JP2010530222A

JP2010530222A - ナトリウム利尿融合タンパク質

Info

Publication number: JP2010530222A
Application number: JP2010511280A
Authority: JP
Inventors: キースカナダ; ウベショーエンベック; ユージーンアール．ヒッキー; アダムメゾ; ケビンマクドネル
Original assignee: べーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲーエムベーハー; シントニクスファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2010-09-09
Also published as: EP2162464A1; CL2008001661A1; CA2689492A1; UY31123A1; US20100310561A1; AR066885A1; PE20090311A1; WO2008154226A1; TW200906849A

Abstract

本発明は、抗体Fc領域に連結したナトリウム利尿ペプチドを含むナトリウム利尿ペプチド融合タンパク質、本明細書に開示されている融合タンパク質をコードする核酸分子、当該融合タンパク質を発現する発現ベクター、当該融合タンパク質を含む薬学的組成物、およびその治療上の使用方法を開示する。

Description

共同研究契約に関する記述
本出願に含まれる一つ以上の発明は、ベーリンガー・インゲルハイム・インターナショナル・ゲーエムベーハーおよびシントニクス・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド間の2004年共同研究技術強化法案に記載の共同研究契約に基づいて開発された。

技術分野
本発明は、利尿、ナトリウム利尿、および血管拡張作用を有する融合タンパク質、具体的には抗体Fc領域に連結したナトリウム利尿ペプチドに関する。本発明の融合タンパク質は、膜グアニリルシクラーゼのリガンドとなる野生型ナトリウム利尿ペプチドよりも延長された血漿半減期を示す。また、本発明は、本明細書に開示される融合タンパク質をコードする核酸分子、当該タンパク質を発現する発現ベクター、本発明の融合タンパク質および／または核酸分子を含む薬学的組成物を対象とする。本発明に記載される組成物は、注射により投与されてもよい。更に、本発明は、病的状態を治療または回復させる方法であって、本発明の融合タンパク質の結合によるNPRA受容体の活性化が患者に対して治療効果を与える方法に関する。

発明の背景
ナトリウム利尿ペプチドは、血管内体積、血圧、ナトリウム利尿、利尿、および長骨の成長の制御を含む多数の生物学的機能に関与している。これらのペプチドとしては、例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）およびB型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）が挙げられ、どちらも、リガンドの結合によりcGMP合成を触媒する膜グアニリルシクラーゼである細胞表面糖タンパク質受容体、ナトリウム利尿ペプチド受容体A（NPRA）、に結合することによりその細胞効果を発揮すると考えられている。それらの生物学的機能の内、ANPおよびBNPは、心臓血管系に影響を与えると考えられており、急性心不全、並びに慢性うっ血性心不全を含む様々な心臓病の治療に特に有効な治療薬であり得る。

残念なことに、この臨床的応用が有望であるにもかかわらず、ANPおよびBNPはエンドペプチダーゼ分解、並びにナトリウム利尿ペプチドクリアランス受容体（NPR-C）を介した内部移行により生体内で極めて短い半減期を有するため、それらの治療的有用性はひどく限られている。例えば、ヒトにおけるANPの血漿半減期は約2分であり、BNPのそれは約20分と推定されている（Potter et al., Endocrine Reviews (2006) 27(1):42-72（非特許文献1））。従って、以前のこれらペプチドの治療用投与は、通常は病院またはその他の医療施設での時間のかかる静脈内注射によるものに限定されている。従って、ANPやBNPなどのナトリウム利尿ペプチドの臨床的恩恵を医学がより完全に受けられるようにする、別の治療法が必要とされている。

Potter et al., Endocrine Reviews (2006) 27(1):42-72

本発明は、IgGまたはその他の抗体のFc領域に連結した一つ以上のナトリウム利尿ペプチドを含む新規の生物学的に活性な融合タンパク質に関する。

更に、本明細書は、本発明のナトリウム利尿融合タンパク質をコードする核酸分子、およびナトリウム利尿融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供するものであって、これらは、異常な利尿作用、ナトリウム利尿作用、および血管拡張性作用に関連する疾患を含むがこれらに限定されない病的状態の治療または回復を含む用途に使用され、NPRA受容体の活性化が患者に対して治療効果を与える。本発明の融合タンパク質または核酸分子は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む組成物中に存在していてもよい。

一つの側面において、本発明は、グリシンコハク酸リンカーによりFc領域に結合された一つ以上のナトリウム利尿ペプチドからなる融合タンパク質を対象としている。本明細書において企図されているように、グリシンコハク酸リンカーを用いてナトリウム利尿ペプチドとFc領域とを連結する場合、リンカーのグリシン残基はFc領域のN末端に連結され、コハク酸部分はナトリウム利尿ペプチドのC末端に連結される。および／または多様な長さと配列を有するアミノ酸リンカー。リンカーに関連して、その長さおよび組成は、ナトリウム利尿ペプチドが長期に渡り有効性をもたらすのに重要である。本明細書において企図されているとおり、ペプチドはFc領域に様々な方向から連結していてもよい。一つの方向では、ペプチドのC末端がFc領域のN末端に連結していてもよく、もう一つの方向では、ペプチドのN末端がFc領域のN末端に連結している。Fc領域はIgG分子のヒンジ、CH2、およびCH3領域のホモダイマーとして存在し、IgGヒンジ領域内の最初のN末端システイン残基から始まるFc領域とホモダイマーは、CysProProCysPro（配列番号：1）のシステイン残基からのヒンジ内の2つのジスルフィド結合により結合している。

更なる側面において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤および本明細書に記載のいずれかの融合ペプチドを含む薬学的組成物を含む。

更なる側面において、本発明は、本明細書に開示される融合タンパク質をコードする核酸分子、および当該タンパク質を発現する発現ベクターも対象にする。

もう一つの側面において、本発明は、病的状態を治療または回復させる方法であって、NPRA受容体の活性化が患者に対して治療的効果を与える方法に関する。病的状態としては、限定するものではないが、異常な利尿作用、ナトリウム利尿作用、および血管拡張性作用に関連する疾患、ならびに／またはナトリウム利尿、利尿、血管拡張作用の誘導、もしくはレニン・アンジオテンシンIIおよびアルドステロン系の調節が望まれる疾患が挙げられる。これらの状態は、過剰な量の細胞外液で特徴付けられ得る状態、例えば、限定するものではないが、肺水腫を含む。特に好ましい態様において、本発明は、心臓血管系の病的状態を治療または回復させる方法であって、その病的状態としては、慢性心不全（非虚血性）、心筋梗塞後の心不全（虚血性慢性心不全）、急性心筋梗塞、再灌流傷害、左室機能不全（LVD）、心線維症、拡張期心不全、および肥大型心筋症が挙げられるが、これらに限定されない。更に、高血圧症を含むがそれに限定されない高血圧障害、例えば、肺高血圧症、収縮期高血圧症、抵抗性高血圧症、および糖尿病性神経障害などのその他の心臓血管関連障害は、本発明の方法により治療または回復され得る。本明細書においては、本発明の融合タンパク質および薬学的組成物が冠動脈バイパス移植術（CABG）を受ける患者に治療的効果を提供し得ることも企図されている。

本発明が、上記の任意の病的状態を治療または回復させるための薬物の製造において本発明の融合タンパク質を利用することを含むこともまた、本明細書で企図されている。

本発明のこれら及びその他の側面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかになる。本明細書中に開示されたすべての文献は、それぞれ個別に組み入れられるようにその全体が本明細書に参考として組み入れられる。

図1A〜Bは組換え技術により作製された四種類のANP-Fc融合タンパク質のDNA配列およびタンパク質配列を示す。太字で示したマウスIgGκ軽鎖シグナル配列は切断され、最終タンパク質生成物の一部ではない。下線部分はhANP28である。イタリック体の部分は(GGS)_xGGリンカーである。 cGMPアッセイの典型的な用量反応曲線を示す。ラットNPRAを発現する293T細胞において、組換え技術により作製された融合タンパク質をcGMP生成についてアッセイした。 hNPRA 293細胞＋／−NEPにおける、ANPまたは融合タンパク質により誘発されるcGMPの生成を示す。

発明の詳細な説明
本開示内容は、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体Fc領域を含む融合タンパク質であって、該ナトリウム利尿ペプチドが直接またはリンカーを介してFc領域に複合化している融合タンパク質を提供する。融合タンパク質のナトリウム利尿ペプチドとFc領域は、融合タンパク質の効果に貢献する二つの異なった生物学的役割を果たす。驚くことに、リンカーの長さも融合タンパク質の効果に影響を与える。

本開示内容はまた、抗体Fc領域によってお互いが分離されている少なくとも二つのナトリウム利尿ペプチドを含む融合タンパク質であって、該ナトリウム利尿ペプチドが直接またはリンカーを介してFc領域に複合化している融合タンパク質も提供する。

いくつかの態様において、融合タンパク質は下記の式を含む：
X-L_a-F:F-L_a-X、またはX-L_a-F:F
式中、Xはナトリウム利尿ペプチドであり、
Lはa個のアミノ酸残基を含むリンカーであり、
aは0以上の整数であり、
:は化学会合または架橋であり、
FはFcRn結合部位を含む免疫グロブリンFc領域の少なくとも一部である。

また、いくつかの態様において、融合タンパク質は下記の式からなるものである。
X-L_a-F:F-L_a-X
式中、Xは一つ以上のナトリウム利尿ペプチドであり、
Lはアミノ酸残基を含むリンカーであり、
aは0以上の整数であり、
:は化学会合または架橋であり、かつ
FはFcRn結合部位を含む免疫グロブリンFc領域の少なくとも一部である。

いくつかの態様において、ナトリウム利尿ペプチドは、ANP、BNP、ウロジラチン、DNP、または生物学的に活性なそれらの配列変異体からなる群より選択される。またいくつかの態様において、ナトリウム利尿ペプチドはANPまたはBNPである。

いくつかの態様において、融合タンパク質は少なくとも二つのナトリウム利尿ペプチドを含む。またいくつかの態様において、xは一つより多いナトリウム利尿ペプチドであってよい。いくつかの態様においては、両方のナトリウム利尿ペプチドはANPである。また、いくつかの態様においては、両方のナトリウム利尿ペプチドはBNPである。

特定の態様において、化学会合、すなわち（：）は、共有結合である。別の態様において、化学会合、すなわち（：）は、非共有相互作用、例えば、イオン相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合である。

いくつかの態様において、融合タンパク質は、少なくとも二つのFc領域を含む。

いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも2、4、6、9、11、16、または20アミノ酸長である。また、他の態様において、リンカーは少なくとも0、1、5、7、8、10、12、13、14、15、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸長、あるいは任意で更に長くてもよく、例えば、30〜40アミノ酸長、または40〜50アミノ酸長であってもよい。いくつかの態様において、リンカーは、6〜11アミノ酸長、11〜16アミノ酸長、9〜20アミノ酸長、16〜20アミノ酸長、16〜25アミノ酸長、または20〜30アミノ酸長、25〜35アミノ酸長、30〜50アミノ酸長、30〜40アミノ酸長、または35〜45アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、10より多い、15より多い、20より多い、25より多い、または30より多いアミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、グリシンコハク酸リンカー（L1）、アミノ酸リンカー、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様において、アミノ酸リンカーは、

である。

いくつかの態様において、融合タンパク質は、対応する野生型ナトリウム利尿タンパク質よりも、タンパク質分解に対して抵抗性がある。いくつかの態様において、融合タンパク質は、対応する野生型ナトリウム利尿タンパク質よりも長い半減期を示す。いくつかの態様において、融合タンパク質は、組換え技術、合成化学、または半合成化学により作製される。

本開示内容は、配列番号：8〜11（それぞれ配列番号：33〜36によりコードされる）のいずれか一つを含むナトリウム利尿融合タンパク質を提供する。また、本開示内容は、配列番号：12〜13のうちのいずれか一つを含むナトリウム利尿融合タンパク質も提供する。

本開示内容はまた、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、および配列番号：11からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも90％の配列同一性を示す単離されたポリペプチドも提供する。

本開示内容はまた、配列番号：12および配列番号：13からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも90％の配列同一性を示す単離されたポリペプチドも提供する。

本開示内容はまた、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、および配列番号：11からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも95％の配列同一性を示す単離されたポリペプチドも提供する。

本開示内容はまた、配列番号：12および配列番号：13からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも95％の配列同一性を示す単離されたポリペプチドも提供する。

本開示内容はまた、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、および配列番号：11からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも99％の配列同一性を示す単離されたポリペプチドも提供する。

本開示内容はまた、配列番号：12および配列番号：13からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも99％の配列同一性を示す単離されたポリペプチドも提供する。

本開示内容は、本明細書に記載のナトリウム利尿融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、融合タンパク質は静脈内、皮下、または経口投与に適合している。

本開示内容は、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、および配列番号：11からなる群より選択されるポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。本開示内容は、配列番号：12および配列番号：13からなる群より選択されるポリペプチドをコードする単離された核酸分子も提供する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、哺乳類、原核生物、酵母、植物、または遺伝子組換えの発現系を利用して組換えにより作製される。

本開示内容は、本明細書に記載の一つ以上のナトリウム利尿融合ペプチドを含む薬学的組成物を、治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与する工程を含む、過剰な量の細胞外液を特徴とする状態を治療または回復させる方法を提供する。

本開示内容は、NPRA受容体の活性化が治療的効果をもたらす病的状態を治療または回復させる方法であって、本明細書に記載の一つ以上のナトリウム利尿融合ペプチドを含む薬学的組成物を、治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。

本開示内容は、異常な利尿作用、ナトリウム利尿作用、および血管拡張性作用に関連する疾患を治療または回復させる方法であって、本明細書に記載の一つ以上のナトリウム利尿融合ペプチドを含む薬学的組成物を、治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。

本開示内容は、ナトリウム利尿、利尿、血管拡張作用の誘導、またはレニン・アンジオテンシンIIおよびアルドステロン系の調節が望まれる疾患を治療または回復させる方法であって、本明細書に記載の一つ以上のナトリウム利尿融合ペプチドを含む薬学的組成物を、治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。

本開示内容は、慢性心不全（非虚血性）、再灌流傷害、左室機能不全（LVD）、心線維症、拡張期心不全、および肥大型心筋症からなる群より選択される心臓血管系の病的状態を治療または回復させる方法であって、本明細書に記載の一つ以上のナトリウム利尿融合ペプチドを含む薬学的組成物を、治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。

本開示内容は、高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症、および抵抗性高血圧症からなる群より選択される高血圧障害を治療または回復させる方法であって、本明細書に記載の一つ以上のナトリウム利尿融合ペプチドを含む薬学的組成物を、治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。

本開示内容は、糖尿病性腎症を治療または回復させる方法であって、本明細書に記載の一つ以上のナトリウム利尿融合ペプチドを含む薬学的組成物を、治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。

A.定義
特別な定めのない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において発明の説明に用いられる術語は、特定の形態を説明するために過ぎず、本発明の限定を意図するものではない。見出しは読者の便宜のためのものであり、本発明の限定を意図するものではない。本明細書中に記載された全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、完全な形で参照として本明細書に組み入れられ、また、本明細書において商標名で言及される任意の商標のついた薬品の添付書も同様である。

本明細書およびここで説明される形態に用いられているとおり、以下に示す用語は、ここに示す意味を持つ。

単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、特に文脈によってはっきりと示されていない限り、複数形も包含するものとする。

本明細書に使用される用語「融合タンパク質」、例えば、「ナトリウム利尿融合タンパク質」とは、共有結合的に連結している少なくとも二つのポリペプチドを有するタンパク質であって、その内の一方のポリペプチドが一つのタンパク質の配列または領域に由来し、他方のポリペプチドが別のタンパク質の配列または領域に由来するタンパク質を意味する。通常、融合タンパク質のポリペプチドは、直接または共有結合性のリンカーを介して連結されていてもよい。この用語（「リンカー」）は、ポリグリシンリンカー等のアミノ酸リンカー、または例えばグリシンコハク酸リンカー、糖鎖リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー等の別の種類の化学的リンカーを意味する。リンカーは、少なくとも2、4、6、9、11、16、または20アミノ酸長であってよい。また、リンカーは、少なくとも0、1、5、7、8、10、12、13、14、15、17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のアミノ酸からなるものであってもよいが、任意で更に長く、その長さは例えば、30〜40アミノ酸長、または40〜50アミノ酸長であってもよい。アミノ酸は、20個の天然アミノ酸のDまたはL型のいずれかの異性体から選択され、その例としては、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンが挙げられる。リンカーは、その大部分が、グリシンおよびアラニン等の立体障害のないアミノ酸で構成されていてもよい。リンカーは、さまざまなアミノ酸残基の長さのものを含んでいてもよく、その長さは例えば、6〜11アミノ酸長、11〜16アミノ酸長、16〜20アミノ酸長、16〜25アミノ酸長、20〜30アミノ酸長、30〜35アミノ酸長、35〜40アミノ酸長、40〜45アミノ酸長、または45〜50アミノ酸長が挙げられる。これらのアミノ酸の一部はグリコシル化されていてもよい。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、--NH--(CH₂)_s--C(O)--等のアルキルリンカーであって、s＝2〜20も利用することができる。これらのアルキルリンカーは更に、低級アルキル基（例えば、C₁--C₆）、低級アシル基、ハロゲン（例えば、Cl、Br）、CN、NH₂、フェニル等の任意の非立体障害性基で置換されていてもよい。例示的な非ペプチドリンカーは、PEGリンカーであり、該リンカーの分子量は100〜5000kD、好ましくは100〜500kDである。ペプチドリンカーを、上記と同様に変化させ、誘導体を形成することもできる。本明細書の実施例に説明されているとおり、本発明の融合タンパク質の好ましいリンカーは、基本の繰り返し部分である(GGS)_xまたは(GGS)_xGGを有する長く伸びたアミノ酸である。例えば、xは0〜16の整数であってもよい。本明細書において特定の配向が具体的に説明されているが、融合タンパク質を形成するポリペプチドは、C末端からC末端、N末端からN末端、またはN末端からC末端へ連結することも可能であるが、C末端からN末端へ連結していてもよく、融合タンパク質のポリペプチドは任意の順番であってよい。本明細書では、本発明の融合タンパク質が二つのペプチド融合を含んでいてもよいことも企図されている。例えば、融合タンパク質は、二つのFc領域に挟まれた一つのペプチドを含んでいてもよく、例えば、Fc-ナトリウム利尿ペプチド-Fcといったナトリウム利尿ペプチドが直接またはリンカーを介してFc領域と複合化しているものが挙げられる。本明細書で企図されているとおり、ナトリウム利尿ペプチドとFc領域をグリシンコハク酸リンカーで連結する場合、リンカーのグリシン残基はFc領域のN末端に連結され、コハク酸部分はナトリウム利尿ペプチドのC末端に連結される。

「融合タンパク質」という用語は、融合タンパク質を構成するポリペプチドの保存的に改変した変異体、多形性の変異体、対立遺伝子、変異体、サブシークエンス、および種間相同体を意味する。融合タンパク質は、一つのタンパク質配列のアミノ酸鎖を共有結合により別のタンパク質配列のアミノ酸鎖と連結することにより製造してもよく、例えば、融合タンパク質を近接してコードする組換えポリヌクレオチドを調製する方法、または当業者によく知られている合成手段が挙げられる。

本明細書において、「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」および「ペプチド」と互換的に使用される。

「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖を形成するそのポリマーを意味する。この用語は、合成、天然、および非天然の公知のヌクレオチドアナログまたは改変された主鎖残基や連結を含有する核酸であって、参照となる核酸と同様の結合特性を持ち、参照となるヌクレオチドと同様に代謝される核酸を包含する。これらのアナログは当業者にはよく知られているものであり、例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロアミデートが挙げられる。他に示されていない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変した変異体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。本明細書において使用される用語「核酸」は、「遺伝子」、「cDNA」、「mRNA」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」と呼んでもよい。

本明細書中で企図されているとおり、本発明の融合タンパク質を含むポリヌクレオチド配列は、融合タンパク質のそれぞれ独立したポリペプチドをコードする各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。従って、融合ポリペプチドの独立したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、保存的に改変した変異体、多形性の変異体、対立遺伝子、変異体、サブシークエンス、および種間相同体が挙げられる。

「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上で二つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列部分は、二つの配列の最適整列のために（付加または欠失を含まない）参照配列と比較したとき、付加または欠失（即ちギャップ）を含むことができる。このパーセンテージは、一致する位置の数を得るために両方の配列中に生じている同一の核酸塩基またはアミノ酸残基の位置の数を決定し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割算し、かつ配列同一性のパーセンテージを得るために、生じた数値を100倍することによって算出される。

ポリヌクレオチド配列の「実質同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも25％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。また、同一性の割合は25％から100％の任意の整数であってよい。更に好ましい態様は、当業者によく知られたプログラム、好ましくは標準パラメーターを使用したBLASTを使用して参照配列と比較した結果、少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％以上を含む。当業者は、コドンの縮重、アミノ酸類似性、読み枠の位置決定等を考慮することによってこれらの値を適切に調整して、2つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができることを理解するだろう。これらの目的のために、アミノ酸配列の「実質同一性」は通常、少なくとも40％の配列同一性を意味する。ポリペプチドの同一性の好ましい割合は、40％から100％の任意の整数であってよい。より好ましい態様は、少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％を含む。「実質的に類似した」ポリペプチドは、上記のように配列を共有するが、同一でない残基の位置は保存的なアミノ酸変化によって異なっていてもよい。

比較のための配列の最適アライメントは、通常の方法によって実施してもよく、例えば、Smithおよび Watermanの局部的相同性アルゴリズム(1981)Add. APL. Math. 2:482、Needlemanおよび Wunschの同一性アライメントアルゴリズム(1970)J. Mol. Biol. 48:443、Pearsonおよび Lipmanの類似性検索方法（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444、またはこれらのアルゴリズムのコンピューター実施（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージにおけるGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTA、ジェネティクス・コンピューター・グループ（GCG）、575サイエンス・ドライブ、マディソン、ウィスコンシン州）が含まれる。

配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389 3402およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410に説明されており、当業者には良く知られている。

ヌクレオチド配列が実質的に同一であることを示す別の指標は、二つの分子が互いに、または第3の核酸と、中程度に、および好ましくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする場合である。一般的に、高い、中程度の、および低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当業者によく知られている。例えば、ストリンジェントな条件としては、規定のイオン強度及びpH下で標的配列の50％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度（T_m）より約5℃から10℃低く選択され、中程度のストリンジェンシーはT_mより約20〜29℃低く、低ストリンジェンシーの条件の特徴はT_mより約40〜48℃低い温度である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、50％ホルムアミド、5X SSC、および1％SDS、42℃でインキュベーション、または5X SSC、1％ SDS、65℃ でのインキュベーション、および65℃で0.2X SSCおよび0.1％SDS中での洗浄が考えられる。例えば、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152巻、1987年、BergerおよびKimmel編参照のこと。

本明細書において「アミノ酸」は、その他に特定されない限り、LまたはD型異性体のいずれかの任意の天然、人工または合成アミノ酸と定義される。「残基」という用語は、「アミノ酸」という用語と互換的に使用され、アミノ酸の定められた配列において特定の位置を有すると指定されていることが多い。

「生物学的に活性」とは、治療活性または薬理学的活性を有する薬剤、例えば、アゴニスト、部分的アゴニスト、またはアンタゴニストを意味する。

本明細書において記述される「有効な量」は、無毒でありながら、所望の治療的効果を提供するのに十分な量を意味する。以下に挙げるように、正確な必要量は、対象によって異なり、対象の年齢や全身状態、治療される病状の程度、投与される特定の生物学的に活性のある薬剤などによっても異なる。任意の個々の場合において、適切な「有効」な量は、関連するテキストおよび文献を参照する、および／または日常的な実験を利用して、当業者により決定されてもよい。

本明細書で使用される用語「Fc領域」は、「Y字」の基部に由来する抗体の部分を意味し、これは（抗体のクラスによって）二つから三つの定常領域にそれぞれ貢献する二つの重鎖により構成されている。Fc領域は多様な細胞レセプターおよび補体タンパク質に結合し、抗体の異なる生理学的な効果を仲介する。本明細書で企図されているとおり、エフェクター作用がわずかに見られる、ないし見られない任意の抗体のFc領域は本発明と一緒に使用されてもよい。これらの例としては、限定されるものではないが、IgG1、IgG2、およびIgG4が挙げられるが、任意の抗体の任意のFc領域であって、当業者によく知られた方法によりわずかなエフェクター活性を有するように配列が改変されたものも含み得る。

また、「Fc領域」という用語は、ヒンジ、CH2、およびCH3領域を含むIgG重鎖と説明することもでき、ここでIgG重鎖は、ヒンジ領域内の第一のN末端システイン残基から始まり、別のFc領域と第一および第二のN末端システイン残基の位置でホモダイマーを形成する。

「Fc」という用語は、融合タンパク質の部分を説明するためにも使用される。このような状況において、Fcはヒンジ、CH2、およびCH3領域を含むIgG重鎖であり、ここでIgG重鎖は、ヒンジ領域内の第一のN末端システイン残基から始まり、別のFcと第一および第二のN末端システイン残基の位置でホモダイマーを形成する。言い換えると、Fcホモダイマーの各鎖のN末端アミノ酸配列は、IgGヒンジ部分のCysProProCysPro（配列番号：1）で始まり、両方のCys残基はジスルフィド結合を形成している。

本明細書で使用されているペプチドは、実質的に細胞物質を含まない、または前駆的化学物質やその他の化学物質を含まない場合に「単離された」または「精製された」と言われる。本発明の融合ペプチドは、均一またはその他の精製度合いになるまで精製できる。精製レベルは、目的の用途に基づく。重要な特徴としては、その調製物を用いると、たとえかなりの量の他の成分が存在していても、ペプチドが望まれる機能を果たすことが可能である。

本明細書中で「ナトリウム利尿ペプチド」と呼ばれるものとしては、哺乳類ナトリウム利尿因子（ANP、BNP、CNP）、並びに、サケ心臓ペプチド（Tervonen et al., Endocrinology 139(9):4021-4025 (1998)）およびマンバ（Dendroaspis）ナトリウム利尿ペプチド（DNP）（Schweitzら、J. Biol. Chem., 267(20):13928-13932 (1992)）、ウロジラチンおよびそれに類似するペプチド、およびそれらの類似体、活性断片、分解生成物、塩、変異体、誘導体、および組み合わせが挙げられる。具体的に、Kangawa et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 118(1):131-139 (1984)、Sudoh, et al. Nature 332(6159):78-81 (1988)、およびKambayashi et al. FEBS Lett., Jan 1; 259(2):341-5 (1990)に開示されているとおり、ヒトANPおよびBNPは「hANP28」および「hBNP32」を含む。

「ナトリウム利尿ペプチド」には、ナトリウム利尿活性を示すペプチドが含まれ、例えば、ナトリウム利尿ペプチドの対立遺伝子変異体、オルソログ、スプライスバリアント、および／または種相同体であるペプチドが挙げられる。本技術分野において知られている手順を用いて、ナトリウム利尿ペプチドをコードする塩基配列に対応する遺伝子およびcDNAの全長遺伝子およびcDNA、対立遺伝子変異体、スプライスバリアント、全長コード部分、オルソログ、および／または種相同体を得ることができる。例えば、対立遺伝子変異体、オルソログ、および／または種相同体は、当業者に知られた任意の技術を使用して、本明細書に記述されている配列より適したプローブまたはプライマーを作成し、対立遺伝子変異体および／または所望の相同体を求めて適した核酸源をスクリーニングすることにより単離され同定されてもよい。

特定の作用様式に制限されず、本明細書に記載の「徐放またはデポー製剤」の薬物動態の特徴は、FcRn結合および酸性リソソーム内から全身循環へ戻るFcRnに結合した分子の再利用によって生物学的利用率の増加が示されるものであり得る（V. Ghetie and E.S. Ward, Annual Rev. Immunol., 18, 739-766, (2000)）。

本明細書で使用される用語「半合成」は、合成化学および組み替え技術の両方の利用を含む、本発明の融合タンパク質を合成する工程を意味する。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質のFc領域は、組換え技術により製造してもよく、ナトリウム利尿ペプチドとリンカーは合成することにより製造してもよい。

B．ペプチド分子
本発明は、IgGまたは別の抗体のFc領域に連結した一つ以上のナトリウム利尿ペプチドを含む新規の生物学的に活性な融合タンパク質に関し、これは、NPRA受容体の活性化が患者に対して治療効果を与える病的状態の治療または回復を含む用途に使用され、その病的状態としては、異常な利尿作用、ナトリウム利尿作用、および血管拡張性作用に関連する疾患が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に記載の融合タンパク質は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む組成物中に存在していてもよい。

本発明は、下記一般式AまたはBで表される本明細書に記載の融合タンパク質に関する。

ここで、
ナトリウム利尿ペプチドは、（i）一つ以上のANP、BNP、ウロジラチン、DNP、および生物学的に活性なそれらの配列変異体からなる群より選択され、（ii）アミノ酸配列のN'からC'へ、アミノ酸配列のC'からN'への配向、または一つよりも多いナトリウム利尿ペプチドの場合、N'からC'、C'からN'、またはN'からC'とC'からN'の混合であってもよく；かつ
Fc領域は、ヒンジ、CH2、およびCH3領域を含むIgG重鎖であり、ここでIgG重鎖は、ヒンジ領域内の第一のN末端システイン残基から始まり、別のFc領域と第一および第二のN末端システイン残基の位置でホモダイマーを形成し（例えば、配列番号：14または配列番号：17）、ここでFc領域はFc_ABまたはFc_BAで表され、ABは両方のFc領域の配向がN'からC'であり、BAは両方のFc領域の配向がC'からN'であることを示す。

本明細書で企図されているとおり、一つの側面において、本発明は、リンカーを介して抗体のFc領域に複合化している少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含む融合タンパク質を具体化する。融合タンパク質は実際に、抗体Fc領域に複合化している一つのナトリウム利尿ペプチドまたは二つのナトリウム利尿ペプチドを含んでいてもよい。以下に詳しく説明するとおり、ペプチドとFc領域を複合化させるために用いるリンカーの配列と長さは、その融合タンパク質がナトリウム利尿ペプチドを一つ含むか二つ含むかに応じて変化してもよい。

本発明の一つの側面は、下記一般式1または2で表される融合タンパク質に関する。

ここで、
ナトリウム利尿ペプチドは、（i）一つ以上のANP、BNP、ウロジラチン、DNP、または生物学的に活性なその配列変異体からなる群より選択され、（ii）アミノ酸配列のN'からC'へ、アミノ酸配列のC'からN'への配向、または一つよりも多いナトリウム利尿ペプチドの場合、N'からC'、C'からN'、またはN'からC'とC'からN'の混合であってもよく；
リンカーは、コハク酸-グリシンリンカー（L1）、GlyGlyリンカー（L2）、Gly(SerGlyGly)₂SerGlyリンカー（L3）（配列番号：2）、(GlyGlySer)_yGlyGlyリンカーであって、ここでyが3から6（例えば、配列番号：3（L4）、4、および7（L6））、(GlyGlySer)₅Gly（L5）（配列番号：6）、および(GlySerGly)₅Glyリンカー（L5a）（配列番号：5）からなる群より選択される一つ以上のリンカーであり；かつ
Fc領域は、ヒンジ、CH2、およびCH3領域を含むIgG重鎖であり、ここでIgG重鎖は、ヒンジ領域内の第一のN末端システイン残基から始まり、別のFc領域と第一および第二のN末端システイン残基の位置でホモダイマーを形成し（例えば、配列番号：14または配列番号：17）、ここでFc領域はFc_ABまたはFc_BAで表され、ABは両方のFc領域の配向がN'からC'であり、BAは両方のFc領域の配向がC'からN'であることを示す。

本発明の別の態様において、融合タンパク質は下記式3で表される。

ここで、ANPはANPのアミノ酸配列（配列番号：15）のN'からC'への配向（ANP_XY）であるか、またはANPのアミノ酸配列のC'からN'への配向（ANP_YX）であり；
リンカーは、L1、L2、L3、L4、L5、L5a、およびL6からなる群より選択される一つ以上のリンカーであって、ここで、L1は本明細書に記載のグリシンコハク酸リンカー、L2はGlyGlyリンカー、L3はGly(SerGlyGly)₂SerGlyリンカー（配列番号：2）、L4は(GlyGlySer)₃GlyGlyリンカー（配列番号：3）、L5は(GlyGlySer)₅Glyリンカー（配列番号：6）、L5aは(SerGlyGly)₅Gly（配列番号：5）、およびL6は(GlyGlySer)₆GlyGlyリンカー（配列番号：7）であり；かつ
Fcは、（i）ヒンジ、CH2、およびCH3領域を含むIgG重鎖であり、ここでIgG重鎖は、ヒンジ領域内の第一のN末端システイン残基から始まり、別のFcと第一および第二のN末端システイン残基の位置でホモダイマーを形成し（例えば、配列番号：14または配列番号：17）、（ii）Fc1_AB, Fc1_BA, Fc2_AB, またはFc2_BAで表され、ここでFc1はIgG1分子に由来し、Fc2はIgG2分子に由来し、ABはFcのN'からC' の配向であり、BAはFcのC'からN'の配向である。

また、本発明の別の側面において、融合タンパク質は下記式4で表される。

本発明の融合タンパク質は、例えばcGMPを触媒することができる生物学的に活性な分子であるが、はるかに長い半減期を有し、更にタンパク質分解に左右されにくいため、治療目的において更に有用である。更に、FcRn介在性輸送を活用することにより、本明細書で開示される治療用融合タンパク質はボーラス注入により投与されてもよいが、持続放出性のデポー製剤に似た薬物速度論的特性を示し得る。

本発明の融合タンパク質は、IgGなどの抗体のFc領域に直接またはリンカーを介して複合化しているナトリウム利尿ペプチドである。ペプチドを抗体のFc領域に複合化することにより、これらの融合タンパク質は、複合化していないものよりも更に長い半減期を示す。特定の作用様式に制限されず、本発明の融合タンパク質は、Fc領域が新生仔定常領域断片受容体（FcRn）に結合し、FcRn活性型輸送システムを活用することにより飲作用されて隔離され、（FcRn経路は母親由来抗体（IgG）を新生動物の腸上皮を経て輸送する）、本明細書で開示される融合タンパク質のレベルは細胞内リソソーム分解からの保護、並びに中性エンドペプチダーゼ（NEP）またはNPRクリアランス受容体への暴露の減少が可能である。融合タンパク質は、細胞から正常に放出されると再利用され、再度循環されてもよい。これにより、リガンドのボーラス投与後に象徴的な、一時に全てのNPRA受容体が活性化される状態を避けることが可能となり得る。本発明の融合タンパク質の生物学的利用率は、徐放デポー製剤のそれに、より酷似し得る。

FcRn受容体は、肺、腎臓、腸管など数種類の成人組織内の内皮細胞表面に発現している。特定の作用様式に制限されず、FcRn受容体の通常の作用は、種々の臨床用途のためにヒトに生理活性ANP-FcおよびBNP-Fc融合タンパク質を投与する手段として活用されてもよい。例えば、心臓血管系の病的状態を治療または回復させる方法に加えて、本発明の融合タンパク質は、NPRA受容体の活性化が患者に治療的効果をもたらす、異常な利尿作用、ナトリウム利尿作用、および血管拡張性作用に関連する疾患を治療するための方法に利用してもよい。

本発明の融合タンパク質は、任意のナトリウム利尿ペプチドを含み得るが、好ましくはANPまたはBNPである。これらのタンパク質のうちヒトのものは、例えば、配列番号：15（NCBI寄託番号NM_006172）のhANP28（Kangawa et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 118(1):131-139 (1984)）および配列番号：16（NCBI寄託番号NM_002521）のhBNP32（Kambayashi et al. FEBS Lett 1990 Jan 1; 259(2):341-5）として知られている。野生型ナトリウム利尿ペプチドの様々な構造および配列形態の他に、本発明は、天然であれ、設計され合成されたものであれ、ありとあらゆる可能な生物学的に活性な配列変異体を企図することが理解されている。更に、いかなる種由来のペプチドも本発明の範囲内に含まれることが理解されているが、ヒト由来のペプチドが好ましい。更に、本発明の融合タンパク質は、ヒトと非ヒト、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどの動物由来のポリペプチド間で可能な任意の組み合わせを含んでいてもよい。

更に、配列変異体に加えて、当該ペプチドの断片が、本明細書に開示される本発明の範囲内に含まれることが企図されており、このような断片は本発明の方法において治療効果を示すのに十分な大きさである。当業者は、過度の実験を実施せずに、生物活性および／または治療効果に影響を及ぼさない程度でペプチドの長さや配列の種類の改変を決定できる。タンパク質は、酸性塩または塩基性塩、または中性の形態であってもよい。個々のアミノ酸残基は、酸化または還元により修飾されてもよい。

本発明の範囲内のその他の変異体としては、一次アミノ酸構造が、ほかのペプチドやポリペプチド、またはグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基などの化学的部分と共有結合性または凝集性の複合体を形成することにより修飾された融合タンパク質が含まれる。共有結合性の誘導体は、例えば、特定の官能基をアミノ酸側鎖またはN末端やC末端に結合することにより調製されてもよい。

本発明の融合タンパク質はグリコシル化されていてもいなくてもよい。酵母または哺乳類の発現系において発現される融合タンパク質は、発現系次第で、天然分子の分子量および糖鎖付加のパターンと類似していても、少し異なっていてもよく、ポリペプチドをコードするDNAを大腸菌（E. coli）などの細菌において発現すると、非グリコシル化された分子が得られる。

特定の態様において、本発明の二量体構築物は、単量体構築物よりも生体内での効力が強いことが認められた。本明細書に記載される抗体Fc領域に連結したナトリウム利尿ペプチドの二量体構築物の増強された効力は、ナトリウム利尿ペプチドリガンド（例えば、ANP、BNPなど）とその細胞表面受容体の間の単量体での相互作用を考えると、特に驚くべきものである。本明細書に記載の二量体構築物は、細胞および／または受容体と相互作用するには、立体構造的に込み合っていると予期され、従ってその様な二量対構築物は僅かな活性を有するおよび／または活性が無いことが予想される。

特定の態様において、本発明の単量体構築物は、二量体構築物よりも増加した生体内血清濃度（Cmax）を有することが認められた。本明細書に記載される抗体Fc領域に連結したナトリウム利尿ペプチドの単量体構築物の増加したCmaxは、二量体EPO-Fc構築物の静脈内投与と比較して単量体EPO-Fc構築物の静脈内投与が低いCmaxを示すという過去の結果を考慮すると、驚くべきものである（例えば、米国特許出願第2007/0172928号、表4参照）。

ナトリウム利尿ペプチドに複合化したFc領域は、好ましくはIgGのFc領域であり、IgG1、IgG2、またはIgG4（例えば、配列番号：14または17参照）が含まれるが、これらに限定されない。しかしながら、エフェクター作用を僅かしか持たないか、あるいは持たないように改変することができれば、他の抗体のFc領域を使用してもよい。ヒト抗体のFc領域が好ましいが、他の種のタイプ、野生型の形式、並びに配列変異体を使用することもでき、例えば、本明細書に記載の実施例に説明されている組換えFc分子を使用することもできる。本発明の一つの側面において、Fc領域は、IgG1またはIgG2アイソタイプ由来の二つのFc重鎖で構成され、システイン残基の鎖間ジスルフィド結合を可能とするため、それぞれの鎖のCPPCP配列まで下流のヒンジ残基は取り除かれている。理想的には、本発明のナトリウム利尿融合タンパク質は、RcRn受容体に結合できるFc領域を含み、この受容体の活性担体機能を誘発し、細胞内への融合タンパク質の送達を引き起こす。いったん細胞内に入ると、pH変化の結果としてFcRn受容体から融合タンパク質が放出され、最終的に融合タンパク質は細胞より放出され、再び循環され得る（Roopenian D. C. et. al. (2003) J. Immunology 170:3528-3533、Lencer, W. I. et al., Trends in Cell Biology 15(1):5-9(2005)）。

本明細書に示されているとおり、ナトリウム利尿ペプチドをFc領域と複合化するために用いられるアミノ酸リンカーの長さと配列は多様である。下記に記載の実施例に説明されているとおり、Fc領域との関連で結合したANPとのNPRAの構造モデリングを使用し、Fcに融合したANPをNPRA活性部位へ挿入可能にするために必要とされる最短リンカー距離を予測した。本明細書で企図されているとおり、リンカーの望ましい長さは、ナトリウム利尿ペプチドとFc領域間の立体的および静電気的な反発を最小にするものである。例えば、ANPのC末端からの望ましい最短距離は、最も近いFcホモ二量体のN末端から12Åであり、他方のFcホモ二量体N末端から17Åである。更に、Fcホモ二量体がANPを一つだけ融合させている場合（例えば、単量体）、リンカーの最小長としては4から6アミノ酸が好ましいとされる。Fcホモ二量体に二つのANPペプチドが結合し（例えば、二量体）、NPRA受容体に一つのANPのみ結合している（即ち、Fc二量体：NPRAが1：1である）場合、それぞれのリンカーにおいて、リンカーの最小長としては9アミノ酸が好ましいとされる。両方のANPがNPRAに結合（例えば、二つの隣接した受容体、または静止せず交代性の様式で一つのNPRA受容体に結合）するには、最小長が12アミノ酸であるリンカーが好ましいとされる。驚くべきことに、リンカー長を延長すると、融合タンパク質の効力を、融合したナトリウム利尿ペプチドの効力に近づけることができることが見出された。例えば、より長いリンカー、特にリンカー長が20アミノ酸である融合タンパク質は、ナトリウム利尿ペプチドの効力を増加させることが見出された（インビトロでcGMPを誘発する能力から測定）。

予想外に、リンカー長の延長は、融合タンパク質の効力がナトリウム利尿ペプチドの効力に近づくことを可能にすることが見出された。予想よりも長いリンカー長を有するそれらの融合タンパク質は、最も向上した効力を示し、特にリンカー長が例えば20アミノ酸であるそれらの融合タンパク質においてそうであった（例えば、実施例3および6参照）。現実には、モデリングから予測されるものよりも長いリンカー長を有する融合タンパク質の効力は、天然ANPの効力に近いものであった。本発明の態様において、融合タンパク質の効力は、リンカー長が16から50アミノ酸の間、好ましくは16から40アミノ酸の間、最も好ましくは16から30アミノ酸の間で向上する。更に、リンカー長を延長することは、融合タンパク質のNEPによるタンパク質分解に対する感受性が高まることが予測されるものであった。対照的に、実験からは、より長いリンカー長はNEPによる影響を受けないことが予想外に示された（例えば、実施例5参照）。

(GGS)xリピート（例えば、ここでxは0から16の整数）を含む本発明に利用されているリンカー配列は、一般的な合成法、半合成法、または組換え技術の方法により作製できる（例えば、Evers T.H. et. al. (2006) Biochemistry, 45:13183-13192参照）。利用されたリンカーの実際のアミノ酸配列に関しては、リンカーにグリシンが存在すると可動性が与えられ、セリンは可溶性を与えるため、典型的にはグリシンおよびセリンが好ましい。好ましいリンカー配列は、これらのアミノ酸の一連の繰り返しにより構成され、例えば、

などの(GGS)x-GGであって、例えばここでxは0から16の整数である。

上記のとおり、Fc領域とナトリウム利尿ペプチドの複合化の配向は異なっていてもよい。例えば、ペプチドのカルボキシ末端は、通常のペプチド結合によりFc領域のアミノ末端に連結されていてもよい（表2参照、配向番号1と呼んでもよい）。また、ペプチドのアミノ末端はFc領域のアミノ末端に連結されていてもよい（表2参照、配向番号2と呼んでもよい）。後者の場合、化学的性質の結果、融合されたアミノ酸一つの代わりにコハク酸部分が残される。そのようなものとして、後者の場合の融合タンパク質では二つのアミノ末端の間に通常のペプチド結合が形成されないために、これを組換え技術により製造できないことを当業者は認識する。収集されたデータは、配向が特定の融合タンパク質の効力に影響を及ぼす様子がないことを示す（例えば、実施例2参照）。

本発明のANP-Fc融合構築物は、一つ以上のANP、一つ以上のリンカー、および一つ以上のFcを含んでいてもよい。下記のANP-Fc融合構築物が本発明により企図される。

ANP_XY（構築物1）（配列番号：15）を含む例示的な融合構築物（構築物2）は、
ANP_XY-L4-Fc1_AB
により表される。当該構築物は、ANP_XY-L4-Fc1_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L4は配列番号：3、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_XY-L4-Fc1_ABは、配列番号：8で表される。ANP_XY-L4-Fc1_AB構築物を組換え技術により作製した場合、ホモ二量体が産生されてもよく、例えば、ANP_XY-L4-Fc1_ABは、第二のANP_XY-L4-Fc1_AB構築物にジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物3）は、
ANP_XY-L6-Fc1_AB
により表される。当該構築物は、ANP_XY-L6-Fc1_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L6は配列番号：7、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_XY-L6-Fc1_ABは、配列番号：9で表される。ANP_XY-L6-Fc1_AB構築物を組換え技術により作製した場合、ホモ二量体が産生されてもよく、例えば、ANP_XY-L6-Fc1_ABは、第二のANP_XY-L6-Fc1_AB構築物にジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物4）は、
ANP_XY-L4-Fc2_AB
により表される。当該構築物は、ANP_XY-L4-Fc2_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L4は配列番号：3、Fc2_ABは配列番号17である。ANP_XY-L4-Fc2_ABは、配列番号：10で表される。ANP_XY-L4-Fc2_AB構築物を組換え技術により作製した場合、ホモ二量体が産生されてもよく、例えば、ANP_XY-L4-Fc2_ABは、第二のANP_XY-L4-Fc2_AB構築物にジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物5）は、
ANP_XY-L6-Fc2_AB
により表される。当該構築物は、ANP_XY-L6-Fc2_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L6は配列番号：7、Fc2_ABは配列番号17である。ANP_XY-L6-Fc2_ABは、配列番号：11で表される。ANP_XY-L6-Fc2_AB構築物を組換え技術により作製した場合、ホモ二量体が産生されてもよく、例えば、ANP_XY-L6-Fc2_ABは、第二のANP_XY-L6-Fc2_AB構築物にジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物6）は、

により表される。当該構築物は、ANP_YX-L1-Fc1_ABを含み、ここでANP_YXは、C'からN'末端の配向が反転している配列番号：15、L1はコハク酸-Gly、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_YX-L1-Fc1_ABは第二のFc1_ABにジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物7）は、

により表される。当該構築物は、ANP_YX-L1-Fc1_ABを含み、ここでANP_YXは、C'からN'末端の配向が反転している配列番号：15、L1はコハク酸-Gly、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_YX-L1-Fc1_ABは第二のANP_YX-L1-Fc1_ABにジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物8）は、

により表される。当該構築物は、ANP_XY-L2-Fc1_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L2はGlyGly、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_XY-L2-Fc1_ABは、配列番号：13で表される。ANP_XY-L2-Fc1_ABは、第二のFc1_ABにジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物9）は、

により表される。当該構築物は、ANP_XY-L2-Fc1_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L2はGlyGly、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_XY-L2-Fc1_ABは、第二のANP_XY-L2-Fc1_ABにジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物10）は、

により表される。当該構築物は、ANP_XY-L4-Fc1_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L4は配列番号：3、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_XY-L4-Fc1_ABは、配列番号：13で表される。ANP_XY-L4-Fc1_ABは、第二のFc1_ABにジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物11）は、

により表される。当該構築物は、ANP_XY-L4-Fc1_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L4は配列番号：3、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_XY-L4-Fc1_ABは、第二のANP_XY-L4-Fc1_AB構築物にジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物12）は、

により表される。当該構築物は、ANP_YX-L3-L1-Fc1_ABを含み、ここでANP_YXは、C'からN'末端の配向が反転している配列番号：15、L3は配列番号：2、L1はコハク酸-Gly、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_YX-L3-L1-Fc1_ABは第二のFc1_ABにジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物13）は、

により表される。当該構築物は、ANP_YX-L3-L1-Fc1_ABを含み、ここでANP_YXは、C'からN'末端の配向が反転している配列番号：15、L3は配列番号：2、L1はコハク酸-Gly、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_YX-L3-L1-Fc1_ABは第二のANP_YX-L3-L1-Fc1_AB構築物にジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物14）は、

により表される。当該構築物は、ANP_XY-L5a-Fc1_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L5aは配列番号：5、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_XY-L5a-Fc1_ABは第二のANP_XY-L5a-Fc1_AB構築物にジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

例示的な融合構築物（構築物15）は、

により表される。当該構築物は、ANP_XY-L5a-Fc1_ABを含み、ここでANP_XYは配列番号：15、L5aは配列番号：5、Fc1_ABは配列番号14である。ANP_XY-L5a-Fc1_ABは第二のFc1_ABにジスルフィド結合を介して連結していてもよい。

C.融合タンパク質の合成
本明細書中に示されていない限り、本発明の融合タンパク質は、当業者によく知られているタンパク質化学や分子生物学の任意の多数の手法により製造されてもよい（例えば、Dawson et al., Ann. Rev. Biochem., 69:923-960, 2000参照）。可能な合成シナリオは本明細書に記載の実施例で説明されており、合成化学的、半合成化学的、並びに組換え技術による方法を含む。

融合タンパク質は、必要に応じて古典的または非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を使用して、全てまたは部分的に化学的方法を利用して産生されてもよい。手法としては、固相化学（Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149,1964、Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5132, 1985）が含まれ、このような自動化されたポリペプチド合成用の機器は市販されている（例えば、Applied Biosystems、フォスター・シティー、カリフォルニア州）。合成されたペプチドは一般的な方法、例えば高速液体クロマトグラフィーを用いて精製できる。合成融合ポリペプチドの構成は、当業者によく知られた手法を用いてアミノ酸解析または配列決定により確認されてもよい。正常な天然の立体構造を得るために、合成されたタンパク質を酸化条件下で更に処理する工程も利用してもよい（例えば、Kelley, R. F. & Winkler, M. E. in Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K.編、Plenum Press, N.Y., 第12巻、1-19ページ、1990年、Stewart, J. M. & Young, J. D. Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984参照）。

本明細書に開示されている融合タンパク質は、遺伝子合成、クローニング、発現方法論が関与する組換え技術により製造されてもよい。これらの手法は公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology,第I, II,およびIII巻、1997年（F. M. Ausubel編）、Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、DNA Cloning: A Practical Approach,第IおよびII巻、1985年（D. N. Glover編）、A Practical Guide to Molecular Cloning、シリーズMethods in Enzymology（Academic Press, Inc.）、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987（J. H. Miller and M. P. Calos編、Cold Spring Harbor Laboratory）、およびMethods in Enzymology第154巻および第155巻（それぞれ、WuおよびGrossman編、およびWu編）に説明されている。

簡潔に、本発明の融合タンパク質は、一般的なクローニングまたは化学合成方法により本明細書に記載の任意のアミノ酸配列をコードする核酸配列を単離または合成して、組換え技術により製造されてもよい。例えば、異なる融合タンパク質の配列をコードするDNA断片は、通常の技術に従って共にインフレームで連結されていても、自動化されたDNA合成機を含む通常の技術により合成されてもよい。また、遺伝子断片のPCR増幅は、二つの連続した遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて実施することができ、このオーバーハングをその後アニールし再度増幅することにより、キメラの遺伝子配列を作成することが可能となる。組換え核酸は更に、タンパク質精製手順を容易にするアフィニティー標識をコードする配列など、その他の塩基配列を含むことができる。

本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列は、適した宿主において核酸配列を発現できる適当な発現ベクター内に連結され、その後、核酸配列が連結された発現ベクターで宿主を形質転換し、その宿主を核酸配列の発現に適した条件下で培養することにより選択された核酸配列によりコードされたタンパク質が宿主により発現し、作製されたタンパク質を精製してもよい。このプロセスにおいて、連結の工程では、核酸が適切な分泌シグナルに機能的に連結されるようにその核酸を適当な発現ベクター内に連結することを更に企図してもよく、それによってアミノ酸配列が宿主により分泌される。本発明での使用に適した分泌シグナルとしては、限定するものではないが、マウスIgGκ軽鎖シグナル配列（Ho et. al. PNAS (2006) 103(25):9637-9642）が挙げられる。

上述のとおり、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞の形質転換に利用できる適切なプラスミドまたは発現ベクターに挿入されてもよい。一般的に、宿主細胞と適合する種に由来する複写配列および制御配列を含むプラスミドベクターがこれらの宿主に関連して用いられる。ベクターは、通常、複写部位および形質転換された細胞の表現型選択を可能にできるタンパク質をコードする配列を有する。例えば、大腸菌は、大腸菌種に由来するプラスミドpBR322を用いて形質転換してもよい（Mandel, M. et al., J. Mol. Biol. 53:154,1970）。プラスミドpBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するため、簡便な選択の手段を提供する。その他のベクターは、発現においてしばしば重要な異なるプロモーターなど、異なる特徴を含む。哺乳類での発現に利用されるベクターは、しばしば、高い組換えタンパク質発現につながる構成的CMVプロモーターを含有する。これらのベクターは、安定した発現細胞株を作り出すために利用される選択配列の遺伝子も含む。

宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。原核生物は、元のポリペプチド、セグメント置換ポリペプチド、残基置換ポリペプチド、およびポリペプチド変種を製造するためのDNA配列のクローニングおよび発現のためには好適である。当業者によく知られているそのような原核生物としては、大腸菌、枯草菌（B. subtillus）、および緑膿菌（P. aeruginosa）細胞株が挙げられるが、それらに限定されない。原核生物に加えて、酵母培養液、多細胞生物由来の細胞など、真核生物を利用することもできる。脊椎動物細胞も有用な宿主細胞株として利用することができる。有用な細胞および細胞株は、当業者にはよく知られており、その例としては、限定するものではないが、HEK293細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、W138、293、BHK、COS-7、およびMDCK細胞株が挙げられる。

また、本発明は、本発明のナトリウム利尿融合タンパク質をコードする単離または精製されたポリヌクレオチドに関する。上述のとおり、融合タンパク質、その断片、またはそれと機能的に同等なものをコードする本発明のポリヌクレオチドは、適した宿主細胞において、融合タンパク質、その断片、またはそれと機能的に同等なものの発現を誘導する組換え核酸分子を作り出すために利用してもよい。そのようなポリヌクレオチドにコードされた融合ポリペプチド産物は、コード配列を分子的に操作することにより変化させてもよい。

遺伝子コードの固有の縮重のため、実質的に同一であるか、あるいは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を、融合ポリペプチドの発現のための発明の実施に利用してもよい。そのようなDNA配列としては、本明細書に開示されているコード配列またはその相補体と本明細書に記載の低い、中程度、または高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるものが含まれる。

本発明に従って使用してもよい変化させた塩基配列は、異なるヌクレオチド残基の欠失、付加、または置換を含み、その結果として同じまたは機能的に同等な遺伝子産物をコードする配列である。遺伝子産物そのものは、沈黙変化を生じるアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を含んでいてもよい。

本発明の塩基配列は、様々な目的で融合タンパク質をコードする配列を変化させるために組換えられていてもよく、遺伝子産物のプロセシングおよび発現を変更する変化が含まれるが、これに限定されない。例えば、変異は、当技術分野で周知の技術を使用して導入されてもよく、例えば制限酵素部位の挿入または除去、糖鎖付加パターンの変化、リン酸化、翻訳、開始および／または終止配列の作成および／または破壊、コード領域におけるバリエーションの作成、更なるインビトロ改変の促進などが挙げられる。当業者は、特定の核酸構築物において変化を生じさせる方法を多数認識する。そのような周知の方法としては、例えば、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを使用したPCR増幅、核酸を含む細胞の突然変異誘発化学物質や放射線照射への暴露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、大型の核酸を作り出すための連結および／またはクローニングの組み合わせ）、およびその他の周知の手法が含まれる。

精製された融合タンパク質の調製は、適した宿主／ベクター系を培養することにより本発明のDNAの組換え翻訳産物を発現し、その後、それを培地または細胞抽出物より精製して行ってもよい。例えば、培地に組換えポリペプチドを分泌するシステムから得られた上清は、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮してもよい。濃縮工程の後、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用してもよい。アフィニティークロマトグラフィーや逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を使用して本発明の融合タンパク質を精製してもよい。

精製された本発明の融合タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、一般的な方法に従って産生してもよい。例えば、本明細書に記載されているものは、一つ以上の異なった形で発現される遺伝子エピトープを特異的に認識することが可能な抗体の産生方法である。そのような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAbs）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')₂断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、抗イディオタイプ（anti-Id）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合性断片を含み得るが、これらに限定されない。

本明細書において企図されている融合タンパク質に対する抗体の産生のために、様々な宿主動物をポリペプチドまたはその一部を注射することによって免疫してもよい。そのような宿主動物としては、限定するものではないが、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられる。種々のアジュバントを宿主種に応じて免疫応答を増強させるために使用してもよく、例えば、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性剤、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin））やコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物やその免疫原性機能的誘導体などの抗原で免疫された動物の血清由来の不均一な抗体分子の集団である。ポリクローナル抗体を作成するために、上記のような宿主動物を、ポリペプチドまたはその一部分に上記のとおりアジュバントを加えて注射して免疫してもよい。

特定の抗原に対する均一な抗体の集団であるモノクローナル抗体は、培養下の連続細胞株による抗体分子の産生を提供するいずれの手法によって得てもよい。これらの例としては、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技術（1975, Nature 256:495-497、および米国特許第4,376,110号）、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72、Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030）、およびEBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、などのいずれの免疫グロブリンクラスおよびそのいずれのサブクラスのものであってもよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養されてもよい。インビボで高力価のmAbsが産生されるため、これは現在好まれている生産方法である。

加えて、適当な生物学的に活性なヒト抗体分子由来の遺伝子と共に適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生を目的として開発された技術（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855、Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608、Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454）が使用できる。キメラ抗体は、マウスmAb由来の可変領域または高頻度可変領域およびヒトの免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。

または、単鎖抗体の作製を目的として記載される技術（米国特許第4,946,778号、Bird, 1988, Science 242:423-426、Huston et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、およびWard et al., 1989, Nature 334:544-546）は、異なった形で発現された遺伝子-単鎖抗体を作製するのに適用できる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重および軽鎖断片を連結して、単鎖のポリペプチドを得ることによって形成される。

最も好ましくは、「ヒト化抗体」の作製に有用な技術を、本明細書に開示されているポリペプチド、断片、誘導体、および機能的に同等なものに対する抗体の作製に応用することができる。このような技術は、米国特許第5,932,448号；同第5,693,762号；同第5,693,761号；同第5,585,089号；同第5,530,101号；同第5,910,771号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,789,650号；同第5,545,580号；同第5,661,016号；および同第5,770,429号に開示され、これらは参照としてすべて本明細書に組み入れられる。

特定のエピトープを認識する抗体断片は公知の技術により作製ことができる。例えば、このような断片としては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生できるF(ab')₂断片、およびF(ab')₂断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製できるFab断片が挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能とするため、Fab発現ライブラリーを構築してもよい(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281)。

D.薬学的組成物
本発明のナトリウム利尿融合タンパク質は、病的状態を治療または回復させる方法であって、NPRA受容体の活性化が患者に対して治療効果を与える方法に使用するための薬学的組成物として投与でき、病的状態としては、限定するものではないが、異常な利尿作用、ナトリウム利尿作用、および血管拡張性作用に関連する疾患および／またはナトリウム利尿、利尿、血管拡張作用の誘導、またはレニン・アンジオテンシンIIおよびアルドステロン系の調節が望まれる疾患が挙げられる。そのような病的状態としては、上に詳しく記載したような心臓血管系の疾患を含む。これらの状態は、過剰な量の細胞外液で特徴付けられてもよいもの、例えば、慢性心不全（CHF）および肺水腫を含むが、これらに限定されない。特に好ましい態様において、本発明は心臓血管系の病的状態を治療または回復させる方法であって、その病的状態としては、慢性心不全（非虚血性）、心筋梗塞後の心不全（虚血性慢性心不全）、急性心筋梗塞、再灌流傷害、左室機能不全（LVD）、心線維症、拡張期心不全、および肥大型心筋症が挙げられるが、これらに限定されない。更に、高血圧症を含むがそれに限定されない高血圧障害、例えば、肺高血圧症、収縮期高血圧症、抵抗性高血圧症、および糖尿病性神経障害など、その他の心臓血管関連障害は、本発明の方法により治療または回復されてもよい。本明細書中では、本発明の融合タンパク質および薬学的組成物が冠動脈バイパス移植術を受ける患者に治療効果を与え得ることも企図されている。

本発明に従って使用される薬学的組成物は、様々な手法による投与、例えば、吸入またはガス注入（経口または経鼻のいずれか）または局所的、経口、口腔、非経口、または直腸投与用の一つ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を利用して、一般的な様式で製剤化されてもよい。例えば、非経口投与は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、および硬膜外投与を含んでいてもよい。これらの化合物は、任意の簡便な経路、例えば、点滴やボーラス注入または上皮層や皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜、等）からの吸収を通じて投与されてもよく、その他の生物学的に活性な薬剤と共に投与されてもよい。投与は、全身または局所が可能である。好ましい態様において、本発明の薬学的組成物は、任意の適切な経路で罹患組織へ導入することが望ましいかもしれない。肺内投与も、例えば吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤と共に製剤化することにより利用することができる。

薬学的組成物は、更に、薬学的に許容される担体などの媒体または担体を含んでいてもよい。特定の態様において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されていること、あるいは、動物、より具体的にはヒトで使用するための米国薬局方または他の一般的に知られている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、医薬組成物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を意味する。このような薬学的担体は、滅菌液であってよく、その例としては、水および油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油、などの石油、動物や植物由来のもの、または合成して得られるものが挙げられる。薬学的組成物を静脈内投与する場合、水は好ましい担体である。生理食塩水およびブドウ糖水溶液並びにグリセリン溶液は、液体担体、特に注射溶液としても利用することができる。適切な薬学的賦形剤としては、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどが挙げられる。所望される場合、組成物はまた、わずかな量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤を含んでいてもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態であり得る。この組成物は、坐剤として、伝統的な結合剤および担体、例えば、トリグリセリドとともに製剤化することが可能である。経口製剤は、標準的な担体、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことが可能である。適した薬学的担体の例は、E. W. Martin著「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されており、これは参照として本明細書にすべて組み入れられる。製剤は投与様式に適合すべきである。

薬学的組成物は経口投与用に、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の薬学的に許容される賦形剤とともに一般的な方法によって調製される錠剤またはカプセルの形態を取り得る。錠剤は当技術分野で公知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ってもよく、またそれらは使用前に水もしくは他の適切な媒体とともに構成するための乾燥産物として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水溶性媒体（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または画分化植物油）、および保存料（例えば、メチル、またはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸、またはソルビン酸）等の薬学的に許容される添加剤とともに一般的な手段により調製され得る。調製物はまた、必要に応じて緩衝塩、香料、着色料、および甘味料も含んでいてもよい。

必要な場合には、経口投与用の調製物は、活性化合物の放出が制御されるよう適切に調剤され得る。

必要な場合には、口腔内投与のために、組成物は従来の方法で調剤される錠剤またはトローチ剤の形態を取り得る。

別の態様において、本発明の融合タンパク質は、吸入またはガス注入（経口または経鼻のいずれか）により投与されるものである。そのようなものとして、本発明に従って使用する化合物は、加圧パックまたは噴霧器より供給されるエアロゾルスプレーの形態で、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体を用いて都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、単位用量は一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定され得る。吸入器またはガス注入器で使用する、例えばゼラチンのカプセルおよび薬包は、化合物とラクトースやデンプン等の適切な粉末基剤との混合粉末を含んで製剤化してもよい。

特に好ましい態様において、本発明の薬学的組成物は、注射、例えばボーラス注射または継続点滴による非経口投与用に製剤化してもよい。更に、本明細書で企図されているとおり、本発明の融合タンパク質および薬学的組成物は、それを必要とする患者による自己注射、例えばCHFの長期的治療に適合し得る。注射用の製剤は、単位用量の形態で、例えばアンプルまたは多回投与用容器に、付加的な保存剤と一緒に与えられてもよい。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとしての形態であってもよく、形成剤、例えば懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤を含み得る。

別法として、有効成分は、使用前に、適当な媒体、例えば、滅菌無パイロジェン水で構成するための散剤の剤形であり得る。例えば、凍結乾燥したタンパク質組成物は吸入してもよく、または再構成した後に適当な媒体に注入してもよい。

また、化合物は、坐薬または停留浣腸などの結腸組成物、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなど、通常の坐薬基剤を含むものとして製剤化してもよい。

徐放製剤に似た薬物動態を示し得る前記の製剤に加えて、化合物は、実際のデポー調製物として製剤化することもできる。このような長期作用性の製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下または筋肉内に）、または筋肉内注射によって投与されてもよい。従って、例えば、化合物は、適当なポリマー性または疎水性材料（例えば、許容されるオイル中のエマルジョン）またはイオン交換樹脂と一緒に製剤化されるか、または難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として製剤化されてもよい。

必要に応じて、組成物を、有効成分を含む一つ以上の単位用量剤形を含みうるパックまたはディスペンサー装置内に提供してもよい。パックは例えば、金属またはブリスタパックのようなプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付してもよい。

本発明における利用に適した薬学的組成物としては、有効成分が本来の目的を達成するのに有効な量含まれている組成物が挙げられる。有効量の決定は十分当業者の能力の範囲内である。例えば、いずれの化合物においても、治療に有効な投与量は、先ず細胞培養試験、例えば新生細胞において、または動物モデル、一般的にはマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて見積もることができる。動物モデルは、更に、適当な濃度範囲および投与経路を決定するために利用してもよい。用量は、IC₅₀（すなわち、症状の最大半量の阻害値を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにて処方してもよい。このような情報は、次にヒトにおける投与のために有用な用量と経路を決定する際に使用できる。

治療に有効な投与量、または「有効量」は、無毒でありながら、所望の治療的効果を提供するのに十分な有効成分の量を意味する。治療的有効性および毒性、例えばED50（50％の個体群において治療的に有効な用量）およびLD50（50％の個体群において致死的な用量）は、細胞培養液や実験動物において標準的な薬学的手順により決定されてもよい。有毒作用と治療効果の用量比が治療係数であり、これはLD50／ED50の比率として表すことができる。大きい治療係数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒト用の投与範囲で製剤化するために使用する。好ましくは、そのような組成物に含有される投与量は、ED50を含み毒性が殆どまたは全く無い循環濃度範囲内にある。投与量は、この範囲内で、用いる投与形態、患者の感受性、および投与経路に応じて変動する。

正確な用量は、治療を必要とする対象に関係する要因を考慮して、実行者により決定される。用量と投与は、十分な量の活性部分を提供できるか、または所望の効果を維持するように調節される。考慮してもよい要因は、病状の重さ、対象の全体的な健康状態、対象の年齢、体重、および性別、食餌、投与の時間および頻度、薬の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する寛容性／反応を包含する。長期間作用する薬学的組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて3日から4日ごと、毎週、または二週ごとに投与してもよい。

標準的な用量は、投与経路によって、0.1から100,000マイクログラムから合計用量約1グラムまで変化し得る。特定の用量および送達法についての手引きは、文献に記載され、当該分野における従業者により一般に利用可能である。当業者らは、ヌクレオチド用にタンパク質またはそのインヒビターと異なる製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、位置などに対して特異的である。タンパク質の経口投与に適した医薬製剤は、例えば、米国特許第5,008,114号、同第5,505,962号、同第5,641,515号、同第5,681,811号、同第5,700,486号、同第5,766,633号、同第5,792,451号、同第5,853,748号、同第5,972,387号、同第5,976,569号、および同第6,051,561号に記載されている。

本発明は、更に、上記いずれかの方法とともに使用するキットを提供する。このようなキットは、典型的には、本明細書に記載の方法を実施するのに必要な二つ以上の構成成分を含む。構成成分は、化合物、試薬、容器、および／または機器であり得る。例えば、キット中の一つの容器には、本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物が入っていてもよい。一つ以上の追加の容器には、試薬や緩衝液などの成分、または薬学的組成物を投与するための方法において使用する機器が含まれていてもよい。

本明細書では、更に、本発明の融合タンパク質および薬学的組成物が単独で、または本明細書に記載の病的状態のいずれかを治療するために使用してもよい化合物または物質と組み合わせて投与してもよいことが考慮される。そのような本発明との併用療法に使用してもよい化合物または製剤としては、利尿薬、β遮断薬、およびAngII受容体遮断薬が挙げられる。

本明細書に記載の発明は、記載されている特定の方法、手順、および試薬は変わることがあるため、これらに限定されないことが考慮される。更に本明細書中に使用される用語は、特定の態様を説明する目的で使用されており、本発明の範囲を何ら制限するものではないことを理解されたい。

本明細書に記載のものと同様または同等のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法、装置、および材料を説明する。本明細書に記載された参考文献は、すべて参照として本明細書に明示的に組み込まれる。

実施例
本明細書に記載の実施例に関係する材料および方法を以下に示す。

ANP-Fc融合／NPRA相互作用の構造モデリング
単量体Fc融合（1つのANPの連結、1つのANPの結合）：ANPとFcの融合に必要なリンカーの要素は、NPRAおよびFcの結晶構造を使用した構造に基づくモデリングにより決定された（それぞれ、RCSB PDBデータベース3次元結晶構造番号第1T34号（ANPと共に得られた構造）および第1HZH号、H. M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gillilant, T.N.Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne: The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp. 235-242(2000)）。これらの構造は、（a）ANPのC末端とFcのN末端が、互いの近位にありながら立体的および静電的反発を最小限にするのに十分な間隔を有し、（b）V474から始まると予測されるNPRAの膜貫通領域へと続く残基と起こり得る相互作用を最小限にするために、二量体NPRAの二つのF425残基（全長ヒトNPRA配列中のF457）に対して末端側に位置した空間配置である。ひとたび二つの構造の位置が最終的に決定されると、ANPのC末端とFcのN末端の間の距離が測定され、この値を3.5で割り、一番近い整数に繰り上げることにより、実行可能なNPRAのリガンドを作るための「Fc-リンカー-hANP28」または「hANP28-リンカー-Fc」（即ち、それぞれ、配向番号1または配向番号2、19頁参照）融合に必要と予測される最小アミノ酸（aa）数が得られる（例えば：距離＝12Å、最小リンカー長＝12／3.5＝3.4＝＞4aaリンカー）。3.5という値は、βシートにおける平均的なアミノ酸長を表す（一つのアミノ酸内の窒素原子から隣のアミノ酸内の窒素原子までの距離）。

二量体Fc融合（2つのANPの連結、1つのANPの結合）：単量体Fc融合用に概説した手順に従った後、第二のリンカーを、Fc上の第二のN末端から一つのANP-NPRAの三量体複合体および1T34、RCSB PDBデータベース3D構造（H. M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T. N. Bhat, H. Weissig, I. N. Shindyalov, P.E. Bourne: The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp. 235-242 (2000)）に定義されている結合性立体構造である一つのANPペプチドへ伸ばすという更なる挑戦が続いた。

二量体Fc融合（2つのANPの連結、2つのANPの結合）：単量体Fc融合用に概説した手順に従った後、第二のリンカーを、Fc上の第二のN末端から二つのANP-NPRAの三量体複合体へ伸ばすという更なる挑戦が続いた。

CysFcのクローニング、発現、および精製：
pEE12,4ベクターに関しては、Lonzaグループ（バーゼル、スイス）よりライセンスが与えられた。IgG1からのヒトFc配列は、マウスIg_Kシグナル配列（以下に太字で示す）によりヒト白血球cDNAライブラリーから標準的なPCR技術を用いて得られた（pSYNFc-001、pSYNFc-007）。マウスIg_Kシグナル配列を含むcysFc配列は、pSYNFc-007（pSYNcysFc-002）より得られた。その後、CysFc配列を中間のクローニング工程によりpEE12.4中にクローニングして（pSYNcysFc-003）、pSYNcysFc-004を作成した。CysFc-004は、下記のアミノ酸配列を有する。

Lonza CHOK1Sv懸濁細胞（1×10⁷個）に、製造者の使用説明書に従って、電気穿孔によりPst1で直線化されたpSYNcysFc-004 40μgをトランスフェクトした。細胞を2500個／ウェルの播種密度で40×96穴プレートに蒔いた。24時間後に25μMのMSZでセレクションを開始し、細胞を37℃／5％CO₂下で3週間培養した。トランスフェクト細胞を、96穴プレートから24穴プレート、T25フラスコ、そしてT75フラスコへと拡大した後、無血清懸濁培地に適応させた。CysFc-004（CysFc）発現レベルは、無血清懸濁液において成長曲線を示している間、プロテインA免疫沈降手順を用いてモニターし、続いて非還元SDS-PAGE解析を行った。これらの成長曲線に基づき、細胞株9F4を産生用に選択した。

Cys-Fc-004（CysFc）は、3Lフェルンバッハフラスコに5×10⁵個／mLで播種した20Lの9F4細胞（細胞1L／フラスコ）より精製した。産生工程の終わりに、細胞を遠心分離により除去し、直線流動濾過により馴化培地を4倍に濃縮した。Cys-Fc-004は、プロテインAクロマトグラフィーにより精製し、カラムをダルベッコPBS（DPBS）に続いて0.9M NaClを含有するDPBSで洗浄した。タンパク質はpH3.4の0.15M塩化ナトリウムを含有する0.1Mクエン酸ナトリウムで溶出した。次にタンパク質をダイアフィルターで濾過し、DPBSに加え、使用時まで4℃で保存した。

C末端ANPチオエステルの合成：
ANPペプチド（0.1mmol）は、Advanced ChemTech 3960合成機を利用して、Fmoc-Gly-NovaSyn（登録商標）TGT（Novabiochem）上で、HBTUをカップリング剤とし、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を塩基とし、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）を溶媒として使用し、標準的なFmoc固相ペプチド合成法により合成された。自動合成の後、手作業で樹脂をDMF10mL中、0.218g（10等量）のジ-t-ブチルジカルボネート（Boc₂O）および174μL（20等量）のDIEAで処理し、室温で一晩混合させることにより、N末端を保護した。反応液を真空フィルターにかけ、樹脂をDMFおよびジクロロメタン（DCM）で洗浄した。完全に保護されたペプチドは、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパナル（HFIP）を含むDCM、HFIP:DCMが3：7のもの50mL中で2時間弱酸分解することにより樹脂から切断された。樹脂を濾過し、予め重さを測定した丸底フラスコに濾液を入れ、これを真空で一晩濃縮することにより、C末端がフリーな保護されたペプチドが得られた。チオエステルを作るために、この物質をDMF10mL中、1.5等量のグリシンベンジルチオエステル塩酸塩（Gly(SBn）HCl)、1.5等量のPyBOP（Novabiochem）、および4.5等量のDIEAと18時間攪拌して処理した。反応混合物を18時間真空下で再度濃縮した。保護されたペプチドチオエステルは、25mLの切断カクテル（23.75mLトリフルオロ酢酸（TFA）、0.625mLトリイソプロピルシラン（TIS）、0.625mLエタンジオール（EDT））で2時間45分処理することにより脱保護し、その後0.624mLのブロモトリメチルシラン（TMSBr）を加え15分間混合させた。反応混合物を濃縮し、粗製ペプチドチオエステルを冷却したジエチルエーテル（Et₂O）で沈殿させた。ペプチドを遠心分離し、上清をデカントし、粗製ペプチドを冷却したEt₂Oで更に二回倍散した。その後粗製ペプチドを、逆相調製用HPLC（Phenomenex Jupiter 5u C4 300 A カラム、250×21.20mm）を使用して精製した；HPLC法のパラメーターは以下に記載されている。分画をLC／MS（Applied Biosystems、Mariner）で分析、同定して、ペプチドを＞90％含む分画を収集、急速冷凍、および凍結乾燥して、純粋なANP C末端チオエステルを得た。

N末端ANPチオエステルの合成：
ANPペプチド（0.1mmol）は、Advanced ChemTech 396Ω合成機を利用して、Fmoc-Tyr(tBu)-NovaSyn（登録商標）TGT（Novabiochem）上で、HBTUをカップリング剤とし、DIEAを塩基とし、DMFを溶媒として使用し、標準的なFmoc固相ペプチド合成法により合成された。自動合成の後、手作業で樹脂をDMF10mL中、0.100g（10等量）の無水コハク酸および174μL（10等量）のDIEAと室温で二時間処理することにより、N末端をフリーなカルボン酸に変換した。反応内容物を真空フィルターにより除去し、樹脂をDMFおよびDCMのそれぞれで洗浄した。チオエステルを作るために、この物質をDMF10mL中、0.109g（5等量）のGly(SBn）・HCl、0.260g（5等量）のPyBOP（Novabiochem）、および261μL（15等量）のDIEAと室温で18時間攪拌して処理した。反応内容物を真空濾過により除去し、樹脂をDMFおよびDCMで洗浄した。保護されたペプチドチオエステルは樹脂から切断され、25mLの切断カクテル（23.75mLのTFA、0.625mLのTIS、0.625mLのEDT）で2時間45分処理することにより脱保護され、その後0.624mLのTMSBrを加え15分間混合させた。反応内容物を濾過し、濾液を保存した。この濾液を濃縮し、粗製ペプチドチオエステルを冷却したジエチルエーテル（Et₂O）で沈殿させた。ペプチドを遠心分離し、上清をデカントし、粗製ペプチドを冷却したEt₂Oで更に二回倍散した。その後粗製ペプチドを、上記と同様に、逆相調製用HPLCを使用して精製した。分画をLC／MS（Applied Biosystems、マリナー）で分析、同定して、ペプチドを＞90％含む分画を収集、急速冷凍、および凍結乾燥して、純粋なANP C末端チオエステルを得た。構造／配列および質量分析データは以下および表1に記載されている。

ANP_xy-L2-ベンジルメルカプタン基（ペプチドA）：

ANP_xy-L4-ベンジルメルカプタン基（ペプチドB）：

ANP_xy-L5a-ベンジルメルカプタン基（ペプチドC）：

ベンジルメルカプタン基-gly-コハク酸-ANP_yx（ペプチドD）：

ベンジルメルカプタン基-gly-コハク酸-L3-ANP_yx（ペプチドE）：

（表１）質量分析データ

＊多価ペプチドイオンの単一イオンの変換プロセスからLCMSにより決定された。

ANPチオエステルペプチドのCys-Fcへの複合化：
ANPペプチドS-ベンジルチオエステルをCys-FcのN末端に複合化した。2-メルカプトスルホン酸ナトリウム塩（MESNA、Sigma-Aldrich）の最終濃度が20mMとなるように、Cys-Fc（PBS、pH7.4中5mg／mL）をMESNAで処理した。反応混合物にペプチドチオエステルを加え（ペプチドに応じて2から6モル等量）、室温で18時間穏やかに攪拌した。ペプチドの実際の等量数は、形成されるモノマー（Fcに対して1ANPペプチド）およびダイマー（Fcに対して2ANPペプチド）複合体のパーセンテージが同じになるように、パイロット規模反応に基づいて選択された。未精製の反応混合物をPBSで1mg／mLに希釈し、PBS（pH7.4）で徹底的に透析した（24時間の間に7回交換）。NuPage SDS-PAGEゲル（Invitrogen）を用いて反応の程度を測定した。タンパク質精製の前に、複合体を50mMトリス塩酸緩衝液pH7.2中に透析した。

半合成ANP-Fc複合体の精製：
透析済みANP-Fc複合化反応混合物は、1M酢酸ナトリウムpH5.0を用いて最終濃度が50mM 酢酸ナトリウム、pH5.0となるように調節した後、0.8／0.2μMシリンジフィルターで濾過した。この浄化した溶液を、50mM酢酸ナトリウムpH5.5で平衡化したフラクトプレップSO₃-650(M)カチオン交換樹脂（CEX）を充填した1×10cmのカラム上に添加した。添加後、カラムを3カラム容量（CV）の平衡化緩衝液で洗浄した。タンパク質は、（50mM酢酸ナトリウムpH5.5中）0Mから0.5M塩化ナトリウムの直線勾配で30CV用いて溶出した。分画をNuPage SDS-PAGEゲル（Invitrogen）を用いて解析し、殆どの単量体複合体を含有する分画を一緒にプールし、また別に、殆どの二量体複合体を含有する分画を一緒にプールした。CEXプールを、先ず1MトリスpH7.2原液を用いて0.1MトリスpH7.2に調節し、次に3M硫酸アンモニウム原液を用いて1M硫酸アンモニウムに調節した。0.8／0.2μMシリンジフィルターで濾過した後、この浄化したタンパク質溶液を、50mMトリス、1M硫酸アンモニウム、pH7.2で前もって平衡化させたEMDフラクトゲルTA650（S）チオアフィニティー樹脂を充填した1×10cmのカラム上に添加した。カラムを3CVの平衡化緩衝液で洗浄した後、タンパク質は、1.0Mから0.33M硫酸アンモニウムの減少直線勾配で20CV用いて溶出した。その後、0.33Mから0M硫酸アンモニウムの段階勾配にかけた。高度に精製された複合体を含むピーク分画をSDS-PAGEゲルにより特定し、これらを一緒にプールした。最終的に得られたプールを1×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（1リットル×2回交換）（Invitrogen）で透析した。タンパク質濃度はUV-280nm解析を用いて決定した。必要に応じて、最終的なタンパク質は、Amicon Ultra-15 Centrifugal Concentration Unit(s)（Millipore）を用いて濃縮した。最終的なタンパク質は、無菌的に0.2μMフィルターで濾過し、その一定分量を−80℃で保管した。

半合成ANP-Fc融合物のサイズ排除クロマトグラフィー：
半合成ANP-Fc融合タンパク質の凝集特性を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（SEC-HPLC）法を利用して評価した。TSKgel Super SW2000 4.6mm（Tosoh Biosciences）SEC-HPLCカラムをPBSpH7.4＋250mM NaClで平衡化した。曲線下面積積分を行い、各ピーク中の総タンパク質のパーセントを予測した。

例えば、TSKgel Super SW2000 4.6mm（Tosoh Biosciences）SEC-HPLCカラムは、250mM NaClを含む PBS、pH7.4を溶出液として使用し、流速0.4mL／分で流した。各分析において、1.0mg／mLの試料を5μL注入した。カラムの整合性を保証するために、注入の各セットの前後にBioRad分子量標準（カタログ番号151-1901）を注入した。

半合成ANP-Fc融合における「遊離」ペプチドの特徴づけ：
精製された半合成ANP-Fc融合調製物中の「遊離」非複合型ANPペプチドによる夾雑物レベルは、逆相クロマトグラフィーを利用して測定した。タンパク質用のC4逆相カラム（Grace Vydac）に100μgの精製された半合成Fc融合タンパク質を注入した。二つの移動相は、（A）0.1％TFAを含む水、および（B）0.1%TFAを含むアセトニトリルである。逆相クロマトグラフィーは、合計50分かけて下記の勾配プロファイルを使用して流した：5％Bで0.5分間、5〜35分で95％Bまで上昇、35〜40分は95％Bで維持、40〜42分で5％Bまで降下、42〜50分は5％Bで維持。また、夾雑物候補の予想されるピークの位置と高さを可視化するために、0.1μgの「遊離」ANPペプチド（0.1μgの添加は1.3モル％と同等）を加えたクロマトグラフィーを交互に行った。この方法での「遊離」ANP検出の下限値は、1％モル濃度ANP夾雑物レベルまでである。

半合成ANP-Fc融合物におけるペプチドジスルフィド結合の特徴づけ：
ANP-Fc融合物のトリプシン消化は、pH5.25、37℃で18時間実施し、ジスルフィド（Cys-Cys）結合は保存された。トリプシン消化物は二つのアリコートに分割され、その内の一つはDTTで還元し、2-ヨードアセトアミドでキャップした。還元されたサンプル（0.5〜1.0pmol）を、ナノLC／MS／MSに連結した自己充填したC18キャピラリーカラム（10cm）に添加した。ペプチド配列決定はSequestを利用してまたはde novoで実施した。遊離ペプチド（酸化型）にも同様の処理を行い（還元および非還元）、陽性対照として使用した。

Agilent 1100HPLC二進法およびThermo LCQ-Advantageイオントラップ質量分析計をLC／MS／MS分析に使用した。ANP-Fc融合物の非複合型のANPペプチドアナログ（GSリンカー領域を含む）は、同定実験のための陽性対照として使用された。3μgのペプチド-Fc融合物（1μgの遊離ペプチドは酸化型）を100mM酢酸アンモニウム（pH5.25）で最終量が30μLとなるように希釈した。10μLの0.01μg／mLトリプシン溶液（Trypsin Gold、質量分析グレード、Promega）をタンパク質／ペプチド溶液に加え、消化を37℃で18時間行った。消化した試料を20μLの二つのアリコートに分割した。消化物のアリコートの内の一つ（非還元状態）は、直ちに凍結し、分析まで−20℃で保管した。第二のアリコートは、真空下で乾燥させ、20μLの50mMトリス-HClと1mM EDTA（pH8.0）に再度溶解した。1マイクロリットルのDTT（0.2M）を加え、その溶液を56℃で30分保温する。その後、1マイクロリットルの2-ヨードアセトアミド（0.5M）を加え、暗所で30分反応させることにより、チオールでキャップされた消化サンプルが作成された。非複合型ペプチド消化物は水で5倍に希釈した。0.5μLの消化されたペプチド-Fc融合物（または1μLの消化されたペプチド）は、ナノLC／MS／MS解析のために個人で充填したC18キャピラリーLCカラム（YMC C18、5μm、長さ10cm）に添加した。HPLCポンプの流速0.2mL／分を分割して、キャピラリーLC用に1μL／分を得た。使用された移動相は、0.05M酢酸を含む水（A）および0.05M酢酸を含むアセトニトリル（B）である。LC／MSデータ（非還元および還元）を、消化された断片に可能なジスルフィド・フォールディング連結に対応する理論質量と比較して、ANPペプチド内で正しいジスルフィドが形成されているかを決定した。還元されたペプチド断片の配列は、MS／MSデータのSEQUESTデータベース検索により確認した。

半合成ANP-Fc融合物のFcRn結合特性の特徴づけ：
精製された可溶性ヒトFcRnをBiacoreチップの表面にpH＝6.0で結合させた。半合成ANP-Fc融合物を一連の異なる濃度でチップ表面の上に流した。平衡応答（R_eq）は、Biacore BiaEvalソフトウェアを使用して、二種類の非干渉性結合部位を有するモデルに非直線回帰で当てはめた。このモデリングは、FcRnコートされたセンサーチップ上に、全体的に観察される結合に貢献する二種類のFc結合部位（K_D1、K_D2）が存在することを想定するものである。

例えば、Biacoreが勧めるとおり（BIAアプリケーションハンドブック、バージョンAB、セクション4.2）、可溶性ヒトFcRnを、1-エチル-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を用いたアミンカップリングによりCM5センサーチップのデキストラン表面へ架橋した。固定化のために、FcRnを10mM酢酸ナトリウム、pH4.5で10μg／mLに希釈した。デキストラン上に残存した部位は、1Mエタノールアミン塩酸塩pH8.5でブロッキングした。FcRnをセンサーチップ上の一つのフローセルに固定化し、それと同時に、基準値を引き算するために、対照フローセルをエタノールアミンでブロッキングした。ANP-Fc複合体の解析のため、最終密度が400〜600応答単位（RU）となるようにFcRnでコーティングした。このレベルのコーティングを用いることにより、センサーチップが許容される注入時間内に注入されたFcタンパク質で確実に完全飽和し、かつ適度なシグナルを発するようにした。実験をpH6で50mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、0.01%界面活性剤P20（Biacore AB）を使用して実施した。ANP-Fcまたは対照タンパク質1μMと1nMの間を11回2段階希釈したものをFcRn-CM5チップ上に30μL／分で5分間注入した。次に、2.5分間緩衝液を流して結合したタンパク質をチップから解離させた。残留したタンパク質は、pH7.4のHBS-P緩衝液（0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005％v/v界面活性剤P20）を30μL／分で27秒間注入することによりチップから除去した。

次に、BiaEvalソフトウェア・バージョン3.1（Biacore AB）を使用して、センサーグラムを解析し、緩衝液ブランクを用いてベースライン補正した後、ベースラインを平均化した。一定の濃度のタンパク質をチップ上に注入すると、シグナルは徐々に最大プラトーに達した。これは、平衡状態における結合の度合いと推定され、観察されたシグナルはReq（Response Units at Equilibrium：平衡状態における反応単位）と呼んだ。濃度に対してReq値をプロットし、次にBiaEvalソフトウェアを用いてデータを不均一リガンドモデルにあてはめることにより平衡親和定数（K_D's）を導き出した。このモデルは、センサーチップ上にFcRnの二種類の非干渉性結合部位が存在することを想定するものである。従って、K_D値は、理論的なReqの最大測定値（Rmax）にいくらかの部分的割合（％）で貢献する二つの別々のK_Dとして報告された。

組換えANP-Fc融合タンパク質の産生および特徴づけ
ANP-Fc融合構築物の作製：通常のオリゴヌクレオチド合成手法に従って4つのDNA配列を合成し、これをpJ13ベクター（DNA2.0 Inc.）にサブクローニングした。各構築物は、同じ基本的な順番でHindIII制限酵素（RE）部位に続き、コザック配列、マウスIgGκ軽鎖シグナル配列、ヒトANP28配列、リンカー配列、ヒトFcγ配列、続いてもう一つのRE部位を含有した。コザック配列およびマウスIgGκ軽鎖シグナル配列は、pSYN-Fc-015ベクター内のその配列と同一であった（pcDNA3.1/Igk sig seq -hFc）。pSYN-Fc-015ベクターは、IgG1アイソタイプタンパク質のFcタンパク質を発現するものであり、これはNCBIデータベース中の寄託番号Y_14735の配列と一致する。ヒトANP28配列は、NCBIデータベース中の寄託番号NM_006172（配列番号：15）から得た。リンカー配列は、グリシンおよびセリン残基の繰り返しからなる11アミノ酸または20アミノ酸ペプチドをコードし、11アミノ酸リンカー（L4）は(GGS)₃GG（配列番号：3）であり、20アミノ酸リンカー（L6）は(GGS)₆GG（配列番号：7）である。構築物pJ13-ANP28-11aa-hFc1およびpJ13-ANP28-20aa-hFc1は、BspEI RE部位を含むpSYN-Fc-015中のヒトFcγ1配列の最初の39bpと同じ配列を含む。構築物pJ13-ANP28-11aa-hFc2およびpJ13-ANP28-20aa-hFc2は、上記の二つの構築物とリンカー配列までは同じである、但しヒトFcγ1配列全部がヒトFcγ2配列に置換されている。ヒトFc2配列の後にはEcoRI制限酵素部位が存在する。

pSYN-Fc-015発現ベクターをHindIIIおよびEcoRIで消化し、コザック配列、マウスIgGκ軽鎖シグナル配列、およびFcγ1配列の全体を含む断片を除去した。5.4kbのベクターバックボーンは標準的な分子生物学的手法により単離された。構築物pJ13-ANP28-11aa-hFc2およびpJ13-ANP28-20aa-hFc2をそれぞれHindIIIおよびEcoRIで消化し、標準的な分子生物学的手法により858bpの断片をpJ13-ANP28-11aa-hFc2から単離し、885bpの断片をpJ13-ANP28-20aa-hFc2から単離した。それぞれ、コザック配列、マウスIgGκ軽鎖シグナル配列、および11アミノ酸リンカー（L4）または20アミノ酸リンカー（L6）、そしてそれに続いてFcγ2配列全体を含有した。5.4kbベクターは、T4 DNAリガーゼと共に4℃で一晩、858bp断片または885bp断片と連結させた。連結したDNAを菌種DH5αに導入し、これをLB+アンピシリンプレートに蒔き、37℃で一晩培養した。翌朝、プレートをインキュベーターから取り出し、各ライゲーション／形質転換プレートより数個の単一コロニーをそれぞれ選択してアンピシリン含有LB培地15mlに入れ、振とう培養器にて37℃で一晩培養した。細菌細胞を翌日回収し、プラスミドDNAをQIAプレップ・スピンミニプレップキット（Qiagen Inc.）を用いて単離した。DNA配列を確認するために、一定量を配列決定に供した（Agencourt）。

pSYN-Fc-015ベクターをHindIIIおよびBspEIで消化し、6kbのベクターバックボーンを単離した。これにより、コザック配列、マウスIgGκ軽鎖シグナル配列、およびFcγ1配列の最初の37bpが除去された。構築物pJ13-ANP28-11aa-hFc1およびpJ13-ANP28-20aa-hFc1をHindIIIおよびBspEIで消化し、209bpの断片をpJ13-ANP28-11aa-hFc1から単離し、236bpの断片をpJ13-ANP28-20aa-hFc1から単離した。各断片はコザック配列、マウスIgGκ軽鎖シグナル配列、および11アミノ酸リンカー（L4）または20アミノ酸リンカー（L6）、並びにFcγ1配列の最初の37bpを含有した。6kbベクターは、209bp断片または236bp断片と連結した；遺伝子導入、DNAプラスミド調製、および配列決定を上記のとおり実施した。

ANP-Fc融合物の哺乳類における発現：ANP融合構築物の初期発現は、一過性導入手順を使用して1Lの規模でHEK293細胞株において実施した。HEK293細胞はFreeStyle 293倍地で培養し、293Fectin試薬および製造者（Invitrogen）が説明する手順を用いて形質移入した。一過性に形質移入された細胞の増殖は、攪拌フラスコ内にて90rpmで攪拌し、37℃、5％CO₂で行った。細胞密度、生存率、直径、グルコースレベル、乳酸レベル、グルタミンレベル、およびpHについて細胞を毎日観察した。馴化培地は、形質移入の72時間後に3600rpmで15分間遠心することにより回収し、新鮮な状態で精製に供した。発現レベルは、SDS-Pageおよびウエスタンブロット解析により測定した。

ひとたび各構築物の発現レベルが測定された後、20Lの一過性形質移入および安定したプールの作製を含む様々なスケールアップ方法を実施し、必要とされるタンパク質を作製した。20Lの一過性形質移入は、50Lウェーブバイオリアクター内でPEI-25試薬を使用して実施した。25mgのDNAのアリコートを250mLのFreeStyle 293倍地中で希釈し、75mgのPEI-25のアリコートを250mLの同一の培地中で希釈した。次にDNAサンプルをPEI溶液と混合した。室温で15分間インキュベートした後、DNA：PEI混合物を細胞密度2,000,000個／mlで新しく添加した10LのHEK293細胞と共にウェーブバイオリアクターに加えた。ウェーブバイオリアクターは、37℃および5％CO₂でその揺動角度を8度、揺動速度を22rpmに設定した。形質移入の5時間後、10LのFreeStyle 293倍地をウェーブバイオリアクターに加えた。細胞密度、生存率、直径、グルコースレベル、乳酸レベル、グルタミンレベル、およびpHについて細胞を毎日観察した。馴化培地は、形質移入の120時間後に3600rpmで15分間遠心することにより回収し、新鮮な状態で精製に供した。発現レベルは、SDS-Pageおよびウエスタンブロット解析により測定した。安定したプールの産生は、フラスコで開始し、ここで安定した細胞は400μg／mlのG418で選択され、これをスピナーへ移した。ひとたびこれらの条件下で細胞を安定化させた後、これらの細胞を増殖し、スピナーまたはウェーブバイオリアクターのいずれかで4〜5Lでの実施を行った。

組換えANP-Fc融合タンパク質の精製：精製は4℃でAKTAシステム（GE Healthcare）またはBioOptix 10（ISCO）を使用して実施した。5ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）を馴化培地1リットル毎に加えた。カラムを馴化培地1リットル毎に3〜4mLのProtein A Ceramic HyperDF（登録商標）樹脂（Pall）で充填し、1mL／分にて10CVの平衡化緩衝液（Mg／Ca不含の1×ダルベッコPBS、pH7.3、Invitrogen）で平衡化した。馴化培地は、培地の量に応じて1〜5mL／分で一晩かけてカラムに添加した。次に樹脂を洗浄緩衝液1（Mg／Ca不含のDPBS、pH7.3）、洗浄緩衝液2（Mg／Ca不含のDPBS、pH7.3＋1M NaCl）、その後再び洗浄緩衝液1を用いて、10CVシークエンスで洗浄した。結合されたタンパク質は、2.5ml／分にて10CVの溶出緩衝液（dH₂O中0.1Mグリシン／HCl、pH2.5）で溶出した。3mL分画を直ちに300μL（分画の10％）の中和緩衝液（1Mトリス-HCl pH8.0、Invitrogen）で中和した。分画のプールを、Slide-A-Lyzerカセット（Pierce）を使用し、合計22時間2×5L PBS（Hyclone）に対して透析し、これをAmicon Ultra-15 10kDa MWCO濃縮装置（Millipore）を用いて1〜2mg／mLまで濃縮した。アリコートを液体窒素で急速冷凍し、−80℃で保管した。最終産物は、SDS-PAGE（還元および非還元）、分析超遠心、および質量分析で特徴づけした後に生物学的機能アッセイに供した。エンドトキシンの夾雑物レベルはgel-clot LAL試薬（The Associates of Cape Cod）を使用して測定した。

組換えANP-Fc融合タンパク質の分析超遠心：精製されたANP-Fc融合物の精製度および凝集物含有量を評価するために沈降速度実験を実施した。ANP-Fc融合物は、10mMリン酸ナトリウムと150mMNaClを含むリン酸緩衝食塩水緩衝液、pH7.3中の沈降速度から評価した。サンプルは、ダブルセクター・チャコールエポン・センターピースおよび石英窓を備えた遠心セルに入れた。データ収集は、ベックマンXLI分析超遠心を使用し、280nm、50,000rpm、および20℃で行った。溶液密度および粘度の測定は自動化されたAnton-Paar AMVn/SP3-V粘度計およびDMA4500/DMA5000密度計を20℃で使用して行った。沈殿データは、SEDFITプログラム、バージョン9.3b(2)を使用して解析した。

組換え技術により作製したANP-Fc融合物の質量分析：インタクトな分子量を測定し、酵素消化やペプチドマッピングを介した部分配列検証を実施し、ANP-Fc融合物の分解物を同定するために、質量分析実験を実施した。

インタクトな分子量を評価するため、5μlの融合タンパク質を流速40μl／分でJupiter C4カラム（5u、300A、1.0×150mm）に注入した。タンパク質は、0％〜100％Aの勾配を使用して、40分間で溶出した［移動相Aは98/2/0.06（水／アセトニトリル／TFA）、移動相Bは95/5/0.052（アセトニトリル／水／TFA）］。流出液をMicromass Quattro Ultima質量分析器に注入し、2秒間のスキャン時間で900から1500amuまでをスキャンした。MaxEnt1プログラムを使用してデータを逆重畳し、分子量を得た。

融合タンパク質は、ペプチド地図作成および分解解析のために、トリプシンまたはEndo-LysC（8010-108）で消化した。簡潔に、各サンプルを25μLずつ変性、還元、およびアルキル化した。トリプシンまたはEndo-LysCを加え、サンプルを37℃の水浴で一晩保温した。HPLC／FTMSにより解析を実施した。この装置は、クロマトグラフ分離中に約50,000の解像度で複数の走査信号を発生した。各溶出ペプチドの質量は、相対誤差0.0005％の精度で測定された。ProQualプログラム（3）を使用してデータを処理することによりペプチドマップを得た。酵素特異性に基づいて予測されたペプチドは、理論値が実験的に測定した値の±0.0005％以内の場合に、それらを対応させた。また、アミノ酸欠失の可能性に対応する質量を探すことによりN末端切断を見付けるためにも、Endo-LysCのデータを検索した。トリプシンと異なり、Endo-LysC実験はインタクトなアミノ末端領域の観察も可能にさせる。

インビトロNPRA細胞アッセイ用の安定細胞株の産生
全長ヒトNPRA、ヒトNPRB、およびヒトGUCY2C（NPRC）配列を含むプラスミドは、OriGene Technologies, Inc.（ロックヴィル、メリーランド州）より購入し、次に哺乳類でのpcDNA3.1方向性発現ベクター（Invitrogen）にサブクローニングした。各構築物の挿入断片の配向および塩基配列は、社外業者（SeqWright, Inc.）により確認された。pcDNA3.1 NPRクローンは、リポフェクタミン（Invitrogen）を使用してHEK293細胞に形質移入し、G418を用いてヒトNPRA、ヒトNPRB、またはヒトNPRCを発現する安定細胞株を選択した。クローンは、以下に説明するナトリウム利尿ペプチド誘発cGMPアッセイを使用してスクリーニングした。（NPRAクローンはヒトANPで処理したが、NPRBクローンはヒトCNP（Sigma）で処理した。）高cGMP産生クローンは拡大した。NPRCクローンは¹²⁵I ANP結合アッセイを使用してスクリーニングした。¹²⁵I ANPを高度に結合するクローンを拡大した。細胞株は、100μg／mlのペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミン、400μg／mLのG418、および10％FBS（Hyclone）を含むDMEM中で増殖させた。HEK293T-GCA（ラットNPRA発現細胞）（Lincoln Potter、ミネソタ大学、生化学・分子生物学・生物物理学部、ミネアポリス／セント・ポール、ミネソタ州）は、100μg／mlのペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミン、ハイグロマイシンB、および10％FBSを含むDMEM中で増殖させた。

ナトリウム利尿ペプチド融合タンパク質誘発cGMPアッセイ：
HPLC純度＞95％のナトリウム利尿ペプチドはSigmaより入手した。HEK293 NPRA細胞は90％コンフルエンスまで増殖させ、HANKS based細胞解離培地（GIBCO）を使用して回収した。細胞を洗浄し、予熱したダルベッコPBS、pH7.4、25mM HEPES、0.1％BSA、500μM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）［アッセイ緩衝液］中に3.3×10⁵個／mLで再懸濁した。アッセイはオプティプレート-96白色不透明96穴マイクロプレート（Perkin Elmer）内で実施した。細胞懸濁液15μLをアッセイ緩衝液中の2X融合タンパク質15μLに加え、これを三重に実施し、これらを37℃で20分間保温した。cGMP濃度はHitHunter（商標）cGMPアッセイキット（DiscoveRx Corporation）を使用して測定した。cGMP産生の用量反応曲線は、XLfit4.2データ解析ソフトウェア（ID Business Solutions, Ltd.）中のLevenburg Marquardtアルゴリズムを使用し、4-パラメーターのロジスティック方程式に当てはめることにより作成した。

¹²⁵I ANP結合アッセイ：
Millipore Multiscreenガラスファイバー・マイクロタイタープレートを0.2％ポリエチレンイミン（PEI）（Sigma）でコーティングし、真空濾過により結合緩衝液（RPMI、0.1%BSA）で洗浄した。結合緩衝液中の1^*10⁶ HEK293-NPRC細胞クローン懸濁液100mlを各ウェルに加えた。100mLの2X ¹²⁵I-ANP +/- 1000×冷却したANP（非特異的結合対照）を適切なウェルに加えた。プレートは、オービタルシェイカー上で室温にて2時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを200μlの冷結合緩衝液で5回洗浄し、引き続き200μlの最終洗浄を真空マニフォールドを使用して洗浄緩衝液（10mMトリス、200mM NaCl、0.02%BSA）で行った。フィルターは室温で乾燥させた。30μlのMicroscint 20を各ウェルに加えた。プレートをPerkin Elmer TopcountNTX液体シンチレーション・カウンターで読み取った。

ラットにおけるANP-Fcの薬物動態：
雌のウィスターラット（約100g、4匹／タンパク質）に0.5mg／kgのPBS中の単量体（構築物14）および二量体（構築物15）または単量体（構築物10）および二量体（二量体構築物11）を静脈内投与した。投与1、2、4、8、24、48、および72時間後（構築物15）、または投与0.25、1、2、4、8、24、48、および72時間後（構築物10、11、および14）、各ラットからテイルニック（tail nick）で採血した。血液（2×60μlアリコート）は、6μlの3.2％クエン酸ナトリウムおよび遠心分離により得られた血漿を含むマイクロキャピラリー管（フィッシャーサイエンティフィック、カタログ番号22-362-574）に採取した。血漿は、ELISAにより解析するまで−20℃で保管した。

新生仔ラットによるANP-Fcの経口摂取：
生後10日の新生仔ウィスターラット（4匹／群）に5mg／mlダイズトリプシン阻害剤を添加したPBS（Calbiochem、カタログ番号650357）中のANP-Fc二量体（構築物14）を0.5mg／kg経口投与した。投与1、2、4、8、24、48、および72時間後、ラットの群から心臓穿刺により採血した。血液（700μl）は、体積が0.1の3.2％クエン酸ナトリウムおよび遠心分離により得られた血漿の中に採取した。血漿は、ELISAにより解析するまで−20℃で保管した。

ANP／Fc ELISA：
50mMの炭酸／炭酸水素緩衝液pH9.6中のマウス抗ヒトANP（US Biologicals、カタログ番号A4150）5μg／ml（50μl／ウェル）で96穴プレート（Costar、カタログ番号369）を4℃で一晩コーティングした。300μl／ウェルの5％ウシ血清アルブミン含有PBS（PBS／5％BSA）（Jackson ImmunoResearch #001-000-162）でプレートを室温（RT）で2時間ブロッキングした。標準物質およびサンプル（100μl／ウェル）をPBS／5％BSAで希釈し、室温で2時間インキュベートした。検量線は0.039ng／mlから10ng／mlの範囲とした。プレートは、Tecanプレート洗浄機内で300μl／ウェルの0.05%Tween-20含有PBS（PBST）を用いて3回洗浄した。次にプレートを100μl／ウェルのヤギ抗ヒト（Fc特異的）西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）複合型抗体（Pierce Biotechnology、カタログ番号31414）を1：7,500でPBS／5％BSAに希釈したものと共に室温で3時間インキュベートした。プレートは300μl／ウェルのPBSTで4回洗浄した後に、室温で約6分間100μl／ウェルのTMB超高感度基質（BioFx Laboratories、カタログ番号TMBS）で発光させた。反応を0.25Mの硫酸（100μl／ウェル）で停止させた。プレートは、Spectromaxプレートリーダーを使用して450（〜600）nmで読み取った。

実施例1：リンカーの最短距離を予測するための構造モデリング
FcとANPの融合に必要なリンカーの要素を決定するために、構造モデリングを実施した。互いの距離が最短になり、立体的および静電気的な反発が最小になるように両方の分子を配置すると、ANPのC末端からの最短距離は、最も近いFc二量体のN末端から12Åであり、もう一つのFc二量体N末端から17Åである。Fc二量体がANP一つだけと融合している場合、リンカーの最小長としては4から6アミノ酸が提案される。Fc二量体に二つのANPペプチドが結合し、一つのANPのみ結合した（Fc二量体：NPRA比率が1：1である）場合、それぞれのリンカーの最小長としては9アミノ酸が提案される。両方のANPをFc二量体：NPRA比率1：2で結合させるには、最小長が12アミノ酸のリンカーが提案される。

実施例2：合成ANP融合タンパク質の合成および特徴づけ
IgG1アイソタイプのヒトFcに融合したリンカーを有するhANP28ペプチドを産生するために合成化学を用いた。結果として産生された半合成ANP-Fc融合分子を表2に示す。試したリンカーは、グリシンコハク酸（L1）、GlyGly（L2）、(GlyGlySer)₃GlyGly（L4）（配列番号：3）、およびGly(SerGlyGly)₂SerGly（L3）（配列番号：2）である。グリシン（G）は可動性を与えるために使用され、極性のセリン（S）は可溶性のために組み込まれた。リンカーを有するhANP28ペプチドは、組換え技術により作製されたCys-Fcと二通りの配向で連結された：（1）hANP28＋リンカーのC末端がCys-FcのN末端へ融合［配向番号1］、および（2）リンカー＋hANP28のN末端がCys-FcのN末端へ融合［配向番号2］。合成化学的性質の結果、第一の配向は完全なペプチド結合構造をもたらしたが、第二の配向の化学的性質の結果、融合物の一つのアミノ酸の代わりにコハク酸部分が残された。

半合成ANP-Fc複合体は、カチオン交換クロマトグラフィーに続いてチオ-アフィニティークロマトグラフィーを行う工程からなる二段階精製工程を使用して精製した。カチオン交換工程は、Cys-Fc、単量体複合体（各Fcに対して一つのANPペプチド）、および二量体複合体（各Fcに対して2つのANPペプチド）を分離し、同時にタンパク質凝集物も除去した。個々のANP-Fc融合体カチオン交換プールは、非複合型遊離ANPペプチドを除去し、単量体および二量体複合体種に「磨きをかける」ために、別々にチオ-アフィニティークロマトグラフィー精製工程に供した。

精製した半合成ANP28-Fc融合物は、SEC-HPLC、逆相クロマトグラフィー、質量分析、および分子結合解析を使用して広範囲に特徴づけられた。凝集を評価するために使用されるSEC-HPLCは、精製された調製物に期待される分子量種が＞90％以上含まれることを示した。また、最終プール中の「遊離」非複合型ANPペプチドレベルをモニターするために逆相クロマトグラフィー法を確立した。合成された調製物には、「遊離」ANPペプチドが1％以下のモル濃度で混入していることが確認された。ジスルフィド結合形成の質を評価するために質量分析手法を使用した。質量分析の結果は、より長いリンカーを有する半合成構築物が少ない割合のジスルフィド結合混合を示したことを表した。混合ジスルフィド結合を有するものの割合は全体のごく一部であると予想されたため、合成された調製物は更なる解析にふさわしいと考えられた。最後に、半合成ANP-Fc融合タンパク質の固定された可溶性ヒトFcRnへの結合をモニターするため、Biacore解析を実施した。この解析は、合成化学がFc領域のFcRn結合能力を変化させないことを確認するために実施した。FcRn結合において著しい変化は見られなかった。

ひとたび半合成ANP-Fc融合構築物の質が確認されたら、2つの異なる研究所においてそれらの有効性をヒトNPRA cGMP誘導アッセイで検証し、そのデータを2つの異なる方法により処理した（表2：研究所1、2、および結果1、2）。研究所1および2の両方から得られた結果1は、生データの相対的発光単位（RLU）を解釈することにより得られた。研究所1から得られた結果2は、RLUを、同様のアッセイ中の既知のcGMP濃度から構成される検量線と比較することにより得られた。両方の解析から得られたEC50値は同じ傾向を示した。観察された一つの傾向は、本アッセイにおいて二量体構築物がそれぞれの単量体構築物よりも強力であることである。また、短い（2aa）リンカーとのANP-Fc融合は、より長い（11aa）リンカーとのものと比較して少なくとも2倍弱いことも明らかである。

（表２）半合成ANP-Fc融合物およびヒトNPRAを形質移入された細胞からのcGMP誘導反応

リンカー長と効力の相関関係を評価するために、16aaリンカー（L5a）とのANP-Fc融合物を作製した（構築物14および構築物15参照）。これより更に長いリンカーを評価するため、組換え20aa（L6）連結ANP-Fc融合タンパク質を作製した。両方の場合において、より長いリンカーの構成は、(GGS)x繰返しパターンに沿うようにし、ここでxは0から16の整数であった。表2に示す16アミノ酸リンカー（L5a）を有する単量体および二量体の両方のANP-Fc構築物は、11アミノ酸リンカー（L4）構築物よりも増強されたインビトロ活性を示した。産生された半合成ANP-Fc融合タンパク質が組換え技術により作製されたANP-Fc融合物と同一であることを確認するために、構築物11を模倣する組換え構築物もIgG1およびIgF2 Fc融合物の両方として作製した。

種特異的NPRAを形質移入された293または293T細胞においてヒトANP28ペプチドをcGMP産生についてアッセイした。cGMPの最大半量の刺激をもたらす融合タンパク質濃度の値を表3に示す。ラットNPRA（rNPRA）発現293T細胞およびヒトNPRA（hNPRA）およびイヌNPRA（caNPRA）発現293細胞においてヒトANP28ペプチドによって刺激されるcGMP産生の用量-反応曲線を図2に示す。

（表３）種特異的NPRAを形質移入された293または293T細胞におけるcGMP産生のアッセイ結果

実施例3：組換えANP融合タンパク質
組換えANP-Fc融合タンパク質を迅速に産生するための作製プラットフォームを作成した。プロセスとしては、IgG1またはIgG2のいずれかのFcのN末端上にDNAカセットを迅速にかつ繋ぎ目なく挿入することを可能にする「基盤」Fc融合ベクターから始まる。IgG1およびIgG2アイソタイプの両方へのFc融合は、ヒンジ領域が同じCPPCPヒンジ残基まで切断されるように作り出され、従って二つのアイソタイプ上でリンカーの延長とANP融合が同様に延長されることが保証された。産生された四つの組換えANP-Fc融合タンパク質それぞれのDNAおよびタンパク質配列は、配列番号：24〜31で表される（例えば、図1A〜B参照）。これらの融合タンパク質は、それぞれ、最終タンパク質生成物には含まれない切断されるN末端マウスIgGκ軽鎖シグナル配列

を含む。太字で示したANP-Fc融合構築物は、先ず1Lの哺乳類での一過性発現に続いてアフィニティークロマトグラフィーを用いて作製した。この作製プロセスから、典型的には1〜3mg／Lの＞90％純粋タンパク質（SDS-PAGEによる）が得られる。増加するタンパク質の需要に答えるため、他に二つの哺乳類での発現技術、すなわち大規模（20L）一過性形質移入および安定したプールの作成の両方を首尾よく実行した。これらの方法論は、どちらも最初の1Lでの一過性形質移入に比べて、1Lあたり少なくとも3倍多いタンパク質をもたらした。全体的に見て、これらのプロセスにより、インビトロおよびインビボ解析に使用される各組換え構築物を50mgより多く産生することが可能になった。非還元ANP-Fc融合物の予想分子量は57.5kDaであるが、還元ANP-Fc融合物の予想分子量は28.7kDaである。

組換え体産生プラットフォームを補うために、特徴づけプラットフォームを設置し、これにより検証されるANP-Fc融合物の品質を確保した。hANP28はかなり高い力価を有し（表4参照）、その配列は機能性に必要な多くの決定的なアミノ酸および一つのジスルフィドを含むため、得られたロット中の「遊離」hANP28ペプチド濃度および分解産物のモニタリングには質量分析（インタクトな質量およびトリプシン消化物）が利用された。また、ANP-Fc融合ペプチドのN末端を評価するため、質量分析Endo-LysC消化プロトコールも実行した。＞90％インタクトなN末端を含むロットのみ更なる解析用に選択した。凝集レベルは、分析用遠心機で沈降速度実験により検証し、これによりロットは＞85％単量体を含むことが明らかになった。

（表４）組換えANP-Fc融合および様々なNPRA細胞種において得られたcGMP誘導反応

¹例えば、式3および4参照。
²二つの異なる鎖のFc領域は、組換え体が発現されると二量体化し、ANPの二量体を形成することに留意されたい。

組換え技術により作製したANP-Fc融合構築物をNPRA cGMP誘導アッセイで検証した。これまでに検証された組換えANP-Fc融合タンパク質は、ラット、イヌ、およびサルでのアッセイにおいて良好な交差反応を示した。11aaリンカー（L4）と組換え技術により作製されたANP-Fc融合タンパク質は、それらが模倣する半合成構築物である構築物11と同様の効力を示した。これは、半合成ANP-Fc融合物から得られた効力データが、組換え技術により産生されたタンパク質から見られる結果を表すことを示す。予想通りに、Fcアイソタイプにおける差異（Fc1対Fc2）は効力に著しい影響を与えない。最も劇的な効力効果は、様々なリンカー長を比較した際にみられた。20aaリンカー（L6）と組換え技術により作製されたANP-Fc融合タンパク質は、対応する11aaリンカー（L4）融合タンパク質よりも明らかに約2倍強力である。半合成16aaリンカー（L5）ANP-Fc融合タンパク質構築物14のヒトNPRA cGMP EC50は14±1nM（n＝2）である。半合成および組換えANP-Fc融合物の効力データを考慮すると、インビトロ効力はリンカー長との直接的相関関係があり、20aa＞16aa＞11aa＞2aaである。

組換えANP-Fc融合タンパク質の選択性は、NPRB発現細胞株においてそれらの有効性を解析することにより評価した。ANP-Fc融合タンパク質の種交差反応性は、ラット、イヌ、およびサルNPRA発現HEK293細胞株において検査した。検査されたANP-Fc融合物は、ラット、イヌ、およびサルNPRAを介するcGMPアッセイ（表4）において良好な交差作用を有する。ANP-Fc融合タンパク質は、ヒト、イヌ、およびサルNPRAを発現する細胞において検査した際、ほぼ同等の用量反応値を有する。これらの結果は、ヒト、イヌ、およびサルANP28が100％の相同性を有することを思えば、当然のことである。一方、ラットNPRAの用量反応値は、約2倍弱く、これはラットANPがヒトANPと1アミノ酸異なることに由来する可能性が高い。野生型ラットANPのEC₅₀は、ヒトNPRA cGMPアッセイで検定した場合、ヒトANPのEC₅₀より少し高い。

実施例4：インビボ薬物動態試験
本発明の融合タンパク質を更に特徴づけるために、インビボ薬物動態試験を実施した。

半合成の11（L4）および16（L5）アミノ酸連結ANP-Fc融合物の単量体（それぞれ、構築物10および構築物14）および二量体（それぞれ、構築物11および構築物15）の薬物動態学的性質は、ウィスターラットへの静脈内投薬を用いて見出した。二つの異なるELISA法を使用し、タンパク質を検出した。ANP／Fc ELISAを使用して、インタクトなANP-Fcを検出した。Fc／Fc ELISAを使用して、Fcタンパク質を検出し、従って、インタクトなANP-FcおよびFcの両方を測定し、ANPペプチド分解の可能性を調査した。

二種類の構築物の半減期は似ていたにもかかわらず、単量体構築物（構築物10および構築物14）はいずれも二量体（構築物11および構築物15）よりも高いC_maxを有した（表5）。その結果として、単量体のAUCは、対応する二量体のものよりも＞5倍大きかった（表5）。薬物動態に関して二つのリンカー長の間に有意な差は検出されなかった。加えて、ANP／FcおよびFc／Fc検出方法は、高められた血清濃度および延長された半減期をもたらすFc／Fc ELISAとは有意に異なる結果を提供することが明らかになった。本データは、ANP-Fc融合物が生体内で時間と共に部分的に分解した可能性があることを示唆するものである。

（表５）ウィスターラットにおける単量体および二量体の薬物動態学的パラメーター

組換えANP-Fc融合候補の薬物動態を、単一用量ラットPK調査を実施することにより評価した。用量1mg／kgでANP-Fc融合物の単回ボーラス注射を、静脈内または皮下注射経由でスプラーグドーリーラットに与えた。媒体対照PBS注射を対照群の動物に行った。血漿サンプルを様々な時点（0、0.083、0.5、1、4、8、24、48、72、96、120、および168時間）で回収した。動物を1週間サンプリングし、予備軍は最長3週間までサンプリングした。サンプリング後、動物を隔離し、EDTAおよびアプロチニンと共に血漿サンプルをサンドイッチELISAでアッセイし、ここでANPはモノクローナル抗体で捕らえられ、抗ヒトFc抗体で検出される。ELISAの感度は1ng／mLで、ラット血漿中のANP-Fc融合タンパク質を検出するために使用してもよい。このラットPKデータは、ANP-Fc融合タンパク質の生体内半減期と天然リガンドhANP28のそれの比較を可能にするものである。

ラットへの四つの組換えANP-Fc融合物の静脈内ボーラス投薬を用いて得たPKデータを表6に示す。得られたデータは、融合タンパク質の終末半減期（T1/2）値（約11〜17時間）が天然ヒトANPのものよりも有意に長いことを立証する。天然ANPは、ラットにおいて0.3分のT1/2、ヒトにおいて2〜3分のT1/2を有することが報告されている。静脈内投薬PKデータは、ANP-Fc融合物が低クリアランス、および中程度の分布体積を示すことを明らかにした。静脈内投薬PKデータから四つの組換えANP-Fc融合タンパク質はいずれも区別することができない。

（表６）クリアランス（CLp）、分布体積（Vss）、半減期（T1/2）、および平均共鳴時間（MRT）データのリスト。

四つの組換えANP-Fc融合物をラットに皮下投薬した際に得られたPKデータを表7に示す。得られたデータは、融合物にゆっくりとした吸収段階があり、その結果より長い半減期（約18〜23時間）を有することを示唆するものである。しかしながら、皮下投薬は低い血漿濃度レベルをもたらした。得られた皮下投薬PKデータから四つの組換えANP-Fc融合タンパク質ははっきりと区別することができなかった。

（表７）得られた最高血清濃度（Cmax）、曲線下面積（AUC）、半減期（T1/2）、観察された生物学的利用率（％F）のリスト。

治療に関連するANPペプチドに付けられたFcの存在は、ANP-Fcタンパク質のFcRn輸送経路を経由した非侵襲性送達を可能にし得る。新生仔ラットは生まれて最初の15日間腸において高いFcRn発現レベルを有することから、これらはFcRn輸送を研究する上で有用なモデルとなる。従って、FcRn輸送の効率を評価するために、新生仔ラットに単一経口用量0.5mg／kgのANP-Fc二量体（構築物14）を投与した。データは、ANP-Fcタンパク質の取り込み効率が悪いこと、並びに、FcのみのELISAから得られる大きなシグナルが示すように、腸でタンパク質の著しい分解が起きていることを示唆するものである。

実施例5：融合タンパク質は、NEPによるタンパク質分解に対する増大した抵抗性を示す
中性エンドペプチダーゼ（NEP、別名ネプリライシン、CALLA中性エンドペプチダーゼ24.11、EC3.4.24.11）は、タイプII内在性膜タンパク質である。NEPは、ナトリウム利尿ペプチド、エンケファリン、およびサブスタンスPを含む数種類のタンパク質の分解に関与する亜鉛メタロペプチダーゼであり、循環から30〜50％のANPを除去することに関与していると考えられている。例えば、J. Kenny et al., Biochem. J. (1993)291, 8348 (1993)参照。このクリアランス機構を研究するために使用するインビトロの手段として、インビトロNEP安定性アッセイが開発された。

100ngの組換えヒトNEP（R&D systems）をcGMPアッセイ緩衝液に溶解し、これを0.01μM ANP（Sigma）または融合タンパク質を含むポリプロピレン・マイクロタイタープレートのウェルに加えた。プレートを室温で60分間インキュベートした。反応を停止させるために、EDTA（Sigma）をカルシウム、マグネシウム不含PBS（Gibco）中10mMで各ウェルに加えた。上記のとおり、ナトリウム利尿ペプチド融合タンパク質誘発cGMPアッセイを実施した。細胞懸濁液にNEPで処理した反応混合物を15μl加え、cGMP産生の測定を行った。データ（3つのウェルの平均）は、検査した構築物がいずれもNPRAによるcGMP産生における著しい効力の低下を少しも見せないことを示した（例えば、図3参照）。

実施例6：ホールセル結合の実証
ホールセルで発現されるヒトNPRAに対する天然リガンドhANPの結合親和性（K_d）を測定した。ヒトNPRAを形質移入されたHEK293細胞は、PEIコーティングされた96穴ガラスファイバー濾過プレート中で、既知の濃度の¹²⁵I標識hANP28と4℃で2時間インキュベートした。プレートは氷冷緩衝液で真空濾過により洗浄し、乾燥させた。シンチラントを加え、プレートをトップカウント・シンチレーションカウンターで読み取った。平衡モデル350（ミカエリスメンテン式[((BLmax^*x)/(K_d+x))]）を用いて、hANPのNPRAへの結合のK_d値0.42nMを算出した。

放射性リガンド全細胞受容体結合アッセイを用いて、異種の結合競合アッセイを実施することにより、構築物1（hANP28）の相対的結合親和性を融合タンパク質のそれと比較した。NPRA形質移入体を一定の量の¹²⁵I標識ANP+/-過剰非標識ANPまたは様々な濃度の融合タンパク質と共に4℃で2時間 PEIコーティングされた96穴ガラスファイバー濾過プレート中でインキュベートした。プレートは真空濾過により洗浄し、乾燥させた。シンチラントを加え、プレートをトップカウント・シンチレーションカウンターで読み取った。XLfit4.2を使用して曲線をあてはめ、用量反応1部位モデル205[4パラメーターへのあてはめ：y=A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))]を使用してIC₅₀値（表8）を決定した。K_i値（例えば、表8参照）は、つぎの式を使用して計算した：K_i=IC₅₀/[1+([L]/K_d)]ここでK_iは非標識のリガンドの平衡解離定数、IC₅₀は結合を50%阻害する濃度、［L］は放射性リガンドの濃度、K_dは放射性リガンドの平衡解離定数である。候補となるものは、NPRAに対して天然リガンドよりも40から200倍弱い親和性を有する。評価された各リガンドの親和性の順番は、構築物1＞構築物5＞構築物3＞構築物4＞構築物2である。

（表８）hANP28および各組換えANP-Fc融合タンパク質のIC₅₀、K_i、および相対的親和性の値

前述の発明は、その理解を明確にするために図面および実施例により多少詳しく説明したが、本発明の教示に鑑みて、付随する態様を含む本明細書における開示の精神または範囲を逸脱するこなく、ある種の変更および修正がそれらになされてもよいことは、当業者には容易に明らかになるだろう。

Claims

ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体Fc領域を含む融合タンパク質であって、該ナトリウム利尿ペプチドが直接またはリンカーを介してFc領域に複合化している、融合タンパク質。
下記の式を含む、請求項1記載の融合タンパク質：
X-L_a-F:F-L_a-X、またはX-L_a-F:F
式中、Xはナトリウム利尿ペプチドであり、
Lはアミノ酸残基を含むリンカーであり、
aは0以上の整数であり、
:は化学会合または架橋であり、かつ
FはFcRn結合部位を含む免疫グロブリンFc領域の少なくとも一部である。
ナトリウム利尿ペプチドがANP、BNP、ウロジラチン、DNP、または生物学的に活性なそれらの配列変異体からなる群より選択される、請求項1または2記載の融合タンパク質。
ナトリウム利尿ペプチドがANPまたはBNPである、請求項1または2記載の融合タンパク質。
少なくとも二つのナトリウム利尿ペプチドを含む、請求項1または2記載の融合タンパク質。
ナトリウム利尿ペプチドの両方がANPである、請求項1、2、または5のいずれか一項記載の融合タンパク質。
ナトリウム利尿ペプチドの両方がBNPである、請求項1、2、または5のいずれか一項記載の融合タンパク質。
少なくとも二つのFc領域を含む、請求項1または2記載の融合タンパク質。
リンカーが6アミノ酸長、11アミノ酸長、16アミノ酸長、または20アミノ酸長である、請求項1または2記載の融合タンパク質。
リンカーが6〜11アミノ酸長、11〜16アミノ酸長、16〜20アミノ酸長、16〜25アミノ酸長、または20〜30アミノ酸長である、請求項1または2記載の融合タンパク質。
リンカーがグリシンコハク酸リンカー、アミノ酸リンカー、またはそれらの組み合わせである、請求項1または2記載の融合タンパク質。
アミノ酸リンカーが

である、請求項1または2記載の融合タンパク質。
抗体Fc領域によってお互いが分離されている少なくとも一つまたはそれ以上のナトリウム利尿ペプチドを含む融合タンパク質であって、該ナトリウム利尿ペプチドが直接またはリンカーを介してFc領域に複合化している、融合タンパク質。
下記の式を含む、請求項13記載の融合タンパク質：
X-L_a-F:F-L_a-X
式中、Xは一つ以上のナトリウム利尿ペプチドであり、
Lはアミノ酸残基を含むリンカーであり、
aは0以上の整数であり、
:は化学会合または架橋であり、かつ
FはFcRn結合部位を含む免疫グロブリンFc領域の少なくとも一部である。
Xが一つより多いナトリウム利尿ペプチドである、請求項14記載の融合タンパク質。
ナトリウム利尿ペプチドがANP、BNP、ウロジラチン、DNP、または生物学的に活性なそれらの配列変異体からなる群より選択される、請求項13または14記載の融合タンパク質。
ナトリウム利尿ペプチドがANPまたはBNPである、請求項13または14記載の融合タンパク質。
ナトリウム利尿ペプチドの両方がANPである、請求項13または14記載の融合タンパク質。
ナトリウム利尿ペプチドの両方がBNPである、請求項13または14記載の融合タンパク質。
ナトリウム利尿ペプチドの内の一方がANPであり、他方がBNPである、請求項13または14記載の融合タンパク質。
リンカーが6アミノ酸長、11アミノ酸長、16アミノ酸長、または20アミノ酸長である、請求項13または14記載の融合タンパク質。
リンカーが6〜11アミノ酸長、11〜16アミノ酸長、16〜20アミノ酸長、16〜25アミノ酸長、または20〜30アミノ酸長である、請求項13または14記載の融合タンパク質。
リンカーがグリシンコハク酸リンカー、アミノ酸リンカー、またはそれらの組み合わせである、請求項13または14記載の融合タンパク質。
アミノ酸リンカーが

である、請求項13または14記載の融合タンパク質。
リンカーの長さが6アミノ酸長、11アミノ酸長、16アミノ酸長、または20アミノ酸長である、請求項13または14記載の融合タンパク質。
対応する野生型ナトリウム利尿タンパク質よりも、タンパク質分解に対して抵抗性がある、請求項1、2、13、または14のいずれか一項記載の融合タンパク質。
対応する野生型ナトリウム利尿タンパク質よりも長い半減期を示す、請求項1、2、13、または14のいずれか一項記載の融合タンパク質。
組換え技術、合成化学、または半合成化学により作製される、請求項1、2、13、または14のいずれか一項記載の融合タンパク質。
配列番号：8〜11のいずれか一つを含む、ナトリウム利尿融合タンパク質。
配列番号：12〜13のいずれか一つを含む、ナトリウム利尿融合タンパク質。
配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、および配列番号：11からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも90％の配列同一性を示す単離されたポリペプチド。
配列番号：12および配列番号：13からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも90％の配列同一性を示す単離されたポリペプチド。
配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、および配列番号：11からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも95％の配列同一性を示す単離されたポリペプチド。
配列番号：12および配列番号：13からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも95％の配列同一性を示す単離されたポリペプチド。
配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、および配列番号：11からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも99％の配列同一性を示す単離されたポリペプチド。
配列番号：12および配列番号：13からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと少なくとも99％の配列同一性を示す単離されたポリペプチド。
配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、および配列番号：11からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
配列番号：12および配列番号：13からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
請求項1、2、13、または14のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む薬学的組成物。
融合タンパク質が静脈内、皮下、または経口投与に適合している、請求項39記載の薬学的組成物。
融合タンパク質が静脈内投与に適合している、請求項39記載の薬学的組成物。
哺乳類、原核生物、酵母、植物、または遺伝子組換えの発現系を利用して組換えにより作製される、請求項1、2、13、または14のいずれか一項記載の融合タンパク質。
治療に有効な量の請求項39記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、過剰な量の細胞外液を特徴とする状態を治療または回復させる方法。
NPRA受容体の活性化が治療的効果をもたらす、病的状態を治療または回復させる方法であって、治療に有効な量の請求項39記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
異常な利尿作用、ナトリウム利尿作用、および血管拡張性作用に関連する疾患を治療または回復させる方法であって、治療に有効な量の請求項39記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
ナトリウム利尿、利尿、血管拡張の誘導、またはレニン・アンジオテンシンIIおよびアルドステロン系の調節が望まれる疾患を治療または回復させる方法であって、治療に有効な量の請求項39記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
慢性心不全（非虚血性）、再灌流傷害、左室機能不全（LVD）、心線維症、拡張期心不全、および肥大型心筋症からなる群より選択される心臓血管系の病的状態を治療または回復させる方法であって、治療に有効な量の請求項39記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
高血圧症、肺高血圧症、収縮期高血圧症、および抵抗性高血圧症からなる群より選択される高血圧障害を治療または回復させる方法であって、治療に有効な量の請求項39記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
糖尿病性腎症を治療または回復させる方法であって、治療に有効な量の請求項39記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。