CN114874333A - 一种生长激素融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种生长激素融合蛋白及其应用。该融合蛋白包括一种Fc突变体，该突变体包括：第一肽链，其中，所述第一肽链1)相较于野生型IgG4Fc片段，具有如下位点的突变：第234位、第235位、第298位、第299位、第300位中的至少一位；或第231‑239位；或2)相较于野生型IgG1Fc片段，具有如下位点的突变：第228‑239位，和/或，第268位、第296位、第330位和第331位中的至少一位。所述融合蛋白与人源生长激素受体具有较强的结合活性，可以消除ADCC以及CDC效应，促进Nb2‑11细胞增殖，从而有效治疗或预防人生长激素异常相关疾病。

Description

一种生长激素融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种生长激素融合蛋白及其应用，更具体地，本发明涉及一种Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、组合物、制药用途以及药物。
背景技术
生长激素缺乏症是一种公认的临床综合征，与许多代谢异常相关，包括身体成分异常、体能下降、脂质代谢改变、骨量减少、胰岛素抵抗增加和生活质量降低。大多数与生长激素缺乏症相关的代谢异常可通过重组人生长激素(rhGH)替代物逆转。传统的生长激素缺乏症治疗包括每天皮下注射rhGH。然而，注射时间过于频繁，对许多患者来说并不方便，引起了人们对治疗依从性差的担忧，这可能导致疗效降低。长效rhGH制剂不仅可以减少注射次数，从而提高依从性，并有助于提高GH治疗的疗效。
已有研究使用免疫球蛋白Fc制备融合蛋白，以增加融合蛋白的半衰期(CheolRyong Ku等人，Eur J Endocrinol.2018 Sep；179(3):169-179；Wolfgang Glaesner等人，Diabetes Metab Res Rev.2010May；26(4):287-96.)。由于生长激素生物学活性的发挥需要一定的空间效应，因此融合蛋白中Fc的连接不当会造成空间位阻效应。但研究发现，采用GGGGSGGGSGGGGS或Genexine GX-H9的部分片段与Fc进行连接，均存在对人生长激素受体结合力低，促进细胞增殖的活性低，及体外活性低等问题。
因此，仍亟需一种对人生长激素受体具有较高结合活性，能够促进T细胞增殖的融合蛋白。
发明内容
本申请是基于发明人对下列问题和事实的发现而提出的：
在本发明的的第一方面，本发明提出了一种Fc突变体。根据本发明的实施例，包括：第一肽链，其中，所述第一肽链1)相较于野生型IgG4 Fc片段，具有如下位点的突变：第234位、第235位、第298位、第299位、第300位中的至少一位；或第231-239位；或2)相较于野生型IgG1 Fc片段，具有如下位点的突变：第228-239位，和/或，第268位、第296位、第330位和第331位中的至少一位。发明人对IgG4或IgG1抗体的Fc片段分别进行上述突变，不同的位点进行突变具有不同的作用，根据本发明实施例的Fc突变体可以有效降低所述Fc片段制备过程中的碎片含量，避免其形成半抗体，并消除ADCC以及CDC效应，利用本申请所述Fc突变体制备的融合蛋白与人源生长激素受体具有较强的结合活性，可以消除ADCC以及CDC效应，促进Nb2-11细胞增殖，能够有效治疗或预防人生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，上述Fc突变体还可以进一步包括如下附加技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述Fc突变体不能将第235位氨基酸突变为丙氨酸。
根据本发明的实施例，所述Fc突变体的序列不为SEQ ID NO:69。
Fc突变体排除序列(第一肽链6)(相较于野生型IgG4抗体的Fc片段具有F234V和L235A突变)的氨基酸序列：
APEVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:69)。
根据本发明的实施例，所述Fc突变体不能同时，有且只有第234位和第235位氨基酸突变。
根据本发明的实施例，所述Fc突变体进一步包括第二肽链，所述第二肽链的C端与所述第一肽链的N端相连，所述第二肽链具有如下突变位点：1)相较于野生型IgG4的铰链区，具有如下位点的突变：第228位；或2)具有野生型IgD片段1或IgD片段1突变体。
野生型IgG4的铰链区包括：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:72)。
根据本发明的实施例，所述野生型IgD片段1包括野生型IgD的第287-298位氨基酸。
根据本发明的实施例，所述IgD片段1突变体相较于野生型IgD片段1具有如下位点的突变：第291-296位中的至少一位。
根据本发明的实施例，所述Fc突变体进一步包括第三肽链，所述第三肽链的C端与所述第二肽链的N端相连，所述第三肽链相较于野生型IgD片段2，具有如下突变位点中的至少之一：第263位、第264位、第266位、第267位、第268位、第269位、第270位、第271位、第272位、第273位、第274位、第275位、第276位、第277位、第278位、第280位、第281位、第283位、第284位、第285位、第286位、第287位、第288位、第289位、第290位、第291位。
根据本发明的实施例，所述野生型IgD片段2包括野生型IgD的第262-291位氨基酸。
根据本发明的实施例，所述第一肽链1)相较于野生型IgG4 Fc片段，具有如下位点的突变：第234位和第235位；或第298位、第299位、第300位；或第231-239位；或2)相较于野生型IgG1 Fc片段，具有如下位点的突变：第228-239位、第268位、第296位、第330位和第331位。
根据本发明的实施例，所述第二肽链1)相较于野生型IgG4的铰链区，具有如下位点的突变：第228位；或2)具有野生型IgD片段1或IgD片段1突变体。
根据本发明的实施例，所述IgD片段1突变体相较于野生型IgD片段1具有如下突变：第291-296位。
根据本发明的实施例，所述第三肽链相较于野生型IgD片段2，具有如下突变位点：1)第266位、第267位、第268位、第277位、第278位、第280位、第283位、第285位、第286位和第287位；或2)第266位、第277位、第278位、第280位、第283位、第285位、第286位和第287位；或3)第266位、第269位、第270位、第271位、第273位、第274位、第275位、第277位、第278位、第281位和第283位；或4)第263位、第264位、第266位、第269位、第270位、第272位、第274位、第276位、第284位、第287-291。
根据本发明的实施例，所述第一肽链1)相较于野生型IgG4 Fc片段，具有如下突变：F234A和L235E；或F234V和L235E；或S298N、T299A和Y300S；或第231-239位氨基酸缺失；或2)相较于野生型IgG1Fc片段，具有如下突变：第228-239位氨基酸缺失、H268Q、Y296F、A330S和P331S。根据本发明的具体实施例，不同的位点进行突变具有不同的作用，因此，将各个突变位点进行组合后获得的Fc突变体具有不同的效果，如，F234V&L235E可以消除ADCC效应，S298N&T299A&Y300S可以消除ADCC及CDC效应。
根据本发明的实施例，所述第二肽链相较于野生型IgG4的铰链区，具有如下突变：S228P；或2)具有野生型IgD片段1或IgD片段1突变体。如前所述，不同的位点进行突变具有不同的作用，因此，将各个突变位点进行组合后获得的Fc突变体具有不同的效果，其中，S228P可以避免IgG4恒定区形成半抗体。
根据本发明的实施例，所述IgD片段1突变体相较于野生型IgD片段1具有如下突变：P291C、S292H、H293P、T294R、Q295L、P296S。
根据本发明的实施例，所述第三肽链相较于野生型IgD片段2，具有如突变：1)R266E、G267R、G268E、K277E、E278K、Q280E、R283E、T285E、K286G和T287E；或2)R266K、K277E、E278K、Q280N、R283E、T285E、K286R和T287E；或3)R266K、E269D、E270D、K271E、K273E、E274D、K275E、K277E、E278K、E281Q和R283G；或4)N263Q、T264S、R266K、E269D、E270D、K272R、E274D、E276D、E284D和287-291缺失。
野生型IgD片段2包括如下氨基酸序列：
RNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(SEQ ID NO:44)。
根据本发明的实施例，所述第一肽链具有SEQ ID NO:55、56、57、58、68、69任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第二肽链具有SEQ ID NO:59、60、61任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第三肽链具有SEQ ID NO:62、63、64、65任一项所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述野生型IgG4、野生型IgG1、野生型IgD为人源抗体。
根据本发明的实施例，所述Fc突变体包括：1)SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54任一项所示的氨基酸序列；或2)与SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54任一项所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在本发明的的第二方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，包括第一肽段，所述第一肽段包括生物活性分子功能区；第二肽段，所述第二肽段包括Fc突变体，所述Fc突变体如第一方面所限定的，其中，所述第二肽段的N端与所述第一肽段的C端相连。根据本发明实施例的融合蛋白与人源生长激素受体具有较强的结合活性，可以有效消除ADCC以及CDC效应，促进Nb2-11细胞增殖，有效治疗或预防人生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，上述融合蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述第一肽段包含生长激素或生长激素类似物，或，生长激素功能区或生长激素类似物功能区。
根据本发明的实施例，所述第一肽段包含人生长激素或人生长激素功能区。
根据本发明的实施例，所述人生长激素具有如SEQ ID NO:1或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白进一步包括连接肽。
根据本发明的实施例，所述连接肽的N端与所述第一肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二肽段的N端相连。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO:46所述的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述连接肽相比于SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，至少一个GGGGS具有S>T、氮末端增加G突变和碳末端增加L突变的至少之一。
(G4S)n(SEQ ID NO:46)，其中，n为大于0的整数，优选n为2～6。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：1)SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26、27、28任一项所示的氨基酸序列；或2)与SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26、27、28任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性的氨基酸序列。本申请中，发明人意外地发现所述第二肽段与所述连接肽组合后获得的所述融合蛋白与人生长激素受体的结合活性、Nb2-11细胞增殖的促进效果均显著优。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的优化的Fc突变体或前面所述的融合蛋白。根据本发明实施例的核酸分子获得的Fc突变体可以有效避免其形成半抗体，并有消除ADCC以及CDC效应，获得的融合蛋白与人源生长激素受体具有较强的结合活性，可以有效消除ADCC以及CDC效应，促进Nb2-11细胞增殖，有效治疗或预防人生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:32、33、34、35、36、37、38、39或SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20任一项所示的核苷酸序列。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带前面所述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将所述核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的Fc突变体或融合蛋白的表达，进而实现所述Fc突变体或融合蛋白的体外大量获得。
根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体、原核表达载体或病毒载体。
根据本发明的实施例，所述病毒包括慢病毒。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，携带前面所述的核酸分子，表达载体，或者表达前面所述的Fc突变体或融合蛋白。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的Fc突变体或融合蛋白体外表达和大量获得。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，所述真核细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述Fc突变体或融合蛋白表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合Fc突变体或融合蛋白表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述Fc突变体或融合蛋白表达的条件。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括：前面所述的融合蛋白，核酸分子，表达载体或重组细胞。如前所述，所述融合蛋白，以及所述核酸分子、表达载体或重组细胞表达后获得的融合蛋白不仅能够有效结合人源生长激素受体，而且可以有效促进Nb2-11细胞增殖，因此，根据本发明实施例的组合物中所包含的融合蛋白或表达的融合蛋白能够结合人源生长激素受体，促进Nb2-11细胞增殖，有效治疗或预防生长激素异常相关疾病。
本领域技术人员可以理解，所述组合物包含食品组合物、药物组合物等。所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的第七方面，本发明提出了前面所述的融合蛋白，核酸分子，表达载体、重组细胞或组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德-威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病和子宫内生长迟缓。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，包括前面所述的融合蛋白，核酸分子，表达载体、重组细胞或组合物。如前所述，所述融合蛋白，以及所述核酸分子、表达载体、或重组细胞表达后能够获得所述融合蛋白，不仅能够有效结合人源生长激素受体，而且可以有效促进Nb2-11细胞增殖，因此，根据本发明实施例的药物中所包含的融合蛋白或表达的融合蛋白能够结合人源生长激素受体，促进Nb2-11细胞增殖，有效治疗或预防生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物进一步包括药学上可接受的载体，包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、或其他液体赋形剂、分散剂、矫味剂或悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、助流剂或润滑剂，等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
例如，本发明的融合蛋白可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物中。这些药物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物为注射溶液或输注溶液形式。所述融合蛋白可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种预防或治疗生长激素异常相关疾病的方法。根据本发明的实施例，包括向受试者施用以下中的至少之一：1)前面所述的融合蛋白；2)前面所述的核酸分子；3)前面所述的表达载体；4)前面所述的重组细胞；5)前面所述的组合物；和6)前面所述的药物。如前所述，所述融合蛋白，以及所述核酸分子、表达载体、或重组细胞表达后获得的融合蛋白，不仅能够有效结合人源生长激素受体，而且可以有效促进Nb2-11细胞增殖，因此，利用上述物质以及包含上述物质的组合物、药物可以有效的治疗或预防生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德-威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病和子宫内生长迟缓。
附图说明
图1是根据本发明实施例的融合蛋白的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的融合蛋白9#诱导的ADCC效应的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。
本发明融合蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本申请中，所述“融合蛋白”是指利用基因工程技术将抗体片段与其他生物活性蛋白融合所得的产物。
在本申请中，术语“突变体”可以指包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变的任何天然存在的或工程化的分子。
在本申请中，所述抗体“Fc片段”包括抗体的CH2和CH3区，如野生型IgG4 Fc片段包括野生型IgG4抗体的CH2和CH3区，野生型IgG1 Fc片段包括野生型IgG1抗体的CH2和CH3区。
在本申请中，“半抗体”是指抗体Fc片段的二硫键断裂后形成的两条抗体片段，例如，野生型人源IgG4抗体的Fc片段形成的半抗体为包含野生型人源IgG4抗体的CH2和CH3区的片段，野生型人源IgG1抗体的Fc片段形成的半抗体为包含野生型人源IgG1抗体的CH2和CH3区的片段。
在本申请中，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸，脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式，及其组合。
本文所用术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。
在本申请中，术语“同一性”、“同源性”或“相似相”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocolsin Molecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork)；和 ALIGN程 序 (Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman 算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和 BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者 WU-BLAST-2(Altschul 等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或 者 GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本申请中，所述IgG4或 IgG1的Fc片段的氨基酸编号为根据EU编号系统编号，例如，所述“S228P”是指按EU编号系统编号第228位的丝氨酸被脯氨酸替代。
在本申请中，所述IgD片段的氨基酸编号方式参考文献：Takahashi, Nobuhiro,et al. “Complete Amino Acid Sequence of the δ Heavy Chain of HumanImmunoglobulin D.” Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America, vol. 79, no. 9, 1982, pp. 2850–54,http://www.jstor.org/stable/11720. Accessed 12 Apr. 2022.
在一些实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，其结构通式表示为X-L-Y，其中X是第一种生物活性分子；L是不存在或为连接肽；Y是第二种生物活性分子；-为肽键；且所述活性分子X或Y选自蛋白或蛋白结构域、多肽、抗体或抗体片段。
根据本发明的一些具体实施方案，上述融合蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的一些具体实施方案，所述X为人生长激素。
根据本发明的一些具体实施方案，所述人生长激素的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1或者与其具有至少80-99％同一性的氨基酸序列或者SEQ ID NO:1的至少一部分。
人生长激素(hGH)氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:1)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述Y为Fc片段或其变体。
根据本发明的一些具体实施方案，所述Fc片段的氨基酸序列包括SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或者与其中任一序列具有至少80-99％同一性的氨基酸序列或者其中任一序列的至少一部分；或者所述Fc片段的变体的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或者与其中任意一序列具有至少80-99％同一性的氨基酸序列或者其中任意一序列的至少一部分。
Fc片段变体1氨基酸序列包括：
ESKYGPPCPPCPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:2)。
Fc片段变体2氨基酸序列包括：
ESKYGPPCPPCPAPEVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:3)。
Fc片段变体3氨基酸序列包括：
ESKYGPPCPPCPAPEVEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:4)。
Fc片段变体4氨基酸序列包括：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:5)。
Fc片段变体5氨基酸序列包括：
TPECCHPRLSLGVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:6)。
Fc片段变体6氨基酸序列包括：
TPECPSHTQPLGVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:7)。
野生型IgG4片段的氨基酸序列包括：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:29)。
野生型IgG1 Fc片段的氨基酸序列包括：
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:30)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述融合蛋白的氨基酸序列包括选自:SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28或者与其中任意一序列具有至少80-99％同一性的氨基酸序列或者其中任意一序列的至少一部分。
融合蛋白8#(生物活性分子功能区-Fc突变体1)的氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFRNTGEREEEKKKEKEEKEEEEEEEGEPECPESKYGPPCPPCPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：21)。
融合蛋白9#(生物活性分子功能区-Fc突变体2)的氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFRNTGKGGEEKKKEKEEKENEEEEEREPECPESKYGPPCPPCPAPEVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：22)。
融合蛋白10#(生物活性分子功能区-Fc突变体4)的氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFRNTGKGGDDEKEDEEEKEQQEGETKTPECPESKYGPPCPPCPAPEVEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：23)。
融合蛋白11#(生物活性分子功能区-(G4S)3-Fc突变体5)的氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：24)。
融合蛋白12#(生物活性分子功能区-GS连接肽突变体-Fc突变体3)的氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGGSGGGGTGGGGSLESKYGPPCPPCPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：25)。
融合蛋白13#(生物活性分子功能区-Fc突变体6)的氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFRQSGKGGDDKRKDKDKEEQEERDTKESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO：26)。
融合蛋白14#(生物活性分子功能区-(G4S)3-Fc突变体7)的氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSGGGGSTPECCHPRLSLGVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：27)。
融合蛋白15#(生物活性分子功能区-(G4S)3-Fc突变体8)的氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSGGGGSTPECPSHTQPLGVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：28)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述连接肽含有1个或更多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
根据本发明的一些具体实施方案，所述连接肽的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或者与其中任意一序列具有至少80-99％同一性的氨基酸序列或者其中任意一序列的至少一部分。
连接肽1(Linker1)(第三肽链1)氨基酸序列：
RNTGEREEEKKKEKEEKEEEEEEEGEPECP(SEQ ID NO:8)。
连接肽2(Linker2)(第三肽链2)氨基酸序列：
RNTGKGGEEKKKEKEEKENEEEEEREPECP(SEQ ID NO:9)。
连接肽3(Linker3)(第三肽链3)氨基酸序列：
RNTGKGGDDEKEDEEEKEQQEGETKTPECP(SEQ ID NO:10)。
连接肽4(Linker4)氨基酸序列：
GGGGGSGGGGTGGGGSL(SEQ ID NO:11)。
连接肽5(Linker5)(第三肽链4)氨基酸序列：
RQSGKGGDDKRKDKDKEEQEERDTK(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，本发明提出了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码前面所述的连接肽。
在一些实施方案中，本发明提出了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码前面所述的融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明提出了一种载体，所述载体包含前面所述的核苷酸序列。
根据本发明的一些具体实施方案，上述载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施方案，本发明提出的所述载体为表达载体。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在一些实施方案中，本发明提出了一种工程细胞，其特征在于，所述工程细胞包含前面所述的融合蛋白，或者所述工程细胞包含前面所述核苷酸序列或表达载体。
在本申请中，术语“工程细胞”是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。
在一些实施方案中，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物含有前面所述融合蛋白。
根据本发明的一些具体实施方案，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施方案，所述药物组合物是用于口服、静脉内施用，如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、损伤内、或吸入路径如鼻内，通常通过静脉内或皮下施用的药物组合物。
根据本发明的一些具体实施方案，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、喷雾剂、注射剂、冻干粉针剂或预充针注射剂。
在一些实施方案中，本发明提出了一种前面所述的融合蛋白的制备方法，其包括：(a)培养前面所述工程细胞，获得含融合蛋白的培养液。(b)从上述培养液中分离出所述融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明提出了前面所述的融合蛋白或药物组合物在制备用于治疗或预防缺乏人生长激素的疾病的药物中的用途。
在本申请中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
本申请中各序列名称及编号如表1所示：
表1：
Figure BDA0003619913970000101
Figure BDA0003619913970000111
相比现有技术，本发明至少具有包括以下有益技术效果中的一种：
(1)本发明长效人生长激素融合蛋白EC50值低，与人GHR有很强的结合活性，尤其是人生长激素融合蛋白8#、9#、10#、15#的结合活性效果显著优于Genexine GX-H9和GH+G/Slinker+IgG4-1蛋白。
(2)本发明长效人生长激素融合蛋白对Nb2-11细胞有良好增殖作用；人生长激素融合蛋白8#、9#、10#、12#的增殖活性效果明显优于Genexine GX-H9和GH+G/S linker+IgG4-1蛋白。
(3)本发明长效人生长激素融合蛋白报告基因细胞表达荧光素酶的活性效果良好，其中，人生长激素融合蛋白8#、9#、10#、12#促进报告基因细胞表达荧光素酶的活性优于Genexine GX-H9和GH+G/Slinker+IgG4-1蛋白。
(4)本发明所提供的第三肽链可提高包含所述第三肽链的人生长激素融合蛋白与人GHR的结合活性、Nb2-11细胞的增殖活性和报告基因细胞表达荧光素酶的活性。
(5)本发明所提供的SEQ ID NO:54有利于提高包含SEQ ID NO:54氨基酸序列的第二种生物活性分子的人生长激素融合蛋白与人GHR的结合活性。
(6)本发明所提供的SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10第三肽链有利于提高包含所述第三肽链的人生长激素融合蛋白对Nb2-11细胞的增殖活性。
(7)本发明所提供的SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50所示的第二种生物活性分子有利于提高包含所述第二种生物活性分子的人生长激素融合蛋白对Nb2-11细胞的增殖活性。
(8)本发明所提供的SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10第三肽链有利于提高包含所述第三肽链的人生长激素融合蛋白的报告基因细胞表达荧光素酶的活性。
(9)本发明所提供的SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50所示的第二种生物活性分子有利于提高包含所述第二种生物活性分子的人生长激素融合蛋白的报告基因细胞表达荧光素酶的活性。
(10)本发明所提供的融合蛋白，具有更长的体内半衰期。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1制备人生长激素融合蛋白表达载体
本申请中将人生长激素(SEQ ID NO:1)与多种抗体Fc突变体(SEQ ID NO:47-54，序列中加粗字体表示第二肽链)进行连接，构建融合蛋白，其中，部分融合蛋白存在连接肽，具有连接肽的融合蛋白具体结构如图1所示，所述连接肽为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:45)或将其进行突变获得的，所述抗体Fc突变体是将野生型IgG4 Fc片段(SEQ ID NO:71)或IgG1 Fc片段(SEQ ID NO:30)进行突变获得的，所述突变方式包括点突变、增加野生型IgG4和/或IgD抗体片段或其对应突变体等。具体的实验操作如下：
将编码人生长激素的核苷酸序列(SEQ ID NO:31)、编码连接肽的核苷酸序列以及编码多种抗体Fc突变体的核苷酸序列(SEQ ID NO:32-39)进行组合，采用基因全合成及分子克隆技术分别将编码融合蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20克隆至表达载体pCDNA3.4(购自Thermo Fisher)中，分别得到各核苷酸序列的融合蛋白表达载体。
人生长激素(hGH)氨基酸序列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:1)。
第一肽链1(相较于野生型IgG4 Fc片段，具有F234V和L235E突变)的氨基酸序列：
APEVEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:55)。
第一肽链2(相较于野生型IgG4 Fc片段，具有S298N、T299A和Y300S突变)的氨基酸序列：
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:56)。
第一肽链3(相较于野生型IgG4 Fc片段，具有第231-239位氨基酸缺失)的氨基酸序列：
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:57)。
第一肽链4(相较于野生型IgG1 Fc片段，具有第228-239位氨基酸缺失、H268Q、Y296F、A330S和P331S突变)的氨基酸序列：
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:58)。
第一肽链5(相较于野生型IgG4抗体的Fc片段具有F234A和L235E突变)的氨基酸序列：
APEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:68)。
第二肽链1的氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:59)。
第二肽链2(IgD片段1突变体)的氨基酸序列：
TPECCHPRLSLG(SEQ ID NO:60)。
第二肽链3(野生型IgD片段1)的氨基酸序列：
TPECPSHTQPLG(SEQ ID NO:61)。
第三肽链1的氨基酸序列：
RNTGEREEEKKKEKEEKEEEEEEEGEPECP(SEQ ID NO:62)。
第三肽链2的氨基酸序列：
RNTGKGGEEKKKEKEEKENEEEEEREPECP(SEQ ID NO:63)。
第三肽链3的氨基酸序列：
RNTGKGGDDEKEDEEEKEQQEGETKTPECP(SEQ ID NO:64)。
第三肽链4的氨基酸序列：
RQSGKGGDDKRKDKDKEEQEERDTK(SEQ ID NO:65)。
Fc突变体1(第一肽链5-第二肽链1-第三肽链1)氨基酸序列：
RNTGEREEEKKKEKEEKEEEEEEEGEPECPESKYGPPCPPCPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:47)。
Fc突变体2(第一肽链6-第二肽链1-第三肽链2)的氨基酸序列：
RNTGKGGEEKKKEKEEKENEEEEEREPECPESKYGPPCPPCPAPEVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:48)。
Fc突变体3(第一肽链5-第二肽链1)的氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:49)
Fc突变体4(第一肽链1-第二肽链1-第三肽链3)的氨基酸序列：
RNTGKGGDDEKEDEEEKEQQEGETKTPECPESKYGPPCPPCPAPEVEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:50)。
Fc突变体5(第一肽链2-第二肽链1)的氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:51)。
Fc突变体6(第一肽链2-第二肽链1-第三肽链4)氨基酸序列：
RQSGKGGDDKRKDKDKEEQEERDTKESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:52)。
Fc突变体7(第一肽链3-第二肽链2)氨基酸序列：
TPECCHPRLSLGVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:53)。
Fc突变体8(第一肽链4-第二肽链3)氨基酸序列：
TPECPSHTQPLGVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:54)。
连接肽(Linker)氨基酸序列：
GGGGGSGGGGTGGGGSL(SEQ ID NO:11)。
编码人生长激素(hGH)的核苷酸序列：
TTTCCCACCATTCCTCTGAGCAGACTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTTGACACATACCAGGAGTTCGAGGAGGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCAGCCTGTGCTTCAGCGAGAGCATCCCCACCCCCAGCAATAGAGAGGAGACACAGCAGAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGAATCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCCGTTCAATTTCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCAGCGATTCTAATGTGTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGACCCTGATGGGCAGACTGGAGGACGGCTCTCCTAGAACCGGACAAATTTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAGAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAGACATTCCTGAGAATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGCGGATTC(SEQ ID NO:31)。
编码Fc突变体1的核苷酸序列：
AGAAACACCGGCGAGAGAGAGGAAGAGAAGAAGAAAGAGAAAGAGGAAAAAGAAGAGGAAGAGGAAGAAGAGGGCGAGCCTGAGTGCCCCGAGTCTAAGTATGGACCTCCTTGTCCTCCATGTCCAGCTCCAGAAGCTGAAGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAGACTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAA(SEQ ID NO:32)。
编码Fc突变体2的核苷酸序列：
AGAAACACCGGCAAGGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGGAGAAGGAGAACGAGGAGGAGGAGGAGAGAGAGCCCGAGTGCCCTGAAAGCAAATACGGACCCCCTTGCCCTCCCTGCCCTGCTCCTGAAGTTGCTGGAGGACCTAGCGTGTTTCTGTTTCCCCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCAAGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAAACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTATACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAACCCGAAAATAATTACAAGACCACACCTCCCGTGCTGGACAGCGATGGATCATTTTTCCTGTACAGCAGACTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAA(SEQ ID NO:33)。
编码Fc突变体3的核苷酸序列：
GAATCTAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCATGTCCAGCTCCAGAAGCTGAAGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAGACTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAA(SEQ ID NO:34)。
编码Fc突变体4的核苷酸序列：
AGAAACACTGGAAAAGGCGGCGACGACGAGAAAGAGGACGAGGAAGAGAAAGAGCAGCAAGAGGGCGAGACAAAGACCCCTGAGTGCCCCGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCATGTCCAGCTCCAGAAGTGGAAGGCGGCCCATCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAGACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAAGAGGGAAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAA(SEQ ID NO:35)。
编码Fc突变体5的核苷酸序列：
GAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCATGTCCAGCTCCAGAGTTTCTCGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTTAACAACGCCAGCAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAGACTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAA(SEQ ID NO:36)。
编码Fc突变体6的核苷酸序列：
AGACAGTCTGGAAAAGGCGGCGACGACAAGCGCAAGGATAAGGACAAAGAGGAACAAGAAGAACGCGACACCAAAGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCATGTCCAGCTCCAGAGTTTCTCGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTTAACAACGCCAGCAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAGACTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAA(SEQ ID NO:37)。
编码Fc突变体7的核苷酸序列：
ACACCTGAGTGCTGTCACCCTAGACTGAGCCTGGGAGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCAAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAGACTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCTCTGAGCCTGTCTCTGGGCAAG(SEQ ID NO:38)。
编码Fc突变体8的核苷酸序列：
ACACCTGAGTGTCCTAGCCACACACAGCCCCTGGGAGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGTAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAA(SEQ ID NO:39)。
编码第三肽链1的核苷酸序列：
AGAAACACCGGCGAGAGAGAGGAAGAGAAGAAGAAAGAGAAAGAGGAAAAAGAAGAGGAAGAGGAAGAAGAGGGCGAGCCTGAGTGCCCC(SEQ ID NO:40)。
编码第三肽链2的核苷酸序列：
AGAAACACCGGCAAGGGCGGCGAGGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGGAGAAGGAGAACGAGGAGGAGGAGGAGAGAGAGCCCGAGTGCCCT(SEQ ID NO:41)。
编码第三肽链3的核苷酸序列：
AGAAACACTGGAAAAGGCGGCGACGACGAGAAAGAGGACGAGGAAGAGAAAGAGCAGCAAGAGGGCGAGACAAAGACCCCTGAGTGCCCC(SEQ ID NO:42)。
编码第三肽链4的核苷酸序列：
AGACAGTCTGGAAAAGGCGGCGACGACAAGCGCAAGGATAAGGACAAAGAGGAACAAGAAGAACGCGACACCAAA(SEQ ID NO:66)。
编码连接肽(Linker4)的核苷酸序列：
ggcggaggcggaggatctggtggcggaggaacaggcggtggtggaagcctg(SEQ ID NO:67)。
编码融合蛋白8#的核苷酸序列：
tttccgaccattccgctgagccgcctgtttgataacgcgatgctgcgcgcgcatcgcctgcatcagctggcgtttgatacctatcaggaatttgaagaagcgtatattccgaaagaacagaaatatagctttctgcagaacccgcagaccagcctgtgctttagcgaaagcattccgaccccgagcaaccgcgaagaaacccagcagaaaagcaacctggaactgctgcgcattagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcagtttctgcgcagcgtgtttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgatagcaacgtgtatgatctgctgaaagatctggaagaaggcattcagaccctgatgggccgcctggaagatggcagcccgcgcaccggccagatttttaaacagacctatagcaaatttgataccaacagccataacgatgatgcgctgctgaaaaactatggcctgctgtattgctttcgcaaagatatggataaagtggaaacctttctgcgcattgtgcagtgccgcagcgtggaaggcagctgcggctttcgcaacaccggcgaacgcgaagaagaaaaaaaaaaagaaaaagaagaaaaagaagaagaagaagaagaagaaggcgaaccggaatgcccggaaagcaaatatggcccgccgtgcccgccgtgcccggcgccggaagcggaaggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaagatccggaagtgcagtttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaaggcctgccgagcagcattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccaggaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagccgcctgaccgtggataaaagccgctggcaggaaggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcctgggcaaa(SEQ ID NO：13)。
编码融合蛋白9#的核苷酸序列：
tttccgaccattccgctgagccgcctgtttgataacgcgatgctgcgcgcgcatcgcctgcatcagctggcgtttgatacctatcaggaatttgaagaagcgtatattccgaaagaacagaaatatagctttctgcagaacccgcagaccagcctgtgctttagcgaaagcattccgaccccgagcaaccgcgaagaaacccagcagaaaagcaacctggaactgctgcgcattagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcagtttctgcgcagcgtgtttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgatagcaacgtgtatgatctgctgaaagatctggaagaaggcattcagaccctgatgggccgcctggaagatggcagcccgcgcaccggccagatttttaaacagacctatagcaaatttgataccaacagccataacgatgatgcgctgctgaaaaactatggcctgctgtattgctttcgcaaagatatggataaagtggaaacctttctgcgcattgtgcagtgccgcagcgtggaaggcagctgcggctttcgcaacaccggcaaaggcggcgaagaaaaaaaaaaagaaaaagaagaaaaagaaaacgaagaagaagaagaacgcgaaccggaatgcccggaaagcaaatatggcccgccgtgcccgccgtgcccggcgccggaagtggcgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaagatccggaagtgcagtttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaaggcctgccgagcagcattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccaggaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagccgcctgaccgtggataaaagccgctggcaggaaggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcctgggcaaa(SEQ ID NO：14)。
编码融合蛋白10#的核苷酸序列：
tttccgaccattccgctgagccgcctgtttgataacgcgatgctgcgcgcgcatcgcctgcatcagctggcgtttgatacctatcaggaatttgaagaagcgtatattccgaaagaacagaaatatagctttctgcagaacccgcagaccagcctgtgctttagcgaaagcattccgaccccgagcaaccgcgaagaaacccagcagaaaagcaacctggaactgctgcgcattagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcagtttctgcgcagcgtgtttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgatagcaacgtgtatgatctgctgaaagatctggaagaaggcattcagaccctgatgggccgcctggaagatggcagcccgcgcaccggccagatttttaaacagacctatagcaaatttgataccaacagccataacgatgatgcgctgctgaaaaactatggcctgctgtattgctttcgcaaagatatggataaagtggaaacctttctgcgcattgtgcagtgccgcagcgtggaaggcagctgcggctttcgcaacaccggcaaaggcggcgatgatgaaaaagaagatgaagaagaaaaagaacagcaggaaggcgaaaccaaaaccccggaatgcccggaaagcaaatatggcccgccgtgcccgccgtgcccggcgccggaagtggaaggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaagatccggaagtgcagtttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaaggcctgccgagcagcattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccaggaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagccgcctgaccgtggataaaagccgctggcaggaaggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcctgggcaaa(SEQ ID NO：15)。
编码融合蛋白11#的核苷酸序列：
tttccgaccattccgctgagccgcctgtttgataacgcgatgctgcgcgcgcatcgcctgcatcagctggcgtttgatacctatcaggaatttgaagaagcgtatattccgaaagaacagaaatatagctttctgcagaacccgcagaccagcctgtgctttagcgaaagcattccgaccccgagcaaccgcgaagaaacccagcagaaaagcaacctggaactgctgcgcattagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcagtttctgcgcagcgtgtttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgatagcaacgtgtatgatctgctgaaagatctggaagaaggcattcagaccctgatgggccgcctggaagatggcagcccgcgcaccggccagatttttaaacagacctatagcaaatttgataccaacagccataacgatgatgcgctgctgaaaaactatggcctgctgtattgctttcgcaaagatatggataaagtggaaacctttctgcgcattgtgcagtgccgcagcgtggaaggcagctgcggctttggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgaaagcaaatatggcccgccgtgcccgccgtgcccggcgccggaatttctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaagatccggaagtgcagtttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacaacgcgagccgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaaggcctgccgagcagcattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccaggaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagccgcctgaccgtggataaaagccgctggcaggaaggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcctgggcaaa(SEQ ID NO：16)。
编码融合蛋白12#的核苷酸序列：
atggagttcggcctgagctggctgttcctggtggctattctgaaaggcgtgcaatgcttccccaccattcctctgagccggctgttcgacaacgccatgctgagagcccacagactgcaccagctggccttcgacacctaccaagagttcgaggaagcctacattcccaaagagcagaagtacagcttcctgcagaaccctcagaccagcctgtgcttcagcgagagcatccccacacctagcaacagagaggaaacccagcagaagtccaacctggaactgctgcggatcagcctgctgctgatccagtcttggctggaacccgtgcagttcctgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtttacgacctgctgaaggacctggaagagggcatccagacactgatgggcagactggaagatggcagccctagaaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagccacaacgacgacgccctgctgaaaaactacggcctgctgtactgctttcggaaggacatggacaaggtggaaaccttcctgcggatcgtgcagtgcagaagcgtggaaggctcttgtggctttggcggaggcggaggatctggtggcggaggaacaggcggtggtggaagcctggaatctaagtacggccctccttgtcctccatgtccagctccagaagctgaaggcggcccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaagaggatcctgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagttcaacagcacctatagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcctagcagcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccaagggaaccccaggtttacacactgcctccaagccaagaggaaatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagaccacacctcctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagatggcaagagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtctctgagcctgagcctgggcaaa(SEQ ID NO：17)。
编码融合蛋白13#的核苷酸序列：
tttccgaccattccgctgagccgcctgtttgataacgcgatgctgcgcgcgcatcgcctgcatcagctggcgtttgatacctatcaggaatttgaagaagcgtatattccgaaagaacagaaatatagctttctgcagaacccgcagaccagcctgtgctttagcgaaagcattccgaccccgagcaaccgcgaagaaacccagcagaaaagcaacctggaactgctgcgcattagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcagtttctgcgcagcgtgtttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgatagcaacgtgtatgatctgctgaaagatctggaagaaggcattcagaccctgatgggccgcctggaagatggcagcccgcgcaccggccagatttttaaacagacctatagcaaatttgataccaacagccataacgatgatgcgctgctgaaaaactatggcctgctgtattgctttcgcaaagatatggataaagtggaaacctttctgcgcattgtgcagtgccgcagcgtggaaggcagctgcggctttcgccagagcggcaaaggcggcgatgataaacgcaaagataaagataaagaagaacaggaagaacgcgataccaaagaaagcaaatatggcccgccgtgcccgccgtgcccggcgccggaatttctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaagatccggaagtgcagtttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacaacgcgagccgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaaggcctgccgagcagcattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccaggaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagccgcctgaccgtggataaaagccgctggcaggaaggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcctgggcaaa(SEQ ID NO：18)。
编码融合蛋白14#的核苷酸序列：
tttccgaccattccgctgagccgcctgtttgataacgcgatgctgcgcgcgcatcgcctgcatcagctggcgtttgatacctatcaggaatttgaagaagcgtatattccgaaagaacagaaatatagctttctgcagaacccgcagaccagcctgtgctttagcgaaagcattccgaccccgagcaaccgcgaagaaacccagcagaaaagcaacctggaactgctgcgcattagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcagtttctgcgcagcgtgtttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgatagcaacgtgtatgatctgctgaaagatctggaagaaggcattcagaccctgatgggccgcctggaagatggcagcccgcgcaccggccagatttttaaacagacctatagcaaatttgataccaacagccataacgatgatgcgctgctgaaaaactatggcctgctgtattgctttcgcaaagatatggataaagtggaaacctttctgcgcattgtgcagtgccgcagcgtggaaggcagctgcggctttggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaccccggaatgctgccatccgcgcctgagcctgggcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaagatccggaagtgcagtttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaaggcctgccgagcagcattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccaggaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagccgcctgaccgtggataaaagccgctggcaggaaggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcctgggcaaa(SEQ IDNO：19)。
编码融合蛋白15#的核苷酸序列：
tttccgaccattccgctgagccgcctgtttgataacgcgatgctgcgcgcgcatcgcctgcatcagctggcgtttgatacctatcaggaatttgaagaagcgtatattccgaaagaacagaaatatagctttctgcagaacccgcagaccagcctgtgctttagcgaaagcattccgaccccgagcaaccgcgaagaaacccagcagaaaagcaacctggaactgctgcgcattagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcagtttctgcgcagcgtgtttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgatagcaacgtgtatgatctgctgaaagatctggaagaaggcattcagaccctgatgggccgcctggaagatggcagcccgcgcaccggccagatttttaaacagacctatagcaaatttgataccaacagccataacgatgatgcgctgctgaaaaactatggcctgctgtattgctttcgcaaagatatggataaagtggaaacctttctgcgcattgtgcagtgccgcagcgtggaaggcagctgcggctttggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaccccggaatgcccgagccatacccagccgctgggcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccgagcagcattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgatgaactgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaa(SEQ IDNO：20)。
野生型IgG4的Fc片段包括：
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:71)。
实施例2人生长激素融合蛋白的表达
本实施例将实施例1获得的多个质粒转染Expi CHO-S(Gibco,A29133)宿主细胞，采用化学转染试剂Polyplus-FectoPRO(polyplus，116-010)瞬时表达长效人生长激素融合蛋白，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：21-28。具体的实验操作如下：
(1)Expi CHO-S细胞瞬染前一天对细胞进行传代，用培养基将细胞密度调整为3×106cells/mL左右，然后，将细胞培养瓶放回摇床(37℃，8％CO2)继续培养。
(2)瞬染当天(每个分子转染1L)：取Expi CHO-S细胞液进行细胞计数，用培养基将细胞密度调整为6×106cells/mL左右。
(3)配制转染复合物：取16个无菌细胞培养瓶，8个标记“DNA”，8个标记“FectoPRO”，在“FectoPRO”瓶中加入转染试剂Polyplus-FectoPRO；在8个“DNA”瓶中全部加入60mL Opti-MEM溶液和每个“DNA”瓶各自加入500μg实施例1所得的分别包括各核苷酸序列的融合蛋白表达载体；混匀，得融合蛋白表达载体稀释液，将包括各核苷酸序列的融合蛋白表达载体稀释液分别加入“FectoPRO”瓶中混匀，室温孵育10min后加入细胞液中摇匀，将细胞培养瓶放回摇床继续培养转染。
(4)转染18-22h后加入适量OPM-CHO ProFeed，并检测细胞液各生化指标，根据生化指标检测结果，补充葡糖糖至6g/L。转染4d后开始检测Titer，并隔天补料补糖。细胞活率<80％即得CHO细胞发酵液，可收获上清液进行纯化。
实施例3人生长激素融合蛋白的纯化
本实施例将实施例2获得的CHO细胞发酵液进行二级离心(一级离心条件：3,000×g,30min；二级离心条件：12,000×g,20min)，收集上清液经0.2μm滤器过滤，备用。
Protein A亲和层析：使用pH7.2的含20mM磷酸盐和150mM氯化钠的水溶液平衡层析柱至少3个柱体积，上样过滤后的澄清滤液，料液保留在层析柱上的时间为5分钟，上完样品后，再使用pH7.2的含20mM磷酸盐和150mM氯化钠的水溶液平衡层析柱至少1个柱体积，按照顺序使用pH 4.5的含50mM HAc的缓冲液，pH4.0的含50mM HAc的缓冲液，和pH 3.5的含50mM HAc的缓冲液，分别洗脱目的蛋白，当出现吸收峰时，收峰范围为50mAU-peak-50mAU，得到SEC纯度符合要求(＞98.0)的融合蛋白。表达SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的ExpiCHO-S细胞经发酵、层析后分别得到融合蛋白8#、融合蛋白9#、融合蛋白10#、融合蛋白11#、融合蛋白12#、融合蛋白13#、融合蛋白14#、融合蛋白15#。
实施例4人生长激素融合蛋白的体外受体结合活性测定
本实施例对实施例3获得的纯化后的融合蛋白进行体外受体(人生长激素受体，Human GHR)结合活性检测，并以Genexine GX-H9(SEQ ID NO:70)、GH+G/S linker+IgG4-1(SEQ ID NO:43)为对照组，具体实验操作如下：
将Human GHR稀释制得0.5μg/mL包被液，分别以100μL/孔加入酶标板，2～8℃包被12小时以上。弃去包板残液，加入1％BSA-PBST，每孔300μL，37℃封闭1小时。每孔加入300μL的PBST洗3次，将重组长效人生长激素融合蛋白、Genexine GX-H9、GH+G/S linker+IgG4-1分别稀释至5μg/mL，再5倍稀释8个梯度浓度，100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育1小时，孵育结束后每孔加入300μL的PBST，洗涤3次后加入1％BSA-PBST稀释10000倍的Goat antihuman IgG Fc-HRP，100μL/孔加样。37℃孵育1小时后，每孔加入300μL的PBST，洗涤3次，拍干。加入TMB显色液，每孔100μL。室温反应5分钟后加2M H2SO4水溶液终止反应，100μL/孔。将中止反应的酶标板置酶标仪上，450nm波长下读取吸光度OD450值并计算各融合蛋白的对人GHR结合活性EC50。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGSGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:43)。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:70)。
具体的实验结果如表2所示，(1)本发明长效人生长激素融合蛋白EC50值低，与Human GHR有很强的结合活性，尤其是SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:20所编码的人生长激素融合蛋白8#、9#、10#、15#对Human GHR结合活性效果显著优于Genexine GX-H9和GH+G/Slinker+IgG4-1；其中，对人GHR结合活性最高的为人生长激素融合蛋白15#，其次为人生长激素融合蛋白9#。
(2)人生长激素融合蛋白15#包含SEQ ID NO:54所编码的第二种生物活性分子，说明SEQ ID NO:54有利于提高人生长激素融合蛋白与人GHR的结合活性。
表2：
Figure BDA0003619913970000211
实施例5人生长激素融合蛋白对Nb2-11细胞增殖的影响
本实施例以实施例3获得的纯化后的融合蛋白进行实验，并以上述Genexine GX-H9(市售产品)和GH+G/S linker+IgG4-1为对照组，具体实验操作如下：
收集细胞并以每毫升1×105个细胞的浓度悬浮在培养基(PRMI 1640培养基，含1％FBS和50μM的β-巯基乙醇)。将每份50μL细胞样品加到96孔细胞培养板的各孔中。用50μL含有0.051ng/mL-3000ng/mL各浓度梯度的长效人生长激素融合蛋白、Genexine GX-H9、GH+G/S linker+IgG4-1的分析培养基分别培养上述细胞。在37℃，5％CO2湿润培养箱中培养上述细胞板96小时，然后在各孔中添加50μL ellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay(Promega，G7571)。10分钟后，酶标仪检测化学发光信号。由所得剂量反应曲线测定重组长效人生长激素融合蛋白的生物活性。
具体的实验结果如表3所示，其中，(1)本发明长效人生长激素融合蛋白对Nb2-11细胞有良好增殖作用；SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17所编码的人生长激素融合蛋白8#、9#、10#、12#的增殖活性效果明显优于Genexine GX-H9和GH+G/Slinker+IgG4-1；其中，增殖活性最高的为人生长激素融合蛋白10#，其次为人生长激素融合蛋白8#，再次为人生长激素融合蛋白9#。
(2)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所编码的第三肽链有利于提高人生长激素融合蛋白的对Nb2-11细胞的增殖活性。
(3)SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50所编码的第二种生物活性分子有利于提高所述人生长激素融合蛋白的对Nb2-11细胞的增殖活性。
表3：
Figure BDA0003619913970000212
Figure BDA0003619913970000221
实施例6人生长激素融合蛋白对报告基因细胞生物学活性实验
本实施例以实施例3获得的纯化后的人生长激素融合蛋白进行实验，并以上述Genexine GX-H9(市售产品)和GH+G/S linker+IgG4-1为对照组，具体实验操作如下：
取对数生长期的报告基因细胞(293-GHR/STAT5 cell line)，胰酶消化后铺板(costar，3917)，4×104cells/well，50μL/well，将96孔白板放在37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。细胞中加入梯度稀释的重组长效人生长激素融合蛋白，起始浓度为100nM，5倍梯度稀释，10个梯度浓度，稀释液加入细胞中，添加体积为50μL/well，将96孔白板放在37℃，5％CO2培养箱中孵育6小时。孵育结束后，取出96孔白板和Nano-Glo Luciferase Assay试剂盒(promega，N112B)，均平衡至室温，样品孔加入反应底物，添加体积为50μL/well，室温放置10分钟，采用酶标仪(Promega，GM2000)记录luminescence信号值，以蛋白浓度作为X轴，以luminescence信号值为Y轴，用GraphPad Prisim 5作四参数拟合，计算EC50值。
具体的实验结果如表4所示，其中：
(1)本发明重组长效人生长激素融合蛋白报告基因细胞表达荧光素酶的活性效果良好，其中，SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17所编码的人生长激素融合蛋白8#、9#、10#、12#促进报告基因细胞表达荧光素酶的活性优于Genexine GX-H9和GH+G/S linker+IgG4-1；其中，促进报告基因细胞表达荧光素酶的活性最高的为人生长激素融合蛋白9#，其次为人生长激素融合蛋白8#，再次为人生长激素融合蛋白10#。
(2)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所编码的第三肽链有利于提高所述人生长激素融合蛋白的报告基因细胞表达荧光素酶的活性。
(3)SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:50所编码的第二种生物活性分子有利于提高包含所述第二种生物活性分子的人生长激素融合蛋白的报告基因细胞表达荧光素酶的活性。
表4：
Figure BDA0003619913970000222
Figure BDA0003619913970000231
实施例7人生长激素融合蛋白诱导效应细胞Jurkat-CD16a-luc对靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR的ADCC效应检测
7.1方法
样品信息如表5所示：
表5：
Figure BDA0003619913970000232
3.2、细胞处理
靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR处理：实验前2天进行传代处理，弃上清，用5mL PBS清洗细胞后，加入1mL的0.25％Trypsin-EDTA，37℃培养箱消化1min后，加入6mL的培养基1(450mL F12 medium+50mL FBS)终止消化，并重悬至单细胞悬液，弃去5mL细胞悬液，并加入8mL的培养基1(450mL F12 medium+50mL FBS)，并加入120μL的G418，G418作用浓度为600μg/mL，混匀，放入培养箱继续培养。
效应细胞Jurkat-CD16a-luc处理：实验前2天进行传代处理，吹打混匀细胞悬液，取5mL细胞悬液至新的T75培养瓶中，然后加入15mL的培养基2(450mLRPMI Medium 1640+50mL FBS)，并加入320μL的G418，G418作用浓度为800μg/mL，60μL的Hygromycin B，Hygromycin B作用浓度为150μg/mL，混匀，放入培养箱继续培养。
3.3、实验流程
第一天，用分析培养基1(40mL F12 medium+0.4mL FBS)将靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR密度调整至1.83×105细胞/mL，50μL/孔铺板过夜；第二天，先将SBT123供试品分子(分子9#和Genexine GX-H9)、阳性对照M7824以及阴性对照Acterma用分析培养基2(RPMIMedium 1640)一级稀释至0.1mg/mL，二级稀释至24μg/mL，再3倍稀释9个梯度，25μL/孔加入细胞板中，混匀，放置37℃培养箱中共孵育45min后，将细胞板取出；用分析培养基2(RPMIMedium 1640)将效应细胞Jurkat-CD16a-luc密度调整至1.47×106细胞/mL，25μL/孔加入细胞板中，混匀，放置37℃培养箱中共孵育5.5h后，将细胞板取出室温平衡后，加入One-GloLuciferase Assay System，100μL/孔加入细胞板中，移液器吹打10次混匀；室温避光裂解10min后，酶标仪检测化学发光信号值。结果如图2所示，在ADCC实验中加入阳性对照PD-L1抗体M7824、阴性对照IL-6R抗体Acterma及SBT123供试品分子后，阳性对照M7824诱导效应细胞Jurkat-CD16a-luc对靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR有明显ADCC效应，阴性对照Acterma无ADCC效应，SBT123供试品分子无ADCC效应。
实施例8人生长激素融合蛋白诱导人血清补体对靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR的CDC效应
8.1方法
样品信息如表6所示：
表6：
Figure BDA0003619913970000241
(2)细胞处理
靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR处理：实验前2天进行传代处理，弃上清，用5mL PBS清洗细胞后，加入1mL的0.25％Trypsin-EDTA，37℃培养箱消化1min后，加入6mL的培养基1(450mL F12 medium+50mL FBS)终止消化，并重悬至单细胞悬液，弃去5mL细胞悬液，并加入8mL的培养基1(450mL F12 medium+50mL FBS)，并加入120μL的G418，G418作用浓度为600μg/mL，混匀，放入培养箱继续培养。
(3)实验流程
第一天，用分化培养基(99％F12+1％FBS)将靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR密度调整至2.0×105细胞/mL，50μL/孔铺板过夜；第二天，先将SBT123供试品分子(分子9#和GenexineGX-H9)、阳性对照Avelumab以及阴性对照Acterma用分化培养基(99％F12+1％FBS)一级稀释至0.1mg/mL，二级稀释至15μg/mL，再3倍稀释7个梯度，50μL/孔加入细胞板中，混匀，放置37℃培养箱中共孵育30min后，将细胞板取出；加入30％补体(含有70％分化培养基+30％补体)，50μL/孔，混匀，放置37℃培养箱中共孵育6h后，将细胞板取出室温平衡后，加入CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay，50μL/孔加入细胞板中，移液器吹打10次混匀；室温避光裂解10min后，酶标仪检测化学发光信号值。结果显示，在CDC实验中加入阳性对照PD-L1抗体Avelumab、阴性对照IL-6R抗体Acterma及SBT123供试品分子后，阳性对照Avelumab诱导人血清补体对靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR有明显CDC效应，阴性对照Acterma无CDC效应，SBT123供试品分子无CDC效应。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (18)

1.一种Fc突变体，其特征在于，包括：第一肽链，
其中，
所述第一肽链1)相较于野生型IgG4 Fc片段，具有如下位点的突变：第234位、第235位、第298位、第299位、第300位中的至少一位；或第231-239位；或2)相较于野生型IgG1 Fc片段，具有如下位点的突变：第228-239位，和/或，第268位、第296位、第330位和第331位中的至少一位。
2.根据权利要求1所述的Fc突变体，其特征在于，所述Fc突变体不能将第235位氨基酸突变为丙氨酸；
任选地，所述Fc突变体的序列不为SEQ ID NO:69；
任选地，所述Fc突变体进一步包括第二肽链，所述第二肽链的C端与所述第一肽链的N端相连，所述第二肽链：
1)相较于野生型IgG4的铰链区，具有如下位点的突变：第228位；或
2)具有野生型IgD片段1或IgD片段1突变体；
任选地，所述野生型IgD片段1包括野生型IgD的第287-298位氨基酸；
任选地，所述IgD片段1突变体相较于野生型IgD片段1具有如下位点的突变：第291-296位中的至少一位；
任选地，所述Fc突变体进一步包括第三肽链，所述第三肽链的C端与所述第二肽链的N端相连，所述第三肽链相较于野生型IgD片段2，具有如下突变位点中的至少之一：第263位、第264位、第266位、第267位、第268位、第269位、第270位、第271位、第272位、第273位、第274位、第275位、第276位、第277位、第278位、第280位、第281位、第283位、第284位、第285位、第286位、第287位、第288位、第289位、第290位、第291位；
任选地，所述野生型IgD片段2包括野生型IgD的第262-291位氨基酸。
3.根据权利要求1～2任一项所述的Fc突变体，其特征在于，所述第一肽链1)相较于野生型IgG4Fc片段，具有如下位点的突变：第234位和第235位；或第298位、第299位、第300位；或第231-239位；或2)相较于野生型IgG1 Fc片段，具有如下位点的突变：第228-239位、第268位、第296位、第330位和第331位；
任选地，所述第二肽链1)相较于野生型IgG4的铰链区，具有如下位点的突变：第228位；或2)具有野生型IgD片段1或IgD片段1突变体；
任选地，所述IgD片段1突变体相较于野生型IgD片段1具有如下突变：第291-296位；
任选地，所述第三肽链相较于野生型IgD片段2，具有如下突变位点：1)第266位、第267位、第268位、第277位、第278位、第280位、第283位、第285位、第286位和第287位；或2)第266位、第277位、第278位、第280位、第283位、第285位、第286位和第287位；或3)第266位、第269位、第270位、第271位、第273位、第274位、第275位、第277位、第278位、第281位和第283位；或4)第263位、第264位、第266位、第269位、第270位、第272位、第274位、第276位、第284位、第287-291。
4.根据权利要求1～3任一项所述的Fc突变体，其特征在于，所述第一肽链1)相较于野生型IgG4Fc片段，具有如下突变：F234A和L235E；或F234V和L235E；或S298N、T299A和Y300S；或第231-239位氨基酸缺失；或2)相较于野生型IgG1 Fc片段，具有如下突变：第228-239位氨基酸缺失、H268Q、Y296F、A330S和P331S；
任选地，所述第二肽链相较于野生型IgG4的铰链区，具有如下突变：S228P；或2)具有野生型IgD片段1或IgD片段1突变体；
任选地，所述IgD片段1突变体相较于野生型IgD片段1具有如下突变：P291C、S292H、H293P、T294R、Q295L、P296S；
任选地，所述第三肽链相较于野生型IgD片段2，具有如突变：1)R266E、G267R、G268E、K277E、E278K、Q280E、R283E、T285E、K286G和T287E；或2)R266K、K277E、E278K、Q280N、R283E、T285E、K286R和T287E；或3)R266K、E269D、E270D、K271E、K273E、E274D、K275E、K277E、E278K、E281Q和R283G；或4)N263Q、T264S、R266K、E269D、E270D、K272R、E274D、E276D、E284D和287-291缺失。
5.根据权利要求1～4任一项所述的Fc突变体，其特征在于，所述第一肽链具有SEQ IDNO:55、56、57、58、68、69任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二肽链具有SEQ ID NO:59、60、61任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述第三肽链具有SEQ ID NO:62、63、64、65任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述野生型IgG4、野生型IgG1、野生型IgD为人源抗体。
6.根据权利要求1～5任一项所述的Fc突变体，其特征在于，包括：
1)SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54任一项所示的氨基酸序列；或
2)与SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54任一项所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
7.一种融合蛋白，其特征在于，包括：
第一肽段，所述第一肽段包括生物活性分子功能区；
第二肽段，所述第二肽段包括Fc突变体，所述Fc突变体如权利要求1-6任一项所限定的，其中，所述第二肽段的N端与所述第一肽段的C端相连。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一肽段包含生长激素或生长激素类似物，或，生长激素功能区或生长激素类似物功能区，优选为人生长激素或人生长激素功能区；
任选地，所述人生长激素具有如SEQ ID NO:1或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列；
任选地，所述融合蛋白进一步包括连接肽；
任选地，所述连接肽的N端与所述第一肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二肽段的N端相连；
任选地，所述连接肽具有SEQ ID NO:46所述的氨基酸序列；
优选的，所述连接肽相较于SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，至少一个GGGGS具有S>T、氮末端增加G突变和碳末端增加L突变的至少之一；
任选地，所述连接肽具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求7～8任一项所述的融合蛋白，其特征在于，包括：
1)SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26、27、28任一项所示的氨基酸序列；或
2)与SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26、27、28任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性的氨基酸序列。
10.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～6任一项所述的Fc突变体或权利要求7～9任一项所述的融合蛋白。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA；
任选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:32、33、34、35、36、37、38、39或SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20任一项所示的核苷酸序列。
12.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求10～11任一项所述的核酸分子。
13.根据权利要求12所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体、原核表达载体或病毒载体；
任选地，所述病毒包括慢病毒。
14.一种重组细胞，其特征在于，携带权利要求10～11任一项所述的核酸分子，权利要求12～13任一项所述的表达载体，或者表达权利要求1～6任一项所述的Fc突变体或权利要求7～9任一项所述的融合蛋白。
15.根据权利要求14所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将权利要求12～13任一项所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的；
任选地，通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中；
任选地，所述重组细胞为真核细胞；
任选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
16.一种组合物，其特征在于，包括：权利要求7～9任一项所述的融合蛋白，权利要求10～11任一项所述的核酸分子，权利要求12～13任一项所述的表达载体或权利要求14～15任一项所述的重组细胞。
17.权利要求7～9任一项所述的融合蛋白，权利要求10～11任一项所述的核酸分子，权利要求12～13任一项所述的表达载体，权利要求14～15任一项所述的重组细胞，或权利要求16所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防生长激素异常相关疾病；
任选地，所述生长激素异常相关疾病包括选自下列中的至少之一：儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德-威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病和子宫内生长迟缓。
18.一种药物，其特征在于，包括：权利要求7～9任一项所述的融合蛋白，权利要求10～11任一项所述的核酸分子，权利要求12～13任一项所述的表达载体，权利要求14～15任一项所述的重组细胞，或权利要求17所述的组合物。
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