KR101733160B1 - Dkk3을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DKK3(Dickkopf 3) 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 해면체 내피세포의 재생을 유도하여 음경 발기력을 증가시키는 등 우수한 발기부전 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

DKK3을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating erectile dysfunction comprising DKK3}

본 발명은 DKK3(Dickkopf 3) 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

발기부전은 남성 성기능 장애의 일종으로서, 남성의 성기가 발기되지 않거나 발기 상태가 지속되지 않아 성행위를 할 수 없는 현상이다. 발기부전의 원인은 크게 심인성 원인과 기질성 원인으로 구별된다. 심인성 발기부전은 심리적, 정신적 영향에 의한 교감신경의 과다한 작용으로 인한 노르아드레날린(noradrenaline)의 과도한 분비, 음경해면체 평활근 긴장도 증가, 신경 전달물질의 분비 억제 등에 기인한다. 한편, 기질성 발기 부전은 그 원인에 따라, 신경인성, 혈관성, 및 내분비성 발기부전으로 분류된다. 상기 혈관성 발기부전은 고지질혈증, 당뇨, 고혈압, 흡연, 전신 심혈관질환 등으로 인해서 음경 해면체 및 혈관내피세포가 손상되어 이 내피세포에서 일산화질소(nitric oxide: NO) 등의 이완성 물질의 분비가 원활하지 않아 생기는 장애이다.

최근 발기부전에 관한 연구는 기질성 원인에 더 비중을 두고 있고, 그의 치료로서 주로 비아그라(viagra, 성분명: 실데나필)를 포함한 경구용 PDE-5(phosphodiesterase-5) 저해제가 전 세계적으로 사용되고 있다. 상기 경구용 약물은 음경해면체에 특이적으로 분포하는 PDE-5의 저해에 의한 cGMP의 농도를 증가시킴으로써 음경해면체 내 혈류를 증대시켜 발기를 유도하여 발기부전의 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 비아그라와 같은 PDE-5 저해제 계열의 약물들은 두통, 안면홍조, 소화불량, 및 심장마비 등 여러 가지 부작용이 있다고 보고되고 있을 뿐만 아니라, 분자적 수준에서 일시적인 단백질 발현 및 관련 인자들을 조절하는 것으로 근본적인 치료라 할 수 없다. 더욱이 당뇨에 의한 발기부전은 이와 같은 치료 효과가 잘 나타나지 않을 뿐만 아니라, 설령 효과가 있다 해도 그 효능이 장기간 지속되지 못한다는 단점이 있다.

따라서 발기부전 음경 내의 비정상화된 해면체 구조를 근본적으로 치료하고, 그 효능도 장시간 지속되는 발기부전 치료제의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.

한편, Dickkopf(DKK)는 4가지 isotype (DKK 1-4)을 갖는 단백질이다. 이들 중 DKK 1, 2는 활발한 연구가 진행되어 LRP 5/6와 결합하여 Wnt 신호전달에 영향을 미친다는 보고가 있다 (B Mao et al., Nature 417(6889), pp664-667, 2002). 그러나 DKK3의 기능과 역할에 대해서는 아직 연구가 많이 진행되지 않았고, 일부 연구에서 DKK3이 암 조직의 혈관내피세포에서 발현이 되고 모세혈관의 구성에 영향을 미치는 것으로 보고가 되었다 (G Untergasser et al., Int J Cancer 122(7), pp1539-1547, 2008). 그러나 DKK3과 음경발기의 관계 및, DKK3의 발기부전 예방 또는 치료 효과에 대해서는 알려진 바 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다.

이에 본 발명자들은 새로운 발기부전 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, 스트렙토조토신(STZ: streptozotocin)으로 유도된 1형 당뇨 마우스 및 당뇨 환자의 음경 발기조직에서 DKK3의 발현이 감소하였고, 1형 당뇨 발기부전 동물모델에서 DKK3 펩타이드, 플라스미드 또는 아데노바이러스가 음경해면체 내피세포의 재생을 유도하여 음경 발기력을 증가시킴으로써, 발기력 개선 효과를 보임을 확인하였으며, 또한 음경해면체 조직에서 일차 분리한 음경해면체 내피세포(MCECs: Mouse Cavernous Endothelial Cells)에서 DKK3이 튜브형성 및 세포이동을 촉진함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 DKK3을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 해면체 내피세포의 재생을 유도하여 음경 발기력을 증가시키는 등 우수한 발기부전 치료 효과를 가지고 있는바, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 발기부전 마우스 모델의 음경해면체 조직에서 DKK3 발현 정도를 면역형광염색(A) 및 RT-PCR(B)을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 발기부전 환자의 음경해면체 조직에서 DKK3 발현 정도를 면역형광염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 DKK3 펩타이드 투여에 의한 생체 내 혈관신생 촉진 효과를 Matrigel 어쎄이를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 DKK3 펩타이드가 마우스 음경해면체 내피세포의 튜브형성 촉진에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다(A: 현미경 사진, B: 형성된 튜브의 수).
도 5는 DKK3 펩타이드가 마우스 음경해면체 내피세포의 이동에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다(A: 현미경 사진, B: 이동 세포의 수).
도 6은 DKK3 펩타이드가 마우스 음경해면체 내피세포에서 bFGF 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 DKK3 펩타이드가 마우스 음경해면체 내피세포에서 VEGF 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다(A:RT-PCR B:웨스턴 블랏).
도 8은 DKK3 펩타이드가 마우스 음경해면체 내피세포에서 angiopoietin 1 및 angiopoietin 2 유전자의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(A:angiopoietin 1 B:angiopoietin 2).
도 9는 DKK3 펩타이드가 마우스 음경해면체 내피세포에서 혈관 내피세포 이음새 단백질(ZO-1, Claudin-5, Occludin)의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다(A:RT-PCR B:웨스턴 블랏).
도 10은 발기부전 마우스 모델에서 음경 내 DKK3 펩타이드 국소 주사 후, 음경해면체신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압(발기력) 측정 결과를 나타낸 도이다(A:음경해면체 내압 측정 결과, B: 최고 음경해면체 내압, C: 음경해면체 내압 곡선의 면적).
도 11은 발기부전 마우스 모델에서 전기천공법(electroporation)을 이용한 음경 내 DKK3 플라스미드 DNA 국소 주사 후, 음경신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압(발기력) 측정 결과를 나타낸 도이다(A: 음경해면체 내압 측정 결과, B: 최고 음경해면체 내압, C: 음경해면체 내압 곡선의 면적).
도 12는 발기부전 마우스 모델에서 음경 내 DKK3 아데노바이러스 국소 주사 후, 음경신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압(발기력) 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 발기부전 마우스 모델의 음경해면체 조직에서 DKK3 아데노바이러스 투여에 의한 혈관내피세포 특이적인 단백질인 혈소판-내피세포 부착 분자-1(PECAM-1: Platelet/Endothelial Cell Adhesion Molucule-1)의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다(A: 면역형광염색 결과, B: 음경 내 PECAM-1 발현양).
도 14는 발기부전 마우스 모델의 음경해면체 조직에서 DKK3 아데노바이러스 투여에 의한 혈관 내피세포 이음새 단백질인 ZO-1(Zonular Occudens-1)의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다(A: 면역형광염색 결과, B: 음경 내 ZO-1 발현양).
도 15는 발기부전 마우스 모델의 음경해면체 조직에서 DKK3 아데노바이러스 투여에 의한 혈관 내피세포 이음새 단백질인 claudin-5의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다(A: 면역형광염색 결과, B: 음경 내 claudin 발현양).

본 발명은 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물, 의약외품 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

본 발명에서 용어, "발기부전"은 성생활에 충분한 발기가 되지 않거나 유지되지 않은 상태를 의미하며, 일반적으로 이러한 상태가 3개월 이상 지속되었을 경우 발기부전으로 정의한다. 발기부전은 음경 해면체 내피세포 및 평활근세포의 기능 저하 또는 손상에 의하여 야기될 수 있다. 이러한 음경 해면체 내피세포 및 평활근세포의 기능 저하 또는 손상은 고지질혈증(고콜레스테롤증 발기부전 포함), 당뇨병, 고혈압, 음경신경손상 및 이들의 조합으로부터 선택된 것으로부터 야기될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "해면체"는 포유류의 음경이나 음핵의 주체를 이루는 발기조직으로, 주위가 탄성섬유를 함유하는 두껍고 튼튼한 결합조직의 막으로 쌓여있으며, 이 막이 내부로 들어가 있어 해면상의 작은 방을 이루고 있다. 남성의 음경 내부에는 좌우에 2개의 음경 해면체와 그 아래쪽에 1개의 요도 해면체가 있고, 여성에게는 음경 해면체와 비슷한 구조를 가진 음핵 해면체와 요도 해면체가 있다. 해면체에 정맥혈이 가득차게 되면 음경이 발기하게 된다. 음경 해면체 평활근과 음경 혈관은 평상시 아드레날린성 교감 신경에 의해 수축 상태에 있으며, 이완에 의한 발기 반응 후, 아드레날린성 교감 신경계의 자극에 의해 다시 수축 상태로 되돌아온다. 이렇듯 발기조직은 평상시 수축 상태를 유지하지만, 성적 각성 시 뇌 중추에서 보내는 신호와 신경계의 자극, 체 내 및 발기조직 내의 여러 신경 전달 물질 및 호르몬 등에 의해 발기조직이 이완되고, 발기가 시작되며, 발기가 유지된다. 이러한 발기반응이 끝난 후, 다시 발기조직은 수축 상태를 유지하게 된다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 이용하여 발기부전 증상을 차단하거나, 발기부전 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명의 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 이용하여 발기부전 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 유효성분인 “DKK3(Dickkopf 3) 단백질”에는 인간, 마우스 등 다양한 포유동물 유래의 DKK3 단백질이 모두 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 DKK3 단백질은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 1의 22 내지 350 번째 아미노산 또는 서열번호 2의 23 내지 350번째 아미노산으로 이루어질 수 있다.

또한, 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기서열로 암호화될 수 있고, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명의 DKK3 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 DKK3 단백질의 변이체란 DKK3 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 DKK3 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명의 DKK3 단백질은 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 암호화될 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것이다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터 또는 아데노바이러스에 포함된 형태일 수 있으며, 바람직하게 DKK3은 플라스미드 DNA 형태로 본 발명의 조성물에 포함된다. 본 발명의 플라스미드 벡터는 abm #PV172185 일 수 있고, 아데노바이러스 포함 형태는 abm #190468일 수 있다.

본 발명에 따른 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 해면체 내피세포의 재생을 유도하여 음경 발기력을 증가시키는 등 발기부전의 예방, 개선 및 치료 효과가 우수하므로, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용한 의약품, 의약외품 또는 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 발기부전의 예방 또는 치료를 목적으로 약학적 조성물로 제형화 될 경우, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 약학적 조성물로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며 본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러나 경구 투여 시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 DKK3 유전자 또는 단백질과 함께 발기부전의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 발기부전의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 발기부전의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다.

본 발명의 조성물을 외약외품 조성물로 사용할 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 발기부전의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 건강기능식품으로 제형화될 수 있다.

본 발명에서 용어, '건강기능식품'이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 당뇨 마우스 및 당뇨 환자의 음경해면체 조직에서 DKK3 단백질 및 유전자의 발현 분석

생후 2개월 된 수컷 마우스(C57BL/6)의 복강에 스트렙토조토신(streptozotocin)을 투여(50 mg/kg 용량으로 5일간 투여)하여 당뇨를 유도하였다. 당뇨 유도 8주 후, 마우스의 음경 조직을 채취하여 4% 파라포름알데히드에 고정하고 동결 절편 후 DKK3 항체를 이용해서 면역형광염색을 진행하였다. 또한, 동일한 마우스의 음경 조직에서 DNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 DKK3 유전자 발현을 확인하였다. 대조군으로는 동일 주령의 정상 마우스를 이용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, 음경 조직에서의 DKK3 발현은 당뇨 마우스의 경우 정상 마우스에 비해 현저하게 감소됨을 확인하였다. 또한, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 당뇨 마우스의 음경 조직에서 정상 마우스에 비해 DKK3 유전자 발현이 현저하게 감소되었다.

또한, 정상 발기력을 가진 사람과 당뇨성 발기부전 환자의 음경 조직을 채취한 후, 이를 동결 절편 후 DKK3 및 vWF(von willebrand factor, 혈관내피세포 마커) 항체를 이용해서 면역형광염색을 진행하였다. 보다 구체적으로 음경 조직을 채취하여 4% 파라포름알데히드가 담긴 튜브에 넣고 4℃에서 하룻밤 고정하였다. 이후 음경 조직을 PBS로 3회 세척하고 동결 절편기를 이용하여 7㎛의 두께로 절편하였다. 절편한 음경 조직을 PBS로 5분간 3회 세척 후 BSA가 포함된 antibody dilution regent (Invitrogen, Eugene, OR, USA)를 이용하여 1시간 동안 블락킹하고, 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 다음날 PBST로 5분간 3회 세척하고 형광 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 PBST로 5분간 3회 세척하고 soluble mount solution으로 고정하였다. 이후 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 나타낸 바와 같이, 당뇨성 발기부전 환자의 음경 발기조직에서 정상인에 비해 DKK3 및 vWF 발현이 현저하게 감소됨을 확인하였다.

실시예 2. DKK3 펩타이드의 생체 내 또는 생체 외 혈관 형성 효과 분석

2-1. 생체 내 Matrigel plug 실험

4℃에서 액체화시킨 matrigel에 DKK3 펩타이드(100 ng/400 μL)를 처리한 후, 주사기를 이용해 마우스의 복부 피하에 400 μL를 신속하게 주사하였다. 5일 후 마우스를 안락사시킨 후 복부 피하에 있는 고체화 된 matrigel을 취하여 혈관생성 정도를 평가하였다. 양성대조군으로 공지된 혈관형성 펩타이드인 VEGF 펩타이드(50 ng/400μL)를 이용하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이 DKK3 펩타이드를 처리한 군에서 양성대조군인 VEGF를 처리한 군과 비슷한 수준으로 혈관 형성을 촉진함을 확인하였다.

2-2. 생체 외 튜브형성 실험

DKK3 펩타이드가 튜브형성(tube formation)에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 마우스 음경해면체 내피세포(MCECs: Mouse Cavernous Endothelial Cells)를 사용하여 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, 96 웰 세포배양 접시에 각 웰 마다 DKK3 펩타이드를 처리한 matrigel을 50μL씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 젤 형태로 고체화시켰다. 각 웰에 M199 medium 200 μL를 넣고, MCECs를 웰당 2×10⁴ 세포의 농도로 분주하여 37℃, 5 % CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 현미경을 통해 관찰하였으며, 형성된 튜브의 개수를 수치화하였다. 이때 양성대조군으로 공지된 튜브형성 촉진 펩타이드인 bFGF 및 VEGF 펩타이드를 동시에 처리하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, DKK3 펩타이드(20 ng/mL)를 처리한 군에서 양성대조군인 bFGF(20 ng/mL)와 VEGF(20 ng/mL)를 동시에 처리한 군과 비슷한 수준으로 튜브 형성을 유도함을 확인하였다.

2-3. 세포이동 실험

MCECs를 60 mm 세포배양 접시에 약 95% 밀집도 만큼 배양한 후, 면도날을 이용해 2 mm 폭으로 상처를 냈다. 이를 혈청이 불포함된 M199 배지로 세척한 후, 혈청(serum) 1%와 티미딘(thymidine) 1 mM, DKK3 펩타이드(20 ng/mL)가 포함된 M199 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 12시간 후 혈청이 불포함된 M199 배지로 세척하고 메탄올로 고정하였다. 이를 Giemsa 용액으로 염색하여 광학현미경을 통해 이동한 세포의 수를 계산하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, DKK3 펩타이드(20 ng/mL)를 처리한 군에서 양성대조군인 bFGF와 VEGF(20 ng/mL)를 동시에 처리한 군과 비슷한 수준으로 마우스 음경해면체 내피세포의 이동 촉진 효과가 나타남을 확인하였다.

이상 실험 결과를 통해 DKK3 펩타이드가 음경해면체 내피세포의 이동에 관여하여 혈관형성을 유도함을 확인하였으며, DKK3이 당뇨에 의한 음경내피세포 손상에 의해 유발되는 발기부전을 치료하는데 효과적으로 작용할 수 있는 가능성이 존재함을 확인하였다.

실시예 3. 음경해면체 조직에서 DKK3 펩타이드에 의한 혈관생성인자 및 이음새 단백질의 발현 분석

MCECs에 DKK3 펩타이드를 24시간 동안 농도별로 처리한 후, 혈관생성인자 및 이음새 단백질의 mRNA 및 단백질 발현이 미치는 영향을 분석하였다.

3-1. 역전사 중합효소연쇄반응

DKK3 펩타이드를 처리한 MCECs로부터 총 RNA를 추출하기 위해서 Trizol reagent(Invitrogen, Eugene, OR, USA)를 사용하였다. Total RNA의 추출 후 cDNA를 합성하기 위해 RT PreMix(BioNEER, Daejeon, South Korea)를 이용하였으며, 다음의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다.

DKK3: 5'- ATG CAG CGG CTC GGG GGT AT -3' (forward), 5'- CTA AAT CTC CTC CTC TCC GC -3' (reverse), VEGF: 5'-CAG GCT GCT GTA ACG ATG AA-3' (forward), 5'-AAA TGC TTT CTC CGC TCT GA-3' (reverse), bFGF: 5'-GGC TTC TTC CTG CGC ATC CA-3' (forward), 5'-GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAGA-3' (reverse), Claudin-5: 5'-GGT CAC TGG GAA CTT CCT GA-3' (forward), 5'-ATG CCA CTC ACT GCC TCT CT-3'(reverse), occludin: 5'-TCA GGC AGC CTC GTT ACA G-3' (forward), 5'-CCT CCT CCA GCT CAT CAC A-3' (reverse), ZO -1: 5'-ATA GCA CGG ACA GTA GAC ACA CTT C-3' (forward), 5'-GTG AGT AAG GAG GGT ATG TCT GGT T-3' (reverse), Ang1: 5'-AAA CAG CAA ATG GGA ACA GG-3' (forward), 5'-GGG CAG GTG AAC TCC ACT AA-3' (reverse), Ang2: 5'-CAA GGC ACT GAG AGA CAC CA-3' (forward), 5'-CTG AAC TCC CAC GGA ACA TT-3' (reverse).

PCR 산물을 수득한 후, 1.0% 아가로스 겔을 이용해 전기영동 하고, mRNA 발현 정도를 분석하였다. 그 결과를 도 6, 도 7A, 도 8 및 도 9A에 나타내었다.

도 6, 도 7A, 도 8 및 도 9A에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 DKK3 펩타이드를 처리한 군에서 혈관생성인자인 bFGF, Ang1, Ang2, ZO-1, claudin-5 및 occludin의 mRNA 발현이 현저하게 증가하였고, VEGF의 mRNA 발현은 감소함을 확인하였다.

3-2. 웨스턴 블랏

DKK3 펩타이드를 처리한 MCECs로부터 단백질을 분리한 후, SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 크기에 따라 분리하고, nitrocellulose membranes(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)에 고정하였다. 5% 탈지분유와 0.05% Tween 20를 포함한 PBS를 이용하여 멤브레인을 블락킹하였으며, 1차 항체(VEGF, SantaCruz Biotechnology; ZO-1, SantaCruz Biotechnology; claudin-5, Zymed Laboratories; occludin, SantaCruz Biotechnology; β-actin, Abcam)와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이를 PBS로 10분간 3회 세척 후 2차 항체와 2시간 동안 반응시킨 후, enhanced chemiluminescence protocol에 따라 X-ray 필름에 노출 하였다. 그 결과를 도 7B 및 9B에 나타내었다.

도 7B 및 9B에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 DKK3 펩타이드를 처리한 군에서 음경해면체 내피세포 이음새 단백질인 ZO-1, claudin-5 및 occludin 단백질의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였으며, VEGF의 단백질 발현은 감소함을 확인하였다.

실시예 4. 발기부전 동물모델에서 DKK3 의 발기부전 치료 효과 검증

4-1. 발기부전 동물모델의 디자인

(1) 실험동물 및 처치

생후 8주 된 수컷 마우스(C57BL/6)의 복강에 스트렙토조토신(STZ, streptozotocin, 50 mg/kg)을 5일 연속 투여하여 1형 당뇨 마우스 모델을 제작하였다. STZ 투여 마지막 날로부터 8주 후 본 실험을 진행하였고, 케타민(100 mg/kg)과 자일라진(5 mg/kg)으로 마취한 후, DKK3 펩타이드(R&D System, Minneapolis, MN, USA), DKK3 플라스미드 DNA(Abm, Richmond, Canada), DKK3 아데노바이러스(Abm)의 발기력 개선효과를 하기와 같이 3개의 독립된 실험으로 나누어 진행하였다.

1) 당뇨모델에서 DKK3 펩타이드의 발기력 개선효과 규명을 위한 실험 디자인

총 4개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다(N = 4 / 군; 1군, 정상 마우스; 2군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + PBS 2회 투여군[days -3 및 0; 20 μL]; 3군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + 마우스 DKK3 펩타이드(서열번호 2) 2회 투여군[days -3 및 0; 5 μg/20 μL]; 4군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + 인간 DKK3 펩타이드(서열번호 1) 2회 투여군[days -3 및 0; 5 μg/20 μL]). PBS 및 DKK3 펩타이드는 3일 간격으로 2회 음경해면체 내에 주사하였고, 마지막 투여 일로부터 1주 째 음경해면체신경 전기자극을 통해 발기력을 측정하였다.

2) 당뇨모델에서 전기천공법(electroporation)을 이용한 DKK3 플라스미드 DNA의 발기력 개선효과 규명을 위한 실험 디자인

총 6개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다(N = 5 / 군; 1군, 정상 마우스; 2군, STZ로 유도한 당뇨 마우스군 + 비치료군; 3군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + 공벡터 투여군[100 μg/ 20 μL]; 4군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + DKK3-마우스 플라스미드 DNA 투여군[10 μg/ 20 μL]; 5군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + DKK3-마우스 플라스미드 DNA (abm #PV172185) 투여군[40 μg/ 20 μL]; 6군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + DKK3-마우스 플라스미드 DNA 투여군[100 μg/ 20 μL]). 각각의 공벡터 또는 플라스미드 DNA를 음경해면체 내에 1회 투여한 직후, 30 V, 40 ms, 8 pulse 강도로 음경에 전기자극(electroporation, ECM 830, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)을 가하였다. 투여 2주 째 음경해면체신경 전기자극을 통해 발기력을 측정하였다.

3) 당뇨모델에서 DKK3 아데노바이러스(Ad-DKK3)의 발기력 개선효과 규명을 위한 실험 디자인

총 6개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다(N = 6 / 군; 1군, 정상 마우스; 2군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + PBS 투여군[20 μL]; 3군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + Ad-GFP 투여군[1x10⁶ vp / 20 μL]; 4군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + Ad-DKK3(abm #190468) -마우스 투여군[1x10⁷ vp / 20 μL]; 5군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + Ad-DKK3-마우스 투여군[1x10⁸ vp / 20 μL]; 6군, STZ로 유도한 당뇨 마우스 + Ad-DKK3-마우스 투여군[1x10⁹ vp / 20 μL]). Ad-GFP 또는 Ad-DKK3-마우스 투여 후 2주 째 음경해면체신경 전기자극을 통해 발기력을 측정하였다.

4-2. 전기 자극에 따른 발기력 측정

상기 실시예 4-1과 같이 발기부전 동물모델의 음경해면체에 DKK3를 투여하고, 발기력 측정을 위하여, 각 마우스의 하복부에서 좌측 표피부분을 개복하고, 전립선의 후외측에 위치한 음경해면체신경(음경신경)이 잘 보이도록 준비하였다. 음경신경의 전기자극을 위해서 백금전극을 음경신경에 위치시킨 후, 5 볼트, 12 헤르츠의 강도로 약 1분 동안 전기자극을 가하였다. 전기자극을 가하게 되면 음경은 발기를 하게 되며, 발기 시 음경 내부의 압력(음경해면체 내압)을 음경해면체에 삽입된 카테터를 통해 컴퓨터와 연결되어 있는 압력 전달기(바이오스팩 시스템, 미국)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 각각 도 10 내지 도 12에 나타내었다.

도 10 내지 도 12 중 A 도면에서의 세로축의 ICP(Intracavernous Pressure: 음경해면체내 압력)는 발기 시 음경내부의 압력(음경해면체 내압)을 의미하며, 일반적으로 발기력을 나타내는 지표이다. 도 10 내지 도 12 중 A에서의 가로축은 전기자극 후의 시간을 나타내며, 1분간의 전기자극 기간은 가로축에 검정색 막대로 표시하였다. 또한, 도 10 내지 도 11 중 B 도면은 최고 음경해면체 내압 (Maximal ICP)을 나타낸 것이고, 도 10 내지 도 11 중 C 도면은 음경해면체 내압 곡선의 면적 (Total ICP[area under the curve])을 나타낸 값이다. 또한, 도 12B는 최고 음경해면체 내압(Maximal ICP)을 평균 수축기 혈압 (MSBP: Mean Systolic Blood Pressure)으로 나눈 값을 나타낸 것이고, 도12C는 음경해면체 내압 곡선의 면적(Total ICP[area under the curve])을 평균 수축기 혈압(MSBP)으로 나눈 값을 나타낸 것이다. 이는 혈압 자체가 음경해면체 내압에 영향을 줄 수 있기 때문에 이의 영향을 보정하기 위한 것이다.

먼저, 도 10에 나타낸 바와 같이, 마우스 DKK3 펩타이드를 투여한 군과 인간 DKK3 펩타이드를 투여한 군은 PBS 투여군(PBS)에 비해 높은 발기력 개선효과를 보였으며, 정상 대조군(Control)의 약 60-70% 정도까지 발기력이 회복됨을 확인하였다. 특히, 음경발기와 관련한 두 가지 변수, 즉 최고 음경해면체 내압과 음경압력곡선의 면적이 DKK3 펩타이드 투여 후 유의한 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, DKK3 플라스미드 DNA를 투여한 군(pDKK3 10 μg, pDKK3 40 μg, pDKK3 100 μg)은 비치료군 및 공벡터 투여군에 비해 높은 발기력 개선효과를 보였으며, 정상 대조군(Control)의 약 70% 정도까지 발기력이 회복됨을 확인하였다. 특히, 음경발기와 관련한 두 가지 변수, 즉 최고 음경해면체 내압과 음경압력곡선의 면적이 DKK3 플라스미드 DNA 투여 후 현저한 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 도 12에 나타낸 바와 같이, DKK3 아데노바이러스를 투여한 군(Ad-DKK3 1x10⁷ vp / 20 μL, 1x10⁸ vp / 20 μL, 1x10⁹ vp / 20 μL)은 PBS 투여군 및 Ad-GFP투여군에 비해 높은 발기력 개선효과를 보였으며, 정상 대조군(Control)의 약 90% 정도까지 발기력이 회복됨을 확인하였다. 특히, 음경발기와 관련한 두 가지 변수, 즉 최고 음경해면체 내압과 음경압력곡선의 면적이 DKK3 아데노바이러스 투여 후 현저한 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

4-3. 음경해면체 조직에서 혈관내피세포 특이적 단백질의 발현 분석

음경은 음경발기의 기능을 담당하는 해면체 조직과 이에 영양을 공급하는 소혈관들로 이루어져있다. 그러나 당뇨, 고지질증, 신경손상 등에 의한 병적조건하에서는 이러한 혈관을 포함한 해면체 조직에 병변이 생기고 상기 조직의 구조가 비정상적으로 되어 발기부전을 초래한다.

상기 실시예 4-1의 3) 번 발기부전 동물모델의 음경해면체 조직에서 혈관내피세포에 특이적 단백질인 혈소판-내피세포 부착 분자-1(PECAM-1)의 발현 정도를 분석하기 위하여, 면역조직화학염색 후 공초점 현미경을 이용하여 혈관내피세포의 양적 변화를 조사하였다.

보다 구체적으로, 각 마우스로부터 음경 해면체 조직을 분리한 후, 이를 4% 파라포름알데히드에 넣은 후, 4℃에서 24 시간 동안 고정하였다. 상기 조직을 동결용 포매제를 이용하여 고정시킨 후, 동결 절편기에서 7㎛ 두께로 잘라 음경조직 절편을 준비하였다. 상기 음경조직 절편을 슬라이드 상에 올리고, PECAM-1 의 발현 분석을 위해 4% 파라포름알데히드에서 약 5분간 고정시켰다. 고정된 음경조직 절편을 세척 버퍼(2% FBS + 0.1% Sodium Azide in PBS)로 3회 세척한 후, 비특이적 단백질 차단 버퍼(5% BSA in PBS)로 1시간 동안 블락킹하였다. 그 후, 1차 항체(항-PECAM-1 햄스터 항체, 1:100)와 함께 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 남아 있는 항체를 제거하기 위해서 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 2차 항체(TRITC-표지된 항-햄스터 항체, 1:1000)와 함께 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 남아있는 항체를 제거하기 위해 세척 버퍼로 다시 2회 세척한 후 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole; 2 ㎍/㎖)를 넣고 5분간 상온에서 반응시켜 세포 핵을 염색시켰다. 다시 세척 완충액으로 2 회 세척한 후에 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, PBS 투여군 및 Ad-GFP 투여군의 음경해면체 조직에서는 정상 마우스(Control)에 비해 해면체 및 혈관내피세포의 수가 현저하게 감소되어 있으나, Ad-DKK3 를 투여한 군의 음경해면체 조직에서는 혈관내피세포 특이적 단백질의 발현이 정상 마우스 수준으로 증가함을 확인하였다. 이를 통해 당뇨에 의하여 감소된 해면체 및 혈관내피세포가 DKK3 아데노바이러스에 의하여 재생이 유도되고, 그에 따라 발기력이 회복된다는 것을 확인할 수 있다.

4-4. 음경해면체 조직에서 이음새 단백질의 발현 분석

상기 실시예 4-1의 3) 번 발기부전 동물모델의 음경해면체 조직에서 이음새 단백질의(ZO-1, Claudin-5)의 발현 정도를 분석하기 위하여, 면역조직화학염색 후 공초점 현미경을 이용하여 이음새 단백질의 양적 변화를 조사하였다. 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.

도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, PBS 투여군 및 Ad-GFP 투여군의 음경해면체 조직에서는 정상 마우스 (Control)에 비해 음경해면체 내 이음새 단백질의 발현이 현저하게 감소되어 있으나, Ad-DKK3를 투여한 군의 음경해면체 조직에서는 이음새 단백질의 발현이 정상 마우스 수준으로 증가함을 확인하였다. 이를 통해 당뇨에 의하여 감소된 이음새 단백질의 발현이 DKK3 아데노바이러스에 의하여 정상 수준만큼 회복되어, 발기력이 개선된다는 것을 확인할 수 있다.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 DKK3 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 해면체 내피세포의 재생을 유도하여 음경 발기력을 증가시키는 등 우수한 발기부전 치료 효과를 가지고 있어, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

이하 본 발명에 따른 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 캡슐제의 제조

DKK3 단백질(유전자) 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-2. 주사제의 제조

DKK3 단백질(유전자) 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-3. 액제의 제조

DKK3 단백질(유전자) 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 조성물의 제조

2-1. 건강식품의 제조

DKK3 단백질(유전자) 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 μg

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg

비오틴 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 μg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Composition for preventing or treating erectile dysfunction comprising DKK3 <130> 1-170p <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 350 <212> PRT <213> DKK3-human <400> 1 Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val 20 25 30 Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn 35 40 45 Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys 50 55 60 Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys 65 70 75 80 Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn 85 90 95 Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His 100 105 110 Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Thr Gly Gln Met Val Phe 115 120 125 Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser 130 135 140 His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln 145 150 155 160 Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met 165 170 175 Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp 180 185 190 Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys 195 200 205 Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg 210 215 220 Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu 225 230 235 240 Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu 245 250 255 Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu 260 265 270 Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe 275 280 285 Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val 290 295 300 Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu 305 310 315 320 Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu 325 330 335 Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile 340 345 350 <210> 2 <211> 349 <212> PRT <213> DKK3-mouse <400> 2 Met Gln Arg Leu Gly Gly Ile Leu Leu Cys Thr Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ser Pro Thr Val Thr Trp Thr Pro Ala 20 25 30 Glu Pro Gly Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn 35 40 45 Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys 50 55 60 Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys 65 70 75 80 Thr Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Ser Leu Pro Pro Asn Tyr His Asn 85 90 95 Glu Thr Ser Thr Glu Thr Arg Val Gly Asn Asn Thr Val His Val His 100 105 110 Gln Glu Val His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Ser Gly Gln Val Val Phe 115 120 125 Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Lys Arg Ser 130 135 140 His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Thr Arg Tyr Cys Gln 145 150 155 160 Phe Ser Ser Phe Lys Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Asp Gln Gln Met 165 170 175 Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Ala Trp 180 185 190 Gly His Cys Thr Gln Lys Ala Thr Lys Gly Gly Asn Gly Thr Ile Cys 195 200 205 Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg 210 215 220 Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu 225 230 235 240 Cys His Asp Pro Thr Ser Gln Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu 245 250 255 Glu Pro Glu Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu 260 265 270 Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Met Cys Lys Pro Ala Phe 275 280 285 Val Gly Ser His Asp His Ser Glu Glu Ser Gln Leu Pro Arg Glu Ala 290 295 300 Pro Asp Glu Tyr Glu Asp Val Gly Phe Ile Gly Glu Val Arg Gln Glu 305 310 315 320 Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Ala Gln Glu Met Ala Phe Glu Gly 325 330 335 Pro Ala Pro Val Glu Ser Leu Gly Gly Glu Glu Glu Ile 340 345 <210> 3 <211> 2587 <212> DNA <213> DKK3-human <400> 3 cgcgcctctg atcgcgttcc gggacacaca ggcggcggct gcgggcgcag agcggagatg 60 cagcggcttg gggccaccct gctgtgcctg ctgctggcgg cggcggtccc cacggccccc 120 gcgcccgctc cgacggcgac ctcggctcca gtcaagcccg gcccggctct cagctacccg 180 caggaggagg ccaccctcaa tgagatgttc cgcgaggttg aggaactgat ggaggacacg 240 cagcacaaat tgcgcagcgc ggtggaagag atggaggcag aagaagctgc tgctaaagca 300 tcatcagaag tgaacctggc aaacttacct cccagctatc acaatgagac caacacagac 360 acgaaggttg gaaataatac catccatgtg caccgagaaa ttcacaagat aaccaacaac 420 cagactggac aaatggtctt ttcagagaca gttatcacat ctgtgggaga cgaagaaggc 480 agaaggagcc acgagtgcat catcgacgag gactgtgggc ccagcatgta ctgccagttt 540 gccagcttcc agtacacctg ccagccatgc cggggccaga ggatgctctg cacccgggac 600 agtgagtgct gtggagacca gctgtgtgtc tggggtcact gcaccaaaat ggccaccagg 660 ggcagcaatg ggaccatctg tgacaaccag agggactgcc agccggggct gtgctgtgcc 720 ttccagagag gcctgctgtt ccctgtgtgc acacccctgc ccgtggaggg cgagctttgc 780 catgaccccg ccagccggct tctggacctc atcacctggg agctagagcc tgatggagcc 840 ttggaccgat gcccttgtgc cagtggcctc ctctgccagc cccacagcca cagcctggtg 900 tatgtgtgca agccgacctt cgtggggagc cgtgaccaag atggggagat cctgctgccc 960 agagaggtcc ccgatgagta tgaagttggc agcttcatgg aggaggtgcg ccaggagctg 1020 gaggacctgg agaggagcct gactgaagag atggcgctga gggagcctgc ggctgccgcc 1080 gctgcactgc tgggagggga agagatttag atctggacca ggctgtgggt agatgtgcaa 1140 tagaaatagc taatttattt ccccaggtgt gtgctttagg cgtgggctga ccaggcttct 1200 tcctacatct tcttcccagt aagtttcccc tctggcttga cagcatgagg tgttgtgcat 1260 ttgttcagct cccccaggct gttctccagg cttcacagtc tggtgcttgg gagagtcagg 1320 cagggttaaa ctgcaggagc agtttgccac ccctgtccag attattggct gctttgcctc 1380 taccagttgg cagacagccg tttgttctac atggctttga taattgtttg aggggaggag 1440 atggaaacaa tgtggagtct ccctctgatt ggttttgggg aaatgtggag aagagtgccc 1500 tgctttgcaa acatcaacct ggcaaaaatg caacaaatga attttccacg cagttctttc 1560 catgggcata ggtaagctgt gccttcagct gttgcagatg aaatgttctg ttcaccctgc 1620 attacatgtg tttattcatc cagcagtgtt gctcagctcc tacctctgtg ccagggcagc 1680 attttcatat ccaagatcaa ttccctctct cagcacagcc tggggagggg gtcattgttc 1740 tcctcgtcca tcagggatct cagaggctca gagactgcaa gctgcttgcc caagtcacac 1800 agctagtgaa gaccagagca gtttcatctg gttgtgactc taagctcagt gctctctcca 1860 ctaccccaca ccagccttgg tgccaccaaa agtgctcccc aaaaggaagg agaatgggat 1920 ttttcttttg aggcatgcac atctggaatt aaggtcaaac taattctcac atccctctaa 1980 aagtaaacta ctgttaggaa cagcagtgtt ctcacagtgt ggggcagccg tccttctaat 2040 gaagacaatg atattgacac tgtccctctt tggcagttgc attagtaact ttgaaaggta 2100 tatgactgag cgtagcatac aggttaacct gcagaaacag tacttaggta attgtagggc 2160 gaggattata aatgaaattt gcaaaatcac ttagcagcaa ctgaagacaa ttatcaacca 2220 cgtggagaaa atcaaaccga gcagggctgt gtgaaacatg gttgtaatat gcgactgcga 2280 acactgaact ctacgccact ccacaaatga tgttttcagg tgtcatggac tgttgccacc 2340 atgtattcat ccagagttct taaagtttaa agttgcacat gattgtataa gcatgctttc 2400 tttgagtttt aaattatgta taaacataag ttgcatttag aaatcaagca taaatcactt 2460 caactgctct tctgtagttc ttggatttct tttccctttt gactttgaat aaatgtaaaa 2520 tcctttcagc cagaaaaagt aaaatagaaa caacctgtat taaaaatctt ccatagaaaa 2580 aaaaaaa 2587 <210> 4 <211> 3357 <212> DNA <213> DKK3-mouse <400> 4 gcacacagtg cctctccagc tgctctgtgg cagcccagct accggtcgtg accagatcca 60 gcttgcagct cagctttgtt cattcgaatt gggcggcggc cagcgcggaa caaacatgca 120 gcggctcggg ggtattttgc tgtgtacact gctggcggcg gcggtcccca ctgctcctgc 180 tccttccccg acggtcactt ggactccggc ggagccgggc ccagctctca actaccctca 240 ggaggaagct acgctcaatg agatgtttcg agaggtggag gagctgatgg aagacactca 300 gcacaaactg cgcagtgccg tggaggagat ggaggcggaa gaagcagctg ctaaaacgtc 360 ctctgaggtg aacctggcaa gcttacctcc caactatcac aatgagacca gcacggagac 420 cagggtggga aataacacag tccatgtgca ccaggaagtt cacaagataa ccaacaacca 480 gagtggacag gtggtctttt ctgagacagt cattacatct gtaggggatg aagaaggcaa 540 gaggagccat gaatgtatca ttgatgaaga ctgtgggccc accaggtact gccagttctc 600 cagcttcaag tacacctgcc agccatgccg ggaccagcag atgctatgca cccgagacag 660 tgagtgctgt ggagaccagc tgtgtgcctg gggtcactgc acccaaaagg ccaccaaagg 720 tggcaatggg accatctgtg acaaccagag ggattgccag cctggcctgt gttgtgcctt 780 ccaaagaggc ctgctgttcc ccgtgtgcac acccctgccc gtggagggag agctctgcca 840 tgaccccacc agccagctgc tggatctcat cacctgggaa ctggagcctg aaggagcttt 900 ggaccgatgc ccctgcgcca gtggcctcct atgccagcca cacagccaca gtctggtgta 960 catgtgcaag ccagccttcg tgggcagcca tgaccacagt gaggagagcc agctgcccag 1020 ggaggccccg gatgagtacg aagatgttgg cttcataggg gaagtgcgcc aggagctgga 1080 agacctggag cggagcctag cccaggagat ggcatttgag gggcctgccc ctgtggagtc 1140 actaggcgga gaggaggaga tttaggccca gacccagctg agtcactggt agatgtgcaa 1200 tagaaatggc taatttattt tcccaggagt gtccccaagt gtggaatggc cgcagctcct 1260 tcccagtagc ttttcctctg gcttgacaag gtacagtgca gtacatttct tccagccgcc 1320 ctgcttctct gacttgggaa agacaggcat ggcgggtaag ggcagcggtg agtcgtccct 1380 cgctgttgct agaaacgctg tcttgttctt catggatgga agatttgttt gaagggagag 1440 gatgggaagg ggtgaagtct gctcatgatg gatttggggg atacagggag gaggatgcct 1500 gccttgcaga cgtggacttg gcaaaatgta acctttgctt ttgtcttgcg ccgctcccat 1560 gggctgaggc agtggctaca caagagctat gctgctctgt ggcctcccac atattcatcc 1620 ctgtgtttca gctcctacct cactgtcagc acagcccttc atagccacgc cccctcttgc 1680 tcaccacagc ctaggagggg accagagggg acttctctca gagccccatg ctctctctct 1740 caaccccata ccagcctctg tgccagcgac agtccttcca aatggaggga gtgaaatcct 1800 ttggttttat tattttctcc ttcaaggcac gcctgccact aaggtcaggc tgacttgcat 1860 gtccctctaa cgttcgtagc agtgtggtgg acactgtctt ccaccgactg cttcaatacc 1920 tctgaaagcc agtgctcgga gtgcagttcg tgtaaattaa tttgcaggaa gtatacttgg 1980 ctaattgtag ggctaggatt gtgaatgaaa tttgcaaagt cgcttagcaa caatggaaag 2040 cctttctcag tcacaccgag aagtcacaac caagccaggt tgtgtagagt acagctgtga 2100 catacagaca gaagaaggct gggctggatg tcaggcctca gatgacggtt tcaggtgcca 2160 ggaactatta ccattctgta tctatccaga gttattaaaa ttgaaagttg cacacatttg 2220 tataagcatg cctttctcct gagttttaaa ttatatgtat acacaaacat gtggccctca 2280 aagatcatgc acaaaccact actctttgct aattcttgga cttttctctt tgattttcaa 2340 taaatacaaa tccccttcat gcaaaaaaat taaaacaatc tgtagtataa agagacaaaa 2400 aaattccata gaagcagatt ttccaggcat ctgcagtttc cctcttttag aatcggaatt 2460 cgttggaact ctcatccttg tctggatggg aattagcttt aacagagaaa ctacttcacc 2520 ctctcctgaa agaacaaatg gaatatatga gtcttctctt ggaggctctt tccactcaaa 2580 tgcagttctg gggctgtgct agcattgata ctgtaacaaa acggctgaag caatgaactt 2640 atatatttaa aaagttaggt taattgggtt caccatttca ggtttcagtc ctgatcccat 2700 ggggttgaaa ctaaggagag gcagcacagc gtggcaaggg aatgtggtag agtcaagctg 2760 ctccctttct ggctaacagg agagtgggca atgtgcagtc ttgtgagaat gcccaggtcc 2820 tggggggaag ggagtgccct ggacatcacc ttaaaggtgg agacttctgc agctttggtt 2880 ttagttactc ttctgggtgc tacaatcaaa cgcccaacaa gaagccacct gagggatgag 2940 ggtttatttt ggctcctggt tcaagcaggg agtccttcgt ggcaggagtg caaggttgct 3000 tcctgcagtg tggaggatca ggaagcaaag aaagagcaat gcaagactca gctttctctc 3060 tttccctgat tatttattct ggaaccccaa cccttggggt ggtgccgacc gcagtaagag 3120 tgagtgtcct ttccttagaa ccctctgaaa actcttggcc tcatagaaat gtgcagaggt 3180 gtgtcaccta aattgttcaa atccattctg ttccaagaca tgggagcgct atgtgctaag 3240 tcttccacat aagagcaccg agtacctctt aaacgcctgt aaatcgcatc tgaagatacc 3300 acagtaaaga gatgtaaaca tttaggaaaa caataaatgt aactgatgaa gtcacct 3357

Claims (7)

1. DKK3 (Dickkopf 3) 단백질 또는 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 DKK3 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 DKK3 단백질은 서열번호 1의 22 내지 350번째 아미노산 또는 서열번호 2의 23 내지 350번째 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. DKK3 (Dickkopf 3) 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
7. DKK3 (Dickkopf 3) 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   

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