ES2608457T3 - Variantes de péptido natriurético de tipo C - Google Patents

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Mika Aoyagi-Scharber
Shinong Long
Michel Claude Vellard
Sianna Castillo
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Christopher P. Price
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Abstract

Una variante de péptido natriurético de tipo C (CNP) seleccionada entre el grupo que consiste en: PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145); PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP37) (SEQ ID NO: 186); MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP37) (SEQ ID NO: 192); MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 191).

Description

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DESCRIPCION
Variantes de peptido natriuretico de tipo C Referenda cruzada a las solicitudes relacionadas Campo de la divulgacion
El campo de la divulgacion se refiere, en general, a variantes de peptido natriuretico de tipo C (CNP), composiciones que comprenden variantes de CNP, metodos para preparar variantes de CNP, y metodos para usar variantes de CNP para tratar trastornos que responden a CNP, que incluyen, pero no se limitan a trastornos relacionados con los huesos tales como displasias esqueleticas (por ejemplo, acondroplasia) y trastornos del musculo liso vascular.
Antecedentes de la divulgacion
La familia de peptidos natriureticos consiste en tres peptidos relacionados estructuralmente: peptido natriuretico atrial (ANP) (n.° de Registro en GenBank NP_006163, para la protelna precursora de ANP, NPPA), peptido natriuretico cerebral (BNP) (n.° de Registro en GenBank NP_002512, para la protelna precursora de BNP, NPPB), y peptido natriuretico de tipo C (CNP) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863-870 (1990) (n.° de Registro en GenBank NP_077720, para la protelna precursora de CNP, NPPC) (J. Hypertens., 10: 907-912 (1992)). Estos peptidos de una sola cadena, pequenos (ANP, BNP, CNP) tienen una estructura de bucle de 17 aminoacidos (Levin et al., N. Engl. J. Med., 339: 863-870 (1998)) y desempenan papeles importantes en multiples procesos biologicos. ANP y BNP se unen y activan el peptido natriuretico receptor A (NPR-A), tambien denominado guanalil ciclasa A (GC-A), dando como resultado niveles mas elevados de monofosfato de guanosina clclico intracelular (cGMP). De forma analoga, CNP interactua con NPR-B (GC-B) para estimular la generation de cGMP (J. Hypertens., 10: 11111114 (1992)). Un tercer tipo de receptor, NPR-C, se une a cada uno de los peptidos natriureticos con afinidad elevada y funciona principalmente para capturar los peptidos del compartimento extracelular y depositar los peptidos en lisosomas, en los que se degradan (Science, 238: 675-678 (1987)). ANP y BNP se producen principalmente dentro de las celulas del musculo cardiaco, a y se cree que desempenan papeles importantes en la homeostasis cardiovascular (Science, 252: 120-123 (1991)). CNP se expresa mas ampliamente, incluyendo en el sistema nervioso central, tracto reproductor, huesos y endotelio de los vasos sangulneos (Hypertension, 49: 419-426 (2007)).
En seres humanos, el CNP se produce inicialmente a partir del gen del precursor de peptido natriuretico C (NPPC) como un polipeptido pre-pro de 126 aminoacidos de una sola cadena (Biochem. Biophys. Res. Commun., 168: 863870 (1990)). La retirada del peptido senal produce pro-CNP, y la escision adicional por la endoproteasa furina genera un peptido activo de 53 aminoacidos (CNP-53), que se secreta y escinde de nuevo por una enzima desconocida para producir el peptido maduro de 22 aminoacidos (CNP-22) (Wu, J. Biol. Chem. 278: 25847-852 (2003)). CNP-53 y CNP-22 se diferencian en su distribution, con CNP-53 predominando en tejidos, mientras que CNP-22 se encuentra principalmente en plasma y llquido cefalorraquldeo (J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res. 26: 269-297 (2006)). Se desconoce la forma de CnP predominante en el cartllago. Tanto CNP-53 como CNP- 22 se unen de forma similar a NPR-B. Ademas, ambos inducen la production de cGMP de una manera dependiente de la dosis y similar (VT Yeung, Peptides, 17: 101-106 (1996)).
Anteriormente se han descrito genes y polipeptidos de CNP naturales. El documento de patente de Estados Unidos n.° 4.352.770 desvela CNP-22 aislado y purificado de cerebro porcino con una secuencia identica a la del CNP humano y su uso en el tratamiento de indicaciones cardiovasculares. El documento de patente de Estados Unidos n.° 6.034.231 desvela el gen humano y polipeptido de proCNP (126 aminoacidos) y el gen y polipeptido CNP-53 humano.
La elimination de CNP del espacio extracelular se produce a traves de la action de la endopeptidasa neutra unida a la membrana (NEP), que rapidamente degrada a CNP (Biochem. J., 291 (Pt 1): 83-88 (1993)), y a traves de NPR-C, que se une y deposita CNP en lisosomas, en los que CNP se degrada. Se ha demostrado que CNP tiene una semivida in vivo de 2,6 min en el ser humano normal (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). La baja concentration en plasma de CNP (J. Bone Moner. Res., 19 (Supl. 1) S20 (2004)) y su coexpresion con NPR-B en una serie de tejidos sugiere que CNP funciona principalmente a traves de un autocrino/paracrino.
Como se ha indicado anteriormente, el CNP se une y activa el receptor de peptido natriuretico B (NPR-B), tambien denominado guanilil ciclasa B (GC-B), dando como resultado niveles mas elevados de monofosfato de guanosina clclico (cGMP) intracelular. La serialization cadena abajo mediada por la generacion de cGMP influye en una matriz diversa de procesos biologicos que incluyen la osificacion endocondral. Por consiguiente, los niveles elevados o disminuidos de cualquiera de los componentes de esta ruta pueden conducir a un crecimiento oseo anomalo. Por ejemplo, la supresion genetica de cualquiera de CNP o NPR-B en modelos de raton da como resultado animales que tienen un fenotipo de enanismo con huesos largos y vertebras mas cortos. Se han identificado mutaciones en NPR- B humano que bloquean la senalizacion apropiada de CNP y dan como resultado enanismo (Olney, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 91(4): 1229-1232 (2006); Bartels, et al., Am. J. Hum. Genet. 75: 27-34 (2004)). Por el contrario, los ratones disenados por ingenierla para producir niveles elevados de CNP presentan huesos largos y vertebras
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alargados.
La acondroplasia es el resultado de una mutacion autosomica dominante en el gen del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR-3), que causa una anomalia en la formacion de cartilagos. Normalmente el FGFR-3 tiene un efecto regulador negativo en el crecimiento de los condrocitos, y por lo tanto en el crecimiento oseo. En la acondroplasia, la forma mutada de FGFR-3 es constitutivamente activa, lo que conduce a un acortamiento severo de los huesos. Parece que tanto la proliferacion como la diferenciacion de condrocitos estan alteradas, lo que da lugar a un cartilago de placas de crecimiento notablemente corto (P. Krejci et al., J. Cell Sci. 118: 5089-5100 (2005)). La osificacion endocondral es el proceso que rige el crecimiento longitudinal de los huesos largos. Existen cuatro zonas de la placa de crecimiento: en reposo, proliferativa, hipertrofica y zona de calcificacion. En la placa de crecimiento, NPR-B se expresa por celulas proliferativas mientras que NPR-C se expresa por celulas hipertroficas (Yamashite et al., J. Biochem. 127: 177-179 (2000)). En el crecimiento del hueso endocondral normal, los condrocitos se organizan en columnas y proliferan en la zona proliferativa de la placa de crecimiento. Estas columnas estan desorganizadas en pacientes con acondroplasia. Ademas, la zona hipertrofica es en la que las celulas se hacen grandes y opcionalmente producen apoptosis (lisis), lo que conduce a la invasion y mineralizacion de osteocitos. Los condrocitos hipertroficos y el tamano total de la zona son mucho mas pequenos en los pacientes con acondroplasia que en los pacientes normales. CNP es un agonista de NPR-B, un regulador positivo de los condrocitos y el crecimiento oseo. La senalizacion cadena abajo de CNP/NPR-B inhibe la ruta de FGFR-3 al nivel de la proteina quinasa activada por mitogeno (MAP K). La inhibicion en MAP K estimula la proliferacion y diferenciacion de los condrocitos en las zonas proliferativa e hipertrofica de la placa de crecimiento, dando como resultado crecimiento oseo.
En seres humanos, las mutaciones activadoras de FGFR-3 son la causa principal del enanismo genetico. Los ratones que tienen FGFR-3 activado sirven como un modelo de acondroplasia, la forma mas comun de las displasias esqueleticas, y la sobreexpresion de CNP rescata a estos animales del enanismo. Por consiguiente, CNP y variantes funcionales de CNP son agentes terapeuticos potenciales para el tratamiento de las diversas displasias esqueleticas.
En la actualidad, el uso terapeutico de CNP esta limitado por su corta semivida en plasma, que en seres humanos se ha demostrado que es de 2,6 minutos in vivo (J Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). Para aumentar la concentracion de CNP por encima de los niveles intrinsecos (aproximadamente 5 pM) encontrados, por lo general, en plasma humano, en todos los estudios en seres humanos y animales fue necesaria una infusion continua usando CNP administrado por via sistemica. Una variante de CNP que tiene una semivida en suero in vivo mas larga y que presenta una actividad similar o mejorada con respecto a la del CNP de tipo silvestre (wt) es importante para una estrategia terapeutica sostenible. Dos mecanismos por los cuales la semivida de CNP se reduce en plasma humano son la degradacion por la endopeptidasa neutra (NEP) y la eliminacion por el receptor de peptido natriuretico C (NPR-C) (Growth Horm. & IGF Res., 16: S6-S14 (2006)). Segun se informa, las modificaciones de peptidos pueden aumentar la resistencia a endopeptidasas y la escision de exopeptidasas (Amino Acids, 30: 351-367 (2006); Curr. Opin. Biotech., 17: 638-642 (2006)).
El documento EP0497368 desvela (pagina 14, lineas 7-10, reivindicaciones 1-2, tabla 2: compuestos 3 y 5 y CNP- 22) variantes de CNP que comprenden la SEQ ID n.°: 178 y su uso para el tratamiento de reestenosis y arteriosclerosis.
Se han evaluado las actividades biologicas de diversos analogos y derivados de CNP. Al sustituir S-metil Cys en lugar tanto de Cys6 como de Cys22, se demostro que supuestamente el ciclado del peptido a traves de un enlace disulfuro Cys6-Cys22 es importante para la actividad de CNP en la estimulacion de la formacion de cGMP (Biochem. Biophys. Res. Comm., 183: 964-969 (1992), usando tambien barrido de alanina para identificar aminoacidos importantes para la funcionalidad de CNP). Un aumento adicional significativo de la actividad resulta supuestamente de la presencia combinada de los aminoacidos Leug, Lys1o, y Leu11. El documento de patente de Estados Unidos n.° 4.434.133 describe analogos de CNP que comprenden CNP-22 con sustituciones en la posicion 6, 7, 9, 11 o 22 del aminoacido, en los que el aminoacido se selecciona entre Cys o Pmp (acido pentaciclomercaptopropionico) en la posicion 6, Phe, 4-cloro-Phe, 4-fluoro-Phe, 4-nitro-Phe, o Cha (3-ciclohexil-Ala) en la posicion 7, Gly, Val, Aib, o tLeu en la posicion 9, Leu o Ile en la posicion 11, y Cys o Pmp en la posicion 22.
La Publicacion de Patente de Estados Unidos n.° 2004/0138134 (ahora documento de patente de Estados Unidos n.° 7.276.481) describe variantes de CNP que comprenden los aminoacidos Cys6 a Cys22 de CNP-22 ("CNP-17") que incluyen al menos una sustitucion para otro aminoacido natural en las posiciones 9, 10, 11, 16, 17, 19, o 20, variantes de CNP con inserciones y deleciones, tales como adicion de un resto de His en el sitio principal informado de escision con NEP, entre Cys6 y Phe7, y metodos de uso de tales variantes para aumentar el tamano de un placa de crecimiento oseo en hueso anomalo y alargamiento de un hueso anomalo. Sin embargo, no se obtuvieron aumentos significativos en la actividad tal como se mire mediante la produccion de cGMP para estas variantes, y la actividad disminuyo para casi todas las variantes, como se observo en un metodo basado en celulas in vitro (Ejemplo 7). Ademas no se proporcionaron datos de soporte, tales como por ejemplo estabilidad in vitro o determinacion del aumento de la farmacocinetica (PK) para confirmar la resistencia a NEP y la resistencia a NPR-C afirmadas de los analogos de CNP. El documento de patente de Estados Unidos n.° 6.743.425 desvela sustancias
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para el tratamiento de la acondroplasia que activan NPR-B/GC-B y son peptidos o compuestos de bajo peso molecular, que incluyen los peptidos natriureticos de tipo C, CNP-22 y CNP-53, La publicacion de PCT n.° WO 94/20534 desvela una quimera de CNP-22 y el extremo C-terminal de 5 aminoacidos de ANP designado como el peptido vasonatrina (VNP), un numero limitado de sustituciones de aminoacidos y peptidos quimericos clclicos que resultan de la formacion de un enlace disulfuro o doble enlace.
Los enfoques para aumentar la semivida de otros miembros de la familia de peptidos natriureticos incluyen la disminucion de la afinidad de ANP con respecto a NPR-C (documento de patente de Estados Unidos n.° 4.846.932), usando antagonistas pentapeptldicos de NPR-C (documento WO 00/61631) y coadministracion de Inhibidores de NEP tales como tiorfano y Candoxatril (Clin. Exp. Pharma. Physiol., 25: 986-991 (1997), Hyperten., 30: 184-190 (1997)). El documento Wo 2004/047871 describe conjugados de BNP y variantes de BNP para restos de polialquilenglicol, restos de azucar, restos de polisorbato, restos policationicos y otros restos de pollmero hidrofilo que supuestamente presentan una semivida mejorada en circulacion y supuestamente son utiles para el tratamiento de insuficiencia cardiaca aguda congestiva.
Sin embargo no se han publicado informes con respecto a una estrategia satisfactoria para hacer a CNP resistente a NEP a la vez que mantiene su funcionalidad.
Sumario de la divulgacion
La presente invention se refiere a una variante de peptido natriuretico de tipo C (CNP) reivindicada en la reivindicacion 1,
En el presente documento se ensenan variantes de peptido natriuretico de tipo C (CNP) que son utiles en el tratamiento de trastornos relacionados con los huesos (por ejemplo, acondroplasia) y trastornos del musculo liso vascular. La divulgation incluye variantes de CNP que tiene un aumento de la semivida en suero, por ejemplo como resultado de la capacidad reducida para unirse a endopeptidasa neutra (NEP), mayor resistencia a la proteolisis o NEP y/o afinidad reducida a la elimination del peptido natriuretico receptor C (NPR-C), a la que se retiene la funcionalidad de CNP.
La secuencia de tipo silvestre del CNP-22 humano (denominado "hCNP22", "wtCNP22" o "CNP22" en el presente documento) se expone a continuation:
(extremo N-terminal)
Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly4-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu9-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20- Gly21-Cys22 (SEQ ID NO: 1).
Las posiciones de 6 a 22 de CNP22 forman un dominio clclico por medio de un enlace disulfuro entre Cys6 y Cys22. Se ha mostrado que la estructura clclica de 17 aminoacidos es importante para la union de CNP a NPR-B (Schiller, Biochem. Biophys. Res. Commun., 138: 880-886 (1986)). La secuencia de aminoacidos de las posiciones 6 a 22 de CNP22 se denomina "CNP17" en el presente documento (SEQ ID NO: 2).
El CNP es susceptible a la escision con NEP en un numero de sitios: Cys6-Phe7, Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13- Ile14, Ser16-Met17 y Gly19-Leu20. En una realization, la divulgacion incluye una variante de CNP que (1) se modifica para aumentar su tamano o peso molecular total, por ejemplo, hasta un intervalo de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 4 kDa, 4,2 kDa, 4,4 kDa, 4,6 kDa, 4,8 kDa, 5 kDa, 4,2 kDa, 4,4 kDa, 4,6 kDa,
4,8 kDa, 6 kDa, 6,2 kDa, 6,4 kDa, o a aproximadamente 7 kDa, 7,2 kDa o aproximadamente 8,2 kDa, y/o (2) se modifica en ciertas posiciones del aminoacido para reducir su susceptibilidad a la escision con NEP en 1, 2, 3, 4, 5 o 6 o todos los sitios enumerados anteriormente. El tamano o peso molecular de la variante de CNP puede aumentar por diversos medios, por ejemplo, por conjugation de aminoacidos adicionales y/o otros tipos de grupos qulmicos (por ejemplo, polimericos naturales o sinteticos) a la secuencia peptica en, por ejemplo, el extremo N-terminal, el extremo C-terminal y/o cadena o cadenas laterales, y/o usando aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, y/o peptidomimeticos con cadenas laterales mas voluminosas. La variante de CNP se conjuga opcionalmente otros restos funcionales o estructurales. Opcionalmente, en combination con cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento, se pueden introducir mutation o mutaciones (por ejemplo, sustitucion o sustituciones, adicion o adiciones, y/o deletion o deleciones) en cierta o ciertas posiciones de CNP22 para reducir la afinidad de las variantes de CNP a NPR-C. Se pueden realizar modificaciones adicionales e influir en la resistencia a NEP o la actividad de CNP, por ejemplo, sustituciones conservativas, otras modificaciones conocidas en la tecnica.
La variante de CNP se puede representar con la formula general: (x)-Gly1-Leu2-Ser3-LyS4-Gly5-Cys6-Phe7-Glys-Leu9- Lys1o-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu2o-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 5), en la que:
la variante de CNP comprende uno o mas aminoacidos modificados, que pueden dar como resultado enlaces peptldicos modificados (por ejemplo, a traves del uso de isoesteres de enlace peptldico), en la position que corresponde a uno o mas de los siguientes restos de CNP: Glyl, Lys4, Gly5, Cys6, Phe7, Gly8, Leu9, Lys10, Leu11, Ile14, Gly15, Ser16, Met17, Gly19, Leu20 y Gly21; y
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(x) y (z) independientemente pueden estar ausentes o pueden ser una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de un polipeptido natriuretico (por ejemplo, NPPC, ANP, BNP) o un polipeptido no natriuretico (por ejemplo, albumina de suero humano (HSA), IgG, etc.).
La variante de CNP incluye: (1) una modificacion en una posicion del aminoacido que corresponde a una de las posiciones 6, 7 o 8 (Cys6, Phe7 o Gly8) de CNP22, (2) opcionalmente delecion, adicion y/o sustitucion de cualquiera o todos los aminoacidos en las posiciones 1-5 (Gly1, Leu2, Ser3, Lys4, y Gly5) y (3) opcionalmente hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6 ,7, 8, 9 o 10 modificaciones adicionales (deleciones, adiciones y/o sustituciones) en posiciones que corresponden a las posiciones 6-22, de las cuales 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pueden ser sustituciones conservativas u otra sustituciones descritas en el presente documento o conocidas en la tecnica.
Se entiende que una referencia a una posicion del aminoacido en particular mediante un numero (por ejemplo, posicion 7 de CNP22) se refiere a la posicion del aminoacido correspondiente en cualquier variante de CNP, incluso si el numero de la posicion en esa variante de CNP ha cambiado debido a inserciones o deleciones precedentes. Por ejemplo, una referencia a la "posicion 7" o "Phe7" podrla hacer referencia a la posicion 2 correspondiente para una variante de CNP en la que se ha hecho una delecion de los primeros cinco aminoacidos. De forma analoga, una referencia a la "posicion 7" podrla hacer referencia a la posicion 8 correspondiente para una variante de CNP en la que se ha anadido un aminoacido al extremo N-terminal.
Una variante de CNP se puede ciclar a traves de un enlace covalente entre posiciones que corresponden a 6 y 22 de CNP22. Se contempla que el enlace covalente se forma usando cualquier metodo conocido en la tecnica. En otra realizacion, la variante de CNP se puede ciclar a traves de un enlace covalente formado entre un aminoacido en o hacia el extremo N-terminal y un aminoacido en o hacia el extremo C-terminal (denominados aminoacidos "terminales" para este fin) del peptido. En una realizacion, el enlace covalente se forma entre las cadenas laterales de los dos aminoacidos terminales o los aminoacidos en posiciones que corresponden a 6 y 22 de CNP22. En otra realizacion, el enlace covalente se forma entre la cadena lateral de un aminoacido terminal y el grupo terminal del otro aminoacido terminal, o entre los grupos terminales de cada aminoacido terminal. Por ejemplo, para el enlace covalente formado entre los aminoacidos terminales o entre los aminoacidos en posiciones que corresponden a 6 y 22 de CNP22, son posibles enlaces de cabeza a cola, cadena lateral a cadena lateral, cadena lateral a cabeza, o cadena lateral a cola.
Una variante de CNP puede tener una afinidad reducida con respecto a NEP, y/o una resistencia mas elevada a la escision o NEP y/o un aumento de la semivida en suero in vivo, a la vez que se retiene la funcionalidad de CNP (por ejemplo, estimulacion de la produccion de cGMP). Preferentemente, NEP reconoce sustratos con tamano inferior a aproximadamente 3 kDa, debido al tamano limitado de su cavidad del sitio activo (Oefner, J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000)). Las variantes de CNP se pueden modificar para aumentar su peso molecular total hasta un intervalo de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 4, 4,6, 5, 4,2, 4,8, 6, 6,4 o 7 kDa, por ejemplo, por adicion de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 5 kDa de aminoacidos, pollmeros hidrofilos o solubles en agua, acidos hidrofobos (incluyendo acidos grasos), y/o carbohidratos. Las variantes de CNP pueden tener un peso molecular entre aproximadamente 2,6 kDa y aproximadamente 7 kDa, o entre aproximadamente 2,8 kDa y 6 kDa, o entre aproximadamente 2,8 kDa y aproximadamente 4,8 kDa. En ciertas realizaciones, se anaden al menos aproximadamente 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6 o 1,8 kDa, o hasta 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6,
4.8 o 5 kDa, para aumentar el peso molecular total de la variante de CNP, por ejemplo, hasta un intervalo de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa hasta aproximadamente 4 kDa, 4,2 kDa, 4,4 kDa, 4,6 kDa, 4,8 kDa, 5 kDa, 4,2 kDa, 4,4 kDa, 4,6 kDa, 4,8 kDa, 6 kDa, 6,2 kDa, 7,2 kDa, 8,2 kDa o mas elevado. Tales variantes de CNP comprenden una secuencia de aminoacidos identica homologa en al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o un 95 % a los aminoacidos 6-22 de CNP22. En otras realizaciones, tales variantes de CNP comprenden una sustitucion, insertion o delecion de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoacidos con otro aminoacido o peptidomimetico natural o no natural. Aunque ambas sustituciones o inserciones conservativas y no conservativas se conciben en cualquier posicion, la introduction de modificaciones puede comenzar, por ejemplo, mediante sustituciones conservativas en regiones que en la tecnica se han identificado como implicadas en la actividad de CNP o en la union a NPR-B, aunque se pueden preparar sustituciones no conservativas en esas regiones que previamente se ha mostrado que son tolerantes a la modificacion.
Las variantes de CNP pueden comprender un CNP que tenga una parte ciclada intacta a entre Cys6 y Cys22, y colas N-terminales y/o C-terminales que contienen aproximadamente 1-40, 1-20, 5-40, 5-35, 10-35, 15-35, 5-31, 1031, o 15-31 aminoacidos y son fragmentos obtenidos a partir de un polipeptido CNP y/o un polipeptido que no es CNP. En una realizacion, tales variantes de CNP tienen un peso molecular en un intervalo de aproximadamente
2.8 kDa a aproximadamente 4, 4,6, 5, 4,2, 4,8, 6, 6,4 o 7 kDa. Los ejemplos no limitantes de tales variantes de CNP incluyen CNP22 de tipo silvestre o CNP22 con una o mas sustituciones de aminoacidos (por ejemplo, una sustitucion de K4R), que tienen una prolongation N-terminal y/o C-terminal obtenida a partir de secuencias precursoras de peptido natriuretico (por ejemplo, ANP, BNP o CNP) de ser humano u otra especie, una variante de precursor de peptido natriuretico C (NPPC) con sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoacidos (por ejemplo, las variantes de CNP pueden ser truncamientos de CNP-53 que dan como resultado peptidos con un peso molecular entre aproximadamente 2,8 kDa y 4,8 kDa), u otros polipeptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, albumina de suero o protelna de IgG (por ejemplo, las variantes de CNP pueden ser quimeras de CNP que contengan
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fragmentos de albumina de suero o IgG de ser humano u otra especie).
Las variantes de CNP pueden tener una masa total caracterizada por los intervalos que por lo general se describen en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, disenadas para aumentar la resistencia a la degradacion de NEP, se representan con la formula general:
(x)-GlyrLeu2-Ser3-(b)4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leug-(h)i0-Leuii-Aspi2-Argi3-Ilei4-Glyi5-Seri6-Meti7-Seri8-Glyig- Leu20-Gly2i-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 6), en la que:
(x) es un grupo polimerico sintetico o natural, o una combinacion de los mismos, en el que un ejemplo no limitante de un grupo polimerico sintetico es el polietilenglicol (PEG, tambien denominado oxido de polietileno (PEO)), y un ejemplo no limitante de un grupo polimerico natural es una secuencia de aminoacidos que contiene de i a 35 aminoacidos y que se obtiene a partir de NPPC o variantes del mismo con sustituciones y/o deleciones, ANP, BNP, u otros (poli)peptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, albumina de suero, IgG, glicoprotelnas ricas en histidina, fibronectina, fibrinogeno, polipeptidos que contienen dedos de cinc, osteocrina o factor 2 de crecimiento de fibroblastos (FGF2);
(z) puede estar ausente o puede ser un grupo polimerico sintetico o natural, o una combinacion de los mismos, en el que un ejemplo no limitante de un grupo polimerico sintetico es PEG, y un ejemplo no limitante de un grupo polimerico natural es una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de un polipeptido natriuretico (por ejemplo, NPPC, CNP, ANP o BNP) o polipeptido no natriuretico (por ejemplo, albumina de suero o IgG); y
(b) y (h) independientemente pueden ser cada uno la Lys de tipo silvestre en esa posicion o se pueden sustituir con una sustitucion de aminoacido conservativa o cualquier aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, (Cit), Gin, Glu o Ser. En una realizacion, (b) es Arg. En otra realizacion, para un aumento de la resistencia a NEP, (b) no es Gly. En otra realizacion mas, (h) no es Arg.
Las secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de NPPC o variantes del mismo ensenadas en el presente documento incluyen:
Arg,
Glu-Arg,
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 7),
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 8),
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg (SEQ ID NO: 9),
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln (SEQ ID NO: i0),
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser (SEQ ID NO: ii),
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln (SEQ ID NO: i2),
Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID NO: i3),
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO: i4),
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO: i5),
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala (SEQ ID NO: i6), Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg (SEQ ID NO: i7), Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: i8), Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: i9), Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg, (SEQ ID NO: 20)
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys- Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 2i), y
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gin-Giu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys- Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 22).
Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de polipeptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, ANP, BNP, albumina de suero e IgG incluyen:
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser (SEQ ID NO: 23);
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 24);
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 25);
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 26);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 27);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 28);
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg (SEQ ID NO: 29);
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr (SEQ ID NO: 30);
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln (SEQ ID NO: 3i); y Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 32).
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El extremo N-terminal y/o C-terminal de CNP22 o variante del mismo se puede conjugar independientemente a una prolongation de aminoacido que contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 aminoacidos. En una realization, la prolongacion del aminoacido se obtiene a partir de NPPC, CNP53, ANP o BNP. En una realizacion especlfica, la prolongacion del aminoacido es Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 33). En una realizacion relacionada, esta prolongacion de 15 aminoacidos se anade al extremo N-terminal para proporcionar una variante de CNP de formula Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys-Gly1-Leu2-Ser3-(b)4-Gly5-Cys6-Phe7- Gly8-Leu9-(h)10-Leun-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 34).
En el presente documento se ensenan variantes de CNP que comprenden wtCNP22 o una variante del mismo (por ejemplo, una que tenga adicion(s), deletion (s), y/o sustitucion (s) tal como, por ejemplo, una sustitucion de k4r) (SEQ ID NO: 35) conjugada en el extremo N-terminal y/o C-terminal con un pollmero hidrofilo (por ejemplo, PEG) para aumentar su tamano molecular total hasta un intervalo de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 4, 5, 6 o 7 kDa. Tales variantes de CNP opcionalmente se conjugan adicionalmente en el extremo N-terminal y/o C-terminal con un grupo polimerico que comprende, por ejemplo, aminoacidos, carbohidratos, acidos hidrofobos y/o fosfollpidos, siendo un ejemplo no limitante de las mismas una prolongacion de aminoacido N- terminal que contiene de 1 a 35, o de 5 a 31, aminoacidos. En una realizacion, se anade un resto de pollmero hidrofilo (por ejemplo, PEG) de al menos aproximadamente 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6 o 1,8 kDa, o hasta aproximadamente 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 o 5 kDa, al extremo N-terminal y/o C- terminal de wtCNP22 o una variante del mismo.
Como se muestra en el presente documento, la conjugation de un pollmero de PEG (o PEO) hidrofilo o soluble en agua de aproximadamente 0,6 kDa o mas a CNP22 o variantes del mismo por lo general aumenta la resistencia a la decision de NEP de forma notable. Sin embargo, la adicion de PEG, incluso tan pequeno como de 0,6 kDa, a wtCNP22 puede reducir la funcionalidad de CNP (por ejemplo, la estimulacion de la serialization de cGMP), y la adicion de mas de aproximadamente of 2 o 3 kDa de PEG a CNP22 o variantes del mismo puede reducir la actividad funcional de CNP de una manera dependiente del tamano. Pero la funcionalidad de CNP (al menos comparable con la de wtCNP22) se retiene cuando un pollmero de PEG (o PEO) de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 1,2 kDa, o potencialmente de aproximadamente 2 kDa, se conjuga con una variante de CNP que tiene una prolongacion de aminoacido N-terminal en la que al menos un aminoacido relativamente grande que puede estar potencialmente cargado con carga positiva en condiciones fisiologicas (por ejemplo, arginina) precede inmediatamente en la position que corresponde a la Gly1 de CNP22, tal como, por ejemplo, GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38), ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), R-CNP22 (SEQ ID NO: 40) y R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41).
Por consiguiente, en el presente documento se ensenan variantes de CNP PEGilado que comprenden, en el extremo N-terminal de CNP22 o una variante del mismo (por ejemplo, una que tenga una sustitucion de K4R), una prolongacion de aminoacido que contiene al menos 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacidos, en la que el pollmero de PEG esta conjugado con el extremo N-terminal de la variante de CNP ampliada con aminoacido para dar como resultado una masa total caracterizada por los intervalos que por lo general se describen en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa para un aumento de la resistencia a la escision con NEP. Para un aumento de la funcionalidad de CNP, tales variantes de CNP prolongadas con aminoacido, pegiladas pueden contener al menos un aminoacido natural o natural relativamente grande que potencialmente puede estar cargado con carga positiva en condiciones fisiologicas, que precede inmediatamente a la posicion que corresponde a Gly1 de CNP22. En una realizacion especlfica, las variantes de CNP prolongadas con aminoacido, pegiladas contienen al menos un resto de arginina que precede inmediatamente a la posicion que corresponde a la Gly1 de CNP22.
Ademas de las variantes de CNP conjugadas en el extremo N-terminal y/o C-terminal con un pollmero hidrofilo o soluble en agua tal como, por ejemplo, PEG (o PEO), en el presente documento se ensenan variantes de CNP conjugadas a un pollmero de este tipo en un sitio interno. Para fines de brevedad, en el presente documento se usara PEG (o PEO) como un ejemplo representativo de un pollmero hidrofilo o soluble en agua. Son posibles diversos sitios de PEGilacion de una variante de CNP, que incluyen, pero no se limitan a: (1) PEGilacion solamente en el extremo N-terminal; (2) PEGilacion solamente en el extremo C-terminal; (3) PEGilacion solamente en un sitio interno (por ejemplo, Lys4); (4) PEGilacion tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal; (5) PEGilacion en el extremo N-terminal y un sitio interno; y (6) PEGilacion en el extremo C-terminal y un sitio interno. Para un aumento de la resistencia a la degradation de NEP y retention de la funcionalidad de CNP, en ciertas realizaciones la masa total de variantes de CNP PEGilado se caracteriza por los intervalos que por lo general se describen en el presente documento, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 4, 5, 6 o 7 kDa. En una realizacion en particular, CNP17, CNP22, CNP37 (definidos a continuation) o variantes de los mismos (incluyendo las que tienen adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoacido) estan PEGiladas solamente en el extremo N-terminal. En otra realizacion, las variantes de CNP estan PEGiladas solamente en un sitio interno (por ejemplo, Lys4). En otra realizacion mas, las variantes de CNP estan PEGiladas en el extremo N-terminal y un sitio interno (por ejemplo, Lys4). Ademas, en otra realizacion, para mejor funcionalidad, las variantes de CNP no estan PEGiladas en un sitio (por ejemplo, Lys10) dentro del dominio clclico (que corresponde de Cys6 a Cys22 de CNP22). Para evitar la PEGilacion en un sitio interno, Lys4 y/o Lys10 pueden
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estar sustituidos con un aminoacido o peptidomimetico natural o natural que no contenga un grupo amino primario reactivo en una cadena lateral, tal como, por ejemplo, Gly, Ser, Arg, Asn, Gln, Asp, Glu o citrulina (Cit). En una realizacion en particular, Lys4 y/o Lys10 estan sustituidos con Arg. En otra realizacion, Lys10 no esta sustituido con Arg.
La divulgacion contempla el uso de pollmeros hidrofilos o solubles en agua (por ejemplo, moleculas de PEG) que pueden variar en el tipo (por ejemplo, homopollmero o copollmero; copollmero aleatorio, alternante o de bloque; llnea no ramificado; monodisperso o polidisperso), union (por ejemplo, union hidrolizable o establezcan como, por ejemplo, enlace de amida, imina, aminal, alquileno, o ester), sitio de conjugacion (por ejemplo, en el extremo N- terminal y/o C-terminal, preferentemente en cualquiera de los restos de la region ciclada de CNP (que corresponde a los restos 6-22 de CNP22)), y longitud (por ejemplo, de aproximadamente 0,2, 0,4 o 0,6 kDa a aproximadamente 2, 3, 4 o 5 kDa). El pollmero hidrofilo o soluble en agua se puede conjugar con el peptido CNP por medio de qulmica basada en N-hidroxisuccinimida (NHS) o basada en aldehldo u otra qulmica, tal como se conoce en la tecnica. Tales variantes de CNP se pueden generar usando, por ejemplo, wtCNP-22 (2,2 kDa), CNP-17 que retiene solamente la region ciclada (restos 6-22) de wtCNP22, variantes de CNP que tengan una prolongacion de aminoacido en el extremo N-terminal y/o C-terminal de CNP22, o variantes con sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoacido , por ejemplo, GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38) y ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39). En una realizacion, las variantes de PEG-CNP que tienen una masa total caracterizada por los intervalos que por lo general se describen en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, contienen un grupo PEG (o PEO) lineal, monodisperso conjugado en el extremo N- terminal y/o C-terminal a traves de qulmica basada en NHS o aldehldo, o un grupo PEG ramificado con dos ramas o tres ramas conjugado en el extremo N-terminal y/o C-terminal a traves de qulmica basada en NHS. La divulgacion contempla adicionalmente variantes de PEG-CNP cargadas con carga negativa disenadas para una reduccion de la eliminacion renal, que incluyen, pero no se limitan a, compuestos carboxilados, sulfatados y fosforilados.
La divulgacion contempla conjugados de PEG-CNP que comprenden PEG basado en NHS o aldehldo de formula (CH2CH2O)n, en la que n es un numero entero de 12 a 50, y el pollmero de PEG tiene un peso molecular de hasta aproximadamente 2,5 kDa. En una realizacion especlfica, n es 12 o 24. En una realizacion, el grupo hidroxilo terminal del pollmero de PEG esta protegido con un grupo no reactivo. En una realizacion particular, el grupo protector es un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo inferior tal como metilo.
Los pollmeros de PEG o derivados de los mismos pueden tener un peso molecular medio en numero en el intervalo de aproximadamente 0,4 kDa a aproximadamente 2,5 kDa o de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 1,5 kDa.
El peptido wtCNP o variante de CNP se puede conjugar con un resto que incluye, por ejemplo, bisfosfonatos, carbohidratos, acidos hidrofobos (incluyendo acidos grasos) o secuencias de aminoacidos. Tales secuencias de aminoacidos incluyen por ejemplo poliAsp o poliGlu utiles en la direccion a hueso/cartllago, o se pueden obtener a partir de protelnas oseas con dominios de direccion a hueso elucidados o derivados de los mismos, tales como por ejemplo las protelnas de fusion o secuencias de peptidos de osteopontina, osteocalcina, sialoproteina, etc. En las realizaciones que se describen en el presente documento en las que CNP22 o una variante del mismo se une a un resto de direccion a hueso o cartllago, tal resto se disena para estimular la obtencion del peptido CNP modificado a condrocitos de placas de crecimiento oseo, en las que el peptido se puede unir y activar nPR-B en los condrocitos.
La divulgacion proporciona variantes de CNP con un enlace peptldico que es menos susceptible a la escision por peptidasas incluyendo NEP. La divulgacion incluye una variante de CNP que comprende al menos un resto modificado en un sitio de escision con endopeptidasa. En una realizacion, el enlace peptldico de Cys6-Phe7 (- C(=O)-NH-) en un sitio de escision con NEP en CNP se puede sustituir con uno cualquiera de los siguientes isoesteres de enlace peptldico:
-CH2-NH-,
-C(=O)-N(R)-, en el que el grupo amida esta alquilado con cualquiera de los siguientes grupos R: metilo, etilo, n- propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo,
-C(=O)-NH-CH2-,
-CH2-S-,
-CH2-S(O)n-, en el que n es 1 o 2,
-CH2-CH2-,
-CH=CH-,
-C(=O)-CH2-,
-CH(CN)-NH-,
-CH(OH)-CH2-,
-O-C(=O)-NH-, y -NHC(=O)NH-.
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En otra realizacion, Phe7 esta sustituido con su enantiomero D-Phe. En otra realizacion mas, se introducen enantiomeros D a uno o mas, hasta todas, 22 posiciones dentro de wtCNP-22. En una realizacion mas, un beta aminoacido tal como acido 3-amino-2-fenilpropionico esta sustituido por Phe7, que aumenta la longitud la estructura principal a la vez que reduce la longitud de la cadena lateral. En otra realizacion mas, la divulgacion contempla analogos de Cys en la posicion Cys6 que incluyen, pero no se limitan a, homocistelna, penicilamina, acido 2- mercaptopropionico, y acido 3-mercaptopropionico.
Incluso en presencia de un enlace resistente a NEP entre Cys6 y Phe7, otros enlaces especlficos se pueden hidrolizar por NEP, incluyendo Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Met17 y Gly19-Leu20. Por consiguiente, la divulgacion incluye analogos de CNP que contienen isoesteres de enlace peptldico en multiples posiciones en la estructura principal de los analogos de CNP. En una realizacion, los analogos o variantes de CNP comprenden modificaciones en mas de un sitio de escision con peptidasa. En una realizacion mas, la variante comprende un CNP con sustituciones en restos de aminoacidos importantes en la union al sitio activo de NEP, aumentando de ese modo la resistencia a la degradacion con NEP. Uno o mas restos de union a NEP, que incluyen, pero no se limitan a, Gly8, Gly15, Ser18, Gly19 y/o Gly21, estan sustituidos con restos de aminoacidos naturales o naturales de tamano mas grande para reducir la afinidad con respecto al sitio de union a NEP. En otra realizacion mas, uno o mas restos hidrofobos esenciales en el reconocimiento de NEP, que incluyen, pero no se limitan a, Phe7, Leu9, Leu11, Ile14, Met17 y Leu20, estan sustituidos con aminoacidos y/o peptidomimeticos naturales o no naturales que disminuyen la union a NEP. En otra realizacion mas, se puede hacer delecion o sustitucion de uno a cinco de los primeros cinco aminoacidos de CNP con cualquier otro aminoacido natural o aminoacidos o peptidomimeticos no naturales, o se pueden anadir uno o mas aminoacidos o peptidomimeticos naturales o no naturales a una cualquiera o a todas las cinco primeras posiciones de CNP.
Las variantes de CNP pueden tener una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa para aumentar la resistencia a NEP, y se representan con la formula:
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-(j)20-Gly21- Cys22-(z) (SEQ ID NO: 46), en la que:
(x) puede estar ausente o se puede seleccionar entre el grupo que consiste en compuestos de direction a hueso sinteticos tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso o cartllago tales como, por ejemplo, poliAsp y poliGlu; secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de protelnas oseas con dominios de direccion a hueso elucidados, tales como, por ejemplo, protelnas de fusion o secuencias peptldicas de osteopontina, osteocalcina, sialoproteina, etc.; moleculas polimericas o no polimericas que reducen la elimination renal tales como, por ejemplo, moleculas de PEG cargadas; y prolongaciones que comprenden, por ejemplo, pollmeros (por ejemplo, los PEG), carbohidratos, acidos hidrofobos (incluyendo acidos grasos), y/o aminoacidos, y en las que tales prolongaciones de aminoacido pueden contener, por ejemplo, de 1 a 31, o 1 a 35, o de 5 a 35, o de 10 a 35, o de 15 a 35 restos de aminoacidos, y se pueden obtener a partir de NPPC, ANP, BNP, otros (poli)peptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, albumina de suero o IgG, o variantes de los polipeptidos mencionados anteriormente que tienen sustituciones, adiciones y/o deleciones, o combinaciones de los mismos;
(z) puede estar ausente o se puede seleccionar entre el grupo que consiste en secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso o cartllago tales como por ejemplo poliAsp y poliGlu, secuencias de aminoacidos de dominios de direccion a hueso de protelnas oseas tales como, por ejemplo, osteopontina, osteocalcina y sialoproteina, y que secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de (poli)peptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, osteopontina, osteocalcina y sialoproteina, y secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de (poli)peptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, ANP o BNP;
(a) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (a) es Arg;
(b) se selecciona entre el grupo que consiste en Cys e isoesteres de enlace peptldico entre Cys6 y Phe7 tales como, por ejemplo, Cys-Chh-NH;
(c) se selecciona entre el grupo que consiste en L-Phe; D-Phe; acido 3-amino-2-fenilpropionico; derivados N- alquilados de Phe, en los que el grupo N-alquilo es metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo; y analogos de Phe, en los que una o mas posiciones en orto, meta, y/o para del anillo de benceno del analogo de Phe estan sustituidas con uno o mas sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en halogeno, hidroxilo, ciano, alquilo C1-6 lineal o ramificado, alcoxi C1-6 lineal o ramificado, halo-alquilo C1-6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-10, heterociclilo, arilo C6-14 y heteroarilo (los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tirosina, 3-clorofenilalanina, 2,3-cloro-fenilalanina, 3-cloro-5-fluoro- fenilalanina, 2-cloro-6-fluoro-3-metil-fenilalanina), o en la que el anillo de benceno del analogo de Phe puede
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estar sustituido con otro grupo arilo (los ejemplos no limitantes incluyen 1- y 2-naftilalanina) o con un grupo heteroarilo (los ejemplos no limitantes incluyen piridilalanina, tienilalanina y furilalanina);
(d) se selecciona entre el grupo que consiste en Gly, terc-butil-Gly (tBu-Gly), Thr, Ser, Val y Asn;
(e) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, Ser, Thr e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(f) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (f) no es Arg;
(g) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(h) se selecciona entre el grupo que consiste en Ile, tBu-Gly, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Ile;
(i) se selecciona entre el grupo que consiste en Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, acido 2-aminobutlrico (Abu) y acido 2-amino-isobutlrico (Aib); y
(j) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, norleucina (Nle), homoleucina (Hleu), Val, terc-butil-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu.
Las variantes de CNP pueden comprender una modification en una o mas de las posiciones 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19 y/o 20, y pueden tener opcionalmente modificaciones en cualquiera de las otras posiciones desveladas en el presente documento.
En realizaciones que se describen en el presente documento en las que CNP22 o variantes del mismo se pueden unir a un acido hidrofobo, los peptidos CNP se pueden unir a uno o mas acidos hidrofobos. Los ejemplos no limitantes de acidos hidrofobos incluyen acidos carboxllicos C5-C12 saturados o insaturados, de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, acido pentanoico, acido heptanoico, etc.) y acidos grasos naturales. Los acidos hidrofobos se pueden unir al extremo N-terminal, el extremo C-terminal, y/o la cadena lateral de uno o mas restos de aminoacidos. En una realizacion, los acidos hidrofobos se conjugan con el extremo N-terminal. En una realizacion, la conjugation de CNP22 o una variante del mismo a un acido hidrofobo se disenan, entre otros, para estimular la interaction no especlfica entre el peptido CNP modificado y albumina de suero, aumentando de ese modo el tamano del peptido CNP y protegiendolo de la escision con proteasas tales como, por ejemplo, NEP. La interaccion entre el peptido CNP conjugado con acido hidrofobo y la albumina se disena para que no sea demasiado fuerte, de modo que el peptido cNp modificado se puede difundir a traves de cartllago, llegar a condrocitos de placas de crecimiento oseo, y unirse y activar a NPR-B.
En una realizacion mas, la divulgation proporciona variantes de CNP que in vitro o in vivo estimulan la production de al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o un 150 % del nivel de cGMP producido con la misma concentration de wtCNP22 (por ejemplo, 1 uM), que comprenden al menos un aminoacido modificado en la posicion (b)6, (c)7 y/o (d)8, y se representan con la formula general:
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(c)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-(j)20-Gly21- Cys22-(z) (SEQ ID NO: 47), en la que:
(x) puede estar ausente o puede ser una secuencia peptldica que contiene de uno a cinco aminoacidos que se obtiene a partir de un polipeptido natriuretico (por ejemplo, NPPC, CNP, ANP o BNP) o un polipeptido no natriuretico como se describe en el presente documento (por ejemplo, HSA, IgG, una protelna de direction a hueso, etc.);
(z) puede estar ausente o se puede seleccionar entre el grupo que consiste en compuestos de direccion a hueso sinteticos tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso/cartllago tales como, por ejemplo, poliAsp y poliGlu; protelnas oseas con dominios de direccion a hueso y derivados de las mismas, tales como protelnas de fusion o secuencias peptldicas de osteopontina, osteocalcina y sialoproteina; moleculas que reducen la elimination renal, tales como, por ejemplo, PEG cargados; y moleculas que aumentan la resistencia de CNP a la degradation mediada con NEP, como se describe en el presente documento;
(a) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-
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norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (a) es Arg;
(b) puede ser Cys o descarboxi cisteina, o el enlace peptidico (b)6-(c)7 (-C(=O)-NH-) se puede sustituir con uno cualquiera de los siguientes isoesteres de enlace peptidico:
-CH2-NH-,
-C(=O)-N(R)-, en el que el grupo amida esta alquilado con cualquiera de los siguientes grupos R: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo,
-C(=O)-NH-CH2-,
-CH2-S-,
-CH2-S(O)n-, en el que n es 1 o 2,
-CH2-CH2-,
-CH=CH-,
-C(=O)-CH2-,
-CH(CN)-NH-,
-CH(OH)-CH2-,
-O-C(=O)-NH-, o -NHC(=O)NH-;
(c) se selecciona entre el grupo que consiste en L-Phe; D-Phe; acido 3-amino-2-fenilpropionico; isoesteres de enlace peptidico de Phe tales como derivados N-alquilados de Phe en los que el grupo N-alquilo se selecciona entre el grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo; y analogos de Phe, en los que una o mas posiciones en orto, meta, y/o para del anillo de benceno del analogo de Phe estan sustituidas con uno o mas sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en halogeno, hidroxilo, ciano, alquilo C1-6 lineal o ramificado, alcoxi C1-6 lineal o ramificado, halo- alquilo Ci_6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-10, arilo C6-14, heterociclilo y heteroarilo (ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tirosina, 3-clorofenilalanina, 2,3-cloro-fenilalanina, 3-cloro-5-fluoro-fenilalanina, 2-cloro-6- fluoro-3-metil-fenilalanina), o en los que el anillo de benceno del analogo de Phe puede estar sustituido con otro grupo arilo (los ejemplos no limitantes incluyen 1- y 2-naftilalanina) o con un grupo heteroarilo (los ejemplos no limitantes incluyen piridilalanina, tienilalanina y furilalanina);
(d) se selecciona entre el grupo que consiste en Gly, terc-butil-Gly (tBu-Gly), Val, Ser, Thr y Asn;
(e) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, Ser, Thr, e isoesteres de enlace peptidico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(f) es cualquier aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tiene un grupo amino primario en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en el que en una realizacion (f) no es Arg;
(g) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu e isoesteres de enlace peptidico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(h) se selecciona entre el grupo que consiste en Ile, tBu-Gly e isoesteres de enlace peptidico tales como, por ejemplo, N-Me-Ile;
(i) se selecciona entre el grupo que consiste en Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, acido 2-aminobutirico (Abu) y acido 2-amino-isobutirico (Aib); y
(j) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, norleucina (Nle), homoleucina (Hleu), Val, terc-butil-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg, e isoesteres de enlace peptidico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu.
En una realizacion mas, la divulgacion incluye variantes de CNP que in vitro o in vivo estimulan la produccion de al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o un 150 % del nivel de cGMP producido con la misma concentracion de wtCNP22 (por ejemplo, 1 uM), que tienen una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa para un aumento de la resistencia a la degradacion de NEP, y se representan con la formula general:
(x)-(y)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leu9-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 48), en la que:
(x) es un grupo polimerico sintetico o natural, o una combinacion de los mismos, en el que un ejemplo no limitante de un grupo polimerico sintetico es el polietilenglicol (PEG), y un ejemplo no limitante de un grupo polimerico natural es una secuencia de aminoacidos que contiene de 1 a 35 aminoacidos y que se obtiene a partir de NPPC o variantes del mismo con sustituciones y/o deleciones, ANP, BNP, u otros (poli)peptidos que
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no son CNP tales como, por ejemplo, albumina de suero, IgG, glicoprotelnas ricas en histidina, fibronectina, fibrinogeno, polipeptidos que contienen dedos de cinc, osteocrina o FGF2;
(y) puede estar ausente o puede ser uno o mas aminoacidos de Glyi-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (que corresponden a las posiciones 1 a 5 de CNP22) (SEQ ID NO: 1) y/o sustituciones en una o mas de esas posiciones usando aminoacidos naturales o no naturales (por ejemplo, sustitucion de K4R);
(h) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (h) no es Arg; y
(z) puede estar ausente o puede ser un grupo polimerico sintetico o natural, o una combinacion de los mismos, en el que un ejemplo no limitante de un grupo polimerico sintetico es PEG, y un ejemplo no limitante de un grupo polimerico natural es una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de un polipeptido natriuretico (por ejemplo, NPPC, CNP, ANP o BNP) o polipeptido no natriuretico (por ejemplo, albumina de suero o IgG).
En una realizacion, (x), (y) y (z) en conjunto contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 aminoacidos. En otra realizacion, (x) es una secuencia de aminoacidos que comprende de 1 a 40 aminoacidos, o de 1 a 20 aminoacidos.
Ademas se contemplan are variantes de CNP que in vitro o in vivo estimulan la produccion de al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o un 150 % del nivel de cGMP producido con la misma concentracion de wtCNP22 (por ejemplo, 1 uM), y comprenden la secuencia:
(y)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22 (SEQ ID nO: 138), en la que:
(y) comprende uno o mas aminoacidos seleccionados entre Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (SEQ ID NO: 1) y/o sustituciones en una o mas de esas posiciones usando aminoacidos naturales o no naturales (por ejemplo, sustitucion de K4R), y comprende adicionalmente un pollmero hidrofilo o soluble en agua con un peso molecular de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 5 kDa. En una realizacion, el pollmero hidrofilo o soluble en agua se conjuga con el extremo N-terminal de tal variante de CNP prolongada con aminoacido. En una realizacion particular, el pollmero hidrofilo o soluble en agua es PEG (o PEO).
En otra realizacion mas, la divulgacion proporciona variantes de CNP que in vitro o in vivo estimulan la produccion de al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o un 150 % del nivel de cGMP producido con la misma concentracion de wtCNP22 (por ejemplo, 1 uM), en la que las variantes de CNP comprenden una prolongacion de peptido N-terminal y/o C-terminal que contiene de 1 a 15 aminoacidos, y se conjugan con un pollmero hidrofilo o soluble en agua. En una realizacion, la prolongacion de peptido contiene de 5 a 10 aminoacidos. En una realizacion especlfica, la prolongacion de peptido contiene 5 aminoacidos. En otra realizacion especlfica, el pollmero hidrofilo o soluble en agua es PEG (o pEo).
Ademas, en una realizacion adicional, las variantes de CNP de la divulgacion in vitro o in vivo estimulan la produccion de al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o un 150 % del nivel de cGMP producido con la misma concentracion de wtCNP22 (por ejemplo, 1 uM), y comprenden un fragmento de al menos a 15 aminoacidos obtenidos obtenida a partir del precursor de peptido natriuretico C (NPPC), en el que el fragmento es homologo en al menos un 70 % con una secuencia del d NPPC e tipo silvestre que contiene el mismo numero de restos de aminoacidos.
Ademas, en otra realizacion, las variantes de CNP de la divulgacion tienen una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa para aumentar la resistencia a NEP, y se representan con la formula:
(x)-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-(j)20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 49), en la que:
(x) puede estar ausente (es decir, los extremos N-terminales con un grupo -NH2) o se puede seleccionar entre el grupo que consiste en una secuencia de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacidos del peptido Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (SEQ ID NO: 1); secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso/cartllago tales como por ejemplo poliAsp o poliGlu; dominios de direccion o hueso de protelnas oseas tales como por ejemplo osteopontina, osteocalcina o sialoproteina; moleculas que reducen la eliminacion renal tales como pollmeros hidrofilos o solubles en agua, que incluyen, pero no se limitan a, moleculas de PEG cargadas; y restos de comprenden PEG, carbohidratos, acidos hidrofobos, aminoacidos, o combinaciones de los mismos, en las que tales restos pueden ser prolongaciones de aminoacido que incluyen, pero no se limitan a, secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de NPPC o (poli)peptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, BNP, ANP, albumina
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de suero o IgG;
(z) puede estar ausente o se puede seleccionar entre el grupo que consiste en secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso/cartllago tales como por ejemplo poliAsp o poliGlu; secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de protelnas de direccion a hueso, tales como por ejemplo osteopontina, osteocalcina o sialoproteina; y secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de NPPC o (poli)peptidos que no son CNP, como se describe en el presente documento;
(b) se selecciona entre el grupo que consiste en Cys e isoesteres de enlace peptldico entre Cys6 y Phe7 tales como, por ejemplo, Cys-CH2-NH;
(c) se selecciona entre el grupo que consiste en L-Phe; D-Phe; acido 3-amino-2-fenilpropionico; derivados N- alquilados de Phe, en los que el grupo N-alquilo es metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo; y analogos de Phe, en los que una o mas posiciones en orto, meta, y/o para del anillo de benceno del analogo de Phe estan sustituidas con uno o mas sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en halogeno, hidroxilo, ciano, alquilo Ci-6 lineal o ramificado, alcoxi Ci-6 lineal o ramificado, halo-alquilo C1-6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-10, arilo C6-14, heterociclilo y heteroarilo (ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tirosina, 3-clorofenilalanina, 2,3-cloro-fenilalanina, 3-cloro-5-fluoro- fenilalanina, 2-cloro-6-fluoro-3-metil-fenilalanina), o en los que el anillo de benceno del analogo de Phe puede estar sustituido con otro grupo arilo (los ejemplos no limitantes incluyen 1- y 2-naftilalanina) o con un grupo heteroarilo (los ejemplos no limitantes incluyen piridilalanina, tienilalanina y furilalanina);
(d) se selecciona entre el grupo que consiste en Gly, terc-butil-Gly (tBu-Gly), Val, Ser, Thr y Asn;
(e) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, Ser, Thr, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(f) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (f) no es Arg;
(g) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(h) se selecciona entre el grupo que consiste en Ile, tBu-Gly e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Ile;
(i) se selecciona entre el grupo que consiste en Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, acido 2-aminobutlrico (Abu) y acido 2-amino-isobutlrico (Aib); y
(j) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, norleucina (Nle), homoleucina (Hleu), Val, terc-butil-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu.
Las variantes de CNP de la presente divulgacion tienen una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa para aumentar la resistencia a NEP, y se representan con la formula:
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6(c)7-(d)8-(e)g-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-(i)15-Ser16-(j)17-Ser18-Gly1g-(k)20-Gly21- Cys22-(z) (SEQ ID NO: 50), en la que:
(x) y (z) independientemente pueden estar ausentes o se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en compuestos de direccion a hueso sinteticos tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso/cartllago tales como por ejemplo poliAsp o poliGlu; secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de dominios de direccion a hueso de protelnas oseas y derivados de los mismos, tales como por ejemplo protelnas de fusion o secuencias peptldicas de osteopontina, osteocalcina, sialoproteina, etc.; restos que reducen la eliminacion renal, que incluyen, pero no se limitan a, pollmeros hidrofilos o solubles en agua tales como, por ejemplo, moleculas de PEG cargadas; y restos que comprenden, por ejemplo, pollmeros hidrofilos (por ejemplo, PEG), carbohidratos, acidos hidrofobos, y/o aminoacidos;
(a) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (a) es Arg;
(b) se selecciona entre el grupo que consiste en Cys e isoesteres de enlace peptldico entre Cys6 y Phe7 tales
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como, por ejemplo, Cys-CH2-NH;
(c) se selecciona entre el grupo que consiste en L-Phe; D-Phe; acido 3-amino-2-fenilpropi6nico; derivados N- alquilados de Phe, en los que el grupo N-alquilo es metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo; y analogos de Phe, en los que una o mas posiciones en orto, meta, y/o para del anillo de benceno del analogo de Phe estan sustituidas con uno o mas sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en hal6geno, hidroxilo, ciano, alquilo Ci-6 lineal o ramificado, alcoxi Ci-6 lineal o ramificado, halo-alquilo Ci-6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-10, arilo C6-14, heterociclilo y heteroarilo (ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tirosina, 3-clorofenilalanina, 2,3-cloro-fenilalanina, 3-cloro-5-fluoro- fenilalanina, 2-cloro-6-fluoro-3-metil-fenilalanina), o en los que el anillo de benceno del analogo de Phe puede estar sustituido con otro grupo arilo (los ejemplos no limitantes incluyen 1- y 2-naftilalanina) o con un grupo heteroarilo (los ejemplos no limitantes incluyen piridilalanina, tienilalanina y furilalanina);
(d) se selecciona entre el grupo que consiste en Gly, terc-butil-Gly, Thr, Ser, Val y Asn;
(e) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, Ser, Thr, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(f) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posici6n o puede estar sustituida con una sustituci6n de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizaci6n (f) no es Arg;
(g) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, Asn, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(h) se selecciona entre el grupo que consiste en Ile, terc-butil-Gly (tBu-Gly), Asn, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Ile;
(i) se selecciona entre el grupo que consiste en Gly, Arg, Ser y Asn;
(j) se selecciona entre el grupo que consiste en Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, acido 2-aminobutlrico (Abu) y acido 2-amino-isobutlrico (Aib); y
(k) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, norleucina (Nle), homoleucina (Hleu), Val, terc-butil-Ala (tBu-Ala), Arg, Thr, Ser, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu.
Las variantes de CNP pueden tener sustituci6n o sustituciones de aminoacidos en una o mas de cualquiera de las posiciones 1 a 22 de CNP22. En una realizaci6n, Gly1 esta sustituido con Arg o Glu. En otra realizaci6n, Lys4 esta sustituido con Arg. Ademas, en otra realizaci6n, Gly5 esta sustituido con Arg, Gln o Ser. En otra realizaci6n mas, Gly15 esta sustituido con Ser, Asn, Arg o Cit. En una realizaci6n mas, Gly19 esta sustituido con Ser, Arg o Asn. En otra realizaci6n mas, Gly21 esta sustituido con Ser, Thr, o Arg.
Una variante de CNP se puede seleccionar entre el grupo que consiste en GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC (formado usando descarboxi-Cys) (SEQ ID NO: 56), GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 57), GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO: 136), GLSKGCF-(tBuG)-LKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 58), GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 137), y GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]- GLKLDRIGSMSGLGC (formado usando acido 3-amino-2-fenilpropi6nico) (SEQ ID NO: 59). En una realizaci6n mas, existe un enlace disulfuro entre Cys6, descarboxi-Cys u otro analogo de cistelna que contiene sulfhidrilo en la posici6n de Cys6, y Cys22 de cualquier variante de CNP descrita en el presente documento.
Una variante de CNP puede contener una prolongaci6n de aminoacido en el extremo N-terminal y/o C-terminal de CNP22 o CNP 17, que incluye, pero no se limita a:
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 4); QEHPNARKYICGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37, Analogo BL) (SEQ ID NO: 60); AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CA) (SEQ ID NO: 61); AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CB) (SEQ ID NO: 62); DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLICLDRIGSMSGLGC (Analogo CC) (SEQ ID NO: 63); RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 40);
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 38);
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 64);
GANRRGLSKGCFGLKL,DRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 65);
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 66);
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 67);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 144) (en ocasiones denominado
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"CNP27-HSA" o "HSA-CNP27" en los Ejemplos y figuras);
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (Analogo CD) (SEQ ID NO: 68) (CNP17 que tiene colas N-terminales y C- terminales obtenidas a partir de BNP).
Una variante de CNP puede tener una sustitucion de K4R en la posicion 4 de CNP22. Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP(K4R) incluyen:
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo AY) ((SEQ ID NO: 36); GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CI) (SEQ ID NO: 37);
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo AZ) (SEQ ID NO: 41);
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo BA) (SEQ ID NO: 39);
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CH) (SEQ ID NO: 69); y GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CG) (SEQ ID NO: 70).
Las variantes de CNP pueden tener un resto de PEG (o PEO) y una prolongacion de aminoacido en el extremo N- terminal que contiene arginina en la posicion que precede inmediatamente a la posicion que corresponde a Gly1 de CNP22. Tales variantes de CNP PEGilado se disenan para un aumento de la resistencia a la degradation de NEP, reduction de la union a albumina de suero, y aumento de la actividad funcional de CNP (por ejemplo, activation de la serialization de cGMP). Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP PEGilado incluyen PEO24-GANRR- CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), PEO24-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 65), PEO12-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 65), PEO24-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), PEO12- GANPR-CNP22(K4R (SEQ ID NO: 37), PEO24-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 37), PEO12-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 66), PEO24-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64), PEO12-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64), PEO24-ER- CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), PEO12-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), PEO24-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38), PEO12-ER-CNP22(SE ID NO: 38), PEO24-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), PEO12-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), PEO24-R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), y PEO12-R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), en las que PEO24 es un pollmero de PEG de 1,2 kDa monodisperso y PEO12 es un pollmero de PEG de 0,6 kDa monodisperso. En una realization, el pollmero de PEG (o PEO) esta unido al extremo N-terminal de las variantes de CNP.
Las variantes de CNP adicionales descritas son derivados de CNP37 que tienen mutation o mutaciones en el sitio de escision de furina (subrayado), disenados para aumentar la resistencia in vivo a la proteasa de furina, y/o que tienen glicina (subrayado) precediendo a glutamina, disenados para evitar la formation de piroglutamina, que incluyen, pero no se limitan a:
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CS) (SEQ ID NO: 71);
GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGEGC (An. CT) (SEQ ID NO: 72);
GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CU) (SEQ ID NO: 73);
GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CW) (SEQ ID NO: 74);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP37, An. DB) (SEQ ID NO: 75);
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145).
Las variantes de CNP pueden ser quimeras que comprenden CNP22 y un fragmento de peptido N-terminal, que incluyen, pero no se limitan a:
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLORIGSMSGLGC (Analogo CQ) (quimera de fragmento de glicoprotelna rica en histidina (HRGP)-CNP22) (SEQ ID NO: 76);
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CR) (quimera de fragmento de HRGP- CNP22) (SEQ ID NO: 77);
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CX) (quimera de fragmento de HRGP- CNP22) (SEQ ID NO: 78);
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CF) (quimera de fragmento de IgG1(Fc) CNP22) (SEQ ID NO: 79);
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CY) (quimera de fragmento de albumina de suero humano (HSA)-CNP22 ) (SEQ ID NO: 80);
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDR1GSMSGLGC (Analogo CE) (quimera de fragmento de HSA-CNP22) (SEQ ID NO: 81);
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CZ) (quimera de fragmento de ”inhibidor de NPR C” de osteocrina-CNP22) (SEQ ID NO: 82); y
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo DA) (quimera de fragmento de “dominio de union a heparina” de FGF2-CNP22) (SEQ ID NO: 83).
Las variantes de CNP que se describen adicionalmente son quimeras que comprenden un fragmento de peptido N- terminal y CNP22 en las que la arginina esta sustituida por la Lys4 de CNP22 ("CNP22(K4R)"), que incluyen, pero no se limitan a:
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GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CK) (quimera de fragmento de IgG1(Fc)- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 84);
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CL) (quimera de fragmento de HSA- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 85
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CM) (quimera de fragmento de fibronectina- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 86);
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CO) (quimera de fragmento de fibrinogeno- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 88); y
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CP) (quimera de fragmento de dedos de cinc- CNP22) (SEQ ID NO: 89).
Las variantes de CNP pueden ser quimeras, o protelnas de fusion, que comprenden un peptido o variante de CNP, y un peptido o protelna escindible, o etiqueta peptldica. Las protelnas ofrecidas que se pueden escindibles a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de histidina (por ejemplo, hexa-His); TAF12: factor de transcripcion humano TAF12; KSI: cetosteroide isomerasa; MBP: protelna de union a maltosa; p-Gal: p-galactosidasa; GST: glutation-S-transferasa; Trx: tiorredoxina; CBD: dominio de union quitina; BMPM: mutacion BMP-2, SUMO, CAT, TrpE, protelna A estafilococica, protelnas estreptococicas, protelna de union a almidon, dominio de endoglucanasa A de union a celulosa, dominio de endoglucanasa Cex de union a celulosa, dominio de union a biotina, recA, Flag, c- Myc, poli(His), poli(Arg), poli(Asp), poli(Gln), poli(Phe), poli(Cys), protelna fluorescente de color verde, protelna fluorescente de color rojo, protelna fluorescente de color amarillo, protelna fluorescente de color cian, biotina, avidina, estreptavidina, epltopos de anticuerpo, y fragmentos de los mismos.
Una variante de CNP puede ser un monomero o un dlmero. En una realizacion relacionada los monomeros de variantes de CNP dimerico pueden unir el extremo N-terminal al extremo N-terminal a traves de un conector o no conector, el extremo N-terminal al extremo C-terminal a traves de un conector o no conector, o el extremo C-terminal al extremo C-terminal a traves de un conector o no conector.
Las quimeras que comprenden un fragmento de IgG y CNP22 o una variante de los mismos se disenan para, entre otros, aumentar la resistencia a la degradacion de NEP y reducir la union a albumina de suero. Las quimeras de CNP que comprenden un fragmento de superficie de HSA se disenan para, entre otros, reducir la inmunogenicidad y reducir la union a albumina de suero. Las quimeras de HRGP-CNP22 y HRGP-CNP22(K4R) que contienen una secuencia que no es arginina, que no es lisina, ricas en histidina, cationicas c en el extremo N-terminal se disenan para, entre otros, aumentar la estabilidad a las proteasas. Las quimeras que contienen un fragmento de osteocrina se disenan para liberar, despues de escision con proteasa (por ejemplo, furina), el fragmento de osteocrina en las placas de crecimiento oseo, en las que el fragmento podrla inhibir la elimination del receptor NPR-C. Con respecto a las quimeras que comprenden un fragmento de union a heparina de FGF2, la union de la heparina al fragmento se disena para proteger la quimera de la degradacion, proporcionando de ese modo una semivida en suero mas larga. Las quimeras que contienen un fragmento de fibronectina, fibrinogeno, o dedos de cinc se disenan para reducir la union a albumina de suero, entre otras caracterlsticas ventajosas.
Sin pretender quedar ligado por la teorla, una variante de CNP de un peso molecular de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa que tiene un aumento de la resistencia a la degradacion de NEP y tiene funcionalidad similar o aumentada (por ejemplo, union a NPR-B y estimulacion de la serialization de cGMP) tal como en comparacion con wtCNP22, puede ser mas eficaz si no se une estrechamente a protelnas plasmaticas tales como albumina de suero. Una variante de CNP que no se une estrechamente a protelnas plasmaticas (por ejemplo, albumina de suero) debe ser mas eficaz para difundirse a traves del cartllago, alcanzando los condrocitos de placas de crecimiento oseo, y uniendose a y activando a NPR-B para la senalizacion de cGMP. Las variantes de CNP disenadas para reduction de la union a protelnas plasmaticas (por ejemplo, albumina de suero) son quimeras que comprenden CNP22 o una variante del mismo y un fragmento peptldico de IgG. Las variantes de CNP disenadas para reduccion de la union a protelnas plasmaticas son quimeras que comprenden CNP22 o CNP22(K4R) y un fragmento de un polipeptido (por ejemplo, IgG, HSA, fibronectina, fibrinogeno, un polipeptido que contiene dedos de cinc, etc.). Otras variantes de CNP disenadas para reduccion de la union a protelnas plasmaticas comprenden CNP22 o una variante del mismo conjugada a un pollmero hidrofilo o soluble en agua. En una realizacion, el pollmero hidrofilo o soluble en agua es PEG (o PEO). En otra realizacion, el pollmero hidrofilo o soluble en agua (por ejemplo, PEG) esta funcionalizado con uno o mas grupos funcionales que transmiten una carga negativa al pollmero en condiciones fisiologicas, tales como, por ejemplo, grupos carboxilo, sulfato o fosfato, o una combination de los mismos.
En cualquiera de las realizaciones que se desvelan en el presente documento, las variantes de CNP pueden tener una actividad biologica sustancialmente igual o mejor que el CNP22 de tipo silvestre. Por ejemplo, las variantes de CNP pueden retener al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o mo mas de la actividad del CNP22 de tipo silvestre, o pueden tener una actividad superior a la de CNP22, por ejemplo, con respecto a la interaction con NPR- B (GC-B) para estimular la generation de cGMP. Como alternativa, o ademas, las variantes de CNP pueden retener al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o mas de la actividad del CNP22 de tipo silvestre, o pueden tener una actividad superior a la de CNP22, con respecto a la regulation del crecimiento oseo endocondral y la actividad de los condrocitos, que incluye, pero no se limita a, proliferation de condrocitos, diferenciacion de condrocitos,
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inhibicion de la ruta de senalizacion de protelna quinasa activada por mitogenos (MAP) / MEK (Raf-1) quinasa, y estimulacion de la osificacion endocondral. En cualquiera de las realizaciones que se describen en el presente documento, las variantes de CNP pueden comprender una secuencia de aminoacidos que es identica u homologa en al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o mas a los aminoacidos 6-22 o 1-22 del CNP22 de tipo silvestre.
La divulgacion proporciona variantes de CNP22 que tienen menos afinidad con respecto al receptor de eliminacion de NPR-C a la vez que retienen la capacidad para unirse y activar a NPR-B. La presente divulgacion incluye variantes que se generaron, o se pueden generar, a partir de un modelo estructural basado en homologla el complejo NPR-B/CNP como se describe en la Descripcion Detallada. En otra realizacion, las variantes de CNP tienen sustitucion o sustituciones en uno o mas sitios de Gly en las posiciones 1, 5, 8, 15, 19 y 21, para reducir la flexibilidad conformacional, que puede aumentar su especificidad para la union a NPR-B con respecto al NPR-C. Las variantes de CNP que tienen una afinidad potencialmente reducida con respecto al NPR-C incluyen, pero no se limitan a, las que tienen una o mas de las siguientes sustituciones: G1R, G1E, G5R, G5Q, G5S, F7Y, G8T, G8S, G8V, G8N, L9S, L9T, K10Cit K10Q, K10S, I14N, G15R, G15S, G15N, G15Cit, S16Q, M17V, M17N, G19S, G19R, G19N, L20V, L20R, L20T, L20S, G21S, G21T y G21R.
Las variantes de CNP pueden tener una modificacion y/o sustitucion en una mas de las posiciones 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 19, 20 y 21, y opcionalmente pueden tener modificaciones y/o sustituciones en cualquiera de las otras posiciones que se desvelan en el presente documento. En una realizacion mas, las variantes de CNP pueden tener opcionalmente conjugacion(s) o prolongacion (s), por ejemplo, en el extremo N- y/o C-terminal para facilitar la direccion a hueso/ cartllago, reducir la eliminacion renal, y/o aumentar la resistencia a la degradation con NEP. Tal conjugacion(s) o prolongacion(s) puede comprender moleculas o secuencias formadas u obtenidas a partir de, por ejemplo, poliAsp, poliGlu, peptidos de direccion a hueso o cartllago, osteopontina, osteocalcina, sialoproteina, PEGs, carbohidratos, acidos hidrofobos, NPPC o (poli)peptidos que no son CNP, o combinaciones de los mismos.
La presente invention proporciona un metodo para la production recombinante de una variante de CNP de la presente invencion como se ensenan las reivindicaciones.
Las variantes de CNP se pueden preparar mediante metodos convencionales de slntesis de peptidos en fase solida con aminoacido(s) o peptidomimetico(s) naturales o naturales que se sustituyen y/o se anaden cuando sea apropiado. En otra realizacion, las variantes de CNP se producen mediante procesos de slntesis recombinante, por ejemplo, a traves de protelnas de fusion que contienen una protelna de etiqueta o vehlculo, en las que el uso de la protelna de etiqueta o vehlculo facilita, por ejemplo, la detection, aislamiento y/o purification de la protelna de fusion, y la escision qulmica o proteolltica selectiva de la protelna de etiqueta o vehlculo de la protelna de fusion proporciona la variante de CNP diana. En una realizacion mas, la PEGilacion de las variantes de CNP se produce despues de, o parte de, slntesis qulmica o biologica con la reaction de conjugation siendo realizada mediante qulmica basada en NHS o aldehldo u otra qulmica conocida en la tecnica. En otra realizacion, las variantes de CNP comprenden un enlace disulfuro. En una realizacion relacionada, el enlace disulfuro forma un peptido clclico. En una realizacion particular, el enlace disulfuro se forma entre restos de cistelna en las posiciones que corresponden a las posiciones 6 y 22 de CNP22.
Las variantes de CNP se pueden conjugar a un resto polimerico o no polimerico hidrofobo tuvo, tal como, por ejemplo, acido heptanoico, acido pentanoico, o acidos grasos. El resto hidrofobo se puede conjugar con la cadena lateral de un resto de aminoacido, que incluye, pero no se limita a, una lisina, una serina, una cistelna o una treonina, o se puede unir al extremo N-terminal y/o C-terminal de la variante de CNP.
En una realizacion, las variantes de CNP, como se describe en el presente documento, tienen un pi en el intervalo de aproximadamente 8 a aproximadamente 10,5 o de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10.
En una realizacion mas, la divulgacion proporciona una composition farmaceutica que comprende una variante de CNP, opcionalmente otro agente biologicamente activo, y opcionalmente un excipiente, vehlculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. En algunas realizaciones, las composiciones son composiciones farmaceuticas esteriles adecuadas para inyeccion parenteral. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden una variante de CNP sustancialmente pura, por ejemplo pura en al menos aproximadamente un 90 % o un 95 %. En algunas realizaciones, las composiciones contienen menos de aproximadamente un 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o un 0,5 % de contaminantes, tales como otras protelnas humanas, protelnas de porcino, o CNP53 o fragmentos de los mismos (otros distintos de la variante de CNP deseada). En ciertas realizaciones, la composicion esteril se administra a un sujeto para tratar o prevenir cualquiera de las afecciones o trastornos sensibles a CNP que se desvelan en el presente documento.
Las variantes de CNP de la divulgacion de forma ventajosa retienen la actividad de CNP y presentan un aumento de la semivida en suero. La retention de la actividad de CNP se puede mostrar, por ejemplo, como retention del efecto biologico in vivo deseado, o retencion de al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o al menos aproximadamente un 100 % de la actividad de estimulacion de cGMP de CNP22, con la misma concentration (por ejemplo, 1 uM de Peptido CNP o superior a la DE80). En algunas realizaciones, las variantes de
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CNP presentan un aumento de la semivida en suero en comparacion con CNP22 de al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces o 40 veces.
En una realizacion relacionada, las variantes de CNP que se describen en el presente documento tienen un aumento de la resistencia a NEP y presentan un aumento de la semivida en comparacion con el CNP22 de tipo silvestre. En una realizacion, la semivida de las variantes de CNP aumenta en aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o aproximadamente un 100 % en comparacion con el CNP22 de tipo silvestre.
En ciertas realizaciones, las variantes de CNP que se describen en el presente documento aumentan la produccion de cGMP in vitro, aumentan la produccion de cGMP in vivo, aumentan el nivel in vivo de uno o mas biomarcadores asociados con la formacion o crecimiento de cartllago o hueso, aumentan la resistencia a la escision con NEP in vitro, aumentan la semivida en plasma o en suero in vivo, aumentan la biodisponibilidad in vivo, o aumentan la longitud de huesos en particular in vivo, o efectuan combinaciones de tales aumentos, en aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 3,5 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 4,5 veces, o aproximadamente 5 veces o mas en comparacion con el CNP22 de tipo silvestre.
En otra realizacion mas, la divulgacion proporciona una variante de CNP o composicion farmaceutica que comprende a la misma para su uso en un metodo para tratar trastornos de crecimiento oseo, que incluyen, pero no se limitan a, displasias esqueleticas y malformaciones esqueleticas hereditarias tales como trastornos asociados con el receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR-3). En una realizacion especlfica, las mutaciones en el receptor asociadas con la mutacion o mutaciones de FGFR-3 es la acondroplasia. En otra realizacion, los trastornos sensibles a CNP son trastornos asociados con celulas y tejidos del musculo liso vascular. En una realizacion mas, las variantes de CNP son utiles para aumentar el tamano de la placa de crecimiento de un hueso (por ejemplo, un hueso de una extremidad). En otra realizacion, las variantes de CNP son utiles para alargar un hueso o aumentar el crecimiento de un hueso largo. Ademas, en otra realizacion, las variantes de CNP son utiles para aumentar la produccion, proliferacion y diferenciacion de condrocitos de matriz.
En ciertas realizaciones, las variantes de CNP que se describen en el presente documento se administran a una dosis en el intervalo de aproximadamente 5 o 10 nmol/kg a aproximadamente 300 nmol/kg, o de aproximadamente 20 nmol/kg a aproximadamente 200 nmol/kg. En algunas realizaciones, las variantes de CNP se administran a una dosis de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 nmol/kg u otra dosis que el medico que prescribe considere apropiada. En otras realizaciones, las variantes de CNP se administran a una dosis de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 o 800 ug/kg, o aproximadamente 1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg u otra dosis que el medico que prescribe considere apropiada. Las dosis de las variantes de CNP que se describen en el presente documento se pueden administrar de acuerdo con la frecuencia de dosificacion/frecuencia de administracion que se describe en el presente documento, que incluye, pero no se limita a, diariamente, 2 o 3 veces a la semana, semanalmente, cada 2 semanas, cada 3 semanas, mensualmente, etc.
En otra realizacion, las variantes de CNP que se describen en el presente documento se administran en un solo tratamiento o en multiples dosis. Las multiples dosis se pueden administrar diariamente, o en multiples dosis durante el transcurso del tratamiento. En ciertas realizaciones, se contempla que la variante de CNP se administre, en una sola dosis o en multiples dosis, diariamente, cada dos dlas, cada 3 dlas, 2 veces a la semana, 3 veces a la semana, semanalmente, quincenalmente, cada 3 semanas, mensualmente, cada 6 semanas, cada 2 meses, cada 3 meses o segun lo considere apropiado el medico que prescribe.
En ciertas realizaciones, la administracion de la variante de CNP se ajusta para permitir periodos de crecimiento (por ejemplo, condrogenesis), seguidos de un periodo de recuperacion (por ejemplo, osteogenesis). Por ejemplo, la variante de CNP se puede administrar por via subcutanea, por via intravenosa, o mediante cualquier otra via diariamente o multiples veces a la semana durante un periodo de tiempo, seguido de un periodo de no tratamiento, a continuacion el ciclo se repite. En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento inicial (por ejemplo, la administracion de la variante de CNP diariamente o multiples veces a la semana) es de 3 dlas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas. En una realizacion relacionada, el periodo de no tratamiento dura 3 dlas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. En ciertas realizaciones, el regimen de dosificacion de la variante de CNP es diario durante 3 dlas seguido de 3 dlas de descanso; o diario o multiples veces a la semana durante 1 semana seguido de 3 dlas o 1 semana de descanso; o diariamente o multiples veces a la semana durante 2 semanas seguido de 1 o 2 semanas de descanso; o diariamente o multiples veces a la semana durante 3 semanas seguido de 1, 2 o 3 semanas de descanso; o diariamente o multiples veces a la semana durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas seguido de 1, 2, 3 o 4 semanas de descanso.
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Ademas, se describe un metodo para tratar una afeccion o trastorno sensible a CNP, que comprende administrar un peptido o variante de CNP a un sujeto, y controlar el nivel de al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago en el sujeto (por ejemplo, en una muestra biologica del sujeto), en el que un aumento o disminucion del nivel del biomarcador asociado a hueso o cartllago indica un efecto terapeutico del peptido o variante de CNP en el sujeto se ensena en el presente documento. En algunas realizaciones, cuando el nivel de un biomarcador aumenta en asociacion con la formacion o crecimiento de hueso o cartllago, un aumento en el nivel del biomarcador indica un efecto terapeutico del peptido o variante de CNP en el sujeto. En otras realizaciones, cuando el nivel de un biomarcador disminuye en asociacion con la formacion o crecimiento de hueso o cartllago, una disminucion en el nivel de ese biomarcador indica un efecto terapeutico del peptido o variante de CNP en el sujeto.
En otras realizaciones, el uso en el metodo terapeutico que se describe en el presente documento comprende adicionalmente ajustar la cantidad (o dosis) o frecuencia de administracion del peptido o variante de CNP, en el que:
(i) la cantidad (o dosis) o frecuencia de administracion del peptido o variante de CNP aumenta si el nivel de el al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago es inferior a un nivel diana, en el que el nivel del biomarcador aumenta en asociacion con la formacion o crecimiento de hueso o cartllago; o
(ii) la cantidad (o dosis) o frecuencia de administracion del peptido o variante de CNP disminuye si el nivel de el al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago es superior a un nivel diana, en el que el nivel del biomarcador aumenta en asociacion con la formacion o crecimiento de hueso o cartllago; o
(iii) la cantidad (o dosis) o frecuencia de administracion del peptido o variante de CNP aumenta si el nivel de el al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago es superior a un nivel diana, en el que el nivel del biomarcador disminuye en asociacion con la formacion o crecimiento de hueso o cartllago; o
(iv) la cantidad (o dosis) o frecuencia de administracion del peptido o variante de CNP disminuye si el nivel de el al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago es inferior a un nivel diana, en el que el nivel del biomarcador disminuye en asociacion con la formacion o crecimiento de hueso o cartllago.
Se contempla que el nivel diana de un biomarcador se refiere al nivel o intervalo de niveles del biomarcador que esta asociado con efecto terapeutico en el sujeto y/o efecto beneficioso para aliviar o mejorar los slntomas del trastorno o afeccion. En ciertas realizaciones, un nivel de un biomarcador por encima o por debajo de un nivel diana puede ser perjudicial para el sujeto.
En el presente documento tambien se ensena un metodo para evaluar el efecto de la administracion de un peptido o variante de CNP en la formacion o crecimiento de hueso o cartllago. En una realizacion, el metodo proporciona la evaluacion o medicion del nivel de al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago en un sujeto al que se le ha administrado peptido o variante de CNP para evaluar el efecto del peptido o variante de CNP en la formacion y crecimiento de hueso y cartllago in vivo. En una realizacion relacionada, un aumento en el nivel de el al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago puede indicar que la administracion del peptido o variante de CNP tiene un efecto positivo en la formacion o crecimiento de hueso o cartllago y es un tratamiento util para displasias esqueleticas y otras enfermedades o trastornos relacionados con hueso o cartllago asociados con una disminucion de la actividad de CNP. Los biomarcadores asociados a hueso o cartllago a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, CNP (por ejemplo, nivel endogeno de CNP-22 o CNP-53), cGMP, osteocalcina, antlgeno nuclear de celulas proliferantes (PCNA), propeptidos de procolageno de tipo I (PINP) y fragmentos de los mismos, colageno de tipo I y fragmentos de los mismos, propeptidos de colageno de tipo II y fragmentos de los mismos, colageno de tipo II y fragmentos de los mismos, sulfato de agrecano y condroitina, y fosfatasa alcalina.
En el presente documento tambien se ensena un metodo para evaluar el efecto del peptido o variante de CNP en el nivel de al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago en un sujeto, que comprende evaluar o medir el nivel del biomarcador asociado a hueso o cartllago en una muestra biologica de un sujeto al que se le ha administrado un peptido o variante de CNP. En algunas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente la administracion del peptido o variante de CNP al sujeto antes de evaluar o medir el nivel del biomarcador asociado a hueso o cartllago.
En ciertas realizaciones, el al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago se selecciona entre el grupo que consiste en CNP (por ejemplo, nivel endogeno de CNP-22 o CNP-53), cGMP, propeptidos de colageno de tipo II y fragmentos de los mismos, colageno de tipo II y fragmentos de los mismos, osteocalcina, antlgeno nuclear de celulas proliferantes (PCNA), propeptidos de procolageno de tipo I (PINP) y fragmentos de los mismos, colageno de tipo I y fragmentos de los mismos, sulfato de agrecano y condroitina, y fosfatasa alcalina.
En los metodos (por ejemplo, metodos terapeuticos, de diagnostico y de ensayo) que se refieren a biomarcadores asociados a hueso o cartllago ensenados en el presente documento, el peptido o variante de CNP puede ser CNP- 22, CNP-53, o cualquiera de los peptidos y variantes de CNP que se describen en el presente documento. En ciertas realizaciones de tales metodos, el peptido o variante de CNP no es CNP-22 o CNP-53.
En el presente documento se ensena un metodo para la produccion recombinante de una variante de CNP, que comprende cultivar en un medio una celula hospedadora que comprende un polinucleotido que codifica un peptido de variante de CNP unido a un polinucleotido que codifica un peptido o protelna escindible, en condiciones que dan como resultado la expresion de un polipeptido de fusion codificado por los polinucleotidos. En una realizacion
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relacionada, la celula hospedadora se transforma con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que codifica un peptido de variante de CNP unido a un polinucleotido que codifica un peptido o proteina escindible.
En una realization, el vector es un plasmido. Ademas, en otra realization, el plasmido se selecciona entre el grupo que consiste en pET-21 a, pJexpress, pET-31b, pET-15b, pET-32a, pET-41a, pMAL, pQE-30, pET-SUMO, pET-22b, y pTYB11.
En ciertas realizaciones, el peptido o protema escindible comprende un polipeptido que se selecciona entre el grupo que consiste en una etiqueta de histidina, factor de transcription humano TAF12, cetosteroide isomerasa, proteina de union a maltosa, p-galactosidasa, glutation-S-transferasa, tiorredoxina, dominio de union a quitina, y mutation de BMP-2, o fragmentos de los mismos.
En una realizacion relacionada, el peptido o proteina escindible se escinde con un agente de escision. En algunas realizaciones, el agente de escision se selecciona entre el grupo que consiste en acido formico, bromuro de cianogeno (CNBr), hidroxilamina, autoescision de proteina, Factor Xa, enteroquinasa, ProTEV, y proteasa de SUMO. Los agentes de escision a modo de ejemplo adicionales incluyen, pero no se limitan a, paladio, clostridolor, trombina, quimotripsina, tripsina, proteasas similares a tripsina, carboxipeptidasa, enteropeptidasa, proteasa de Kex 2, proteasa de Omp T, subtilisina, proteasa de V8, proteasa del VIH, proteasa de rinovirus, proteasa de furilisina, proteasas de IgA, proteasa de Pace humano, colagenasa, proteasa de Nia, proteasa de 2Apro de poliovirus, proteasa de 3C de poliovirus, genenasa, furina, elastasa, Proteinasa K, pepsina, renina (quimosina), proteasas asparticas microbianas, padolor, caldolor, quimopadolor, ficina (ficaina), bromelaina (bromelasa), catespisina B, caspasas, termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, kalikreina, y plasmina.
En ciertas realizaciones, el polipeptido de fusion se expresa como una proteina soluble o como un cuerpo de inclusion. En una realizacion relacionada, la divulgacion contempla aislar el polipeptido de fusion expresado de la celula hospedadora o medio de cultivo. En una realizacion mas, el polipeptido de fusion aislado se pone en contacto con un agente de escision como se describe en el presente documento.
En una realizacion, la divulgation proporciona una celula hospedadora bacteriana que comprende un vector de expresion, y dicho vector comprende un polinucleotido que codifica una variante de peptido CNP unido a un polinucleotido que codifica un peptido o proteina escindible. En algunas realizaciones, el peptido o proteina escindible se selecciona entre el grupo que consiste en una etiqueta de histidina, factor TAF 12 de transcripcion humano, cetosteroide isomerasa, proteina de union a maltosa, p-galactosidasa, glutation-S-transferasa, tiorredoxina, dominio de union a quitina, y BMP-2.
En otra realizacion, la celula hospedadora es una bacteria, tal como E. coli. En una realizacion relacionada, la celula de E. coli se selecciona entre el grupo que consiste en BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pGro7, ArcticExpress(DE3), C41 [tambien denominada C41(DE3)], C43 [tambien denominada c43(DE3)], Origami B(DE3), Origami B(DE3)pLysS, KRX, y Tuner(DE3). Ademas, en una realizacion adicional, la celula hospedadora comprende un vector como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la celula hospedadora se transforma con el vector antes del cultivo celular.
En ciertas realizaciones, se contempla que la celula hospedadora se cultive en un medio en condiciones adecuadas para la expresion de un polipeptido de fusion codificado por los polinucleotidos. En una realizacion, el polipeptido de fusion se expresa como una proteina soluble o como cuerpo de inclusion. En una realizacion relacionada, el polipeptido de fusion expresado se aisla de la celula hospedadora o medio de cultivo. Ademas, en otra realizacion, el polipeptido de fusion aislado se pone en contacto con un agente de escision como se describe en el presente documento.
Breve description de las figuras
La Figura 1 muestra expresion de proteinas de fusion a CNP en E. coli (Fig. 1A: tincion con azul de Coomassie, Fig 1B: transferencia de Western). M: marcador de proteina; T: lisados de celulas totales; S: sobrenadantes solubles; P: 2 ug de CNP22; KSI: expresion de proteina de fusion a KSI-CNP(M/N) (insoluble); N: lisados totales de proteina de fusion a KSI-CNP sin inducir; KSI': expresion de proteina de fusion a KSI-P-CNP (insoluble); Trx: expresion de proteina de fusion a Trx-P-CNP (soluble); MBP: expresion de proteina de fusion a MBP-P-CNP (soluble); TAF: expresion de proteina de fusion a TAF-P-CNP (insoluble) (BL21); TAF': expresion de proteina de fusion a TAF-P-CNP (insoluble) BL21(DE3), en la que CNP es Gly-CNP37.
La Figura 2 muestra la escision con acido formico de cuerpos de inclusion de TAF-CNP. M: marcador de proteina; 1: control positivo de Gly-CNP37; 2: cuerpos de inclusion de TAF-CNP sin escindir; 3: un 2 % de acido formico de cuerpos de inclusion de TAF-CNP escindidos, en el que CNP es Gly-CNP37.
Las Figuras 3A-E representan la expresion de proteinas de fusion a CNP en E. coli. M: marcador de proteina; Tu: lisados celulares sin inducir totales; Su: sobrenadantes solubles sin inducir; T: lisados celulares inducidos totales; S: sobrenadantes solubles; C1: CNP22; C: Gly-wtCNP37 ("CNP38"); P: sedimentos insolubles. A: KSI: expresion
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de protelna de fusion a KSI-CNP38(M/N) (Insoluble); KSI': expresion de protelna de fusion a KSI-Pro-CNP38 (Pro-Gly-wtCNP37 se denomina "Pro-CNP38") (Insoluble); Trx: expresion de fusion a Trx-Pro-CNP38 (Soluble); MBP: expresion de protelna de fusion a MBP-Pro-CNP38 (Soluble); TAF: expresion de protelna de fusion a TAF- Pro-CNP38 (Insoluble) de celulas BL21; TAF': expresion de protelna de fusion a TAF-Pro-CNP38 (Insoluble) de celulas BL21(DE3). B: expresion de protelna de fusion a TAF-Pro-CNP37 y BMP-Pro-CNP37. C: protelna de fusion a BMP-Pro-CNP38 y expresion de protelna de BMP. D: expresion de protelna de fusion a TAF-Pro-HSA- CNP ("Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 188) se denomina "Pro-HSA-CNP"). E: protelna de fusion a TAF-Pro-CNP38 y expresion de protelna de TAF.
Las Figuras 4A-C representan la escision con acido formico de cuerpos de inclusion de TAF-Pro-CNP38. A: un 50 % de escision con acido formico de sedimentos insolubles. M: marcador de protelna; U: sin escindir sedimentos insolubles; 25 °C, 37 °C, 42 °C, 55 °C: los sedimentos insolubles se escindieron en un 50 % de acido formico a 25 °C, 37 °C, 42 °C o 55 °C durante 24 horas. 37 °C-S y 55 °C-S: sobrenadantes solubles de las reacciones de escision a 37 °C y 55 °C neutralizados con NaOH 10 N y centrifugados a 14.000 rpm durante 15 minutos. B: 10 % y 2 % de escision con acido formico de sedimentos insolubles. M: marcador de protelna; U: sedimentos insolubles sin escindir; C: TAF-Pro-CNP38 escindido con acido formico; S: sobrenadante soluble despues de centrifugar a 14.000 rpm durante 5 minutos sin neutralizacion; P: sedimentos insolubles despues de centrifugar a 14.000 rpm durante 5 minutos sin neutralizacion. C: analisis de LC/MS de un 2 % y un 10 % de productos escindidos con acido formico a partir de sedimentos insolubles.
Las Figuras 5A-C representan la escision con acido formico de sedimentos insolubles a diferente temperatura y tiempo de escision con acido formico. M: marcador de protelna; C: control positivo de Gly-wtCNP37 ("CNP38"); U: sedimentos insolubles sin escindir. A: 2 % de TAF-Pro-CNP38 escindido con acido formico a 42 °C, 55 °C o 70 °C durante 6, 24 o 48 horas. B: 2 % de TAF-Pro-CNP38 escindido con acido formico a 55 °C, 60 °C, 65 °C o 70 °C durante 17 o 24 horas. C: analisis de LC/MS de un 2 % de productos escindidos con acido formico a partir de sedimentos insolubles.
La Figura 6 es una SDS-PAGE (tincion con azul de Coomassie) para la expresion de una protelna de fusion a TAF-CNP34. M: marcador de protelna; C: control [Gly-CNP37 ("CNP38")]; T: lisados de celulas totales; S: sobrenadante; TI: lisados de celulas totales inducidas; SI: sobrenadante inducido.
La Figura 7 es una SDS-PAGE (tincion con azul de Coomassie) para la expresion de protelnas de fusion TAF- NL-(C/A y 6D/6E)-Pro-CNP38, TAF(C/A y 10D/10E)-Pro-CNP38, y TAF-Pro-CNP53, en las que "Pro-CNP38" representa Pro-Gly-CNP37, M: marcador de protelna; C: control [Gly-CNP37 ("CNP38")]; T: lisados de celulas totales; TI: lisados de celulas totales inducidas; S: sobrenadante; SI: sobrenadante inducido.
La Figura 8 es una SDS-PAGE (tincion con azul de Coomassie) de los productos de escision con acido formico de las protelnas de fusion TAF-CNP34 y TAF-Pro-CNP53. M: marcador de protelna; P: control positivo de [Gly- CNP37 ("CNP38")]; U: sin escindir; C: escindido; CS: sobrenadante escindido; CP: sedimento escindido.
La Figura 9 es un cromatograma de LC/MS que muestra el pico para CNP-34 despues de escision con acido formico de TAF-CNP34.
La Figura 10 es un cromatograma de LC/MS que muestra el pico para Pro-CNP53 despues de escision con acido formico de TAF-Pro-CNP53.
La Figura 11 es una SDS-PAGE (tincion con azul de Coomassie) para la expresion de protelnas de fusion TAF(C/A y 4D/4E)-Pro-CNP38 y TAF(4D/4E)-Pro-CNP38, en las que "Pro-CNP38" representa Pro-Gly-CNP37, M: marcador de protelna; C: control [Gly-CNP37 ("CNP38")]; T: lisados de celulas totales; TI: lisados de celulas totales inducidas; S: sobrenadante; SI: sobrenadante inducido.
La Figura 12 es una SDS-PAGE (tincion con azul de Coomassie) de los productos de escision con acido formico de las protelnas de fusion TAF(4D/4E)-Pro-CNP38 y TAF(C/A y 4D/4E)-Pro-CNP38, en las que "Pro-CNP38" representa Pro-Gly-CNP37, M: marcador de protelna; P: control positivo de [Gly-CNP37 ("CNP38")]; U: sin escindir; C: escindido; CS: sobrenadante escindido; CP: sedimento escindido.
La Figura 13 es una SDS-PAGE (tincion con azul de Coomassie) de los productos de escision con acido formico de las protelnas de fusion TAF-NL-(C/A y 6D/6E)-Pro-CNP38 y TAF(C/A y 10D/10E)-Pro-CNP38, en las que "Pro-CNP38" representa Pro-Gly-CNP37, M: marcador de protelna; P: control positivo de [Gly-CNP37 ("CNP38")]; U: sin escindir; C: escindido; CS: sobrenadante escindido; CP: sedimento escindido.
La Figura 14 es una transferencia de Western, usando un anticuerpo anti-CNP, de una protelna de fusion de of a TAF-Pro-CNP38 producida en una fermentacion de 10 l de celulas BL21(DE3), en la que las celulas indujeron a DO600 = 64 y hora 17 y "Pro-CNP38" representa Pro-Gly-CNP37.
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La Figura 15 es una SDS-PAGE (tincion con azul de Coomassie) de fracciones de eluato de cromatografla de intercambio cationico de SP-Sepharose de un producto de Pro-Gly-CNP37 ("Pro-CNP38") en bruto. A: cuerpo de inclusion (IB) de TAF-Pro-CNP38 en agua; B: IB en formiato; C: IB en formiato, neutralizado; D: sedimento o neutralizado; E: sobrenadante neutralizado; F: carga de TMAE Hi-CAP; G: flujo continuo de TMAE Hi-CAP/carga de SP-Sepharose; H: flujo continuo de SP-Sepharose; fracciones 1-47 de eluato de SP-Sepharose: 10 ul/calle.
La Figura 16 muestra el grado de resistencia de conjugados de CNP22 PEGilado N-terminal a endopeptidasa neutra (NEP) in vitro.
La Figura 17 representa el grado de resistencia a NEP de variantes de CNP que tienen una prolongacion de aminoacido en el extremo N-terminal ["CNP27" es GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36)].
La Figura 18 ilustra el grado de resistencia a NEP de CNP17 y GANRR-CNP22(K4R) ("CNP27") PEGilado N- terminal (SEQ ID NO: 36).
La Figura 19 ilustra el grado de resistencia a NEP de wtCNP22 y las variantes de CNP, Gly-CNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 ("CNP27-HSA" en las figuras) (SEQ ID NO: 144) y PEO12-GANRR-CNP22(K4R) ("CNP27-PEO12" en las figuras) (SEQ ID NO: 36).
La Figura 20 muestra la capacidad de las variantes de CNP que tienen una prolongacion de aminoacido N- terminal para estimular la produccion de cGMP en celulas NIH3T3 in vitro. Los resultados son con respecto al nivel de cGMP producido en presencia de CNP22 1 uM. "CNP27" es GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).
La Figura 21 presenta la capacidad de CNP17 y GANRR-CNP22(K4R) ("CNP27") PEGilado N-terminal (SEQ ID NO: 36) para estimular la produccion de cGMP en celulas NIH3T3.
La Figura 22 ilustra los efectos de la PEGilacion N-terminal de CNP22 en la produccion de cGMP.
La Figura 23 ilustra la produccion de cGMP inducida por wtCNP22 y las variantes de CNP, Gly-CNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 ("CNP27-HSA") (SEQ ID NO: 144), wtCNP29 y PEO12-GANRR-CNP22(K4R) ("CNP27-PEO12") (SEQ ID NO: 36), en celulas NIH3T3.
Las Figuras 24A y B muestran que CNP-22 y Pro-Gly-CNP37 ("Pro-CNP38") estimulaban la produccion de cGMP a traves de NPR-B con curvas de dosis-respuestas similares, y esta un alcance mucho mayor que a traves de NPR-A, y presentaban un perfil similar para la selectividad de NPR-B con respecto a la de NPR-C en los ensayos de competicion de senalizacion in vitro.
La Figura 25 demuestra que la exposicion de celulas de condrosarcoma de ratas a CNP22 1 hora una vez al dla o 2 horas una vez al dla tiene una eficacia sustancialmente similar en la inversion de la parada inducida por FGF2 del crecimiento de condrocitos como una exposicion continua a CNP22.
Las Figuras 26A y B muestran resultados de un estudio de respuesta a la dosis de efectos de CNP22 en celulas de condrosarcoma de rata (RCS) detenidas con FGF2.
Las Figuras 27A-D muestran que la adicion de CNP22 a celulas RCS detenidas por FGF2 aumenta la slntesis de la matriz e inhibe parcialmente a FGF2, tal como se evalua mediante la incorporacion de 35S-sulfato y 3H-Pro en o la disminucion de la matriz. Paneles A y C, slntesis; B y D, degradation; A y B, medicion de 35S; C y D, medicion de 3H. Las diferencias estadlsticamente significativas se resaltan (ANOVA; *p<0,05, **p<0,01).
Las Figuras 28A-C muestran los niveles de produccion de agrecano y fibronectina (ARNm, paneles A y C, y protelna, panel B) en celulas RCS cultivadas con FGF2 y CNP22.
La Figura 29 muestra la eficacia de CNP37 y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) ("CNP27-PEO24" en las figuras) (SEQ ID NO: 36) en la estimulacion del crecimiento longitudinal del femur de tipo silvestre en un modelo de organo de raton ex vivo.
La Figura 30 muestra crecimiento de hueso longitudinal de tibias de raton de tipo silvestre de 2-3 dlas de edad tratadas con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) cada dos dlas. Los resultados se normalizan a mediciones antes del tratamiento (dla 0). Los datos se representan como media ± ETM (n = 8).
La Figura 31 muestra crecimiento de hueso longitudinal de tibias de raton FGFR3ac acondroplasico de 2-3 dlas de edad tratadas con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) cada dos dlas. Los resultados se normalizan a mediciones antes del tratamiento (dla 0). Los datos se representan como media ± ETM (n = 7-8).
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La Figura 32 muestra crecimiento de hueso longitudinal de femures de raton de tipo silvestre de 2-3 dlas de edad tratados con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) cada dos dlas. Los resultados se normalizan a mediciones antes del tratamiento (dla 0). Los datos se representan como media ± ETM (n = 8).
La Figura 33 muestra crecimiento de hueso longitudinal de femures de raton FGFR3ac de 2-3 dlas de edad tratados con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) cada dos dlas. Los resultados se normalizan a mediciones antes del tratamiento (dla 0). Los datos se representan como media ± ETM (n = 3-7).
Las Figuras 34A-I representan la biodistribucion de CNP37 en femures de raton FGFR3ac tratados ex vivo cada dos dlas. Los Paneles A-C ilustran la distribucion en femures distales, los paneles D-F ilustran la distribucion en condrocitos articulares y los paneles G-I ilustran la distribucion en condrocitos hipertroficos.
Las Figuras 35A-C representan la celularidad de columnas proliferantes en placas de crecimiento despues de tratamiento de femures de raton de tipo silvestre y FGFR3ac con CNP22 o CNP37 cada dos dlas durante 8 dlas. (A) sin tratamiento, (B) numero de celulas por columna despues del tratamiento, (C) estudios morfologicos despues del tratamiento. Los paneles en la Fig 35C(i) a C(vi) corresponden al orden de la muestra establecido en la Fig. 35B. Los datos se representan como media ± ETM (n = 4-8).
Las Figuras 36A-C representan la hipertrofia de condrocitos despues de tratamiento ex vivo de femures de raton de tipo silvestre y FGFR3ac con CNP22 o CNP37 cada dos dlas durante 8 dlas. (A) sin tratamiento, (B) tamano celular despues del tratamiento, (C) estudios morfologicos despues del tratamiento. Los paneles en la Fig 36C(i) a C(vi) corresponden al orden de la muestra establecido en la Fig. 36B. Los datos se representan como media ± ETM (n = 4-9).
Las Figuras 37A-I representan la biodistribucion de CNP37 en tibias de raton FGFR3ac tratadas in vivo. Los paneles A-C muestran la distribucion en femures distales, los paneles D-F ilustran la distribucion en condrocitos articulares y los paneles G-I ilustran la distribucion en condrocitos hipertroficos.
Las Figuras 38A-C ilustran los efectos in vivo de CNP37 en placa de crecimiento de tibias de raton FGFR3ac: (A) espesor total de la placa de crecimiento, (B) espesor de la zona proliferante, y (C) espesor de la zona hipertrofica. Los datos se representan como media ± ETM (n = 7-15).
La Figura 39 muestra los niveles de cGMP en medios acondicionados de femures de raton de tipo silvestre tratados ex vivo con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) ("CNP27-PEO24") (SEQ ID NO: 36) (p < 0,01).
La Figura 40 muestra los niveles de cGMP en medios acondicionados de femures de raton FGFR3ac tratados ex vivo con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (p < 0,01).
La Figura 41 representa los niveles de cGMP en medios acondicionados de tibias de raton de tipo silvestre tratadas ex vivo con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (p < 0,01).
La Figura 42 muestra los niveles de cGMP en medios acondicionados de tibias de raton FGFR3ac tratadas ex vivo con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (p < 0,01).
La Figura 43 demuestra que la exposicion ex vivo de femures de raton de tipo silvestre y FGFR3ac a CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) aumentaba los niveles de colageno de tipo II escindido en los medios acondicionados (p < 0,05).
La Figura 44 representa la region hipertrofica de huesos femorales aislados de ratones de tipo silvestre y ratones FGFR3Y367C (un modelo de raton de acondroplasia grave) y tratados ex vivo con vehlculo o Pro-Gly-CNP37 1 uM ("ProCNP38") durante 6 dlas, demostrando que el tratamiento con Pro-Gly-CNP37 daba como resultado un aumento en el crecimiento de hueso y una prolongacion en la placa de crecimiento.
La Figura 45 muestra que CNP37 y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) administrados por via intravenosa (i.v.) a ratas tienen una semivida mucho mas larga y una biodisponibilidad mucho mayor en el plasma que CNP22.
La Figura 46 ilustra que PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) administrado por via subcutanea (s.c.) A ratas tambien tiene una semivida mucho mas larga y una biodisponibilidad mucho mayor en el plasma que CNP22.
La Figura 47 demuestra que CNP37 y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) administrados i.v. estimulan un nivel mucho mas elevado de produccion de cGMP en ratas que CNP22.
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La Figura 48 muestra que PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) administrado s.c., y en menor medida, CNP37 son sustancialmente mas eficaces en la estimulacion de la produccion de cGMP en ratas que CNP22.
La Figura 49 muestra mediciones de peso corporal de ratones de tipo silvestre tratados con Gly-CNP37 o PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).
La Figura 50 muestra mediciones de longitud de la cola de ratones de tipo silvestre tratados con Gly-CNP37 o PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).
La Figura 51 ilustra el efecto del tratamiento de ratones FGFR3ac con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR- CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) en la longitud corporal (p = 0,02, ensayo unilateral, varianza desigual).
La Figura 52 muestra el efecto de CNP22, CNP37 y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) en la longitud de la cola en ratones FGFR3ac.
Las Figuras 53A y B muestran el efecto de CNP22, CNP37 y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) en la longitud de huesos largos distales (A, cubito; B, tibia) en ratones FGFR3ac (p<0,01, ensayo unilateral, varianza desigual).
Las Figuras 54A y B muestran el efecto de CNP22, CNP37 y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) en la longitud de huesos proximales (A, humero; B, femur) en ratones FGFR3ac (p<0,01, ensayo unilateral, varianza desigual).
La Figura 55 ilustra que la administracion de CNP37 corrige la rizomelia (desproporcion de la longitud de las extremidades proximales) tal como se evalua con la proporcion de femur:tibia observada en ratones FGFR3ac (p<0,01, ensayo unilateral, varianza desigual).
La Figura 56 muestra el efecto de CNP22, CNP37 y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) en la longitud de la cabeza en ratones FGFR3ac (p<0,01 ensayo unilateral, varianza desigual).
La Figura 57 muestra que el tratamiento de ratones FGFR3ac con CNP37 aumenta el tamano del conducto auditivo externo (EAM) (P = 0,03, ensayo unilateral, varianza desigual).
La Figura 58 muestra el efecto de CNP22, CNP37 y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) en la longitud espinal en ratones acondroplasicos, expresado como una prolongation de cuerpos vertebrales (por ejemplo, vertebra lumbar 5).
La Figura 59 muestra que el tratamiento de ratones FGFR3ac con CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) da como resultado un aumento de los niveles en plasma de cGMP 15 minutos despues de la dosis.
La Figura 60 ilustra los niveles en suero de colageno de tipo II escindido en ratones FGFR3ac tratados 5 semanas con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).
La Figura 61 muestra los niveles en suero de osteocalcina en ratones FGFR3ac tratados 5 semanas con CNP22, CNP37 o PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).
La Figura 62 muestra los niveles en plasma de cGMP 15 minutos despues de la dosis de ratones de tipo silvestre tratados con Gly-CNP37 o PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) (p < 0,05).
La Figura 63 muestra los niveles en suero de colageno de tipo II escindido en ratones de tipo silvestre tratados 5 semanas con Gly-CNP37 o PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36).
Las Figuras 64-66 presentan los niveles de cGMP, colageno de tipo II escindido y fosfatasa alcalina despues de la administracion de vehlculo o 20 nmol/kg o 70 nmol/kg de Pro-Gly-CNP37 ("Pro-CNP38") a ratones de tipo silvestre.
Las Figuras 67 y 68 representan los niveles de colageno de tipo II escindido y fosfatasa alcalina total despues de la administracion de vehlculo o Pro-Gly-CNP37 ("Pro-CNP38") en diferentes reglmenes de dosificacion.
La Figura 69 ilustra el aumento relativo en la longitud corporal de animales tratados con Pro-Gly-CNP37 ("Pro- CNP38") y vehlculo en dos estudios separados (S1 y S2) en el Dla 37 con respecto al Dla 1.
Las Figuras 70A y B muestran cambios en la densidad mineral en el hueso (A) y en el contenido de mineral en el hueso (B) despues de la administracion de Pro-Gly-CNP37 ("Pro-CNP38").
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La Figura 71 muestra los niveles de cGMP en plasma 15 min despues de la ultima dosis subcutanea de la variante de CNP, Dia 36, en la que Gly-wtCNP37 es "CNP38", Pro-Gly-wtCNP37 es "Pro-CNP38", y GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO: 144) es "HSA-CNP27" en las Figuras 71-73.
La Figura 72 muestra niveles en suero de colageno de tipo II escindido de ratones tratados con Gly-CNP37, Pro- Gly-CNP37 o GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO: 144).
La Figura 73 muestra niveles en suero de fosfatasa alcalina de ratones tratados con Gly-CNP37, Pro-Gly-CNP37 o GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO: 144).
Las Figuras 74A y B representan la desensibilizacion de la respuesta de cGMP despues de tratamiento agudo (A) o cronico (B) con Gly-CNP37 1 uM.
La Figura 75A demuestra que el tratamiento diario de ratones de tipo silvestre con 200 nmol/kg de Pro-Gly- CNP37 ("Pro-CNP38") durante 8 dias no desensibiliza la respuesta de cGMP. La Figura 75B muestra que el tratamiento de los ratones con 200 nmol/kg de Pro-Gly-CNP37 una vez al dia durante dos dias consecutivos potenciaba la respuesta de cGMP.
Las Figuras 76A-D muestran que el tratamiento de ratones de tipo silvestre con 200 nmol/kg de Gly-CNP37 estimulaba la secrecion de cGMP en femures distales (cartilago y hueso) (A), cortezas femorales (hueso) (B), pabellon auricular (cartilago) (C), y rinon (D). Las Figuras 76E-H muestran que los tejidos de higado (E), corazon (F), pulmon (G) y cerebro (H) no presentaban una secrecion de cGMP apreciable como respuesta a Gly-CNP37 con respecto al control de vehiculo en los momentos estudiados.
Las Figuras 77-82 muestran resultados de un estudio en desarrollo en monos cinomolgos jovenes normales a los que se inyecta por via subcutanea diariamente el vehiculo o 10 o 36 ug/kg de Pro-Gly-CNP37. Ambas dosis de Pro-Gly-CNP37 presentan un aumento del ancho de la placa de crecimiento (Figura 77), aumento de las longitudes de las tibias derecha e izquierda (Figuras 78A y B), aumento de la longitud de la pierna (Figura 79), aumento de la longitud del brazo (Figura 80), aumento de la longitud corporal (Figura 81), y aumento del nivel en suero de fosfatasa alcalina (Figura 82).
La Figura 83 representa la representation observada de la constante de tasa de degradation (Kobs) con respecto al pH a pH 3-8 y 5 °C, 25 °C y 40 °C para las formulaciones de Gly-CNP37.
Description detallada de la divulgation
La presente divulgacion se refiere a nuevas variantes de CNP que tienen una reduction de la afinidad con respecto a NEP y/o NPR-C, y una reduccion de la susceptibilidad a la escision con NEP y/o elimination con nPR-C, composiciones farmaceuticas que comprenden tales variantes de CNP, y metodos de uso de tales variantes de CNP para tratar trastornos sensibles a CNP, que incluyen, pero no se limitan a, trastornos relacionados con los huesos tales como acondroplasia y trastornos asociados con celulas y tejidos del musculo liso vascular.
A. Definiciones
A menos que se indique de otro modo, los siguientes terminos usados en la presente solicitud, incluyendo la the memoria descriptiva y las reivindicaciones, tienen las definiciones que se proporcionan a continuation.
Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, los articulos indefinidos "un" y "uno" y el articulo definido "el" incluyen referentes en plural asi como en singular a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.
El termino "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a un error aceptable para un valor en particular tal como lo determina un experto habitual en la materia, que depende en parte de como se mide o se determina el valor. En ciertas realizaciones, el termino "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a dentro de 1, 2, 3 o 4 desviaciones estandar. En ciertas realizaciones, el termino "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a dentro de un 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, o un 0,05 % de un valor o intervalo dado. Siempre que el termino "alrededor de" o "aproximadamente" preceda al primer valor numerico en una serie de dos o mas valores numericos, se entiende que el termino "alrededor de" o "aproximadamente" se aplica a cada uno de los valores numericos en esa serie.
Los terminos "temperatura ambiente" y "temperatura ambiente" se usan indistintamente en el presente documento y hacen referencia a la temperatura del entorno circundante (por ejemplo, la habitation en la que se realiza una reaction o se almacena una composition). En ciertas realizaciones, la temperatura ambiente o la temperatura de la habitacion esta en un intervalo de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 28 °C, o de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 28 °C, o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 22 °C a aproximadamente 28 °C, o de aproximadamente 22 °C a
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aproximadamente 25 °C. En otras realizaciones, la temperatura ambiente o la temperatura de la habitacion es de aproximadamente 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C o 28 °C.
La definicion de terminos de qulmica convencional se puede encontrar en trabajos de referencia, que incluyen Carey y Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3a Edicion, Vols. A y B (Plenum Press, New York 1992). La practica de la presente divulgacion puede usar, a menos que se indique de otro modo, ciertos metodos convencionales de qulmica organica sintetica, espectrometrla de masas, cromatografla preparativa y analltica, qulmica de protelnas, bioqulmica, tecnologla de ADN recombinante y farmacologla, dentro de la experiencia en la materia. Vease, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman y Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4a Edicion, 2004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edicion, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990).
Las siguientes abreviaturas de aminoacidos se usan a traves de todo el texto:
Alanina: Ala (A) Asparagina: Asn (N) Cistelna: Cys (C)
Acido glutamico: Glu (E) Histidina: His (H) Leucina: Leu (L) Metionina: Met (m) Prolina: Pro (P) Treonina: Thr (T) Tirosina: Tyr (Y)
Arginina: Arg (R)
Acido aspartico: Asp (D) Glutamina: Gln (Q) Glicina: Gly (G) Isoleucina: Ile (I)
Lisina: Lys (K) Fenilalanina: Phe (F) Serina: Ser (S) Triptofano: Trp (W) Valina: Val (V)
"Polipeptido" y "protelna" se refieren a un pollmero formado por restos de aminoacidos, variantes estructurales relacionadas de origen natural, y analogos sinteticos que se producen de forma natural de los mismos, unidos a traves de enlaces peptldicos o isoesteres de enlace peptldico. Los polipeptidos sinteticos se pueden sintetizar, por ejemplo, usando un sintetizador de polipeptidos automatizado. Los terminos "polipeptido" y "protelna" no estan limitados a una longitud minima del producto. El termino "protelna" por lo general se refiere a polipeptidos grandes. El termino "peptido" por lo general se refiere a polipeptidos cortos. Por lo tanto, peptidos, oligopeptidos, dimeros, multimeros, y similares, estan incluidos dentro de la definicion. En la definicion estan incluidas tanto las proteinas de longitud completa como fragmentos de las mismas. Los terminos "polipeptido" y "proteina" tambien incluyen modificaciones del polipeptido o proteina despues de su expresion, por ejemplo, glicosilacion, acetilacion, fosforilacion y similares. Ademas, para fines de la presente divulgacion, un "polipeptido" puede incluir "modificaciones", tales como deleciones, adiciones, sustituciones (que pueden ser de naturaleza conservativa o pueden incluir sustituciones con cualquiera de los 20 aminoacidos que normalmente estan presentes en proteinas humanas, o cualquier otro aminoacido de origen natural o no natural o atlpico), y modificaciones qulmicas (por ejemplo, adicion de dos sustituciones con peptidomimeticos), a la secuencia nativa. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, tal como a traves de mutagenesis dirigida al sitio, o a traves de modificacion qulmica de aminoacidos para retirar o unir restos qulmicos, o pueden ser accidentales, tal como a traves de mutaciones que surgen con hospedadores que producen las proteinas o a traves de errores debidos a la amplificacion de PCR.
En el presente documento se usa una notacion convencional para representar secuencias de polipeptidos: el final hacia el lado izquierdo de una secuencia de polipeptidos es el extremo amino-terminal; el final hacia el lado derecho de una secuencia de polipeptidos es el extremo carboxilo-terminal.
"Sustitucion conservativa" se refiere a una sustitucion de un aminoacido en un polipeptido con un aminoacido natural o no natural, funcional, estructurado qulmicamente similar. En una realization, cada uno de los siguientes grupos contiene aminoacidos naturales que son sustituciones conservativas entre si:
(1) Alanina (A) Serina (S), Treonina (T);
(2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E);
(3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
(4) Arginina (R), Lisina (K);
(5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
(6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
En otra realizacion, cada uno de los siguientes grupos contiene aminoacidos naturales que son sustituciones conservativas entre si:
(1) Glicina (G), Alanina (A);
(2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E);
(3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
(4) Arginina (R), Lisina (K);
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(5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V), Alanina (A);
(6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); y
(7) Serina (S), Treonina (T), Cistelna (C).
En una realizacion mas, los aminoacidos se pueden agrupar como se establece a continuacion:
(1) hidrofobos: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp;
(2) hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) acidos: Asp, Glu;
(4) basicos: His, Lys, Arg;
(5) restos que influyen en la orientacion de la estructura principal: Gly, Pro; y
(6) aromaticos: Trp, Tyr, Phe, His.
En una realizacion, los peptidos o polipeptidos que se describen en el presente documento se generan a traves de medios recombinantes, usando un polinucleotido que codifica una variante de CNP. Por lo tanto, la divulgacion incluye polinucleotidos que codifican cualquiera de las variantes de CNP que se describen en el presente documento, celulas hospedadoras o vectores que comprenden tales polinucleotidos, unidos opcionalmente a secuencias de control de expresion, y metodos de uso de tales polinucleotidos, vectores o celulas hospedadoras para producir variantes de CNP de la divulgacion. Las variantes de CNP expresadas por tales polinucleotidos se pueden producir con metodos que incluyen cultivar de celulas hospedadoras en medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresion del polinucleotido que codifica una variante de CNP, y aislar el producto de expresion product de las celulas hospedadoras o medio de cultivo. Los productos de expresion reales pueden variar ligeramente del producto de protelna codificada dependiendo de cualquier procesamiento posterior a la traduccion.
"Polinucleotido" se refiere a un pollmero formado por unidades de nucleotido. Los polinucleotidos incluyen acidos nucleicos de origen natural, tales como acido desoxirribonucleico ("ADN") y acido ribonucleico ("ARN") as! como analogos de acido nucleico. La expresion "acido nucleico" por lo general se refiere a polinucleotidos grandes. El termino "oligonucleotido" por lo general se refiere a polinucleotidos cortos, por lo general no superiores a aproximadamente 50 nucleotidos. Se entendera que cuando una secuencia de nucleotidos se representa con una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), la secuencia de nucleotidos tambien incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que "U" sustituye a "T". "ADNc" se refiere a un ADN que es complementario o identico con un ARNm, en cualquier forma monocatenaria o bicatenaria.
"Secuencia de control de la expresion" se refiere a una secuencia de nucleotidos que regula la expresion de una secuencia de nucleotidos unida a la misma de forma operativa. "Unida de forma operativa" se refiere a una relacion funcional entre dos partes en las que la actividad de una parte (por ejemplo, la capacidad para regular la transcripcion) da como resultado una accion en la otra parte (por ejemplo, transcripcion de la secuencia). La expresion de secuencias de control puede incluir, por ejemplo y sin limitation, secuencias de promotores (por ejemplo, inducibles o constitutivos), potenciadores, terminadores de la transcripcion, un codon de inicio (es decir, ATG), senales de corte y empalme para intrones, y codones de parada.
"Polinucleotido recombinante" se refiere a un polinucleotido que tiene secuencias que no se unen de forma natural entre si. Un polinucleotido recombinante amplificado o ensamblado se puede incluir en un vector adecuado, y el vector se puede usar para transformar una celula hospedadora adecuada. Una celula hospedadora que comprende el polinucleotido recombinante se denomina "celula hospedadora recombinante". A continuacion, el gen se expresa en la celula hospedadora recombinante para producir, por ejemplo, un "polipeptido recombinante". Un polinucleotido recombinante tambien puede servir para una funcion no codificante (por ejemplo, promotor, origen de replication, sitio de union a ribosoma, etc.).
"Quimera", como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleotido o polipeptido que comprende al menos dos secuencias heterologas de polinucleotidos o polipeptidos (es decir, que se obtienen a partir de diferentes fuentes o no se asocian entre si como una secuencia de origen natural) que se unen o relacionan directa o indirectamente usando tecnicas usadas normalmente en la tecnica, por ejemplo, expresion recombinante o reticulation qulmica. En una realizacion, la secuencia heterologa puede comprender una protelna o peptido unido directa o indirectamente a un peptido o variante de CNP, que incluye protelna su peptidos que se pueden escindir del peptido o variante de CNP. En una realizacion relacionada, las variantes de CNP son quimeras como se describe en el presente documento.
En ciertas realizaciones, las quimeras incluyen protelnas de fusion a CNP que comprenden una etiqueta de protelna o peptido vehlculo escindible. La expresion "protelna vehlculo escindible" o "etiqueta peptldica escindible" se refiere a una secuencia de peptidos o polipeptidos que se puede fusionar, directa o indirectamente a traves de un conector, a una secuencia de polipeptidos heterologa, y que se puede retirar de la secuencia heterologa usando una gente que escinde o separa del peptido o polipeptido escindible del polipeptido o protelna heterologos. En algunas realizaciones, la etiqueta de protelna o peptido vehlculo escindible aumenta la generation, purification y/o detection de la protelna de fusion o el polipeptido heterologo. Las p etiquetas de protelnas y peptidos vehlculo escindibles a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, factor de transcripcion humano TAF12 (TAF12), cetosteroide
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isomerasa (KSI), protelna de union a maltosa (MBP), p-galactosidasa (p-gal), glutation-S-transferasa (GST), tiorredoxina (Trx), dominio de union a quitina (cBd), mutacion BMP-2 (bMpM), SUMO, CAT, TrpE, protelna A estafilococica, protelnas estreptococicas, protelna de union a almidon, dominio de endoglucanasa A de union a celulosa, dominio de endoglucanasa Cex de union a celulosa, dominio de union a biotina, recA, Flag, c-Myc, poli(His), poli(Arg), poli(Asp), poli(Gln), poli(Phe), poli(Cys), protelna fluorescente de color verde, protelna fluorescente de color rojo, protelna fluorescente de color amarillo, protelna fluorescente de color cian, biotina, avidina, estreptavidina, epltopos de anticuerpo, y fragmentos de los mismos.
Un "agente de escision" es un agente que es util para escindir o separar, por ejemplo, a un peptido o polipeptido escindible de un polipeptido o protelna heterologos. Los agentes de escision a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, paladio, bromuro de cianogeno (CNBr), acido formico, hidroxilamina, clostridolor, trombina, quimotripsina, tripsina, proteasas similares a la tripsina, carboxipeptidasa, enteroquinasa (enteropeptidasa), proteasa de Kex 2, proteasa de Omp T, proteasa de Factor Xa, subtilisina, proTEV, proteasa de SUMO, proteasa de V8, proteasa del VIH, proteasa de rinovirus, proteasa de furilisina, proteasas de IgA, proteasa de Pace humano, colagenasa, proteasa de Nia, proteasa de 2Apro de poliovirus, proteasa de 3C de poliovirus, genenasa, furina, elastasa, Proteinasa K, pepsina, renina (quimosina), proteasas asparticas microbianas, padolor, caldolor, quimopadolor, ficina (ficalna), bromelalna (bromelasa), catespisina B, caspasas, termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, kalikrelna, y plasmina.
Los terminos "identico" y porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o mas secuencias de polinucleotidos o polipeptidos, se refieren a dos o mas secuencias o sub secuencias que son las mismas obtienen un porcentaje especificado de nucleotidos o restos de aminoacidos que son los mismos, cuando se comparan y se alinean para correspondencia maxima, tal como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual.
La expresion "sustancialmente homologo" o "sustancialmente identico", en el contexto de dos acidos nucleicos o polipeptidos, por lo general se refiere a dos o mas secuencias o sub secuencias que tienen una identidad del resto de nucleotidos o aminoacidos de al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o un 98 %, cuando se compara y se alinea para correspondencia maxima, tal como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. En ciertas realizaciones, la homologla o identidad sustancial existe con respecto a regiones de las secuencias que tienen una longitud de al menos aproximadamente su 25, 50, 100 o 150 restos. En otra realizacion, las secuencias son sustancialmente homologo asco identicas con respecto a la toda la longitud de cualquiera o ambos biopollmeros de comparacion.
Para comparacion de secuencias, por lo general una secuencia actua como una secuencia de referencia a, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se disenan coordenadas de subsecuencias, si fuera necesario, y se disenan parametros de programa de algoritmo de secuencias. A continuacion, el algoritmo de comparacion de secuencias calculo el porcentaje de identidad de secuencias para la secuencia o secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basandose en los parametros del programa designados.
El alineamiento optimo de las secuencias para su comparacion se puede realizar, por ejemplo, con el algoritmo de homologla local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981), con el algoritmo de alineamiento de homologla de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970), mediante la busqueda con el metodo de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informaticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Grupo de Genetica Informatica, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion visual. Un ejemplo de un algoritmo util es PILEUP, que usa una simplificacion del metodo de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol., 35: 351-360 (1987) y es similar al metodo que describen Higgins y Sharp, CABIOS, 5: 151153 (1989). Otro algoritmo util para generar alineamientos multiples de secuencias es Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y similitud de secuencias es el algoritmo BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915 (1989); Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787 (1993)). El software para realizar analisis de BLAST esta disponible al publico a traves del Centro Nacional para Informacion de Biotecnologla.
Una indicacion adicional de que dos secuencias de acidos nucleicos o polipeptidos son sustancialmente homologas o homologas es que el polipeptido codificado por el primer acido nucleico tiene una reactividad cruzada de forma inmunologica con el polipeptido codificado por el segundo acido nucleico, como se describe a continuacion. Por lo tanto, un polipeptido por lo general es sustancialmente identico a un segundo polipeptido, por ejemplo, en el que los dos polipeptidos se diferencian solamente por sustituciones conservativas. Otra indication de que las secuencias de acidos nucleicos son sustancialmente identicas es que las dos moleculas se hibridan entre si en condiciones rigurosas, como se describe en el presente documento.
"Sustancialmente pura" o "aislada" se refiere a una especie objeto que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar, mas abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composition),
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y una fraccion sustancialmente purificada es una composicion en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente un 50 % (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En una realizacion, una composicion sustancialmente pura se refiere a que la especie de interes comprende al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o mas de las especies macromoleculares presentes en la composicion en una base molar o de peso. La especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composicion con metodos de detection convencionales) si la composicion consiste esencialmente en una sola especie macromolecular. Las especies de disolvente, moleculas pequenas (< 500 Daltons), estabilizantes (por ejemplo, BSA), y especies ionicas elementales no se consideran especies macromoleculares para fines de la presente definition. En una realizacion, los compuestos de la divulgation son sustancialmente puros o aislados. En otra realizacion, los compuestos de la divulgation son sustancialmente puros o aislados con respecto a los materiales de partida macromoleculares usados en su production. En otra realizacion mas, las composiciones farmaceuticas de la divulgacion comprenden una variante de CNP sustancialmente pura o aislada en combination con uno o mas excipientes, vehlculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente con otro agente biologicamente activo.
"De origen natural" tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que el objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptidos o polinucleotidos que esta presente en un organismo (incluyendo virus) y que no ha sido modificado de forma intencionada por el ser humano en el laboratorio es de origen natural. En una realizacion, una sustancia "de origen natural" es de origen humano.
"Tipo silvestre" (wt) es un termino que se refiere a la forma natural, incluyendo la secuencia, de un polinucleotido, polipeptido o protelna en una especie. Una forma de tipo silvestre se distingue de una forma mutante de un polinucleotido, polipeptido o protelna que surge de una mutation o mutaciones geneticas.
En una realizacion, un primer polipeptido que es un "analogo" o "variante" o "derivado" de un segundo polipeptido es un polipeptido que tiene una homologla de secuencias de al menos aproximadamente un 50 %, 60 % o 70 %, pero una homologla de secuencia es inferior a un 100 %, con el segundo polipeptido. Tales analogos, variantes o derivados pueden estar comprendidos por restos de aminoacidos de origen no natural, que incluyen, pero no se limitan a, homoarginina, ornitina, penicilamina, y norvalina, as! como restos de aminoacidos de origen natural. Tales analogos, variantes o derivados tambien ponen estar formados por uno o una pluralidad de restos de D- aminoacidos, y tambien pueden contener peptidomimeticos o isoesteres de enlace peptldico tales como enlaces no peptldicos entre dos o mas restos de aminoacido o peptidomimetico. En otra realizacion, un primer polipeptido es un "analogo", "variante" o "derivado" de un segundo polipeptido si el primer polipeptido no es un producto de escision conocido del segundo polipeptido o no es un precursor conocido del segundo polipeptido, incluso si el primer polipeptido tiene una homologla de secuencias de un 100 % con respecto al segundo polipeptido o tiene una secuencia de tipo silvestre.
En una realizacion, la expresion "obtenida a partir de", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polipeptidos o peptidos que se basa en una secuencia de polipeptidos o peptidos de tipo silvestre o de origen natural y que puede tener una o mas deleciones, adiciones, y/o sustituciones con aminoacidos naturales, o peptidomimeticos no naturales. En una realizacion, la secuencia derivada comparte una similitud de secuencias de al menos aproximadamente un 40 %, 50 %, 60 % o un 70 %, pero inferior a un 100 %, con la secuencia de tipo silvestre o de origen natural (por ejemplo, homologa en al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o un 95 %) con respecto al polipeptido de tipo silvestre con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoacidos. Ademas, en otra realizacion, un polipeptido se "obtiene a partir de" un polipeptido de tipo silvestre se tiene un resto (por ejemplo, un pollmero tal como, por ejemplo, PEG) unido directa o indirectamente al mismo que no esta presente en el polipeptido de tipo silvestre, incluso si ambos polipeptidos comparten una homologla de un 100 % en su secuencia de aminoacidos.
Como se usa en el presente documento, un polipeptido "derivado de NPPC" se refiere a un polipeptido tenido a partir del polipeptido precursor de peptido natriuretico C (NPPC), que es un pre-pro polipeptido de 126 aminoacidos de una sola cadena, y que por ultimo despues de escision da como resultado wtCNP22. La retirada del peptido senal de NPPC proporciona pro-CNP, y la escision adicional con la endoproteasa furina genera un peptido de 53 aminoacidos activo (CNP-53), que se secreta y se escinde de nuevo con una enzima desconocida para producir el peptido de 22 aminoacidos maduro (CNP, o CNP-22). Por lo tanto, el propio CNP22 es un polipeptido "derivado de NPPC" en virtud de su obtencion a partir de NPPC. En una realizacion, un polipeptido derivado de NPPC es homologo en al menos aproximadamente un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o un 95 % con el NPPC de tipo silvestre con respecto al mismo numero de restos de aminoacidos. Ademas, se contempla que un peptido derivado de NPPC puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 53, o de 1 a 37, o de 1 a 35, o de 1 a 31, o de 1 a 27, o de 1 a 22, o de 10 a 35, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 37 restos del polipeptido NPPC. En una realizacion, un peptido derivado de NPPC puede comprender una secuencia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, o 53 aminoacidos obtenida a partir del polipeptido NPPC.
La expresion "cantidad eficaz" se refiere a una dosificacion suficiente para producir un resultado deseado en una afeccion, patologla o enfermedad en la salud de un sujeto o para un fin de diagnostico. El resultado deseado puede
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comprender una mejora subjetiva u objetiva en el receptor de la dosificacion. "Cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente eficaz para producir el efecto beneficioso pretendido en la salud. Una cantidad "eficaz" apropiada en cualquier caso individual la puede determinar alguien con experiencia habitual en la materia usando experimentacion de rutina. Se entendera que el nivel de dosis especlfica y la frecuencia de la dosificacion para cualquier paciente en particular puede variar y dependera de una diversidad de factores, que incluyen la actividad del compuesto especlfico usado; la biodisponibilidad, estabilidad metabolica, tasa de excrecion y duracion de la accion de ese compuesto; el modo y tiempo de administracion del compuesto; la edad, peso corporal, salud en general, sexo y dieta del paciente; y la gravedad de la afeccion en particular.
"Tratamiento" se refiere a tratamiento profilactico o tratamiento terapeutico o tratamiento de diagnostico. En ciertas realizaciones, "tratamiento" se refiere a la administracion de un compuesto o composition a un sujeto para fines terapeuticos, profilactico sobre diagnostico.
Un tratamiento "profilactico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no presentan signos de una enfermedad o presenta solamente signos tempranos de la enfermedad, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar una patologla. Los compuestos o composiciones de la divulgation se pueden administrar como un tratamiento profilactico para reducir la probabilidad de desarrollar una patologla o para minimizar la gravedad de la patologla, si se desarrollara.
Un tratamiento "terapeutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos o slntomas de patologla con el fin de disminuir o eliminar esos signos o slntomas. Los signos o slntomas pueden ser bioqulmicos, celulares, histologicos, funcionales o flsicos, subjetivos u objetivos. Los compuestos de la divulgacion tambien se pueden administrar como un tratamiento terapeutico o para diagnostico.
"Diagnostico" se refiere a la identification de la presencia, alcance y/o naturaleza de una afeccion patologica. Los metodos de diagnostico se diferencian en su especificidad y selectividad. Aunque un metodo de diagnostico en particular no puede proporcionar un diagnostico definitivo de una afeccion, es suficiente si el metodo proporciona una indication positiva que ayude en el diagnostico.
"Biomarcador asociado a hueso o cartllago" o "marcador asociado a hueso o cartllago" se refiere a un factor de crecimiento, enzima, protelna, u otra sustancia o resto biologicamente detectables cuyo nivel aumenta o disminuye en asociacion con, por ejemplo, renovation de cartllago, formation de cartllago, crecimiento de cartllago, resorcion osea, formacion de hueso, crecimiento de hueso, o combinaciones de los mismos. Tales biomarcadores se pueden medir antes, durante y/o despues de la administracion de una variante de CNP como se describe en el presente documento. Los biomarcadores asociados a hueso o cartllago a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, CNP, cGMP, propeptidos de colageno de tipo II y fragmentos de los mismos, colageno de tipo II y fragmentos del mismo, propeptidos de colageno de tipo I y fragmentos de los mismos, colageno de tipo I y fragmentos del mismo, osteocalcina, antlgeno nuclear de celulas proliferantes (PCNA), sulfato de agrecano y condroitina, y fosfatasa alcalina. Los biomarcadores asociados a cartllago y hueso se pueden medir en cualquier muestra biologica apropiada, que incluye, pero no se limita a, tejidos, sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, fluido sinovial y orina. En algunas realizaciones, los biomarcadores se miden en sangre, plasma o suero a partir de animales que se someten a estudios de eficacia/farmacodinamica in vivo y/o a partir de los medios acondicionados de estudios ex vivo.
En ciertas realizaciones, se mide el nivel de al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago y la cantidad o frecuencia de la administracion de la variante de CNP administrara a un sujeto se puede ajustar de acuerdo con el nivel del biomarcador medido. En algunas realizaciones, el nivel de biomarcador esta "por debajo de un nivel diana" o "por encima de un nivel diana". Un nivel diana de un biomarcador es un nivel o intervalo de niveles del biomarcador en los que un efecto terapeutico se observa en el sujeto que recibe la variante de CNP. En ciertas realizaciones, el nivel diana de un biomarcador para un sujeto que tiene un trastorno o afeccion sensible a CNP es el nivel o intervalo de niveles del biomarcador observados en un sujeto no afectado, normal. En otras realizaciones, para indicar un efecto terapeutico, no es necesario que el nivel diana de un biomarcador sea equivalente al nivel o intervalo de niveles del biomarcador observado en un sujeto normal, pero puede estar dentro de, por ejemplo, un 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % o un 5 % del nivel o intervalo de niveles "normales" del biomarcador observado en un sujeto no afectado.
Por ejemplo, si el nivel de un biomarcador aumenta en asociacion con la formacion o crecimiento de hueso o cartllago, el nivel diana del biomarcador que indica un efecto terapeutico puede ser mas elevado que al nivel del biomarcador en pacientes que padecen un trastorno sensible a CNP a los que no se les ha administrado una variante de CNP, y puede ser opcionalmente mas bajo que el nivel o niveles "normales", a aproximadamente el nivel o niveles "normales", o superior al el nivel o niveles "normales" del biomarcador en sujetos que no padecen ese trastorno. En una realization, si el nivel de un biomarcador es inferior a un nivel diana, este indica un efecto terapeutico inadecuado, que puede requerir un aumento de la cantidad frecuencia de administracion de la variante de CNP administrada. En una realizacion relacionada, si el biomarcador es superior a un nivel diana, este indica que se ha administrado mas variante de CNP de la necesaria, lo que puede requerir una disminucion de la cantidad o frecuencia de administracion de la variante de CNP administrada.
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Como otro ejemplo, si el nivel de un biomarcador disminuye en asociacion con la formacion o crecimiento de hueso o cartilago, el nivel diana del biomarcador que indica un efecto terapeutico puede ser menor que el nivel del biomarcador en pacientes que padecen un trastorno sensible a CNP a los que no se les ha administrado una variante de CNP, y opcionalmente puede ser mas elevado que el nivel o niveles "normales", a aproximadamente el nivel o niveles "normales", o inferior a nivel o niveles "normales" del biomarcador en sujetos que no padecen ese trastorno. En tal caso, se puede aplicar lo contrario a los ajustes mencionados anteriormente en una cantidad y frecuencia de administracion de variante de CNP.
"Composicion farmaceutica" se refiere a una composicion adecuada para uso farmaceutico en un animal sujeto, incluyendo seres humanos y mamiferos. Una composicion farmaceutica comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una variante de CNP, opcionalmente otro agente biologicamente activo, y la opcionalmente un excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, una composicion farmaceutica incluye una composicion que comprende el principio o principios activos, y el ingrediente o ingredientes inertes que forman el vehiculo, asi como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combination, formacion de complejos o agregacion de cualquiera de dos o mas de los ingredientes, o a partir de disociacion de uno o mas de los ingredientes, o a partir de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o mas de los ingredientes. Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas de la presente divulgation incluyen cualquier composicion preparada por combinacion de un compuesto de la divulgacion y un excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
"Vehiculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehiculos, tampones, farmaceuticos convencionales, y similares, tales como una solution salina tamponada con fosfato, solution acuosa de dextrosa al 5 %, y emulsiones (por ejemplo, una emulsion de aceite/agua o de agua/aceite). Los ejemplos no limitantes de excipientes incluyen adyuvantes, aglutinantes, cargas, diluyentes, agentes disgregantes, agentes emulgentes, agentes humectantes, lubricantes, sustancias de deslizamiento, agentes edulcorantes, agentes saborizantes y agentes colorantes. Los vehiculos, excipientes y diluyentes farmaceuticamente adecuados se describen en Pharmaceutical Sciences de Remington, 19a Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Los vehiculos farmaceuticos preferentes dependen del modo de administracion pretendido del agente activo. Los modos de administracion habituales incluyen administracion enteral (por ejemplo, oral) o parenteral (por ejemplo, inyeccion subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal; o administracion topica, transdermica, o transmucosal).
Una "sal farmaceuticamente aceptable" es una sal que se puede formular en un compuesto para uso farmaceutico, que incluye, pero no se limita a, sales metalicas (por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.) y sales de amoniaco o aminas organicas.
Por "farmaceuticamente aceptable" o "farmacologicamente aceptable" se hace referencia a un material que no es biologicamente ni de otro modo no deseado, es decir, el material se puede administrar a un individuo sin causar ningun efecto biologico no deseado o sin interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composicion en la que esta contenido el mismo o con cualquier componente presente sobre o en el cuerpo del individuo.
La expresion "forma de dosificacion unitaria" se refiere a unidades fisicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales, con cada unidad conteniendo una cantidad determinada previamente de un compuesto de la divulgacion calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, opcionalmente en asociacion con un excipiente, diluyente, soporte o vehiculo farmaceuticamente aceptable. Las especificaciones para las nuevas formas de dosificacion unitaria de la presente divulgacion dependen del compuesto en particular usado y del efecto a conseguir, y la farmacodinamica asociada con cada compuesto en el hospedador.
"Condiciones fisiologicas" se refiere a condiciones en el cuerpo de un animal (por ejemplo, un ser humano). Las condiciones fisiologicas incluyen, pero no se limitan a, temperatura corporal y un buen entorno acuoso de fuerza ionica fisiologica, pH y enzimas. Las condiciones fisiologicas tambien incluyen condiciones en el cuerpo de un sujeto en particular que se diferencian de las condiciones "normales" presentes en la mayoria de los sujetos, por ejemplo, que son diferentes a la temperatura del cuerpo humano normal de aproximadamente 37 °C o se diferencian del pH de la sangre humana normal de aproximadamente 7,4.
Por "pH fisiologico" o un "pH en un intervalo fisiologico" se hace referencia a un pH en el intervalo de aproximadamente 7,0 a 8,0 inclusive, de forma mas habitual en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 7,6 inclusive.
Como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" incluye mamiferos y no mamiferos. Los ejemplos de mamiferos incluyen, pero no se limitan a, cualquier miembro de la clase de mamiferos: seres humanos, primates no humanos tales como chimpances, a y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado, caballos, ovejas, cabras, cerdos; animales domesticos tales como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores, tales como ratas, ratones y cobayas, y similares. Los ejemplos de no mamiferos incluyen, pero no se limitan a, pajaros, peces y similares. El termino no indica una edad o genero en particular.
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Los terminos "polietilenglicol", "PEG", "oxido de polietileno" y "PEO" se usan indistintamente en el presente documento a menos que se indique de otro modo. Un peptido CNP (CNP22 o una variante del mismo) conjugado a traves de un grupo amino a un pollmero "PEOn" asociado con el numero n, en general tiene la formula: CH3-[-O- CH2CH2-]n-C(=O)-NHR, en la que n es el numero de unidades de oxido de etileno y R representa el resto del peptido. El pollmero "PEOn" puede tener opcionalmente un grupo alquileno, (CH2)m, en el que m es un numero entero de 1 a 5, entre el carbono del carbonilo y las unidades de repeticion de oxido de etileno. Un pollmero del tipo "PEOn" (por ejemplo, PEO12 o PEO24) es monodisperso, es decir, es un solo pollmero separado de un peso molecular en particular. De forma analoga, un peptido CNP conjugado a traves de un grupo amino a un pollmero "PEGnK" asociado con el numero nK, en general tiene la formula: CH3-[-O-CH2CH2-]p-C(=O)-NHR, en la que p es un numero entero mayor que 1. El pollmero de tipo "PEGnK" tambien puede tener can opcionalmente un grupo alquileno, (CH2)m, en el que m es un numero entero de 1 a 5, entre el carbono del carbonilo y las unidades de repeticion de oxido de etileno. Sin embargo, el pollmero de tipo "PEGnK" (por ejemplo, PEG1K, PEG2K, PEG5K o PEG20K) es polidisperso, es decir, contiene una mezcla de pollmeros que tienen una distribucion de pesos moleculares, en el que el numero nK representa el peso molecular medio en numero del pollmero (Mn) en kilo Daltons. Por ejemplo, el "PEG2K" conjugado con un peptido CNP representa un pollmero de PEG polidisperso que tiene un peso molecular medio el numero de pollmero de aproximadamente 2 kDa.
Cuando un intervalo de la masa de un pollmero (por ejemplo, PEG) se proporciona (por ejemplo, en unidades de kDa), el intervalo se refiere a un intervalo de pesos moleculares medios en numero de pollmero, no a un intervalo de pesos moleculares de multiples pollmeros en una mezcla polidispersa, a menos que se indique de forma expresa de otro modo.
El termino "halogeno", "haluro" o "halo" se refiere a fluor, cloro, bromo, e/o yodo.
El termino "alquilo" se refiere a un radical de hidrocarburo monovalente saturado lineal o ramificado, en el que el alquilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes Q como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el alquilo es un radical de hidrocarburo monovalente saturado lineal que tiene de 1 a 20 (C1-20), 1 a 15 (C1-15), 1 a 12 (C1-12), 1 a 10 (C1-10), o 1 a 6 (C1-6) atomos de carbono, o un radical de hidrocarburo monovalente saturado ramificado de 3 a 20 (C3-20), 3 a 15 (C3-15), 3 a 12 (C3-12), 3 a 10 (C3-10), o 3 a 6 (C3-6) atomos de carbono. Como se usa en el presente documento, los grupos alquilo C1-6 lineal y C3-6 ramificado tambien se denominan "alquilo inferior." Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo (incluyendo todas las formas isomericas, que incluyen n-propilo e isopropilo), butilo (incluyendo todas las formas isomericas, que incluyen n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo), pentilo (incluyendo todas las formas isomericas), y hexilo (incluyendo todas las formas isomericas). Por ejemplo, alquilo C1-6 se refiere a un radical de hidrocarburo monovalente saturado lineal de 1 a 6 atomos de carbono o un radical de hidrocarburo monovalente saturado ramificado de 3 a 6 atomos de carbono.
El termino "alcoxi" se refiere a un grupo -O-alquilo. En ciertas realizaciones, un grupo alcoxi puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes Q como se describe en el presente documento.
El termino "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo que esta sustituido con uno o mas atomos de haluro. En ciertas realizaciones, un grupo haloalquilo esta sustituido con uno, dos, tres, cuatro cinco o seis atomos de haluro. En ciertas realizaciones, un grupo haloalquilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes Q adicionales como se describe en el presente documento.
El termino "cicloalquilo" se refiere a un radical de hidrocarburo monovalente unido por puente y/o no unido por puente saturado clclico, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes Q como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el cicloalquilo tiene de 3 a 20 (C3-20), de 3 a 15 (C3-15), de 3 a 12 (C3.12), de 3 a 10 (C3-10), o de 3 a 7 (C3-7) atomos de carbono. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, decalinilo, y adamantilo.
El termino "heterociclilo" o "heteroclclico" se refiere a un sistema de anillos no aromatico monoclclico o un sistema de anillos policlclico que contiene al menos un anillo no aromatico, en el que uno o mas de los atomos no aromaticos en el anillo son heteroatomos seleccionados independientemente entre O, S o N, y los atomos no aromaticos restantes en el anillo son atomos de carbono. En ciertas realizaciones, el grupo heterociclilo o heteroclclico tiene de 3 a 20, de 3 a 15, de 3 a 10, de 3 a 8, de 4 a 7, o de 5 a 6 atomos en el anillo. En ciertas realizaciones, el heterociclilo es un sistema de anillos monoclclico, biclclico, triclclico, o tetraclclico, que puede incluir un sistema de anillos fusionados o unidos por puente, y en el que los atomos de nitrogeno o azufre pueden estar opcionalmente oxidados, los atomos de nitrogeno pueden estar opcionalmente cuaternizados, y algunos anillos pueden estar parcial o totalmente saturados, o ser aromaticos. El heterociclilo se puede unir a la estructura principal de cualquier heteroatomo o atomo de carbono que de como resultado la creacion de un compuesto estable. Los ejemplos de grupos heteroclclicos incluyen, pero no se limitan a, acridinilo, azepinilo, benzoimidazolilo, benzindolilo, benzoisoxazolilo, benzoisoxazinilo, benzodioxanilo, benzodioxolilo, benzofuranonilo, benzofuranilo, benzonaftofuranilo, benzopiranonilo, benzopiranilo, benzotetrahidrofuranollo, benzotetrahidrotienilo, benzotiadiazolilo, benzotiazolilo, benzotiofenilo, benzotriazolilo, benzotiopiranilo, benzoxazinilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, p-carbolinilo, carbazolilo, cromanilo, chromonilo, cinnolinilo, coumarinilo, decahidroisoquinolinilo,
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dibenzofuranilo, dihidrobenzoisotiazinilo, dihidrobenzoisoxazinilo, dihidrofurilo, dihidropiranilo, dioxolanilo,
dihidropirazinilo, dihidropiridinilo, dihidropirazolilo, dihidropirimidinilo, dihidropirrolilo, dioxolanilo, 1,4-ditianilo, furanonilo, furanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, imidazopiridinilo, imidazotiazolilo, indazolilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, isobenzotetrahidrofuranollo, isobenzotetrahidrotienilo, isobenzotienilo, isocromanilo,
isocoumarinilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolidinilo, isotiazolilo, isoxazolidinilo, isoxazolilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo, oxadiazolilo, oxazolidinonilo, oxazolidinilo, oxazolopiridinilo, oxazolilo, oxiranilo, perimidinilo, fenantridinilo, fenatrolinilo, fenarsazinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pteridinilo, purinilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridinilo, piridopiridinilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, tetrahidrofurilo, tetrahidrofuranollo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidropiranilo,
tetrahidrotienilo, tetrazolilo, tiadiazolopirimidinilo, tiadiazolilo, tiamorfolinilo, tiazolidinilo, tiazolilo, tienilo, triazinilo, triazolilo, y 1,3,5-tritianilo. En ciertas realizaciones, un grupo heteroclclico puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes Q como se describe en el presente documento.
El termino "arilo" se refiere a un grupo aromatico monoclclico o un grupo aromatico monovalente policlclico que contiene al menos un anillo de hidrocarburo aromatico. En ciertas realizaciones, el arilo tiene de 6 a 20 (C6.20), de 6 a 15 (C6-15), o de 6 a 10 (C6.10) atomos en el anillo. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, fluorenilo, azulenilo, antrilo, fenantrilo, pirenilo, bifenilo, y terfenilo. Arilo tambien se refiere a anillos de carbono biclclicos o triclclicos, en los que al menos uno de los anillos es aromatico y los otros pueden estar saturados, parcialmente insaturados, o aromaticos, por ejemplo, dihidronaftilo, indenilo, indanilo, y tetrahidronaftilo (tetralinilo). En ciertas realizaciones, un grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes Q como se describe en el presente documento.
El termino "heteroarilo" se refiere a un grupo aromatico monoclclico o un grupo aromatico policlclico que contiene al menos un anillo aromatico, en el que al menos un anillo aromatico contiene uno o mas heteroatomos seleccionados independientemente entre O, S, y N. Cada anillo de un grupo heteroarilo puede contener uno o dos atomos de O, uno o dos atomos de S, y/o de uno a cuatro atomos de N atomos, con la condicion de que el numero total de heteroatomo sin cada anillo sea cuatro o menos y cada anillo contenga al menos un atomo de carbono. El heteroarilo se puede unir a la estructura principal en cualquier heteroatomo o atomo de carbono que de como resultado la creacion de un compuesto estable. En ciertas realizaciones, el heteroarilo tiene de 5 a 20, de 5 a 15, o de 5 a 10 atomos en el anillo. Los ejemplos de grupos heteroarilo monoclclico incluyen, pero no se limitan a, pirrolilo, pirazolilo, pirazolinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, isotiazolilo, furanilo, tienilo, oxadiazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, y triazinilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo biclclico incluyen, pero no se limitan a, indolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzotienilo, quinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, isoquinolinilo, benzoimidazolilo, benzopiranilo, indolizinilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo, chromonilo, coumarinilo, cinnolinilo, quinoxalinilo, indazolilo, purinilo, pirrolopiridinilo, furopiridinilo, tienopiridinilo, dihidroisoindolilo, y tetrahidroquinolinilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo triclclico incluyen, pero no se limitan a, carbazolilo, benzindolilo, fenantrollinilo, acridinilo, fenantridinilo, y xantenilo. En ciertas realizaciones, un grupo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes Q como se describe en el presente documento.
La expresion "opcionalmente sustituido" pretende indicar que un grupo, que incluye alquilo, alcoxi, haloalquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo, puede estar sustituido con uno o mas sustituyentes Q (en una realizacion, uno, dos, tres o cuatro sustituyentes Q), en el que cada Q se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en ciano, halo, oxo, nitro, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, halo-alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, heterociclilo, arilo C6-14, heteroarilo,-C(O)Re, -C(O)ORe, -C(O)NRfRg, -C(NRe)NRfRg, -ORe, -OC(O)Re, -OC(O)ORe,-OC(O)NRfRg, - OC(=NRe)NRfRg, -OS(O)Re, -OS(O)2Re, -OS(O)NRfRg, -OS(O)2NRfRg,-NRfRg, -NReC(O)Rf, -NReC(O)ORf, - NReC(O)NRfRg, -NReC(=NRh)NRfRg, -NReS(O)R,-NReS(O)2Rf, -NReS(O)NRfRg, -NReS(O)2NRfRg, -SRe, -S(O)Re, - S(O)2Re, y -S(O)2NRfRg, en los que cada Re, Rf, Rg, y Rh es independientemente hidrogeno, alquilo C1-6, cicloalquilo C3.7, heterociclilo, arilo C6.14, o heteroarilo; o Rf y Rg, junto con el atomo de N al que se unen, forman heterociclilo.
B. Variantes de CNP
El uso de CNP22 como un agente terapeutico esta limitado por su corta semivida en plasma (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). En el plasma humano, la concentracion de CNP22 por lo general es inferior a cinco picomolar. CNP22 se degrada y se elimina de la circulacion por NEP y NPR-C en seres humanos (Growth Hormone & IGF Res., 16: S6-S14). En todos los estudios en seres humanos y animales que usan CNP22 administrado por via sistemica, se ha usado una infusion continua para aumentar la concentracion de CNP22 en los sujetos. Un peptido CNP que tiene una semivida mas larga y un nivel de funcionalidad al menos similar podrla ser beneficioso para una estrategia terapeutica basada en CNP. Las variantes de CNP tambien se desvelan en la Solicitud Internacional relacionada n.° PCT/US08/84270, incorporara de forma especlfica en el presente documento por referencia.
La presente divulgacion proporciona variantes de CNP que tienen una reduction de la afinidad con respecto a NEP y/o NPR-C, y una reduccion de la susceptibilidad con respecto a la escision por NEP y/o elimination por NPR-C, pero que tienen una funcionalidad sustancialmente similar o mejor que la del CNP22 de tipo silvestre. La reduccion de la susceptibilidad de las variantes de CNP con respecto a la escision por NEP y/o eliminacion por y NPR-C podrla aumentar la semivida en plasma o en suero de las variantes, aumentando de ese modo la oportunidad para las
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variantes para distribuirse a los tejidos y sitios diana y para efectuar los efectos farmacologicos deseados. En ciertas realizaciones, las variantes de cNp descritas en el presente documento tienen una reduccion de la susceptibilidad con respecto a la escision por NEP y/o eliminacion por NPR-C in vitro o in vivo en al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, o 5 veces en comparacion con wtCNP22, y tienen un aumento de la semivida en plasma o en suero in vivo de al menos 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, o 5 veces en comparacion con wtCNP22, a la vez que se retiene al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de la funcionalidad de WtCNP22, o que tienen una funcionalidad de al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, o 5 veces superior a la de wtCNP22. La funcionalidad de CNP se puede evaluar en terminos de, por ejemplo, el nivel de uno o mas biomarcadores (por ejemplo, cGMP) asociados con la formacion o crecimiento de cartllago o de hueso en un estudio in vitro o in vivo, la longitud de los huesos en particular en un estudio ex vivo o in vivo, etc.
Los sustratos naturales de NEP son peptidos pequenos y natriureticos (de aproximadamente 2,2 a aproximadamente 3,2 kDa) que son los mas grandes de los sustratos naturales natural. De acuerdo con analisis de cristalografla de rayos X, el sitio activo de NEP esta interno dentro de la cavidad central, limitando de forma eficaz el tamano de las moleculas de sustrato a no mas de aproximadamente 3 kDa (Oefner et al., J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000)). Basandose en estudios de senalizacion de NPR-B, las variantes de CNP-22, tales como CNP-17 (que retiene solamente el dominio clclico, Cys6 - Cys22, de CNP22) y CNP-53 (CNP-22 con una prolongacion de 31 aminoacidos en el extremo N-terminal), aun se puede unir y activar a NPR-B de manera similar a la del wtCNP-22 de 2,2 kDa. Por consiguiente, la divulgacion incluye variantes de CNP conjugadas a un pollmero natural (por ejemplo, peptido) y/o sintetico (por ejemplo, PEG) en el extremo N-terminal y/o C-terminal de CNP22 o variantes del mismo, que presentan un aumento de la resistencia a NEP pero que tienen la capacidad para unirse y activar el receptor de la senalizacion de NPR-B.
En el presente documento se ensenan variantes de CNP representadas por la formula general:
(x)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Ly1o-Leu11-Asp12-Arg13-ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu2o-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 139), o
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19- Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SeQ ID NO: 140), en la que:
(x) y (z) cada uno independientemente son un pollmero natural (por ejemplo, una secuencia peptldica que contiene al menos un aminoacido) y/o un pollmero sintetico (por ejemplo, PEG) como se describe en el presente documento, de modo que la masa total de la variante de cNp se caracteriza por los intervalos que por lo general se describen en el presente documento, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa. En una realization, los restos de Cys6 a Cys22 forman una parte clclica. En una realizacion, (x) y/o (z) comprenden una prolongacion de aminoacido obtenida a partir de un polipeptido de NPPC o un polipeptido que no es CNP (por ejemplo, ANP, BNP, IgG, etc.), en el que la prolongacion contiene de 1 a 40, de 1 a 35, de 1 a 31, de 5 a 35, de 5 a 31 o de 5 a 15 aminoacidos. En otra realizacion, las variantes de CNP comprenden una o mas modificaciones y/o acciones con otro aminoacido natural, un aminoacido no natural, un peptidomimetico y/o un isoester de enlace peptldico en una o mas de las siguientes posiciones de CNP22: Glyl, Lys4, Gly5, Cys6, Phe7, Gly8, Leu9, Lys10, Leu11, Ile14, Gly15, Ser16, Met17, Gly19, Leu20 y Gly21.
En el presente documento se ensenan variantes de CNP que tienen una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, disenados para un aumento de la resistencia a la degradation de NEP, se representan con la formula general:
(x)-Cys6-Phe7-Gly8-Leug-(h)10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 141), o
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(b)4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leun-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19- Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 6), en la que:
(x) es un grupo polimerico sintetico o natural, o una combination de los mismos, en el que un ejemplo no limitante de un grupo polimerico sintetico es PEG (o PEO), y un ejemplo no limitante de un grupo polimerico natural es una secuencia de aminoacidos que contiene de 1 a 35 aminoacidos y que se obtiene a partir de NPPC o variantes del mismo con sustituciones y/o deleciones, ANP, BNP, u otros (poli)peptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, albumina de suero, IgG, glicoprotelnas ricas en histidina, fibronectina, fibrinogeno, polipeptidos que contienen dedos de cinc, osteocrina o factor 2 de crecimiento de fibroblastos (FGF2);
(z) puede estar ausente o puede ser un grupo polimerico sintetico o natural, o una combinacion de los mismos, en el que un ejemplo no limitante de un grupo polimerico sintetico es PEG, y un ejemplo no limitante de un grupo polimerico natural es una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de un polipeptido natriuretico (por ejemplo, NPPC, CNP, ANP o BNP) o polipeptido no natriuretico (por ejemplo, albumina de
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suero o IgG); y
(b) y (h) pueden ser independientemente la Lys de tipo silvestre en esa posicion no pueden estar sustituidos por una sustitucion de aminoacido conservativa o cualquier aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Glu o Ser. En una realizacion, (b) es Arg. En otra realization, para un aumento de la resistencia a NEP, (b) no es Gly. En otra realizacion mas, (h) no es Arg.
Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de NPPC o variantes del mismo incluyen:
Arg,
Glu-Arg,
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 7),
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 8),
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg (SEQ ID NO: 9),
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln (SEQ ID NO: 10),
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser (SEQ ID NO: 11),
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln (SEQ ID NO: 12),
Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID NO: 13),
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO: 14),
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO: 15),
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala (SEQ ID NO: 16), Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg (SEQ ID NO: 17), Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: 18), Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 19), Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 20),
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys- Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 21), y
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys- Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 22).
Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de polipeptidos que no son CNP tales como, por ejemplo, ANP, BNP, albumina de suero e IgG incluyen:
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser (SEQ ID NO: 23);
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 24);
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 25);
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 26);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 27);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 28);
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg (SEQ ID NO: 29);
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr (SEQ ID NO: 30);
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln (SEQ ID NO: 31); Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 32).
En una realizacion, el grupo N-terminal (x) y/o el grupo C-terminal (z) de cualquiera de las variantes de CNP que tienen un grupo (x) y/o (z), como se describe en el presente documento, comprenden independientemente una secuencia de aminoacidos que contiene un numero pequeno de, si los hubiera, aminoacidos naturales o naturales acidos (por ejemplo, Asp o Glu). En otra realizacion, (x) y/o (z) estan enriquecidos en aminoacidos naturales o naturales basicos (por ejemplo, Lys, Arg o His) para mantener un pI alcalino similar al pI de CNP22 (pI 8,9). En una realizacion, el pI de las variantes de CNP esta en el intervalo de aproximadamente 8 a aproximadamente 10,5, disenado de modo que las variantes de CNP se puedan difundir mas facilmente a traves de la matriz extracelular que rodea los condrocitos de las placas de crecimiento oseo. En realizaciones menos amplias, el pI de las variantes de CNP es de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10,5, o de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 9 a aproximadamente 10.
En otra realizacion mas, (x) y/o (z) estan enriquecidos en aminoacidos naturales o naturales polares, disenados para aumentar la solubilidad acuosa. Ademas, en otra realizacion, (x) y/o (z) contienen un numero pequeno de, si los hubiera, aminoacidos naturales o naturales hidrofobos (por ejemplo, Ala, Val, Leu, Ile o Met).
El extremo N-terminal de una variante de CNP puede terminar en al menos un resto de glicina, disenado para aumentar la semivida en suero. En una realizacion relacionada, para evitar la formation de piroglutamina, el extremo N-terminal de las variantes de CNP termina en un resto de glicina si pudiera de otro modo termina en glutamina. En una realizacion, el grupo (x) contiene una prolongation de aminoacido cuyo extremo N-terminal termina en al menos un resto de glicina. En otra realizacion, (x) y/o (z) no contienen dos aminoacidos naturales o naturales basicos
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adyacentes (por ejemplo, Lys-Lys o Arg-Arg), disenados para reducir la susceptibilidad a la escision por la proteasa furina. En una realizacion, (x) no contiene dos aminoacidos basicos adyacentes que preceden inmediatamente a la posicion que corresponde a la Gly1 de CNP22.
El grupo (x) y/o el grupo (z) de una variante de CNP pueden comprender una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de NPPC (por ejemplo, obtenida a partir de CNP53). En una realizacion, (x) comprende una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de la cola N-terminal de ANP o BNP. En otra realizacion, (z) comprende una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de la cola C-terminal de ANP o BNP. En una realizacion mas, (x) y/o (z) comprenden una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de un polipeptido no natriuretico tal como, por ejemplo, IgG, albumina de suero humano (HSA), glicoprotelnas ricas en histidina, fibronectina, fibrinogeno, polipeptidos que contienen dedos de cinc, FGF-2, y protelnas de direction a hueso (por ejemplo, osteocrina, osteopontina, osteocalcina, y sialoprotelna).
En cualquier realizacion descrita en el presente documento en la que CNP22 o una variante del mismo pueda tener un grupo N-terminal (x) y/o un grupo C-terminal (z), (x) y/o (z) pueden contener independientemente una secuencia de aminoacidos obtenida a partir del dominio funcional de una protelna genetica osea (BMP). Una prolongation de aminoacido N-terminal y/o C-terminal obtenida a partir del dominio funcional de una BMP puede aumentar la resistencia a NEP, y por lo tanto la semivida en suero de la variante de CNP, aumentando la masa total de la variante de CNP que se caracteriza por los intervalos que se describen por lo general el presente documento, por ejemplo, un intervalo de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa. Ademas, dado que ciertas BMP son factores de crecimiento y citoquinas que inducen la formation de hueso y cartllago, un fragmento obtenido a partir del dominio funcional de una a BMP puede estimular el crecimiento de condrocitos, cartllago o hueso mediante un mecanismo distinto del de la activation de la funcion de la guanilil ciclasa de NPR-B por el dominio clclico de CNP22 o una variante del mismo. Los ejemplos no limitantes de las BMP que estimulan la formacion y desarrollo de hueso, formacion y desarrollo de cartllago, y/o diferenciacion de osteoblastos incluyen BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 y BMP8a. En una realizacion, el extremo N-terminal y/o C-terminal de CNP22 o una variante del mismo estan conjugados independientemente con una secuencia de aminoacidos obtenida a partir de los ultimos 140 aminoacidos en la parte C-terminal de BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 o BMP8a.
Una variante de CNP puede contener una prolongacion de aminoacido en el extremo N-terminal y/o C-terminal de CNP22 o CNP17, que incluye, pero no se limita a:
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 4);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37, Analogo BL) (SEQ ID NO: 60);
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CA) (SEQ ID NO: 61);
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CB) (SEQ ID NO: 62);
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CC) (SEQ ID NO: 63);
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 40);
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 38);
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 64);
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 65);
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 66);
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 67);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 144); y
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (Analogo CD) (CNP17 que tiene colas N-terminales y C-terminales obtenido a
partir de BNP) (SEQ ID NO: 68).
Las variantes de CNP pueden tener una sustitucion de K4R en la posicion 4 de CNP22. Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP(K4R) incluyen:
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo AY) (SEQ ID NO: 36);
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CI) (SEQ ID NO: 37);
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo AZ) (SEQ ID NO: 41);
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo BA) (SEQ ID NO: 39);
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CH) (SEQ ID NO: 69); y
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CG) (SEQ ID NO: 70).
Las variantes de CNP pueden ser quimeras que comprenden CNP22 o una variante del mismo que tienen adicion o adiciones, deletion o deleciones y/o sustitucion o sustituciones de aminoacido, y un fragmento de peptido obtenido a partir de un polipeptido o protelna distinta de CNP, o todo el polipeptido o protelna que no es CNP, con respecto al extremo N-terminal del peptido CNP, en el que CNP22 o la variante del mismo puede tener opcionalmente una prolongacion de aminoacido N-terminal de uno o mas restos de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las quimeras de CNP comprenden CNP22 o una variante del mismo que quien una prolongacion de aminoacido N-terminal de uno o mas restos de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las quimeras de CNP contienen restos de lisina-lisina (KK) o restos de GANKK que preceden inmediatamente a la primera posicion de CNP22 (Gly en el caso de CNP22) o una variante del mismo. En otras realizaciones, las quimeras de CNP contienen uno o dos restos diferentes de la lisina-
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lisina que precede inmediatamente la primera posicion de CNP22 o una variante del mismo. Los ejemplos no limitantes de restos que pueden preceder inmediatamente la primera posicion de CNP22 o una variante del mismo incluyen KP, PK, PR, PQ, QK, QQ, RR, SS, GANKP (SEQ ID NO: 200), GANPK (SEQ ID NO: 201), GANPR (SEQ ID NO: 9), GANPQ (SEQ ID NO: 202), GANQK (SEQ ID NO: 203), GANQQ (SEQ ID NO: 10), GANRR (SEQ ID NO: 8), y GANSS (SEQ ID NO: 11).
Las variantes de CNP pueden ser quimeras que comprenden CNP22 y un fragmento de peptido N-terminal, que incluyen, pero no se limitan a:
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CQ) (quimera de fragmento de glicoprotelna rica en histidina (HRGP)-CNP22) (SEQ ID NO: 76);
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CR) (quimera de fragmento de HRGP- CNP22) (SEQ ID NO: 77);
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CX) (quimera de fragmento de HRGP- CNP22) (SEQ ID NO: 78);
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CF) (quimera de fragmento de IgG1(Fc) CNP22) (SEQ ID NO: 79);
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CY) (quimera de fragmento de albumina de suero humano (HSA)-CNP22 ) (SEQ ID NO: 80);
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CE) (quimera de fragmento de HSA-CNP22 ) (SEQ ID NO: 81);
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CZ) (quimera de fragmento de ”inhibidor de NPR C” de osteocrina-CNP22) (SEQ ID NO: 82); y
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo DA) (quimera de fragmento de “dominio de union a heparina” de FGF2-CNP22) (SEQ ID NO: 83).
Las variantes de CNP son quimeras que comprenden un fragmento de peptido N-terminal y CNP22 en las que la arginina esta sustituida por la Lys4 de CNP22 ("CNP22(K4R)"), que incluyen, pero no se limitan a:
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CK) (quimera de fragmento de IgG1(Fc)- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 84);
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CL) (quimera de fragmento de HSA- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 85);
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CM) (quimera de fragmento de fibronectina- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 86);
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CN) (quimera de fragmento de fibrinogeno- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 87);
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CO) (quimera de fragmento de fibrinogeno- CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 88); y
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo CP) (quimera de fragmento de dedos de cinc- CNP22) (SEQ ID NO: 89).
Las quimeras que comprenden IgG y CNP22 o una variante de los mismos se disenan para, entre otros, a aumentar la resistencia a la degradation de NEP y reducir la union a albumina de suero. Las quimeras de CNP que comprenden un fragmento de superficie de HSA se disenan para, entre otros, reducir la inmunogenicidad y reducir la union a albumina de suero. Las quimeras de HRGP-CNP22 y HRGP-CNP22(K4R) que contienen una secuencia que no es arginina, que no es lisina, rica en histidina, cationica en el extremo N-terminal se disenan para, entre otros, aumentar la estabilidad a proteasas. Las quimeras que contienen un fragmento de osteocrina se disenan para que liberen, despues de escision con proteasa (por ejemplo, furina), el fragmento de osteocrina en las placas de crecimiento oseo, en las que el fragmento podrla inhibir la elimination del receptor NPR-C. Con respecto a las quimeras que comprenden un fragmento de union a heparina de FGF2, la heparina que se une al fragmento se disena para proteger la quimera de la degradacion, proporcionando de ese modo una semivida en suero mas larga. Las quimeras que contienen un fragmento de fibronectina, fibrinogeno, o dedos de cinc se disenan para reducir la union a albumina de suero, entre otras caracterlsticas.
Sin pretender quedar ligado por la teorla, una variante de CNP de un peso molecular de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa que tiene un aumento de la resistencia a la degradacion de NEP y tiene una funcionalidad similar o mayor (por ejemplo, union a NPR-B y estimulacion de la serialization de cGMP) tal como en comparacion con wtCNP22, puede ser mas eficaz si no se une estrechamente a protelnas plasmaticas tales como albumina de suero. Una variante de CNP que no se une estrechamente a protelnas plasmaticas (por ejemplo, albumina de suero) puede ser mas eficaz en la difusion a traves del cartllago, llegando a los condrocitos de las placas de crecimiento oseo, y en la union y en la activation de la NPR-B para la senalizacion de cGMP. Las variantes de CNP disenadas para reduction de la union a protelnas plasmaticas (por ejemplo, albumina de suero) son quimeras que comprenden CNP22 o una variante del mismo y un fragmento peptldico de IgG. Otras variantes de CNP disenadas para reducir la union a protelnas plasmaticas son quimeras que comprenden CNP22 o CNP22(K4R) y un fragmento de un polipeptido (por ejemplo, IgG, HSA, fibronectina, fibrinogeno, un polipeptido que
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contiene dedos de cinc, etc.). Ademas, otras variantes de CNP disenadas para reducir la union a protelnas plasmaticas comprenden CNP22 o una variante del mismo conjugada a un pollmero hidrofilo o soluble en agua. El pollmero hidrofilo o soluble en agua puede ser PEG (o PEO). El pollmero hidrofilo o soluble en agua (por ejemplo, PEG) se puede funcionalizar con uno o mas grupos funcionales que transmiten una carga negativa al pollmero en condiciones fisiologicas, tales como, por ejemplo, grupos carboxilo, sulfato o fosfato, o una combinacion de los mismos.
Las variantes de CNP pueden incluir peptidos CNP truncados que varlan del CNP-17 humano (hCNP-17) al CNP-53 humano (hCNP-53), y que tienen secuencias de aminoacidos de tipo silvestre obtenidas a partir de hCNP-53. Tales peptidos CNP truncados incluyen:
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 4); LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-52) (SEQ ID NO: 146); RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-51) (SEQ ID NO: 147); VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-50) (SEQ ID NO: 148); DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-49) (SEQ ID NO: 149); TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-48) (SEQ ID NO: 150); KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-47) (SEQ ID NO: 151); SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-46) (SEQ ID NO: 152); RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-45) (SEQ ID NO: 153); AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-44) (SEQ ID NO: 154); AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-43) (SEQ ID NO: 155); WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-42) (SEQ ID NO: 156); ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 157); RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-40) (SEQ ID NO: 158); LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 159); LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 160); QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37) (SEQ ID NO: 60); EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-36) (SEQ ID NO: 161); HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-35) (SEQ ID NO: 162); PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-34) (SEQ ID NO: 163); NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-33) (SEQ ID NO: 164); ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-32) (SEQ ID NO: 165); RKYKGANKKGLSKGCFGLKLRIGSMSGLGC (CNP-31) (SEQ ID NO: 166); KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-30) (SEQ ID NO: 167); YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-29) (SEQ ID NO: 168); KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-28) (SEQ ID NO: 169);
GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-27) (SEQ ID NO: 170);
ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-26) (SEQ ID NO: 171);
NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-25) (SEQ ID NO: 172);
KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-24) (SEQ ID NO: 173);
KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-23) (SEQ ID NO: 174);
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 1);
LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-21) (SEQ ID NO: 175);
SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-20) (SEQ ID NO: 176);
KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-19) (SEQ ID NO: 177);
GCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-18) (SEQ ID NO: 178); y CFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-17) (SEQ ID NO: 2).
En ciertas realizaciones, las variantes de CNP no incluyen CNP-17, CNP-22 o CNP-53.
Los peptidos CNP truncados que varlan de hCNP-17 a hCNP-53 pueden contener adicion(s), delecion(s) y/o sustitucion(s) de aminoacidos con aminoacido(s) o peptidomimetico(s) naturales o no naturales (por ejemplo, isoester(es) de enlace peptldico), como se describe en el presente documento, en una cualquiera o mas de las posiciones del aminoacido de los peptidos CNP truncados en particular. En otra realizacion mas, los peptidos CNP truncados que tienen secuencias de tipo silvestre o adicion(s), delecion(s) y/o sustitucion(s) de aminoacidos, se pueden conjugar en el extremo N-terminal, C-terminal, y/o un sitio interno con cualquiera de los restos que se describen en el presente documento, que incluyen, pero no se limitan a, restos de direccion a hueso o cartllago (por ejemplo, bisfosfonatos, secuencias peptldicas de direccion a hueso o cartllago (por ejemplo, poliAsp, poliGlu), secuencias peptldicas obtenidas a partir de dominios de direccion a hueso de protelnas oseas (por ejemplo, osteopontina, osteocalcina, sialoproteina)), secuencias peptldicas obtenidas a partir de los dominios funcionales de protelnas morfogeneticas oseas (por ejemplo, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7, BMP8a), secuencias peptldicas obtenidas a partir de polipeptidos natriureticos (por ejemplo, NPPC, ANP, BNP), secuencias peptldicas obtenidas a partir de polipeptidos de origen no natriuretico (por ejemplo, albumina de suero, IgG, glicoprotelnas ricas en histidina, fibronectina, fibrinogeno, polipeptidos que contienen dedos de cinc, FGF-2, osteocrina), restos que reducen la eliminacion renal (por ejemplo, restos de PEG con carga negativa), pollmeros hidrofilos (por ejemplo, PEG),
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carbohidratos (por ejemplo, carbohidratos reconocidos por receptores en la superficie de las celulas en las placas de crecimiento oseo), acidos hidrofobos (por ejemplo, acidos carboxllicos C5-Ci2, acidos grasos naturales), fosfollpidos, y combinaciones de los mismos. En una realizacion, los peptidos CNP truncados que tienen secuencias de tipo silvestre o adicion(s), delecion(s) y/o sustitucion(s) de aminoacidos, y que estan opcionalmente conjugados con uno o mas restos en el extremo N-terminal, C-terminal, y/o un sitio interno, tienen una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa.
Las variantes de CNP pueden ser derivados de CNP37, que es QEHPNARKYKGANKK-CNP22 (SEQ ID NO: 60). Las variantes de CNP37 pueden contener adicion(s), delecion(s) y/o sustitucion(s) de aminoacidos con aminoacido(s) o peptidomimetico(s) naturales o no naturales (por ejemplo, isoester(es) de enlace peptldico) en una cualquiera o mas de las 37 posiciones de CNP37. Los ejemplos no limitantes de sustituciones que se pueden realizar en CNP37, basandose en la numeration de CNP22, incluyen K4R, G5S, G5R, G8S, K11R, G15S, S16Q, M17N, G19R, y combinaciones de los mismos. En una realizacion, los derivados de CNP37 contienen una sustitucion de Met17 por un aminoacido o peptidomimetico natural (por ejemplo, asparagina) o no natural, disenado en parte para evitar la oxidation del atomo de azufre de la metionina. En otra realizacion, las variantes de CNP37 contienen sustitucion o sustituciones de Lys8, Lys10, Lys14 y/o Lys15 (basandose en la numeracion desde el extremo N-terminal de CNP37) a aminoacido(s) o peptidomimetico(s) naturales o no naturales no basicos, disenados en parte para reducir la union a albumina.
Ademas o como alternativa a la adicion(s), delecion(s) y/o sustitucion(s) de aminoacidos, los derivados de CNP37 se pueden conjugar en el extremo N-terminal, C-terminal, y/o un sitio interno a cualquiera de los restos que se describen en el presente documento, que incluyen, pero no se limitan a, restos de direction a hueso o cartllago (por ejemplo, dominio especlficos de direccion a hueso), restos que reducen la elimination renal (por ejemplo, restos de PEG con carga negativa), pollmeros hidrofilos (por ejemplo, PEG), secuencias de aminoacidos que comprenden uno o mas aminoacidos (por ejemplo, fragmento de ”inhibidor de NPR C” de osteocrina), carbohidratos (por ejemplo, carbohidratos reconocidos por receptores en la superficie de las celulas en las placas de crecimiento oseo), acidos hidrofobos (por ejemplo, acidos carboxllicos C5-C12 y acidos grasos naturales), y combinaciones de los mismos.
Las variantes de CNP pueden ser peptidos modificados con CNP37 que tienen mutation o mutaciones/sustitucion o sustituciones en el sitio de escision de furina (subrayado), disenadas para aumentar la resistencia in vivo a la proteasa de furina, y/o que contienen glicina (subrayado) en el extremo N-terminal, disenadas para aumentar la estabilidad en plasma y para prevenir la formation de piroglutamina. Tales variantes de CNP37 incluyen, pero no se limitan a:
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CS) (SEQ ID NO: 71);
GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CT) (SEQ ID NO: 72);
GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CU) (SEQ ID NO: 73);
GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (An. CW) (SEQ ID NO: 74);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP37, An. DB) (SEQ ID NO: 75); y
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145).
Las variantes de CNP pueden incluir peptidos CNP y variantes de los mismos que se pueden producir con el proceso de protelna de fusion que se describe en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP que se pueden producir con el proceso de protelna de fusion que se describe en el presente documento, usando escision qulmica o proteolltica o aunque escision de protelnas, incluyen:
GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-wtCNP53) (SEQ ID
NO: 179);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 75);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (wtCNP37) (SEQ ID NO: 60);
GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (fragmento de HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 144);
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 36);
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP53(M48N)] (SEQ ID
NO: 180);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP37(M32N)] (SEQ ID NO: 181);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP37(M32N)] (SEQ ID NO: 182);
GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP27(M22N)] (SEQ ID NO: 183);
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 184);
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-wtCNP53) (SEQ ID
NO: 185);
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 145);
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-wtCNP37) (SEQ ID NO: 186);
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (wtCNP34) (SEQ ID NO: 187);
P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 188);
PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Pro-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 189);
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MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-wtCNP53) (SEQ ID NO: 190);
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 191); MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-wtCNP37) (SEQ ID NO: 192); M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 193); MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Met-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 194).
Otras variantes de CNP, que incluyen peptidos CNP truncados que varlan de hCNP-17 a hCNP-53 y que tienen secuencias de tipo silvestre o adicion(s), delecion(s) y/o sustitucion(s) de aminoacidos, tambien se traen producir con el proceso de protelna de fusion que se describe en el presente documento, siempre y cuando el sitio pretendido de escision qulmica o proteolltica de la protelna de fusion no este presente dentro de la secuencia de aminoacidos de la propia variante de CNP diana. Como un ejemplo no limitante, el proceso de protelna de fusion que se describe en el presente documento se puede usar para producir wtCNP34 truncado usando escision con acido formico.
En realizaciones adicionales, para cualquiera de los peptidos CNP y variantes de CNP que se describen en el presente documento que tienen resto o restos de asparagina (Asn/N) y/o resto o restos de glutamina (Gln/Q), tanto si tienen una secuencia de tipo silvestre como una secuencia de aminoacido no natural, cualquier resto o restos de Asn y/o cualquier resto o restos de Gln se puede sustituir independientemente con cualquier otro aminoacido natural o no natural, incluyendo sustituciones conservativas tales como de Asn a Gln. Tal sustitucion o sustituciones se disenan en parte para minimizar o para evitar cualquier potential desamidacion potencial de asparagina y/o glutamina. Los ejemplos no limitantes de peptidos CNP y variantes en los que cualquier resto o restos de Asn y/o cualquier resto o restos de Gln se puede sustituir independientemente con cualquier otro aminoacido natural o no natural, incluyendo sustituciones conservativas tales como de Asn a Gln, incluyen wtCNP34, wtCNP37, Gly- wtCNP37, Pro-wtCNP37, Pro-Gly-wtCNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 144), Pro-GHKSEVAHRFK- wtCNP27 (SEQ ID NO: 188), PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), y PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36). En ciertas realizaciones, un resto de asparagina de los peptidos CNP y variantes de CNP que se describen en el presente documento no esta sustituido con glutamina, acido aspartico o acido glutamico. En ciertas realizaciones, un resto de glutamina de los peptidos CNP y variantes de CNP que se describen en el presente documento no esta sustituido con asparagina, acido aspartico o acido glutamico. Como un ejemplo no limitante, los restos 7 y/o 15 de asparagina de Pro-Gly-wtCNP37 (PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 145) pueden estar sustituidos independientemente con cualquier otro aminoacido natural o no natural, incluyendo glutamina, para evitar cualquier desamidacion potencial del resto o restos de asparagina a acido aspartico o acido isoaspartico. En ciertas realizaciones, los restos 7 y/o 15 de asparagina de Pro-Gly-wtCNP37 no estan sustituidos con glutamina, acido aspartico o acido glutamico.
Sin embargo, se entiende que la presente divulgacion incluye variantes de CNP en las que uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos susceptibles a la desamidacion o una reaccion similar a una desamidacion (por ejemplo, isomerizacion) se pueden convertir en otro resto o restos a traves de desamidacion o una reaccion similar a una desamidacion en cualquier medida, hasta un 100 % de conversion por resto convertido. En ciertas realizaciones, la divulgacion incluye variantes de CNP en las que:
(1) uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de asparagina (Asn/N) se pueden convertir en acido aspartico o aspartato, y/o en acido isoaspartico o isoaspartato, a traves de desamidacion hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido; o
(2) uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de glutamina (Gln/Q) se pueden convertir en acido glutamico o glutamato, y/o en acido isoglutamico o isoglutamato, a traves de desamidacion hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido; o
(3) uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de acido aspartico o aspartato (Asp/D) se pueden convertir en acido isoaspartico o isoaspartato a traves de una reaccion similar a la desamidacion (tambien denominada isomerizacion) hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido; o
(4) uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de acido glutamico o glutamato (Glu/E) se pueden convertir en acido isoglutamico o isoglutamato a traves de una reaccion similar a la desamidacion (tambien denominada isomerizacion) hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido; o
(5) una combinacion de lo mencionado anteriormente.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP en las que uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de asparagina, glutamina, acido aspartico, y/o acido glutamico de Pro-Gly-wtCNP37
[PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 145) se pueden convertir en (1) acido aspartico/aspartato y/o acido isoaspartico/isoaspartato, (2) acido glutamico/glutamato y/o acido isoglutamico/isoglutamato, (3) acido isoaspartico/isoaspartato, y/o (4) acido isoglutamico/isoglutamato, respectivamente, a traves de desamidacion o una reaccion similar a una desamidacion hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido, como se ha descrito anteriormente.
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En el presente documento se ensenan las variantes de CNP en las que uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de asparagina y/o acido aspartico de Pro-Gly-wtCNP37
[PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 145) se pueden convertir en (1) acido aspartico/aspartato y/o acido isoaspartico/isoaspartato, y/o (2) acido isoaspartico/isoaspartato, respectivamente, a traves de desamidacion o una reaccion similar a una desamidacion hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP en las que uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de asparagina, glutamina, acido aspartico, y/o acido glutamico de Gly-wtCNP37 [GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 75)] se pueden convertir en (1) acido aspartico/aspartato y/o acido isoaspartico/isoaspartato, (2) acido glutamico/glutamato y/o acido
isoglutamico/isoglutamato, (3) acido isoaspartico/isoaspartato, y/o (4) acido isoglutamico/isoglutamato,
respectivamente, a traves de desamidacion o una reaccion similar a una desamidacion hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP en las que uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de asparagina, glutamina, acido aspartico, y/o acido glutamico de wtCNP37 [QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 60)] se pueden convertir en (1) acido aspartico/aspartato y/o acido isoaspartico/isoaspartato, (2) acido glutamico/glutamato y/o acido
isoglutamico/isoglutamato, (3) acido isoaspartico/isoaspartato, y/o (4) acido isoglutamico/isoglutamato,
respectivamente, a traves de desamidacion o una reaccion similar a una desamidacion hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP en las que uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de asparagina, acido aspartico, y/o acido glutamico de una quimera de HSA-wtCNP27,
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 144), se pueden convertir en (1) acido aspartico/aspartato y/o acido isoaspartico/isoaspartato, (2) acido isoaspartico/isoaspartato, y/o (3) acido
isoglutamico/isoglutamato, respectivamente, a traves de desamidacion o una reaccion similar a una desamidacion hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP en las que uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de asparagina, acido aspartico, y/o acido glutamico de una quimera de Pro-HSA-wtCNP27,
PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 188), se pueden convertir en (1) acido aspartico/aspartato y/o acido isoaspartico/isoaspartato, (2) acido isoaspartico/isoaspartato, y/o (3) acido
isoglutamico/isoglutamato, respectivamente, a traves de desamidacion o una reaccion similar a una desamidacion hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de conversion por resto convertido.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP en las que uno cualquiera o mas, hasta todos, los restos de metionina (Met/M) se pueden oxidar a una forma oxidada qulmicamente factible (por ejemplo, sulfoxido y/o sulfona) hasta aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % de transformacion por resto oxidado.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP que comprenden CNP22 o variantes del mismo conjugados en el extremo N-terminal y/o C-terminal a resto o restos que facilitan la translocacion de las variantes a traves de una membrana celular o barrera celular. En una realizacion, las variantes de CNP se conjugan en el extremo N-terminal y/o C-terminal con secuencia o secuencias peptldicas que facilitan el transporte de las variantes a traves de una membrana celular o barrera celular, incluyendo traves de transportadores de peptidos activos.
El extremo N-terminal y/o C-terminal de CNP22 o una variante del mismo se puede conjugar con restos qulmicos tales como, por ejemplo, pollmeros naturales y/o sinteticos, para aumentar la masa total del peptido CNP modificado con respecto a los intervalos que por lo general se describen en el presente documento, por ejemplo, un intervalo de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa. En una realizacion, los restos qulmicos son pollmeros naturales hidrofilos o solubles en agua (por ejemplo, peptidos, carbohidratos) o sinteticos (por ejemplo, PEG (o PEO)) biocompatibles.
El extremo N-terminal y/o C-terminal de CNP22 o una variante del mismo se puede conjugar con pollmeros de PEG (o PEO) para dar como resultado una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa. La pegilacion de CNP22 o una variante del mismo se disenan, entre otros, para reducir la inmunogenicidad y para mejorar la semivida mediante la reduccion de la eliminacion renal y el aumento de la resistencia a proteasas. Un resto de PEG se puede unir al extremo N- y/o C-terminal de CNP22 o cualquier variante que se describe en el presente documento, que incluye, pero no se limita a, CNP-17 (la porcion ciclada de Cys6-Cys22 de CNP22), CNP37, y variantes de CNP17, CNP22 o CNP37 que tengan prolongacion o prolongaciones de aminoacido N- y/o C- terminal, sustitucion o sustituciones de aminoacido (s) y/o delecion o deleciones de aminoacido. En una realizacion,
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los restos Lys4 y/o Lys10 de CNP17, CNP22 o CNP37, o variantes de los mismos, estan sustituidos con un aminoacido natural o no natural (por ejemplo, Arg, Gly, Ser, Gln, Glu o Cit) o peptidomimetico que no contiene una amina primaria reactiva en una cadena lateral, para excluir cualquier PEGilacion potencial de estos restos de lisina. En una realizacion, los restos Lys4 y/o Lys10 de los peptidos cNp estan sustituidos con Arg. En otra realizacion, el resto Lys10 no esta sustituido con Arg.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP (incluyendo CNP22 y variantes del mismo) que tienen un resto PEG (o PEO) y una prolongacion de aminoacido en el extremo N-terminal contienen arginina en la posicion que precede inmediatamente a la posicion que corresponde a Gly1 de CNP22. Tales variantes de CNP PEGilado se disenan para un aumento de la resistencia a la degradacion de NEP, reduccion de la union a albumina de suero, y aumento de la actividad funcional de CNP (por ejemplo, activacion de la senalizacion de cGMP). Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP PEGilado incluyen PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), PEO12-GANRR- CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), PEO24-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 36), PEO12-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 36), PEO24-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), PEO12-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), PEO24- GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 37), PEO12-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 37), PEO24-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64), PEO12-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 64), PEO24-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), PEO12-ER- CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39), PEO24-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 39), PEO12-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 39), PEO24- R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), PEO12-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), PEO24-R-CNP22 (SEQ ID NO: 41), and PEO12-R-CNP22 (SEQ ID NO: 41), en los que PEO24 es un pollmero de PEG de 1,2 kDa monodisperso y PEO12 es un pollmero de PEG de 0,6 kDa monodisperso. En una realizacion, el pollmero de PEG (o PEO) esta conjugado con el extremo N-terminal de las variantes de CNP.
La divulgacion contempla el uso de pollmeros hidrofilos o solubles en agua (por ejemplo, PEG) que pueden variar en su tipo (por ejemplo, homopollmero o copollmero; copollmero aleatorio, alternante o de bloque; lineal o ramificado; monodisperso o polidisperso), union (por ejemplo, union hidrolizable o es tan letal como, por ejemplo, enlace de amida, imina, aminal, alquileno, o ester), sitio de conjugacion (por ejemplo, en el extremo N-terminal y/o C-terminal, preferentemente no en cualquiera de los restos en la region ciclada de CNP (que corresponde a los restos 6-22 de CNP22)), y longitud (por ejemplo, de aproximadamente 0,2, 0,4 o 0,6 kDa a aproximadamente 2, 3, 4 o 5 kDa). El pollmero hidrofilo o soluble en agua se puede conjugar con el peptido CNP por medio de qulmica basada en N- hidroxisuccinimida (NHS) o aldehldo o cualquier otra qulmica, como se sabe en la tecnica. Tales variantes de CNP se pueden generar usando, por ejemplo, wtCNP22 (2,2 kDa), CNP17 que retiene solamente la region ciclada (restos 6-22) de wtCNP22, variantes de CNP que tienen una prolongacion de aminoacido en el extremo N-terminal y/o C- terminal de CNP22 o CNP17, o variantes que tienen sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoacido, tales como, por ejemplo, GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 37), R-CNP22 (SEQ ID NO: 40), R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 38) y ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 39). En una realizacion, las variantes de PEG-CNP que tienen una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, contienen un resto de PEG (o PEO) lineal, monodisperso conjugado en el extremo N- terminal y/o C-terminal a traves de qulmica basada en NHS o aldehldo, o un resto de PEG ramificado con dos ramas o tres ramas conjugado en el extremo N-terminal y/o C-terminal a traves de qulmica basada en NHS. La divulgacion tambien incluye variantes con carga negativa de PEG-CNP disenadas para reducir la eliminacion renal, que incluyen, pero no se limitan a, compuestos carboxilados, sulfatados y fosforilados (Caliceti, Adv. Drug Deliv. Rev., 55: 1261-77 (2003); Perlman, J. Clin. Endo. Metab., 88: 3227-35 (2003); Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo., 29: 440-444 (1986); Vehaskari, Kidney Int'1, 22: 127-135 (1982)). En una realizacion, el resto de PEG (o PEO) contiene grupo o grupos carboxilo, grupo o grupos sulfato, y/o grupo o grupos fosfato.
En otra realizacion, los restos de PEG (o PEO) conjugados con el extremo N-terminal, C-terminal y/o sitio o sitios internos de las variantes de CNP que se describen en el presente documento contienen uno o mas grupos funcionales que tienen carga positiva en condiciones fisiologicas. Tales restos de PEG se disenan, entre otros, para aumentar la distribucion de tales variantes de CNP PEGilado a tejidos de cartllago. En una realizacion, tales restos de PEG contienen uno o mas grupos amino primario, secundario o terciario, grupos amonio cuaternario, y/u otros grupos que contienen amina (por ejemplo, urea).
En el presente documento se ensenan el CNP22 o variantes del mismo conjugados a traves de qulmica basada en NHS o aldehldo a PEG (r PEO) de formula (CH2CH2O)n, en la que n es un numero entero de aproximadamente 6 a aproximadamente 100, y el pollmero de PEG tiene de aproximadamente 0,3 kDa a aproximadamente 5 kDa. En otra realizacion, n es un numero entero de aproximadamente 12 a aproximadamente 50, y el pollmero de PEG tiene de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 2,5 kDa. En otra realizacion mas, n es de aproximadamente 12 a aproximadamente 24, y el pollmero de PEG tiene de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 1,2 kDa. Ademas, en otra realizacion, el grupo hidroxilo terminal del pollmero de PEG esta protegido con un grupo no reactivo. En una realizacion particular, el grupo de proteccion terminal es un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo inferior tal como metilo.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP que tienen uno o mas enlaces peptldicos o isoesteres de enlace peptldico que tienen una reduccion de la susceptibilidad a la escision con peptidasas que incluyen endopeptidasa neutra (NEP). La NEP es una endopeptidasa dependiente de cinc unida a membrana que escinde un
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enlace peptldico de sustrato en el extremo amino de restos hidrofobos grandes. Por lo tanto, la modification de un enlace peptldico en un sitio de escision por NEP a un enlace peptldico o no peptldico natural puede excluir o disminuir la eficacia de la escision con NEP.
Para ANP y CNP, se informa que la escision con NEP se produce en primer lugar en el enlace Cys6-Phe7 dentro de la region ciclada, a continuation en cualquier parte a traves del resto de las estructuras. Para BNP, se informa que la escision se produce en primer lugar en el extremo N-terminal del peptido, y a continuacion dentro de la estructura clclica. Aunque se informa que el sitio de escision con NEP primario en CNP es el enlace Cys6-Phe7, cuando wtCNP22 se expuso a la digestion con NEP durante 2,5 minutos in vitro, todos los sitios posibles se hidrolizaron de forma inesperada, con los enlaces peptldicos Cys6-Phe7 y Gly8-Leu9 siendo ligeramente los mas labiles, como se describe en el Ejemplo 2.
La especificidad de sustrato de NEP se determina principalmente con dos subsitios de union al sustrato, S1' y S2' (Oefner et al., J. Mol. Biol. 296: 341-349 (2000)). El sitio S1' acepta un resto de P1' hidrofobo grande del cual el enlace peptldico N-terminal se somete a hidrolisis (por ejemplo, Phe, Leu, Ile y Met). El sitio S2' por lo general prefiere un resto mas pequeno, denominado P2' (por ejemplo, Gly o Ser). En el caso de CNP, se informa que Phe7 es el resto de P1' preferente para el sitio S1' de NEP, mientras que Gly8 es el resto P2' preferente para el sitio the S2'. Dado que estos dos subsitios pueden acomodar en conjunto solamente un cierto tamano de cadena lateral total, cualquier aumento en el tamano total de los restos P1'-P2' de CNP c puede interrumpir de forma potencial la union a NEP. Por ejemplo, la adicion de un atomo de cloruro en la position 3 del anillo aromatico Phe7 de P1' (es decir, 3-Cl- Phe7) puede modificar de forma potencial (por ejemplo, desestabilizar) interacciones entre CNP y los sitios de escision con NEP, por ejemplo en el subsitio S1'. La adicion de un grupo butilo terciario al resto Gly8 de P2' mas pequeno (es decir, tBu-Gly8) puede interrumpir potencialmente la interaction entre CNP y el subsitio S2'.
Se ensena que las variantes de CNP que incluyen CNP que tienen un aumento del tamano de los restos P1'-P2', tales como Phe7-Gly8, interfieren con el reconocimiento de sustrato en el sitio activo, reduciendo de ese modo la susceptibilidad a la escision con NEP. Los restos de aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales y/o peptidomimetico se sustituyen por uno o mas restos hidrofobos P1' grandes, que incluyen, pero no se limitan a, Phe7, Leu9, Leu11, Ile14, Met17 y Leu20, y/o f por uno o mas restos P2' mas pequenos, que incluyen, pero no se limitan a, Cys6, Gly8, Gly15, Ser16 y Gly19.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP que comprenden al menos un aminoacido modificado y/o al menos un enlace peptldico modificado, en al menos un resto implicado en el reconocimiento de sustrato y/o escision con NEP, en las que los aminoacidos modificados y los enlaces peptldicos modificados pueden ser aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, peptidomimeticos y/o isoesteres de enlace peptldico. En una realizacion, el sitio de escision con NEP en CNP entre Cys6 y Phe7 esta modificado. En una realizacion relacionada, el enlace peptldico (-C(=O)-NH-) entre Cys6 y Phe7 esta sustituido con uno de los siguientes isoesteres de enlace peptldico:
-CH2-NH-,
-C(=O)-N(R)-, en el que el grupo amida esta alquilado con cualquiera de los siguientes grupos R: metilo, etilo, n- propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo,
-C(=O)-NH-CH2-,
-CH2-S-,
-CH2-S(O)n-, en el que n es 1 o 2,
-CH2-CH2-,
-CH=CH-,
-C(=O)-CH2-,
-CH(CN)-NH-,
-CH(OH)-CH2-,
-O-C(=O)-NH-, o -NHC(=O)NH-.
En otra realizacion, las variantes de CNP se representan con la formula:
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20- Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO: 90), en la que:
(x) y (z) independientemente pueden estar ausente o se puede seleccionar entre el grupo que consiste en compuestos de direction a hueso sinteticos tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso o cartllago tales como, por ejemplo, poliAsp y poliGlu; secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de dominios de direccion a hueso de protelnas oseas tales como o, por ejemplo, osteopontina, osteocalcina y sialoproteina (Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev., 57: 1049-76 (2005)); moleculas polimericas y no polimericas que reducen la elimination renal tales como, por ejemplo, los PEG con carga negativa; y pollmeros naturales (por ejemplo, los que contienen aminoacidos, acidos grasos y/o carbohidratos) y pollmeros sinteticos (por ejemplo, los PEG) que aumentan la resistencia de la variante de
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CNP a la degradacion con NEP aumentando la masa total de la variante de CNP a los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa;
(b) y (c) pueden ser Cys6 y Phe7 de tipo silvestre, otro aminoacido natural o un aminoacido no natural, o puede contener un isoester de enlace peptldico como se describe en el presente documento para aumentar la resistencia a la escision con NEP; y
(d) puede ser Gly8 de tipo silvestre, o puede ser un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural (por ejemplo, t-Bu-Gly) de mayor tamano para reducir la union a NEP.
En una realizacion, tales variantes de CNP contienen al menos un aminoacido modificado en (b), (c) y/o (d).
Otros enlaces peptldicos dentro de CNP se pueden escindir incluso si CNP22 o una variante del mismo tiene un enlace peptldico o isoesteres de enlace peptldico resistentes a NEP en Cys6-Phe7, incluyendo los enlaces Gly8- Leu9, Lysl0-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Metl7, y Gly19-Leu20. Por lo tanto, la divulgacion incluye variantes de CNP que tienen isoester(es) de enlace peptldico en uno u otros sitios de escision con NEP mas ademas del enlace Cys6- Phe7, en las que los the isoesteres de enlace peptldico incluyen los que se describen en el presente documento.
En el presente documento se ensenan las variantes de CNP que tienen un analogo de cistelna en Cys6 y/o Cys22, que incluye, pero no se limita a, homocistelna, penicilamina, acido 2-mercaptopropionico, y acido 3- mercaptopropionico. En una realizacion, tales variantes de CNP tienen un dominio clclico formado por un enlace disulfuro entre Cys6 o analogo y Cys22 o analogo de tipo silvestre.
Uno o mas restos de CNP22 o una variante del mismo, hasta todos los restos, pueden estar sustituidos con un D- aminoacido. La sustitucion de un L-aminoacido con un D-aminoacido esencialmente mueve la cadena lateral aproximadamente 120 grados desde su posicion original, interrumpiendo potencialmente de ese modo la union del peptido CNP a NEP. En una realizacion especlfica, L-Phe en Phe7 esta sustituido con su enantiomero D, D-Phe.
Un beta aminoacido tal como, por ejemplo, acido 3-amino-2-fenilpropionico (o 2-fenil-beta-alanina), puede sustituir al alfa- aminoacido Phe7 de tipo silvestre. El uso de un beta-aminoacido aumenta de forma eficaz la longitud de la estructura principal peptldica con una unidad de metileno. La resistencia a proteasas puede resultar del cambio en la conformacion del sustrato o el aumento de la distancia entre cadenas laterales de aminoacidos.
Los ejemplos no limitantes de variantes de CNP22 que tienen un alfa-aminoacido, un beta-aminoacido o un isoester de enlace peptldico no naturales incluyen:
GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC (Analogo A) (SEQ ID NO: 56), GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (Analogo B) (SEQ ID NO: 57), GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (Analogo E) (SEQ ID NO: 136), GLSKGCF-(tBu-Gly)-LKLDRIGSMSGLGC (Analogo F) (SEQ ID NO: 58), GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (Analogo G) (SEQ ID NO: 137), y GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC (Analogo H, formado usando fenilpropionico) (SEQ ID NO: 59).
Las variantes de CNP tienen una masa total caracterizada por los intervalos que se describen presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 para un aumento de la resistencia a la degradacion de NEP, y se representan con la formula:
acido 3-amino-2-
por lo general en el o 7 kDa, disenados
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-(j)20-Gly21- Cys22-(z) (SEQ ID NO: 46), en la que:
(x) y (z) independientemente pueden estar ausentes o se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en compuestos de direccion a hueso sinteticos tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso o cartllago tales como, por ejemplo, poliAsp y poliGlu; secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de dominios de direccion a hueso de protelnas oseas tales como, por ejemplo, osteopontina, osteocalcina y sialoproteina; restos polimericos y no polimericos que reducen la eliminacion renal tales como, por ejemplo, los PEG con carga negativa; pollmeros que contienen, por ejemplo, aminoacidos, acidos hidrofobos, y/o carbohidratos; y pollmeros hidrofilos sinteticos tales como, por ejemplo, los PEG;
(a) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (a) es Arg;
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(b) se selecciona entre el grupo que consiste en Cys e isoesteres de enlace peptldico entre Cys6 y Phe7 tales como, por ejemplo, Cys-CH2-NH;
(c) se selecciona entre el grupo que consiste en L-Phe; D-Phe; acido 3-amino-2-fenilpropionico; derivados N- alquilados de Phe, en los que el grupo N-alquilo es metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo; y analogos de Phe, en los que una o mas posiciones en orto, meta, y/o para del anillo de benceno del analogo de Phe estan sustituidas con uno o mas sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en halogeno, hidroxilo, ciano, alquilo Ci-6 lineal o ramificado, alcoxi Ci-6 lineal o ramificado, halo-alquilo Ci-6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-10, heterociclilo, arilo C6-14 y heteroarilo (ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tirosina, 3-clorofenilalanina, 2,3-cloro-fenilalanina, 3-cloro-5-fluoro- fenilalanina, 2-cloro-6-fluoro-3-metil-fenilalanina), o en el que el anillo de benceno del analogo de Phe puede estar sustituido con otro grupo arilo (los ejemplos no limitantes incluyen 1- y 2-naftilalanina) o con un grupo heteroarilo (los ejemplos no limitantes incluyen piridilalanina, tienilalanina y furilalanina);
(d) se selecciona entre el grupo que consiste en Gly, terc-butil-Gly (tBu-Gly), Thr, Ser, Val y Asn;
(e) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, Ser, Thr e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(f) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (f) no es Arg;
(g) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(h) se selecciona entre el grupo que consiste en Ile, tBu-Gly, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Ile;
(i) se selecciona entre el grupo que consiste en Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, acido 2-aminobutlrico (Abu) y acido 2-amino-isobutlrico (Aib); y
(j) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, norleucina (Nle), homoleucina (Hleu), Val, terc-butil-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu.
Las variantes de CNP tienen una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, disenados para aumentar la resistencia a la escision con NEP, y se representan con la formula:
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-(i)15-Ser16-(j)17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21- Cys22-(z) (SEQ ID NO: 143), en la que:
(x) y (z) independientemente pueden estar ausentes o se puede seleccionar entre el grupo que consiste en compuestos de direccion a hueso sinteticos tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de aminoacidos utiles en direccion a hueso o cartllago tales como, por ejemplo, poliAsp y poliGlu; secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de dominios de direccion a hueso de protelnas oseas y derivados de los mismos, tales como, por ejemplo, protelnas de fusion o secuencias peptldicas de osteopontina, osteocalcina, sialoproteina, etc.; restos que reducen la eliminacion renal, que incluye, pero no se limita a, pollmeros hidrofilos o solubles en agua tales como, por ejemplo, moleculas de PEG cargadas; y textos que comprenden, por ejemplo, los PEG, aminoacidos, carbohidratos, y/o acidos hidrofobos;
(a) puede ser la Lys de tipo silvestre en esa posicion o puede estar sustituida con una sustitucion de aminoacido conservativa o un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no tenga una amina primaria reactiva en una cadena lateral, que incluye, pero no se limita a, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln, Ser o Glu, en la que en una realizacion (a) es Arg;
(b) se selecciona entre el grupo que consiste en Cys e isoesteres de enlace peptldico entre Cys6 y Phe7 tales como, por ejemplo, Cys-CH2-NH;
(c) se selecciona entre el grupo que consiste en L-Phe; D-Phe; acido 3-amino-2-fenilpropionico; derivados N- alquilados de Phe, en los que el grupo N-alquilo es metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo; y analogos de Phe, en los que una o mas posiciones en orto, meta, y/o para del anillo de benceno del analogo de Phe estan sustituidas con uno o mas sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en halogeno, hidroxilo, ciano, alquilo C1-6 lineal o ramificado, alcoxi C1-6 lineal o ramificado, halo-alquilo C1-6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-10, arilo C6-14, heterociclilo y heteroarilo
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(ejemplos incluyen, pero no se limitan a, tirosina, 3-clorofenilalanina, 2,3-cloro-fenilalanina, 3-cloro-5-fluoro- fenilalanina, 2-cloro-6-fluoro-3-metil-fenilalanina), o en el que el anillo de benceno del analogo de Phe puede estar sustituido con otro grupo arilo (los ejemplos no limitantes incluyen 1- y 2-naftilalanina) o con un grupo heteroarilo (los ejemplos no limitantes incluyen piridilalanina, tienilalanina y furilalanina);
(d) se selecciona entre el grupo que consiste en Gly, terc-butil-Gly, Thr, Ser, Val y Asn;
(e) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, Ser, Thr, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(f) se selecciona entre el grupo que consiste en Lys, Arg, Gly, 6-hidroxi-norleucina, citrulina (Cit), Gln y Ser;
(g) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, Asn, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu;
(h) se selecciona entre el grupo que consiste en Ile, terc-butil-Gly (tBu-Gly), Asn, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Ile;
(i) se selecciona entre el grupo que consiste en Gly, Arg, Ser y Asn;
(j) se selecciona entre el grupo que consiste en Met, Val, Asn, beta-Cl-Ala, acido 2-aminobutlrico (Abu) y acido 2-amino-isobutlrico (Aib); y
(k) se selecciona entre el grupo que consiste en Leu, norleucina (Nle), homoleucina (Hleu), Val, terc-butil-Ala (tBu-Ala), Arg, Thr, Ser, e isoesteres de enlace peptldico tales como, por ejemplo, N-Me-Leu.
Para mejorar la administracion de las variantes de CNP a los sitios diana de trastornos relacionados con los huesos (por ejemplo, displasia esqueleticas), las variantes de CNP se pueden unir (por ejemplo, en el extremo N-terminal y/o C-terminal) a restos de direction a hueso o cartllago. Los ejemplos no limitantes de restos de direction a hueso o cartllago incluyen bisfosfonatos; hidroxiapatita; glucosarnina; colageno (por ejemplo, colageno de tipo X); poliAsp; poliGlu; y secuencias de aminoacidos obtenidas a partir de dominios de direccion a hueso de protelnas oseas tales como, por ejemplo, osteocrina, osteopontina, osteocalcina y sialoproteina.
Ademas de ser menos susceptibles a la escision con NEP, las variantes de CNP tienen potencialmente una reduction de la afinidad con respecto al receptor de elimination de NPR-C, a la vez que mantienen la funcionalidad de CNP. Ademas de la degradation mediada por NEP, la semivida de CNP22 se ve influida por el receptor de eliminacion, NPR-C, que comparte una homologla de secuencias de un 58 % con el dominio de union a peptido extracelular de NPR-B. El CNP22 se une estrechamente no solamente a NPR-B (afinidad de 7-30 pM), sino tambien a NPR-C (11-140 pM) (Bennett, B.D. et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-67 (1991); Koller K.J. I. Goeddel, D.V., Circulation, 86: 1081-88 (1992); Suga, S. et al., Endocrinology, 130: 229-39 (1992)). A pesar de que la estructura cristalina de NPR-B todavla se tiene que informar, la homologla de secuencia es as! como similitudes entre las estructuras cristalinas de NPR-C y NPR-A (He, X.-L. et al., Science, 293 (5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279 (27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361 (4): 698-714 (2006)) sugieren que NPR-B probablemente supone un plegamiento estructural global similar.
Por lo tanto, se construyo un modelo de homologla de NPR-B basandose en el alineamiento de secuencias basado en la estructura y estructuras cristalograficas de los siguientes sistemas relacionados: CNP unido a NPR-C, ANP unido a NPR-A, y ANP unido a NPR-C (He, X.-L. et al., Science, 293 (5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279 (27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361 (4): 698-714 (2006)). Basandose en las observaciones de que parece que el receptor determina la conformation del peptido unido, y que NPR-B se parece en la mayor medida a NPR-A con respecto a la estructura primaria y propiedades funcionales, el modelo de homologla de NPR-B/CNP se construyo con la estructura cristalina de NPR-A/ANP como un modelo. Los datos de serialization publicados de variantes de CNP (documento de patente de Estados Unidos n.° 5.434.133 y Publication de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 2004/0138134 A1), y de variantes de ANP funcionales que ya no se unen a NPR-C (Cunningham, EMBO 13 (11) 2508-15, 1994) se usaron para refinar e interpretar el modelo de NPR- B/CNP.
La presente divulgation incluye variantes de CNP disenadas para aumentar la selectividad de NPR-B basandose en un modelo estructural basado en homologla del complejo NPR-B/CNP. Combinando los datos de estructura experimental de ser informaticos de los peptidos natriureticos unidos a los diversos receptores con los datos funcionales publicados, se generaron variantes de CNP que continuan uniendose a NPR-B, pero que potencialmente pueden tener una reduccion de la afinidad hacia el receptor de eliminacion de NPR-C. Por ejemplo, NPR-C tiene una insertion unica en una estructura de bucle en el sitio de union a peptido, colocando sus restos del bucle mas cerca a tales restos de peptido tales como Gly8 de CNP (o Gly9 de ANP), en comparacion con los respectivos restos de bucle en NPR-A y NPR-B. Los estudios mas tempranos indicaban que la mutation de G9T en ANP contribuye a reducir la afinidad hacia NPR-C, aumentando de ese modo la selectividad de NPR-A (Cunningham, EMBO J., 13 (11): 2508-15 (1994)). Por consiguiente, se generaron variantes de CNP para sustituir el correspondiente resto de
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Gly8 con un resto mas grande (Ser, Val, Thr o Asn) para interrumpir la union de CNP a NPR-C sin influir en su union a NPR-B. Ademas, se introdujeron una o mas mutaciones en el extremo C-terminal de CNP, que incluyen Gly15 a Gly21, que se predice que interaction con restos especlficos de receptor, basandose en los analisis estructurales detallados de los complejos de receptor/peptido. Por ejemplo, una mutacion de G19R en CNP22 no da como resultado una perdida significativa de la actividad de senalizacion de NPR-B. Sin embargo, esta mutacion no se puede modelar en la estructura cristalina disponible de NPR-C/CNP sin alterar las conformaciones de los restos vecinos. Estas observaciones sugieren que la mutacion de G19R puede interrumpir de forma selectiva la union de CNP a un receptor en particular, tal como NPR-C.
Las variantes de CNP pueden tener sustitucion o sustituciones en uno o mas sitios de Gly en las posiciones 1, 5, 8, 15, 19 y 21, para reducir la flexibilidad conformacional y de ese modo aumentar la especificidad del receptor. Los analisis comparativos de estructuras cristalinas de ANP unido a to NPR-C y NPR-A (Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279: 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361: 698-714 (2006)) indican que la flexibilidad conformacional de ANP puede desempenar un papel importante en la determinacion de la selectividad del receptor.
Las variantes de CNP funcionales con afinidad potencialmente reducida hacia NPR-C pueden tener una mas de las siguientes sustituciones de aminoacido: G1R, G1E, G5R, G5Q, G5S, F7Y, G8T, G8S, G8V, G8N, L9S, L9T, K10Cit, K10Q, K10S, I14N, G15R, G15S, G15N, G15Cit, S16Q, M17V, M17N, G19S, G19R, G19N, L20V, L20R, L20T, L20S, G21S, G21T y G21R. En una realizacion, las variantes de CNP pueden tener sustituciones en multiples puntos en las posiciones 1, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 19, 20 y/o 21, y pueden tener opcionalmente modificaciones en cualquiera de las otras posiciones en la secuencia peptldica de la variante.
En una realizacion mas, las variantes de CNP que se describen en el presente documento se pueden conjugar con restos, hasta una masa total caracterizada por los intervalos que se describen por lo general en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, en el extremo N- terminal, el extremo C-terminal y/o un sitio interno, para facilitar la direccion a hueso/cartllago, reducir NPR-C y la eliminacion renal, aumentar la resistencia a la degradacion con NEP, y/o aumentar la funcionalidad de CNP. En una realizacion, las variantes de CNP no se conjugan con un resto polimerico en un sitio dentro de la region clclica (que corresponde de Cys6 a Cys22 de CNP22). Los ejemplos no limitantes de restos polimericos o no polimericos que se pueden conjugar con las variantes de CNP incluyen compuestos de direccion a hueso sinteticos tales como, por ejemplo, bisfosfonatos; secuencias de peptidos que se dirigen a hueso/cartllago tales como, por ejemplo, poliAsp y poliGlu; secuencias peptldicas obtenidas a partir de dominios de direccion a hueso de protelnas oseas tales como, por ejemplo, osteopontina, osteocalcina y sialoproteina; secuencias peptldicas obtenidas a partir de los dominios funcionales de protelnas morfogeneticas oseas tales como, por ejemplo, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 y BMP8a; secuencias peptldicas obtenidas a partir de polipeptidos de origen of natriuretico tales como, por ejemplo, NPPC, ANP y BNP; otros restos polimericos o no polimericos naturales tales como, por ejemplo, carbohidratos, acidos grasos y fosfollpidos; pollmeros hidrofilos sinteticos biocompatibles tales como, por ejemplo, PEG (o PEO); restos polimericos o no polimericos hidrofobos tales como, por ejemplo, acido heptanoico y acido pentanoico; y combinaciones de los mismos.
Las variantes de CNP que se describen en el presente documento pueden tener una actividad funcional sustancialmente similar o mejor que CNP22, por ejemplo, con respecto a la estimulacion de la produccion y senalizacion de cGMP. En una realizacion, las variantes de CNP in vitro o in vivo estimulan la produccion de al menos aproximadamente un 50 % del nivel de cGMP producido con la misma concentracion de wtCNP22 (por ejemplo, 1 uM). En ciertas realizaciones, las variantes de CNP retienen al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o un 100 % de la actividad estimulacion de cGMP de CNP22 de tipo silvestre in vitro o in vivo. En otra realizacion, las variantes de CNP presentan un aumento de la actividad estimulacion de cGMP en comparacion con CNP22. En ciertas realizaciones, las variantes de CNP in vitro o in vivo estimulan la produccion de al menos aproximadamente un 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, un 500 % o mas del nivel de cGMP producido con la misma concentracion de wtCNP22 (por ejemplo, 1 uM).
En una realizacion, la presente divulgacion excluye todos los CNP-53 de tipo silvestre, CNP-22 de tipo silvestre, CNP-17 de tipo silvestre, BNP de tipo silvestre, y ANP de tipo silvestre de origen humano y de origen no humano conocidos. Por ejemplo, en una realizacion, la divulgacion excluye el humano CNP-17, CNP-22 humano, CNP-22 de pollo (que corresponde a hCNP-22 (Leu9Val)), CNP-22 de trucha y anguila (que corresponde a hCNP-22 (Leu2Trp, Ser3Asn, Lys4Arg)), CNP22-I de rana (que corresponde a hCNP-22 (Leu2Tyr, Lys4Arg, Leu9Val, Ser16Ala, Met17Phe)), CNP22-II de rana (que corresponde a hCNP-22 (Leu2Thr, Ser16Ala)), CNP-53 humano, y CNP-53 de cerdo y rata (que corresponde a hCNP-53 (Gln17His, Ala28Gly)). En otra realizacion, la divulgacion excluye fragmentos de NPPC, proCNP y CNP-53 que se producen por escision proteolltica in vivo en seres humanos y animales no humanos. En otra realizacion mas, de la divulgacion se excluyen los siguientes fragmentos truncados de CNP-53: CNP-50, CNP-46, CNP-44, CNP-39, CNP-30, CNP-29, CNP-28, CNP-27 y CNP-26 humano de tipo silvestre.
En una realizacion mas, la presente divulgacion excluye peptidos CNP y fragmentos de los mismos aislados o buscados a partir de las especies de tiburones, Triakis scyllia y Scyliorhinus canicula (vease, por ejemplo, M. Takano et al., Zool. Sci., 11: 451-454 (1994)), que incluyen:
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RLLKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 204); LKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 205); KDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 206); y GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 207).
En otra realizacion, la presente divulgacion excluye peptidos CNP y fragmentos de los mismos aislados o buscados a partir de las especies de tiburon, Lamna ditropis (vease, por ejemplo, M. Takano et al., Zool. Sci., 11: 451-454 (1994)), que incluyen:
RLLKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 208); LKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 209); KDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 210); FKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-29) (SEQ ID NO: 211); y GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 212).
Ademas, en otra realizacion, la presente divulgacion excluye peptidos CNP y fragmentos de los mismos aislados de la especie de tiburon, Squalus acantias (vease, por ejemplo, M. Takano et al., Zool. Sci., 11: 451-454 (1994)), que incluye:
RLLQDLSNNPLRFKGRSKKGPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 213); y GPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 214).
En una realizacion mas, la presente divulgacion excluye peptidos de CNP aislados de medaka y pez globo, denominados "CNP-1", "CNP-2", "CNP-3" y "CNP-4" en K. Inoue et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 100 (17): 10079-10084 (2003): GWNRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-1 de medaka y pez globo) (SEQ ID NO: 215); PMVAGGGCFGMKMDRIGSISGLGC (CNP-2 de medaka) (SEQ ID NO: 216); GRSSMVGGRGCFGMKIDRIGSISGLGC (CNP-2 de globo) (SEQ ID NO: 217); GGMRSCFGVRLERIGSFSGLGC (CNP-3 de medaka) (SEQ ID NO: 218); GGLRSCFGVRLARIGSFSGLGC (CNP-3 de pez globo) (SEQ ID NO: 219); GGSTSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (CNP-4 de medaka) (SEQ ID NO: 220); y GGSSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (CNP-4 de pez globo) (SEQ ID NO: 221).
En otra realizacion adicional otra realizacion, la presente divulgacion excluye CNP-39 aislado de veneno de ornitorrinco y el fragmento de CNP-22 del mismo, denominado "ovCNP-39" y "ovCNP-39 (18-39)" en G. de Plater et al., Toxicon., 36 (6): 847-857 (1998):
LLHDHPNPRKYKPANKKGLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC (ovCNP-39) (SEQ ID NO: 222); y GLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC (ovCNP-39(18-39)) (SEQ ID NO: 223).
En otra realizacion, la presente divulgacion excluye los siguientes peptidos como seres de la reforma especlfica en el documento US 2007/0197434:
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys (SEQ ID NO: 224); Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys (SEQ ID NO: 225); Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Ala-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys (SEQ ID NO: 226); Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys (SEQ ID NO: 227);
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg- Tyr (SEQ ID NO: 228); y
Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 229).
En otra realizacion mas, la divulgacion excluye peptidos de la SEQ ID NO: 10, que se desvelan de forma generica en el documento US 2007/0197434, en la que tales peptidos son variantes de CNP-17 que tienen ciertas sustitucion o sustituciones de aminoacido natural en la posicion o posiciones (s) 4, 5, 6, 11, 12, 14 y/o 14. Ademas, en otra realizacion, la divulgacion excluye opcionalmente peptidos que corresponden a to hCNP-53 (Ser47Ala), hCNP-53 (Met48Gln), hCNP-53 (Met48Ala), y hCNP-53 (C-term.)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr.
En una realizacion, la presente divulgacion excluye los peptidos de SEQ ID NOs 1-4 y 6-71 como se desvela de forma especlfica en el documento de patente de Estados Unidos n.° 7.276.481. En otra realizacion, la divulgacion excluye peptidos de la SEQ ID NO 5, que se desvelan de forma generica el documento de patente de Estados Unidos n.° 7.276.481, en la que tales peptidos son variantes de CNP17 que tienen al menos una sustitucion de aminoacido natural en Leu9, LyslO, Leul11, Ser16, Met17, Gly19, y/o Leu20. Ademas, en otra realizacion, se excluyen variantes de CNP17 en las que CNP17 o variantes del mismo contienen N-Me-Phe7, o N-Me-Phe7 y N-Me- Leu11. En una realizacion mas, la divulgacion excluye variantes de CNP17 de la SEQ ID NO 5, como se desvela en el documento de patente de Estados Unidos n.° 7.276.481, que estan fusionadas o conjugadas con hormona de crecimiento (GH), factor 1 de crecimiento de tipo insullnico (IGF-1), o hormona tiroidea (TH). En otra realizacion mas,
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se excluyen variantes de CNP22 en las que CNP22 esta fusionado con GH, IGF-1 o TH, o unido a GH, IGF-1 o TH a traves de un conector (por ejemplo, un conector peptidico). Ademas, en otra realizacion, se excluyen variantes de CNP17 en las que CNP17 o variantes del mismo estan conjugados con biotina o fluoresceina en el extremo N- terminal o en el extremo C-terminal.
En una realizacion mas, la presente divulgacion excluye los peptidos de los Compuestos N°s 1-27, y SEQ ID NOs 117, 22-24, 30, 31 y 40-42 como se desvela de forma especifica en el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.434.133. En otra realizacion, la divulgacion excluye peptidos de las SEQ ID NOs 18-21 y 25-29, que se desvelan de forma generica en el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.434.133. Ademas, en otra realizacion, la divulgacion excluye los peptidos de las SEQ ID NOs 1-4 y 9 como se desvela de forma especifica en el documento WO 94/20534.
C. Sintesis y purificacion de variantes de CNP
En algunas realizaciones, las variantes de CNP que se describen en el presente documento se producen mediante expresion recombinante, usando ciertas tecnicas conocidas en la tecnica en ciertas realizaciones. Vease, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion. Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes I e II, D. N. Glover, Ed. (1985); y Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
En ciertas realizaciones, las variantes de CNP que se describen en el presente documento se producen mediante un proceso recombinante que comprende cultivar en un medio una celula hospedadora que comprende un primer polinucleotido que codifica una variante de polipeptido CNP unido a un segundo polinucleotido que codifica un peptido o proteina escindible en condiciones que dan como resultado la expresion de un polipeptido de fusion codificado por los polinucleotidos, en el que el polipeptido de fusion comprende la variante de polipeptido CNP unida directamente al peptido o proteina escindible o unida indirectamente al mismo a traves de un conector. En algunas realizaciones, la celula hospedadora se transforma con un vector de expresion que comprende el polinucleotido que codifica la variante de polipeptido CNP unida al polinucleotido que codifica el peptido o proteina escindible. En ciertas realizaciones, el polipeptido de fusion se expresa como una proteina soluble o como un cuerpo de inclusion. El polipeptido de fusion expresado se puede aislar de la celula hospedadora o medio de cultivo, y el polipeptido de fusion aislado se puede poner en contacto con un agente de escision para liberar la variante de CNP.
Las celulas hospedadoras usadas para producir variantes de CNP pueden ser celulas bacterianas, de levadura, de insecto, de vertebrado no mamifero, o de mamifero. Las celulas bacterianas incluyen, pero no se limitan a, lineas celulares y cepas de E. coli. Los ejemplos no limitantes de lineas celulares y cepas de E. coli incluyen BL21, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pGro7, ArcticExpress(DE3), C41 [tambien denominado C41(DE3)], C43 [tambien denominado C43(DE3)], Origami B(DE3), Origami B(DE3)pLysS, KRX, y Tuner(DE3). En una realizacion, las variantes de CNP y proteinas de fusion a CNP se producen usando celulas BL21(DE3). Las celulas de mamifero incluyen, pero no se limitan a, celulas de hamster, mono, chimpance, perro, gato, bovino, porcino, raton, rata, conejo, oveja y humanas. Las celulas hospedadoras pueden ser celulas inmortalizadas (una linea celular) o celulas no inmortalizadas (primarias o secundarias) y puede ser cualquiera de una gran diversidad de tipos de celulas, tales como, pero no limitados a, fibroblastos, queratinocitos, celulas epiteliales (por ejemplo, celulas epiteliales de mama, celulas epiteliales intestinales), celulas de ovario (por ejemplo, celulas de ovario de hamster chino o CHO), celulas endoteliales, celulas de la glia, celulas neuronales, elementos de la sangre formados (por ejemplo, linfocitos, celulas de medula osea), condrocitos y otras celulas derivadas de hueso, y precursores de estos tipos de celulas somaticas. Las celulas hospedadoras que contienen la variante de ADN o aRn de CNP se cultivan en condiciones apropiadas para el crecimiento de las celulas, expresion del ADN o ARN e identificacion/seleccion de celulas que expresan la variante de CNP.
En algunas realizaciones, las celulas hospedadoras crecen o se cultivan durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C. En ciertas realizaciones, las celulas hospedadoras crecen o se cultivan durante un periodo de tiempo a aproximadamente 20 °C, 22 °C, 25 °C, 28 °C, 30 °C, 35 °C o 37 °C. En ciertas realizaciones, las celulas hospedadoras crecen o se cultivan durante un periodo de tiempo a aproximadamente 35 °C o 37 °C.
Los polinucleotido recombinantes que codifican variantes de polipeptido CNP (incluyendo proteinas de fusion a CNP) se expresan en un vector de expresion que comprende un polinucleotido recombinante que comprende secuencias de control de expresion unidas de forma operativa a una secuencia de nucleotidos a expresar. Un vector de expresion comprende eficientes elementos de actuacion en cis para expresion; otros elementos para expresion pueden ser suministrados por by la celula hospedadora o sistema de expresion in vitro. Los vectores de expresion incluyen todos los conocidos en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, cosmidos, plasmidos (por ejemplo, desnudo o contenido en liposomas) y virus que incorporan el polinucleotido recombinante. El vector de expresion se inserta en una celula hospedadora apropiada, a traves de transformation o transfection, para la expresion del polinucleotido que codifican polipeptido (vease, por ejemplo, Sambrook et al., (mencionado anteriormente)).
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Los ejemplos no limitantes de vectores de expresion contemplados para la produccion de variantes de CNP, incluyendo protelnas de fusion a CNP escindibles, incluyen pJexpress, pJexpress401, pJexpress404, pET-15b, pET- 21a, pET-22b, pET-31b, pET-32a, pET-41a, pMAL, pMAL-c2X, pQE-30, pET-SUMO, y pTYB11 o expresion de construcciones en particular puede generar variantes de CNP solubles (incluyendo protelnas de fusion a CNP) o variantes de CNP insolubles (incluyendo protelnas de fusion a CNP) en forma de cuerpos de inclusion.
En algunas realizaciones, la expresion del polinucleotido o polinucleotidos que codifican una variante de CNP o protelna de fusion a CNP aumenta usando un vector inducible por isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG). En algunas realizaciones, las celulas hospedadoras crecen o se cultivan durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C, en presencia de IPTG. En ciertas realizaciones, las celulas hospedadoras crecen o se cultivan durante un periodo de tiempo a aproximadamente 20 °C, 22 °C, 25 °C, 28 °C, 30 °C, 35 °C o 37 °C en presencia de IPTG. En ciertas realizaciones, las celulas hospedadoras crecen o se cultivan durante un periodo de tiempo a aproximadamente 35 °C o 37 °C en presencia de IPTG 1 mM.
En otras realizaciones, las celulas hospedadoras se cultivan con IPTG a una concentracion de aproximadamente 0,4 mM a aproximadamente 2 mM, o de aproximadamente 0,4 mM a aproximadamente 1,5 mM, o de aproximadamente 0,4 mM a aproximadamente 1 mM. En ciertas realizaciones, el IPTG esta en una concentracion de aproximadamente 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o 2 mM. En una realizacion, la concentracion de IPTG es aproximadamente 1 mM.
En ciertas realizaciones, las variantes de CNP que se describen en el presente documento se expresan de forma recombinante como protelnas de fusion que comprenden una variante de polipeptido CNP y una protelna vehlculo escindible o etiqueta escindible (por ejemplo, etiqueta peptldica), en las que la protelna de fusion comprende la variante de polipeptido CNP unida directamente con la protelna o etiqueta vehlculo escindible o unida indirectamente a la misma a traves de un conector. El uso de una protelna o etiqueta vehlculo facilita, por ejemplo, la deteccion, aislamiento y/o purificacion de la protelna de fusion. Las protelnas y etiquetas vehlculo escindibles incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de histidina (por ejemplo, hexa-His); factor TAF12 de transcripcion humano (TAF12), fragmentos de TAF12, dominio de plegamiento de histona TAF12, mutantes de TAF12 y fragmentos de los mismos, TAF12 (C/A), TAF12 (D/E), TAF12 (4D/4E), TAF12 (6D/6E), TAF12 (10D/10E), TAF12 (C/A y D/E), TAF12 (C/A y 4D/4E), TAF12 (C/A y 6D/6E), TAF12 (C/A y 10D/10E); cetosteroide isomerasa (KSI); protelna de union a maltosa (MBP); p-galactosidasa (p-Gal); glutation-S-transferasa (GST); tiorredoxina (Trx); dominio de union a quitina (CBD); BMP-2, mutantes de BmP-2, BMP-2(C/A); SUMO; y mutantes y fragmentos de los mismos.
Una construccion de expresion puede expresar una protelna de fusion que comprende una variante de CNP y una protelna o etiqueta vehlculo. La etiqueta puede ser una secuencia de aminoacidos que confiere una propiedad util a la protelna de fusion. En una realizacion, la etiqueta es un dominio de union a virando que se puede usar para purificar la protelna de fusion mediante la aplicacion de la protelna de fusion a medios de separacion que contienen el ligando. Por ejemplo, una protelna de fusion que comprende un dominio de glutation-S-transferasa (GST) se puede aplicar una columna de cromatografla que contiene medios de separacion unidos a glutation. Como otro ejemplo, una protelna de fusion que comprende protelna de union a maltosa (MBP) como una etiqueta se puede aplicar a medios de separacion que contienen maltosa. Como un ejemplo adicional, una protelna de fusion que comprende una etiqueta de polihistidina se puede aplicar a una columna de nlquel, con lo que la quelacion de la etiqueta de polihistidina a la columna de nlquel facilita la purificacion de la protelna de fusion. En otra realizacion, la etiqueta es un ligando. Por ejemplo, una protelna de fusion puede comprender glutation como una etiqueta y se puede aplicar a una columna de cromatografla que contiene medios de separacion unidos con glutation-S- transferasa. Los ejemplos no limitantes de protelnas y etiquetas vehlculo para su uso en protelnas de fusion incluyen factor de transcripcion humano TAF12 (TAF12), cetosteroide isomerasa (KSI), protelna de union a maltosa (MBP), p- galactosidasa (p-Gal), glutation-S-transferasa (GST), tiorredoxina (Trx), dominio de union a quitina (CBD), mutacion de BMP-2 (BMPM), SUMO, CAT, TrpE, protelna A estafilococica, protelnas estreptococicas, protelna de union a almidon, dominio de endoglucanasa A de union a celulosa, dominio de endoglucanasa Cex de union a celulosa, dominio de union a biotina, recA, Flag, poli(His), poli(Arg), poli(Asp), poli(Gln), poli(Phe), poli(Cys), protelna fluorescente de color verde, protelna fluorescente de color rojo, protelna fluorescente de color amarillo, protelna fluorescente de color cian, biotina, avidina, estreptavidina, epltopos de anticuerpo, y mutantes y fragmentos de los mismos.
Para generar la variante de CNP diana, la protelna o etiqueta vehlculo se puede escindir de la protelna de fusion por medio de escision qulmica, escision con proteasa, o autoescision de protelna. Los agentes de escision qulmicos y proteollticos a modo de ejemplo (sitios de escision entre parentesis) incluyen, pero no se limitan a, acido formico (Asp-Pro), bromuro de cianogeno (CNBr) (Met-X), hidroxilamina (Asn-Gly), Factor Xa (IEGR-X) (SEQ ID NO: 230), Enteroquinasa (DDDDK-X) (SEQ ID NO: 231), ProTEV (EXXYXQ-G) (SEQ ID NO: 232), y proteasa de SUMO. Debido a la naturaleza de los tipos de escision qulmica en particular, la escision usando acido formico puede generar Pro-CNP, CNBr puede generar CNP que tiene sustitucion de Met por Asn, y la hidroxilamina puede generar Gly-CNP. Como alternativa, la escision qulmica o con proteasa se puede evitar usando construcciones en particular (por ejemplo, pET-21a-CNP) que expresan variantes de CNP no como protelnas de fusion. La expresion de pET-
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21a-CNP puede producir Met-CNP. O ciertas protelnas de fusion (por ejemplo, las que contienen intelna-CBD) se pueden someter a autoescision para generar CNP.
En otras realizaciones, una protelna de fusion comprende un conector peptldico escindible entre una variante de CNP y una protelna o etiqueta vehlculo (por ejemplo, etiqueta peptldica). En ciertas realizaciones, el conector peptldico escindible se selecciona entre el grupo que consiste en Asp-Pro, Asn-Gly, Met-X, Val-Asp-Asp-Arg (SEQ ID NO: 233), Gly-Ser-Asp-Arg (SEQ ID NO: 234), Ile-Thr-Asp-Arg (SEQ ID NO: 235), Pro-Gly-Asp-Arg (SEQ ID NO: 236), Ile-Glu-Gly-Arg-X (SEQ ID NO: 230), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X (SEQ ID NO: 231), Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly (SEQ ID NO: 232), Ala-Phe-Leu-Gly-Pro-Gly-Asp-Arg (SEQ ID NO: 237), y MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTGDDDDKHMD (conector de pET-15b) (SEQ ID NO: 95), en los que X representa un aminoacido. En algunas realizaciones, el conector peptldico escindible se escinde con un agente de escision seleccionado entre el grupo que consiste en paladio, bromuro de cianogeno (CNBr), acido formico, hidroxilamina, clostridolor, trombina, quimotripsina, tripsina, proteasa similares a la tripsina, carboxipeptidasa, enteroquinasa (enteropeptidasa), proteasa de Kex 2, proteasa de Omp T, proteasa de Factor Xa, subtilisina, proTEV, proteasa de SUMO, proteasa de V8, proteasa del VIH, proteasa de rinovirus, proteasa de furilisina, proteasas de IgA, proteasa de Pace humano, colagenasa, proteasa de Nia, proteasa de 2Apro de poliovirus, proteasa de 3C de poliovirus, genenasa, furina, elastasa, Proteinasa K, pepsina, renina (quimosina), proteasas asparticas microbianas, padolor, caldolor, quimopadolor, ficina (ficalna), bromelalna (bromelasa), catespisina B, caspasas, termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, kalikrelna, y plasmina.
En ciertas realizaciones, la protelna vehlculo, etiqueta (por ejemplo, etiqueta peptldica) o conector peptldico escindible se escinde usando acido formico para liberar la variante de CNP de la protelna de fusion. En algunas realizaciones, el acido formico esta en una concentration de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 20 %, o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 15 %, o de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 15 %, o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 10 %, o de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 10 %, o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 %, o de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 5 %. En ciertas realizaciones, el acido formico esta en una concentracion de aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 % o un 15 %. En ciertas realizaciones, el acido formico esta en una concentracion de aproximadamente un 2 %, 5 % o un 10 %.
En otras realizaciones, la escision de la protelna de fusion a CNP en presencia de acido formico se realiza a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 80 °C, o de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C, o de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 75 °C, o de aproximadamente 50 °C a
aproximadamente 75 °C, o de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C, o de aproximadamente 55 °C a
aproximadamente 70 °C, o de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 60 °C. En algunas realizaciones la escision en presencia de acido formico se realiza a aproximadamente 20 °C, 22 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C, 37 °C, 40 °C, 42 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C o 80 °C. En ciertas realizaciones la escision en presencia de acido formico se realiza a aproximadamente 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C o 70 °C. En ciertas realizaciones la escision en presencia de acido formico se realiza a aproximadamente 55 °C o 70 °C.
En realizaciones adicionales, la escision de la protelna de fusion a CNP en presencia de acido formico se realiza durante un periodo de tiempo de aproximadamente 3 h a aproximadamente 48 h, o de aproximadamente 5 h a aproximadamente 48 h, o de aproximadamente 5 h a aproximadamente 36 h, o de aproximadamente 5 h a
aproximadamente 24 h, o de aproximadamente 5 h a aproximadamente 18 h, o de aproximadamente 20 h a
aproximadamente 24 h, o durante aproximadamente 6 h a aproximadamente 10 h. En ciertas realizaciones la escision en presencia de acido formico se realiza durante aproximadamente 5 h, 6 h, 12 h, 15 h, 18 h, 20 h o 24 horas.
En algunas realizaciones, la escision de la protelna de fusion a CNP se realiza en presencia de aproximadamente un 2 %, 5 % o un 10 % de acido formico a aproximadamente 55 °C durante aproximadamente 20 h a aproximadamente 36 h, o a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 15 h a aproximadamente 24 h, o a aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 10 h a aproximadamente 21 h, o a aproximadamente 70 °C durante aproximadamente 6 h a aproximadamente 18 h. En ciertas realizaciones, la escision de la protelna de fusion a CNP se realiza en presencia de aproximadamente un 2 % de acido formico a aproximadamente 55 °C durante aproximadamente 20 h a aproximadamente 24 o 36 h, o a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 15 h a aproximadamente 24 h, o a aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 10 h a aproximadamente 18 h, o a aproximadamente 70 °C durante aproximadamente 6 h a aproximadamente 10 horas.
La presente divulgation proporciona condiciones suaves para la escision de protelnas de fusion de CNP usando acido formico para proporcionar rendimientos elevados de las variantes de CNP. Las condiciones que se describen en el presente documento para escision de protelna de fusion usando acido formico tambien son adecuadas para escision de protelnas de fusion que comprenden polipeptidos o protelnas distintos de CNP, en los que las protelnas de fusion contienen un enlace peptldico de Asp-Pro.
En otras realizaciones, las protelnas de fusion a CNP solubles o cuerpos de inclusion de protelna de fusion a CNP se tratan con un tampon y/o un detergente antes de la escision qulmica (por ejemplo, usando acido formico) o la
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escision proteolltica de la protelna de fusion a CNP. Los ejemplos no limitantes de tampones incluyen B-PER II; B- PER II diluido (por ejemplo, dilucion a 1/20); B-PER; tampon de fosfato de B-PER; tampones que contienen Tris (por ejemplo, Tris 25 mM, pH 7,5); tampones que contienen Tris y NaCl (por ejemplo, Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,9); y PBS. En una realizacion, el tampon es B-PER II. Los ejemplos no limitantes de detergentes incluyen octilsacarosa, Triton X-100, Tween-20, NP-40, y CA-630. El detergente puede ser un tampon (por ejemplo, detergente al 1 % en tampon Tris 25 mM, pH 7,5). En ciertas realizaciones, el detergente es Triton X-100 o CA-630.
Se entiende que cualquiera de los metodos y condiciones que se han descrito anteriormente se pueden usar en combinacion con cualquiera de los otros metodos y condiciones que se han descrito anteriormente para generar una variante de CNP desvelaran el presente documento.
En otras realizaciones, las variantes de CNP que se describen en el presente documento se sintetizan usando un sintetizador de peptidos se purifican de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, de acuerdo con los metodos de Atherton y Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, IRL Press (Oxford, England (1989)).
Los peptidos se pueden sintetizar basandose en, por ejemplo, la siguiente secuencia peptldica de CNP: G1LS(K o R)GC6F7G8L(K o R o Nle o 6-OH-Nle)LDRIGSMSGLGC22.
Las variantes de CNP a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a:
El Analogo A (GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 56) se preparo por conversion del grupo "-C=O" de la estructura principal de C6 en un grupo "-CH2";
El Analogo B (GLSKGC(N-Me-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 57) se preparo por conversion del grupo "-NH" de la estructura principal de F7 en un grupo"-N-CH3";
El Analogo E (GLSKGC(D-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 136) se preparo usando D-Phe en F7;
El Analogo F (GLSKGCF(tBu-Gly)LKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 58) se preparo usando un terc-butilo-Gly en G8;
El Analogo G (GLSKGC(3-Cl-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 137) se preparo por adicion de un atomo de cloruro en una posicion meta del anillo de fenilo de F7 (se pueden generar variantes similares haciendo sustituciones en orto, meta y/o para del anillo de fenilo de Phe7 con Cl, F, Br, OH y/o CH3); y El Analogo H (GLSKGC[NHCH2CH(Ph)CO]GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 59) se preparo usando acido (±)-3-(amino)-2-fenilpropionico en F7.
Los ejemplos de variantes de CNP que tienen, por ejemplo, prolongaciones de aminoacido, sustituciones con aminoacidos naturales o no naturales o isoesteres de enlace peptldico, y/o conjugaciones con pollmeros o restos hidrofobos, incluyen pero no se limitan a:
Analogo J
C6-CH2-NH, N-Me-L9, N-Me-L20 (SEQ ID NO: 91)
Analogo K
N-Me-L9, N-Me-L20 (SEQ ID NO: 92)
Analogo L
N-Me-L9, N-Me-L11, N-Me-L20 (SEQ ID NO: 93)
Analogo M
N-Me-L9, N-Me-L11 (SEQ ID NO: 94)
Analogo Z
K4R, F7Y (SEQ ID NO: 95)
Analogo AA
K4R, G8V (SEQ ID NO: 96)
Analogo AB
K4R, G8S (SEQ ID NO: 97)
Analogo AC
K4R, G8T (SEQ ID NO: 98)
Analogo AD
K4R, L9T (SEQ ID NO: 99)
Analogo AE
K4R, G15R (SEQ ID NO: 100)
Analogo AF
K4R, G15Cit (SEQ ID NO: 101)
Analogo AG
K4R, M17V (SEQ ID NO: 102)
Analogo AH
K4R (SEQ ID NO: 35)
Analogo AJ
K4R, L20V (SEQ ID NO: 103)
Analogo AK
K4R, L20t-Bu-Ala (SEQ ID NO: 104)
Analogo AT
G1E, K4E (SEQ ID NO: 105)
Analogo AV
G1E, K4E - acido pentanoico (unido en el extremo N-terminal) (SEQ ID NO: 106)
Analogo AW
G1E, K4E - acido heptanoico (unido en el extremo N-terminal) (SEQ ID NO: 107)
Analogo AX
CNP17 (delta N-term) (SEQ ID NO: 2)
Analogo AY
GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36)
Analogo AZ
R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 41)
Analogo BB
G1E - acido heptanoico (unido en el extremo N-terminal) (SEQ NO: 108)
Analogo BC
G1E - acido pentanoico (unido en el extremo N-terminal) (SEQ NO: 109)
Analogo BF
K4R, K10Cit (SEQ ID NO: 110)
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Analogo BG Analogo BH Analogo BJ Analogo BK Analogo BL
Analogo CA Analogo CB Analogo CC Analogo CD
NO: 68) Analogo CE Analogo CF
PEG(5K)-CNP22 PEG(2K)-CNP22 PEG(2K)-CNP17
PEG(1 K)-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ PEG(1K)-CNP22
PEO4-(PEO12)3(ramificado)-CNP2 PEO12-CNP22 PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36)
PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36); y
SEQ ID NOs: 1 a 6 y 34 a 144, y variantes de las mismas que comprenden hasta 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones adicionales.
En una realizacion, las variantes de CNP se ciclan a traves de formacion de un enlace disulfuro entre Cys6 y Cys22. Cys6 puede ser un analogo de cistelna tal como, por ejemplo, homocistelna o penicilamina. En una realizacion mas, las variantes de CNP se pueden ciclar con un enlace covalente formato de cabeza a cola, de cadena lateral a cadena lateral, de cadena lateral a cabeza, o de cadena lateral a cola. En una realizacion, el enlace covalente se forma entre un aminoacido en o hacia el extremo N-terminal y un aminoacido en o hacia el extremo C-terminal del peptido (denominados aminoacidos "terminales" en este contexto). En otra realizacion, el enlace covalente se forma entre las cadenas laterales de los dos aminoacidos terminales. En otra realizacion mas, el enlace covalente se forma entre la cadena lateral de un aminoacido terminal y el grupo terminal del otro aminoacido terminal, o entre los grupos terminales de los dos aminoacidos terminales.
El ciclado de cabeza a cola de la terminal amina con respecto al grupo carboxilo terminal se puede realizar usando un numero de metodos, por ejemplo, usando ester de p-nitrofenilo, ester de 2,4,5-triclorofenilo, ester de pentafluorofenilo, el metodo de azida, el metodo de anhldrido mixto, HATU, una carbodimida (por ejemplo, DIC, EDC o DCC) con un catalizador tal como HOBt, HONSu o HOAt, o ciclado en resina.
Ademas, la estructura clclica se puede formar a traves de un grupo de union por puente que implica a las cadenas laterales de restos de aminoacidos de la variante de CNP y/o los restos de aminoacido terminal. Un grupo de desplazamiento es un resto qulmico que permite el ciclado de dos porciones del peptido. Los ejemplos no limitantes de grupos de desplazamiento incluyen amidas, tioeteres, tioesteres, disulfuros, ureas, carbamatos, sulfonamidas, y similares. En la tecnica se conoce una diversidad de metodos para la incorporacion de unidades que tienen tales grupos de desplazamiento. Por ejemplo, un puente de lactama (es decir, una amida clclica) se puede formar entre el grupo amino N-terminal o un grupo amino en una cadena lateral y el acido carboxllico C-terminal o un grupo carboxilo en una cadena lateral, por ejemplo, la cadena lateral de lisina u ornitina y la cadena lateral de acido glutamico o acido aspartico. Un tioester se puede formar entre el grupo carboxilo C-terminal o un grupo carboxilo en una cadena lateral del grupo tiol en la cadena lateral de cistelna o un analogo de cistelna.
Como alternativa, una reticulacion se puede formar por incorporacion de un resto de lantionina (tio-dialanina) para unir restos de alanina que se unen de forma covalente entre si mediante un enlace tioeter. En otro metodo, un agente de reticulacion, tal como un acido dicarboxllico (por ejemplo, acido su subeerico (acido octanodioico)), puede unir los grupos funcionales de cadenas laterales de aminoacido, tales como grupos amino libre, hidroxilo, y tiol.
Tambien se puede usar ciclado catalizado por enzimas. Por ejemplo, se ha informado que el dominio de tioesterasea de la tirocidina sintetasa se puede usar para ciclar un precursor tioester, un montante de subtilisina se puede usar para ciclar esteres de fenilalanilamida de glicolato peptldico, y la ligasa 16G3 de anticuerpos se puede usar para ciclar un a p-nitrofenilester. Para una revision de ciclado de peptidos, vease Davies, J. Peptide Sci., 9: 471-501 (2003), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
K4R, K10Q (SEQ ID NO: 111)
K4R, K10R (SEQ ID NO: 112)
K4R, G15N (SEQ ID NO: 113)
K4R, G15S (SEQ ID NO: 114)
CNP-37 (SEQ ID NO: 60)
CNP-53 (SEQ ID NO: 4)
AAWARLLQEHPNA-CNP22 (SEQ ID NO: 61) AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (SEQ ID NO: 62) DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (SEQ ID NO: 63) SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (colas de BNP N- y C- terminales) (SEQ ID
GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (HSA-CNP22) (SEQ ID NO: 81) GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (SEQ ID NO: 79)
PEG(24K)-CNP22
PEG(20K)-CNP22
ID NO: 36)
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En ciertas realizaciones, el producto ciclado final tiene una pureza de al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o al menos aproximadamente un 99 %.
D. Variantes de CNP Modificado Qulmicamente
La modificacion qulmica de CNP22 o variantes del mismo puede impartir potencialmente propiedades ventajosas a los peptidos CNP modificados, tales como aumento de la estabilidad y semivida y reduction de la inmunogenicidad (para una discusion general de modificacion qulmica de protelnas terapeuticas, vease Pharmazie, 57 (1): 5-29 (2002)). Por ejemplo, los restos de union naturales o sinteticos, polimericos o no polimericos (por ejemplo, PEG) a peptidos CNP, para aumentar la masa total de los peptidos CNP a los intervalos que por lo general se describen en el presente documento, por ejemplo, un intervalo de aproximadamente 2,6 o 2,8 kDa a aproximadamente 6 o 7 kDa, puede reducir la susceptibilidad de los peptidos modificados a la escision in vivo mediante exopeptidasas y/o endopeptidasas (por ejemplo, NEP). Ademas de la PEGilacion, la glicosilacion y otros procedimientos de derivatizacion qulmica, por ejemplo, modificacion por fosforilacion, amidacion, carboxilacion, acetilacion, metilacion, y creacion de sales de adicion de acido, amidas, esteres y derivados de N-acilo, tambien puede enmascarar regiones potencialmente inmunogenicas y/o regiones proteollticamente sensibles (Science, 303: 480-482 (2004)).
Los ejemplos de modificaciones qulmicas incluyen, pero no se limitan a, el metodo de adicion de pollmero de Bednarsaki y el metodo de reticulation de Altus Corporation para aumentar la estabilidad y la resistencia a proteasas y reducir la inmunogenicidad. Bednarsaki mostro que la adicion de pollmero puede aumentar la estabilidad del pollmero a temperatura (J. Am. Chem. Soc., 114 (1): 378-380 (1992)), y Altus Corporation encontro que la reticulacion con glutaraldehldo puede aumentar la estabilidad enzimatica.
La modificacion qulmica de polipeptidos se puede realizar de una manera no especifica (que conduce a mezclas de especies derivatizadas) o de una manera especifica del sitio (por ejemplo, basandose en derivatizacion dirigida por reactividad de macromoleculas de tipo silvestre y/o modificacion selectiva del sitio usando una combination de mutagenesis dirigida al sitio y modificacion quimica) o, como alternativa, usando metodos de ligamiento de proteina expresada (Curr. Opin. Biotechnol., 13 (4): 297-303 (2002)).
Variantes de CNP Pegilado
Para aumentar la estabilidad (por ejemplo, resistencia a la degradation de NEP), CNP22 o variantes del mismo (incluyendo las que tienen adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoacido) se conjugan con polimeros hidrofilos, naturales o sinteticos, para aumentar la masa total de los peptidos CNP modificados hasta un intervalo de de aproximadamente 2,6 kDa o 2,8 kDa a aproximadamente 4, 5, 6, 7 o una cantidad superior de kDa. En ciertas realizaciones, los polimeros hidrofilos anadidos tienen una masa total de aproximadamente 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, o aproximadamente 5 kDa.
Los polimeros hidrofilos son solubles en agua de modo que los peptidos CNP conjugados a los mismos no precipitan en un entorno acuoso (por ejemplo, fisiologico). Ademas, los polimeros hidrofilos son biocompatibles, es decir, no causan lesion, toxicidad o una reaction inmunologica in vivo.
Los polimeros hidrofilos pueden estar ramificados o no ramificados. En una realization, los polimeros hidrofilos no estan ramificados.
Diversos sitios de conjugation de CNP22 o variantes del mismo a un pollmero hidrofilo son posibles, e incluyen, pero no se limitan a: (1) solamente en el extremo N-terminal; (2) solamente en el extremo C-terminal; (3) solamente en un sitio interno (por ejemplo, Lys4); (4) tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal; (5) tanto en el extremo N-terminal como en un sitio interno; y (6) tanto en el extremo C-terminal como en un sitio interno. En una realizacion, CNP22 o variantes del mismo se conjugan con un pollmero hidrofilo solamente en el extremo N-terminal. En otra realizacion, la conjugacion se produce solamente en un sitio interno (por ejemplo, Lys4). En otra realizacion mas, la conjugacion se traduce en el extremo N-terminal y un sitio interno (por ejemplo, Lys4). Ademas, en otra realizacion, para mejor funcionalidad, los peptidos the CNP no se conjugan con un polimero hidrofilo en un sitio (por ejemplo, Lys10) dentro del dominio ciclico (que corresponde de Cys6 a Cys22 de CNP22). Si la conjugacion a un polimero hidrofilo se basa en la formation de enlaces con un grupo amino primario reactivo en el peptido CNP, la conjugacion en un sitio interno (por ejemplo, Lys4 y/o Lys10) se puede evitar por sustitucion de Lys4 y/o Lys10 con un aminoacido o peptidomimetico natural o no natural que no contiene un grupo amino primario reactivo en una cadena lateral, tal como, por ejemplo, Gly, Ser, Arg, Asn, Gln, Asp, Glu o citrulina (Cit). En una realizacion en particular, Lys4 y/o Lys10 se sustituyen con Arg. En otra realizacion, Lys10 no se sustituye con Arg.
Los ejemplos no limitantes de polimeros hidrofilos incluyen polimeros formados a partir de monomeros que portan acido carboxllico (por ejemplo, acido metacrllico (MA) y acido acrllico (AA)), alcoholes de polivinilo, polimeros formados a partir de monomeros que portan hidroxilo (por ejemplo, metacrilato de hidroxietilo (HEMA), metacrilato de hidroxipropilo (HPMA), metacrilamida de hidroxipropilo, y metacrilato de 3-trimetilsililpropilo (TMSPMA)), oxidos de polialquileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(etilenglicol) (PEG), poli(propilenglicol), mono- alcoxi C1-C10-PEGs (por ejemplo, monometoxi-PEG), tresil monometoxi-PEG, ariloxi-PEGs, acrilato de PEG (PEGA),
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metacrilato de PEG, PEG propionaidehldo, carbonato de bis-succinimidilo PEG, copollmeros de 2-methacriloiloxietil- fosforilcolina (MPC) y N-vinil pirrolidona (VP), poli(N-vinil pirrolidona) hidroxi funcional (PVP), SIS-PEG (SIS es copollmero de bloque de poliestireno-poliisobutileno-poliestireno), poliestireno-PEG, poliisobutileno-PEG, PCL-PEG (PCL es policaprolactona), PLA-PEG (PLA es acido polilactico), pMmA-PEG (PMMA es poli(metacrilato de metilo)), PDMS-pEg (PDMS es polidimetiloxanona), PVDF-PEG (PvDF es fluoruro de polivinilideno), tensioactivos PLURONIC™ (oxido de polipropileno-co-polietilenglicol), poli(tetrametilenglicol), poli(L-lisina-g-etilenglicol) (PLL-g- PEG), poli(L-lisina-g-acido hialuronico) (PLL-g-HA), poli(L-lisina-g-fosforil colina) (PLL-g-PC), poli(L-lisina-g-vinil pirrolidona) (PLL-g-PVP), poli(etilimina-g-etilenglicol) (PEI-g-PEG), poli(etilimina-g-acido hialuronico) (PEI-g-HA), poli(etilimina-g-fosforil colina) (pEI-g-PC), poli(etilimina-g-vinil pirrolidona) (PEI-g-PVP), PLL-co-HA, PLL-co-PC, PlL- co-PVP, PEI-co-PEG, PEI-co-HA, PEI-co-PC, PEI-co-PVP, celulosa y derivados de la misma (por ejemplo, hidroxietil celulosa), dextrano, dextrinas, acido hialuronico y derivados del mismo (por ejemplo, hialuronato sodico), elastina, quitosan, sulfato acrllico, sulfonato acrllico, sulfamato acrllico, sulfato metacrllico, sulfonato metacrllico, sulfamato metacrllico, pollmeros y copollmeros de los mismos y pollmeros y copollmeros de combinaciones de los mismos.
En una realizacion en particular, el pollmero hidrofilo es poli(etilenglicol) (PEG), tambien denominado poli(oxido de etileno) (PEO). Como se usa en el presente documento, el termino "PEG" o "PEO" incluye todas las formas de PEG, ramificado y sin ramificar, que se pueden usar para derivatizar polipeptidos, que incluyen, pero no se limitan a, mono-alcoxi (C1-C10)-PEGs y ariloxi-PEGs.
En una divulgacion, los conjugados de PEG-CNP comprenden un pollmero de PEG (o PEO) de formula (CH2CH2O)n, en la que n es un numero entero de aproximadamente 6 a aproximadamente 100, y el pollmero de PEG tiene de aproximadamente 0,3 kDa a aproximadamente 5 kDa. En otra divulgacion, n es un numero entero de aproximadamente 12 a aproximadamente 50, y el pollmero de PEG tiene de aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 2,5 kDa. Ademas, en otra divulgacion, n tiene de aproximadamente 12 a aproximadamente 24, y el pollmero de PEG tiene que aproximadamente 0,6 kDa a aproximadamente 1,2 kDa. En una divulgacion adicional, el grupo hidroxilo terminal del pollmero de PEG esta protegido con un grupo no reactivo. En una divulgacion en particular, el grupo con proteccion terminal es un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo inferior tal como metilo, de modo que el pollmero de PEG termina en un grupo alcoxi. En una divulgacion, el pollmero de PEG no esta ramificado. En otra divulgacion, CNP22 o variantes del mismo estan conjugados con un pollmero de PEG solamente en el extremo N-terminal.
Los PEG y los PEO incluyen potencialmente moleculas con una distribucion de pesos moleculares, es decir, son potencialmente polidispersos, dependiendo de la manera en la que se preparan. La distribucion de tamano/masa de una preparacion polimerica se puede caracterizar de forma estadlstica por su peso molecular medio en peso (Mw) y su peso molecular medio e en l numero (Mn), cuya proporcion se denomina Indice de polidispersion (Mw/Mn). Mw y Mn se pueden medir por espectroscopla de masas. Las variantes de PEG-CNP conjugadas con un resto de PEG con un tamano superior a 1,5 kDa pueden presentar un intervalo de pesos moleculares debidos a la naturaleza polidispersa de la molecula de PEG precursora. Por ejemplo, en el caso de mPEG2K (Sunbright ME-020HS, nOf Co.), las masas moleculares de las moleculas de PEG se distribuyen en un intervalo de aproximadamente 1,5 kDa a aproximadamente 3 kDa, con un Indice de polidispersion de 1,036. Por el contrario, los PEG conjugados con CNP22 o variantes del mismo que usan reactivos de MS(PEG)n (n = 4, 8, 12 o 24, indicados como, por ejemplo, "PEO12" o "PEO24") de Pierce Biotechnology (Rockford, Illinois) son monodispersos, y tienen longitud de cadena discontinua y peso molecular definido.
En la tecnica se conocen metodos para generar polipeptidos que comprenden un resto de PEG (vease, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.824.784). Los metodos para preparar peptidos CNP PEGilado por lo general comprenden las etapas de (a) hacer reaccionar CNP22 o una variante del mismo con un reactivo de PEGilacion en condiciones adecuadas para unir PEG al peptido CNP (por ejemplo, en el extremo N-terminal), y (b) obtener el producto o productos de reaccion. Dado que la PEGilacion en un peptido CNP podrla alterar de forma significativa su union a NPR-B, dependiendo del tamano del resto de PEG y la posicion de la PEGilacion, se pueden explorar diferentes tipos de PEG y de condiciones de reaccion de PEGilacion. La qulmica que se puede usar para la PEGilacion de un peptido CNP incluye acilacion de la amina o aminas primarias reactivas del peptido usando el ester de NHS de metoxi-PEG (O-[(N-Succinimidiloxicarbonil)-metil]-O'-metilpolietilenglicol). La acilacion con metoxi- PEG-NHS o metoxi-PEG-SPA da como resultado un enlace de amida que elimina cualquier carga de la amina primaria original. Los peptidos de PEG-CNP designados con el slmbolo "PEO12" o "PEO24", as! como los designados con el slmbolo "PEG1K", "PEG2K", "PEG5K" o "PEG20K", estan PEGilados a traves de reaccion de un grupo amino primario en el peptido con un reactivo de PEG activado con ester de NHS, protegido en el extremo de metoxi. Tambien se pueden preparar variantes de PEG-CNP con otros metodos, por ejemplo, a traves de aminacion reductora que involucra a un grupo amino primario en el peptido y un PEG aldehldo, tal como, por ejemplo, PEG- propionaldehldo, o mono-alcoxi C1-C1o o derivados de ariloxi del mismo (vease el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.252.714).
A diferencia de la slntesis de protelnas de ribosoma, la slntesis de peptidos sinteticos evoluciona a partir del el extremo C-terminal al extremo N-terminal. Por consiguiente, Boc-PEG (que contiene terc-butiloxicarbonilo (Boc)) es un metodo para unir PEG al extremo C-terminal de un peptido (R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85 (14): 21492154 (1963)). Como alternativa, se puede usar qulmica de Fmoc (fluorenilmetoxicarbonilo) (E. Atherton y R.C.
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Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach, IRL Press (Oxford, Inglaterra (1989)).
Los presentes metodos para preparar variantes de PEG-CNP proporcionan una mezcla sustancialmente homogenea de conjugados de pollmero-protelna. Despues de purificacion, las preparaciones de PEG-CNP separadas son lo suficientemente puras para ensayo in vitro e in vivo de propiedades biologicas. Como se demuestra en el presente documento, ciertas variantes de PEG-CNP presentan una reduccion de la susceptibilidad a la escision con NEP y una funcionalidad sustancialmente similar o mejor (por ejemplo, estimulacion de la produccion de cGMP).
Como se describe en el presente documento, las reacciones de PEGilacion de CNP22 o variantes del mismo, usando proporciones apropiadas de reactivo de PEGilacion/peptido CNP y condiciones de reaccion, proporcionan derivados de PEG-CNP. La naturaleza y al alcance de la PEGilacion se pueden determinar usando, por ejemplo, analisis de PAGE y HPLC. En ciertas realizaciones, al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o un 99 % de CNP22 o variantes del mismo estan mono-PEGiladas en el extremo N-terminal. Para optimizar los efectos beneficiosos de la PEGilacion en las propiedades biologicas de un peptido CNP, la longitud, conformacion (por ejemplo, ramificado o lineal), y/o funcionalizacion del pollmero (por ejemplo, adicion de un grupo con carga negativa) de un resto de PEG puede variar. Las variantes de CNP PEGilado se someten a ensayo para resistencia a NEP, farmacocinetica y bioactividad (por ejemplo, la capacidad para unirse a NPR-B y estimular la generacion de cGMP). Las variantes de CNP PEGilado que muestran un aumento de la resistencia a NEP y al menos aproximadamente un 50 % de la actividad estimulacion de cGMP de CNP22 se pueden someter a ensayo adicionalmente, por ejemplo, in vitro en un modelo de acondroplasia basado en celulas de condrosarcoma de rata e in vivo en un modelo animal de acondroplasia de murino.
E. Metodos de Uso de Variantes de CNP, Composiciones Farmaceuticas de Variantes de CNP, y Vlas de Administration
Metodos de uso de Variantes de CNP
Trastornos Relacionados con los Huesos
Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) desempenan papeles importantes en la formation de hueso, y las mutaciones en genes del receptor FGF (FGFR 1, 2 y 3) dan lugar a una diversidad de malformaciones esqueleticas hereditarias (Curr. Biol., 5: 500-507 (1995)). En particular, la activation de las mutaciones en FGFR-3 son responsables de trastornos de los huesos largos, incluyendo la acondroplasia, la forma mas comun de enanismo genetico humano (Nature, 371: 252-254 (1994); Cell, 78: 335-342 (1994)), el trastorno mas leve, hipoacondroplasia (Ann. N.Y. Acad. Sci., 785: 182-187 (1996)), y la displasia tanatoforica mas grave y letal neonatal (TD) de tipos I e II (Hum. Mol. Genet., 5: 509-512 (1996); Nat. Genet., 9: 321-328 (1995)). Los modelos de raton que sobreexpresan FGF-2, en consecuencia activan FGFR-3, muestran un acortamiento de los huesos largos y macrocefalia (Mol. Biol. Cell, 6: 1861-73 (1995)). De forma coherente con este modelo, los ratones deficientes en FGFR-3 presentan un sobre crecimiento esqueletico notable con placas de crecimiento mas anchas (Nature Genet., 12: 390-397 (1996)).
Los experimentos complementarios con CNP, NPR-B y NPR-C sugieren una relation entre el ligando peptldico, los receptores correspondientes, y el crecimiento oseo. La activacion de NPR-B mediante concentraciones de CNP en plasma elevadas en ratones transgenicos causa un crecimiento excesivo del esqueleto (Nat. Med., 10: 80-86 (2004)) histologicamente similar al del cartllago de la placa de crecimiento de ratones con supresion genetica de FGFR-3 (Nat. Genet., 4: 390-397 (1996)). En ratones con supresion genetica de NPR-C, la elimination de CNP mediada por NPR-C se deberla eliminar; de forma coherente con esta prediction, los animales con supresion genetica muestran huesos largos alargados y vertebras alargadas con cifosis (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7403-08 (1999)). Por el contrario, los ratones con supresion genetica de CNP se ven empequenecidos con huesos largos y vertebras mas cortos, un fenotipo histologicamente similar al de la acondroplasia, y tienen un aumento de la mortalidad como resultado de maloclusion limitation pulmonar de la caja de las costillas pequenas (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 4016-4021 (2001)). De forma coherente con el papel propuesto de CNP como un activador de NPR-B, el raton con supresion genetica de NPR-B tiene el mismo fenotipo esqueletico empequenecido y un aumento de la mortalidad que el raton con supresion genetica de CNP (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 101: 17300-05 (2004)). Ademas, en un modelo de raton de acondroplasia con FGFR-3 activado en el cartllago, la sobreexpresion dirigida de CNP en condrocitos contrarresta el enanismo (Yasoda et al., Nat. Med., 10: 80-86 (2004)). Ademas, se ha mostrado que CNP desempena un papel en la regulation del crecimiento del hueso endocondral y actividad de condrocitos, que incluye, pero no se limita a, proliferation y diferenciacion de condrocitos, inhibition de la ruta de serialization de quinasa quinasa/MEK (Raf-1) de protelna activada por mitogenos (MAP), y estimulacion de la osificacion endocondral (Yasoda et al., Nat. Med., 10: 80-86 (2004)). Estos resultados sugieren que la activacion del sistema CNP/NPR-B es una estrategia terapeutica potencial para el tratamiento de la acondroplasia humana.
Mediante la estimulacion de la produccion, proliferacion y diferenciacion de condrocitos de matriz y aumentando el crecimiento de hueso largo, las variantes de CNP de la divulgation son utiles para el tratamiento de mamlferos, incluyendo seres humanos, que padecen un trastorno relacionado con los huesos, tal como una displasia esqueletica. Los ejemplos no limitantes de trastornos sensibles a CNP relacionados con los huesos y displasias esqueleticas incluyen acondroplasia, hipoacondroplasia, estatura baja, enanismo, osteocondrodisplasias, displasia
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tanatoforica, osteogenesis imperfecta, acondrogenesis, condrodisplasia punctata, acondroplasia homocigotica, condrodisplasia punctata, displasia camptomelica, hipofosfatasia letal congenita, tipo letal perinatal de osteogenesis imperfecta, slndromes de polidactilia y costillas cortas, hipoacondroplasia, tipo rizomelico de condrodisplasia punctata, displasia metafisaria de tipo Jansen, displasia espondiloepifisiaria congenita, atelosteogenesis, displasia diastrofica, displasia mesomelica de tipo Langer de femur corto congenita, displasia mesomelica de tipo Nievergelt, slndrome de Robinow, slndrome de Reinhardt, acrodisostosis, disostosis periferica, displasia de Kniest, fibrocondrogenesis, slndrome de Roberts, displasia acromesomelica, micromelia, slndrome de Morquio, slndrome de Kniest, displasia metatrofica, y displasia espondiloepimetafisaria. Ademas, las variantes de CNP son utiles como un complemento o una alternativa a la hormona del crecimiento para el tratamiento de estatura baja idiopatica y otras displasias esqueleticas.
Ademas, las variantes de CNP son utiles para el tratamiento otras afecciones y trastornos relacionados con los huesos, tales como raquitismo, raquitismo hipofosfatemico [incluyendo raquitismo hipofosfatemico relacionado con el cromosoma X (tambien denominado raquitismo resistente a la vitamina D) y raquitismo hipofosfatemico autosomico dominante], y osteomalacia [incluyendo osteomalacia inducida por tumor (tambien denominada osteomalacia oncogenica u osteomalacia hipofosfatemica oncogenica)].
Las variantes de CNP de la divulgacion tambien se pueden usar para tratar la artrosis. La artrosis es una enfermedad degenerativa del cartllago articular y frecuentemente se produce en las personas de edades avanzadas. La artrosis implica la destruccion del cartllago y cambio proliferativa o en el hueso y el cartllago que resultan de la degeneracion de los componentes articulares, con el cambio dando como resultado una artritis secundaria (por ejemplo, sinovitis). Las protelnas de la matriz extracelular, que son la entidad funcional del cartllago, se reducen, y el numero de condrocitos disminuye en la artrosis (Arth. Rheum. 46 (8): 1986-1996 (2002)). Al estimular la produccion, crecimiento y diferenciacion de condrocitos de la matriz, las variantes de CNP son utiles para contrarrestar los efectos no deseados de FGF-2 y aumentar la slntesis de la matriz en sujetos que padecen artritis, incluyendo artrosis, tratando de ese modo la artritis, incluyendo la artrosis.
Trastornos del Musculo Liso Vascular
El CNP y otros peptidos vasoactivos (incluyendo ANP, BNP y urodilatina) tienen propiedades vasodilatadoras y diureticas si desempenan un papel importante en la homeostasis cardiovascular (J. Cardiovasc. Pharmacol., 117: 1600-06 (1998); Kidney Int., 49: 1732-37 (1996); Am. J. Physiol., 275: H1826-1833 (1998)). El CNP se distribuye ampliamente en el sistema cardiovascular, especialmente en concentracion elevada en celulas endoteliales vasculares (J. Cardiovasc. Pharmacol., 117: 1600-06 (1998)). El CNP es un relajante potente del musculo liso vascular, en particular en la circulacion coronaria (Biochem. Biophys. Res. Commun., 205: 765-771 (1994)), y es un inhibidor de la proliferacion de celulas del musculo liso (Biochem. Biophys. Res. Commun., 177: 927-931 (1991)). Aunque el efecto vasodilatador de CNP es menos potente que el de ANP (aproximadamente 1:100) (Hypertens. Res., 21: 7-13 (1998); Am. J. Physiol., 275: L645-L652 (1998)), el ARNm del CNP aumenta como respuesta a la tension al cizallamiento (FEBS Lett., 373: 108-110 (1995)) y los niveles en plasma de CNP aumentan en patologlas cardiovasculares inflamatorias (Biochem. Biophys. Res. Commun., 198: 1177-1182 (1994)). Se ha mostrado que el CNP suprime la inflamacion a traves de la inhibicion de infiltracion de macrofagos en arterias carotidas lesionadas de conejos (Circ. Res., 91: 1063-1069 (2002)) e inhibe directamente la proliferacion de fibroblastos cardiacos a traves de una ruta dependiente de NPR-B/cGMP (Endocrinology, 144: 2279-2284 (2003)).
Las acciones cardiovasculares de CNP estan mediadas por la activacion de los subtipos de NPR, NPR-B y NPR-C (Endocrinology, 130: 229-239 (1992)), esta ultima representando un 95 % de los NPR expresados in vivo (Science, 293: 1657-1662 (2001)). La ruta de CNP/NPR-B conduce a un aumento de cGMP, un mensajero secundario bien establecido en el sistema cardiovascular. La porcion de 37 aminoacidos de NPR-C del extremo C-terminal tiene una secuencia consenso que interactua con la protelna G heterotrimelica Gi (J. Biol. Chem., 274: 17587-17592 (1999)), que se ha mostrado que regula la actividad de la adenilato ciclasa y la fosfolipasa C (J. Biol. Chem., 276: 22064-70 (2001); Am. J. Physiol., 278: G974-980 (2000); J. Biol. Chem., 271: 19324-19329 (1996)). El CNP media la hiperpolarizacion y la relajacion del musculo liso a traves de la activacion de NPR-C y la apertura de canales de K+ de rectificacion hacia dentro, regulados por la protelna G (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 1426-1431 (2003)). De forma analoga, el CNP tiene importantes efectos antiproliferativos en fibroblastos cardiacos y, a traves de la interaccion con NPR-C, regula el flujo sangulneo local y la presion sangulnea sistemica hiperpolarizando las celulas del musculo liso (R. Rose and W. Giles, J. Physiol. 586: 353-366 (2008)).
Al unirse a NPR-B en celulas de musculo liso vascular, CNP22 estimula la produccion de cGMP, que actua como un mensajero intracelular secundario para causar en ultima instancia la relajacion de los vasos sangulneos. Basandose en las acciones hipotensoras de CNP, las variantes de CNP de la divulgacion son utiles para tratar hipertension, insuficiencia cardiaca congestiva, edema cardiaco, nefredema, edema hepatico, insuficiencia renal aguda y cronica, y as! sucesivamente. Ademas, la activacion de la senalizacion de cGMP suprime el crecimiento de celulas de musculo liso vascular. Por consiguiente, las variantes de CNP de la divulgacion se pueden usar para tratar afecciones o enfermedades causadas por el crecimiento anomalo de celulas del musculo liso vascular, que incluyen, pero no se limitan a, reestenosis y arteriosclerosis.
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Los estudios descritos anteriormente sugieren que el CNP puede ser un candidato terapeutico potencial para la relajacion y remodelacion del musculo liso vascular. Los efectos farmacologicos del CNP en relacion con ciertos trastornos se han atribuido, en parte, a efectos vasoprotectores en lugar de a la actividad vasodilatadora (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 170: 1204-1211 (2004)). Por lo tanto, las variantes de CNP de la presente divulgacion son utiles para tratar afecciones, por ejemplo, trastornos del musculo liso vascular, en las que el CNP puede tener un efecto vasoprotector, que incluye, pero no se limita a, induccion de la relajacion del musculo liso e inhibicion de la infiltracion de macrofagos en el tejido cardiaco. En una divulgacion, las variantes de CNP se usan para tratar insuficiencia cardiaca congestiva, que incluye, pero no se limita a, insuficiencia cardiaca descompensada aguda e insuficiencia cardiaca congestiva aguda. En otra divulgacion, las variantes de CNP se usan para tratar asma, cardiomiopatla y reestenosis de arterias coronarias (aumentando la relajacion de las celulas del musculo liso y disminuyendo la proliferacion de celulas del musculo liso).
Composiciones Farmaceuticas de Variantes CNP
En realizaciones adicionales, la divulgacion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una variante de CNP, y uno o mas excipientes, vehlculos y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones comprenden tradicionalmente uno u otros agentes biologicamente activos mas (por ejemplo, inhibidores de proteasas, tirosina quinasas receptoras, y/o el receptor de eliminacion NPR-C).
En algunas realizaciones, las composiciones comprenden la variante de CNP deseada con una pureza de al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 %. En ciertas realizaciones, las composiciones contienen menos de aproximadamente un 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o un 0,5 % de contaminantes macromoleculares, tales como otras protelnas de mamlfero (por ejemplo, de ser humano) y otras variantes de CNP.
Los ejemplos no limitantes de excipientes, vehlculos y diluyentes incluyen vehlculos, llquidos, tampones, agentes de isotonicidad, aditivos, estabilizantes, conservantes, solubilizantes, tensioactivos, emulgentes, agentes humectantes, y as! sucesivamente. Las composiciones pueden contener llquidos (por ejemplo, agua, etanol); diluyentes de diverso contenido de tampon (por ejemplo, Tris-HCl, fosfato, tampones de acetato, tampones de citrato), pH y fuerza ionica; detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Polisorbato 20, Polisorbato 80); antioxidantes (por ejemplo, metionina, acido ascorbico, metabisulfito sodico); conservantes (por ejemplo, Timerosal, alcohol bencllico o, m- cresol); y sustancias de aumento del volumen (por ejemplo, lactosa, manitol, sacarosa). El uso de excipientes, diluyentes y vehlculos en la formulacion de las composiciones farmaceuticas se conoce en la tecnica; vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, paginas 1435-1712, Mack Publishing Co. (Easton, Pensilvania (1990)), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
Por ejemplo, los vehlculos incluyen, pero no se limitan a, diluyentes, vehlculos y adyuvantes, as! como vehlculos de implante, y cargas solidas o llquidas inertes, no toxicas y materiales encapsulacion que no reaccionan con el principio o principios activos. Los ejemplos no limitantes de vehlculos incluyen solucion salina tamponada con fosfato, solucion salina fisiologica, agua, y emulsiones (por ejemplo, emulsiones de aceite/agua). Un vehlculo puede ser un medio disolvente o de dispersion que contiene, por ejemplo, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol llquido, y similares), un aceite vegetal, y mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, las composiciones son formulaciones llquidas. En ciertas realizaciones, las formulaciones comprenden una variante de CNP en un intervalo de concentracion de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, o de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml.
En otras realizaciones, las composiciones comprenden una solucion tampon o agente de tamponamiento para mantener el pH de una solucion o suspension que contiene CNP dentro de un intervalo deseado. Los ejemplos no limitantes de soluciones tampon incluyen solucion salina tamponada con fosfato, solucion salina tamponada con Tris, y solucion salina tamponada con Hank. Los agentes de tamponamiento incluyen, pero no se limitan a, acetato sodico, fosfato sodico, y citrato sodico. Tambien se pueden usar mezclas de agentes de tamponamiento. En ciertas realizaciones, el agente de tamponamiento es acido acetico/acetato o acido cltrico/citrato. La cantidad de agente de tamponamiento adecuada en una composition depende en parte del tampon usado en particular y del pH deseado de la solucion o suspension. Por ejemplo, el acetato es un tampon de pH mas eficaz a pH 5 que a pH 6, de modo que se puede usar menos acetato en una solucion a pH 5 que a pH 6, En algunas realizaciones, el agente de tamponamiento tiene una concentracion de aproximadamente 10 mM ± 5 mM. En ciertas realizaciones, el pH de una composicion es de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7,5, o de aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente pH 7, o de aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente pH 6,5, o de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 6, o de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 5, o es a aproximadamente pH 4,0 ± 1,0.
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En otras realizaciones, las composiciones contienen un agente de ajuste de isotonicidad para hacer que la solucion o suspension sea isotonica y mas compatible para inyeccion. Los ejemplos no limitantes de agentes de isotonicidad incluyen NaCl, dextrosa, glucosa, glicerina, sorbitol, xilitol, y etanol. En ciertas realizaciones, el agente de
isotonicidad es NaCl. En ciertas realizaciones, NaCl esta en una concentracion de aproximadamente 160 ± 20 mM, o
aproximadamente 140 mM ± 20 mM, o aproximadamente 120 ± 20 mM , o aproximadamente 100 mM ± 20 mM, o
aproximadamente 80 mM ± 20 mM, o aproximadamente 60 mM ± 20 mM.
Ademas, en otras realizaciones, las composiciones comprenden un conservante. Los conservantes. incluyen, pero no se limitan a, m-cresol y alcohol bencllico. En ciertas realizaciones, el conservante esta en una concentracion de aproximadamente un 0,4 % ± 0,2 %, o aproximadamente un 1 % ± 0,5 %, o aproximadamente un 1,5 % ± 0,5 %, o aproximadamente un 2,0 % ± 0,5 %.
En otras realizaciones mas, las composiciones contienen un antiadsorbente (por ejemplo, para aliviar la adsorcion de una variante de CNP a vidrio o plastico). Los antiadsorbentes incluyen, pero no se limitan a, alcohol bencllico, Polisorbato 20, y Polisorbato 80. En ciertas realizaciones, el antiadsorbente esta en una concentracion de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 0,5 %, o de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,5 %, o de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 1 %, o de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 1 %, o de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1,5 %, o de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2 %, o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %.
En realizaciones adicionales, las composiciones comprenden un estabilizante. Los ejemplos no limitantes de estabilizantes incluyen glicerina, glicerol, tioglicerol, metionina, y acido ascorbico y sales de los mismos. En algunas realizaciones, cuando el estabilizante es tioglicerol o acido ascorbico o una sal de los mismos, el estabilizante esta en una concentracion de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 1 %. En otras realizaciones, cuando el estabilizante es metionina, el estabilizante esta en una concentracion de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,5 %, o de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,2 %. En otras realizaciones mas, cuando el estabilizante es glicerina, el estabilizante esta en una concentracion de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 100 % (puro).
En otras realizaciones, las composiciones contienen un antioxidante. Los antioxidantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, metionina y acido ascorbico. En ciertas realizaciones, la proportion molar de antioxidante con respecto a la variante de CNP es de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 15:1, o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 15:1, o de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 10:1, o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1 o de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 10:1.
En las composiciones se pueden usar sales farmaceuticamente aceptables, que incluyen, pero no se limitan a, sales de acido mineral (por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato), sales de acidos organicos (por ejemplo, acetato, propionato, malonato, benzoato, mesilato, tosilato), y sales de aminas (por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, diciclohexilamina, dietanolamina). Una discusion minuciosa de sales farmaceuticamente aceptables se encuentra en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edition, Mack Publishing Company, (Easton, Pensilvania (1990)).
Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar en diversas formas, tales como comprimidos, capsulas, granulos, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, pomadas, y parches transdermicos. Las formas de dosificacion de las composiciones se pueden adaptar al modo de administracion deseado de las composiciones. Para la administration oral, las composiciones pueden tomar la forma de, por ejemplo, un comprimido o capsula (incluyendo capsula de gelatina blanda), o pueden ser, por ejemplo, una solucion acuosa o no acuosa, suspension o jarabe. Los comprimidos y capsulas para su administracion oral pueden incluir uno o mas excipientes, diluyentes y vehlculos usados habitualmente, tales como manitol, lactosa, glucosa, sacarosa, almidon, almidon de malz, sacarina sodica, talco, celulosa, carbonato de magnesio y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, estearil fumarato sodico). Si se desea, se pueden anadir agentes aromatizantes, colorantes y/o edulcorantes a las formulaciones solidas y llquidas. Otros ingredientes opcionales para las formulaciones orales incluyen, pero no se limitan a, conservantes, agentes de suspension y agentes espesantes. Las formulaciones orales tambien pueden tener un revestimiento enterico para proteger la variante de CNP del entorno acido del estomago. Se conocen metodos de preparation de formas de dosificacion solidas y llquidas, o seran obvios para los expertos en esta materia (vease, por ejemplo, Pharmaceutical Sciences de Remington, mencionado anteriormente).
Las formulaciones para administracion parenteral se pueden reparar, por ejemplo, como soluciones o suspensiones llquidas, como formas solidas adecuadas para solubilization o suspension en un medio llquido antes de la inyeccion, o como emulsiones. Por ejemplo, las soluciones y suspensiones inyectables esteriles se pueden formular de acuerdo con tecnicas conocidas en la tecnica usando agentes diluyentes, vehlculos, disolventes (por ejemplo, solucion acuosa tamponada, solucion de Ringer, solucion isotonica de cloruro sodico), agentes dispersantes, agentes humectantes, agentes emulgentes, agentes de suspension adecuados, y similares. Ademas, se pueden usar aceites no volatiles esteriles, esteres grasos, polioles y/o otros ingredientes inactivos. Como ejemplos adicionales, las formulaciones para administracion parenteral incluyen soluciones inyectables esteriles acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostaticos y solutos que hacen que la formulation sea isotonica con la sangre del receptor deseado; y suspensiones acuosas y no acuosas esteriles, que pueden contener
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agentes de suspension y agentes espesantes.
Las composiciones que comprenden una variante de CNP tambien pueden ser formulaciones liofilizadas. En ciertas realizaciones, las formulaciones liofilizadas comprenden un tampon y un agente formador de volumen, y opcionalmente un antioxidante. Los tampones a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, tampones de acetato y tampones de citrato. Los agentes formadores de volumen a modo de ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, manitol, sacarosa, dextrano, lactosa, trehalosa, y povidona (PVP K24). En ciertas realizaciones, el manitol esta en una cantidad de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 10 %, o de aproximadamente un 4 % a aproximadamente un 8 %, o de aproximadamente un 4 % a aproximadamente un 6 %. En ciertas realizaciones, la sacarosa esta en una cantidad de aproximadamente un 6 % a aproximadamente un 20 %, o de aproximadamente un 6 % a aproximadamente un 15 %, o de aproximadamente un 8 % a aproximadamente un 12 %. Los antioxidantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, metionina y acido ascorbico.
La divulgacion tambien proporciona kits que contienen, por ejemplo, frascos, viales, ampollas, tubos, cartuchos y/o jeringas que comprenden una formulacion llquida (por ejemplo, inyectable esteril) o una formulacion solida (por ejemplo, liofilizada). Los kits tambien pueden contener vehlculos o excipiente farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, disolventes, soluciones y/o tampones) para reconstituir una formulacion solida (por ejemplo, liofilizada) en una solucion o suspension para su administracion (por ejemplo, by por inyeccion), que incluye, pero no se limita a, reconstitucion de una formulacion liofilizada en una jeringa para inyeccion o para dilucion de un concentrado hasta una concentration mas baja. Ademas, las soluciones y suspensiones de inyeccion extemporanea se pueden preparar a partir de, por ejemplo, polvo esteril, granulos, o comprimidos que comprenden una composition que contienen CNP. Los kits tambien pueden incluir dispositivos de distribution, tales como dispositivos de distri bucion de aerosol o inyeccion, inyectores de bollgrafo, auto inyectores, inyectores sin aguja, jeringas, y/o agujas.
Como un ejemplo no limitante, un kit puede incluir jeringas que tengan una camara individual o una camara doble. Para jeringas de camara individual, la camara individual puede contener una formulacion llquida de CNP lista para su inyeccion, o una formulacion solida de CNP (por ejemplo, liofilizada) o una formulacion llquida de una variante de CNP en una cantidad relativamente pequena de un sistema de disolvente adecuado (por ejemplo, glicerina) que se puede reconstituir en una solucion o suspension para inyeccion. Para las jeringas de camara doble, una camara puede contener un vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, sistema de disolvente, solucion o tampon), y la otra camara porque contener una formulacion solida de CNP (por ejemplo, liofilizada) o una formulacion llquida de una variante de CNP en una cantidad relativamente pequeno de un sistema de disolvente adecuado (por ejemplo, glicerina) que se puede reconstituir en una solucion o suspension, usando el vehlculo fue excipiente de la primera camara, para inyeccion.
Como un ejemplo adicional, un kit puede incluir uno o mas inyectores de bollgrafo o dispositivos de autoinyeccion, y cartuchos de camara doble. Una camara de un cartucho puede contener un vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, sistema de disolvente, solucion o tampon) y la otra camara puede contener una formulacion de cNp solida (por ejemplo, liofilizada) o una formulacion llquida de una variante de CNP en una cantidad relativamente pequena de un sistema de disolvente adecuado (por ejemplo, glicerina) que se puede reconstituir en una solucion o suspension, usando el vehlculo o excipiente de la primera camara, para inyeccion. Un cartucho puede comprender una cantidad de la variante de CNP que es suficiente para su dosificacion durante un periodo de tiempo deseado (por ejemplo, 1 dla, 2 dlas, 3 dlas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, etc.). El inyector de bollgrafo o autoinyector se puede ajustar para administrar una cantidad deseada de la formulacion de CNP desde un cartucho.
Ademas, las composiciones farmaceuticas que comprenden una variante de CNP se pueden formular como un sistema de liberation lenta, de liberation controlada o de liberation sostenida para mantener un nivel de dosificacion relativamente constante durante un periodo de tiempo deseado, tal como 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, o 3 meses. Las formulaciones de liberacion lenta, de liberacion controlada y de liberacion sostenida se pueden preparar usando, por ejemplo, sistemas polimericos biodegradables {que pueden comprender, por ejemplo, pollmeros hidrofilos [por ejemplo, polilactida, poliglicolido, poli(lactida-glicolido)]}, y pueden tomar la forma de, por ejemplo, micropartlculas, microesferas o liposomas, como se sabe en la tecnica.
Dosificaciones y frecuencia de dosificacion
Como se usa en el presente documento, la expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" de un agente activo (por ejemplo, una variante de CNP) se refiere a una cantidad que proporciona un beneficio terapeutico a un paciente. La cantidad puede variar de un individuo a otro y puede depender de una serie de factores, incluyendo la condition flsica general del paciente. Una cantidad terapeuticamente eficaz de una variante de CNP la puede establecer facilmente un experto en la materia, utilizando materiales y procedimientos disponibles publicamente. Por ejemplo, la cantidad de una variante de CNP usada para terapia deberla dar una tasa de crecimiento aceptable basandose en graficos de crecimiento para ninos de 0-17 anos con acondroplasia (214 mujeres y 189 hombres), que en eran la altura para la edad, circunferencia de la cabeza, y crecimiento segmentario (Horton WA et al., Standard growth curves for achondroplasia, J. Pediatr., 93: 435-8 (1978)). Los graficos de CDC se pueden usar para evaluar el peso para la edad y el peso para la altura o IMC para la edad. Tambien se pueden medir los resultados secundarios con
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cursos que tienen una naturaleza mas cronica mas.
Teniendo una semivida mas larga en suero que el CNP22 de tipo silvestre, las variantes de CNP se pueden administrar de forma potencial con menos frecuencia que CNP22. La frecuencia de dosificacion para un individuo en particular puede variar dependiendo de diversos factores, que incluyen el trastorno que se esta tratando y la afeccion y la respuesta del individuo a la terapia. En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica que contiene una variante de CNP se administra a un sujeto aproximadamente una vez al dla, una vez cada dos dlas, una vez cada tres dlas, o una vez a la semana. En una realizacion, para el tratamiento de of trastornos relacionados con los huesos (por ejemplo, displasias esqueleticas, incluyendo acondroplasia), se administra una dosis diaria o semanal de una variante de CNP a pacientes hasta y/o a traves de la edad adulta.
Las variantes de CNP que se describen en el presente documento se pueden administrar a pacientes a dosis terapeuticamente eficaces para tratar, mejorar o prevenir trastornos relacionados con los huesos (por ejemplo, displasias esqueleticas, incluyendo acondroplasia) y afecciones (por ejemplo, trastornos del musculo liso vascular) en las que el CNP puede proporcionar un efecto vasoprotector. La seguridad y la eficacia terapeutica de las variantes de CNP se pueden determinar mediante procedimientos farmacologicos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentation, tal como, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal para un 50 % de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en un 50 % de la poblacion). La proportion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el Indice terapeutico y se puede expresar como la proporcion de DL50/DE50. Normalmente se prefieren agentes activos que presenten un Indice terapeutico grande.
Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificacion para uso en seres humanos. La dosificacion normalmente se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulation que incluye la DE50, con poca o minima toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion usada y de la via de administration usada. La dosis terapeuticamente eficaz se puede determinar a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales.
En ciertas realizaciones, las variantes de CNP que se describen en el presente documento se administran a una dosis en el intervalo de aproximadamente 5 o 10 nmol/kg a aproximadamente 300 nmol/kg, o de aproximadamente 20 nmol/kg a aproximadamente 200 nmol/kg. En algunas realizaciones, las variantes de CNP se administran a una dosis de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 nmol/kg u otra dosis que el medico que trata considere apropiada. En otras realizaciones, las variantes de CNP se administran a una dosis de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 ug/kg, o aproximadamente 1, 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 4,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 mg/kg, u otra dosis que el medico que trata considere apropiada. Las dosis de las variantes de CNP que se describen en el presente documento se pueden administrar de acuerdo con la frecuencia de dosificacion/ frecuencia de administracion que se describen el presente documento, que incluye, pero no se limita a diariamente, 2 o 3 veces a la semana, semanalmente, cada 2 semanas, cada 3 semanas, mensualmente, etc.
La frecuencia de la dosificacion/administracion de una variante de CNP para un sujeto en particular puede variar dependiendo de diversos factores, incluyendo el trastorno que se esta tratando y la afeccion y respuesta del sujeto a la terapia. La variante de CNP se puede administrar en una sola dosis o en multiples dosis por dosificacion. En ciertas realizaciones, la dosis de cNp se administra, en una sola dosis o en multiples dosis, diariamente, cada dos dias, cada 3 dias, 2 veces a la semana, 3 veces a la semana, semanalmente, quincenalmente, cada 3 semanas, mensualmente, cada 6 semanas, cada 2 meses, cada 3 meses, o segun lo considere apropiado el medico que trata.
En algunas realizaciones, se administra una variante de CNP para permitir periodos de crecimiento (por ejemplo, condrogenesis), seguidos de un periodo de recuperation (por ejemplo, osteogenesis). Por ejemplo, la variante de CNP se puede administrar por via intravenosa, por via subcutanea o mediante cualquier otra via diariamente o multiples veces a la semana durante un periodo de tiempo, seguido de un periodo sin tratamiento, y a continuation el ciclo se repite. En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento inicial es de 3 dlas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas. En una realizacion relacionada, el periodo sin tratamiento dura 3 dlas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. En ciertas realizaciones, el regimen de dosificacion de la variante de CNP es diario durante 3 dias seguido de 3 dias de descanso; o diario o multiples veces a la semana durante 1 semana seguido de 3 dlas o 1 semana de descanso; O diario o multiples veces a la semana durante 2 semanas seguido de 1 o 2 semanas de descanso; O diario o multiples veces por semana durante 3 semanas seguido de 1, 2 o 3 semanas de descanso; O diario o multiples veces a la semana durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas seguido de 1, 2, 3 o 4 semanas de descanso.
Modos de Administracion
Las variantes de CNP, o composiciones farmaceuticas que las comprenden, se pueden administrar a sujetos de diversas maneras, por ejemplo mediante inyeccion por via subcutanea, por via intravenosa, por via intraarterial, por
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via intraperitoneal, por via intramuscular, por via intradermica o por via intratecal. En una realizacion, las variantes de CNP se administran mediante una sola inyeccion subcutanea, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradermica o intratecal una vez al dla.
Las variantes de CNP tambien se pueden administrar por inyeccion directa en o cerca del sitio de la enfermedad. Ademas, las variantes de CNP se pueden administrar mediante la implantacion de un deposito en el sitio de accion diana (por ejemplo, un hueso anomalo o displasico). Como alternativa, las variantes de CNP se pueden administrar por via sublingual bajo la lengua (por ejemplo, comprimido sublingual) o por inhalacion en los pulmones (por ejemplo, inhalador o pulverizacion de aerosol), por administracion en la cavidad nasal (por ejemplo, pulverizacion intranasal), por administracion en el ojo (por ejemplo, gota ocular), o por administracion transdermica (por ejemplo, por medio de un parche sobre la piel). Las variantes de CNP tambien se pueden administrar por via oral en forma de microesferas, microcapsulas, liposomas (no cargados o cargados (por ejemplo, cationicos)), micropartlculas polimericas (por ejemplo, poliamidas, polilactida, poliglicolido, poli(lactida-glicolido)), microemulsiones, y similares.
Un metodo adicional de administracion es mediante bomba osmotica (por ejemplo, una bomba Alzet) o mini-bomba (por ejemplo, una bomba mini-osmotica Alzet), que permite una administracion controlada y continua controlado y
continuo y/o de liberacion lenta de la variante de CNP o composicion farmaceutica durante un periodo
predeterminado. La bomba o mini-bomba osmotica se puede implantar por via subcutanea o cerca del sitio diana (por ejemplo, los huesos largos de las extremidades, las eplfisis, etc.).
Como se ha explicado anteriormente, las variantes de CNP se pueden usar para tratar afecciones o enfermedades causadas por el crecimiento anomalo de las celulas del musculo liso vascular, que incluye, pero no se limita a, reestenosis y arteriosclerosis. Para la administracion local de una variante de CNP al vaso sangulneo corporal enfermo, la variante de CNP se puede administrar por medio de un dispositivo medico (por ejemplo, una endoprotesis vascular) implantado en el sitio enfermo. En una realizacion, la variante de CNP esta impregnada en una matriz polimerica o revestimiento polimerico colocado sobre una endoprotesis vascular. En otra realizacion, la variante de CNP esta contenida en depositos o canales formados en el cuerpo de una endoprotesis vascular y cubiertos por una membrana o capa polimerica porosa a traves de la cual la variante de CNP se puede difundir. La matriz, revestimiento, membrana o capa polimerica puede comprender al menos un pollmero biodegradable (por ejemplo, hidroxilo), tal como se sabe en la tecnica. En una realizacion mas, la variante de CNP puede estar
contenida en microporos en el cuerpo de una endoprotesis vascular. La variante de CNP se puede administrar
desde una endoprotesis vascular por liberacion de estallidos, liberacion de pulso, liberacion controlada o liberacion sostenida, o una combinacion de las mismas. Por ejemplo, la endoprotesis vascular puede administrar la variante de CNP de forma local al sitio enfermo en una liberacion de estallido seguida de una liberacion sostenida. La liberacion sostenida puede ser durante un periodo de aproximadamente 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses o 1 ano.
Para un experto en la materia sera evidente que las variantes de CNP o composiciones de las mismas tambien se pueden administrar por otros modos. La determinacion del modo de administracion mas eficaz de las variantes de CNP o composiciones de las mismas esta dentro de la habilidad del experto en la materia.
Las variantes de CNP se pueden administrar como formulaciones farmaceuticas adecuadas para, por ejemplo, administracion por via oral (incluyendo bucal y sublingual), rectal, nasal, topica, pulmonar, vaginal o parenteral (incluyendo intramuscular, intraarterial, intratecal, subcutanea e intravenosa), o en una forma adecuada para administracion por inhalacion o insuflacion. Dependiendo del modo de administracion pretendido, las formulaciones farmaceuticas se pueden presentar como formas de dosificacion solidas, semisolidas o llquidas, tales como comprimidos, supositorios, plldoras, capsulas, polvos, llquidos, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, lociones y similares. Las formulaciones se pueden proporcionar en una forma de dosificacion unitaria adecuada para administracion unica de una dosificacion precisa. Las formulaciones comprenden una cantidad eficaz de una variante de CNP, y uno o mas excipientes, vehlculos y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente uno o mas de otros agentes biologicamente activos.
Terapia de combinacion
En una realizacion, una variante de CNP se puede usar en combinacion con uno o mas de otros agentes activos utiles para tratar, mejorar o prevenir afecciones o trastornos sensibles a CNP tales como, por ejemplo, trastornos relacionados con los huesos (por ejemplo, displasias esqueleticas) y trastornos del musculo liso vascular. El o los otros agentes activos pueden aumentar los efectos de la variante de CNP y/o ejercer otros efectos farmacologicos ademas de los de la variante de CNP. Los ejemplos no limitantes de agentes activos que se pueden usar en combinacion con las variantes de CNP que se describen en el presente documento son otros peptidos natriureticos (por ejemplo, BNP) e inhibidores (por ejemplo, antagonistas) de peptidasas y proteasas (por ejemplo, NEP y furina), NPR-C y tirosina quinasas (por ejemplo, FGFR-3). Al prevenir la escision con NEP de la variante de CNP, un inhibidor de NEP puede prolongar la semivida de la variante. Los ejemplos de inhibidores de NEP incluyen, pero no se limitan a, tiorfano y candoxatril. El co-uso de un inhibidor de nPR-C tambien puede prolongar la semivida de la variante de CNP a traves de la inhibition de la elimination de la variante por NPR-C. Un ejemplo no limitante de un inhibidor de NPR-C es el fragmento FGIPMDRIGRNPR (SEQ ID NO: 82), que se podrla liberar al sitio diana (por
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ejemplo, placa de crecimiento oseo) despues de la escision proteolltica de la quimera de FGIPMDRIGRNPR-CNP22 (Analogo CZ) (SEQ ID NO: 82) o quimeras similares que comprenden variantes de CNP22 (por ejemplo, las que contienen sustitucion(es), adicion(es), y/o delecion(es) de aminoacidos con respecto a CNP22). El co-uso de un inhibidor de tirosina quinasa puede acentuar los efectos de una terapia de CNP inhibiendo el receptor FGFR-3 de tirosina quinasa, un regulador negativo de condrocitos y crecimiento oseo. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de tirosina quinasa incluyen los que se desvelan en los documentos de patente de Estados Unidos n.°s 6.329.375 y 6.344.459.
Para conseguir el resultado terapeutico adecuado en las terapias de combinacion, por lo general se podrla administrar al sujeto la composition de CNP y otro u otros agentes terapeuticos en una cantidad combinada eficaz para producir el resultado terapeutico deseado (por ejemplo, restablecimiento del crecimiento oseo). Este proceso puede implicar la administration de la composicion de CNP y otro u otros agentes terapeuticos al mismo tiempo. La administration simultanea se puede conseguir administrando una formulation de una sola composicion o una formulation de protelna farmacologica que incluya tanto la variante de CNP como otro u otros agentes terapeuticos. Como alternativa, el otro u otros agentes s terapeuticos se pueden tomar por separado al mismo tiempo que una formulacion farmacologica (por ejemplo, comprimido, inyeccion o bebida) de la variante de CNP. La variante de CNP tambien se puede formular en un producto alimenticio como brownies, tortitas, o pastel, adecuados para su ingestion.
En otras alternativas, la administracion de la variante de CNP puede preceder o seguir a la administracion del otro u otros agentes terapeuticos (mediante intervalos que varlan de minutos a horas. En realizaciones en las que el otro agente o agentes terapeuticos y la composicion de CNP se administran por separado, por lo general se podrla asegurar que la variante de CNP y el otro agente o agentes terapeuticos se administran dentro de un periodo de tiempo apropiado entre si de modo que tanto la variante de CNP como el otro u otros agentes terapeuticos pueden ejercer, de forma sinergica o aditiva, un efecto beneficioso en el paciente. Por ejemplo, la composicion de CNP se puede administrar en aproximadamente 0,5-6 horas (antes o despues) de del otro u otros agentes terapeuticos. En una realization, la composicion de CNP se administra dentro de aproximadamente 1 hora (antes o despues) del otro u otros agentes terapeuticos.
Identification y seguimiento de poblaciones de pacientes
Para identificar sujetos adecuados para la terapia con CNP y para determinar si un paciente dado es sensible a la terapia con CNP se pueden establecer protocolos. Por ejemplo, para el tratamiento de trastornos relacionados con los huesos, se pueden medir indicadores de crecimiento, tales como mediciones de crecimiento de hueso largo in utero y neonatal y mediciones de biomarcadores de crecimiento oseo tales como CNP, cGMP, Colageno II, osteocalcina y Antlgeno Nuclear de Celulas Proliferantes (PCNA).
Un marcador de serialization de CNP es cGMP (monofosfato de guanosina 3',5' clclico). El nivel de esta molecula de serialization intracelular aumenta despues de que CNP se una y active su receptor NPR-B afln. Los niveles elevados de cGMP se pueden medir a partir de extractos de cultivos celulares (in vitro) despues de la exposition a CNP, medios acondicionados de estudios de explantes de huesos (ex vivo) despues de la exposicion a CNP, y en plasma (in vivo) dentro de minutos de la administracion de CNP por via subcutanea, por via intravenosa, a traves de otras vlas de administracion conocidas en la tecnica.
Los analitos especlficos de cartllago y de hueso (o marcadores asociados con cartllago y hueso) tambien se pueden medir para evaluar la eficacia de CNP. Por ejemplo, los fragmentos de colageno de tipo II escindido son un marcador especlfico de cartllago para la renovation del cartllago. El colageno de tipo II es el componente organico principal del cartllago y los fragmentos de colageno de tipo II (colageno escindido) se liberan en circulation, y posteriormente se secretan en la orina, despues de la renovacion del cartllago. La renovacion del cartllago precede a la formation de hueso nuevo.
Un biomarcador especlfico de hueso para la formacion osea que se puede medir son los propeptidos N-terminales del procolageno de tipo I (PINP). La slntesis del colageno de tipo I es una etapa importante en la formacion de hueso, ya que el colageno de tipo I es el principal componente organico en la matriz osea. Durante la slntesis del colageno, los propeptidos s se liberan de la molecula de procolageno y se pueden detectar en el suero. Ademas, los fragmentos de colageno de tipo I se pueden medir como un marcador para la resorcion osea.
Otros biomarcadores potenciales para el cartllago y la formacion osea y el crecimiento incluyen sulfato de agrecano y condroitina (marcador especlfico de cartllago para la renovacion del cartllago), propeptidos del colageno de tipo II (marcador especlfico de cartllago para la formacion del cartllago), fosfatasa alcalina (especlfica de hueso) y osteocalcina para la formacion de hueso). Los biomarcadores asociados a cartllago y hueso se pueden medir, por ejemplo, en suero a partir de estudios de eficacia/farmacodinamicos in vivo y a partir de los medios acondicionados de estudios ex vivo, usando kits disponibles en el mercado.
En una realizacion, el nivel de al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago se somete a ensayo se mide en un sujeto al que se le ha administrado una variante de CNP con el fin de controlar los efectos de la variante de
5
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15
20
25
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35
CNP en la formation y crecimiento de hueso y cartliago in vivo. Por ejemplo, un aumento en el nivel de al menos un biomarcador asociado a hueso o cartllago puede indicar que la administration de una variante de CNP tiene un efecto positivo en el crecimiento oseo y es un tratamiento util para displasias esqueleticas y otras enfermedades o trastornos relacionados con los huesos o cartllagos con disminucion de la actividad de CNP. Los ejemplos de biomarcadores asociados de hueso o cartllago incluyen, pero no se limitan a, CNP (por ejemplo, niveles endogenos de CNP), cGMP, propeptidos de colageno de tipo II y fragmentos de los mismos, colageno de tipo II y fragmentos de los mismos, osteocalcina, antlgeno nuclear de celulas proliferantes (PCNA), propeptidos de procolageno de tipo I (PINP) y fragmentos de los mismos, colageno de tipo I y fragmentos de los mismos, sulfato de agrecano y condroitina y fosfatasa alcalina.
En una realization, los biomarcadores se miden al obtener una muestra biologica de un sujeto al que se le administrara, se lee esta administrando o se le ha administrado una variante de CNP. Los biomarcadores se pueden medir usando tecnicas conocidas en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, transferencia de Western, ensayos de inmunoabsorcion relacionados con enzimas (ELISA) y ensayo de actividad enzimatica. La muestra biologica puede ser sangre, suero, orina u otros fluidos biologicos.
Los aspectos adicionales y los detalles de la divulgation seran evidentes a partir de los ejemplos que siguen a continuation, que pretenden ser ilustrativos.
F. Ejemplos
Ejemplo 1
Slntesis de Variantes de CNP
Las variantes de CNP se prepararon usando los metodos que se describen en el presente documento. Se realizaron sustituciones con aminoacidos o peptidomimeticos naturales o no naturales, como se indica en las Tablas 1-3 (mostradas en el Ejemplo 3), en los respectivos restos de aminoacidos en la secuencia de CNP22 de tipo silvestre. En ciertas variantes, se anadieron aminoacidos adicionales a los extremos N-terminales y/o C-terminales de toda o una parte de la secuencia de CNP22 de tipo silvestre (vease la Tabla 3).
Tambien se prepararon variantes de CNP en las que un resto de PEG (o PEO) se conjugo con el extremo N-terminal de CNP22 o variantes del mismo (vease la Tabla 4, mostrada en el Ejemplo 3). Los reactivos de PEGilacion se pueden obtener a partir de las fuentes comerciales que se muestran en la Tabla 5.

Claims (15)

  1. 5
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    15
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    30
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    45
    50
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    65
    1. Una variante de peptido natriuretico de tipo C (CNP) seleccionada entre el grupo que consiste en:
    PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145); PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP37) (SEQ ID NO: 186); MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP37) (SEQ ID NO: 192); MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 191).
  2. 2. Una composicion farmaceutica que comprende una variante de CNP de la reivindicacion 1, y un excipiente, vehlculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
  3. 3. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 2, que es una formulacion liofilizada preparada a partir de una formulacion que comprende un tampon de acido cltrico/citrato o un tampon de acido acetico/acetato que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, en la que la formulacion ademas comprende opcionalmente un agente de ajuste de isotonicidad y/o un agente formador de volumen, y/o ademas comprende un antioxidante seleccionado entre el grupo que consiste en metionina, acido ascorbico, formas de sal de acido ascorbico, tioglicerol, y combinaciones de los mismos.
  4. 4. Una variante de CNP de acuerdo con la reivindicacion 1 o una composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de la reivindicacion 2 o 3 para su uso en un metodo para el tratamiento de un trastorno relacionado con los huesos o displasia esqueletica seleccionado entre el grupo que consiste en artrosis, raquitismo hipofosfatemico, acondroplasia, hipoacondroplasia, estatura baja, enanismo, osteocondrodisplasias, displasia tanatoforica, osteogenesis imperfecta, acondrogenesis, acondroplasia homocigotica, condrodisplasia punctata, displasia camptomelica, hipofosfatasia letal congenita, tipo letal perinatal de osteogenesis imperfecta, slndromes de polidactilia y costillas cortas, hipoacondroplasia, tipo rizomelico de condrodisplasia punctata, displasia metafisaria de tipo Jansen, displasia espondiloepifisiaria congenita, atelosteogenesis, displasia diastrofica, displasia mesomelica de tipo Langer de femur corto congenita, displasia mesomelica de tipo Nievergelt, slndrome de Robinow, slndrome de Reinhardt, acrodisostosis, disostosis periferica, displasia de Kniest, fibrocondrogenesis, slndrome de Roberts, displasia acromesomelica, micromelia, slndrome de Morquio, slndrome de Kniest, displasia metatrofica y displasia espondiloepimetafisaria.
  5. 5. Una variante de CNP de acuerdo con la reivindicacion 1 o una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3 para su uso en un metodo para el tratamiento de un trastorno del musculo liso vascular seleccionado entre el grupo que consiste en hipertension, reestenosis, arteriosclerosis, insuficiencia cardiaca descompensada aguda, insuficiencia cardiaca congestiva, edema cardiaco, nefredema, edema hepatico, insuficiencia renal aguda e insuficiencia renal cronica.
  6. 6. Un metodo para produccion recombinante de una variante de CNP de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende
    (i) cultivar una celula hospedadora bacteriana que comprende un primer polinucleotido que codifica una variante de polipeptido CNP de la reivindicacion 1 unido a un segundo polinucleotido que codifica un peptido o protelna escindible en condiciones que dan como resultado la expresion de un polipeptido de fusion codificado por dicho primer y segundo polinucleotidos, en el que el polipeptido de fusion comprende dicha variante de CNP unida directamente a dicho peptido o protelna escindible o unida indirectamente al mismo a traves de un conector y en el que el peptido o protelna escindible se selecciona entre el grupo que consiste en etiquetas de histidina, factor de transcripcion humano TAF12, dominio de plegamiento de histona TAF12, tAf12(C/A), TAF12(D/E), TAF12(4D/4E), TAF12(6D/6E), TAF12(10D/10E), TAF12(C/A y D/E), TAF12(C/A y 4D/4E), TAF12(C/A y 6D/6E), TAF12(C/A y 10D/10E), cetosteroide isomerasa, protelna de union a maltosa, p-galactosidasa, glutation-S- transferasa, tiorredoxina, dominio de union a quitina, BMP-2, y BMP-2(C/A), y
    (ii) escindir dicho peptido o protelna escindible de dicho polipeptido de fusion para liberar dicha variante de CNP.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que el polipeptido de fusion se expresa como una protelna soluble o como un cuerpo de inclusion, que comprende adicionalmente aislar el polipeptido de fusion expresado de la celula hospedadora o medio de cultivo.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 6 o 7, que comprende adicionalmente poner en contacto el polipeptido de fusion aislado con un agente de escision seleccionado entre el grupo que consiste en acido formico, bromuro de cianogeno (CNBr), hidroxilamina, autoescision de protelna, Factor Xa, enteroquinasa, ProTEV y proteasa de SUMO.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que el agente de escision es acido formico, y en el que la puesta en contacto del polipeptido de fusion aislado con un agente de escision se realiza en presencia de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 10 % de acido formico a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 36 horas.
  10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, que produce una variante de CNP seleccionada entre el grupo que consiste en:
    10
    15
    20
    PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP37) (SEQ ID NO: 186); MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP37) (SEQ ID NO: 192); PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145); y MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 191).
  11. 11. Una variante de CNP producida de acuerdo con el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que la variante de CNP se selecciona entre el grupo que consiste en:
    PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP37) (SEQ ID NO: 186); MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP37) (SEQ ID NO: 192); PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145); y MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 191).
  12. 12. Una variante de CNP para su uso en un metodo para aumentar el crecimiento de huesos largos, en el que la variante de CNP se selecciona entre:
    (SEQ ID NO: 192) MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP37);
    (SEQ ID NO: 186) PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP37);
    (SEQ ID NO: 145) PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37)); y (SEQ ID NO: 191) MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP37)).
    imagen1
    imagen2
    Tincion con azul de Ceemassie Transferencia tie Western cen anticuerpo anti-CNP
    FIGURA2
    M 1 2 3
    imagen3
    A.
    KSI KSI' Trx MBP TAP TAF' KSI KSI' Tn< MBP TAP TAF'
    M NT ST ST STSTS T S P MNTSTS TSTSTSTSP
    imagen4
    BMP-Pro-CNP37 TAF-Pro-CNP37 BMP-Pr&-CNP37 TAF-ProCNF37
    MCTuT SPTuTS P MCTuTSPTuTSP
    imagen5
    Tincion con <izul <le Coonmssie Transferencia de Western con anticuerpo anti-CNP
    imagen6
    FIGURA
    continuacion
    BMP
    Pm<WjK
    so o
    BMP
    BMP
    Pttvt
    NI’^K
    solo
    BMP
    TA
    Pni-CNPftt
    solo
    TAF
    ■■ ■
    AF-Pro-HSA-CNP
    TAF-Pro-HSA-CNP
    i «SjR^
    imagen7
    acido fornuco a 50 %
    J 25nC 37°e i2K 55 “C
    37”C-£
    TAF RthCNP9G
    TA.^
    Prn-CNP3B
    TAF-Prj-CNP3S
    TAF
    F r&- C N P38
    ki{lof«rniito a 2 % acido formico aid*.
    imagen8
    |>ni = ' ' . (ciclado)
    Escision de AspArg colateral
    pm = . ' J'i
    bianco
    T/iF Pio.ChFJi
    TAP
    i’FJ K1
    me 7D‘c me arc me jpe td*c
    rAF-Prt-CHRS
    ► '
    CHFJS
    XT J 'Qi 7A\u 17hf H4hr 17k 2*hr 17k 24i*r
    TAF-CNP34
    CNP38
    Clou
    Cton 2
    imagen9
    CNP36
    FIGURA7
    TAF-NL- TAFCC/AA
    (C/A&6D/6E)- 10D/IOEF TAF-Pto-
    Prt)-CNF38 Pro-CNP38 CNF53
    M C T TI S SJ I TI 5 51 T TI S .SI
    imagen10
    imagen11
    TAF-CNkM
    TAF-Pro-CNP5 i
    CNKW
    FIGURA 9
    M<is<i inonoisotoi>ic<i <le CNP34 col. = 3553,88
    3553,3,
    r.:All
    CNP34
    . *•
    Sin ni^.1 en
    este pic©
    tsas
    >.1
  13. 5.
    imagen12
    Masa monoisotopica de Pro-CNP53 cal.= 5898,14
    PADlA So-ZU>-» ncM6Q 2fl DMACNP<20'00125001 100125000001 Lj»-
    589fl,6
    Alt mALl
    Pro-CNP53 i
    Sin en
    este ijico
    4W
    MW
    mi
    rr rT
    ^ S-f-
    u.
    FIGURA 11
    T AF( C/A&4D/4G)- TAFI4D/4E)
    fr*-CNP3S
    Pri>CNP3S
    •u
  14. - .1
    JAF-Pm-CNP:^
    CI4P3K
    imagen13
    TAF(4D/4F,i
    TARC/A&4D/4E)-
    Pro-CNP3S
    Prt>-CNP3R
    ■ j
    CNP38
    -1 ****
    F GURA13
    TAF-NL-
    TAFfC/A &
    (C/A&6D/6E)-
    IOEVJOE)-Pro-
    P10-CNP3K
    CNP38
    as*,
    —
    **
    CNPMJi
    Induction
    a-------_----------t.
    Time (hr): 17 18 19 20 21 23 24
    imagen14
    FIGURA 15
    imagen15
    Pro CNP38
    Fiacciones de Eluato de SP-Sepliarose
    imagen16
    Digestion con NEP de conjugados de CNP22-PEG
    CNP22
    CNP22-PEG5K
    CNP22-PEG2K
    CNP22-PEQ24
    CNP22-PEG1K
    25
    CNP22-PE012
    Mi nut os
    FIGURA 17
    Digestion con NEP de Extensiones N-terminales de CNP
    -A-CNP53
    CNP37
    CNP27
    120
    160
    Minutos
    !■(. de Peptido liitiicto Restaiite
    imagen17
    Noimalizado a 1 uM tie CNP
    imagen18
    Nommlizado a 1 uM de CNP22
    imagen19
    imagen20
    CNP22 / 293T
    Produccion de cGMP
    celu as 293T tiansfectadtis con NPR-B
    ♦ — CNP22 V 293T
    - ♦ -CNP22 / NPRC
    - — Pro-CNP38 / 293T
    - » - Pro-CNP38 / NPRC —*—ANP/293T
    - M -ANP.NPR-C
    n
    000
    100000
    nM CNP
    Produccion de cGMP
    celiilds 293T fi«insfec?«id<is con NPR-A
    Pro-CNP38 ) 293T
    - » - Pro-CNP38 / NPRC
    ANP/293T
    -ANP.NPR-C
    0,001
    1000
    100000
    nM CNP
    imagen21
    Barras de izquierda a derecha
    1 control (sin CNP22, sin FGF2)
    2 CNP22 (0,2 uM) continuo
    3 CNP22 (0,2 uM} 1 hr una vez al dia
    4 CNP22 (0,2 uM) 2 hr una vez al dia
    5 FGF2 (5 ng/ml) continuo
    6 FGF2 + CNP22 (0,2 uM} continuo
    7 FGF2+CNP22 (0,2 uM}1 hr <liai iameiite 8FGF2+CNP22 (0,2 uM}2 hr diariameiite
    celulas/pocillo (x 10^ )
    imagen22
    celulas/pocillo (x 10^ ) S & g
    imagen23
    >
    CD
    FIGURA 26
    CPM.pocillo CPM.pocillo
    A B
    imagen24
    control FGF2 FGF^CNP CNP control FGF2 FGFJtCUP CNF
    C D
    r—--------------------------------------------8-,
    imagen25
    control FGF2 FGF2*CNP CNP control FGF2 FGF2+CNP CNP
    imagen26
    imagen27
    120-
    110-
    CNP37
    CNP27-PE024
    -B-
    CNP22
    S-
    VEHClILu
    illi'lS
    F GURA 30
    Tibia WT
    -o-
    CNP37
    CNP27-PE024
    -B-
    CNP22
    -E3-
    VEHCUU.I
    illViS
    % de crecimiento
    at
    1
    '3
    a»
    *
    ■u
    Tibia Ac
    imagen28
    -6- CNP37 -9- CNP27-PE024 -&■ CNP22 -E3- VEHiCULO
    FIGURA 32 Femur WT
    imagen29
    CNP37
    -©- CNP27-PE024 -B- CNP22 *£3- VEHiCULO
    imagen30
    Femur Ac
    -0- CNP37
    CNP27-PE024
    -e- CNP22
    -E3- VEHICULO
    dias
    imagen31
    Condrocitos
    Femur dista
    Condrocitos articu ares
    hipertroficos
    U c
    Celulac por columns
    B.
    Celularidad do Columnar Proliferates Sin tratamiento
    imagen32
    imagen33
    Hiperrrofia condrocitica Sin tratamiento
    silvestre
    tipo
    CNP37 veh Ac veh Wt
    Condrocitos
    Tibia distal Condrocitos articulares hipertroficos
    D.
    G.
    E.
    * ' ■ « - 0f- ' f ff i .T' _ * : % •' * « y ‘ , * ' U ' < n- . .
    imagen34
    ' * ‘
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    «* > -
    i • . • >-• ' .j^l •
    '■ . r l
    ■ * * .. ' ' -
    F.
    1. ■
    imagen35
    Espesor tottil do pitied do crociiiiioiito
    Espesor de la zona proliferante
    ■i. -
    Espesor de la zona hipemofita
    3,500 3^000 - ^500
    I 2^000
    | 1,500 “• 1,000 0,500 0,000
    niveles <le cGMP <le medies acendicienades, femmes ex-vive wt
    .1
    T
    T
    Vehfcule CNP22 CMP27PE024 CNP37
    imagen36
    imagen37
    nivtlfts dc cGMP (k meuios iicondicioiuvks,
    til>uis ex-vive WT
    5,000
    4X00
    E 3,000
    E 2,000
    1.000
    0,000
    uehicnlo
    CHP22
    CNP27-PEQ24
    CMP37
    FIGURA 42
    mveles <le cGMP de medies acendicmiades, tunas ex
    vive de FGFR3 Ac
    0,000
    4,000
  15. 3.0 j'.:
    2,000
    1.000
    0,000
    Ve hicu o
    CNP22
    CNP27-PEQ24
    CNP3“
    pmol'mi
    Piesencia de celagene escindide de lipo II en los medies acendicienades de femmes de WT y de FGFR3 ex-vive
    8Q
    imagen38
    FIGURA 44
    imagen39
    imagen40
    Adrninistraaon ntravenosa
    20 nmowg (ratas)
    t^NPIT-PEDM
    CNP37
    Tiempo (mm)
    FIGURA 46
    Administration Subcutanea
    50 nmovkg (ratas)
    f NP27 PHOM
    CNP37
    MC
    Tiempo (mm)
    imagen41
    Longitud (•") Peso (g)
    Pesos corporates
    imagen42
    ■2 3 8 13 18 23 28 33
    Tiempo {(lias)
    FIGURA 50
    Longitudes de la cola
    imagen43
    cm,'9*1/3
    Lonijit Miles corporates
    □ wt+VEH ■ Ach+VEH
    □ Ach+CNP22
    O Ach+CNP27-PE024
    imagen44
    Tienipo (semanas)
    imagen45
    imagen46
    Longrtud del cubito
    b t-J
    5J0
    i
    ■■■■■
    AduWK CNPZ7-PE024
    CNPJ7
    iw* '.'F ■ i
    HL.T+ VE H
    Longitud de hi tibia
    ij.ii
    A t- -VrH
    teh+C«P22
    CNP27-PEQ24
    CNP37
    imagen47
    Longitud del liumero
    1. V
    c
    wUVkH
    ArfuCNF22
    CNP2?'FE024
    .Iii I-
    Longitud del femur
    - ^
    CHPJT.PSa?^
    wltWH
    WltVEJH
    M'i+ONP/?
    n ;; ■ ■
    imagen48
    romA2(gA2/3)
    Meato .nulitiuo extemo, Semana 5
    imagen49
    FIGURA 58
    imagen50
    p m ol.'rrt I pmol/ml
    imagen51
    pmol/ml
    imagen52
    FIGURA 62
    Respuesta de cGMP despues de 15 min tras la dosis de exposition a variante de CNP
    70
    imagen53
    pmotml
    imagen54
    -coo
    !
    3SJ ■ 3«) ■ HO ■ £00 ■
    imagen55
    Vehiculo
    * p < 0,05
    FIGURA 64
    Niveles de cGMP
    imagen56
    20 nmol,'kg Pro-CNP38
    imagen57
    70 nmo!/kg Pro-CNP3B
    pgttnl
    imagen58
    imagen59
    CTXJI (og-irtPI
    imagen60
    imagen61
    Aumento relative* en la longitud corporal (%)
    100 i
    160 -
    140 -
    120 -
    100 -
    80
    I I Vehiculo
    1=1 Pro-CNP36(Sl) [ZZD Pro-CMP3e (S2}
    imagen62
    imagen63
    SM egg 7D0 ■
    m ■
    5 DO ■
    400
    3M
    m |
    & ■
    Vehiculo
    •= p <0,01
    •t =p<0,001 I
    imagen64
    CNP38 Pro-CNP38 HSA-CNP27
    pg.'m I
    * - p <0,05
    *
    imagen65
    Vehiculo 20 70
    20 70 70 200
    CNP38
    Pro-CNP38 HSA-CNP27
    25t.fi
    200,0
    150,0
    100,0
    50,0
    "¥>
    t
    imagen66
    Vehiculo 20 70
    20 70 70 200
    CNP38
    Pro-CNP38 HSA-CNP27
    imagen67
    imagen68
    F0,3
    N. de tratamientos al dia:
    ProCNP38 200nmol/kg:
    1.5-1
    C.5-
    Q.
    Tratamiento individual los dias: i
    ProCNP38 200nmol/kg:
    pmol/tnMng pmol/mlflmg
    A: Femur distal (cartilago + luieso)
    B: Eje medio femoral (luieso cortical f
    imagen69
    iSmln 3Pmin 6Qmn 180min C: Cartilago tie la oreja
    imagen70
    E: Hifjado
    imagen71
    ■: Pulmon
    imagen72
    imagen73
    lSmin 30min SOrnin iSOmin D: Riiiou
    0T
    imagen74
    lSmin 30min £0min ISOmin F: Corazon
    imagen75
    lSmin 30min 6Qmin ISOmin H: Cereltro
    imagen76
    lSmin 30min 60min ISOmin
    Aumento en el Ancho de la Placa de Crecimiento a partir del Valor del Estudio previo
    0,6
    5,5
    A4
    0,3
    0,2
    0,1
    0
    imagen77
    Dia del Estudio 23 51 86 23 51 86 23 51 86
    Grupo de Tratamiento uehiculo lOugkg 36ug,'kg
    FIGURA 79
    Aumento eu la Longitud de la Pierna a paitii del Valor del Estudio previo
    imagen78
    imagen79
    IQug.'kg
    Dm -del Estudio
    Grupo de Ti<it<imiento vehiculo
    lOug/kg
    36ug kg
    Aumento en la Longitud de la Tibia Izqmerda a partii del Valor del Estudio previo
    FIGURA 78
    Aumento en la Longitud <le la Tibia Derecha a partii del Valor del Estudio previo 5
    Dl.i <lel Estinlio
    Giupo <le Ti.it.imiento vehiculo
    An memo en Li Lon<|itu<l del Braze a partir del Valor del Estudio p re vie
    25
    imagen80
    Dfa del Estudio ” 55 91 1*B 27 SS 91 118 27 55 91 118
    Grupo lie Tratamieiito iiehfculo 10uq'hq 36ug;kg
    FIGURA 81
    Aumento en la Lonijitud del Cuerpo a partir del Valor del Estudio previo
    imagen81
    Dfa del Estudio 27 55 « 118 27 55 « 1« & 55 91 11®
    Gru|>o de Tratamieiito iiehfculo lOug.'hg 36ug/kg
    imagen82
    Gamble en el Nivel <le Fesfatasa Alcanna en Suere
    Di.i <lel E studio
    7
    21
    35
    49
    53
    77
    91
    105
    . 200
    u'rlih Ul<>
    10uq *g
    Jb'Jtf kg
    Grupe <le Tratannento
    FGURAS3
    DC 000
    « o,ioaoa
    250
    40C
    S 0,01000
    D. D0100
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