JP5274771B2 - クロマトグラフィー固定相の再生 - Google Patents
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Description
以下のものは、明細書中で使用された用語の詳述された定義である。
b)生成物を保有するサンプルの適用、
c)結合された生成物を含むクロマトグラフィー固定相を洗浄する任意の洗浄工程、
d)クロマトグラフィー固定相に対する生成物の親和力が減少し、前記生成物がクロマトグラフィーカラム溶出液中のカラムから離れる溶出、および
e)再生溶液を使用して残存不純物をクロマトグラフィー固定相から取り除くことを試みる任意の再生。
スレオニンエチルエステルB30ヒトインシュリン、
AspB28ヒトインシュリン、
スレオニンメチルエステルB30AspB28ヒトインシュリン、
スレオニンエチルエステルB30AspB28ヒトインシュリン、
LysB28ProB29ヒトインシュリン、
MetB-1ArgB0LysB28ProB29ヒトプロインシュリン、
LysB3GluB29ヒトインシュリン、
GlyA21ArgB31ArgB32ヒトインシュリン、
des(B30)ヒトインシュリン、
NεB29-テトラデカノイルdes(B30)ヒトインシュリン、
NεB29-リトコロイル-γ-グルタミルdes(B30)ヒトインシュリン、
NεB29-オクタノイルdes(B30)ヒトインシュリン、および
NεB29-オクタノイルヒトインシュリン。
a)本発明の再生プロセスによって生成されたクロマトグラフィー固定相を使用してポリペプチドまたはその前駆体を精製する工程と、
b)前記得られたポリペプチド生成物を与えるために前記ポリペプチドまたはその前駆体を単離する工程と
を含むプロセスによって製造されたポリペプチド生成物に関する。
a)最初に、本発明によるプロセスによって再生されたクロマトグラフィー固定相を使用してポリペプチドまたはその前駆体を精製する工程と、
b)次に、前記ポリペプチドを乾燥させる工程と、
c)最後に、薬学的に許容可能な賦形剤と混合させる工程と
を含むプロセスによって製造された薬学的組成物に関する。
a)最初に、少なくとも1つの有機酸と0.5%未満の水、好ましくは0.1%未満の水、より好ましくは0.02%未満の水、および最も好ましくは0.001%未満の水とを含む再生溶液にクロマトグラフィー固定相を接触させるプロセスによって再生されたクロマトグラフィー固定相を使用して、ポリペプチドまたはその前駆体を精製する工程と、
b)次に、前記ポリペプチドを乾燥させる工程と、
c)最後に、薬学的に許容可能な賦形剤と混合させる工程と
を含むプロセスによって製造された薬学的組成物に関する。
商業的に利用可能な化学物質および材料について以下の頭字語を使用した:
HCOOH: ギ酸
EtOH: エタノール
AcOH: 酢酸
ODDMS: オクタデシルジメチルで置換されたシリカ粒子(ODDMSシリカ)
例1〜68の実験全体の構成は以下のようにした:
1)圧力問題のないカラム(新しい未使用のカラム)の背圧および谷の高さの決定。
4)カラムの再生
5)再生後のカラムの背圧および谷の高さの決定
同じタイプのシリカゲルを、このセクションにおいて言及された全ての実験について使用した。シリカゲルは、ODDMS 200Å、15μmシリカゲルである。大部分において、同じゲルバッチ(バッチ番号205144)を使用した(全て874-で始まるカラム)。
圧力および性能問題を1〜3の方法で導入した:
1)カラムを機能性試験において使用し、70℃で1〜16時間にわたってローディングおよび静置した後、システムから取り外した。その後、背圧および谷の高さを測定し、機能性試験の残りを行った。
また、カラムの再生をAktaexplorer 100A上で行った。このプロセスについてのカラムサイクルを以下の表3で見ることができる。再生後、カラムを再び機能性試験において試験し、背圧を決定した。
表5。問題の導入前および導入後ならびに表4に列挙された条件によるカラムの再生後に行われた機能性試験の背圧および谷の高さの結果。
カラムの寿命−クロマトグラフィー溶媒/溶出液
置換されたシリカゲルの寿命は、クロマトグラフィーカラムに適用された溶液、例えばバッファーおよび再生溶液によるゲルの化学分解によって制限されるおそれがある。置換されたシリカゲルの化学分解は、カラムから出て行くケイ素の出現、または置換基の喪失を示すゲルの炭素含量の低下によって観察することができる。以下の実験は、3つのクロマトグラフィー溶液(20%エタノール水、溶出液1、および溶出液2)で長時間フラッシングしている間のカラム流出液中のケイ素の出現とゲルの炭素含量の減少を示す。溶出液2の組成物は、31重量%エタノール、1.5重量%KCl、0.40重量%CaCl2、0.15重量%トリエタノールアミンであり、pHがHClを使用してpH7.4に調整されている。溶出液1の組成物は、塩、バッファー、エタノールであり、pH3.0である。
カラムの寿命−ギ酸を含む再生溶液
置換されたシリカゲルの寿命は、クロマトグラフィーカラムに適用された溶液、例えばバッファーおよび再生溶液によるゲルの化学分解によって制限されるおそれがある。置換されたシリカゲルの化学分解は、カラムから出て行くケイ素の出現、または置換基の喪失を示すゲルの炭素含量の低下によって観察することができる。以下の実験は、ギ酸含有の再生溶液で長時間フラッシングしている間のカラム流出液中のケイ素の出現とゲルの炭素含量の減少を示す。従って、クロマトグラフィーバッファーまたは溶媒を使用する状況と比較すると、再生溶液を含むギ酸はカラムマトリックス上でこれ以上悪化させない。
共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してSource 30Qアニオン交換器上のインシュリン原繊維を検出する。
共焦点レーザー走査顕微鏡を使用する目的は、異なる再生溶媒がインシュリン原繊維をSource 30Qからいかに効率的に取り除くかを視覚的に決定することである。洗練された画像に加工するソフトウェアは、各写真上でのインシュリン原繊維の面積を測定する機会を与え、各写真の視覚的判断の代わりにより正確な判断を与える。
CLSMを使用する原理は、サンプルを蛍光色素で染色することである。染色されたサンプルを顕微鏡下に静置し、レーザーを使用して蛍光色素を励起させる。蛍光色素からくる放射光を検出し、画像を形成させる。
Source 30Qは、30ミクロンの粒子サイズをもつ単分散のビーズに基づいた強力な陰イオン交換体である。マトリックスは、ポリスチレン/ジビニルベンゼンからなる。Source 30Qは、650nmを越える波長領域で弱い自己蛍光を発する。これはあらゆる染色無しでSource 30Q粒子を見ることができることを意味する。
インシュリン原繊維を染色するために使用される色素は、アミロイドタンパク質を染色するために知られているチオフラビンTである。チオフラビンTは、490nm未満から530nmを越える範囲の最大発光をもつ広い発光スペクトルを有する。これは、インシュリン原繊維(緑色)と粒子からくる自己発光(赤色)との間を区別できることを意味する。
0.0385g乾燥Source 30Qを25〜30mlガラスに入れる。
顕微鏡の条件
対物レンズ:40*;油;NA?
レーザー:アルゴン488 nm
レーザー強度:100%
共焦点ピンホール:20μm
発光フィルター(No2):Chromaからの515/30M
発光フィルター(No3):ChromaからのHQ650LP
顕微鏡:NikonからのPCM2000共焦点走査ヘッド(光電子増倍管)を備えたNikon TE300
ソフトウェア:Nikon EZ2000 Viewer 2.5.77
イメージ加工のために使用されるソフトウェア:AnalySIS 3.00
インシュリン原繊維の面積を、各サンプルからの2D写真10枚上で測定した。各サンプルが同じ方法で正確に処理されることを保障するために、イメージ加工はマクロを形成させることによって自動的に行われた。マクロは以下に示す。各サンプルの10枚の写真からの各々個々の原繊維の面積をエクセルワークシート中に要約した。各サンプルからの要約された原繊維を比較のための棒グラフ中に集めた。
Op.Display=1;
docActivate("picture name");
DbLoadImage();
MaximizeContrast();
ShadingCorrection(N*N average filter size;3; lower limit;1900; upper limit; 2000 );
BinarizeColorImage(ColorThresholds:=NULL, Phase:=-1);
Invert();
EdgeEnhance(size; 5; percent; 70 );
SetFrame(Left:=0, Top:=0, Right:=1023, Bottom:=1023);
Detect();
ParticleResults();
Op.Display=6;
Option.BurnOverlay=TRUE;
SaveAs(FileName:);
docActivate("Sheet*");
SaveAs(FileName:);
Close(AskForSave:=TRUE);
生産規模におけるギ酸でのRP-HPLCカラムの再生のための標準的手順
ヒトインシュリンの生産規模の精製における4つのクロマトグラフィー精製工程において使用された2つのタイプのカラムに以下に記載された手順を適用する。
ベッド高さ32.5cm
1.バッファー塩を除去するために、約1.5CV 20重量%エタノール水を流速4.6CV/hでカラムに流す。
ベッド高さ37.5cm
1.バッファー塩を除去するために、約1.5CV 20重量%エタノール水を流速4.6CV/hでカラムに流す。
DEAEセファロースの再生
ヒト成長ホルモンの精製のためのプロセスにおける多数の精製サイクルが使用されるDEAEセファロースのバッチは、純粋なギ酸(100% HCOOH)によって再生された。再生前のセファロースは、ゲル上に堆積した材料を示す茶褐色を示す。再生されたセファロースは十分に明るい色であった。色の違いを数量化するために比色計(Minolta CR-300)を使用し、再生されたセファロースのサンプルを再生前のセファロースと比較した。結果を表10に示す。
グルカゴン凝集体を含む消耗したシリカゲルの再生
グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド(GLP-1およびGLP-2)は特に凝集にさらされ、原繊維、すなわちβ-シート構造の凝集体を形成する。この例において、ヒトグルカゴンをシリカカラム上にロードしたモデル実験を行った(例1〜68に記載されたように)。グルカゴン溶液を30℃で3日間にわたってカラム中に留まらせ、グルカゴンの工業生産中に直面する問題を模倣した圧力および性能問題を導入した。カラム全体の圧力は、例69に記載された溶出液2を使用して22℃で9mL/minの流速で3.5MPaで測定した。
カラムの寿命−0.1M NaOHと60重量%エタノール水とを含む再生溶液
この実験における再生溶液が、クロマトグラフィー固定相を再生するために通常使用されるアルカリ性エタノールであることを除いて、例70に記載された通りに実験を行った。
XAD 1180の再生
浄化された発酵ブロスからのインシュリン前駆体の濃縮のために使用された逆相ポリマー樹脂XAD 1180の寿命は、疎水性汚染物質、例えば発酵からの着色化合物、ペプチドおよび消泡物質の深刻な蓄積のために制限される。通常の再生サイクルは、pH3の0.1Mクエン酸中で80%エタノールを含む再生溶液での洗浄、続いて5% NaOH溶液での80℃加熱に基づいた。この再生プロセスは、蓄積された汚染物質を除去するのに効率的ではなかった。
Claims (52)
- シリカ材料、置換されたシリカ材料、Source30Q材料またはRP−HPLCマトリックスのクロマトグラフィー固定相を再生するための方法であって、前記クロマトグラフィー固定相を、少なくとも1つの有機酸と75重量%未満の水とを含む再生溶液と0℃〜70℃の範囲の温度で接触させ、前記有機酸はギ酸である方法。
- シリカ材料、置換されたシリカ材料、Source30Q材料またはRP−HPLCマトリックスのクロマトグラフィー固定相を再生するための方法であって、前記クロマトグラフィー固定相を、少なくとも1つの有機酸と1重量%未満の水とを含む再生溶液と0℃〜70℃の範囲の温度で接触させ、前記有機酸はギ酸である方法。
- 前記有機酸の濃度が、少なくとも25重量%である請求項1または2に記載の方法。
- 前記再生溶液が、有機溶媒を含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、エタノールである請求項4に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、2-プロパノールである請求項4に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、アセトニトリルである請求項4に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、メタノール、1-プロパノール、およびヘキシレングリコールからなる群から選択される請求項4に記載の方法。
- 前記再生溶液が、0.5%未満の水を含む請求項1ないし8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記再生溶液が、0.1%未満の水を含む請求項9に記載の方法。
- 前記再生溶液が、0.02%未満の水を含む請求項10に記載の方法。
- 前記再生溶液が、0.001%未満の水を含む請求項11に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、クロマトグラフィーカラム内部で前記再生溶液と接触させる請求項1ないし12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、カラムに再充填させずに再生させる請求項13に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、前記再生中に流動化させる請求項13に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を前記再生溶液と接触させる前に、クロマトグラフィー溶出液または平衡バッファーを水混和性有機溶媒で置換する請求項13ないし15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有機溶媒がまた、クロマトグラフィー溶出液または平衡バッファー中に存在する請求項16に記載の方法。
- 前記水混和性有機溶媒がまた、再生溶液中に存在する請求項16または17に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、クロマトグラフィーカラムの外側で前記再生溶液と接触させる請求項1ないし12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相が、C16またはC18で置換されたシリカである請求項19に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相が、C4、C8またはフェニルで置換されたシリカである請求項19に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、少なくとも1秒間にわたって前記再生溶液と接触させる請求項1ないし21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、少なくとも1分間にわたって前記再生溶液と接触させる請求項22に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、少なくとも5分間にわたって前記再生溶液と接触させる請求項23に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、1分間〜24時間にわたって前記再生溶液と接触させる請求項1ないし21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、1分間〜5時間にわたって前記再生溶液と接触させる請求項25に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、1分間〜2時間にわたって前記再生溶液と接触させる請求項26に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を、10分間〜60分間にわたって前記再生溶液と接触させる請求項27に記載の方法。
- 通常の流速でのクロマトグラフィーカラム全体にわたる圧力降下が少なくとも10%まで減少するまで、前記クロマトグラフィー固定相を前記再生溶液と接触させる請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。
- 通常の流速でのクロマトグラフィーカラム全体にわたる圧力降下が少なくとも25%まで減少するまで、前記クロマトグラフィー固定相を前記再生溶液と接触させる請求項29に記載の方法。
- 通常の流速でのクロマトグラフィーカラム全体にわたる圧力降下が少なくとも50%まで減少するまで、前記クロマトグラフィー固定相を前記再生溶液と接触させる請求項30に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相と前記再生溶液との接触が、5℃〜50℃の範囲の温度で行われる請求項1ないし31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相と前記再生溶液との接触が、10℃〜40℃の範囲の温度で行われる請求項32に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相と前記再生溶液との接触が、15℃〜30℃の範囲の温度で行われる請求項33に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相と前記再生溶液との接触が、18℃〜25℃の範囲の温度で行われる請求項34に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相の寿命が、少なくとも500クロマトグラフィーサイクルである請求項1ないし35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相の寿命が、少なくとも700クロマトグラフィーサイクルである請求項36に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相の寿命が、少なくとも1000クロマトグラフィーサイクルである請求項37に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相の寿命が、少なくとも2000クロマトグラフィーサイクルである請求項38に記載の方法。
- クロマトグラフィーサイクル毎に、前記方法を前記クロマトグラフィー固定相に適用する請求項1ないし39のいずれか1項に記載の方法。
- 2クロマトグラフィーサイクル毎に少なくとも1回、前記方法を前記クロマトグラフィー固定相に適用する請求項1ないし39のいずれか1項に記載の方法。
- 5クロマトグラフィーサイクル毎に少なくとも1回、前記方法を前記クロマトグラフィー固定相に適用する請求項1ないし39のいずれか1項に記載の方法。
- 20クロマトグラフィーサイクル毎に少なくとも1回、前記方法を前記クロマトグラフィー固定相に適用する請求項1ないし39のいずれか1項に記載の方法。
- 50クロマトグラフィーサイクル毎に少なくとも1回、前記方法を前記クロマトグラフィー固定相に適用する請求項1ないし39のいずれか1項に記載の方法。
- 100クロマトグラフィーサイクル毎に少なくとも1回、前記方法を前記クロマトグラフィー固定相に適用する請求項1ないし39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー固定相を請求項1ないし45のいずれか1項に記載の方法によって再生させる少なくとも1つのクロマトグラフィー工程を含む、治療用ポリペプチドまたはその前駆体を生成するための方法。
- 前記治療用ポリペプチドが、親油性置換基を含む誘導体である請求項46に記載の方法。
- 前記治療用ポリペプチドが、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1、グルカゴン様ペプチド2、エキセンジン-4、TFFペプチド、ヒトインシュリンおよびこれらの誘導体からなる群から選択される請求項46に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたはその前駆体が、Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、エキセンジン-4、Lys17Arg30-GLP-2(1-33)、Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-2(1-33)、およびGly2-GLP-2(1-33)からなる群から選択される請求項46に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたはその前駆体が、
スレオニンメチルエステルB30ヒトインシュリン、
スレオニンエチルエステルB30ヒトインシュリン、
AspB28ヒトインシュリン、
スレオニンメチルエステルB30AspB28ヒトインシュリン、
スレオニンエチルエステルB30AspB28ヒトインシュリン、
LysB28ProB29ヒトインシュリン、
MetB-1ArgB0LysB28ProB29ヒトプロインシュリン、
LysB3GluB29ヒトインシュリン、
GlyA21ArgB31ArgB32ヒトインシュリン、
des(B30)ヒトインシュリン、
NεB29-テトラデカノイルdes(B30)ヒトインシュリン、
NεB29-リトコロイル-γ-グルタミルdes(B30)ヒトインシュリン、
NεB29-オクタノイルdes(B30)ヒトインシュリン、および
NεB29-オクタノイルヒトインシュリン
からなる群から選択される請求項46に記載の方法。 - クロマトグラフィーカラム全体の圧力降下を減少させるための請求項1ないし50のいずれか1項に記載のプロセスの使用。
- 治療用ポリペプチドの製造のための請求項1ないし45のいずれか1項に記載のプロセスの使用。
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