CN103239714B - 用于治疗缺血性疾病的蛋白质及药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗缺血性疾病的蛋白质及药物组合物，具体地，本发明人发现，胰岛素样生长因子结合蛋白，特别是胰岛素样生长因子结合蛋白‑4(IGFBP‑4)具有优异的治疗缺血性疾病的作用，IGFBP‑4蛋白能够促进血管增殖、促进干细胞分化为心肌细胞，对于缺血性疾病，尤其是心肌缺血和下肢缺血具有良好的治疗和预防作用，无毒副作用。

Description

用于治疗缺血性疾病的蛋白质及药物组合物

技术领域

本发明涉及生物工程和生物医药领域，具体地，本发明涉及用于治疗缺血性疾病的蛋白质及药物组合物。

背景技术

缺血性疾病已成为人类死亡的主要原因，其中，心肌缺血和下肢缺血病患者数呈现着不断增加的趋势。目前全世界每死亡3个人，就有1人死于心肌缺血类疾病。在心血管疾病中，各种原因可导致心脏细胞死亡，主要因为成熟心肌细胞一个最大的特性就是在出生不久，这些细胞就失去了分裂增殖的能力。这样，死亡的细胞最终就全部由没有功能的疤痕组织所代替，最终导致心力衰竭。这类心脏机能极其低下患者的预后也极其不良。

在现阶段，心脏移植是这些患者主要治疗方式，然而，器官捐献数量极少，也受到伦理等的限制；代替心脏移植的一个较有希望的治疗办法是近年来兴起的干细胞治疗，是通过干细胞替代坏死心肌细胞方式来达到细胞再生的目的，现有的实验结果表明，移植细胞包括骨髓干细胞和胚胎干细胞可在心肌内发育为成熟心肌细胞并与宿主细胞形成闰盘联接，阻止心室扩大，提高心脏功能，但由干细胞发育成的成熟心肌细胞数量有限，不能从根本上起到修复病变心肌的作用。

本领域目前尚无有效的治疗缺血性疾病的药物，因此迫切需要开发效果优良、无毒副作用的、能够替代器官移植和干细胞的新型药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于治疗缺血性疾病的蛋白质及药物组合物。

本发明的另一目的是提供一种胰岛素样生长因子结合蛋白或其基因的用途。

本发明的另一目的是提供一种预防和/或治疗缺血性疾病和体外非治疗性地促进血管增殖的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)或其基因的用途，用于制备预防和/或治疗缺血性疾病的药物。

在另一选例中，所述的缺血性疾病选自下组：心肌缺血和下肢缺血。

在另一选例中，所述的胰岛素样生长因子结合蛋白或其基因选自下组：IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4或IGFBP-6。

在另一优选例中，所述的胰岛素样生长因子结合蛋白或其基因为IGFBP-4。

在另一优选例中，所述的IGFBP-4基因的核酸序列如SEQ ID NO.：1所示，所述IGFBP-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示。

在本发明的第二方面，提供了一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)构建含有编码胰岛素样生长因子结合蛋白的核酸序列的表达载体；

(2)将步骤(1)获得的表达载体转入宿主细胞；

(3)在适合表达的条件下，培养步骤(2)所述的宿主细胞，从而表达胰岛素样生长因子结合蛋白；

(4)分离步骤(3)中所表达的胰岛素样生长因子结合蛋白。

在另一优选例中，步骤(1)所述的胰岛素样生长因子结合蛋白为IGFBP-4。

在另一优选例中，编码IGFBP-4的核酸序列如SEQ ID NO.：1所示，或IGFBP-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示。

在另一优选例中，步骤(2)所述的宿主细胞为肾细胞，较佳地为为HEK293细胞。

在另一优选例中，所述的胰岛素样生长因子结合蛋白为带有His标签的融合蛋白。

在另一优选例中，在步骤(4)中，利用镍柱纯化带有His标签的胰岛素样生长因子结合蛋白。

在本发明的第三方面，提供了一种预防和/或治疗缺血性疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用胰岛素样生长因子结合蛋白，或施用含胰岛素样生长因子结合蛋白的药物组合物。

在另一优选例中，所述的胰岛素样生长因子结合蛋白选自下组：IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4或IGFBP-6，较佳地为IGFBP-4。

在另一优选例中，所述的缺血性疾病为心肌缺血或下肢缺血。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态剂型，如注射液。

在另一优选例中，所述的施用包括：静脉注射、皮下注射、或肌内注射等。

在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物。

在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地促进血管增殖的方法，包括步骤：将胰岛素样生长因子结合蛋白与组织和/或细胞接触，从而促进血管增殖。

在另一优选例中，所述的接触是在胰岛素样生长因子结合蛋白存在下，培养所述组织和/或细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了IGFBP-4的蛋白结构示意图。

图2显示了宿主细胞表达IGFBP-4蛋白的纯化与检测结果。

图3显示了纯化的IGFBP-4蛋白SDS-PAGE电泳图。

图4显示了IGFBP-4蛋白用于动物治疗的结果，其中，图4A为解剖直接观察结果；图4B为治疗后0天的血管红外成像图；图4C为治疗后6天的血管红外成像图，每组的左图为IGFBP-4治疗组，右侧为对照组。

图5为冠状动脉结扎后小鼠心脏横切面，注射了IGFBP-4以后的小鼠心脏心肌层(右)比对照组(左)要厚，显示IGFBP-4蛋白在心肌缺血中具有保护作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP-4)竟然具有优异的治疗缺血性疾病的作用，具体地，IGFBP-4蛋白能够促进血管增殖，从而有效改善缺血症状，因此对于缺血性疾病，尤其是心肌缺血、下肢缺血具有良好的治疗和预防作用。在此基础上完成了本发明。

胰岛素样生长因子(IGFs)

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，简称IGFs)是一类多功能细胞增殖调控因子。IGFs家族由两种低分子多肽(IGF-I、IGF-II)、两类特异性受体及六种结合蛋白组成。IGF-I是一个有70个氨基酸的单链碱性蛋白，分子量7649Da，耐热；而IGF-II则为一个含67个氨基酸的单链弱酸性蛋白，分子量为7471Da，对0.1％SDS稳定，两者70％以上同源，与人类胰岛素原的结构和功能约50％相似。

IGFs的生物学功能是通过与特异性的靶细胞表面的受体结合而实现的。IGFs与其它的生长因子不同，不论在血清，细胞外液及细胞培养液中都与特异性的结合蛋白(Binding Proteins，BPs)结合以无活性的复合物形式存在。

到目前为止，已发现6种IGFBP，即IGFBP1、2、3、4、5和6，其特征性的结构构成了一个相关性分泌蛋白家族，均为低分子肽类，50％结构相似。它们与两种IGF都具高亲和力，而不与胰岛素结合。IGFBP1、2，4和6的性质较接近。

胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP-4)及其制备

IGFBP-4是最小的IGFBP，也是极其重要的一类胰岛素样生长因子结合蛋白。IGFBP-4存在于所有的生物体液中，不同类型的细胞，包括纤维母细胞、神经母细胞瘤细胞、前列腺细胞和骨细胞等均能生成IGFBP-4，肝脏是IGFBP-4mRNA表达最丰富的部位。

人类IGFBP-4基因位于17号染色体，跨距15.3kb，鼠的IGFBP-4基因位于11号染色体，跨距11.3kb。人与鼠的IGFBP-4基因都由被3个内含子分别隔开的4个外显子组成，剪接位点高度保守，IGFBP-4的启动子具有典型的TATA盒与CART盒。

在本发明的一个优选例中，IGFBP-4蛋白质结构见图1，IGFBP-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示：

aaagtccgggggagccggtcccgggcagccgctcagccccctgcccctcgccgcccgccgcctgcctgggccgggccgaggatgcggcgcagcgcctcggcggccaggcttgctcccctccggcacgcctgctaacttcccccgctacgtccccgttcgcccgccgggccgccccgtctccccgcgccctccgggtcgggtcctccaggagcgccaggcgctgccgccgtgtgccctccgccgctcgcccgcgcgcccgcgctccccgcctgcgcccagcgccccgcgcccgcgcccagtcctcgggcggtcatgctgcccctctgcctcgtggccgccctgctgctggccgccgggcccgggccgagcctgggcgacgaagccatccactgcccgccctgctccgaggagaagctggcgcgctgccgcccccccgtgggctgcgaggagctggtgcgagagccgggctgcggctgttgcgccacttgcgccctgggcttggggatgccctgcggggtgtacaccccccgttgcggctcgggcctgcgctgctacccgccccgaggggtggagaagcccctgcacacactgatgcccgggcaaggcgtgtgcatggagctggcggagatcgaggccatccaggaaagcctgcagccctctgacaaggacgagggtgaccaccccaacaacagcttcagcccctgtagcgcccatgaccgcaggtgcctgcagaagcacttcgccaaaattcgagaccggagcaccagtgggggcaagatgaaggtcaatggggcgccccgggaggatgcccggcctgtgccccagggctcctgccagagcgagctgcaccgggcgctggagcggctggccgcttcacagagccgcacccacgaggacctctacatcatccccatccccaactgcgaccgcaacggcaacttccaccccaagcagtgtcacccagctctggatgggcagcgtggcaagtgctggtgtgtggaccggaagacgggggtgaagcttccggggggcctggagccaaagggggagctggactgccaccagctggctgacagctttcgagagtgaggcctgccagcaggccagggactcagcgtcccctgctactcctgtgctctggaggctgcagagctgacccagagtggagtctgagtctgagtcctgtctctgcctgcggcccagaagtttccctcaaatgcgcgtgtgcacgtgtgcgtgtgcgtgcgtgtgtgtgtgtttgtgagcatgggtgtgcccttggggtaagccagagcctggggtgttctctttggtgttacacagcccaagaggactgagactggcacttagcccaagaggtctgagccctggtgtgtttccagatcgatcctggattcactcactcactcattccttcactcatccagccacctaaaaacatttactgaccatgtactacgtgccagctctagttttcagccttgggaggttttattctgacttcctctgattttggcatgtggagacactcctataaggagagttcaagcctgtgggagtagaaaaatctcattcccagagtcagaggagaagagacatgtaccttgaccatcgtccttcctctcaagctagccagagggtgggagcctaaggaagcgtggggtagcagatggagtaatggtcacgaggtccagacccactcccaaagctcagacttgccaggctccctttctcttcttccccaggtccttcctttaggtctggttgttgcaccatctgcttggttggctggcagctgagagccctgctgtgggagagcgaagggggtcaaaggaagacttgaagcacagagggctagggaggtggggtacatttctctgagcagtcagggtgggaagaaagaatgcaagagtggactgaatgtgcctaatggagaagacccacgtgctaggggatgaggggcttcctgggtcctgttccctaccccatttgtggtcacagccatgaagtcaccgggatgaacctatccttccagtggctcgctccctgtagctctgcctccctctccatatctccttcccctacacctccctccccacacctccctactcccctgggcatcttctggcttgactggatggaaggagacttaggaacctaccagttggccatgatgtcttttcttctttttcttttttttaacaaaacagaacaaaaccaaaaaatgtccagatgaaaaaaaaaaa(SEQ ID NO.：1)。

IGFBP-4蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示：

MLPLCLVAALLLAAGPGPSLGDEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRCGSGLRCYPPRGVEKPLHTLMPGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDEGDHPNNSFSPCSAHDRRCLQKHFAKIRDRSTSGGKMKVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNFHPKQCHPALDGQRGKCWCVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE(SEQ ID NO.：2)。

根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的IGFBP-4基因的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

包含基因编码序列可以与表达调控序列操作性相连的。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

表达载体可采用市售的例如但不限于：pUCT、pIRES、pDR，pUC18等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。

根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明IGFBP-4基因的编码核酸序列插入合适的限制性位点，制得重组表达载体。

所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于HEK293细胞，CHO细胞，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。上述宿主细胞均可以市售获得。作为本发明的优选方式，所述的细胞是HEK293细胞，其可良好地表达IGFBP-4蛋白。

在本发明的一个优选例中，提供了一种制备IGFBP-4蛋白的方法，包括步骤：

1)提供编码IGFBP-4蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO：1序列)；

2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；

3)将2)的重组表达载体导入宿主细胞HEK293中；

4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；

5)收集上清液，His和镍金属纯化蛋白产物。

将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。

有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand1996；86：338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。

可将上述制备获得的蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。

可利用含有所述蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

IGFBP-4的用途

本发明还提供了一种胰岛素样生长因子结合蛋白(特别是IGFBP-4)的用途，所述蛋白用于制备预防和/或治疗缺血性疾病的药物。所述的缺血性疾病选自下组：心肌缺血、下肢缺血、脑缺血、肠道缺血、或肾缺血，较佳地为心肌缺血或下肢缺血。

本发明还提供了一种预防和/或治疗缺血性疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用胰岛素样生长因子结合蛋白，或施用含胰岛素样生长因子结合蛋白的药物组合物。所述的胰岛素样生长因子结合蛋白选自下组：IGFBP-1、IGFBP-3、或IGFBP-4，较佳地为IGFBP-4。所述的缺血性疾病包括选自下组：心肌缺血、下肢缺血、脑缺血、肠道缺血、或肾缺血；较佳地为心肌缺血或下肢缺血。所述的施用包括：静脉注射、口服片剂、瘤内、腹腔注射等；所述的对象为哺乳动物。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-90wt％；较佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％)的IGFBP蛋白(尤其是IGFBP-4蛋白)，以及药学上可接受的载体。

通常，可将IGFBP蛋白配制于无毒、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的IGFBP-4蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药的方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当IGFBP-4蛋白每天以约0.0001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

以IGFBP-4蛋白为例，本发明的主要优点包括，

1)IGFBP-4蛋白能促进干细胞向心肌细胞分化，是一个与IGF信号通路无关的细胞分化诱导因子；

2)IGFBP-4蛋白可促进血管增殖；

3)IGFBP-4蛋白具有优异的治疗缺血性疾病的效果；

4)IGFBP-4蛋白在治疗中无毒副作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

术语说明

℃＝摄氏度；min＝分钟；sec＝秒；M＝摩尔；mM＝毫摩尔；mL＝毫升；μL＝微升；μg＝微克。

实施例1

IGFBP-4蛋白的制备

1.克隆IGFBP-4基因：

用常规方法抽提的人mRNA，经反转录获得cDNA。将所述cDNA作为模板，用对应于IGFBP-4基因(SEQ ID NO.：1)ORF框两侧的引物，通过RT-PCR扩增获得人IGFBP-4扩增产物，产物长度与预测值一致。

2.构建IGFBP-4真核表达载体：

将上述获得的PCR扩增产物，经TA亚克隆到pcDNA3.1-TOPO-6XHis真核细胞表达载体(购自Invitrogen公司)中。

3.转染：

用常规方法转染宿主细胞为HEK293细胞，并在含500μg/ml G418的条件下培养，获得了多株生长的HEK293细胞株，即为转化子。

挑选表达量高的转化子，用常规方法培养，使其表达IGFBP-4蛋白质，宿主细胞表达结果见图2。

4.IGFBP-4蛋白质的纯化和检测：

利用His和镍金属相结合的方法，使用镍柱纯化IGFBP-4蛋白，纯化结果见图3。结果表明，已经成功地纯化了IGFBP-4蛋白质。

实施例2

动物下肢缺血缺血模型的制备

1.模型建立和标本收集

8周雄性C57BL/6小鼠10只(The Jackson Laboratory，美国)，随机分为实验组和对照组，每组5只。分几点直接注射IGFBP-4(5μg/50μl)到缺血下肢部位，给对照组小鼠注射相同容量的生理盐水。激光多普勒影像显示缺血部分为蓝色，而有血流部分为红色。

2.于小鼠12周龄时，行左侧股动脉结扎和切除术，建立小鼠下肢缺血模型。分别于术前、术后即刻，和术后7、14、21、28d以激光多普勒超声扫描仪监测小鼠下肢血流灌注情况。

实施例3

药物治疗动物下肢缺血模型

小鼠下肢缺血模型建立(实施例2)后，以激光多普勒超声扫描仪监测小鼠下肢血流灌注情况；利用小鼠尾静脉一次性注射重组IGFBP-4蛋白(5μg/25g)或安慰剂(PBS)作为对照；6天后同样以激光多普勒超声扫描仪监测小鼠下肢血流灌注情况。

治疗效果的观察与评价：结果表明，一次性注射重组IGFBP-4蛋白组小鼠下肢缺血明显有改善，图4显示了IGFBP-4蛋白用于动物治疗的结果，其中，图4A为解剖直接观察结果；图4B为治疗后0天的血管红外成像图；图4C为治疗后6天的血管红外成像图，每一组的左图为IGFBP-4治疗组，右侧为对照组。

实施例4

动物心肌缺血模型的制备

1.模型建立和标本收集

8周雄性C57BL/6小鼠4只(The Jackson Laboratory，美国)，随机分为实验组和对照组，每组2只，一次性直接尾静脉注射IGFBP-4(5μg/50μl)，给对照组小鼠注射相同容量的生理盐水，进行组织切片后观察。

2.选用C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射阿托品(0.04mg/kg)，5min后腹腔麻醉(戊巴比妥钠，60mg/kg)，观测小鼠的呼吸频率(90次/min以上)及动度，接呼吸机(潮气量1ml，频率90-105次/min)，小鼠呼吸频率与呼吸机节律相同，无呼吸抵抗，可以开胸。

在胸骨左缘2-3mm，第2、3、4肋间处做一纵切口，结扎肋间动脉，分离胸腺、心包，暴露心脏，冠状动脉前降支从左心耳前端和肺动脉圆锥间下行，在左心耳下缘打活结结扎该冠脉，从心电图判断其缺血情况。30min后，解开活结，恢复冠脉血流；再灌注15min，观测小鼠心律平稳后，开始关胸。由于小鼠胸壁较薄，不宜单层缝合，将肋间肌和胸肌分别缝合，针距在1.5mm左右。

缝合完毕后，用注射针抽取胸腔内残余气体，减小气量，小鼠出现轻微的自主呼吸，此时可以撤下呼吸机，小鼠恢复自主呼吸。若不能及时恢复，用左手轻按小鼠胸骨助其呼吸。小鼠自主呼吸频率在90次/分钟以上，观察20min，待其呼吸动度和频率没有减弱时，缝合皮肤，腹腔注射0.5ml温生理盐水，将其放置在25℃的环境中。

实施例5

药物治疗动物心肌缺血模型

小鼠心肌缺血模型建立后(实施例4)进行指标检测，利用小鼠尾静脉一次性注射重组IGFBP-4蛋白(5μg/25g)或安慰剂(PBS)，6天后根据图示进行组织切片后观察。

治疗效果的观察与评价：一次性注射重组IGFBP-4蛋白组小鼠对心肌缺血小鼠心脏明显有保护作用，图5为冠状动脉结扎后小鼠心脏横切面，注射了IGFBP-4以后的小鼠心脏心肌层(右)比对照组(左)要厚，显示IGFBP-4蛋白在心肌缺血中具有保护作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)或其基因的用途，其特征在于，所述胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)或其基因选自下组：IGFBP-4，用于制备预防和/或治疗缺血性疾病的药物，其中，所述的缺血性疾病选自下组：下肢缺血。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的IGFBP-4基因的核酸序列如SEQ IDNO.:1所示，所述IGFBP-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

3.一种体外非治疗性地促进血管增殖的方法，其特征在于，包括步骤：将胰岛素样生长因子结合蛋白与组织和/或细胞接触，从而促进血管增殖，其中，所述胰岛素样生长因子结合蛋白选自下组：IGFBP-4。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的接触是在胰岛素样生长因子结合蛋白存在下，培养所述组织和/或细胞。