KR20230167026A

KR20230167026A - Cxcr2 및 gpc3에 대한 star를 공동-발현하는 t 세포, 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230167026A
Application number: KR1020237032054A
Authority: KR
Inventors: 웨이 루이; 광나 리우; 홍리 젱; 지아셩 왕; 단 통; 쉬창 자오; 신 린
Original assignee: 브리스타 이뮤노테크 리미티드; 칭화 유니버시티
Priority date: 2021-02-25
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2023-12-07
Also published as: EP4299592A1; JP2024508819A; WO2022179520A1; CN117999281A; US20240148787A1; CA3211842A1

Abstract

공동-발현되는 CXCR2와 GPC3에 특이적인 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(STAR)의 T 세포, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

공동-발현되는 CXCR2 및 GPC3에 특이적인 STAR의 T 세포, 및 이의 용도

본 발명은 생물의학 분야, 특히 CXCR2 및 GPC3에 대한 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(Synthetic T-Cell Receptor and Antigen Receptor, STAR)를 공동-발현하는 T 세포, 및 이의 용도에 관한 것이다.

세포 치료제, 특히 T 세포 관련 치료제가 급속도로 발전하고 있으며, 그 중 키메라 항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T) 치료제와 TCR-T 치료제가 많은 주목을 받고 있다.

TCR-T 치료제는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)를 기반으로 한다. TCR은 T 세포의 정체를 뜻하며, TCR의 종류에 따라 αβ T 세포와 γδ T 세포로 나눌 수 있다. 발달 과정에서 T 전구 세포는 TCR γ 및 TCR δ 사슬의 VDJ 재배열을 거치게 되며, 재배열이 성공하면 γδ T 세포로 발달하고, 재배열이 실패하면 TCR α 및 TCR β 사슬의 VDJ 재조합을 거친 다음 αβ T 세포로 발달한다. αβ T 세포는 말초혈액 T 세포의 90-95%를 차지하고, γδ T 세포는 말초혈액 T 세포의 5-10%를 차지한다. 두 가지 유형의 T 세포는 각각 MHC-제한 방식과 MHC-비제한 방식으로 항원을 인식하며, 이는 병원체와 종양에 대한 면역에 중요한 역할을 한다.

T 세포 수용체(TCR) 복합체 분자는 다중 사슬을 포함하며, 여기서 TCR α 및 TCR β 사슬(또는 TCR γ 및 TCR δ 사슬)은 MHC-폴리펩티드 분자를 인식하는 역할을 담당하고, 나머지 6개 CD3 서브유닛은 TCR α/β 사슬(또는 TCR γ/δ 사슬)에 결합하여 신호 전달의 역할을 한다. 천연 TCR 복합체는 10개의 ITAM 신호 서열을 포함하며, 이는 이론적으로 CAR보다 더 강한 신호를 전송할 수 있다. 천연 TCR의 신호 전달 기능을 이용하면, T 세포 장애를 완화하는 새로운 수용체의 구축이 가능하며, 이는 고형 종양에 대해 더 나은 역할을 할 수 있다. TCR의 엑토도메인(ectodomain)은 항체의 Fab 도메인과 매우 유사하므로 TCR의 가변 영역 서열을 항체의 가변 영역 서열로 대체하여 합성 TCR 및 항원 수용체(Synthetic TCR and Antigen Receptor, STAR)를 얻을 수 있으며, 이는 항체 특이성을 가질 뿐만 아니라 T 세포 활성화 매개에 대한 천연 TCR의 우수한 신호 전달 기능도 가지고 있다.

업계에서 임상에 적용된 세포 치료제의 수는 매우 제한적이므로 STAR-기반 T세포 치료제와 같은 개선된 T 세포 치료제가 여전히 필요하다.

발명의 요약

일 측면에서, 본 발명은 CXCR2 및 GPC3에 대한 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(STAR)를 공동-발현하는 단리된 치료용 T 세포를 제공하며, 여기서 GPC3에 대한 STAR는 GPC3에 대한 항원 결합 영역을 포함하고, GPC3에 대한 STAR는 제1 불변 영역을 포함하는 α 사슬 및 제2 불변 영역을 포함하는 β 사슬을 포함한다.

일부 구현예에서,

i) α 사슬은 GPC3에 대한 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 제2 불변 영역을 포함하거나; 또는

ii) α 사슬은 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 GPC3에 대한 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하고;

iii) α 사슬은 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 천연 TCR α 사슬 불변 영역, 예를 들어 천연 인간 TCR α 사슬 불변 영역 또는 천연 마우스 TCR α 사슬 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 6의 아미노산, 예컨대 E는 D로 치환되고, 위치 13의 아미노산 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실된다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 6의 아미노산, 예컨대 E는 D로 치환되고, 위치 13의 아미노산 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실되고, 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신산 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 불변 영역의 엔도도메인(endodomain)이 결여되어 있고, 예를 들어, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 서열번호 3-4 및 28-30 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 제2 불변 영역은 천연 TCR β 사슬 불변 영역, 예를 들어 천연 인간 TCR β 사슬 불변 영역 또는 천연 마우스 TCR β 사슬 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 제2 불변 영역은 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환되고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되고, 위치 9의 아미노산 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 위치 17 및 21-25의 아미노산은 결실된다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환된고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되고, 위치 9의 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 17, 21-25번 아미노산은 결실된다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR 베타 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있고, 예를 들어, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 167-172의 아미노산이 결실되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 서열번호 7-8 및 31-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, GPC3에 대한 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 상기 항체의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 상기 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고; 또는 제1 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 상기 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 22에 제시된 VH CDR1, 서열번호 23에 제시된 VH CDR2, 및 서열번호 24에 제시된 VH CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 25에 제시된 VL CDR1, 서열번호 26에 제시된 VL CDR2, 및 서열번호 27에 제시된 VL CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, α 사슬 및/또는 β 사슬은 C-말단에 연결된 적어도 하나의 외인성 세포내 기능성 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 외인성 세포내 기능성 도메인은 α 사슬 및/또는 β 사슬의 불변 영역의 C-말단에 직접 연결되거나 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 외인성 세포내 기능성 도메인은 엔도도메인이 결실된 α-사슬 및/또는 β-사슬의 불변 영역의 C-말단에 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 (G4S)n 링커이고, 여기서 n은 1-10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3이다.

일부 구현예에서, 외인성 세포내 기능성 도메인은 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)의 엔도도메인, 바람직하게는 OX40의 엔도도메인이고, 예를 들어, OX40의 엔도도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, α 사슬은 서열번호 13, 15, 17 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, β 사슬은 서열번호 14, 16, 18 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, STAR는 서열번호 13에 제시된 α 사슬 및 서열번호 14에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 15에 제시된 α 사슬 및 서열번호 16에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 17에 제시된 α 사슬 및 서열번호 18에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 19에 제시된 α 사슬 및 서열번호 20에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 15에 제시된 α 사슬 및 서열번호 14에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 19에 제시된 α 사슬 및 서열번호 18에 제시된 β 사슬을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 치료용 T 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암과 같은 질병을 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어서 본 발명의 치료용 T 세포 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 질병은 GPC3-관련 질병, 예컨대 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)과 같은 간암, 폐 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma, SqCC)과 같은 폐암, 위암, 난소암, 흑색종 또는 소아 배아 종양이다.

도 1은 실시예에서 사용된 일부 구축물(construct)의 맵을 보여준다.
도 2는 GPC3 항원에 대한 CAR 또는 서로 다른 불변 영역 최적화 구조(A 및 C: Nrec-Cys-TM; B 및 D: Cys-TM)를 갖는 GPC3 항원에 대한 STAR 및 CXCR2를 공동-발현하는 T 세포의 표적 세포에 대한 사멸 효과, 및 표적 세포의 자극 하에서 사이토카인의 분비를 보여준다.
도 3은 CXCR2의 발현이 종양으로의 T 세포 침윤을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 4는 CXCR2, 및 GPC3 항원을 표적으로 하는 CAR 또는 Nrec-Cys-TM의 최적화된 불변 영역 구조를 갖는 GPC3 항원을 표적으로 하는 STAR를 공동-발현하는 T 세포의 생체 내 종양 억제 효과를 보여준다.
도 5는 상응하는 GPC3 STAR-aOX40-T와 비교하여 Cys-TM의 최적화된 불변 영역 구조를 갖는 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T의 시험관 내 기능 평가. A: TRAC (Cys-TM) 및 TRBC (Cys-TM)를 포함하는 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T의 구축 전략; B: GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T는 GPC3 및 CXCR2의 우수한 동시-발현 수준을 나타내었다. C: GPC3 STAR-aOX40-T 및 GPC3 CAR-T와 비교한 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T의 종양 세포 사멸 활성.
도 6은 Cys-TM의 최적화된 불변 영역 구조를 갖는 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T의 시험관 내 이동(migration) 능력을 보여준다.
도 7은 Cys-TM의 최적화된 불변 영역 구조를 갖는 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T의 생체 내 종양으로 이동하는 능력을 보여준다. A: 실험 과정; B: 세포 재주입 후 종양 조직 무게의 비교; C: 종양 조직에 침윤된 T 세포의 비교.
도 8은 Cys-TM의 최적화된 불변 영역 구조를 갖는 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T의 항종양 활성이 상응하는 GPC3 STAR-aOX40-T의 항종양 활성보다 강력함을 보여준다.

달리 표시하거나 정의하지 않는 한, 사용되는 모든 용어는 해당 분야에서 통상적인 의미를 가지며, 이는 해당 분야의 숙련된 기술자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 표준 매뉴얼, 예컨대 Sambrook et al., "Molecular cloning: a laboratory manual"; Lewin, "Genes VIII", 및 Roitt et al., "Immunology" (8판), 및 본원에서 인용된 일반 선행 기술을 참조하라; 또한, 달리 언급하지 않는 한, 구체적으로 설명되지 않은 모든 방법, 단계, 기법 및 동작은 공지된 방식 그 자체로 수행되었을 수 있으며, 이는 당업자가 이해할 수 있을 것이다. 또한, 예를 들어 표준 매뉴얼, 상기 일반 선행 기술 및 거기에 인용된 기타 참고 문헌을 참조하라.

본원에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 해당 용어로 연결된 항목의 모든 조합을 포함하며, 이는 본원에서 별개로 나열된 것으로 간주된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"에는 "A", "A 및 B", 및 "B"를 포함한다. 예를 들어, "A, B 및/또는 C"는 "A", "B", "C", "A 및 B", "A 및 C", "B 및 C", 및 "A 및 B 및 C"를 포함한다.

"포함하는"이라는 용어는 단백질 또는 핵산의 서열을 설명하기 위해 본원에서 사용되며, 이는 상기 서열로 구성될 수 있거나, 상기 단백질 또는 핵산의 한쪽 또는 양쪽 말단에 추가적인 아미노산 또는 뉴클레오티드를 가질 수 있지만 여전히 본원에 설명된 활성을 보유한다. 또한, 당업자는 폴리펩티드의 N-말단의 시작 코돈에 의해 암호화되는 메티오닌이 특정의 실질적 상황(예를 들어, 특정 발현 시스템에서 발현되는 경우)에서 유지되지만, 폴리펩티드의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 특정 폴리펩티드 아미노산 서열에 대한 설명에서, N-말단의 시작 코돈에 의해 암호화되는 메티오닌을 포함하지 않을 수 있지만, 여전히 시간에 따라 메티오닌을 포함하는 서열을 포함하며, 이에 따라 이의 암호화 뉴클레오티드 서열은 시작 코돈을 포함할 수도 있으며; 그 반대도 마찬가지이다.

본원에서 사용되는 "서열번호 x를 참조하는 아미노산 번호"(서열번호 x는 본원에 나열된 특정 서열이다)는 기재된 특정 아미노산의 위치 번호가 서열번호 x 상에 해당 아미노산에 상응하는 아미노산의 위치 번호임을 의미한다. 서로 다른 아미노산 서열 사이의 아미노산 일치성(correspondence)은 당업계에 공지된 서열 정렬 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 일치성은 EMBL-EBI 온라인 정렬 도구(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 두 서열은 디폴트 파라미터와 함께 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 정렬될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에서 시작하여 위치 46의 아미노산이 서열번호 x의 위치 48에 있는 아미노산과 서열 정렬로 정렬되는 경우, 폴리펩티드의 아미노산은 또한 "폴리펩티드의 위치 48에 있는 알라닌, 아미노산 위치는 서열번호 x를 참조한다"라고 본원에 기재될 수 있다. 본 발명에서, α 사슬 불변 영역과 관련된 아미노산 위치에 대해서는 서열번호 2를 참조한다. 본 발명에서, β 사슬 불변 영역과 관련된 아미노산 위치에 대해서는 서열번호 6을 참조한다.

CXCR2는 G 단백질-결합된(coupled) 수용체 계열에 속하며, 호중구에 흔히 분포하며, 비만세포, 대식세포, 내피세포 및 다양한 종양 세포에서도 발견될 수 있다. 인터루킨(IL)-8 특이적 결합과의 높은 친화성 때문에 IL8Rβ라고도 한다. CXCR2 코딩 유전자는 염색체 2q33-q36에 위치하며, 수용체 단백질은 약 350개의 아미노산으로 구성된다. CXCR2의 리간드는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7 및 CXCL8과 같은 다양한 CXC 케모카인이다. 초기 연구에서는 CXCR2가 호중구를 모집하여 염증성 면역과 관련이 있는 것으로 간주되는 염증 부위로 이동할 수 있음을 발견하였다. 최근에는 CXCR2가 다양한 종양의 발생, 발달 및 치료에 관여하는 것으로 밝혀졌다. CXCR2의 예시적인 아미노산 서열이 서열번호 12에 제시되어 있다. 본원에 기재된 CXCR2는 또한 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 서열번호 12와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

GPC3(Glypican 3)은 세포 분열, 또는 발달 중 세포 분열 패턴의 조절에 관여한다. GPC3은 HCC(간세포 암종) 세포에서 고도로 발현되므로 HCC의 진단 마커 및 치료 표적으로 사용되어 왔다.

본 발명자들은 놀랍게도 T 세포에서 CXCR2 및 GPC3(Glypican 3)을 표적으로 하는 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(STAR), 특히 불변 영역에서 조작된 STAR를 공동-발현하면, T 세포의 표적 사멸 능력이 현저히 향상되고 치료 효능이 개선될 수 있다는 것을 발견하였다.

일부 구현예에서, T 세포는 CXCR2 및 GPC3에 대한 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(STAR)를 공동-발현하고, 여기서 GPC3에 대한 STAR는 α 사슬 및 β 사슬을 포함하고, α 사슬은 GPC3에 대한 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 제2 불변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, T 세포는 CXCR2 및 GPC3에 대한 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(STAR)를 공동-발현하고, 여기서 GPC3에 대한 STAR는 α 사슬 및 β 사슬을 포함하고, α 사슬은 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 GPC3에 대한 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, T 세포는 CXCR2 및 GPC3에 대한 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(STAR)를 공동-발현하고, 여기서 GPC3에 대한 STAR는 α 사슬 및 β 사슬을 포함하고, α 사슬은 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 공동-발현은 공동-과발현이다. 예를 들어, 본 발명의 단리된 치료용 T 세포에서 CXCR2의 발현은 비변형 대조군 T 세포(예를 들어, 자연적으로 발생하는 T 세포)에 비해 증가하고, 바람직하게는 유의하게 증가한다.

일부 구현예에서, 항원 결합 영역은 불변 영역의 N-말단에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 링커를 통해) 융합된다.

일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 T 세포에서 발현 시 기능성 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, T 세포에서 발현 시, α 사슬과 β 사슬은 내인성 CD3 분자(CD3εδ, CD3γε, CD3ζζ)와 결합하여 8개의 서브유닛으로 구성된 TCR 복합체를 형성할 수 있으며, TCR 복합체는 세포 표면에 디스플레이되고, 표적 항원 GPC3에 결합 시 T 세포를 활성화시킨다. 기능성 TCR 복합체는 표적 항원에 특이적으로 결합한 후 T 세포를 활성화할 수 있다는 것을 의미한다.

일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 천연 TCR α 사슬 불변 영역, 예를 들어 천연 인간 TCR α 사슬 불변 영역 또는 천연 마우스 TCR α 사슬 불변 영역이다. 예시적인 천연 인간 TCR α 사슬 불변 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 천연 마우스 TCR α 사슬 불변 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이된다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산이 발린 V로 돌연변이된다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 6의 아미노산, 예컨대 E는 D로 치환되고, 위치 13의 아미노산 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실된다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이된다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 6의 아미노산, 예컨대 E는 D로 치환되고, 위치 13의 아미노산 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실되고, 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신산 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이된다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있으며, 예를 들어 야생형 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실되어 있다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있으며, 예를 들어, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실되어 있다.

일부 특정 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 서열번호 3-4 및 28-30 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 제2 불변 영역은 천연 TCR β 사슬 불변 영역, 예를 들어 천연 인간 TCR β 사슬 불변 영역 또는 천연 마우스 TCR β 사슬 불변 영역이다. 예시적인 천연 인간 TCR β 사슬 불변 영역은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 천연 마우스 TCR β 사슬 불변 영역은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 제2 불변 영역은 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이된다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환되고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되며, 위치 9의 아미노산 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 위치 17 및 21-25의 아미노산은 결실된다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환되고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되고, 위치 9의 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 17, 21-25번 아미노산은 결실된다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있으며, 예를 들어 야생형 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 167-172의 아미노산이 결실되어 있다.

일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR 베타 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있으며, 예를 들어, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 167-172의 아미노산이 결실되어 있다.

일부 특정 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 서열번호 7-8 및 31-33 중 하나에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 불변 영역은 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 불변 영역은 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 불변 영역은 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

본원에서 사용되는 "항원 결합 영역"은 단독으로 또는 다른 항원 결합 영역과 함께 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 영역은 임의의 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함하여 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 상기 항체의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 상기 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 22에 제시된 VH CDR1, 서열번호 23에 제시된 VH CDR2, 및 서열번호 24에 제시된 VH CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 25에 제시된 VL CDR1, 서열번호 26에 제시된 VL CDR2, 및 서열번호 27에 제시된 VL CDR3을 포함한다.

일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 항체(예컨대 scFv) 또는 단일 도메인 항체(예컨대 낙타과(camelid) 항체)일 수 있다. 이 경우, 예를 들어, 상기 제1 및 제2 항원 결합 영역은 GPC3의 동일하거나 상이한 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, STAR의 α 사슬은 GPC3에 특이적인 항원 결합 영역을 포함하고, β 사슬은 GPC3에 특이적인 항원 결합 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, STAR의 α 사슬은 GPC3에 특이적인 항원 결합 영역을 포함하지 않고, β 사슬은 GPC3에 특이적인 항원 결합 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, α 사슬 및/또는 β 사슬, 바람직하게는 α 사슬은 C-말단에 연결된 적어도 하나의 외인성 세포내 기능성 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 외인성 세포내 기능성 도메인은 직접적으로 또는 링커를 통해 α 사슬 및/또는 β 사슬, 바람직하게는 α 사슬의 불변 영역의 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 외인성 세포내 기능성 도메인은 α-사슬 및/또는 β-사슬, 바람직하게는 엔도도메인이 결실된 α-사슬의 불변 영역의 C-말단에 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 (G4S)n 링커이고, 여기서 n은 1-10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3이다.

일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 48의 아미노산, 예를 들어 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이되고, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있으며, 예를 들어, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실되어 있고, α 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함하고(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임); 및

제2 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이된 것이다.

본원에서 사용되는 "외인성"은 외래종으로부터의 단백질 또는 핵산 서열, 또는 동일한 종으로부터인 경우 고의적인 인간 개입에 인해 그 구성 및/또는 위치가 본래의 형태로부터 상당히 변경된 단백질 또는 핵산 서열을 의미한다.

본원에서 사용되는 "외인성 세포내 도메인"은 CD40, OX40, ICOS, CD28, 4-1BB, CD27, CD137과 같은 공동-자극 분자의 세포내 도메인일 수도 있고; 이는 또한 TIM3, PD1, CTLA4, LAG3와 같은 공동-억제 분자의 세포내 도메인일 수도 있고; 이는 또한 사이토카인 수용체 예컨대 인터류킨 수용체(예컨대 IL-2β 수용체, IL-7α 수용체 또는 IL-21 수용체), 인터페론 수용체, 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 수용체, 콜로니 자극 인자 수용체, 케모카인 수용체, 성장 인자 수용체, 또는 기타 막 단백질의 세포내 도메인; 또는 NIK와 같은 세포내 단백질의 도메인일 수 있다.

일부 바람직한 구현예에서, 외인성 세포내 기능성 도메인은 공동-자극 분자의 엔도도메인, 바람직하게는 OX40의 엔도도메인이다. 일부 구현예에서, OX40의 엔도도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, α 사슬은 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역은 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제1 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 48의 아미노산, 예를 들어 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이되고; 임의로, α 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함한다(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임).

일부 구현예에서, α 사슬은 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역은 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제1 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 E와 같은 위치 6의 아미노산은 D로 치환되고, 위치 13의 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실되고, 위치 48의 아미노산, 예를 들어 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이되고; 임으로, α 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함한다(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임).

일부 구현예에서, α 사슬은 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역은 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제1 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 48의 아미노산, 예를 들어 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이되고; 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인을 결여하고 있으며, 예를 들어 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실되어 있으며; 임의로, α 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함한다(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임).

일부 구현예에서, α 사슬은 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역은 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제1 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 E와 같은 위치 6의 아미노산은 D로 치환되고, 위치 13의 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실되고, 위치 48의 아미노산, 예를 들어 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이되고; 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인을 결여하고 있으며, 예를 들어 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실되어 있으며; 임의로, α 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함한다(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임).

일부 구현예에서, α 사슬은 서열번호 13, 15, 17 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, β 사슬은 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역은 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이되고; 임의로, β 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함한다(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임).

일부 구현예에서, β 사슬은 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역은 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환되고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되고, 위치 9의 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 위치 17 및 21-25의 아미노산은 결실되고; 임의로, β 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함한다(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임).

일부 구현예에서, β 사슬은 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역은 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고; 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인을 결여하고 있으며, 예를 들어 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 167-172의 아미노산이 결실되고; 임의로, β 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함한다(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임).

일부 구현예에서, β 사슬은 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역은 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환되고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되고, 위치 9의 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 위치 17 및 21-25의 아미노산은 결실되고; 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인을 결여하고 있으며, 예를 들어 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 167-172의 아미노산이 결실되고; 임의로, β 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함한다(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임).

일부 구현예에서, β 사슬은 서열번호 14, 16, 18 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, α 사슬은 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역은 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제1 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 48의 아미노산, 예를 들어 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이되고; 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인을 결여하고 있으며, 예를 들어 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실되어 있으며; α 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함하고(예를 들어, (G4S)n 링커와 같은 링커에 의해 연결되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3임); 및

β 사슬은 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역은 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이며, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이된 것이다.

일부 구현예에서, STAR는 서열번호 13에 제시된 α 사슬 및 서열번호 14에 제시된 β 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, STAR는 서열번호 15에 제시된 α 사슬 및 서열번호 16에 제시된 β 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, STAR는 서열번호 17에 제시된 α 사슬 및 서열번호 18에 제시된 β 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, STAR는 서열번호 19에 제시된 α 사슬 및 서열번호 20에 제시된 β 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, STAR는 서열번호 15에 제시된 α 사슬 및 서열번호 14에 제시된 β 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, STAR는 서열번호 19에 제시된 α 사슬 및 서열번호 18에 제시된 β 사슬을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 CXCR2와 본 발명에서 위에서 정의한 GPC3(글리피칸 3)에 대한 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(STAR)를 T 세포에서 공동-발현하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 치료용 T 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 상기 CXCR2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터, 상기 α 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화 뉴클레오티드 서열은 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 "발현 벡터"는 선형 핵산 단편, 고리형 플라스미드, 바이러스 벡터, 또는 번역 가능한 RNA(예를 들어, mRNA)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다.

용어 "조절 서열" 및 "조절 요소"는 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 중간 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하며, 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 관련 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 발현 조절 요소는 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 관심 뉴클레오티드 서열의 번역을 제어할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 인핸서 및 폴리아데닐화 인식 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 요소(예를 들어, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 등이나 이에 제한되지 않음)가 핵산 서열(예를 들어, 코딩 서열 또는 오픈 리딩 프레임)에 연결되어 뉴클레오티드 서열 전사가 전사 조절 요소에 의해 제어되고 조절되도록 하는 것을 의미한다. 조절 요소 영역을 핵산 분자에 작동 가능하게 연결하는 기술은 해당 분야에 알려져 있다.

일부 구현예에서, CXCR2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터, α 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 서로 다른 발현 벡터일 수도 있고, 동일한 발현 벡터일 수도 있다. 예를 들어, 3개의 코딩 뉴클레오티드 서열은 3개의 서로 다른 발현 벡터에 각각 위치할 수 있거나; 또는 이들 중 2개는 동일한 발현 벡터에 위치하고, 다른 하나는 다른 발현 벡터에 위치하거나; 또는 모두 동일한 발현 벡터에 위치한다.

일부 구현예에서, α-사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 β-사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 프레임 내 동일한 발현 벡터에 위치할 수 있고, 그 사이에 자가-절단 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. α 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치할 수 있다.

본원에서 사용되는 "자가-절단 펩티드"는 세포 내에서 자가-절단을 달성할 수 있는 펩티드를 의미한다. 예를 들어, 자가-절단 펩티드는 세포 내에서 프로테아제에 의해 인식되어 특이적으로 절단될 수 있도록 프로테아제 인식 부위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 자가-절단 펩티드는 2A 폴리펩티드일 수 있다. 2A 폴리펩티드는 바이러스에서 유래한 일종의 짧은 펩티드로, 번역 과정에서 자가-절단이 일어난다. 두 개의 서로 다른 표적 단백질이 2A 폴리펩티드로 연결되어 동일한 리딩 프레임에서 발현되면, 두 가지 표적 단백질이 거의 1:1의 비율로 생성된다. 일반적인 2A 폴리펩티드는 돼지 테코바이러스-1(porcine techovirus-1)로부터의 P2A, 테세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스로부터의 T2A, 말 비염(equine rhinitis) A 바이러스로부터의 E2A, 및 구제역(foot-and-mouth disease) 바이러스로부터의 F2A일 수 있다. 그 중에서, P2A가 가장 높은 절단 효율을 가지므로 선호된다. 이들 2A 폴리펩티드의 다양한 기능적 변이체도 당업계에 공지되어 있으며, 이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.

일부 추가 구현예에서, α 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 CXCR2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 CXCR2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 서열에 의해 α 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 비제한적인 공급원으로부터 다양한 비제한적인 방법으로 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 건강한 기증자로부터 또는 암으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 별개의 표현형 프로파일을 나타내는 혼합된 세포 집단의 일부일 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리한 후 특정 항체로 활성화하고 증폭시켜 T 세포를 얻을 수 있다.

본 발명의 측면의 일부 구현예에서, T 세포는 대상체의 자가유래(autologous) 세포로부터 유래된다. 본원에서 사용되는 "자가유래"는 대상체를 치료하는 데 사용되는 세포, 세포주 또는 세포 집단이 대상체로부터 유래된다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, T 세포와 같은 면역 세포는 동종이형(allogeneic) 세포, 예컨대 대상체 인간 백혈구 항원(HLA)과 양립가능한 공여자로부터 유래된다. 공여자로부터의 세포는 표준 프로토콜을 사용하여 비-동종반응성(non-alloreactive) 세포로 전환될 수 있으며 필요에 따라 복제되어 한 명 이상의 환자에게 투여할 수 있는 세포를 생산할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 치료용 T 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 생리학적으로 양립가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의한)에 적합하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암과 같은 질병을 치료하기 위한 의약품 제조에 있어서 본 발명의 치료용 T 세포의 용도를 제공한다.

본원에서 사용되는 "대상체"는 본 발명의 세포, 방법 또는 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병(예를 들어, 암)을 앓고 있거나 앓기 쉬운 유기체를 지칭한다. 비-제한적인 예로는 인간, 가축(cattle), 래트, 마우스, 개, 원숭이, 염소, 양, 소, 사슴 및 기타 비포유동물을 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, 대상체는 인간이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본 발명의 치료용 면역 세포 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암과 같은 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 용량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여한 후 치료적 효과를 생성하기에 적어도 충분한 물질, 화합물, 재료 또는 세포의 양을 지칭한다. 따라서, 질병이나 장애의 증상을 예방, 치료, 개선, 차단 또는 부분적으로 차단하는 데 필요한 양이다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 약제학적 조성물의 "유효량"은 바람직하게는 장애 증상의 중증도 감소, 장애의 무증상(asymptomatic) 기간의 빈도 및 기간의 증가, 또는 장애를 앓음으로 인해 발생하는 부상 또는 무능의 예방을 초래할 수 있다. 예를 들어, 종양 치료의 경우, 본 발명의 세포 또는 약제학적 조성물의 "유효량"은 바람직하게는 치료받지 않은 대상체와 비교하여 종양 세포 성장 또는 종양 성장을 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 30%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%로 억제할 수 있다. 종양 성장을 억제하는 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측할 수 있는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 당업자에게 공지된 시험에 의해 시험관내에서 결정될 수 있는 종양 세포의 성장을 억제하는 능력을 조사함으로써 평가를 수행하는 것이 가능하다.

실제로, 본 발명의 약제학적 조성물 중 세포의 투여량 수준은 환자에 대한 독성 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 경로에 대한 원하는 치료 반응을 효과적으로 달성할 수 있는 활성 성분의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 적용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 적용된 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 적용된 특정 조성물과 병용하여 적용된 다른 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료할 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 상태 및 병력, 및 의료 분야에서 알려진 유사한 요소를 비롯한 다양한 약동학적 요인에 따라 달라진다.

본 발명에 따른 치료용 T 세포 또는 약제학적 조성물 또는 약물의 투여는 주사, 주입, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 세포 또는 조성물의 투여는 정맥내, 림프내, 피내, 종양내, 골수내, 근육내 또는 복강내 투여일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 세포 또는 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 다양한 측면의 구현예에서, 질병은 GPC3-관련 질병, 예컨대 GPC3-관련 암과 같은 GPC3의 비정상적인 발현과 관련된 질병이다. 암은 예를 들어 간세포 암종과 같은 간암, 폐 편평 세포 암종(SqCC)과 같은 폐암, 위암, 난소암, 흑색종 또는 소아 배아 종양이다.

실시예

실험 재료 및 방법

벡터 구축

본 출원의 실시예에서 사용된 렌티바이러스 벡터 및 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 상업 회사에서 구입했거나 상업 회사에서 합성하였다. 신호 펩티드, 항체 결합 영역, 힌지 영역, TCR 불변 영역, 태그 단백질 등을 포함하여 본 출원의 실시예에서 사용된 유전자 단편은 상업 회사에서 합성되었다. 합성 프라이머를 사용한 PCR을 통해 하나 이상의 표적 단편을 연결하여 해당 기능성 서열을 얻었다. 본 발명에서 사용되는 렌티바이러스 벡터는 pHAGE-EF1α-RFP이다. 제한효소(restriction endonuclease) Not I/Cla I을 이용하여 pHAGE-EF1A-WPRE-AMP 벡터를 얻었다. 단편 유전자는 합성과 PCR 방법으로 얻었다. 그런 다음 재조합효소(recombinase)의 작용하에 상동 재조합 방법을 통해 완전한 벡터를 얻었다.

하기의 구축물을 본 출원의 실시예에서 구축하였다: 3RD-GC33-BBzCAR-CXCR2(GPC3 CAR-CXCR2), 및 TRAC (Cys-TM) 및 TRBC (Cys-TM)으로부터 유래된 구축물 3RD-GC33-STAR-abOX40-CXCR2(GPC3 STAR-OX40-CXCR2) 및 3RD-GC33-STAR-CXCR2(GPC3 STAR-CXCR2). 구축물의 맵을 도 1에 나타내었다. TRAC (Nrec-Cys-TM) 및 TRBC (Nrec-Cys-TM)를 사용하는 구축물의 맵은 나타내지 않았다.

대조군으로서 GPC3 CAR-CXCR2의 아미노산 서열은 서열번호 21에 제시되어 있다.

GPC3을 표적으로 하는 항원 결합 영역은 항체 GC33에서 유래하며, 그의 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되어 있고, 그의 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열은 서열번호 10에 제시되어 있다.

α 사슬의 불변 영역은 마우스로부터 유래되었으며, 야생형은 TRAC로 명명되고 그 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다. TRAC (Cys-TM)는 위치 48의 트레오닌 T가 시스테인 C로 돌연변이되고 LSVMGLRIL에서 LLVIVLRIL로의 돌연변이가 있는 뮤린 불변 영역을 지칭한다. TRAC (Cys-TM)의 아미노산 서열은 서열번호 3에 제시되어 있다. TRAC (Nrec-Cys-TM)는 위치 6의 아미노산, 예컨대 E는 D로 치환되고, 위치 13의 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실되고, 위치 48의 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 서열 LSVMGLRIL이 LLVIVLRIL로 돌연변이된 뮤린 불변 영역을 지칭하며, TRAC (Nrec-Cys-TM)의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시되어 있다.

β 사슬의 불변 영역은 마우스로부터 유래되었으며, 야생형은 TRBC로 명명되고 그 서열은 서열번호 6에 제시되어 있다. TRBC (Cys-TM)는 위치 56의 세린 S가 시스테인 C로 돌연변이된 뮤린 불변 영역을 지칭하며, 그 아미노산 서열은 서열번호 7에 제시되어 있다. TRBC (Nrec-Cys-TM)는 위치 56의 아미노산, 예컨대 세린 S는 시스테인 C로 돌연변이되고, 위치 3의 아미노산, 예컨대 R은 K로 치환되고, 위치 6의 아미노산, 예컨대 T는 F로 치환되고, 위치 9의 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 아미노산 17, 21-25가 결실된 뮤린 불변 영역을 지칭하며, 그의 아미노산 서열은 서열번호 7에 제시되어 있다.

공동자극 분자 OX40의 세포질 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시되어 있다. 공동-자극 분자 OX40의 세포질 영역은 (G4S)₃ 링커를 통해 엔도도메인이 결여된 α 사슬 불변 영역(TRAC (Nrec-Cys-TM) 또는 TRAC (Cys-TM) 기반)의 C 말단 및 엔도도메인이 결여된 β 사슬 불변 영역(TRBC (Nrec-Cys-TM) 또는 TRBC (Cys-TM) 기반)의 C 말단에 연결된다.

렌티바이러스 패키징

Lentix-293T 세포를 10 cm 배양 접시에 5×10⁵ 세포/mL로 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하고, 세포 밀도가 약 80%에 도달했을 때(현미경으로 관찰) 형질감염시켰다. 3개의 플라스미드를 PMD2.G:PSPAX:전달 플라미드=1:2:3의 비율에 따라 500 uL 무혈청 DMEM과 균일하게 혼합하였다. 54 uL PEI-max를 500 uL 무혈청 DMEM과 균일하게 혼합하고, 실온에 5분간 두었다(PEI-Max와 플라스미드의 부피-질량비는 3:1이었음). PEI-max 혼합물을 플라스미드 혼합물에 천천히 첨가하고, 부드럽게 피펫팅하고, 잘 혼합하고, 실온에 15분 동안 두었다. 최종 혼합물을 배양 배지에 천천히 첨가하고, 잘 섞은 후, 다시 인큐베이터에 넣어 12시간 내지 16시간 동안 배양한 후, 6% FBS DMEM 배지로 바꿔 배양하여 48시간과 72시간에 바이러스액을 수집하였다.

T 세포의 배양 및 감염

1) Jurkat T 세포주의 배양

Jurkat T 세포주를 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배양 밀도는 3*10⁵/ml이었으며, 최고 밀도는 3*10⁶/ml 이하였다. 세포를 1-2일마다 계대배양하였다. 세포수를 계수한 후 필요한 양의 세포를 채취하고, 상기 밀도에 맞춰 배지를 첨가하여 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

2) Jurkat T 세포주의 감염

세포 계수 후, 1*10⁶/ml 세포를 원심분리하여 배지를 교체하고, 10% FBS를 함유하는 1 ml RPMI 1640 배지로 재현탁한 후, 24-웰 플레이트에 첨가하고, 바이러스 용액을 첨가(MOI=1)하고, 1500 rpm에서 90분 동안 원심분리하고, CO₂ 인큐베이터에 넣었다. 감염 12시간 후, 배지를 10% FBS를 함유하는 새로운 RPMI 1640 배지로 완전히 교체하였고, 72시간 이내에 양성률을 검출하였다.

3) 인간 일차 T 세포의 배양

Ficoll 분리 방법에 의해 일차 T 세포를 얻은 후, 10% FBS와 100 IU/ml IL-2가 포함된 X-VIVO 배지에서 배양하였다. 초기 배양 밀도는 1*10⁶/ml이었다. 세포를 CD3 및 RetroNectin(최종 농도 5 μg/ml)으로 미리 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 후기 단계 동안, 배양 밀도는 5*10⁵/ml이었고, 최고 밀도는 3*10⁶/ml 이하였으며, 세포는 1-2일마다 계대배양하였다.

4) 인간 일차 T 세포의 감염

일차 T 세포를 48시간 동안 배양한 후, 바이러스 용액을 MOI=20으로 첨가하고 1500 rpm에서 90분 동안 원심분리한 후, CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 감염 24시간 후, 10% FBS와 100 IU/ml IL-2가 포함된 X-VIVO 배지를 보충하여 다른 웰로 옮겼으며, 72시간째에 태그 단백질 또는 항체를 통해 감염 효율을 검출하였다.

5) 감염 효율 검출

감염 72시간 후, 세포를 고르게 불어서 계수한 후, 5*10⁵/ml를 취하여 원심분리하고, 상층액은 버렸다. 염색 용액은 PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA였으며, 해당 항체를 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션한 후, PBS로 2회 세척하고 기계로 검출하였다.

CXCR2를 발현하는 STAR-T 세포의 시험관 내 기능 테스트

양성 T 세포를 루시퍼라제를 발현하는 표적 세포(GPC3 발현이 낮은 SK-Hep-1, GPC3 발현이 중간인 Huh-7, GPC3 발현이 높은 HepG2)와 지정된 효과 대 표적 비율로 공동 배양하였다.

24시간 동안 공동 배양한 후, 세포 현탁액을 부드럽게 균일하게 불어넣고, 각 웰의 세포 현탁액 150 μL를 각각 2개의 복제 웰이 있는 흰색 96-웰 플레이트에 첨가하고, 루시퍼라제 기질을 첨가하였다. 혼합물을 (저속으로) 흔들고 10분 동안 인큐베이션한 후, 다기능 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 화학발광 값을 검출하였다. 세포 사멸 계산: 사멸 효율 = 100% - (이펙터 세포-표적 세포 웰의 값 / 대조균 세포-표적 세포 웰의 값). 대안적으로, 공동배양 24시간 후, 세포 배양 상층액을 수집하고, 시판되는 키트를 이용하여 사이토카인의 함량을 검출하였다.

CXCR2를 발현하는 STAR-T 세포의 생체 내 기능 테스트

1. 마우스 종양 모델의 확립

(1) 생후 5-6주령, 체중 약 20 g의 NCG 마우스 10마리를 구입하여 동물실에서 3-5일간 사육하였다.

(2) 마트리겔을 얼음 위에서 3-5시간 동안 해동하였다. 그리고 PBS, 피펫팁 등은 미리 냉각해 두었다.

(3) HuH7-Luc/GFP 세포를 PBS로 2회 세척하고 계수한 후, 5개 그룹으로 나누고 각각 1×10⁶/mL, 5×10⁶/mL, 1×10⁷/mL, 5×10⁷/mL, 1×10⁸/mL로 희석하고, 각 군당, 250 μL를 준비하였다.

(4) 녹인 마트리겔을 얼음 위에서 각 세포 그룹에 250 μL/그룹씩 첨가하고 가볍게 불어 피펫(미리 냉각된 피펫 팁)으로 혼합한 후, PBS를 500 μL까지 첨가하였다.

(5) 모든 것(세포, 주사기, 피펫, 팁)을 얼음 위에 놓고 멸균한 후 종양 접종을 위해 동물실로 가져왔다.

(6) 마우스를 이소플루란 가스 마취 장치로 마취시킨 후, 각 그룹에 2마리씩 5개의 그룹으로 나누었다. 종양 세포를 마우스 오른쪽 등의 피하로 100 μL/마우스로 접종하였다. 이 날을 0일로 기록하였다.

(7) 3일, 6일, 9일, 및 12일에 마우스의 종양을 측정하고 실시간 영상으로 검출하였다. 후속 실험을 위해 적절한 종양 접종 용량과 성장 시간을 선택하였다.

2. 생체 내 T 세포의 종양 사멸 기능 분석

(1) 실험군에 따라 해당 마우스 수를 설정하였으며, 각 그룹당 5-6마리의 마우스를 사용하였다. T 세포를 감염시키고 양성 세포를 미리 선별한 후, 7-10일 동안 배양한 후 재주입하였다.

(2) 종양 세포는 예비 실험에서 얻은 종양 접종량에 따라 마우스당 3×10⁶개의 HuH-7-Luc/GFP 세포로 접종하였다.

(3) 종양 크기가 약 100 cm³까지 성장했을 때(7일), 생체 내 형광 이미징을 실시하고, 종양 크기에 따라 마우스를 여러 그룹으로 나누고, 대조군 T 세포, 전통적인 STAR-T 세포 및 개선된 STAR-T 세포를 포함하여 T 세포를 꼬리 정맥에 재주입하였다. 마우스당 재주입량은 1×10⁶-3×10⁶ 양성 T 세포였다.

(4) 재주입 후 3-4일마다 생체 내 이미저(imager)를 이용하여 종양의 크기를 검출하고, 마우스의 말초혈액을 채취하여 생체 내 T 세포의 증식을 분석하였다.

(5) 종양 접종 35일 후, 각 군의 마우스를 죽이고, 종양을 벗겨내어 마우스의 말초혈액, 비장 및 기타 조직을 채취하여 T 세포의 분포, T 세포의 종류, 및 종양-침윤 세포의 고갈을 분석하였다.

3. 마우스의 생체 내 이미징

이소플루란으로 마우스를 마취시킨 후, 체중을 측정하고 기록하였으며, D-플루오레세인 칼륨염 200 μL를 복강내 주사하였다. 5-7분 후, 이미징을 위해 마우스를 생체 내 이미저에 배치하였다. 이미징 시간은 1분이었다. (참고: 이미징 시간은 종양 유형과 크기에 따라 결정되지만 실험 전반에 걸쳐 일관되어야 한다). 이미징 후, 이미징 사진을 저장하고, 종양 부위에 동그라미를 치고, 각 마우스의 종양 부위의 총 형광 값을 기록하였다.

4. 생체 내 T 세포 이동 분석

(1) 36마리의 마우스를 구입하였다. T 세포를 감염시키고 양성 세포를 미리 선별하여, 7-10일 동안 배양한 후 재주입하였다.

(2) 마우스당 3.5×10⁶개의 HuH-7-Luc/GFP 세포로 종양 세포를 접종하였다.

(3) 종양 크기가 약 100 cm³까지 성장했을 때(7일), 생체 내 형광 이미징을 실시하고, 종양 크기에 따라 마우스를 3개 그룹으로 각 그룹당 12마리씩으로 나누고, 대조군 T 세포, 전통적인 STAR-T 세포 및 새로운 CXCR2-변형된 STAR-T 세포를 포함하여 T 세포를 꼬리 정맥에 재주입하였다. 각 마우스의 재주입량은 2×10⁶개의 양성 T 세포였다.

(4) T 세포 재주입 후 1일, 3일, 5일 및 7일에 마우스를 취하여 종양 침윤 세포를 분석하였다. 각 그룹당 3마리의 마우스를 희생시켜, 종양을 벗겨낸 후, 종양의 무게를 측정하였다. 종양의 절반을 절제하고 면역조직화학적 염색을 위해 4% PFA에 고정시켰다.

(5) 나머지 1/2 종양의 무게를 재고, 잘게 자르고, 갈아서 PBS로 두 번 세척한 다음 염색 용액을 60 μL/샘플로 첨가하고(염색 프로토콜은 아래 표 참조), 염색을 위해 96-웰 플레이트로 옮기고, 어둠 속에서 30분 동안 얼음 위에서 염색하였다.

마우스 종양의 T 세포 염색 프로토콜

(6) 세포를 4℃에서 5분간 1800 rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 세포를 200 μL의 PBS로 2회 세척하였다.

(7) 4% PFA 200 μL를 첨가한 후 세포를 재현탁시키고, 200-메시 필터를 통해 유동관으로 여과한 후, 4℃ 냉장고에 넣고, 24시간 이내에 기계에서 테스트하였다. 종양 조직의 단위 중량당 침윤 T 세포의 수를 개수와 종양 중량에 따라 계산하였다.

실시예 1. STAR 구조의 최적화

본 발명에서는 불변 영역의 뮤린화(murineization), 시스테인 점 돌연변이, 및 α 사슬의 불변 영역의 소수성 아미노산 돌연변이가 STAR의 기능을 향상시킨다.

불변 영역 뮤린화 변형: 인간, 영장류 및 마우스 TCRα/β 사슬의 불변 영역 서열은 기능적 보존성이 높고 주요 아미노산 서열이 동일하기 때문에 서로 교환될 수 있다. 교환 후, 한편으로는 STAR 분자의 올바른 페어링 효율성이 증가하고, 다른 한편으로는 미스매치로 인한 알려지지 않은 특이성의 가능성이 감소하여 안전성을 증가시킨다.

이황화(disulfide) 결합을 도입하기 위한 시스테인 점 돌연변이: 뮤린화된 TCR α 사슬의 불변 영역에서 위치 48의 트레오닌 T를 시스테인 C로 돌연변이시키고, 뮤린화된 TCR β 사슬의 불변 영역에서 위치 56의 세린 S를 시스테인 C로 돌연변이시켰다. 이들 2개의 새로이 추가된 시스테인은 STAR의 두 사슬 사이에 이황화 결합을 형성하고, STAR의 두 사슬과 내인성 TCR 사슬 사이의 미스매치를 줄이고, STAR 분자가 보다 안정적인 복합체를 형성하도록 돕는다.

STAR의 막관통(transmembrane) 영역에서 소수성 아미노산 치환 설계: 111번부터 119번까지 TCR α 사슬의 불변 영역의 막관통 영역에 있는 세 개의 아미노산 부위를 돌연변이시켰고, 위치 112의 세린 S는 류신 L로 돌연변이시켰고, 위치 114의 메티오닌 M은 이소류신 I로 돌연변이시켰고, 위치 115의 글리신 G는 발린 V로 돌연변이시켰다. 이 영역의 전체 아미노산 서열은 LSVMGLRIL에서 LLVIVLRIL로 돌연변이시켰다. 이러한 설계는 막관통 영역의 소수성을 증가시키고, TCR 막관통 영역에 의해 운반되는 양전하로 인한 불안정성을 감소시키며, STAR 분자가 세포막에 보다 안정적으로 존재할 수 있게 하여 더 나은 기능을 얻는다.

STAR 분자의 설계를 추가로 최적화하기 위해, 더 나은 효과를 얻기 위해 불변 영역의 뮤린화, 시스테인 점 돌연변이 및 α-사슬 불변 영역의 소수성 아미노산 돌연변이에 기초하여 STAR 분자의 불변 영역의 N-말단의 특이적 재배열을 수행하였다. 재배열이란 서열의 일부를 결실시킴과 동시에 서열의 일부에 인간화 돌연변이를 수행하는 것을 의미한다. 인간화 돌연변이의 중요성은 STAR 분자의 기능을 보장하면서 STAR 분자의 비인간 서열을 최대한 줄여 임상 적용에서 수용체에 의해 STAR-T 세포가 거부될 가능성을 최대한 방지하는 것이다.

이를 위해, TCR α 사슬 불변 영역의 N-말단에 있는 18개 아미노산을 추가로 변형시켰으며, 여기에는 위치 6의 아미노산, 예컨대 E를 D로 교체하고, 위치 13의 K를 R로 교체하고, 위치 15-18의 아미노산을 결실시키는 것이 포함되었다. 수득한 α 사슬의 불변 영역을 TRAC (Nrec-Cys-TM)로 명명하였다. TCR β 사슬 불변 영역의 N-말단에 있는 25개 아미노산을 추가로 변형시켰으며, 여기에는 위치 3의 아미노산, 예컨대 R을 K로 교체하고, 위치 6의 아미노산, 예컨대 T를 F로 교체하고, 위치 9의 K를 E로 교체되고, 위치 11의 아미노산 S를 A로 교체하고, 위치 12의 L을 V로 교체하고, 위치 17 및 21-25의 아미노산을 결실시키는 것이 포함되었으며, 생성된 β-사슬 불변 영역을 TRBC (Nrec-Cys-TM)로 명명하였다.

또한, OX40의 세포질 영역과 같은 공동-자극 분자는 α-사슬 불변 영역의 C-말단 및/또는 β-사슬 불변 영역의 C-말단에 연결되어 STAR의 기능을 더욱 향상시킬 수 있다. 공동-자극 분자는 링커, 예를 들어 (G4S)₃ 링커를 통해 α-사슬 불변 영역의 C-말단 및/또는 β-사슬 불변 영역의 C-말단에 연결될 수 있다. 위에서 언급한 변형 외에도, 공동-자극 분자에 연결된 불변 영역은 야생형 불변 영역에 비해 천연 엔도도메인을 결여할 수도 있으며, 이는 STAR의 기능을 추가로 향상시킨다. 예를 들어, 아미노산 136-137은 α 사슬 불변 영역으로부터 결실될 수 있으며; 및/또는 아미노산 167-172는 β 사슬 불변 영역으로부터 결실될 수 있다.

실시예 2. CXCR2를 공동-발현하는 GPC3 - 표적화 CAR-T 세포와 CXCR2를 공동-발현하는 GPC3 - 표적화 STAR-T 세포의 시험관 내 표적 사멸 능력 및 사이토카인 분비 능력의 비교

GPC3-표적화 CAR은 GPC3에 대한 항체 GC33의 scFv를 사용하여 구축하였다. CAR은 CD8a 힌지 영역, CD8 막관통 영역, 41-BB 공동-자극 도메인 및 CD3 신호전달 도메인을 포함한다.

GPC3을 표적으로 하는 STAR는 항체 GC33의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여 실시예 1의 최적화된 불변 영역을 기반으로 구축하였다(도 2 A 및 C의 불변 영역: Nrec-Cys-TM; 도 2 B 및 D의 불변 영역: Cys-TM).

수득한 CAR 및 STAR 구조물을 T 세포에서 CXCR2와 함께 공동-발현시켜 상응하는 GPC3 CAR-CXCR2 T 세포 및 GPC3 STAR-CXCR2 T 세포를 획득하였다.

그런 다음, 수득한 T 세포의 표적 사멸 효과를 다양한 정도의 GPC3를 발현하는 간암 세포주(GPC3 발현이 낮은 SK-Hep-1, GPC3 발현이 중간인 Huh-7, 및 GPC3 발현이 높은 HepG2)를 사용하여 테스트하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. CXCR2를 발현하는 경우, GPC3 STAR가 표적 세포 사멸 능력과 IFNγ 분비능력이 더 높았고, OX40 공동-자극 도메인을 갖는 GPC3 STAR의 효과가 가장 좋았다.

실시예 3. CXCR2를 공동-발현하는 GPC3 - 표적화 CAR-T 세포와 CXCR2를 공동-발현하는 GPC3 - 표적화 STAR-T 세포(최적화된 Nrec - Cys - TM 불변 영역 구조를 가짐)의 생체 내 종양 침윤 및 종양 억제 능력의 비교

HuH7-Luc/GFP 세포를 마우스에 접종하여 종양 모델을 확립하고, 다양한 치료용 T 세포의 생체 내 종양 침윤 및 종양 억제 능력을 테스트하였다. 실험 결과를 도 3에 나타내었으며, CXCR2 공동-발현은 치료용 CAR-T 세포의 종양 내로의 침투를 유의적으로 향상시킬 수 있다. 도 4에 나타난 바와 같이, CXCR2를 발현하는 경우, GPC3-STAR가 더 높은 종양 억제 능력을 보였으며, OX40 공동자극 도메인을 갖는 GPC3-STAR(최적화된 Nrec-Cys-TM 불변 영역 구조를 가짐)가 가장 좋은 효과를 나타내었다. 본 실험에 기술된 STAR는 TRAC (Nrec-Cys-TM) 및 TRBC (Nrec-Cys-TM)로부터 유래되었다.

실시예 4. CXCR2를 공동-발현하는 GPC3 - 표적화 STAR-T 세포( Cys - TM 불변 영역의 최적화된 구조 및 공동-자극 도메인이 α-사슬에만 추가됨)의 생체 내 및 시험관 내 효능 분석

이 실시예에서는, Cys-TM 불변 영역의 최적화된 구조를 기반으로 하고 α 사슬에만 OX40 공동-자극 도메인이 추가된(OX40을 엔도도메인이 결실된 α 사슬의 Cys-TM 불변 영역에 추가하였음) CXCR2를 공동-발현하는 STAR-T 세포의 시험관 내 및 생체 내 효능을 분석하였다.

1. CXCR2를 공동-발현하지 않는 상응하는 GPC3 STAR-aOX40-T와 비교하여 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)는 더 나은 시험관 내 기능 및 이동 능력을 나타내었다.

GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)의 구축 전략을 도 5A에 나타내었다. STAR는 TRAC (Cys-TM) 및 TRBC (Cys-TM)으로부터 유래되었다.

먼저, GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM) 세포에서 CXCR2의 발현 수준을 유세포 분석법으로 검출하였다. 결과를 도 5B에 나타내엇다. 바이러스에 감염된 T 세포에서, mTCRβ 항체 염색은 세포막 상에서 STAR 수용체를 검출하였고, CXCR2-APC 항체는 CXCR2 수용체의 발현을 검출하여, GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)가 GPC3-STAR 및 CXCR2의 우수한 공동-발현 수준을 가지는 것을 확인시켜주었다.

이어서, GPC3-CAR-T, GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM) 및 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM) 세포를 각각 Huh-7 세포와 (1:5) 효과-대-표적 비율로 공동-배양하였다. 표적 세포에 대한 3가지 T 세포의 사멸 수준을 24시간 후에 검출하였다. 결과를 도 5C에 나타내었다. 결과는 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)가 GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM) 및 GPC3 CAR-T보다 더 높은 사멸 활성을 가짐을 보여주었다.

그런 다음 GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM) 및 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM) 세포 화학주성(chemotactic) 이동을 Transwell에 의해 검출하였다. 1E5 GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM) 및 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)을 함유한 완전 배지 200 μL를 Tranwell의 상부 챔버에 첨가하였고, 표시된 구배 농도의 CXCR2 리간드 케모카인이 첨가된 하부 챔버에 600 μL의 배지를 첨가하였으며; 또 다른 하부 층을 간암 종양 세포주 Huh-7의 배양 상층액 그룹으로 설정하고, 배양 배지 단독을 대조군으로 사용하였다.

지정된 시간 동안 인큐베이션한 후, 하부 층의 배양 배지를 수집하여 유세포분석기에서 하부 층으로 이동하는 세포 수를 검출하고, 이동하는 세포의 비율을 계산하였다. 결과를 도 6에 나타내었다. GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)의 이동 능력은 케모카인의 농도 및 시간과 양의 상관관계가 있었고; GPC3-STAR-aOX40-T (Cys-TM)는 기본적으로 낮은 이동 능력을 유지하였다.

2. GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM)와 비교하여 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)는 생체 내에서 종양 방향(directional) 이동 능력이 향상되었다.

실험 프로토콜을 도 7A에 나타내었다. NSG 마우스에 HuH-7 종양 세포를 피하 접종하고, 종양 형성 후 6일째에 Mock T, GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM) 및 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM) 세포를 꼬리 정맥을 통해 재주입하였다. 이후, 종양 형성 후 9일째 및 14일째에 각각 종양 조직을 채취하여 종양 침윤 T 세포의 수와 비율을 검출하였다.

도 7B는 Mock T, GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM) 및 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM) 세포 재주입 그룹의 종양 조직 중량의 비교를 보여준다. T 세포 재주입 후 3일째 및 8일째에 종양이 있는 마우스를 안락사시키고 종양 조직을 꺼내 무게를 측정한 후 기록하였다. 결과는 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)가 효과적으로 종양을 제거할 수 있으며, GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM)와 비교하여 종양 사멸 속도가 더 빠르다는 것을 보여준다.

도 7C는 종양 조직에 침투한 T 세포의 비교를 보여준다. 칭량된 종양 조직을 단일 세포 현탁액으로 분쇄하고, 항체 염색 후 유세포 분석기에서 종양 조직 내 T 세포의 수를 검출하였다. 도 7D는 유세포 분석(왼쪽 패널) 및 정량적 통계 분석(오른쪽 패널)에 의해 검출된 종양 조직에서 침윤 CD3+ T 세포의 비율을 보여준다. 결과는 T 세포 재주입 3일 후, GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM) 세포가 종양 침윤의 수와 비율이 더 높았음을 보여주었다.

3. GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)의 항종양 활성은 GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM)보다 강력하다.

이 실험에서, 종양 성장은 루시페린 기질을 이용한 촉매 발광에 의해 검출하였다. 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 HuH-7 세포주를 NSG 마우스에 피하 주사하였고, 종양 형성 7일 후, Mock T, GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM) 및 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)을 꼬리 정맥을 통해 재주입한 후, 루시페린 기질 촉매 발광에 의해 종양 성장을 주기적으로 검출하였다. 형광 값에 의해 반영된 종양 크기의 통계를 도 8의 오른쪽 패널에 나타내었다. 결과는 더 낮은 재주입 용량에서 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM) 세포를 재주입한 마우스가 기본적으로 종양 없는 상태를 달성할 수 있음을 보여주었다. GPC3 STAR-aOX40-T (Cys-TM)와 비교하여 GPC3 STAR-aOX40-CXCR2-T (Cys-TM)는 더 빠르고 강력한 종양 사멸 효능을 나타내었다.

서열 목록:

서열번호 1 인간 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역

DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

서열번호 2 마우스 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역

DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

서열번호 3 시스테인 치환 및 소수성 영역의 변형을 포함하는 마우스 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC-Cys-TM)

DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

서열번호 4 N-말단 변형, 시스테인 치환 및 막관통 소수성 영역의 변형을 포함하는 마우스 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC-Nrec-Cys-TM)

DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

서열번호 5 인간 T 세포 수용체 베타 사슬 불변 영역

DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF

서열번호 6 마우스 T 세포 수용체 베타 사슬 불변 영역

DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

서열번호 7 시스테인 치환을 포함하는 마우스 T 세포 수용체 베타 사슬 불변 영역(TRBC-Cys-TM)

DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

서열번호 8 N-말단 변형 및 시스테인 치환을 포함하는 마우스 T 세포 수용체 베타 사슬 불변 영역(TRBC-Nrecc-Cys-TM)

DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

서열번호 9 항-GPC3 GC33 VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS

서열번호 10 항-GPC3 GC33 VL

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR

서열번호 11 OX40 엔도도메인

RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

서열번호 12 CXCR2 아미노산 서열

MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL

서열번호 13 GPC3 STAR-CXCR2(TRAC-Cys-TM) α 사슬

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

서열번호 14 GPC3 STAR-CXCR2(TRBC-Cys-TM) β 사슬

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKREDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

서열번호 15 GPC3 STAR-OX40-CXCR2(TRAC-Cys-TM) α 사슬

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

서열번호 16 GPC3 STAR-OX40-CXCR2(TCRbC-Cys-TM) β 사슬

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKREDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

서열번호 17 GPC3 STAR-CXCR2(TRAC-Nrec-Cys-TM) α 사슬

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

서열번호 18 GPC3 STAR-CXCR2(TRBC-Nrec-Cys-TM) β 사슬

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRDLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

서열번호 19 GPC3 STAR-OX40-CXCR2(TRAC-Nrec-Cys-TM) α 사슬

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSDIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

서열번호 20 GPC3 STAR-OX40-CXCR2(TRBC-Nrec-Cys-TM) β 사슬

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRDLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

서열번호 21 GPC3 CAR-CXCR2

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSSRSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

서열번호 22 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열

GYTFTDYE

서열번호 23 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열

LDPKTGDT

서열번호 24 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열

TR

서열번호 25 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열

QSLVHSNRNTY

서열번호 26 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열

KVS

서열번호 27 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열

SQNTHVP

서열번호 28 엔도도메인이 결실된 마우스 T 세포 수용체 α 사슬 불변 영역

DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLW

서열번호 29 시스테인 치환 및 소수성 변형을 갖는 엔도도메인이 결실된 마우스 T 세포 수용체 α 사슬 불변 영역

DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW

서열번호 30 N-말단 변형, 시스테인 치환 및 막관통 소수성 영역의 변형을 갖는 엔도도메인이 결실된 마우스 T 세포 수용체 α 사슬 불변 영역

DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW

서열번호 31 엔도도메인이 결실된 마우스 T 세포 수용체 β 사슬 불변 영역

DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM

서열번호 32 시스테인 치환을 갖는 엔도도메인이 결실된 마우스 T 세포 수용체 β 사슬 불변 영역

DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM

서열번호 33 N-말단 변형 및 시스테인 치환을 갖는 엔도도메인이 결실된 마우스 T 세포 수용체 β 사슬 불변 영역

DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM

서열번호 34 (G4S)₃ 링커

GGGGSGGGGSGGGGS

Sequence listing <110> CHINA IMMUNOTECH (BEIJING) BIOTECHNOLOGY CO., LTD. <120> T cell co-expressing CXCR2 and a STAR against GPC3 and uses thereof <130> P2022TC1979 <150> 202110214637.0 <151> 2021-02-25 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 1 5 10 15 Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr 20 25 30 Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 35 40 45 Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 50 55 60 Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 65 70 75 80 Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp 85 90 95 Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe 100 105 110 Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala 115 120 125 Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 2 <211> 137 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile 20 25 30 Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr 35 40 45 Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala 50 55 60 Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr 65 70 75 80 Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr 85 90 95 Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser 100 105 110 Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu 115 120 125 Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 <210> 3 <211> 137 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mouse T cell receptor alpha chain constant region containing cysteine substitution and modification of hydrophobic region (TRAC-Cys-TM) <400> 3 Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile 20 25 30 Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys 35 40 45 Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala 50 55 60 Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr 65 70 75 80 Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr 85 90 95 Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu 100 105 110 Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu 115 120 125 Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mouse T cell receptor alpha chain constant region containing N-terminal modification, cysteine substitution and modification of transmembrane hydrophobic region (TRAC-Nrec-Cys-TM) <400> 4 Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Asp Ser 1 5 10 15 Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys 20 25 30 Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met 35 40 45 Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln 50 55 60 Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe 85 90 95 Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu 100 105 110 Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu 115 120 125 Arg Leu Trp Ser Ser 130 <210> 5 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu 50 55 60 Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg 65 70 75 80 Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln 85 90 95 Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg 100 105 110 Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala 115 120 125 Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala 130 135 140 Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val 145 150 155 160 Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe 165 170 175 <210> 6 <211> 172 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu 50 55 60 Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His 85 90 95 Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val 100 105 110 Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile 115 120 125 Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr 130 135 140 Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 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Val Ser Thr 145 150 155 160 Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser 165 170 <210> 8 <211> 166 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mouse T cell receptor beta chain constant region containing N-terminal modification, and cysteine substitution (TRBC-Nrecc-Cys-TM) <400> 8 Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Ala Glu Ile Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp 20 25 30 His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly 35 40 45 Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys 50 55 60 Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg 65 70 75 80 Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp 85 90 95 Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala 100 105 110 Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln 115 120 125 Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 130 135 140 Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr 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<210> 19 <211> 298 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GPC3 STAR-OX40-CXCR2 (TRAC- Nrec-Cys-TM) alpha chain <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg 115 120 125 Asp Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn 130 135 140 Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys Val 145 150 155 160 Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp 165 170 175 Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn 180 185 190 Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu 195 200 205 Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val 210 215 220 Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu 225 230 235 240 Met Thr Leu Arg Leu Trp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His 260 265 270 Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln 275 280 285 Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 290 295 <210> 20 <211> 325 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GPC3 STAR-OX40-CXCR2(TRBC- Nrec-Cys-TM) beta chain <400> 20 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125 Ser Ala Glu Ile Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro 130 135 140 Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser 145 150 155 160 Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr 165 170 175 Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro 180 185 190 Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu 195 200 205 Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser 210 215 220 Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr 225 230 235 240 Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly 245 250 255 Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala 260 265 270 Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 290 295 300 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 305 310 315 320 Thr Leu Ala Lys Ile 325 <210> 21 <211> 477 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GPC3 CAR-CXCR2 <400> 21 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Ser Arg Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys 245 250 255 Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 260 265 270 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 275 280 285 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 290 295 300 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 305 310 315 320 Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 325 330 335 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 340 345 350 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys 355 360 365 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 370 375 380 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 385 390 395 400 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 405 410 415 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 420 425 430 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 435 440 445 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 450 455 460 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 475 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region CDR1 amino acid sequence <400> 22 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region CDR2 amino acid sequence <400> 23 Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr 1 5 <210> 24 <211> 2 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region CDR3 amino acid sequence <400> 24 Thr Arg 1 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region CDR1 amino acid sequence <400> 25 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 3 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region CDR2 amino acid sequence <400> 26 Lys Val Ser 1 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region CDR3 amino acid sequence <400> 27 Ser Gln Asn Thr His Val Pro 1 5 <210> 28 <211> 135 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Endodomain-deleted mouse T cell receptor alpha chain constant region <400> 28 Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile 20 25 30 Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr 35 40 45 Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala 50 55 60 Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr 65 70 75 80 Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr 85 90 95 Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser 100 105 110 Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu 115 120 125 Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 130 135 <210> 29 <211> 135 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Endodomain-deleted mouse T cell receptor alpha chain constant region with cysteine substitution and hydrophobic modification <400> 29 Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile 20 25 30 Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys 35 40 45 Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala 50 55 60 Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr 65 70 75 80 Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr 85 90 95 Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu 100 105 110 Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu 115 120 125 Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 130 135 <210> 30 <211> 131 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Endodomain-deleted mouse T cell receptor alpha chain constant region with N-terminal modification, cysteine substitution and modification of transmembrane hydrophobic region <400> 30 Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Asp Ser 1 5 10 15 Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys 20 25 30 Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met 35 40 45 Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln 50 55 60 Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe 85 90 95 Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu 100 105 110 Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu 115 120 125 Arg Leu Trp 130 <210> 31 <211> 166 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Endodomain-deleted mouse T cell receptor beta chain constant region <400> 31 Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu 50 55 60 Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His 85 90 95 Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val 100 105 110 Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile 115 120 125 Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr 130 135 140 Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr 145 150 155 160 Leu Val Val Met Ala Met 165 <210> 32 <211> 166 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Endodomain-deleted mouse T cell receptor beta chain constant region with cysteine substitution <400> 32 Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu 50 55 60 Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His 85 90 95 Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val 100 105 110 Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile 115 120 125 Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr 130 135 140 Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr 145 150 155 160 Leu Val Val Met Ala Met 165 <210> 33 <211> 160 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Endodomain-deleted mouse T cell receptor beta chain constant region with N-terminal modification and cysteine substitution <400> 33 Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Ala Glu Ile Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp 20 25 30 His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly 35 40 45 Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys 50 55 60 Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg 65 70 75 80 Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp 85 90 95 Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala 100 105 110 Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln 115 120 125 Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 130 135 140 Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met 145 150 155 160 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> (G4S)3 linker <400> 34 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims

CXCR2와 GPC3에 대한 합성 T 세포 수용체 및 항원 수용체(Synthetic T cell Receptor and Antigen Receptor, STAR)를 공동-발현하는 단리된 치료용 T 세포로서, GPC3에 대한 STAR는 GPC3에 대한 항원 결합 영역을 포함하고, GPC3에 대한 STAR는 제1 불변 영역을 포함하는 α 사슬 및 제2 불변 영역을 포함하는 β 사슬을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항에 있어서,
i) α 사슬은 GPC3에 대한 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 제2 불변 영역을 포함하거나; 또는
ii) α 사슬은 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 GPC3에 대한 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하고;
iii) α 사슬은 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, β 사슬은 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 불변 영역이 천연 TCR α 사슬 불변 영역, 예를 들어 천연 인간 TCR α 사슬 불변 영역 또는 천연 마우스 TCR α 사슬 불변 영역인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 불변 영역이 변형된 TCR α 사슬 불변 영역인, 단리된 치료용 T 세포.
제4항에 있어서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제4항 또는 제5항에 있어서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 E와 같은 위치 6의 아미노산은 D로 치환되고, 위치 13의 아미노산 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 E와 같은 위치 6의 아미노산은 D로 치환되고, 위치 13의 아미노산 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실되고, 트레오닌 T와 같은 위치 48의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신산 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 불변 영역의 엔도도메인(endodomain)이 결여되어 있으며, 예를 들어 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제4항에 있어서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이 서열번호 3-4 및 28-30 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 불변 영역이 천연 TCR β 사슬 불변 영역, 예를 들어 천연 인간 TCR β 사슬 불변 영역 또는 천연 마우스 TCR β 사슬 불변 영역인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 불변 영역이 변형된 TCR β 사슬 불변 영역인, 단리된 치료용 T 세포.
제13항에 있어서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산이 시스테인 C로 돌연변이된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬과 비교하여 R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환되고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되고, 위치 9의 아미노산 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 위치 17 및 21-25의 아미노산은 결실된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환되고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되고, 위치 9의 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 아미노산 17, 21-25는 결실된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이 마우스 TCR 베타 사슬 불변 영역으로부터 유래되고, 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있으며, 예를 들어, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 167-172의 아미노산이 결실된 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제13항에 있어서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이 서열번호 7-8 및 31-33 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
i) GPC3에 대한 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 상기 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 예를 들어 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 링커에 의해 연결되고;
ii) 제1 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 상기 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고; 또는
iii) 제1 항원 결합 영역은 표적 항원 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 상기 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제19항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 22에 제시된 VH CDR1, 서열번호 23에 제시된 VH CDR2, 및 서열번호 24에 제시된 VH CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 25에 제시된 VL CDR1, 서열번호 26에 제시된 VL CDR2, 및 서열번호 27에 제시된 VL CDR3을 포함하거나, 또는
중쇄 가변 영역은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, α 사슬 및/또는 β 사슬이 C-말단에 연결된 적어도 하나의 외인성 세포내 기능성 도메인을 갖는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제21항에 있어서, 외인성 세포내 기능성 도메인이 α 사슬 및/또는 β 사슬의 불변 영역의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결되고,
바람직하게는, 외인성 세포내 기능성 도메인이 엔도도메인이 결실된 α-사슬 및/또는 β-사슬의 불변 영역의 C-말단에 링커를 통해 연결되고,
바람직하게는, 링커는 (G4S)n 링커이고, 여기서 n은 1-10의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 3인, 단리된 치료용 T 세포.
제22항에 있어서, 외인성 세포내 기능성 도메인이 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)의 엔도도메인, 바람직하게는 OX40의 엔도도메인이고, 예를 들어 OX40의 엔도도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, α 사슬이 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, 여기서 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역은 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제1 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영과와 비교하여 위치 48의 아미노산, 예를 들어 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이되고; 임의로 α 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, α 사슬이 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, 여기서 GPC3에 대한 제1 항원 결합 영역은 서열번호 9에 제시된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제1 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR α 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영과와 비교하여 E와 같은 위치 6의 아미노산은 D로 치환되고, 위치 13의 K는 R로 치환되고, 위치 15-18의 아미노산은 결실되고, 위치 48의 아미노산, 예를 들어 트레오닌 T는 시스테인 C로 돌연변이되고, 세린 S와 같은 위치 112의 아미노산은 류신 L로 돌연변이되고, 메티오닌 M과 같은 위치 114의 아미노산은 이소류신 I로 돌연변이되고, 글리신 G와 같은 위치 115의 아미노산은 발린 V로 돌연변이되고; 임의로, α 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제24항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있으며, 예를 들어 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 136-137의 아미노산이 결실되어 있는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, α 사슬이 서열번호 13, 15, 17 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, β 사슬이 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역은 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고; 임의로, β 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, β 사슬이 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하며, 여기서 GPC3에 대한 제2 항원 결합 영역은 서열번호 10에 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이고, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 세린 S와 같은 위치 56의 아미노산은 시스테인 C로 돌연변이되고, R과 같은 위치 3의 아미노산은 K로 치환되고, T와 같은 위치 6의 아미노산은 F로 치환되고, 위치 9의 K는 E로 치환되고, 위치 11의 S는 A로 치환되고, 위치 12의 L은 V로 치환되고, 위치 17 및 21-25의 아미노산은 결실되고; 임의로, β 사슬은 불변 영역의 C-말단에 연결된 OX40의 엔도도메인을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제28항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 불변 영역의 엔도도메인이 결여되어 있으며, 예를 들어 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여 위치 167-172의 아미노산이 결실되어 있는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, β 사슬이 서열번호 14, 16, 18 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항에 있어서, STAR는 서열번호 13에 제시된 α 사슬 및 서열번호 14에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 15에 제시된 α 사슬 및 서열번호 16에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 17에 제시된 α 사슬 및 서열번호 18에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 19에 제시된 α 사슬 및 서열번호 20에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 15에 제시된 α 사슬 및 서열번호 14에 제시된 β 사슬을 포함하거나; 또는 STAR는 서열번호 19에 제시된 α 사슬 및 서열번호 18에 제시된 β 사슬을 포함하는 것인, 단리된 치료용 T 세포.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 치료용 T 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
대상체에서 암과 같은 질병을 치료하기 위한 의약품의 제조에 있어서 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 치료용 T 세포 또는 제33항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
제34항에 있어서, 질병이 GPC3-관련 질병, 예컨대 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)과 같은 간암, 폐 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma, SqCC)과 같은 폐암, 위암, 난소암, 흑색종 또는 소아 배아 종양인, 용도.