KR101198346B1 - 크로마토그래피 고정상의 재생 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 크로마토그래피 고정상을 재생하는 방법에 관한 것이다.
크로마토그래피, 고정상, 재생

Description

크로마토그래피 고정상의 재생{REGENERATION OF CHROMATOGRAPHIC STATIONARY PHASES}
본 발명은 크로마토그래피 정제 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 크로마토그래피 고정상을 재생하는 방법에 관한 것이다.
폴리펩티드는 모든 주요 치료 영역 내에서 질병의 치료를 위한 약제로서 더욱 더 사용되고 있다. 장기간 인슐린 투여에 의한 당뇨병의 치료는 80 년 이상 동안 실행되어 왔으며, 성장 장해 및 암 내에서의 폴리펩티드의 치료학적 적용도 오랜 세월 동안 실행되어 왔다. 치료학적 적용에 충분히 높은 순도를 가진 폴리펩티드의 대규모 생산을 위한 경제적인 공정은 폴리펩티드에 기초한 치료법이 대형 시장에 이르고, 기존의 치료법이 보다 널리 사용되는데 중요하다.
혼합물로부터의 폴리펩티드 정제는 치료용 폴리펩티드에 대한 전반적인 제조 공정 중에 정상적으로 수 회 사용되는 단계이다. 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)는 폴리펩티드의 공업적 고 해상도 분리를 위한 바람직한 방법이고, 이 방법은 많은 폴리펩티드의 대규모 정제에 다재다능한 것으로 입증되었다.
치료용 폴리펩티드는 환자에게 투여시 악영향을 일으키지 않도록 하기 위하여 고 정제되기 때문에, 제조 공정에서 수 회 크로마토그래피 정제를 사용하는 것 이 매우 통상적이다. 제조 플랜트에서 크로마토그래피 컬럼의 고정상은 고가이고, 따라서, 이들은 수 회 크로마토그래피 사이클에 사용된다. 그러나, 크로마토그래피 고정상의 성능은 경시적으로 감퇴되는데, 즉 컬럼 상에서의 압력 강하는 엄청나게 증가하고, 분리 인자는 손상된다. 이것은 침착물의 점진적인 누적에 기여한다. 이 문제점은 알칼리성 완충액(J. Chrom. 461, 1989, 45-61), 예를 들면 pH 7.4 및 고 농도의 유기 개질제를 포함하는 재생 공정에 의해 극복할 것이 제안되었다. 문헌(Brange et al., J. Pharm. Sci. 86 (1997) 517-525)에는 산 및 염기 중에 인슐린 원섬유를 용해시키는 것이 개시되어 있다.
오랫동안, 상기 문제는 크로마토그래피 고정상을 알칼리성 용액, 예를 들면 0.1 몰 수산화나트륨으로 재생함으로써 경감되었다(Liliedahl, "Twelve years of silica-based HPLC purification with focus on peptides", Tides 2000, 10 May 2000 in Las Vegas, USA, 참조). 이 재생 공정은 인슐린을 정제하는 데 사용되는 실리카의 수명을 100 내지 600 사이클로 증가시킬 수 있다. 그러나, 실리카 물질은 가혹한 알칼리성 조건에 노출될 때 안정하지 않으며, 특히 치환된 실리카 물질은 알칼리성 용액에 의한 재생에 의해 개정될 수 없다. 약제, 예컨대 치료용 펩티드를 정제하는 데 경제적으로 유용한 공정은 크로마토그래피 고정상을 열화시키지 않는 재생 공정을 포함해야 한다.
매우 다양한 공급원으로부터 미립자 물질(점토, 모래, 실리카 등)을 재생하는 일반적이고 복잡한 공정은 WO 00/61493호에 개시되어 있다. 이것은 상기 물질을 a) 유기 물질의 추출물, b) 산화제, 이어서 c) 산 용액과 접촉시키고, d) 상기 물 질을 가열하며, e) 상기 재료를 회수하는 단계를 포함하는 5 단계 공정이다. 이 공정은 성기시고, 크로마토그래피 정제 플랜트 내에서의 이행에 대하여 개정할 수 없다.
이러한 고가의 원료 수명을 증가시키고, 크로마토그래피 컬럼 상의 압력 악하가 상승하는 것을 방지하도록 크로마토그래피 고정상을 재생하는 보다 효율적인 방법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다. 특히, 제조 플랜트에서 크로마토그래피 고정상의 계내 재생에 적합한 재생 공정이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 크로마토그래피 고정상을 1 종 이상의 유기산 및 약 75% w/w 미만의 물을 포함하는 재생 용액과 접촉시키는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 크로마토그래피 고정상을 1 종 이상의 유기산 및 약 1% w/w 미만의 물을 포함하는 재생 용액과 접촉시키는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법을 제공한다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 유기산은 포름산이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 유기산은 아세트산이다. 다른 구체예에서, 재생 용액은 0.5% 미만의 물, 바람직하게는 0.1% 미만의 물, 보다 바람직하게는 0.02% 미만의 물, 가장 바람직하게는 0.001% 미만의 물을 함유한다.
다른 양태에서, 본 발명은 크로마토그래피 고정상을 1 종 이상의 유기산, 유기 용매 및 약 1% w/w 미만의 물을 포함하는 재생 용액과 접촉시키는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법을 제공한다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 유기 용매는 에탄올이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 유기 용매는 2-프로판올이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 유기 용매는 메탄올, 1-프로판올 및 헥실렌 글리콜로 구성된 군 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 재생 용액은 0.5% 미만의 물, 바람직하게는 0.1% 미만의 물, 보다 바람직하게는 0.02% 미만의 물 및 가장 바람직하게는 0.001% 미만의 물을 함유한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻어진 폴리펩티드 생성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의한 크로마토그래피 고정상의 재생을 포함하는 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 생성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 재생 방법을 수행하기 위한 파이프 및 제어 시스템을 포함하는 자동화 크로마토그래피 장치에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드를 정제함으로써 제조된 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 첨부 도면에 더 예시되어 있다.
도 1은 공초점 원리를 보여준다.
도 2는 티오플라빈 T로 염색된 인슐린 원섬유를 가진 소스(Source) 30Q의 2 차원 도면이다.
도 3은 소스 30Q 상의 원섬유 면적을 측정하는 원리를 보여준다. 밝은 착색 영역은 소스 30Q 입자 상의 인슐린 원섬유로부터 유래하는 녹색광을 보여준다.
도 4a-b는 크로마토그래피 정제 III로부터의 정제용 크로마토그램이다(도 4a(상부 도면)는 포름산으로 재생하기 전이고, 도 4b(하부 도면)는 포름산으로 재생한 후이다).
정의
다음은 본 명세서에 사용된 용어의 상세한 정의이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "크로마토그래피 고정상"은 가용성 상이 통과하는 고상, 즉 크로마토그래피 매트릭스를 의미한다. 일반적으로, 크로마토그래피 고정상은 크로마토그래피 컬럼 내에 위치한다. 크로마토그래피 고정상의 예는 치환 실리카, 예컨대 C-4 실리카, C-12 실리카 및 C-18 실리카, 뿐만 아니라 중합체 물질, 예컨대 폴리스티렌, 소스 30Q 및 세파로스(Sepharose)이다. 크로마토그래피 고정상의 추가 예는 멤브레인, 모노리스 물질 및 필터이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "크로마토그래피 용출액"은 정제하고자 하는 폴리펩티드가 크로마토그래피 고장성으로부터 용출액으로 정상적으로 방출되는 용출 단계에 사용되는 용액을 의미한다. 크로마토그래피의 정상 모드에서, 완전 사이클은
a) 컬럼이 사이클 준비가 된 상태가 되도록 평형 완충액으로 평형시키는 단계,
b) 생성물 보유 샘플의 적용 단계,
c) 결합된 생성물을 가진 크로마토그래피 고정상을 세척하는 임의의 세척 단계,
d) 크로마토그래피 고정상에 대한 생성물의 친화도가 감소하고, 생성물이 크로마토그래피 용출물 중에서 칼럼을 떠나는 용출 단계, 및
e) 재생 용액을 사용하여 잔류 불순물을 크로마토그래피 고정상에서 제거하려는 임의의 재생 단계
를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "평형 완충액"은 크로마토그래피 컬럼이 크로마토그래피 사이클을 준비하는 평형 단계에 사용되는 용액을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재생 용액"은 크로마토그래피 고정상을 재생하는 데 사용되는 용액을 의미한다. 재생 목적은 수 회의 크로마토그래피 사이클에 걸친 크로마토그래피 분리의 만족할 만한 성능을 유지하는 것이다. 통상적으로, 중요한 성능 관련 매개변수는 크로마토그래피 컬럼 상의 압력 강하 및 분리 인자이다. 재생 단계는 크로마토그래피 고정상을 단일 재생 용액 또는 1 종 이상의 재생 용액과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 후자의 경우, 재생 용액뿐만 아니라 이들의 생성된 혼합물은 용어 "재생 용액"에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼합물"은 2 이상의 성분을 포함하는 물질의 조성물을 의미한다. 크로마토그래피 컬럼 용출물은 컬럼으로부터 제거된 생성물과 함께 용출액 내 화학물질을 포함하는 혼합물이다. 혼합물의 다른 예는 용매 중의 화학물질의 용액, 예컨대 식염수이다. 혼합물의 다른 예는 물과 수혼화성 유기 용매이다. 혼합물의 또 다른 예는 용매, 예컨대 물 또는 유기 용매 중의 폴리펩티드의 용액 또는 현탁액이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드를 단리하는"은 폴리펩티드를, 이것을 단리하기 전보다, 즉 출발 물질에서보다 더 고 농도 또는 더 고 순도인 상태로 하는 것을 의미한다. 따라서, 폴리펩티드를 분리하는 예는 폴리펩티드를 용액으로부터 침전 또는 결정화시키고, 모액으로부터 침전물 또는 결정을 분리하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유기 용매"는 1 이상의 탄소 원자를 포함하고, 0℃ 내지 50℃ 범위의 온도에 걸쳐서 유체 상태로 있는 용매를 의미한다. 유기 용매의 비한정적인 예는 저급 알콜, 예컨대 메탄올 및 에탄올, 다가 알콜, 아세토니트릴, 헥산 및 아세톤이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "수혼화성 유기 용매"는 20℃에서의 수중 용해도가 1 g/L 이상인 유기 용매를 의미한다. 수혼화성 유기 용매의 비한정적인 예는 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 아세토니트릴 및 헥실렌글리콜이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유기산"은 해리 상수 pKa가 5.0 미만인 1 이상의 작용기를 가진 유기 화합물을 의미한다. 유기산의 예는 포름산, 아세트산, 시트르산 등이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "저급 알콜"은 1 내지 6 개의 탄소 원자 및 1 개의 히드록실 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 C1-6 알콜을 의미한다. 저급 알콜의 탄소 골격은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 저급 알콜의 비한정적인 예는 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 및 t-부탄올이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "다가 알콜"은 2 이상의 히드록실 부분을 가진 알콜을 의미한다. 다가 알콜의 비한정적인 예는 헥실렌 글리콜(4-메틸-2,4-펜탄디올) 및 네오펜틸 알콜(2,2-디메틸-1,3-프로판디올)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "부형제"는 약학 조성물을 안정화시키고 보존하기 위하여 약학 조성물에 첨가하는 화합물을 의미한다. 통상적인 부형제는 완충제, 보존제 및 장성 조절제이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학 조성물"은 약학 부형제, 예컨대 완충제, 보존제 및 장성 조절제와 함께 활성 화합물 또는 그것의 염을 포함하는 생성물이고, 상기 약학 조성물은 질환 또는 장해를 치료하는 데 유용하다. 따라서, 약학 조성물은 약학 제제로도 당업계에 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "완충제"는 화학 반응에 기인하여 일어날 수 있는, 경시적으로 변하는 용액의 pH의 경향을 감소시키기 위하여 용액에 사용되는 화학적 화합물에 관한 것이다. 완충제는 인산나트륨, TRIS, 글리신 및 시트르산나트륨과 같은 화학물질을 포함한다.
"장성 조절제"는 삼투압이 사람 혈장과 유사하게 되도록 약학 조성물의 삼투압을 조절하는 역할을 하는 약학 조성물 중의 화학적 화합물에 관한 것이다. 긴장성 조절제로는 NaCl, 글리세롤, D-만니톨 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 정상적인 약학적 적용에 적당한 것, 즉 환자에게 악영향을 유발하지 않는 등을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사람 인슐린"은 그 구조 및 성질이 잘 알려진 사람 호르몬을 의미한다. 사람 인슐린은 시스테인 잔기 사이에 이황화물 다리결합에 의해 연결된 두 개의 폴리펩티드 사슬, 즉 A 사슬 및 B 사슬을 가진다. A 사슬은 21 개의 아미노산 펩티드이고, B 사슬은 30 개의 아미노산 펩티드이며, 두 개의 사슬은 세 개의 이황화물 결합에 의해 연결되어 있는데, 하나는 A 사슬의 6번 및 11번 위치의 시스테인 사이이고, 두 번째는 A 사슬의 7번 위치의 시스테인과 B 사슬의 7번 위치의 시스테인 사이이며, 세 번째는 A 사슬의 20번 위치의 시스테인과 B 사슬의 19번 위치의 시스테인 사이이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 10 이상의 구성 아미노산으로 구성되어 있다. 구성 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화된 아미노산의 군으로부터일 수 있고, 이들은 유전자 암호에 의해 암호화되지 않은 천연 아미노산, 뿐만 아니라 합성 아미노산일 수 있다. 유전자 암호에 의해 암호화되지 않은 천연 아미노산의 예로는 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민이 있다. 합성 아미노산은 화학 합성에 의해 제조된 아미노산, 즉 유전자 암호에 의해 암호화된 아미노산의 D-이성질체, 예컨대 D-알라닌 및 D-루신, Aib(α-아미노이소부티르산), Abu(α-아미노부티르산), Tle(tert-부틸글리신) 및 β-알라닌을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료용 폴리펩티드"는 치료제로서 인식된 잠재적 용도가 있는 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 치료용 폴리펩티드는 고순 도이고, 규제 승인 절차의 일부로서 임상 연구된다. 치료용 폴리펩티드의 예로는 사람 인슐린, 트롬보포에틴, 에리트로포에틴 및 사람 성장 호르몬이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드 생성물"은 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 의미한다. 폴리펩티드 생성물의 예로는 결정화된 폴리펩티드, 침전된 폴리펩티드 및 폴리펩티드의 용액이 있다.
모체 폴리펩티드에 관한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "유사체"는 모체 폴리펩티드의 1 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 변성 폴리펩티드 및/또는 1 이상의 아미노산 잔기가 모체 폴리펩티드로부터 결실된 변성 폴리펩티드 및/또는 1 이상의 아미노산 잔기가 모체 폴리펩티드에 첨가된 변성 폴리펩티드를 의미한다. 아미노산 잔기의 그러한 첨가 또는 결실은 폴리펩티드의 N-말단 또는 폴리펩티드의 C-말단 또는 폴리펩티드 내에서 일어날 수 있다. 유사체의 예로는 34번 위치의 Lys가 Arg로 치환된 GLP-1(7-37)인 Arg34-GLP-1(7-37)이다. 다른 예는 돼지 또는 소 인슐린이며, 둘 다 사람 인슐린의 유사체이다.
폴리펩티드에 관한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "전구체"는 생성되는 폴리펩티드의 변형을 의미한다. 통상적으로, 폴리펩티드의 전구체는 폴리펩티드의 아미노산 연장형 또는 폴리펩티드의 절두형이다. 이러한 전구체는 세포 발현을 향상시키는 역할을 하고, 정제를 위한 친화성 태그를 포함하며, 생성하고자 하는 폴리펩티드의 특정한 반응성기를 보호하는 등의 역할을 할 수 있다.
모체 폴리펩티드에 관한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "유도체"는 1 이상의 치환기가 모체 폴리펩티드 또는 그것의 유사체에 존재하지 않는 화학 변성 모체 폴리펩티드 또는 그것의 유사체, 즉 공유적으로 변성된 모체 폴리펩티드를 의미한다. 통상적인 변성은 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 에스테르, PEGylation 등이다. 사람 인슐린의 유도체의 예로는 트레오닌 메틸 에스테르B30 사람 인슐림 및 NεB29-테트라데칸오일 des(B30) 사람 인슐린이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "친지성 치환기"는 4 내지 40 탄소 원자를 포함하고, 20℃에서의 수용해도가 약 0.1 mg/100 ㎖ 물 내지 약 250 mg/100 ㎖ 물, 예컨대 약 0.3 mg/100 ㎖ 물 내지 약 75 mg/100 ㎖ 물 범위인 4 내지 40 탄소 원자를 포함하는 치환기를 의미한다. 예를 들면, 옥탄산(C8)은 20℃ 수용해도가 68 mg/100 ㎖이고, 데칸산(C10)은 20℃ 수용해도가 15 mg/100 ㎖이며, 옥타데칸산(C18)은 20℃ 수용해도가 0.3 mg/100 ㎖이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "파이프 및 제어 시스템"은 물리적 수단(파이프 및 제어 밸브) 및 공정 장치의 파이프 및 밸브를 제어하는 소프트웨어를 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 크로마토그래피 고정상을 1 종 이상의 유기산 및 약 75% w/w 미만의 물을 포함하는 용액과 접촉시키는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 크로마토그래피 고정상을 1 종 이상의 유기산 및 약 1% w/w 미만의 물을 포함하는 재생 용액과 접촉시키는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 크로마토그래피 고정상을 25% w/w 이상인 유기산의 농도를 가진 재생 용액과 접촉시키는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법에 관한 것이다. 다수의 유기산을 본 방법의 재생 용액에 사용할 수 있다. 바람직한 유기산은 포름산이다. 재생 용액에 대한 다른 유기산은 아세트산이다. 다른 재생 용액은 2 종의 유기산, 예를 들면 포름산 및 아세트산을 포함한다.
재생 용액은 유기 용매를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유기 용매는 평형 완충제 또는 크로마토그래피 용출액에도 사용된다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 유기 용매는 에탄올이다. 다른 구체예에서, 유기 용매는 2-프로판올이다. 다른 구체예에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 다른 구체예에서, 유기 용매는 메탄올, 1-프로판올 및 헥실렌 글리콜로 구성된 군 중에서 선택된다.
다른 구체예에서, 유기산은 포름산이고, 유기 용매는 에탄올이다. 다른 구체예에서, 유기산은 포름산이고, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 또 다른 구체예에서, 유기산은 포름산이고, 유기 용매는 2-프로판올이다. 또 다른 구체예에서, 유기산은 포름산이고, 유기 용매는 헥실렌 글리콜이다. 다른 다른 구체예에서, 유기산은 아세트산이고, 유기 용매는 에탄올이다. 다른 구체예에서, 유기산은 아세트산이고, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 또 다른 구체예에서, 유기산은 아세트산이고, 유기 용매는 2-프로판올이다. 또 다른 구체예에서, 유기 산은 아세트산이고, 유기 용매는 헥실렌 글리콜이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 고정상을 1 종 이상의 유기산 및 0.5% 미만의 물, 바람직하게는 0.1% 미만의 물, 보다 바람직하게는 0.02% 미만 의 물, 가장 바람직하게는 0.001% 미만의 물을 포함하는 재생 용액과 접촉시키는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법에 관한 것이다.
크로마토그래피 고정상은 크로마토그래피 컬럼 내에서 재생 용액과 접촉시키는 것이 바람직하다. 이 방식에서, 재생 단계와 관련된 정지 시간에 기인하여 최소의 생산 용량이 손실된다. 따라서, 크로마토그래피 고정상의 재생 방법은 컬럼을 재패킹하지 않으면서 수행할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 크로마토그래피 고정상은 상기 재생 중에 유동화된다. 다른 구체예에서, 크로마토그래피 용출액 또는 평형 완충제는 상기 크로마토그래피 고정상이 상기 재생 용액과 접촉하기 전에 수혼화성 유기 용매로 대체된다. 상기 수혼화성 유기 용매는 크로마토그래피 용출액 또는 평형 완충제에도 존재하는 것이 바람직하다. 상기 수혼화성 유기 용매는 재생 용액에도 존재하는 것이 바람직하다.
다른 구체예에서, 크로마토그래피 고정상은 크로마토그래피 컬럼 외부에서 상기 재생 용액과 접촉한다. 이 과정은 컬럼 내부에서 재생 공정을 수행하는 것보다 더 불편하지만, 그럼에도 불구하고, 침전된 물질이 크로마토그래피 고정상 입자 사이에 포획된다면 유용할 수 있다. 후자의 경우, 침전된 물질은 상기 물질을 용해시키지 않고 크로마토그래피 고정상에서 제거할 수 있다.
한 가지 구체예에서, 크로마토그래피 고정상은 RP-HPLC 매트릭스이다. RP-HPLC에 대한 크로마토그래피 고정상은 기계적으로 매우 단단한 물질이며, 실리카 또는 치환 실리카, 예컨대 C4, C6, C8, C10, C12, C16, C18, C30 또는 페닐 실리카일 수 있거나, 또는 치환 또는 비치환된 압력 안정성 중합체 물질일 수 있다. 실리카계 매트릭스 또는 중합체 물질인 크로마토그래피 고정상은 거대 공동 또는 중간 공동을 가진 모노리스 로드로서 컬럼에 존재할 수도 있다. 크로마토그래피 고정상용으로 적당한 실리카 물질은 좁은 공동 크기 분포를 가지며, 입도 범위가 3 ㎛ 내지 100 ㎛, 예컨대 5 ㎛ 내지 100 ㎛, 예컨대 8 ㎛ 내지 30 ㎛, 예컨대 10 ㎛, 13 ㎛, 15 ㎛, 16 ㎛, 18 ㎛ 및 20 ㎛인 구형 입자이다. 60 Å 내지 300 Å, 예컨대 100 Å, 120 Å, 150 Å, 175 Å, 200 Å 또는 300 Å 범위의 통상적인 공동 크기가 사용된다. 한 가지 구체예에서, 압력 안정성 중합체 물질은 소스 30Q 또는 XAD 1180이다. 크로마토그래피 컬럼은 고정상으로 패킹되고, 패킹량의 적당한 테스트 후에, 컬럼은 결합 모드에서 사용되는 완충제로 평형화된다. 통상적으로, 생산 규모 크로마토그래피 컬럼은 직경이 15 내지 100 cm이고, 그러한 시스템은 동적 축 압축을 가진다. 소용적 폴리펩티드의 생산의 경우, 생성 컬럼은 직경이, 예를 들면 15 cm, 20 cm 또는 25 cm일 수 있다. 대용적 폴리펩티드의 생산의 경우, 생성 컬럼은 직경이, 예를 들면 40 cm, 60 cm, 80 cm 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 재생하고자 하는 크로마토그래피 고정상은 멤브레인, 모노리스 물질, 필터 등이다.
크로마토그래피 고정상의 재생 방법의 한 가지 구체예에서, 상기 크로마토그래피 고정상은 상기 재생 용액과 1 초 이상, 바람직하게는 1 분 이상, 보다 바람직하게는 5 분 이상, 예컨대 1 분 내지 24 시간, 1 분 내지 5 시간, 1 분 내지 2 시간, 10 분 내지 60 분 동안 접촉시킨다.
크로마토그래피 고정상의 재생 방법의 다른 구체예에서, 상기 크로마토그래 피 고정상은 정상 유속에서 크로마토그래피 컬럼의 길이 상에서 압력 강하가 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상 감소될 때까지 상기 재생 용액과 접촉시킨다.
크로마토그래피 고정상의 재생 방법의 다른 구체예에서, 상기 크로마토그래피 고정상과 재생 용액의 접촉은 약 0℃ 내지 70℃, 5℃ 내지 50℃, 예컨대 10℃ 내지 40℃, 예컨대 15℃ 내지 30℃ 또는 18℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 수행된다.
크로마토그래피 고정상의 재생 방법의 다른 구체예에서, 상기 크로마토그래피 고정상의 수명은 500 이상의 크로마토그래피 사이클, 바람직하게는 700 이상의 크로마토그래피 사이클, 보다 바람직하게는 1000 이상의 크로마토그래피 사이클, 가장 바람직하게는 2000 이상의 크로마토그래피 사이클이다.
크로마토그래피 고정상의 재생 방법의 다른 구체예에서, 상기 방법은 크로마토그래피 사이클마다, 2 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상, 5 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상, 20 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상, 50 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상, 또는 100 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상 동안 상기 크로마토그래피 고정상에 적용된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 크로마토그래피 고정상에 수행되는 재생 공정의 수는 25 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 400 이상 또는 1000 이상이다.
크로마토그래피 고정상의 재생 방법의 다른 구체예에서, 상기 방법은 크로마토그래피 컬럼 상의 압력 강하가 역치를 초과할 때마다 상기 크로마토그래피 고정 상에 적용된다.
본 발명의 다른 양태는 치료용 폴리펩티드 또는 그것의 전구체의 생성 방법이며, 상기 방법은 크로마토그래피 고정상이 전술한 바와 같은 재생 방법에 의해 재생되는 1 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 치료용 폴리펩티드 또는 그것의 전구체의 생성 방법의 한 가지 구체예에서, 상기 치료용 폴리펩티드는 친지성 치환기를 포함하는 유도체이다. 치료용 폴리펩티드 또는 그것의 전구체의 생성 방법의 다른 구체예에서, 상기 치료용 폴리펩티드는 리신 잔기의 ε-아미노기에 부착된 친지성 치환기를 포함하는 유도체이다. 치료용 폴리펩티드 또는 그것의 전구체의 생성 방법의 다른 구체예에서, 상기 치료용 폴리펩티드는 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1, 글루카곤 유사 펩티드 2, 엑센딘-4, TFF 펩티드, 사람 인슐린, 이들의 유사체 및 이들의 유도체로 구성된 군 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-헥사데칸오일)))-GLP-1(7-37), Arg34-GLP-1(7-37), 엑센딘-4, Lys17Arg30-GLP-2(1-33), Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-헥사데칸오일))GLP-2(1-33) 및 Gly2-GLP-2(1-33)으로 구성된 군 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 엑센딘-4이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체와 사람 혈청 알부민 단편 또는 그것의 유사체 간의 융합 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 엑센딘-4(1-39) 또는 그것의 유사체와 사람 혈청 알부민 단편 또는 그것의 유사체 간의 융합 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 부분 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체와 면역글로불린의 Fc 부분의 단편 또는 그것의 유사체 간의 융합 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 엑센딘-4(1-39) 또는 그것의 유사체와 면역글로불린의 Fc 부분의 단편 또는 그것의 유사체 간의 융합 폴리펩티드이다.
다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 사람 인슐린, 사람 인슐린 전구체, 사람 인슐린 유사체, 사람 인슐린 유사체 전구체, GLP-1(7-37) 유사체, 엑센딘-4(1-39) 유사체 및 이들의 유도체로 구성된 군 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 1 이상의 메톡시 또는 에톡시 부분을 포함하는 사람 인슐린 유도체 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는
트레오닌 메틸 에스테르B30 사람 인슐린,
트레오닌 에틸 에스테르B30 사람 인슐린,
AspB28 사람 인슐린,
트레오닌 메틸 에스테르B30AspB28 사람 인슐린,
트레오닌 에틸 에스테르B30AspB28 사람 인슐린,
LysB28ProB29 사람 인슐린,
MetB-1ArgB0LysB28ProB29 사람 인슐린,
LysB3GluB29 사람 인슐린,
GlyA21ArgB31ArgB32 사람 인슐린,
삭제
des(B30) 사람 인슐린,
NεB29-테트라데칸오일 des(B30) 사람 인슐린,
NεB29-리토콜로일-γ-글루타밀 des(B30) 사람 인슐린,
NεB29-옥탄오일 des(B30) 사람 인슐린 및
NεB29-옥탄오일 사람 인슐린
으로 구성된 군 중에서 선택된다.
또 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민, 에리트로포이에틴, TNF-α, 인터루킨, IGF-1, IGF-2, 사람 성장 호르몬, 소마토스타틴, 사람 아밀린 및 이들의 유사체 중에서 선택된다.
본 발명의 방법에 의해 재생되는 크로마토그래피 고정상에서 정제하고자 하는 폴리펩티드는 폴리펩티드 생산 분야에 공지된 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 보통, 3000 돌턴 이상의 폴리펩티드는 발효 또는 세포 배양에 의해 생성되는 반면에, 보다 작은 폴리펩티드는 화학적 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다. 또한, 최적 생성 방법을 결정하는 다른 중요한 인자는 생성하고자 하는 폴리펩티드의 양 및 폴리펩티드의 구조, 예를 들면 이황화물 결합 및 다른 변성이다. 발효 또는 세포 배양 유도 폴리펩티드는 적당한 배양 배지 내에서 재조합 숙주 세포, 예를 들면 박테리아, 진균 포유류 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포를 배양함으로써 통상적으로 생산된다. 배양 배지는 숙주 세포의 성장 및 산물 형성을 위한 필수 영양분, 예를 들면 당, 질소원, 염, 비타민 및 기타 성장 인자를 함유하는 다소 화학적으로 정의된 배지일 수 있다. 미생물 또는 세포가 배지에 배양되고, 이들이 임의로 붕괴되면, 배양 배지는 잔존 배지 성분, 숙주 세포 유도 불순물 및 생성물 관련 불순물과 혼합된 소정의 생성물을 함유한다. 숙주 세포 유도 불순물은 주로 폴리펩티드, 핵산 및 세포 잔존물이다. 생성물은 회수 또는 초기 정제 단계에서 이러한 비관련 불순물로부터 분리된다. 생성물 폴리펩티드와 밀접하게 관련있는 불순물을 생성물 폴리펩티드에서 분리하는 최종 정제 단계(마무리)에서, 크로마토그래피 단계가 집중적으로 사용된다.
또한, 폴리펩티드의 합성은 메리필드형 화학에 의한 고상 합성, 용액상 방법 또는 당업계에 공지된 반합성 방법에 의하여 수행될 수 있다. 1 이상의 화학 전환 단계는 회수 단계와 최종 정제 단계 사이에서 수행될 수 있다. 그러한 화학 변성은 폴리펩티드에 대한 아미노산 연장이 폴리펩티드를 개열하는 전구체 폴리펩티드의 가수분해에 의할 수 있다. 그러한 아미노산 연장은 배양 유도 폴리펩티드의 경우에서 숙주 세포 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있거나, 또는 예컨대 친화도 크로마토그래피, 예를 들면 히스티딘 태그된 폴리펩티드의 IMAC 정제에 의하여 폴리펩티드를 특이적으로 정제하는 데 사용될 수 있다. 또한, 화학 전환은, 예를 들면 아실화, PEG화 또는 에스테르화에 의하여 유도체인 폴리펩티드를 생성하는 화학 변성일 수 있다. 그러한 화학 변성은 당업계에 널리 알려져 있다(예컨대, WO 98/08871호, WO 99/43706호, 미국 특허 제5,424,286호, WO 00/09666호, WO 00/66629호, WO 01/04156호 및 WO 02/90388호 참조).
본 발명의 다른 양태는 크로마토그래피 컬럼의 길이 상에서 압력 강하를 감소시키기 위한 크로마토그래피 고정상의 상기 재생 방법의 용도이다.
본 발명의 다른 양태는 치료용 폴리펩티드의 제조를 위한 크로마토그래피 고정상의 상기 재생 방법의 용도이다.
본 발명의 다른 양태는 크로마토그래피 고정상을 재생 용액과 접촉시킴으로써 재생된 크로마토그래피 고정상이며, 상기 재생 용액은 1 종 이상의 유기산 및 약 75% w/w 미만의 물을 포함한다. 본 발명의 다른 양태는 상기 크로마토그래피 고정상을 재생 용액과 접촉시킴으로써 재생된 크로마토그래피 고정상이며, 상기 재생 용액은 1 종 이상의 유기산 및 약 1% w/w 미만의 물을 포함한다.
한 가지 구체예에서, 크로마토그래피 고정상은 전술한 바와 같은 방법에 의해 재생된다. 다른 구체예에서, 크로마토그래피는 재생 용액이 0.5% 미만의 물, 바람직하게는 0.1% 미만의 물, 보다 바람직하게는 0.02% 미만의 물, 가장 바람직하게는 0.001% 미만의 물을 함유하는 방법에 의해 재생된다. 다른 구체예에서, 재생된 크로마토그래피 고정상은 실리카 또는 치환 실리카 물질이다.
다른 양태에서, 본 발명은
a) 본 발명의 재생 방법에 의해 생성된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계, 및
b) 상기 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 단리하여 생성된 폴리펩티드 생성물을 제공하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 생성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하는 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 생성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재생 방법을 수행하기 위한 파이프 및 제어 시스템을 포함하는 자동화 크로마토그래피 장치에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은
a) 먼저, 본 발명에 따른 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계,
b) 그 다음, 상기 폴리펩티드를 건조시키는 단계, 및
c) 최종적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은
a) 먼저, 크로마토그래피 고정상을, 1 종 이상의 유기산 및 0.5% 미만의 물, 바람직하게는 0.1% 미만의 물, 보다 바람직하게는 0.02% 미만의 물, 가장 바람직하게는 0.001% 미만의 물을 포함하는 재생 용액과 접촉시키는 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계,
b) 그 다음, 상기 폴리펩티드를 건조시키는 단계, 및
c) 최종적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된 약학 조성물에 관한 것이다.
시판 화학 물질 및 재료에 대하여 하기 약어를 사용한다:
HCOOH: 포름산
EtOH: 에탄올
AcOH: 아세트산
ODDMS: 옥타데실디메틸 치환 실리카 입자(ODDMS 실리카)
실시예 1-68, 70-71, 73-74 및 76에 사용된 포름산은 98-100%의 명시된 순도를 가지며(제조자에 따름), 실시예 72에 사용된 포름산은 순도가 99.9%이다.
약어 CV는 크로마토그래피 분야에 알려진 바와 같이 컬럼 부피를 의미한다.
실시예 1-68
실시예 1-68의 실험의 전체 셋업은 다음과 같았다:
1) 압력 문제가 없는 컬럼(새로운 비사용 컬럼)의 후압 및 밸리 높이 결정.
2) 압력 및 성능 문제의 도입
3) 압력 문제가 있는 컬럼의 후압 및 밸리 높이의 결정
4) 컬럼의 재생
5) 재생 후 컬럼의 후압 및 밸리 높이의 결정
후압 및 밸리 높이의 결정
동일 유형의 실리카 겔을 이 섹션에서 언급된 모든 실험에 사용하였다. 실리카 겔은 ODDMS 200 Å, 15 ㎛ 실리카 겔이다. 대부분, 동일한 겔 뱃치(뱃치 번호 205144)를 사용하였다(모든 컬럼은 874-로 출발함).
실리카 겔을 10 mm x 250 mm 강 컬럼에 패킹하고, 테스트 물질로서 DesB30 인슐린을 사용하고, 염화칼슘 및 염화칼륨 염을 함유하는 물-에탄올 혼합물로 용출하여 기능성 테스트에서 테스트하였다(표 1 참조). 용출 하의 후압 및 DesB30 인슐린과 최근접 불순물(인슐린 피크 앞에서) 간의 밸리 높이를, 컬럼이 얼마나 그 성능을 잘 회복하였는 지에 대한 테스트 매개변수로서 사용하였다.
DesB30 인슐린의 용출 시간은 온도 및 다른 실험 매개변수의 작은 변동으로 인하여 약간의 실험 변동을 받을 수 있다. DesB30 인슐린의 용출 시간이 상이한 실험에서 동일할 때, 밸리 높이는 컬럼 분리 성능의 완전한 비교 대상이다. DesB30 인슐린의 용출 시간이 실험 간에 상이할 때, 밸리 높이는 컬럼 분리 성능의 덜 좋은 측정치이다. 다른 것도 마찬가지로 체류 시간이 길수록, 밸리 높이는 더 낮을 것이다.
[표 1]
기능성 테스트에 사용된 용액
입구 완충제 종류 함량(w/w)
A11 1 평형 완충제 20% 에탄올
A12 2 용출 완충제 A 25% 에탄올, 1.5% KCl, 0.4% CaCl2 및 0.15% 트리에탄올 아민(pH 7.4, HCl)
B1 3 용출 완충제 B 35% 에탄올, 1.5% KCl, 0.4% CaCl2 및 0.15% 트리에탄올 아민(pH 7.4, HCl)
A13 4 재생 완충제 70% 에탄올 및 6.9% 아세트산
A18 적용 DesB30 인슐린 Na2EDTA 용액, pH 7.5, 에탄올
기능성 테스트는 23 ± 2℃에서 Aktaexplorer 100A 상에서 제어 소프트웨어로서 Unicorn 4.0을 사용하고, 하기 컬럼 사이클을 실행하여 수행하였다(표 2 참 조):
[표 2]
기능성 테스트에서의 컬럼 사이클(CV는 컬럼 부피임)
작용 CV(no.) 부피(㎖)
평형 3 58.9
로딩 0.8 15
세척 1 1 19.6
용출 10 196.3
세척 2 0.5 9.8
세정 2 39.3
실리카 겔(뱃치 205144)로 충전된 컬럼를 테스트하고, 후압을 3.4 ± 0.1 MPa로 측정하였다. 유사하게, 후압은 압력 문제가 도입되기 전에 다른 컬럼에 대해 결정하였다. 실험은, 이러한 값이 처리 후 회복될 때 컬럼은 그 성능을 회복한다는 것을 보여준다.
또한, 밸리 높이는 압력 및 성능 문제의 도입 전후, 그리고 컬럼의 재생 후에 개별 컬럼에 대해 측정하였다.
압력 및 성능 문제의 도입:
압력 및 성능 문제는 세 가지 방식 중 하나로 도입하였다:
1) 컬럼을 기능성 테스트하는 데 사용하였지만, 로딩 후에 시스템에서 제거하고, 70℃에서 1 내지 16 시간 동안 놓았다. 그 후, 나머지 기능성 테스트를 수행하면서 후압 및 밸리 높이를 측정하였다.
2) ODDMS 실리카 겔(25 g)을, DesB30 인슐린(0.14 g), 0.1 M 트리스 완충제(22 ㎖) 및 에탄올(15 ㎖)을 가진 비이커 중에서 50℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 그 후, 겔을 경사 분리하고, 강 컬럼(10 mm x 250 mm)에 패킹하였다. 후압 및 밸리 높이는 기능성 테스트를 수행하면서 측정하였다.
이 방법도 저온에서 수행할 수 있지만, 더 긴 반응 시간을 요한다.
3) 1) 및 2)의 조합. 먼저, 겔을 2)에서와 같이, 그러나 패킹 후에 처리하여고, 컬럼을 1)에서와 같이 테스트하였다.
개별 컬럼에 사용된 방법은 하기 표 4에 열거한다.
컬럼의 재생(즉, 압력 및 성능 문재의 제거):
컬럼의 재생도 Aktaexplorer 100A 상에서 수행하였다. 이 방법에 대한 컬럼 사이클은 하기 표 3에서 찾아볼 수 있다. 재생 후, 컬럼을 다시 기능성 테스트하고, 후압을 결정하였다.
[표 3]
재생 하의 컬럼 사이클
작용 용매 CV(no.) 부피(㎖)
세척 1 EtOH 3 58.9
재생 표 4 및 5 참조 2 39.3
방치 - 0 30 분
재생 표 4 및 5 참조 2 39.3
세척 2 EtOH 3 58.9
상이한 용매를 22℃ 및 40℃에서 테스트하였다(전체 HPLC 시스템은 선택된 온도 ± 1℃에서 냉장고에 넣었다). 개별 컬럼에 대한 특정 조건은 표 4에 나타내고, 기능성 테스트로부터의 결과를 표 5에 나타낸다.
개별 컬럼에 대한 특정 실험 조건:
[표 4]
개별 컬럼에 대한 실험 조건
Figure 112005056743510-pct00001
Figure 112005056743510-pct00002
Figure 112005056743510-pct00003
개별 컬럼에 대한 기능성 테스트 결과:
[표 5]
문제 도입 전후 및 표 4에 열거된 조건에 따른 컬럼의 재생 후 수행된 기능성 테스트로부터의 후압 및 밸리 높이 결과.
RT는 DesB30 인슐린에 대한 체류 시간이고, 밸리 높이(HV)는 DesB30 인슐린 및 최근접 불순물에 대한 것이다.
Figure 112005056743510-pct00004
Figure 112005056743510-pct00005
Figure 112005056743510-pct00006
실시예 69
컬럼 수명 - 크로마토그래피 용매/용출액
치환 실리카 겔의 수명 시간은 크로마토그래피 컬럼에 적용된 용액, 예를 들면 완충제 및 재생 용액에 의하여 겔의 화학 분해에 의해 제한될 수 있다. 치환 실리카 겔의 화학 분해는 컬럼으로부터의 출구에서 규소의 출현에 의하거나, 치환 손실을 나타내는 겔의 탄소 함량의 저하에 의하여 관찰될 수 있다. 하기 실험은 세 가지 크로마토그래피 용액: 물 중의 20% 에탄올, 용출액 1 및 용출액 2로 장기간 플러싱하는 중의 컬럼 유출물 내 규소 출현 및 겔의 탄소 함량 감소를 보여준다. 용출액 2의 조성은 31% w/w 에탄올, 1.5% w/w KCl, 0.40% w/w CaCl2, 0.15% w/w 트리에탄올 아민이고, pH는 HCl을 사용하여 pH 7.4로 조정하였다. 용출액 1의 조성은 염, 완충제, 에탄올 및 pH 3.0이다.
ODDMS 실리카 겔의 뱃치는 크로마토그래피 컬럼을 패킹하는 표준 절차에 의하여 5 개의 4.0 x 250 mm에 패킹하였다. 그 다음, 컬럼은 크로마토그래피 용출액 으로 연속 플러싱을 개시하기 전에 3 CV의 에탄올로 평형화하였다. 그 다음, 5 개의 컬럼을 각각 1, 3, 7, 12 및 16 일 동안 크로마토그래피 용출액(20% EtOH, 용출액 1 또는 용출액 2)으로 플러싱하였다. 그 다음, 적당한 플러싱 시간 후, 각각의 컬럼을 3 CV 에탄올로 평형화하고, 실리카 겔을 컬럼에서 제거하였다. 소모된 실리카 겔의 샘플을 탄소 함량에 대해 분석하고, 소모된 재생 용액의 샘플을 규소 함량에 대해 분석하였다. 0 일째의 결과는 컬럼을 패킹하는 데 사용된 실리카 겔의 결과(탄소 함량)이다.
[표 6]
잔류 탄소 및 방출된 규소의 측정에 의한 통상의 크로마토그래피 용출물로 장기간 플러싱 중의 컬럼 수명 평가
Figure 112005056743510-pct00007
실시예 70
컬럼 수명 - 포름산을 포함하는 재생 용액
치환 실리카 겔의 수명은 크로마토그래피 컬럼에 적용된 용액, 예를 들면 완충제 및 재생 용액에 의한 겔의 화학 분해에 의해 제한될 수 있다. 치환 실리카 겔 의 화학 분해는 컬럼으로부터의 출구에서 규소의 출현에 의하거나, 치환 손실을 나타내는 겔의 탄소 함량의 저하에 의하여 관찰될 수 있다. 하기 실험은 포름산 함유 재생 용액으로 장기간 플러싱하는 중의 컬럼 유출물 내 규소 출현 및 겔의 탄소 함량 감소를 보여준다. 따라서, 크로마토그래피 완충제 또는 용매를 사용하는 경우와 비교하면, 포름산 함유 재생 용액은 컬럼 매트릭스 상에서 더 열화되지 않았다.
ODDMS 실리카 겔의 뱃치는 크로마토그래피 컬럼을 패킹하는 표준 절차에 의하여 5 개의 4.0 x 250 mm에 패킹하였다. 그 다음, 컬럼은 포름산으로 연속 플러싱을 개시하기 전에 3 CV 100% 에탄올로 평형화하였다. 그 다음, 5 개의 컬럼을 각각 1, 3, 7, 12 및 16 일 동안 포름산(100% 또는 80%)인 재생 용액으로 플러싱하였다. 그 다음, 적당한 플러싱 시간 후, 각각의 컬럼을 3 CV 에탄올로 평형화하고, 실리카 겔을 컬럼에서 제거하였다. 소모된 실리카 겔의 샘플을 탄소 함량에 대해 분석하고, 소모된 재생 용액의 샘플을 규소 함량에 대해 분석하였다. 0 일째의 결과는 컬럼을 패킹하는 데 사용된 실리카 겔의 결과(탄소 함량)이다.
[표 7]
잔류 탄소 및 방출된 규소의 측정에 의한 포름산을 함유하는 용액으로 장기간 플러싱 중의 컬럼 수명 평가
Figure 112005056743510-pct00008
실시예 71
소스 30Q 음이온 교환기 상의 인슐린 원섬유를 검출하는 공초점 레이저 주사 현미경 사용
목적
공초점 레이저 주사 현미경을 사용하는 목적은 상이한 재생 용액이 소스 30Q로부터 인슐린 원섬유를 얼마나 효과적으로 제거하는 지를 육안 결정하는 것이다. 각각의 사진 상의 인슐린 원섬유 면적을 측정할 수 있는 정교한 이미지 가공 소프트웨어를 사용하면, 각각의 사진의 육안 판단 대신에 보다 정확한 판단을 얻을 수 있다.
공초점 원리
CLSM을 사용하는 원리는 샘플이 형광 염료로 염색되는 것이다. 염색된 샘플을 현미경 아래에 놓고, 형광 염료를 레이저를 사용하여 여기시킨다. 형광 염료로부터 나오는 방출광을 검출하여 이미지를 형성한다. 공초점 레이저 주사 현미경은 광원으로서 레이저를 사용하는 정상 공초점 현미경이다. 레이저로부터의 광은 이색성 빔스플리터를 경유하여 현미경의 대상물을 통하여 나간다. 이색성 빔스플리터는 레이저로부터의 광이 샘플 아래의 대상물을 통하여 나가고, 샘플로부터 나오는 방출광이 이색성 빔스플리터를 통과하여 광전자 배증관까지 나가서 광이 검출되어 이미지가 형성되는 장치이다. 공초점 핀홀은 이색성 빔스플리터와 광전자 배증관 사이에 배치된다. 공초점 핀홀은 광전자 배증관에 도달하는 초점 영역 밖으로부터 나오는 모든 광을 정지시키는 필터로서 작용한다. 이는 형성되는 이미지가 매우 좁은 초점면으로부터 나온다는 것을 의미한다. 공초점 핀홀을 조절함으로써 이미지 초점면을 샘플을 통하여 위 아래로 이동시키고, 현미경의 광학 (z) 축을 따라 일련의 이미지를 생성할 수 있다. 이 일련의 이미지는 샘플의 3D 이미지로 수집될 수 있다.
소스 30Q
소스 30Q는 입도가 30 미크론인 단분산 비드에 기초한 강음이온 교환기이다. 매트릭스는 폴리스티렌/디비닐 벤젠으로 구성된다. 소스 30Q는 650 nm 이상의 파장 영역에서 약한 자가형광을 제공한다. 이는 염색하지 않고 소스 30Q 입자를 볼 수 있다는 것을 의미한다.
티오플라빈 T
인슐린 원섬유를 염색하는 데 사용되는 염료는 아밀로이드 단백질 염색에 알려진 티오플라빈 T이다. 티오플라빈 T는 최대 방출 범위가 490 nm 이하 및 530 nm 이상인 넓은 방출 스펙트럼을 가진다. 이는 인슐린 원섬유에서 나오는 광(녹색)과 입자에서 나오는 자가형광(적색)을 구별할 수 있다는 것을 의미한다.
소스 30Q 상에서 인슐린 원섬유를 염색하는 방법
0.0385 g 건조 소스 30Q를 25 내지 30 ㎖ 유리병에 넣는다.
500 ㎕ 96% 에탄올을 소스 30Q에 가한다.
NaOH로 pH 3으로 조절된 4.5 ㎖ 0.05 M 아세트산을 가한다.
혼합물은 유리병을 신중하게 진탕함으로써 함께 혼합한다.
Milli-Q-물 중의 20 ㎕ 116.62 mM 티오플라빈 T를 가한다.
혼합물을 5 분 동안 신중하게 진탕한다.
샘플은 이제 염색되며, 현미경 분석할 준비한다.
대략 40 ㎕의 혼합물의 소적을 현미경 웰에 넣고, 현미경에 놓는다.
웰의 상이한 위치로부터 각각의 샘플의 2D 사진을 10장 찍는다.
장치
현미경 조건
대상물: 40*; 오일; NA?
레이저: 아르곤 488 nm
레이저 강도: 100%
공초점 핀홀: 20 ㎛
방출 필터(No 2): 크로마사의 515/30 M
방출 필터(No 3): 크로마사의 HQ650LP
현미경: 니콘사의 PCM2000 공초점 스캔 헤드(광전자 배증판)를 장착한 니콘 TE300
소프트웨어: 니콘 EZ2000 뷰어 2.5.77
이미지 가공에 사용된 소프트웨어: AnalySIS 3.00
이미지 가공
인슐린 원섬유의 면적은 각 샘플로부터의 10장의 2D 사진 상에서 측정하였다. 각각의 샘플이 정확히 동일한 방식으로 처리되도록 하기 위하여 이미지 가공은 매크로를 형성함으로써 자동적으로 수행하였다. 매크로는 아래에 나타낸다. 각 샘플의 10 장의 사진으로부터 각 개별 원섬유의 면적은 엑셀 워크시트에 요약하엿다. 각 샘플로부터의 요약된 피브릴 면적은 비교용 바 차트에 모았다.
원섬유 면적 측정을 위한 매크로:
Figure 112005056743510-pct00009
[표 8]
상이한 재생 용액을 사용하는 겔의 재생 전후의 소모된 소스 30Q 상의 원섬유의 측정된 면적
재생 용액 원섬유 면적(랜덤 유닛)
없음 485
없음 458
NaOAc(0.25% w/w NaOAc, 0.24% w/w 트리스,
42.5% w/w EtOH, pH 7.5		 154
NaOH(1 M) 101
HCOOH:물(50:50) 68
HCOOH(100%) 0
HCOOH:EtOH(50:50) 0
인슐린 원섬유의 완전 제거는 순수 포름산 또는 포름산과 에탄올의 혼합물을 사용하여 얻어진다. 포름산:물의 50:50 혼합물은 원섬유를 완전하게 제거하지 못하 지만, 이 혼합물은 수산화나트륨(1 M)보다 더 효율적인 재생 용액이다.
실시예 72
포름산을 이용한 RP-HPLC 컬럼 재생의 생산 규모 표준 절차
후술되는 절차는 사람 인슐린의 생산 규모 정제에서 4 개의 크로마토그래피 정제 단계에 사용된 2 종의 컬럼에 적용된다.
타입 1 컬럼:
베드 높이 32.5 cm
1. 컬럼은 완충제 염을 제거하기 위하여 4.6 CV/시간의 유속으로 물 중의 대략 1.5 CV 20% w/w 에탄올로 플러싱한다.
2. 컬럼 내 유동 방향을 반전한다.
3. 컬럼을 4.5 CV/시간의 유속으로 대략 1.1 CV 무수 에탄올로 플러싱한다.
4. 1.1 CV 순수 포름산을 2.1 CV/시간의 유속으로 컬럼으로 펌핑한다.
5. 유동을 중지하고, 컬럼을 포름산으로 30 분 동안 유지시킨다.
6. 컬럼을 4.5 CV/시간의 유속으로 대략 1.1 CV 무수 에탄올로 플러싱한다.
7. 컬럼을 4.5 CV/시간의 유속으로 물 중의 대략 1.1 CV 20% 에탄올로 플러싱한다.
8. 컬럼 내 유동 방향을 정상으로 다시 전환한다.
9. 컬럼을 4.6 CV/시간의 유속으로 물 중의 최소 4 CV의 20% w/w 에탄올로 평형화한다.
컬럼을 다시 사용할 수 있다.
타입 2 컬럼:
베드 높이 37.5 cm
1. 컬럼은 완충제 염을 제거하기 위하여 4.6 CV/시간의 유속으로 물 중의 대략 1.5 CV 20% w/w 에탄올로 플러싱한다.
2. 컬럼 내 유동 방향을 반전한다.
3. 컬럼을 3.9 CV/시간의 유속으로 대략 1.0 CV 무수 에탄올로 플러싱한다.
4. 0.92 CV 순수 포름산을 1.9 CV/시간의 유속으로 컬럼으로 펌핑한다.
5. 유동을 중지하고, 컬럼을 포름산으로 30 분 동안 유지시킨다.
6. 컬럼을 3.9 CV/시간의 유속으로 대략 1.0 CV 무수 에탄올로 플러싱한다.
7. 컬럼을 3.9 CV/시간의 유속으로 물 중의 대략 1.0 CV 20% 에탄올로 플러싱한다.
8. 컬럼 내 유동 방향을 정상으로 다시 전환한다.
9. 컬럼을 4.6 CV/시간의 유속으로 물 중의 최소 4.0 CV의 20% w/w 에탄올로 평형화한다.
컬럼을 다시 사용할 수 있다.
타입 1 컬럼 상에서, 포름산을 이용한 재생은, 컬럼 후압을 증가시키고 풀 부피를 증가시키는, 성분의 누적을 중지하기 위한 보존 조치로서 매 16번째 실행 후 수행하였다. 크로마토그래피 정제 I 단계에서 포름산을 이용한 재생 과정을 적용함으로써 컬럼 베드의 수명은 2000 실행까지 연장된다.
타입 2 컬럼 상에서, 포름산을 이용한 재생은 매 60번째 실행 후에, 또는 후 압 증가, 풀 부피 증가 및 불순물의 누적이 관찰된다면 일상적으로 수행하였다. 포름산을 이용한 재생 과정을 적용함으로써 컬럼 베드의 수명은 크로마토그래피 정제 III 단계에서 600 실행까지, 크로마토그래피 정제 IV 단계에서 900 실행까지 연장된다.
크로마토그래피 정제 I, III 및 IV 단계에서 사용된 컬럼 매트릭스는 옥타데실디메틸 치환 실리카 입자(ODDMS 실리카)로 구성된다. 기재된 표준 절차는 생산 규모로 사용된 모든 종류의 치환 실리카 매트릭스에 적용된다.
또한, 절차는 소스 Q 물질에 기초한 컬럼 매트릭스에 대한 포름산 재생 절차에 사용된다.
크로마토그래피 정제 III 및 IV에서의 효과의 예는 아래에 나타낸다.
[표 9]
크로마토그래피 정제 III: 풀 부피 및 후압에 대한 효과
포름산(100%)으로 재생하기 전
풀 부피(중량) 후압(전달 펌프에 대한 최대 압력)
208 kg 27 Bar
포름산(100%)으로 재생한 후
풀부피 후압(전달 펌프에 대한 최대 압력)
165 kg 17 Bar
재생은 풀 부피를 대략 21%, 후압을 37% 감소시킨다.
도 4a-b는 크로마토그래피 정제 III를 위한 정제용 크로마토그램에 대한 재생 효과를 보여준다.
포름산 재생을 적용함으로써 개선된 분리 및 사람 인슐린 피크 형태가가 달 성된다(인슐린 피크는 상부 도면에서 시간 8.20, 하부 도면에서 시간 14.02에서 출발하는 큰 피크이다).
실시예 73
DEAE 세파로스의 재생
사람 성장 호르몬의 정제 공정에서 다수의 정제 사이클에 사용되고 있는 DEAE 세파로스의 뱃치는 순수 포름산(100% HCOOH)에 의해 재생하였다. 재생 전, 세파로스는 갈색을 띠는데, 이는 겔 상에 물질이 침착되었음을 가리킨다. 재생된 세파로스는 색이 훨씬 더 밝다. 재생된 세파로스의 샘플을 색차를 정량하기 위하여 색도계(Minolta CR-300)를 사용하여 재생 전 세파로스와 비교하였으며, 결과를 표 10에 나타낸다.
[표 10]
포름산의 재생 용액으로 슬러리로서 재생하였을 때 DEAE 세파로스의 재생 평가
분석된 세파로스 물질
 색 좌표
L(밝기) A(적색) b(황색)
재생 전 소모된 겔 68.81 2.37 17.22
3 시간 재생 후 소모된 겔 84.99 0.66 11.55
24 시간 재생 후 소모된 겔 87.94 0.35 7.64
새로운 재생 용액이 12 시간째에 적용된, 24 시간 재생 후 소모된 겔 85.85 0.69 8.81
크로마토그래피에 사용되지 않은 비소모 겔 86.44 -0.06 2.01
실시예 74
글루카곤 응집물을 함유하는 소모된 실리카 겔의 재생
글루카곤 및 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1 및 GLP-2)는 이들이 원섬유, 즉 β-시트 구조의 응집물을 형성할 때 특히 응집되기 쉽다. 이 실시예에서, 모델 실험을 수행하였는데, 사람 글루카곤을 실리카 컬럼에 로딩하였다(실시예 1 내지 68에 기재된 바와 같음). 글루카곤 용액을 컬럼 내에서 3 일 동안 30℃에서 방치하여 글루카곤의 공업적 제조 중에 대면하게 되는 문제와 유사한 압력 및 성능 문제를 도입하였다. 컬럼 상의 압력은 실시예 69에 기재된 바와 같은 용출액 2를 22℃에서 9 ㎖/분의 유속으로 사용하여 3.5 MPa로 측정되었다.
포름산(100%)을 사용한 재생 사이클 후, 컬럼 상의 압력은 2.67 MPa로 감소되었는데, 이는 재생 용액으로서 포름산의 효율을 설명해준다.
실시예 75
컬럼 수명 - 0.1 M NaOH 및 물 중의 60% w/w 에탄올을 함유하는 재생 용액.
실험은 실시예 70에 기재된 바와 같이 수행하였으나, 다만 이 실험에서의 재생 용액은 크로마토그래피 고정상을 재생하는 데 통용되는 알칼리성 에탄올이었다.
재생 용액의 유량은 대략 0.1 ㎖/분이었고, 실험은 컬럼 상의 압력이 >10 MPa였을 때 종결하였다. 컬럼이 붕괴될 때까지의 결과는 표 11에 나타낸다.
[표 11]
0.1 M NaOH 및 물 중의 60% w/w 에탄올을 함유하는 재생 용액으로 장기간 재생하는 중의 컬럼 수명의 평가
컬럼 종류 컬럼
번호		 기간
(일)		 측정치 C
(%)		 측정치 Si
(%)		 부피
(㎖)		 상대 C
(%)
200Å ODDMS
4.0 * 250
mm
 0 0 9.80 0.0 0 100
204630/26 1 9.80 16.2 116 100
204630/25 2 9.77 27.0 180 99.7
204630/24 4 9.59 31.9 228 97.9
실시예 76
XAD 1180의 재생
맑은 발효 육즙으로부터의 인슐린 전구체를 농축하는 데 사용되는 역상 중합체 수지 XAD 1180의 수명은 발효로부터의 착색 화합물, 펩티드 및 소포제와 같은 소수성 오염물의 심각한 퇴적으로 인하여 제한되었다. 정상적인 재생 사이클은 0.1 M 시트르산, pH 3.0 중의 80% 에탄올을 함유하는 재생 용액으로 세척한 후, 5% NaOH로 80℃로 가열하는 것에 기초하였다. 이 재생 공정은 퇴적된 오염물을 제거하는 데 효율적이지 못하였다.
소모된 수지로부터의 결합된 소포제(Pluronic PE 6100 및 P2000)의 제거는 정적 모드에서 에탄올 및 이소프로판올의 상이한 농도 및 접촉 시간을 이용한 실험에 의해 평가하고, 포름산 재생과 비교하였다(표 12). 포름산 처리는 표준 공업용 재생 용매와 비교하였을 때 흡착된 오염물 제거에 더 우수하다.
[표 12]
소모된 XAD 1180 크로마토그래피 고정상으로부터의 흡착된 소포제 오염물 제거에서의 상이한 재생 용액의 효율
재생 용매 농도 시간(hr) 온도(℃) 수지 상의
소포제 농도(ppm)
에탄올 84% 2 25 20023
에탄올 92% 2 25 13058
에탄올 99% 2 25 8042
에탄올 84% 6 25 25083
에탄올 84% 2 50 14712
에탄올 99% 6 50 9911
이소프로판올 70% 2 25 15899
이소프로판올 99% 2 25 3262
포름산 99% 2 25 670

Claims (64)

  1. 크로마토그래피 고정상을 1 종 이상의 유기산 및 75% w/w 미만의 물을 포함하는 재생 용액과 접촉시키는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법으로서, 상기 유기산은 포름산인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법.
  2. 크로마토그래피 고정상을 1 종 이상의 유기산 및 1% w/w 미만의 물을 포함하는 재생 용액과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 고정상의 재생 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기산의 농도는 25% w/w 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기산은 아세트산인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재생 용액은 유기 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 유기 용매는 2-프로판올인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 유기 용매는 메탄올, 1-프로판올 및 헥실렌 글리콜로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재생 용액은 0.5% 미만의 물을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재생 용액은 0.1% 미만의 물을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재생 용액은 0.02% 미만의 물을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재생 용액은 0.001% 미만의 물을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 크로마토그래피 컬럼 내부에서 상기 재생 용액과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 컬럼을 재패킹하지 않고 재생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 상기 재생 중에 유동화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 크로마토그래피 용출액 또는 평형 완충제는 상기 크로마토그래피 고정상이 상기 재생 용액과 접촉하기 전에 수혼화성 유기 용매로 대체되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 유기 용매는 크로마토그래피 용출액 또는 평형 완충제에도 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 수혼화성 유기 용매는 재생 용액에도 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 크로마토그래피 컬럼 외부에서 상기 재생 용액과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 RP-HPLC 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 실리카 또는 치환 실리카 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 C16 또는 C18 치환 실리카인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 C4, C8 또는 페닐-치환 실리카인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 중합체 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 상기 재생 용액과 1 초 이상 동안 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 상기 재생 용액과 1 분 이상 동안 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 상기 재생 용액과 5 분 이상 동안 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 상기 재생 용액과 2 시간 이상 동안 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 상기 재생 용액과 10 분 내지 60 분 동안 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 정상 유속에서 크로마토그래피 컬럼의 길이 상에서 압력 강하가 10% 이상 감소될 때까지 상기 재생 용액과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 정상 유속에서 크로마토그래피 컬럼의 길이 상에서 압력 강하가 25% 이상 감소될 때까지 상기 재생 용액과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 정상 유속에서 크로마토그래피 컬럼의 길이 상에서 압력 강하가 50% 이상 감소될 때까지 상기 재생 용액과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상과 상기 재생 용액의 접촉은 5℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상과 상기 재생 용액의 접촉은 10℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상과 상기 재생 용액의 접촉은 15℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상과 상기 재생 용액의 접촉은 18℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상의 수명은 500 이상의 크로마토그래피 사이클인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상의 수명은 700 이상의 크로마토그래피 사이클인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상의 수명은 1000 이상의 크로마토그래피 사이클인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상의 수명은 2000 이상의 크로마토그래피 사이클인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 크로마토그래피 사이클마다, 2 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상 동안 상기 크로마토그래피 고정상에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 크로마토그래피 사이클마다, 5 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상 동안 상기 크로마토그래피 고정상에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 크로마토그래피 사이클마다, 20 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상 동안 상기 크로마토그래피 고정상에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 크로마토그래피 사이클마다, 50 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상 동안 상기 크로마토그래피 고정상에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 크로마토그래피 사이클마다, 100 크로마토그래피 사이클마다 1 회 이상 동안 상기 크로마토그래피 고정상에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 크로마토그래피 고정상이 제1항 또는 제2항의 재생 방법에 의해 재생되는 1 이상의 크로마토그래피 단계를 포함하는, 치료용 폴리펩티드 또는 그것의 전구체의 제조 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 치료용 폴리펩티드는 친지성 치환기를 포함하는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 치료용 폴리펩티드는 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1, 글루카곤 유사 펩티드 2, 엑센딘-4, TFF 펩티드, 사람 인슐린, 이들의 유사체 및 이들의 유도체로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 그것의 전구체는 Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-헥사데칸오일)))-GLP-1(7-37), Arg34-GLP-1(7-37), 엑센딘-4, Lys17Arg30-GLP-2(1-33), Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-헥사데칸오일))GLP-2(1-33) 및 Gly2-GLP-2(1-33)으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제47항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 그것의 전구체는
    트레오닌 메틸 에스테르B30 사람 인슐린,
    트레오닌 에틸 에스테르B30 사람 인슐린,
    AspB28 사람 인슐린,
    트레오닌 메틸 에스테르B30AspB28 사람 인슐린,
    트레오닌 에틸 에스테르B30AspB28 사람 인슐린,
    LysB28ProB29 사람 인슐린,
    MetB-1ArgB0LysB28ProB29 사람 인슐린,
    LysB3GluB29 사람 인슐린,
    GlyA21ArgB31ArgB32 사람 인슐린,
    des(B30) 사람 인슐린,
    NεB29-테트라데칸오일 des(B30) 사람 인슐린,
    NεB29-리토콜로일-γ-글루타밀 des(B30) 사람 인슐린,
    NεB29-옥탄오일 des(B30) 사람 인슐린 및
    NεB29-옥탄오일 사람 인슐린
    으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 크로마토그래피 고정상을 재생 용액과 접촉시킴으로써 재생된 크로마토그래피 고정상으로서, 상기 재생 용액은 1 종 이상의 유기산 및 1% w/w 미만의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 고정상.
  53. 크로마토그래피 고정상을 재생 용액과 접촉시킴으로써 재생된 크로마토그래피 고정상으로서, 상기 재생 용액은 1 종 이상의 유기산 및 75% w/w 미만의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 고정상.
  54. 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 재생되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 고정상.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 크로마토그래피 고정상은 실리카 또는 치환 실리카 물질인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 고정상.
  56. a) 제52항 또는 제53항의 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계, 및
    b) 상기 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 단리하여 생성된 폴리펩티드 생성물을 제공하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 생성물.
  57. 제52항 또는 제53항의 크로마토그래피 고정상을 사용하는 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 생성물.
  58. 제1항의 방법을 수행하는 파이프 및 제어 시스템을 포함하는 자동화 크로마토그래피 장치.
  59. a) 먼저, 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계,
    b) 그 다음, 상기 폴리펩티드를 건조시키는 단계, 및
    c) 최종적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조된 약학 조성물.
  60. a) 먼저, 제1항의 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계,
    b) 그 다음, 상기 폴리펩티드를 건조시키는 단계, 및
    c) 최종적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조된 약학 조성물.
  61. a) 먼저, 제10항의 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계,
    b) 그 다음, 상기 폴리펩티드를 건조시키는 단계, 및
    c) 최종적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조된 약학 조성물.
  62. a) 먼저, 제11항의 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계,
    b) 그 다음, 상기 폴리펩티드를 건조시키는 단계, 및
    c) 최종적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조된 약학 조성물.
  63. a) 먼저, 제12항의 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계,
    b) 그 다음, 상기 폴리펩티드를 건조시키는 단계, 및
    c) 최종적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조된 약학 조성물.
  64. a) 먼저, 제13항의 방법에 의해 재생된 크로마토그래피 고정상을 사용하여 폴리펩티드 또는 그것의 전구체를 정제하는 단계,
    b) 그 다음, 상기 폴리펩티드를 건조시키는 단계, 및
    c) 최종적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조된 약학 조성물.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007121271A (ja) * 2005-09-30 2007-05-17 National Institute Of Advanced Industrial & Technology ８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの測定方法及び測定のための装置
WO2010066676A1 (en) * 2008-12-09 2010-06-17 Upfront Chromatography A/S Method of removal of unbound, entrained and/or non-specifically adsorbed material from an affinity chromatography column
SG177319A1 (en) * 2009-06-24 2012-02-28 Hoffmann La Roche Characterization of re-useable chromatography equipment
MX363522B (es) 2013-03-21 2019-03-26 Sanofi Aventis Deutschland Síntesis de productos peptídicos que contienen hidantoína.
ES2624961T3 (es) 2013-03-21 2017-07-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Síntesis de productos de péptido que contienen imida cíclica
MX2016002798A (es) * 2013-09-05 2016-07-21 Genentech Inc Metodo para reutilizacion de cromatografia.
CN105424839A (zh) * 2015-12-15 2016-03-23 袁泳 高效液相色谱仪中反相填料柱的再生方法
CN105964606B (zh) * 2016-04-22 2018-07-10 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 延长色谱柱使用寿命的清洗方法
CN109011698B (zh) * 2018-08-25 2020-12-01 江苏曼氏生物科技股份有限公司 一种硅胶填料分离柱在线清洗及储存方法
CN112933660A (zh) * 2020-09-11 2021-06-11 石家庄新奥环保科技有限公司 一种离子色谱保护柱再生方法
CN112843789A (zh) * 2020-12-29 2021-05-28 上海赛梵科分离技术有限公司 大麻二酚纯化中色谱填料和层析介质的再生方法
US20240116029A1 (en) * 2021-02-02 2024-04-11 Biocon Biologies Limied A process for the regeneration of silica based reverse phase chromatography material
WO2022236085A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Genzyme Corporation Composition and methods for sanitization

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10221323A (ja) * 1997-02-10 1998-08-21 Teijin Ltd 吸着カラムの連続使用方法及び装置
US20030006191A1 (en) * 2001-05-09 2003-01-09 Danisco Sweeteners Oy Chromatographic separation method

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4164481A (en) * 1978-01-27 1979-08-14 The Dow Chemical Company Process of regenerating a noble metal catalyst used in the reduction of organic nitro compounds
SU1270689A1 (ru) 1984-12-17 1986-11-15 Предприятие П/Я В-8644 Способ регенерации хроматографической колонки
EP0235205B1 (en) 1985-08-22 1992-10-28 Gropep Pty. Ltd. Peptide analogues of mammalian insulin-like growth factor-1
CA2028848A1 (en) 1989-04-11 1990-10-12 Tapan Audhya Lyophilized peptide formulations
DE4028120C2 (de) * 1990-09-05 1996-09-19 Hoechst Ag Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten
US5837826A (en) * 1995-02-27 1998-11-17 Regents Of The University Of Minnesota Protein adsorption by very dense porous zirconium oxide particles in expanded beds
US6852690B1 (en) * 1995-08-22 2005-02-08 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Method and composition for enhanced parenteral nutrition
US6115233A (en) 1996-06-28 2000-09-05 Lsi Logic Corporation Integrated circuit device having a capacitor with the dielectric peripheral region being greater than the dielectric central region
UA65549C2 (uk) * 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
DE19652713C2 (de) * 1996-12-18 2001-11-22 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher
ATE296680T1 (de) * 1997-03-31 2005-06-15 Battelle Memorial Institute Methode zur ammoniakentfernung von abströmen
EP1061946B1 (en) 1998-02-27 2004-04-28 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives with helix-content exceeding 25 %, forming partially structured micellar-like aggregates
WO1999043361A1 (en) 1998-02-27 1999-09-02 Novo Nordisk A/S Glp-2 derivatives with helix-content exceeding 25 %, forming partially structured micellar-like aggregates
DK1140148T3 (da) 1998-12-22 2006-01-30 Lilly Co Eli Lagerholdbar formulering af glucagon-agtigt peptid-1
DE60021166T3 (de) 1999-01-14 2019-08-22 Amylin Pharmaceuticals, Llc Neue exendin agonist formulierungen und deren verabreichung
US6248683B1 (en) 1999-04-07 2001-06-19 Silicycle Inc. Process for the regeneration of used silica gel
US6329336B1 (en) * 1999-05-17 2001-12-11 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides
IL147745A0 (en) 1999-08-09 2002-08-14 Pharmacia & Upjohn Spa Formulations for parenteral use of estramustine phosphate and albumin
JP2001133446A (ja) 1999-08-20 2001-05-18 Sekisui Chem Co Ltd 液体クロマトグラフ装置及びこれに用いる洗浄液
CA2385179A1 (en) 1999-10-08 2001-04-19 David J. Hammond Isoagglutinin-depleted blood compositions and methods of making same
JP4473999B2 (ja) 2000-01-17 2010-06-02 積水化学工業株式会社 カラム洗浄液
US6550320B1 (en) * 2000-05-31 2003-04-22 Continental Ag System and method for predicting tire forces using tire deformation sensors
HUP0301246A3 (en) 2000-09-13 2005-12-28 Novo Nordisk Healthcare Ag Human coagulation factor vii variants
PL393178A1 (pl) 2000-12-07 2011-02-14 Eli Lilly And Company Heterogenne białko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna do leczenia pacjentów z cukrzycą insulino-niezależną i kompozycja farmaceutyczna do leczenia pacjentów z otyłością
CA2439455A1 (en) * 2001-02-28 2002-09-06 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Method for regenerating adsorbent
JP2002265383A (ja) 2001-03-14 2002-09-18 Mitsubishi Pharma Corp インターフェロンα注射用液状製剤
EP1412384B1 (en) 2001-06-28 2007-12-26 Novo Nordisk A/S Stable formulation of modified glp-1
CA2477739A1 (en) * 2002-02-28 2003-09-12 Mallinckrodt Inc. Method and system for separation and purification of at least one narcotic alkaloid using reverse phase preparative chromatography
AU2003239478A1 (en) 2002-06-04 2003-12-22 Eli Lilly And Company Modified glucagon-like peptide-1 analogs
WO2004024284A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Biogen Idec Inc. Method of purifying polypeptides by simulated moving bed chromatography
DE10347975B4 (de) * 2002-10-24 2008-10-09 Siemens Ag Einrichtung der programmierbaren Logik
RU2239827C1 (ru) 2003-05-12 2004-11-10 Государственный научно-исследовательский институт органической химии и технологии Восстановление аналитических и препаративных колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии (вэжх)
EP1506809A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-16 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Regeneration of hydrolysis sensitive adsorbent matrices
US7449116B2 (en) * 2004-10-01 2008-11-11 Agilent Technologies, Inc. Methods and systems for protein separation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10221323A (ja) * 1997-02-10 1998-08-21 Teijin Ltd 吸着カラムの連続使用方法及び装置
US20030006191A1 (en) * 2001-05-09 2003-01-09 Danisco Sweeteners Oy Chromatographic separation method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The Cleaning and regeneration of reversed-phase HPLC columns, LCGC Europe(2003. 01.) 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0408978B1 (pt) 2018-05-15
US9364772B2 (en) 2016-06-14
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US20080312131A1 (en) 2008-12-18
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US20060102561A1 (en) 2006-05-18

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