KR20230137342A - 반감기 연장 모이어티 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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안드레아 페란테
요제프 조지 호이어
스테이시 린 리
페트라 베르디노
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 생물제제 및 의약에 관한 것이고, 보다 특히 치료제와 함께 사용하기 위한, 특히 생물학적-기반 치료제 (즉, 생물요법제 또는 생물제제)의 반감기 (t½)를 개선시키기 위한, t½-연장 모이어티로서 작용하는 화합물에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 t½-연장 모이어티로서 작용하는 1종 이상의 화합물을 포함하는 융합체 및 접합체, 뿐만 아니라 그를 포함하는 제약 조성물, 및 다양한 상태, 질환 또는 장애를 치료하는 데 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

반감기 연장 모이어티 및 그의 사용 방법
본 개시내용은 일반적으로 생물학 및 의약에 관한 것이고, 보다 특히 이는 치료제와 함께 사용하기 위한, 특히 생물학적-기반 치료제 (즉, 생물요법제 또는 생물제제)의 t½를 개선시키기 위한 반감기 (t½)-연장 모이어티로서 작용하도록 조작/변형된 중쇄-단독 항체 (VHH)의 가변 도메인으로 공지된 단일 도메인 항체에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 1종 이상의 VHH-기반 t½-연장 모이어티 및 치료제를 포함하는 융합체 및 접합체, 뿐만 아니라 그를 포함하는 제약 조성물, 및 다양한 상태, 질환 또는 장애를 치료하는 데 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.
생물요법제는 생리학적 경로의 천연 또는 변형된 성분이고, 고도로 선택적이고, 효과적이고, 안전한 경향이 있다. 그러나, 이들은 일부 제한이 있다. 몇몇 예외가 있지만, 하나의 제한은 생물요법제가 경구로 투여될 수 없다는 것이다. 또 다른 제한은 많은 생물요법제가 임상 세팅에서 사용되는 경우에 비교적 짧은 t½를 갖는다는 것이다.
생물요법제의 t½를 연장하기 위한 여러 전략이 존재하며, 이는 그의 약동학 (PK) 및/또는 약역학 (PD) 프로파일을 개선시킬 수 있다. 이러한 전략은 전형적으로 벌킹 모이어티 또는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)-매개 재순환을 사용한다. 이러한 방식으로, 항체 (Ab) 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab, Fc 등); 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리시알산 (PSA), 히알루론산 (HA) 및 히드록시-에틸-전분 (HES); 지방산 및 다른 지질; N- 또는 O-글리코실화; 및 혈청 알부민 또는 다른 혈장 단백질 (예컨대 트랜스페린)은 주어진 생물요법제에 공유 및/또는 비-공유 결합되어 그의 t½을 연장시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448; Harmsen & Haard (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:13-22; Kontermann (2016) Expert Opin. Biol. Ther. 16:903-915; Mueller et al. (2012) MAbs 4:673-685; Podust et al. (2013) Protein Eng. Des. Sel. 26:743-753; Strohl (2015) BioDrugs 29:215-239; and Werle U Bernkop-Schnuerch (2006) Amino Acids 30:351-367]을 참조한다.
방대한 수의 t½-연장 전략에도 불구하고, PK 특성을 연장 또는 개선시키기 위한 추가의 구조, 예컨대 생물요법제의 t½에 대한 필요성이 존재한다.
이러한 필요성을 다루기 위해, 본 개시내용은 먼저 생물요법제를 위한 t½-연장 모이어티로서 사용될 수 있는 화합물을 기재한다. 한 예에서, 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 내지 37 및 124 내지 126 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00001
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 1과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00002
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 2와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00003
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 3과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00004
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 4와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00005
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 5와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00006
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 6과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00007
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 7과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00008
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 8과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00009
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 9와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00010
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 10과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00011
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 11과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00012
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 12와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00013
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 13과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00014
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 14와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00015
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 15와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00016
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 16과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00017
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 17과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00018
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 18과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00019
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 19와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00020
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 20과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00021
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 21과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00022
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 22와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00023
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 23과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00024
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 24와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00025
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 25와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00026
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 26과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00027
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 27과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00028
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 28과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00029
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 29와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00030
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 30과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00031
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 31과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00032
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 32와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00033
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 33과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00034
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 34와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00035
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 35와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00036
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 36과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00037
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 37과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00038
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 124와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00039
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 125와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00040
. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 126과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
둘째로, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 VHH-기반 t½-연장 모이어티 및 생물요법제 중 적어도 하나를 포함하는 화합물을 기재한다. 일부 예에서, 화합물은 하기의 아미노-말단 (N-말단)에서 카르복시-말단 (C-말단)까지의 구조를 포함할 수 있다:
M-X1,
X1-M,
M-X2,
X2-M,
M-L1-X1,
M-L2-X1,
M-L1-X2,
M-L2-X2,
X1-L1-M,
X1-L2-M,
X2-L1-M,
X2-L2-M,
X1-M-X2,
X2-M-X1,
X1-L1-M-X2,
X2-L1-M-X1,
X1-M-L1-X2,
X2-M-L1-X1,
X1-L1-M-L2-X2,
X2-L1-M-L2-X1,
M-L1-X1-L2-X2,
M-L1-X2-L2-X1,
X1-L2-X2-L1-M,
X2-L2-X1-L1-M, 또는
M-L2-X2와 조합된 M-L1-X1 (즉, 비-공유 회합됨),
여기서 M은 t½-연장 모이어티로서 작용하고, 서열식별번호: 1 내지 37 및 124 내지 126으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나 또는 그와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 화합물이고, 여기서 L1 (존재하는 경우)은 제1 링커이고, L2 (존재하는 경우)는 제2 링커이고, X1은 생물요법 단백질, 펩티드 또는 올리고머이고, X2는 X1과 동일하거나 구별될 수 있는 생물요법 단백질, 펩티드 또는 올리고머이다 (예컨대 생물요법제가 동종이량체인 경우, 또는 생물요법제가 이종이량체인 경우, X1은 하나의 쇄 (α-쇄)일 수 있고, X2는 그의 또 다른 쇄 (β-쇄)일 수 있음). X1 및 X2는 또한 서로 완전히 구별될 수 있다. 일부 예에서, L1은 (GGGGQ)n (서열식별번호: 38), (GGGQ)n (서열식별번호: 39), (GGGGS)n (서열식별번호: 40), (PGPQ)n (서열식별번호: 41), (PGPA)n (서열식별번호: 42), GGGG(AP)nGGGG (서열식별번호: 43), (GGE)n (서열식별번호: 44), (GGGGE)n (서열식별번호: 45), (GGK)n (서열식별번호: 46), (GGGGK)n (서열식별번호: 47), GGGG(EP)nGGGG (서열식별번호: 48), GGGG(KP)nGGGG, (서열식별번호: 49), (PGPE)n (서열식별번호: 50) 또는 (PGPK)n (서열식별번호: 51)의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 15, 특히 약 5 내지 약 10일 수 있다. 다른 예에서, L1은 서열식별번호: 52 내지 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, L1은 L1이 서열식별번호: 52 내지 63 중 어느 하나와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 1개 이상의 부가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다.
일부 예에서, L2는 서열식별번호: 64 내지 65로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 예에서, L2는 L2가 서열식별번호: 64 내지 65 중 어느 하나와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 1개 이상의 부가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, L1 또는 L2는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 특히 (PEG)n일 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 20일 수 있다.
일부 예에서, X1, X2 또는 X1/X2는 펩티드 또는 단백질 (및 심지어 올리고머, 예를 들어 공유 연결될 수 있거나 또는 공유 연결되지 않을 수 있는 동종이량체 또는 이종이량체)이다. 이러한 펩티드 또는 단백질의 예는 항체 (Ab), 항체 단편 (예를 들어, 상이한 특이성의 Fab, scFv, Fab-Fab, VH, VL 또는 VHH), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 성장/분화 인자 15 (GDF15), 인크레틴 (INC), 인터류킨 (IL), 뉴레귤린 (NRG), 또는 호르몬을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 예에서, INC는 인슐린 (INS), 글루코스-의존성 인슐린분비자극 펩티드 (GIP), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), GIP/GLP-1, 또는 심지어 삼중 수용체 활성 (즉, 글루카곤-GIP-GLP-1 수용체 활성)을 갖는 INC일 수 있다. 특정 예에서, IL은 인터류킨-2 (IL-2)이다. 특정 예에서, NRG는 뉴레귤린 1 (NRG1) 또는 뉴레귤린 4 (NRG4)이다. 특정 예에서, 호르몬은 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 또는 릴랙신-2 (RLN-2)이다. 특정 예에서, Fab는 GITR에 결합하고; 일부 예에서 Fab는 GITR에 결합하고 GITR 길항제이다.
특정한 예에서, 화합물은 서열식별번호: 100 내지 118 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 화합물은 서열식별번호: 100 내지 118 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 것을 가질 수 있다.
셋째로, 본 개시내용은 본원의 적어도 1종의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 기재한다.
넷째로, 본 개시내용은 의약을 위한 및 생물요법제의 t½를 연장시키기 위한 화합물 및 제약 조성물의 사용 방법을 기재한다.
다섯째로, 본 개시내용은 의약의 제조 및 생물요법제의 t½의 연장에서의 본원의 화합물의 용도를 기재한다.
t½-연장 모이어티 및 그를 포함하는 화합물의 이점은 이들이 단일-쇄 폴리펩티드 (즉, 단량체)로서 화학적으로 또는 재조합적으로 합성될 수 있고, 따라서 생물학적 활성을 위한 내단백질분해 프로세싱을 필요로 하지 않는다는 것이다. 그러나, 일부 예에서, t½-연장 모이어티로서 작용하는 화합물이 단일-쇄 펩티드 및 단백질 뿐만 아니라 1개 초과의 쇄를 갖는 펩티드, 예를 들어 2-쇄 펩티드, 다중-쇄 펩티드 및 단백질에 또한 융합될 수 있는 것으로 고려된다. t½-연장 모이어티로서 작용하는 화합물 상에서, N- 및 C-말단 뿐만 아니라 t½-연장 모이어티의 임의의 표면-노출된 아미노산에 화학적으로 접합될 수 있다 (단, 이러한 접합이 알부민 결합을 완전히 제거하지는 않음).
t½-연장 모이어티로서 작용하는 화합물 및 그를 포함하는 화합물의 이점은 t½-연장 모이어티가 포유동물, 예컨대 인간에서 연장된 작용 지속기간을 제공하고, 약 20일 내지 약 30일의 t½를 가질 수 있으며, 이에 의해 천연 펩티드 및 단백질과 비교 시 적어도 매주 또는 격주 투여를 가능하게 하고, 이는 특히 평생 요법을 필요로 하는 만성 질환의 경우에 순응도를 개선시킬 수 있고, 삶의 질을 개선시킬 수 있다는 것이다.
본원에서 t½-연장 모이어티로서 작용하는 화합물의 이점은 이들이 t½-연장 모이어티의 알부민 친화도를 변화시킴으로써 달성되는 조정가능한 약동학을 갖는다는 것이다.
본원에서 t½-연장 모이어티로서 작용하는 화합물의 이점은 이들이 표준 제조 유기체, 예컨대 효모, 포유동물 또는 원핵생물에서 재조합 발현을 가능하게 할 수 있다는 것이다.
또한, 본원에서 t½-연장 모이어티로서 작용하는 화합물의 이점은 이들이 인간 혈청 알부민 뿐만 아니라 원숭이, 마우스, 래트, 개 및 돼지 혈청 알부민에 대해서도 유사한 결합을 갖는다는 것이며, 이는 약역학적, 약동학적 및 독성학 연구가 이들 종으로부터 인간으로 보다 용이하게 해석되도록 한다. 따라서, 본원에서 t½-연장 모이어티는 인간을 치료하기 위해서 뿐만 아니라 동물을 치료하기 위해서도 사용될 수 있다.
상세한 설명
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 유사체, 제약 조성물 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기재되어 있다.
또한, 단수형태의 요소에 대한 언급은, 문맥이 하나 및 단지 하나의 요소가 존재하는 것을 명백하게 요구하지 않는 한, 하나 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수형태는 통상적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
정의
본원에 사용된 "약"은 예를 들어 언급된 농도, 길이, 분자량, pH, 서열 유사성, 시간 프레임, 온도, 부피 등과 같은 값 또는 값들의 통계적으로 의미있는 범위 내를 의미한다. 이러한 값 또는 범위는 주어진 값 또는 범위의 자릿수 이내, 전형적으로 20% 이내, 보다 전형적으로 10% 이내, 보다 더 전형적으로 5% 이내일 수 있다. "약"에 의해 포괄되는 허용가능한 변동은 연구 중인 특정한 시스템에 좌우될 것이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인지될 수 있다.
수용체 중 1종 이상과 관련하여, 본원에 사용된 "활성", "활성화시키다", "활성화시키는" 등은 관련 기술분야에 공지된 검정, 예컨대 하기 기재된 시험관내 검정을 사용하여 측정된 바와 같이, 수용체(들)에 결합하고 그에서 반응을 유도하는 화합물, 예컨대 본원의 융합체의 능력을 의미한다.
본원에 사용된 "부신피질자극 호르몬" 또는 "ACTH"는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 ACTH를 의미한다. ACTH는 천연 ACTH (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 ACTH의 부가, 결실, 삽입 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. ACTH에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 95 (유니프롯(UniProt)/스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스 수탁 번호 P01189)에 제시된다. 인간에서, ACTH는 ACTH 수용체 (ACTHR, 멜라노코르틴 수용체 2 또는 MC2R로도 공지됨)에 결합하고, ACTHR에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 96 (유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q01718)에 제시된다. ACTHR은 외부 세포 형질 막 상에 위치한 G 단백질-커플링된 수용체이고, Gα에 커플링되고, 아데닐릴 시클라제를 활성화시킴으로써 cAMP의 수준을 상향조절한다.
본원에 사용된 "아미노산"은 화학적 관점에서, 1개 이상의 아민 기 및 1개 이상의 카르복실산 기의 존재를 특징으로 하고, 다른 관능기를 함유할 수 있는 분자를 의미한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 표준 아미노산으로서 지정되고 임의의 생물에 의해 생산된 대부분의 펩티드/단백질에 대한 빌딩 블록으로서 사용될 수 있는 20개의 아미노산의 세트가 존재한다. 본 개시내용에서 아미노산 서열은 20개의 자연 발생 아미노산에 대한 표준 단일 문자 또는 3문자 코드를 함유한다.
본원에 사용된 "유사체"는 표적 수용체를 활성화시키고 그 수용체에 대해 천연 효능제에 의해 도출되는 적어도 1종의 생체내 또는 시험관내 효과를 도출하는 화합물, 예컨대 합성 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 "생물요법제" 등은 적어도 1종의 치료 활성/적용가능성을 갖는 아미노산- 또는 핵산-기반 화합물, 예컨대 항체, 응고 인자, 응혈 인자, 시토카인, 효소, 성장 인자, 호르몬 및 그의 단편, 뿐만 아니라 치료 DNA 및/또는 RNA 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "CNTF" 또는 "섬모 신경영양 인자"는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 CNTF를 의미한다. CNTF는 천연 CNTF (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 CNTF의 부가, 결실, 삽입 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. CNTF에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 97 (유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P26441)에 제시된다. 인간에서, CNTF는 CNTFα-수용체 (CNTFRα)에 결합하고, CNTFRα에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 98 (유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P26992)에 제시된다. CNTFRα는 또한 2개의 신호-전달 막횡단 서브유닛, LIFRβ 및 gp130을 사용하며, 이들은 함께 Jak-STAT 신호전달 경로를 활성화시킨다. 문헌 [Stahl et al. (1994) Science 263:92-95 및 Stahl & Yancopoulos (1994) J. Neurobiol. 25:1454-1466]을 참조한다.
본원에 사용된 "보존적 치환"은 아미노산 서열에 1개 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 참조 분자와 동일한 참조 펩티드 또는 폴리펩티드의 변이체를 의미한다. 일반적으로, 보존적으로 변형된 변이체는 참조 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 보존적 치환은 유사한 특징 (예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 입체형태 및 강성 등)을 갖고 생성된 치환된 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 대해 최소의 영향을 갖는 아미노산으로의 아미노산의 치환을 지칭한다. 기능적으로 유사한 아미노산의 보존적 치환은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 따라서 본원에 철저하게 기재될 필요는 없다.
본원에 사용된 "유효량"은 그를 필요로 하는 개체에게 단일 또는 다중 용량 투여 시, 진단 또는 치료 하에 있는 이러한 개체에서 목적하는 효과를 제공하는 (즉, 예를 들어 심장, 신장, 간 또는 폐에서 증가된 혈관신생, 증가된 혈관 탄성, 증가된 심장 혈류, 증가된 간 혈류, 증가된 폐 혈류, 증가된 신장 혈류, 증가된 사구체 여과율, 감소된 혈압, 감소된 (또는 예방된) 염증 및/또는 감소된 (또는 예방된) 섬유증과 같은 개체의 상태에서 임상적으로 측정가능한 차이를 생성할 수 있는) 본원의 화합물 중 1종 이상 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 의미한다. 유효량은 공지된 기술을 사용하고 유사한 상황 하에 수득된 결과를 관찰함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 개체에 대한 유효량을 결정하는 데 있어서, 포유동물의 종, 그의 크기, 연령 및 전반적 건강, 침범된 구체적 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 침범 정도 또는 중증도, 개체의 반응, 투여되는 특정한 화합물, 투여 방식, 투여되는 제제의 생체이용률 특징, 선택된 용량 요법, 병용 의약의 사용, 및 다른 관련 상황을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 고려된다.
본원에 사용된 "연장된 작용 지속기간"은 본원의 적어도 1종의 화합물 및 본원의 생물요법제를 포함하는 융합체에 대한 결합 친화도 및 활성이 천연 생물요법제보다 더 긴 기간 동안 계속되어, 적어도 1일 1회만큼 드물게 또는 심지어 매주-3회, 매주-2회 또는 매주-1회 투여를 가능하게 하는 것을 의미한다. 시간 작용 프로파일은 공지된 약동학적 시험 방법, 예컨대 하기 실시예에서 이용되는 것을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 18 (TNFRSF18)로도 공지된 "글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질" 또는 "GITR"은 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 GITR을 의미한다. GITR은 천연 GITR (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 GITR의 부가, 결실, 삽입 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. 인간 GITR 전장 (그러나 신호 펩티드는 없음)에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 122에 제시된다 (또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q9Y5U5 참조). 인간 GITR ECD에 대한 하나의 서열 (그러나 신호 펩티드 없음)은 서열식별번호: 123에 제시된다.
본원에 사용된 "글루코스-의존성 인슐린분비자극 펩티드(들)", "위 억제 펩티드(들)" 또는 "GIP(들)"는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 GIP를 의미한다. GIP는 천연 GIP (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 GIP의 부가, 결실, 삽입 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. GIP는 전구체인 프로GIP로부터 프로세싱된다. 프로GIP에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 67에 제시되고 (또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P09681 참조), GIP에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 68에 제시된다. 대안적 GIP는 GIP1-30이다 (문헌 [Hansen et al. (2016) Br. J. Pharmacol. 173:826-838] 참조). 인간에서, G 단백질-커플링된 수용체로서 작용하는 1종의 GIP 수용체 (GIPR; 서열식별번호: 69; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P48546 참조)가 존재한다. 문헌 [Yaqub et al. (2010) Mol. Pharmacol. 77:547-558]을 참조한다.
본원에 사용된 "글루카곤-유사 펩티드-1" 또는 "GLP-1"은 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 GLP-1을 의미한다. GLP-1은 천연 GLP-1 (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 GLP-1의 부가, 결실, 삽입 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. GLP-1은 전구체인 프로글루카곤 (프로GCG)으로부터 프로세싱된다. 프로GCG에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 70에 제시되고 (또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P01275 참조), GLP-1에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 71에 제시된다. 2종의 활성, 생리학적 변이체가 공지되어 있으며, 이는 서열식별번호: 72 및 73에 제시된다. 인간에서, G 단백질-커플링된 수용체로서 작용하는 1종의 GLP-1 수용체 (GLP-1R; 서열식별번호: 74; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P43220 참조)가 존재한다. 문헌 [Dillon et al. (1993) Endocrinol. 133:1907-1910; Graziano et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:141-146; 및 Thorens et al. (1993) Diabetes 42:1678-1682]을 참조한다.
본원에 사용된 "성장/분화 인자 15" 또는 "GDF15"는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 GDF15를 의미한다. GDF15는 천연 GDF15 (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 GDF15의 부가, 결실, 삽입 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. GDF15는 전구체인 프로GDF15로부터 프로세싱되는 동종이량체 펩티드이다. 전구체에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 75에 제시되고, GDF15에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 76에 제시된다 (또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q99988 참조). 인간에서, RET-수용체 티로신 키나제로서 작용하는 1종의 GDF15 수용체 (GFRAL; 서열식별번호: 77; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q6UXV0 참조)가 존재한다. 문헌 [Emmerson et al. (2017) Nat Med. 23:1215-1219; Yang et al. (2017) Nat. Med. 23:1158-1166; and Baek & Eling (2019) Pharmacol. Ther. 198:46-58]을 참조한다.
본원에 사용된 "반감기" 또는 "t½"는 화합물, 예컨대 본원에 기재된 융합체의 양의 절반이 생물학적 과정에 의해 개체의 체액 또는 다른 생리학적 공간, 예컨대 혈청 또는 혈장으로부터 제거되는 데 걸리는 시간을 의미한다. 대안적으로, t½는 또한 이러한 융합의 양이 그의 약리학적, 생리학적 또는 방사선학적 활성의 절반을 상실하는 데 걸리는 시간을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "반수-최대 유효 농도" 또는 "EC50"은 검정 종점, 예컨대 용량-반응 곡선 (예를 들어, CNTF: Jak, STAT, Ras, PI3K/Akt 및 MAPK/ERK; NRG: PI3K/Akt, Jak, STAT, Ras 및 PLCγ; GDF15: PI3K/AKT 및 MAPK/ERK 및 Smad; IL-2: JAK-STAT, PI3K/Akt 및 MAPK/ERK; GLP1: cAMP, PI3K, MAPK/ERK, PKCδ; TNF: TRAF, MKK, IKK 및 NFkB; ACTH: cAMP 및 PKA)의 50% 활성화/자극을 유발하는 화합물의 농도를 의미한다.
본원에 사용된 "와 조합하여"는 본원의 융합체 중 적어도 하나를 1종 이상의 추가의 치료제와 동시에, 순차적으로 또는 조합된 단일 제제로 투여하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "그를 필요로 하는 개체"는, 예를 들어 본원에 열거된 것을 포함한, 치료 또는 요법을 필요로 하는 상태, 질환, 장애 또는 증상을 갖는 포유동물, 예컨대 인간을 의미한다. 특히, 치료할 바람직한 개체는 인간이다.
본원에 사용된 "인크레틴(들)" 또는 "INC(들)"는 공급 후에 인슐린 분비를 증가시킬 수 있는 장내분비 세포로부터 분비된 펩티드를 의미한다. INC는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 인크레틴일 수 있다. 인간에서, INC는 상기 논의된 INS, GIP 및 GLP-1을 포함한다.
본원에 사용된 "인슐린" 또는 "INS"는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 인슐린을 의미하며, 여기서 천연 형태는 2개의 디술피드 결합을 통해 연결된 2개의 펩티드 쇄 (예를 들어, A 쇄 및 B 쇄)를 갖고, A 쇄는 단일 분자내 디술피드 결합을 추가로 갖는 이종이량체 펩티드이다. 인간에서, INS 프로세싱은 프리프로인슐린 (유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P01308 참조)으로 시작하고, 이는 프로인슐린 (A 쇄, B 쇄 및 C 펩티드 포함; 천연 INS는 B-C-A의 구조를 가짐; 서열식별번호: 78 참조; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P01308 참조)으로 프로세싱된다. 프로인슐린은 C 펩티드가 절단되어 INS에 도달하는 추가의 프로세싱을 겪는다 (천연 인간 INS의 A 쇄에 대해 서열식별번호: 79 및 천연 인간 INS의 B 쇄에 대해 서열식별번호: 80 참조; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P01308 참조).
본원에 사용된 "인터류킨(들)" 또는 "IL(들)"은 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 인터류킨을 의미한다. IL은 천연 IL (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 IL의 부가, 결실, 삽입 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. 인간에서, 다수의 천연 IL 이소형이 존재하지만; 본원에서는 IL-2가 관심 대상이다. IL-2는 JAK-STAT, PI3K/Akt/mTOR 및 MAPK/ERK 경로를 포함하는 3가지 상이한 신호전달 경로를 통해 신호를 전달할 수 있는 시토카인이다. 인간 IL-2에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 83에 제시된다 (또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P60568 참조). 인간에서, α-, β- 및 γ-서브유닛 (IL-2R; 서열식별번호: 84 내지 86; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P01589, P14784 및 P31785 참조)을 포함하는 1종의 IL-2 수용체가 존재한다. 문헌 [Liao et al. (2011) Curr. Opin. Immunol. 23:598-604; 및 Malek & Castro (2010) Immunity 33:153-165]을 참조한다.
본원에 사용된 "장기-작용"은 본원의 조성물의 결합 친화도 및 활성이 천연 펩티드 또는 단백질보다 더 긴 기간 동안 계속되어, 적어도 1일 1회만큼 드물게 또는 심지어 매주-3회, 매주-2회, 매주-1회 또는 매월 투여를 가능하게 하는 것을 의미한다. 본원의 화합물의 시간 작용 프로파일은 공지된 약동학적 시험 방법, 예컨대 하기 실시예에 기재된 것을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 "뉴레귤린(들)" 또는 "NRG(들)"는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 뉴레귤린을 의미한다. NRG는 천연 NRG (즉, 전장) 및 그의 변이 (즉, 천연 NRG의 부가, 결실, 삽입 및/또는 치환) 둘 다를 포함한다. 인간에서, 다수의 천연 NRG 패밀리 구성원이 존재하지만; 본원에서 관심 대상은 NRG1이다. 모든 NRG와 같이, NRG1은 보다 큰 전구체로부터 프로세싱된다. 전구체에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 87에 제시되고, NRG1에 대한 하나의 서열은 서열식별번호: 88에 제시된다 (또한, 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q02297 참조). 인간에서, 2개의 NRG1 수용체, ErbB3 (서열식별번호: 89; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P21860 참조) 및 ErbB4 (서열식별번호: 90; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 Q15303 참조)가 존재한다. 문헌 [Mei & Xiong (2008)]을 참조한다.
본원에 사용된 "비-표준 아미노산"은 세포에서 자연적으로 발생할 수 있지만 펩티드 합성에 참여하지 않는 아미노산을 의미한다. 비-표준 아미노산은 펩티드의 구성성분일 수 있고, 종종 펩티드 내의 표준 아미노산의 변형에 의해 (즉, 번역후 변형을 통해) 생성된다. 비-표준 아미노산은 상기 표준 아미노산의 반대 절대 키랄성을 갖는 D-아미노산을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "올리고머"는 보다 작은 분자, 그의 단량체의 카피로부터 유래될 수 있는 몇몇 유사하거나 동일한 반복 단위를 갖는 분자를 의미한다. 이들 단량체는 강하거나 약한, 공유 또는 비-공유 (예를 들어, 분자내)인 결합에 의해 연결될 수 있다.
본원에 사용된 "환자", "대상체" 및 "개체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 포유동물, 특히 인간을 의미한다. 특정 예에서, 개체는 본원의 화합물 또는 조성물의 투여로부터 이익을 얻을 상태, 질환, 장애 또는 증상으로 추가로 특징화된다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 완충제"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 표준 제약 완충제를 의미한다.
본원에 사용된 "렐락신-2" 또는 "RLN-2"는 임의의 종, 예컨대 포유동물 종, 특히 인간으로부터 수득되거나 유래된 렐락신-2를 의미하며, 여기서 천연 형태는 2개의 디술피드 결합을 통해 연결된 2개의 펩티드 쇄 (예를 들어, A 쇄 및 B 쇄)를 갖고, A 쇄는 단일 분자내 디술피드 결합을 추가로 갖는 이종이량체 펩티드이다. 인간에서, RLN-2 프로세싱은 프리프로렐락신 (유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P04090 참조)으로 시작하고, 이는 프로렐락신 (A 쇄, B 쇄 및 C 펩티드를 포함함; 천연 RLN은 B-C-A의 구조를 가짐; 서열식별번호: 91 참조; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P04090 참조)으로 프로세싱된다. 프로렐락신은 C 펩티드가 절단되어 RLN-2에 도달하는 추가의 프로세싱을 겪는다 (RLN-2의 A 쇄에 대해 서열식별번호: 92 및 RNL-2의 B 쇄에 대해 서열식별번호: 93 참조; 또한 유니프롯/스위스프롯 데이터베이스 수탁 번호 P04090 참조).
본원에 사용된 "서열 유사성"은 생물학적 화합물의 2개 이상의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 정량적 특성, 예컨대 예를 들어 전체 길이에 걸친 상응성 또는 2개 이상의 서열의 비교 윈도우를 의미한다. 서열 유사성은 (1) 퍼센트 동일성 또는 (2) 퍼센트 유사성에 의해 측정될 수 있다. 퍼센트 동일성은 2종의 생물학적 화합물 사이에 동일한 잔기를 가장 짧은 서열의 길이로 나눈 백분율을 측정하는 반면, 퍼센트 유사성은 동일성을 측정하고, 또한 평가에서 서열 갭 및 잔기 유사성을 포함한다. 서열 유사성을 결정하기 위한 방법 및 알고리즘은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 따라서 본원에 철저하게 기재될 필요는 없다. 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치의 명시된 백분율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과이다.
본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료하는 것"은 상태, 질환, 장애 또는 증상의 진행 또는 중증도를 약화, 저지, 역전, 둔화 또는 정지시키는 목적을 위해 본원의 화합물의 투여가 지시되는 상태, 질환, 장애 또는 증상을 갖는 개체를 관리하고 돌보는 것을 의미한다. 치료는 개체에게 본원의 화합물 또는 본원의 화합물을 함유하는 조성물을 투여하여 증상 또는 합병증의 발병을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 완화시키거나, 또는 상태, 질환, 장애 또는 증상을 제거하는 것을 포함한다. 치료는 본원의 화합물 또는 본원의 화합물을 함유하는 조성물을 개체에게 투여하여 예컨대, 예를 들어 심장, 신장, 간 또는 폐에서 증가된 혈관신생, 증가된 혈관 탄성, 증가된 심장 혈류, 증가된 간 혈류, 증가된 폐 혈류, 증가된 신장 혈류, 증가된 사구체 여과율, 감소된 혈압, 감소된 (또는 예방된) 염증 및/또는 감소된 (또는 예방된) 섬유증을 초래하는 것을 포함한다. 치료할 개체는 포유동물, 특히 인간이다.
본원에 사용된 "VHH" 또는 "VHH 모이어티"는 단일-도메인 항체의 형태, 특히 약 15 kDa의 크기를 가질 수 있는 중쇄 단독 항체 (HcAb)의 단일, 단량체 가변 영역을 포함하는 항체 단편을 의미한다. 조작된/변형된 VHH-기반 화합물은 생물요법제의 작용 지속기간을 연장시키고/거나 그의 t½를 개선시키기 위한 약동학적 인핸서로서 사용될 수 있는 것으로 본원에서 밝혀졌다. VHH-기반 화합물은 혈청 알부민에 결합하지만; VHH-기반 화합물은 IgG (Fc 도메인 포함), 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 또는 다른 장기-지속 혈청 단백질에 결합하는 데 사용될 수 있다. 따라서, VHH-기반 화합물은 화합물, 예컨대 펩티드 또는 단백질 또는 심지어 다른 분자, 예컨대 예를 들어 소분자의 t½를 개선시키는 데 사용될 수 있다.
특정 약어는 하기와 같이 정의된다: "ACR"은 소변 알부민/소변 크레아티닌 비를 지칭하고; "AUC"는 곡선하 면적을 지칭하고; "cAMP"는 시클릭 아데노신 모노포스페이트를 지칭하고; "CMV"는 시토메갈로바이러스를 지칭하고; "DNA"는 데옥시리보핵산을 지칭하고; "ECD"는 세포외 도메인을 지칭하고; "EDC"는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드를 지칭하고; "ETA"는 에탄올아민을 지칭하고; "GS"는 글루타민 신테타제를 지칭하고; "HC"는 중쇄를 지칭하고; "HIC"는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 지칭하고; "hr"은 시간을 지칭하고; "IV"는 정맥내를 지칭하고; "kDa"는 킬로달톤을 지칭하고; "LC"는 경쇄를 지칭하고; "LC-MS"는 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법을 지칭하고; "min"은 분을 지칭하고; "MS"는 질량 분광측정법을 지칭하고; "MSX"는 메티오닌 술폭시민을 지칭하고; "NHS"는 N-히드록시숙신이미드를 지칭하고; "OtBu"는 O-tert-부틸을 지칭하고; "PEI"는 폴리에틸렌이민을 지칭하고; "RP-HPLC"는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "sec"는 초를 지칭하고; "NaOAc"는 아세트산나트륨을 지칭하고; "rcf"는 상대 원심력을 의미하고; "RT"는 실온을 의미하고; "RU"는 공명 단위를 의미하고; "SQ"는 피하를 지칭하고; "SEC"는 크기-배제 크로마토그래피를 지칭하고; "SEM"은 평균의 표준 오차를 지칭하고; "SPR"은 표면 플라즈몬 공명을 의미하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고; "Trt"는 트리틸을 지칭한다.
반감기 연장제로서 작용하는 VHH-기반 화합물 및 그를 포함하는 융합체 또는 접합된 화합물
간략하게, 본원의 화합물은 하기 구조 중 하나를 갖는 N-말단에서 C-말단까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
M-X1,
X1-M,
M-X2,
X2-M,
M-L1-X1,
M-L2-X1,
M-L1-X2,
M-L2-X2,
X1-L1-M,
X1-L2-M,
X2-L1-M,
X2-L2-M,
X1-M-X2,
X2-M-X1,
X1-L1-M-X2,
X2-L1-M-X1,
X1-M-L1-X2,
X2-M-L1-X1,
X1-L1-M-L2-X2,
X2-L1-M-L2-X1,
M-L1-X1-L2-X2,
M-L1-X2-L2-X1,
X1-L2-X2-L1-M,
X2-L2-X1-L1-M, 또는
M-L2-X2와 조합된 M-L1-X1 (즉, 비-공유 회합됨),
여기서 M은 t½-연장 모이어티로서 작용하고 서열식별번호: 1 내지 37 및 124 내지 126으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나 또는 그와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VHH-기반 화합물이고, 여기서 L1 (존재하는 경우)은 제1 링커이고, L2 (존재하는 경우)는 제2 링커이고, X1 (존재하는 경우)은 생물요법 단백질, 펩티드 또는 올리고머이고, X2 (존재하는 경우)는 마찬가지로 X1과 동일하거나 구별될 수 있는 생물요법 단백질, 펩티드 또는 올리고머이다 (예컨대 생물요법제가 동종이량체인 경우, 또는 생물요법제가 이종이량체인 경우, X1은 하나의 쇄 (α-쇄)일 수 있고, X2는 그의 또 다른 쇄 (β-쇄)일 수 있음). X1 및 X2는 또한 서로 완전히 구별될 수 있다.
일부 예에서, L1은 (GGGGQ)n (서열식별번호: 38), (GGGQ)n (서열식별번호: 39), (GGGGS)n (서열식별번호: 40), (PGPQ)n (서열식별번호: 40), (PGPA)n (서열식별번호: 42), GGGG(AP)nGGGG (서열식별번호: 43), (GGE)n (서열식별번호: 44), (GGGGE)n (서열식별번호: 45), (GGK)n (서열식별번호: 46), (GGGGK)n (서열식별번호: 47), GGGG(EP)nGGGG (서열식별번호: 48), GGGG(KP)nGGGG (서열식별번호: 49), (PGPE)n (서열식별번호: 50), 또는 (PGPK)n (서열식별번호: 51)의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 15, 특히 약 5 내지 약 10일 수 있다. 다른 예에서, L1은 서열식별번호: 52 내지 63 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, L1은 L1이 서열식별번호: 52 내지 63 중 어느 하나와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 1개 이상의 부가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다.
일부 예에서, L2는 서열식별번호: 64 내지 65 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 예에서, L2는 L2가 서열식별번호: 64 내지 65 중 어느 하나와 적어도 약 90% 내지 약 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 1개 이상의 부가, 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다.
또 다른 예에서, L1 또는 L2는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 특히 말레이미드-(PEG)12일 수 있다.
종합하면, 예시적인 융합체는 다음과 같다:
CNTF, (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시)을 포함하는 VHH-CNTF 융합체인 화합물 1은 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00041
t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시), (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 CNTF를 포함하는 VHH-CNTF 융합체인 화합물 2는 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00042
NRG1, (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시)을 포함하는 VHH-NRG1 융합체인 화합물 3은 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00043
t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시), (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 NRG1을 포함하는 VHH-NRG1 융합체인 화합물 4는 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00044
t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시), (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 GDF15를 포함하는 VHH-GDF15 융합체인 화합물 5는 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00045
IL-2, (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시)을 포함하는 VHH-IL-2 융합체인 화합물 6은 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00046
t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시), (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 IL-2를 포함하는 VHH-IL-2 융합체인 화합물 7은 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00047
GLP-1, (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시)을 포함하는 VHH-GLP-1 융합체인 화합물 8은 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00048
HC, (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시)을 포함하는 VHH-Fab 융합체인 화합물 9는 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00049
화합물 9는 하기 아미노산 서열을 갖는 LC를 추가로 포함한다.
Figure pct00050
LC, (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시)을 포함하는 VHH-Fab 융합체인 화합물 10은 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00051
화합물 10은 하기 아미노산 서열을 갖는 HC를 추가로 포함한다.
Figure pct00052
t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시), (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 HC를 포함하는 VHH-Fab 융합체인 화합물 11은 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00053
화합물 11은 하기 아미노산 서열을 갖는 LC를 추가로 포함한다.
Figure pct00054
t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시), (G4Q)5 링커 (이탤릭체) 및 LC를 포함하는 VHH-Fab 융합체인 화합물 12는 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00055
화합물 12는 하기 아미노산 서열을 갖는 HC를 추가로 포함한다.
Figure pct00056
GLP-1, (G4Q)5 링커 (이탤릭체), t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시) 및 C-말단 Cys를 포함하는 VHH-GLP-1 융합체인 화합물 13은 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00057
GLP-1, (G4Q)5 링커 (이탤릭체), t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시), C-말단 Cys 및 말레이미드(PEG)12 링커를 통해 C-말단에서 N-말단 배향으로 연결된 ACTH를 포함하는 VHH-GLP-1/ACTH 융합 접합체인 화합물 14는 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00058
t½-연장 모이어티로서 작용하는 VHH-기반 화합물 (밑줄표시), C-말단 Cys 및 말레이미드(PEG)12 링커를 통해 C-말단에서 N-말단 배향으로 연결된 ACTH를 포함하는 VHH-ACTH 융합 접합체인 화합물 15는 하기 아미노산 서열을 갖는다.
Figure pct00059
제약 조성물 및 키트
본원의 화합물 (즉, VHH-기반 융합체 또는 VHH-기반 접합체, 예컨대 예를 들어 상기 화합물 1 내지 15)은 비경구 경로 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 경피)에 의해 투여될 수 있는 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 이러한 제약 조성물 및 그를 제조하기 위한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" (D.B. Troy ed., 21st Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)]을 참조한다. 특정한 예에서, 조성물은 SQ 또는 IV 투여된다. 그러나, 대안적으로, 조성물은 다른 제약상 허용되는 경로를 위한 형태, 예컨대 예를 들어 경구 투여를 위한 정제 또는 다른 고체; 시한 방출 캡슐, 및 크림, 로션, 흡입제 등을 포함한 현재 사용되는 임의의 다른 형태로 제제화될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 그의 생체내 상용성 및 유효성을 개선하기 위해, 본원의 VHH-기반 융합체 또는 VHH-기반 접합체는 임의의 수의 무기 및 유기 산/염기와 반응하여 제약상 허용되는 산/염기 부가염을 형성할 수 있다. 제약상 허용되는 염 및 이를 제조하기 위한 통상의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Stahl et al., "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use" (2nd Revised Ed. Wiley-VCH, 2011)] 참조). 본원에 사용하기 위한 제약상 허용되는 염은 나트륨, 트리플루오로아세테이트, 히드로클로라이드 및 아세테이트 염을 포함한다.
본원의 화합물은 의사에 의해 투여되거나 또는 주사를 사용하여 자가-투여될 수 있다. 게이지 크기 및 주사 부피의 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 그러나, 주사 부피의 양은 ≤ 약 2 mL 또는 심지어 ≤ 약 1 mL일 수 있고, 니들 게이지는 ≥ 약 27 G 또는 심지어 ≥ 약 29 G일 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 합성하는 데 유용한 신규 중간체 및 방법을 제공하고, 따라서 이를 포괄한다. 중간체 및 화합물은 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 재조합 합성을 사용하는 방법은 하기 실시예에 예시되어 있다. 기재된 각각의 기술에 대한 구체적 단계는 화합물을 제조하기 위해 상이한 방식으로 조합될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다.
본원의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물의 예시적인 용량은 개체의 킬로그램 (kg)당 밀리그램 (mg) 또는 마이크로그램 (μg), 나노그램 (ng), 또는 피코그램 (pg) 양일 수 있다. 이러한 방식으로, 1일 용량은 약 1 μg 내지 약 100 mg일 수 있다.
여기서, 제약 조성물 중 화합물의 유효량은 약 0.25 mg 내지 약 5.0 mg의 용량일 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일부 경우에 유효량 (즉, 용량/투여량)이 상기 범위의 하한치 미만일 수 있고, 적절한 것을 초과할 수 있는 반면, 다른 경우에 유효량은 더 큰 용량일 수 있고, 허용되는 부작용과 함께 사용될 수 있다는 것을 이해한다.
본원의 화합물에 추가로, 제약 조성물은 또한 적어도 1종의 추가의 치료제, 예컨대, 예를 들어 특정한 상태, 질환 및 장애 (예를 들어, 심혈관, 신경, 면역, 대사, 종양, 심리, 폐 및/또는 신장 상태, 질환 또는 장애)의 표준 관리로서 전형적으로 사용되는 치료제를 포함할 수 있다.
이러한 방식으로, 제약 조성물은 유효량의 본원의 1종 이상의 화합물, 제약상 허용되는 담체 및 임의로 적어도 1종의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 유효량의 서열식별번호: 100의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 101의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 102의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 103의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 104의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 105의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 106의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 107의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 108 및 109의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 110 및 111의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 112 및 113의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 114 및 115의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 116의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 유효량의 서열식별번호: 117의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 및 유효량의 서열식별번호: 118의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
대안적으로, 본원의 화합물은 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 일부 예에서, 키트는 개체에게 적어도 1종의 화합물 (및 임의로 적어도 1종의 추가의 치료제)을 투여하기 위한 장치를 포함한다. 특정 예에서, 키트는 적어도 1종의 화합물 (및 임의로 적어도 1종의 추가의 치료제)을 투여하기 위한 시린지 및 바늘을 포함한다. 특정한 예에서, 화합물 (및 임의로 적어도 1종의 추가의 치료제)은 시린지 내에서 수용액 중에 사전-제제화된다.
반감기 연장제로서 작용하는 VHH-기반 화합물 또는 그의 융합체 및 접합체의 제조 및 사용 방법
본원의 화합물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수의 표준 재조합 DNA 방법 또는 표준 화학적 펩티드 합성 방법을 통해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 방법과 관련하여, 표준 재조합 기술을 사용하여 화합물에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (즉, 융합 펩티드 또는 융합 단백질 또는 융합 접합체)를 구축하고, 그 폴리뉴클레오티드를 재조합 발현 벡터 내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포, 예컨대 박테리아, 효모 및 포유동물 세포 내로 도입하여 화합물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Green & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 4th ed. 2012)]을 참조한다.
재조합 DNA 방법과 관련하여, 본원의 화합물은 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질 또는 전구체 단백질 분자를 생산함으로써 제조될 수 있다. cDNA 및 합성 DNA를 포함한 DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 본원의 화합물을 코딩하는 그 안의 코딩 서열은 유전자 코드의 중복성 또는 축중성의 결과로서 달라질 수 있다. 간략하게, 본원의 화합물을 코딩하는 DNA 서열이 화합물 또는 그의 전구체를 생산하기 위해 숙주 세포에 도입된다. 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 K12 또는 B 균주, 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 또는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포일 수 있다.
적절한 숙주 세포는 본원의 화합물 또는 그의 전구체를 생산하기 위해 발현 시스템, 예컨대 발현 벡터로 일시적으로 또는 안정하게 형질감염 또는 형질전환된다. 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하기 위해 선택 마커, 예컨대 예를 들어 테트라시클린, 네오마이신, G418 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다.
본원에 기재된 각각의 단계에 대한 특정한 생합성 또는 합성 단계는 본원의 화합물을 제조하기 위해 사용되거나, 사용되지 않거나 또는 상이한 방식으로 조합될 수 있다.
화학적 펩티드 합성 방법과 관련하여, 표준 수동 또는 자동화 고체-상 합성 절차를 사용할 수 있다. 예를 들어, 자동화 펩티드 합성기는, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (캘리포니아주 포스터 시티) 및 프로테인 테크놀로지스 인크.(Protein Technologies Inc.) (애리조나주 투산)로부터 상업적으로 입수가능하다. 고체-상 합성을 위한 시약은 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수가능하다. 고체-상 합성기는 간섭 기의 차단, 반응 동안 아미노산의 보호, 커플링, 탈보호 및 미반응 아미노산의 캡핑을 위해 제조업체의 지침서에 따라 사용될 수 있다.
본원의 화합물에 대한 한 용도는 심혈관, 신경, 면역, 대사, 종양, 심리, 폐 및/또는 신장 상태, 질환 또는 장애를 치료하는 것이다.
방법은 본원에 기재된 단계를 포함할 수 있고, 이들은 반드시는 아니지만 기재된 바와 같은 순서로 수행될 수 있다. 그러나, 다른 순서도 고려될 수 있다. 또한, 개별 또는 다중 단계는 동시에 및/또는 시간상 중첩되어 및/또는 개별적으로 또는 다중 반복 단계로 수행될 수 있다. 또한, 방법은 추가의 명시되지 않은 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 이러한 방법은, 예를 들어 신경 상태, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 그에 대한 소인이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 대사 상태, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 그에 대한 소인이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 심혈관 상태, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 그에 대한 소인이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 종양학 상태, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 그에 대한 소인이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 심리 상태, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 그에 대한 소인이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 폐 상태, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 그에 대한 소인이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 신장 상태, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 그에 대한 소인이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 자가면역 상태, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 그에 대한 소인이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 또한 개체에게 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물의 형태일 수 있는 유효량의 본원의 적어도 1종의 화합물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 화합물/제약 조성물은 추가의 치료제를 포함할 수 있다.
화합물 및 임의적인 추가의 치료제의 농도/용량/투여량은 본원의 다른 곳에서 논의된다.
투여 경로와 관련하여, 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 공지된 방법에 따라, 예컨대, 예를 들어 경구로; 주사에 의해 (즉, 동맥내로, 정맥내로, 복강내로, 뇌내로, 뇌실내로, 근육내로, 안내로, 문맥내로 또는 병변내로); 지속 방출 시스템에 의해, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다. 특정 예에서, 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 볼루스 주사에 의해 또는 연속적으로 SQ 투여될 수 있다.
투여 빈도와 관련하여, 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 매일, 격일, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회 (즉, 매주), 격주 (즉, 격주), 또는 매월 투여될 수 있다. 특정 예에서, 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 격일로 SQ, 주 3회 SQ, 주 2회 SQ, 주 1회 SQ, 격주로 SQ 또는 매월 SQ 투여된다. 특정한 예에서, 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 1주 1회 (QW) SQ 투여된다.
대안적으로, 및 IV 투여되는 경우에, 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 격일로 IV, 1주 3회 IV, 1주 2회 IV, 1주 1회 IV, 격주로 IV 또는 매월 IV 투여된다. 특정한 예에서, 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물은 1주 1회 (IW) IV 투여된다.
화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물이 유효량의 적어도 1종의 추가의 치료제와 조합되어 투여되는 경우에 관하여, 추가의 치료제는 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물과 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
더욱이, 추가의 치료제는 화합물 또는 제약 조성물 (그를 포함함)과 동일한 빈도로 (즉, 격일로, 1주 2회, 또는 심지어 매주) 투여될 수 있다. 대안적으로, 추가의 치료제는 화합물 또는 그를 포함하는 제약 조성물과 구별되는 빈도로 투여될 수 있다. 다른 예에서, 추가의 치료제는 SQ 투여될 수 있다. 다른 예에서, 추가의 치료제는 IV 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 추가의 치료제는 경구로 투여될 수 있다.
방법은 식이 및 운동과 조합될 수 있고/거나 상기 논의된 것 이외의 추가의 치료제와 조합될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
실시예
하기 비제한적 실시예는 제한이 아닌 예시 목적으로 제공된다.
폴리펩티드 발현, 정제 및 접합
실시예 1: VHH-기반 융합체 1의 재조합 발현 및 정제
실시예 1은 하기의 아미노산 서열을 갖는 CNTF-VHH 융합체이다.
Figure pct00060
여기서, 서열식별번호: 100의 VHH 융합체는 CHOK1 세포 유도체를 사용하여 포유동물 세포 발현 시스템에서 생성된다. 서열식별번호: 100을 코딩하는 cDNA 서열은 GS-함유 발현 플라스미드 백본 (pEE12.4-기반 플라스미드) 내로 서브클로닝된다. cDNA 서열은 신호 펩티드 서열, METDTLLLWVLLLWVPGSTG (서열식별번호: 66)의 코딩 서열과 인 프레임 융합되어 조직 배양 배지 내로의 VHH 융합 유사체의 분비를 증진시킨다. 발현은 바이러스 CMV 프로모터에 의해 구동된다.
일시적 형질감염을 통해 VHH 융합체를 생성하기 위해, CHOK1 세포를 PEI-기반 방법을 사용하여 재조합 발현 플라스미드로 형질감염시킨다. 간략하게, 4 x 106개 세포/mL의 밀도의 적절한 부피의 CHOK1 현탁 세포를 진탕 플라스크에 옮기고, PEI 및 재조합 플라스미드 DNA 둘 다를 세포에 첨가한다. 세포를 현탁 배양물 중에서 32℃에서 6일 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 말미에, 세포를 저속 원심분리에 의해 제거하고, VHH 융합체를 조건화 배지로부터 정제한다.
대안적으로, 및 안정한 형질감염을 통해 VHH 융합체를 생성하기 위해, CHOK1 세포를 전기천공 및 적절한 양의 재조합 발현 플라스미드를 사용하여 안정하게 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 현탁 배양물 중에서 적절한 세포 밀도로 유지한다. 형질감염된 세포의 선택은 25 μM MSX-함유 무혈청 배지에서의 성장에 의해 달성되고, 약 37℃ 및 약 6% CO2에서 인큐베이션한다.
CHO 세포로부터 배지 내로 분비된 VHH 융합체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어 이온 교환, 소수성 상호작용, 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제한다. 구체적으로, 수거된 배지로부터의 VHH 융합체를 맙 셀렉트(Mab Select) 단백질 A 수지 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 포획한다. 이어서, 수지를 구동 완충제, 예컨대 포스페이트-완충 염수 (PBS; pH 7.4) 또는 트리스를 함유하는 구동 완충제로 간략하게 세척하여 비-특이적으로 결합된 물질을 제거한다. VHH 융합체를 저 pH 용액, 예컨대 10 mM 시트르산 pH 3으로 수지로부터 용리시킨다. VHH 융합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 낮은 pH에서 유지시켜 잠재적 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 염기, 예컨대 1 M 트리스 pH 8.0을 첨가하여 pH를 중화시킬 수 있다. VHH 융합체는 포로스(Poros) 50 HS (써모피셔(ThermoFisher))와 같은 수지를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. VHH 융합체를 15 칼럼 부피에 걸쳐 20 mM NaOAc, pH 5.0 중 0에서 500 mM NaCl 구배를 사용하여 이온 교환 칼럼으로부터 용리시킨다.
VHH 융합체는 캅토 페닐 임프레스(Capto Phenyl ImpRes) HIC 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 칼럼 충전 용액을 약 0.5 M 황산나트륨으로 조정하고, 20 mM 트리스 pH 8 용액 중 0.5 M에서 0 M 황산나트륨으로 진행하는 10 칼럼 부피 (CV) 구배를 사용하여 용리시킴으로써 정제를 수행한다. HIC 후, 농축된 캅토 페닐 임프레스 풀을 슈퍼덱스(Superdex)200 또는 슈퍼덱스75 (지이 헬스케어) 상에 로딩하여 PBS (pH 7.4) 또는 20 mM 히스티딘, 50 mM NaCl (pH 6.0) 중에서 등용매 용리함으로써 VHH 융합체를 SEC에 의해 추가로 정제할 수 있다.
정제된 VHH 융합체를 플라노바(Planova) 20N (아사히 카세이 메디칼(Asahi Kasei Medical))과 같은 바이러스 체류 필터를 통해 통과시킨 후, 재생 셀룰로스 막 (밀리포어(Millipore)) 상에서의 접선 흐름 한외여과를 사용하여 20 mM 히스티딘, 20 mM NaCl pH 6으로 농축/투석여과할 수 있다.
따라서, VHH 융합체는 상기 방식으로 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 유사한 방식으로 제조된다.
실시예 2: VHH-기반 융합체 2의 재조합 발현 및 정제
실시예 2는 하기의 아미노산 서열을 갖는 VHH-CNTF 융합체이다.
Figure pct00061
여기서, 서열식별번호: 101의 VHH 융합체는 서열식별번호: 101을 코딩하는 cDNA 서열을 발현 플라스미드에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 3: VHH-기반 융합체 3의 재조합 발현 및 정제
실시예 3은 하기의 아미노산 서열을 갖는 NRG1-VHH 융합체이다.
Figure pct00062
여기서, 서열식별번호: 102의 VHH 융합체는 서열식별번호: 102를 코딩하는 cDNA 서열을 발현 플라스미드에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 4: VHH-기반 융합체 4의 재조합 발현 및 정제
실시예 4는 하기의 아미노산 서열을 갖는 VHH-NRG1 융합체이다.
Figure pct00063
여기서, 서열식별번호: 103의 VHH 융합체는 서열식별번호: 103을 코딩하는 cDNA 서열을 발현 플라스미드에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 5: VHH-기반 융합체 5의 재조합 발현 및 정제
실시예 5는 하기의 아미노산 서열을 갖는 VHH-GDF15 융합체이다.
Figure pct00064
여기서, 서열식별번호: 104의 VHH 융합체는 서열식별번호: 104를 코딩하는 cDNA 서열을 발현 플라스미드에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 6: VHH-기반 융합체 6의 재조합 발현 및 정제
실시예 6은 하기의 아미노산 서열을 갖는 IL-2-VHH 융합체이다.
Figure pct00065
여기서, 서열식별번호: 105의 VHH 융합체는 서열식별번호: 105를 코딩하는 cDNA 서열을 발현 플라스미드에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 7: VHH-기반 융합체 7의 재조합 발현 및 정제
실시예 7은 하기의 아미노산 서열을 갖는 VHH-IL-2 융합 유사체이다.
Figure pct00066
여기서, 서열식별번호: 106의 VHH 융합체는 서열식별번호: 106을 코딩하는 cDNA 서열을 발현 플라스미드에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 8: VHH-기반 융합체 8의 재조합 발현 및 정제
실시예 8은 하기의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1-VHH 융합체이다.
Figure pct00067
여기서, 서열식별번호: 107의 VHH 융합체는 서열식별번호: 107을 코딩하는 cDNA 서열을 발현 플라스미드에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 9: VHH-기반 융합체 9의 재조합 발현 및 정제
실시예 9는 HC-VHH 및 LC를 포함하는 Fab-VHH 융합체이며, HC-VHH 아미노산 서열은 하기를 갖고:
Figure pct00068
LC 아미노산 서열은 하기를 갖는다.
Figure pct00069
여기서, 서열식별번호: 108 및 109의 VHH 융합체는, 서열식별번호: 108 및 109를 코딩하는 cDNA 서열을 2개의 발현 플라스미드 내로 클로닝한 후, 두 플라스미드의 1:1 믹스를 형질감염에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 10: VHH-기반 융합체 10의 재조합 발현 및 정제
실시예 10은 HC 및 LC-VHH를 포함하는 Fab-VHH 융합체이며, HC 아미노산 서열은 하기를 갖고:
Figure pct00070
LC-VHH 아미노산 서열은 하기를 갖는다.
Figure pct00071
여기서, 서열식별번호: 110 및 111의 VHH 융합 유사체는, 서열식별번호: 110 및 111을 코딩하는 cDNA 서열을 2개의 발현 플라스미드 내로 클로닝한 후, 두 플라스미드의 1:1 믹스를 형질감염에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 11: VHH-기반 융합체 11의 재조합 발현 및 정제
실시예 11은 VHH-HC 및 LC를 포함하는 Fab-VHH 융합체이며, VHH-HC 아미노산 서열은 하기를 갖고:
Figure pct00072
LC 아미노산 서열은 하기를 갖는다.
Figure pct00073
여기서, 서열식별번호: 112 및 113의 VHH 융합체는, 서열식별번호: 112 및 113을 코딩하는 cDNA 서열을 2개의 발현 플라스미드 내로 클로닝한 후, 두 플라스미드의 1:1 믹스를 형질감염에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 12: VHH-기반 융합체 12의 재조합 발현 및 정제
실시예 12는 HC 및 VHH-LC를 포함하는 VHH-Fab이며, HC 아미노산 서열은 하기를 갖고:
Figure pct00074
VHH-LC 아미노산 서열은 하기를 갖는다.
Figure pct00075
여기서, 서열식별번호: 114 및 115의 VHH 융합 유사체는, 서열식별번호: 114 및 115를 코딩하는 cDNA 서열을 2개의 발현 플라스미드 내로 클로닝한 후, 두 플라스미드의 1:1 믹스를 형질감염에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 13: 대조군 Fab의 재조합 발현 및 정제
실시예 13은 HC 및 LC를 포함하는 Fab이며, HC 아미노산 서열은 하기를 갖고:
Figure pct00076
LC 아미노산 서열은 하기를 갖는다.
Figure pct00077
여기서, 서열식별번호: 120 및 121의 Fab는, 서열식별번호: 120 및 121을 코딩하는 cDNA 서열을 2개의 발현 플라스미드 내로 클로닝한 후, 두 플라스미드의 1:1 믹스를 형질감염에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 14: VHH-기반 융합체 13의 재조합 발현 및 정제
실시예 14는 하기의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1-VHH 융합체이다.
Figure pct00078
여기서, 서열식별번호: 116의 VHH 융합체는 서열식별번호: 116을 코딩하는 cDNA 서열을 발현 플라스미드에 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1에 대해 설명된 바와 같이 생성된다.
실시예 15: VHH-기반 접합체 1의 생산
실시예 15는 하기의 화학 구조를 갖는 GLP-1/ACTH-VHH 접합체이다.
Figure pct00079
서열식별번호: 117의 VHH 접합체는 하기와 같이 생성된다. 10 mg/mg 원액을 PBS pH 7.2로 10배 희석함으로써 1 mg/mL (~50 μM)로 실시예 14의 VHH 융합체 (서열식별번호: 116) 1 mg을 제조한다. PBS, pH 7.2 중 4 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 균질한 단량체로의 성공적인 환원을 질량 분광측정법을 통해 확인한다.
반응 혼합물을 2 mL 7K MW 컷오프 ZEBA 탈염 칼럼을 사용하여 탈염시킨다. 칼럼 저장 완충제를 1000 rcf에서 1분 동안 회전시킴으로써 제거한다. 칼럼을 PBS pH 7.2 2 mL를 첨가하고 1000 rcf에서 1분 동안 회전시킴으로써 세척한다. 반응 혼합물을 ZEBA 칼럼 상에 로딩하고, 1000 rcf에서 1분 동안 회전시킴으로써 깨끗한 15 mL 원추형 바이알 내로 탈염시킨다. 탈염된 샘플을 3K MW 컷오프 아미콘 울트라 스핀 칼럼을 사용하여 ~700 μM (~100 μL)로 농축시킨다.
ACTH-(PEG)12-말레이미드-NH2 (서열식별번호: 119)를 PBS pH 7.2 중에서 20 mg/mL (5.2 mM)로 제조한다. 2 화학량론적 당량에 상응하는 20 μL ACTH-(PEG)12-말레이미드-NH2를 실시예 14 (서열식별번호: 116)의 VHH 융합체의 탈염 및 농축 용액에 첨가한다. 백색 침전물이 즉시 형성된다. 반응을 10분 동안 계속하고, 용액이 투명해질 때까지 0.1 M HCl을 천천히 첨가하여 pH를 5.5로 낮춤으로써 용액을 가용화시킨다. 성공적인 접합은 질량 분광측정법을 통해 확인한다.
목적 생성물을 PBS, pH 7.2의 로딩 완충제 및 20 mM 시트레이트, pH 3의 용리 완충제를 사용하는 5 mL 맙셀렉트 단백질 A 수지 (지이 헬스케어) 칼럼을 사용하여 AKTA 정제 시스템 상에서 정제한다. 샘플을 칼럼 상에 로딩하고, 로딩 완충제 상을 미반응 ACTH-(PEG)12-말레이미드-NH2에 대한 피크가 칼럼을 통과할 때까지 유지한다. 신호가 기준선으로 돌아오면, 완충제를 20 mM 시트레이트, pH 3으로 교체하여, 원하는 생성물을 칼럼으로부터 용리시킨다. 1 mL 분획을 용리시 수집하고, 풀링하고, 트리스 HCl, pH 8을 사용하여 pH를 7로 조정한다.
말레이미드 고리를 개환하기 위해, 0.1 M NaOH를 첨가하여 pH를 8로 조정하고, 실온에서 밤새 둔다. 부분 개환을 완료까지 유도하기 위해, pH를 8.5로 조정하고, 실온에서 추가로 24시간 동안 인큐베이션한다. 개환의 완료를 질량 분광측정법에 의해 확인하고, 0.1 N HCl을 첨가하여 다시 약 7.2로의 최종 pH 조정을 수행한다. 이어서, 실시예 15의 VHH 접합체를 4℃에서 보관한다.
실시예 16: VHH-기반 접합체 2의 생산
실시예 16은 하기 화학 구조를 갖는 ACTH-VHH 접합체이다.
Figure pct00080
서열식별번호: 118의 VHH 접합체는 하기와 같이 생성된다. 10 mg/mg 원액을 PBS, pH 7.2로 10배 희석함으로써 1 mg/mL (약 70 μM)로 1 mg의 대조군 VHH (서열식별번호: 37)를 제조한다. PBS, pH 7.2 중 4 당량의 TCEP를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 균질한 단량체로의 성공적인 환원을 질량 분광측정법을 통해 확인한다.
반응 혼합물을 2 mL 7K MW 컷오프 ZEBA 탈염 칼럼을 사용하여 탈염시킨다. 칼럼 저장 완충제를 1000 rcf에서 1분 동안 회전시킴으로써 제거한다. 칼럼을 PBS, pH 7.2, 2 mL를 첨가하고 1000 rcf에서 1분 동안 회전시킴으로써 세척한다. 반응 혼합물을 ZEBA 칼럼 상에 로딩하고, 1000 rcf에서 1분 동안 회전시킴으로써 깨끗한 15 mL 원추형 바이알 내로 탈염시킨다. 탈염된 샘플을 3K MW 컷오프 아미콘 울트라 스핀 칼럼을 사용하여 약 700 uM (~100 μL)로 농축시킨다.
ACTH-(PEG)12-말레이미드-NH2 (서열식별번호: 119)를 제조하고, 실시예 15에 기재된 바와 같이 VHH에 접합시킨다.
시험관내 기능 - 알부민 결합
실시예 17: VHH 모이어티의 SPR을 통한 알부민-결합 연구
인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 혈청 알부민 (SA)에 대한 다양한 VHH 모이어티의 시험관내 결합을 SPR에 의해 결정한다. 특히, 이들 종의 SA에 대한 본원의 VHH 모이어티의 결합은 하기 표 1에 요약된다. 다양한 SA에 대한 서열식별번호: 3 및 8 내지 28의 VHH 모이어티의 결합을 비아코어 8K 기기 상에서 수행한다.
시리즈 S 센서 칩 CM5 표면에의 SA의 고정화는 제조업체의 지침 (아민 커플링 키트 BR-1000-50)에 따라 수행된다. 간략하게, 75 mg/mL 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 11.5 mg/mL N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 함유하는 혼합물 70 μL를 10 μL/분으로 주입함으로써 센서 칩 표면 (유동 셀 1 및 2) 상의 카르복실 기를 활성화시킨다. 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA를 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.0 (BR-1003-49) 중에 1, 1, 3, 1, 1, 1 및 1 μg/mL로 희석한 다음, 활성화된 칩 표면 (유동 셀 2, 채널 1 내지 8) 상에 10 μL/분으로 90초 동안 주입한다. 인간 SA는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) (미주리주 세인트 루이스; 카탈로그 번호 A8763)로부터 입수한다. 시노몰구스 원숭이 SA를 아텐스 알앤티(Athens R&T) (조지아주 아텐스; 카탈로그 번호 16-16-011202-CM)로부터 입수한다. 마우스 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A3559)로부터 입수한다. 래트 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A4538)로부터 입수한다. 돼지 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A4414)로부터 입수한다. 개 SA는 몰레큘라 이노베이션스(Molecular Innovations) (미시간주 노비; 카탈로그 번호 DSA-1213 NC0739153)로부터 입수한다. 소 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A7030)로부터 입수한다. 다양한 SA를 평균 대략 77 (58-98) RU의 표면 밀도를 표적으로 하는 카르복시메틸 덱스트란-코팅된 센서 칩 CM5 상에 유리 아민을 통해 공유 고정화시킨다. 표면 (유동 셀 1 및 2) 상의 과량의 반응성 기를 70 μL의 1 M 에탄올아민 히드로클로라이드-NaOH, pH 8.5를 10 μL/분으로 주입함으로써 불활성화시킨다.
VHH 모이어티를 300 nM의 농도로 HBS-EP + 완충제 (10 mM HEPES, pH 7.6, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 폴리소르베이트 20) 중에 희석한다. 150 μL의 샘플을 고정화된 SA 표면을 가로질러 순차적으로 개별적으로 주입하고, 25℃에서 50 μL/분의 유량으로 600초 동안 해리시킨다. 10 mM 글리신-HCl, pH 1.5, (BR-1003-54)를 50 μL/분으로 100초 동안 주입함으로써 표면을 재생시킨다. 생성된 센서그램을 비아코어 8K 인사이트 평가 소프트웨어 (버전 2.0.15.12933)를 사용하여 분석하여 해리율 (kd)을 계산한다.
표 1: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA에 대한 예시적인 VHH 모이어티의 결합.
Figure pct00081
Figure pct00082
실시예 18: SPR을 통한 VHH-기반 융합체 알부민-결합 연구
인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 VHH-기반 융합체의 시험관내 결합을 25℃에서 SPR에 의해 결정한다. 특히, 이들 종의 SA에 대한 실시예 1 내지 9의 VHH-융합체의 친화도는 하기 표 2 내지 10에 요약된다.
다양한 SA에 대한 실시예 1 내지 9의 VHH-기반 융합체의 결합을 비아코어 8K 기기 상에서 수행한다. 시리즈 S 센서 칩 CM5 (BR-1006-68) 표면에 대한 다양한 SA 오르토로그의 고정화는 제조업체의 지침 (아민 커플링 키트 BR-1000-50)에 따라 수행된다. 간략하게, 75 mg/ml 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 11.5 mg/ml N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 함유하는 혼합물 70 μl를 10 μl/분으로 주입함으로써 센서 칩 표면 (유동 셀 1 및 2) 상의 카르복실 기를 활성화시킨다. 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 마우스, 개, 돼지, 소 및 토끼 SA를 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.0 (BR-1003-49) 중에 1 및 0.8 μg/ml, 1 및 0.8 μg/ml, 1.5 및 0.8 μg/ml, 4 및 2.5 μg/ml, 1 및 0.8 μg/ml, 1 및 1 μg/ml, 1 및 1 μg/ml, 및 1 및 1.5 μg/ml로 희석한 다음, 활성화된 칩 표면 (유동 셀 2, 채널 1 내지 8) 상에 10 μl/분으로 100초 동안 주입한다. 인간 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A8763)로부터 입수한다. 시노몰구스 원숭이 SA는 아텐스 알앤티 (카탈로그 번호 16-16-011202-CM)로부터 입수한다. 마우스 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A3139)로부터 입수한다. 래트 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A4538)로부터 입수한다. 돼지 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A4414)로부터 입수한다. 개 SA는 몰레큘라 이노베이션스 (미시간주 노비; 카탈로그 번호 DSA-1213 NC0739153)로부터 입수한다. 소 SA는 시그마 알드리치 (카탈로그 번호 A7030)로부터 입수한다. 토끼 SA는 피츠게랄드 인더스트리즈 인터내셔널(Fitzgerald Industries International) (매사추세츠주 액톤; 카탈로그 번호 30R-3303)로부터 입수한다. SA를 유리 아민을 통해 카르복시메틸 덱스트란-코팅된 센서 칩 CM5 상에 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 마우스, 개, 돼지 및 소 SA에 대한 25-78 공명 단위 (RU) 뿐만 아니라 토끼 SA에 대한 118-372 공명 단위 (RU)의 표면 밀도로 공유 고정화시킨다. 표면 (유동 셀 1 및 2) 상의 과량의 반응성 기를 70 μl의 1 M 에탄올아민 히드로클로라이드-NaOH pH 8.5를 주입함으로써 불활성화시킨다.
VHH-융합체를 1000, 333.3, 111.1, 37.04, 12.35, 4.12, 1.37, 0.457, 0.152, 0.051 및 0.017 nM의 농도로 HBS-EP+ 완충제 (10 mM HEPES pH 7.6, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 폴리소르베이트 20) 중에 희석한다. 180 μl의 샘플을 칩의 표면 상의 고정화된 SA를 가로질러 순차적으로 개별적으로 주입하고, 25℃에서 60 μl/분 유량으로 600초 동안 해리시킨다. 10 mM 글리신-HCl pH 1.5 (BR-1003-54)를 60 μl/분으로 100초 동안 주입함으로써 표면을 재생시킨다. 생성된 센서그램을 비아코어 8K 인사이트 평가 소프트웨어 (버전 3.0.11.15423) 1:1 결합 동역학 모델 피팅을 사용하여 분석하여 결합 동역학 파라미터: 회합률 (ka), 해리율 (kd), 및 평형 해리 상수 (KD)를 계산한다.
표 2: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 1의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00083
KD는 실시예 1의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 3.2, 13, 100, 83, 190, 40 및 820 nM로 결정된다.
표 3: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 2의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00084
KD는 실시예 2의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 0.58, 1.2, 8.8, 6.1, 19, 3.7 및 110 nM로 결정된다.
표 4: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 3의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00085
KD는 실시예 3의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 1.9, 6.1, 62, 52, 130, 19 및 470 nM로 결정된다.
표 5: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 4의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00086
KD는 실시예 4의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 0.19, 0.94, 6.4, 3.1, 15, 2.2 및 100 nM로 결정된다.
표 6: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 5의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00087
KD는 실시예 5의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 0.2, 0.45, 0.86, 0.74, 3.3, 0.6 및 28 nM로 결정된다.
표 7: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 6의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00088
KD는 실시예 6의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 1.5, 5.0, 50, 34, 100, 19 및 380 nM로 결정된다.
표 8: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 7의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00089
KD는 실시예 7의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 0.23, 0.39, 3.9, 3.0, 13, 1.8 및 78 nM로 결정된다.
표 9: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 8의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00090
KD는 실시예 8의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 0.15, 0.96, 18, 11, 27, 5.4 및 120 nM로 결정된다.
표 10: 25℃에서의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소 및 토끼 SA에 대한 실시예 9의 VHH-기반 융합체의 결합 동역학.
Figure pct00091
KD는 실시예 9의 VHH-기반 융합체와의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 개 및 소 SA 결합에 대해 각각 1.3, 4.3, 43, 33, 83, 15, 및 340 nM로 결정된다.
시험관내 기능 - 페이로드의 비활성
실시예 19: 실시예 1 및 2의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력
인간 CNTFR pSTAT3 검정: 인간 CNTFR, LIFR 및 gp130을 내인성으로 발현하는 IMR-32 세포 (ATCC, 카탈로그# CCL-127)를 37℃, 5% CO2, 90% 습도에서 최종 10% FBS, 1 mM 피루브산나트륨 및 1X 항생제-항진균제 (써모 피셔 사이언티픽, 15240062)로 보충된 RPMI-1640 (ATCC, Cat# 30-2001) 배지 중에서 배양한다. 제-1일 (pSTAT3 검정 전날)에, 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, 세포 해리 완충제 (깁코(Gibco), 13151)를 사용하여 플라스크로부터 채취하고, 상기 언급된 배양 배지 중에 재현탁시킨다. 세포를 96-웰 폴리 D 리신 코팅된 플레이트 (코닝(Corning); 카탈로그# 354640)에 150,000개 세포/0.1 mL/웰로 플레이팅한다. 세포를 37℃, 5% CO2, 90% 습도에서 밤새 배양한다. 제1일 (pSTAT3 검정일)에, 배지를 흡인 제거하고, 100 μL EMEM (ATCC, 카탈로그# 30-2003)으로 대체한다. 세포를 37℃, 5% CO2, 90% 습도에서 4시간 동안 혈청 고갈시킨 다음, 50 μL의 3x 연속 희석된 인간 CNTF (알앤디 시스템즈(R&D Systems); 카탈로그# 257-NT-010), 0.3% IgG 무함유 BSA (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.); Cat# 001-000-162) 중 실시예 1 또는 실시예 2를 첨가한다. EMEM을 최종 1X 농도로 첨가한다. 세포를 이들 연속 희석된 단백질과 함께 37℃, 5% CO2, 90% 습도에서 추가로 10분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간이 완료된 후, 내용물을 플레이트로부터 꺼낸다. 세포를 용해시키고, 알파리사 슈어파이어 울트라(AlphaLISA Surefire Ultra) p-STAT3 (Tyr705) 검정 키트 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer); ALSU-PST3) 및 부착 세포에 대한 그의 2-플레이트 검정 프로토콜을 사용하여 pSTAT3을 검출한다. 플레이트를 엔비전(Envision) 2102 기기 (퍼킨 엘머) 상에서 판독한다.
데이터의 통계적 분석: 데이터를 엔비전 2102 기기 판독기로부터 엑셀(Excel)® (마이크로소프트(Microsoft))로 입력한다. 최대 (1 nM) 인간 CNTF 자극된 pSTAT3 신호의 %를 시험된 단백질의 각각의 농도에 대해 계산한다. EC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)® 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 엘엘씨(GraphPad Software, LLC); 캘리포니아주 라 졸라; 버전 8.4.3)를 사용하여 가변 기울기-4 파라미터 용량 반응 곡선 분석에 의해 이들 계산으로부터 생성한다. 검정의 결과는 하기 표 11에 제시된다.
표 11: 인간 CNTF 수용체에 대한 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력.
Figure pct00092
실시예 20: 실시예 3 및 4의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력
디스커버엑스/유로핀스(DiscoverX/eurofins)로부터의 세포-기반 이량체화 생물검정 (패쓰헌터 익스프레스(PathHunter eXpress) ErbB4/ErbB4 이량체화 검정 카탈로그# 93-0961E3)을 수행하여 인간 Eb4 수용체 (NCBI 참조 서열 번호 NP_001036064.1)에서 실시예 3 및 4의 VHH 융합체의 효력을 시험한다. 검정은 수용체-이량체 쌍의 2개의 서브유닛의 리간드 유도된 이량체화를 검출하고, 효력을 평가하도록 설계된다. 시험은 제조업체에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행된다. 간략하게, 세포를 해동시키고, 제공된 96-웰 플레이트에 웰당 100 uL로 플레이팅한다. 5% CO2 하에 37℃에서 24시간 인큐베이션 후에, 10 μL 11X의 실시예 3, 실시예 4 및 대조군 효능제, rhNRG-1 (유로핀스 카탈로그# 92-1091)을 11-포인트 연속 희석 곡선 (1:3)으로 적절한 웰에 이중으로 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 6-시간 인큐베이션 후, 110 μL 검출 시약을 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 암실에서 추가의 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 화학발광 신호를 0.5초 통합 시간을 사용하여 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)의 스펙트라맥스(SpectraMax) i3x 플레이트 판독기) 상에서 판독한다. 미가공 데이터의 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 버전 9.0으로 수행한다. 평균 배경 판독치를 모든 값으로부터 차감하고, 미가공 데이터를 변환시키고, 비-선형 회귀 분석 (log(효능제) 대 반응 - 가변 기울기 (4 파라미터))을 실행하여 EC50 값을 얻고, 적합도 (모든 데이터에 대해 n = 2)를 결정한다.
표 12: 디스커버엑스 패스헌터 ErbB4 생물검정에서의 실시예 3 및 4의 VHH-기반 융합체의 효력.
Figure pct00093
실시예 21: 실시예 5의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력
HEK293 인간 GFRAL- 및 인간 RET-발현 세포주의 생성: HEK293 세포 (ATCC)를 10% FBS 및 25 mM HEPES, 1x 항생제를 함유하는 DMEM 중에서 배양하고, 트리플(TrypLE)™ 익스프레스(Express) (깁코)로 3-4일마다 1:16으로 분할한다. 세포를 제조업체의 지침에 따라 인간 GFRAL (GDNF 수용체 알파 유사; NCBI 참조 서열 번호 NP_997293.2), 인간 RET (원종양유전자 티로신-단백질 키나제 수용체 RET; NCBI 참조 서열 번호 NP_066124.1) 및 퓨진 6 (프로메가(Promega))의 플라스미드 DNA로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 3-4주 동안 제네티신 (깁코, 1 mg/ml) 및 퓨로마이신 (깁코, 0.1 mg/ml)으로 선택한다. 클론 세포주를 96-웰 플레이트 내로의 제한 희석 클로닝에 의해 수득하고, 알파리사 슈어파이어 울트라 p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) 검정 키트 (퍼킨엘머)에 의해 GDF15 반응으로 확인한다. 클론을 확장시키고, 수거하고, 동결 배지 중에 재현탁시키고, 냉동바이알 내로 분취하고, 장기간 저장을 위해 액체 질소 중에 유지시킨다. 최고 반응자는 최상의 GDF15 반응 (신호 대 배경 비), 클론 세포주 #7로 선택된다.
인간 GFRAL 및 RET 수용체 알파리사 슈어파이어 울트라 p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) 검정: 인간 GFRAL 및 인간 RET를 발현하는 HEK293 세포주를 선택 배지 (10% FBS + 25 mM HEPES, 1x 항생제, 1 μg/mL 퓨로마이신, 1 mg/mL 제네티신을 함유하는 DMEM)와 함께 배양한다. 제-3일 (세포 플레이팅일)에, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 트리플™ 익스프레스를 갖는 플라스크로부터 채취하고, 플레이팅 배지 (25 mM HEPES, 1x 항생제, 10% FBS를 함유하는 DMEM) 중에 재현탁시킨다. 세포를 96-웰 플레이트 (코닝 카탈로그# 356461)에 20,000개 세포/0.1 mL/웰로 플레이팅한다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양한다. 제1일 (검정일)에, 배지를 제거하고, 50 μL 무혈청 배지 (25 mM HEPES, 1x 항생제를 함유하는 DMEM)로 대체한다. 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 μL의 2x 리간드를 첨가한다 (GDF15, 최종 1x). 플레이트를 37℃에서 추가로 10분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간이 완료된 후에, 배지를 경사분리 및 백색 유틸리티 와이프스 상에서의 블롯팅에 의해 플레이트로부터 제거한다. 이어서, 50 μL의 1x 알파리사 슈어파이어 울트라 용해 완충제를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 플레이트 진탕기 상에서 350 rpm에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 후속적으로, 부착 세포에 대한 2-플레이트/1-인큐베이션 프로토콜에 대한 제조업체의 지침 (알파리사 슈어파이어 울트라 p-ERK (Thr202/Tyr204) 검정 키트, 퍼킨엘머 카탈로그# ALSU-pERK-A10K)에 따라, 10 μL 세포 용해물, 5 μL 수용자 믹스, 및 5 μL 공여자 믹스를 옵티플레이트(OptiPlate)™-384 플레이트 (퍼킨엘머 cat# 6007290)에 첨가한다. 플레이트를 밀봉하고, 호일로 랩핑하고, 플레이트 진탕기 상에서 250 rpm에서 실온에서 1분 동안 인큐베이션하고, 암실에서 실온에서 8시간 동안 인큐베이션한 다음, 엔비전 매니저(EnVision Manager) 소프트웨어 (퍼킨엘머)를 사용하여 엔비전 2102 멀티라벨 리더(Multilabel Reader) 상에서 판독한다.
데이터의 통계적 분석: 데이터를 엔비전 2102 멀티라벨 리더로부터 그래프패드 프리즘® 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 엘엘씨; 캘리포니아주 라 졸라; 버전 8)로 입력한다. EC50 값은 가변 기울기-4 파라미터 용량 반응 곡선 분석에 의해 생성된다.
표 13: 실시예 5의 VHH-기반 융합체에 의한 인간 GFRAL & RET51을 발현하는 HEK293 세포에서의 ERK1/2 인산화의 자극.
Figure pct00094
실시예 22: 실시예 6 및 7의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력
디스커버엑스, 패스헌터 IL-2 생물검정 키트 (유로핀스/디스커버엑스 파트 # 93-1003Y3-00091)로부터의 세포-기반 이량체화 생물검정을 사용하여 실시예 6 및 7의 VHH-기반 융합체의 효력을 평가한다. 검정은 IL-2 수용체-이량체 쌍의 2개의 서브유닛의 IL-2 유도된 이량체화를 검출하고, IL-2 효력을 평가하도록 설계된다. 검정은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행된다. 간략하게, 세포를 해동시키고, 제공된 96-웰 플레이트에 웰당 80 uL로 플레이팅한다. 5% CO2 하에 37℃에서 20시간 인큐베이션 후, 20 μL의 5X 원액 농도의 실시예 6 및 7 및 제공된 IL-2 참조 표준을 11-포인트 연속 희석 곡선 (1:3)으로 적절한 웰에 이중으로 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 실시예 6 및 7 및 참조 표준과의 6-시간 인큐베이션 후, 10 μL 검출 시약 1을 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트 진탕기 상에서 350 rpm에서 1분 동안 혼합을 달성하고, 플레이트를 암실에서 15분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 그 후, 40 μL의 검출 시약 2를 각각의 웰에 첨가하고, 암실에서 추가 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 화학발광 신호를 1-초 통합 시간을 사용하여 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스의 스펙트라맥스 i3x 플레이트 판독기) 상에서 판독한다. 미가공 데이터의 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 버전 8.4.3으로 수행한다. 미가공 데이터를 변환시키고, 비-선형 회귀 분석 (log(효능제) 대 반응 - 가변 기울기 (4 파라미터))을 실행하여 EC50 값을 얻고, 적합도 (모든 데이터에 대해 n = 2)를 결정한다.
표 14: 디스커버엑스 패스헌터 IL-2 생물검정에서의 실시예 6 및 7의 VHH-기반 융합체의 효력.
Figure pct00095
실시예 23: 실시예 9 및 13의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력
L929 세포-기반 세포독성 검정을 사용하여 가용성 인간 TNFα, 가용성 시노 TNFα 또는 막-결합된 인간 TNFα의 실시예 9 및 13의 시험관내 중화 효력을 평가한다.
인간 TNFα 수용체를 내인성으로 발현하는 L929 세포 (ATCC)를 10% 열-불활성화 FBS, 2 mM L-글루타민, 1x 비-필수 아미노산, 1x 피루브산나트륨, 1x 항생제를 함유하는 DMEM 고 글루코스 배지에서 배양하고, 트리플™ 익스프레스 (깁코)로 3-4일마다 1:20으로 분할한다.
가용성 인간 TNFα 단백질은 신진(Syngene) (인도 방갈로르)에 의한 맞춤 합성으로부터 입수한다. 가용성 시노 TNFα 단백질은 알앤디 시스템즈 (미네소타주 미네아폴리스; 카탈로그 #1070-RM/CF)로부터 입수한다.
안정한 MT104 H2 CHO-막 인간 TNFα-발현 세포주를 일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company) (인디애나주 인디애나폴리스)에서 생성한다. 세포를 8 mM L-글루타민 및 선택제 G418 (500 μg/mL)을 함유하는 릴리 배지 LM7300 중에서 배양하고, 3-4일마다 1:10으로 분할한다.
L929 세포독성 검정: 제1일에, L929 세포를 5 mL 트리플™ (깁코# 12605036)로 트립신처리하고, 완전 배지를 첨가하고 (1:3 부피), 1000 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리한다. 상청액을 부드럽게 흡인하고, 세포를 15 mL의 완전 배지 (10% 열-불활성화 FBS, 2 mM L-글루타민, 1x 비-필수 아미노산, 1x 피루브산나트륨, 1x 항생제를 함유하는 DMEM 고 글루코스 배지) 중에 재현탁시키고, 세포의 분취물을 비아셀 계수기를 사용하여 계수한다. 세포를 96-웰 폴리-D 리신-코팅된 플레이트 (코닝#354496)에 10,000개 세포/0.1 mL/웰로 플레이팅하고, 37℃ 5% CO2에서 밤새 배양한다. 제2일에, 실시예 9 및 13을 고정량의 항원: 액티노마이신 D (6.25 μg/mL)를 함유하는 DMEM + FBS 중 가용성 인간 TNFα (200 pg/mL) 또는 가용성 시노 TNFα (750 pg/mL) 또는 막 인간 TNFα 발현 세포 (5000개 세포/mL)로 적정한다. 출발 농도는 가용성 인간 TNF, 가용성 시노 TNF 및 막 인간 TNF 중화에 대해 각각 1.5 μg/mL, 3 μg/mL 및 10 μg/mL이고, 3배 연속 희석에 의해 8 포인트 아래까지 적정한다. 적정된 화합물-항원 복합체를, 배지를 제거한 후 L929 세포를 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다. 자극된 음성 대조군 웰은 L929 세포 + 악티노마이신 D + TNFα 항원을 함유하는 반면, 비자극 대조군 웰은 L929 세포 + 악티노마이신 D만을 포함한다.
제3일에, 배지를 96-웰 플레이트로부터 제거하고, 120 μL의 세포 역가 수성 ONE 기질 용액 (DMEM 배지 +FBS 중 1:6 희석)을 모든 플레이트 상의 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 소프트맥스(Softmax) 4.7 소프트웨어를 사용하여 스펙트라 맥스 플레이트 판독기 상에서 2시간 후에 OD 490 nm에서 판독한다.
데이터 분석: 농도에 대한 OD 판독치를 엑셀® (마이크로소프트; 워싱턴주 레드몬드)에서 그래프화하고; EC50 계산 및 통계적 분석을 일라이 릴리(Eli Lilly) 통계 소프트웨어 도구 (글로벌 스타츠 디스커버리 팀(Global Stats Discovery Team), 릴리)를 사용하여 수행한다.
표 15: 가용성 인간 TNFα를 중화시키는 실시예 9 및 13의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력.
Figure pct00096
표 16: 가용성 시아노 TNFα를 중화시키는 실시예 9 및 13의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력.
Figure pct00097
표 17: 막 인간 TNFα를 중화시키는 실시예 9 및 13의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력.
Figure pct00098
표 18: 다양한 형태의 인간 및 시노 TNFα를 중화시키는 실시예 9 및 13의 VHH-기반 융합체의 시험관내 효력.
Figure pct00099
실시예 24: 실시예 15 및 16의 다중-특이적 VHH-기반 융합체 및 접합체의 시험관내 활성
디스커버엑스 (유로핀스)로부터 구입한 세포-기반 시클릭 AMP 검정 키트를 사용하여 GLP1R 및 MC3R에서의 실시예 15 및 16의 VHH-기반 접합체의 활성을 평가한다. cAMP의 경우, 헌터 익스프레스 GLP1R CHO-K1 GPCR 검정 (카탈로그# 95-0062E2)을 사용하고, 내부 GLP-1 표준 (서열식별번호: 99)을 양성 대조군으로서 사용한다. cAMP의 경우, 헌터 익스프레스 MC3R CHO-K1 GPCR 검정 (카탈로그 # 95-0045E2)을 사용하고, α-MSH를 양성 대조군으로서 사용한다. 검정은 제조업체에 의해 제공된 GPCR 검정 프로토콜에 따라 수행된다. 간략하게, 세포를 해동시키고, 96-웰 플레이트에 웰당 100 μL로 플레이팅한다. 5% CO2 하에 37℃에서 24-시간 인큐베이션 후에, 15 μL 3X 효능제 (VHH 접합체/융합체 및 대조군) 및 cAMP 표준을 적절한 웰에 이중으로 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. cAMP 작업 검출 용액을 제조하고, 광으로부터 보호하여 실온에서 유지한다. VHH 융합체 또는 접합체와의 30분 인큐베이션 후에, 15 μL cAMP 항체 시약을 각각의 웰에 첨가한다. 항체 시약을 첨가한 직후, 인큐베이션 기간 동안 제조된 60 μL의 cAMP 작업 검출 용액을 첨가한다. 플레이트를 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 다음, 60 μL의 cAMP 용액 A를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 암실에서 3-18시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 화학발광 신호를 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스의 스펙트라맥스 i3x 플레이트 판독기) 상에서 판독한다. 미가공 데이터의 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 버전 8로 수행한다. 미가공 데이터를 변환시키고, 비-선형 회귀 분석 (log(효능제) 대 반응 - 가변 기울기 (4 파라미터))을 실행하여 EC50 값을 얻고, 적합도 (모든 데이터에 대해 n = 2)를 결정한다.
표 19: MC3R에서의 실시예 15 및 16의 VHH-기반 접합체의 시험관내 효력.
Figure pct00100
표 20: GLP1R에서의 실시예 15의 VHH-기반 접합체의 시험관내 효력.
Figure pct00101
생체내 기능 - 각각의 페이로드에 대한 장기-작용 비(specific) PD
실시예 25: 실시예 1 및 2의 VHH-기반 융합체의 생체내 활성 (건강한 마우스에서의 체중 감소)
연구는 타코닉(Taconic)으로부터 공급받은 48마리의 수컷 DIO C57BL6 마우스를 사용하여 수행된다. 마우스는 연구 시작시 15주령이다. 동물을 자동화 가정용수 (2-5 ppm 염소) 및 고지방 사료 (TD95217)에 자유롭게 접근하도록 하여 마이크로-아이솔레이터 케이지에 단일 수용한다. 마우스를 생체내 군 무작위화를 위해 릴리(Lilly) 통계학자에 의해 개발된 블록 무작위화 배정 도구를 사용하여 체중에 기초하여 8개의 군 (n = 6)으로 무작위화한다. 잠재적 스트레스-관련 연구-효과를 감소시키기 위해, 모든 동물을 연구 시작 전 적어도 3일 동안 매일 취급에 순응시킨다. 연구 시작 전 2일 동안에 이어서 연구 전반에 걸쳐 매일, 체중 및 음식 중량을 기록한다. 0.5 mL 28G 인슐린 시린지 (BD 카탈로그# 329461)를 사용하여 연구 과정 (QD 투여 스케줄)에 걸쳐 견갑간부에서 치료를 피하로 투여한다. 천연 CNTF (알앤디 시스템즈, 재조합 인간 CNTF 카탈로그# 257-NT/CF, 로트 # GL402101A), 실시예 1, 및 실시예 2를 투여 30분 내에 멸균 PBS pH 7.2 중에 적절한 농도로 희석한다. 천연 CNTF를 0.25 mpk로 투여한다. 실시예 1 및 실시예 2를 0.25 mpk 또는 0.1 mpk로 투여한다. 전날로부터의 평균 군 체중에 기초하여 매일 각각의 치료에 대해 희석을 계산한다. 200 μL의 PBS를 비히클 대조군의 동물에게 투여한다. 생체내 PD 연구를 위해 릴리 통계학자에 의해 개발된 엄격한 모델-기반 접근법으로 내부 통계적 도구를 사용하여 체중 변화를 분석한다. 20% 체중 감소에 도달했을 때 투여 일자에 관계없이 동물을 연구로부터 제외한다.
표 21: 다양한 시점에서의 건강한 마우스에서의 체중에 대한 다양한 용량의 실시예 1 및 2의 VHH-기반 융합체의 효과
Figure pct00102
표 22: 다양한 시점에서의 건강한 마우스에서의 체중에 대한 다양한 용량의 실시예 1 및 2의 VHH-기반 융합체의 효과의 통계적 분석.
Figure pct00103
P-값은 천연 CNTF 0.25 mpk 처리군과 비교한 것이다.
표 21 및 22에 제시된 바와 같이, 모든 처리군은 연구 제3일에 비히클 군과 비교하여 유의한 체중 감소를 입증한다. 0.1 mpk로 투여한 실시예 1 및 실시예 2는 둘 다 0.25 mpk로 투여한 rhCNTF와 동등한 체중 감소를 나타낸다. 0.25 mpk의 실시예 1을 제공받은 동물은 연구 제2일에 0.25 mpk의 rhCNTF와 비교하여 유의하게 더 많은 체중 감소를 나타낸다. 0.25 mpk의 실시예 1을 제공받은 동물은 연구 제3일에 0.25 mpk의 rhCNTF와 비교하여 유의하게 더 많은 체중 감소를 나타낸다. 0.25 mpk 투여량의 실시예 1 및 2 둘 다를 제공받은 군의 동물은, 탈수 및/또는 20% BWL의 달성의 임상 징후로 인해 제5일 또는 제6일에 투여되지 않는다.
실시예 26: 실시예 3 및 4의 VHH-기반 융합체의 생체내 활성 (건강한 마우스의 혈액 화학 분석)
연구는 6주령으로 엔비고(Envigo)로부터 공급받은 48마리의 암컷 C57BL6 마우스를 사용하여 수행된다. 동물을 자동화 가정용수 (2-5 ppm 염소) 및 표준 사료 (테크라드(Teklad) 2014 설치류 유지 식이)에 자유롭게 접근하도록 하여 마이크로-아이솔레이터 케이지에 쌍으로 수용한다. 마우스를 생체내 군 무작위화를 위해 릴리 통계학자에 의해 개발된 블록 무작위화 배정 도구를 사용하여 체중에 기초하여 6개의 군 (n = 8)으로 무작위화한다. 잠재적 스트레스-관련 연구-효과를 감소시키기 위해, 모든 동물을 연구 시작 전 적어도 3일 동안 매일 취급에 순응시킨다. 연구 시작 전 2일 동안 체중 및 음식 중량을 기록한 다음, 연구 전반에 걸쳐 매일 모니터링 및 기록한다. 동물은 제1 투여 시점에 8주령이다. 0.5 mL 28G 인슐린 시린지 (BD 카탈로그# 329461)를 사용하여 총 3회 용량 (Q2D 투여 스케줄)에 대해 7일 동안 격일로 견갑간부에서 치료를 피하로 투여한다. 천연 NRG-1 (알앤디 시스템즈, 재조합 인간 NRG1-베타 1 EGF 도메인, CF, 카탈로그# 396-HB/CF, 배치# ACD182101A), 실시예 3 및 실시예 4를 투여 30분 내에 멸균 PBS pH 7.2 중에 적절한 농도로 희석한다. 천연 NRG-1을 1 mpk로 투여한다. 실시예 3 및 실시예 4를 1 및 0.3 mpk로 투여한다. 각각의 처리를 위한 희석은 전날로부터의 평균 군 체중에 기초하여 매일 계산된다. 비히클 대조군의 동물은 200 μL의 PBS를 SC 제공받는다. 치료는 연구 제1일, 제3일 및 제5일에 아침에 투여된다. 모든 동물을 이소플루란 (4%)으로 수술가능한 수준으로 마취시키고, 연구 제7일에 동물 관리 및 사용 프로토콜에 따라 안와후 출혈을 통해 방혈시킨다. 혈액을 혈청 분리기 튜브 (BD 카탈로그 # 365967) 내로 수집하고, 실온에서 최대 90분 동안 유지한다. 혈액을 10,000 RPM에서 10분 동안 회전 침강시킨다. 각각의 튜브로부터 혈청을 수집하고, Chem 18 분석을 위해 분취한다. 로슈 코바스(Roche Cobas) 8000 모듈 화학 분석기 상에서 혈청을 분석한다. Chem 18 분석을 위한 모든 시약은 후지필름 와코(Fujifilm WAKO) 시약을 사용하는 트리글리세리드 시험을 제외하고는 로슈(Roche)로부터 공급받는다. 던넷 방법을 사용한 군별 CI의 JMP 소프트웨어 일원 분석을 혈액 화학 값의 통계적 분석에 사용한다.
표 23: 건강한 마우스의 혈액 화학 값에 대한 실시예 3 및 4의 VHH-기반 융합체의 다양한 용량의 효과의 통계적 분석.
Figure pct00104
* 비히클 처리군으로부터 통계적으로 유의한 차이를 나타냄
표 23에 제시된 바와 같이, 실시예 3 & 4의 VHH 융합체는 비히클 대조군과 비교하여 혈액 화학에 대한 유의한 효과를 입증한다. 혈청 크레아티닌의 감소가 모든 처리군에 걸쳐 관찰되며, 실시예 4 및 천연 rhNRG1 대조군의 용량 수준 둘 다는 통계적으로 유의한 하락을 생성한다. 천연 rhNRG1 대조군을 투여한 동물 및 실시예 3 및 4 둘 다에 대한 1 mpk 투여군에 대해 기준선으로부터 ALP의 유의한 감소가 발생한다. 실시예 3의 용량 수준 둘 다에 대해, 실시예 4의 1 mpk 용량에서, 및 천연 rhNRG1 대조군에서 콜레스테롤 수준이 증가된다. 천연 rhNRG1 대조군 및 실시예 4의 0.3 mpk 투여군은 또한 BUN을 유의하게 감소시킨다.
실시예 27: 실시예 5의 VHH-기반 융합체의 생체내 활성 (건강한 마우스에서의 체중 감소).
24마리의 수컷 DIO C57BL6 마우스를 12주령에 타코닉으로부터 공급받았다. 동물을 자동화 가정용수 (2-5 ppm 염소) 및 고지방 사료 (TD95217)에 자유롭게 접근하도록 하여 마이크로-아이솔레이터 케이지에 단일 수용한다. 마우스를 생체내 군 무작위화를 위해 릴리 통계학자에 의해 개발된 블록 무작위화 배정 도구를 사용하여 체중에 기초하여 4개의 군 (n = 6)으로 무작위화한다. 잠재적 스트레스-관련 연구-효과를 감소시키기 위해, 모든 동물을 연구 시작 전 적어도 3일 동안 매일 취급에 순응시킨다. 연구 시작 전 2일 동안 체중 및 음식 중량을 기록한 다음, 연구 전반에 걸쳐 매일 모니터링 및 기록한다. 각각의 처리의 5회 용량을 0.5 mL 28G 인슐린 시린지 (BD 카탈로그# 329461)를 사용하여 연구 과정 (Q3D 투여 스케줄)에 걸쳐 견갑간부에 피하로 투여한다. 천연 GDF-15 (알앤디 시스템즈, 재조합, 카탈로그 #957-GD/CF; 배치 EHF232101A) 및 실시예 5의 VHH 융합 단백질을 투여 30분 내에 멸균 PBS pH 7.2 중에 적절한 농도로 희석한다. 전일로부터의 평균 군 체중에 기초하여 천연 GDF-15는 0.1 mpk로 투여하고, 실시예 5의 VHH 융합 단백질은 1 mpk 또는 0.1 mpk로 투여한다. 비히클 대조군의 동물은 200 μL의 PBS를 제공받는다. 생체내 PD 연구를 위해 릴리 통계학자에 의해 개발된 엄격한 모델-기반 접근법으로 내부 통계적 도구를 사용하여 체중 변화를 분석한다.
표 24: 다양한 시점에서의 건강한 마우스에서의 체중에 대한 다양한 용량의 실시예 5의 VHH-기반 융합체의 효과
Figure pct00105
표 25: 다양한 시점에서의 건강한 마우스에서의 체중에 대한 다양한 용량의 실시예 5의 VHH-기반 융합체의 효과의 통계적 분석.
Figure pct00106
P-값은 비히클 처리 대조군과 비교한 것이다.
표 24 및 25에 제시된 바와 같이, 비히클 대조군과 비교하여 제3일에 0.1 mpk 또는 1 mpk의 실시예 5의 VHH 융합 단백질로 처리된 군 둘 다에서 유의한 체중 감소가 발생한다. 천연 GDF-15 처리군에서의 체중 감소는 제9일에 유의성에 도달한다. 실시예 5의 VHH 융합 단백질의 1 및 0.1 mpk 용량 군 사이에 임의의 시점에서 체중 감소의 차이는 없었다. 1 mpk 또는 0.1 mpk 실시예 5의 VHH 융합 단백질을 제공받은 동물은 천연 GDF15로 처리된 동물과 비교하여 연구 시 제6일에 유의하게 더 많은 체중이 감소된다. 이러한 유의성은 나머지 연구 동안 지속된다.
실시예 28: 실시예 15의 VHH-기반 접합체의 생체내 활성 (건강한 마우스에서의 코르티코스테론 유도 및 체중 감소)
건강한 6-주령 암컷 C57BL6 마우스를 엔비고로부터 구입하고, 병에 담긴 가정용 여과수를 포함한 마이크로-아이솔레이터 케이지에 그룹 수용하고 (케이지당 3마리 마우스), 표준 사료 식이 (2014 테클라드 글로벌 설치류 유지 식이)를 공급한다. 마우스를 적어도 72시간 동안 수용 후에 순응시킨다. 마우스를 투여 1일 전에 칭량한다. 0.1, 0.3, 1 또는 3 nmol/kg의 실시예 15의 VHH 융합 접합체, 또는 비히클 (DPBS)의 단일 피하 용량을 제1일에 투여한다; 군당 n = 3. 코르티코스테론 수준 분석을 위한 건조 혈반 (DBS) 샘플의 수집을 위한 꼬리 관통을 투여 직전 (T0) 및 투여 2, 6, 24, 30, 48 및 72시간 후에 수행한다. 각각의 동물의 꼬리로부터의 혈액 약 20-30 μL를 와트만(Whatman) DMPK 카드 (WB129243) 상에 수집한다. DBS 카드를 코르티코스테론 수준 분석을 위해 사내 LC-MS 전문가에게 제공한다. 동물 체중을 또한 연구 전반에 걸쳐 매일 기록한다. 모든 생체내 실험 절차는 IACUC 표준에 따라 및 승인된 동물 사용 프로토콜 (19-033)에 따라 수행된다. 데이터는 각각 평균 코르티코스테론 수준 (ng/mL) 또는 제0일에 기록된 체중으로부터의 평균 퍼센트 변화로서 표 26 및 27에 보고된다.
표 26: 다양한 시점에서의 건강한 마우스에서의 코르티코스테론 수준에 대한 다양한 용량의 실시예 15의 VHH-기반 접합체의 효과.
Figure pct00107
P-값을 계산하여 그래프패드 프리즘 소프트웨어에서 개별 시점별로 처리군 대 비히클의 독립표본 T-검정을 사용하여 유의성을 결정한다.
표 26에 제시된 바와 같이, 실시예 15의 VHH-기반 접합체를 사용한 처리는 모든 용량 수준에 대해 투여 2 및 6시간 후에 비히클 대조군과 비교하여 코르티코스테론 수준의 유의한 유도를 이끈다. 3 mpk 투여군의 동물의 경우, 코르티코스테론 수준의 증가는 투여 30시간 후까지 비히클 대조군보다 유의하게 더 높게 유지된다.
표 27: 주사 72시간 후 건강한 마우스에서의 체중에 대한 다양한 용량의 실시예 15의 VHH-기반 접합체의 효과
Figure pct00108
표 27에 제시된 바와 같이, 실시예 15의 VHH-기반 접합체를 사용한 처리는 연구 과정에 걸쳐 1 nmol/kg 및 3 nmol/kg 처리군에서 체중 증가의 예방을 이끈다. 체중 증가율 (%)의 차이는 비히클 대조군과 비교하여 제3일에 상기 두 처리군에 대해 유의하다. P-값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어에서 처리군 대 비히클의 독립표본 T-검정을 사용하여 계산한다.
생체내 기능 - PK
실시예 29: 수컷 스프라그 돌리 래트에서의 실시예 4의 VHH-기반 융합체의 PK
수컷 스프라그 돌리 래트에게 2.6 mL/kg의 용량 부피로 PBS 완충제 (pH 7.4) 중에 제제화된, 실시예 4에 대한 106.8 nmol/kg의 단일 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 용량을 투여한다. 혈액을 PK 특징화를 위해 IV 경로의 경우 투여 1, 6, 12, 24, 48, 96, 144, 168 및 240시간 후에; 및 SC 경로의 경우 투여 6, 12, 24, 48, 96, 144, 168 및 240시간 후에 수집한다.
실시예 4의 VHH-기반 융합체의 혈장 농도를 Q/이그잭티브 플러스(Exactive Plus) 질량 분광계 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 알타사이언스 캄파니(Altascience Company) (캐나다 퀘벡 라발)에서 검증된 LC/MS 검정에 의해 결정한다. 실시예 4의 VHH 융합체 및 내부 표준을 항-VHH-항체-비오틴 접합체 및 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 사용한 면역침전을 통해 K3EDTA 래트 혈장으로부터 단리한다. 간섭 내인성 단백질을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 실시예 4의 단리된 VHH 융합체를 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신으로 소화시키고, 트립신 펩티드를 무손상 융합체의 대용 척도로서 LC/MS에 의해 분석한다. 실시예 4의 VHH 융합체의 혈장 농도를 사용하여 표 28에 나타낸 PK 파라미터를 계산한다.
표 28: 실시예 4의 VHH-기반 융합체에 대한, 수컷 스프라그 돌리 래트에게 투여된 단일 IV 또는 SC 용량 후의 평균 혈장 약동학적 파라미터.
Figure pct00109
주: 약어: t½ = 반감기, Tmax = 최대 농도까지의 시간, Cmax = 최대 관찰된 혈장 농도, C0 = 시점 0으로 외삽된 혈장 농도, AUC0-inf = 시점 0시간으로부터 무한대까지의 곡선하 면적, CL = 클리어런스, CL/F = 클리어런스/생체이용률. 표준 편차 값은 표에서 평균 PK 파라미터 아래에 괄호 안에 포함된다 (N = 3/군).
표 28에 제시된 바와 같이, 실시예 4의 VHH 융합체는 비-융합된 단백질에 비해 스프라그 돌리 래트에서 연장된 PK 프로파일을 입증한다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 30: 수컷 스프라그 돌리 래트에서의 실시예 5, 6 및 7의 VHH-기반 융합체의 PK
수컷 스프라그 돌리 래트에게 4 mL/kg의 용량 부피로 PBS 완충제 (pH 7.4) 중에 제제화된, 실시예 5에 대해서는 50 nmol/kg, 실시예 6 또는 7에 대해서는 25 nmol/kg의 단일 정맥내 (IV) 또는 피하 (SQ) 용량을 투여한다. 혈액을 PK 특징화를 위해 IV 경로의 경우 투여 1, 6, 12, 24, 48, 96, 144, 168 및 240시간 후에; 및 SQ 경로의 경우 투여 6, 12, 24, 48, 96, 144, 168 및 240시간 후에 수집한다.
실시예 5-7의 VHH-기반 융합체의 혈장 농도를 Q/이그잭티브 플러스 질량 분광계 (써모 사이언티픽, 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 코반스 래보러토리즈(Covance Laboratories) (인디애나주 그린필드)에서 검증된 LC/MS 검정에 의해 결정한다. 실시예 5-7의 VHH 융합체 및 내부 표준을 항-VHH-항체-비오틴 접합체 및 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 사용한 면역침전을 통해 K3EDTA 래트 혈장으로부터 단리한다. 간섭 내인성 단백질을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 실시예 5-7의 단리된 VHH 융합체를 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신으로 소화시키고, 트립신 펩티드를 무손상 융합체의 대용 척도로서 LC/MS에 의해 분석한다. 실시예 5-7의 VHH 융합체의 혈장 농도를 사용하여 표 29에 나타낸 PK 파라미터를 계산한다.
표 29: 실시예 5, 6 및 7의 VHH-기반 융합체에 대한, 수컷 스프라그 돌리 래트에게 투여된 단일 IV 또는 SQ 용량 후의 평균 혈장 약동학적 파라미터.
Figure pct00110
코멘트: *연구 지속기간은 PK 프로파일의 제거기를 완전히 특징화하기에는 너무 짧다. 데이터는 평균 값 (표준 편차는 괄호 안)이다: 실시예 5 값은 N = 3 (IV 및 SC 1-240시간)이고; 실시예 6 IV 값은 N = 3 (1-168시간) 및 N = 1 (240시간)이고, SC 값은 N = 3 (6-144시간)이고; 실시예 7 IV 값은 N = 3 (1-96시간), N = 2 (144시간), 및 N = 1 (168, 240시간)이고; SC 값은 N = 3 (6 내지 96시간), N = 2 (144시간), 및 N = 1 (168시간)이다.
주: 약어: t½ = 반감기, Tmax = 최대 농도까지의 시간, Cmax = 최대 관찰된 혈장 농도, C0 = 시점 0으로 외삽된 혈장 농도, AUC0-inf = 시점 0시간으로부터 무한대까지의 곡선하 면적, CL = 클리어런스, CL/F = 클리어런스/생체이용률.
표 29에 제시된 바와 같이, 실시예 5, 6 및 7의 VHH 융합체는 비-융합된 단백질에 비해 스프라그 돌리 래트에서 연장된 PK 프로파일을 입증한다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 31: 수컷 스프라그 돌리 래트에서의 실시예 9의 Fab-VHH 융합체 및 상응하는 비-융합된 Fab (실시예 13)의 PK
수컷 스프라그 돌리 래트에게 4 mL/kg의 용량 부피로 PBS 완충제 (pH 7.4) 중에 제제화된, 실시예 9에 대해서는 63.4 nmol/kg, 실시예 13에 대해서는 78.9 nmol/kg의 단일 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 용량을 투여한다. 혈액을 PK 특징화를 위해 IV 경로의 경우 투여 1, 6, 12, 24, 48, 96, 144, 168 및 240시간 후에; 및 SC 경로의 경우 투여 6, 12, 24, 48, 96, 144, 168 및 240시간 후에 수집한다.
실시예 9의 Fab-VHH 융합체 및 실시예 13의 상응하는 비-융합된 Fab의 혈장 농도를 Q/이그잭티브 플러스 질량 분광계 (써모 사이언티픽, 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 알타사이언스 캄파니 (캐나다 퀘벡 라발)에서 검증된 LC/MS 검정에 의해 결정한다. 실시예 9의 Fab-VHH 융합체 및 실시예 13의 Fab 및 내부 표준을 항-인간 카파 경쇄-비오틴 접합체 및 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드, 또는 항-VHH-항체-비오틴 접합체 및 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 사용한 면역침전을 통해 K3EDTA 래트 혈장으로부터 단리한다. 간섭 내인성 단백질을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 실시예 9 및 13의 단리된 단백질을 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신으로 소화시키고, 트립신 펩티드를 무손상 융합체의 대용 척도로서 LC/MS에 의해 분석한다. 실시예 9의 Fab-VHH의 혈장 농도 (표 30)를 사용하여 표 31에 제시된 PK 파라미터를 계산한다. 실시예 13의 비-융합된 Fab의 혈장 농도는 PK 파라미터를 계산하기에는 너무 낮다.
표 30: 실시예 9의 Fab-VHH 융합체 및 상응하는 비-융합된 Fab (실시예 13)에 대한, 수컷 스프라그 돌리 래트에게 투여된 단일 IV 또는 SC 용량 후의 평균 혈장 농도 (nmol/L로 보고됨).
Figure pct00111
표준 편차 값은 표에서 평균 농도 값 아래에 괄호 안에 포함된다 (N = 3/군).
표 30에 제시된 바와 같이, 실시예 9의 Fab-VHH 융합체는 상응하는 비-융합된 Fab (실시예 13)에 비해 스프라그 돌리 래트에서 유의하게 더 높은 평균 혈장 농도를 입증한다.
표 31: 실시예 9의 Fab-VHH 융합체에 대한, 수컷 스프라그 돌리 래트에게 투여된 단일 IV 또는 SC 용량 후의 평균 혈장 약동학적 파라미터.
Figure pct00112
주: 약어: t½ = 반감기, Tmax = 최대 농도까지의 시간, Cmax = 최대 관찰된 혈장 농도, C0 = 시점 0으로 외삽된 혈장 농도, AUC0-inf = 시점 0시간으로부터 무한대까지의 곡선하 면적, CL = 클리어런스, CL/F = 클리어런스/생체이용률. 표준 편차 값은 표에서 평균 PK 파라미터 아래에 괄호 안에 포함된다 (N = 3/군).
표 31에 제시된 바와 같이, 실시예 9의 Fab-VHH 융합체는 스프라그 돌리 래트에서 연장된 PK 프로파일을 입증하는 반면, 상응하는 비-융합된 Fab (실시예 13)의 평균 혈장 농도는 PK 파라미터를 계산하기에는 너무 낮다.
서열
하기 핵산 및/또는 아미노산 서열은 본 개시내용에서 언급되고, 하기 참조로 제공된다.
서열식별번호: 1 - VHH 모이어티 1 (MC6.1C22)
Figure pct00113
서열식별번호: 2 - VHH 모이어티 2 (MC6.1C80)
Figure pct00114
서열식별번호: 3 - VHH 모이어티 3 (MC6.1C22.43)
Figure pct00115
서열식별번호: 4 - VHH 모이어티 4 (MC6.1C80.43)
Figure pct00116
서열식별번호: 5 - VHH 모이어티 5 (MC6)
Figure pct00117
서열식별번호: 6 - VHH 모이어티 6 (MC6.1)
Figure pct00118
서열식별번호: 7 - VHH 모이어티 7 (MC6.1C6)
Figure pct00119
서열식별번호: 8 - VHH 모이어티 8 (MC6.1C22-G26Y)
Figure pct00120
서열식별번호: 9 - VHH 모이어티 9 (MC6.1C22-R27A)
Figure pct00121
서열식별번호: 10 - VHH 모이어티 10 (MC6.1C22-I57E)
Figure pct00122
서열식별번호: 11 - VHH 모이어티 11 (MC6.1C22-I57Q)
Figure pct00123
서열식별번호: 12 - VHH 모이어티 12 (MC6.1C22-Y59A)
Figure pct00124
서열식별번호: 13 - VHH 모이어티 13 (MC6.1C22-Y59E)
Figure pct00125
서열식별번호: 14 - VHH 모이어티 14 (MC6.1C22-Y59Q)
Figure pct00126
서열식별번호: 15 - VHH 모이어티 15 (MC6.1C22-Y59S)
Figure pct00127
서열식별번호: 16 - VHH 모이어티 16 (MC6.1C22-Y59T)
Figure pct00128
서열식별번호: 17 - VHH 모이어티 17 (MC6.1C22-R102K)
Figure pct00129
서열식별번호: 18 - VHH 모이어티 18 (MC6.1C22-R102Q)
Figure pct00130
서열식별번호: 19 - VHH 모이어티 19 (MC6.1C22-R102S)
Figure pct00131
서열식별번호: 20 - VHH 모이어티 20 (MC6.1C22-P103)
Figure pct00132
서열식별번호: 21 - VHH 모이어티 21 (MC6.1C22-P103Q)
Figure pct00133
서열식별번호: 22 - VHH 모이어티 22 (MC6.1C22-P103S)
Figure pct00134
서열식별번호: 23 - VHH 모이어티 23 (MC6.1C22-L104E)
Figure pct00135
서열식별번호: 24 - VHH 모이어티 24 (MC6.1C22-L104G)
Figure pct00136
서열식별번호: 25 - VHH 모이어티 25 (MC6.1C22-L104Q)
Figure pct00137
서열식별번호: 26 - VHH 모이어티 26 (MC6.1C22-L104T)
Figure pct00138
서열식별번호: 27 - VHH 모이어티 27 (MC6.1C22-S107E)
Figure pct00139
서열식별번호: 28 - VHH 모이어티 28 (MC6.1C80-A98T)
Figure pct00140
서열식별번호: 29 - VHH 모이어티 29 (MC6.1C80-P100Q)
Figure pct00141
서열식별번호: 30 - VHH 모이어티 30 (MC6.1C80-A98T, P100Q)
Figure pct00142
서열식별번호: 31 - VHH 모이어티 31 (MC6.1C80-K108Q)
Figure pct00143
서열식별번호: 32 - VHH 모이어티 32 (MC6.1C80-V109Q)
Figure pct00144
서열식별번호: 33 - VHH 모이어티 33 (MC6.1C80-D111E)
Figure pct00145
서열식별번호: 34 - VHH 모이어티 34 (MC6.1C80-D111S)
Figure pct00146
서열식별번호: 35 - VHH 모이어티 35 (MC6.1C80-V109Q, D111E)
Figure pct00147
서열식별번호: 36 - VHH 모이어티 36 (MC6.1C80-V109Q, D111S)
Figure pct00148
서열식별번호: 37 - VHH 모이어티 37 (MC6.1C80Cys)
Figure pct00149
서열식별번호: 38 - L1 ((GGGGQ)n의 기본 서열)
Figure pct00150
서열식별번호: 39 - L1 ((GGGQ)n의 기본 서열)
Figure pct00151
서열식별번호: 40 - L1 ((GGGGS)n의 기본 서열)
Figure pct00152
서열식별번호: 41 - L1 ((PGPQ)n의 기본 서열)
Figure pct00153
서열식별번호: 42 - L1 ((PGPA)n의 기본 서열)
Figure pct00154
서열식별번호: 43 - L1 (GGGG(AP)nGGGG의 기본 서열)
Figure pct00155
서열식별번호: 44 - L1 ((GGE)n의 기본 서열)
Figure pct00156
서열식별번호: 45 - L1 ((GGGGE)n의 기본 서열)
Figure pct00157
서열식별번호: 46 - L1 ((GGK)n의 기본 서열)
Figure pct00158
서열식별번호: 47 - L1 ((GGGGK)n의 기본 서열)
Figure pct00159
서열식별번호: 48 - L1 (GGGG(EP)nGGGG의 기본 서열)
서열식별번호: 49 - L1 (GGGG(KP)nGGGG의 기본 서열)
Figure pct00161
서열식별번호: 50 - L1 ((PGPE)n의 기본 서열)
Figure pct00162
서열식별번호: 51 - L1 ((PGPK)n의 기본 서열)
Figure pct00163
서열식별번호: 52 - L1 1 (GGGGQ)5
Figure pct00164
서열식별번호: 53 - L1 2 (PGPQ)8
Figure pct00165
서열식별번호: 54 - L1 3 (PGPA)8
Figure pct00166
서열식별번호: 55 - L1 4 ((GGE)8)
Figure pct00167
서열식별번호: 56 - L1 5 ((GGGGE)5)
Figure pct00168
서열식별번호: 57 - L1 6 ((GGK)8)
Figure pct00169
서열식별번호: 58 - L1 7 ((GGGGK)5)
Figure pct00170
서열식별번호: 59 - L1 8 ((GGGG(AP)10GGGG))
Figure pct00171
서열식별번호: 60 - L1 9 ((GGGG(EP)10GGGG))
Figure pct00172
서열식별번호: 61 - L1 10 ((GGGG(KP)10GGGG))
Figure pct00173
서열식별번호: 62 - L1 11 ((PGPE)8)
Figure pct00174
서열식별번호: 63 - L1 12 ((PGPK)8)
Figure pct00175
서열식별번호: 64 - L2 1
Figure pct00176
서열식별번호: 65 - L2 2
Figure pct00177
서열식별번호: 66 - 신호 펩티드
Figure pct00178
서열식별번호: 67 - 인간 프로GIP
Figure pct00179
서열식별번호: 68 - 인간 GIP
Figure pct00180
서열식별번호: 69 - 인간 GIP 수용체
Figure pct00181
서열식별번호: 70 - 인간 프로글루카곤
Figure pct00182
서열식별번호: 71 - 인간 GLP-1
Figure pct00183
서열식별번호: 72 - 인간 GLP-17-37
Figure pct00184
서열식별번호: 73 - 인간 GLP-17-36
Figure pct00185
서열식별번호: 74 - 인간 GLP-1 수용체
Figure pct00186
서열식별번호: 75 - 인간 프로GDF15
Figure pct00187
서열식별번호: 76 - 인간 GDF15
Figure pct00188
서열식별번호: 77 - 인간 GDF15 (GFRAL) 수용체
Figure pct00189
서열식별번호: 78 - 인간 프로INS
Figure pct00190
서열식별번호: 79 - 인간 INS A 쇄
Figure pct00191
서열식별번호: 80 - 인간 INS B 쇄
Figure pct00192
서열식별번호: 81 - 인간 INS 수용체 α-서브유닛
Figure pct00193
서열식별번호: 82 - 인간 INS 수용체 β-서브유닛
Figure pct00194
서열식별번호: 83 - 인간 IL-2
Figure pct00195
서열식별번호: 84 - 인간 IL-2 수용체 α-서브유닛
Figure pct00196
서열식별번호: 85 - 인간 IL-2 수용체 β-서브유닛
Figure pct00197
서열식별번호: 86 - 인간 IL-2 수용체 γ-서브유닛
Figure pct00198
서열식별번호: 87 - 인간 proNRG1
Figure pct00199
서열식별번호: 88 - 인간 NRG1
Figure pct00200
서열식별번호: 89 - 인간 NRG1 수용체 ErbB3
Figure pct00201
서열식별번호: 90 - 인간 NRG1 수용체 ErbB4
Figure pct00202
서열식별번호: 91 - 인간 proRLN2
Figure pct00203
서열식별번호: 92 - 인간 RLN2 A 쇄
Figure pct00204
서열식별번호: 93 - 인간 RLN2 B 쇄
Figure pct00205
서열식별번호: 94 - 인간 RXFP1 수용체
Figure pct00206
서열식별번호: 95 - 인간 ACTH
Figure pct00207
서열식별번호: 96 - 인간 ACTH 수용체 (ACTHR, MC2R)
Figure pct00208
서열식별번호: 97 - 인간 CNTF
Figure pct00209
서열식별번호: 98 - 인간 CNTF 수용체 알파
Figure pct00210
서열식별번호: 99 - GLP1-표준
Figure pct00211
서열식별번호: 100 - VHH 융합체 1 (CNTF-(G4Q)5-MC6.1C22.43)
Figure pct00212
서열식별번호: 101 - VHH 융합체 2 (MC6.1C22-(G4Q)5-CNTF)
Figure pct00213
서열식별번호: 102 - VHH 융합체 3 (NRG1-(G4Q)5-MC6.1C22.43)
Figure pct00214
서열식별번호: 103 - VHH 융합체 4 (MC6.1C22-(G4Q)5-NRG1)
Figure pct00215
서열식별번호: 104 - VHH 융합체 5 (MC6.1C22-(G4Q)5-GDF15)
Figure pct00216
서열식별번호: 105 - VHH 융합체 6 (IL2-(G4Q)5-MC6.1C22.43)
Figure pct00217
서열식별번호: 106 - VHH 융합체 7 (MC6.1C22-(G4Q)5-IL2)
Figure pct00218
서열식별번호: 107 - VHH 융합체 8 (GLP1-(G4Q)5-MC6.1C22.43)
Figure pct00219
서열식별번호: 108 - HC-VHH (AdaFabVHCH1-(G4Q)5-MC6.1C22.43)
Figure pct00220
서열식별번호: 109 - LC (AdaFabVLCL)
Figure pct00221
서열식별번호: 110 - HC (AdaFabVHCH1)
Figure pct00222
서열식별번호: 111 - LC-VHH (AdaFabVLCL-(G4Q)5-MC6.1C22.43)
Figure pct00223
서열식별번호: 112 - VHH-HC (MC6.1C22-(G4Q)5-AdaFabVHCH1)
Figure pct00224
서열식별번호: 113 - LC (AdaFabVLCL)
Figure pct00225
서열식별번호: 114 - HC (AdaFabVHCH1)
Figure pct00226
서열식별번호: 115 - VHH-LC (MC6.1C22-(G4Q)5-AdaFabVLCL)
Figure pct00227
서열식별번호: 116 - VHH 융합체 13 (GLP1-MC6.1C80Cys)
Figure pct00228
서열식별번호: 117 - VHH 융합 접합체 1 (GLP1-C80Cys-ACTH 접합체)
Figure pct00229
Figure pct00230
서열식별번호: 118 - VHH 융합 접합체 2 (MC6.1C80Cys-ACTH 접합체)
Figure pct00231
Figure pct00232
서열식별번호: 119 - 중간체 1 (ACTH-(PEG)12-말레이미드 접합체)
Figure pct00233
Figure pct00234
서열식별번호: 120 - Fab HC (AdaFabVHCH1)
Figure pct00235
서열식별번호: 121 - Fab LC (AdaFabVLCL)
Figure pct00236
서열식별번호: 122 - 인간 GITR 전장 (신호 펩티드 없음)
Figure pct00237
서열식별번호: 123 - 인간 GITR ECD (신호 펩티드 없음)
Figure pct00238
서열식별번호: 124 - VHH 모이어티 38 (MC6.1C90Cys)
Figure pct00239
서열식별번호: 125 - VHH 모이어티 39 (MC6.1C90.43)
Figure pct00240
서열식별번호: 126 - VHH 모이어티 40 (MC6.1C95.43)
Figure pct00241
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> HALF-LIFE EXTENDING MOIETIES AND METHODS OF USING THE SAME <130> X22636 <150> 63/144696 <151> 2021-02-02 <160> 126 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 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Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys 115 120 125 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <400> 38 Gly Gly Gly Gly Gln 1 5 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(4) <400> 39 Gly Gly Gly Gln 1 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(4) <400> 41 Pro Gly Pro Gln 1 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(4) <400> 42 Pro Gly Pro Ala 1 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (5)..(6) <400> 43 Gly Gly Gly Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 44 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(3) <400> 44 Gly Gly Glu 1 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <400> 45 Gly Gly Gly Gly Glu 1 5 <210> 46 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(3) <400> 46 Gly Gly Lys 1 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <400> 47 Gly Gly Gly Gly Lys 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp 225 <210> 111 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 111 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Glu 225 230 235 240 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 245 250 255 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr Ala 260 265 270 Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 275 280 285 Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 290 295 300 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 305 310 315 320 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 325 330 335 Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu Tyr 340 345 350 Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Pro 355 360 365 <210> 112 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 112 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 165 170 175 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 180 185 190 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His 195 200 205 Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 210 215 220 Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala 245 250 255 Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 275 280 285 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 290 295 300 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 305 310 315 320 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 325 330 335 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 340 345 350 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 355 360 365 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 370 375 <210> 113 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 113 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 114 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 114 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp 225 <210> 115 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 115 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 145 150 155 160 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 165 170 175 Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 180 185 190 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly 195 200 205 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 210 215 220 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 225 230 235 240 Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 245 250 255 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 260 265 270 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 275 280 285 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 290 295 300 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 305 310 315 320 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 325 330 335 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 340 345 350 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 355 360 365 <210> 116 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 116 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 65 70 75 80 Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala 85 90 95 Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp 100 105 110 Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 115 120 125 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 130 135 140 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 165 170 175 Leu Val Thr Val Ser Ser Cys 180 <210> 117 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (183)..(183) <223> Cys at position 183 is chemically modified on the sulfur group of the side chain, forming a thioether linkage with maleamide-(PEG)12-(ACTH in a C-termina to N-terminal orientation) <400> 117 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 65 70 75 80 Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala 85 90 95 Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp 100 105 110 Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 115 120 125 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 130 135 140 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 165 170 175 Leu Val Thr Val Ser Ser Cys 180 <210> 118 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (127)..(127) <223> Cys at position 127 is chemically modified on the sulfur group of the side chain, forming a thioether linkage with maleamide-(PEG)12-(ACTH in a C-terminal to N-terminal orientation) <400> 118 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys 115 120 125 <210> 119 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Lys at position 25 is chemically modified by conjugation of the epsilon-amino group of the side chain with (PEG)12-maleamide <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> AMIDATION <400> 119 Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys 1 5 10 15 Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Lys 20 25 <210> 120 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 120 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp 225 <210> 121 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 122 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys 20 25 30 Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met 35 40 45 Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys 50 55 60 Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys 65 70 75 80 Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser 85 90 95 Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe 100 105 110 Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys 115 120 125 Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val 130 135 140 Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu 145 150 155 160 Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu 165 170 175 Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser 180 185 190 Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys 195 200 205 Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val 210 215 <210> 123 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys 20 25 30 Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met 35 40 45 Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys 50 55 60 Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys 65 70 75 80 Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser 85 90 95 Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe 100 105 110 Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys 115 120 125 Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu 130 135 <210> 124 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 124 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys 115 120 125 <210> 125 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 125 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Ala Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Pro 115 120 125 <210> 126 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 126 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Asp Glu Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Gly Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Thr Arg Pro Gly Arg Pro Leu Ile Thr Ser Lys Val Ala Asp Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Pro 115 120 125

Claims (66)

  1. 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-37 및 124-126으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것을 포함하는 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00242
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00243
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00244
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00245
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00246
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00247
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00248
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00249
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00250
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00251
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  13. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00253
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  14. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00254
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  15. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00255
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  16. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00256
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  17. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00257
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  18. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00258
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  19. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00259
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  20. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00260
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  21. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00261
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  22. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00262
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  23. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00263
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  24. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00264
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  25. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00265
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  26. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00266
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  27. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00267
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  28. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00268
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  29. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00269
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  30. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00270
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  31. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00271
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  32. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00272
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  33. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00273
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  34. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00274
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  35. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00275
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  36. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00276
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  37. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00277
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  38. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00278
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  39. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00279
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  40. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00280
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  41. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
    Figure pct00281
    또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것인 화합물.
  42. 하기 구조를 포함하는 화합물:
    M-X1,
    X1-M,
    M-L1-X1,
    X1-L1-M,
    X1-M-X2,
    X2-M-X1,
    X1-L1-M-X2,
    X2-L1-M-X1,
    X1-M-L1-X2,
    X2-M-L1-X1,
    X1-L1-M-L2-X2,
    X2-L1-M-L2-X1,
    M-L1-X1-L2-X2,
    M-L1-X2-L2-X1,
    X1-L2-X2-L1-M, 또는
    X2-L2-X1-L1-M,
    여기서 M은 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 124, 125 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것이고,
    여기서 X1은 제1 생물요법제이고,
    여기서 X2 (존재하는 경우)는 제2 생물요법제이고,
    여기서 L1 (존재하는 경우)은 (GGGGQ)n (서열식별번호: 38), (GGGQ)n (서열식별번호: 39), (GGGGS)n (서열식별번호: 40), (PGPQ)n (서열식별번호: 41), (PGPA)n (서열식별번호: 42), (GGGG(AP)nGGGG) (서열식별번호: 43), (GGE)n (서열식별번호: 44), (GGGGGE)n (서열식별번호: 45), (GGK)n (서열식별번호: 46), (GGGGK)n (서열식별번호: 47), (GGGG(EP)nGGGG) (서열식별번호: 48), (GGGG(KP)nGGGG) (서열식별번호: 49), (PGPE)n (서열식별번호: 50), 및 (PGPK)n (서열식별번호: 51)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 링커이며, 여기서 n은 1 내지 10일 수 있고,
    여기서 L2 (존재하는 경우)는 서열식별번호: 64 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것을 갖는 제2 링커이다.
  43. 제42항에 있어서, 제1 생물요법제가 펩티드, 단백질 또는 올리고머인 화합물.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 제2 생물요법제가 펩티드, 단백질 또는 올리고머인 화합물.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생물요법제 및 제2 생물요법제가 서로 구별되는 것인 화합물.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, L1이 서열식별번호: 52 내지 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것을 갖는 것인 화합물.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생물요법제 및/또는 제2 생물요법제가 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체 (Ab) 또는 그의 단편, 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 성장/분화 인자 15 (GDF15), 인크레틴 (INC), 인슐린 (INS), 인터류킨 (IL), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 뉴레귤린 (NRG) 또는 렐락신 (RLN)인 화합물.
  48. 제47항에 있어서, 펩티드 또는 단백질이 INC인 화합물.
  49. 제48항에 있어서, INC가 글루코스-의존성 인슐린분비자극 펩티드 (GIP), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 및 GIP/GLP-1로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  50. 제47항에 있어서, 펩티드 또는 단백질이 IL이고, IL이 IL-2인 화합물.
  51. 제47항에 있어서, 펩티드 또는 단백질이 NRG이고, NRG가 뉴레귤린 1 (NRG1) 또는 뉴레귤린 4 (NRG4)인 화합물.
  52. 제47항에 있어서, 펩티드 또는 단백질이 RLN이고, RLN이 렐락신 2 (RLN2)인 화합물.
  53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항의 화합물 및 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 제약 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  55. 개체에게 유효량의 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제53항 또는 제54항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 치료하는 방법.
  56. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 생물요법제의 t½를 연장시키는 데 사용하기 위한 화합물.
  57. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물.
  58. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관, 신경, 면역, 대사, 종양, 심리, 폐 및/또는 신장 상태, 질환 및/또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 화합물.
  59. 의약을 제조하기 위한 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  60. 서열식별번호: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 또는 118 중 어느 하나, 또는 그와 적어도 약 90% 서열 유사성을 갖는 것을 포함하는 화합물.
  61. 제60항의 화합물 및 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 제약 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  63. 개체에게 유효량의 제60항의 화합물 또는 제61항 또는 제62항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 치료하는 방법.
  64. 제60항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물.
  65. 제60항에 있어서, 심혈관, 신경, 면역, 대사, 종양, 심리, 폐 및/또는 신장 상태, 질환 및/또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 화합물.
  66. 의약을 제조하기 위한 제60항의 화합물의 용도.
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