CN106749682A - 重组人胰岛素原融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

一种重组人胰岛素原融合蛋白，其由如SEQ ID No 1所示的序列编码。本发明提供的重组人胰岛素原融合蛋白具有更好的稳定性，能高效通过多种生物膜屏障，具有更高的药物吸收率，可经皮吸收、经舌下含服、经黏膜(口腔粘膜、舌黏膜、鼻腔粘膜)吸收，实现显著的降血糖生物活性。

Description

重组人胰岛素原融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种重组人胰岛素原融合蛋白，以及在制备降血糖药物中的应用。

背景技术

糖尿病是一组由于胰岛素分泌和/或功能缺陷导致的临床综合征，以慢性血糖升高为主要特征。糖尿病是与遗传、环境等多因素相关的代谢综合征，表现为碳水化合物、脂肪、蛋白质的代谢紊乱。慢性糖尿病常导致一个或多个器官的并发症，如糖尿病肾病、下肢外周血管病变、糖尿病足等。这些器官功能障碍与衰竭是糖尿病致死、致残的主要原因。

胰岛素是糖尿病患者用于控制血糖水平的激素类药物，广泛用于I型和II型糖尿病患者，以替代或补充机体胰岛素分泌之不足。然而，目前临床上可用之胰岛素药物均为皮下注射剂型。胰岛素注射常常给患者带来诸多不便与痛苦，并有许多不良反应，如注射部位疼痛、出血、皮下结节形成等。胰岛素注射可能导致高胰岛素血症，严重者出现低血糖、昏迷乃至休克。此外，由于制剂纯度较低或采用动物来源胰岛素，注射后可能引起过敏反应，重者甚至出现过敏性休克。因此，开发一种不需要皮下注射的胰岛素药物显得极为重要。

口服吸入型胰岛素、经皮或经鼻给药等是目前研究较多的胰岛素皮下注射替代给药途径。但这些给药途径主要面临两方面的困难，一方面是胃肠道、鼻腔等富含各类蛋白酶类，造成胰岛素降解；另一方面是胰岛素难以通过上皮细胞及其紧密连接所构成的生物膜屏障，造成极低的药物吸收。研究者使用肠溶衣、脂质体等包裹胰岛素，一定程度上减少了胰岛素降解，但极低的药物吸收率不足以产生治疗效果。

胰岛素专一地由胰岛β细胞表达分泌，首先表达为前胰岛素原，在内质网内剪切掉信号肽并折叠氧化形成二级结构，转运到高尔基体。在高尔基体蛋白内切酶PC2、PC1/3的作用下，剪切掉其C肽，使之成为成熟胰岛素。由于PC2、PC1/3只在胰岛β细胞表达，其它组织细胞因缺乏蛋白内切酶PC2、PC1/3，不能加工胰岛素原。有人曾利用PCR定点突变技术，将胰岛素原PC2、PC1/3酶切位点改造为弗林蛋白酶(Furin)酶切位点((Higuchi et al.1988)，使普通细胞或组织摄入这种改造后的胰岛素原后，具有剪切掉胰岛素原C肽，使之加工为成熟胰岛素。

近年来，利用细胞穿膜肽(cell penetrating peptide)携带生物大分子、脂质体或纳米粒子等进入细胞及组织得到越来越多的研究。细胞穿膜肽是一类能够高效通过生物膜屏障的功能多肽，一般不到20个氨基酸残基，根据生化性质分为阳离子穿膜肽(cationicpeptides)和两性穿膜肽(amphiphilic peptides)两类。常见的细胞穿膜肽包括TAT，细胞穿透肽(penetratin)，寡聚精氨酸等。将穿膜肽与生物大分子通过化学合成的方法连接或构建融合表达蛋白，可有效地促进生物大分子跨膜吸收。

将TAT与胰岛素通过化学合成连接，可促进胰岛素在体外条件下经肠上皮吸收(Liang JF，et al，2005)。将多种穿膜肽与胰岛素直接混合孵育也在体外显示出促进药物吸收的效果(Kamei N，et al，2013)。目前尚未有穿膜肽与胰岛素或胰岛素原融合蛋白的成功表达与制备的文献报道。

经查，中国发明专利ZL200410039129.X提供了一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白的表达与应用，但其实施方式未显示出该技术方案能够制备出具有生物学活性的转导肽-胰岛素原融合蛋白的结果。究其原因，可能如下：①其重组质粒所用表达宿主为克隆感受态细胞JM109、DH5α。这些细胞不能有效表达重组蛋白，其所附图2 SDS-PAGE电泳图不能看出表达产物条带；②实施例4与其所对应的附图3不相符：实施例4为温度诱导表达，而附图3的说明中却是IPTG诱导表达，且附图3的SDS-PAGE电泳图不能看出表达产物条带，电泳图呈“黑板状”无法进行实施例4中所描述的密度扫描并计算表达产物占比；③所附核苷酸序列、氨基酸序列与附图1融合蛋白一级结构不符，序列表及实施例中转导肽TAT位于融合蛋白氨基端，而附图1中转导肽却位于羧基端。④实施例4描述该融合蛋白以包涵体形式存在，然而“有益效果”部分和实施例7纯化部分中没有任何该融合蛋白复性的步骤，因此不可能得到有活性的融合蛋白⑤该专利中所用表达载体为常见的大肠杆菌表达质粒，而技术方案中却认为该载体转染酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞也可以表达，且没有提供相关实验证据；⑥该专利中未提供任何蛋白生物学活性检测结果。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种重组人胰岛素原融合蛋白，利于临床防治手段的实施。

本发明的另一个目的在于提供一种重组人胰岛素原融合蛋白的制备方法，以获得具有参与糖代谢过程的生物学活性的多肽或蛋白。

本发明的再一个目的在于提供一种组合物，以经上皮细胞和粘膜细胞等方式向生物体施以重组人胰岛素原融合蛋白。

本发明的又一个目的在于提供一种重组人胰岛素原融合蛋白在制备治疗和预防糖代谢相关病症药物中的应用。

本发明的又一个目的在于提供一种重组人胰岛素原融合蛋白在制备治疗和预防糖尿病药物中的应用。

本发明所称的组合物，还包括各种与所含化合物或组合物相适应的药物辅料，以制成有利于给药(drug delivery)的剂型，如：但不仅限于水溶液丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。这些药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善各种化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如：但不仅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称的“有利于给药”的主要表现有：但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。

在水溶液注射剂中，辅料一般包括等渗剂和缓冲液，以及必要的乳化剂(如：Tweeen-80、Pluronic和Poloxamer等)、增溶剂和抑菌剂等。此外，还包括含有药学上可接受的其它药用辅料，如：抗氧剂、pH调节剂和止痛剂等。

用于制取口服液体制剂的辅料一般包括溶剂，以及必要的矫味剂、抑菌剂、乳化剂和着色剂等。

用于制取片剂的辅料一般包括填充剂(如：淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇等)、粘合剂(如：乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液或醇溶液等)、崩解剂(如：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠)和润滑剂(如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇4,000、聚乙二醇6,000和月桂醇硫酸镁等)等。

用于制取乳剂的辅料一般为水、油(如：脂肪酸)、乳化剂，以及必要的防腐剂和矫味剂等。

用于制取颗粒剂的辅料与片剂类似，但造粒过程不同。根据需要，将制得的颗粒剂与助流剂混合后装入胶囊即得胶囊剂。

本发明所称的“生物体”、“动物”或“患者”是指人、野生动物和家畜(Livestock)。野生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。家畜是为了提供食物来源而人工饲养的动物，如：但不仅限于狗、猫、鼠、大鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、公牛、绵羊、山羊、鹅和鸡等。给予治疗的“患者”或“生物体”优先选择哺乳动物，尤其是人。

本发明所称的“预防”是指在未被临床标准认定的疾病前，各种用于防止疾病发生或发展的手段或措施，包括医学、物理或化学的方法，以阻止和降低疾病各种症状的发生或发展。

本发明所称的“预防糖尿病”是指将本发明组合物用于还未符合“糖尿病”临床指标的，随着时间的延续将慢慢发展成为临床上定义为“糖尿病”的潜在患者，从而改善这些患者对葡萄糖的耐受，促进肌体对糖代谢的能力，增加肌体对胰岛素的敏感性。这类潜在的患者通常患有“代谢综合症(Metabolic Syndrome)”(Annnu.Rev.Nutri.，2005，25，391-406；Annnu.Rev.Med.，2005，56，45-62；Nat.Rev.Drug.Disc.，2006，5，295-309；Nat.Rev.Endocri.，2006，2，335-348)，如：肥胖、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、高血压、动脉硬化症(antherosclerosis)、血脂异常症(dyslipidemia)(即血液中的甘油三酯水平偏高，高密度脂蛋白同时偏低)等。

本发明所称的“治疗”是指为了阻止和降低疾病的发生或发展，使疾病病程的发展或加重得以抑制、遏制、减轻、改善、减缓、停止、延迟或反转，所描述的保持和/或用药时的疾病的、紊乱的或病理学状态的各种指标包括减轻或减少症状或并发症，或治愈或消除疾病、紊乱或状况。

本发明所称的“治疗糖尿病”是指将本发明组合物用于临床诊断为“糖尿病”的患者，改善这些患者对葡萄糖的耐受，促进肌体对糖代谢的能力，增加肌体对胰岛素的敏感性。进而使得患者的餐后和空腹血糖得以控制在正常的水平。由于对葡萄糖代谢的能力得以提高，从而减缓了因长期高血糖而产生的各种心血管疾病、慢性肾衰竭、视网膜病变、神经病变及微血管病变的发生和发展。

本发明所称的“食品”是指包括本发明提供的各种化合物、组合物或提取物制成可食用的单一化合物或组合物。该种单一化合物或组合物的生产和制造应当符合相关食品安全标准，但是这些食品安全标准不得限定本发明。

本发明所称的“保健品”是指将包括本发明提供的各种化合物、组合物或提取物制成可食用的单一化合物或组合物以施于患者，起到对疾病进行预防和治疗的目的。其属于本发明所称的食品，但其生产、制造和销售还应当符合各种相关的要求、标准和规范。

本发明所称的“药物”是指可以用于预防或治疗某种疾病的单一化合物、多种化合物形成的组合物、中药材及其提取物，或指以单一化合物为主要活性成分的组合物或制剂(formulation)，还指由多种化合物为活性成分的组合物或制剂。“药物”应理解为不仅指根据一国之法律规定，通过其设立的行政机构审批并准予生产的产品，还指在为了获得通过审批和准予生产的过程中，所形成的含单一化合物为活性成分的各类物质形态。“形成”应理解为通过化学合成、生物转化或购买等途径获得。

本发明提供的重组人胰岛素原融合蛋白，是在人胰岛素原C肽与B链、C肽与A链连接处设置furin酶识别位点，还将B链第10个氨基酸由组氨酸替换为天冬氨酸。

一种重组人胰岛素原融合蛋白，其由如SEQ ID No 1所示的序列编码。

另一种重组人胰岛素原融合蛋白，其序列如SEQ ID No 2所示。

本发明的重组人胰岛素原融合蛋白能穿透表皮细胞细胞膜，由上皮细胞将重组人胰岛素原融合蛋白加工成为成熟胰岛素。因此可采用经皮给药的方式，以及口腔黏膜给药(如：口腔贴片)、舌黏膜或舌下给药(如：口含片)、呼吸道黏膜给药(如：喷雾)、阴道黏膜(如：栓剂)和经眼给药(如：眼药水)等方式，以改善患者的糖代谢，尤其是糖尿病患者的血糖水平。

一种组合物，其包括SEQ ID No 2所示的蛋白，以经上皮细胞和黏膜细胞等方式向生物体施以重组人胰岛素原融合蛋白。

一种重组人胰岛素原融合蛋白的制备方法，其由如SEQ ID No 1所示的序列经载体构建、细胞表达、分离和纯化后获得序列如SEQ ID No 2所示的蛋白。

重组人胰岛素原融合蛋白原核表达系统如下：

以大肠杆菌为表达载体，在LB培养基中过夜培养。

过夜培养物于次日以新鲜LB培养基，按1∶1.5～100的比例放大培养，继续发酵1小时～24小时。

超声波破碎大肠杆菌培养物，重组蛋白溶解于含高浓度变性剂(8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍)的破菌缓冲液中。

超声裂解产物0.45μm过滤除去颗粒物，进样到镍螯合琼脂糖层析柱中，流洗除去杂蛋白，以1.0-1000.0mM梯度浓度咪唑洗脱，收集A280nm洗脱峰样品。

重组人胰岛素原融合蛋白以按照1∶100比例采用脉冲法稀释于复性缓冲液中。

复性缓冲液成分为1.0～100.0mM Tris、1.0～100.0mM甘氨酸、1.0～10.0mMEDTA、0.1～1.5M精氨酸、0.1～1.5mM半胱氨酸、1.0～10.0mM胱氨酸，pH＝10.5±0.5。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的重组人胰岛素原融合蛋白，其与现有技术相比，核苷酸序列相似性仅为38.81％，氨基酸序列相似性为61.87％，并首次提供了详细的技术方案、实施方式和实验结果，表明已经获得具有生物学活性的重组人胰岛素原融合蛋白。

本发明提供的重组人胰岛素原融合蛋白，具有更好的稳定性，能高效通过多种生物膜屏障，具有更高的药物吸收率，可经皮吸收、经舌下含服、经黏膜(口腔粘膜、舌黏膜、鼻腔粘膜)吸收，以及经呼吸道黏膜、阴道黏膜吸收。各个器官的促进胰岛素吸收模式各异，吸收效果也不尽相同。

通过简便易行的制备方法，本发明获得了高浓度的具有生物学活性的重组人胰岛素原融合蛋白。

附图说明

图1是本发明重组人胰岛素原融合蛋白的原核表达载体图谱；

图2是本发明重组人胰岛素原融合蛋白纯化与复性方法的流程图；

图3是大肠杆菌表达鉴定，可见表达菌株无论是否经过IPTG诱导均可高效表达目的蛋白。目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中；

图4是穿膜肽-人胰岛素原变异体重组蛋白的纯化，可见漂洗液中不含目的蛋白。随着洗脱液中咪唑浓度的增加，目的蛋白从镍柱上洗脱下来；

图5是重组人胰岛素原融合蛋白的复性结果，图中非还原SDS凝胶电泳图，可见与未复性样品相比，复性蛋白迁移率增加，条带位置在电泳图上前移，说明二硫键形成，该重组蛋白具有二级结构；

图6是重组人胰岛素原融合蛋白二级结构示意图；

图7是免疫荧光染色检测重组人胰岛素原融合蛋白穿过表皮细胞(HaCaT细胞)的细胞膜，进入表皮细胞中，随着孵育时间的延长，穿膜肽-胰岛素原变异体重组蛋白在HaCaT细胞中不断聚集；

图8是表皮细胞(HaCaT细胞)切割掉重组人胰岛素原融合蛋白(分子量为17kDa)的C肽，将其加工为成熟胰岛素；

图9是重组人胰岛素原融合蛋白经皮吸收，其中HA是Anti-HA标签抗体，DAPI是核染料。随着孵育时间的延长，穿膜肽-人胰岛素原变异体重组蛋白逐渐穿过表皮，进入到皮下组织的量逐渐增加；

图10是重组人胰岛素原融合蛋白通过经皮给药方式降血糖，可见给药30分钟时，糖尿病小鼠血糖下降达60％；

图11是重组人胰岛素原融合蛋白通过经眼给药方式降血糖，可见经眼给药1小时后，糖尿病小鼠血糖下降53％。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明涉及分子生物学实验，若没有特别注明，可参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。此外，根据不同实验目的，本领域技术人员在各种商品化试剂盒(Kit)所附带的操作手册的指导下完成相应的实验或委托专业化的公司进行，如：基因测序、质粒测序和确定分子量等。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

实施例1重组人胰岛素原融合蛋白原核表达系统的构建

①携带胰岛素原变异体编码基因的慢病毒质粒pCMV-nFM-hppI4-HD(参见201310138167.X)为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增胰岛素原变异体编码基因，根据表达质粒pTAT-HA(Addgene公司)多克隆酶切位点设计引物，上下游引物分别带有NcoI和EcoRI酶切位点。

②过TA连接(采用TA连接试剂盒，购自全式金公司)，将目的基因连接到扩增质粒T载体上，扩增目的基因质粒。

③分别提取表达质粒pTAT-HA和目的基因质粒，采用限制性内切酶NcoI和EcoRI双酶切这两种质粒。经琼脂糖凝胶电泳后，分别回收目的片段和载体片段。

④用T4连接酶连接目的基因片段和表达质粒载体片段，转化入DH5α感受态中扩增。

⑤提取表达质粒，进行NcoI和EcoRI酶切鉴定，测序确定含改良胰岛素原变异体编码基因的表达质粒构建成功，重组质粒如附图2所示。

⑥将附图2中的表达质粒转化到大肠杆菌(如：BL21(DE3)或BL21(DE3)plys或Rossetta(DE3)等)表达宿主中。

实施例2大肠杆菌表达鉴定

①将空载体转化到表达宿主中，作为对照。

②将对照菌株与表达菌株过夜发酵培养，次日收菌。菌体沉淀直接加SDS上样缓冲液，煮沸变性后作为总蛋白样品。另取菌体沉淀，加入溶菌酶裂菌，离心后收集上清和沉淀，分别加入SDS上样缓冲液。

③将上述所提取的蛋白用15％SDS-PAGE鉴定，如图3所示，可见表达菌株无论是否加入IPTG诱导均可可高效表达目的蛋白。目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。

实施例3重组人胰岛素原融合蛋白质粒的大肠杆菌表达宿主发酵培养

②重组人胰岛素原融合蛋白表达载体的大肠杆菌，在LB培养基中过夜培养。

②过夜培养物于次日加入新鲜LB培养基按1∶1.5～100的比例放大培养，继续发酵1小时～24小时。

实施例4重组人胰岛素原融合蛋白的纯化

①超声波破碎大肠杆菌培养物，重组蛋白溶解于含高浓度变性剂(8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍)的破菌缓冲液中。

②以镍离子金属螯合琼脂糖作为亲和层析介质纯化重组蛋白，以梯度浓度咪唑，在变性条件下洗脱，如图4所示，可见各流穿液中不含目的蛋白，随着咪唑浓度的增加目的蛋白从镍柱上洗脱下来。

实施例5重组人胰岛素原融合蛋白的复性

①制复性缓冲液，成分为1.0～100.0mM Tris、1.0～100.0mM甘氨酸、1.0～10.0mMEDTA、0.1～1.5M精氨酸、0.1～1.5mM半胱氨酸、1.0～10.0mM胱氨酸，pH＝10.5±0.5。

②变性状态的穿膜肽-人胰岛素原变异按照1∶100比例采用脉冲法稀释于复性缓冲液中。如图5所示，非还原Tricine-SDS-PAGE可见复性后的样品较之变性样品在电泳图上稍前移，说明二硫键形成，蛋白具有二级结构。图6是重组人胰岛素原融合蛋白的二级结构示意图。

实施例6重组人胰岛素原融合蛋白穿透表皮细胞的细胞膜。

①24孔板每孔接种6万HaCaT表皮细胞，加0.5mlDMEM高糖培养基，过夜培养.

②取一管穿膜肽-人胰岛素原变异体重组蛋白样品，加入到新鲜培养基中，使其终浓度为0.5uM，继续孵育HaCaT表皮细胞。

③孵育结束，除去培养基，以预冷PBS洗涤细胞，3x5min

④4％多聚甲醛室温下固定细胞15min，。

⑤吸弃多聚甲醛，PBS洗涤细胞每次5min，3次。

⑥以抗体稀释液(0.2％BSA+0.1％Triton X-100)洗涤细胞每次5min，2次。

⑦室温下封闭细胞1小时。封闭液为：1％BSA+0.1％Triton X-100，

⑧封闭结束后，加入抗体Anti-HA tag抗体(1∶500稀释)，4℃孵育过夜。

⑨孵育结束后，PBS洗涤细胞每次5min，3次。

⑩加入荧光标记的Anti-Mouse(Alexa488 Conjugate)抗体(1∶400稀释)，室温下孵育1小时。

孵育结束后，PBS洗涤细胞每次5min，3次。

室温下DAPI染核5min。

PBS洗涤细胞每次5min，3次。

荧光显微镜下观察，拍照。如附图7，随孵育时间的延长，穿膜肽-人胰岛素原变异体重组蛋白在HaCaT细胞聚集逐渐增加。

实施例7上皮细胞将重组人胰岛素原融合蛋白加工成为成熟胰岛素。

①在6cm培养皿中接种60万HaCaT细胞，加3ml高糖培养基，过夜培养。

②第二天，换液，加入含有终浓度为0.5μM的重组人胰岛素原融合蛋白，孵育60min。

③孵育结束，除去培养基，以PBS漂洗细胞每次5min，4次。

③胰酶消化细胞，离心收集细胞。

④接向细胞沉淀加入200μl 2×SDS loading buffer，重悬，煮沸变性10min

⑥电泳分离重组人胰岛素原融合蛋白及其降解产物。

⑦100V，转膜，30分钟。

⑧5％脱脂奶粉封闭室温1h。

⑨Anti-HA tag(1∶10000)抗体4℃过夜孵育。

⑩TBST洗膜每次5min，3次。

辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000稀释)室温下孵育1小时。

TBST洗膜每次5min，3次。

加入发光液体，曝光。如图8，上皮细胞摄入重组人胰岛素原融合蛋白后，出现分子量12kDa的蛋白片段，说明重组人胰岛素原融合蛋白的C肽被切割，形成了为成熟胰岛素。

实施例8重组人胰岛素原融合蛋白透皮转运

①C57BL6/J小鼠4只，腹腔注射10％水合氯醛，300mg/kg。

②用脱毛膏将背部皮肤去净，用PBS将背部皮肤清洗干净。

③取融合蛋白样品适量，滴加在背部皮肤上，涂抹均匀，PBS做对照，孵育0min，5min，10min和30min。

⑤育结束后，脱臼处死小鼠，取下背部皮肤，PBS冲洗，10％中性福尔马林固定

⑥规石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，柠檬酸钠修复，2％BSA封闭，组织免疫荧光检测皮肤组织中的重组人胰岛素原融合蛋白，参见图9。

实施例9重组人胰岛素原融合蛋白通过经皮给药方式降血糖。

①STZ注射C57BL6/J小鼠，制备出糖尿病模型鼠。取糖尿病模型小鼠3只，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，300mg/kg。

②用脱毛膏脱去模型鼠背部皮肤毛囊，用生理盐水将背部皮肤清洗干净。

③取穿膜肽-人胰岛素原变异体重组蛋白样品适量，滴加在背部皮肤上，涂抹均匀。

④尾静脉采血，检测涂抹穿膜肽-人胰岛素原变异体重组蛋白后不同时间：0min、10min、30min、40min、60min、70min、80min、90min血糖水平。如图10所示，重组人胰岛素原融合蛋白经皮给药后，糖尿病小鼠血糖下降达60％。

实施例10重组人胰岛素原融合蛋白通过经眼给药方式降血糖。

①糖尿病模型小鼠(C57BL6/J)3只，腹腔注射10％水合氯醛，300mg/kg。

②小鼠一只眼睛滴加适量融合蛋白样品(浓度为1.744mg/ml，约10μl)。60分钟后，尾静脉采血，检测糖尿病小鼠血糖水平。如图11所示，重组人胰岛素原融合蛋白经眼给药60分钟后，糖尿病小鼠血糖下降53％。

实施例11重组人胰岛素原融合蛋白通过舌下含服方式降血糖。

①STZ注射新西兰大白兔，制备出糖尿病模型兔。取糖尿病兔5只，腹腔注射10％水合氯醛，600mg/kg。

②兔子舌下滴加穿膜肽-人胰岛素原变异体重组蛋白样品0.1ml(约0.08mg/kg)，耳缘静脉采血，检测滴加穿膜肽-胰岛素原变异体重组蛋白后糖尿病兔子血糖水平，给药30min后血糖水平下降28.3％。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 重组人胰岛素原融合蛋白及其制备方法和用途

<130> 8

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> SEQ ID No 1

<211> 676

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaagcaaga cgcctctcct cgcgcgttga ccgattcaaa atgcaggatc tcgatcccgc 60

gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 120

ttaactttaa gaaggagata tacatatgcg gggttctcat catcatcatc atcatggtat 180

ggctagcatg actggtggac agcaaatggg tcgggatctg tacgacgatg acgataagga 240

tcgatgggga tccaagcttg gctacggccg caagaaacgc cgccagcgcc gccgcggtgg 300

atccaccatg tccggctatc catatgacgt cccagactat gctggctcca tggatttcgt 360

gaaccaacac ctgtgcggct cagacctggt ggaagctctc tacctagtgt gtggggaacg 420

aggcttcttc tacacaccca agacccgccg gaagcgagag gacctgcagg tggggcaggt 480

ggagctgggc gggggccctg gtgcaggcag cctgcagccc ttggccctgg aggggtctcg 540

gcggaagcgt ggcattgtgg aacaatgctg taccagcatc tgctccctct accagctgga 600

gaactactgc aactaatagt cctcggaatt cgaagcttga tccggctgct aacaaagccc 660

gaaagagcga ggcata 676

<210> SEQ ID No 2

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr

1 5 10 15

Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp

20 25 30

Arg Trp Gly Ser Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg

35 40 45

Arg Arg Gly Gly Ser Thr Met Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp

50 55 60

Tyr Ala Gly Ser Met Asp Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp

65 70 75 80

Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr

85 90 95

Thr Pro Lys Thr Arg Arg Lys Arg Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val

100 105 110

Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu

115 120 125

Glu Gly Ser Arg Arg Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser

130 135 140

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

145 150 155

Claims (10)

1.一种重组人胰岛素原融合蛋白，其由如SEQ ID No 1所示的序列编码。

2.一种重组人胰岛素原融合蛋白，其序列如SEQ ID No 2所示。

3.一种如权利要求1或2所述重组人胰岛素原融合蛋白在制备预防和治疗糖尿病的药物、食品或保健品中的应用。

4.一种组合物，其包括SEQ ID No 2所示的蛋白。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述的组合物为经皮给药制剂。

6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述的组合物为经眼给药制剂。

7.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述的组合物为经口腔黏膜、舌黏膜和鼻腔黏膜给药制剂。

8.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述的组合物为经呼吸道黏膜给药制剂。

9.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述的组合物为经阴道黏膜给药制剂。

10.一种重组人胰岛素原融合蛋白的制备方法，其由如SEQ ID No 1所示的序列经载体构建、细胞表达、分离和纯化复性后获得序列如SEQ ID No 2所示的蛋白。