CN110964094A - 人源白细胞蛋白酶抑制因子及其重组制备与应用 - Google Patents

人源白细胞蛋白酶抑制因子及其重组制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人源白细胞蛋白酶抑制因子及其重组制备与应用，属于生物医药领域。人源白细胞蛋白酶抑制因子含有的氨基酸序列为：(1)由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；(2)在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列；(3)在SEQ ID NO:1SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述人源白细胞蛋白酶抑制因子活性的氨基酸序列。制备方法为先构建质粒，再进行诱导表达获得融合蛋白，纯化后，再进行复性浓缩。本发明中的蛋白质在制备治疗代谢性疾病药物中具有重要的应用，能减轻体重，抑制脂肪组织重量的增加，并抑制肝脏脂肪变性。

Description

人源白细胞蛋白酶抑制因子及其重组制备与应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及人源白细胞蛋白酶抑制因子及其重组制备与应用，尤其涉及重组人WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白用于制备预防和治疗肥胖及代谢疾病的药物的应用。
背景技术
以肥胖和糖尿病为代表的代谢疾病是我国乃至全世界面临的重大健康问题，给人类带来严重的社会影响和经济负担。中国的糖尿病和肥胖患者人数居全球之首，糖尿病患者约为1.14亿，肥胖患者约8900万。同时，据保守估计，糖尿病前期即糖耐量异常的人群在中国也约为1.4亿，这类人将逐步发展成为糖尿病患者。因此，以肥胖和糖尿病为代表的代谢疾病已成为我国严重的公共健康问题。肥胖是因能量代谢失调而导致的身体多余能量以脂肪的方式累积。产生肥胖的原因有很多，过多能量摄入、能量失衡、遗传背景等都有可能导致肥胖的发生。肥胖及其代谢综合征已成为影响全人类健康的最严重的疾病。然而，目前对于肥胖的治疗干预手段非常有限，治疗肥胖及其并发症的新药研发以及治疗手段亟待需要解决。
脂肪组织是机体的内分泌器官，主要负责机体的能量代谢，同时分泌多种脂肪因子参与众多生理病理过程。随着研究的深入，多种新型脂肪分泌因子在代谢疾病中的作用相继被揭示。人WAP是一种非糖基化阳离子小蛋白，属于内源性免疫相关蛋白。WAP是单链蛋白，分子量12kDa，全长人WAP由132个氨基酸组成，其N端含25个氨基酸组成的信号肽，26-132的活性区域含有2个结构相同的乳清酸性蛋白结构域(whey acidic protein,WAP)，每个WAP由8个半胱氨酸残基形成4个二硫键，使其结构相对稳定。
WAP在生物体组织和细胞内广泛表达。主要在呼吸道、消化道和生殖道等粘膜上皮细胞和骨髓细胞内表达和分泌。WAP能特异性抑制丝氨酸蛋白酶活性，具有抗炎症反应、抗菌、抗病毒活性等。WAP也参与细胞增殖、细胞凋亡和免疫功能的调节作用，在创伤修复发挥重要调控功能。WAP也可以通过抑制NF-κB信号通路激活而参与炎症反应。
近年研究发现，WAP也可以由肝胆管上皮细胞、巨噬细胞分泌，在急性肝损伤疾病的调控中发挥功能。有报道显示，WAP在人内脏白色脂肪组织中高表达，外周分泌的WAP与进行性代谢功能障碍密切相关。由此推测，WAP与相关代谢性疾病的发生和发展密切相关。
目前对肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等多种代谢性疾病的治疗尚缺乏有效的药物。本发明研究了重组人WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白对肥胖中脂肪组织的扩增、肝脏脂肪变性的影响，公开重组人WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白作为治疗代谢疾病的药物的应用潜力。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种重组蛋白WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白，并应用于肥胖和糖尿病等代谢疾病，本发明的WAP蛋白和WAP两个短肽降低体重，减轻脂肪组织重量，对肥胖症有治疗作用，由此解决现有技术对代谢疾病缺乏有效治疗手段的技术问题。
按照本发明的第一方面，提供了一种人源白细胞蛋白酶抑制因子，所述人源白细胞蛋白酶抑制因子含有的氨基酸序列为：
(1)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
(2)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述人源白细胞蛋白酶抑制因子活性的氨基酸序列。
按照本发明的第一方面，提供了一种人源白细胞蛋白酶抑制因子，所述人源白细胞蛋白酶抑制因子含有的氨基酸序列为：
(1)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
(2)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述人源白细胞蛋白酶抑制因子活性的氨基酸序列。
按照本发明的第一方面，提供了一种人源白细胞蛋白酶抑制因子，所述人源白细胞蛋白酶抑制因子含有的氨基酸序列为：
(1)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
(2)在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述人源白细胞蛋白酶抑制因子活性的氨基酸序列。
按照本发明的第一方面，提供了所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子的重组制备方法，包括以下步骤：
(1)设计并合成引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；以人源组织的DNA为模板，经聚合酶链式反应、酶切和连接，构建得到表达含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒诱导表达获得融合蛋白，纯化后，再进行复性浓缩，即得到含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质。
按照本发明的第一方面，提供了所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子的重组制备方法，包括以下步骤：
(1)设计并合成引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；以人源组织的DNA为模板，经聚合酶链式反应、酶切和连接，构建得到表达含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒诱导表达获得融合蛋白，纯化后，再进行复性浓缩，即得到含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质。
按照本发明的第一方面，提供了所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子的重组制备方法，包括以下步骤：
(1)设计并合成引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；以人源组织的DNA为模板，经聚合酶链式反应、酶切和连接，构建得到表达含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒诱导表达获得融合蛋白，纯化后，再进行复性浓缩，即得到含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的蛋白质。
按照本发明的第一方面，提供了任一所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子的重组制备方法，步骤(1)所述质粒中还含有肠激酶位点；步骤(2)所述诱导表达为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达；步骤(2)所述纯化为镍柱纯化。
按照本发明的第一方面，提供了任一所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子在制备治疗代谢性疾病药物的应用。
优选地，所述代谢性疾病为肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂、高胆固醇、冠心病、脂代谢紊乱或非酒精性脂肪肝。
优选地，所述药物用于降低体重、降低肝脏重量、降低脂肪组织重量、减小白色脂肪细胞大小、减小棕色脂肪细胞大小、促进白色脂肪的产热、促进棕色脂肪的产热、促进白色脂肪产热基因的上调、促进棕色脂肪产热基因的上调以及降低肝脏组织的脂质积累。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明的重组人源WAP全长(WAP-FL)参照标准的构建质粒、诱导表达和纯化步骤。设计并合成引物，构建pET-WAP质粒、pET-SWAP1质粒和pET-SWAP2质粒，得到重组质粒后，进行诱导表达和纯化，获得SWAP1蛋白和SWAP2蛋白。
(2)本发明中小鼠在WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射5天后血清中hWAP含量检测值，HFD喂养组小鼠血清中hWAP未能检测到；而注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白组小鼠血清中WAP含量显著性上升，说明小鼠皮下注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白后，会进入体液循环系统。
(3)本发明公开了WAP及其两个短肽在肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等代谢疾病中的新应用。本发明公开了WAP及其两个短肽对高脂食物喂养(HFD)小鼠模型的体重、脂肪重量和脂肪肝的作用，发现WAP及其两个短肽能够显著地减轻高脂喂养小鼠的体重；WAP及其两个短肽增强皮下白色脂肪和棕色脂肪中Ucp1蛋白表达，抑制高脂食物引起的脂肪组织重量增加；并显著抑制肝脏脂肪变性等。本发明的重组人WAP和其两个短肽可作为治疗肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和肥胖等代谢疾病的药物，具有重要的临床应用价值。
(4)本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白能显著地减轻高脂喂养C57BL/6小鼠的体重；同时能抑制高脂食物喂养引起的肝脏及脂肪组织中脂质积累；WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射能够显著升高脂肪组织内Ucp1的蛋白水平。本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白为制备治疗肥胖和糖尿病等代谢疾病药物奠定了基础，为开发出更加有效的治疗药物提供了新思路。
附图说明
图1和图2分别是是本发明的WAP蛋白的一级结构和三级结构。
图3是本发明的WAP蛋白及其两个短肽的详细信息。
图4动物实验设计图。
图5是本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射后的血清WAP含量测试。
图6是本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射后体重的测试。
图7是本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射后摄食量的测试。
图8是本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射后肝脏、附睾白色脂肪、皮下白色脂肪和棕色脂肪组织重量统计。
图9是本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射后各组脂肪组织中脂肪细胞大小的测试。
图10是本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射后白色脂肪和棕色脂肪组织组织Ucp1染色的测试。
图11是本发明的WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射后肝脏脂质积累的测试。
具体实施方式
下面结合具体实验，详细阐述本发明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施方式及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
重组人源白细胞蛋白酶抑制因子WAP、SWAP1、SWAP2蛋白的构建表达和纯化方法，该方法包括下列步骤：
(1)重组质粒pET-WAP，pET-SWAP1，pET-SWAP2的构建A1)根据生物信息网站上公布的序列，设计并合成引物，构建pet-WAP质粒：pET-6*his-肠激酶位点-WAP，引物序列分别是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；pET-SWAP1质粒：pet-6*his-肠激酶位点-SWAP1，引物序列分别是SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；pET-SWAP2质粒：pet-6*his-肠激酶位点-SWAP2，引物序列分别是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；肠激酶位点的作用是在蛋白复性过程中促进蛋白的正确折叠，提高蛋白的复性得率；
A2)提取人肺组织的DNA并以其为模板，采用步骤A1)合成的引物进行PCR扩增(反应程序：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环)，然后利用PCR产物回收试剂盒回收PCR扩增产物；
A3)取步骤A2)回收的PCR扩增产物，用限制性内切酶Sal1/Xhol1酶切，回收约399bp，171bp，150bp的DNA片段；
A4)用限制性内切酶Sal1/Xhol1酶切载体pET-30a，回收载体骨架，将DNA片段和载体骨架连接，得到重组质粒pET-6*his-肠激酶位点-WAP，pET-6*his-肠激酶位点-SWAP1，pET-6*his-肠激酶位点-SWAP2测序鉴定；
(2)WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白的表达和纯化
A1)将待表达的质粒用BL21感受态进行转化，接种于Kana+培养基过夜增菌；37℃摇床培养；过夜培养物接种于大体积新鲜培养基中，当用紫外分光光度计测量OD 600nm＝0.6时，加入IPTG(0.2mM、0.5mM)，而后继续诱导8hr；
A2)取1ml培养物用100μl PBS/灭菌水超声，8％功率，超声5s，停止5s，共超声5次；实验组1ml培养物超声后作为全菌液；另1ml培养物超声后12000rpm，室温离心1min，上清为可溶性蛋白，沉淀为包涵体蛋白；包涵体蛋白再用100μl PBS/灭菌水超声一次；
A3)超声后的蛋白样品分别加入100μl 2*SDS loading buffer，95℃变性10min，收蛋白样品；
A4)进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色鉴定目的蛋白的分布情况；鉴定表明该重组蛋白的表达情况，随后进行大量表达；
A5)6000rpm，78min，4℃离心收菌；用0.1体积的重悬液(20mM Tris-HCl，pH＝8.0，5mM咪唑、500mM NaCl)重悬；
A6)冰浴下超声破菌，超声30min，功率25％(总功率960W)；破菌后加入蛋白酶抑制剂1mM PMSF；10000g，10min，4℃离心收集沉淀，弃上清；沉淀用8M尿素在4℃溶解2小时，低温离心机离心(10000g，10min，4℃)后，收集上清；
A7)使用重悬液洗镍柱，洗2次；后加入已过滤的蛋白上清，4℃结合2小时；去上清，用蛋白洗涤液(20mM Tris-Hcl，pH＝8.0，20mM咪唑、500mM NaCl)洗涤3次镍柱；用蛋白洗脱液(20mM Tris-HCl，pH＝8.0，500mM咪唑、500mM NaCl)洗脱获得目的蛋白；考染鉴定；
A8)按照肠激酶与重组蛋白lμl：50μg的比例，对重组蛋白在4℃下切割16小时；取lml 50％Ni-NTA His结合树脂于试管中，静置分层后弃上清；加入上述重悬液，静置分层后弃上清；加入肠激酶酶切完成后的混合物，4℃磁力低速搅拌30min；于4℃12000g离心1min，取上清即为切除了融合标签的WAP蛋白和WAP两个短肽蛋白，保存于-20℃冰箱；剩余物中加入上述蛋白洗脱液，洗脱下的蛋白12000g，离心1min，该剩余物为切割下的his标签+肠激酶+未切割的融合蛋白，考染鉴定；
(3)蛋白复性浓缩
A1)调整纯化后的蛋白浓度为0.5mg/ml，将融合蛋白置于20倍蛋白体积的透析复性液(含有0.2mM GSSG，2mM GSH，0.6M L-Arg，10％甘油，20mM Tris-cl，1mM EDTA，pH＝8)，放于4℃冰箱中透析，按照6/4/2/1M的梯度依次降低透析复性液中尿素的浓度(每12小时换一次)，最后在不含尿素的复性液中透析2次；
A2)将1L蛋白与6M盐酸胍(1L体积)混合，并在室温下孵育30分钟；而后加入1.23gDTT固体轻轻搅拌，在25℃下继续温育1小时，然后加入114ml 250mM胱氨酸(溶于0.5N NaOH中)于上述混合物中，孵育10min；用5min的时间加入10L含有5.3mM半胱氨酸的50mM Tris溶液的混合物，在25℃中反应16小时，得到WAP蛋白(图1和图2)、SWAP1和SWAP2蛋白(图3)。
实施例2
WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白增加小鼠的血清中hWAP含量。
本发明实施例中使用的C57BL/6小鼠购买于湖北省实验动物中心。小鼠高脂食物喂养是一个经典的模拟2型糖尿病的小鼠模型。在WAP注射前，将年龄在4周大的C57BL/6小鼠进行高脂食物喂养，连续喂养14周。将HFD组小鼠随机分成4组：HFD组注射生理盐水(Saline组)、HFD组注射WAP全长蛋白(WAP组)；HFD组注射WAP短肽1(SWAP1组)；HFD组注射WAP短肽2(SWAP2组)，所注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白序列如图2所示。正式注射WAP和其两个短肽，选取皮下注射方式，每次按照0.2μg/g体重的剂量注射，每天一次，共注射5天，每天对小鼠的摄食量进行监测，动物实验设计如图4。注射5天后，解剖小鼠，收集小鼠血清，用于后续生化指标检测；称重并收取小鼠的肝脏、附睾白色脂肪、皮下白色脂肪、棕色脂肪等，用于后续病理和基因检测分析。
对注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白小鼠的血清进行hWAP含量检测：小鼠在WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射5天后血清中hWAP含量检测值，HFD喂养组小鼠血清中hWAP未能检测到；而注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白组小鼠血清中WAP含量显著性上升(图5)，说明小鼠皮下注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白后，会进入体液循环系统。
实施例3
WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白降低小鼠体重，且不影响小鼠摄食。
在注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白5天后，对小鼠体重相较于注射前的体重变化(△BW)进行统计计算：与HFD+Saline组相比，WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白组小鼠体重有明显下降(图6)；同时对各组小鼠的摄食量(Food intake)进行统计，各组小鼠摄食量之间无显著性差异(图7)，说明短期内注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白可显著减轻高脂食物喂养的C57BL/6小鼠的体重，与此同时，WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射并不影响小鼠体重。
实施例4
WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白显著性降低高脂食物喂养小鼠肝脏、附睾白色脂肪和皮下白色脂肪重量。
注射WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白5天后，解剖小鼠，通过对小鼠的肝脏(Liver)、附睾白色脂肪(eWAT)、皮下白色脂肪(iWAT)、棕色脂肪(BAT)等组织进行称重统计：相较HFD-Saline组，WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白组小鼠liver、eWAT、iWAT重量有显著性降低，而BAT重量无明显变化(图8)。说明短期内注射rhWAP及其两个短肽可降低高脂喂养的C57BL/6小鼠脂肪积累和肝脏重量。
实施例5
WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白能降低高脂食物喂养小鼠的eWAT、iWAT和BAT的脂肪细胞大小。
在HFD条件下，WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射组小鼠eWAT、iWAT、BAT石蜡切片的苏木精-伊红(H&E)染色显示脂肪细胞大小显著减少(图9)。提示WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白能够显著抑制高脂食物喂养引起的脂肪细胞中脂质的积累。
实施例6
WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射能上调高脂食物喂养小鼠的eWAT、iWAT和BAT组织Ucp1的表达量。
在HFD喂养条件下，eWAT、iWAT和BAT组织石蜡切片的Ucp1免疫组化染色显示，WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射组小鼠的eWAT、iWAT和BAT组织中Ucp1表达较HFD-Saline组显著性升高(图10)，结果表明WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射能够显著升高脂肪组织内Ucp1的蛋白水平。
实施例7
WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射能降低高脂食物喂小鼠的肝脏脂质积累。
肝脏切片H&E染色以及肝脏脂肪变性评分结果显示，在HFD喂养条件下，WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射组小鼠肝脏中的脂质积累显著降低(图11)，提示WAP蛋白、SWAP1蛋白和SWAP2蛋白注射后能够显著抑制高脂引起的肝脏中脂质积累。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 1
Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala
1 5 10 15
Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys
20 25 30
Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu
35 40 45
Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys
50 55 60
Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys
65 70 75 80
Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met
85 90 95
Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala
100 105
<210> 2
<211> 57
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala
1 5 10 15
Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys
20 25 30
Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu
35 40 45
Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr
50 55
<210> 3
<211> 50
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 3
Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met
1 5 10 15
Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp
20 25 30
Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala
50
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatgtcgaca aatgtctgga aagtccttc 29
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatctcgagt tatttcacag gggaaacgca g 31
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatgtcgaca agacgacgac gacaagatgt ctggaaagtc cttc 44
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatctcgagt tatgttgggt ttggggtgtc 30
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatgtcgaca agacgacgac gacaagatga ggaggaagcc tgggaagt 48
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatctcgagt taagctttca caggggaaac gcag 34

Claims (10)

1.一种人源白细胞蛋白酶抑制因子，其特征在于，所述人源白细胞蛋白酶抑制因子含有的氨基酸序列为：
(1)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
(2)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述人源白细胞蛋白酶抑制因子活性的氨基酸序列。
2.一种人源白细胞蛋白酶抑制因子，其特征在于，所述人源白细胞蛋白酶抑制因子含有的氨基酸序列为：
(1)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
(2)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述人源白细胞蛋白酶抑制因子活性的氨基酸序列。
3.一种人源白细胞蛋白酶抑制因子，其特征在于，所述人源白细胞蛋白酶抑制因子含有的氨基酸序列为：
(1)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
(2)在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述人源白细胞蛋白酶抑制因子活性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子的重组制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计并合成引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；以人源组织的DNA为模板，经聚合酶链式反应、酶切和连接，构建得到表达含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒诱导表达获得融合蛋白，纯化后，再进行复性浓缩，即得到含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质。
5.如权利要求2所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子的重组制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计并合成引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；以人源组织的DNA为模板，经聚合酶链式反应、酶切和连接，构建得到表达含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒诱导表达获得融合蛋白，纯化后，再进行复性浓缩，即得到含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质。
6.如权利要求3所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子的重组制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计并合成引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；以人源组织的DNA为模板，经聚合酶链式反应、酶切和连接，构建得到表达含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒诱导表达获得融合蛋白，纯化后，再进行复性浓缩，即得到含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的蛋白质。
7.如权利要求4-6任一所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子的重组制备方法，其特征在于，步骤(1)所述质粒中还含有肠激酶位点；步骤(2)所述诱导表达为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达；步骤(2)所述纯化为镍柱纯化。
8.如权利要求1-3任一所述的人源白细胞蛋白酶抑制因子在制备治疗代谢性疾病药物的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述代谢性疾病为肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂、高胆固醇、冠心病、脂代谢紊乱或非酒精性脂肪肝。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物用于降低体重、降低肝脏重量、降低脂肪组织重量、减小白色脂肪细胞大小、减小棕色脂肪细胞大小、促进白色脂肪的产热、促进棕色脂肪的产热、促进白色脂肪产热基因的上调、促进棕色脂肪产热基因的上调以及降低肝脏组织的脂质积累。
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