JP2016536306A - ヒト・リラキシン類似体、その医薬組成物及びその医薬用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト・リラキシン類似体、ヒト・リラキシン類似体をコードするポリヌクレオチド、ヒト・リラキシン類似体を含む医薬組成物、及びヒト・リラキシン類似体の薬学的応用について開示する。さらに本発明は、ヒト・リラキシン類似体の誘導体について開示する。【選択図】なし
Description
本発明は、新規ヒト・リラキシン類似体、並びにそれを含有する医薬組成物及びその用途に関する。
リラキシン(RLXと称する)は、哺乳動物の黄体から分泌されるポリペプチドホルモンである。リラキシンは生体内で様々な生理的機能を有し、これには恥骨靱帯の弛緩、子宮収縮抑制、子宮頸部の軟化、乳腺発育促進及び乳汁分泌への影響が含まれる。リラキシンは、1926年に妊娠中の骨盤帯変化の研究中にFrederick Hisawにより初めて発見された。1970年代から1980年代には、リラキシンは二本鎖タンパク質と考えられていた。リラキシンの構造はインスリンと類似している。リラキシンはペプチドホルモンファミリーの一員であることが実証された。人類のリラキシンファミリーは7種の遺伝子:RLN1、RLN2、RLN3(INSL7とも呼ばれる)、INSL3/RLF、INSL4/EPIL、INSL5/RIF2及びINSL6/RIF1によってコードされている。ヒト血液循環中のリラキシンの大部分は、RLN2遺伝子によりコードされた産物である。RLN2の翻訳産物はリラキシン前駆体であり、N末端からC末端に向けて、24アミノ酸残基のシグナルペプチド、29アミノ酸残基のB鎖、104番から107番のアミノ酸残基のリンカー、及び約24アミノ酸残基のA鎖からなる。
リラキシンは妊娠に重要な役割を果たすだけではなく、非妊娠動物の血管の構造と機能に影響を与えていることが明らかである。リラキシンは広範囲の生物学的作用を有し、これには哺乳動物の妊娠期間中や加齢過程における内部環境の恒常性維持作用、抗炎症作用、心臓保護作用、血管拡張作用、創傷治癒促進作用、さらには特に抗線維化作用が含まれる。心臓疾患や腎臓疾患は様々な要因で引き起こされ、最終的には線維化、構造変化及び機能喪失に至る。したがって、線維化の効果的な抑制は、臓器機能を回復させる重要な手段である。結果として、リラキシンの抗線維化作用は、将来の抗線維症治療における効果的な作用になる可能性がある。さらに重要なことには、リラキシンは心臓で産生され、局所の受容体を介して心臓保護作用や細胞外マトリックス調節作用を示す。リラキシンは、種々の動物モデルで心筋線維症を改善することに成功している。したがって、リラキシンはヒト心臓線維症の治療に有用であることが期待される(Xiaojun Du、Juan Zhou、ベイカー心臓研究所(Baker Heart Institute))。
先行技術において、ヒト・リラキシン(hRelaxin、野生型)前駆体は大腸菌で発現され、精製後の再折り畳み(リフォールディング)、二段階反応においてCPBとトリプシンによりそれぞれ消化され、その後精製して活性型生成物であるリラキシンが得られている。先行技術には、生産過程においてタンパク質のリフォールディング、二段階消化及び再精製が必要であるという欠点がある。工程を変更すると、各工程でタンパク質の損失が伴うので、大幅な収量低下やコスト上昇となる。さらには、外因性の酵素(CPB、トリプシンなど)はコスト高であり、また酵素の品質が最終産物の品質や収量に影響する。
他の欠点として、発現された野生型リラキシンは活性が低く、治療には組み換えタンパク質の増量が必要となり、そのためコストが上昇する。さらには、発現された野生型リラキシンの活性が低いことは、タンパク質修飾のさらなる開発を難しくする。これは、タンパク質修飾がタンパク質活性を損なうためである。
先行技術の上記した欠点に対し、本発明は、野生型リラキシンのアミノ酸を特異的部位で変更することにより一連の新規な分子を設計し、上記の課題を解決する新規ヒト・リラキシン類似体を見いだした。新たな技術的解決法は以下の優位性を示す。
(1)リラキシンの特異的部位でのアミノ酸変更は、その類似体を酵母細胞中で正しく折り畳むこと(フォールディング)の助けとなる。ここでは、その過程において酵母細胞中の内在性酵素系により、A鎖及びB鎖のc-ペプチドが除去される。生理的機能を有する完全な活性分子が得られ、細胞外に分泌される。活性分子は一段階の精製で得られる。結果として、先行技術において必要なリフォールディング、消化及び精製などの工程を省略することができる。
(2)リラキシンの特異的部位でのアミノ酸変更は、リラキシン類似体の構造を、細胞内フォールディング、消化及び分泌により適したものとする。さらには、リラキシンの生物活性が改善される。したがって、単位投与あたりの組み換えタンパク質の量を減らすことができ、コスト減につながる。それと同時に、そのような類似体の活性が向上することにより、分子修飾の開発がより簡便となる。
特異的な配列を有するヒト・リラキシン類似体が、本発明において、設計(リラキシン配列における特定のアミノ酸の置換又は削除)により入手可能となる。リラキシン前駆体のタンパク質フォールディング及び酵素消化は、真核生物発現系(細胞)において実現することができる。この類似体が発酵ブロス中に分泌される場合、本発明のヒト・リラキシン類似体は成熟しており、無傷であり、そして機能がある。さらに、これらの特定の設計を通じて得られたリラキシン類似体の生物活性は、野生型の活性より少なくとも2倍高い。
本発明は、A鎖及びB鎖を含み、A鎖及びB鎖のアミノ酸配列がそれぞれ下記式により表され、
A鎖:A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24アミノ酸残基)
B鎖:DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29アミノ酸残基)
A1はQ、D、E及びWからなる群より選ばれ;
B14はE、D及びNからなる群より選ばれ;
A1がQであり、B14がE又はDではない場合には、任意にB1及びB2は同時に欠落しているヒト・リラキシン類似体を提供する。
A鎖:A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24アミノ酸残基)
B鎖:DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29アミノ酸残基)
A1はQ、D、E及びWからなる群より選ばれ;
B14はE、D及びNからなる群より選ばれ;
A1がQであり、B14がE又はDではない場合には、任意にB1及びB2は同時に欠落しているヒト・リラキシン類似体を提供する。
本発明の一実施形態において、A鎖及びB鎖を含み、A鎖及びB鎖のアミノ酸配列がそれぞれ下記式により表され、
A鎖:A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24アミノ酸残基)
B鎖:DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29アミノ酸残基)
A1はQ、D、E及びWからなる群より選ばれ;
B14はE、D及びNからなる群より選ばれ;
A1がQである場合には、B14はE又はDではない;
上記ヒト・リラキシン類似体が提供される:
A鎖:A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24アミノ酸残基)
B鎖:DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29アミノ酸残基)
A1はQ、D、E及びWからなる群より選ばれ;
B14はE、D及びNからなる群より選ばれ;
A1がQである場合には、B14はE又はDではない;
上記ヒト・リラキシン類似体が提供される:
本発明の一実施形態において、A1はD、E又はWであり、好ましくはDである。
本発明の一実施形態において、A1はDであり、B14はDである。具体的な一例は、配列番号(SEQ ID NO)134(A鎖)及び配列番号(SEQ ID NO)135(B鎖)を含み、これらがジスルフィド結合により相互に結合しているヒト・リラキシン類似体である。
本発明の一実施形態において、B14はDである。
本発明の一実施形態において、前記A鎖及びB鎖のアミノ酸配列を含み、前記A鎖及びB鎖は下記からなる群より選ばれる、上記ヒト・リラキシン類似体が提供される。
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:ELYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 136;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRNLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 139
A鎖:QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135;
B鎖:WMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 140
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖:WLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 141;及び、
B鎖:DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:ELYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 136;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRNLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 139
A鎖:QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135;
B鎖:WMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 140
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖:WLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 141;及び、
B鎖:DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
本発明の一実施形態において、前記B鎖がリンカー配列(本願においてLと称する)により前記A鎖に結合しており、該リンカー配列は1〜15アミノ酸残基の長さを有し、好ましくは2〜8アミノ酸残基であり、該リンカー配列のアミノ酸配列が下記からなる群より選ばれる、上記ヒト・リラキシン類似体が提供される。
L1:KR、
L2:KRKPTGYGSRKKR、 SEQ ID NO: 27、
L3:KRKPTGYGSRKR、 SEQ ID NO: 28、
L4:KRGGGPRR、 SEQ ID NO: 29、
L5:KRGGGPKR、 SEQ ID NO: 30、
L6:KRKPTGYGSKR、 SEQ ID NO: 31、及び、
L7:KRSLKR、 SEQ ID NO: 32
L1:KR、
L2:KRKPTGYGSRKKR、 SEQ ID NO: 27、
L3:KRKPTGYGSRKR、 SEQ ID NO: 28、
L4:KRGGGPRR、 SEQ ID NO: 29、
L5:KRGGGPKR、 SEQ ID NO: 30、
L6:KRKPTGYGSKR、 SEQ ID NO: 31、及び、
L7:KRSLKR、 SEQ ID NO: 32
本発明の一実施形態において、前記ヒト・リラキシン類似体のN末端がシグナルペプチド配列(本願においてSと称する)に結合しており、該シグナルペプチド配列は4〜15アミノ酸残基の長さを有し、好ましくは6〜11アミノ酸残基であり、さらに好ましくは、該シグナルペプチド配列のアミノ酸配列が下記からなる群より選ばれる、上記ヒト・リラキシン類似体が提供される。
S1:EEGEPK、 SEQ ID NO: 33、
S2:EEGEPKR、 SEQ ID NO: 34、及び、
S3:MKKNIAFLLKR、 SEQ ID NO: 35
S1:EEGEPK、 SEQ ID NO: 33、
S2:EEGEPKR、 SEQ ID NO: 34、及び、
S3:MKKNIAFLLKR、 SEQ ID NO: 35
本発明の一実施形態において、上記ヒト・リラキシン類似体の調製に使用される発現前駆体が提供される。該発現前駆体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 26からなる群より選ばれる1つ以上の配列である。
本発明はさらに、上記ヒト・リラキシン類似体のPEG修飾により得られたヒト・リラキシン類似体誘導体を提供する。すなわち、上記ヒト・リラキシン類似体をPRG分子で修飾する。ある実施形態では、PEGの分子量は5〜100 KDaであり、ある実施形態では10〜80 KDaであり、ある実施形態では15〜45 KDaであり、またある実施形態では20〜40 KDaである。さらに、ある実施形態では、PEG分子は分枝型又は直鎖型である。
本発明はさらに、上記ヒト・リラキシン類似体の発現前駆体をコードするポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドはDNA又はRNAから選択される。当業者であれば、このポリヌクレオチドの相補的配列は本発明の範囲内であることを十分に理解する。
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドの発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。ある実施形態において宿主細胞は細菌であり、具体的な実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。他の実施形態において宿主細胞は酵母であり、具体的な実施形態において、宿主細胞はピキア・パストリス(Pichia pastoris)である。
本発明はさらに、下記成分を含む又は下記成分からなる医薬組成物を提供する。
a)1種以上の上記ヒト・リラキシン類似体、及び/又は、1種以上の上記ヒト・リラキシン類似体誘導体、及び、
b)1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤。
a)1種以上の上記ヒト・リラキシン類似体、及び/又は、1種以上の上記ヒト・リラキシン類似体誘導体、及び、
b)1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤。
本発明はさらに、ヒト・リラキシン類似体又はその誘導体の注射剤であって、溶解型又は可溶型の上記医薬組成物を含む注射剤を提供する。当業者であれば、注射剤の乾燥粉末型又は凍結乾燥粉末型は本発明の範囲に含まれることを理解する。
本発明はさらに、線維症又は循環器疾患の治療又は予防のための薬剤の調製における、上記ヒト・リラキシン類似体、上記ヒト・リラキシン類似体誘導体、若しくは上記医薬組成物、又は上記注射剤の使用を提供する。ここで、Cardiovascular effects of relaxin; from basic science to clinical therapy, Nat.Rev.Cardiol.7,48-58(2010); Relaxin decreases renal interstitial fibrosis and slows progression of renal disease, Kindney International, Vol. 59(2001), pp. 876-882.を参照することができる。
本発明はさらに、線維症又は循環器疾患の治療又は予防方法であって、治療的有効量の上記ヒト・リラキシン類似体若しくはその誘導体、又は上記医薬組成物を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。
[用語]
本発明の理解を容易にするため、ある技術及び科学用語を具体的に以下に定義する。本明細書で具体的に定義しない限り、本明細書で使用される他の技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者により、一般に理解される意味を有する。
本発明の理解を容易にするため、ある技術及び科学用語を具体的に以下に定義する。本明細書で具体的に定義しない限り、本明細書で使用される他の技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者により、一般に理解される意味を有する。
本明細書で使用されるアミノ酸の一文字記号及び三文字記号は、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558.に記述されている通りである。
動物、ヒト、被験者、細胞、組織、臓器又は体液に対して適用する場合に、「投与」、「施用」、「治療」、「処理」とは、外因性の薬学的、治療学的若しくは診断的な薬剤又は組成物の、動物、ヒト、被験者、細胞、組織、臓器又は体液への接触を指す。例えば、「投与」、「施用」、「治療」、「処理」とは、治療学的、薬物動態学的若しくは診断的な研究及び実験方法を指す。細胞の処理は、細胞への試薬の接触や、液体への試薬の接触を含み、液体は細胞との接触においても存在する。また「投与」、「施用」、「治療」、「処理」は、細胞をインビトロ及びエクスビボで、試薬、診断薬、結合組成物又は他の細胞により処理することを意味する。ヒト、動物又は被験者に適用する際の「処理」は、治療的処理、予防若しくは予防的措置、又は研究及び診断的応用を指す。
「治療」とは、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、その治療薬が既知の治療効果を示す1種以上の疾病症状を持つ患者に体内投与すること又は外用することを意味する。通常、治療薬は、治療される患者又は個体群において、有効量がどのように効くか、すなわち、臨床的に測定できる程度の発症から症状の緩和を促すことによるのか、又は症状を予防することによるのかに関わらず、1種以上の疾病症状を緩和するための有効量が投与される。特定の症状を緩和するのに有効である治療薬の量(「治療的有効量」と称する)は、疾患状態、年齢及び患者の体重、並びに患者において望ましい反応を引き出す薬物の能力などの要因により変動する。症状が緩和されるかどうかは、医師又は他の熟練した医療介護提供者が、症状の重症度又は進行状態を判断するするために一般的に用いる臨床検査手段により評価される。本発明の実施形態(例えば、治療方法又は製品)では、患者によって標的となる疾病症状の緩和の程度は異なるが、本発明の実施形態において、患者における標的疾病症状は統計的有意性をもって緩和されるが、これはスチューデントt-検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーのU検定、クラスカル・ワリス検定(H-検定)、ヨンクヒール・タプストラ検定、及びウィルコクソン検定などの当業者により知られた統計的検定により確定される。
本明細書中で明確に示している場合を除き、ここで用いられるリラキシン又はヒト・リラキシンは、ヒト・リラキシンRLN2であり、完全長配列又は生物活性を有する部分配列からなる。ヒト・リラキシンはA鎖及びB鎖を含み、これらはジスルフィド結合を介して結合している。本明細書中で用いられるヒト・リラキシンの配列記述は、GenBank受託番号:EAW58770を参照する。リラキシン800828は野生型であり、本発明において陽性対照として使用される。
本発明によれば、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、ヒト・リラキシン類似体前駆体は、シグナルペプチド配列、B鎖又はその突然変異体、リンカー、及びA鎖又はその突然変異体からなる。ここで、シグナルペプチド配列の長さは4〜15アミノ酸残基であり、好ましくは6〜11アミノ酸残基であり;B鎖又はその突然変異体の長さは29アミノ酸残基であり;リンカー配列の長さは1〜15アミノ酸残基であり、好ましくは2〜8アミノ酸残基であり;また、A鎖又はその突然変異体の長さは約24アミノ酸残基である。
本明細書で用いられる突然変異体とは、配列におけるアミノ酸の修飾、替換、置換又は取り換えを指す。好ましくは、突然変異体は、B鎖の第14番アミノ酸残基のEがDで置換され(略してB14)、またA鎖の第1番アミノ酸残基のQがDで置換されたもの(略してA1)である。
本明細書で用いられる配列略語について、Lnは本発明のあるリンカー配列(例えばL1〜L6)を表し;Snは本発明のあるシグナルペプチド配列(例えばS1、S2、S3)を示し;DA1は、A鎖の第1番アミノ酸の突然変異がDであることを示し;DB14 は、B鎖の第14番アミノ酸での突然変異がDであることを表し;DelB1,B2は、B鎖の第1番及び第2番アミノ酸の欠失を表し;A(wt) は、突然変異のない野生型A鎖を表し;B(wt) は、突然変異のない野生型B鎖を表す。
「保守修飾」又は「保守置換」とは、タンパク質のアミノ酸を、類似する特性(例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性/親水性、骨格構造及び剛性等)を有する他のアミノ酸残基で置換することを指し、それは、しばしばタンパク質の生物活性を変化させることなく行われる。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域における1個のアミノ酸置換では、実質的な生物活性の変化はないことを理解している(例えば、Watsonら (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224, 4th Ed.を参照)。さらに、構造的又は機能的に類似するアミノ酸残基の置換では、生物活性を妨害する可能性は低い。
「有効量」とは、疾患の徴候又は兆候を改善する又は抑制するのに十分な量を含むことである。また、有効量とは、診断を可能にする又は容易にするのに十分な量を意味する。特定の患者に対する有効量は、治療すべき疾患、患者の全体的な健康状況、投与方法、投与ルート及び服用量及び副作用の重症度などの要因により変動する。有効量は、著しい副作用又は毒性作用を回避する最大服用量又は投薬手順のことである。
「外因性」とは、生物外、細胞外又は人体外で産生される物質に言及するものである。「内因性」とは、細胞内、生物内又は人体内で産生される物質に言及するものである。
本明細書で用いられる「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、そのような名称は子孫を含む。したがって、「形質転換体」や「形質転換細胞」は、継代数に関わらず、初代被験細胞やそれから誘導される培養物を包含する。すべての子孫は、意図的な又は想定外の突然変異により、DNA含量において厳密に同じというわけではないと理解される。元々の突然変異細胞の機能又は生物活性と同じそれらを有する突然変異子孫は含まれる。異なる名称が意図される場合、それは文脈から明らかとなる。
本明細書で用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「PCR」は、例えば米国特許第4,683,195号に記載される増幅手段又は増幅技術を指す。一般に、目的領域の末端又はその領域外の配列情報を得ることが必要であり、そこからオリゴヌクレオチドプライマーが設計される。これらのプライマーは、増幅すべき鋳型の逆鎖と配列において同一か又は類似している。2本のプライマーの5’末端ヌクレオチドは、増幅材料の末端に適合する。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDNAからの特定のDNA配列、及び全細胞RNA、バクテリオファージ又はプラスミド配列などから転写されたcDNAを増幅するために使用することができる。一般には、Mullisら (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) を参照する。本明細書で用いられるPCRは、これに限られるわけではないが、核酸被検試料の増幅に使用される核酸ポリメラーゼ反応法の一例と考えられている。この方法は、プライマーとして既知の核酸と、核酸の特定の部分を増幅又は生成するための核酸ポリメラーゼからなる。
「任意の」又は「任意に」は、引き続く事象又は事態が生じるが、必ずしも必要ではないことを意味する。
「医薬組成物」は、1種以上の本発明の類似体又は前駆体、及び付加的な化学成分を含む混合物を指す。付加的な該化学成分は、生理学的/薬学的に許容される担体又は賦形剤等である。付加的な該成分は、生物への投与を促進すること、活性成分の吸収を容易にすること、及び、これらのことにより生物学的効果を発揮することを目的とする。
本明細書中で述べる宿主細胞の形質転換過程は、当業者には周知である。得られた形質転換細胞は、従来法により培養することができ、また本発明の遺伝子によりコードされたポリペプチドを発現することができる。ここで使用される培地は、使用される宿主細胞に応じて、従来の種々の培地から選ばれる。宿主細胞は適切な条件下で培養される。前駆体により発現された生成物から遊離されたヒト・リラキシン類似体は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼB、リジンエンドペプチダーゼC等の当業者に周知の化学的及び/又は酵素的方法に利用できる。
〔組み換えヒト・リラキシン800800のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800800発現ベクターの構築
コドン最適化ヒト・リラキシン800800のDNA配列はオーバーラップ(Overlap)PCR法により合成した。インビトロジェン(Invitrogen)社により合成した6本の一本鎖DNA断片を合成プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
800‐プライマー1:
CTCGAGGATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGT(SEQ ID NO: 36)
800‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAATTCTCTACCACACAACTTAATAACTTCTTCCATCCAAGAA(SEQ ID NO: 37)
800‐プライマー3:
AGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGACA(SEQ ID NO: 38)
800‐プライマー4:
ATGACAACACTTGTTAGCCAAAGCAGAGTACAATTGTCTCTTAGACCAAGTAGACATAC(SEQ ID NO: 39)
800‐プライマー5:
CTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGT(SEQ ID NO: 40)
800‐プライマー6:
GAATTCTTAACAAAATCTAGCCAAAGATCTCTTA(SEQ ID NO: 41)
1.組み換えヒト・リラキシン800800発現ベクターの構築
コドン最適化ヒト・リラキシン800800のDNA配列はオーバーラップ(Overlap)PCR法により合成した。インビトロジェン(Invitrogen)社により合成した6本の一本鎖DNA断片を合成プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
800‐プライマー1:
CTCGAGGATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGT(SEQ ID NO: 36)
800‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAATTCTCTACCACACAACTTAATAACTTCTTCCATCCAAGAA(SEQ ID NO: 37)
800‐プライマー3:
AGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGACA(SEQ ID NO: 38)
800‐プライマー4:
ATGACAACACTTGTTAGCCAAAGCAGAGTACAATTGTCTCTTAGACCAAGTAGACATAC(SEQ ID NO: 39)
800‐プライマー5:
CTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGT(SEQ ID NO: 40)
800‐プライマー6:
GAATTCTTAACAAAATCTAGCCAAAGATCTCTTA(SEQ ID NO: 41)
リラキシンはKOD Plusキット(東洋紡、カタログ番号KOD-201)により合成し、反応は2ステップPCRにより行った。
PCRステップ1、25 μL反応系:2.5 μLの10XKOD緩衝液、2.5 μLの2 mM dNTPs、プライマー1、2、3、4、5、6(10 μM)をそれぞれ1 μL、0.5 μLのKOD Plus、1 μLの25 mM MgSO4、12.5 μLの脱イオン蒸留水(ddH2O)。
反応プログラム:94℃、5分、次に94℃、30秒;60℃、30秒;68℃、30秒の増幅サイクルを30回後、68℃、30分でPCR増幅工程を停止した。
PCRステップ2、25 μL反応系:2.5 μLの10XKOD緩衝液、2.5 μLの2 mM dNTPs、プライマー1及び6(10 μM)をそれぞれ1 μL、1 μLの第1回PCR産物、0.5 μLのKOD Plus、1 μLの25 mM MgSO4、15.5 μLの脱イオン蒸留水。
反応プログラム:94℃、5分、次に94℃、30秒;68℃、60秒の増幅サイクルを30回後、68℃、10分でPCR増幅工程を停止した。
PCRにより合成されたDNA配列及びpPIC9K発現ベクター(インビトロジェン社、カタログ番号K1750-01)は、それぞれEcoR I/Xho I(ニュー・イングランド・バイオラボ社、カタログ番号R0101S/R0146V)を用いて消化し、得られた目的とする断片を1.2%アガロースゲルにより回収し、T4 DNAリガーゼ(ニュー・イングランド・バイオラボ社、カタログ番号M0202V)により結合させ、DH5αコンピテント細胞(天根生化(Tiangen)、カタログ番号CB101-02)に形質転換させた。陽性クローンを採取し、インビトロジェン社により配列を決定した。800前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 1)
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 1)
2.組み換えヒト・リラキシン800800の形質転換
上記ステップで得られた5〜10 μgのリラキシン800800発現ベクターを、Sal I(タカラバイオ、カタログ番号D1080a)で直線化した後、1/10量の3 M 酢酸ナトリウム、2倍量の無水エタノールを添加し、混合物を−20℃で2時間放置した。この混合物を5分間高速遠心分離(13,000 rpm)して上清を除き、沈渣を75%エタノールで2回洗浄し、倒置乾燥させ、10 μLの脱イオン蒸留水に溶解した。直線化したプラスミドと80 μLのエレクトロポレーションコンピテント細胞(ピキア酵母GS115、インビトロジェン社、カタログ番号K1750-01)を混合し、氷浴中で5分間、エレクトロポレーションキュベット(バイオ・ラド社、カタログ番号1652086)に充填した。エレクトロポレーションは、2 kV、25 Ω、200 μFのエレクトロポレーション装置(バイオ・ラド社Micropulser)条件で行った。この後、氷浴で冷やした1 mLのD‐ソルビトール(生工生物工程有限公司)を素早く加え、混合した。次に、この混合物をMD培養板上に広げ、コロニーが観察されるまで30℃で3日間培養した。
上記ステップで得られた5〜10 μgのリラキシン800800発現ベクターを、Sal I(タカラバイオ、カタログ番号D1080a)で直線化した後、1/10量の3 M 酢酸ナトリウム、2倍量の無水エタノールを添加し、混合物を−20℃で2時間放置した。この混合物を5分間高速遠心分離(13,000 rpm)して上清を除き、沈渣を75%エタノールで2回洗浄し、倒置乾燥させ、10 μLの脱イオン蒸留水に溶解した。直線化したプラスミドと80 μLのエレクトロポレーションコンピテント細胞(ピキア酵母GS115、インビトロジェン社、カタログ番号K1750-01)を混合し、氷浴中で5分間、エレクトロポレーションキュベット(バイオ・ラド社、カタログ番号1652086)に充填した。エレクトロポレーションは、2 kV、25 Ω、200 μFのエレクトロポレーション装置(バイオ・ラド社Micropulser)条件で行った。この後、氷浴で冷やした1 mLのD‐ソルビトール(生工生物工程有限公司)を素早く加え、混合した。次に、この混合物をMD培養板上に広げ、コロニーが観察されるまで30℃で3日間培養した。
3.組み換えヒト・リラキシン800800発現クローンのG418選択
MD培養板上のコロニーを3 mLのYPD培地で溶離し、再懸濁し、再懸濁細胞の濃度を分光高度計(ベックマン社、DU800)により測定した(1 OD600 = 5X107細胞/mL)。1X105個の細胞を、4 mg/mLのG418(GIBCO、カタログ番号11811-031)を含むYPD培養板上に広げ、コロニーが観察されるまで30℃で5日間培養した。
MD培養板上のコロニーを3 mLのYPD培地で溶離し、再懸濁し、再懸濁細胞の濃度を分光高度計(ベックマン社、DU800)により測定した(1 OD600 = 5X107細胞/mL)。1X105個の細胞を、4 mg/mLのG418(GIBCO、カタログ番号11811-031)を含むYPD培養板上に広げ、コロニーが観察されるまで30℃で5日間培養した。
4.組み換えヒト・リラキシン800800の誘導性発現
YPD培養板より単一コロニーを採取し、4 mLのBMGY培地中に置き、30℃、250 rpmで一晩培養した。翌日、培養液のOD600値を測定した。この値は2〜6である。細胞は、遠心分離機(ベックマン・コールター)により室温で5分間低速(1500 g)で集め、OD600が1.0になるようBMMY培地に再懸濁した。1/200量の100%メタノール(終濃度0.5%)を添加し、
1/200量の100%メタノールを24時間ごとに追加しながら、28℃、250 rpmで72時間培養した。誘導後、混合物を低速(1500 g)で遠心分離し、上清を集めた。タンパク質発現は、電気泳動SDS-PAGE(インビトロジェン社、カタログ番号456-1083)で検出し、好ましいクローンを、次の発酵工程用に選択した。
YPD培養板より単一コロニーを採取し、4 mLのBMGY培地中に置き、30℃、250 rpmで一晩培養した。翌日、培養液のOD600値を測定した。この値は2〜6である。細胞は、遠心分離機(ベックマン・コールター)により室温で5分間低速(1500 g)で集め、OD600が1.0になるようBMMY培地に再懸濁した。1/200量の100%メタノール(終濃度0.5%)を添加し、
1/200量の100%メタノールを24時間ごとに追加しながら、28℃、250 rpmで72時間培養した。誘導後、混合物を低速(1500 g)で遠心分離し、上清を集めた。タンパク質発現は、電気泳動SDS-PAGE(インビトロジェン社、カタログ番号456-1083)で検出し、好ましいクローンを、次の発酵工程用に選択した。
得られた組み換えヒト・リラキシン800800(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800801のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800801発現ベクターの構築
リラキシン800801は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
801‐プライマー1:
GTATGTCTACTTGGTCTAAGAGATCTTTGAAGAGACAATTGTACTC(SEQ ID NO: 43)
801‐プライマー2:
GAGTACAATTGTCTCTTCAAAGATCTCTTAGACCAAGTAGACATAC(SEQ ID NO: 44)
1.組み換えヒト・リラキシン800801発現ベクターの構築
リラキシン800801は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
801‐プライマー1:
GTATGTCTACTTGGTCTAAGAGATCTTTGAAGAGACAATTGTACTC(SEQ ID NO: 43)
801‐プライマー2:
GAGTACAATTGTCTCTTCAAAGATCTCTTAGACCAAGTAGACATAC(SEQ ID NO: 44)
ラキシン800800担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。KOD Plusキット(東洋紡、カタログ番号KOD-201)25 μL反応系:2.5 μLの10XKOD緩衝液、2.5 μLの2 mM dNTPs、プライマー1及び2(10 μM)をそれぞれ1 μL、0.5 μLのKOD Plus、1 μLの25 mM MgSO4、16.5 μLの脱イオン蒸留水。反応プログラム:94℃、5分、次に94℃、30秒;60℃、30秒;68℃、12分の増幅サイクルを30回後、68℃、12分でPCR増幅工程を停止した。PCR産物は、1 μLのエンドヌクレアーゼDpnI(NEB(ニュー・イングランド・バイオラボ社)、カタログ番号R0176L)を直接添加し、5時間消化して、DH5αコンピテント細胞(天根生化(Tiangen)、カタログ番号CB101-02)に形質転換させた。陽性クローンを採取し、インビトロジェン社により配列を決定した。801前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRSLKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 2)
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRSLKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 2)
2.組み換えヒト・リラキシン800801の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800801の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800801の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン800801(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800802のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800802発現ベクターの構築
リラキシン800802は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
802‐プライマー1:
GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGACAATTGTACTCTGC(SEQ ID NO: 46)
802‐プライマー2:
GCAGAGTACAATTGTCTCTTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGAC(SEQ ID NO: 47)
1.組み換えヒト・リラキシン800802発現ベクターの構築
リラキシン800802は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
802‐プライマー1:
GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGACAATTGTACTCTGC(SEQ ID NO: 46)
802‐プライマー2:
GCAGAGTACAATTGTCTCTTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGAC(SEQ ID NO: 47)
ラキシン800801担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。KOD Plusキット(東洋紡、カタログ番号KOD-201)25 μL反応系:2.5 μLの10XKOD緩衝液、2.5 μLの2 mM dNTPs、プライマー1及び2(10 μM)をそれぞれ1 μL、0.5 μLのKOD Plus、1 μLの25 mM MgSO4、16.5 μLの脱イオン蒸留水。反応プログラム:94℃、5分、次に94℃、30秒;60℃、30秒;68℃、12分の増幅サイクルを30回後、68℃、12分でPCR増幅工程を停止した。PCR産物は、1 μLのエンドヌクレアーゼDpnI(NEB、カタログ番号R0176L)を直接添加し、5時間消化して、DH5αコンピテント細胞(天根生化(Tiangen)、カタログ番号CB101-02)に形質転換させた。陽性クローンを採取し、インビトロジェン社により配列を決定した。802前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 3)
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 3)
2.組み換えヒト・リラキシン800802の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800802の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800802の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン800802(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800802-1のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800802-1発現ベクターの構築
リラキシン800802-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
802-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 49)
802-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 50)
802-1‐プライマー3:
GTTCTAGAAAGAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 51)
802-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTCTTTCTAGAAC(SEQ ID NO: 52)
1.組み換えヒト・リラキシン800802-1発現ベクターの構築
リラキシン800802-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
802-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 49)
802-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 50)
802-1‐プライマー3:
GTTCTAGAAAGAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 51)
802-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTCTTTCTAGAAC(SEQ ID NO: 52)
ラキシン800802担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800802-1前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 4)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 4)
2.組み換えヒト・リラキシン800802-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800802-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800802-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800802-1の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800803のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800803発現ベクターの構築
リラキシン800803は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
803‐プライマー1:
GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAGACAATTGTACTCTGC(SEQ ID NO: 54)
803‐プライマー2:
GCAGAGTACAATTGTCTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGAC(SEQ ID NO: 55)
1.組み換えヒト・リラキシン800803発現ベクターの構築
リラキシン800803は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
803‐プライマー1:
GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAGACAATTGTACTCTGC(SEQ ID NO: 54)
803‐プライマー2:
GCAGAGTACAATTGTCTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGAC(SEQ ID NO: 55)
ラキシン800801担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800803前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 5)
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 5)
2.組み換えヒト・リラキシン800803の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800803の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800803の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800803(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800803-1のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800803-1発現ベクターの構築
リラキシン800803-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
803-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 57)
803-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 58)
803-1‐プライマー3:
CGGTTCTAGAAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 59)
803-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTTCTAGAACCG(SEQ ID NO: 60)
1.組み換えヒト・リラキシン800803-1発現ベクターの構築
リラキシン800803-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
803-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 57)
803-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 58)
803-1‐プライマー3:
CGGTTCTAGAAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 59)
803-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTTCTAGAACCG(SEQ ID NO: 60)
ラキシン800803担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800803-1前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 6)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 6)
2.組み換えヒト・リラキシン800803-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800803-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800803-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800803-1の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800805のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800805発現ベクターの構築
リラキシン800805は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
805‐プライマー1:
GTCTACTTGGTCTAAGAGAGGTGGTGGTCCAAGAAGACAATTGTACTCTGCTTTG(SEQ ID NO: 62)
805‐プライマー2:
CAAAGCAGAGTACAATTGTCTTCTTGGACCACCACCTCTCTTAGACCAAGTAGAC(SEQ ID NO: 63)
1.組み換えヒト・リラキシン800805発現ベクターの構築
リラキシン800805は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
805‐プライマー1:
GTCTACTTGGTCTAAGAGAGGTGGTGGTCCAAGAAGACAATTGTACTCTGCTTTG(SEQ ID NO: 62)
805‐プライマー2:
CAAAGCAGAGTACAATTGTCTTCTTGGACCACCACCTCTCTTAGACCAAGTAGAC(SEQ ID NO: 63)
ラキシン800801担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800805前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRGGGPRRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 7)
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRGGGPRRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 7)
2.組み換えヒト・リラキシン800805の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800805の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800805の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン800805(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800805-1のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800805-1発現ベクターの構築
リラキシン800805-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
805-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 65)
805-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 66)
805-1‐プライマー3:
GGTGGTCCAAGAAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 67)
805-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTTCTTGGACCACC(SEQ ID NO: 68)
1.組み換えヒト・リラキシン800805-1発現ベクターの構築
リラキシン800805-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
805-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 65)
805-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 66)
805-1‐プライマー3:
GGTGGTCCAAGAAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 67)
805-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTTCTTGGACCACC(SEQ ID NO: 68)
ラキシン800805担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800805-1前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRGGGPRRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 8)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRGGGPRRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 8)
2.組み換えヒト・リラキシン800805-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800805-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800805-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800805-1の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800806のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800806発現ベクターの構築
リラキシン800806は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
806‐プライマー1:
GTCTACTTGGTCTAAGAGAGGTGGTGGTCCAAAGAGACAATTGTACTCTGCT(SEQ ID NO: 70)
806‐プライマー2:
AGCAGAGTACAATTGTCTCTTTGGACCACCACCTCTCTTAGACCAAGTAGAC(SEQ ID NO: 71)
1.組み換えヒト・リラキシン800806発現ベクターの構築
リラキシン800806は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
806‐プライマー1:
GTCTACTTGGTCTAAGAGAGGTGGTGGTCCAAAGAGACAATTGTACTCTGCT(SEQ ID NO: 70)
806‐プライマー2:
AGCAGAGTACAATTGTCTCTTTGGACCACCACCTCTCTTAGACCAAGTAGAC(SEQ ID NO: 71)
ラキシン800801担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800806前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRGGGPKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 9)
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRGGGPKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 9)
2.組み換えヒト・リラキシン800806の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800806の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800806の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン800806(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800806-1のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800806-1発現ベクターの構築
リラキシン800806-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
806-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 73)
806-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 74)
806-1‐プライマー3:
GGTGGTGGTCCAAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 75)
806-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTTGGACCACCACC(SEQ ID NO: 76)
1.組み換えヒト・リラキシン800806-1発現ベクターの構築
リラキシン800806-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
806-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 73)
806-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 74)
806-1‐プライマー3:
GGTGGTGGTCCAAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 75)
806-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTTGGACCACCACC(SEQ ID NO: 76)
ラキシン800806担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800806-1前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRGGGPKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 10)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRGGGPKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 10)
2.組み換えヒト・リラキシン800806-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800806-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800806-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800806-1の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800808のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800808発現ベクターの構築
リラキシン800808は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
808‐プライマー1:
GGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAAGAAGGTGAACCAAAGGATTCTTGGATGGAAGAAG(SEQ ID NO: 78)
808‐プライマー2:
CTTCTTCCATCCAAGAATCCTTTGGTTCACCTTCTTCTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO: 79)
1.組み換えヒト・リラキシン800808発現ベクターの構築
リラキシン800808は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
808‐プライマー1:
GGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAAGAAGGTGAACCAAAGGATTCTTGGATGGAAGAAG(SEQ ID NO: 78)
808‐プライマー2:
CTTCTTCCATCCAAGAATCCTTTGGTTCACCTTCTTCTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO: 79)
ラキシン800800担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800808前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
EEGEPKDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 11)
EEGEPKDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 11)
2.組み換えヒト・リラキシン800808の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800808の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800808の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン800808(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800808-1のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800808-1発現ベクターの構築
リラキシン800808-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
808-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 81)
808-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 82)
808-1‐プライマー3:
CTACTTGGTCTAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 83)
808-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTAGACCAAGTAG(SEQ ID NO: 84)
1.組み換えヒト・リラキシン800808-1発現ベクターの構築
リラキシン800808-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
808-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 81)
808-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 82)
808-1‐プライマー3:
CTACTTGGTCTAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 83)
808-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTAGACCAAGTAG(SEQ ID NO: 84)
ラキシン800808担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800808-1前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
EEGEPKDSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 12)
EEGEPKDSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 12)
2.組み換えヒト・リラキシン800808-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800808-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800808-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800808-1の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800809のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800809発現ベクターの構築
リラキシン800809は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
809‐プライマー1:
GGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAAGAAGGTGAACCAAAGAGAGATTCTTGGATGGAAGAAG(SEQ ID NO: 86)
809‐プライマー2:
CTTCTTCCATCCAAGAATCTCTCTTTGGTTCACCTTCTTCTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO: 87)
1.組み換えヒト・リラキシン800809発現ベクターの構築
リラキシン800809は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
809‐プライマー1:
GGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAAGAAGGTGAACCAAAGAGAGATTCTTGGATGGAAGAAG(SEQ ID NO: 86)
809‐プライマー2:
CTTCTTCCATCCAAGAATCTCTCTTTGGTTCACCTTCTTCTCTTTTCTCGAGAGATACCC(SEQ ID NO: 87)
ラキシン800800担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800809前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
EEGEPKRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 13)
EEGEPKRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 13)
2.組み換えヒト・リラキシン800809の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800809の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800809の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン800809(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800809-1のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800809-1発現ベクターの構築
リラキシン800809-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は800808-1のものと同一であった。
809-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 89)
809-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 90)
809-1‐プライマー3:
CTACTTGGTCTAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 91)
809-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTAGACCAAGTAG(SEQ ID NO: 92)
1.組み換えヒト・リラキシン800809-1発現ベクターの構築
リラキシン800809-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した4本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は800808-1のものと同一であった。
809-1‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 89)
809-1‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 90)
809-1‐プライマー3:
CTACTTGGTCTAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 91)
809-1‐プライマー4:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTAGACCAAGTAG(SEQ ID NO: 92)
ラキシン800809担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800809-1前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
EEGEPKRDSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 14)
EEGEPKRDSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 14)
2.組み換えヒト・リラキシン800809-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800809-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800809-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン800809-1の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800810のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800810発現ベクターの構築
リラキシン800810は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
810‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 94)
810‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 95)
1.組み換えヒト・リラキシン800810発現ベクターの構築
リラキシン800810は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
810‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 94)
810‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 95)
ラキシン800800担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800810前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 15)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 15)
2.組み換えヒト・リラキシン800810の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800810の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800810の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン800810の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800810-1のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800810-1発現ベクターの構築
リラキシン800810-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
810-1‐プライマー1:
CTACTTGGTCTAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 97)
810-1‐プライマー2:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTAGACCAAGTAG(SEQ ID NO: 98)
1.組み換えヒト・リラキシン800810-1発現ベクターの構築
リラキシン800810-1は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
810-1‐プライマー1:
CTACTTGGTCTAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGG(SEQ ID NO: 97)
810-1‐プライマー2:
CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTAGACCAAGTAG(SEQ ID NO: 98)
ラキシン800810担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800810-1前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 16)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 16)
2.組み換えヒト・リラキシン800810-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800810-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800810-1の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800810-1の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800811のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800811発現ベクターの構築
リラキシン800811は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
811‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 100)
811‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 101)
1.組み換えヒト・リラキシン800811発現ベクターの構築
リラキシン800811は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
811‐プライマー1:
GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTG(SEQ ID NO: 100)
811‐プライマー2:
CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAAC(SEQ ID NO: 101)
ラキシン800804担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800811前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 17)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 17)
2.組み換えヒト・リラキシン800811の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800811の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800811の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800811の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800813のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800813発現ベクターの構築
リラキシン800813は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
813‐プライマー1:
CTGGTTACGGTTCTAAGAGAGAATTGTACTCTGCTTTGGC(SEQ ID NO: 103)
813‐プライマー2:
GCCAAAGCAGAGTACAATTCTCTCTTAGAACCGTAACCAG(SEQ ID NO: 104)
1.組み換えヒト・リラキシン800813発現ベクターの構築
リラキシン800813は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
813‐プライマー1:
CTGGTTACGGTTCTAAGAGAGAATTGTACTCTGCTTTGGC(SEQ ID NO: 103)
813‐プライマー2:
GCCAAAGCAGAGTACAATTCTCTCTTAGAACCGTAACCAG(SEQ ID NO: 104)
ラキシン800811担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800813前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRELYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 18)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRELYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 18)
2.組み換えヒト・リラキシン800813の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800813の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800813の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800813の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(EA1) ELYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 136
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(EA1) ELYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 136
〔組み換えヒト・リラキシン800814のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800814発現ベクターの構築
リラキシン800814は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
814‐プライマー1:
CTGGTTACGGTTCTAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGGC(SEQ ID NO: 106)
814‐プライマー2:
GCCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTAGAACCGTAACCAG(SEQ ID NO: 107)
1.組み換えヒト・リラキシン800814発現ベクターの構築
リラキシン800814は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
814‐プライマー1:
CTGGTTACGGTTCTAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGGC(SEQ ID NO: 106)
814‐プライマー2:
GCCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTAGAACCGTAACCAG(SEQ ID NO: 107)
ラキシン800811担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800814前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 19)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 19)
2.組み換えヒト・リラキシン800814の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800814の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800814の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800814の配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800816のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800816発現ベクターの構築
リラキシン800816は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
816‐プライマー1:
ATTAAGTTGTGTGGTAGAAACTTGGTTAGAGCTCAAATTGC(SEQ ID NO: 109)
816‐プライマー2:
GCAATTTGAGCTCTAACCAAGTTTCTACCACACAACTTAAT(SEQ ID NO: 110)
1.組み換えヒト・リラキシン800816発現ベクターの構築
リラキシン800816は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
816‐プライマー1:
ATTAAGTTGTGTGGTAGAAACTTGGTTAGAGCTCAAATTGC(SEQ ID NO: 109)
816‐プライマー2:
GCAATTTGAGCTCTAACCAAGTTTCTACCACACAACTTAAT(SEQ ID NO: 110)
ラキシン800804担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800816前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRNLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 20)
DSWMEEVIKLCGRNLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 20)
2.組み換えヒト・リラキシン800816の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800816の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800816の形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800816の配列は次の通りであった。
B鎖(NB14) DSWMEEVIKLCGRNLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 139
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(NB14) DSWMEEVIKLCGRNLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 139
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800847Yのクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800847Y発現ベクターの構築
リラキシン800847Yは、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
847Y‐プライマー1:
AAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAA(SEQ ID NO: 112)
847Y‐プライマー2:
TTTGAGCTCTAACCAATTCTCTACCACACAACTT(SEQ ID NO: 113)
1.組み換えヒト・リラキシン800847Y発現ベクターの構築
リラキシン800847Yは、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
847Y‐プライマー1:
AAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAA(SEQ ID NO: 112)
847Y‐プライマー2:
TTTGAGCTCTAACCAATTCTCTACCACACAACTT(SEQ ID NO: 113)
ラキシン800814担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800847Y前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 21)
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 21)
2.組み換えヒト・リラキシン800847Yの形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800847Yの形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800847Yの形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800847Yの配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800851Yのクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800851Y発現ベクターの構築
リラキシン800851Yは、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
851Y‐プライマー1:
GGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGGATGGAAGAAGTTATTAAG(SEQ ID NO: 115)
851Y‐プライマー2:
CTTAATAACTTCTTCCATCCATCTTTTCTCGAGAGATACCCC(SEQ ID NO: 116)
1.組み換えヒト・リラキシン800851Y発現ベクターの構築
リラキシン800851Yは、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
851Y‐プライマー1:
GGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGGATGGAAGAAGTTATTAAG(SEQ ID NO: 115)
851Y‐プライマー2:
CTTAATAACTTCTTCCATCCATCTTTTCTCGAGAGATACCCC(SEQ ID NO: 116)
ラキシン800814担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例2に記載したものと同一であった。800851Y前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
WMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 22)
WMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 22)
2.組み換えヒト・リラキシン800851Yの形質転換、スクリーニング及び誘導性発現
組み換えヒト・リラキシン800851Yの形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
組み換えヒト・リラキシン800851Yの形質転換、スクリーニング及び誘導性発現の方法は、実施例1に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800851Yの配列は次の通りであった。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1)DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1)DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
〔組み換えヒト・リラキシン800828のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800828発現ベクターの構築
コドン最適化ヒト・リラキシンの完全長DNA配列は、NdeI切断部位(CATATG)を5’末端に、またBamHI切断部位(GGATCC)を3’末端に導入することにより、オーバーラップ(Overlap)PCR法により合成した。インビトロジェン(Invitrogen)社により合成した6本の一本鎖DNA断片を合成プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
828‐プライマー1:
CATATGAAGAAAAACATCGCGTTCCTGCTGAAACGTGACTCTTGGATGGA(SEQ ID NO: 118)
828‐プライマー2:
GCACGAACCAGTTCACGACCGCACAGTTTGATAACTTCTTCCATCCAAGAGTCACGTTT(SEQ ID NO: 119)
828‐プライマー3:
CGTGAACTGGTTCGTGCGCAAATTGCGATCTGCGGTATGTCTACCTGGTCTAAACGTAA(SEQ ID NO: 120)
828‐プライマー4:
CAGCTGACGTTTTTTACGAGAACCGTAACCGGTCGGTTTACGTTTAGACCAGGTAGACA(SEQ ID NO: 121)
828‐プライマー5:
CTCGTAAAAAACGTCAGCTGTACTCTGCGCTGGCGAACAAATGCTGCCACGTTGGTTGC(SEQ ID NO: 122)
828‐プライマー6:
GGATCCTTAGCAGAAACGCGCCAGAGAACGTTTGGTGCAACCAACGTGGCAG(SEQ ID NO: 123)
1.組み換えヒト・リラキシン800828発現ベクターの構築
コドン最適化ヒト・リラキシンの完全長DNA配列は、NdeI切断部位(CATATG)を5’末端に、またBamHI切断部位(GGATCC)を3’末端に導入することにより、オーバーラップ(Overlap)PCR法により合成した。インビトロジェン(Invitrogen)社により合成した6本の一本鎖DNA断片を合成プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
828‐プライマー1:
CATATGAAGAAAAACATCGCGTTCCTGCTGAAACGTGACTCTTGGATGGA(SEQ ID NO: 118)
828‐プライマー2:
GCACGAACCAGTTCACGACCGCACAGTTTGATAACTTCTTCCATCCAAGAGTCACGTTT(SEQ ID NO: 119)
828‐プライマー3:
CGTGAACTGGTTCGTGCGCAAATTGCGATCTGCGGTATGTCTACCTGGTCTAAACGTAA(SEQ ID NO: 120)
828‐プライマー4:
CAGCTGACGTTTTTTACGAGAACCGTAACCGGTCGGTTTACGTTTAGACCAGGTAGACA(SEQ ID NO: 121)
828‐プライマー5:
CTCGTAAAAAACGTCAGCTGTACTCTGCGCTGGCGAACAAATGCTGCCACGTTGGTTGC(SEQ ID NO: 122)
828‐プライマー6:
GGATCCTTAGCAGAAACGCGCCAGAGAACGTTTGGTGCAACCAACGTGGCAG(SEQ ID NO: 123)
リラキシンはKOD Plusキット(東洋紡、カタログ番号KOD-201)により合成し、反応は2ステップPCRにより行った。PCRステップ1、25 μL反応系:2.5 μLの10XKOD緩衝液、2.5 μLの2 mM dNTPs、プライマー1、2、3、4、5、6(10 μM)をそれぞれ1 μL、0.5 μLのKOD Plus、1 μLの25 mM MgSO4、12.5 μLの脱イオン蒸留水(ddH2O)。反応プログラム:94℃、5分を行い、次に94℃、30秒;60℃、30秒;68℃、30秒の増幅サイクルを30回後、68℃、30分でPCR増幅工程を停止した。PCRステップ2、25 μL反応系:2.5 μLの10XKOD緩衝液、2.5 μLの2 mM dNTPs、プライマー1及び6(10 μM)をそれぞれ1 μL、1 μLの第1回PCR産物、0.5 μLのKOD Plus、1 μLの25 mM MgSO4、15.5 μLの脱イオン蒸留水。反応プログラム:94℃、5分、次に94℃、30秒;68℃、60秒の増幅サイクルを30回後、68℃、10分でPCR増幅工程を停止した。
合成されたDNA配列及びpET9aベクター(ノバジェン(Novagen)社、カタログ番号69431-3)は、それぞれNdeI/BamHI(タカラバイオ、カタログ番号D1161A/D1010A)を用いて消化し、得られた断片を1.2%アガロースゲルにより回収し、T4 DNAリガーゼ(ニュー・イングランド・バイオラボ社、カタログ番号M0202V)により結合させ、DH5αコンピテント細胞(天根生化(Tiangen)、カタログ番号CB101-02)に形質転換させた。陽性クローンを採取し、インビトロジェン社により配列を決定した。800828前駆体のDNA配列は次の通りである。
下線部は切断部位を示す。
下線部は切断部位を示す。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
MKKNIAFLLKRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 23)
MKKNIAFLLKRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 23)
2.少量の組み換えヒト・リラキシン800828の誘導性発現
正確な配列を持つPET9a−リラキシン800828プラスミドを、BL21(DE3)コンピテント細胞(天根生化(Tiangen)、カタログ番号CB105-02)に形質転換させ、IPTG誘導のために単クローン株を採取した。具体的な方法は次の通りであった:単クローン株を新鮮プレートから採取し、10 mLのアンピシリンを含むLB培地に接種して、OD600値が0.6に到達するまで、振とうしながら37℃で培養した。試料の一部を未誘導対照として集め、凍結保存した。残余試料を、1 M IPTG原液を加えて終濃度が1 mMになるように希釈し、さらに4時間培養した。菌株を遠心分離により回収し、誘導後、SDS-PAGE電気泳動により分析した。
正確な配列を持つPET9a−リラキシン800828プラスミドを、BL21(DE3)コンピテント細胞(天根生化(Tiangen)、カタログ番号CB105-02)に形質転換させ、IPTG誘導のために単クローン株を採取した。具体的な方法は次の通りであった:単クローン株を新鮮プレートから採取し、10 mLのアンピシリンを含むLB培地に接種して、OD600値が0.6に到達するまで、振とうしながら37℃で培養した。試料の一部を未誘導対照として集め、凍結保存した。残余試料を、1 M IPTG原液を加えて終濃度が1 mMになるように希釈し、さらに4時間培養した。菌株を遠心分離により回収し、誘導後、SDS-PAGE電気泳動により分析した。
得られた組み換えヒト・リラキシン800828(WT、野生型)の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800843のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800843発現ベクターの構築
リラキシン800843は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
843‐プライマー1:
GTTCTCGTAAAAAACGTTGGCTGTACTCTGCGCTG(SEQ ID NO: 125)
843‐プライマー2:
CAGCGCAGAGTACAGCCAACGTTTTTTACGAGAAC(SEQ ID NO: 126)
1.組み換えヒト・リラキシン800843発現ベクターの構築
リラキシン800843は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
843‐プライマー1:
GTTCTCGTAAAAAACGTTGGCTGTACTCTGCGCTG(SEQ ID NO: 125)
843‐プライマー2:
CAGCGCAGAGTACAGCCAACGTTTTTTACGAGAAC(SEQ ID NO: 126)
リラキシン800828担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例18に記載したものと同一であった。800843前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
MKKNIAFLLKRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRWLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 24)
MKKNIAFLLKRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRWLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 24)
2.少量の組み換えヒト・リラキシン800843の誘導性発現
少量の組み換えヒト・リラキシン800843の誘導性発現の方法は、実施例16に記載したものと同一であった。
少量の組み換えヒト・リラキシン800843の誘導性発現の方法は、実施例16に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800843の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WA1) WLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 141
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WA1) WLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 141
〔組み換えヒト・リラキシン800847のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800847発現ベクターの構築
リラキシン800847は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
847‐プライマー1:
CAAACTGTGCGGTCGTGAACTGGTTCGTGCGCAAA(SEQ ID NO: 128)
847‐プライマー2:
TTTGCGCACGAACCAGTTCACGACCGCACAGTTTG(SEQ ID NO: 129)
1.組み換えヒト・リラキシン800847発現ベクターの構築
リラキシン800847は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
847‐プライマー1:
CAAACTGTGCGGTCGTGAACTGGTTCGTGCGCAAA(SEQ ID NO: 128)
847‐プライマー2:
TTTGCGCACGAACCAGTTCACGACCGCACAGTTTG(SEQ ID NO: 129)
リラキシン800845担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例18に記載したものと同一であった。800847前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
MKKNIAFLLKRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 25)
MKKNIAFLLKRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 25)
2.少量の組み換えヒト・リラキシン800847の誘導性発現
少量の組み換えヒト・リラキシン800847の誘導性発現の方法は、実施例16に記載したものと同一であった。
少量の組み換えヒト・リラキシン800847の誘導性発現の方法は、実施例16に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800847の配列は次の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138.
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138.
〔組み換えヒト・リラキシン800851のクローニングと発現〕
1.組み換えヒト・リラキシン800851発現ベクターの構築
リラキシン800851は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
851‐プライマー1:
CGCGTTCCTGCTGAAACGTTGGATGGAAGAAGTTATC(SEQ ID NO: 131)
851‐プライマー2:
GATAACTTCTTCCATCCAACGTTTCAGCAGGAACGCG(SEQ ID NO: 132)
1.組み換えヒト・リラキシン800851発現ベクターの構築
リラキシン800851は、PCR部位特異的突然変異誘発法により合成した。インビトロジェン社により合成した2本の一本鎖DNA断片を、部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。該プライマーの配列は次の通りであった。
851‐プライマー1:
CGCGTTCCTGCTGAAACGTTGGATGGAAGAAGTTATC(SEQ ID NO: 131)
851‐プライマー2:
GATAACTTCTTCCATCCAACGTTTCAGCAGGAACGCG(SEQ ID NO: 132)
リラキシン800845担体をPCR部位特異的突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異過程は実施例18に記載したものと同一であった。800851前駆体のDNA配列は次の通りである。
上記DNAによりコードされたアミノ酸配列は次の通りである。
MKKNIAFLLKRWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 26)
MKKNIAFLLKRWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO: 26)
2.少量の組み換えヒト・リラキシン800851の誘導性発現
少量の組み換えヒト・リラキシン800851の誘導性発現の方法は、実施例16に記載したものと同一であった。
少量の組み換えヒト・リラキシン800851の誘導性発現の方法は、実施例16に記載したものと同一であった。
得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800851の配列は次の通りであった。
B鎖(DelB1B2、DB14) WMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 140
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138.
B鎖(DelB1B2、DB14) WMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 140
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138.
〔組み換えヒト・リラキシン800828の発酵〕
1.菌株種培養
1)菌株:800828発現菌株
2)培地:
a)LB培地:酵母エキス5 g/L、トリプトン10 g/L、NaCl 5 g/L、121℃、30分高温滅菌、
b)カナマイシン保存液:50 mg/mL、0.22 μmフィルター除菌、
c)発酵培地:トリプトン20 g/L、酵母エキス10 g/L、NaCl 10 g/L、Na2HPO4・12H2O 4 g/L、KH2PO4 2 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4 1 g/L、グリセロール10 g/L、消泡剤5 mL、すべてを溶解後、混合物を5 Lの罐内で、121℃、30分滅菌した。
d)追加培地:トリプトン100 g/L、酵母エキス50 g/L、グリセロール500 g/L、121℃で30分滅菌した。
1.菌株種培養
1)菌株:800828発現菌株
2)培地:
a)LB培地:酵母エキス5 g/L、トリプトン10 g/L、NaCl 5 g/L、121℃、30分高温滅菌、
b)カナマイシン保存液:50 mg/mL、0.22 μmフィルター除菌、
c)発酵培地:トリプトン20 g/L、酵母エキス10 g/L、NaCl 10 g/L、Na2HPO4・12H2O 4 g/L、KH2PO4 2 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4 1 g/L、グリセロール10 g/L、消泡剤5 mL、すべてを溶解後、混合物を5 Lの罐内で、121℃、30分滅菌した。
d)追加培地:トリプトン100 g/L、酵母エキス50 g/L、グリセロール500 g/L、121℃で30分滅菌した。
2.発酵工程管理
1)種活性化:グリセロールチューブ内で−80℃に保存された種を室温で解凍し、グリセロールチューブ内の500 μLの菌懸濁液を無菌的に50 mLのLB培地に接種した後、5 μLのカナマイシン保存液を添加し、37℃で7時間、200 rpmで培養した。
2)発酵槽への上積み:50 mLの活性化した種を3 Lの発酵培地に無菌的に接種した後、30 mLのカナマイシンを添加した。培養温度条件:37℃、空気流量:0.5 vvm、発酵槽圧:0.04〜0.05 mpa、DO:30%以上、pH:約7.0、アンモニア水で維持。
3)発酵後およそ4時間で、OD600値の測定のため培養液からサンプルが1時間ごとに採取され、OD600≧40の間に誘導が開始された。
4)誘導物質:4 mLのIPTG(1 mol/L、使用前に0.22 μmフィルターメンブランを通して滅菌)を加え、IPTGの終濃度を1 mmol/Lとした。誘導期間中、温度は37℃を保った。他の条件は変化させないまま12時間誘導した。
5)誘導終了後、発酵槽を降ろし、培養液のOD600を測定後、5000 rpmで20分間遠心分離した。菌体を回収し、−80℃で冷凍保存した。
1)種活性化:グリセロールチューブ内で−80℃に保存された種を室温で解凍し、グリセロールチューブ内の500 μLの菌懸濁液を無菌的に50 mLのLB培地に接種した後、5 μLのカナマイシン保存液を添加し、37℃で7時間、200 rpmで培養した。
2)発酵槽への上積み:50 mLの活性化した種を3 Lの発酵培地に無菌的に接種した後、30 mLのカナマイシンを添加した。培養温度条件:37℃、空気流量:0.5 vvm、発酵槽圧:0.04〜0.05 mpa、DO:30%以上、pH:約7.0、アンモニア水で維持。
3)発酵後およそ4時間で、OD600値の測定のため培養液からサンプルが1時間ごとに採取され、OD600≧40の間に誘導が開始された。
4)誘導物質:4 mLのIPTG(1 mol/L、使用前に0.22 μmフィルターメンブランを通して滅菌)を加え、IPTGの終濃度を1 mmol/Lとした。誘導期間中、温度は37℃を保った。他の条件は変化させないまま12時間誘導した。
5)誘導終了後、発酵槽を降ろし、培養液のOD600を測定後、5000 rpmで20分間遠心分離した。菌体を回収し、−80℃で冷凍保存した。
〔組み換えヒト・リラキシン800814の発酵〕
1.菌株:800828発現菌株
2.5 L発酵槽の操作工程:
1)種活性化:
上記のグリセロール中の菌株1 mLを、1000 mLのBMGY培地に接種し、30℃で20時間、220 r/min(rpm)で培養した。
2)接種:
活性化した種を、3 Lの発酵培地(H3PO4 26.7 ml/L、CaSO4 0.93 g/L、K2SO4 18.2 g/L、MgSO4・7H2O 14.9 g/L、KOH 4.13 g/L、グリセロール40 g/L)に無菌的に接種した後、除菌した0.4%PTM1溶液を添加し、発酵を開始した。
3)培養初期段階:
菌株は、調整期(10〜12時間)の後、指数増殖期に入った。菌体生育に必要な30%を超えるDOは、攪拌速度及び通気速度を上げることにより充足させた。回転速度は、毎回50〜100 rpmまで上げた。発酵温度は37℃に制御し、槽圧を0.04〜0.05 Mpa、pHを7.0とした。
4)グリセロール追加段階:
初期培地中の基質が消費された後(18〜24時間)、50%グリセロールを加えたバッチを、制限された速度で追加した。
5)メタノール誘導段階:
グリセロール追加段階における菌体生育の2〜4時間後に、グリセロール追加を停止し、グリセロールが完全に消費されるように、菌を30分間飢餓状態に置いた。次に、誘導のためにメタノールを加えた。70〜96時間後、発酵を終了し、発酵液を7000 rpmで遠心分離し、上清を回収した。
6)目的タンパク質の発現量
発酵上清を1 mL採取し、上清中の目的タンパク質の含量をSDS-PAGEにより調べ、正確な発現量を検証した。
1.菌株:800828発現菌株
2.5 L発酵槽の操作工程:
1)種活性化:
上記のグリセロール中の菌株1 mLを、1000 mLのBMGY培地に接種し、30℃で20時間、220 r/min(rpm)で培養した。
2)接種:
活性化した種を、3 Lの発酵培地(H3PO4 26.7 ml/L、CaSO4 0.93 g/L、K2SO4 18.2 g/L、MgSO4・7H2O 14.9 g/L、KOH 4.13 g/L、グリセロール40 g/L)に無菌的に接種した後、除菌した0.4%PTM1溶液を添加し、発酵を開始した。
3)培養初期段階:
菌株は、調整期(10〜12時間)の後、指数増殖期に入った。菌体生育に必要な30%を超えるDOは、攪拌速度及び通気速度を上げることにより充足させた。回転速度は、毎回50〜100 rpmまで上げた。発酵温度は37℃に制御し、槽圧を0.04〜0.05 Mpa、pHを7.0とした。
4)グリセロール追加段階:
初期培地中の基質が消費された後(18〜24時間)、50%グリセロールを加えたバッチを、制限された速度で追加した。
5)メタノール誘導段階:
グリセロール追加段階における菌体生育の2〜4時間後に、グリセロール追加を停止し、グリセロールが完全に消費されるように、菌を30分間飢餓状態に置いた。次に、誘導のためにメタノールを加えた。70〜96時間後、発酵を終了し、発酵液を7000 rpmで遠心分離し、上清を回収した。
6)目的タンパク質の発現量
発酵上清を1 mL採取し、上清中の目的タンパク質の含量をSDS-PAGEにより調べ、正確な発現量を検証した。
〔組み換えヒト・リラキシン800828の精製とリフォールディング〕
1.封入体の精製
1)湿重量100 gの大腸菌を300 mLの50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAに懸濁し、超音波処理した。10000 rpm、4℃、1時間の遠心分離後、上清を除去した。
2)沈渣を300 mLの2 M尿素、50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAに完全に懸濁した。遠心分離後、上清を除去した。これを1回繰り返した。
3)沈渣を200 mLの8 M尿素、50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAに完全に懸濁した。遠心分離後、上清を除去した。
4)沈渣を200 mLの50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAに完全に懸濁した。遠心分離後、上清を除去した。沈渣は重量を測定した。
5)沈渣を6倍量の6 M GdnCl、50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTA、10 mM DTTに完全に懸濁し、室温で2時間溶解させた。10000 rpm、4℃、1時間の遠心分離後、上清を回収した。
6)電気泳動により各成分が検出された。
1.封入体の精製
1)湿重量100 gの大腸菌を300 mLの50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAに懸濁し、超音波処理した。10000 rpm、4℃、1時間の遠心分離後、上清を除去した。
2)沈渣を300 mLの2 M尿素、50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAに完全に懸濁した。遠心分離後、上清を除去した。これを1回繰り返した。
3)沈渣を200 mLの8 M尿素、50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAに完全に懸濁した。遠心分離後、上清を除去した。
4)沈渣を200 mLの50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAに完全に懸濁した。遠心分離後、上清を除去した。沈渣は重量を測定した。
5)沈渣を6倍量の6 M GdnCl、50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTA、10 mM DTTに完全に懸濁し、室温で2時間溶解させた。10000 rpm、4℃、1時間の遠心分離後、上清を回収した。
6)電気泳動により各成分が検出された。
2.封入体のリフォールディング
1)得られた封入体は、2倍量の50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAで希釈し、十分に混合して4℃冷蔵庫内に一晩静置した。
2)リフォールディング過程はRP-UPLC分析により検出した。反応後、生成物は分取液相より精製し、分子量はLC-MSにより測定した。
a)RP-UPLC条件:ウォーターズ(Waters)社UPLC BioHClass、ACQUITY UPLC BEH 300 C4(1.7 μm、 2.1X100 mm)、移動相:A液0.1%TFA、B液ACN、流速0.3 mL/分、直線的グラジエント:0.5分(10%B液)から9分(60%B液)。
b)分取:ウォーターズ社AutoPurifier、Kromasil 10-100-C18、30X250 mm;移動相:A液0.1%TFA、B液ACN、流速40 mL/分、直線的グラジエント:2分(25%B液)から15分(50%B液)。
c)LC-MS法:Finnigan LCQ Ad、Jupiter C4(5 μ、300A、250X4.6 mm)、移動相:A液0.2%FA、B液0.18%FA/CAN、直線的グラジエント0分(5%B液)から20分(50%B液)。
1)得られた封入体は、2倍量の50 mM Tris(pH8.5)、0.2%EDTAで希釈し、十分に混合して4℃冷蔵庫内に一晩静置した。
2)リフォールディング過程はRP-UPLC分析により検出した。反応後、生成物は分取液相より精製し、分子量はLC-MSにより測定した。
a)RP-UPLC条件:ウォーターズ(Waters)社UPLC BioHClass、ACQUITY UPLC BEH 300 C4(1.7 μm、 2.1X100 mm)、移動相:A液0.1%TFA、B液ACN、流速0.3 mL/分、直線的グラジエント:0.5分(10%B液)から9分(60%B液)。
b)分取:ウォーターズ社AutoPurifier、Kromasil 10-100-C18、30X250 mm;移動相:A液0.1%TFA、B液ACN、流速40 mL/分、直線的グラジエント:2分(25%B液)から15分(50%B液)。
c)LC-MS法:Finnigan LCQ Ad、Jupiter C4(5 μ、300A、250X4.6 mm)、移動相:A液0.2%FA、B液0.18%FA/CAN、直線的グラジエント0分(5%B液)から20分(50%B液)。
3.消化:50 mM Tris(pH8.5)、5 mM Ca2+、トリプシン1:1300、CPB 1:50、基質濃度1 mg/mL、反応温度30℃。反応経過はUPLCにより監視した。その後、反応系をpH3〜4に調節して反応を停止し、沈渣を除去するため遠心分離した。上清を0.22 μmメンブランで濾過し、分取RP-HPLCで精製した。逆相分取グラジエントは2分(20%B液)から15分(45%B液)、その他の試験条件は上記の通りであった。生成物(No. 828)は凍結乾燥して得た。純度はRP-UPLC及びIEC-HPLCで分析した。
1)RP-UPLC条件は上記の通りであった。
2)IEC-HPLC:ウォーターズ社UPLC BioHClass、Protein-Pak Hi Res CM(7 μm、4.6×100mm)、A液:20 mM HEPES pH8.0;B液:0.5 M NaCl、20 mM HEPES(pH8.0)、直線的グラジエント:1分(0%B液)から10分(100%B液)。
1)RP-UPLC条件は上記の通りであった。
2)IEC-HPLC:ウォーターズ社UPLC BioHClass、Protein-Pak Hi Res CM(7 μm、4.6×100mm)、A液:20 mM HEPES pH8.0;B液:0.5 M NaCl、20 mM HEPES(pH8.0)、直線的グラジエント:1分(0%B液)から10分(100%B液)。
4.環化:生成物粉末を1 mM HClに溶解し、80℃の水浴中に静置した。反応経過はUPLCにより監視した。試験条件は上記の通りであった。
5.得られた、本発明における陽性対象であり原初配列を有する初期試料800828(野生型)は、活性試験のために20 mM酢酸ナトリウム(pH5.0)に溶解した。
得られた組み換えヒト・リラキシン800828(WT、野生型)の配列は以下の通りであった。
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
B鎖(WT) DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖(WT) QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135
〔組み換えヒト・リラキシン800814の精製と発酵産物の同定〕
本発明において設計された一連の分子は、A1及びB14部位で電荷の異なるアミノ酸を持つ。その結果、酵母で発現されたリラキシン前駆体は、細胞内で自動的に開裂し、次に、成熟したリラキシン分子が培養液上清中に分泌されることが発見された。無損傷のリラキシン分子は、上清より直接精製することができる。方法は以下の通りであった。
本発明において設計された一連の分子は、A1及びB14部位で電荷の異なるアミノ酸を持つ。その結果、酵母で発現されたリラキシン前駆体は、細胞内で自動的に開裂し、次に、成熟したリラキシン分子が培養液上清中に分泌されることが発見された。無損傷のリラキシン分子は、上清より直接精製することができる。方法は以下の通りであった。
ステップ1:カラムにより精製された上清
まず発酵液上清を、Capto MMC(GE17-5318-03)カラムを装着したAKTA精製装置により精製した。カラムは20 mM酢酸ナトリウム(pH4)により平衡化し、発酵液上清をpH4に調整して試料を添加した。100 mM NaHCO3(pH11)で溶出後、溶出ピークを集めた。このpHを3に調整した後、RP-HPLCで精製した。精製用の逆相分取条件:ウォーターズ社AutoPurifier、Kromasil 10-100-C18、30×250 mm;移動相:A液0.1% TFA;B液CAN、流速40 mL/min、直線的グラジエント2分(20%B液)から15分(50%B液)。溶出ピークを集めた。得られた目的とする生成物は凍結乾燥した。HPLC純度は93%であった。LC-MS測定により、分子量は5953.0であり、これは計算された分子量である5952.9と矛盾しない。得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800814の配列は以下の通りである。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
まず発酵液上清を、Capto MMC(GE17-5318-03)カラムを装着したAKTA精製装置により精製した。カラムは20 mM酢酸ナトリウム(pH4)により平衡化し、発酵液上清をpH4に調整して試料を添加した。100 mM NaHCO3(pH11)で溶出後、溶出ピークを集めた。このpHを3に調整した後、RP-HPLCで精製した。精製用の逆相分取条件:ウォーターズ社AutoPurifier、Kromasil 10-100-C18、30×250 mm;移動相:A液0.1% TFA;B液CAN、流速40 mL/min、直線的グラジエント2分(20%B液)から15分(50%B液)。溶出ピークを集めた。得られた目的とする生成物は凍結乾燥した。HPLC純度は93%であった。LC-MS測定により、分子量は5953.0であり、これは計算された分子量である5952.9と矛盾しない。得られた組み換えヒト・リラキシン類似体800814の配列は以下の通りである。
B鎖(DB14) DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖(DA1) DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138
ステップ2:ジスルフィド結合の同定
上記の生成物を50 mM Tris(pH8.0)に溶解し、トリプシン(シグマ社、カタログ番号T1426)で37℃、一晩消化した。その後、3 μLの1 M HClを添加することにより反応を停止した。LC-MSで検出可能な断片を以下の表に記載した。A24−B23でのジスルフィド結合の存在が証明され、その他の2個のジスルフィド結合は、A10、A11、A15及びB11により構成された。
上記の生成物を50 mM Tris(pH8.0)に溶解し、トリプシン(シグマ社、カタログ番号T1426)で37℃、一晩消化した。その後、3 μLの1 M HClを添加することにより反応を停止した。LC-MSで検出可能な断片を以下の表に記載した。A24−B23でのジスルフィド結合の存在が証明され、その他の2個のジスルフィド結合は、A10、A11、A15及びB11により構成された。
〔リラキシン800814のペプチド断片分析〕
リラキシン800814のMS分子量測定及び配列カバレージ分析は、アジレント社1260 LC-6530 Q-TOF-MSを用いて行った。液相条件における移動相組成は以下の通りであった。
A相:水(0.1%ギ酸を含む);B相:アセトニトリル(0.1%ギ酸を含む)、
カラム:Poroshell 300 SB-C8 2.1×75 mm(5 μm)、カラム温度:50℃。溶出グラジエントは表3に示した。
リラキシン800814のMS分子量測定及び配列カバレージ分析は、アジレント社1260 LC-6530 Q-TOF-MSを用いて行った。液相条件における移動相組成は以下の通りであった。
A相:水(0.1%ギ酸を含む);B相:アセトニトリル(0.1%ギ酸を含む)、
カラム:Poroshell 300 SB-C8 2.1×75 mm(5 μm)、カラム温度:50℃。溶出グラジエントは表3に示した。
MS条件:イオン源:AJS ESI(+)、イオン源パラメータ:噴霧器40 psig、乾燥ガス温度325℃、ガス流速10 L/分、シースガス温度350℃、シースガス流速12 L/分、Vcap 3500 V、フラグメンター200 V、走査範囲:m/z 50〜3200。
リラキシン800814の分子量測定:分子量5948.7996 Daは理論値と完全に一致し、正確な発現が証明された。
リラキシン800814還元ペプチド解析:タンパク質ジスルフィド結合はDTTにより還元し、配列カバレージ分析は、タンパク質発現が正確であることを確認するために行った。条件は以下の通りであった:0.1 mg/mLの試料を、DTT(終濃度20 mM)を加えて2時間インキュベートした後、IAA(終濃度40 mM)を加え、遮光して30分間インキュベートした。処理後の試料はLC-MSで分析した。結果より、分子の配列は理論配列と完全に一致し、発現したタンパク質分子と予期されたタンパク質分子との間に整合性のあることが示される。
〔ヒト・リラキシン類似体800814 PEG誘導体の調製〕
1.組み換えヒト・リラキシン800814(SEQ ID NO: 19、実施例19で調製)の試料100 mgを50 mL反応チューブに正確に秤量し、5.0 mLの0.1 M酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5、4℃)に溶解した。組み換えヒト・リラキシン800814の終濃度は2.0 mg/mLであった(0.1 M氷酢酸/酢酸ナトリウム(3.7 g氷酢酸+3.2 g酢酸ナトリウム+1000 mL水)で調製)。
1.組み換えヒト・リラキシン800814(SEQ ID NO: 19、実施例19で調製)の試料100 mgを50 mL反応チューブに正確に秤量し、5.0 mLの0.1 M酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5、4℃)に溶解した。組み換えヒト・リラキシン800814の終濃度は2.0 mg/mLであった(0.1 M氷酢酸/酢酸ナトリウム(3.7 g氷酢酸+3.2 g酢酸ナトリウム+1000 mL水)で調製)。
2.100 mgのアルデヒド・モノメトキシ・ポリエチレングリコール(m-PEG-CHO、20 kDa)を精秤し、2.0 mLのテトラヒドロフラン/アセトニトリル(1:1)混合溶媒に溶解した。この混合物に、上記の組み換えヒト・リラキシン800814の緩衝液溶液を加えた(PEGと組み換えヒト・リラキシン800814との比率は3:1)。
3.0.5 mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を精秤して、1.0 mLの緩衝液(pH4.5)に溶解し、上記の組み換えヒト・リラキシン800814の緩衝液溶液を加えた(還元剤は100:1(還元剤と修飾剤)の比率で添加した)。
4.反応混合物は室温(T = 25℃)に1.0及び2.0時間保持し、反応過程をRP-HPLCにより測定した。反応生成物がそれ以上生じなくなった時、反応系に1.0 mLの10%グリシン溶液を加え、10〜30分間インキュベートして反応を止めた。
5.精製:反応で得られた組み換えヒト・リラキシン800814−PEG誘導体(PEG-814と称する)は、SP Sepharose Fast Flowカチオン交換媒体カラム(1.6 cm×18 cm)を装着したAKTA purifier 10高速液体クロマトグラフィーシステムにより分離、精製した。平衡緩衝液は20 mmol/L酢酸/酢酸ナトリウム(pH4.5)であった。試料を10倍希釈してカラムに添加し、素通り画分ピークを集め、1 mol/L NaClを含む溶出緩衝液で洗浄し、溶出ピークを集めた。流速は1.0 mL/min、検出波長は280 nmであった。本発明の産物であるヒト・リラキシン類似体誘導体PEG-814が得られた。
〔生物的評価〕
〔生物的評価〕
ヒト・リラキシン及びその類似体のインビトロ生物活性測定
本発明のヒト・リラキシン類似体(800814)は、THP-1細胞上の受容体に結合し、THP-1細胞のcAMP産生を誘導する。ヒト・リラキシン類似体(800814)のインビトロ活性を測定するため、cAMP産生量を測定した。本来の配列を有する野生型ヒト・リラキシン類似体800828(WT)(実施例29にて調製)を、陽性対照として本試験で使用した。
本発明のヒト・リラキシン類似体(800814)は、THP-1細胞上の受容体に結合し、THP-1細胞のcAMP産生を誘導する。ヒト・リラキシン類似体(800814)のインビトロ活性を測定するため、cAMP産生量を測定した。本来の配列を有する野生型ヒト・リラキシン類似体800828(WT)(実施例29にて調製)を、陽性対照として本試験で使用した。
実験用細胞THP-1((ATCC、製品番号TIB-202(登録商標)を37℃、5%CO2で浮遊培養し、細胞が良好な状態で対数増殖期にある時に、実験又は継代に使用した。THP-1細胞は、2〜3日ごとに1:3から1:4の比率で継代することができる。培養液:0.05 mM β−メルカプトエタノール及び10%FBSを含むRPMI1640。実験当日、対数増殖期にあるTHP-1細胞を遠心分離により集め、DMEM/F12に再懸濁した。細胞密度を2×106細胞/mLに調整し、96ウェルプレートに植え付け(ウェルあたり50 μL)、37℃のインキュベーターで30分間インキュベートした。ヒト・リラキシン類似体は、希釈液(DEME/F12+0.2%BSA+0.02ポリソルベート80+2 μMフォルスコリン+500 μM IBMX)で3倍希釈した。50 μLの薬物希釈液を96ウェルプレートに加え、2分間混合し、37℃のインキュベーターで30分間インキュベートした。次に、細胞を4100 rpm/分で10分間、4℃で遠心分離し、75 μLの上清を除去し、50 μLの予冷した溶解緩衝液を各ウェルに添加した(すべての操作は氷上で行った)。これを氷上で20分間、必要な場合には振盪しながらインキュベートした後、細胞を4100 rpm/分で10分間、4℃で遠心分離した。cAMP含有量は、cAMP ELISAキット(セルバイオラボ社)を用いて測定した。
上記実験により得られたデータはGraphpad Prismを用いて非線形曲線に適合させ、THP-1細胞においてヒト・リラキシン類似体(800814)により誘導されるcAMPのEC50値(ng/mL)を得た。結果は以下の表5に示す。
これらの結果より、分子構造の改変のため、800814前駆体分子は細胞内で消化が完了し(発現産物のインビトロ消化精製ステップを省略する)、さらに、上清に直接分泌される成熟リラキシン類似体(800814)のインビトロ活性は、陽性対照分子(800828(WT))の活性に比較して2倍になることが示される(EC50が3.05 ng/mLから1.50 ng/mLに増加した。)。
ヒト・リラキシン及びその類似体のインビボ生物活性測定
本試験では、ICRマウス(雌性、SINO-BRITSH SIPPR/BK実験動物有限公司より購入、証明書番号:SCXK(Shanghai)2008-0016、18〜20 g)を使用した。飼育環境:SPFグレード。ICRマウスは、購入後、実験室環境で2週間飼育した。照明条件:12/12−時間の明暗周期調整;温度20〜25℃;湿度40〜60%。本来の配列を有する野生型ヒト・リラキシン類似体800828(実施例29にて調製)を、本試験において陽性対照として使用した。
本試験では、ICRマウス(雌性、SINO-BRITSH SIPPR/BK実験動物有限公司より購入、証明書番号:SCXK(Shanghai)2008-0016、18〜20 g)を使用した。飼育環境:SPFグレード。ICRマウスは、購入後、実験室環境で2週間飼育した。照明条件:12/12−時間の明暗周期調整;温度20〜25℃;湿度40〜60%。本来の配列を有する野生型ヒト・リラキシン類似体800828(実施例29にて調製)を、本試験において陽性対照として使用した。
実験開始1週間前、各雌性ICRマウスに、オリーブオイルと混合したβ−エストラジオール(水不溶、油微溶)を、5 μg/100μL/動物で皮下注射した。6日後、体重が22 g未満のICRマウスを除外し、残りのマウスを、体重に従って均等に群分けした。マウスには、リラキシン800828(WT)(6 μg/100 μL/マウス)、800814(6 μg/100 μL/マウス)及び0.1%ベンゾパープリン4B生理食塩水(溶媒対照群)をそれぞれ皮下注射した。リラキシン800828(WT)及び800814は、0.1%ベンゾパープリン4Bを含む生理食塩水に溶解した。40時間後、恥骨を取り出し、皮膚と筋肉を骨より除去し、顕微鏡下で恥骨幅を測定した。溶媒対照群の平均恥骨幅を1として、相対幅を、各投与群の幅の溶媒対照群の幅に対する比として表した。結果は次の通りである。
これらの結果は、800814と同様に、陽性対照分子もマウスにおける恥骨の成長を促進するが、800814分子は、陽性対照分子よりも顕著に優れた有効性を有することを示す(1.72対1.24、p<0.05)。
ヒト・リラキシン及びその類似体のインビボ半減期測定
本試験では、全部で12匹の実験用SDラット(雄6匹、雌6匹)を使用した(SINO-BRITSH SIPPR/BK実験動物有限公司より購入、証明書番号:SCXK(Shanghai)2008-0016、160〜180 g)。飼育環境:SPFグレード。SDラットは、温度20〜25℃、湿度40〜60%の実験室環境で3日間飼育した。本来の配列を有する野生型ヒト・リラキシン類似体800828(WT、実施例29にて調製)を、本試験において陽性対照として使用した。
本試験では、全部で12匹の実験用SDラット(雄6匹、雌6匹)を使用した(SINO-BRITSH SIPPR/BK実験動物有限公司より購入、証明書番号:SCXK(Shanghai)2008-0016、160〜180 g)。飼育環境:SPFグレード。SDラットは、温度20〜25℃、湿度40〜60%の実験室環境で3日間飼育した。本来の配列を有する野生型ヒト・リラキシン類似体800828(WT、実施例29にて調製)を、本試験において陽性対照として使用した。
ラットは無作為に3群に分け、各群4匹のラット、雌雄同数とした。対照(生理食塩水)及びヒト・リラキシン(類似体800814、野生型800828)を、それぞれ0.5 mg/kg/ラットの投与量でラット尾静脈に注射した(試料あたりラット4匹)。血液試料は、ラット眼窩静脈叢から、投与後0、0.03、0.08、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6及び8時間で採取した。血液試料は遠心分離し、上清を集めて、次の試験のため−20℃で保存した。血液を集めた後、血液試料中のリラキシン含量を、ヒト・リラキシン−2 Quantikine ELISAキット(R&Dシステムズ社)で測定した。被験薬物のT1/2は、T1/2用計算公式及びエクセルで計算した。結果は以下の通りである。
結果より、本発明による800814分子における構造改変は、その半減期に影響しないことが示される。
ヒト・リラキシン類似体誘導体PEG-814の長期インビボ活性分析
実験用SHR雌性ラット(35週齢、体重約370 g)は、Beijing Weitong Lihua実験動物有限公司から入手した(カタログ番号:11400700009329)。飼育環境::SPFグレード。被験試料のヒト・リラキシン類似体誘導体PEG-814は実施例31で調製した。
実験用SHR雌性ラット(35週齢、体重約370 g)は、Beijing Weitong Lihua実験動物有限公司から入手した(カタログ番号:11400700009329)。飼育環境::SPFグレード。被験試料のヒト・リラキシン類似体誘導体PEG-814は実施例31で調製した。
ラットは、購入後、5匹/ケージとし、12/12−時間の明暗周期調整;温度20〜25℃;湿度50〜60%の実験室環境で1週間飼育した。実験開始前、SHRラットの基礎血圧を、非侵襲性血圧モニター(Softron公司、型式BP-98A)で測定した。血圧が安定し、170 mmHg以上のラットを選択し、無作為に各群10匹の被験薬物群(PEG-814)と溶媒対照群(生理食塩水)とに分割した。リラキシンPEG-814又は生理食塩水を、毎回500 μL(30 μg/日/ラット)、1日1回(午後15:00)、6週連続で、それぞれラット尾静脈に注射した。血圧は週に1回測定し、体重と血圧データを記録した。
各群におけるラット体重及び血圧の変化は、エクセル統計ソフトウェアを用いて計算した。被験薬物群及び溶媒対照群における体重及び血圧データはt検定を行った。統計的有意性及び有意差に関して、投薬群及び溶媒対照群の両方について投与前後の血圧を比較した。PEG-814の降圧効果を評価した。
結果より、PEG-814は、1日1回の頻度で投与した場合、顕著な効果(血圧低下)及び長時間持続効果を発揮することが示される。また、PEG-814は体重に影響を与えないことも示された。従来型のリラキシン(非PEG修飾)は、連続的に静脈内投与することが必要である。
Claims (18)
- A鎖及びB鎖を含み、A鎖及びB鎖のアミノ酸配列がそれぞれ下記式により表され、
A鎖:A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC
B鎖:DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS
A1はQ、D、E及びWからなる群より選ばれ;
B14はE、D及びNからなる群より選ばれ;
A1がQであり、B14がE又はDではない場合には、任意にB1及びB2は同時に欠落している;
ヒト・リラキシン類似体。 - A鎖及びB鎖のアミノ酸配列がそれぞれ下記式により表され、
A鎖:A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC
B鎖:DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS
A1はQ、D、E及びWからなる群より選ばれ、好ましくは、A1はD、E及びWからなる群より選ばれ、より好ましくはDであり;
B14はE、D及びNからなる群より選ばれ;
A1がQである場合には、B14はE又はDではない;
請求項1に記載のヒト・リラキシン類似体。 - B14がDである、請求項1に記載のヒト・リラキシン類似体。
- A鎖及びB鎖のアミノ酸配列が下記からなる群より選ばれる、請求項1に記載のヒト・リラキシン類似体。
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 137
A鎖:ELYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 136;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRNLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 139
A鎖:QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 135;
B鎖:WMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 140
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138;
B鎖:DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖:WLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 141;及び、
B鎖:DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS SEQ ID NO: 134
A鎖:DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC SEQ ID NO: 138 - 前記B鎖はリンカー配列により前記A鎖に結合しており、該リンカー配列は1〜15アミノ酸残基の長さを有し、好ましくは2〜8アミノ酸残基である、請求項1に記載のヒト・リラキシン類似体。
- リンカー配列のアミノ酸配列が下記からなる群より選ばれる、請求項5に記載のヒト・リラキシン類似体。
L1:KR、
L2:KRKPTGYGSRKKR、 SEQ ID NO: 27、
L3:KRKPTGYGSRKR、 SEQ ID NO: 28、
L4:KRGGGPRR、 SEQ ID NO: 29、
L5:KRGGGPKR、 SEQ ID NO: 30、
L6:KRKPTGYGSKR、 SEQ ID NO: 31、及び、
L7:KRSLKR、 SEQ ID NO: 32 - 前記ヒト・リラキシン類似体のN末端がシグナルペプチド配列に結合しており、該シグナルペプチド配列は4〜15アミノ酸残基の長さを有し、好ましくは6〜11アミノ酸残基である、請求項1に記載のヒト・リラキシン類似体。
- 前記シグナルペプチド配列が下記からなる群より選ばれる、請求項7に記載のヒト・リラキシン類似体。
S1:EEGEPK、 SEQ ID NO: 33、
S2:EEGEPKR、 SEQ ID NO: 34、及び、
S3:MKKNIAFLLKR、 SEQ ID NO: 35 - ヒト・リラキシン類似体誘導体であって、該誘導体が、請求項1〜8のいずれか1項に記載のヒト・リラキシン類似体のPEG修飾により得られ、該PEGの分子量が5〜100 KDaであり、好ましくは10〜80 KDaであり、より好ましくは15〜45 KDaであり、もっとも好ましくは20〜40 KDaであり、該PEG分子が分枝型又は直鎖型であるヒト・リラキシン類似体誘導体。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のヒト・リラキシン類似体を発現する発現前駆体であって、該発現前駆体のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 26からなる群より選ばれる1つ以上である発現前駆体。
- 請求項10に記載の発現前駆体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドからなる発現ベクター。
- 請求項12に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 宿主細胞が細菌であり、好ましくは大腸菌である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が酵母であり、好ましくはピキア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 1種以上の請求項1〜8のいずれか1項に記載のヒト・リラキシン類似体、及び/又は、1種以上の請求項9に記載のヒト・リラキシン類似体誘導体、及び、1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む又はからなる医薬組成物。
- 請求項16に記載の医薬組成物の溶解型を含む注射剤。
- 線維症又は循環器疾患の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項1〜8のいずれか1項に記載のヒト・リラキシン類似体、請求項9に記載のヒト・リラキシン類似体誘導体、若しくは請求項16に記載の医薬組成物、又は請求項17に記載の注射剤の使用。
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