および５群のＣＮＰ処置マウスだけが、全アルカリホスファターゼレベルにおいて媒体処置マウスと比較して統計的有意な増加を示した理由には、考えられる説明がある。この研究の媒体処置マウスもまた成長しているので、成長のバイオマーカーである切断されたＩＩ型コラーゲンおよびアルカリホスファターゼが、媒体処置マウスにおいても産生されていた可能性がある。さらに、１から４群それぞれのマウスに関して処置しない１週間の期間が存在したので、１から３群のＣＮＰ処置マウスおよび媒体処置マウスの間の、切断されたＩＩ型コラーゲンおよび全アルカリホスファターゼのレベルにおけるあらゆる変化が希釈された可能性がある。５群のＣＮＰ処置マウスには処置しない期間がなく、それらのマウスは、媒体処置マウスと比較して有意に高い（ｐ＜０．００１）全アルカリホスファターゼレベルを示した。
（実施例１５）
マウスにおけるＣＮＰ変異体の用量反応
ＣＮＰ変異体の様々な用量の効果を、野生型ＦＶＢマウスにおいて評価した。
２つの別々の研究（Ｓ１およびＳ２）において、用量研究のために、１０匹のマウスの群に、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を、２０および７０ｎｍｏｌ／ｋｇで、１日１回、３６回の皮下注射で投与した。尾長および体長を、処置の過程にわたって測定した。実験の終わりに動物を犠牲にし、骨長を評価した。
媒体処置動物の尾長は、３６日目におよそ８ｃｍであったが、一方２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８を用いて処置した動物はおよそ８．７５ｃｍの尾長を示し、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８を用いて処置した動物はおよそ９．５ｃｍに尾長が増加した。いずれの用量のＰｒｏ−ＣＮＰ３８の投与も、対照処置動物と比較して、全体長において有意な（ｐ＜０．０５）相対的増加を誘導し、このことは２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８でおよそ１３０％の成長速度の増加、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８でおよそ１６０％の成長速度の増加を実証している（図６９）。
Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を用いた処置は、動物の評価した長骨の大部分および鼻から肛門までの合計（体長）においてもまた、骨長を有意に増加させた。表１４は、媒体処置動物と比較した、処置動物における骨長の相対的％増加の表示である。
Figure 0005718909
 相対的％増加， ＊ ｐ＜０．０５ ＡＮＮＯＶＡ （Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ） ｖ媒体
骨無機質密度（ＢＭＤ）および骨無機質量（ＢＭＣ）を、様々な用量でＰｒｏ−ＣＮＰ３８を投与後にさらに評価した。結果（図７０）は、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８の投与が骨無機質密度（図７０Ａ）を有意に減少させ、骨無機質量を有意に増加させた（図７０Ｂ）ことを示し、このことは処置動物において骨の鉱化作用の遅延があるが、鉱化作用過程それ自体はＣＮＰを用いた処置によって不利な影響を受けないことを示唆している。
Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８処置動物または媒体処置動物の間に器官重量の有意な変化はなかった。
マウスにおける用量反応の生体分析研究
生体分析研究を実施し、様々な用量のＰｒｏ−ＣＮＰ３８のｉｎ ｖｉｖｏの投与後のＣＮＰ活性のマーカーを測定した。ｉｎ ｖｉｖｏ試料からの、血漿ｃＧＭＰレベル、ＩＩ型コラーゲンの血清レベルおよびアルカリホスファターゼの血清レベルを分析した。野生型マウスに、２０および７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）、２０および７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）ならびに７０および２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫ−ｗｔＣＮＰ２７（「ＨＳＡ−ＣＮＰ２７」）（配列番号１４４）を、皮下に１日１回３６日間投与した。３６日目に最後の注射を行なったその１５分後、血漿を採取し、マウスを２４時間後に犠牲にした。犠牲にするときに、最終採血血清を回収し、前述のようにバイオマーカーの分析に使用した。
図７１は、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＣＮＰ３８および７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＨＳＡ−ＣＮＰ２７が、血漿ｃＧＭＰレベルを有意に増加させたことを示し（ｐ＜０．０１）、上昇した血漿ｃＧＭＰレベルは、それぞれおよそ３００ｐｍｏｌおよび４００ｐｍｏｌであった。７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＣＮＰ３８の投与は、ｃＧＭＰをおよそ５００ｐｍｏｌ（ｐ＜０．０１）に増加させたが、一方、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８の投与は、ｃＧＭＰをおよそ５７５ｐｍｏｌに増加させた（ｐ＜０．００１）。２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＨＳＡ−ＣＮＰ２７の投与は、ｃＧＭＰをおよそ６７５ｐｍｏｌ（ｐ＜０．００１）に増加させた。
ＣＮＰ変異体もまた、切断されたＩＩ型コラーゲンの血清レベルを有意に増加させた（図７２）。２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＣＮＰ３８は、コラーゲンをおよそ９ｐｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０５）に増加させ、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＣＮＰ３８は、コラーゲンをおよそ８ｐｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０５）に増加させ、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８は、コラーゲンをおよそ１２ｐｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０５）に増加させ、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８は、コラーゲンをおよそ１６ｐｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０５）に増加させ、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＨＳＡ−ＣＮＰ２７は、コラーゲンをおよそ１０ｐｇ／ｍｌに増加させ、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＨＳＡ−ＣＮＰ２７は、コラーゲンをおよそ１０ｐｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０５）に増加させた。
血清アルカリホスファターゼ（ＡＰ）レベルもまたＣＮＰ変異体の投与後増加した（図７３）。２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＣＮＰ３８はＡＰをおよそ１３０ＩＵ／Ｌに増加させ、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＣＮＰ３８はＡＰをおよそ１６０ＩＵ／Ｌ（ｐ＜０．００１）に増加させ、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８はＡＰをおよそ１５５ＩＵ／Ｌ（ｐ＜０．００１）に増加させ、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８はＡＰをおよそ１８０ＩＵ／Ｌ（ｐ＜０．００１）に増加させ、７０ｎｍｏｌ／ｋｇのＨＳＡ−ＣＮＰ２７はＡＰをおよそ１２０ＩＵ／Ｌに増加させ、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＨＳＡ−ＣＮＰ２７はＡＰをおよそ１４０ＩＵ／Ｌ（ｐ＜０．０１）に増加させた。表１５は骨特異的である全ＡＰのパーセントを例示する。
Figure 0005718909
 抗ＣＮＰ抗体の分析は、ＨＳＡ−ＣＮＰ２７だけがマウスにおいてＩｇＧ抗体反応を誘発することを示した。
上記の結果は、ＣＮＰ変異体の投与が、血清中のＩＩ型コラーゲンおよびアルカリホスファターゼの濃度を増加させることを例示し、このことはＣＮＰが、骨成長の増加に関連する因子を増加させることを示し、そして２０ｎｍｏｌ／ｋｇほどの低用量でのＣＮＰ変異体の投与が、ｉｎ ｖｉｖｏの骨成長の増加に有効であることを示唆している。
様々な投薬計画後のｃＧＭＰの反応
生体分析を、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）の野生型ＣＤ−１マウス８〜１０週齢、（ｎ＝３／処置群）への投与後様々な時間においてさらに評価した。Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を、２００ｎｍｏｌ／ｋｇ単回皮下用量で与え、注射後１５分、３時間、１日、２日および３日において、血漿、骨端、皮質骨（髄は除去）、肺および脳中のｃＧＭＰレベルを測定した。血液をＫ２ＥＤＴＡに回収した。脛骨および大腿骨の骨端ならびに皮質骨、耳介、脳、腎臓および肺を収穫し、沸騰水中に５分置き、その後−７０℃に凍結した。血漿および組織の両方を、ｃＧＭＰに関してアッセイした（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ サイクリックＧＭＰ ＥＬＩＳＡキット）。
結果は、ｃＧＭＰレベルが、血漿（およそ１３００ｐｍｏｌ／ｍｌ）および骨端（およそ２．５ｐｍｏｌ／ｍｌ／ｍｇ）において、注射後１５分において増加したことを示した。３時間までに、血漿レベルはほぼ対照レベルまで減少し、一方、骨端におけるレベルは、注射後１５分におけるｃＧＭＰレベルよりもおよそ（ａｐｐｒｉｍａｔｅｌｙ）３倍低いが、対照レベルよりも高かった。皮質骨のレベルは、１５分においておよそ０．５ｐｍｏｌ／ｍｌ／ｍｇに増加し、３時間においてこのレベルを維持していた。すべての時点のｃＧＭＰのレベルは注射後１日までに対照レベルに戻った。いかなる時点においても、肺および脳中にｃＧＭＰは殆ど検出されなかったかまたは全く検出されなかった。
ｃＧＭＰのレベルを、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の複数回注射を投与されたマウスにおいて、さらに測定した。マウスの群（ｎ＝３）に、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を以下のように与えた：２０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回投薬、皮下；２００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回投薬、皮下；２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、皮下、０および１日目；２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、皮下、０および１日目；２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、皮下、０および３日目；２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、皮下、０および３日目。マウスを、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８の最終投薬１５分後に犠牲にし、ｃＧＭＰの血漿レベルを分析した。様々な投薬計画による、血漿ｃＧＭＰシグナルの変調は現れていない。軟骨におけるｃＧＭＰ反応をさらに調査する。
ＮＰＲ−Ｂ受容体の潜在的脱感作の評価
組織学的分析は、毎日２００ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した場合、ＣＮＰ免疫反応性の増加に基づき、ＣＮＰが動物の成長板に蓄積されることを示す。成長板におけるこの蓄積またはＣＮＰ受容体の毎日の刺激が、ＣＮＰ受容体を脱感作できる可能性がある。
複数回投薬がＮＰＲ−Ｂ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで脱感作するかどうかを決定するために、正常なヒト関節軟骨細胞を、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）と一緒に様々な時間培養し、ｃＧＭＰの分泌を測定した。
関節軟骨から単離した一次正常ヒト軟骨細胞を、供給業者（Ｌｏｎｚａ）の推奨のように培養した。６０〜８０％の集密において、軟骨細胞を、１ｕＭのＰｒｏ−ＣＮＰ３８を用いて２回処理し、処理の間の時間量を増やした（０時間に最初の処理、その後、最初の処理後１５分、３０分、６０分、２時間、３時間、４時間、６時間）。以下の実験において、処理は、処理の間の時間量を増やしながら（０時間に最初の処理、その後、最初の処理後６、１６、２４、４８時間）２回、または２回目の処理と並行して（６、１６、２４および４８時間におけるナイーブな反応だけ）１回だけ、のいずれかで適用した。処理は、１５分だけ（急性処理）または実験期間中（ＣＮＰを培地中に放理した場合、慢性処理）のいずれかを適用した。細胞溶解物およびならし培地を回収し、全ｃＧＭＰ分泌物を分析した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＥＬＩＳＡ）。
短期実験において、細胞を、Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）１ｕＭを用いて１５分間で２回（急性処理）、または培養を通してＣＮＰ３８を用いて２回（慢性処理）刺激した。処理の間の期間は、１５分、３０分、６０分、２時間、３時間、４時間および６時間であった。実験の最後の時点で、細胞を１度だけ処理することによって、ピークのｃＧＭＰ刺激を得た（６時間；急性実験において＞０．１ｐｍｏｌ／ウェルおよび慢性実験において０．２ｐｍｏｌ／ウェル）。急性実験において、細胞を２回処理するとき、細胞を、０時間およびその後１５分に再度処理した場合、反応は０．１ｐｍｏｌ／ウェルに減少する。急性実験において、細胞を２回処理するとき、細胞を、０時間およびその後３０分、６０分、２、３および４時間に再度処理した場合、反応はおよそ０．５ｐｍｏｌ／ウェルに減少する。慢性実験において、細胞を２回処理するとき、細胞を、０時間および１５分に処理した場合、反応はおよそ０．１６ｐｍｏｌ／ウェルに減少する。慢性実験において、細胞を２回処理するとき、細胞を、０時間および３０分、６０分または２時間に処理した場合、反応はおよそ０．６ｐｍｏｌ／ウェルに減少する。慢性実験において、細胞を２回処理するとき、細胞を、０時間および２、４または６時間に再度処理した場合、反応は＜０．５ｐｍｏｌ／ウェルに減少する。
長期研究もまた実施した。急性処理のために、１ｕＭのＣＮＰ３８を、上記のように細胞培養物に加えた。慢性処理のために、１ｕＭのＣＮＰ３８を上記のように実験期間を通して細胞培養物に加えた。結果は、毎日のｉｎ ｖｉｔｒｏのＣＮＰ投与の反復後、ＮＰＲ−Ｂ受容体が脱感作でき、最初の投薬後にＣＮＰを除去した場合、投薬の間の４８時間は、ＣＮＰ３８に対するＮＰＲ−Ｂの最大の反応の６０％に回復するために十分であり、ＣＮＰを実験を通してインキュベートする場合、＜４０％に回復することを示す（図７４）。
ＣＮＰ変異体を用いた処置が、ＮＰＲ−Ｂ受容体をｉｎ ｖｉｖｏで脱感作するかどうかを評価するために、野生型マウスを用いて実験を実施した。ＣＤ−１雄マウス、８〜１０週齢に、媒体対照またはＰｒｏ−Ｇｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８」）を２００ｎｍｏｌ／ｋｇで適切な日に皮下注射した。マウスに、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を最大８日間毎日注射するか、または研究の１日目、１日目および２日目、もしくは１日目および３日目にＰｒｏ−ＣＮＰ３８を注射するかのいずれかを行った。最後の注射の１５分後、マウス（ｎ＝３／処置群）に深麻酔をかけ、開胸および大動脈カニューレ挿入を介して放血させた。循環血液を、大動脈カニューレを介してＰＢＳにより体から洗い流した。腎臓および右脛骨、右大腿骨および左大腿骨を回収し、水中で５分間沸騰させ、および／または液体窒素中で急速凍結させ、ドライアイスまたは−７０℃の冷凍庫においてｃＧＭＰアッセイまで保存した。軟骨におけるｃＧＭＰの産生の推定のために、大腿骨遠位および／または近位の脛骨を解剖し、秤量し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｃｒｙｏｐｒｅｐ ＣＰ０２を使用して粉砕した。粉末化した試料を、５％過塩素酸中でＣｏｖａｒｉｓ Ｅ２１０ソニケーターを使用して均質化し、６０％ＫＯＨ中で中和した。試料を、その後１０，０００ｒｐｍにおいて４℃で５分間遠心分離し、上清をｃＧＭＰアッセイ（Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｃａｙｍａｎ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）に使用した。さらに、左脛骨を回収し、１０％の通常緩衝ホルマリン中で固定し、さらなる免疫組織化学分析のために保管した。
図７５Ａは、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８を用いた１、４、６、７および８日間の野生型マウスの毎日の反復処置が、ｃＧＭＰ反応の脱感作をもたらさなかったことを示す。対照的に、ｃＧＭＰ反応の増強作用が、毎日の処置の４日後に観察された。さらなる毎日の処置は、最大８日間ｃＧＭＰ反応のプラトーをもたらした。結果は、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰｒｏ−ＣＮＰ３８を用いた最大８日間の野生型マウスの毎日の処置が、ｃＧＭＰ反応を脱感作しないことを示す。
Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８を用いた野生型マウスの処置後の遠位大腿骨軟骨におけるｃＧＭＰ反応の動態も調査した。１日１回、２日間のマウスの処置は、単回処置に対するｃＧＭＰ反応と比較して、Ｐｒｏ−ＣＮＰ３８に対するｃＧＭＰ反応を増強した（図７５Ｂ）。マウスを１日目および３日目に処置した場合、２回目の処置（３日目）後のｃＧＭＰ反応が、１日目の単回処置後に観察されたｃＧＭＰ反応と実質的に同様であったが、１日目および２日目に処置した場合は同様ではなかった（図７５Ｂ）。この結果は、連続する日の投薬が、本マウス研究においてＰｒｏ−ＣＮＰ３８に対するｃＧＭＰ反応の増強に有利であることを示唆する。
様々な組織におけるＮＰＲ−Ｂの活性化
ＣＮＰ変異体による様々な組織におけるＮＰＲ−Ｂの潜在的活性化を評価するために、野生型雄ＣＤ−１マウスに、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧｌｙ−ＣＮＰ３７を注射し、様々な時点において、特定の組織中のｃＧＭＰ反応を測定した。２匹のマウスを各処置群に使用した。個々のマウスは、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７または媒体対照の単回皮下注射を受けた。注射の１５、３０もしくは６０分または３時間後、マウスに深麻酔をかけ、開胸および大動脈カニューレ挿入を介して放血させた。循環血液を、大動脈カニューレを用いてＰＢＳを流すことにより除去した。心臓、肝臓、肺、腎臓、耳介、大動脈および脳を回収した。すべての組織を水中で５分間沸騰させ、細かく解剖し（ＰＢＳを用いた大腿皮質からの髄の洗い流しを含む）、秤量し、液体窒素中で冷却し、ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒにおいて粉々にした。得られた粉末化した試料を、６％のあらかじめ冷やした過塩素酸中でＰｏｌｙｔｒｏｎを用いて均質化し、６０％ＫＯＨを用いて中和した。その後、試料を、１０，０００ｒｐｍにおいて４℃で５分間遠心分離し、上清をｃＧＭＰのアッセイに使用した（Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、 Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）。結果を、組織の重量に対して正規化した。
Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（図７６中「ＣＮＰ」）を用いた処置に反応したｃＧＭＰの分泌は、大腿骨遠位（軟骨および骨）、大腿皮質（骨）、耳介（軟骨）および腎臓において検出可能であった（図７６Ａ〜Ｄ）。それらの組織における最大のｃＧＭＰ反応が、処置後１５分で観察された。肝臓、心臓、肺および脳組織は、研究の各時点で媒体対照と比較して、Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７に反応した感知可能なｃＧＭＰの分泌を示さなかった（図７６Ｅ〜Ｈ）。この結果は、２００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧｌｙ−ＣＮＰ３７を用いた処置が、軟骨、骨および腎臓組織におけるｃＧＭＰの分泌を刺激した。
（実施例１６）
サルにおけるＣＮＰ変異体の用量反応
ＣＮＰ変異体のＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の骨成長に対する効果および骨成長関連バイオマーカーのレベルを、カニクイザルにおいて評価する。８匹の正常な若年カニクイザル（継続中の研究の開始時に約２．５歳）に、１０または３６μｇ／ｋｇ／日のＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７を毎日皮下注射する（ｎ＝４／投薬群）。このような４匹のサルに対照として媒体を投与する。処置の合計の長さは６ヵ月である。成長板拡大および骨成長の様々な測定を、デジタルＸ線写真および磁気共鳴画像によって実施し、外面的には肢および体長の測定によって実施する。血液および尿試料を臨床病理学ならびにＰｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７およびバイオマーカーのレベルの測定のために定期的に回収する。研究の終了後、肉眼的病理学を実施し、組織試料を有効性および安全性の評価のために組織学的に評価する。
継続中の研究において今までに得られたデータは、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７の両方の用量が、デジタルＸ線写真により成長板の幅を増加させ（図７７）、デジタルＸ線写真により左右の脛骨の長さを増加させ（図７８ＡおよびＢ）、外部測定により脚長を増加させ（図７９）、外部測定により腕長を増加させ（図８０）、外部測定により体長を増加させ（図８１）、骨形成に関するバイオマーカーであるアルカリホスファターゼの血清レベルを増加させた（図８２）ことを示す。このデータは、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７が正常な若年カニクイザルにおいて、血行力学的に許容される用量で骨成長を刺激できることを実証する。
（実施例１７）
マウスの心臓血管系に対するＣＮＰ変異体の効果
ＣＮＰなどのナトリウム利尿ペプチドが、心臓血管系に影響を与えることが報告されている。Ｗａｎｇら（Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．９巻：５４８〜５７頁、２００７年）は、ＣＮＰが、ラットにおいて、心筋虚血／再かん流傷害の予防および心筋梗塞後の心臓のリモデリングの改善において心臓保護効果を有することが示されていることを記載している。Ｗａｎｇは、ＣＮＰを過剰発現するマウスが、心筋梗塞が原因の心臓肥大の発生を減少させたことを実証した。さらに、ＣＮＰが内皮非依存性血管拡張を引き起こし（Ｍ． Ｈｏｎｉｎｇら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、３７巻：１１７９〜１１８３頁（２００１年））、したがってｉｎ ｖｉｖｏで一時的に血圧を低下させ得ることが示された。
ＣＮＰ変異体の心臓血管系への効果を評価するために麻酔をかけた野生型ＦＶＢマウスにおける血圧および心拍数を、変異体の皮下注射後に研究する。
心筋血管活性の広い用量範囲を規定するための予備試験後、用量反応研究を実施し、個々のＣＮＰ変異体の３種の異なる用量レベルの効果を調べる。各処置群は８週齢の３匹の雄ＦＶＢマウスを含む。用量を、麻酔をかけたマウスに皮下投与し、収縮期血圧、拡張期血圧および平均動脈圧（ＭＡＰ）ならびに心拍数を、埋め込まれた動脈内圧トランスデューサーを介してモニターする。
（実施例１８）
ＣＮＰ変異体の製剤化
ＣＮＰの予備製剤化研究を実施し、様々なｐＨ（ｐＨ３、４、５、６、７および８）および温度（５℃、２５℃および４０℃）において、経時的に、ＣＮＰ変異体であるＧｌｙ−ｗｔＣＮＰ３７（「ＣＮＰ３８」）の安定性を評価した。ＣＮＰ３８は、ｐＨ４〜６において、この研究の他のｐＨにおけるよりもはるかに高い安定性を示した。ＣＮＰ３８は、５℃でｐＨ４〜６において安定であり、１５週後にＣＮＰ３８の≧約９５％が残存した。温度を２５℃まで上げた場合、ｐＨ４においてＣＮＰ３８の約８５％が１５週後に残存し、ｐＨ５において約８５％が１５週後に残存し、ｐＨ６において約８０％が１５週後に残存した。温度を４０℃まで上げた場合、ｐＨ４においてＣＮＰ３８の約５５〜６０％が１５週後に残存し、ｐＨ５において約６５％が１５週後に残存し、ｐＨ６において約４０％が１５週後に残存した。図８３は、ｐＨ３から８のｐＨに対する疑似一次分解速度定数（Ｋｏｂｓ）の、５℃、２５℃および４０℃における観察されたプロットを例示する。予備製剤化研究におけるＣＮＰ３８に関する安定性のデータは、ＣＮＰ製剤が約４から約６の範囲のｐＨを有することを示唆する。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ≦約６）は、例えば、アスパラギンおよび／またはグルタミン残基（複数可）の脱アミド、アスパラギン酸残基（複数可）の異性化または他の経路によるＣＮＰ変異体の分解を最小化または回避することによって、ＣＮＰ変異体の安定性を促進できる。
ＣＮＰ変異体は、例えば、骨成長の病態によって影響を受ける被験体への投与のための薬学的キャリア中で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、ＣＮＰ変異体の液体製剤は、表１６中の成分およびそれらの量または濃度の任意の組合せに従って製剤化される。
Figure 0005718909
 １ グリセリンは、ＣＮＰ変異体の水起因の加水分解、脱アミド、異性化または切断を最小化または予防するために使用する。凍結乾燥製剤のために、４〜６％または６〜２０％マンニトールまたはスクロースをＮａＣｌと置換できる。
特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体の凍結乾燥製剤は、表１７中の成分およびそれらの量または濃度の任意の組合せに従って製剤化された製剤から調製される。
Figure 0005718909
 １ グリセリンは、ＣＮＰ変異体の水起因の加水分解、脱アミド、異性化または切断を最小化または予防するために使用する。
特定の実施形態において、ＣＮＰ変異体を含む製剤は、約３〜７または約３〜６または約３．５〜６．５または約４〜６または約４〜５または約４．５〜５．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｐＨ４〜５．５のために、適切な緩衝剤は酢酸／酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）であり、ｐＨ５．５〜６のために、適切な緩衝剤はクエン酸／クエン酸塩である。クエン酸／クエン酸塩（例えばクエン酸ナトリウム）は、ｐＨ３〜６またはｐＨ４〜６の範囲においてもまた、適切な緩衝剤である。特定の実施形態において、緩衝剤は、製剤中で約２〜５０ｍＭまたは約２〜４０ｍＭまたは約２〜３０ｍＭまたは約５〜３０ｍＭまたは約２〜２０ｍＭまたは約５〜２０ｍＭまたは約５〜１５ｍＭの濃度を有する。
ＣＮＰ変異体の脱アミドを最小化または回避するために、変異体は、薬学的に許容される有機共溶媒、例えばグリセリン、エタノールおよびプロピレングリコール中で製剤化され得る。脱アミドは加水分解によっておこるので、有機共溶媒の水に代えての置換が、ＣＮＰ変異体と水との接触を最小にする。有機水性溶媒系中の１種以上の有機溶媒の濃度は、例えば、約１０％から約９９％または水を使用しない場合約１００％であり得る。
さらにＣＮＰ変異体の脱アミドを最小化または回避するために、凍結乾燥によって製剤から水を除去できる。いくつかの実施形態において、凍結乾燥製剤は以下の要素の任意の組合せを含有する：
緩衝剤：酢酸ナトリウムおよび酢酸、またはクエン酸ナトリウムおよびクエン酸；
等張性／増量剤：マンニトール（例えば、３〜１０％、２〜８％または４〜６％）；
スクロース（例えば、６〜２０％、５〜１５％または８〜１２％）；
酸化防止剤：メチオニンおよび／またはアスコルビン酸、各酸化防止剤とＣＮＰ変異体のモル比は約０．１：１から約１：１、または約０．５：１から約５：１、または約１：１から約１５：１、または約１：１から約１０：１、または約３：１から約１０：１。
脱アミドは、ＣＮＰ組成物（例えば、液体製剤または凍結乾燥製剤）を低温、例えば約５℃、０℃、−１０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃または−１００℃において保存することによっても、最小化または回避され得る。
ＣＮＰ変異体中の酸化可能な残基（例えばメチオニン）の酸化を最小化または回避するために、変異体を、１種以上の酸化防止剤と一緒に製剤化できる。例示的酸化防止剤は、限定するものではないが、メチオニン、アスコルビン酸およびチオグリセロールを含む。例えば、メチオニン残基の酸化は、窒素またはアルゴンを用いて（液体製剤の場合）液体媒質から酸素を取り除くことによって、および／または窒素またはアルゴンを用いて容器またはパッケージから酸素を取り除くことによってもまた最小化または予防できる。
いくつかの実施形態において、吸着（例えば、ＣＮＰ変異体のプラスチックまたはガラスへの吸着）を最小化または予防するために、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０もしくはベンジルアルコールまたはそれらの組合せをＣＮＰ製剤に加える。特定の実施形態において、個々の抗吸着剤（複数可）は、約０．００１％から約０．５％、または約０．０１％から約０．５％、または約０．１％から約１％、または約０．５％から約１％、または約０．５％から約１．５％、または約０．５％から約２％、または約１％から約２％の濃度である。製剤中の抗吸着剤（複数可）の例示的範囲（複数可）は、限定するものではないが、約０．００１％から約０．５％のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、約０．００１％から約０．５％のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０および／または約０．５％から約１．５％のベンジルアルコールを含む。
特定の実施形態において、液体ＣＮＰ製剤は、（１）約３０ｍＭ±５、または１０ｍＭ緩衝剤の濃度および約４±０．５または約４±１のｐＨを有する酢酸／酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）緩衝液および（２）約１％±０．５％濃度のベンジルアルコール（例えば、保存剤および／または抗吸着剤）ならびに必要に応じ（３）約１０％±５％濃度のスクロース、を含み、あるいは凍結乾燥ＣＮＰ製剤は、（１）約３０ｍＭ±５、または１０ｍＭ緩衝剤の濃度および約４±０．５または約４±１のｐＨを有する酢酸／酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）緩衝液および（２）約１％±０．５％濃度のベンジルアルコール（例えば、保存剤および／または抗吸着剤）ならびに必要に応じ（３）約１０％±５％濃度のスクロース、を含む製剤から調製される。
（実施例１９）
ＣＮＰ変異体の臨床的評価
以下の実施例は、本開示の治療法において、ＣＮＰ２２またはそれらの変異体を含む組成物の臨床的評価のために使用されるパラメーターに関するガイダンスを提供する。本明細書において議論するように、ＣＮＰ２２またはそれらの変異体は、骨および血管平滑筋の障害を含む、ＣＮＰに反応性の障害の治療に使用される。臨床試験を実施し、これらはＣＮＰ２２またはそれらの変異体の用量の、安全性、薬物動態学およびサロゲート臨床エンドポイントおよび既定の臨床エンドポイントの両方の初期反応に関する評価を提供する。この試験は、必ずしも限定されないが、約１００例の評価可能な患者に関する十分な安全性情報を収集するために最低限２４週間実施されるものである。この試験の初期用量は、約０．００１から約１．０ｍｇ／ｋｇ／週、または本明細書に記載の任意の用量に変動する。この範囲の初期用量が有意な直接的臨床的利益を生み出さない事象において、用量は、必要に応じてこの範囲内またはこの範囲以上に増加されるべきであり、安全性を確立し、さらに有効性を評価するために、必ずしも限定されないが、さらなる最小期間の２４週間維持されるべきである。
安全性の測定は、有害事象、アレルギー反応、完全臨床化学パネル（腎機能および肝機能を含む）、尿検査および鑑別を伴うＣＢＣを含むものである。さらに、臨床的利益に関連する他のパラメーターをモニターする。本実施例は、吸着、分布、代謝、排泄ならびに血液中の半減期および生物学的利用能を含む、ＣＮＰ２２またはそれらの変異体の薬物動態学的パラメーターの決定をさらに含む。このような分析が、用量と臨床反応を関連付ける助けになることが予期される。
方法
患者は、ベースラインの病歴および健康診断ならびに標準的な一連の臨床検査室検査（ＣＢＣ、Ｐａｎｅｌ２０、ＣＨ５０およびＵＡを含む）を受けることになる。患者は、毎週の通院で密接に追跡調査される。患者は、完全な評価のために、治療期間の完了後の１週に再度来院する。用量の増加が必要ならば、患者は上に概説した同じスケジュールに従う。安全性を、試験を通してモニターする。
診断および試験被験体患者基準
患者は、ＣＮＰ反応性障害の可能性の診断が記録された、男性であっても女性であってもよい。潜在的にＣＮＰ反応性骨関連障害の具体的な例は軟骨無形成症であり、これは、遺伝子検査およびＦＧＦＲ−３の変異または機能障害の他の証拠により確認され得る。軟骨無形成症患者の理想的な年齢範囲は、幼児（＜１歳）から青年期前（＜１３歳）までである。患者が妊娠している、もしくは授乳中である、患者が本研究の登録前３０日以内に治験薬の投与を受けている、または患者が病態、重度の併発する病気または研究のコンプライアンスを著しく減少し得る他の酌量すべき事情を有する場合、患者をこの研究から除外する。
安全性
ＣＮＰ２２またはそれらの変異体を用いる療法は、研究の過程の間に有意な急性または慢性の薬物反応が起こらない場合、安全であると決定される。薬剤の長期投与は、臨床検査、臨床検査室または他の適切な研究において著しい異常が観察されない場合、安全であると決定される。
野生型ＣＮＰ２２と比較して、本開示の特定のＣＮＰ変異体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＥＰ分解に対してはるかに耐性が強く、ラットにおいてはるかに長い血漿半減期および生物学的利用能を有し、ラットにおいてはるかに高いｃＧＭＰ産生レベルを刺激し、および／または軟骨無形成症マウスにおいて長骨の長さおよび体長において有意により大きな増加を誘導することが示されている。さらに、ＣＮＰ２２を用いた短期間の投薬計画治療は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの軟骨細胞成長のＦＧＦ２誘導性停止の逆転において、連続ＣＮＰ２２治療とほぼ同等に有効であることが示されている。本明細書に記載の中でもとりわけ、これらの結果は、ＣＮＰ反応性の病態または障害、例えば骨関連障害および血管平滑筋障害の治療における本開示のＣＮＰ変異体の有用性を実証している。
本明細書に記載の、本開示の個々の実施形態が、必要に応じて本明細書に記載のいずれか１つ以上の他の実施形態と組合せ可能であることが理解される。本明細書に引用された個々の特許文献および個々の非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の実施形態および例示的実施例において記載されるように、本開示に対する多数の改変および変形を、当業者が想到することが予測される。したがって、添付の特許請求の範囲に現れるような限定だけが本開示に関して認められるべきである。

Claims (22)

  1. ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）（配列番号１４５）；
    ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＮＳＧＬＧＣ［ＣＮＰ３７（Ｍ３２Ｎ）］（配列番号１８２）；
    ＰＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７）（配列番号１８６）；
    ＭＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｍｅｔ−ＣＮＰ３７）（配列番号１９２）；
    ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＮＳＧＬＧＣ［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（Ｍ３２Ｎ）］（配列番号１８１）；および
    ＭＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）（配列番号１９１）
    からなる群から選択されるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）の変異体。
  2. 請求項１に記載のＣＮＰ変異体および薬学的に許容される賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物。
  3. ４から６までのｐＨを有するクエン酸／クエン酸緩衝液または酢酸／酢酸緩衝液を含む製剤から調製された凍結乾燥製剤である、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記凍結乾燥製剤を、
    （ａ）等張性調節剤、および／または増量剤、あるいは
    （ｂ）抗酸化剤
    をさらに含む製剤から調製する、請求項３に記載の組成物。
  5. 軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、低身長症、およびホモ接合性軟骨無形成症からなる群から選択される骨関連障害または骨格異形成症の治療のための請求項１に記載のＣＮＰ変異体または請求項２から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記骨関連障害または骨格異形成症が軟骨無形成症である、請求項５に記載のＣＮＰ変異体または医薬組成物。
  7. 高血圧、再狭窄、アテローム動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性腎不全および慢性腎不全からなる群から選択される血管平滑筋障害の治療のための請求項１に記載のＣＮＰ変異体または請求項２から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. ＣＮＰ変異体の組換え産生のための方法であって、該方法は、
    切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに連結された、ＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該第１および該第２のポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現をもたらす条件下で培地中で培養するステップ
    を含み、該融合ポリペプチドは、該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に直接的に連結されたか、またはリンカーを介して該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に間接的に連結された該ＣＮＰ変異体ポリペプチドを含み、該ＣＮＰ変異体は、
    ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）（配列番号１４５）；
    ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＮＳＧＬＧＣ［ＣＮＰ３７（Ｍ３２Ｎ）］（配列番号１８２）；
    ＰＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７）（配列番号１８６）；
    ＭＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｍｅｔ−ＣＮＰ３７）（配列番号１９２）；
    ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＮＳＧＬＧＣ［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（Ｍ３２Ｎ）］（配列番号１８１）；および
    ＭＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）（配列番号１９１）
    からなる群から選択される、方法。
  9. 前記宿主細胞が、前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドに連結された、前記ＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換されている、請求項８に記載の方法。
  10. 前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質がヒスチジンタグ、ヒト転写因子ＴＡＦ１２、ＴＡＦ１２断片、ＴＡＦ１２ヒストン折りたたみドメイン、ＴＡＦ１２の突然変異体およびその断片、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ）、ＴＡＦ１２（Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（１０Ｄ／１０Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆Ｄ／Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆４Ｄ／４Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆６Ｄ／６Ｅ）、ＴＡＦ１２（Ｃ／Ａ＆１０Ｄ／１０Ｅ）、ケトステロイドイソメラーゼ、マルトース結合タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、キチン結合ドメイン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２突然変異体、ＢＭＰ−２（Ｃ／Ａ）ならびにそれらの突然変異体および断片からなる群から選択される、請求項８および９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記宿主細胞が細菌宿主細胞である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記融合ポリペプチドを可溶性タンパク質または封入体として発現させる、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記発現した融合ポリペプチドを前記宿主細胞または培地から単離するステップをさらに含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記単離した融合ポリペプチドを、ギ酸、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、自己切断タンパク質、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ＰｒｏＴＥＶおよびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される切断剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）（配列番号１４５）；
    ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＮＳＧＬＧＣ［ＣＮＰ３７（Ｍ３２Ｎ）］（配列番号１８２）；
    ＰＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７）（配列番号１８６）；
    ＭＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｍｅｔ−ＣＮＰ３７）（配列番号１９２）；
    ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＮＳＧＬＧＣ［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（Ｍ３２Ｎ）］（配列番号１８１）；および
    ＭＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７）（配列番号１９１）
    からなる群から選択される、請求項８から１４のいずれか一項に記載の方法により産生されるＣＮＰ変異体。
  16. 発現ベクターを含む宿主細胞であって、該ベクターは、切断可能なペプチドもしくはタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドに連結された、ＣＮＰ変異体ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含み、該ＣＮＰ変異体は、
    ＰＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７））（配列番号１４５）；
    ＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＮＳＧＬＧＣ［ＣＮＰ３７（Ｍ３２Ｎ）］（配列番号１８２）；
    ＰＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｐｒｏ−ＣＮＰ３７）（配列番号１８６）；
    ＭＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｍｅｔ−ＣＮＰ３７）（配列番号１９２）；
    ＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＮＳＧＬＧＣ［Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７（Ｍ３２Ｎ）］）（配列番号１８１）；および
    ＭＧＱＥＨＰＮＡＲＫＹＫＧＡＮＫＫＧＬＳＫＧＣＦＧＬＫＬＤＲＩＧＳＭＳＧＬＧＣ（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−ＣＮＰ３７））（配列番号１９１）
    からなる群から選択される、宿主細胞。
  17. 前記宿主細胞は、前記第１および前記第２のポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドの発現に適する条件下で培地中で培養され、ここで、該融合ポリペプチドは、前記切断可能なペプチドもしくはタンパク質に直接的に連結されたか、またはリンカーを介して該切断可能なペプチドもしくはタンパク質に間接的に連結された前記ＣＮＰ変異体ポリペプチドを含む、請求項１６に記載の宿主細胞。
  18. ＣＮＰ反応性の状態もしくは障害を治療するための組成物であって、
    該組成物は、ＣＮＰ変異体を含み、
    該組成物は被験体に投与されて、該被験体における少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルがモニターされることを特徴とし、
    該少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーのレベルの増加が該被験体または該状態もしくは障害に対する該ＣＮＰ変異体の治療効果を示すことを特徴とし、
    該ＣＮＰ変異体は請求項１に記載の変異体である、組成物。
  19. 前記少なくとも１つの骨関連バイオマーカーまたは軟骨関連バイオマーカーがＣＮＰ、ｃＧＭＰ、ＩＩ型コラーゲンのプロペプチドおよびその断片、ＩＩ型コラーゲンおよびその断片、オステオカルシン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｉ型プロコラーゲンのプロペプチド（ＰＩＮＰ）およびその断片、Ｉ型コラーゲンおよびその断片、アグリカンコンドロイチン硫酸ならびにアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
  20. 長骨の成長を必要とする被験体において、長骨の成長を増加させるための組成物であって、該組成物は、請求項１に記載のＣＮＰ変異体を含み、ここで、長骨の成長が増加される、組成物。
  21. 長骨の成長の増加、または軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、低身長症、もしくはホモ接合性軟骨無形成症の治療を必要とする被験体において、長骨の成長を増加させるか、または、軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、低身長症、もしくはホモ接合性軟骨無形成症を治療するための組成物であって、該組成物は、請求項１に記載のＣＮＰ変異体を含む、組成物。
  22. 請求項１に記載のＣＮＰ変異体を含む組成物であって、該ＣＮＰ変異体は、疎水性酸および骨ターゲティングに有用な１個〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列から選択される部分に結合され得、該部分は、ポリＡｓｐ、ポリＧｌｕ、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質、心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）および脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）からなる群より選択される、組成物。
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