CN110577589B - 胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体及其制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体及其制药用途。本发明的突变体去除了天然胰岛素样生长因子结合蛋白的部分功能，避免了因特异性蛋白酶造成的体内降解，提高了其通过抑制Wnt信号通路而预防和治疗缺血性疾病的能力。本发明的突变体可预防、缓解或治疗缺血性疾病，并避免结合IGFs而诱发的各种潜在健康风险。

Description

胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体及其制药用途

技术领域

本发明涉及生物工程和生物医药领域；具体地，本发明涉及胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体及其制药用途。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病患病期间，长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。据2016年WHO统计发布，中国糖尿病患者总人数1.1亿，占全球患者总数的四分之一。在不远的将来，会达到1.5亿。糖尿病心血管病变被认为是糖尿病的主要死亡原因，而在心血管病变中，心肌缺血最为常见。

心肌缺血是指由于心脏的血液灌注的减少所导致的心脏的供氧不足、心肌物质和能量代谢不正常、不能支持心脏正常功能的病理状态。相比常规缺血性疾病的发生，糖尿病心肌缺血往往由于高血糖造成心肌神经钝化，表现为无症状。进而造成确诊病患病情严重，预后状况差。

此外，糖尿病并发下肢缺血，造成的糖尿病足在临床治疗中也较为普遍。约十分之一以上的糖尿病患者会出现显著的下肢缺血性临床表现。目前临床主要通过外科手术进行治疗，通过微创或供血再造减少肢体坏死范围、避免截肢。

然而，用于治疗糖尿病缺血性疾病手段比较有限，所述疗法存在操作复杂，花费大，且效果和预后不良、有较大的毒副作用等诸多缺点。本领域目前尚无有效防治糖尿病缺血性疾病的药物疗法，因此迫切需要开发效果优良、无毒副作用的、能够替代现有治疗手段的新型药物。

发明内容

本发明的目的在于提供胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体及其制药用途。

在本发明的第一方面，提供胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体，所述突变体相对于野生型的胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)，第95位突变为脯氨酸，第147位突变为丙氨酸，第149位突变为丙氨酸。

在一个优选例中，所述的野生型的胰岛素样生长因子结合蛋白4来源于哺乳动物；较佳地，来源于人；更佳地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在另一优选例中，所述的野生型的胰岛素样生长因子结合蛋白4具有如SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的突变体。

在一个优选例中，编码所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体的多核苷酸具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述宿主细胞为卵巢细胞或HEK293细胞。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体。

在一个优选例中，所述方法包括步骤：

(1)构建含有编码所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体的表达载体；

(2)将步骤(1)获得的表达载体转入宿主细胞；

(3)在适合表达的条件下，培养步骤(2)所述的宿主细胞，从而所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体；

(4)分离步骤(3)中所表达的所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体；

(5)亲和纯化。

在另一优选例中，表达时，所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体与His标签融合表达，在亲和纯化后，利用凝血酶切除标签His。

在本发明的另一方面，提供所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体的用途，用于预防、缓解或治疗缺血性疾病；较佳地，所述的缺血性疾病为糖尿病性缺血性疾病；更佳地，所述的糖尿病性缺血性疾病包括：糖尿病下肢缺血疾病，糖尿病心肌缺血疾病；或所述的糖尿病性缺血性疾病包括：急性缺血性疾病，早期缺血性疾病。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述的组合物包括：(a)所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体；或所述的宿主细胞；以及(b)药学上或食品学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的组合物为液态剂型或固态剂型，如注射液或冻干制剂。

在另一优选例中，所述的组合物的施用包括：静脉注射、皮下注射、或肌内注射等。

在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中包括：所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体；或所述的宿主细胞；或所述的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种消除胰岛素样生长因子结合蛋白4的结合胰岛素样生长因子(IGF)的能力或提高胰岛素样生长因子结合蛋白4的性能的方法，所述方法包括：将胰岛素样生长因子结合蛋白4的第95位突变为脯氨酸，第147位突变为丙氨酸，第149位突变为丙氨酸。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、人源重组胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质结构的示意图。

图2A～B、宿主细胞成功表达了IGFBP4-H95P，R147A，R149A。

图2A、检测IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质表达和纯化的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为在变性条件下纯化后的蛋白；泳道2为在非变性条件下纯化后的蛋白。

图2B、检测IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质表达和纯化的蛋白杂交(Westernblot)结果。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为作为阳性对照的多标签蛋白；泳道2为在变性条件下纯化后的蛋白；泳道4为在非变性条件下纯化后的蛋白。

图3表示野生型IGFBP4和IGFBP4-H95P，R147A，R149A的IGF结合活性定量结果。

图4表示野生型IGFBP4和IGFBP4-H95P，R147A，R149A突变体对IGF II所刺激的细胞增殖的影响。

图5(A)～(B)、下肢缺血术前后糖尿病小鼠的下肢血流的激光多普勒成像检测结果和下肢组织的H&E染色结果；其中右肢结果代表术前小鼠下肢的正常血流状况。

图6(A)～(B)、心肌缺血术后，针对小鼠左心室的射血分数(EF％)和短轴缩短率(FS％)的超声检测结果、以及心脏中间部分的切片检测结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，揭示了一种胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体(IGFBP4-H95P，R147A，R149A)，其消除了野生型IGFBP-4结合胰岛素样生长因子(IGF)的能力，更好地体现出优异的治疗缺血性疾病、特别是糖尿病缺血性疾病的作用。本发明的突变体避免了在预防和/或治疗对象的缺血性疾病过程中，由于结合IGFs而诱发对象中潜在的健康风险，尤其是糖尿病心肌缺血、下肢缺血具有良好的治疗和预防作用。

术语

如本文所用，除非另外说明，所述的“胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体”、“突变型胰岛素样生长因子结合蛋白4”“本发明的突变体”、“IGFBP4-H95P，R147A，R149A”可互换使用，是指对应于野生型IGFBP4，第95位突变为脯氨酸，第147位突变为丙氨酸，第149位突变为丙氨酸构成的蛋白。

若需要表示野生型的IGFBP4，其将被标示为“野生型胰岛素样生长因子结合蛋白4”、“野生型IGFBP4”、“IGFBP4”或“野生型蛋白”，其氨基酸序列例如为SEQ ID NO:1。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。

如本文所用，术语“突变”具有本领域公知的涵义，包括但不限于缺失突变、插入突变、置换突变、多点突变、单点突变、定点突变等。

胰岛素样生长因子(IGFs)

胰岛素样生长因子(IGFs)胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，简称IGFs)是一类多功能细胞增殖调控因子，包括两种低分子多肽(IGF-I、IGF-II)、两类特异性受体及六种结合蛋白。IGF-I是一个有70个氨基酸的单链碱性蛋白，分子量7649Da，耐热；而IGF-II则为一个含67个氨基酸的单链弱酸性蛋白，分子量为7471Da，对0.1％SDS稳定，两者70％以上同源，与人类胰岛素原的结构和功能约50％相似。

胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)

IGFs的特异性的结合蛋白(Binding Proteins，BPs)，已发现6种IGFBP，即IGFBP1、2、3、4、5和6，其特征性的结构构成了一个相关性分泌蛋白家族。它们与两种IGF都具高亲和力，而不与胰岛素结合。胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)是最小的IGFBP，也是极其重要的一类胰岛素样生长因子结合蛋白。IGFBP4存在于所有的生物体液中，不同类型的细胞，包括纤维母细胞、神经母细胞瘤细胞、前列腺细胞和骨细胞等均能生成IGFBP4，肝脏是IGFBP4mRNA表达最丰富的部位。目前研究发现，IGFBP4能有效促进血管再生，并通过与IGFs的直接结合而减弱IGFBP4独立的促进血管再生的能力。

突变的胰岛素样生长因子结合蛋白4

本发明的突变型IGFBP4消除了野生型胰岛素样生长因子结合蛋白4结合IGF的能力，但保留了野生型胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)的缺血性疾病防治功能，从而避免了在预防和/或治疗对象的缺血性疾病过程中，由于结合IGFs而诱发对象中潜在的各种健康风险；并且可更加有效地防治缺血性疾病。

在优选实施方案中，本发明突变的蛋白质为野生型IGFBP4的第95位组氨酸(H)被脯氨酸(P)取代，第147和149位精氨酸(R)被丙氨酸(A)的重组突变体IGFBP4-H95P，R147A，R149A。

本发明还包括所述IGFBP4突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“IGFBP4-H95P，R147A，R149A”相同的生物学功能或活性的蛋白。所述的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的IGFBP4突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于野生型IGFBP4，第95位突变为脯氨酸，第147位突变为丙氨酸，第149位突变为丙氨酸。

本发明中还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸后形成的“IGFBP4-H95P，R147A，R149A”的进一步的变异形式。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。但是在这些变异形式中，对应于野生型IGFBP4，第95位突变为脯氨酸，第147位突变为丙氨酸，第149位突变为丙氨酸。

本发明突变体可来源于多种野生型IGFBP4，优选为来源于哺乳动物的野生型IGFBP4，更优选来源于人。然而，基于IGFBP4在不同物种之间的高度同源性，本领域技术人员将明白来源不同的IGFBP4突变体在种间具有相同或类似的功能。

本发明还提供了编码本发明IGFBP4突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明的IGFBP4突变体核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或IGFBP4突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的IGFBP4突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码IGFBP4突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，IGFBP4突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含IGFBP4突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

表达载体可采用市售的例如但不限于：pUCT、pIRES、pDR、pUC18、pcDNA等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。本发明优选实例中采用的表达载体是pcDNA 3.1。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞。例如但不限于HEK293细胞，CHO细胞，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。上述宿主细胞均可以市售获得。作为本发明的优选方式，所述的细胞是HEK293细胞，其可良好地表达。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

IGFBP4突变体的用途

本发明还提供了一种突变的IGFBP4的用途，所述蛋白用于制备预防和/或治疗糖尿病缺血性疾病、尤其是急性缺血性疾病或早期缺血性疾病的药物。所述的糖尿病缺血性疾病选自下组：心肌缺血、下肢缺血、肠道缺血、或肾缺血，较佳地为心肌缺血或下肢缺血。

本发明的突变体改善糖尿病缺血性疾病的症状以及防治缺血性疾病的用途至少可归因于其防止缺血部位的短时间内的大量细胞死亡，这至少可部分归因于在细胞死亡之前，防止缺血引起的初期DNA损伤以及由DNA损伤引起的细胞死亡。并通过避免与IGFs的结合，确保该突变体蛋白重建供血的能力保持稳定持久。该突变体蛋白的上述作用对于糖尿病急性心肌缺血尤其重要。由于在出生后，维持心跳的心肌细胞基本上失去了分裂增殖的能力，缺血导致的死亡的心肌细胞只能最终被疤痕替代，形成无功能的心脏组织，其最终导致心衰，甚至个体的死亡。而且这一情况在糖尿病患者中更为显著，成为糖尿病并发死亡的主要原因之一。因此，防止糖尿病急性心肌缺血引起的短时间内的心肌细胞的大量死亡具有在根本上防治心肌缺血疾病的意义。本发明的突变体由于可防止短时间发生大面积的细胞死亡，从而极大地有利于延缓缺血部位的例如组织损伤，促进血流恢复、血管重建等一系列恢复性生理活动，进而缓解各种缺血性疾病的症状，加速健康状态的回复。

在本发明的具体实施例中，证明了本发明的突变体对于糖尿病缺血性疾病治疗的效果优于野生型蛋白的效果，这不仅体现在由于其不结合IGFs，因此可以施用较小的剂量，由此减少潜在的药物毒性和与IGFs结合相关的健康风险；还体现在即使不存在IGFs因素，所述突变蛋白质也体现了出了更加优于其野生型的治疗效果。

本发明还提供了一种预防和/或治疗缺血性疾病、优选急性缺血性疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量的本发明的IGFBP4突变体，或有效量的能够体内表达本发明IGFBP4突变体的核苷酸序列，或有效量的含所述IGFBP4突变体或所述核苷酸序列的药物组合物。所述的糖尿病缺血性疾病包括选自下组：心肌缺血、下肢缺血、脑缺血、肠道缺血、或肾缺血；较佳地为心肌缺血或下肢缺血。所述的施用包括：静脉注射、口服片剂、瘤内、腹腔注射等；所述的对象为哺乳动物，优选人。

组合物

本发明还提供了一种组合物，所述的组合物可以是(但不限于)药物组合物、保健品组合物或食品组合物。所述的组合物包含有效量(如0.000001-90wt.％；较佳的0.1-50wt.％；更佳的5-40wt.％)的本发明的IGFBP4突变体，以及药学上或食品学上可接受的载体。

通常，可将本发明的IGFBP4突变体配制于无毒、惰性的和药学上或食品学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的IGFBP4突变体以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。通常药物制剂应与给药的方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当IGFBP4突变体每天以约0.0001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明还提供了一种用于试剂盒(或称为药盒)，其中包括：所述的IGFBP4突变体、表达该突变体的宿主细胞或含有所述IGFBP4突变体的组合物。作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还可包括其它一些药剂或辅剂，或中还可包括使用说明书，以便于人们使用。

本发明的突变体的主要优点包括：

1)可防止糖尿病急性缺血导致的短时间内的缺血部位大面积的细胞死亡，促进缺血部位的血流恢复、组织重塑和症状缓解；

2)具有优异的预防和治疗缺血性疾病的效果；而且其效果优于野生型IGFBP4，而该优异的效果不仅仅在于不结合IGFs。

3)在治疗中无毒副作用；

4)不结合IGF I和/或IGFII，从而避免在预防和/或治疗对象的缺血性疾病过程中，由于结合IGFs而诱发对象中的各种潜在健康风险。

下面结合基于IGFBP4-H95P，R147A，R149A的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

术语说明

℃＝摄氏度；min＝分钟；sec＝秒；M＝摩尔；mM＝毫摩尔；mL＝毫升；μL＝微升；μg＝微克。

野生型人IGFBP4

人的野生型IGFBP4氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：

编码野生型IGFBP4的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

突变型人IGFBP4

人的突变型IGFBP4氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示(用下划线标记了突变位点P，A，A)：

编码突变型IGFBP4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：

实施例1、IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质的制备

1、构建表达IGFBP4-H95P，R147A，R149A突变体的重组载体

常规方法抽提的人mRNA，经反转录获得cDNA。以所述cDNA作为模板，用对应于IGFBP-4基因(SEQ ID NO：1)ORF框两侧的引物对1，通过反转录获得cDNA序列，使用DNA聚合酶，执行PCR扩增：获得人IGFBP-4扩增产物。经1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物长度与预测值一致。

将所获得人IGFBP-4的编码核苷酸序列克隆至pcDNA3.1V5-6HIS载体(购自Agilent Technologies Genomics公司)，获得重组载体pcDNA3.1V5-6HIS/IGFBP4。该重组载体可用于与本实施例中以下相同的流程转染HEK293细胞，以表达野生型IGFBP-4蛋白。

根据IGFBP4基因预突变的位置(即对应IGFBP4蛋白质的第95位组氨酸欲突变为脯氨酸，第147和149位精氨酸欲突变为丙氨酸的位置设计分别设计引物对2，3，4，利用QuikChange Lightning多点位点定点诱变试剂盒(购自Agilent Technologies Genomics公司)，根据所述试剂盒中所提供的说明书对上述重组载体进行直接的定点诱变。

简言之，使用所设计的引物对2、3、4，以上述重组载体pcDNA3.1V5-6HIS/IGFBP4为模板，使用Pfu DNA聚合酶(上述试剂盒之成分)，进行PCR扩增：98℃5min(热启动)—98℃30s(18循环)—65℃1min(退火)—74℃16min(延伸)获得含有突变的IGFBP-4基因、表达IGFBP4-H95P、R147A，R149A突变体(SEQ ID NO：3)的重组载体pcDNA3.1V5-6HIS/IGFBP4-H95P，R147A，R149A。经Sam I限制性酶切图谱和DNA测序检测，重组载体pcDNA3.1V5-6HIS/IGFBP4和pcDNA3.1V5-6HIS/IGFBP4-H95P，R147A，R149A分别含有编码野生型IGFBP4和突变IGFBP4-H95P，R147A，R149A的核苷酸序列。

引物对1：

CTCGGATCCACTATGCTGCCCCTCTGCCTCGTGGCC(SEQ ID NO：5)

GCAGAATTCCACCTCTCGAAAGCTGTCAGCCAGCTGGTGGCAG(SEQ ID NO：6)

引物对2：

CTGCACACACTGATGCCCGGGCAAGGCGTGTGC(SEQ ID NO：7)

GCACACGCCTTGCCCGGGCATCAGTGTGTGCAG(SEQ ID NO：8)

引物对3：

CCGGGAGGATGCCGCGCCTGTGCCCCAGGGC(SEQ ID NO：9)

GCCCTGGGGCACAGGCGCGGCATCCTCCCGG(SEQ ID NO：10)

引物对4：

GATGCCCGGCCTGCGCCCCAGGGCTCC(SEQ ID NO：11)

GGAGCCCTGGGGCGCAGGCCGGGCATC(SEQ ID NO：12)

2、转染

采用FreeStyleTM 293表达培养基(购自Agilent Technologies Genomics公司上海)体外培养HEK293细胞。在细胞密度为1.7～2.0×10⁶个/mL，活力大于95％的条件下用常规的PEI转染法将前述所构建的编码突变IGFBP4-H95P，R147A，R149A的重组载体pcDNA3.1V5-6HIS/IGFBP4-H95P，R147A，R149A转染该HEK293细胞。转染后24～48h添加TN1；继续培养6天，获得了多株生长的HEK293细胞株，即为转化子。

3、IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质的纯化和检测

转染后第6天收获细胞培养液，2000g/min离心40分钟，弃去沉淀物。利用His和镍金属相结合的方法，使用镍柱提取并纯化IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白。

具体而言，将收获的上清用0.45μm的滤膜过滤。用1M Tris缓冲液调整样品pH至8.0，调整NaCl浓度至500mM，上样镍离子亲和层析柱(GE)，用AKTA步级洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，2ml/管；取样，进行SDS-PAGE和Western blot检测。

根据检测结果，合并高浓度高纯度洗脱收集峰，通过透析或者脱盐柱交换缓冲液到PBS。测试蛋白浓度，将蛋白分装冻存。从图2A和图2B可见，已经成功地表达并纯化了IGFBP4-H95P蛋白质。

实施例2、IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质不结合IGF I或IGF II(即IGFs)

如实施例1获得野生IGFBP4蛋白和突变的IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白，与含有β-巯基乙醇的SDS-PAGE(100mM Tris、pH 6.8、10％SDS、0.01％酚蓝)上样缓冲液混合，通过10％SDS-PAGE凝胶分离。将凝胶蛋白转移至硝酸纤维素膜，进行常规的125I-IGF-I和125I-IGF-II(购自Amersham PharmaciaBiotech，Freibury，Germany)Western配体印迹(¹²⁵I-IGF-I和¹²⁵I-IGF-II Western ligand blotting分析)。所使用的天然IGFBP4蛋白和突变的IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白用量为各105ng；所使用的¹²⁵I-IGF-I和¹²⁵I-IGF-II用量为250μCi/μg蛋白质。分析结果示于图3。图3中，通过对所分析的蛋白条带进行γ计数来定量蛋白质的IGF结合活性，且计数结果中已减去硝酸纤维素膜的背景放射活性。图中所示数值为三次实验的平均值。图3中可见，与天然IGFBP4相比，突变的IGFBP4蛋白失去了结合IGFs的能力。

实施例3、IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质不结合IGF II

已知IGF II刺激人骨肉瘤细胞MG63中的DNA合成，且该刺激可被IGFs的结合蛋白IGFBP4中和。

体外培养人骨肉瘤MG63细胞(购自美国典型细胞培养中心(AmericanTypeCulture Collection)；Rockville，MD；CRL 1427)至细胞基本汇合，更换新鲜的DMEM培养基(添加有0.1％小牛血清)继续培养20h后，以不同浓度添加如实施例1获得的天然IGFBP4和IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质分别至相同体积的培养相同数量细胞的培养基。以相同浓度的BSA作为对照。在正常的细胞培养条件下，孵育48h。收集培养细胞，使用CytQUANT细胞增殖试剂盒(购自Life Technologies，北京)，根据说明书的指示将所收集的细胞与裂解缓冲液和染液混合，三次冻融，之后在激发波长480nm和最大发射波长520nm下，利用荧光分析仪检测核酸含量。结果显示于图4。

可见，随着IGFBP4浓度的不断增加，IGF II促进核酸合成以及由此引起的促进细胞增殖的作用被不断中和，当添加的IGFBP4浓度为50ng/mL时，IGF II被显著地中和。这表明IGF II被逐渐增加浓度的IGFBP4结合，以至于无法发挥其原有的核酸合成促进作用。而H95P，R147A，R149A突变体由于失去了结合IGFs的能力，IGF II的所述促进核酸合成的作用并没有被加入的H95P，R147A，R149A蛋白质所削弱，使其浓度达到300ng/mL。

实施例4、糖尿病动物模型的制备

选用8周的雄性C57BL/6小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，测量随机血糖和体重，按照随机化原则，对小鼠进行分组，并对小鼠禁食12h，但不禁水。

冰浴下，将2g链脲佐菌素(STZ)粉末用100ml，pH4.5 0.05M柠檬酸缓冲液进行溶解，配制2％的链脲佐菌素(STZ)-柠檬酸溶液。按小鼠体重，以剂量为160mg/kg，对小鼠进行腹腔注射2％STZ-柠檬酸溶液，对照组的小鼠一次性腹腔注射相应体积的柠檬酸缓冲液，注射完成2小时后，恢复供食。监测血糖，确定模型制备成功。

实施例5、糖尿病动物下肢缺血模型的制备

随机选择如实施例4所建立的糖尿病小鼠模型，行左侧股动脉结扎和切除术，建立小鼠下肢缺血模型。如图5A-B中术后第1天的下肢血流灌注情况所表明，小鼠下肢缺血模型成功建立。

实施例6、IGFBP4-H95P，R147A，R149A对动物下肢缺血的治疗

随机选择如实施例3所建立的糖尿病下肢缺血模型小鼠10只，随机分为实验组和对照组，每组5只。在模型建立成功的当天，即在结扎和切除术后即刻(第1天)，一次性地将重组IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白(10μg/25g)和相当剂量的安慰剂(PBS)分别多点注射到实验组和对照组小鼠的下肢缺血部位。分别于术前、术后即刻，和术后第4和6天以激光多普勒超声扫描仪监测实验组和对照组小鼠的下肢血流灌注情况。激光多普勒影像显示缺血部分为蓝色，而有血流部分为红色。治疗效果的观察与评价：结果显示于图5A-B。

具体而言，图(A-B显示与对照组(标记为PBS)相比，实验组(标记为IGFBP4-H95P，R147A，R149A)小鼠在下肢缺血术后应用IGFBP4-H95P，R147A，R149A后，即开始显示改善的下肢血流情况；至第6天时，改善显著。相比IGFBP4野生型蛋白注射实验组，IGFBP4-H95P，R147A，R149A注射后的供血重建也显著优于野生型注射组。所述灌注率结果基于统计学分析；其中*表示p<0.5，具有显著性差异。该结果表明，一次性注射重组IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白的实验组小鼠的下肢缺血部位的血液系统重建和血流恢复得以加强。

图5B显示对照组和实验组的糖尿病下肢缺血模型小鼠分别在术后应用PBS或IGFBP4-H95P，R147A，R149A后的第4天和第6天，下肢组织的H&E染色结果。所述组织采于小鼠大腿靠近股动脉结扎以下部位。可见，与对照组相比，IGFBP4-H95P，R147A，R149A使得缺血部位具有明显更少的细胞死亡和组织损伤。由此，下肢缺血症状得到明显改善。

实施例7、糖尿病动物心肌缺血模型的制备

选用8周的C57BL/6雄性小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，制备心肌缺血模型。

小鼠腹腔注射阿托品(0.04mg/kg)，5min后腹腔麻醉(戊巴比妥钠，60mg/kg)，观测小鼠的呼吸频率(90次/min以上)及动度，接呼吸机(潮气量1ml，频率90-105次/min)，小鼠呼吸频率与呼吸机节律相同，无呼吸抵抗，可以开胸。

在胸骨左缘2-3mm，第2、3、4肋间处做一纵切口，结扎肋间动脉，分离胸腺、心包，暴露心脏，冠状动脉前降支从左心耳前端和肺动脉圆锥间下行，在左心耳下缘打活结结扎该冠脉，从心电图判断其缺血情况。30min后，解开活结，恢复冠脉血流；再灌注15min，观测小鼠心律平稳后，开始关胸。由于小鼠胸壁较薄，不宜单层缝合，将肋间肌和胸肌分别缝合，针距在1.5mm左右。

缝合完毕后，用注射针抽取胸腔内残余气体，减小气量，小鼠出现轻微的自主呼吸，此时可以撤下呼吸机，小鼠恢复自主呼吸。若不能及时恢复，用左手轻按小鼠胸骨助其呼吸。小鼠自主呼吸频率在90次/分钟以上，观察20min，待其呼吸动度和频率没有减弱时，缝合皮肤，腹腔注射0.5ml温生理盐水，将其放置在25℃的环境中。

如图6A的术后PBS实验组结果显示，小鼠心肌缺血模型成功建立。

实施例8、IGFBP4-H95P，R147A，R149A对动物心肌缺血症状的改善

随机选择如前所建立的心肌缺血模型小鼠4只，其中实验组和对照组每组各2只。分别在术后(即模型构建成功后)的第4和6天进行组织染色，第4周进行左心室射血分数(EF％)和左室短轴缩短率(FS％)测定。

治疗效果的观察与评价：结果显示于图6B。具体而言，图6B显示了心梗手术后第4周的左心室射血分数(EF％)，图6B显示了心梗手术后第4周的左室短轴缩短率(FS％)。从图6B可见，与对照组小鼠和注射IGFBP4-H95P的小鼠相比，注射重组IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质的实验组小鼠在术后第四周开始左心室射血分数和左室短轴缩短率呈现非常显著的升高。

图6A显示了心梗手术后第4天和第6天，利用Masson氏染色方法对实验组小鼠和对照小鼠的心脏的中间部分的切片检测结果，其中肌纤维纤维为红色染色，胶原纤维显示为蓝色染色，其中，染成蓝紫色的区域为受损心肌组织。结果表明IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质对心肌缺血的心脏具有明显的保护作用，其可用于防治心脏心肌缺血。

根据上述可见，本发明IGFBP4-H95P，R147A，R149A蛋白质在缺血症状的防治效果方面显著地优于野生型IGFBP4。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 朱伟东

<120> 胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体及其制药用途

<130> 176809

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 258

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Leu Pro Leu Cys Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Gly Pro

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Leu Gly Asp Glu Ala Ile His Cys Pro Pro Cys Ser Glu

            20                  25                  30

Glu Lys Leu Ala Arg Cys Arg Pro Pro Val Gly Cys Glu Glu Leu Val

        35                  40                  45

Arg Glu Pro Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Leu Gly Leu Gly

    50                  55                  60

Met Pro Cys Gly Val Tyr Thr Pro Arg Cys Gly Ser Gly Leu Arg Cys

65                  70                  75                  80

Tyr Pro Pro Arg Gly Val Glu Lys Pro Leu His Thr Leu Met His Gly

                85                  90                  95

Gln Gly Val Cys Met Glu Leu Ala Glu Ile Glu Ala Ile Gln Glu Ser

            100                 105                 110

Leu Gln Pro Ser Asp Lys Asp Glu Gly Asp His Pro Asn Asn Ser Phe

        115                 120                 125

Ser Pro Cys Ser Ala His Asp Arg Arg Cys Leu Gln Lys His Phe Ala

    130                 135                 140

Lys Ile Arg Asp Arg Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met Lys Val Asn Gly

145                 150                 155                 160

Ala Pro Arg Glu Asp Ala Arg Pro Val Pro Gln Gly Ser Cys Gln Ser

                165                 170                 175

Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gln Ser Arg Thr

            180                 185                 190

His Glu Asp Leu Tyr Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys Asp Arg Asn Gly

        195                 200                 205

Asn Phe His Pro Lys Gln Cys His Pro Ala Leu Asp Gly Gln Arg Gly

    210                 215                 220

Lys Cys Trp Cys Val Asp Arg Lys Thr Gly Val Lys Leu Pro Gly Gly

225                 230                 235                 240

Leu Glu Pro Lys Gly Glu Leu Asp Cys His Gln Leu Ala Asp Ser Phe

                245                 250                 255

Arg Glu

<210> 2

<211> 777

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atgctgcccc tctgcctcgt ggccgccctg ctgctggccg ccgggcccgg gccgagcctg 60

ggcgacgaag ccatccactg cccgccctgc tccgaggaga agctggcgcg ctgccgcccc 120

cccgtgggct gcgaggagct ggtgcgagag ccgggctgcg gctgttgcgc cacttgcgcc 180

ctgggcttgg ggatgccctg cggggtgtac accccccgtt gcggctcggg cctgcgctgc 240

tacccgcccc gaggggtgga gaagcccctg cacacactga tgcacgggca aggcgtgtgc 300

atggagctgg cggagatcga ggccatccag gaaagcctgc agccctctga caaggacgag 360

ggtgaccacc ccaacaacag cttcagcccc tgtagcgccc atgaccgcag gtgcctgcag 420

aagcacttcg ccaaaattcg agaccggagc accagtgggg gcaagatgaa ggtcaatggg 480

gcgccccggg aggatgcccg gcctgtgccc cagggctcct gccagagcga gctgcaccgg 540

gcgctggagc ggctggccgc ttcacagagc cgcacccacg aggacctcta catcatcccc 600

atccccaact gcgaccgcaa cggcaacttc caccccaagc agtgtcaccc agctctggat 660

gggcagcgtg gcaagtgctg gtgtgtggac cggaagacgg gggtgaagct tccggggggc 720

ctggagccaa agggggagct ggactgccac cagctggctg acagctttcg agagtga 777

<210> 3

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(258)

<400> 3

Met Leu Pro Leu Cys Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Gly Pro

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Leu Gly Asp Glu Ala Ile His Cys Pro Pro Cys Ser Glu

            20                  25                  30

Glu Lys Leu Ala Arg Cys Arg Pro Pro Val Gly Cys Glu Glu Leu Val

        35                  40                  45

Arg Glu Pro Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Leu Gly Leu Gly

    50                  55                  60

Met Pro Cys Gly Val Tyr Thr Pro Arg Cys Gly Ser Gly Leu Arg Cys

65                  70                  75                  80

Tyr Pro Pro Arg Gly Val Glu Lys Pro Leu His Thr Leu Met Pro Gly

                85                  90                  95

Gln Gly Val Cys Met Glu Leu Ala Glu Ile Glu Ala Ile Gln Glu Ser

            100                 105                 110

Leu Gln Pro Ser Asp Lys Asp Glu Gly Asp His Pro Asn Asn Ser Phe

        115                 120                 125

Ser Pro Cys Ser Ala His Asp Arg Arg Cys Leu Gln Lys His Phe Ala

    130                 135                 140

Lys Ile Ala Asp Ala Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met Lys Val Asn Gly

145                 150                 155                 160

Ala Pro Arg Glu Asp Ala Arg Pro Val Pro Gln Gly Ser Cys Gln Ser

                165                 170                 175

Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gln Ser Arg Thr

            180                 185                 190

His Glu Asp Leu Tyr Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys Asp Arg Asn Gly

        195                 200                 205

Asn Phe His Pro Lys Gln Cys His Pro Ala Leu Asp Gly Gln Arg Gly

    210                 215                 220

Lys Cys Trp Cys Val Asp Arg Lys Thr Gly Val Lys Leu Pro Gly Gly

225                 230                 235                 240

Leu Glu Pro Lys Gly Glu Leu Asp Cys His Gln Leu Ala Asp Ser Phe

                245                 250                 255

Arg Glu

<210> 4

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> mutation

<222> (1)..(777)

<400> 4

atgctgcccc tctgcctcgt ggccgccctg ctgctggccg ccgggcccgg gccgagcctg 60

ggcgacgaag ccatccactg cccgccctgc tccgaggaga agctggcgcg ctgccgcccc 120

cccgtgggct gcgaggagct ggtgcgagag ccgggctgcg gctgttgcgc cacttgcgcc 180

ctgggcttgg ggatgccctg cggggtgtac accccccgtt gcggctcggg cctgcgctgc 240

tacccgcccc gaggggtgga gaagcccctg cccacactga tgcacgggca aggcgtgtgc 300

atggagctgg cggagatcga ggccatccag gaaagcctgc agccctctga caaggacgag 360

ggtgaccacc ccaacaacag cttcagcccc tgtagcgccc atgaccgcag gtgcctgcag 420

aagcacttcg ccaaaattgc cgacgccagc accagtgggg gcaagatgaa ggtcaatggg 480

gcgccccggg aggatgcccg gcctgtgccc cagggctcct gccagagcga gctgcaccgg 540

gcgctggagc ggctggccgc ttcacagagc cgcacccacg aggacctcta catcatcccc 600

atccccaact gcgaccgcaa cggcaacttc caccccaagc agtgtcaccc agctctggat 660

gggcagcgtg gcaagtgctg gtgtgtggac cggaagacgg gggtgaagct tccggggggc 720

ctggagccaa agggggagct ggactgccac cagctggctg acagctttcg agagtga 777

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ctcggatcca ctatgctgcc cctctgcctc gtggcc 36

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

gcagaattcc acctctcgaa agctgtcagc cagctggtgg cag 43

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

ctgcacacac tgatgcccgg gcaaggcgtg tgc 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

gcacacgcct tgcccgggca tcagtgtgtg cag 33

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

ccgggaggat gccgcgcctg tgccccaggg c 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

gccctggggc acaggcgcgg catcctcccg g 31

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

gatgcccggc ctgcgcccca gggctcc 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

ggagccctgg ggcgcaggcc gggcatc 27

Claims (12)

1.胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型的胰岛素样生长因子结合蛋白4，第95 位突变为脯氨酸，第147位突变为丙氨酸，第149位突变为丙氨酸；其氨基酸序列如SEQ ID NO：3 所示。

2.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的突变体。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体，或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5. 一种生产权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体的方法，其特征在于，包括步骤：

(1) 培养权利要求4所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2) 从培养物中分离权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体。

6.权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体的用途，用于制备预防或治疗缺血性疾病的组合物。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的缺血性疾病为糖尿病性缺血性疾病。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的糖尿病性缺血性疾病包括：糖尿病下肢缺血疾病，糖尿病心肌缺血疾病。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的糖尿病性缺血性疾病包括：急性缺血性疾病，早期缺血性疾病。

10. 一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括：

(a) 权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体；或权利要求4所述的宿主细胞；以及

(b) 药学上可接受的载体。

11. 一种药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：

权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白4突变体；或

权利要求4所述的宿主细胞；或

权利要求10所述的组合物。

12. 一种非治疗性地消除胰岛素样生长因子结合蛋白4的结合胰岛素样生长因子的能力的方法，其特征在于，所述方法包括：将胰岛素样生长因子结合蛋白4的第95 位突变为脯氨酸，第147位突变为丙氨酸，第149位突变为丙氨酸；突变后的胰岛素样生长因子结合蛋白4的氨基酸序列如SEQ ID NO：3 所示。

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