JPS63501567A

JPS63501567A - 生長因子

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Publication number: JPS63501567A
Application number: JP61504662A
Authority: JP
Inventors: バラード　フランシス　ジョン; ウォリス　ジョン　キャンベル; フランシス　ジョフレイ　レオナード; バッグリィ　クリストファー　ジェームス
Original assignee: グロペップ　プロプライエタリー　リミテッド
Priority date: 1985-08-22
Filing date: 1986-08-21
Publication date: 1988-06-16
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: CA1341207C; EP0235205B1; JPH0720993B2; US5077276A; WO1987001038A1; EP0235205A4; AU6286986A; AU598205B2; ATE81779T1; EP0235205A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２、　ウシまたはヒトインシュリン様生長因子−１の類縁体である請求の範囲第１項に記載のペプチド類縁体。

３、　配列ｐｒｏ−ａ、ｐｕ−ｔｈｒ−ｖｅｕ−ｃｙｓ−ｏ、ｅｙ−ａｉａ−ｏｌｕ−、ｃｅｕ−ｖａｉ−ａＳｐ−ａｈａ−ｊ！ｅＬＪ−Ｑｌｎ−ｐｈｅ−Ｖａｊ！−ＣＶＳ−ＱｉＶ−ａｓｐ−ａｒＱ　−Ｑｉ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−ｊ！ｙｓ−ｐｒｏ−ｔｈｒ−Ｑバー。

Ｇｊ！ｕ−ｔｈｒ−１ｅｕ−ｃｙｓ−Ｑｊ！ｙ−ａｊ！ａ−Ｑｌｕ−ｊ！ｅｕ− ｖａｊ！　−ａＳｐ−ａｌａ−０１Ｊ−ｑｌｎ−ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＣＶＳ−ＱＪｔＶ−ａｓｐ−ａｒＱ　−Ｑｌｙ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−Ｄｉｌｅ−ａｓｎ−１ｙＳ −ｐｒＯ−ｔｈｒ−ＱＪｔＶ−。

Ｔｈｒ−ｊ！ｅｕ−ｃｙｓ−ｏｌｙ−ａｊ！ａ−Ｑｊ！ｕｌｅｕ−ｖａｊ！−ａＳｐ−ａｉａ−１ｅＵ−Ｑｊ！ｎ−ｐｈｅ−Ｖａｌ−ｃｙＳ−Ｑｉｙ−ａＳｐ− ａｒＱ−ＧＪＹ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−ｚｙｓ−ｐｒｏ−ｔｈｒ− ０１’ｙｆ−。

Ｌｅｕ−ＣＶＳ−Ｑｊ！　ｙ−ａｊ！　ａ−Ｑｊ！　ＬＪ−１ｅＵ−Ｖａｌ−ａｓｐ−ａｌａ−４ｅｕ−ｇｊ！ｎ−ｐｈｅ−ｖａＪ−ｃｙＳ”−ｏｊ！ｙ−ａＳｐ−ａｒｐ　−ＱＪｔＶ−ｐｈｅ−ｔＶｒ−Ｄｈｅ−ａＳｎ−ｊ！ｙｓ−ｐｒｏ −ｔｈｒ−ＱＩＶ−。

またはＣｙＳ−ｇｆＶ−ａｊ！ａ−Ｑｆｕ−ｖｅＵ−Ｖａｌ−ａｓｐ−ａＪａ−ｊ！ｅｕ−ＯＡｎ−ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＣＶＳ−Ｑｌｙ−ａｓｐ−ａｒＱ−ＱＩＶ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−ｊ！ｙｓ−ｐｒｏ−ｔｈｒ−ｏｊ！ｙ−載のペプチド類縁体。

４、　生物学的に純粋な形態である請求の範囲第３項に記載のペプチド類縁体。

５、　＠哺乳類動物のインシュリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのペプチド類縁体の有効量および０医薬用または獣医薬用として許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する哺乳類動物における蛋白質蓄積不全または蛋白質喪失の処置のための医薬用または獣医薬用組成物。

６、　ペプチド類縁体を約０．０２〜２．０００■含有する請求の範囲第５項に記載の組成物。

７、　哺乳類動物のインシュリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのペプチド類縁体の有効量を、処置すべき対象に投与する、哺乳類動物における蛋白質蓄積不全の処置力′法。

８、　蛋白質蓄積不全は、癌、嚢胞性線維症、デュシエン型筋ジストロフィー、ベラカー型ジストロフィー、常染色体性劣性ジストロフィー、多発性筋炎ならびに他の筋疾患に伴って生じるものである請求の範囲第７項に記載の方法。

９６　ペプチド類縁体は約１〜ｉ　ｏｏｏμｇ／υ体重７日の用徂比で投与する請求の範囲第７項に記載の方法。

１０、＠乳類動物のインシュリン様生長因子−１のＮ末端から１−５＠のアミノ酸残塁を欠失させたそのペプチド類縁体の有効（６）を、処置すべき対象に投与する、噛乳類動物における蛋白質喪失の処置方法。

１１．　蛋白質喪失は、火傷、骨格筋外傷または感染に関連したものである請求の範囲第１０項に記載の方法。

１２、ペプチド類縁体は約１〜１０００μｇ／附体重７日の用量比で投与する請求の範囲第１０項に記載の方法。

１３、　１ｉ）（２）ウシ初乳または血清から選ばれるウシの製品と（ハ）酸を準備し、（１１）ウシの製品を蛋白質の抽出を行うのに十分な酸で処理し、（面蛋白質抽出物を少なくとも１回のクロマトグラフィー溶媒溶出工程に付してｂｌＧＦ−１のデストリペプチド類縁体を単離する、デストリペプチドウシインシュリン様生長因子−１（ｂｌＧＦ−１＞であるペプチド類縁体の製造方法。

１４、Ｂは酢酸であり、溶媒はアセトニトリルである請求の範囲第１３項に記載の方法。

１５、＠乳類動物のインシュリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのペプチド類縁体を製造するにあたり、（ｉ）Ｍ−１ｅｕ −ｃｙｓ−Ｑｌｙ−ａｌａ−（Ｊｊｕ−ｊｅｕ−Ｖａｉ−ａｓｐ−ａｚａ−ｚｅｕ−ｏｉｎ−ｐｈｅ−ｖａｉ−ｃｙｓ−ＯＪＶ−ａｓｌ）−ａｒｏ−ＯｊＶ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｔｈｒ−ＱＩＶ−（式中ＭはＧｊ！ｙ−ｐｒｏ−Ｑｊｕ−ｔｈｒまたはＴｈｒ−である）で示されるＮ末端構造を有するペプチド類縁体を準備し、ついで（ｉｉｌそのペプチド類縁体を１または２以上のアミノ酸切断工程に付す方法。

１６、例１または２にとくに記載したと実質的に同一記載の方法。

明　細　書生長因子本発明は、生長因子、関連化合物およびそれらの使用に関する。

インスリン様生長因子−１、ソマトメジンは、広範囲の培養哺乳類細胞の生長を刺激する小さな蛋白質である。

ヒトＩＧＦ−１（ｈｌＧＦ−１）は、ヒト血清から均一に精製され、その全アミノ酸配列が確立されている。生長ホルモン活性の血清メディエータ−、ソマトメジンＣがｈＩＧＦ−１と同二の配列を有することか明らかにされ、したがってこれらの２者は現在では同義語となっている。ｈｌＧＦ−１の確立された配列は、Ｎ末端グリシンに始まり、次のとおりである。

ａｔｔｙ−ｐｒｏ−ｇＪ！ｕ−ｔｈｒ−Ｊ！ｅｕ−ｃｙｓ−ｇｉｙ−ａｚａ−ｇｌｕ−１ｅｕ　−Ｖａｆ−ａＳＤ−ａＪａ−Ｊｅｕ−ｏｊ！ｎ−Ｄｈｅ−Ｖａｆ −ｃｙＳ−Ｑｊｙ−ａｓｐ−ａｒＱ−ＱＩＶ−ｐｈｅ−ｔａｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ −ＩＶＳ−ＤｒＯ−ｔｈｒ−０１￥−ｔｙｒ−Ｑｌｙ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ −ａｒＱ−ａｒｏ−ａＪ！ａ−ｐｒｏ−Ｑｌｎ−ｔｈｒ−ｇｊｙ−ｉ　ｔｅ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｏｊ！ｕ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｐｈｅ−ａｒａ　−ｓｅｒ−ｃｙｓ −ａｓｐ−１ｅｕ−ａｒｇ−ａｒｇ−Ｊ！ｅｕ−０１ｕ−ｍｅｔ−ｔｙｒ−ＣＶＳ−ａｌａ−ＤｒＯ−Ｊｅｕ−１／５−ＤｒＯ−８１ａ−ｊ！￥Ｓ−８ｅｒ−ａＪ！ａ−血清中のＩＧＦ−ルベルは青年期男性の生長速度と正の相関を示し、生長遅延者においては生長ホルモンの欠乏の程度と負の相関を示す。また、生長ホルモン遺伝子をトランスフェクションしたマウスの生長速度と最終的なサイズの両者と相関する。ＩＧＦ−１１１１度が生長速度と間接的に連動するという所見、またＩＧＦ−１を投与すると、下垂体機能低下（生長ホルモン欠乏）ラットおよびマウスでは生長速度が回復し、正常マウスでは生長速度が増大するというさらに直接的な証拠で支持される上述の所見から、ＩＧＦ−１は、（１）ヒトにおける生長ホルモン欠乏の治療、（り畜産動物の生長速度の増大と詞料変換率の上昇、に利用して有用であろうと考えられてきた。また、生長ホルモンまたは同化ステロイドの研究から主として類推して、ＩＧＦ−１の投与は、（３）ヒトの重症異化状態、たとえば火傷、感染もしくは他の外傷後における生体蛋白質の喪失抑制、（４）生体内の筋肉含量の増加と脂肪含量の低下による組織分布の変動、・をもたらす可能性が示唆されいる。

このような推論の結果として、動物の生長試験および臨床試験に使用するＩＧＦ −１の市販品の要求が生じてきた。しかしながら、ヒト血清蛋白質１トンを精製しても、たとえばｈＩＧＦ−１はわずかミリグラム単位管られるにすぎない。

したがって、本発明の目的は、この先行技術に関連した難点の１つまたは２つ以上を克服または少なくとも緩和することにある。

すなわち、本発明の第一の態様は、哺乳類インシュリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残塁が欠失したペプチド類縁体を、好ましくは生物学的に純粋な形態で提供することにある。

このペプチドは、ウシまたはヒトインシュリン様生長因子−１類縁体であることが好ましい。

さらに好ましくは、このペプチド類縁体は以下の配列ｐｒｏ−ａｊ！ｕ−ｔｈｒ −，ｅｅｕ−ｃｙｓ−ｏｊ！ｙ−ａｉａ−ａｚｕ−、ｅｅｕ　−Ｖａｌ−ａｓｐ −ａｌ　ａ−ｊ！　ｅｕ−Ｑｌ　ｎ−ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃ；ｙＳ−Ｑｊ！　Ｖ　 −ｏ、１！ｕ−ｔｈｒ−１ｅｕ−ｃｙｓ−ｏｔｙ−ａｐａ−ｏｉｕ−１ｅｕ　− ｖａｊ！−ａｓｐ−ａｊ！ａ−ｊ！ｅｕ−０１ｎ−ｐｈｅ−ｖａｌ−ｃｙｓ−ｇハ←ａＳｐ−ａｒａ−ｃｌ！ｙ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−１／５−ｐｒｏ　−ｔｈｒ−ＱＪＩＶ−。

ｔｈｒ−１ｅｕ−ｃｙｓ−ｇハｒ−ａｚａ−ｑｊ！ｕ−ｊ！ｅｕ−Ｖａｊ！−ａｓｐ−ａｌａ−ｊ！ｅＬＩ−Ｑｊ！ｎ−ｐｈｅ−Ｖａｊ！−ＣＶＳ”−ＱＩＶ− ａｓｐ−ａｒＱ−ＱＪＩＶ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−４ｙｓ−ｐｒｏ　−ｔｈｒ−ｏｊ！ｙ−。

１ｅｕ−ｃｙｓ−ｇｊ！ｙ−ａＡａ−Ｃｌｊ！ｕ−Ｊｅｕ−Ｖａｊ！−ａｓｌ） −ａｊ！ａ−ｊ！ｅｕ−Ｑｊ！ｎ−ｐｈｅ−Ｖａｎ−ＣＶＳ−ＱＩＶ　−ａＳｐａｒＱ−ＱＪＩＶ　Ｄｈｅ−ｊａｒ−ｐｈｅ　ａｓｎ−１ｙｓ　ｐｒｏ　−ｔｈｒ−ｏＩＶ−、またはｃｙｓ−ａｉｙ−ａｊ！ａ−ｏｉｕ−１ｅｕ　−ＶａＪ！−ａＳｐ−ａｌａ−ｊ！ｅｕ−ＱＪ！ｎ−ｐｈｅ−ＶａＪ！−ＣＶＳ−ＱＪＩＶ−ａｓｐ−ａｒｏ−ＱＪＩＶ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−Ｊｌｙｓ−ｐｒｏ　−ｔｈｒ−Ｑｚｙから選ばれるＮ末端構造を有する。

本明細書において用いられる「生物学的に純粋な形態」の語は、生物学的活性を有するすべての不純物または夾雑物を実質的に除去した生成物を意味する。

本発明は、ＩＧＦ−１に相当するがその分子のＮ末端から１〜５個、好ましくは３個のアミノ酸残塁を欠失させた化合物が、完全な化合物に比較して、生物学的強度の上昇を示すことを発見し、完成されたものである。

たとえば、ウシＩＧＦ−１（ｂＩＧＦ−１）の式を有するがＮ末端からアミノ酸残ＷｏＪｙ、ｐｒｏおよびｇぷりが欠失した化金物、デストリペプチドｂＩＧＦ −１は、細胞系における蛋白質分解の阻害ならびに蛋白質合成およびＤＮＡ合成の両者の刺激に、完全なり１ＧＦ＝１またはｈＩＧＦ−１の必要量より４〜５０倍低濃度で有効である。

ｈＩＧＥ−１と共通のＮ末端アミノ酸配列を有するがそのＮ末端から１〜５個のアミノ酸残塁を除去したＩＧＦ−１ペプチドも、生物学的活性の上昇を生じる。

このＮ末端アミノ酸配列は、ヒト、ウシ、ラットおよび他の哺乳類種のＩＧＦ− １の特徴である。

したがって、その最も広い態様において、本発明は、哺乳類動物におけるＤＮＡおよび蛋白質の合成の促進ならびに蛋白質喪失の抑制に有効なペプチド類縁体を提供する。

本発明のデストリペプチドＩＧＦ−１および関連ペプチドを包含するペプチド類縁体は、以下の適用、すなわち（１）ヒト対象における生長欠陥の治療ならびに異化状態に伴う負の窒素平衡の抑制、（２）下垂体機能正常動物における生長促進および飼料変換率の改善に際し、ＩＧＦ−１の代用として適している。

さらに詳しくは、デストリペプチドＩＧＦ−１および関連ペプチドは、ウシ、ヒツジ、ブタおよびニワトリを含む畜産用、混血動物の生長促進および飼料変換率の改善のために投与することができる。この改良ＩＧＦ−１は単独で、または意図した投与方法によって選択された各種希釈剤、担体またｔま賦形剤とともに投与できる。

したがって、本発明は、さらに別の態様として、（の哺乳類動物のインシュリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残塁を欠失させたそのペプチド類縁体の有効量および（ハ）医薬用または獣医薬用として許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する哺乳類動物における蛋白質蓄積不全または蛋白質喪失の処置のための医薬用または獣医薬用組成物を提供する。

さらに調製された剤型として、本発明は、上記ペプチド類縁体を約１〜１，０００、好ましくは１０〜１００μ９／に９体重／日のｍｍで与えるのに十分な旦含有させた組成物を提供する。ペプチド類縁体は単位用ｍ剤型中に約０．０２〜２．０００■含有させることができる。

畜産用動物への投与方法としては実際に慣用されているような徐放性ベレットのインブラントの使用も好ましい。

したがって、本発明はまたさらに別の態様として、哺乳類動物のインシュリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのペプチド類縁体の有効量を、処置すべき対象に投与する、哺乳類動物における蛋白質蓄積不全の処置方法を提供する。この処置は哺乳類動物における蛋白質喪失にも適用できる。

本発明のデストリペプチドＩＧＦ−１および関連ペプチドを包含するペプチド類縁体は、生長ホルモン欠乏およびソマトメジン欠乏を含む慢性的発育障害の治療のためにヒトに投与することができる。この改良ＩＧＦ−１ペプチドはこの目的で非経口的に投与することもできるし、先に慨述した畜産用動物に使用される方法を用いてもよい。

本発明のペプチド類縁体は発育不全または組織破壊を伴う疾患、それらに限定されるものではないがたとえば癌、嚢胞性線維症、デュシエン型筋ジストロフィー、ベラカー型ジストロフィー、常染色体性劣性ジストロフィー、多発性筋炎ならびに他の筋疾患の処置のためにヒトに投与することができる。この改良ＩＧＦ− １ペプチドは、発育障害に関して上述した方法を用いて投与できる。

本発明のデストリペプチドＩＧＦ−１および関連ペプチドを包含するペプチド類縁体は、窒素平衡の劣化した急性状態、それらに限定されるものではないがたとえば火傷、骨格筋外傷および感染の処置のためにヒトに投与することができる。

このような危急の処置を必要とする場合は、腸管内以外の体液中への添加を介した投与方法が好ましいが、発育障害について上述した方法が適当な場合もある。

本発明のペプチド類縁体は、未熟児またはその他の乳幼児に、生長促進、窒素平衡状態の改善または異化障害の治療のために投与することができる。この場合、ペプチドは急性ヒト症状について先に概述したようにして、あるいは経腸経路によって投与できる。

デストリペプチドＩＧＦ−１および関連ペプチドの用量比および投与回数は、本発明による強度の増大に対応した割合で完全なＩＧＦ−１ペプチドより低レベルにセットできる。用量は約１〜１，０００μ９　／Ｋｓ／日とすることができる。約１０〜１００μ９７に９／日の用量が好ましい。

本発明はさらに別の態様として、哺乳類動物のインシュリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのペプチド類縁体を製造するにあたり、＋ｉｌ　Ｍ−Ｊｅｕ−ＣＶＳ−Ｑｊ！”／−８１ａ−０４！ｕ　−ｆｌ　ｅ　ｕ　−Ｖ　ａ　１−　ａ　Ｓ　ｌ）　−ａ　ｊ！　ａ　−１ｅ　Ｕ　−Ｑ　ｊ！　ｎ　−ｐｈｅ−Ｖａｊ−Ｃｙｓ−ＱＪｌｙ−ａＳｐ−ａｒ（］−］ＱＩＶ−Ｄｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅａｓｎ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｔｈｒ−ＱｉＶ　（式中ＭはＧｊ！Ｖ−１）ｒｏ＝０Ｊｕ−ｔｈｒまたはＴｈｒ）で示されるＮ末端構造を有するペプチド類縁体をＴＪｌ−備し、ついで１ｉｉｌそのペプチド類縁体を１または２以上のアミノ酸切断工程に付すことをこのペプチド類縁体は、完全なｈ−ＩＧＦ−１ペプチドの製造方法として既知の方法を適当に改変することによって製造できる。これらの改変は本技術分野の熟練者にはよく知られているところである。

たとえば、デストリペプチドヒトＩＧＦ−１は、最後の３サイクルのアミノ酸の連結を省略するほかは、ヒトＩＧＦ−１について開発された操作を用いて化学的に合成できる（たとえばＬｉほか：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ・“、８０：２２１６〜２２２０．１９８３）。Ｎ末端から１〜５個のアミノ酸が除去された関連ペプチドも同様にして得ることができる。合成デストリペプチドウシ、ヒツジまたはブタＩＧＦ−１および関連ペプチドは、これらのペプチドについてのアミノ酸配列情報を用い、ヒトＩＧＦ−１の場合と類似の技術によって製造できる。

本発明によれば、デストリペプチドＩＧＦ−１および関連ペプチドは、このデストリペプチドＩＧＦ−１および関連ペプチドの発現を指図できるＤＮＡ配列を包含する組換えプラスミドによって適当な細菌、酵母または組織培養細胞宿主を形質転換しても製造できる。ＤＮＡ配列は、合成、染色体、ｃＤＮＡまたはそれらの組合せを使用できる。この挿入暗号配列はデストリペプチドＩＧＦ−１（および関連ペプチド）と完全ＩＧＦ−１ペプチドの配列の差を生じる欠失または脱落が導入されていてもよい。

また、完全ＩＧＦ−１の挿入暗号配列を用いて完全ＩＧＦ−１ペプチド鎖を発現させ、下流プロセッシングの一部として３個のＮ末端アミノ酸を切断することもできる。１〜５個のＮ末端アミノ酸が除去されたＩＧＦ−１の製造も本発明により同様にして行うことができる。

本発明の好ましい形態として、本発明は、（ｉ）＠ウシ初乳または血清から選ばれるウシの製品と（ハ）酸を準備し、（１１）ウシの製品を蛋白質の抽出を行うのに十分な酸で処理し、（ｉ）蛋白質抽出物を少なくとも１回のりＯマドグラフィー溶媒溶出工程に付してｂＩＧＦ−１のデストリペプチド類縁体を単離することを特徴とするデストリペプチドウシインシュリン様生艮因子−１（ｂｌＯＦ− １）であるペプチド類縁体の製造方法を提供する。

好ましい酸は酢酸であり、好ましい溶媒はアセトニトリルである。

とくに好ましい出発原料はウシ初乳である。液体クロマトグラフィー過程を使用できる。ＨＰＬＣ過程を使用できる。好ましい蛋白質抽出物は４回までのクロマトグラフィー溶媒溶出工程に付す。

別法としてまたはさらに付加的にゲル浸透クロマトグラフィ一工程を包含させることができる。

次に本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の記述は単に例示であって、前述の一般的記述をいかなる意味においても限定するものデストリペプチドｂｌＧＦ−１は、順次以下の工程によってウシ初乳から単離できる。各工程においては生物活性を有するフラクションを合して次工程に適用した。

酸抽出約４１の初乳を５℃において、２０．０００ｇで３０分間遠心分離した。下漬（３，６ｊりを２℃で激しく攪拌しながら１時間を要して、氷酢酸でｐＨ２，８に調整した。混合物を０．２’５Ｍ、ＮａＣｊ！を含むＩＭＩ！￥１１１３゜６１で希釈した。５℃において２０．０００９で３０分間遠心分離すると乳白光を発する抽出物（６ｊ２）が得られた。

ＳＰ−セファデックス上クロマトグラフィーＳＰ−セファデックスＣ−２５，１００ｇを９５℃で２時間、水で処理した水和し、ｐＨ２，５で酢酸処理して水素型に変換した。このゲル層にｐＨ２，８の初乳抽出物を加え、混合物を２℃で一夜匿拌した。ゲルをガラスカラム中に懸潤し、１Ｍ酢酸１．５１．ついで５ＱｍＨ酢酸アンモニウムｐＨ５，５により、流速５０ｄ／分で、Ａ　（光路５悶）０．０５以下になるまで洗浄した。

生物活性の溶出は、ｐＨ５，５の緩衝液から０．５ＭＮａＣＪ！含有０．２５Ｍ　Ｎ１−（４０Ｈまでの５００ｄ直線勾配、ついで後者の溶液さらに２１によって実施した。

０１８逆相クロマトグラフイーによる濃縮ＳＰ−セファデックスクロマトグラフィーからの溶出液をトリフルオロ酢酸０．１％に調整し、ついで濃塩酸によりＩ）Ｈを２．１に調整したのちアセトニトリル（１０％、Ｖ／Ｖ）を加えた。混合物を２０℃で１５時間攪拌したのち、２０．０００ｇで３０分間遠心分離して沈殿を除去した。以下の工程はすべて２２℃で実施した。上清液を、あらかじめ０．１％トリフルオａｉ￥酸で平衡化した１２５？の八ｍ１ｃｏｎ　Ｃ１８マトリツクスカラムに、流速１５ｄ／分で、ポンプを用いて通じた。溶出は５０％（Ｖ／Ｖ　）アセトニトリル含有０．１％トリフルオロ酢酸によって行った。

酸−ゲル浸水Ｃ１８溶出液を凍結乾燥し、１Ｍ酢酸７５ｍに溶解し、１Ｍ酢酸で平衡化したＴＳＫフラクトゲルＨ５５（Ｓ）の５×９０υカラムに通した。流速は２ｄ１分とした。

匙二比旦旦旦ユ１酸ゲル浸透カラムからの活性フラクションを０．１２％へブタトリフルオロ醋酸で希釈してアセトニトリル濃度を２０％（Ｖ／Ｖ　）に低下させて、あらかじめ同じ溶液で平衡化したアミコン０１８カラム（２２Ｘ３３０ＩＭ１）に適用した。蛋白質は、流速５ｄ／分において、アセトニトリル３５％（Ｖ／Ｖ　）までの直線勾配で１０分、ついでアセトニトリル５６％（Ｖ／Ｖ）までの直線勾配で２１０分、カウンターイオンは０．１３％に維持しながら、溶出した。

匙二肚旦■旦ユＩ活性フラクションを合し、０．１％トリフルオロｌ￥酸でアセトニトリル濃度が２０％（Ｖ／Ｖ　）になるように希釈し、あらかじめ０．１％トリフルオＯ酢酢酸中上セトニトリル２０（Ｖ／Ｖ　）で平衡化したーａｔｅｒｓｕ　Ｂｏｎｄｐａｋ　Ｃ１８カラム（７，８Ｘ３００ｍ）に適用した。流速はロード時１．５Ｉｄ／分、溶出時１１Ｉｌ！！／分とした。中断点を０．１％トリフルオロ酢酢酸ノアセトニトリル２９．３９．８％および６５％（Ｖ／Ｖ　’）とした３工程直線勾配を１７４分間を要して適用した。

」二比旦ｌ旦ユ１フラクションを合して０．５容の０．１％トリフルオロ酢酸で希釈し、あらかじめ０．１％トリフルオロ酢酸中１０％（Ｖ／Ｖ　）プロパン−１−オルで平衡化したＷａｔｅｒｓ　Ｎｏｖａｐａｋ　（：、　１８Ｒａｄｉａｌｐａｋカートリツジ（４μｍ、８Ｘ１００履）に適用した。流速１ｄ／分の溶出プログラムは、１６．３％（Ｖ／Ｖ　）プロパン−１−オールまでの直線勾配置０分、ついで１９．８％（ｖ／ｖ　）プロパン−１−オールまでの直線勾配置５７分、ついで４５％（Ｖ／Ｖ　）プロパン−１−オールまでの直線勾配置５分、そして６２．５％（ｖ／ｖ）プロパン−１−オールまでの直線勾配置０分とした。

第四ＨＰＬＣ工程フラクションを合して０．５容の０．１３％ヘプタフルオロ酪酸で希釈し、第三ＨＰＬＣ工程で使用したと同一であるが０．１３％へブタフルオロ酪酸中１０％（Ｖ／Ｖ　）プロパン−１−オールで平衡化したカラム上に注入した。溶出時の流速は１ｍ／分とし、溶出プログラムは２７．５％（Ｖ　／Ｖ　）プロパン−１ −、ｔ−／ｌｚ［テの直線勾配置０分、ついで４１．５％（Ｖ／Ｖ　）プロパン −１−オールまでの直線勾配置３０分であり、カウンターイオンは０．１３％に維持した。

第四ＨＰＬＣ工程後に、生物活性を有する２領域が純粋な形で得られ、いずれも、１、ヒト胎盤膜への結合において１２５１−標識ヒトＩＧＦ−１と効率的に競合できる、２４　ヒツジ胎盤膜への結合において１２５Ｉ−標識ヒトＩＧＦ−２と競合できる。

３、ヒトＩＧＦ−１に対するポリクロナールまたはモノりＯナール抗体への結合において、　■＝標識ヒトＩＧＦ−１と競合できる。

第四ＨＰＬＣ工程で得られた生物活性を有する２領域を、Ｓ−カルボキシメチル化後、気相配列決定法で解析したところ、Ｎ末端から以下配列が得られた。

第一の溶出ピークＱｊｌＶ−Ｄｒｏ−ｐｊ！ｕ−ｔｈｒ−ｊ！ｅｕ−ｃｙｓ−ｇｊ！ｙ−ａＪ！ａ −Ｑｊ！ｕ−ｊ！ｅｕ−Ｖａ！−ａＳｐ−ａｌａ−ｊ！ｅｕ−ｇＪ！ｎ−１）ｈｅ−Ｖａｊ！−ＣｙＳ　−Ｂｙ−ａｓｐ−ａｒａ−ｏｌｙ−１）ｈｅ−ｔｙｒ− ｐｈｅ−ａｓｎ−Ｊｙｓ　−ｐｒｏ−ｔｈｒ−Ｑｌｙ− 第二の溶出ピークＴｈｒ−Ｊ！ｅｕ−ｃｙｓ−ａｌｙ−ａｚａ−ａｌｕ−ｚｅｕ−ｖａｚ−ａｓｐ −ａｊ！ａ−ｊ！ｅＬＩ−Ｑｊ！ｎ−ｐｈｅ−Ｖａｊ！−ＣＶＳ−Ｑハ／−ａＳｐ−ａｒＱ　−ＱｊｌＶ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−１ＶＳ−ｐｒｏ− ｔｈｒ−ｇｊ！ｙ−ｔｙｒ−ＱｊｌＶ−Ｓｅｒ　− 第一の配列はヒトＩＧＦ−１のＮ末端の３０個のアミノ酸と同一であり、明らかにウシＩＧＦ−１である。第二のピークのペプチドの配列も、最初の３個のアミノ酸（ＱｊｌＶ、１）ｒｏ、ＱＪ！Ｕ）を欠くことを除いて、ｈｌＧＦ−１のＮ末＠ｉ領域に一致する。この物質はしたがって、デストリペプチドｂｌＧＦ−１と呼ぶことにする。

第四ＨＰＬＣ工程で溶出した両ピークの生物学的検定結果は、純粋なヒトＩＧＦ −１に匹敵するものであった。

この検定では、総ｉ胞蛋白質への３日Ｍ１．識０イシンの導入、細胞ＤＮＡへの３日−チミジンの導入およびあらかじめ標識した細胞蛋白質からの３日標識ロイシンの放出に対する影響を検討した。

ラット１６筋原細胞における上述の測定結果を第１図、第２図および第３図に用量反応曲線として示すが、これから、デストリペプチドｂｌＧＦ−１（ｄｅｓ３ −ｂｌＧＦ−１＞は平均してｂｌＧＦ−１よりも１桁低い濃度で有効なことがわかる。もつとも大きな効力の差は、ヒト肺線繊芽細胞におけるＤＮＡ合成刺激または蛋白分解阻害をみた場合に認められた（表参照）。

１６筋原細胞およびヒト肺線維芽細胞Ｉ）ＩＥ（３９）Ｌ］におけるデストリペプチドｂｌＧＦ−１（ｄｅｓ３− ｂｌＧＦ−１＞とｂｌＧＦ−１の動力比生長因子（ｎＭｄ＞細胞　測定項目　ｄα５３−ｂｌＧＦ−１１０Ｆ−ＩＬ６　ＤＮＡ合成、１００％刺激　０．４５　５．３蛋白合成、１００ｘ刺激　１．６　１４蛋白分解、５０％最大阻害　０．２　１．５ＨＥ（３９）Ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成、１０ｏｚ刺激　０．１５　５．３蛋白分解、５０χ最大阻害　０．１５　３．８牲ユＩＧＦ−１ペプチドの合成Ｎ末端から１〜５個のアミノ酸を除去したｂｌＧＦ−１ペプチドの合成は、以下の操作によって行った。

出発原料は３ｏｃ−ａｉａ−フェニルアセトアミドメチル樹脂とした。カップリングは、Ａｐｐｌｉｅｄ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ４３０型ベブヂドシンセサイザーを用い、アルギニン、アスパラギンおよびグルタミンの誘導体についてはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でカップリングさせたほかはあらかじめ形成させたＢｏａ−アミノ酸の対称無水物によりジクロロメタン中でカップリングを行った。

第二のカップリングはすべての場合、ＤＭＦ中で実施した。合成の各サイクル後に樹脂サンプルを取出して定向ニンヒドリン分析（Ｓａｒｉｎ、Ｖ、に、、　Ｋｅｎｔ、　Ｓ、Ｂ、Ｈ，、Ｔａ１Ｊ、Ｐ、、　Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ：Ａｎａｌ。Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１７　：　１４〜１５７．１９８１）に付した。側鎖保護、樹脂結合・ブチドの予備配列解析も実施した。いずれによっても均反復収率は９９％を示した。

ｈｌＧＦ−１の全配列に相当するがＮ末端の５〜０１のアミノ酸が連結されていない。側鎖保護ペプチドを一部する樹脂の一部を取出した。ペプチドをＡＤＤｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃの操作に従って切断し、脱保護し、エテルで沈殿させて回、収した。

ペプチドを、１０ｍＨジチオスレイトール含有Ｔｒｉとともに６Ｍグアニジン塩Ｍ塩ｐＨ８，５に再溶解し、デ相ＨＰＬＣでｌ１５２塩し、乾燥したａ還元型ペプチドの酸イは、１ｍＨ還元型グルタチオンおよび０．１ｍＨＭ化型ゲッタチオンを含有する５０ｍＨＴｒ　＋　Ｓ、１）８８．５中にン解して行い、２０℃で１５時間インキュベートした。ｉ相ＨＰＬＣで脱塩後、サンプルを再懸濁に先立って乾メした。生物学的活性は、１６筋原細胞における蛋白質で成に対するペプチドの刺濫能によって確認した。

本発明は、その精神または範囲から逸脱することな・以上述べた各部分の構成または配置に多くの改変およ（／または変更が可能なことは自明のとおりである。

こ４らの改変および変更は本発明に包含される。

ｎｇ／ｍｌ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳類動物のインシユリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのぺプチド類縁体。
２．ウシまたはヒトインシユリン様生長因子−１の類縁体である請求の範囲第１項に記載のペプチド類縁体。
３．配列【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】から選ばれるＮ末端構造を有する請求の範囲第２項に記載のペプチド類縁体。
４．生物学的に純粋な形態である請求の範囲第３項に記載のペプチド類縁体。
５．（ａ）哺乳類動物のインシユリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのペプチド類縁体の有効量および（ｂ）医薬用または獣医薬用として許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する哺乳類動物における蛋白質蓄積不全または蛋白質喪失の処置のための医薬用または獣医薬用組成物。
６．ペプチド類縁体を約０．０２〜２，０００ｍｇ含有する請求の範囲第５項に記載の組成物。
７．哺乳類動物のインシユリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのぺプチド類縁体の有効量を、処置すべき対象に投与する、哺乳類動物における蛋白質蓄積不全の処置方法。
８．蛋白質蓄積不全は、癌、嚢胞性線維症、デユシエン型筋ジストロフイー、ペツカー型ジストロフイー、常染色体性劣性ジストロフイー、多発性筋炎ならびに他の筋疾患に伴つて生じるものである請求の範囲第７項に記載の方法。
９．ペプチド類縁体は約１〜１０００μｇ／ｋｇ体重／日の用量比で投与する請求の範囲第７項に記載の方法。
１０．哺乳類動物のインシユリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのぺプチド類縁体の有効量を、処置すべき対象に投与する、哺乳類動物における蛋白質喪失の処置方法。
１１．蛋白質喪失は、火傷、骨格筋外傷または感染に関連したものである請求の範囲第１０項に記載の方法。
１２．ペプチド類縁体は約１〜１０００μｇ／ｋｇ体重／日の用量比で投与する請求の範囲第１０項に記載の方法。
１３．（ｉ）（ａ）ウシ初乳または血清から選ばれるウシの製品と（ｂ）酸を準備し、（ｉｉ）ウシの製品を蛋白質の抽出を行うのに十分な酸で処理し、（ｉｉｉ）蛋白質抽出物を少なくとも１回のクロマトグラフイー溶媒溶出工程に付してｂＩＧＦ−１のデストリペプチド類縁体を単離する、デストリペプチドウシインシユリン様生長因子−１（ｂＩＧＦ−１）であるペプチド類縁体の製造方法。
１４．酸は酢酸であり、溶媒はアセトニトリルである請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．哺乳類動物のインシユリン様生長因子−１のＮ末端から１〜５個のアミノ酸残基を欠失させたそのペプチド類縁体を製造するにあたり、（ｉ）【配列があります】（式中Ｍは【配列があります】またはＴｈｒ−である）で示されるＮ末端構造を有するぺプチド類縁体を準備し、ついで（ｉｉ）そのペプチド類縁体を１または２以上のアミノ酸切断工程に付す方法。
１６．例１または２にとくに記載したと実質的に同一である請求の範囲第１３項または第１５項のいずれかに記載の方法。