CN114174347A - 松弛素类似物及其使用方法 - Google Patents

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P·费尔迪诺
王晓军
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Abstract

公开了松弛素(RLN)类似物，其包括与天然人RLN相比的修饰，所述修饰增加半衰期、维持对RXFP1受体的选择性和提供体外和体内稳定性以改善成药性和减少免疫原性。还公开了药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的一种或多种本文所述的RLN类似物。还公开了制备和使用RLN类似物的方法，特别是用于治疗心血管、肺和/或肾病症、疾病或障碍。

Description

松弛素类似物及其使用方法
本公开内容总体上涉及生物学和医学，且更具体地它涉及松弛素（RLN）类似物，尤其是长效单链RLN类似物，其可以结合RLN/胰岛素样家族肽(RXFP)受体，诸如RXFP1受体，从而作为RXFP受体激动剂起作用。本公开内容进一步涉及包含它们的组合物以及它们在治疗心血管、肺和/或肾病症、疾病或障碍中的用途。
松弛素(RLN)是胰岛素超家族的一部分，且在人类中包括七种具有高结构相似性但低序列相似性的肽——RLN1 (H1RLX、RLXH1或H1)、RLN2 (H2RLX、RLXH2或H2)、RLN3(RXN3、ZINS4或H3)、胰岛素样(INSL)肽3 (INSL3)、INSL4、INSL5和INSL6。本文特别感兴趣的是RLN2，它是通过两个二硫键连接的分别有24个和29个氨基酸的两条肽链（A链和B链）的异源二聚体，其中A链进一步具有一个分子内二硫键(参见，Schwabe & McDonald (1977)Science 197:914-915)。RLN2从它的激素原（松弛素原）通过从其裂解C肽产生。
在生理学上，RLN2表现出多种功能，其调节心血管、肝、神经、胰腺、肺和肾的适应，诸如血管扩张、抗纤维化和血管生成作用，尽管它最初被描述为妊娠激素。RLN2信号传递通过两类不同的G-蛋白偶联受体(GPCR)发生，即，含有富亮氨酸重复序列的GPCR LGR7和LGR8，现在分别称为RXFP1和RXFP2受体。该家族中的另外两种受体包括RXFP3和RXFP4受体。RLN2具有短半衰期(t½)，这在将其用作治疗剂时提出了挑战。实际上，天然RLN2在体内具有数分钟的t½。因此，临床医师通过连续静脉内输注来施用RLN2，这经常导致接受RLN化合物的个体的不便和短期效力。
存在许多具有改善的t½的RLN2类似物。例如，国际专利申请公开号WO 2018/148419描述了包括非天然氨基酸残基（诸如对-乙酰基-苯丙氨酸）的类似物，可以向该残基连接接头、聚合物和/或药代动力学增强剂以改善t½。国际专利申请公开号WO 2018/138170描述了类似物，它们是A链和B链的融合物，其具有至少十五个氨基酸的接头和半衰期延长部分以改善t½。国际专利申请公开号WO 2017/201340描述了类似物，它们是A链和B链的融合物，其具有可变轻链片段以改善t½。国际专利申请公开号WO 2015/067791描述了类似物，它们是载体连接的前药，尤其是基于PEG的载体，以改善t½（关于另外的PEG连接的类似物，也参见WO 2012/024452）。国际专利申请公开号WO 2014/102179描述了类似物，它们是A链和B链的融合物，其具有IgG2或IgG4的Fc部分以改善t½。国际专利申请公开号WO 2013/004607描述了类似物，它们是A链和B链的融合物，其具有至少五个氨基酸但少于十五个氨基酸的接头以改善t½，或者它们是A链和B链的融合物，其具有抗体的Fc结构域以改善t½。
考虑到对RLN的各种生理作用的理解的增加，仍然需要具有改善的t½的长效RLN类似物。
为了满足这种需要，本公开内容首先描述了对RXFP1受体具有主要活性（即，用作RXFP1受体激动剂）的单链RLN类似物。这样的RXFP1受体激动剂包括以下的从氨基端(N-端)到羧基端(C-端)的基础结构：
VHH-L1-A-L2-B，
VHH-L1-B-L2-A，
A-L2-B-L1-VHH，或者
B-L2-A-L1-VHH，
其中VHH是可以充当药代动力学增强剂的部分，A是RLN A链，B是RLN B链，L1是第一接头，和L2是第二接头。
在某些情况下，VHH部分可以具有SEQ ID NO:10、11、12或13、尤其是SEQ ID NO:10或12的氨基酸序列。在其它情况下，VHH部分可以具有一个或多个添加、缺失、插入或置换，使得VHH部分具有与SEQ ID NO:10、11、12或13中的任一个具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列(参见，例如，SEQ ID NO:45-66)。
在某些情况下，A链可以具有SEQ ID NO:2、5或8、尤其是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在其它情况下，A链可以具有一个或多个添加、缺失、插入或置换，使得A链具有与SEQ IDNO:2、5或8中的任一个具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。例如，A链可以是SEQ ID NO:5的des1-4。
在某些情况下，B链可以具有SEQ ID NO:3、6或9、尤其是SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在其它情况下，B链可以具有一个或多个添加、缺失、插入或置换，使得B链具有与SEQ IDNO:3、6或9中的任一个具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。例如，B链可以是SEQ ID NO:6的des1。
在某些情况下，L1可以具有(GGGGQ)n (SEQ ID NO:14)、(GGGQ)n (SEQ ID NO:15)、(GGGGS)n (SEQ ID NO:16)、(PGPQ)n (SEQ ID NO:17)或(PGPA)n (SEQ ID NO:18)的氨基酸序列，其中n可以是1-10，尤其是约5至约8。在其它情况下，L1可以具有SEQ ID NO:19、20或21的氨基酸序列。在其它情况下，L1可以具有一个或多个添加、缺失、插入或置换，使得L1具有与SEQ ID NO:14至21中的任一个具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
在某些情况下，L2可以具有SEQ ID NO:22、23或67的氨基酸序列。在其它情况下，L2可以具有一个或多个添加、缺失、插入或置换。
在某些情况下，RLN类似物可以具有这样的氨基酸序列，其包括：SEQ ID NO:10、11、12或13的VHH；SEQ ID NO:2、5或8的A链；SEQ ID NO:3、6或9的B链；SEQ ID NO:19、20或21的L1；和SEQ ID NO:22、23或67的L2。可替换地，RLN类似物可以具有与特定氨基酸序列具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列，所述特定氨基酸序列包含包括以下内容的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、11、12或13的VHH；SEQ ID NO:2、5或8的A链；SEQ ID NO:3、6或9的B链；SEQ ID NO:19、20或21的L1；和SEQ ID NO:22、23或67的L2。
在特定情况下，RLN类似物可以具有SEQ ID NO:24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39、尤其是SEQ ID NO:26、27、30、31、34或35的氨基酸序列。可替换地，RLN类似物可以具有与SEQ ID NO:24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39、尤其是SEQ ID NO:26、27、30、31、34或35的氨基酸序列具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
在某些情况下，RLN类似物对RXFP1受体的结合亲和力与天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)的结合亲和力相当。在其它情况下，RLN类似物对RXFP1受体的结合亲和力大于天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)的结合亲和力。在其它情况下，RLN类似物对RXFP1受体的结合亲和力小于天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)的结合亲和力。
在某些情况下，当施用给人时，RLN类似物的t½比天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)的t½更长，包括长了至多约20天至约30天。
可替换地，上述组合物可以是编码本文所述的氨基酸序列的核酸序列，以及用于表达本文所述RLN类似物的载体和包含其的宿主细胞。
其次，描述了药物组合物，其包括至少一种本文所述RLN类似物或其药学上可接受的盐（例如，三氟乙酸盐、乙酸盐或盐酸盐）和药学上可接受的载体。在某些情况下，药学上可接受的载体是缓冲液，例如，生理盐水、磷酸盐-缓冲盐水、柠檬酸盐-缓冲盐水或组氨酸-缓冲盐水。在某些情况下，缓冲液是组氨酸、组氨酸缓冲液或组氨酸-缓冲盐水。在其它情况下，药物组合物进一步可以包括载体、稀释剂和/或赋形剂。
此外，药物组合物可以包括至少一种另外的治疗剂，例如，用作心血管、肺和/或肾病症、疾病或障碍的护理标准的药剂。在某些情况下，至少一种另外的治疗剂可以是抗凝血剂、血管紧张素-转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、ARB脑啡肽酶抑制剂(ARNI)、β-阻滞剂、利尿剂、毛地黄、地高辛、肼屈嗪/硝酸异山梨酯、盐皮质激素受体拮抗剂(MRA；或醛固酮拮抗剂)、钠-葡萄糖协同转运蛋白-2 (SGLT2)抑制剂、抑制素和/或抗血糖剂。
第三，描述了使用本文所述RLN类似物的方法，尤其是使用所述RLN类似物治疗心血管、肺和/或肾病症、疾病或障碍的方法。所述方法至少包括给有此需要的个体施用有效量的至少一种本文所述RLN类似物或其药学上可接受的盐的步骤。
在某些情况下，可以经由任何标准施用途径施用RLN类似物，例如，肌肉内、静脉内、胃肠外、皮下或透皮施用。在某些情况下，皮下(SQ)、肌肉内(IM)或静脉内(IV)施用RLN类似物。在特定情况下，可以将RLN类似物皮下或静脉内施用给个体。
同样地，且在某些情况下，可以每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次(即，每周)、每两周(即，每隔一周)、每个月一次(即，每月)、每两个月(即，每隔一个月)或甚至每三个月施用RLN类似物。在某些情况下，可以每隔一天皮下、每周三次皮下、每周两次皮下、每周一次皮下、每隔一周皮下或每个月一次皮下施用RLN类似物。在特定情况下，每周一次(QW)皮下施用RLN类似物。
可替换地，可以将RLN类似物静脉内施用给个体。如上，可以每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次(即，每周)、每两周(即，每隔一周)或每月施用RLN类似物。在某些情况下，可以每隔一天静脉内、每周三次静脉内、每周两次静脉内、每周一次静脉内、每隔一周静脉内或每个月一次静脉内施用RLN类似物。在特定情况下，每周一次静脉内施用RLN类似物。
所述方法也可以包括与有效量的至少一种另外的治疗剂组合施用RLN类似物的步骤。简而言之，许多本文所述病症/疾病/障碍的护理标准包括抗凝血剂、ACE抑制剂、ARB、ARNI、β-阻滞剂、利尿剂、毛地黄、地高辛、肼屈嗪/硝酸异山梨酯、MRA或其它醛固酮拮抗剂、SGLT2抑制剂、抑制素和/或抗血糖剂，以及用于控制并存病（包括但不限于，高胆固醇、高血压、心房颤动和糖尿病）的其它治疗剂。在某些情况下，可以与RLN类似物同时、分开或依次施用另外的治疗剂。
例如，可以以与RLN类似物相同的频率(即，每隔一天、每周两次、每周或甚至每月)施用另外的治疗剂。在其它情况下，可以以与RLN类似物不同的频率施用另外的治疗剂。在其它情况下，可以皮下或静脉内施用另外的治疗剂。在其它情况下，皮下施用RLN类似物，且可以口服或静脉内施用另外的治疗剂。可替换地，静脉内施用RLN类似物，且皮下施用另外的治疗剂。
在某些情况下，有需要的个体是糖尿病患者、伴有肾功能损伤的高血压患者和/或肥胖症患者。
所述方法还可以包括诸如测量或获得血压并将这样获得的值与一个或多个基线值或先前获得的值进行对比以评估治疗/疗法的有效性的步骤。
所述方法还可以与饮食和锻炼相结合和/或可以与除以上讨论的那些之外的另外的治疗剂相结合。
第四，描述了包括至少一种本文所述RLN类似物的用途。例如，可以提供本文所述RLN类似物用于治疗，特别是用于治疗心血管、肺和/或肾病症、疾病或障碍。任选地可以与至少一种另外的治疗剂同时、分开或依次(即，组合)施用RLN类似物。同样地，提供了本文所述RLN类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗心血管、肺和/或肾病症、疾病或障碍，其中所述药物任选地可以进一步包括一种或多种如上所述的另外的治疗剂。
第五，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 373687DEST_PATH_IMAGE001
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:10具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 121063DEST_PATH_IMAGE002
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:11具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 269147DEST_PATH_IMAGE003
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:12具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 11844DEST_PATH_IMAGE004
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:13具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 954393DEST_PATH_IMAGE005
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:45具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 392327DEST_PATH_IMAGE006
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:46具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 344103DEST_PATH_IMAGE007
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:47具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 816672DEST_PATH_IMAGE008
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:48具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 71067DEST_PATH_IMAGE009
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:49具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 996298DEST_PATH_IMAGE010
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:50具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 486185DEST_PATH_IMAGE011
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:51具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 78840DEST_PATH_IMAGE012
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:52具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 628770DEST_PATH_IMAGE013
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:53具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 189369DEST_PATH_IMAGE014
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:54具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 482947DEST_PATH_IMAGE015
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:55具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 930108DEST_PATH_IMAGE016
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:56具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 650940DEST_PATH_IMAGE017
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:57具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 550763DEST_PATH_IMAGE018
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:58具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 257819DEST_PATH_IMAGE019
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:59具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 559487DEST_PATH_IMAGE020
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:60具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 451220DEST_PATH_IMAGE021
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:61具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 838339DEST_PATH_IMAGE022
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:62具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 598353DEST_PATH_IMAGE023
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:63具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 20107DEST_PATH_IMAGE024
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:64具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 82741DEST_PATH_IMAGE025
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:65具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
可替换地，提供了一种化合物，其包括以下氨基酸序列：
Figure 691577DEST_PATH_IMAGE026
在某些情况下，所述化合物可以具有与SEQ ID NO:66具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。
本文所述RLN类似物的一个优点是，它们可以化学或重组合成为单链多肽（即单体），且因此不需要内切蛋白水解加工来获得生物活性。但是，考虑在一些情况下，VHH部分不仅可以缀合至单链RLN，而且可以缀合至双链RLN（例如，天然的）。在VHH部分上，不仅可以缀合至N-和C-端，而且可以缀合至VHH的任何表面暴露的氨基酸（前提条件是，这样的缀合不会完全消除白蛋白结合）。
本文所述RLN类似物的一个优点是，VHH部分不仅可以与天然A链和B链序列一起使用，而且可以与其修饰序列一起使用。此外，VHH部分可以通过连接到VHH部分的其它肽/蛋白融合物或小分子被进一步修饰以具有增强的或另外的功能性。
本文所述RLN类似物的一个优点是，与天然人RLN、尤其是天然人RLN2 (SEQ IDNO:5和6)相比，VHH部分在哺乳动物（诸如人类）中提供延长的作用持续时间并且可以具有约20天至约30天的t½，从而允许至少每周或每两周施用，这可以改善顺应性。
本文所述RLN类似物的一个优点是，与天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)相比，它们对RXFP1受体具有与对RXFP2受体类似或比其更好的选择性、亲和力和/或效能。换言之，本文所述RLN类似物导致对RXFP1受体足够的活性和对RXFP2、RXFP3和RXFP4受体中的一种或多种的减少的或不足的活性。
本文所述RLN类似物的一个优点是，它们具有通过改变VHH部分的白蛋白亲和力实现的可调药代动力学。
本文所述RLN类似物的一个优点是，与天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)或具有Fc融合物的RLN类似物相比，它们在保存的制剂中具有改善的稳定性。
此外，VHH部分的一个优点是，它们不仅与人血清白蛋白具有相等的结合，而且与狗、猴、小鼠、猪和大鼠血清白蛋白具有相等的结合，这使得药效动力学、药代动力学和毒理学研究更容易从这些物种转化至人类。
VHH部分的一个优点是，它们不仅可以用于与天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)相比改善本文所述RLN类似物的t½，而且可以用于改善其它生物活性的肽和蛋白（例如，胰岛素、生长分化因子15 (GDF-15)或葡萄糖依赖性促胰岛素肽1 (GLP-1)）的t½。
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管在RLN类似物、药物组合物和方法的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但本文描述了优选的方法和材料。
此外，不定冠词“一个/种”对要素的提及不排除存在超过一个/种要素的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个/种且仅一个/种要素。因此，不定冠词“一个/种”通常是指“至少一个/种”。
定义
如本文中使用的，“约”是指在一个或多个值例如所述的浓度、长度、分子量、pH、序列相似性、时间范围、温度、体积等的统计上有意义的范围内。这样的值或范围可以是在一个数量级以内，通常在给定值或范围的20%以内，更通常在10%以内，和甚至更通常在5%以内。“约”所涵盖的允许变化将取决于所研究的特定系统，并且本领域技术人员可以容易地理解。
如本文中使用的并且就一种或多种RXFP受体而言，“活性”、“激活”、“活化”等是指化合物、诸如本文所述RLN类似物的结合其受体并诱导其受体处的应答的能力，如使用本领域已知的测定法（诸如下文所述的体外测定法）测量的。
本文中使用的“氨基酸”是指这样的分子：从化学观点来看，其特征在于存在一个或多个胺基团和一个或多个羧酸基团并且可以含有其它官能团。如本领域已知的，存在一组二十种氨基酸，其被指定为标准氨基酸并且其可以用作任何生物产生的大多数肽/蛋白的结构单元。本公开内容中的氨基酸序列含有二十种标准氨基酸的标准单字母或三字母代码。
本文中使用的“类似物”是指激活靶受体并引发至少一种由该受体的天然激动剂引发的体内或体外效应的化合物，诸如合成的肽或多肽。
本文中使用的“保守置换”是指，除了在其氨基酸序列中具有一个或多个保守氨基酸置换以外，与参照分子相同的参照肽或多肽的变体。一般而言，保守修饰的变体包括与参考氨基酸序列具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。更具体地，保守置换表示将一个氨基酸用具有相似特征（例如，电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚度等）并且对得到的被置换的肽或多肽的生物活性具有最小影响的氨基酸置换。在功能上相似的氨基酸的保守置换是本领域众所周知的，且因此无需在本文中详尽描述。
本文中使用的“有效量”是指一种或多种本文所述RLN类似物或其药学上可接受的盐的量或剂量，其在向有此需要的个体施用单剂量或多剂量后，在这样的接受诊断或治疗的个体中提供所需的效果（即，可在个体的状况中产生临床上可测量的差异，例如，心脏、肾、肝或肺中增加的血管生成、增加的血管顺应性、增加的心脏血流量、增加的肝血流量、增加的肺血流量、增加的肾血流量、增加的肾小球滤过率、降低的血压、降低的(或预防的)炎症和/或减少的(或预防的)纤维化）。通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果，本领域技术人员可以容易地确定有效量。在确定个体的有效量时，考虑许多因素，包括但不限于哺乳动物的物种、其大小、年龄和一般健康、所涉及的特定疾病或障碍、疾病或障碍的程度或涉入度或严重程度、个体的应答、施用的特定RLN类似物、施用模式、施用的制剂的生物利用度特征、所选择的剂量方案、伴随药物的使用和其它有关的情况。
本文中使用的“延长的作用持续时间”是指，本文所述RLN类似物的结合亲和力和活性持续比天然RLN、尤其是天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)更长的时间段，从而允许至少如每天一次或甚至每周三次、每周两次或每周一次较不频繁地给药。使用已知的药代动力学试验方法，诸如在以下实施例中使用的那些，可以测量RLN类似物的时间作用特性。
本文中使用的“半衰期”或“t½”是指通过生物学过程从个体的流体或其它生理空间（诸如血清或血浆）除去化合物（诸如天然RLN或本文所述RLN类似物）的量的一半所花费的时间。可替换地，t½也可以是指一定量的这样的化合物失去其药理学、生理学或放射学活性的一半所花费的时间。
本文中使用的“半数最大有效浓度”或“EC50”是指导致测定终点诸如剂量-响应曲线(例如，cAMP、PI3K-Akt、NFκβ、VEGF和/或一氧化氮(NO)信号传递途径)的50%活化/刺激的化合物的浓度。
本文中使用的“与……组合”是指与一种或多种另外的治疗剂同时、依次或在单一组合制剂中施用至少一种本文所述RLN类似物。
本文中使用的“有此需要的个体”是指具有需要治疗或疗法的病症、疾病、障碍或症状的哺乳动物，诸如人，包括例如本文所列的那些。特别是，待治疗个体是人。
本文中使用的“长效”是指，本文所述RLN类似物的结合亲和力和活性持续比天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)更长的时间段，从而允许至少如每天一次或甚至每周三次、每周两次、每周一次或每月一次较不频繁地给药。使用已知的药代动力学试验方法，诸如在以下实施例中描述的那些，可以测量RLN类似物的时间作用特性。
本文中使用的“非标准氨基酸”是指可天然存在于细胞中但不参与肽合成的氨基酸。非标准氨基酸可以是肽的组分，且经常通过修饰肽中的标准氨基酸（即通过翻译后修饰）而产生。非标准氨基酸可以包括D-氨基酸，其具有与上述标准氨基酸相反的绝对手性。
本文中使用的“药学上可接受的缓冲液”是指本领域技术人员已知的标准药用缓冲液中的任一种。
本文中使用的“RLN”是指从任何物种（诸如哺乳动物物种，尤其是人）获得或衍生的松弛素，其中天然形式是具有通过两个二硫键连接的两条肽链（例如，A链和B链）的异源二聚体肽，并且其中A链进一步具有单个分子内二硫键。RLN包括天然RLN（即，全长）及其变体（即，天然RLN的添加、缺失、插入和/或置换）。在人类中，存在三种天然RLN亚型- RLN1、RLN2和RLN3。RLN加工从前松弛素原开始，它被加工成松弛素原（包括A链、B链和C肽；天然RLN具有B-C-A的结构），其中天然人proRLN1的序列如在SEQ ID NO:1 (也参见，UniProt/SwissProt数据库登记号P04808)中所示，天然人proRLN2的序列如在SEQ ID NO:4 (也参见，UniProt/SwissProt数据库登记号P04090)中所示，且天然人proRLN3的序列如在SEQ IDNO:7 (也参见，UniProt/SwissProt数据库登记号Q8WXF3)中所示。松弛素原经历进一步加工，其中C肽被裂解以得到RLN。天然人RLN1、RLN2和RLN3的A链的序列分别如在SEQ ID NO:2、5和8中所示。同样，天然人RLN1、RLN2和RLN3的B链的序列分别如在SEQ ID NO:3、6和9中所示。
在人类中，存在四种RLN受体- RXFP1 (SEQ ID NO:40；也参见，UniProt/SwissProt数据库登记号Q9HBX9)、RXFP2 (SEQ ID NO:41；也参见，UniProt/SwissProt数据库登记号Q8WXD0)、RXFP3 (SEQ ID NO:42；也参见，UniProt/SwissProt数据库登记号Q9NSD7)和RXFP4 (SEQ ID NO:43；也参见，UniProt/SwissProt数据库登记号Q8TDU9)–它们充当GPCR (参见，Halls等人(2007) Br. J. Pharmacol. 150:677-691)。本文感兴趣的是RXFP1和RXFP2受体，它们都可以结合RLN1和RLN2。在脑、血细胞、骨、心脏、肾、肺、肝和脉管系统中已经发现了RXFP1受体，而RXFP2受体则受到更多限制，并且已在骨和引带中发现。RXFP1和RXFP2受体的刺激会激活涉及腺苷酸环化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇3-激酶和/或细胞外信号调节激酶(Erk1/2)的信号转导网络。
本文中使用的“RLN类似物”等是指在一种或多种RXFP受体引发天然RLN的一种或多种作用、但与天然RLN相比在氨基酸序列方面以某种方式变化的化合物，诸如肽或多肽。RLN类似物还可以包括这些化合物的变体，其在功能上与RLN相当，但具有作为片段的序列，或者是完整序列但具有添加、缺失、插入和/或置换。除非另外指出，否则对本文所述的未修饰的或修饰的RLN中的氨基酸位置的所有提及均基于天然人RLN2的SEQ ID NO:5的A链或SEQ ID NO:6的B链中的相应位置。在一些情况下，与天然RLN、尤其是天然人RLN2 (SEQ IDNO:5和6)相比，本文所述RLN类似物可以以更高或更低的亲和力结合RXFP，但在体内或体外表现出更长的t½。以此方式，本文所述RLN类似物是充当RXFP受体激动剂的合成化合物。
本文中使用的“序列相似性”是指生物化合物的两个或更多个核酸序列或氨基酸序列的定量特性，例如，两个或更多个序列在整个长度或对比窗上的对应性。通过(1)同一性百分比或(2)相似性百分比，可以测量序列相似性。同一性百分比测量两种生物化合物之间相同的残基除以最短序列的长度的百分比；而相似性百分比测量同一性，并且此外在评价中包括序列间隙和残基相似性。用于确定序列相似性的方法和算法是本领域众所周知的，且因此无需在本文中详尽描述。相同核苷酸或氨基酸位置的指定百分比为至少约75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
本文中使用的“单链松弛素”、“scRLN”等是指这样的RLN多肽：其中A链和B链通过接头(即，L2)彼此连接，如在A-L2-B或B-L2-A中。此外，scRLN可以包括天然链间和/或链内二硫键中的至少一种以维持正确的结构折叠。
本文中使用的“双链松弛素”、“tcRLN”等是指这样的RLN多肽：其中A链和B链通过一个或多个链间和/或链内二硫键、但不通过任何接头彼此连接，以维持正确的结构折叠，诸如天然RLN。
本文中使用的“治疗”是指管理和护理具有病症、疾病、障碍或症状的个体，针对所述病症、疾病、障碍或症状，指示RLN类似物施用，以实现减弱、抑制、逆转、减缓或停止病症、疾病、障碍和/或症状的进展或严重程度的目的。治疗包括给个体施用本文所述RLN类似物或含有本文所述RLN类似物的组合物，以预防症状或并发症的发作，减轻症状或并发症，或消除病症、疾病、障碍或症状。治疗包括给个体施用RLN类似物或含有本文所述RLN类似物的组合物以导致例如心脏、肾、肝或肺中增加的血管生成、增加的血管顺应性、增加的心脏血流量、增加的肝血流量、增加的肺血流量、增加的肾血流量、增加的肾小球滤过率、降低的血压、降低的(或预防的)炎症和/或减少的(或预防的)纤维化。待治疗的个体是哺乳动物，尤其是人。
本文中使用的“个体”、“患者”和”对象”互换使用，并是指哺乳动物，尤其是人。在某些情况下，所述个体进一步的特征在于具有将受益于施用本文所述RLN类似物的病症、疾病、障碍和/或症状。
本文中使用的“VHH”或“VHH部分”是指单结构域抗体的一种形式，尤其是仅重链抗体(HcAb)的单个单体可变区的抗体片段，其具有非常小的约15 kDa的大小。本文已发现，VHH部分可以用作药代动力学增强剂以延长本文所述RLN类似物的作用持续时间和/或改善其t½。本文中的VHH部分结合血清白蛋白；但是，VHH部分可以用于结合IgG (包括Fc结构域)、新生儿Fc受体(FcRn)或其它持久的血清蛋白。尽管本文中的VHH部分用于改善RLN的t½，但它们同样可以用于改善其它生物活性肽/蛋白例如胰岛素、GDF-15或GLP-1的t½。
某些缩写定义如下：“ACR”表示尿白蛋白/尿肌酸酐比率；“amu”表示原子质量单位；“AUC”表示曲线下面积；“Boc”表示叔丁氧基羰基；“cAMP”表示环磷酸腺苷；“CMV”表示巨细胞病毒；“CV”表示柱体积；“DNA”表示脱氧核糖核酸；“DMF”表示二甲基甲酰胺；“DMSO”表示二甲亚砜；“EDC”表示1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；“EDTA”表示乙二胺四乙酸；“EIA/RIA”表示酶免疫测定/放射免疫测定；“ETA”表示乙醇胺；“GS”表示谷氨酰胺合成酶；“HIC”表示疏水相互作用色谱法；“hr”表示小时；“HTRF”表示均相时间分辨荧光；“IV”表示静脉内；“IP”表示腹膜内；“kDa”表示千道尔顿；“LC/MS”表示液相色谱法-质谱法；“min”表示分钟；“MS”表示质谱法；“MSX”表示甲硫氨酸亚砜亚胺；“NaOAc”表示醋酸钠；“NHS”表示N-羟基琥珀酰亚胺；“OtBu”表示O-叔丁基；“Pbf”表示NG-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；“PEI”表示聚乙烯亚胺；“RP-HPLC”表示反相高效液相色谱法；“RU”是指共振单位；“sec”表示秒；“SPR”表示表面等离子体共振；“SQ”表示皮下；“SEC”表示尺寸排阻色谱法；“SEM”表示平均值的标准误差；“TFA”表示三氟乙酸；和“Trt”表示三苯甲基。
RLN类似物
本文所述RLN类似物与天然人RLN具有结构相似性，但有许多结构差异。例如，与天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)相比，RLN类似物缺少在天然人RLN2中存在的一个或多个氨基酸，包括A链和B链之间的肽接头，并包括结合白蛋白的VHH部分。RLN类似物导致对RXFP1受体的足够活性和减少的或不足的对RXFP2、RXFP3和RXFP4受体中的一种或多种的活性。同样，RLN类似物具有与其作为治疗性治疗的可开发性相关的有益属性，包括提高的在水溶液中的溶解度、提高的化学和物理制剂稳定性、延长的药代动力学特性（其可根据VHH对血清白蛋白的亲和力进行调整）和/或最小化的免疫原性可能性。
简而言之，本文所述RLN类似物包括从N-端至C-端具有以下结构之一的氨基酸序列：
VHH-L1-A-L2-B，
VHH-L1-B-L2-A，
A-L2-B-L1-VHH，或者
B-L2-A-L1-VHH，
其中VHH是充当药代动力学增强剂的部分，A是RLN A链，B是RLN B链，L1是第一肽接头且L2是第二肽接头，其中L1和L2彼此不同(即，各自具有不同的氨基酸序列)。
关于A链，它可以是天然RLN A链，诸如天然人RLN1 A链(SEQ ID NO:2)；天然人RLN2 A链(SEQ ID NO:5)；或天然人RLN3 A链(SEQ ID NO:8)。可替换地，A链可以是其变体。例如，一种A链变体可以具有缺乏SEQ ID NO:5的残基1-4的氨基酸序列(即，des1-4人RLN2A链或desA1-4)。
同样地，关于B链，它可以是天然RLN B链，诸如天然人RLN1 B链(SEQ ID NO:3)；天然人RLN2 B链(SEQ ID NO:6)；或天然人RLN3 B链(SEQ ID NO:9)。可替换地，B链可以是其变体。例如，一种B链变体可以具有缺乏SEQ ID NO:6的残基1的氨基酸序列(即，des1人RLN2B链或desB1)。
在某些情况下，A链可以是天然人RLN1 A链(SEQ ID NO:2)且B链可以是天然人RLN1 B链(SEQ ID NO:3)；A链可以是天然人RLN2 A链(SEQ ID NO:5)且B链可以是天然人RLN2 B链(SEQ ID NO:6)；A链可以是天然人RLN3 A链(SEQ ID NO:8)且B链可以是天然人RLN3 B链(SEQ ID NO:9)；A链可以是天然人RLN1 A链(SEQ ID NO:2)且B链可以是天然人RLN2 B链(SEQ ID NO:6)；A链可以是天然人RLN1 A链(SEQ ID NO:2)且B链可以是天然人RLN3 B链(SEQ ID NO:9)；A链可以是天然人RLN2 A链(SEQ ID NO:5)且B链可以是天然人RLN1 B链(SEQ ID NO:3)；A链可以是天然人RLN2 A链(SEQ ID NO:5)且B链可以是天然人RLN3 B链(SEQ ID NO:9)；A链可以是天然人RLN3 A链(SEQ ID NO:8)且B链可以是天然人RLN1 B链(SEQ ID NO:3)；或A链可以是天然人RLN3 A链(SEQ ID NO:8)且B链可以是天然人RLN2 B链(SEQ ID NO:6)。
在某些情况下，A链可以是缺乏残基1-4的RLN2 A链变体(desA1-4)且B链可以是任何天然B链。在其它情况下，A链可以是任何天然A链且B链可以是缺乏残基1的RLN2 B链变体(desB1)。在再其它情况下，A链可以是缺乏残基1-4的RLN2 A链变体(desA1-4)且B链可以是缺乏残基1的RLN2 B链变体(desB1)。在某些情况下，A链是desA1-4变体。在某些情况下，B链是desB1变体。
可以用在本文所述RLN类似物中的其它A和B链描述在，例如，国际专利申请公开号WO 2018/148419、WO 2018/138170、WO 2017/201340、WO 2016/149501、WO 2015/157829、WO2015/067791、WO 2015/067113、WO 2014/102179、WO 2013/177529、WO 2013/007563、WO2013/004607、WO 2012/031326和WO 2012/024452；和美国专利申请公开号US 2011/0243942。也参见，Chan等人(2012) J. Biol. Chem. 287:41152-41164; Claasz等人(2002) Eur. J. Biochem. 269:6287-6293; Hossain等人(2015) Org. Biomol. Chem.13:10895-10890; Hossain等人(2016) Chem. Sci. 7:3805-3819; Park等人(2008) J. Biol. Chem. 283:32099-32109和Wilkinson等人(2005) BMC Evol. Biol. 5:14。
关于L1，它可以是约1个氨基酸至约50个氨基酸的肽。可替换地，L1可以是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个氨基酸。还可替换地，L1可以是约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约35个氨基酸、约35个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约45个氨基酸或约45个氨基酸至约50个氨基酸。在某些情况下，L1可以被省略，使得A链或B链直接缀合至VHH部分。在某些情况下，L1可以包括(GGGGQ)n (SEQ ID NO:14)的重复序列，其中n可以是约1至约10，尤其是5(即，(GGGGQ)5; SEQ ID NO:19)。在其它情况下，L1可以包括(PGPQ)n (SEQ ID NO:17)的重复序列，其中n可以是约1至约10，尤其是8 (即，(PGPQ)8; SEQ ID NO:20)。在其它情况下，L1可以包括(PGPA)n (SEQ ID NO:18)的重复序列，其中n可以是约1至约10，尤其是8 (即，(PGPA)8; SEQ ID NO:21)。
可以作为L1用于RLN类似物的其它接头包括但不限于(GGGQ)n (SEQ ID NO:15)或(GGGGS)n (SEQ ID NO:16)。
关于L2，它可以是约1个氨基酸至约15个氨基酸的肽。可替换地，L2可以是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15个氨基酸。还可替换地，L2可以是约1个氨基酸至约5个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸，尤其是10个氨基酸至15个氨基酸。在某些情况下，L2可以包括Ala/A、Gln/Q、Gly/G、Pro/P和Ser/S残基的混合物。在其它情况下，L2可以是SEQ ID NO:22、23或67。
关于VHH，它可以是约50个氨基酸至约200个氨基酸、尤其是约125个氨基酸至约150个氨基酸的多肽，其可以结合血清白蛋白或具有长t½的另一种血清蛋白。在某些情况下，VHH可以是SEQ ID NO:10至13中的任一种。可替换地，VHH可以是SEQ ID NO:45-66中的任一种。这些VHH部分的结构特征产生与天然RLN、尤其是天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)相比具有更长t½的RLN类似物。鉴于本文中的VHH部分靶向血清白蛋白，因此可以预期RLN类似物的t½类似于给其施用RLN类似物的物种的血清白蛋白的t½(考虑了任何靶标介导的药物处置)。
除了在本公开内容中描述的变化以外，本文所述RLN类似物可以包括一个或多个另外的氨基酸修饰，尤其是保守置换，但是，前提条件是，RLN类似物仍然能够结合和活化RXFP1受体。
总之，示例性的RLN类似物如下：
RLN类似物1，其包括VHH部分(带下划线)、(G4Q)5 L1 (斜体)、RLN2的A链、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的B链(desB1)，具有下述氨基酸序列：
Figure 865069DEST_PATH_IMAGE027
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物2，其包括VHH部分(带下划线)、(PGPA)8 L1 (斜体)、RLN2的A链、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的B链(desB1)，具有下述氨基酸序列：
Figure 16696DEST_PATH_IMAGE028
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物3，其包括VHH部分(带下划线)、(G4Q)5 L1 (斜体)、RLN2的B链(desB1)、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的A链，具有下述氨基酸序列：
Figure 968341DEST_PATH_IMAGE029
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物4，其包括VHH部分(带下划线)、(PGPQ)8 L1 (斜体)、RLN2的B链(desB1)、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的A链，具有下述氨基酸序列：
Figure 205418DEST_PATH_IMAGE030
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物5，其包括RLN2的B链(desB1)、10个残基的L2 (粗体)、RLN2的A链、(G4Q)5L1 (斜体)和VHH部分(带下划线)，具有下述氨基酸序列：
Figure 182601DEST_PATH_IMAGE031
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物6，其包括RLN2的B链(desB1)、10个残基的L2 (粗体)、RLN2的A链、(PGPQ)8 L1 (斜体)和VHH部分(带下划线)，具有下述氨基酸序列：
Figure 578947DEST_PATH_IMAGE032
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物7，其包括VHH部分(带下划线)、(G4Q)5 L1 (斜体)、RLN2的B链(desB1)、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的A链，具有下述氨基酸序列：
Figure 983384DEST_PATH_IMAGE033
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物8，其包括VHH部分(带下划线)、(PGPQ)8-L1 (斜体)、RLN2的B链(desB1)、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的A链，具有下述氨基酸序列：
Figure 691446DEST_PATH_IMAGE034
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物9，其包括RLN2的B链(desB1)、10个残基的L2 (粗体)、RLN2的A链、(G4Q)5L1 (斜体)和VHH部分(带下划线)，具有下述氨基酸序列：
Figure 206741DEST_PATH_IMAGE035
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物10，其包括RLN2的B链(desB1)、10个残基的L2 (粗体)、RLN2的A链、(PGPQ)8 L1 (斜体)和VHH部分(带下划线)，具有下述氨基酸序列：
Figure 457594DEST_PATH_IMAGE036
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物11，其包括VHH部分(带下划线)、(G4Q)5 L1 (斜体)、RLN2的B链(desB1)、13个残基的L2 (粗体)和RLN2的A链(desA1-4)，具有下述氨基酸序列：
Figure 298511DEST_PATH_IMAGE037
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物12，其包括VHH部分(带下划线)、(G4Q)5 L1 (斜体)、RLN2的B链(desB1)、13个残基的L2 (粗体)和RLN2的A链(desA1-4)，具有下述氨基酸序列：
Figure 244601DEST_PATH_IMAGE038
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物13，其包括VHH部分(带下划线)、(G4Q)5 L1 (斜体)、RLN2的A链(desA1-4)、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的B链(desB1)，具有下述氨基酸序列：
Figure 563587DEST_PATH_IMAGE039
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物14，其包括VHH部分(带下划线)、(PGPQ)8 L1 (斜体)、RLN2的A链(desA1-4)、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的B链(desB1)，具有下述氨基酸序列：
Figure 403367DEST_PATH_IMAGE040
或其药学上可接受的盐；
RLN类似物15，其包括VHH部分(带下划线)、(G4Q)5 L1 (斜体)、RLN2的B链(天然)、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的A链(天然)，具有下述氨基酸序列：
Figure 149606DEST_PATH_IMAGE041
或其药学上可接受的盐；和
RLN类似物16，其包括VHH部分(带下划线)、(PGPA)8 L1 (斜体)、RLN2的B链(天然)、10个残基的L2 (粗体)和RLN2的A链(天然)，具有下述氨基酸序列：
Figure 973206DEST_PATH_IMAGE042
或其药学上可接受的盐。
使用本领域已知的方法，包括例如以下实施例中描述的那些，可以测量本文所述RLN类似物的半衰期。同样地，使用本领域已知的用于测量结合亲和力的方法，例如在以下实施例中描述的那些，可以测量RLN类似物对不同物种的白蛋白的亲和力，并且通常表示为平衡解离常数(KD)值。此外，使用本领域已知的方法，包括例如下面描述的体外活性测定，可以测量RLN类似物对每种RXFP受体的活性，并且通常表示为EC50值。
作为上述修饰的结果，当施用于哺乳动物、尤其是人类时，本文所述RLN类似物具有比天然RLN、尤其是天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)更长的t½。如上面所指出的，本文中的VHH部分靶向血清白蛋白；因此，可以预期本文所述RLN类似物的t½与给其施用RLN类似物的物种的血清白蛋白的t½相似。在某些情况下，RLN类似物可以具有约1天至约31天、约5天至约25天、约10天至约20天或甚至约15天的t½。在其它情况下，RLN类似物可以具有约1天至约5天、约6天至约10天、约11天至约15天、约16天至约20天、约21至约25天或甚至约26至约31天的t½。在其它情况下，RLN类似物可以具有约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天或甚至约31天的t½。在特定情况下，当施用给人时，RLN类似物可以具有约20天的t½。
同样地，当施用给人时，本文所述RLN类似物对RXFP1受体的效能在例如天然人RLN2 (SEQ ID NO:5和6)的约10倍至约100倍内。
药物组合物和试剂盒
本文所述RLN类似物可以配制成药物组合物，其可以通过胃肠外途径（例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或透皮）施用。这样的药物组合物及其制备技术是本领域众所周知的。参见，例如，Remington, “The Science and Practice of Pharmacy”(D.B. Troy编,第21版, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。在特定情况下，皮下或静脉内施用RLN类似物。但是，可替换地，可以将RLN类似物配制成用于其它药学上可接受的途径的形式，例如，用于口服施用的片剂或其它固体，限时释放胶囊剂和目前使用的任何其它形式，包括乳膏剂、洗剂、吸入剂等。
如上面所指出的，且为了改善它们的体内相容性和有效性，本文所述RLN类似物可以与任何数目的无机和有机酸/碱反应以形成药学上可接受的酸/碱加成盐。药学上可接受的盐和制备它们的常用技术是本领域众所周知的(参见，例如，Stahl等人, “Handbook ofPharmaceutical Salts：Properties, Selection and Use”(第2次修订版，Wiley-VCH,2011))。用于本文的药学上可接受的盐包括钠盐、三氟乙酸盐、盐酸盐和乙酸盐。
本文所述RLN类似物可以由医师施用或使用注射剂自我施用。应当理解，本领域技术人员可以容易地确定规格尺寸和注射体积的量。但是，注射体积的量可以≤约2 mL或甚至≤约1 mL，并且针头规格可以≥约27 G或甚至≥约29 G。
本公开内容还提供并因此涵盖可用于合成本文所述RLN类似物或其药学上可接受的盐的新型中间体和方法。通过本领域众所周知的多种技术，可以制备中间体和RLN类似物。例如，在以下实施例中说明了使用重组合成的方法。所描述的每种技术的具体步骤可以以不同方式组合以制备RLN类似物。试剂和起始原料对于本领域技术人员来说是容易获得的。
本文所述RLN类似物通常在宽剂量范围内是有效的。RLN类似物或包含它们的药物组合物的示例性剂量可以是每千克(kg)个体的毫克(mg)或微克(µg)、纳克(ng)或皮克(pg)量。以此方式，每日剂量可以是约1 μg至约100 mg。
在这里，药物组合物中的RLN类似物的有效量可以是约0.25 mg至约5.0 mg的剂量。但是，本领域技术人员理解，在某些情况下，有效量（即剂量/用量）可能低于上述范围的下限并绰绰有余，而在其它情况下，有效量可能是更大的剂量并且可以在可接受的副作用下使用。
除了本文所述RLN类似物之外，药物组合物还可以包含至少一种另外的治疗剂，尤其是通常用作心血管、肺和肾病症、疾病和障碍的护理标准的治疗剂。
以此方式，药物组合物可以包括有效量的至少一种本文所述RLN类似物、药学上可接受的载体和任选的至少一种另外的治疗剂。例如，药物组合物可以包括有效量的SEQ IDNO:24的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:25的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:26的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQID NO:27的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:28的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:29的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:30的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:31的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:32的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:33的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:34的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:35的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:36的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:37的RLN类似物和药学上可接受的载体，有效量的SEQ ID NO:38的RLN类似物和药学上可接受的载体，或有效量的SEQ ID NO:39的RLN类似物和药学上可接受的载体。
可替换地，本文所述RLN类似物可以作为试剂盒的一部分提供。在某些情况下，试剂盒包括用于给个体施用至少一种RLN类似物(和任选的至少一种另外的治疗剂)的装置。在某些情况下，试剂盒包括用于施用至少一种RLN类似物(和任选的至少一种另外的治疗剂)的注射器和针头。在特定情况下，将RLN类似物(和任选的至少一种另外的治疗剂)预配制在注射器内的水溶液中。
制备和使用RLN类似物的方法
通过本领域已知的任何数量的标准重组DNA方法或标准化学肽合成方法，可以制备本文所述RLN类似物。关于重组DNA方法，可以使用标准重组技术构建具有编码RLN类似物的氨基酸序列的核酸序列的多核苷酸，将该多核苷酸掺入重组表达载体，并将该载体引入宿主细胞诸如细菌、酵母和哺乳动物细胞，以产生RLN类似物。参见，例如，Green &Sambrook, “Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(Cold Spring HarborLaboratory Press, 2012年第4版)。
关于重组DNA方法，可以通过使用重组DNA技术产生蛋白或前体蛋白分子来制备本文的化合物。DNA，包括cDNA和合成的DNA，可以是双链的或单链的，并且其中编码本文化合物的编码序列可能由于遗传密码的冗余或简并性而变化。简而言之，将编码本文化合物的DNA序列引入宿主细胞以产生化合物或其前体。宿主细胞可以是细菌细胞诸如大肠杆菌的K12或B株，真菌细胞诸如酵母细胞，或哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
将适当的宿主细胞用表达系统诸如表达载体瞬时或稳定转染或转化，以产生本文的化合物或其前体。表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。通常，表达载体将含有选择标志物例如四环素、新霉素、G418和二氢叶酸还原酶，以允许选择用期望的DNA序列转化的那些细胞。
可以使用、不使用或以不同方式组合本文描述的每个步骤的具体生物合成或合成步骤以制备本文的化合物。
关于化学肽合成方法，可以使用标准的手动或自动化固相合成程序。例如，自动化的肽合成仪可从例如Applied Biosystems (Foster City, CA)和Protein TechnologiesInc. (Tucson, AZ)商购获得。用于固相合成的试剂容易从商业来源获得。可以根据生产商的说明书使用固相合成仪阻断干扰基团、在反应过程中保护氨基酸、偶联、去保护和将未反应氨基酸加帽。制备合成的RLN的另外的细节可以参见美国专利号4,835,251和5,166,191。
本文所述RLN类似物的一种用途是用于治疗心血管病症、疾病和/或障碍。示例性的心血管病症、疾病和障碍包括但不限于急性心力衰竭、慢性心力衰竭、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、糖尿病、中风、高胆固醇血症、高血压、缺血、血管收缩和心室肥大。
本文所述RLN类似物的另一种用途是用于治疗肺病症、疾病和/或障碍。示例性的肺病症、疾病和障碍包括但不限于肺动脉高血压和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
本文所述RLN类似物的另一种用途是用于治疗肾病症、疾病和/或障碍。示例性的肾病症、疾病和障碍包括但不限于慢性肾脏疾病和糖尿病性肾病。
所述方法可以包括本文所述的步骤，并且这些步骤可以但不一定按照所述的顺序进行。但是，其它顺序也是可以想到的。此外，单个或多个步骤可以并行地和/或在时间上重叠地和/或单独地或以多次重复的步骤进行。此外，所述方法可以包括另外的、未指定的步骤。
因此，这样的方法可以包括选择具有心血管病症、疾病或障碍或易患它们的个体。可替换地，所述方法可以包括选择具有肺病症、疾病或障碍或易患它们的个体。可替换地，所述方法可以包括选择具有肾病症、疾病或障碍或易患它们的个体。在某些情况下，所述方法可以包括选择是糖尿病患者、伴有肾功能损伤的高血压患者和/或肥胖症患者的个体。
所述方法也可以包括给个体施用有效量的至少一种本文所述RLN类似物，其可以是也如本文所述的药物组合物的形式。在某些情况下，RLN类似物/药物组合物可以包含另外的治疗剂，诸如抗凝血剂、ACE抑制剂、ARB、ARNI、β-阻滞剂、利尿剂、毛地黄、地高辛、肼屈嗪/硝酸异山梨酯、MRA或其它醛固酮拮抗剂、SGLT2抑制剂、抑制素和/或抗血糖剂，以及用于控制并存病（包括但不限于，高胆固醇、高血压、心房颤动和糖尿病）的其它治疗剂。
在本文别处讨论RLN类似物和任选的另外的治疗剂的浓度/剂量/用量。
关于施用途径，RLN类似物或包含其的药物组合物可以按照已知方法施用，例如口服；通过注射（即，动脉内、静脉内、腹膜内、大脑内、脑室内、肌肉内、眼内、门静脉内或病灶内）；通过持续释放系统，或通过植入装置。在某些情况下，可以通过快速推注或连续地皮下施用RLN类似物或包含其的药物组合物。
关于给药频率，可以每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次(即，每周)、每两周（即，每隔一周）或每月施用RLN类似物或包含其的药物组合物。在某些情况下，每隔一天皮下、每周三次皮下、每周两次皮下、每周一次皮下、每隔一周皮下或每月皮下施用RLN类似物或包含其的药物组合物。在特定情况下，每周一次(QW)皮下施用RLN类似物或包含其的药物组合物。
关于其中将RLN类似物或包含其的药物组合物与有效量的至少一种另外的治疗剂组合施用的那些情况，另外的治疗剂可以与RLN类似物或包含其的药物组合物同时、分开或依次施用。
此外，可以以与RLN类似物或包含其的药物组合物相同的频率(即，每隔一天、每周两次或甚至每周)施用另外的治疗剂。可替换地，可以以与RLN类似物或包含其的药物组合物不同的频率施用另外的治疗剂。在其它情况下，可以皮下施用另外的治疗剂。在其它情况下，可以静脉内施用另外的治疗剂。在其它情况下，可以口服施用另外的治疗剂。
进一步考虑，所述方法可以与饮食和锻炼结合，和/或可以与除上述那些之外的另外的治疗剂组合。
实施例
提供以下非限制性实施例用于举例说明而非限制的目的。
多肽表达
实施例1：RLN类似物1的重组表达
实施例1是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 954937DEST_PATH_IMAGE043
Figure 180382DEST_PATH_IMAGE044
。
在这里，使用CHOK1细胞衍生物在哺乳动物细胞表达系统中产生SEQ ID NO:24的RLN类似物。将编码SEQ ID NO:24的cDNA序列亚克隆到含有GS的表达质粒主链(基于pEE12.4的质粒)中。cDNA序列与信号肽序列METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO:44)的编码序列发生框架内融合以增强RLN类似物向组织培养基中的分泌。该表达由病毒CMV启动子驱动。
为了通过瞬时转染生成RLN类似物，使用基于PEI的方法用重组表达质粒转染CHOK1细胞。简而言之，将密度为4 x 106个细胞/mL的适当体积的CHOK1悬浮细胞转移到摇瓶中，并将PEI和重组质粒DNA加入细胞中。将细胞在悬浮培养物中在32℃温育6天。在温育时段结束时，通过低速离心除去细胞，并从条件培养基中纯化RLN类似物蛋白。
可替换地，并且为了通过稳定转染产生RLN类似物，使用电穿孔和适当量的重组表达质粒稳定转染CHOK1细胞，并将转染的细胞以适当细胞密度维持在悬浮培养物中。通过在25µM含有MSX的无血清培养基中生长并在约35℃-37℃和约5%-7%CO2下温育来完成转染的细胞的选择。
将RLN类似物从CHO细胞分泌到培养基中，所述RLN类似物通过蛋白A亲和色谱法和随后的离子交换和疏水相互作用色谱法或尺寸排阻色谱法进行纯化。具体而言，将来自收获的培养基的RLN类似物捕获到Mab Select Protein A树脂(GE)上。然后将树脂用运行缓冲液诸如磷酸盐-缓冲盐水(PBS；pH 7.4)或含有Tris的缓冲液短暂洗涤，以除去非特异性结合的物质。用低pH溶液，诸如10 mM柠檬酸pH 3，从树脂洗脱蛋白。将含有RLN类似物的级分合并，并可以保持在低pH以灭活潜在的病毒。通过加入碱诸如0.1 M Tris pH 8.0，可以中和pH。使用树脂诸如Poros 50 HS (ThermoFisher)，通过离子交换色谱法可以进一步纯化RLN类似物。使用在20 mM NaOAc（pH 5.0）中的0-500 mM NaCl梯度经15个柱体积从柱洗脱RLN类似物。
可以使用Capto Phenyl ImpRes HIC柱(GE Healthcare)通过疏水相互作用色谱法进一步纯化RLN类似物。通过将柱装载溶液调节至约0.5 M硫酸钠并使用10个CV的在20mM Tris pH 8溶液中的从0.5 M至0 M硫酸钠的梯度洗脱进行纯化。在HIC后，甚至可以通过SEC进一步纯化RLN类似物，其中将浓缩的Capto Phenyl ImpRes合并物加载到Superdex200(GE Healthcare)上，在PBS pH 7.4中或在20 mM组氨酸、50mM NaCl pH 6.0中等度洗脱。
可以将纯化的RLN类似物通过病毒截留过滤器，诸如Planova 20N (Asahi KaseiMedical)，然后在再生纤维素膜(Millipore)上使用切向流超滤浓缩/渗滤到20 mM组氨酸、20 mM NaCl pH 6中。
因此，以这种方式或以本领域技术人员容易确定的类似方式制备RLN类似物。
实施例2：RLN类似物2的重组表达
实施例2是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 97522DEST_PATH_IMAGE045
Figure 142839DEST_PATH_IMAGE046
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:25的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:25的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例3：RLN类似物3的重组表达
实施例3是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 538048DEST_PATH_IMAGE047
Figure 493366DEST_PATH_IMAGE048
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:26的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:26的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例4：RLN类似物4的重组表达
实施例4是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 581407DEST_PATH_IMAGE049
Figure 114020DEST_PATH_IMAGE050
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:27的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:27的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例5：RLN类似物5的重组表达
实施例5是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 765450DEST_PATH_IMAGE051
Figure 434329DEST_PATH_IMAGE052
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:28的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:28的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例6：RLN类似物6的重组表达
实施例6是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 427693DEST_PATH_IMAGE053
Figure 854126DEST_PATH_IMAGE054
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:29的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:29的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例7：RLN类似物7的重组表达
实施例7是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 856717DEST_PATH_IMAGE055
Figure 380102DEST_PATH_IMAGE056
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:30的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:30的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例8：RLN类似物8的重组表达
实施例8是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 544367DEST_PATH_IMAGE057
Figure 441785DEST_PATH_IMAGE058
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:31的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:31的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例9：RLN类似物9的重组表达
实施例9是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 982488DEST_PATH_IMAGE059
Figure 360379DEST_PATH_IMAGE060
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:32的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:32的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例10：RLN类似物10的重组表达
实施例10是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 757863DEST_PATH_IMAGE061
Figure 221205DEST_PATH_IMAGE062
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:33的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:33的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例11：RLN类似物11的重组表达
实施例11是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 565599DEST_PATH_IMAGE063
Figure 204522DEST_PATH_IMAGE064
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:34的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:34的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例12：RLN类似物12的重组表达
实施例12是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 976169DEST_PATH_IMAGE065
Figure 926807DEST_PATH_IMAGE066
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:35的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:35的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例13：RLN类似物13的重组表达
实施例13是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 74892DEST_PATH_IMAGE067
Figure 427375DEST_PATH_IMAGE068
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:36的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:36的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例14：RLN类似物14的重组表达
实施例14是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 369924DEST_PATH_IMAGE069
Figure 73438DEST_PATH_IMAGE070
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:37的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:37的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例15：RLN类似物15的重组表达
实施例15是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 149847DEST_PATH_IMAGE071
Figure 356837DEST_PATH_IMAGE072
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:38的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:38的cDNA序列用在表达质粒中。
实施例16：RLN类似物16的重组表达
实施例16是具有以下氨基酸序列的RLN类似物：
Figure 735866DEST_PATH_IMAGE073
Figure 926676DEST_PATH_IMAGE074
。
在这里，基本上如关于实施例1所述产生SEQ ID NO:39的RLN类似物，除了将编码SEQ ID NO:39的cDNA序列用在表达质粒中。
体外功能
实施例17: 通过SPR进行的RLN类似物白蛋白结合
通过SPR确定RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的体外结合。具体地，实施例1-14的RLN类似物对这些物种的血清白蛋白的亲和力总结在下面表1-14中。
在Biacore 8K仪器上进行实施例1-14的RLN类似物与各种血清白蛋白的结合。根据生产商的说明书(Amine Coupling Kit BR-1000-50)将血清白蛋白固定到S系列传感器芯片CM5表面。简而言之，通过以10µL/min注射70µL含有75 mg/mL EDC和11.5 mg/mL NHS的混合物，活化在传感器芯片表面(流动池1和2)上的羧基基团。将人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白以0.5、0.5、2.2、0.6、0.6、0.8、0.6和0.3 μg/mL在10 mM醋酸钠pH4.0 (BR-1003-49)中稀释，然后以10µL/min注射到活化的芯片表面(流动池2, 通道1-8)上180秒(人、小鼠、大鼠、猪和牛血清白蛋白得自Sigma Aldrich (St. Louis, MO)；食蟹猴血清白蛋白得自Hölzel Diagnostika (Cologne，德国)；狗血清白蛋白得自MolecularInnovations (Novi, MI)；和兔血清白蛋白得自Fitzgerald Industries Intl. (Acton,MA))。将各种血清白蛋白通过游离胺共价地固定到羧甲基葡聚糖包被的传感器芯片CM5上，目标表面密度为约100 (62-145) RU。通过注射70µL 1 M ETA HCl-NaOH pH 8.5，使表面（流动池1和2）上的过量反应基团失活。
将实施例1-14的RLN类似物以1000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.12、1.37、0.457、0.152、0.051和0.017 nM的浓度在HBS-EP+ 缓冲液(10 mM HEPES pH 7.6, 150 mMNaCl, 3 mM EDTA, 0.05%聚山梨酯20)中稀释。将150 μl样品单独地依次注射经过在芯片表面上固定化的血清白蛋白，并在25℃以50 μL/min流速解离600秒。通过以50 μL/min注射10 mM甘氨酸-HCl pH 1.5 (BR-1003-54) 100秒使表面再生。使用Biacore 8K Insight评价软件（版本2.0.15.12933）1:1结合动力学模型拟合分析所得的传感图，以计算结合动力学参数结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡解离常数(KD)。
表1：在25℃实施例1的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 416563DEST_PATH_IMAGE075
。
使用实施例1的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.1、0.5、3.3、2.1、7.1、1.2和37 nM。
表2：在25℃实施例2的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 743639DEST_PATH_IMAGE076
。
使用实施例2的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.1、0.45、3.8、3.0、8.0、1.4和50 nM。
表3：在25℃实施例3的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 903356DEST_PATH_IMAGE077
。
使用实施例3的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.08、0.36、2.4、1.6、4.8、0.7和26 nM。
表4：在25℃实施例4的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 581462DEST_PATH_IMAGE078
。
使用实施例4的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.09、0.42、3.0、2.1、6.2、1.0和37 nM。
表5：在25℃实施例5的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 875040DEST_PATH_IMAGE079
。
使用实施例5的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.45、1.8、14、10、23、4.7和120 nM。
表6：在25℃实施例6的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 56623DEST_PATH_IMAGE080
。
使用实施例6的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.51、2.3、12、9.7、24、4.1和130 nM。
表7：在25℃实施例7的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 777454DEST_PATH_IMAGE081
。
使用实施例7的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.06、0.29、2.1、1.4、3.7、0.69和25 nM。
表8：在25℃实施例8的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 801911DEST_PATH_IMAGE082
。
使用实施例8的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.08、0.32、1.8、1.7、4.1、0.66和21 nM。
表9：在25℃实施例9的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 633601DEST_PATH_IMAGE083
。
使用实施例9的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.19、0.86、9.5、8.2、14、3.8和84 nM。
表10：在25℃实施例10的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 200848DEST_PATH_IMAGE084
。
使用实施例10的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.37、1.5、9.7、7.8、20、3.4和100 nM。
表11：在25℃实施例11的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 827002DEST_PATH_IMAGE085
。
使用实施例11的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.17、0.48、3.6、1.3、7.3、1.3和27 nM。
表12：在25℃实施例12的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 214121DEST_PATH_IMAGE086
。
使用实施例12的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.14、0.47、2.6、1.7、4.2、0.77和30 nM。
表13：在25℃实施例13的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 724868DEST_PATH_IMAGE087
。
使用实施例13的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.14、0.49、2.6、2.0、5.0、0.92和29 nM。
表14：在25℃实施例14的RLN类似物与人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗、牛和兔血清白蛋白的结合动力学
Figure 146622DEST_PATH_IMAGE088
。
使用实施例14的RLN类似物，对于人、食蟹猴、小鼠、大鼠、猪、狗和牛血清白蛋白结合，KD分别确定为0.16、0.61、3.1、2.2、6.0、1.1和34 nM。
实施例18:RLN类似物对RXFP1和RXFP2受体的体外效能
生成CHO-CRE-Luc细胞系：将CHO-K1细胞(ATCC)在含有5%FBS和20 mM HEPES、40 µg/mL L-脯氨酸、1x抗生素的DMEM-F12 3:1中培养，每2-3天用TrypLE™ Express (Gibco)1:5分割。根据生产商的说明书，用pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] (Promega)和Fugene HD(Promega)的质粒DNA转染细胞。将转染的细胞用1 mg/mL的潮霉素B选择3-4周。通过有限稀释克隆到96-孔平板中得到克隆系，并通过用Bright-Glo Reagent (Promega)的萤光素酶测定用forskolin应答进行确认。将克隆扩增，收获，重新悬浮在冷冻介质中，等分到冷冻小瓶中，并保存在液氮中用于长期贮存。选择具有最佳forskolin应答(信号与背景之比)的顶部应答者克隆系# 2B6，用于随后的人RXFP1和RXFP2受体转染。
产生CHO人RXFP1和人RXFP2表达细胞系：将CHO-CRE-Luc系# 2B6细胞在含有5%FBS和20 mM HEPES、40 µg/mL L-脯氨酸、1x抗生素、1 mg/mL潮霉素B的DMEM-F12 3:1中培养，每2-3天用TrypLE Express (Gibco) 1:5分割。根据生产商的说明书，用人RXFP1受体或人RXFP2受体和Fugene HD (Promega)的质粒DNA转染细胞。将转染的细胞用潮霉素B (1 mg/mL)和嘌呤霉素(6 µg/mL)选择3-4周。通过有限稀释克隆到96-孔平板中得到克隆系。通过人RLN2应答确认克隆系。将克隆扩增，收获，重新悬浮在冷冻介质中，等分到冷冻小瓶中，并在液氮下冷冻保存用于长期贮存。选择对人RLN2具有最佳应答(信号与背景之比)的克隆系用于测定验证。
人RXFP1和RXFP2受体萤光素酶测定：用选择培养基(DMEM-F12 3:1，含有5%FBS和20 mM HEPES、40 µg/mL L-脯氨酸、1x抗生素、6 µg/mL嘌呤霉素、1 mg/mL潮霉素B)培养表达人RXFP1或人RXFP2的CHO细胞系。在第1天(cAMP CRE萤光素酶报告测定前一天)，将细胞用PBS洗涤一次，用细胞解离溶液(不含酶的细胞解离溶液, GIBCO目录号13151-014:TrypLE™ Express = 30:1)从烧瓶取出，并重新悬浮在铺板培养基(DMEM-F12 3:1，含有20mM HEPES、1x抗生素、0.5%FBS)中。将细胞以20,000个细胞/0.1 mL/孔在96-孔板(Falcon目录号353219)中铺板。将细胞在37℃5%CO2下培养过夜。在第1天(cAMP CRE萤光素酶报告测定当天)，将培养基取出并用90µL无血清培养基(DMEM-F12 3:1，含有20 mM HEPES、1x抗生素)替换。将平板在37℃温育2小时，然后加入10µL的10x配体(RLN2, 最终1x)。将平板在37℃温育另外4小时。温育时段结束以后，使平板达到室温保持15 min。然后，将50µL Bright-Glo™加入每个孔中，并将平板在Biotek Neo2读数器上用Gen5软件读出。
数据的统计分析：将数据从Biotek Neo2读数器输入到GraphPad Prism®软件(GraphPad Software, LLC; La Jolla, CA; version 7)中。通过可变斜率-四参数剂量响应曲线分析产生EC50值。
表15: RLN类似物对RXPF1和RXPF2受体的体外效能
Figure 209256DEST_PATH_IMAGE089
。
体内功能
实施例19：RLN类似物在雄性Sprague Dawley大鼠中的药代动力学
以1.0 mL/kg的体积，在His-NaCl缓冲液(pH 6.0)中给雄性Sprague Dawley大鼠施用200 nmol/kg的RLN类似物的单次皮下剂量。在给药后3、6、12、24、48、72、96、120、144、168和240小时收集血液用于药代动力学表征。
在Eli Lilly and Company通过合格的LC/MS方法确定RLN类似物的血浆浓度。使用人RLN抗体从100%大鼠血浆提取实施例化合物和类似物内标，随后使用Q-Exactive™Orbitrap®质谱仪检测N-端胰蛋白酶肽。
实施例4和7的RLN类似物的数据提供在下面表16中。
表16：在给雄性Sprague Dawley大鼠单次200 nmol/kg皮下剂量后RLN类似物的平均血浆药代动力学参数
Figure 83671DEST_PATH_IMAGE090
注：缩写：t½= 半衰期，Tmax = 达到最大浓度的时间，Cmax = 观察到的最大血浆浓度，AUC0-inf = 从时间0小时至无穷大的曲线下面积，CL/F = 清除率/生物利用度，N = 3只动物/组/时间点。
如在表16中所示，实施例4和7的RLN类似物在Sprague Dawley大鼠中表现出延长的药代动力学特性。
实施例20：在雄性Sprague Dawley大鼠中静脉内施用后RLN类似物对肾血流量的体内影响
在实验开始之前，将雄性5周龄Sprague Dawley大鼠(Charles RiverLaboratories, Inc.)在动物饲养所中以正常的光照/黑暗周期圈养1周。然后基于体重将大鼠随机分入以下治疗组：媒介物(20 mM His/20 mM NaCl, pH 6.0缓冲液)和实施例7的RLN类似物。如下给药RLN类似物：2.44 µg/kg静脉内推注然后0.36 µg/kg/hr静脉内输注，8.13 µg/kg静脉内推注然后1.2 µg/kg/hr静脉内输注，24.4 µg/kg静脉内推注然后3.6 µg/kg/hr静脉内输注，和81.3 µg/kg静脉内推注然后11.9 µg/kg/hr静脉内输注。
为了测量RLN类似物对肾血流量的影响，将大鼠用乌拉坦(1.2 g/kg，腹膜内)麻醉并准备用于腹部/肾超声成像和肾动脉脉冲波多普勒血流量测量(VisualSonics, ModelVevo 3100超声系统; Fujifilm)。放置慢性尾静脉导管用于静脉内推注和输注施用。在30-min顺应期以后，获取基线和给药开始后3小时的肾血流量测量值。
表17：静脉内施用的RLN类似物对健康大鼠的肾血流量的影响
Figure 991584DEST_PATH_IMAGE091
注：将结果表示为平均值±SD，†显著不同于基线p<0.001 ANOVA，* 显著不同于媒介物p<0.001 ANOVA，N = 5/治疗组。
如在表17中所见，在8.13 µg/kg静脉内推注然后1.2 µg/kg/hr静脉内输注、24.4µg/kg静脉内推注然后3.6 µg/kg/hr静脉内输注以及81.3 µg/kg静脉内推注然后11.9 µg/kg/hr静脉内输注治疗的组中，在暴露3小时以后，实施例7的RLN类似物使肾血流量显著增加了26.6%、48.8%和60.4%。
实施例21：在雄性Sprague Dawley大鼠中皮下施用后RLN类似物对肾血流量的体内影响
在实验开始之前，将雄性5周龄Sprague Dawley大鼠(Charles RiverLaboratories, Inc.)在动物饲养所中以正常的光照/黑暗周期圈养1周。然后基于体重将大鼠随机分入以下治疗组：媒介物(20 mM His/20 mM NaCl, pH 6.0缓冲液)和实施例7的RLN类似物。以180 µg/kg皮下给药RLN类似物。
为了测量RLN类似物对肾血流量的影响，在给药后48小时，将大鼠用乌拉坦(1.2g/kg，腹膜内)麻醉并准备用于腹部/肾超声成像和肾动脉脉冲波多普勒血流量测量(VisualSonics, Model Vevo 3100超声系统; Fujifilm)。在30-min顺应期以后，获取肾血流量测量值。
表18：皮下施用的RLN类似物对健康大鼠的肾血流量的影响
化合物和剂量 肾血流量(mL/min) 从媒介物的变化百分比(%)
5 mL/kg的媒介物 8.51±0.33 --
180 μg/kg的实施例7 11.27±0.81* 32.4
注：将结果表示为平均值±SD，* 显著不同于媒介物p<0.001 ANOVA，N = 10/治疗组。
如在表18中所见，在暴露于180 µg/kg的皮下剂量48小时以后，实施例7的RLN类似物显著增加肾血流量。
序列
在本公开内容中提及下述核酸和/或氨基酸序列并提供在下面供参考。
SEQ ID NO:1 - 人RLN1原
Figure 392478DEST_PATH_IMAGE092
SEQ ID NO:2 - 人RLN1 A链
Figure 626013DEST_PATH_IMAGE093
SEQ ID NO:3 - 人RLN1 B链
Figure 987725DEST_PATH_IMAGE094
SEQ ID NO:4 - 人RLN2原
Figure 964908DEST_PATH_IMAGE095
SEQ ID NO:5 - 人RLN2 A链
Figure 971041DEST_PATH_IMAGE096
SEQ ID NO:6 - 人RLN2 B链
Figure 375478DEST_PATH_IMAGE097
SEQ ID NO:7 - 人RLN3原
Figure 224485DEST_PATH_IMAGE098
SEQ ID NO:8 - 人RLN3 A链
Figure 5359DEST_PATH_IMAGE099
SEQ ID NO:9 - 人RLN3 B链
Figure 725053DEST_PATH_IMAGE100
SEQ ID NO:10 - VHH部分#1 (C22)
Figure 425025DEST_PATH_IMAGE101
SEQ ID NO:11 - VHH部分#2 (C22.43)
Figure 761329DEST_PATH_IMAGE102
SEQ ID NO:12 - VHH部分#3 (C80)
Figure 80314DEST_PATH_IMAGE103
SEQ ID NO:13 - VHH部分#4 (C80.43)
Figure 185674DEST_PATH_IMAGE104
SEQ ID NO:14 - L1 ((GGGGQ)n的基础序列)
Figure 666334DEST_PATH_IMAGE105
SEQ ID NO:15 - L1 ((GGGQ)n的基础序列)
Figure 365299DEST_PATH_IMAGE106
SEQ ID NO:16 - L1 ((GGGGS)n的基础序列)
Figure 222397DEST_PATH_IMAGE107
SEQ ID NO:17 - L1 ((PGPQ)n的基础序列)
Figure 182263DEST_PATH_IMAGE108
SEQ ID NO:18 - L1 ((PGPA)n的基础序列)
Figure 364982DEST_PATH_IMAGE109
SEQ ID NO:19 - L1 #1 ((GGGGQ)5)
Figure 144719DEST_PATH_IMAGE110
SEQ ID NO:20 - L1 #2 ((PGPQ)8)
Figure 930142DEST_PATH_IMAGE111
SEQ ID NO:21 - L1 #3 (PGPA)8
Figure 10093DEST_PATH_IMAGE112
SEQ ID NO:22 - L2 #1
Figure 35818DEST_PATH_IMAGE113
SEQ ID NO:23 - L2 #2
Figure 302851DEST_PATH_IMAGE114
SEQ ID NO:24 - RLN2类似物#1 (C22-(G4Q)5-A10B(desB1)RLN)
Figure 501751DEST_PATH_IMAGE115
SEQ ID NO:25 - RLN2类似物#2 (C22-(PGPA)8-A10B(desB1)RLN)
Figure 92002DEST_PATH_IMAGE116
SEQ ID NO:26 - RLN2类似物#3 (C22-(G4Q)5-B10A(desB1)RLN)
Figure 85365DEST_PATH_IMAGE117
SEQ ID NO:27 - RLN2类似物#4 (C22-(PGPQ)8-B10A(desB1)RLN)
Figure 839695DEST_PATH_IMAGE118
SEQ ID NO:28 - RLN2类似物#5 (B10A(desB1)RLN-(G4Q)5-C22.43)
Figure 107865DEST_PATH_IMAGE119
SEQ ID NO:29 - RLN2类似物#6 (B10A(desB1)RLN-(PGPQ)8-C22.43)
Figure 631250DEST_PATH_IMAGE120
SEQ ID NO:30 - RLN2类似物#7 (C80-(G4Q)5-B10A(desB1)RLN)
Figure 61095DEST_PATH_IMAGE121
SEQ ID NO:31 - RLN2类似物#8 (C80-(PGPQ)8-B10A(desB1)RLN)
Figure 302720DEST_PATH_IMAGE122
SEQ ID NO:32 - RLN2类似物#9 (B10A(desB1)RLN-(G4Q)5-C80.43)
Figure 249948DEST_PATH_IMAGE123
SEQ ID NO:33 - RLN2类似物#10 (B10A(desB1)RLN-(PGPQ)8-C80.43)
Figure 893418DEST_PATH_IMAGE124
SEQ ID NO:34 - RLN2类似物#11 (C22-(G4Q)5-B13A(desB1, desA1-4)RLN)
Figure 228585DEST_PATH_IMAGE125
SEQ ID NO:35 - RLN2类似物#12 (C80-(G4Q)5-B13A(desB1, desA1-4)RLN)
Figure 613299DEST_PATH_IMAGE126
SEQ ID NO:36 - RLN2类似物#13 (C80-(G4Q)5-A10B(desB1, desA1-4)RLN)
Figure 692113DEST_PATH_IMAGE127
SEQ ID NO:37 - RLN2类似物#14 (C80-(PGPQ)8-A10B(desB1, desA1-4)RLN)
Figure 190091DEST_PATH_IMAGE128
SEQ ID NO:38 - RLN2类似物#15 (C22-(G4Q)5-B10ARLN)
Figure 227317DEST_PATH_IMAGE129
SEQ ID NO:39 - RLN2类似物#16 (C22-(PGPA)8-B10ARLN)
Figure 177955DEST_PATH_IMAGE130
SEQ ID NO:40 - 人RXFP1受体
Figure 60461DEST_PATH_IMAGE131
SEQ ID NO:41 - 人RXFP2受体
Figure 678524DEST_PATH_IMAGE132
SEQ ID NO:42 - 人RXFP3受体
Figure 886651DEST_PATH_IMAGE133
SEQ ID NO:43 - 人RXFP4受体
Figure 465531DEST_PATH_IMAGE134
SEQ ID NO:44 - 信号肽
Figure 886148DEST_PATH_IMAGE135
SEQ ID NO:45 - VHH部分#5 (MC6.1)
Figure 624297DEST_PATH_IMAGE136
SEQ ID NO:46 - VHH部分#6 (MC6.1C6)
Figure 3326DEST_PATH_IMAGE137
SEQ ID NO:47 - VHH部分#7 (C22-G26Y)
Figure 194136DEST_PATH_IMAGE138
SEQ ID NO:48 - VHH部分#8 (C22-R27A)
Figure 808657DEST_PATH_IMAGE139
SEQ ID NO:49 - VHH部分#9 (C22-I57E)
Figure 870154DEST_PATH_IMAGE140
SEQ ID NO:50 - VHH部分#10 (C22-I57Q)
Figure 420084DEST_PATH_IMAGE141
SEQ ID NO:51 - VHH部分#11 (C22-Y59A)
Figure 98190DEST_PATH_IMAGE142
SEQ ID NO:52 - VHH部分#12 (C22-Y59E)
Figure 391768DEST_PATH_IMAGE143
SEQ ID NO:53 - VHH部分#13 (C22-Y59Q)
Figure 901246DEST_PATH_IMAGE144
SEQ ID NO:54 - VHH部分#14 (C22-Y59S)
Figure 90919DEST_PATH_IMAGE145
SEQ ID NO:55 - VHH部分#15 (C22-Y59T)
Figure 990742DEST_PATH_IMAGE146
SEQ ID NO:56 - VHH部分#16 (C22-R102K)
Figure 88011DEST_PATH_IMAGE147
SEQ ID NO:57 - VHH部分#17 (C22-R102Q)
Figure 389680DEST_PATH_IMAGE148
SEQ ID NO:58 - VHH部分#18 (C22-R102S)
Figure 750254DEST_PATH_IMAGE149
SEQ ID NO:59 - VHH部分#19 (C22-P103E)
Figure 809477DEST_PATH_IMAGE150
SEQ ID NO:60 - VHH部分#20 (C22-P103Q)
Figure 179278DEST_PATH_IMAGE151
SEQ ID NO:61 - VHH部分#21 (C22-P103S)
Figure 69874DEST_PATH_IMAGE152
SEQ ID NO:62 - VHH部分#22 (C22-L104E)
Figure 866928DEST_PATH_IMAGE153
SEQ ID NO:63 - VHH部分#23 (C22-L104G)
Figure 6923DEST_PATH_IMAGE154
SEQ ID NO:64 - VHH部分#24 (C22-L104Q)
Figure 180415DEST_PATH_IMAGE155
SEQ ID NO:65 - VHH部分#25 (C22-L104T)
Figure 191096DEST_PATH_IMAGE156
SEQ ID NO:66 - VHH部分#26 (C22-S107E)
Figure 80424DEST_PATH_IMAGE157
SEQ ID NO:67 - L2 #3
Figure 176556DEST_PATH_IMAGE158
序列表
<110> Eli Lilly and Company
<120> 松弛素类似物及其使用方法
<130> X22483
<160> 67
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 185
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Pro Arg Leu Phe Leu Phe His Leu Leu Glu Phe Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Asn Gln Phe Ser Arg Ala Val Ala Ala Lys Trp Lys Asp Asp Val Ile
20 25 30
Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly
35 40 45
Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu Ser Gln Glu Asp Ala Pro Gln
50 55 60
Thr Pro Arg Pro Val Ala Glu Ile Val Pro Ser Phe Ile Asn Lys Asp
65 70 75 80
Thr Glu Thr Ile Ile Ile Met Leu Glu Phe Ile Ala Asn Leu Pro Pro
85 90 95
Glu Leu Lys Ala Ala Leu Ser Glu Arg Gln Pro Ser Leu Pro Glu Leu
100 105 110
Gln Gln Tyr Val Pro Ala Leu Lys Asp Ser Asn Leu Ser Phe Glu Glu
115 120 125
Phe Lys Lys Leu Ile Arg Asn Arg Gln Ser Glu Ala Ala Asp Ser Asn
130 135 140
Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Thr His Ser Gln Lys Lys
145 150 155 160
Arg Arg Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu Ile Gly Cys
165 170 175
Thr Lys Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys
180 185
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu Ile Gly Cys Thr Lys
1 5 10 15
Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys
20
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Val Ala Ala Lys Trp Lys Asp Asp Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu
1 5 10 15
Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 185
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Pro Arg Leu Phe Phe Phe His Leu Leu Gly Val Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Asn Gln Phe Ser Arg Ala Val Ala Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile
20 25 30
Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly
35 40 45
Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu Ser Gln Glu Asp Ala Pro Gln
50 55 60
Thr Pro Arg Pro Val Ala Glu Ile Val Pro Ser Phe Ile Asn Lys Asp
65 70 75 80
Thr Glu Thr Ile Asn Met Met Ser Glu Phe Val Ala Asn Leu Pro Gln
85 90 95
Glu Leu Lys Leu Thr Leu Ser Glu Met Gln Pro Ala Leu Pro Gln Leu
100 105 110
Gln Gln His Val Pro Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu Leu Phe Glu Glu
115 120 125
Phe Lys Lys Leu Ile Arg Asn Arg Gln Ser Glu Ala Ala Asp Ser Ser
130 135 140
Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Thr His Ser Arg Lys Lys
145 150 155 160
Arg Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys
165 170 175
Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
180 185
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr
1 5 10 15
Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
20
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser
20 25
<210> 7
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr
1 5 10 15
Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val
20 25 30
Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly
35 40 45
Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly
50 55 60
Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu
65 70 75 80
Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser
85 90 95
Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly
100 105 110
Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys
115 120 125
Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys
130 135 140
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser
1 5 10 15
Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys
20
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg
1 5 10 15
Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp
20 25
<210> 10
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Pro
115 120 125
<210> 12
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Pro
115 120 125
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Gln
1 5
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
Gly Gly Gly Gln
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
Pro Gly Pro Gln
1
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
Pro Gly Pro Ala
1
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln
20 25
<210> 20
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln
1 5 10 15
Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln
20 25 30
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 21
Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala
1 5 10 15
Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala
20 25 30
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 22
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 23
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 24
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys
145 150 155 160
Cys Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys Gly
165 170 175
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Met Glu Glu Val Ile
180 185 190
Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly
195 200 205
Met Ser Thr Trp Ser
210
<210> 25
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 25
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Gly
115 120 125
Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly
130 135 140
Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Gln Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg
165 170 175
Ser Leu Ala Arg Phe Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg
195 200 205
Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser
210 215 220
<210> 26
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu
145 150 155 160
Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser
165 170 175
Thr Trp Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu Tyr
180 185 190
Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser
195 200 205
Leu Ala Arg Phe Cys
210
<210> 27
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Gly
115 120 125
Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly
130 135 140
Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Ser Trp
145 150 155 160
Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln
165 170 175
Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His
195 200 205
Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
210 215 220
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 28
Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys
35 40 45
Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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195 200 205
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<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 29
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50 55 60
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65 70 75 80
Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Glu Val
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115 120 125
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130 135 140
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 30
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1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu
145 150 155 160
Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser
165 170 175
Thr Trp Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu Tyr
180 185 190
Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser
195 200 205
Leu Ala Arg Phe Cys
210
<210> 31
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
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130 135 140
Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Ser Trp
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Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 32
Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg
1 5 10 15
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Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
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100 105 110
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115 120 125
Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile
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210 215
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<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 33
Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys
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Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Glu Val
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100 105 110
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr Ala Val
115 120 125
Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Gly
130 135 140
Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
<210> 34
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 34
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu
145 150 155 160
Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser
165 170 175
Thr Trp Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
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195 200 205
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210
<210> 35
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu
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Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser
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195 200 205
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210
<210> 36
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 36
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
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115 120 125
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val
145 150 155 160
Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly
180 185 190
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195 200 205
Ser
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<211> 216
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 37
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
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Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
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Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Ala Leu
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<211> 214
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 38
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<210> 39
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 39
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100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Gly
115 120 125
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130 135 140
Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ala Asp Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys
195 200 205
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210 215 220
<210> 40
<211> 757
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Met Ser Leu Gln Trp Asn Leu Ile Arg Lys Leu Pro Pro Asp
130 135 140
Cys Phe Lys Asn Tyr His Asp Leu Gln Lys Leu Tyr Leu Gln Asn Asn
145 150 155 160
Lys Ile Thr Ser Ile Ser Ile Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Ser Leu
165 170 175
Thr Lys Leu Tyr Leu Ser His Asn Arg Ile Thr Phe Leu Lys Pro Gly
180 185 190
Val Phe Glu Asp Leu His Arg Leu Glu Trp Leu Ile Ile Glu Asp Asn
195 200 205
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210 215 220
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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420 425 430
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Ile Leu Ala Lys Arg Phe Phe Phe Ile Val Phe Thr Asp Ala Leu Cys
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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Glu Met Trp Pro Leu Gln Glu Met Pro Pro Glu Leu Met Lys Pro Asp
725 730 735
Leu Phe Thr Tyr Pro Cys Glu Met Ser Leu Ile Ser Gln Ser Thr Arg
740 745 750
Leu Asn Ser Tyr Ser
755
<210> 41
<211> 754
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Met Ile Val Phe Leu Val Phe Lys His Leu Phe Ser Leu Arg Leu Ile
1 5 10 15
Thr Met Phe Phe Leu Leu His Phe Ile Val Leu Ile Asn Val Lys Asp
20 25 30
Phe Ala Leu Thr Gln Gly Ser Met Ile Thr Pro Ser Cys Gln Lys Gly
35 40 45
Tyr Phe Pro Cys Gly Asn Leu Thr Lys Cys Leu Pro Arg Ala Phe His
50 55 60
Cys Asp Gly Lys Asp Asp Cys Gly Asn Gly Ala Asp Glu Glu Asn Cys
65 70 75 80
Gly Asp Thr Ser Gly Trp Ala Thr Ile Phe Gly Thr Val His Gly Asn
85 90 95
Ala Asn Ser Val Ala Leu Thr Gln Glu Cys Phe Leu Lys Gln Tyr Pro
100 105 110
Gln Cys Cys Asp Cys Lys Glu Thr Glu Leu Glu Cys Val Asn Gly Asp
115 120 125
Leu Lys Ser Val Pro Met Ile Ser Asn Asn Val Thr Leu Leu Ser Leu
130 135 140
Lys Lys Asn Lys Ile His Ser Leu Pro Asp Lys Val Phe Ile Lys Tyr
145 150 155 160
Thr Lys Leu Lys Lys Ile Phe Leu Gln His Asn Cys Ile Arg His Ile
165 170 175
Ser Arg Lys Ala Phe Phe Gly Leu Cys Asn Leu Gln Ile Leu Tyr Leu
180 185 190
Asn His Asn Cys Ile Thr Thr Leu Arg Pro Gly Ile Phe Lys Asp Leu
195 200 205
His Gln Leu Thr Trp Leu Ile Leu Asp Asp Asn Pro Ile Thr Arg Ile
210 215 220
Ser Gln Arg Leu Phe Thr Gly Leu Asn Ser Leu Phe Phe Leu Ser Met
225 230 235 240
Val Asn Asn Tyr Leu Glu Ala Leu Pro Lys Gln Met Cys Ala Gln Met
245 250 255
Pro Gln Leu Asn Trp Val Asp Leu Glu Gly Asn Arg Ile Lys Tyr Leu
260 265 270
Thr Asn Ser Thr Phe Leu Ser Cys Asp Ser Leu Thr Val Leu Phe Leu
275 280 285
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290 295 300
Lys Asn Leu Gly Glu Leu Asp Leu Ser Ser Asn Thr Ile Thr Glu Leu
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Ser Pro His Leu Phe Lys Asp Leu Lys Leu Leu Gln Lys Leu Asn Leu
325 330 335
Ser Ser Asn Pro Leu Met Tyr Leu His Lys Asn Gln Phe Glu Ser Leu
340 345 350
Lys Gln Leu Gln Ser Leu Asp Leu Glu Arg Ile Glu Ile Pro Asn Ile
355 360 365
Asn Thr Arg Met Phe Gln Pro Met Lys Asn Leu Ser His Ile Tyr Phe
370 375 380
Lys Asn Phe Arg Tyr Cys Ser Tyr Ala Pro His Val Arg Ile Cys Met
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Asn Leu Phe Val Ile Gly Met Arg Ser Phe Ile Lys Ala Glu Asn Thr
435 440 445
Thr His Ala Met Ser Ile Lys Ile Leu Cys Cys Ala Asp Cys Leu Met
450 455 460
Gly Val Tyr Leu Phe Phe Val Gly Ile Phe Asp Ile Lys Tyr Arg Gly
465 470 475 480
Gln Tyr Gln Lys Tyr Ala Leu Leu Trp Met Glu Ser Val Gln Cys Arg
485 490 495
Leu Met Gly Phe Leu Ala Met Leu Ser Thr Glu Val Ser Val Leu Leu
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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Tyr Tyr Asp Gln Thr Glu Asp Ile Gly Ser Lys Gly Tyr Ser Leu Gly
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610 615 620
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625 630 635 640
Phe Phe Ile Val Phe Ser Asp Ala Ile Cys Trp Ile Pro Val Phe Val
645 650 655
Val Lys Ile Leu Ser Leu Phe Arg Val Glu Ile Pro Asp Thr Met Thr
660 665 670
Ser Trp Ile Val Ile Phe Phe Leu Pro Val Asn Ser Ala Leu Asn Pro
675 680 685
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690 695 700
Leu Leu His Lys His Gln Arg Lys Ser Ile Phe Lys Ile Lys Lys Lys
705 710 715 720
Ser Leu Ser Thr Ser Ile Val Trp Ile Glu Asp Ser Ser Ser Leu Lys
725 730 735
Leu Gly Val Leu Asn Lys Ile Thr Leu Gly Asp Ser Ile Met Lys Pro
740 745 750
Val Ser
<210> 42
<211> 469
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Met Gln Met Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ala Thr Met Asn Lys Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Asp Lys Leu Ala Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Asp Leu Leu
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Glu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Asn Ala Ser Leu Gln Leu Pro Asp Leu
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Asp Gly Ala Pro Pro Gly His
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Pro Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Ala Asp Thr Glu Ala Arg Val
65 70 75 80
Arg Ile Leu Ile Ser Val Val Tyr Trp Val Val Cys Ala Leu Gly Leu
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Asp Phe Lys Trp Pro Phe Gly Lys Ala Met Cys Lys Ile Val Ser Met
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Val Thr Ser Met Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Phe Leu Thr Ala Met
165 170 175
Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg
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Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp
195 200 205
Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu
210 215 220
Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys
225 230 235 240
Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu
245 250 255
Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val
260 265 270
Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu
275 280 285
Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly
290 295 300
Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg
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Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe
325 330 335
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340 345 350
Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val
355 360 365
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370 375 380
Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu
385 390 395 400
Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg
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Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Pro Thr Leu Asn Thr Ser Ala Ser Pro Pro Thr Phe Phe Trp Ala
1 5 10 15
Asn Ala Ser Gly Gly Ser Val Leu Ser Ala Asp Asp Ala Pro Met Pro
20 25 30
Val Lys Phe Leu Ala Leu Arg Leu Met Val Ala Leu Ala Tyr Gly Leu
35 40 45
Val Gly Ala Ile Gly Leu Leu Gly Asn Leu Ala Val Leu Trp Val Leu
50 55 60
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Phe Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Gly Leu Ala Leu Thr Leu Pro Phe
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100 105 110
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115 120 125
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Ala Thr Leu Ala Val Trp Ala Ala Ala Ala Leu Val Thr Val Pro Thr
165 170 175
Ala Val Phe Gly Val Glu Gly Glu Val Cys Gly Val Arg Leu Cys Leu
180 185 190
Leu Arg Phe Pro Ser Arg Tyr Trp Leu Gly Ala Tyr Gln Leu Gln Arg
195 200 205
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210 215 220
Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Gln Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Asp
225 230 235 240
Ser Arg Val Val Ala Arg Ser Val Arg Ile Leu Val Ala Ser Phe Phe
245 250 255
Leu Cys Trp Phe Pro Asn His Val Val Thr Leu Trp Gly Val Leu Val
260 265 270
Lys Phe Asp Leu Val Pro Trp Asn Ser Thr Phe Tyr Thr Ile Gln Thr
275 280 285
Tyr Val Phe Pro Val Thr Thr Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu
290 295 300
Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Leu Arg Arg Glu Pro Arg Gln Ala Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Phe Arg Asp Leu Arg Leu Arg Leu Trp Pro Gln Gly Gly
325 330 335
Gly Trp Val Gln Gln Val Ala Leu Lys Gln Val Gly Arg Arg Trp Val
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355 360 365
Asp Arg Gly Thr Pro Gly
370
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 44
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 45
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 45
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Ser Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Arg Asp Ala Asn Leu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 46
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Ser Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Arg Val Ala Asn Leu
100 105 110
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<211> 126
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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115 120 125
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<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 49
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
<210> 50
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 50
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1 5 10 15
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20 25 30
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<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 51
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
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Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 52
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<211> 126
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 53
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<210> 54
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 54
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 55
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<211> 126
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 56
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Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 57
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 57
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
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85 90 95
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Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 58
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 59
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 59
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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Ala Ala Arg Pro Gly Arg Glu Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
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Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 60
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Gln Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 61
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 61
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Ser Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 62
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 62
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Glu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 63
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Gly Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 64
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Gln Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 65
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 65
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Thr Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 66
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Glu Lys Val Ala Asp Leu
100 105 110
Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 67
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10

Claims (47)

1.包含以下结构的化合物或其药学上可接受的盐：
VHH-L1-A-L2-B，
VHH-L1-B-L2-A，
A-L2-B-L1-VHH，或者
B-L2-A-L1-VHH，
其中VHH包含选自SEQ ID NO:10、11、12和13的氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列，
其中A是松弛素A链，其包含选自SEQ ID NO:2、5和8的氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列，
其中B是松弛素B链，其包含选自SEQ ID NO:3、6和9的氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列，
其中L1是第一接头，其包含选自(GGGGQ)n (SEQ ID NO:14)、(PGPQ)n (SEQ ID NO:17)和(PGPA)n (SEQ ID NO:18)的氨基酸序列，且其中n可以是1-10，且
其中L2是第二接头，其包含选自SEQ ID NO:22、23和67的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的化合物，其中A是SEQ ID NO:2。
3.权利要求1或2所述的化合物，其中B是SEQ ID NO:3。
4.权利要求1所述的化合物，其中A是SEQ ID NO:5。
5.权利要求1或2所述的化合物，其中B是SEQ ID NO:6。
6.权利要求1所述的化合物，其中A是SEQ ID NO:5且缺少前四个氨基酸(desA1-4)。
7.权利要求1所述的化合物，其中B是SEQ ID NO:6且缺少第一个氨基酸(desB1)。
8.权利要求1所述的化合物，其中A是SEQ ID NO:5且缺少前四个氨基酸(desA1-4)，且其中B是SEQ ID NO:6且缺少第一个氨基酸(desB1)。
9.权利要求1所述的化合物，其中A是SEQ ID NO:8。
10.权利要求1或2所述的化合物，其中B是SEQ ID NO:9。
11.权利要求1-10中的任一项所述的化合物，其中L1是SEQ ID NO:19。
12.权利要求1-10中的任一项所述的化合物，其中L1是SEQ ID NO:20。
13.权利要求1-10中的任一项所述的化合物，其中L1是SEQ ID NO:21。
14.化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物包含选自SEQ ID NO:24至39的氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列。
15.化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物基本上由选自SEQ ID NO:24至39的氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列组成。
16.化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物由选自SEQ ID NO:24至39的氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列组成。
17.药物组合物，其包含：
权利要求1-16中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐；和
药学上可接受的缓冲液。
18.治疗个体的心脏、肺和/或肾病症、疾病和/或障碍的方法，所述方法包括下述步骤：
给所述个体施用有效量的权利要求1-16中的任一项所述的化合物或权利要求17所述的药物组合物。
19.权利要求1-16中的任一项所述的化合物，用于治疗。
20.权利要求1-16中的任一项所述的化合物，用于治疗心脏、肺和/或肾病症、疾病和/或障碍。
21.权利要求1-16中的任一项所述的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗心脏、肺和/或肾病症、疾病和/或障碍。
22.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 52151DEST_PATH_IMAGE002
。
23.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 969291DEST_PATH_IMAGE004
。
24.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 317403DEST_PATH_IMAGE006
。
25.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 712612DEST_PATH_IMAGE008
。
26.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
Figure 792564DEST_PATH_IMAGE010
。
27.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Figure 146185DEST_PATH_IMAGE012
。
28.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure 695109DEST_PATH_IMAGE014
。
29.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
Figure 159588DEST_PATH_IMAGE016
。
30.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE017
Figure 359626DEST_PATH_IMAGE018
。
31.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
Figure 884148DEST_PATH_IMAGE020
。
32.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE021
Figure 215641DEST_PATH_IMAGE022
。
33.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE023
Figure 952653DEST_PATH_IMAGE024
。
34.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE025
Figure 272776DEST_PATH_IMAGE026
。
35.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE027
Figure 250090DEST_PATH_IMAGE028
。
36.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE029
Figure 491715DEST_PATH_IMAGE030
。
37.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE031
Figure 297997DEST_PATH_IMAGE032
。
38.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE033
Figure 738206DEST_PATH_IMAGE034
。
39.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE035
Figure 73372DEST_PATH_IMAGE036
。
40.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE037
Figure 585650DEST_PATH_IMAGE038
。
41.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE039
Figure 664464DEST_PATH_IMAGE040
。
42.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE041
Figure 959179DEST_PATH_IMAGE042
。
43.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE043
Figure 261985DEST_PATH_IMAGE044
。
44.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE045
Figure 212623DEST_PATH_IMAGE046
。
45.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE047
Figure 642599DEST_PATH_IMAGE048
。
46.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE049
Figure 995083DEST_PATH_IMAGE050
。
47.化合物，其包含以下氨基酸序列或与其具有至少90%序列相似性的序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE051
Figure 468789DEST_PATH_IMAGE052
。
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