CN114316068A - 丝氨酸蛋白酶抑制剂融合多肽和其使用方法 - Google Patents

丝氨酸蛋白酶抑制剂融合多肽和其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂融合多肽和其使用方法。本发明涉及分子，特别是多肽，更特别是融合蛋白，其包含丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列和包含至少一种以下多肽的第二多肽：Fc多肽或自Fc多肽衍生的氨基酸序列；细胞因子靶向多肽或自细胞因子靶向多肽衍生的序列；包含WAP结构域的多肽或自包含WAP的多肽衍生的序列；和白蛋白多肽或自血清白蛋白多肽衍生的氨基酸序列。本发明还涉及在各种治疗性和诊断性适应症中使用这样的分子的方法，以及产生这样的分子的方法。

Description

丝氨酸蛋白酶抑制剂融合多肽和其使用方法
本申请是申请日为2015年10月27日的中国专利申请201580071331.7“丝氨酸蛋白酶抑制剂融合多肽和其使用方法”的分案申请。
相关申请
本申请要求2014年10月27日提交的美国专利申请号14/524,832的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
序列表的并入
创建于2015年10月26日和大小为228KB的名为“INHI002002WO_SeqList.txt”的文本文件的内容，通过引用以其整体结合到本文中。
技术领域
本发明涉及分子，特别是多肽，更特别是融合蛋白，其包含丝氨酸蛋白酶(serpin)抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的氨基酸序列和第二多肽。另外，本发明涉及融合蛋白，其包含丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的氨基酸序列、第二多肽和第三多肽。特别是，本发明涉及包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和第二多肽的融合蛋白，或包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽、第二多肽和第三多肽的融合蛋白，其中本发明的融合蛋白的第二和第三多肽可以是以下的至少一种：Fc多肽或自Fc多肽衍生的氨基酸序列；细胞因子靶向多肽或自细胞因子靶向多肽衍生的序列；包含WAP结构域的多肽或自包含WAP的多肽衍生的序列；或白蛋白多肽或自血清白蛋白多肽衍生的氨基酸序列。本发明还涉及在各种治疗性和诊断性适应症中使用这样的分子的方法，以及产生这样的分子的方法。
背景技术
异常丝氨酸蛋白酶活性或蛋白酶与蛋白酶抑制剂的失衡可导致蛋白酶-介导的组织破坏和炎性反应。因此，对靶向异常丝氨酸蛋白酶活性和/或蛋白酶与蛋白酶抑制剂的失衡的治疗剂和疗法存在需要。此外，通过削弱异常细胞因子信号传导和丝氨酸蛋白酶活性，可获得提高的治疗效果。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白已经证实了抗感染活性，而靶向炎性细胞因子已表明增加感染风险。本发明的融合蛋白具有抑制炎性细胞因子活性和限制感染风险的潜力。
发明内容
本文所述的融合蛋白包含至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的氨基酸序列(多肽1)和第二多肽(多肽2)。另外，本文所述的融合蛋白包含丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的氨基酸序列(多肽1)、第二多肽(多肽2)和第三多肽(多肽3)。如本文可互换使用的，术语“融合蛋白”和“融合多肽”是指可操作连接至至少第二多肽或自至少第二多肽衍生的氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的氨基酸序列。融合蛋白的单个元件可以各种方式的任一种连接，包括例如，直接连接、使用中间肽或间隔肽、使用接头区、使用铰链区或使用接头和铰链区二者。在一些实施方案中，接头区可落入铰链区的序列内，或者铰链区可落入接头区的序列内。优选地，接头区是肽序列。例如，接头肽大约包括0-40个氨基酸，例如0-35个氨基酸，0-30个氨基酸，0-25个氨基酸或0-20个氨基酸。优选地，铰链区是肽序列。例如，铰链肽大约包括0-75个氨基酸，例如0-70个氨基酸，0-65个氨基酸或0-62个氨基酸。在其中融合蛋白包括接头区和铰链区二者的实施方案中，优选地，接头区和铰链区各自是肽序列。在这些实施方案中，铰链肽和接头肽一起大约包括0-90个氨基酸，例如0-85个氨基酸或0-82个氨基酸。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和第二多肽可通过中间结合蛋白连接。在一些实施方案中，融合蛋白的基于丝氨酸蛋白酶抑制剂的部分和第二多肽部分可经非共价连接。
在一些实施方案中，根据本发明的融合蛋白在N-末端至C-末端方向上或在C-末端至N-末端方向上可具有以下各式之一：
多肽1(a)–铰链m–多肽2(b)
多肽1(a)–接头n–多肽2(b)
多肽1(a)–接头n–铰链m–多肽2(b)
多肽1(a)–铰链m–接头n–多肽2(b)
多肽1(a)–多肽2(b)–多肽3(c)
多肽1(a)–铰链m–多肽2(b)–铰链m–多肽3(c)
多肽1(a)–接头n–多肽2(b)–接头n–多肽3(c)
多肽1(a)–铰链m–接头n–多肽2(b)–铰链m–接头n–多肽3(c)多肽1(a)–接头n–铰链m–多肽2(b)–接头n–铰链m–多肽3(c)
其中n是0-20的整数，其中m是1-62的整数和其中a、b和c是至少1的整数。这些实施方案包括上式和其任何变体或组合。例如，式中多肽的顺序还包括多肽3(c)–多肽1(a)–多肽2(b)、多肽2(b)–多肽3(c)–多肽1(a)、或其任何变体或组合。
在一些实施方案中，多肽1序列包括丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。丝氨酸蛋白酶抑制剂是一组具有类似结构的蛋白，其最初作为一组能够抑制蛋白酶的蛋白被鉴定。适合用于本文提供的融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白，以非限制性实例的方式，包括α-1抗胰蛋白酶(AAT)、抗胰蛋白酶-相关蛋白(丝氨酸蛋白酶抑制剂A2)、α1-抗胰凝乳蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂A3)、kallistatin(丝氨酸蛋白酶抑制剂A4)、单核细胞中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制剂B1)、PI-6(丝氨酸蛋白酶抑制剂B6)、抗凝血酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂C1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(丝氨酸蛋白酶抑制剂E1)、α2-抗血纤维蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂F2)、补体1-抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制剂G1)和神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制剂I1)。
在一些实施方案中，多肽1序列包括α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽序列或自AAT衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽1序列包括AAT蛋白的一部分。在一些实施方案中，多肽1序列包括至少AAT蛋白的反应位点环部分。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分包括至少氨基酸序列：GTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNK SEQ ID NO:1)。
在优选的实施方案中，AAT多肽序列或自AAT衍生的氨基酸序列是人AAT多肽序列或衍生自人AAT多肽序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包括具有以下氨基酸序列的全长人AAT多肽序列：
1 EDPQGDAAQK TDTSHHDQDH PTFNKITPNLAEFAFSLYRQ LAHQSNSTNI FFSPVSIATA
61 FAMLSLGTKA DTHDEILEGL NFNLTEIPEA QIHEGFQELL RTLNQPDSQL QLTTGNGLFL
121 SEGLKLVDKF LEDVKKLYHS EAFTVNFGDT EEAKKQINDY VEKGTQGKIV DLVKELDRDT
181 VFALVNYIFF KGKWERPFEV KDTEEEDFHV DQVTTVKVPM MKRLGMFNIQ HCKKLSSWVL
241 LMKYLGNATA IFFLPDEGKL QHLENELTHD IITKFLENED RRSASLHLPK LSITGTYDLK
301 SVLGQLGITK VFSNGADLSG VTEEAPLKLS KAVHKAVLTI DEKGTEAAGA MFLEAIPMSI
361 PPEVKFNKPF VFLMIEQNTK SPLFMGKVVN PTQK(SEQ ID NO:2)
在一些实施方案中，融合蛋白包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的人AAT多肽序列。
在一些实施方案中，AAT多肽序列是GenBank检索号AAB59495.1,CAJ15161.1,P01009.3,AAB59375.1,AAA51546.1,CAA25838.1,NP_001002235.1,CAA34982.1,NP_001002236.1,NP_000286.3,NP_001121179.1,NP_001121178.1,NP_001121177.1,NP_001121176.16,NP_001121175.1,NP_001121174.1,NP_001121172.1和/或AAA51547.1所示的一个或多个人AAT多肽序列，或自AAT多肽衍生的氨基酸序列自所述一个或多个人AAT多肽序列衍生。
在一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个突变。例如，融合蛋白包含在融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂部分的甲硫氨酸(Met)残基处的至少一个突变。在这些Met突变中，Met残基可被任何氨基酸置换。例如，Met残基可被具有疏水性侧链的氨基酸，例如亮氨酸(Leu,L)置换。不希望受理论的束缚，Met突变防止本发明的融合蛋白的氧化和随后抑制活性的失活。在一些实施方案中，Met残基可被带电荷的残基，例如谷氨酸(Glu,E)置换。在一些实施方案中，Met突变在AAT多肽的位置358处。例如，Met突变是Met358Leu(M358L)。在一些实施方案中，Met突变在AAT多肽的位置351处。例如，Met突变是Met351Glu(M351E)。在一些实施方案中，Met突变在AAT多肽的位置351和位置358处，例如Met突变是Met351Glu(M351E)和Met358Leu(M358L)。例如，融合AAT多肽的该变体的反应位点环具有以下序列：GTEAAGAEFLEAIPLSIPPEVKFNK(SEQ ID NO:32)。在一些实施方案中，Met突变在AAT多肽的位置351和位置358处，例如Met突变是Met351Leu(M351L)和Met358Leu(M358L)。例如，融合AAT多肽的该变体的反应位点环具有以下序列：GTEAAGALFLEAIPLSIPPEVKFNK(SEQ ID NO:33)。
在一些实施方案中，融合蛋白包括包含在M351和M358处修饰的变体反应位点环的全长人AAT多肽序列，其具有以下氨基酸序列：
1 EDPQGDAAQK TDTSHHDQDH PTFNKITPNL AEFAFSLYRQ LAHQSNSTNI FFSPVSIATA
61 FAMLSLGTKA DTHDEILEGL NFNLTEIPEA QIHEGFQELL RTLNQPDSQL QLTTGNGLFL
121 SEGLKLVDKF LEDVKKLYHS EAFTVNFGDT EEAKKQINDY VEKGTQGKIV DLVKELDRDT
181 VFALVNYIFF KGKWERPFEV KDTEEEDFHV DQVTTVKVPM MKRLGMFNIQ HCKKLSSWVL
241 LMKYLGNATA IFFLPDEGKL QHLENELTHD IITKFLENED RRSASLHLPK LSITGTYDLK
301 SVLGQLGITK VFSNGADLSG VTEEAPLKLS KAVHKAVLTI DEKGTEAAGA EFLEAIPLSI
361 PPEVKFNKPF VFLMIEQNTK SPLFMGKVVN PTQK(SEQ ID NO:80)
在一些实施方案中，融合蛋白包括与SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的人AAT多肽序列。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的第二多肽(多肽2)是Fc多肽或自Fc多肽衍生。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白”。本文所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列和Fc多肽或自Fc多肽衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白包括单一丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白包括超过一个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，和这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-Fc融合蛋白”，其中(a’)是至少2的整数。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-Fc融合蛋白中的每个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-Fc融合蛋白中的每个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括具有不同的氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-Fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽可位于融合蛋白内的任何位置。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分包括至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分的变体包括至少SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽至少包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的全长人AAT多肽序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽至少包括具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的全长人AAT多肽序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括与SEQ ID NO:2或32或33或80的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的人AAT多肽序列。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括AAT多肽序列或自AAT多肽衍生的氨基酸序列，所述AAT多肽序列是GenBank检索号AAB59495.1,CAJ15161.1,P01009.3,AAB59375.1,AAA51546.1,CAA25838.1,NP_001002235.1,CAA34982.1,NP_001002236.1,NP_000286.3,NP_001121179.1,NP_001121178.1,NP_001121177.1,NP_001121176.16,NP_001121175.1,NP_001121174.1,NP_001121172.1和/或AAA51547.1所示的一个或多个人AAT多肽序列，或自AAT多肽衍生的氨基酸序列自所述一个或多个人AAT多肽序列衍生。
在一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽是人Fc多肽，例如人IgG Fc多肽序列或自人IgG Fc多肽序列衍生的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，Fc多肽是人IgG1 Fc多肽或自人IgG1 Fc多肽序列衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽是人IgG2 Fc多肽或自人IgG2 Fc多肽序列衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽是人IgG3 Fc多肽或自人IgG3 Fc多肽序列衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽是人IgG4 Fc多肽或自人IgG4 Fc多肽序列衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽是人IgM Fc多肽或自人IgM Fc多肽序列衍生的氨基酸序列。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括具有以下氨基酸序列的人IgG1 Fc多肽序列：
1 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
181 TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:3)
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白包括与融合蛋白的Fc多肽的N-末端偶联的铰链区，其中Fc多肽包括具有以下氨基酸序列的人IgG1 Fc多肽序列：
1 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
61 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
121 GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
181 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:43)
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括与SEQ ID NO:3或43的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的人IgG1 Fc多肽序列。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，Fc多肽经突变或修饰以提高FcRn结合。在这些实施方案中，突变的或修饰的Fc多肽包括以下突变：Met252Tyr,Ser254Thr,Thr256Glu(M252Y,S256T,T256E)或Met428Leu和Asn434Ser(M428L,N434S)或Met428Val和Asn434Ser(M428V,N434S)，使用Kabat编号系统。在一些实施方案中，突变的或修饰的Fc多肽包括选自Met252Tyr(M252Y),Ser254Thr(S256T),Thr256Glu(T256E),Met428Leu(M428L),Met428Val(M428V),Asn434Ser(N434S)和其组合的一个或多个突变。在一些实施方案中，Fc多肽部分经突变或另外修饰，以破坏Fc-介导的二聚化。在这些实施方案中，融合蛋白在性质上是单体的。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，Fc多肽被突变或修饰。在一些实施方案中，突变的或修饰的Fc多肽包括在选自M252,T246,M428和其组合的位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中，突变的或修饰的Fc多肽包括以下突变：Met252Ile,Thr256Asp,Met428Leu(M252I,T256D,M428L)，使用Kabat编号系统。
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG1 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括在对应于上述SEQ ID NO:3的残基22,26和198或SEQ ID NO:43的残基32,36和208的残基M252,T256和M428处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LIISRDPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
181 TVDKSRWQQG NVFSCSVLHEALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:44)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG1 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括在对应于上述SEQ ID NO:3的残基22,26和198或SEQ ID NO:43的残基32,36和208的残基M252,T256和M428处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记:
1 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LIISRDPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
61 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
121 GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
181 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVLHE ALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:45)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG1 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括修饰的人IgG1 Fc多肽序列，其中对应于上述SEQ ID NO:3的残基6或SEQ ID NO:43的残基16的残基G236被缺失，和具有以下氨基酸序列：
1 APELLGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
121 PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:46)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG1 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括修饰的人IgG1 Fc多肽序列，其中对应于上述SEQ ID NO:3的残基6或SEQ ID NO:43的残基16的残基G236被缺失，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列：
1 DKTHTCPPCP APELLGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG
61 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
121 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD
181 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:47)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG1 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括在对应于上述SEQ ID NO:3的残基4和5或SEQ ID NO:43的残基14和15的残基L234和L235处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APEVAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
181 TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:48)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG1 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括在对应于上述SEQ ID NO:3的残基4和5或SEQ ID NO:43的残基14和15的残基L234和L235处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 DKTHTCPPCP APEVAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
61 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
121 GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
181 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:49)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG1 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括残基G236处的缺失和残基L234和L235处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APEVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
121 PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:50)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG1 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括残基G236处的缺失和残基L234和L235处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 DKTHTCPPCP APEVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG
61 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
121 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD
181 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:51)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG1 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括残基G236处的缺失和残基L234,L235,M252,T256和M428处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APEVAGPSVF LFPPKPKDTL IISRDPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
121 PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN VFSCSVLHEALHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:52)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG1 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括残基G236处的缺失和残基L234,L235,M252,T256和M428处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 DKTHTCPPCP APEVAGPSVF LFPPKPKDTL IISRDPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG
61 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
121 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD
181 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVLHEA LHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:53)在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG1 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG1 Fc多肽包括修饰的人IgG1 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO:44,45,46,47,48,49,50,51,52或53的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括人IgG2 Fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：
1 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL
121 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:4)
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括人IgG2 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG2 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG2 Fc多肽包括修饰的人IgG2 Fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL IISRDPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL
121 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN VFSCSVLHEALHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:54)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG2 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG2 Fc多肽包括修饰的人IgG2 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括人IgG3 Fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：
1 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT
121 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL
181 TVDKSRWQQG NIFSCSVMHEALHNRFTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:5)
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括人IgG3 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG3 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG3 Fc多肽包括修饰的人IgG3 Fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LIISRDPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT
121 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL
181 TVDKSRWQQG NIFSCSVLHEALHNRFTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:55)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG3 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG3 Fc多肽包括修饰的人IgG3 Fc多肽序列，其中对应于上述SEQ ID NO:5的残基6的残基G236被缺失，和具有以下氨基酸序列：
1 APELLGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFKWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQYNSTFR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL
121 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESSGQPENNY NTTPPMLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN IFSCSVMHEA LHNRFTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:56)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG3 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG3 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:5的残基4和5的残基L234和L235处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APEVAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT
121 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL
181 TVDKSRWQQG NIFSCSVMHEALHNRFTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:57)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG3 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG3 Fc多肽包括残基G236处的缺失和残基L234和L235处的突变，和具有以下氨基酸序列：
1 APEVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFKWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQYNSTFR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL
121 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESSGQPENNY NTTPPMLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN IFSCSVMHEA LHNRFTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:58)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG3 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG3 Fc多肽包括残基G236处的缺失和残基L234,L235,M252,T256和M428处的突变，和具有以下氨基酸序列：
1 APEVAGPSVF LFPPKPKDTL IISRDPEVTC VVVDVSHEDP EVQFKWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQYNSTFR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL
121 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESSGQPENNY NTTPPMLDSD GSFFLYSKLT
181 VDKSRWQQGN IFSCSVLHEA LHNRFTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:59)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG3 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG3 Fc多肽包括修饰的人IgG3 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO:55,56,57,58或59的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在一些实施方案中，人IgG3 Fc区在氨基酸Asn297(Kabat编号)处被修饰，以阻止抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)。在一些实施方案中，人IgG3 Fc区在氨基酸435处被修饰，以延长半寿期，例如Arg435His(R435H)。在一些实施方案中，人IgG3 Fc区缺少Lys447(Kabat et al 1991 Sequences ofProteins ofImmunological Interest中的EU索引)。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括人IgG4 Fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：
1 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL
181 TVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK(SEQ ID NO:6)
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括与融合蛋白的Fc多肽的N-末端偶联的铰链区，其中Fc多肽包括人IgG4 Fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：
1 ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY
61 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK
121 AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
181 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:60)
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括人IgG4 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO:6或60的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG4 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:6的残基22,26和19或SEQ ID NO:60的残基34,38和210的残基M252,T256和M428处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LIISRDPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL
181 TVDKSRWQEG NVFSCSVLHEALHNHYTQKS LSLSLGK(SEQ ID NO:61)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG4 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:6的残基22,26和197或SEQ ID NO:60的残基34,38和210的残基M252,T256和M428处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLIISRDPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY
61 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK
121 AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
181 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVL HEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:62)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG4 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括修饰的人IgG4 Fc多肽序列，其中对应于上述SEQ ID NO:6的残基6或SEQ ID NO:60的残基19的残基G236被缺失，和具有以下氨基酸序列：
1 APEFLGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP
61 REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL
121 PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT
181 VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLGK(SEQ ID NO:63)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG4 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括修饰的人IgG4 Fc多肽序列，其中对应于上述SEQ ID NO:6的残基6或SEQ ID NO:60的残基19的残基G236被缺失，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列：
1 ESKYGPPCPS CPAPEFLGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV
61 DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA
121 KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
181 SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK(SEQ ID NO:64)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG4 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:6的残基5或SEQ ID NO:60的残基17的残基L235处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL
181 TVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK(SEQ ID NO:65)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG4 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:6的残基5或SEQID NO:60的残基17的残基L235处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 ESKYGPPCPS CPAPEFEGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY
61 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK
121 AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
181 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:66)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG4 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:6的残基4和5或SEQ ID NO:60的残基16和17的残基L234和L235处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APEVAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL
181 TVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK(SEQ ID NO:67)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG4 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:6的残基4和5或SEQ ID NO:60的残基16和17的残基L234和L235处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 ESKYGPPCPS CPAPEVAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY
61 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK
121 AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
181 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:68)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG4 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:60的残基10的残基S228处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY
61 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK
121 AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
181 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:69)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG4 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:60的残基10和17的残基S228和L235处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 ESKYGPPCPP CPAPEFEGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY
61 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK
121 AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
181 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:70)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG4 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:6的残基5,22,26和197或SEQ ID NO:60的残基17,34,38和210的残基L235,M252,T256和M428处的突变，和具有以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LIISRDPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
61 PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
121 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL
181 TVDKSRWQEG NVFSCSVLHEALHNHYTQKS LSLSLGK(SEQ ID NO:71)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG4 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:6的残基5,22,26和197或SEQ ID NO:60的残基17,34,38和210的残基L235,M252,T256和M428处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 ESKYGPPCPS CPAPEFEGGP SVFLFPPKPK DTLIISRDPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY
61 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK
121 AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
181 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVL HEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:72)
在其中本发明的融合蛋白包括与修饰的IgG4 Fc多肽的N-末端偶联的铰链区的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括对应于上述SEQ ID NO:60的残基10,17,34,38和210的残基S228,L235,M252,T256和M428处的突变，和融合蛋白包括至少以下氨基酸序列，其中突变的氨基酸残基用框标记：
1 ESKYGPPCPP CPAPEFEGGP SVFLFPPKPK DTLIISRDPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY
61 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK
121 AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
181 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVL HEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:73)
在其中本发明的融合蛋白包括修饰的IgG4 Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的修饰的IgG4 Fc多肽包括修饰的人IgG4 Fc多肽序列，其与SEQ ID NO:61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括人IgM Fc多肽序列，其具有以下氨基酸序列：
1 IAELPPKVSV FVPPRDGFFG NPRKSKLICQ ATGFSPRQIQ VSWLREGKQV GSGVTTDQVQ
61 AEAKESGPTT YKVTSTLTIK ESDWLGQSMF TCRVDHRGLT FQQNASSMCV PDQDTAIRVF
121 AIPPSFASIF LTKSTKLTCL VTDLTTYDSV TISWTRQNGE AVKTHTNISE SHPNATFSAV
181 GEASICEDDW NSGERFTCTV THTDLPSPLK QTISRPKG(SEQ ID NO:7)
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，融合蛋白的Fc多肽包括人IgM Fc多肽序列，其与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的氨基酸序列，其可操作连接至Fc多肽序列，所述Fc多肽序列包括或衍生自SEQID NO:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包括选自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包括与选自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分包括至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过接头区可操作连接，例如甘氨酸-丝氨酸接头或基于甘氨酸-丝氨酸的接头。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过铰链区可操作连接。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过接头区和铰链区可操作连接。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽直接连接。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的变体的氨基酸序列，其可操作连接至Fc多肽序列，所述Fc多肽序列包括或衍生自SEQ ID NO:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包括选自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包括与选自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分的变体包括至少SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过接头区可操作连接，例如甘氨酸-丝氨酸接头或基于甘氨酸-丝氨酸的接头。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过铰链区可操作连接。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过接头区和铰链区可操作连接。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽直接连接。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白至少包括具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的全长人AAT多肽序列，其可操作连接至Fc多肽序列，所述Fc多肽序列包括或衍生自SEQ ID NO:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包括选自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包括与选自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的人AAT多肽序列，其可操作连接至Fc多肽序列，所述Fc多肽序列包括或衍生自SEQ ID NO:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包括选自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽包括与选自43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72和73的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过接头区可操作连接，例如甘氨酸-丝氨酸接头或基于甘氨酸-丝氨酸的接头。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过铰链区可操作连接。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过接头区和铰链区可操作连接。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽直接连接。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白至少包括具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的全长人AAT多肽序列，其可操作连接至Fc多肽序列，所述Fc多肽序列包括或衍生自SEQ ID NO:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白包括与SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的人AAT多肽序列，其可操作连接至Fc多肽序列，所述Fc多肽序列包括或衍生自SEQ ID NO:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过接头区可操作连接，例如甘氨酸-丝氨酸接头或基于甘氨酸-丝氨酸的接头。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过铰链区可操作连接。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽通过接头区和铰链区可操作连接。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和Fc多肽直接连接。
在本文提供的融合蛋白的一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的第二多肽(多肽2)是细胞因子靶向多肽或自细胞因子靶向多肽衍生。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白”。本文所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽或其衍生物。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白包括单个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白包括超过一个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，和这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-细胞因子靶向多肽融合蛋白”，其中(a’)是至少2的整数。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-细胞因子靶向多肽融合蛋白中的每个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂(a)-细胞因子靶向多肽融合蛋白中的每个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括具有不同的氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白的细胞因子靶向多肽是细胞因子受体或自细胞因子受体衍生。在优选的实施方案中，细胞因子靶向多肽或衍生自细胞因子受体的氨基酸序列是人细胞因子受体序列或衍生自人细胞因子受体序列。在其它实施方案中，细胞因子靶向多肽是抗体或抗体片段，例如抗-细胞因子抗体或抗-细胞因子抗体片段。在优选的实施方案中，细胞因子靶向多肽或自抗体或抗体片段衍生的氨基酸序列，衍生自嵌合、人源化或全人抗体序列。术语抗体片段包括单链、Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
在其它实施方案中，细胞因子靶向多肽结合细胞因子受体和阻止细胞因子与受体的结合。在其它实施方案中，细胞因子靶向多肽是抗体或抗体片段，例如抗-细胞因子受体抗体或抗-细胞因子受体抗体片段。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分包括至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分的变体包括至少SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括或衍生自至少具有SEQID NO:2的氨基酸序列的全长人AAT多肽序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括或衍生自至少具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的全长人AAT多肽序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括人AAT多肽序列，其与SEQ ID NO:2或32或33或80的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括AAT多肽序列或自AAT多肽衍生的氨基酸序列，其是或衍生自GenBank检索号AAB59495.1,CAJ15161.1,P01009.3,AAB59375.1,AAA51546.1,CAA25838.1,NP_001002235.1,CAA34982.1,NP_001002236.1,NP_000286.3,NP_001121179.1,NP_001121178.1,NP_001121177.1,NP_001121176.16,NP_001121175.1,NP_001121174.1,NP_001121172.1和/或AAA51547.1所示的一个或多个人AAT多肽序列。
丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白可掺有丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的一部分。例如，抗体包含Fc多肽。因此，在其中细胞因子靶向多肽是细胞因子-靶向抗体的一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白将掺有丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的一部分。此外，具有治疗性功用的大多数受体融合蛋白是Fc融合蛋白。因此，在其中丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子受体融合蛋白的一些实施方案中，除了丝氨酸蛋白酶抑制剂部分和细胞因子受体部分之外，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白还可掺有Fc多肽。
在其中丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白包括Fc多肽序列的一些实施方案中，Fc多肽序列包括或衍生自SEQ ID NO:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73中任一个的氨基酸序列。在其中丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白包括Fc多肽序列的一些实施方案中，Fc多肽序列与SEQ ID NO:3,4,5,6,7,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72或73的任一个氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和细胞因子靶向多肽通过接头区可操作连接，例如甘氨酸-丝氨酸接头或基于甘氨酸-丝氨酸的接头。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和细胞因子靶向多肽通过铰链区可操作连接。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和细胞因子靶向多肽通过接头区和铰链区可操作连接。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和细胞因子靶向多肽直接连接。
在本文提供的融合蛋白的一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的第二多肽(多肽2)是包含乳清酸性蛋白(WAP)结构域的多肽，或衍生自包含WAP结构域的多肽的氨基酸序列。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白”。丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或至少自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列、包含WAP结构域的多肽或衍生自包含WAP结构域的多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白包括单个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP靶向多肽融合蛋白包括超过一个丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-WAP结构域融合蛋白”，其中(a’)是至少2的整数。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-WAP结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-细胞因子靶向多肽融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括具有不同的氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。
这些丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白包括包含WAP结构域的多肽或是或衍生自包含WAP结构域的多肽的多肽序列。WAP结构域是50个氨基酸的进化上保守的序列基序，其包含以特征性的4-二硫键核心排列存在的8个半胱氨酸(亦称为4-二硫键核心基序)。WAP结构域序列基序是在许多蛋白中特征为丝氨酸蛋白酶抑制活性的功能基序。
适合用于本文提供的融合蛋白的包含WAP结构域的多肽，以非限制性实例的方式，包括分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、弹性蛋白酶抑制剂(Elafin)和Eppin。
在一些实施方案中，融合蛋白的包含WAP结构域的多肽序列包括分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)多肽序列或衍生自SLPI的氨基酸序列。这些实施方案在本文称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI-衍生的融合蛋白”。在一些实施方案中，SLPI多肽序列包含SLPI蛋白的一部分，例如WAP2结构域或其子部分。在优选的实施方案中，SLPI多肽序列或衍生自SLPI的氨基酸序列是或衍生自人SLPI多肽序列。
在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的SLPI序列或SLPI-衍生序列包括具有以下氨基酸序列的全长人SLPI多肽序列：
1 MKSSGLFPFL VLLALGTLAP WAVEGSGKSF KAGVCPPKKS AQCLRYKKPE CQSDWQCPGK
61 KRCCPDTCGI KCLDPVDTPN PTRRKPGKCP VTYGQCLMLN PPNFCEMDGQ CKRDLKCCMG
121 MCGKSCVSPV KA(SEQ ID NO:8)
在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的SLPI序列或SLPI-衍生序列包括人SLPI多肽序列，其与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的SLPI序列或SLPI-衍生序列包括全长人SLPI多肽序列的一部分，其中该部分具有以下氨基酸序列：
1 SGKSFKAGVC PPKKSAQCLR YKKPECQSDW QCPGKKRCCP DTCGIKCLDP VDTPNPTRRK
61 PGKCPVTYGQ CLMLNPPNFC EMDGQCKRDL KCCMGMCGKS CVSPVKA(SEQ ID NO:9)
在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的SLPI序列或SLPI-衍生序列包括人SLPI多肽序列，其与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的SLPI序列或SLPI-衍生序列包括全长人SLPI多肽序列的WAP2结构域，其中WAP2结构域具有以下氨基酸序列：
1 TRRKPGKCPV TYGQCLMLNP PNFCEMDGQC KRDLKCCMGM CGKSCVSPVK A(SEQ ID NO:10)在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的SLPI序列或SLPI-衍生序列包括人SLPI多肽序列，其与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI融合蛋白的一些实施方案中，SLPI多肽序列或自SLPI多肽衍生的氨基酸序列是或衍生自GenBank检索号CAA28187.1,NP_003055.1,EAW75869.1,P03973.2,AAH20708.1,CAB64235.1,CAA28188.1,AAD19661.1和/或BAG35125.1所示的一个或多个人SLPI多肽序列。
在本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白的SLPI多肽序列或SLPI-衍生序列包括在甲硫氨酸(Met)残基处被修饰的人SLPI多肽序列。在这些Met突变中，Met残基可被任何氨基酸置换。例如，Met残基可被具有疏水性侧链的氨基酸置换，例如亮氨酸(Leu,L)或缬氨酸(Val,V)。不希望受理论的束缚，Met突变阻止本发明的融合蛋白的氧化和随后的抑制活性失活。在一些实施方案中，Met突变在SLPI多肽的位置98。例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂-SLPI的修饰的SLPI多肽序列包括SEQ ID NO:8中的突变M98L或M98V。
在其它实施方案中，融合蛋白的包含WAP结构域的多肽序列包括弹性蛋白酶抑制剂多肽序列或衍生自弹性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列。这些实施方案在本文称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂–弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白。在一些实施方案中，弹性蛋白酶抑制剂多肽序列包括弹性蛋白酶抑制剂蛋白的一部分，例如WAP结构域或其子部分。在优选的实施方案中，弹性蛋白酶抑制剂多肽序列或衍生自弹性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列是或衍生自人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列。
在丝氨酸蛋白酶抑制剂–弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括全长人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列，其具有以下氨基酸序列：
1 MRASSFLIVV VFLIAGTLVL EAAVTGVPVK GQDTVKGRVP FNGQDPVKGQ VSVKGQDKVK
61 AQEPVKGPVS TKPGSCPIIL IRCAMLNPPN RCLKDTDCPG IKKCCEGSCG MACFVPQ(SEQID NO:11)
在丝氨酸蛋白酶抑制剂–弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列，其与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在丝氨酸蛋白酶抑制剂–弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括全长人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列的一部分，其中该部分具有以下氨基酸序列：
1 AVTGVPVKGQ DTVKGRVPFN GQDPVKGQVS VKGQDKVKAQ EPVKGPVSTK PGSCPIILIR
61 CAMLNPPNRC LKDTDCPGIK KCCEGSCGMA CFVPQ(SEQ ID NO:12)
在丝氨酸蛋白酶抑制剂–弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列，其与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在丝氨酸蛋白酶抑制剂–弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括全长人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列的WAP结构域，其中WAP结构域具有以下氨基酸序列：
1 VSTKPGSCPI ILIRCAMLNP PNRCLKDTDC PGIKKCCEGS CGMACFVPQ(SEQ ID NO:13)在丝氨酸蛋白酶抑制剂–弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包括人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列，其与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在丝氨酸蛋白酶抑制剂–弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白的一些实施方案中，弹性蛋白酶抑制剂多肽序列或自弹性蛋白酶抑制剂多肽衍生的氨基酸序列衍生自GenBank检索号P19957.3,NP_002629.1,BAA02441.1,EAW75814.1,EAW75813.1,Q8IUB2.1和/或NP_542181.1所示的一个或多个人弹性蛋白酶抑制剂多肽序列。
在其它实施方案中，融合蛋白的包含WAP结构域的多肽序列包括Eppin多肽序列或衍生自Eppin的氨基酸序列。这些实施方案在本文称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)–Eppin融合蛋白。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂–Eppin融合蛋白的Eppin多肽序列包括Eppin蛋白的一部分，例如WAP结构域或其子部分。在优选的实施方案中，Eppin多肽序列或衍生自Eppin的氨基酸序列是或衍生自人Eppin多肽序列。
在丝氨酸蛋白酶抑制剂–Eppin融合蛋白的一些实施方案中，Eppin多肽序列或自Eppin多肽衍生的氨基酸序列是或衍生自GenBank检索号O95925.1,NP_065131.1,AAH44829.2,AAH53369.1,AAG00548.1,AAG00547.1和/或AAG00546.1所示的一个或多个人Eppin多肽序列。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分包括至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分的氨基酸序列包括至少SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少全长人AAT多肽序列，其具有SEQID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括或衍生自至少全长人AAT多肽序列，其具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括人AAT多肽序列，其与SEQ ID NO:2或32或33或80的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括AAT多肽序列或自AAT多肽衍生的氨基酸序列，所述AAT多肽序列是GenBank检索号AAB59495.1,CAJ15161.1,P01009.3,AAB59375.1,AAA51546.1,CAA25838.1,NP_001002235.1,CAA34982.1,NP_001002236.1,NP_000286.3,NP_001121179.1,NP_001121178.1,NP_001121177.1,NP_001121176.16,NP_001121175.1,NP_001121174.1,NP_001121172.1和/或AAA51547.1所示的一个或多个人AAT多肽序列，或所述自AAT多肽衍生的氨基酸序列自所述一个或多个人AAT多肽序列衍生。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白还可包括Fc多肽或自Fc多肽衍生的氨基酸序列。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc-WAP结构域融合蛋白”。在这些实施方案中，该术语不应解释为特定的顺序。例如，融合蛋白的顺序可以是丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc-WAP结构域、丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域-Fc或其任何变体组合。本文所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc-WAP结构域融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列、包含WAP结构域的多肽或衍生自包含WAP结构域的多肽的氨基酸序列，和Fc多肽或自Fc多肽衍生的氨基酸序列。
在其中丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白包括Fc多肽序列的一些实施方案中，Fc多肽序列可具有SEQ ID NO:3-7和43-73的氨基酸序列。在其中丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白包括Fc多肽序列的其它实施方案中，Fc多肽序列可与SEQ ID NO.3-7和43-73的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白还可包括白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白-WAP结构域融合蛋白”。在这些实施方案中，该术语不应解释为特定的顺序。例如，融合蛋白的顺序可以是丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白-WAP结构域、丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域-白蛋白或其任何变体组合。本文所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白-WAP结构域融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列、包含WAP结构域的多肽或衍生自包含WAP结构域的多肽的氨基酸序列，和白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。
在其中丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白包括白蛋白多肽序列的一些实施方案中，白蛋白多肽序列包括本文所述的SEQ ID NO:14-15的氨基酸序列。在其中丝氨酸蛋白酶抑制剂-WAP结构域融合蛋白包括白蛋白多肽序列的其它实施方案中，白蛋白多肽序列与具有SEQ ID NO:14或15的任何一个氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的第二多肽(多肽2)是白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽。这些实施方案在本文统称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-白蛋白融合蛋白”。本文所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列和白蛋白多肽或衍生自白蛋白多肽的氨基酸序列。此外，本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂白蛋白结合多肽融合蛋白，其中白蛋白通过中间结合分子可操作连接至丝氨酸蛋白酶抑制剂。本文中，丝氨酸蛋白酶抑制剂非共价或共价连接至人血清白蛋白。
在其中本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列是人血清白蛋白(HSA)多肽或自HSA衍生的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包括具有以下氨基酸序列的HSA多肽序列：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO:14)
在其中本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括人血清白蛋白多肽序列，其与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在其中本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括人血清白蛋白多肽序列的结构域3，具有以下氨基酸序列：
EEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA(SEQ ID NO:15)
在其中本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的实施方案中，融合蛋白的白蛋白多肽序列包括人血清白蛋白多肽序列，其与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在其中本发明的融合蛋白包括白蛋白多肽序列的一些实施方案中，融合蛋白通过中间白蛋白结合多肽连接至人血清白蛋白。白蛋白结合多肽可以是抗体或抗体片段或自抗体或抗体片段衍生。在优选的实施方案中，白蛋白结合多肽或衍生自抗体或抗体片段的氨基酸序列衍生自嵌合、人源化或全人抗体序列。术语抗体片段包括单链、Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scAb、dAb、单一结构域重链抗体和单一结构域轻链抗体。此外，白蛋白结合多肽可以是白蛋白结合肽。本发明的另一实施方案是丝氨酸蛋白酶抑制剂白蛋白结合多肽融合物，其中白蛋白结合多肽是链球菌蛋白G的结构域3或自链球菌蛋白G的结构域3衍生的序列。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂(a’)-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分包括至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少AAT蛋白的反应位点环部分的变体的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAT蛋白的反应位点环部分的变体包括至少SEQID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括至少全长人AAT多肽序列，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括或衍生自至少全长人AAT多肽序列，其具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在一些实施方案中丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括人AAT多肽序列，其与SEQ ID NO:2或32或33或80的氨基酸序列具有至少50％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性。
在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽包括AAT多肽序列或自AAT多肽衍生的氨基酸序列，AAT多肽序列或自AAT多肽衍生的氨基酸序列是或衍生自GenBank检索号AAB59495.1,CAJ15161.1,P01009.3,AAB59375.1,AAA51546.1,CAA25838.1,NP_001002235.1,CAA34982.1,NP_001002236.1,NP_000286.3,NP_001121179.1,NP_001121178.1,NP_001121177.1,NP_001121176.16,NP_001121175.1,NP_001121174.1,NP_001121172.1和/或AAA51547.1所示的一个或多个人AAT多肽序列。
在一些实施方案中，融合蛋白经修饰以增加或以其它方式抑制蛋白水解裂解，例如通过突变一个或多个蛋白水解裂解位点。在一些实施方案中，与未改变的融合蛋白相比，融合蛋白经修饰以改变或以其它方式调节融合蛋白的Fc效应功能，同时保留结合和抑制功能。Fc效应功能，以非限制性实例的方式，包括Fc受体结合，在与Fc受体结合时阻止促炎性介质释放，吞噬作用，修饰的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，修饰的补体依赖性细胞毒性(CDC)，修饰的Fc多肽Asn297残基处糖基化(Kabat编号的EU索引,Kabat et al 1991Sequencess of Proteins of Immunological Interest)。在一些实施方案中，融合蛋白经突变或以其它方式修饰以影响Fc受体结合。在一些实施方案中，Fc多肽经修饰以增强FcRn结合。增强与FcRn结合的Fc多肽突变的实例是Met252Tyr,Ser254Thr,Thr256Glu(M252Y,S256T,T256E)(Kabat编号,Dall’Acqua et al 2006,J.Biol Chem Vol 281(33)23514–23524)或Met428Leu和Asn434Ser(M428L,N434S)(Zalevsky et al 2010Nature Biotech,Vol.28(2)157-159).(Kabat et al 1991Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest的EU索引)或Met428Val和Asn434Ser(M428V,N434S)，使用Kabat编号系统。在一些实施方案中，突变的或修饰的Fc多肽包括选自Met252Tyr(M252Y),Ser254Thr(S256T),Thr256Glu(T256E),Met428Leu(M428L),Met428Val(M428V),Asn434Ser(N434S)和其组合的一个或多个突变。在一些实施方案中，Fc多肽部分经突变或以其它方式修饰以破坏Fc-介导的二聚化(Ying et al 2012J.Biol Chem 287(23):19399–19408)。在这些实施方案中，融合蛋白在性质上是单体的。
本文提供的融合蛋白和其变体显示抑制活性，例如通过抑制丝氨酸蛋白酶，例如人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)，一种胰凝乳蛋白酶折叠的丝氨酸蛋白酶(chemotrypsin-fold serine protease)，其由中性粒细胞在炎性反应期间分泌。本文提供的融合蛋白在结合丝氨酸蛋白酶例如人丝氨酸蛋白酶或以其它方式与其相互作用时，完全或部分地减少或以其它方式调节丝氨酸蛋白酶表达或活性。当融合蛋白和人丝氨酸蛋白酶蛋白、多肽和/或肽之间相互作用时，丝氨酸蛋白酶的生物功能的减少或调节是完全的或部分的。与不存在相互作用，例如与本文所述的融合蛋白结合时丝氨酸蛋白酶表达或活性水平相比，当在存在融合蛋白时丝氨酸蛋白酶表达或活性的水平降低至少95％，例如96％,97％,98％,99％或100％时，融合蛋白被认为完全抑制丝氨酸蛋白酶表达或活性。与不存在相互作用，例如与本文所述的融合蛋白结合时丝氨酸蛋白酶表达或活性水平相比，当在存在融合蛋白时丝氨酸蛋白酶表达或活性的水平降低少于95％，例如10％,20％,25％,30％,40％,50％,60％,75％,80％,85％或90％时，融合蛋白被认为部分地抑制丝氨酸蛋白酶表达或活性。
本文所述的融合蛋白可用于各种治疗性、诊断性和预防性适应症。例如，融合蛋白可用于治疗受试者的各种疾病和病症。在一些实施方案中，包括本文所述的融合蛋白的丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白可用于治疗受试者的疾病或病症、减轻其症状、改善受试者的疾病或病症和/或延迟其进展，所述受试者患有选自以下的疾病或病症，或经鉴定处于选自以下的疾病或病症的风险中：α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺部癌症、缺血-再灌注损伤、包括例如心脏移植后的缺血/灌注损伤、心肌梗塞、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、I型和/或II型糖尿病、细菌感染、真菌感染、病毒感染、肺炎、脓毒症、移植物抗宿主病(GVHD)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化。
依据本发明的药物组合物包括本发明的融合蛋白，其包含修饰的融合蛋白和其它变体，以及合适的载体。这些药物组合物可包括在药剂盒中，例如诊断性药剂盒。
附图说明
图1A是根据本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白的一些实施方案的示意图。丝氨酸蛋白酶抑制剂可位于融合蛋白内的任何位置。还提供了掺有超过一种丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc融合蛋白。图1B是SDS-PAGE凝胶的照片，显示血清来源的AAT(泳道1)、AAT-Fc1(泳道2,人IgG1 Fc)和AAT-EL-Fc1(泳道3,AAT内的Met351Glu,Met358Leu突变,人IgG1 Fc)。图1C是显示AAT-Fc融合蛋白抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性的图。图1D是SDS-PAGE凝胶的照片，显示四价AAT-Fc-AAT，每个Fc多肽具有两个AAT多肽。图1E是显示四价AAT-Fc-AAT融合蛋白抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性的图。图1F是显示自蛋白A树脂的低pH洗脱效果的图，其中以低pH洗脱的AAT-Fc融合蛋白的NE抑制能力显著降低。图1G是显示与野生型AAT和单突变体AAT-EM-Fc(Met351Glu)相比，双重突变体AAT-EL-Fc(Met351Glu,Met358Leu突变)抵抗H2O2失活(浓)的图。图1H是描述与给予10mg/kg蛋白的大鼠(3只大鼠/试验蛋白)中的AAT-Fc相比，血清来源的AAT(sdAAT)的血清清除速率的图。AAT-Fc的半寿期显著长于sdAAT。
图2A是本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向融合蛋白的一些实施方案的示意图。丝氨酸蛋白酶抑制剂可融合至抗体的重链、轻链或二者。还描述了丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子受体融合蛋白。图2B是SDS-PAGE凝胶的照片，显示D2E7抗体(泳道1)和具有融合至重链的AAT的D2E7抗体(泳道2)。图2C是显示融合至AAT的D2E7抗体抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性的图。对于NE抑制，血清来源的AAT显示为阳性对照，而单独的D2E7抗体显示为阴性对照。
图3A是丝氨酸蛋白酶抑制剂-Fc-WAP融合蛋白的一些实施方案的示意图。图3B是SDS-PAGE凝胶的照片，显示AAT-Fc-弹性蛋白酶抑制剂(泳道1)和AAT-Fc-SLPI(泳道2)。图3C是显示AAT-Fc-弹性蛋白酶抑制剂融合蛋白和AAT-Fc-SLPI融合蛋白抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性的图。AAT-Fc融合蛋白和血清来源的AAT包括在内用于比较。
图4A是AAT-HSA融合蛋白的一些实施方案的示意图。图4B是SDS-PAGE凝胶的照片，显示AAT-HSA融合物。图4C是显示与血清来源的AAT相比，AAT-HSA抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性的图。
发明详述
人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)是一种胰凝乳蛋白酶折叠的丝氨酸蛋白酶，由中性粒细胞在炎症期间分泌。NE的异常活性导致弹性蛋白组织的进行性降解和肺中肺泡结构的缓慢破坏，导致肺气肿和肺纤维化(Lungarella et al 2008Int.J.Biochem Cell Biol40:1287)。通常，错误指导的NE活性是由于蛋白酶与其天然抑制剂α1-抗胰蛋白酶(AAT)的失衡。这种失衡可由于中性粒细胞侵润至肺的升高导致，如在吸烟者和囊性纤维化(CF)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的患者的肺中所观察到的。相反，AAT缺陷，通常由于引起在肝中ATT聚集和累积的点突变导致，使肺暴露于未受抑制的NE活性。具有AAT缺陷的个体处于增加的肺气肿、COPD、肝病和许多其它疾病的风险中。
AAT缺陷影响大约100,000名美国人(根据来自α-1基金会的估算)，和许多受累的人在他们30多岁和40多岁时死亡。目前仅有几种FDA-批准的药物用于治疗ATT缺陷(
Figure BDA0003382463750000321
AralastTM,
Figure BDA0003382463750000322
GlassiaTM)。每种药物是源自合并的人血浆的天然AAT，这显得不足以满足预期的临床需求。此外，这些产品具有短的血清半寿期(T1/2为大约5天)和需要高剂量(60mg/kg体重)每周输注。这些药物的当前市场估值为大约4亿美元。根据多至95％的AAT-缺陷个体未被诊断的估算和以下事实，AAT-样药物的市场可能显著更大：这些药物有可能在并非AAT-缺陷的个体中有效治疗特征为NE活性升高的病状(例如，囊性纤维化(CF)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、吸烟引起的肺气肿和/或COPD)。
AAT已表明具有广谱抗-炎活性(Tilg et al 1993 J Exp Med 178:1629–1636,Libert et al 1996Immunol 157:5126–5129,Pott et al,Journal of LeukocyteBiology 85 2009,Janciauskiene et al 2007 J.Biol Chem 282(12):8573–8582,Nitaet al 2007 Int J Biochem Cell Biol 39:1165–1176)。最近，已提出AAT可用于治疗除了通常提议的炎性肺病况之外的许多人病理的证据。人AAT已显示保护小鼠免于实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的临床和组织病理学迹象，表明其可为自身免疫疾病的潜在治疗，例如多发性硬化或系统性红斑狼疮(SLE)(Subramanian et al 2011 Metab Brain Dis 26:107–113)。血清AAT已显示在移植物抗宿主病(GVHD)的啮齿动物模型中的活性(Tawara etal 2011 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:564–569,Marcondes et al 2011 Blood Nov 3；118(18):5031-9)，这导致使用AAT治疗类固醇无响应性急性GVHD的个体的人类临床试验(NCT01523821)。另外，AAT在I型和II型糖尿病的动物模型中是有效的，抑制炎症，保护胰岛细胞免于凋亡和使得能够持久的胰岛细胞同种异体移植(Zhang et al 2007 Diabetes56:1316–1323,Lewis et al 2005 Proc Natl Acad SciUSA 102:12153–12158,Lewis etal 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105:16236–16241,Kalis et al 2010 Islets 2:185–189)。目前，有使用血清来源的AAT产品的许多I型糖尿病的早期人类临床试验(NCT01183468,NCT01319331,NCT01304537)。
目前血清来源的AAT产品经过广泛纯化和试验，以确保除去病原性病毒，然而，不能完全消除感染性病原传播的风险。此外，血清是有限的，这限制了血清来源的AAT的产生能力。解决血清来源产品和生产问题的顾虑的尝试已把目标放在重组AAT的表达上。然而，经过20年的努力，治疗上有活力的重组AAT的产生仍未上市(Karnaukhova et al 2006Amino Acids 30:317)。像血浆来源的产品一样，重组形式的AAT具有短的血清半寿期、低产率和差的肺分布。
与未修饰的AAT分子相比，本发明的融合蛋白具有提高的功能。AAT多肽与第二多肽(其与新生Fc受体(FcRn)相互作用的)的融合用于增加血清半寿期，为患者提供许多需要的给药益处。融合蛋白的这些FcRn相互作用多肽包括源自人IgG1,IgG2,IgG3,IgG4或IgM的免疫球蛋白(Ig)Fc多肽和人白蛋白的衍生物。在一些实施方案中，融合蛋白掺有AAT部分的突变，其赋予分子更耐受氧化导致的失活。例如，Met351Glu,Met358Leu(AAT-EL-Fc)证实耐受H2O2氧化导致的失活(图1G)。尽管AAT是天然的抗-炎性蛋白，但本发明的一些实施方案通过AAT多肽和细胞因子靶向多肽的融合，提供了增强的炎症抑制能力。来自AAT和第二多肽的双重抗-炎性功能的偶联将提供比任一多肽本身更有效的治疗性蛋白。此外，偶联AAT的抗-感染活性将减少大多数细胞因子靶向生物制品的感染风险。通过AAT-多肽和包含WAP结构域的多肽的融合，一些实施方案提供了更有效的抗-炎性和抗-感染性蛋白。预期本发明的融合蛋白具有大的治疗性功用和优于当前血清来源的AAT产品。
为了延长重组AAT的半寿期，重组DNA技术用于产生AAT基因与人IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgM的Fc结构域或HSA的融合，使得预期的蛋白产品是AAT接着Fc结构域((AAT-Fc(IgG1),AAT-Fc(IgG2),AAT-Fc(IgG3),AAT-Fc(IgG4),AAT-Fc(IgM))或AAT接着HSA。尽管已知HSA或Fc结构域与一些蛋白、蛋白结构域或肽的融合可延长它们的半寿期(参见例如Jazayeri et al.BioDrugs 22,11-26,Huang et al.(2009)Curr Opin Biotechnol 20,692-699,Kontermann et al.(2009)BioDrugs 23,93-109,Schmidt et al.(2009)CurrOpin Drug Discov Devel 12,284-295)，但不知道融合至AAT的Fc结构域或HSA是否将允许正确折叠和保持NE抑制活性，或是否能延长重组AAT的半寿期。本发明的融合蛋白显示是有效的NE抑制剂，具有延长的血清半寿期，和在一些实施方案中耐受氧化。在其它实施方案中，本文所述的融合蛋白通过掺入其它功能多肽，包括细胞因子靶向多肽和包含WAP结构域的多肽而具有不同的性质。
中性粒细胞，中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的主要来源，经常在NE分泌的同时经历氧化发生。因此，在氧化环境中有活性的本发明的融合蛋白具有极大的治疗性功用。AAT在反应位点环内在Met351和/或Met358处的氧化抑制AAT抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的能力。如图1G所示，氧化失活可通过SEQ ID NO:32中所示的突变Met351Glu和Met358Leu(M351E/M358L)而减少。此外，Met252和Met428处的Fc区氧化已表明减少FcRn结合和随后减少包含Fc的蛋白的血清半寿期。Met252和Met428的突变减少Fc区的氧化。本发明公开和优化了AAT-Fc融合蛋白，其中其通过M351和M358处的突变耐受在融合蛋白的AAT部分内的氧化-失活；和通过M252和M428处的突变耐受FcRn相互作用的氧化破坏，和通过M252I,T256D和M428L的组合突变具有延长的半寿期。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，Fc多肽经突变或修饰以增强FcRn结合。在这些实施方案中突变的或修饰的Fc多肽包括以下突变：Met252Ile,Thr256Asp和Met428Leu(M252I,T256D,M428L)，使用Kabat编号系统。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，Fc多肽是修饰的IgG1Fc多肽，和融合蛋白包括至少SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，Fc多肽是修饰的IgG1Fc多肽，和融合蛋白包括至少SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在其中本发明的融合蛋白包括Fc多肽的一些实施方案中，Fc多肽经突变或修饰以减少对Fc-γ受体(FcgR)的结合。在一些实施方案中，减少的FcgR结合可通过修饰Asn297的Fc糖基化来实现。例如，Asn297Ala(N297A)或Asn297Gln(N297Q)的突变。在一些实施方案中，减少的FcgR结合通过修饰Fc的下游铰链区来实现。在一些实施方案中，Fc多肽衍生自人IgG1。在这些实施方案的一些中，下游铰链区经修饰，通过Leu234Val和Leu235Ala(L235V/L235A)的突变和Gly236(ΔG236)的缺失以模拟IgG2，使用Kabat编号系统：
IgG1-铰链wt:DKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO:74)
IgG1-VAΔG铰链:DKTHTCPPCPAPEVA-GPS(SEQ ID NO:75)
在这些实施方案的一些中，融合蛋白包括至少SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc多肽衍生自人IgG4。在这些实施方案的一些中，下游铰链区通过Leu235Glu(L235E)的突变被修饰。此外，在其中Fc多肽衍生自IgG4的本发明的实施方案中，铰链区通过稳定突变Ser228Pro(S228P)被修饰，使用Kabat编号系统：
IgG4-铰链wt:ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPS(SEQ ID NO:76)
IgG4-铰链PE:ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPS(SEQ ID NO:77)
在这些实施方案的一些中，融合蛋白包括至少SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
本文所述的融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列和第二多肽。在一些实施方案中，例如，本发明提供融合至人IgG1-Fc,IgG2-Fc,IgG3-Fc,IgG4-Fc,IgM-Fc或HSA衍生物的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。本文所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-融合物预期可用于治疗各种适应症，以非限制性实例的方式包括α-1-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷、肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺部癌症、缺血-再灌注损伤包括例如心脏移植后的缺血/灌注损伤、心肌梗塞、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、I型和/或II型糖尿病、细菌感染、真菌感染、病毒感染、肺炎、脓毒症、移植物抗宿主病(GVHD)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化。
在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽或衍生自AAT的氨基酸序列和第二多肽。例如，本发明提供融合至人IgG1-Fc,IgG2-Fc,IgG3-Fc,IgG4-Fc,IgM-Fc或HSA衍生物的α-1-抗胰蛋白酶(AAT)。
在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的氨基酸序列和细胞因子靶向多肽或自细胞因子靶向多肽衍生的氨基酸序列。例如，本发明提供了丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的序列，其融合至人细胞因子受体或衍生物。本发明的另一实施方案提供了丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的序列，其融合至细胞因子靶向抗体例如抗-细胞因子抗体，或自细胞因子靶向抗体例如抗-细胞因子抗体衍生的序列，或自细胞因子靶向抗体的片段例如抗-细胞因子抗体的片段衍生的序列。例如，本发明提供了丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽衍生的序列，其融合至细胞因子靶向多肽，其中细胞因子靶向多肽结合任何以下人细胞因子：TNFα,IgE,IL-12,IL-23,IL-6,IL-1α,IL-1β,IL-17,IL-13,IL-4,IL-10,IL-2,IL-18,IL-27或IL-32。
例如，在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向TNFα和包括任何以下TNFα-靶向多肽或自以下TNFα-靶向多肽衍生的序列：
Figure BDA0003382463750000361
Figure BDA0003382463750000362
或ATN-103和ATN-192。
例如，在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向IgE和包括任何以下IgE-靶向多肽或自以下IgE-靶向多肽衍生的序列：Xolair或FcεRI。
例如，在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向IL-12和IL-23的共有p40亚基，和包括
Figure BDA0003382463750000363
多肽或自
Figure BDA0003382463750000364
多肽衍生的序列。
例如
Figure BDA0003382463750000365
细胞因子靶向多肽靶向IL-13和包括CDP7766多肽或自CDP7766多肽衍生的序列。
在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽或衍生自AAT的氨基酸序列，和细胞因子靶向多肽或自细胞因子靶向多肽衍生的氨基酸序列。例如，本发明提供α-1-抗胰蛋白酶抑制剂(AAT)，其融合至细胞因子靶向多肽，其中细胞因子靶向多肽结合任何以下人细胞因子：TNFα,IgE,IL-6,IL-1α,IL-1β,IL-12,IL-17,IL-13,IL-23,IL-4,IL-10,IL-2,IL-18,IL-27或IL-32。
在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽结合细胞因子受体和阻止细胞因子的结合。例如，本发明包括融合至细胞因子受体靶向抗体的丝氨酸蛋白酶抑制剂。例如，本发明提供了融合至细胞因子靶向多肽的α-1-抗胰蛋白酶抑制剂(AAT)，其中细胞因子靶向多肽结合任何以下人细胞因子的受体：TNFα,IgE,IL-6,IL-1α,IL-1β,IL-12,IL-17,IL-13,IL-23,IL-12和IL-23的p40亚基,IL-4,IL-10,IL-2,IL-18,IL-27或IL-32。
例如，在一些实施方案中，细胞因子靶向多肽靶向IL-6受体和包括
Figure BDA0003382463750000366
多肽(描述于专利公开号EP0628639)或ALX-0061多肽(描述于WO2010/115998)或自
Figure BDA0003382463750000367
多肽或ALX-0061多肽衍生的序列。
例如，
Figure BDA0003382463750000368
细胞因子靶向多肽靶向IL-6受体和包括tocilizumab多肽或自tocilizumab多肽衍生的序列。
通过蛋白治疗剂靶向炎性细胞因子和免疫刺激剂已证实了在许多炎性病况中的临床成功。用作细胞因子靶向剂的最常见的蛋白是可溶性细胞因子受体和单克隆抗体和其片段。靶向细胞因子的明显缺点是在这些患者中感染风险增加，如通过TNFα靶向生物制品
Figure BDA0003382463750000371
和
Figure BDA0003382463750000372
和IL-12/23p40靶向抗体
Figure BDA0003382463750000373
所证明的。这可能是靶向炎性细胞因子的常见问题，在患者中导致免疫抑制。AAT和其它丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白引人关注，在于它们证实了抗-感染和抗-炎性活性二者。因此，本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂-细胞因子靶向多肽融合蛋白可抑制异常细胞因子活性，同时降低感染风险。
在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列，包含WAP结构域的多肽或衍生自包含WAP结构域的多肽的氨基酸序列，和Fc多肽或自Fc多肽衍生的氨基酸序列。例如，本发明提供了以任何功能组合可操作连接在一起的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽、包含WAP结构域的多肽和人IgG1-Fc,IgG2-Fc,IgG3-Fc,IgG4-Fc或IgM-Fc衍生物。在一些实施方案中，包含WAP结构域的蛋白是人SLPI或自人SLPI衍生。在其它实施方案中，包含WAP结构域的蛋白是人弹性蛋白酶抑制剂(ELAFIN)或自人弹性蛋白酶抑制剂衍生。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽或衍生自AAT的氨基酸序列，和SLPI多肽或衍生自SLPI的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少AAT多肽或衍生自AAT的氨基酸序列，和弹性蛋白酶抑制剂多肽或衍生自弹性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列。
SLPI和弹性蛋白酶抑制剂是包含WAP结构域的蛋白，其显示丝氨酸蛋白酶抑制活性。这两种蛋白具有抗-炎性功能。此外，这些蛋白对许多细菌、病毒和真菌的菌株具有广泛的抗-感染能力。
在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列和人血清白蛋白(HSA)多肽或衍生自HSA多肽的氨基酸序列。本发明的进一步的实施方案包括丝氨酸蛋白酶抑制剂-白蛋白结合多肽融合蛋白，其中白蛋白结合多肽负责缔合丝氨酸蛋白酶抑制剂和HSA。由此，本发明包括共价和非共价连接的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和HSA多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或HSA多肽衍生的序列。例如，本发明提供了融合至人HSA或HSA衍生物或HSA结合肽或多肽的丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。
在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽或衍生自AAT的氨基酸序列，和HSA多肽或衍生自HSA多肽的氨基酸序列。例如，本发明提供了融合至HSA或自HSA衍生的片段或白蛋白结合多肽的α-1-抗胰蛋白酶(AAT)。
在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或自丝氨酸蛋白酶抑制剂衍生的氨基酸序列、HSA多肽或衍生自HSA多肽的氨基酸序列和包含WAP结构域的多肽或衍生自包含WAP结构域的多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽或衍生自AAT的氨基酸序列和HSA多肽或衍生自HSA多肽的氨基酸序列，和SLPI多肽或衍生自SLPI的氨基酸序列。在其它实施方案中，本文所述的融合蛋白包括至少α-1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽或衍生自AAT的氨基酸序列和HSA多肽或衍生自HSA多肽的氨基酸序列，和弹性蛋白酶抑制剂多肽或衍生自弹性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列。
本发明的融合蛋白可容易地在哺乳动物细胞表达系统中产生。例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)293细胞、COS细胞、
Figure BDA0003382463750000381
NS0细胞、SP2/0、YB2/0可容易地用于表达本文所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白。重要的是，哺乳动物细胞表达系统产生通常更适于治疗性应用的蛋白。与基于细菌、昆虫或酵母的表达系统相反，哺乳动物细胞表达系统产生具有糖基化模式的蛋白，其与天然人蛋白中发现的类似或相同。蛋白的合适的糖基化可极大地影响血清稳定性、药代动力学、生物分布、蛋白折叠和功能性。因此，在哺乳动物表达系统中产生治疗性蛋白的能力具有不同于其它系统的优势。此外，大多数哺乳动物细胞表达系统(例如，CHO,NS0,
Figure BDA0003382463750000382
细胞)可容易地在商业生产设施中放大规模以产生治疗性蛋白来满足临床要求。相较于天然形式的AAT，本文所述的融合蛋白具有提高的功能和可在哺乳动物表达系统中产生用于临床和商业供应。本发明的一些实施方案包括能够分离保留其抑制NE的能力的丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的纯化系统。重要的是，本发明的纯化过程可容易地并入现今的基于哺乳动物细胞的商业化生产过程中。
除非另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数，和复数术语应包括单数。通常，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡或多核苷酸化学和杂交使用的命名法和其中的技术是本领域众所周知的和通常使用的。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。酶反应和纯化技术根据生产商的说明书，或按本领域通常进行的或如本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法和按本说明书中引用和论述的各种一般性和更具体的参考文献中所述进行。参见例如，Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。结合本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和制药化学使用的命名法和其中的实验室程序和技术是本领域众所周知的和通常使用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送，和治疗患者。术语患者包括人和兽医受试者。
将理解，根据本发明的治疗性实体的给予将与合适的载体、缓冲液、赋形剂和其它试剂一起给予，其可掺入制剂中以提供改进的运输、递送、耐受性等。各种合适的制剂可见于所有药物化学家已知的药典：Remington's Pharmaceutical Sciences(15th ed,MackPublishing Company,Easton,PA(1975))，特别是其中Blaug,Seymour的第87章。这些制剂包括例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、包含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含聚乙二醇的半固体混合物。任何前述混合物可适合于根据本发明的治疗和疗法，只要制剂中的活性成分没有被制剂失活，和制剂与所述给予途径是生理学上相容和耐受的。对于关于药物化学家众所周知的制剂、赋形剂和载体的另外信息，还参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development:the need forpreclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2):210-8(2000),Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000),Charman WN“Lipids,lipophilic drugs,and oraldrug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8):967-78(2000),Powellet al.“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm SciTechnol.52:238-311(1998)和其中的引文。
包括本发明的融合蛋白的本发明的治疗性制剂可用于治疗或改善受试者中与异常丝氨酸蛋白酶活性有关的疾病或病症的相关症状。本发明还提供了治疗或减轻受试者中与异常丝氨酸蛋白酶活性有关的疾病或病症的相关症状方法。治疗性方案通过以下进行：使用标准方法，包括各种临床和/或实验室程序中的任一种，鉴定受试者，例如患有(或有风险发生)与异常丝氨酸蛋白酶活性有关的疾病或病症的人患者。术语患者包括人和兽医受试者。术语受试者包括人和其它哺乳动物。
治疗功效结合用于诊断或治疗与异常丝氨酸蛋白酶活性有关的特定疾病或病症的任何已知的方法确定。与异常丝氨酸蛋白酶活性有关的疾病或病症的一种或多种症状的改善指示融合蛋白产生临床益处。
筛选具有需要的特异性的融合蛋白的方法包括但不限于，酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶测定法、流式细胞术和本领域已知的其它免疫学介导的技术。
本文所述的融合蛋白可用于本领域已知的涉及靶标例如丝氨酸蛋白酶的定位和/或定量的方法，例如用于测量在合适的生理学样品中这些靶标的水平，用于诊断性方法，用于使蛋白成像等等。术语“生理学样品”和“生物学样品”，可互换使用，在本文意欲包括自受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及受试者内存在的组织、细胞和流体。因此，包括在术语“生理学样品”和“生物学样品”的使用范围内的是血液和血液的级分或组分，包括血清、血浆或淋巴。
在给定的实施方案中，对给定的靶标或其衍生物、片段、类似物或同源物特异性的融合蛋白，其包含靶标结合结构域，用作药理学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
使用标准技术，例如免疫亲和、色谱或免疫沉淀，本发明的融合蛋白可用于分离特定靶标。可通过偶联(即物理连接)融合蛋白至可检测物质促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白，和合适的放射性材料的实例包括125I,131I,35S或3H。
本发明的融合蛋白的治疗性有效量通常涉及实现治疗性目标需要的量。如上所述，这可以是融合蛋白和其靶标之间的结合相互作用，其在某些情况下，干扰靶标发挥功能。另外，需要给予的量将取决于融合蛋白对其特异性靶标的结合亲和力，和还将取决于给予的融合蛋白自其所给予的其它受试者的自由体积耗尽的速率。以非限制性实例的方式，本发明的融合蛋白或其片段的治疗有效剂量的通常范围可以是约0.1mg/kg体重至约250mg/kg体重。通常的给药频率范围可以是例如每日两次至每月一次。
在使用融合蛋白片段的情况下，特异性结合靶标的最小抑制片段是优选的。例如，可设计保留结合靶标的能力的肽分子。这样的肽可经化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如,Marasco et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993))。按需要，制剂还可包含超过一种对治疗的特定适应症的活性化合物，优选地没有不利彼此影响的具有互补活性的那些。备选地，或另外，组合物可包含增强其功能的试剂，例如细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂、生长抑制剂、抗炎剂或抗感染剂。这样的分子适合于以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分还可包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。
用于体内给予的制剂必须是无菌的。这通过无菌滤膜过滤容易地实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括包含融合蛋白的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质为成型物品的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOTTM(可注射微球由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶在更短的时间内释放蛋白。
药物组合物
本发明的融合蛋白(本文亦称为“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物和同源物，可掺入适合于给予的药物组合物中。这样的组合物通常包含融合蛋白和药学上可接受的载体。如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”意欲包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣料、抗微生物和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等，其与药物给予相容。合适的载体描述于本领域的标准参考书Remington’s Pharmaceutical Sciences的最新版本中，其通过引用并入本文。这样的载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。脂质体和非水性溶媒例如固定油也可使用。用于药物活性物质的这样的介质和试剂的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组合物中的用途。补充的活性化合物也可掺入组合物中。
本发明的药物组合物经配制以与其预期给予途径相容。给予途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(即，局部)、透粘膜和直肠给予。用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢纳；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可包装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(水溶性时)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内注射，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，和应该为流体的，至容易注射的程度。其在制备和贮存的条件下必须是稳定的，和必须针对微生物例如细菌和真菌的污染作用防腐。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。合适的流动性可例如通过使用包衣料例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持需要的粒径，和通过使用表面活性剂来保持。阻止微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可通过将需要量的活性化合物掺入合适的溶剂，按需要含上述一种成分或各成分的组合，接着过滤除菌来制备。通常，分散剂通过将活性化合物掺入包含基础分散介质和需要的上述其它成分的无菌溶媒来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其得到活性成分加来自之前其无菌过滤溶液的任何其它需要的成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可包封在明胶胶囊中或压制成片剂。为口服治疗性给予的目的，活性化合物可掺有赋形剂和以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可使用用作漱口剂的流体载体制备，其中流体载体中的化合物口服施用和漱口，并吐出或咽下。药学上相容的粘合剂和/或辅助材料可作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂。
对于通过吸入给予，化合物以气溶胶喷雾剂的形式自包含合适的抛射剂，例如气体，例如二氧化碳的加压容器或分配器，或喷雾器中递送。
系统给予也可通过透粘膜或透皮方式。对于透粘膜或透皮给予，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的，和对于透粘膜给予，包括例如去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜给予可通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现。对于透皮给予，活性化合物配制为软膏剂、药膏、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的。
化合物也可以栓剂(例如用常规栓剂基质，例如可可脂和其它甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备用于直肠递送。
在一个实施方案中，活性化合物用保护化合物免于自身体快速消除的载体制备，例如控制释放制剂，包括植入剂和微胶囊递送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。所述材料也可市售获自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc。脂质体混悬液也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域已知的方法制备，例如描述于美国专利号4,522,811。
特别有利的是，配制呈容易给予和剂量均匀的单位剂型的口服或胃肠外组合物。本文使用的单位剂型是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位包含预定量的活性化合物，其经计算以与需要的药用载体结合产生需要的治疗性效果。本发明的单位剂型的规格由活性化合物的独特性质和实现的特定治疗效果，以及配制用于治疗个体的这样的活性化合物的领域中固有的局限性规定和直接取决于它们。
药物组合物可与给药说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
本发明将在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
具体实施方式
本发明还涉及以下实施方案：
1.分离的融合蛋白，其包含可操作连接至人免疫球蛋白Fc多肽或自免疫球蛋白Fc多肽衍生的氨基酸序列的至少一种人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，所述人免疫球蛋白Fc多肽或自免疫球蛋白Fc多肽衍生的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64和65的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白Fc多肽包含在选自S228、L235、M252、M258、M428和其组合的位置处的一个或多个突变。
2.实施方案1的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含选自以下的另外的多肽：
细胞因子靶向多肽或自细胞因子靶向多肽衍生的序列；
包含WAP结构域的多肽或自包含WAP结构域的多肽衍生的序列；或白蛋白多肽或自血清白蛋白多肽衍生的氨基酸序列。
3.实施方案1的融合蛋白，其中所述人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽是人α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽或自人AAT多肽衍生。
4.实施方案3的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
5.实施方案3的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含AAT的反应位点环，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
6.实施方案3的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含AAT的突变的反应位点环，其包含SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列。
7.实施方案1的分离的融合蛋白，其中免疫球蛋白Fc多肽包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
8.实施方案1的分离的融合蛋白，其中免疫球蛋白Fc多肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
9.实施方案1或实施方案3的分离的融合蛋白，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和免疫球蛋白Fc多肽通过铰链区、接头区或铰链区和接头区二者可操作连接。
10.实施方案9的分离的融合蛋白，其中铰链区、接头区或铰链区和接头区二者包含肽序列。
11.实施方案1的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:78或79的氨基酸序列。
12.分离的融合蛋白，其包含可操作连接至修饰的人IgG4 Fc多肽的至少一种人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其中所述修饰的人IgG4 Fc多肽包含选自SEQ ID NO:6、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72和73的氨基酸序列。
13.实施方案12的分离的融合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc多肽包含SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
14.实施方案13的分离的融合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc多肽包含在选自M252(SEQ ID NO:60的残基34)、T246(SEQ ID NO:60的残基38)、M428(SEQ ID NO:60的残基210)和其组合的位置处的一个或多个突变。
15.实施方案13的分离的融合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc多肽包含在位置M252(SEQ ID NO:60的残基34)处和在位置M428(SEQ ID NO:60的残基210)处的突变。
16.实施方案13的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含选自以下的另外的多肽：细胞因子靶向多肽或自细胞因子靶向多肽衍生的序列；
包含WAP结构域的多肽或自包含WAP结构域的多肽衍生的序列；或白蛋白多肽或自血清白蛋白多肽衍生的氨基酸序列。
17.实施方案13的融合蛋白，其中人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽是人α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽或自人AAT多肽衍生。
18.实施方案17的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
19.实施方案17的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含AAT的反应位点环，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
20.实施方案17的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含AAT的突变的反应位点环，其包含SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列。
21.实施方案13或实施方案17的分离的融合蛋白，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和修饰的人IgG4 Fc多肽通过铰链区、接头区或铰链区和接头区二者可操作连接。
22.实施方案21的分离的融合蛋白，其中铰链区、接头区或铰链区和接头区二者包含肽序列。
23.在有需要的受试者中治疗或减轻与异常丝氨酸蛋白酶表达或活性有关的疾病或病症的症状的方法，所述方法包括给予实施方案1或实施方案12的融合蛋白。
24.在有需要的受试者中治疗或减轻炎症或炎性疾病或病症的症状，同时降低感染风险的方法，所述方法包括给予实施方案1或实施方案12的融合蛋白。
25.在有需要的受试者中降低感染风险的方法，所述方法包括给予实施方案1或实施方案12的融合蛋白。
26.实施方案25的方法，其中所述受试者是人。
27.实施方案25的方法，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:78或79的氨基酸序列。
28.实施方案24的方法，其中所述炎性疾病或病症选自：肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺部癌症、缺血-再灌注损伤、心脏移植后的缺血/灌注损伤、心肌梗塞、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、I型和/或II型糖尿病、肺炎、脓毒症、移植物抗宿主病(GVHD)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化。
29.实施方案24的方法，其中所述感染选自细菌感染、真菌感染或病毒感染。
实施例
实施例1：AAT-Fc融合蛋白和变体
根据本发明的AAT-Fc融合蛋白的实例性而非限制性的实例包括以下序列。尽管这些实例包括铰链序列和/或接头序列，但本发明的融合蛋白可使用长度和/或柔韧性合适的任何铰链序列和/或接头序列制备。或者，融合蛋白可不使用铰链和/或接头序列制备。例如，多肽组分可直接连接。
实例性的AAT-Fc融合蛋白是本文所述的AAT-hFc1(人IgG1 Fc)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)和融合蛋白的IgG-Fc多肽部分用斜体表示(SEQ ID NO:3)。
AAT-hFc1(人IgG1 Fc)
Figure BDA0003382463750000461
实例性的AAT-Fc融合蛋白是本文所述的AAT-hFc2(人IgG2 Fc)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)和融合蛋白的IgG-Fc多肽部分用斜体表示(SEQ ID NO:4)。
AAT-hFc2(人IgG2 Fc)
Figure BDA0003382463750000462
实例性的AAT-Fc融合蛋白是本文所述的AAT-MM-EL-hFc1(人IgG1 Fc,Met351Glu/Met358Leu)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:34)，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分用斜体表示(SEQ ID NO:3)和Met351Glu突变用框盒表示，和Met358Leu突变用灰色阴影表示。
AAT-MM-EL-hFc1(人IgG1 Fc,Met351Glu/Met358Leu)
Figure BDA0003382463750000471
实例性的AAT-Fc融合蛋白是本文所述的AAT-MM-EL-hFc2(人IgG2 Fc,Met351Glu/Met358Leu)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:34)，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分用斜体表示(SEQ ID NO:4)，Met351Glu突变用框盒表示，和Met358Leu突变用灰色阴影表示。
AAT-MM-EL-hFc2(人IgG2 Fc,Met351Glu/Met358Leu)
Figure BDA0003382463750000472
实例性的AAT-Fc融合蛋白是本文所述的AAT-MM-LL-hFc1(人IgG1 Fc,Met351Leu/Met358Leu)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:35)，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分用斜体表示(SEQ ID NO:3)，Met351Leu突变用黑色阴影表示，和Met358Leu突变用灰色阴影表示。
AAT-MM-LL-hFc1(人IgG1 Fc,Met351Leu/Met358Leu)
Figure BDA0003382463750000473
Figure BDA0003382463750000481
实例性的AAT-Fc融合蛋白是本文所述的AAT-MM:LL-hFc2(人IgG2 Fc,Met351Leu/Met358Leu)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:35)，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分用斜体表示(SEQ ID NO:4)，Met351Leu突变用黑色阴影表示和Met358Leu突变用灰色阴影表示。
AAT-MM:LL-hFc2(人IgG2 Fc,Met351Leu/Met358Leu)
Figure BDA0003382463750000482
实例性的AAT-Fc融合蛋白是本文所述的AAT-hFc1-AAT(人IgG1)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，融合蛋白的IgG-Fc多肽部分用斜体表示(SEQ ID NO:3)。
AAT-hFc1-AAT(人IgG1)
Figure BDA0003382463750000483
Figure BDA0003382463750000491
AAT-EL-Fc-IgG1-DV,ΔG,IDL(AAT:Met351Glu/Met358Leu；Fc IgG1:Leu234Val/Leu235Ala,缺失Gly236,Met252Ile,Thr256Asp,Met428Leu)
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGT KADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFT VNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPM MKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGT YDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAEFLEAIPLSIPPEVKFNKPFVF LMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKGGGGDKTHTCPPCPAPEVAGPSVFLFPPKPKDTLIISRDPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:78)
AAT-EL-Fc-IgG4-PE,IDL(AAT:Met351Glu/Met358Leu；Fc IgG4:Ser228ProLeu235Glu,Met252Ile,Thr256Asp,Met428Leu)
EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGT KADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFT VNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPM MKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGT YDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAEFLEAIPLSIPPEVKFNKPFVF LMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLIISRDPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:79)
这些实例性的AAT-Fc融合蛋白使用以下技术制备。
编码人AAT的基因自人肝cDNA(Zyagen)经PCR扩增。编码AAT或Fc区的基因内的特定点突变通过重叠PCR产生。AAT编码基因与编码铰链区、接着人IgG1,IgG2,IgG3,IgG4或IgM的CH2结构域和CH3结构域的基因符合读框地克隆至哺乳动物表达载体，所述载体包含在AAT基因插入位点上游的哺乳动物分泌信号序列。将这些表达载体转染至哺乳动物细胞(具体是HEK293或CHO细胞)和在8％CO237℃生长数天。重组AAT-Fc融合蛋白自表达细胞上清液通过蛋白A色谱纯化。重要的是，使用接近中性的pH缓冲液(Gentle Ag/Ab ElutionBuffer,Thermo Scientific)以自蛋白A树脂洗脱AAT-Fc融合蛋白。AAT-Fc融合蛋白不能使用标准的低pH洗脱自蛋白A树脂洗脱，因为AAT抑制NE的能力在低pH处理后受损，可能归因于低pH介导的AAT寡聚化。图1F显示低pH洗脱对AAT抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的能力的影响。AAT-Fc融合蛋白可通过蛋白A和接近中性的pH洗脱缓冲液，或通过
Figure BDA0003382463750000501
α-1抗胰蛋白酶亲和基质(BAC BV)纯化。
通过确定其抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的能力，测试纯化的AAT-Fc融合蛋白的活性。图1B和1D显示纯化的血清来源的AAT(sdAAT)和AAT-Fc融合蛋白的还原性SDS-PAGE凝胶(图1B-泳道1:sdAAT,泳道2:AAT-Fc(SEQ ID NO:16),泳道3:AAT-EL-Fc(SEQ ID NO:18)，图1DAAT-Fc-AAT(SEQ ID NO:20)。蛋白通过用考马斯蓝染色可视化。
为了监测人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性，使用荧光微板测定法。使用以下测定法，通过残留NE活性的伴随降低，测量抑制活性。该测定缓冲液包含100mM Tris pH 7.4,500mM NaCl和0.0005％Triton X-100。人NE以终浓度5nM使用(但也可以1-20nM使用)。在该测定法中荧光肽底物AAVP-AMC以终浓度100μM使用。来自Molecular Devices的Gemini EM读板仪用于读出测定动力学，使用分别为370nm和440nm的激发和发射波长，和420nm的截止值。该测定法在室温下读数10min，每5-10秒扫描。Vmax/秒对应于残留NE活性，其对抑制剂的各浓度作图。x-轴的截距表示在测定中完全失活起始浓度的NE需要的抑制剂的浓度。人血清来源的AAT(sdAAT)在这些测定法中用作阳性对照。AAT-Fc融合蛋白显示有效的NE抑制活性，如图1C所示。其中两个AAT多肽融合至单个Fc多肽的融合物(AAT-Fc-AAT)显示比sdAAT和包含单个AAT多肽的AAT-Fc融合蛋白提高的效力(图1E)。此处提供的这些发现结果首次证实了AAT可融合至Fc区和保持其抑制NE的能力。特别重要的是，发现AAT-Fc-AAT融合蛋白是更有效的NE抑制剂。
图1F证实了AAT-EL-Fc(M351E,M358L)融合蛋白对氧化失活的抗性。在NE抑制测定法中，AAT融合蛋白、AAT-Fc(wt)、AAT-EL-Fc(M351E,M358L)和AAT-EM-Fc(M351E)用33mMH2O2处理和与未处理的融合蛋白比较。AAT-EL-Fc抑制NE不受氧化的损害，这与测试的其它蛋白相反。
此外，在大鼠中与血清来源的AAT相比，AAT-Fc融合蛋白显示更长的血清半寿期(图1H)。在这些研究中，向3只大鼠/各试验蛋白I.V.注射10mg/kg的sdAAT或AAT-Fc。在48小时期间在各个时间点获得血清样品。血清ATT浓度使用ELISA测量。这些结果证实了对于治疗许多人炎性病况和感染性疾病，与血清来源的AAT相比，本发明的融合蛋白具有改进的药代动力学性质并且是优越的治疗形式。
实施例2：AAT-TNFα靶向分子融合蛋白
本文提供的研究描述了包含融合至抗-TNFα抗体或TNFα受体衍生物的人AAT的重组AAT衍生物的数个非限制性实例。这些实例在下文提供以进一步说明本发明的不同特征。实例还说明了实施本发明的有用方法。这些实例不限制，也不意欲限制本发明的范围。
下文的融合蛋白包括来自或衍生自以下的细胞因子靶向多肽序列：(i)抗-TNFα抗体D2E7(亦称为Adalimumab或
Figure BDA0003382463750000511
)或(ii)2型TNFα受体的细胞外结构域(TNFR2-ECD)。融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示，抗体恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3，或CL)用斜体表示，和D2E7-VH、D2E7-VK和TNFR2-ECD用黑体表示。尽管这些实例包括铰链序列和/或接头序列，但本发明的融合蛋白可使用长度和/或柔韧性合适的任何铰链序列和/或接头序列制备。或者，融合蛋白可不使用铰链和/或接头序列制备。
实例性的AAT-TNFα融合蛋白是本文所述的D2E7-轻链-AAT(G3S)2接头。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，D2E7-VK用黑体表示(SEQ ID NO:37)和抗体恒定区用斜体表示(SEQ ID NO:38)。
D2E7-轻链-AAT(G3S)2接头
Figure BDA0003382463750000512
Figure BDA0003382463750000521
实例性的AAT-TNFα融合蛋白是本文所述的D2E7-轻链-AAT ASTGS接头。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，D2E7-VK用黑体表示(SEQ ID NO:37)，和抗体恒定区用斜体表示(SEQ ID NO:38)。
D2E7-轻链-AATASTGS接头
Figure BDA0003382463750000522
实例性的AAT-TNFα融合蛋白是本文所述的D2E7-重链-AAT(G3S)2接头。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，D2E7-VH用黑体表示(SEQ ID NO:39)和抗体恒定区用斜体表示(SEQ ID NO:40)。
D2E7-重链-AAT(G3S)2接头
Figure BDA0003382463750000523
Figure BDA0003382463750000531
实例性的AAT-TNFα融合蛋白是本文所述的D2E7-重链-AAT ASTGS接头。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，D2E7-VH用黑体表示(SEQ ID NO:39)，和抗体恒定区用斜体表示(SEQ ID NO:40)。
D2E7-重链-AATASTGS接头
Figure BDA0003382463750000532
实例性的AAT-TNFα融合蛋白是本文所述的TNFR2-ECD-Fc1-AAT(G3S)2接头。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，TNFR2-ECD用黑体表示(SEQ IDNO:41)，和抗体恒定区用斜体表示(SEQ ID NO:42)。
TNFR2-ECD-Fc1-AAT(G3S)2接头
Figure BDA0003382463750000533
Figure BDA0003382463750000541
实例性的AAT-TNFα融合蛋白是本文所述的TNFR2-ECD-Fc1-AAT ASTGS接头。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，TNFR2-ECD用黑体表示(SEQID NO:41)，和抗体恒定区用斜体表示(SEQ ID NO:42)。
TNFR2-ECD-Fc1-AATASTGS接头
Figure BDA0003382463750000542
这些实例性的AAT-TNFα靶向分子融合蛋白使用以下技术制备。
编码抗-TNFα抗体D2E7的可变重链(VH)和可变κ(VK)区的基因通过基因合成产生。D2E7-VH基因与编码人IgG1抗体重链恒定区(由CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域组成)的基因符合读框地克隆至哺乳动物表达载体，所述载体包含VH结构域插入位点(D2E7-HC)上游的哺乳动物分泌信号序列。D2E7-VK基因与人抗体κ轻链恒定(CL)结构域符合读框地克隆至哺乳动物表达载体，所述载体包含VK结构域插入位点(D2E7-LC)上游的哺乳动物分泌信号序列。在上述哺乳动物表达载体中，AAT编码基因和邻接的5’接头序列符合读框地克隆至D2E7重链基因的CH3结构域(D2E7-HC-AAT)或D2E7轻链基因的CL结构域(D2E7-LC-AAT)编码序列的3’端。TNFα受体2的细胞外结构域(TNFR2-ECD)通过基因合成产生和与编码铰链区，接着人IgG1(hFc1)的CH2结构域和CH3结构域的基因符合读框地克隆至哺乳动物表达载体，所述载体包含TNFR2-ECD插入位点上游的哺乳动物分泌信号序列。AAT编码基因和邻近的5’接头序列符合读框地克隆至哺乳动物表达载体中编码TNFR2-ECD-hFc1的基因的3’端(TNFR2-ECD-hFc1-AAT)。
D2E7-HC-AAT表达载体与D2E7-LC或D2E7-LC-AAT表达载体共转染至哺乳动物细胞(特别是HEK293或CHO细胞)以产生具有分别融合至重链的C-末端或重链和轻链二者的C-末端的AAT的D2E7抗体。D2E7-LC-AAT与D2E7-HC表达载体共转染至哺乳动物细胞以产生具有融合至轻链的C-末端的AAT的D2E7抗体。将TNFR2-hFc1-AAT表达载体转染至哺乳动物细胞。将转染的细胞在8％CO237℃生长数天。
重组AAT-TNFα靶向融合蛋白自表达细胞上清液通过蛋白A色谱纯化。使用接近中性的pH缓冲液(Gentle Ag/Ab Elution Buffer,Thermo Scientific)以自蛋白A树脂洗脱AAT-TNFα靶向融合蛋白。
图2B显示单独D2E7抗体(泳道1)和其中AAT融合至D2E7的重链的变体(泳道2)的SDS-PAGE凝胶。蛋白通过考马斯蓝染色可视化。
通过测定其抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的能力，测试纯化的AAT-TNFα靶向分子融合蛋白的活性。在这些测定中，人血清来源的AAT(sdAAT)用作阳性对照。NE抑制测定法按上所述进行。图2C证实了相对于sdAAT，AAT-TNFα靶向分子融合蛋白显示类似的中性粒细胞弹性蛋白酶抑制，表明通过其与抗体融合，AAT的抑制能力并未受损。
实施例3AAT-Fc-SLPI和AAT-Fc-弹性蛋白酶抑制剂
本文提供的研究描述了包含融合至包含WAP结构域的蛋白的人AAT的重组AAT衍生物的数个非限制性实例。这些实例在下文提供，以进一步说明本发明的不同特征。实例还说明了实施本发明的有用方法。融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示，Fc部分用斜体表示，和包含WAP结构域的多肽用黑体表示。尽管这些实例包括铰链序列和/或接头序列，但本发明的融合蛋白可使用长度和/或柔韧性合适的任何铰链序列和/或接头序列制备。或者，融合蛋白可不使用铰链和/或接头序列制备。例如，多肽组分可直接连接。
实例性的AAT-Fc-SLPI融合蛋白是本文所述的AAT-hFc1-SLPI(人IgG1 Fc)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，Fc部分用斜体表示(SEQ IDNO:3)，和包含WAP结构域的多肽用粗体表示(SEQ ID NO:9)。
AAT-hFc1-SLPI(人IgG1 Fc)
Figure BDA0003382463750000561
实例性的AAT-Fc-SLPI融合蛋白是本文所述的AAT-hFc1-SLPI(人IgG1 Fc)。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，Fc部分用斜体表示(SEQ IDNO:3)，和包含WAP结构域的多肽用粗体表示(SEQ ID NO:12)。
AAT-hFc1-弹性蛋白酶抑制剂(人IgG1 Fc)
Figure BDA0003382463750000562
编码SLPI和弹性蛋白酶抑制剂的基因自人脾cDNA(Zyagen)经PCR扩增。这些基因克隆至实施例1的哺乳动物表达载体，其中SLPI或弹性蛋白酶抑制剂基因与AAT-Fc基因符合读框地插入。将这些表达载体转染至哺乳动物细胞(特别是HEK293或CHO细胞)和在8％CO237℃生长数天。重组AAT-Fc-WAP结构域融合蛋白自表达细胞上清液通过蛋白A色谱纯化。使用接近中性的pH缓冲液(Gentle Ag/Ab Elution Buffer,Thermo Scientific)以自蛋白A树脂洗脱AAT-Fc-WAP结构域融合蛋白。
图3B显示AAT-Fc-WAP融合蛋白的SDS-PAGE凝胶(泳道1AAT-Fc-弹性蛋白酶抑制剂,泳道2AAT-Fc-SLPI)。蛋白通过考马斯蓝染色可视化。通过测定其抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的能力，测试纯化的AAT-Fc-WAP结构域融合蛋白的活性。NE抑制测定法按上所述进行。在这些测定法中人血清来源的AAT(sdAAT)和AAT-Fc融合蛋白用作阳性对照。相对于sdAAT，AAT-Fc-WAP靶向分子融合蛋白显示提高的中性粒细胞弹性蛋白酶的NE抑制效力(图3C)。
实施例4AAT-白蛋白
本文提供的研究描述了包含融合至白蛋白多肽的人AAT的重组AAT衍生物的数个非限制性实例。这些实例在下文提供，以进一步说明本发明的不同特征。实例还说明了实施本发明的有用方法。这些实例不限制，也不意欲限制本发明。AAT部分用下划线表示和白蛋白部分用斜体表示。例如，多肽组分可直接连接。
实例性的AAT-白蛋白融合蛋白是本文所述的AAT-HSA。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，和白蛋白多肽用斜体表示(SEQ ID NO:14)。
AAT-HSA
Figure BDA0003382463750000571
Figure BDA0003382463750000581
实例性的AAT-白蛋白融合蛋白是本文所述的AAT-HSA结构域3。如下所示，融合蛋白的AAT多肽部分用下划线表示(SEQ ID NO:2)，和白蛋白多肽用斜体表示(SEQ ID NO:15)。
AAT-HSA结构域3
Figure BDA0003382463750000582
编码人血清白蛋白(HSA)的基因自人肝cDNA(Zyagen)经PCR扩增。产生哺乳动物表达载体，其中编码HSA或HSA的结构域3的基因符合读框地克隆至AAT编码基因的3’端，在AAT上游包含哺乳动物分泌信号序列。
将这些表达载体转染至哺乳动物细胞(特别是HEK293或CHO细胞)和在8％CO237℃生长数天。重组AAT-HSA融合蛋白自表达细胞上清液使用
Figure BDA0003382463750000583
α-1抗胰蛋白酶亲和基质(BAC BV)纯化，其中结合缓冲液由20mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4组成，和洗脱缓冲液由20mM Tris,2M MgCl2 pH 7.4组成。
图4B显示AAT-HSA融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。蛋白通过考马斯蓝染色可视化。通过测定其抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的能力，测试纯化的AAT-HSA融合蛋白的活性。NE抑制测定法按上所述进行。在这些测定法中人血清来源的AAT(sdAAT)用作阳性对照。相对于sdAAT，AAT-HSA融合蛋白显示类似的NE抑制效力，证实了融合至白蛋白不抑制AAT抑制NE的能力(图4C)。
其它实施方案
尽管本发明已结合其详细描述进行了说明，但前文的描述意欲说明，而非限制由随附权利要求书的范围定义的本发明的范围。其它方面、优点和修饰在随附权利要求书的范围内。
序列表
<110> Inhibrx LP
Eckelman, Brendan P.
Timmer, John C.
Deveraux, Quinn
<120> 丝氨酸蛋白酶抑制剂融合多肽和其使用方法
<130> INHI-002/002WO
<150> US 14/524,832
<151> 2014-10-27
<160> 80
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反应位点环子序列
<400> 1
Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser
1 5 10 15
Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
20 25
<210> 2
<211> 390
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn
385 390
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 5
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 6
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 7
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp
1 5 10 15
Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr
20 25 30
Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys
35 40 45
Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys
50 55 60
Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys
65 70 75 80
Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His
85 90 95
Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp
100 105 110
Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser
115 120 125
Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu
130 135 140
Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu
145 150 155 160
Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr
165 170 175
Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro
195 200 205
Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly
210 215
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu Val Leu Leu Ala Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala
20 25 30
Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys
35 40 45
Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys
50 55 60
Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn
65 70 75 80
Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys
85 90 95
Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys
100 105 110
Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser
115 120 125
Pro Val Lys Ala
130
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala
1 5 10 15
Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys
20 25 30
Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu
35 40 45
Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys
50 55 60
Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys
65 70 75 80
Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met
85 90 95
Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala
100 105
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<211> 51
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu
1 5 10 15
Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg
20 25 30
Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala
50
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Arg Ala Ser Ser Phe Leu Ile Val Val Val Phe Leu Ile Ala Gly
1 5 10 15
Thr Leu Val Leu Glu Ala Ala Val Thr Gly Val Pro Val Lys Gly Gln
20 25 30
Asp Thr Val Lys Gly Arg Val Pro Phe Asn Gly Gln Asp Pro Val Lys
35 40 45
Gly Gln Val Ser Val Lys Gly Gln Asp Lys Val Lys Ala Gln Glu Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Arg Cys Ala Met Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys Leu Lys Asp Thr
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100 105 110
Cys Phe Val Pro Gln
115
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
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1 5 10 15
Val Pro Phe Asn Gly Gln Asp Pro Val Lys Gly Gln Val Ser Val Lys
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Gly Gln Asp Lys Val Lys Ala Gln Glu Pro Val Lys Gly Pro Val Ser
35 40 45
Thr Lys Pro Gly Ser Cys Pro Ile Ile Leu Ile Arg Cys Ala Met Leu
50 55 60
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Lys Cys Cys Glu Gly Ser Cys Gly Met Ala Cys Phe Val Pro Gln
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<213> 智人
<400> 13
Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser Cys Pro Ile Ile Leu Ile Arg Cys Ala
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Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser Cys Gly Met Ala Cys Phe Val Pro
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<213> 智人
<400> 14
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1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
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35 40 45
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Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
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Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
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Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
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Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
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Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
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Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
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Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
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Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
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Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
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Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
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Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
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Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
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Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
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Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
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Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
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<213> 智人
<400> 15
Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln
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Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
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Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
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500 505 510
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-MM-EL-hFc1融合蛋白
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Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
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Gly Lys
625
<210> 19
<211> 622
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-MM-EL-hFc2融合蛋白
<400> 19
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
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Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
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Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
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610 615 620
<210> 20
<211> 622
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-MM:LL-hFc2融合蛋白
<400> 20
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1 5 10 15
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20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
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65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
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180 185 190
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195 200 205
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260 265 270
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Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Leu Phe
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355 360 365
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385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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595 600 605
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615 620
<210> 21
<211> 1025
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-hFc1-AAT融合蛋白
<400> 21
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1 5 10 15
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35 40 45
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130 135 140
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180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
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210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
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Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn
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1025
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<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2E7-轻链-AAT (G3S)2接头
<400> 22
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435 440 445
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610 615
<210> 23
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2E7-轻链-AAT ASTGS接头
<400> 23
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Ser Thr Gly Ser Glu Asp Pro Gln Gly
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Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro
225 230 235 240
Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu
245 250 255
Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser
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Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg
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Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly
325 330 335
Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp
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Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp
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Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro
405 410 415
Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val
420 425 430
Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile
435 440 445
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His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu
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515 520 525
Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala
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Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro
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Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu
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595 600 605
Asn Pro Thr Gln Lys
610
<210> 24
<211> 853
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2E7-重链-AAT (G3S)2接头
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
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Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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595 600 605
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645 650 655
Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val
660 665 670
Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile
675 680 685
Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu
690 695 700
Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln
705 710 715 720
His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu
725 730 735
Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile
740 745 750
Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr
755 760 765
Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala
770 775 780
Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp
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Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2E7-重链-AAT ASTGS接头
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-hFc1-弹性蛋白酶抑制剂
<400> 29
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
595 600 605
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
610 615 620
Gly Lys Ala Ser Thr Gly Ser Ala Val Thr Gly Val Pro Val Lys Gly
625 630 635 640
Gln Asp Thr Val Lys Gly Arg Val Pro Phe Asn Gly Gln Asp Pro Val
645 650 655
Lys Gly Gln Val Ser Val Lys Gly Gln Asp Lys Val Lys Ala Gln Glu
660 665 670
Pro Val Lys Gly Pro Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser Cys Pro Ile Ile
675 680 685
Leu Ile Arg Cys Ala Met Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys Leu Lys Asp
690 695 700
Thr Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser Cys Gly Met
705 710 715 720
Ala Cys Phe Val Pro Gln
725
<210> 30
<211> 984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-HSA
<400> 30
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Ala Ser Thr Gly Ser Asp
385 390 395 400
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
405 410 415
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
420 425 430
Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
435 440 445
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
450 455 460
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
465 470 475 480
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
485 490 495
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
500 505 510
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
515 520 525
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
530 535 540
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
545 550 555 560
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
565 570 575
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
580 585 590
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
595 600 605
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
610 615 620
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
625 630 635 640
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
645 650 655
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
660 665 670
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
675 680 685
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
690 695 700
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu
705 710 715 720
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
725 730 735
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
740 745 750
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
755 760 765
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
770 775 780
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
785 790 795 800
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
805 810 815
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
820 825 830
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
835 840 845
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
850 855 860
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
865 870 875 880
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
885 890 895
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
900 905 910
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
915 920 925
Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys
930 935 940
Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala
945 950 955 960
Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala
965 970 975
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
980
<210> 31
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-HSA结构域3
<400> 31
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Ala Ser Thr Gly Ser Glu
385 390 395 400
Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu
405 410 415
Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys
420 425 430
Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu
435 440 445
Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met
450 455 460
Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val
465 470 475 480
Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr
485 490 495
Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp
500 505 510
Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His
515 520 525
Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln
530 535 540
Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu
545 550 555 560
Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys
565 570 575
Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys
580 585 590
Leu Val Ala
595
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反应位点环子序列变体
<400> 32
Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Glu Phe Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser
1 5 10 15
Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
20 25
<210> 33
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反应位点环子序列变体
<400> 33
Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Leu Phe Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser
1 5 10 15
Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
20 25
<210> 34
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-MM-EL肽
<400> 34
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Glu Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
<210> 35
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-MM-LL肽
<400> 35
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Leu Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
<210> 36
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-MM-LL-hFc1融合蛋白
<400> 36
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Leu Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp
385 390 395 400
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
405 410 415
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
420 425 430
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
435 440 445
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
450 455 460
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
465 470 475 480
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
485 490 495
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
500 505 510
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
515 520 525
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
530 535 540
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
545 550 555 560
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
565 570 575
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
580 585 590
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
595 600 605
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
610 615 620
Gly Lys
625
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2E7-VK 轻链
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体恒定区
<400> 38
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
100 105
<210> 39
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D2E7-VH 重链
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu
115
<210> 40
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体恒定区
<400> 40
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
20 25 30
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
35 40 45
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
50 55 60
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
85 90 95
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
100 105 110
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
130 135 140
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
145 150 155 160
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
165 170 175
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
180 185 190
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
195 200 205
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
210 215 220
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
225 230 235 240
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
245 250 255
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
260 265 270
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 41
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFR2-细胞外结构域
<400> 41
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
20 25 30
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp
225 230 235
<210> 42
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体恒定区
<400> 42
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Gln Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Gln Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asn Trp Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 43
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 44
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 44
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Ile Ile Ser Arg Asp Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 45
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 45
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ile
20 25 30
Ile Ser Arg Asp Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 46
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 46
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 47
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 47
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 48
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 48
Ala Pro Glu Val Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 49
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 49
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Val Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 50
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 50
Ala Pro Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 51
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 51
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 52
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 52
Ala Pro Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Ile Ile Ser Arg Asp Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 53
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG1 Fc
<400> 53
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ile Ile
20 25 30
Ser Arg Asp Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 54
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG2 Fc
<400> 54
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Ile Ile Ser Arg Asp Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 55
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG3 Fc
<400> 55
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Ile Ile Ser Arg Asp Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 56
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG3 Fc
<400> 56
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
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65 70 75 80
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85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 73
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的人IgG4 Fc
<400> 73
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Ile Ile Ser Arg Asp Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 74
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1-VA δG铰链
<400> 75
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser
<210> 76
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser
20
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4-铰链PE
<400> 77
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser
20
<210> 78
<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-EL-Fc-IgG1-DV,δG,IDL
<400> 78
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Glu Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Gly Gly Gly Gly Asp Lys
385 390 395 400
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Val Ala Gly Pro Ser
405 410 415
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ile Ile Ser Arg
420 425 430
Asp Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
435 440 445
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
450 455 460
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
465 470 475 480
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
485 490 495
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
500 505 510
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
515 520 525
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
530 535 540
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
545 550 555 560
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
565 570 575
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
580 585 590
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala
595 600 605
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615 620
<210> 79
<211> 623
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAT-EL-Fc-IgG4-PE,IDL
<400> 79
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Glu Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
385 390 395 400
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val
405 410 415
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ile Ile Ser Arg Asp
420 425 430
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
435 440 445
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
450 455 460
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
465 470 475 480
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
485 490 495
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
500 505 510
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
515 520 525
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
530 535 540
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
545 550 555 560
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
565 570 575
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
580 585 590
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
595 600 605
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
610 615 620
<210> 80
<211> 394
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Glu Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Leu Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390

Claims (17)

1.分离的融合蛋白，其包含可操作连接至修饰的人IgG4 Fc多肽的至少一种人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其中所述修饰的人IgG4 Fc多肽包含SEQ ID NO:60、69或70的氨基酸序列，其中所述修饰的IgG4 Fc多肽包含在位置M252（SEQ ID NO: 60的残基34）和/或在位置M428（SEQ ID NO: 60的残基210）处的突变。
2.权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含选自以下的另外的多肽：
细胞因子靶向多肽或自细胞因子靶向多肽衍生的序列；
包含WAP结构域的多肽或自包含WAP结构域的多肽衍生的序列；或
白蛋白多肽或自血清白蛋白多肽衍生的氨基酸序列。
3.权利要求1的融合蛋白，其中所述人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽是人α-1抗胰蛋白酶(AAT)多肽或自人AAT多肽衍生。
4.权利要求3的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 80的氨基酸序列。
5.权利要求3的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含AAT的反应位点环，其包含SEQ IDNO: 1的氨基酸序列。
6.权利要求3的分离的融合蛋白，其中AAT多肽包含AAT的突变的反应位点环，其包含SEQ ID NO: 32或33的氨基酸序列。
7.权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述修饰的IgG4 Fc多肽包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列。
8.权利要求1或权利要求3的分离的融合蛋白，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽和免疫球蛋白Fc多肽通过铰链区、接头区或铰链区和接头区二者可操作连接。
9.权利要求8的分离的融合蛋白，其中铰链区、接头区或铰链区和接头区二者包含肽序列。
10.权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 79的氨基酸序列。
11.权利要求1的分离的融合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc多肽包含在位置T246(SEQ ID NO: 60的残基38)处的突变。
12.权利要求1的融合蛋白在制备用于有需要的受试者中治疗或减轻与异常丝氨酸蛋白酶表达或活性有关的疾病或病症的症状的药物中的用途。
13.权利要求1的融合蛋白在制备用于有需要的受试者中治疗或减轻炎症或炎性疾病或病症的症状同时降低感染风险的药物中的用途。
14.权利要求1的融合蛋白在制备用于有需要的受试者中降低感染风险的药物中的用途。
15.权利要求12-14中任一项的用途，其中所述受试者是人。
16.权利要求13的用途，其中所述炎性疾病或病症选自：肺气肿、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、变应性哮喘、囊性纤维化、肺部癌症、缺血-再灌注损伤、心脏移植后的缺血/灌注损伤、心肌梗塞、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、I型和/或II型糖尿病、肺炎、脓毒症、移植物抗宿主病(GVHD)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化。
17.权利要求14的用途，其中所述感染选自细菌感染、真菌感染或病毒感染。
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