CN103946388A - Wap结构域融合多肽及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及融合蛋白，其包含含有乳清酸性蛋白(WAP)结构域的多肽和第二多肽。另外，本发明涉及融合蛋白，其包含含有WAP结构域的多肽、第二多肽和第三多肽。本发明融合蛋白的第二和/或第三多肽是Fc多肽；白蛋白多肽；细胞因子靶向多肽；或丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。本发明也涉及在各种治疗性和诊断性适应症中使用所述分子的方法，以及产生所述分子的方法。

Description

WAP结构域融合多肽及其使用方法

相关申请

本申请要求2011年6月28日申请的美国临时申请号61/502052；2011年12月1日申请的美国临时申请号61/565625；和2012年4月25日申请的美国临时申请号61/638168；和2012年4月26日申请的美国临时申请号61/638516的权益。这些申请的每一个的内容通过引用全部结合到本文中。

发明领域

本发明涉及分子、尤其是多肽、更尤其是融合蛋白，其包含含有乳清酸性蛋白(WAP)结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列、以及第二多肽。另外，本发明涉及融合蛋白，其包含含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列、第二多肽、以及第三多肽。具体地讲，本发明涉及融合蛋白，其包含含有WAP结构域的多肽和第二多肽；或融合蛋白，其包括含有WAP结构域的多肽、第二多肽、以及第三多肽，其中本发明融合蛋白的第二和第三多肽可以是以下的至少一个：Fc多肽或衍生自Fc多肽的氨基酸；白蛋白多肽、或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列；细胞因子靶向多肽或衍生自细胞因子靶向多肽的氨基酸序列；和丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的氨基酸序列。本发明也涉及在各种治疗和诊断适应症中使用所述分子的方法、以及产生所述分子的方法。

发明背景

异常丝氨酸蛋白酶活性或蛋白酶与蛋白酶抑制剂不平衡可导致蛋白酶-介导的组织破坏和炎性反应。因此，需要靶向异常丝氨酸蛋白酶活性和/或蛋白酶与蛋白酶抑制剂不平衡的治疗药和治疗。

发明概述

本文所述的融合蛋白包括至少一个包含乳清酸性蛋白(WAP)结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列(多肽1)和第二多肽(多肽2)。此外，本文所述的融合蛋白包括含有乳清酸性蛋白(WAP)结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列(多肽1)、第二多肽(多肽2)和第三多肽(多肽3)。具体地讲，本发明涉及融合蛋白，其包含含有WAP结构域的多肽和第二多肽，或含有WAP结构域的多肽、第二多肽和第三多肽，其中第二和第三多肽可包含以下的至少一种：Fc多肽或衍生自Fc多肽的氨基酸；白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列；细胞因子靶向多肽或衍生自细胞因子靶向多肽的氨基酸序列；和丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的氨基酸序列。

本文中可互换使用的术语“融合蛋白”和“融合多肽”是指与至少第二多肽或衍生自第二多肽的氨基酸序列操作性连接的含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列。所述融合蛋白的个性化元件(individualized element)可以各种方式中的任一种连接，所述方式包括例如直接连接，使用媒介物或间隔肽，使用接头区，使用铰链区或同时使用接头和铰链区。在某些实施方案中，接头区可以落入铰链区序列内，或者，铰链区可以落入接头区序列内。优选地，接头区是肽序列。例如，接头肽包含0-40个氨基酸的任何一处，例如0-35个氨基酸、0-30个氨基酸、0-25个氨基酸、或0-20个氨基酸。优选地，铰链区是肽序列。例如，铰链肽包含0-75个氨基酸的任何一处，例如0-70个氨基酸、0-65个氨基酸或0-62个氨基酸。在融合蛋白同时包含接头区和铰链区的实施方案中，优选接头区和铰链区各自是肽序列。在这些实施方案中，铰链肽和接头肽一起包括0-90个氨基酸的任何一处，例如0-85个氨基酸或0-82个氨基酸。

在某些实施方案中，融合蛋白的基于WAP结构域的部分和基于第二多肽的部分可通过媒介结合多肽而非共价连接。在某些实施方案中，融合蛋白的基于WAP结构域的部分和基于第二多肽的部分可以是非共价连接的。

在某些实施方案中，本发明的融合蛋白可具有以N-端到C-端方向或以C-端到N-端方向的下式之一：

多肽1_(a) – 铰链 _m –多肽2_(b)

多肽1_(a) – 接头 _n –多肽2_(b)

多肽1_(a) – 接头 _n – 铰链 _m –多肽2_(b)

多肽1_(a) – 铰链 _m – 接头 _n –多肽2_(b)

多肽1_(a) –多肽2_(b)–多肽3_(c)

多肽1_(a) – 铰链 _m –多肽2_(b)– 铰链 _m –多肽3_(c)

多肽1_(a) – 接头 _n –多肽2_(b)– 接头 _n –多肽3_(c)

多肽1_(a) – 铰链 _m – 接头 _n –多肽2_(b)–铰链 _m – 接头 _n –多肽3_(c)多肽1_(a) – 接头 _n – 铰链 _m –多肽2_(b)– 接头 _n – 铰链 _m –多肽3_(c)

其中n是0-20的整数，其中m是1-62的整数，其中a、b和c是至少1的整数。这些实施方案包括上式及其任何变化或组合。例如，式中多肽的顺序也包括多肽3_(c) –多肽1_(a)–多肽2_{(b) 、}多肽2_(b) –多肽3_(c)–多肽1_(a)或其任何变化或组合。

在某些实施方案中，所述多肽1序列包含含有乳清酸性蛋白(WAP)结构域的多肽。WAP结构域是50个氨基酸的进化保守的序列基序，在以特征性的4-二硫键核心排列(也称为4-二硫键核心基序)中发现含有8个半胱氨酸。WAP结构域序列基序是功能基序，其特征在于在多种蛋白中的丝氨酸蛋白酶抑制活性。适用于本文提供的融合蛋白的含有WAP结构域的多肽，以非限制性实例方式包括分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、弹性蛋白酶抑制剂(Elafin)和附睾蛋白酶抑制剂(Eppin)。

在某些实施方案中，所述多肽1序列包含分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)多肽序列或衍生自SLPI的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多肽1序列包含SLPI蛋白部分，例如，WAP2结构域或其亚部分。在一个优选的实施方案中，SLPI多肽序列或衍生自SLPI的氨基酸序列衍生自人SLPI多肽序列。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含具有以下氨基酸序列的全长人SLPI多肽序列：

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含人SLPI多肽序列，其与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含全长人SLPI多肽序列部分，其中所述部分具有以下氨基酸序列：

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含人SLPI多肽序列，其与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含全长人SLPI多肽序列的WAP2结构域，其中WAP2结构域具有以下氨基酸序列：

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含人SLPI多肽序列，其与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施方案中，SLPI多肽序列或衍生自SLPI多肽的氨基酸序列是衍生自GenBank登记号CAA28187.1, NP_003055.1, EAW75869.1, P03973.2, AAH20708.1, CAB64235.1, CAA28188.1, AAD19661.1和/或BAG35125.1所示的人SLPI多肽序列的一个或多个。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含具有以下氨基酸序列的全长人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列：

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列，其与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含全长人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列部分，其中所述部分具有以下氨基酸序列：

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列，其与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含全长人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列的WAP结构域，其中所述WAP结构域具有以下氨基酸序列：

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列，其与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施方案中，弹性蛋白酶抑制剂多肽序列或衍生自弹性蛋白酶抑制剂多肽的氨基酸序列是衍生自GenBank登记号P19957.3, NP_002629.1, BAA02441.1, EAW75814.1, EAW75813.1, Q8IUB2.1和/或NP_542181.1所示的人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列的一个或多个。

在某些实施方案中，所述多肽1序列包含附睾蛋白酶抑制剂多肽序列或衍生自附睾蛋白酶抑制剂的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多肽1序列包含附睾蛋白酶抑制剂蛋白的部分，例如，WAP结构域或其亚部分。在一个优选的实施方案中，附睾蛋白酶抑制剂多肽序列或衍生自附睾蛋白酶抑制剂的氨基酸序列是衍生自人附睾蛋白酶抑制剂多肽序列。

在某些实施方案中，附睾蛋白酶抑制剂多肽序列或衍生自附睾蛋白酶抑制剂多肽的氨基酸序列是衍生自GenBank登记号O95925.1, NP_065131.1, AAH44829.2, AAH53369.1, AAG00548.1, AAG00547.1和/或AAG00546.1所示的人附睾蛋白酶抑制剂多肽序列的一个或多个。

在某些实施方案中，所述融合蛋白含有一个或多个突变。例如，所述融合蛋白在融合蛋白的非-Fc部分例如在融合蛋白的SLPI部分中含有至少一个在甲硫氨酸 (Met) 残基上的突变。在这些Met突变中，所述Met残基可被任何氨基酸取代。例如，所述Met残基可以被具有疏水性侧链的氨基酸取代，所述氨基酸例如亮氨酸 (Leu, L)或缬氨酸(Val, V)。不希望受到理论的束缚，所述Met突变阻止本发明融合蛋白的氧化和随后的抑制活性的失活。在某些实施方案中，所述Met突变是在SLPI多肽的位置98，例如，所述Met突变是SEQ ID NO: 8的Met98Leu (M98L)。

在某些实施方案中，修饰融合蛋白以增加或另外抑制蛋白水解性裂解，例如，通过使蛋白水解性裂解位点突变。在某些实施方案中，蛋白水解性裂解位点突变发生在融合蛋白的SLPI部分的残基上。例如，蛋白水解性裂解位点突变发生在SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中选自Ser15、Ala16、Glu17及其组合的残基上。

在某些实施方案中，含有WAP结构域的融合蛋白的第二多肽(多肽2)是Fc多肽或衍生自Fc多肽。这些实施方案在本文中统称为“WAP-Fc融合蛋白”。本文所述的WAP-Fc融合蛋白包括至少一个含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列和Fc多肽或衍生自Fc多肽的氨基酸序列。

在某些实施方案中，WAP-Fc融合蛋白包含单个含有WAP结构域的多肽。在其它实施方案中，WAP-Fc融合蛋白包括不止一个含有WAP结构域的多肽，其在本文中统称为“WAP_{(a ′ )}-Fc融合蛋白”，其中(a′)是至少2的整数。在某些实施方案中，WAP_{(a ′ )}-Fc融合蛋白中的含有WAP结构域的多肽可包含相同氨基酸序列。例如，WAP_{(a ′ )}-Fc融合蛋白的含有WAP结构域的多肽可衍生自SLPI或弹性蛋白酶抑制剂多肽，但并非两者(例如，弹性蛋白酶抑制剂-Fc-弹性蛋白酶抑制剂，或SLPI-Fc-SLPI)。在其它实施方案中，WAP_{(a ′ )}-Fc融合蛋白中的含有WAP结构域的多肽可包含不同氨基酸序列。例如，融合蛋白包括衍生自SLPI和弹性蛋白酶抑制剂两者的氨基酸序列(例如SLPI-Fc-弹性蛋白酶抑制剂、或弹性蛋白酶抑制剂-Fc-SLPI)。

在某些实施方案中，WAP-Fc融合蛋白的含有WAP结构域的多肽衍生自SEQ ID NO 1-6的氨基酸序列的任一个。在某些实施方案中，WAP-Fc融合蛋白的含有WAP结构域的多肽与具有SEQ ID NO. 1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的任一个具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

在某些实施方案中，WAP-Fc融合蛋白的含有WAP结构域的多肽序列是或衍生自：GenBank登记号CAA28187.1, NP_003055.1, EAW75869.1, P03973.2, AAH20708.1, CAB64235.1, CAA28188.1, AAD19661.1, BAG35125.1., P19957.3, NP_002629.1, BAA02441.1, EAW75814.1, EAW75813.1, Q8IUB2.1和/或NP_542181.1., O95925.1, NP_065131.1, AAH44829.2, AAH53369.1, AAG00548.1, AAG00547.1和/或AAG00546.1所示的序列。

在某些实施方案中，WAP-Fc融合蛋白的Fc多肽是人Fc多肽，例如，人IgG Fc多肽序列或衍生自人IgG Fc多肽序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc多肽是人IgG1 Fc多肽或衍生自人IgG1 Fc多肽序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc多肽是人IgG2 Fc多肽或衍生自人IgG2 Fc多肽序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc多肽是人IgG3 Fc多肽或衍生自人IgG3 Fc多肽序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc多肽是人IgG4 Fc多肽或衍生自人IgG4 Fc多肽序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc多肽是人IgM Fc多肽或衍生自人IgM Fc多肽序列的氨基酸序列。

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含具有以下氨基酸序列的人IgG1 Fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含人IgG1 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含具有以下氨基酸序列的人IgG2 Fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含人IgG2 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含具有以下氨基酸序列的人IgG3 Fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含人IgG3 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含具有以下氨基酸序列的人IgG4 Fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含人IgG4 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含具有以下氨基酸序列的人IgM Fc多肽序列：

在本发明的融合蛋白包含Fc多肽的某些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包含人IgM Fc多肽序列，其与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在本文所提供的融合蛋白的某些实施方案中，含有WAP结构域的融合蛋白的第二多肽(多肽2)是细胞因子靶向多肽，或衍生自细胞因子靶向多肽。这些实施方案在本文中统称为“WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白”。本文所述的WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白包含至少一个含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽，或其衍生物。在某些实施方案中，WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白包含单个含有WAP结构域的多肽。在其它实施方案中，WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白包含多于一个含有WAP结构域的多肽，并且这些实施方案在本文中统称为“WAP_{(a ′ )}-细胞因子靶向多肽融合蛋白”，其中(a′)是至少2的整数。在某些实施方案中，WAP_{(a ′ )}-细胞因子靶向多肽融合蛋白中的每个含有WAP结构域的多肽可包含相同氨基酸序列。在其它实施方案中，WAP_{(a ′ )}-细胞因子靶向多肽融合蛋白的每个含有WAP结构域的多肽可包含不同氨基酸序列。

在某些实施方案中，WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白的含有WAP结构域的多肽衍生自SEQ ID NO 1-6的氨基酸序列中的任一个。在某些实施方案中，WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白的含有WAP结构域的多肽与具有SEQ ID NO. 1、2、3、4、5或6的氨基酸序列中的任一个具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

在某些实施方案中，WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白的含有WAP结构域的多肽序列是或衍生自：GenBank登记号CAA28187.1, NP_003055.1, EAW75869.1, P03973.2, AAH20708.1, CAB64235.1, CAA28188.1, AAD19661.1, BAG35125.1., P19957.3, NP_002629.1, BAA02441.1, EAW75814.1, EAW75813.1, Q8IUB2.1和/或NP_542181.1., O95925.1, NP_065131.1, AAH44829.2, AAH53369.1, AAG00548.1, AAG00547.1和/或AAG00546.1所示的序列。

在某些实施方案中，WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白的细胞因子靶向多肽是细胞因子受体或衍生自细胞因子受体。在一个优选的实施方案中，细胞因子靶向多肽是衍生自细胞因子受体(其衍生自人细胞因子受体序列)的氨基酸序列。在其它实施方案中，细胞因子靶向多肽是抗体或抗体片段，例如抗细胞因子抗体或抗细胞因子抗体片段。术语抗体片段包括单链、Fab片段、F(ab')₂片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。在一个优选的实施方案中，细胞因子靶向多肽是衍生自抗体或抗体片段(其衍生自嵌合、人源化或完全人抗体序列)的氨基酸序列。在其它实施方案中，细胞因子靶向多肽与细胞因子受体结合并阻止细胞因子与所述受体结合。

WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白可包括WAP-Fc融合蛋白的一部分。例如，抗体含有Fc多肽。因此，在细胞因子靶向多肽是细胞因子-靶向抗体的某些实施方案中，WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白将包括WAP-Fc融合蛋白的一部分。此外，具有治疗效用的大部分受体融合蛋白是Fc融合蛋白。因此，在WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白是WAP-细胞因子受体融合蛋白的某些实施方案中，除了含有WAP结构域的多肽部分和所述细胞因子受体部分之外，WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白还可包括Fc多肽。

在WAP-细胞因子靶向多肽融合蛋白包含Fc多肽序列的某些实施方案中，所述Fc多肽序列衍生自具有SEQ ID NO. 7、8、9、10或11的氨基酸序列中的任一个。在WAP-细胞因子靶向融合蛋白包含Fc多肽序列的某些实施方案中，Fc多肽序列与具有SEQ ID NO. 7、8、9、10或11的序列的任一个的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

在某些实施方案中，含有WAP结构域的多肽和细胞因子靶向多肽经由接头区操作性连接，所述接头区例如甘氨酸-丝氨酸接头或基于甘氨酸-丝氨酸的接头。在某些实施方案中，含有WAP结构域的多肽和细胞因子靶向多肽经由铰链区操作性连接。在某些实施方案中，含有WAP结构域的多肽和细胞因子靶向多肽经由接头区和铰链区操作性连接。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和细胞因子靶向多肽直接连接。

在本文所提供的融合蛋白的某些实施方案中，含有WAP结构域的融合蛋白的第二多肽(多肽2)是丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。这些实施方案在本文中统称为“WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白”。本文所述的WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白包含至少一个含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列、和丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的氨基酸序列。

在某些实施方案中，WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的含有WAP结构域的多肽衍生自SEQ ID NOs 1-6的氨基酸序列的任一个。在某些实施方案中，WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的含有WAP结构域的多肽与具有SEQ ID NO. 1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的任一个具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

在某些实施方案中，WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的含有WAP结构域的多肽序列是或衍生自：GenBank登记号CAA28187.1, NP_003055.1, EAW75869.1, P03973.2, AAH20708.1, CAB64235.1, CAA28188.1, AAD19661.1, BAG35125.1., P19957.3, NP_002629.1, BAA02441.1, EAW75814.1, EAW75813.1, Q8IUB2.1和/或NP_542181.1., O95925.1, NP_065131.1, AAH44829.2, AAH53369.1, AAG00548.1, AAG00547.1和/或AAG00546.1所示的序列。

本文所述的WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白包含含有WAP结构域的多肽和丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的氨基酸序列。丝氨酸蛋白酶抑制剂是一组具有类似结构的蛋白质，其最初被鉴定为能够抑制蛋白酶的一组蛋白质。适用于本文所提供的融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白以非限制性实例的方式包括：α-1抗胰蛋白酶(AAT)、抗胰蛋白酶-相关蛋白(SERPINA2)、α1-抗凝乳蛋白酶(SERPINA3)、kallistatin (SERPINA4)、单核细胞嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(SERPINB1)、PI-6 (SERPINB6)、抗凝血酶(SERPINC1)、纤溶酶原激活物抑制剂1 (SERPINE1)、α 2-抗纤溶酶(SERPINF2)、补体1-抑制剂(SERPING1)和神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINI1)。

在某些实施方案中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽序列包含α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽序列或衍生自AAT的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽序列包含AAT蛋白的一部分。在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽序列包含至少AAT蛋白的反应位点环部分。在本发明的融合蛋白包含丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的某些实施方案中，融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包含AAT蛋白的反应位点环部分或包括至少氨基酸序列GTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNK (SEQ ID NO: 12)。在一个优选的实施方案中，AAT多肽序列是衍生自AAT (其衍生自人AAT多肽序列)的氨基酸序列。在本发明的融合蛋白包含丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的某些实施方案中，融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包含AAT蛋白的反应位点环部分的修饰变体或包含至少氨基酸序列GTEAAGAEFLEAIPLSIPPEVKFNK (SEQ ID NO: 38)。

在WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包含具有以下氨基酸序列的全长人AAT多肽序列：

在WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包含人AAT多肽序列，其与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包含AAT多肽序列或衍生自AAT多肽的氨基酸序列或是衍生自GenBank登记号AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172所示的人AAT多肽序列的一个或多个。

在某些实施方案中，WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域融合蛋白也可包含Fc多肽或衍生自Fc多肽的氨基酸序列。这些实施方案在本文中统称为“WAP-Fc-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白”。在这些实施方案中，该术语不限定特定顺序。例如，所述融合蛋白的顺序可以是WAP-Fc-丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP-Fc、或其任何变化或组合。本文所述的WAP-Fc-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白包含至少一个含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列、丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的氨基酸序列、和Fc多肽或衍生自Fc多肽的氨基酸序列.

在WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽融合蛋白包含Fc多肽序列的某些实施方案中，Fc多肽序列衍生自具有SEQ ID NO. 7、8、9、10,或11的氨基酸序列的任一个。在WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白包含Fc多肽序列的某些实施方案中，Fc多肽序列与具有SEQ ID NO. 7、8、9、10或11的序列的任一个的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

在某些实施方案中，WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域融合蛋白也可包含白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。这些实施方案在本文中统称为“WAP-白蛋白-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白”。在这些实施方案中，该术语不限定特定顺序。例如，所述融合蛋白的顺序可以是WAP-白蛋白-丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白-WAP、或其任何变化或组合。本文所述的WAP-白蛋白-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白包含至少一个含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列、丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列和白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。

在WAP-丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域融合蛋白包含白蛋白多肽序列的某些实施方案中，白蛋白多肽序列衍生自SEQ ID NO. 14-15的氨基酸序列的任一个，如本文所述。在丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白包含白蛋白多肽序列的其它实施方案中，白蛋白多肽序列与具有SEQ ID NO. 14或15的氨基酸序列的任一个具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

在本文提供的融合蛋白的某些实施方案中，含有WAP结构域的融合蛋白的第二多肽(多肽2)是白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽。这些实施方案在本文中统称为“WAP-白蛋白融合蛋白”。本文所述的WAP-白蛋白融合蛋白包含至少一个含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列和白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。此外，本发明涉及含有WAP结构域的多肽白蛋白结合多肽融合蛋白，其中白蛋白与含有WAP结构域的多肽经由媒介结合分子操作性连接。在此，含有WAP结构域的多肽与人血清白蛋白非共价或共价结合。

在某些实施方案中，WAP-白蛋白融合蛋白的含有WAP结构域的多肽衍生自SEQ ID NO 1-6的氨基酸序列的任一个。在某些实施方案中，WAP-白蛋白融合蛋白的含有WAP结构域的多肽与具有SEQ ID NO. 1、2、3、4、5或6的氨基酸序列的任一个具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

在某些实施方案中，WAP-白蛋白融合蛋白的含有WAP结构域的多肽序列是或衍生自：GenBank登记号CAA28187.1, NP_003055.1, EAW75869.1, P03973.2, AAH20708.1, CAB64235.1, CAA28188.1, AAD19661.1, BAG35125.1., P19957.3, NP_002629.1, BAA02441.1, EAW75814.1, EAW75813.1, Q8IUB2.1和/或NP_542181.1., O95925.1, NP_065131.1, AAH44829.2, AAH53369.1, AAG00548.1, AAG00547.1和/或AAG00546.1所示的序列。

在本发明的融合蛋白包含白蛋白多肽序列的某些实施方案中，所述融合蛋白的白蛋白多肽序列是人血清白蛋白(HSA)多肽或衍生自HSA的氨基酸序列。在本发明的融合蛋白包含白蛋白多肽序列的某些实施方案中，所述融合蛋白的白蛋白多肽序列，所述融合蛋白包含具有以下氨基酸序列的HSA多肽序列：

在本发明的融合蛋白包含白蛋白多肽序列的某些实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包含人血清白蛋白多肽序列，其与SEQ ID NO: 14的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在WAP-白蛋白融合蛋白的某些实施方案中，白蛋白多肽序列包含具有以下氨基酸序列的人血清白蛋白多肽序列的结构域3：

在WAP-白蛋白融合蛋白的某些实施方案中，白蛋白多肽序列包含人血清白蛋白多肽序列，其与SEQ ID NO: 15的氨基酸序列具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

在某些实施方案中，含有WAP结构域的多肽经由媒介白蛋白结合多肽与人血清白蛋白连接。所述白蛋白结合多肽可以是抗体或抗体片段或衍生自抗体或抗体片段。在一个优选的实施方案中，白蛋白结合多肽是衍生自所述抗体或抗体片段(其衍生自嵌合抗体序列、人源化抗体序列、或完全人抗体序列)的氨基酸序列。该术语抗体片段包含单链、Fab片段、F(ab')₂片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。此外，所述白蛋白结合多肽可以是白蛋白结合肽。本发明的另一实施方案是含有WAP结构域的多肽-白蛋白结合多肽融合物，其中所述白蛋白结合多肽是链球菌蛋白G的结构域3或衍生自链球菌蛋白G的结构域3的序列。在其它实施方案中，含有WAP结构域的多肽和人血清白蛋白直接连接。

在某些实施方案中，所述融合蛋白含有一个或多个突变。例如，所述融合蛋白在融合蛋白的非-Fc部分例如在融合蛋白的SLPI部分中含有至少一个在甲硫氨酸(Met)残基上的突变。在这些Met突变中，Met残基可被任何氨基酸取代。例如，Met残基可以被具有疏水性侧链的氨基酸取代，所述氨基酸例如亮氨酸(Leu, L)或缬氨酸(Val, V)。不希望受到理论的束缚，所述Met突变阻止本发明融合蛋白的氧化和随后的抑制活性的失活。在某些实施方案中，所述Met突变是在SLPI多肽的位置98。例如，发生在SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的残基上的Met突变是Met98Leu (M98L)。

在某些实施方案中，修饰融合蛋白以增加或另外抑制蛋白水解性裂解，例如，通过使蛋白水解性裂解位点突变。在某些实施方案中，蛋白水解性裂解位点突变发生在融合蛋白的SLPI部分的残基上。例如，蛋白水解性裂解位点突变发生在SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中选自Ser15、Ala16、Glu17及其组合的残基上。

在某些实施方案中，修饰融合蛋白以改变或另外调节融合蛋白的Fc效应子功能，而与未改变的融合蛋白相比，同时又保留结合和抑制功能。Fc效应子功能以非限制性实例的方式包括Fc受体结合、在与Fc受体结合后阻止促炎介质的释放、吞噬作用、经修饰的抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)、经修饰的补体-依赖性细胞毒性(CDC)、在Fc多肽的Asn297残基的经修饰的糖基化(Kabat编号的EU指数，Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest)。在某些实施方案中，使融合蛋白突变或另外经修饰以影响Fc受体结合。在某些实施方案中，修饰Fc多肽以增强FcRn结合。增强与FcRn结合的Fc多肽突变的实例是Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu (M252Y、S256T、T256E) (Kabat编号，Dall’Acqua等人，2006, J. Biol Chem Vol 281(33) 23514–23524)，或Met428Leu和Asn434Ser (M428L, N434S) (Zalevsky等人，2010 Nature Biotech, Vol 28(2) 157-159)。(EU指数，Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest)。

本文提供的融合蛋白及其变体表现出抑制活性，例如通过抑制丝氨酸蛋白酶例如人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)，所述酶是在炎性反应期间由嗜中性粒细胞分泌的一种胰凝乳蛋白酶-折叠丝氨酸蛋白酶(chemotrypsin-fold serine protease)。本文提供的融合蛋白在与丝氨酸蛋白酶例如人丝氨酸蛋白酶结合或另外与其相互作用之后完全或部分地降低或另外调节丝氨酸蛋白酶表达或活性。在融合蛋白与人丝氨酸蛋白酶蛋白,多肽和/或肽之间相互作用之后，丝氨酸蛋白酶生物功能的降低或调节是完全的或部分的。当与相互作用(例如与本文所述的融合蛋白结合)不存在时的丝氨酸蛋白酶表达或活性水平相比，在融合蛋白存在时的丝氨酸蛋白酶表达或活性水平降低达至少95%，例如96%、97%、98%、99%或100%时，就认为所述融合蛋白完全地抑制了丝氨酸蛋白酶表达或活性。当与相互作用(例如与本文所述的融合蛋白结合)不存在时的丝氨酸蛋白酶表达或活性水平相比，在融合蛋白存在时的丝氨酸蛋白酶表达或活性水平降低小于95%、例如10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%或90%时，就认为融合蛋白部分地抑制了丝氨酸蛋白酶表达或活性。

本文所述的融合蛋白可用于各种治疗性、诊断性和预防性适应症。例如，融合蛋白可用于在受试者中治疗各种疾病和病症。在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白可用于在罹患或经鉴定处于选自以下疾病或病症的风险之中的受试者中治疗所述疾病或病症、缓解其症状、改善和/或延迟其发展：α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺癌、缺血-再灌注损伤(包括例如心脏移植后的缺血/再灌注损伤)、心肌梗塞、关节炎、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病性关节炎、关节强直性脊椎炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、银屑病、I型和/或II型糖尿病、细菌感染、真菌感染、病毒感染、肺炎、脓毒病、移植物抗宿主病(GVHD)、创伤愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化。

本文提供的融合蛋白及其变体表现出抑制活性，例如通过抑制丝氨酸蛋白酶。本文提供的融合蛋白在与丝氨酸蛋白酶例如人丝氨酸蛋白酶结合或另外与其相互作用之后完全或部分地降低或另外调节丝氨酸蛋白酶表达或活性。在融合蛋白与人丝氨酸蛋白酶蛋白,多肽和/或肽之间相互作用之后，丝氨酸蛋白酶生物功能的降低或调节是完全的或部分的。当与相互作用(例如与本文所述的融合蛋白结合)不存在时的丝氨酸蛋白酶表达或活性水平相比，在融合蛋白存在时的丝氨酸蛋白酶表达或活性水平降低达至少95%，例如96%、97%、98%、99%或100%时，就认为所述融合蛋白完全地抑制了丝氨酸蛋白酶表达或活性。当与相互作用(例如与本文所述的融合蛋白结合)不存在时的丝氨酸蛋白酶表达或活性水平相比，在融合蛋白存在时的丝氨酸蛋白酶表达或活性水平降低小于95%，例如10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%或90%时，就认为融合蛋白部分地抑制了丝氨酸蛋白酶表达或活性。

本发明的药物组合物可包含本发明的融合蛋白，包括修饰的融合蛋白和其它变体，以及合适的载体。可将这些药物组合物包括到试剂盒例如诊断试剂盒中。

附图简述

图1A是本发明的含有WAP结构域的多肽-Fc融合蛋白的某些实施方案的示意图。含有WAP结构域的多肽可位于融合蛋白的任何位置上。也给出了包括多于一个含有WAP结构域的多肽的这些融合蛋白的变体。图1B是SDS-PAGE凝胶照片，显示弹性蛋白酶抑制剂-Fc1 (第1道, 人IgG1 Fc)和SLPI-Fc1 (第2道, 人IgG1 Fc)。图1C是一幅图，显示了弹性蛋白酶抑制剂-Fc和SLPI-Fc融合蛋白对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的抑制。图1D是SDS-PAGE凝胶照片，显示由弹性蛋白酶抑制剂-Fc-SLPI组成的融合蛋白。图1E是一幅图，显示了弹性蛋白酶抑制剂-Fc-SLPI对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的抑制。显示血清衍生的AAT作为NE抑制的对照。图1F是一幅图，显示重组SLPI随时间的血清浓度，与给予10mg/kg蛋白的大鼠(每种测试蛋白3只)中的SLPI-Fc相比。SLPI-Fc的半寿期明显比重组SLPI的更长。

图2A是本发明的含有WAP结构域的多肽-细胞因子靶向融合蛋白的某些实施方案的示意图。可将含有WAP结构域的多肽与抗体的重链、轻链、或者这两者融合。也描述了含有WAP结构域的多肽-细胞因子受体融合蛋白。图2B是SDS-PAGE凝胶照片，显示了D2E7抗体(第1道)、SLPI融合到重链的D2E7抗体(第2道)、和SLPI融合到轻链的D2E7抗体(第3道)。图2C是一幅图，显示了在重链或者轻链上与SLPI融合的D2E7抗体对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的抑制。显示血清衍生的AAT和阳性对照，而单独D2E7抗体显示为NE抑制的阴性对照。

图3A是丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc-WAP融合蛋白的某些实施方案的示意图。图3B是SDS-PAGE凝胶的照片，显示了AAT-Fc-弹性蛋白酶抑制剂(第1道)和AAT-Fc-SLPI (第2道)。图3C是一幅图，显示了AAT-Fc-弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白和AAT-Fc-SLPI融合蛋白对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的抑制。包括了AAT-Fc融合蛋白和血清衍生的AAT，用于比较。

图4是含有WAP结构域的多肽-HSA融合蛋白的某些实施方案的示意图。

发明详述

乳清酸性蛋白(WAP)结构域是大约50个氨基酸的基序，特征在于在指定位置上的8个保守半胱氨酸，其构成4个二硫键(Ranganathan等人，1999 J. Mol. GraphicsModell. 17, 134–136)。WAP结构域的最充分表征的功能就是丝氨酸蛋白酶抑制。若干含有WAP结构域的蛋白参与多种上皮表面的先天免疫保护作用(Abe等人，1991 J. Clin. Invest. 87(6): 2207–15；Maruyama等人，1994 J Clin Invest. 94(1):368–375；Si-Tahar等人，2000 Gastroenterology 118(6): 1061–71；King等人，2003 Reproductive Biology 和 Endocrinology 1:116)。已经证明了这些蛋白中的某些具有抗菌活性。示例性的含有WAP结构域的蛋白是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、弹性蛋白酶抑制剂和附睾蛋白酶抑制剂。

SLPI基因和弹性蛋白酶抑制剂基因是trappin基因家族成员。由trappin基因成员编码的蛋白，其特征在于N-端转谷氨酰胺酶结构域基质(substrate)和C-端WAP结构域(Schalkwijk等人，1999Biochem. J. 340:569–577)。SLPI和弹性蛋白酶抑制剂都是嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的抑制剂，然而却具有稍微不同的目标蛋白酶。尽管SLPI和弹性蛋白酶抑制剂都是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的强有效抑制剂，但是SLPI还抑制组织蛋白酶G，却不抑制蛋白酶-3，而弹性蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶-3，却不抑制组织蛋白酶G (Eisenberg等人， 1990 J. Biol. Chem. 265, 7976–7981, Rao等人，1993 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 8, 612–616, Ying等人，2001 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 83–89)。另外，弹性蛋白酶抑制剂抑制内源血管弹性蛋白酶(EVE)，由患病的血管组织产生的一种丝氨酸蛋白酶(Rabinovitch, M. 1999 Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 277, L5–L12；Cowan,等人，1996 J. Clin. Invest. 97,2452–2468)。

炎症和损伤期间，自嗜中性粒细胞释放的蛋白酶通常通过降解ECM、产生趋化肽、MMP活化和诱导蛋白水解和促炎性细胞因子信号转导级联而起到放大炎性反应的作用。SLPI和弹性蛋白酶抑制剂代表了炎性信号转导的内源调节剂，其起到在局部炎症部位预防过度炎症并保护组织免遭蛋白水解破坏的作用。

在众多体外和体内，SLPI和弹性蛋白酶抑制剂都证明了维持广泛的抗炎性质(Doumas等人，2005.Infect Immun 73, 1271-1274；Williams等人，2006 Clin Sci (Lond) 110, 21-35, Scott等人，2011 Biochem. Soc. Trans. 39(5) 1437–1440；Shaw和Wiedow, 2011 Biochem. Soc. Trans. 39, 1450–1454)。尽管这些蛋白的许多抗炎活性是因为蛋白酶抑制，但是SLPI和弹性蛋白酶抑制剂都具有独立于直接蛋白酶抑制的抗炎能力。例如，这两者都结合细菌LPS并通过巨噬细胞阻止其与CD14结合和下游信号转导(Ding等人，1999 Infect. Immun. 67 4485-4489, McMichael等人，2005 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 32 443-452)。使用暴露给LPS的人单核细胞的研究已经证明，在暴露给LPS的单核细胞中SLPI抑制了Toll-样受体和NF-κB活化和随后产生IL-8和TNFα的信号转导(Lentsch等人，1999 Am. J. Pathol. 154, 239–247；Taggart等人，2005 J. Exp. Med. 202, 1659–1668)。SLPI缺陷小鼠对LPS诱导的内毒素休克明显更易感并具有更高的死亡率(Nakamura等人，2003 J. Exp. Med. 197, 669–674)。同样，与野生型小鼠相比，在LPS攻击之后，过量表达弹性蛋白酶抑制剂的小鼠表现出降低的促炎性细胞因子，包括TNFα、MIP-2和MCP-1 (Sallenave等人，2003，Infect. Immun. 71, 3766–3774)。

除了它们的抗蛋白酶和抗炎活性之外，SLPI和弹性蛋白酶抑制剂具有针对广泛类别的病原体(包括病毒、细菌和真菌)的抗感染功能性。SLPI和弹性蛋白酶抑制剂都已显示出针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性。已经发现SLPI有效针对上呼吸道内常见的病原体种类，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，除了表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和大肠杆菌(Escherichiacoli)之外。而弹性蛋白酶抑制剂也表现出针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的杀细菌活性(Hiemstra等人，1996 Infect. Immun. 64, 4520–4524；Wiedow等人，1998 Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 904–909；Simpson等人，2001 Hum. Gene Ther. 12, 1395–1406；Meyer-Hoffert等人， 2003 Exp. Dermatol. 12, 418–425；Simpson等人，1999 FEBS Lett. 452, 309–313)。已经证明SLPI具有针对病原性真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和白色念珠菌(Candida albicans)的杀真菌活性(Tomee等人，1997 J. Infect. Dis. 176:740–747；Chattopadhyay等人，2004 Infect. Immun. 72:1956–1963)。也已证明SLPI具有抗HIV活性(McNeely等人，1995 J. Clin. Investig. 96:456–464；McNeely等人，1997 Blood 90:1141–1149；Hocini等人，2002 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:515–518；Pillay等人，2001 J. Infect. Dis. 183:653–656)。

根据已报道的研究，提出重组人SLPI可用于治疗变应性哮喘、肺气肿、囊性纤维化、AAT缺陷、COPD、ARDS、关节炎、细菌感染、真菌感染和病毒感染、脊髓损伤、创伤愈合和心脏移植后的缺血/再灌注损伤(Lucey, E.C., Stone, P.J., Ciccolella, D.E., Breuer, R., Christensen, T.G., Thompson, R.C.和Snider, G.L. (1990). Recombinant human secretory leukocyte-protease inhibitor: in vitro properties, and amelioration of human neutrophil elastase-induced emphysema and secretory cell metaplasia in the hamster.(重组人分泌性白细胞-蛋白酶抑制剂: 体外性质和仓鼠中的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶-诱导的肺气肿和分泌细胞化生的改善). J Lab Clin Med 115, 224-232；Stolk, J., Rudolphus, A.和Kramps, J.A. (1991). Lipopolysaccharide-induced alveolar wall destruction in the hamster is inhibited by intratracheal treatment with r-secretory leukocyte protease inhibitor(在仓鼠中通过用r-分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的气管内治疗，抑制脂多糖-诱导的肺泡壁破坏). Ann N Y Acad Sci 624, 350-352；Stromatt, S.C. (1993). Secretory leukocyte protease inhibitor in cystic fibrosis(囊性纤维化中的分泌性白细胞蛋白酶抑制剂). Agents Actions Suppl 42, 103-110；Watterberg, K.L., Carmichael, D.F., Gerdes, J.S., Werner, S., Backstrom, C.和Murphy, S. (1994). Secretory leukocyte protease inhibitor and lung inflammation in developing bronchopulmonary dysplasia (在发展的支气管肺发育不良中的分泌性白细胞蛋白酶抑制剂和肺部炎症). J Pediatr 125, 264-269；McNeely, T.B., Dealy, M., Dripps, D.J., Orenstein, J.M., Eisenberg, S.P.和Wahl, S.M. (1995). Secretory leukocyte protease inhibitor: a human saliva protein exhibiting anti-human immunodeficiency virus 1 activity in vitro (分泌性白细胞蛋白酶抑制剂：人唾液蛋白在体外表现出抗人免疫缺陷病毒1活性). J Clin Invest 96, 456-464；Fath, M.A., Wu, X., Hileman, R.E., Linhardt, R.J., Kashem, M.A., Nelson, R.M., Wright, C.D.和Abraham, W.M. (1998). Interaction of secretory leukocyte protease inhibitor with heparin inhibits proteases involved in asthma (分泌性白细胞蛋白酶抑制剂与肝素的相互作用抑制涉及哮喘的蛋白酶). J Biol Chem 273, 13563-13569；Jin, F., Nathan, C.F., Radzioch, D.和Ding, A. (1998). Lipopolysaccharide-related stimuli induce expression of the secretory leukocyte protease inhibitor, a macrophage-derived lipopolysaccharide inhibitor (脂多糖-相关刺激诱导分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(一种巨噬细胞-衍生的脂多糖抑制剂)的表达). 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已经产生了SLPI和弹性蛋白酶抑制剂的重组形式并给予人。事实上，目前在人类临床试验中正在评价重组弹性蛋白酶抑制剂治疗多种类型的血管损伤的炎性组分(ref)。SLPI和弹性蛋白酶抑制剂两者的重组形式都显示非常短的血清半寿期(<3小时, Bergenfeldt等人，1990 Scand J Clin Lab Invest. 50(7):729-37, WO/2011/107505)。短的半寿期表示对于这些蛋白治疗用途的主要局限。因此用这些蛋白形式的有效治疗将需要频繁给药(每天多次给药)。

产生了本发明的融合蛋白以增强SLPI和弹性蛋白酶抑制剂的治疗潜力。为了延长重组SLPI和弹性蛋白酶抑制剂的半寿期，产生了Fc和白蛋白的融合蛋白。尽管已知Fc结构域或白蛋白与某些蛋白、蛋白结构域或肽的融合可延长它们的半寿期(参见例如Jazayeri, J.A.,和Carroll, G.J. (2008). Fc-based cytokines : prospects for engineering superior therapeutics (基于Fc的细胞因子: 改造优良治疗药的展望). BioDrugs 22, 11-26；Huang, C. (2009). Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODY technology (受体-Fc融合治疗药、traps和MIMETIBODY技术). Curr Opin Biotechnol 20, 692-699；Kontermann, R.E. (2009). Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies (延长重组抗体的血浆半寿期的策略). BioDrugs 23, 93-109；Schmidt, S.R. (2009). Fusion-proteins as biopharmaceuticals--applications and challenges (融合-蛋白作为生物药物—应用和挑战). Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-295)，但是在本文所述的研究之前尚不知道，与SLPI或弹性蛋白酶抑制剂融合的Fc结构域或白蛋白是否会失去其抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力或具有增加血清半寿期的所需效果。本文所述的研究证明了本发明的融合蛋白能够进行强有效NE抑制并表现出增加的血清半寿期。相对于先前未经修饰形式的SLPI或弹性蛋白酶抑制剂，本发明的这些融合蛋白提供了更有效的治疗。

在某些实施方案中，WAP结构域融合蛋白包括与细胞因子靶向蛋白融合的SLPI或弹性蛋白酶抑制剂多肽序列。

在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少一个含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽或衍生自细胞因子靶向多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供与人细胞因子受体或其衍生物融合的含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的序列。本发明的另一实施方案提供含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的序列，其融合到细胞因子靶向抗体例如抗细胞因子抗体或衍生自细胞因子靶向抗体例如抗细胞因子抗体的序列，或衍生自细胞因子靶向抗体片段例如抗细胞因子抗体片段的序列。例如，本发明提供与细胞因子靶向多肽融合的含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的序列，其中细胞因子靶向多肽与以下人细胞因子的任一个结合：TNFα、IgE、IL-12、IL-23、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-13、IL-12和IL-23的p40亚单位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27或IL-32。

例如，在某些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向TNFα并包含以下TNFα-靶向多肽或衍生自以下TNFα-靶向多肽的序列的任一个：Remicade®、Humira®、Simponi®、Cimiza®或Enbrel®。

例如，在某些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向IgE并包含以下IgE-靶向多肽或衍生自以下IgE-靶向多肽的序列的任一个：Xolair®或FcεRI。

例如，在某些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向IL-12和IL-23的共享的p40亚单位并包含Stelara®多肽或衍生自Stelara®多肽的序列。

例如，Stelara®，细胞因子靶向多肽靶向IL-13并包含CDP7766多肽或衍生自CDP7766多肽的序列。

本发明提供与细胞因子靶向多肽融合的含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的序列，其中细胞因子靶向多肽与以下人细胞因子的受体的任一个结合：TNFα、IgE、IL-12、IL-23、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-13、IL-12和IL-23的p40亚单位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27或IL-32，从而阻止了受体和细胞因子之间的结合。

在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少一个SLPI多肽或衍生自SLPI的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽或衍生自细胞因子靶向多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供与细胞因子靶向多肽融合的SLPI，其中细胞因子靶向多肽与以下人细胞因子的任一个结合：TNFα、IgE、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-13、IL-23、IL-12和IL-23的p40亚单位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27或IL-32.

在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少弹性蛋白酶抑制剂多肽或衍生自弹性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽或衍生自细胞因子靶向多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供与细胞因子靶向多肽融合的弹性蛋白酶抑制剂，其中细胞因子靶向多肽与以下人细胞因子的任一个结合：TNFα、IgE、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-13、IL-23、IL-12和IL-23的p40亚单位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27或IL-32。

在某些实施方案中，细胞因子靶向多肽与细胞因子受体结合并阻止了受体和细胞因子之间的结合。例如，本发明包括与细胞因子受体靶向抗体融合的丝氨酸蛋白酶抑制剂。例如，本发明提供与细胞因子靶向多肽融合的SLPI，其中细胞因子靶向多肽与以下人细胞因子的任一个的受体结合：TNFα、IgE、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-13、IL-23、IL-12和IL-23的p40亚单位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27或IL-32。例如，本发明提供与细胞因子靶向多肽融合的弹性蛋白酶抑制剂，其中细胞因子靶向多肽与以下人细胞因子的任一个的受体结合：TNFα、IgE、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-13、IL-23、IL-12和IL-23的p40亚单位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27或IL-32。

例如，在某些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向IL-6受体并包含Actemra®多肽或衍生自Actemra®多肽的序列。例如，Actemra®细胞因子靶向多肽靶向IL-6受体并包含tocilizumab多肽或衍生自tocilizumab多肽的序列。

蛋白治疗药对炎性细胞因子和免疫刺激剂的靶向在多种炎性病症中已经证明了临床成功。用作细胞因子靶向剂的最常用的蛋白质是可溶性细胞因子受体和单克隆抗体和其片段。通过TNFα靶向生物制剂Remicade®、Humira®、Simponi®、Cimiza®和Enbrel®，和IL-12/23 p40靶向抗体Stelara®证明，靶向细胞因子的明显缺陷是增加了这些患者的感染风险。这很可能是靶向炎性细胞因子导致患者的免疫抑制的常见问题。如上所述，SLPI和弹性蛋白酶抑制剂证明了抗感染和抗炎活性。因此，本发明的含有WAP结构域的多肽-细胞因子靶向多肽融合蛋白可抑制异常细胞因子活性，同时降低感染风险。

在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少以下组分：含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列、丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列和Fc多肽或衍生自Fc多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供含有WAP结构域的多肽、丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽、和人IgG1-Fc、IgG2-Fc、IgG3-Fc、IgG4-Fc或IgM-Fc衍生物，其以任何功能组合操作性地连接在一起。在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽是人AAT或衍生自AAT。相对于仅由含有WAP结构域的多肽或丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽组成的融合蛋白，本发明的WAP-Fc-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白预期具有增强的抗蛋白酶、抗感染和抗炎性质。

在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少一个含有WAP结构域的多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽的氨基酸序列和人血清白蛋白(HSA)多肽或衍生自HSA多肽的氨基酸序列。本发明的进一步的实施方案包括含有WAP结构域的多肽-白蛋白结合多肽融合蛋白，其中白蛋白结合多肽负责含有WAP结构域的多肽和HSA的缔合。因此本发明同时包含丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和HSA多肽或衍生自含有WAP结构域的多肽或HSA多肽的序列的共价和非共价连接。例如，本发明提供与人HSA或HSA衍生物或HSA结合肽或多肽融合的含有WAP结构域的多肽。

在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少SLPI多肽或衍生自SLPI的氨基酸序列和HSA多肽或衍生自HSA多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供与HSA或衍生自HSA的片段、或白蛋白结合多肽融合的SLPI。在某些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少弹性蛋白酶抑制剂多肽或衍生自弹性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列和HSA多肽或衍生自HSA多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供与HSA或衍生自HSA的片段、或白蛋白结合多肽融合的弹性蛋白酶抑制剂。

本文所述的融合蛋白和融合蛋白衍生物预期可用于治疗各种适应症，以非限制性实例的方式包括：α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、缺血-再灌注损伤包括例如心脏移植后的缺血/再灌注损伤、关节炎、变应性哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、囊性纤维化、I型和/或II型糖尿病、缺陷、细菌感染、真菌感染和病毒感染、脊髓损伤、创伤愈合、移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、肺动脉高血压(PAH)、慢性血栓栓塞性肺高血压和心脏移植后的缺血/再灌注损伤。

除非另有说明，否则本发明所用的科技术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文需要，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。通常，关于本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、和蛋白和寡-或多核苷酸化学和杂交的技术所用的命名法是本领域众所周知的和常用的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染法)。按照制造商的说明书或如本领域通常进行的或如本文所述地进行酶促反应和纯化技术。通常按照本领域众所周知的和如本说明书自始至终引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述的常规方法进行上述技术和程序。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))。关于本文所述的分析化学、合成有机化学、医学和药物化学的实验室程序和技术所用的命名法是本领域众所周知的和通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送和患者的治疗。术语患者包括人和兽医受试者。

可以理解，本发明的治疗实体的给予将与合适的载体、缓冲剂、赋形剂和掺入到制剂中以提供改进的转移、递送、耐受等的其它药剂一起给予。多种合适的制剂可以在所有药物化学家已知的处方集中找到：Remington's Pharmaceutical Sciences (第15版, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))，尤其是其中由Blaug, Seymour所编写的第87章。这些制剂包括例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如Lipofectin™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂(anhydrous absorption pastes)、水包油和油包水乳剂、聚乙二醇(carbowax，不同分子量的聚乙二醇)乳剂、含有聚乙二醇的半固体凝胶剂和半固体混合物。任何上述混合物都可适合于本发明的治疗和疗法，前提是配制不会使制剂中的活性成分失活和制剂与给药途径是生理上相容的和可耐受的。另见Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell等人 “ Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)和其中对于有关药物化学家众所周知的配制、赋形剂和载体的额外信息的引文。

包含本发明的融合蛋白的本发明的治疗制剂，用于在受试者中治疗异常丝氨酸蛋白酶活性相关的疾病或病症或缓解其相关症状。本发明也提供在受试者中治疗异常丝氨酸蛋白酶活性相关的疾病或病症或缓解其相关症状的方法。通过使用标准方法，包括各种临床和/或实验室程序的任一个，鉴定受试者，例如罹患异常丝氨酸蛋白酶活性相关的疾病或病症(或处于发展的风险中)的人类患者，实施治疗方案。术语患者包括人类和兽医受试者。术语受试者包括人类和其它哺乳动物。

结合用于诊断或治疗异常丝氨酸蛋白酶活性相关的特定疾病或病症的任何已知方法，确定治疗有效性。异常丝氨酸蛋白酶活性相关的疾病或病症的一个或多个症状的缓解表明融合蛋白提供了临床益处。

筛选具有所需特异性的融合蛋白的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶测定、流式细胞术和本领域已知的其它免疫学介导的技术。

本文所述的融合蛋白可用于本领域已知的涉及靶标例如丝氨酸蛋白酶的定位和/或定量的方法，例如用于在合适的生理样品中测量这些靶标的水平，用于诊断方法，用于对蛋白成像，等等)。互换使用的术语“生理样品”和“生物样品”在本文中意图包括分离自受试者的组织、细胞和生物流体，以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。因此，术语“生理样品”和“生物样品”的使用内包括的是血和血的级分或组分，包括血清、血浆，或淋巴。

在给定的实施方案中，对给定靶标、或其衍生物、片段、类似物或同源物(homolog)具有特异性的含有靶标-结合结构域的融合蛋白，用作药理学上的活性化合物(在下文中称为“治疗药”)。

使用标准技术，例如免疫亲和、色谱或免疫沉淀，本发明的融合蛋白可用于分离特定靶标。可通过将融合蛋白与可检测物质偶联(即物理连接)以有助于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰基胆碱酯酶；合适的辅基复合物实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、荧光素和水母蛋白；和合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

本发明的融合蛋白的治疗有效量通常涉及达到治疗目标所需的量。如上所述，这可以是融合蛋白及其靶标之间的结合相互作用，其在某些情况下干扰靶标的功能。此外，需要给予的量将取决于融合蛋白对其特异性靶标的结合亲和性，并且也将取决于所给予融合蛋白从所给予的其它受试者的自由体积中耗尽的速率。本发明融合蛋白或其片段的治疗有效剂量的通常范围以非限制性实例的方式可以为约0.1 mg/kg体重至约250 mg/kg体重。通常的给药频率范围可以是例如每天2次至每月1次。

当使用融合蛋白片段时，优选与靶标特异性结合的最小抑制性片段。例如，肽分子可经设计为保留与靶标结合的能力。这样的肽可经化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如Marasco等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993))。制剂也可视需要而含有多于一种活性化合物，用于所治疗的具体适应症，优选具有互补活性而彼此没有不利影响的那些。或者，或另外，组合物可包含增强其功能的药剂，例如，细胞毒素剂、细胞因子、化疗药、生长抑制剂、抗炎药或抗感染药。这样的分子适宜存在于组合中，其量对于预期目的是有效的。

也可在胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微型乳剂、纳米粒和纳米囊)中或在大乳剂(macroemulsion)中，将活性成分包入例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊剂中，例如分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊剂和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊剂。

用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤而容易地实现。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含融合蛋白的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品的形式，例如薄膜、或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和-L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT^TM (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能使分子释放超过100天，但某些水凝胶在较短的时间周期内释放蛋白质。

药物组合物

可将本发明的融合蛋白(在本文中也称为“活性化合物”)、及其衍生物、片段、类似物和同源物，包括到适于给药的药物组合物中。这样的组合物通常包含融合蛋白和药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的载体”意图包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂(coating)、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，等等。合适的载体描述于最新版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences，这是本领域的标准参考文本，其通过引用结合到本文中。这类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性溶媒例如不挥发油。将这类介质和试剂用于药学活性物质是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况之外，考虑了其在组合物中的使用。也可将补充的活性化合物加入到组合物中。

将本发明的药物组合物配制成与其预期给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外例如静脉内、皮内、皮下、口腔(例如吸入)、透皮(即局部)、透粘膜、和直肠给药。用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液剂或混悬剂可包含以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张度调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节pH。可将胃肠外制剂封装到玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小管中。

适于注射用的药物组合物包括无菌水性溶液剂(当具有水溶性时)或分散剂以及用于临时制备无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物都必须是无菌的并且应当是具有方便的可注射性程度的流体。它在制造和贮存条件下必须是稳定的并且针对微生物例如细菌和真菌的污染作用而言必须是防腐的。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇,多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可通过例如使用包衣剂例如卵磷脂，通过在分散的情况下维持所需粒径和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。可通过多种抗菌剂和抗真菌剂，实现对微生物作用的阻止，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，使注射用组合物的延长吸收。

无菌注射用溶液剂可如下制备：通过将活性化合物以所需量掺入到具有以上列举的成分的一种或组合的合适溶剂中(根据需要)，再通过过滤除菌。通常，通过将活性化合物掺入到含有基础分散介质和以上列举的所需其它成分的无菌溶媒中，制备分散剂。在制备无菌注射用溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，得到活性成分的粉剂加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外的所需成分。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可将它们封装到明胶胶囊剂中或压制成片剂。为了口腔治疗给药的目的，可掺入活性化合物以及赋形剂并以片剂、糖锭剂或胶囊剂形式使用。也可制备口服组合物，使用流体载体用作漱口剂，其中在流体载体中的化合物经口服施用并刷洗(swish)并吐出或咽下。可包括药物相容的结合剂和/或辅助材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、糖锭剂等可含有任何以下成分或类似性质的化合物：结合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel,或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味料。

对于通过吸入给药，从含有合适抛射剂(例如气体，例如二氧化碳)的加压容器或分配器或者喷雾器中以气溶胶喷雾形式递送化合物。

系统给药也可通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮给药，适于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。这样的渗透剂通常是本领域已知的，包括例如，对于透粘膜给药，去垢剂、胆盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。可通过使用鼻腔喷雾或栓剂而实现透粘膜给药。对于透皮给药，将活性化合物配制到本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂中。

也可以栓剂(例如与常规栓剂基料例如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂形式制备化合物，用于直肠递送。

在一个实施方案中，将活性化合物与保护化合物免于从机体快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。材料也可购自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.。脂质体混悬剂也可用作药学上可接受的载体。这些可按照本领域技术人员已知方法来制备，所述方法例如描述于美国专利号4,522,811。

尤其有利的是配制便于给药和剂量一致的单位剂型的口服或胃肠外组合物。单位剂型用于本文中是指适合单次给予待治疗受试者的物理上分离的单元；每一单元含有预定量的活性化合物(其经计算产生所需疗效)以及所需药物载体。本发明单位剂型的规格由以下规定或直接取决于以下：活性化合物独特性质和欲达到的具体疗效、以及配混所述活性化合物用于治疗个体的本领域固有局限。

可将药物组合物连同给药说明书包括在容器、包装或分配器中。

在以下实施例中将会进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。

实施例

实施例 1: SLPI-Fc 和弹性蛋白酶抑制剂 -Fc 融合蛋白和变体

本发明的SLPI-Fc和弹性蛋白酶抑制剂Fc融合蛋白的示例性的、而非限制性实例包括以下序列，其中融合蛋白的SLPI或弹性蛋白酶抑制剂多肽部分以粗体显示，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示，SLPI中的Met98Leu (ML)突变以方框显示，增强FcRn结合的Fc突变Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu (YTE)或Met428Leu、Asn434Ser (LS)以方框、粗体文本和灰色阴影显示。当这些实例包含铰链序列和/或接头序列时，可用合适长度和/或柔性的任何铰链序列和/或接头序列制备本发明的融合蛋白。或者，可制备融合蛋白而不使用铰链和/或接头序列。例如，多肽组分可直接连接。

示例性的SLPI-Fc融合蛋白是SLPI-hFc。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体显示(SEQ ID NO: 2)，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 7)。

SLPI-hFc1 (人IgG1 Fc, 长铰链) (SEQ ID NO:16)

示例性的SLPI-Fc融合蛋白是SLPI-hFc2 (人IgG2 Fc, 长铰链)。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体显示(SEQ ID NO: 2)，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 8)。

SLPI-hFc2 (人IgG2 Fc, 长铰链) (SEQ ID NO:17)

示例性的SLPI-Fc融合蛋白是SLPI-ML-hFc1。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体显示(SEQ ID NO: 39)，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 7)，SLPI中的Met98Leu (ML)突变以方框显示。

SLPI-ML-hFc1 (人IgG1 Fc, Met98Leu) (SEQ ID NO:18)

示例性的SLPI-Fc融合蛋白是SLPI-hFc1-YTE。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体显示(SEQ ID NO: 39)，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 40)，Fc突变Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu (YTE)以方框、粗体文本和灰色阴影显示。

SLPI-hFc1-YTE (人IgG1 Fc, Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu) (SEQ ID NO:19)

示例性的SLPI-Fc融合蛋白是SLPI-hFc1-LS。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体显示(SEQ ID NO: 39)，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 41)，增强FcRn结合的Met428Leu、Asn434Ser (LS)以方框、粗体文本和灰色阴影显示。

SLPI-hFc1-LS (人IgG1 Fc, Met428Leu, Asn434Ser)

示例性的弹性蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白是弹性蛋白酶抑制剂-hFc1。如下所示，融合蛋白的弹性蛋白酶抑制剂多肽部分以粗体显示(SEQ ID NO: 5)，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 41)，增强FcRn结合的Asn434Ser (LS)以方框、粗体文本和灰色阴影显示。

弹性蛋白酶抑制剂 -hFc1 ( 人 IgG1)

示例性的SPLI-Fc融合蛋白是SLPI-hFc1-SLPI。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体显示(SEQ ID NO: 39)，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 7)。

SLPI-hFc1-SLPI (人IgG1)

示例性的弹性蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白是弹性蛋白酶抑制剂-hFc1-弹性蛋白酶抑制剂。如下所示，融合蛋白的弹性蛋白酶抑制剂多肽部分以粗体显示(SEQ ID NO: 5)，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 7)。

弹性蛋白酶抑制剂 -hFc1- 弹性蛋白酶抑制剂 ( 人 IgG1)

示例性的弹性蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白是弹性蛋白酶抑制剂-hFc1-SLPI。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽(SEQ ID NO: 39)部分以粗体显示，WAP结构域加下划线，融合蛋白的弹性蛋白酶抑制剂(SEQ ID NO: 5)多肽部分以粗体和斜体显示，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 7)。

弹性蛋白酶抑制剂 -hFc1-SLPI ( 人 IgG1)

示例性的SLPI-Fc融合蛋白是SLPI-hFc1-弹性蛋白酶抑制剂。如下所示，融合蛋白的SLPI (SEQ ID NO: 39)部分以粗体显示，WAP结构域加下划线，融合蛋白的弹性蛋白酶抑制剂(SEQ ID NO: 5)多肽部分以粗体和斜体显示，WAP结构域加下划线，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 7)。

SLPI-hFc1-弹性蛋白酶抑制剂(人IgG1)

使用以下技术制备这些示例性的SLPI-Fc和弹性蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白。

自人脾脏cDNA (Zyagen)经PCR扩增编码人SLPI和弹性蛋白酶抑制剂的基因。通过重叠PCR产生编码SLPI、弹性蛋白酶抑制剂或Fc区的基因内的特定点突变。将编码SLPI或弹性蛋白酶抑制剂的基因与编码铰链区的基因、接着是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM的CH2结构域和CH3结构域，符合读框地克隆到哺乳动物表达载体中，所述载体在SLPI或弹性蛋白酶抑制剂基因插入位点的上游含有哺乳动物分泌信号序列。在某些情况下，这些载体经进一步修饰，其中将编码接头序列和或者SLPI或者弹性蛋白酶抑制剂的基因符合读框地克隆到CH3结构域的3’端，产生SLPI-Fc-SLPI、弹性蛋白酶抑制剂-Fc-弹性蛋白酶抑制剂、SLPI-Fc-弹性蛋白酶抑制剂,或弹性蛋白酶抑制剂-Fc-SLPI。将这些表达载体转染到哺乳动物细胞(尤其是HEK293或CHO细胞)中并在8% CO₂在37℃生长数天。通过蛋白A色谱从表达细胞上清液中纯化重组SLPI-Fc和弹性蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白。图1B显示弹性蛋白酶抑制剂-Fc (SEQ ID NO:21, 第1道)和SLPI-Fc (SEQ ID NO:16, 第2道)融合蛋白的还原性SDS-PAGE凝胶。图1D显示弹性蛋白酶抑制剂-Fc-SLPI (SEQ ID NO:24)的还原性SDS-PAGE凝胶。蛋白质通过用考马斯蓝染色而显现。

为了监测人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性，使用荧光微量板测定法。使用以下测定法，通过剩余NE活性的同时降低，测定抑制活性。该测定缓冲液由以下组成：100 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl和0.0005% Triton X-100。人NE以5 nM的最终浓度使用(但也可使用1-20 nM)。在测定法中，荧光肽底物AAVP-AMC以100 µM的最终浓度使用。来自Molecular Devices的Gemini EM读板器用于读取测定动力学，分别使用激发和发射波长370 nm和440 nm，截止为420 nm。在室温每5-10秒扫描一次，读取测定达10分钟。每秒的Vmax相当于剩余NE活性，将其对抑制剂的每一浓度作图。x-轴的截距表示在测定中使起始浓度的NE完全失活所需的抑制剂浓度。在这些测定中，人血清衍生的AAT (sdAAT)用作NE抑制的阳性对照。弹性蛋白酶抑制剂-Fc和SLPI-Fc融合蛋白表现出对NE的强有效抑制(图1C)。弹性蛋白酶抑制剂-Fc-SLPI融合蛋白也是NE的强有效抑制剂(图1E)。

此外，与大肠杆菌产生的未经修饰的SLPI相比，SLPI-Fc融合蛋白在大鼠中表现出更长的血清半寿期(图1F)，证明了本发明的融合蛋白具有改进的药物动力学性质并且相对于未经修饰形式的SLPI和弹性蛋白酶抑制剂是优良的治疗方式，用于治疗多种人炎性病症。

实施例 2: SLPI-TNF α靶向分子融合蛋白

本文给出的研究描述了重组SLPI衍生物的若干非限制性实例，所述衍生物包含与抗TNFα抗体或TNFα受体衍生物融合的人SLPI。以下提供了这些实例以进一步说明本发明的不同特征。所述实例也说明了实施本发明的有用的方法。这些实例并非也无意限制要求保护的本发明。

以下融合蛋白包含细胞因子靶向多肽序列，其来自或衍生自：(i)抗TNFα抗体D2E7 (也称为阿达木单抗(Adalimumab)或Humira®)，或(ii) 2型TNFα受体胞外结构域(TNFR2-ECD)。融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体文本显示，WAP结构域加下划线，抗体恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3或CL)以斜体显示，D2E7-VH、D2E7-VK和TNFR2-ECD以灰色阴影和粗体文本显示。当这些实例包含铰链序列和/或接头序列时，可用合适长度和/或柔性的任何铰链序列和/或接头序列制备本发明的融合蛋白。或者，可制备融合蛋白而不使用铰链和/或接头序列。例如，多肽组分可直接连接。

示例性的SLPI-TNFα靶向分子融合蛋白是D2E7-轻链-SLPI (G₃S)₂接头。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，WAP结构域加下划线，抗体恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3或CL)以斜体显示(SEQ ID NO: 43)，D2E7-VK以灰色阴影和粗体文本显示(SEQ ID NO: 42)。

D2E7-轻链-SLPI (G₃S)₂接头

示例性的SLPI-TNFα靶向分子融合蛋白是D2E7-轻链-SLPI ASTGS接头。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，WAP结构域加下划线，抗体恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3或CL)以斜体显示(SEQ ID NO: 43)，D2E7-VK以灰色阴影和粗体文本显示(SEQ ID NO: 42)。

D2E7-轻链-SLPI ASTGS 接头

示例性的SLPI-TNFα靶向分子融合蛋白是D2E7-重链-SLPI (G₃S)₂接头。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，WAP结构域加下划线，抗体恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3或CL)以斜体显示(SEQ ID NO: 45)，D2E7-VH以灰色阴影和粗体文本显示(SEQ ID NO: 44)。

D2E7-重链-SLPI (G₃S)₂ 接头

示例性的SLPI-TNFα靶向分子融合蛋白是D2E7-重链-SLPI ASTGS接头。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，WAP结构域加下划线，抗体恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3或CL)以斜体显示(SEQ ID NO: 45)，D2E7-VH以灰色阴影和粗体文本显示(SEQ ID NO: 44)。

D2E7-重链-SLPI ASTGS 接头

示例性的SLPI-TNFα靶向分子融合蛋白是TNFR2-ECD-Fc1-SLPI(G₃S)₂接头。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，WAP结构域加下划线，Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 47)，TNFR2-ECD以灰色阴影和粗体文本显示(SEQ ID NO: 46)。

TNFR2-ECD-Fc1-SLPI(G₃S)₂接头

示例性的SLPI-TNFα靶向分子融合蛋白是TNFR2-ECD-Fc1-SLPI ASTGS接头。如下所示，融合蛋白的SLPI多肽部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，WAP结构域加下划线，Fc多肽部分以斜体显示(SEQ ID NO: 47)，TNFR2-ECD以灰色阴影和粗体文本显示(SEQ ID NO: 46)。

TNFR2-ECD-Fc1-SLPI ASTGS 接头

使用以下技术制备这些示例性的SLPI-TNFα靶向分子融合蛋白。

通过基因合成产生编码抗TNFα抗体D2E7的可变重链(VH)和可变kappa (VK)区的基因。将D2E7-VH基因与编码人IgG1抗体重链恒定区(由CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域组成)的基因符合读框地克隆到哺乳动物表达载体中，所述载体在VH结构域插入位点(D2E7-HC)的上游含有哺乳动物分泌信号序列。将D2E7-VK基因与人抗体kappa轻链恒定(CL)结构域符合读框地克隆到哺乳动物表达载体中，所述载体在VK结构域插入位点(D2E7-LC)的上游含有哺乳动物分泌信号序列。将编码SLPI的基因和邻近的5’接头序列符合读框地克隆到上述哺乳动物表达载体中的D2E7重链基因的CH3结构域(D2E7-HC-SLPI)、或者D2E7轻链基因的CL结构域(D2E7-LC-SLPI)编码序列的3’端。通过基因合成产生TNFα受体2胞外结构域(TNFR2-ECD)并与编码铰链区的基因、接着是人IgG1 (hFc1)的CH2结构域和CH3结构域，符合读框地克隆到哺乳动物表达载体中，所述载体在TNFR2-ECD插入位点的上游含有哺乳动物分泌信号序列。将编码SLPI的基因和邻近的5’接头序列符合读框地克隆到哺乳动物表达载体中编码TNFR2-ECD-hFc1的基因的3’端(TNFR2-ECD-hFc1-SLPI)。

将D2E7-HC-SLPI表达载体与D2E7-LC或者D2E7-LC-SLPI表达载体共转染到哺乳动物细胞(尤其是HEK293或CHO细胞)中以产生D2E7抗体，其SLPI融合到重链C-端或分别融合到重链和轻链两者的C-端。将D2E7-LC-SLPI与D2E7-HC表达载体共转染到哺乳动物细胞中，产生其SLPI融合到轻链C-端的D2E7抗体。将TNFR2-hFc1-SLPI表达载体转染到哺乳动物细胞中。转染的细胞在8% CO₂在37℃生长数天。

通过蛋白A色谱从表达细胞上清液中纯化重组SLPI-TNFα靶向融合蛋白。图2B显示以下的还原性SDS-PAGE凝胶：单独D2E7抗体(第1道)、SLPI融合到轻链的D2E7抗体(SEQ ID NO: 27与D2E7重链共转染，第2道)、SLPI融合到重链的D2E7抗体(SEQ ID NO: 29与D2E7轻链共转染，第3道)。箭头表示经修饰的(SLPI融合)和未经修饰的(无SLPI)重链和轻链。蛋白质通过用考马斯蓝染色而显现。

通过测定纯化的SLPI-TNFα靶向分子融合蛋白抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力，测试其活性。在这些测定中使用人血清衍生的AAT (sdAAT)作为阳性对照(图2C)。相对于血清衍生的AAT，D2E7-抗体-SLPI融合蛋白显示出对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的类似抑制，表明SLPI的抑制能力并未因其与抗体融合而受损。如上所述地进行NE抑制测定。

实施例 3 AAT-Fc-SLPI 和 AAT-Fc- 弹性蛋白酶抑制剂

本文给出的研究描述了重组AAT衍生物的若干非限制性实例，所述衍生物包含与含有WAP结构域的蛋白融合的人AAT。以下提供了这些实例以进一步说明本发明的不同特征。所述实例也说明了实施本发明的有用的方法。融合蛋白的AAT多肽部分以粗体文本和灰色阴影显示，Fc部分以斜体显示，SLPI和弹性蛋白酶抑制剂部分以粗体文本显示，含有WAP结构域的多肽加下划线。当这些实例包含铰链序列和/或接头序列时，可用合适长度和/或柔性的任何铰链序列和/或接头序列制备本发明的融合蛋白。或者，可制备融合蛋白而不使用铰链和/或接头序列。例如，多肽组分可直接连接。

示例性的AAT-Fc-SLPI融合蛋白是AAT-hFc1-SLPI (人IgG1 Fc)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分以粗体文本和灰色阴影显示(SEQ ID NO: 13)，Fc部分以斜体显示(SEQ ID NO: 7)，SLPI部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，含有WAP结构域的多肽加下划线(SEQ ID NO: 3)。

AAT-hFc1-SLPI (人IgG1 Fc)

示例性的AAT-Fc-弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白是AAT-hFc1-弹性蛋白酶抑制剂。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分以粗体文本和灰色阴影显示(SEQ ID NO: 13)，Fc部分以斜体显示(SEQ ID NO: 7)，弹性蛋白酶抑制剂部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 5)，含有WAP结构域的多肽加下划线(SEQ ID NO: 6)。

AAT-hFc1-弹性蛋白酶抑制剂(人IgG1 Fc)

自人脾脏cDNA (Zyagen)经PCR扩增编码SLPI和弹性蛋白酶抑制剂的基因。将这些基因和侧翼接头序列符合读框地克隆到哺乳动物表达载体中，所述载体含有编码AAT和Ig Fc区的基因，其中哺乳动物分泌序列在AAT基因之前。将这些表达载体转染到哺乳动物细胞(尤其是HEK293或CHO细胞)中并在8% CO₂在37℃生长数天。通过蛋白A色谱从表达细胞上清液中纯化重组AAT-Fc-WAP结构域融合蛋白。使用接近中性pH的缓冲液(Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Thermo Scientific)以从蛋白A树脂上洗脱AAT-Fc-WAP结构域融合蛋白。图3B显示以下纯化的融合蛋白的还原性SDS-PAGE凝胶：AAT-Fc-弹性蛋白酶抑制剂(SEQ ID NO: 33, 第1道)和AAT-Fc-SLPI (SEQ ID NO: 32, 第2道)。

通过测定纯化的AAT-Fc-WAP结构域融合蛋白抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力，测试其活性。在这些测定中使用人血清衍生的AAT (sdAAT)作为阳性对照(图3C)。相对于血清衍生的AAT，AAT-Fc-WAP靶向分子融合蛋白显示出对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的增强的NE抑制效能。如上所述地进行NE抑制测定。

实施例 4 SLPI- 白蛋白和弹性蛋白酶抑制剂 - 白蛋白

本文给出的研究描述了重组AAT衍生物的若干非限制性实例，所述衍生物包含与白蛋白多肽融合的人SLPI。以下提供了这些实例以进一步说明本发明的不同特征。所述实例也说明了实施本发明的有用的方法。这些实例并非也无意限制要求保护的本发明。AAT部分以粗体文本显示，白蛋白部分以斜体显示，WAP结构域加下划线。当这些实例包含接头序列时，可用合适长度和/或柔性的任何接头序列制备本发明的融合蛋白。或者，可制备融合蛋白而不使用接头序列。

示例性的SLPI-白蛋白融合蛋白是SLPI-HSA。如下所示，SLPI部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，白蛋白部分以斜体显示(SEQ ID NO: 14)。

SLPI-HSA

示例性的SLPI-白蛋白融合蛋白是SLPI-HSA结构域3。如下所示，SLPI部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 2)，白蛋白部分以斜体显示(SEQ ID NO: 15)。

SLPI-HSA结构域3

示例性的SLPI-白蛋白融合蛋白是弹性蛋白酶抑制剂-HSA。如下所示，弹性蛋白酶抑制剂部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 5)，白蛋白部分以斜体显示(SEQ ID NO: 14)，WAP结构域加下划线.

SLPI-HSA

示例性的弹性蛋白酶抑制剂-白蛋白融合蛋白是弹性蛋白酶抑制剂-HSA结构域3。如下所示，弹性蛋白酶抑制剂部分以粗体文本显示(SEQ ID NO: 5)，白蛋白部分以斜体显示(SEQ ID NO: 15)，WAP结构域加下划线(SEQ ID NO: 6)。

弹性蛋白酶抑制剂 -HSA 结构域 3

自人肝脏cDNA (Zyagen)经PCR扩增编码人血清白蛋白(HSA)的基因。产生哺乳动物表达载体，其中将编码HSA或HSA结构域3的基因符合读框地克隆到编码SLPI或弹性蛋白酶抑制剂的基因的3’端，在SLPI或弹性蛋白酶抑制剂的上游含有哺乳动物分泌信号序列。

将这些表达载体转染到哺乳动物细胞(尤其是HEK293或CHO细胞)中并在8% CO₂在37℃生长数天。使用苯基-琼脂糖，从表达细胞上清液中纯化重组SLPI-HSA和弹性蛋白酶抑制剂-HSA融合蛋白。

其它实施方案

尽管结合本发明的详述描述了本发明，但上述描述意图说明而非限制本发明的范围，本发明的范围是由所附权利要求书的范围限定的。其它方面、优势和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (44)

1. 分离的融合蛋白，其包含与第二多肽操作性连接的至少一个含有人乳清酸性蛋白(WAP)结构域的多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一个：

免疫球蛋白Fc多肽或衍生自免疫球蛋白Fc多肽的氨基酸序列；

细胞因子靶向多肽或衍生自细胞因子靶向多肽的序列；

丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的序列；或

白蛋白多肽或衍生自血清白蛋白多肽的氨基酸序列。

2. 分离的融合蛋白，其包含与第二多肽操作性连接的至少一个人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一个：

免疫球蛋白Fc多肽；

细胞因子靶向多肽；

α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽；

α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽和免疫球蛋白Fc多肽；和

人白蛋白(HSA)多肽。

3. 分离的融合蛋白，其包含与第二多肽操作性连接的至少一个人弹性蛋白酶抑制剂多肽，其中所述第二多肽包含以下的至少一个：

免疫球蛋白Fc多肽；

细胞因子靶向多肽；

α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽；

α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽和免疫球蛋白Fc多肽；和

人白蛋白(HSA)多肽。

4. 权利要求2的分离的融合蛋白，其中所述人SLPI多肽是全长SLPI多肽或衍生自人SLPI多肽。

5. 权利要求2-4中任一项的分离的融合蛋白，其中SLPI多肽包含选自SEQ ID NO: 1、2和3的氨基酸序列。

6. 权利要求3的分离的融合蛋白，其中所述人弹性蛋白酶抑制剂多肽是全长弹性蛋白酶抑制剂多肽或衍生自人弹性蛋白酶抑制剂多肽。

7. 权利要求3和6中任一项的分离的融合蛋白，其中弹性蛋白酶抑制剂多肽包含选自SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。

8. 权利要求1-6中任一项的分离的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc多肽是人Fc多肽。

9. 权利要求8的分离的融合蛋白，其中人Fc多肽是人IgM多肽或人IgG多肽。

10. 权利要求9的分离的融合蛋白，其中所述人IgG Fc多肽是人IgG1多肽、人IgG2 Fc多肽、人IgG3 Fc多肽或人IgG4 Fc多肽。

11. 权利要求1-3中任一项的分离的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc多肽包含选自SEQ ID NO: 7、8、9、10和11的氨基酸序列。

12. 权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述含有WAP结构域的多肽和所述免疫球蛋白Fc多肽经由铰链区、接头区、或经由铰链区和接头区两者操作性连接。

13. 权利要求2-4中任一项的分离的融合蛋白，其中所述SLPI多肽和所述免疫球蛋白Fc多肽经由铰链区、接头区、或经由铰链区和接头区两者操作性连接。

14. 权利要求3或6中任一项的分离的融合蛋白，其中所述弹性蛋白酶抑制剂多肽和所述免疫球蛋白Fc多肽经由铰链区、接头区、或经由铰链区和接头区两者操作性连接。

15. 权利要求12-14中任一项的分离的融合蛋白，其中所述铰链区、所述接头区或所述铰链区和所述接头区两者包含肽序列。

16. 权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述白蛋白多肽是人血清白蛋白(HSA)多肽或衍生自HSA多肽。

17. 权利要求2、3或16中任一项的分离的融合蛋白，其中所述HSA多肽包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。

18. 权利要求2、3或16中任一项的分离的融合蛋白，其中所述HSA多肽包含HSA结构域3。

19. 权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述含有WAP-结构域的多肽经由白蛋白结合多肽与HSA操作性连接。

20. 权利要求19的分离的融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是抗体或抗体片段或者衍生自抗体或抗体片段。

21. 权利要求20的分离的融合蛋白，其中所述抗体或抗体片段是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。

22. 权利要求19的分离的融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是肽。

23. 权利要求19的分离的融合蛋白，其中所述白蛋白结合多肽是链球菌蛋白G的结构域3或衍生自链球菌蛋白G的结构域3的序列。

24. 权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述含有WAP-结构域的多肽与HSA多肽共价连接。

25. 权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述含有WAP-结构域的多肽与HSA多肽非共价连接。

26. 权利要求1、权利要求2或权利要求3的分离的融合蛋白，其中所述细胞因子靶向多肽是细胞因子受体多肽或细胞因子受体多肽的衍生物，结合细胞因子受体的细胞因子靶向多肽，或结合人细胞因子的细胞因子靶向多肽。

27. 权利要求26的分离的融合蛋白，其中所述细胞因子受体是人细胞因子受体多肽。

28. 权利要求27的分离的融合蛋白，其中所述人细胞因子受体多肽包含多个亚单位。

29. 权利要求27的分离的融合蛋白，其中所述人细胞因子受体是以下的受体：TNFα、IgE、IL-12、IL-23、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-13、IL-12和IL-23的p40亚单位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27或IL-32。

30. 权利要求26的分离的融合蛋白，其中所述细胞因子靶向多肽是抗体或抗体片段。

31. 权利要求30的分离的融合蛋白，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。

32. 权利要求26的分离的融合蛋白，其中所述人细胞因子是TNFα、IgE、IL-12、IL-23、IL-6、IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-13、IL-12和IL-23的p40亚单位、IL-4、IL-10、IL-2、IL-18、IL-27或IL-32。

33. 权利要求32的分离的融合蛋白，其中所述细胞因子是人TNFα。

34. 权利要求2或权利要求3的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 38的氨基酸序列。

35. 权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽、含有WAP结构域的多肽和免疫球蛋白Fc多肽，使得丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽、含有WAP结构域的多肽和免疫球蛋白Fc多肽中的至少2种经由铰链区、接头区或经由铰链区和接头区两者操作性连接。

36. 权利要求2的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含AAT多肽、SLPI多肽和免疫球蛋白Fc多肽，使得AAT多肽、SLPI多肽和免疫球蛋白Fc多肽中的至少2种经由铰链区、接头区或经由铰链区和接头区两者操作性连接。

37. 权利要求35或权利要求36的分离的融合蛋白，其中所述铰链区、所述接头区或所述铰链区和所述接头区两者包含肽序列。

38. 权利要求1、权利要求2或权利要求3中任一项的分离的融合蛋白，其中修饰所述Fc多肽以增强FcRn结合。

39. 权利要求1-3中任一项的分离的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc多肽包含以下突变的至少一个：Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu或Met428Leu和Asn434Ser。

40. 权利要求1-3中任一项的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37的氨基酸序列。

41. 在有需要的受试者中治疗异常丝氨酸蛋白酶表达或活性相关的疾病或病症或缓解其症状的方法，所述方法包括给予前述权利要求中任一项的融合蛋白。

42. 在有需要的受试者中治疗炎性疾病或病症或缓解其症状的方法，所述方法包括给予前述权利要求中任一项的融合蛋白。

43. 在有需要的受试者中治疗感染性疾病或病症或缓解其症状的方法，所述方法包括给予前述权利要求中任一项的融合蛋白。

44. 权利要求41-43中任一项的方法，其中所述受试者是人。