BRPI0408978B1

BRPI0408978B1 - Processos para regenerar uma fase estacionária cromatográfica

Info

Publication number: BRPI0408978B1
Application number: BRPI0408978-2A
Authority: BR
Inventors: Larsen Per; Schou Ole; Schroder Rasmussen Eigil
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 2003-04-08
Filing date: 2004-04-02
Publication date: 2018-05-15
Also published as: CN1771080B; US20060102561A1; US9364772B2; BRPI0408978B8; US20080312131A1; KR20060015496A; KR101198346B1; BRPI0408978A; CN1771080A

Abstract

"processos para regenerar uma fase estacionária cromatográfica e para produzir um polipeptídeo terapêutico ou um precursor do mesmo, uso do mesmo, fase estacionária cromatográfica, produto de polipeptídeo, equipamento cromatográfico automatizado, e, composição farmacêutica". processo para regenerar fases estacionárias cromatográficas.

Description

“PROCESSOS PARA REGENERAR UMA FASE ESTACIONÁRIA CROMATOGRÁFICA” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito ao campo da purificação cromatográfica. Mais especificamente, diz respeito a um processo para regenerar fases estacionárias cromatográficas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os polipeptídeos estão sendo aumentadamente usados como medicamentos para o tratamento de doenças em todas as áreas principais de terapia. O tratamento do diabete pela administração crônica de insulina foi praticada por mais de 80 anos e as aplicações terapêuticas de polipeptídeos em distúrbios de desenvolvimento e câncer também foi praticado por muitos anos.

Processos econômicos para produção de polipeptídeos em escala maior com uma pureza suficientemente alta para aplicações terapêuticas são cruciais para outras terapias com base em polipeptídeo para atingir o mercado em massa e para a existência de terapias que se tome mais amplamente usadas. A purificação de um polipeptídeo a partir de uma mistura é uma etapa que é normalmente usada diversas vezes durante todo o processo de fabricação de um polipeptídeo terapêutico. A cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa (RP-HPLC) é o método preferido para a separação de alta resolução industrial de polipeptídeos e os métodos mostraram-se versáteis para a purificação de grande escala de muitos polipeptídeos.

Visto que os polipeptídeos para o uso terapêutico devem ser altamente purificados a fim de não causar eventos adversos na administração ao paciente, é muito comum usar várias etapas de purificação cromatográfica no processo de fabricação. A fase estacionária das colunas cromatográficas nas plantas de fabricação é cara e, desta maneira, são usadas por diversos ciclos cromatográficos. Entretanto, durante o tempo, o desempenho da fase estacionária cromatográfica declina, isto é, a queda de pressão na coluna aumenta proibitivamente e o fator de separação é prejudicado. Isto foi atribuído à formação gradual de depósitos. O problema foi sugerido ser superado por um processo de regeneração que compreende os tampões alcalinos (J. Chrom. 461, 1989, 45-61), por exemplo, pH 7,4 e concentração alta de modificador orgânico.

Brange et al. (J. Pharm. Sei. 86 (1997) 517 a 525) divulga a dissolução de fibrilas de insulina em ácido e em base.

Por muitos anos, o problema foi aliviado pela regeneração da fase estacionária cromatográfica com solução alcalina por exemplo, hidróxido de sódio 0,1 molar (vide Liliedahl “Twelve years of silica-based HPLC purification with focus on peptides” em Tides 2000, 10 de maio de 2000 em LasVegas, USA). Este processo de regeneração pode aumentar o tempo de vida da sílica usada para a purificação da insulina entre 100 e 600 ciclos. Entretanto, os materiais de sílica não são estáveis na condições alcalinas severas e especialmente materiais de sílica substituídos podem não ser receptivos à regeneração por soluções alcalinas. Os processos economicamente viáveis para a purificação farmacêutica, tais como os polipeptídeo terapêuticos devem incluir um processo de regeneração que não degradam a fase estacionária cromatográfica.

Um processo geral e complexo para regenerar materiais particulados (argila, areia, sílica etc) a partir de uma ampla variedade de fontes foi divulgado no WOOO/61493. Este é um processo de 5 etapas que compreende contar o material com a) um extrator de material orgânico, b) um agente oxidante, seguido por c) uma solução ácida, d) aquecer o material e e) recuperar o material. O processo é incômodo e não receptivo para a implementação em uma planta de purificação cromatográfica.

Existe uma necessidade na técnica quanto a maneiras mais eficientes de regenerar fases estacionárias cromatográficas a fim de aumentar o tempo de vida destes materiais brutos caros e evitar que a queda de pressão nas colunas cromatográficas aconteça. Especialmente, os processos de regeneração que são adequados para a regeneração in situ das fases estacionárias cromatográficas nas plantas de fabricação são necessários. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica em que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico e menos do que 75% p/p de água.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica em que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico e menos do que cerca de 1% p/p de água.

Em uma forma de realização da invenção, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em uma outra forma de realização da invenção, o ácido orgânico é o ácido acético. Em uma outra forma de realização, a solução de regeneração contém menos do que 0,5% de água, preferivelmente menos do que 0,1% de água, mais preferivelmente menos do que 0,02% de água e mais preferivelmente menos do que 0,001% de água.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a um processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica em que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico, um solvente orgânico e menos do que cerca de 1% p/p de água.

Em uma forma de realização da invenção, o solvente orgânico é etanol. Em uma outra forma de realização da invenção, o solvente orgânico é 2-propanol. Em uma outra forma de realização da invenção o solvente orgânico é acetonitrila. Em uma outra forma de realização da invenção o solvente orgânico é selecionado do grupo que consiste de metanol, 1-propanol e hexileno glicol.

Em uma outra forma de realização a solução de regeneração contém menos do que 0,5% de água, preferivelmente menos do que 0,1% de água, mais preferivelmente menos do que 0,02% de água e mais preferivelmente menos do que 0,001% de água.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a uma fase estacionária cromatográfica que foi regenerada pelos processos da invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um produto de polipeptídeo obtido pelos processos da invenção.

Ainda, em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a um produto de polipeptídeo fabricado por um processo que compreende a regeneração da fase estacionária cromatográfica pelos processos.

Ainda, em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um equipamento cromatográfico automatizado que compreende tubulação e sistema de controle para implementar o processo de regeneração.

Ainda, em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica preparada pela purificação de um polipeptídeo que usa uma fase estacionária cromatográfica que foi regenerada pelo processo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção ainda é ilustrada nos desenhos anexos em que: A Figura 1 mostra o princípio confocal. A Figura 2 mostra a figura 2D da Fonte 30Q com fibrilas d insulina tingidas com tioflavina T. A Figura 3 mostra o princípio da medição da área de fibrilas na fonte 30Q. a área colorida com luz mostra a luz verde que vem a partir das fibrilas de insulina nas partículas da fonte 30Q. A Figura 4A-B mostra cromatogramas preparativos da purificação cromatográfica III (Fig 4A, figura superior, antes da regeneração com ácido fórmico e fig4B (figura inferior) após a regeneração com ácido fórmico).

DEFINIÇÕES O seguinte é uma definição detalhada dos termos usados no relatório descritivo. O termo “fase estacionária cromatográfica” como usado neste significa a fase sólida em que a fase solúvel passa, isto é, a matriz cromatográfica. A fase estacionária cromatográfica é, normalmente, colocada dentro de uma coluna cromatográfica. Os exemplos de fases estacionárias cromatográficas são sílica substituída, tal como sílica C-4, sílica C-12 e sílica C-18, bem como materiais poliméricos, tais como poliestireno, Source 30Q e Sepharose. Os exemplos adicionais de fases estacionárias cromatográficas são membranas, materiais monolíticos e filtros. O termo “eluente cromatográfico” como usado neste significa a solução que é usada para a etapa de eluição quando o polipeptídeo sendo purificado é normalmente liberado a partir da fase estacionária cromatográfica no eluente. No modo normal de cromatografia, um ciclo completo compreende a) equilíbrio com um tampão de equilíbrio para colocar uma coluna em um estado onde está pronta para um ciclo, b) aplicação da amostra que mantém o produto, c) uma etapa de lavagem opcional onde a fase estacionária cromatográfica com o produto de ligação é lavada, d) eluição onde a afinidade do produto em tomo da fase estacionária cromatográfica diminui e o produto deixa a coluna no eluído de coluna cromatográfica e e) uma regeneração opcional onde é tentado separar a fase estacionária cromatográfica das impurezas remanescentes usando-se uma solução de regeneração. O termo “tampão de equilíbrio” como usado neste significa a solução que é usada na etapa de equilíbrio em que a coluna cromatográfica é preparada por um ciclo cromatográfico. O termo “solução de regeneração” como usado neste significa uma solução que é usada para regenerar a fase estacionária cromatográfica. O propósito da regeneração é manter um desempenho satisfatório da separação cromatográfica em diversos ciclos cromatográficos. O desempenho tipicamente crítico relacionado com os parâmetros são a queda de pressão na coluna cromatográfica e o fator de separação. Uma etapa de regeneração pode compreender contatar a fase estacionária cromatográfica com uma solução de regeneração simples ou com mais do que uma solução de regeneração. No último caso, cada uma das soluções de regeneração bem como as misturas resultantes destes são abrangidos pelo termo “solução de regeneração”. O termo “mistura” como usado neste, significa uma composição de matéria que compreende pelo menos dois ingredientes. Um eluído da coluna cromatográfica é uma mistura que compreende os produtos químicos no eluente junto com o produto que foi retirado da coluna.Um outro exemplo de uma mistura é uma solução de um produto químico, por exemplo, solução salina. Ainda, um outro exemplo de uma mistura é água e um solvente orgânico miscível em água. Ainda, um outro exemplo de uma mistura é uma solução ou suspensão de um polipeptídeo em um solvente, tal como água ou um solvente orgânico. O termo “isolar um peptídeo” como usado neste significa colocar o polipeptídeo em um estado onde este é de concentração mais alta ou de pureza mais alta do que foi antes do isolamento, isto é, no material de partida. Desta maneira, um exemplo de isolar um polipeptídeo é precipitar ou cristalizar o polipeptídeo a partir de uma solução e separar o precipitado ou os cristais de um líquido principal. O termo “solventes orgânicos” usado neste significa um solvente que compreende pelo menos um átomo de carbono e que está no estado de fluido por toda a faixa de temperatura de 0°C a 50°C. Os exemplos não limitantes de solventes orgânicos são álcoois inferiores, tais como metanol e etanol, álcoois poliídrico, acetonitrila, hexano e acetona. O termo “solventes orgânicos miscíveis em água” usados neste significa um solvente orgânico que tem uma solubilidade em água a 20°C de pelo menos 1 g/1. os exemplos não limitantes de solventes orgânicos miscíveis em água são etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrila e hexilenoglicol. O termo “ácido orgânico” como usado neste significa um composto orgânico que tem pelo menos um grupo funcional com uma constante de dissociação, pKa, menor do que 5,0. Os exemplos de ácidos orgânicos são ácido fórmico, ácido acético, ácido cítrico etc. O termo “álcool inferior” como usado neste significa um álcool Ci _6 que é caracterizado tendo entre 1 e 6 átomos de carbono e uma porção hidróxi. A estrutura de carbono no álcool inferior pode ser reto ou ramificado. Os exemplos não limitantes de álcoois inferiores são etanol, n-propanol, iso-propanol e t-butanol. O termo “álcool poliídrico” como usado neste significa um álcool tendo pelo menos duas porções de hidroxila. Os exemplos não limitantes de álcoois poliídricos são hexileno glicol (4-metil-2,4-pentanodiol) e álcool neopentílico (2,2-dimetil-l,3-propanodiol). O termo “excipiente” como usado neste significa compostos que são adicionados composições farmacêuticas a fim de estabilizar e preservar a composição. Os excipientes típicos são tampões, conservantes e modificadores de tonicidade. O termo “composição farmacêutica” como usado neste significa um produto que compreende um composto ativo ou um sal deste junto com excipientes farmacêuticos, tais como tampão, conservante, e modificador de tonicidade, a dita composição farmacêutica sendo útil para o tratamento de uma doença ou distúrbio. Desta maneira, uma composição farmacêutica também é conhecida na técnica como uma formulação farmacêutica. O termo “tampão” como usado neste refere-se a um composto químico que é usado em uma solução para reduzir a tendência do pH da solução mudar durante o tempo como, de outra maneira, deve ocorrer devido às reações químicas. Os tampões incluem produtos químicos, tais como fosfato de sódio, TRIS, glicina e citrato de sódio. O termo “modificador de tonicidade” como usado neste refere-se a um composto químico em uma composição farmacêutica que serve para modificar a pressão osmótica da composição farmacêutica de modo que a pressão osmótica tome-se mais próxima daquela do plasma humano. Os modificadores de tonicidade incluem NaCl, glicerol, D-mannitol, etc. O termo “farmaceuticamente aceitável” como usado neste significa adequado para as aplicações farmacêuticas normais, isto é, não causa eventos adversos em pacientes. O termo “insulina humana” como usado neste significa a estrutura total de hormônio humano e as propriedades são bem conhecidas. A insulina humana tem duas cadeias de polipeptídeo que são conectadas por pontes de bissulfeto entre os resíduos de cisteína, isto é, a cadeia A e a cadeia B. A cadeia á é um peptídeo de 21 aminoácidos A e a cadeia B é um peptídeo de 30 aminoácidos, as duas cadeias sendo conectadas por três pontes de bissulfeto: uma entre as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A, a segunda entre a cisteína na posição 7 da cadeia A e a cisteína na posição 7 da cadeia B e a terceira entre a cisteína na posição 20 da cadeia A e a cisteína na posição 19 da cadeia B. O termo “polipeptídeo” como usado neste significa um composto constituído de pelo menos dez aminoácidos constituintes conectados pelas ligações de peptídeo. Os aminoácidos constituintes podem ser do grupo de aminoácidos codificados pelo código genético e estes podem ser aminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético, bem como aminoácidos genéticos. Os aminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético são, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, omitina, fosfoserina, D-alanina e D-glutamina. Os aminoácidos sintéticos compreendem os aminoácidos fabricados por síntese química, isto é, D-isômeros dos aminoácidos codificados dos aminoácidos codificados pelo código genético, tal como D-alanina e D-leucina, Aib (ácido α-aminoisobutírico), Abu (ácido c^aminobutírico), Tle (terc-butilglicina) e β-alanina. O termo “polipeptídeo terapêutico” como usado neste significa um polipeptídeo para o qual existe uma utilidade reconhecida potencial como um agente terapêutico. Os polipeptídeos terapêuticos são, tipicamente, altamente purificados e são submetidos a estudos clínicos como parte do processo de aprovação regulatória. Os exemplos de polipeptídeos terapêuticos são insulina humana, trombopoetina, eritropoietina e hormônio de crescimento humano. O termo “produto de polipeptídeo” como usado neste significa uma composição que compreende o polipeptídeo. Os exemplos de produtos de polipeptídeo são polipeptídeo cristalizado, polipeptídeo precipitado e uma solução do polipeptídeo. O termo “análogo” como usado neste, em relação a um polipeptídeo precursor significa um polipeptídeo modificado em que um ou mais resíduos de aminoácido do polipeptídeo precursor foram substituídos por outros resíduos de aminoácido e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram anulados do polipeptídeo precursor e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram anulados do polipeptídeo precursor e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados ao polipeptídeo precursor. Tal adição ou anulação de resíduos de aminoácido pode acontecer no terminal N do polipeptídeo ou no terminal C do polipeptídeo ou dentro do polipeptídeo. Um exemplo de um análogo é Arg34-GLP-1 (7-37) que é um polipeptídeo GLP-1 (7-37) em que o Lys na posição 34 foi substituído por um Arg. Outros exemplos são insulina porcina ou bovina que são ambos análogos de insulina humana. O termo “precursor” como usado neste, em relação com um polipeptídeo significa uma versão modificada de polipeptídeo que está sendo produzida. Os precursores de um polipeptídeo são, tipicamente, versões estendidas de aminoácido do polipeptídeo ou versões truncadas do polipeptídeo. Estes precursores podem servir para intensificar a expressão celular, compreende rótulos de afinidade para purificação, proteger certos grupos reativos do polipeptídeo sendo produzido, etc. O termo “derivado” como usado neste em relação com um polipeptídeo precursor significa um polipeptídeo precursor quimicamente modificado ou um análogo deste, em que pelo menos um substituinte não está presente no polipeptídeo precursor ou um análogo deste, isto é um polipeptídeo precursor que foi covalentemente modificado. As modificações típicas são amidas, carboidratos, grupos alquila, grupos acila, ésteres, PEGilações e outros, os exemplos de derivados de insulina humana são insulina humana de éster treonina metílico830 e insulina humana de Ne829-tetradecanoil des(B30). O termo “substituinte lipofílico” como usado neste significa um substituinte que compreende de 4 a 40 átomos de carbono e tendo uma solubilidade em água a 20°C na faixa de cerca de 0,1 mg/100 ml de água a cerca de 250 mg/100 ml de água, tal como na faixa de cerca de 0,3 mg/100 ml de água a cerca de 75 mg/100 ml de água. Por exemplo, o ácido octanóico (C8) tem uma solubilidade em água a 20°C de 68 mg/100 ml, ácido decanóico (CIO) tem uma solubilidade em água a 20°C de 15mg/100 ml e ácido octadecanóico (Cl 8) tem uma solubilidade em água a 20°C de 0,3 mg/100 ml. O termo “tubulação e sistema de controle” como usado neste significa os meios físicos (tubos e válvulas de controle) e o software que controla os tubos e as válvulas de um equipamento de processo.

DESCR1CÃO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada com um processo para regenerar uma fase estacionária cromatográfica em que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico e menos do que cerca de 75% p/p de água. A presente invenção também está relacionada com um processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica em que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico e menos do que cerca de 1% p/p de água. A presente invenção também está relacionada com um processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica em que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com uma solução de regeneração tendo uma concentração de ácido orgânico que é de pelo menos 25% p/p.

Diversos ácidos orgânicos podem ser usados na solução de regeneração do processo. Um ácido orgânico preferido é o ácido fórmico. Um outro ácido orgânico para a solução de regeneração é o ácido acético. Uma outra solução de regeneração compreende dois ácidos orgânicos, por exemplo, ácido fórmico e ácido acético. A solução de regeneração pode, além disso, compreender um solvente orgânico. Preferivelmente, o solvente orgânico também é usado no tampão de equilíbrio ou eluente cromatográfico. Em uma forma de realização da invenção, o solvente orgânico é etanol. Em uma outra forma de realização, o solvente orgânico é 2-propanol. Em uma outra forma de realização o solvente orgânico é acetonitrila. Em uma outra forma de realização, o solvente orgânico é selecionado do grupo que consiste de metanol, 1-propanol e hexileno glicol.

Em uma outra forma de realização, o ácido orgânico é acido fórmico e o solvente orgânico é etanol. Em uma outra forma de realização, o ácido orgânico é ácido fórmico e o solvente orgânico é acetonitrila. Ainda, em uma outra forma de realização, o ácido orgânico é ácido fórmico e o solvente orgânico é 2-propanol. Ainda, em uma outra forma de realização, o ácido orgânico é ácido fórmico e o solvente orgânico é hexileno glicol. Em uma outra forma de realização, o ácido orgânico é ácido acético e o solvente orgânico é etanol. Em uma outra forma de realização, o ácido orgânico é ácido acético e o solvente orgânico é acetonitrila. Ainda, em uma outra forma de realização, o ácido orgânico é ácido acético e o solvente orgânico é 2-propanol. Ainda, em uma outra, forma de realização, o ácido orgânico é ácido acético e o solvente orgânico é hexileno glicol.

Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um processo para regenerar uma fase estacionária cromatográfica em que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico e menos do que 0,5% de água, preferivelmente menos do que 0,1% de água, mais preferivelmente menos do que 0,02% de água e mais preferivelmente menos do que 0,001% de água. A fase estacionária cromatográfica é preferivelmente contactada com a solução de regeneração dentro da coluna cromatográfica. Desta maneira, um mínimo de capacidade de produção é perdido devido à diminuição de tempo em conexão com a etapa de regeneração. Desta maneira, o processo de regenerar a fase estacionária cromatográfica pode ser realizado recheando-se novamente a coluna. Em uma forma de realização, a fase estacionária cromatográfica é fluidizada durante a dita regeneração. Em uma outra forma de realização, o eluente cromatográfico ou tampão de equilíbrio é substituído por um solvente miscível em água antes da dita fase estacionária cromatográfica ser contatada com a dita solução de regeneração. Preferivelmente, o dito solvente orgânico miscível em água também está presente no eluente cromatográfico ou tampão de equilíbrio. Preferivelmente, o dito solvente orgânico miscível em água também está presente na solução de regeneração.

Em uma outra forma de realização, a fase estacionária cromatográfica é contatada com a dita solução de regeneração fora da coluna cromatográfica. Este procedimento é mais incômodo do que realizar o processo de regeneração dentro da coluna, mas pode, todavia, útil se o material precipitado for preso entre as partículas da fase estacionária cromatográfica.

No último caso, o material precipitado pode ser removido da coluna da fase estacionária cromatográfica sem dissolver o dito material.

Em uma forma de realização, a fase estacionária cromatográfica é uma matriz de RP-HPLC. A fase estacionária cromatográfica para RP-HPLC são materiais muito rígidos mecanicamente que podem ser sílica ou sílica substituída, tal como C4, C6, C8, CIO, Cl2, Cl6, Cl8, C30 ou fenil sílica ou pode ser um material polimérico estável em pressão que é substituído ou não substituído. A fase estacionária cromatográfica, pode ser uma matriz com base em sílica ou um material polimérico, mas também pode estar nas colunas como bastões monolíticos com macroporos e mesoporos. O material de sílica adequado para o uso com a fase estacionária cromatográfica é partículas esféricas com uma distribuição de tamanho de poro e de tamanhos de partícula estreitos na faixa de 3 pm a 100μ, tal como de 5 μπι a 100 μηι, tal como de 5 μπι a 30 μηι, tal como 10 μπι, 13 μηι, 15 μηι, 16 μπι, 18 μηι e 20 μιη. Tipicamente, os tamanhos de poro na faixa de 60 Â a 300 Â, tal como 100 Â, 120 Â, 150 Â, 175 Â, 200 Â ou 300 Â, são usados. Para materiais poliméricos estáveis em pressão o tamanho de poro pode ser de 10 Â ou ainda maior, por exemplo, 50 À, 100 Á, 400 À, 600 Â, 1000 Â ou 3000 À. Em uma forma de realização, o material estável sob pressão é Source 30Q ou XAD 1180. A coluna cromatográfica é recheada com a fase estacionária a após o teste apropriado da qualidade do recheio, a coluna é equilibrada com o tampão usado no modo de ligação. As colunas cromatográficas em escala de produção, tipicamente, têm diâmetros de 15 a 100 cm e tais sistemas podem ter compressão axial dinâmica. Para a produção de polipeptídeos de em volume pequeno, as colunas de produção podem ter um diâmetro de por exemplo, 15 cm, 20 cm ou 25 cm. Para a produção de polipeptídeos em grande volume as colunas podem ter um diâmetro de, por exemplo, 40 cm, 60 cm, 80 cm ou maior.

Em uma outra forma de realização da invenção, a fase estacionária cromatográfica sendo regenerada é uma membrana, materiais monolíticos, filtros ou coisa parecida.

Em uma forma de realização do processo, para regenerar a fase estacionária cromatográfica, a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com a dita solução de regeneração por pelo menos 1 segundo, preferivelmente, por pelo menos 1 minuto, mais preferivelmente por pelo menos 5 minutos, tal como de 1 minuto a 24 horas, de 1 minuto a 5 horas, de 1 minuto a 2 horas, de 10 minutos a 60 minutos.

Em uma outra forma de realização do processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica, a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com a dita solução de regeneração até a queda de pressão no comprimento da coluna cromatográfica em vazão normal diminua por pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 25%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50%.

Em uma outra forma de realização do processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica, o contato da dita fase estacionária cromatográfica com a solução de regeneração é realizado em uma temperatura na faixa de cerca de 0°C a 70°C, de 5°C a 50°C, tal como de 10°C a 40°C, tal como de 15°C a 30°C ou de 18°C a 25°C.

Em uma outra forma de realização do processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica, o temperatura ambiente ode vida da dita fase estacionária cromatográfica é de pelo menos 500 ciclos cromatográficos, preferivelmente pelo menos 700 ciclos cromatográficos, mais preferivelmente pelo menos 1000 ciclos cromatográficos, mais preferivelmente pelo menos 2000 ciclos cromatográficos.

Em uma outra forma de realização do processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica, o dito processo é aplicado à dita fase estacionária cromatográfica para cada ciclo cromatográfico, pelo menos uma vez a cada 2 ciclos cromatográficos, pelo menos uma vez a cada 5 ciclos cromatográficos, pelo menos uma vez a cada 20 ciclos cromatográficos, pelo menos uma vez a cada 50 ciclo cromatográficos ou pelo menos uma vez a cada 100 ciclos cromatográficos.

Em uma outra forma de realização da invenção, o número de processos de regeneração realizados em uma fase estacionária cromatográfica é de pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 400 ou pelo menos 1000.

Em uma outra forma de realização do processo para regenerar a fase estacionária cromatográfica, o dito processo é aplicado da dita fase estacionária cromatográfica quando a queda de pressão no comprimento da coluna cromatográfica excede um valor inicial.

Um outro aspecto da presente invenção é um processo para a produção de um polipeptídeo terapêutico ou um precursor deste, o dito processo compreendendo pelo menos uma etapa cromatográfica em que a fase estacionária cromatográfica é regenerada por um processo de regeneração como descrito acima. Em uma forma de realização do processo para a produção de um polipeptídeo terapêutico ou um precursor deste, o dito polipeptídeo terapêutico é um derivado que compreende um substituinte lipofílico. Em uma outra forma de realização do processo para a produção de um polipeptídeo terapêutico ou um precursor deste, o dito polipeptídeo terapêutico é um derivado que compreende um substituinte lipofílico ligado ao grupo c-amino de um resíduo de lisina. Em uma outra forma de realização do processo para a produção de um polipeptídeo terapêutico ou um precursor deste, o dito polipeptídeo terapêutico é selecionado do grupo que consiste de glucagon, peptídeo semelhante a glucagon 1, peptídeo semelhante a glucagon 2, exendin-4, peptídeos TFF, insulina humana, análogos destes e derivados destes. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste de Lys26(N8-Glu (N“-hexadecanoil)))-GLP-l (7-37), Arg34-GLP-1 (7-37), exendin-4, Lys17Arg30-GLP-2 (1-33), Arg30Lys17N8(/3-Ala(N“-hexadecanoil)) GLP-2 (1-33) e Gly2-GLP-2 (1-33). Em uma outra forma de realização o dito polipeptídeo é exendin-4. Em uma outra forma de realização o polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão que compreende albumina de soro humano ou um fragmento deste. Em uma outra forma de realização o dito polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão entre GLP- 1 (7-37) ou um análogo deste e um fragmento de albumina de soro humano ou um análogo deste. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão entre exendin-4 (1-39) ou um análogo deste e um fragmento de albumina de soro humano ou um análogo deste. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão que compreende a porção Fc de uma imunoglobulina ou um fragmento desta. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão entre GLP-1 (7-37) ou um análogo deste e um fragmento da porção de Fc de uma imunoglobulina ou um análogo desta, em uma outra forma de realização o dito polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão entre exendin-4(l-39) ou um análogo deste e um fragmento da porção de Fc de uma imunoglobulina ou um análogo deste.

Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste de insulina humana, um precursor de insulina humana, um análogo de insulina humana, um precursor do análogo de, um análogo de GLP-1 (7-37), um análogo de exendin-4 (1-39) e derivados destes. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo é selecionado de um derivado de insulina humana que compreende pelo menos uma porção de metóxi ou etóxi. Em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste de insulina humana de éster treonina metílicoB3°, insulina humana de éster treonina etílicoB3°, insulina humana de AspB28, insulina humanaAspB28 de éster treonina metílicoB3°, insulina humanaAspB28 de éster treonina etílico630, insulina humana LysB23ProB29, pró-insulina humana Met8'1 ArgB0LysB28 ProB29, insulina humana LysB3GluB29, insulina humana GlyA21ArgB31ArgB32, insulina humana des(B30), insulina humana NsB29-tetradecanoil des (B30), insulina humana N£B29-litocoloil-Y-glutamil des (B30), insulina NsB29-octanoil des (B30) e insulina humana N£B29-octanoíla.

Ainda, em uma outra forma de realização, o dito polipeptídeo é selecionado da albumina de soro humano, eritropoietina, TNF-α, um interleucina, IGF-1, IGF-2, hormônio de crescimento humano, somatostatina, amilina humana e análogos destes.

Os polipeptídeos sendo purificados nas fases estacionárias cromatográficas regeneradas pelos processos da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica de produção de polipeptídeo. Os polipeptídeos maiores do que 3000 Dalton são usualmente produzidos por fermentação em uma cultura celular, onde o polipeptídeo menor pode ser produzido pela síntese química de polipeptídeo. Outros fatores importantes que determinam o método de produção ótimo também são a quantidade de polipeptídeo a ser produzida e a estrutura do polipeptídeo, por exemplo, ligações de bissulfeto e outras modificações. A fermentação ou a cultura celular derivada de polipeptídeos são comumente produzidas por cultivo de células hospedeiras recombinantes, por exemplo, bactérias, fungos, células de mamífero, células de inseto ou células vegetais em um meio de cultivo apropriado. O meio de cultivo pode ser um meio mais ou menos definido quimicamente contendo os nutrientes necessários para o desenvolvimento e formação de produto das células hospedeiras, por exemplo, açúcar, fonte de nitrogênio, sais, vitaminas e outros fatores de desenvolvimento. Uma vez que os microorganismos e as células foram cultivados no meio e estes foram opcionalmente interrompidos, o meio de cultivo contém o produto desejado em uma mistura com os componentes de meio remanescentes, as impurezas derivadas de célula hospedeira e impurezas relacionadas com o produto. As impurezas derivadas de células hospedeira são, principalmente, polipeptídeos, ácidos nucléicos e escombros celulares. O produto é separado destas impurezas não relacionadas nas etapas de recuperação ou de purificação anteriores. Nas etapas de purificação finais (polimento) onde as impurezas intimamente relacionadas com o produto de polipeptídeo são separadas do polipeptídeo do produto, as etapas cromatográficas são extensivamente usadas. A síntese de polipeptídeos também pode ser realizada por meio da síntese de fase sólida pela química do tipo Merrifield, pelos métodos de fase de solução ou pelos métodos semi-sintéticos conhecidos na técnica. Uma ou mais etapas de conversão química podem ser realizadas entre as etapas de recuperação e de purificação final. Tais modificações químicas podem ocorrer pela hidrólise de um polipeptídeo precursor em que a extensão de aminoácido no polipeptídeo é clivada do polipeptídeo. Tais extensões de aminoácido podem ser usadas para aumentar a expressão da célula hospedeira no caso de polipeptídeos derivados de cultura ou estes podem ser usados para purificar, especificamente o polipeptídeo, tal como pela cromatografia de afinidade por exemplo, purificação IMAC de polipeptídeos rotulados por histidina. A conversão química também pode ser a modificação química para a produção de um polipeptídeo que é um derivado, por exemplo, pela acilação, PEGilação ou esterificação. Tais modificações químicas são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, WO 98/08871, WO 99/43706, US 5.424286, WO 00/09666, WO 00/66629, WO 01/04156 e WO 02/90388).

Um outro aspecto da presente invenção é o uso dos processos acima para a regeneração da fase estacionária cromatográfica para diminuir a queda de pressão no comprimento da coluna cromatográfica.

Um outro aspecto da presente invenção é o uso dos processos acima para a regeneração da fase estacionária cromatográfica para a fabricação de um polipeptídeo terapêutico.

Um outro aspecto da presente invenção é a fase estacionária cromatográfica que foi regenerada pelo contato da dita fase estacionária cromatográfica com a solução de regeneração, a dita solução de regeneração compreendendo pelo menos um ácido orgânico e menos do que cerca de 75% p/p de água. Um outro aspecto da presente invenção é uma fase estacionária cromatográfica que foi regenerada pelo contato da dita fase estacionária cromatográfica com uma solução de regeneração, a dita solução de regeneração compreendendo pelo menos um ácido orgânico e menos do que cerca de 1% p/p de água.

Em uma forma de realização, a fase estacionária cromatográfica foi regenerada por um processo como descrito acima. Em uma outra forma de realização, a fase estacionária cromatográfica foi regenerada por um processo, em que a dita solução de regeneração contém menos do que 0,5% de água, preferivelmente menos do que 0,1% de água, mais preferivelmente menos do que 0,02% de água e mais preferivelmente menos do que 0,001% de água. Em uma outra forma de realização fase estacionária cromatográfica regenerada é uma sílica ou um material de sílica substituída.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um produto de polipeptídeo fabricado por um processo que compreende as etapas de a) purificar um polipeptídeo ou um precursor deste usando-se a fase estacionária cromatográfica produzida pelo processo de regeneração da presente invenção e b) isolar o dito polipeptídeo ou um precursor deste para dar o produto de polipeptídeo resultante.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a um produto de polipeptídeo fabricado por um processo em que é usada a fase estacionária cromatográfica regenerada de acordo com o processo da presente invenção.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a um equipamento cromatográfico automatizado que compreende tubulação e sistema de controle para implementar o processo de regeneração de acordo com a presente invenção.

Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica preparada por um processo que compreende as etapas de a) primeiro purificar um polipeptídeo ou um precursor deste usando-se uma fase estacionária cromatográfica regenerada pelo processo de acordo com a presente invenção, b) depois, secar o dito polipeptídeo e c) finalmente misturar com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica preparada por um processo que compreende as etapas de a) primeiro purificar um polipeptídeo ou um precursor deste usando-se uma fase estacionária cromatográfica regenerada pelo processo em que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico e menos do que 0,5% de água, preferivelmente menos do que 0,1% de água, mais preferivelmente menos do que 0,02% de água e mais preferivelmente menos do que 0,001% de água e b) depois secar o dito polipeptídeo e c) finalmente misturar com um excipiente farmaceuticamente aceitável. EXEMPLOS.

Os seguintes acrônimos para produtos químicos e materiais comercialmente disponíveis são usados: HCOOH: Ácido fórmico EtOH: Etanol AcOEl: Ácido acético ODDMS: Partículas de sílica substituídas por octadecildimetila (sílica ODDMS) O ácido fórmico usado nos exemplos DE 1 a 68, 70 e 71, 73 a 74 e 76 tem uma pureza especificada de 98 a 100% (de acordo com o fabricante) e o ácido fórmico usado, por exemplo, o 72 tiver uma pureza de 99,9%. A abreviação CV significa Volumes de Coluna como conhecido no campo da cromatografia.

Exemplos 1 a 68. O ajuste total dos experimentos dos exemplos 1 a 68 foi como segue: 1) Determinação da contra-pressão e da altura da calha de uma coluna sem nenhum problema de pressão (uma coluna nova não usada). 2) Introdução de problemas de pressão e desempenho. 3) Determinação da contra-pressão e da altura da calha de uma coluna com problemas de pressão. 4) Regeneração da coluna. 5) Determinação da contra-pressão e da altura da calha de uma coluna após a regeneração.

Determinação da contra-pressão e da altura da calha: O mesmo tipo de sílica gel foi usado para todos os experimentos mencionados nesta seção. O sílica gel é um ODDMS 200Â, 15 μπι de sílica gel. Na maior parte, o mesmo grupo de gel (grupo n° 205144) foi usado (todas as colunas começando com 874-). O sílica gel foi recheado em colunas de aço de 10 mm x 250 mm e testado em um teste de funcionalidade usando-se insulina DesB30 como a substância de teste eluindo-se com misturas de água-etanol contendo cloreto de cálcio e cloreto de potássio (ver a tabela 1). A pressão da parte posterior sob eluição e a altura da calha entre a insulina DesB30 e a impureza mais próxima (na frente do pico de insulina) foram usados como os parâmetros de teste com a finalidade de verificar quão bem a coluna readquiriu seu desempenho. O tempo de eluição da insulina DesB30 pode estar sujeito a alguma variação experimental, devido a variações pequenas na temperatura e outros parâmetros experimentais. Quando o tempo de eluição da insulina DesB30 for o mesmo em experimentos diferentes a altura da calha será uma comparação perfeita do desempenho de separação das colunas. Quando o tempo de eluição da insulina DesB30 variar entre os experimentos a altura da calha será uma medição pior do desempenho de separação de coluna. Todos os outros iguais, quanto maior o tempo de retenção menor a altura da calha será.

Tabela 1. Soluções usadas no teste de funcionalidade. O teste de funcionalidade foi realizado a 23 ± 2°C em um ÂktaexplorerlOOA com Unicom 4.0 como o software de controle r funcionando o seguinte ciclo de coluna (ver tabela 2): Tabela 2. Ciclo da coluna no teste de funcionalidade (CV é volumes de coluna).__________________________________________________________ A coluna recheada com sílica gel (grupo 205144) foi testada e a pressão da parte posterior medida a 3,4 ± 0,1 MPa. Similarmente a pressão da parte superior foi determinada para outras colunas antes de introduzir os problemas de pressão. Os experimentos mostram que se estes valores forem ganhos novamente após o tratamento, a coluna atingirá novamente seu desempenho. A altura da calha também foi determinada para as colunas individuais antes e após a introdução de problemas de pressão e desempenho e após a regeneração da coluna.

Introdução de problemas de pressão e de desempenho: Os problemas de pressão e de desempenho foram introduzidos em 1 de 3 maneiras: 1) a coluna foi usada no teste de funcionalidade mas foi retirado o sistema após o carregamento e colocado a 70°C por 1 a 16 horas. A seguir a pressão e a altura da parte posterior da calha foram medidos realizando-se o teste de funcionalidade. 2) O sílica gel ODDMS (25 g) foi agitado em um béquer com insulina DesB30 (0,14 g), tampão de tris 0,1 M (22 ml) e etanol (15 ml) a 50°C por 1 hora. A seguir, o sílica gel foi decantado e recheado em uma coluna de aço (10 mm x 250 mm). A pressão e a altura da parte posterior da calha foram medidas realizando-se o teste de funcionalidade. Este método também pode ser realizado em temperaturas inferiores mas que demandam tempos de reação mais longos. 3) Uma combinação de 1) e 2). Primeiramente, o gel foi tratado como em 2) mas após o recheio, a coluna foi tratada como em 1).

Os métodos usados para as colunas individuais são listados na tabela 4 abaixo.

Regeneração da coluna (isto é, remoção dos problemas de pressão e desempenho): A regeneração da coluna também foi realizada em Àktaexplorer 100A. O ciclo da coluna para este processo pode ser visto na Tabela 3 abaixo. Após a regeneração, a coluna foi testada novamente no teste de funcionalidade e a pressão da parte posterior determinada.

Tabela 3. Ciclo de coluna sob regeneração._____________ Solventes diferentes foram testados a 22°C e 40°C (o sistema de HPLC inteiro foi colocado em um refrigerador na temperatura escolhida ± 1°C). As condições específicas para as colunas individuais individual são mostradas na tabela 4 e os resultados dos testes de funcionalidade são mostrados na tabela 5.

Condições experimentais específicas para as colunas individuais: Tabela 4. Condições experimentais para colunas individuais.______________ Resultados do teste de funcionalidade para as colunas individuais: Tabela 5. Pressão e altura da parte posterior da calha resulta dos testes de funcionalidade antes e depois da introdução de problemas e após a regeneração das colunas de acordo com as condições listadas na tabela 4. RT é o tempo de retenção para insulina DesB30 e altura da calha (HV) é para insulina DesB30 e a impureza mais próxima.

Exemplo 69.

Tempo de vida da coluna - solventes/eluentes cromatográficos. O tempo de vida dos sílica géis substituídos pode ser limitado pelas degradações químicas do gel pelas soluções aplicadas à coluna cromatográfica, por exemplo, tampões e soluções de regeneração. A degradação química de sílica géis substituídos pode ser observada pelo aparecimento de silício na saída da coluna ou pela diminuição dos teores de carbono do gel que apresenta perda da substituição. Os seguintes experimentos mostram o aparecimento de silício no efluente da coluna e a diminuição dos teores de carbono dos géis durante a pulverização prolongada com três soluções cromatográficas: etanol a 20% em água, eluente 1 e eluente 2. A composição do eluente 2 é etanol a 31% p/p, KC11,5% p/p, CaOh 0,40% p/p, trietanolamina a 0,15% p/p e pH ajustado a 7,4 usando-se HC1. A composição do eluente 1 é sal, tampão, etanol e pH 3,0 Um grupo de sílica gel ODDMS foi recheado em cinco colunas de aço de 4,0 x 250 mm pelo procedimento padrão para rechear colunas cromatográficas. As colunas foram então equilibradas com 3 CV de etanol antes da pulverização contínua com um eluente cromatográfico ser iniciada. As cinco colunas foram então pulverizadas com um eluente cromatográfico (EtOH a 20%, eluente 1 ou eluente 2) por 1, 3, 7, 12 e 16 dias, respectivamente. Depois do tempo de pulverização apropriado, cada coluna foi então equilibrada com 3 CV de etanol e o sílica gel foi retirado das colunas. Uma amostra do sílica gel gasto foi submetida a análise dos teores de carbono e uma amostra da solução de regeneração gasta foi submetida a análise quanto ao teor de silício.

Os resultados do dia 0 é o resultado (teor de carbono) do sílica gel usado para rechear as colunas.

Tabela 6. Avaliação do tempo de vida da coluna durante pulverização prolongada com eluentes cromatográficos típicos pela medição de carbono remanescente e silício liberado.

Exemplo 70.

Tempo de vida da coluna - soluções de regeneração que compreendem ácido fórmico. O tempo de vida de sílica géis substituídos pode ser limitado pelas degradações químicas do gel pelas soluções aplicadas à coluna cromatográfica, por exemplo, tampões e soluções de regeneração. A degradação química de sílica géis substituídos pode ser observada pelo aparecimento de silício na saída da coluna e pela diminuição do teor de carbono do gel que apresenta perda da substituição. Os seguintes experimentos mostram o aparecimento de silício na coluna efluente e a diminuição do teor de carbono dos géis durante a pulverização prolongada com soluções de regeneração contendo ácido fórmico. Desta maneira, comparando-se à situação usando-se tampões ou solventes cromatográficos, as soluções de regeneração contendo ácido fórmico não deterioram-se mais na matriz da coluna.

Um grupo de sílica gel ODDMS foi recheado em cinco colunas de aço de 4,0 x 250 mm por procedimento padrão para rechear as colunas cromatográficas. Cada coluna foi então equilibrada com 3 CV de EtOH a 100% antes que a pulverização contínua com ácido fórmico fosse iniciada. As cinco colunas foram então pulverizadas com um solvente de regeneração sendo ácido fórmico (100% ou 80%) por 1, 3, 7, 12 e 16 dias, respectivamente. Depois do tempo de pulverização apropriado cada coluna foi então equilibrada com 3 CV de etanol e o sílica gel foi retirado das colunas. Uma amostra do sílica gel gasto foi submetida a análise do teor de carbono e, uma amostra da solução de regeneração gasta foi submetida a análise quanto ao teor de silício. Os resultados para o dia 0 é o resultado (teor de carbono) do sílica gel usado para rechear as colunas.

Tabela 7. Avaliação do tempo de vida da coluna durante regeneração prolongada com soluções contendo ácido fórmico pela medição de carbono remanescente e silício liberado.

Exemplo 71 Usando-se microscopia de varredura a laser confocal que detecta fibrilas de insulina no trocador de ânion Source 30Q

Propósito O propósito de usar microscopia de varredura a laser confocal é determinar visualmente como os solventes de regeneração efetivamente diferentes estão na remoção de fibrilas de insulina de Source 30Q. Com software de processamento de imagem sofisticado permite a oportunidade de medir a área de fibrilas de insulina em cada imagem dando um julgamento mais preciso no lugar de um julgamento visual de cada imagem. O princípio confocal O princípio de usar CLSM é que a amostra é tingida com um pigmento fluorescente. A amostra tingida é colocada sob o microscópio e o pigmento fluorescente é excitado usando-se um laser. A luz emitida vinda do pigmento fluorescente é detectada e a imagem formada. O microscópio de varreduras a laser confocal é como o microscópio confocal normal que usa um laser como fonte de luz. A luz do laser passa através da objetiva do microscópio por intermédio do divisor de raio dicromático. O divisor de raio dicromático é, um dispositivo que permite à luz do laser passar através da objetiva até a amostra e a luz emitida, que vem da amostra passa pelo divisor de raio dicromático e vai até os tubos fotomultiplicadores onde a luz é detectada e a imagem é formada. Entre o divisor de raio dicromático e os tubos fotomultiplicadores está colocado o furo confocal. O furo confocal funciona como um filtro que intercepta toda a luz que vem de fora das regiões de foco atingindo os tubos fotomultiplicadores. Isto significa que a imagem é formada vindo de um plano de foco muito estreito. Pelo ajuste do furo confocal é possível mover o plano de foco de imagem para. cima e para baixo através da amostra e produzir uma série de imagens junto ao eixo óptico (z) do microscópio. Esta série de imagens pode ser coletada na imagem 3 D da amostra.

Source 30Q

Source 30Q é um trocador de ânion forte com base em gotas monodispersas com um tamanho de partícula de 30 mícrons. A matriz consiste de poliestireno/divinil benzeno. Source 30Q dá uma auto-fluorescência fraca na área do comprimento de onda acima de 650 nm. Isto significa que é possível ver as partículas de Source 30Q sem qualquer tingimento.

Tioflavina T O pigmento usado para tingimento das fibrilas de insulina é Tioflavina T que é conhecida para o tingimento de proteínas amilóides. A Tioflavina T tem um espectro de emissão amplo com emissão máxima que varia de abaixo de 490 nm e acima de 530nm. Isto significa que é possível distinguir entre luz que vem das fibrilas de insulina (verde) e a luz da auto-fluorescência que vem das partículas (vermelha).

Método para o tingimento das fibrilas de insulina em Source 30Q 0,0385 g de Source 30Q seco é colocado em vidro de 25 a 30 ml. 500 μΐ de etanol 96% são adicionados ao Source 30Q 4,5 ml de ácido acético a 0,05 M ajustado ao pH 3 com NaOH são adicionados. A mistura é misturada junta agitando-se o vidro cuidadosamente 20 μΐ de Tioflavina T a 116,62 mM em Milli-Q-water são adicionados A mistura é cuidadosamente agitada por 5 minutos. A amostra é agora tingida e preparada para análise sob o microscópio Uma gotícula pequena da mistura, aproximadamente 40 μΐ colocada em um reservatório microscópico e colocada no microscópio 10 imagens 2D de cada amostra de lugares diferentes do reservatório foram tomadas Equipamento Condições microscópicas Objetiva: 40*; óleo; NA?

Laser: Argon 488 nm Intensidade do laser: 100% Furo confocal: 20 pm Filtro de emissão (No 2): 515/30M da Chroma Filtro de emissão (No 3): HQ650LP da Chroma Microscópio: Nikon TE300 equipado com scanhead confocal PCM2000 (fotomultiplicador) da Nikon.

Software: Nikon EZ2000 Viewer 2.5.77 Software usado para processamento de imagem: AnalySIS 3.00 Processamento de imagem A área de fibrilas de insulina foi medida nas 10 imagens 2D a partir de cada amostra. Para garantir que cada amostra foi tratada exatamente da mesma maneira o processamento de imagem foi feito automaticamente pela formação de um macro. O macro é mostrado abaixo. A área de cada fibrila individual das 10 imagens de cada amostra foi resumida em planilha do excel. A área de fibrila resumida de cada amostra foi coletada em um gráfico de barra para comparação.

Macro para a área de medição de fibrilas: Op. Display = 1; docActivate (“picture name ”);

DbLoadlmageQ;

MaximizeContrastQ;

ShadingCorrection (N*N average filter size; 3; lower limit; 1900; upper limit; 2000);

BinarizeColorlmage (ColorThresholds: —NULL, Phase: =-l);

InvertQ;

EdgeEnhance (size; 5; percent; 70);

SetFrame (Left:-0, Top:=0, Right:=1023, Bottom:-1023);

Detect ();

ParticleResultsQ;

Op.Display .= 6;

Option.Burn Overlay=TR UE;

SaveAs (FileName:); docActivate (“Sheet*”);

SaveAs (FileName:);

Close (AskForSave: =TRUE);

Tabela 8. Área medida de fibrilas em gel de Source 30Q gasto antes e depois da regeneração do gel usando-se soluções de regeneração diferentes. A remoção completa das fibrilas de insulina é obtida usando-se ácido fórmico puro ou uma mistura de ácido fórmico e etanol. Uma mistura 50:50 de ácido fórmicoiágua não elimina completamente as fibrilas, embora esta mistura seja uma solução de regeneração mais eficiente do que hidróxido de sódio (1 M).

Exemplo 72.

Procedimento padrão para regeneração de colunas de RP-HPLC com ácido fórmico na escala de produção.

Os procedimentos descritos abaixo aplicam-se a dois tipos de colunas usadas em quatro etapas de purificação cromatográfica em uma purificação de escala de produção de insulina humana.

Coluna Tino 1: Altura de leito 32,5 cm 1. A coluna é pulverizada com aproximadamente 1,5 CV de etanol a 20% p/p em água com uma taxa de fluxo de 4,6 CV/h a fim de remover sais de tampão 2. A direção de fluxo na coluna é invertida 3. A coluna é pulverizada com aproximadamente 1,1 CV de etanol absoluto com uma taxa de fluxo de 4,5 CV/h 4. 1,1 CV de ácido fórmico puro é bombeado na coluna em uma taxa de fluxo de 2,1 CV/h 5. O fluxo é interrompido e a coluna é deixada repousar com ácido fórmico por 30 minutos 6. A coluna é pulverizada com aproximadamente 1,1 CV de etanol absoluto com uma taxa de fluxo de 4,5 CV/h 7. A coluna é pulverizada com aproximadamente 1,1 CV de etanol a 20% p/p em água com uma taxa de fluxo de 4,5 CV/h 8. A direção de fluxo na coluna é mudada de volta para normal 9. A coluna é equilibrada com 4 CV mínimo de etanol a 20% p/p em água com uma taxa de fluxo de 4,6 CV/h Agora a coluna está pronta para o uso novamente.

Coluna Tino 2: Altura de leito 37,5 cm 1. A coluna é pulverizada com aproximadamente 1,5 CV de etanol a 20% p/p em água com uma taxa de fluxo de 4,6 CV/h a fim de remover sais de tampão 2. A direção de fluxo na coluna é invertida 3. A coluna é pulverizada com aproximadamente 1,0 CV de etanol absoluto com uma taxa de fluxo de 3,9 CV/h 4. 0,92 CV de ácido fórmico puro é bombeado na coluna em uma taxa de fluxo de 1,9 CV/h 5. O fluxo é interrompido e a coluna é deixada repousar com ácido fórmico por 30 minutos 6. A coluna é pulverizada com aproximadamente 1,0 CV de etanol absoluto com uma taxa de fluxo de 3,9 CV/h 7. A coluna é pulverizada com aproximadamente 1,0 CV de etanol a 20% p/p em água com uma taxa de fluxo de 3,9 CV/h 8. A direção de fluxo na coluna é mudada de volta para normal 9. A coluna é equilibrada com 4,0 CV mínimo de etanol a 20% p/p em água com uma taxa de fluxo de 4,6 CV/h Agora a coluna está pronta para o uso novamente.

Nas colunas Tipo 1 a regeneração com ácido fórmico é realizada depois de cada 16a série como uma ação preventiva para interromper a construção de componentes, aumentando as pressões da parte posterior da coluna e aumentando os volumes de grupo. Aplicando-se o procedimento de regeneração com ácido fórmico na etapa I de purificação cromatográfica, o tempo de vida do leito de coluna é estendido até 2000 séries.

Nas colunas Tipo 2 a regeneração com ácido fórmico é realizada rotineiramente depois de cada 60a série ou se, aumentando as pressões posteriores, aumentando-se os volumes de grupo e a formação de impurezas é observada. Aplicando-se o procedimento de regeneração com ácido fórmico o tempo de vida do leito de coluna é estendido até 600 séries na etapa III de purificação cromatográfica e até 900 séries na etapa IV cromatográfica. A matriz da coluna usada nas etapas I, III e IV de purificação cromatográfica consiste de partículas de sílica substituídas por octadecildimetila (sílica ODDMS). O procedimento padrão descrito aplica-se para todos os tipos de matrizes de sílica substituídas usadas na escala de produção.

O procedimento também é usado em procedimentos de regeneração de ácido fórmico para matrizes de coluna com base no material de Source Q

Os exemplos do efeito em purificação cromatográfica III e IV são mostrados abaixo.

Tabela 9. Purificação cromatográfica III: Efeito no volume do grupo e contra-pressão. A regeneração reduz o volume do grupo com ap. 21% e a contra-pressão com 37%. A Figura 4A-B mostra o efeito de regeneração no cromatograma preparativo para purificação cromatográfica III.

Aplicando-se a regeneração de ácido fórmico uma separação melhorada e a forma de pico da insulina humana são conseguidas (pico de insulina sendo o pico grande que começa no tempo 8,20 na figura superior e no tempo 14,02 na figura inferior).

Exemplo 73.

Regeneração de DEAE Sepharose. • Um grupo de DEAE Sepharose que foi usado para um grande número de ciclos de purificação em um processo para a purificação de hormônio de crescimento humano foi regenerado pelo ácido fórmico puro (HCOOH a 100%). Antes da regeneração a Sepharose tem uma cor marrom que indica material depositado no gel. A Sepharose regenerada foi muito mais clara na cor.

As amostras da Sepharose regenerada foi comparada à Sepharose antes da regeneração, usando-se um colorímetro (Minolta CR-300) para quantificar as diferenças de cor, cn.f. resultados na tabela 10.

Tabela 10. Avaliação da regeneração de DEAE Sepharose quando regenerada como uma pasta com uma solução de regeneração de ácido fórmico.

Exemplo 74.

Regeneração de sílica gel gasto contendo agregados de glucagon.

Glucagon e os peptídeos semelhantes a glucagon (GLP-1 e GLP-2) são particularmente suscetíveis a agregação onde formam fibrilas, isto é, agregados de estruturas de chapa β. Neste exemplo um experimento modelo foi realizado onde glucagon humano foi carregado em uma coluna de sílica (como descrito nos exemplos 1 a 68). A solução de glucagon foi deixada repousar na coluna por 3 dias a 30°C a fim de introduzir a pressão e imitando problemas de desempenho os problemas encontrados durante a fabricação industrial de glucagon. A pressão sobre a coluna foi medida a 3,5 MPa usando-se eluente 2 como descrito no Exemplo 69 em uma taxa de fluxo de 9 ml/min a 22°C.

Seguinte ao ciclo de regeneração, usando-se ácido fórmico (100%) a pressão sobre a coluna foi reduzida a 2,67 MPa ilustrando a eficácia do ácido fórmico como uma solução de regeneração.

Exemplo 75.

Tempo de vida da coluna - solução de regeneração contendo NaOH a 0,1 M e etanol a 60% p/p em água. O experimento foi realizado como descrito no Exemplo 70 exceto para a solução de regeneração que neste experimento foi etanol alcalino como comumente usado para regenerar as fases estacionárias cromatográficas. O fluxo da solução de regeneração foi aproximadamente de 0,1 ml/min e os experimentos foram terminados depois de 4 dias visto que a pressão sobre as colunas foram de > lOMPa. Os resultados até a quebra das colunas são mostrados na tabela 11.

Tabela 11. Avaliação do tempo de vida da coluna durante regeneração prolongada com uma solução de regeneração contendo NaOH a 0,1 M e etanol a 60% p/p em água.

Exemplo 76 Regeneração de XAD 1180 O tempo de vida da resina XAD 1180 polimérica de fase reversa usada para a concentração de um precursor de insulina a partir do caldo de fermentação clarificado foi limitado por causa do acúmulo severo de contaminantes hidrofóbicos tais como compostos coloridos, peptídeos e anti-espumantes da fermentação. O ciclo de regeneração normal foi baseado na lavagem com uma solução de regeneração contendo Etanol a 80% em ácido cítrico a 0,1 M, pH 3,0 seguido pelo aquecimento com uma solução de NaOH a 5% a 80°C. Este processo de regeneração não foi eficiente para remover contaminantes acumulados. A remoção de anti-espumante ligado (Pluronic PE 6100 e P2000) da resina gasta foi avaliada pelos experimentos com concentração diferente e tempo de contato de etanol e isopropanol no modo estático e comparado a uma regeneração de ácido fórmico (Tabela 12). O tratamento de ácido fórmico é superior na remoção de contaminantes adsorvidos comparado aos solventes de regeneração industrial padrão.

Tabela 12. Eficiência de soluções de regeneração diferentes na remoção de contaminantes de anti-espumante adsorvidos de uma fase estacionária cromatográfica de XAD 1180 gasta.______________________________________ REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para regenerar uma fase estacionária cromatográfica, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada a uma temperatura na faixa de 0°C a 70°C com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico e menos do que 75% p/p de água, em que o dito ácido orgânico é ácido fórmico, em que a concentração do dito ácido orgânico é de pelo menos 25% p/p e em que a dita fase estacionária cromatográfica é uma sílica ou material de sílica substituído.

2. Processo para regenerar uma fase estacionária cromatográfica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada a uma temperatura na faixa de 0°C a 70°C com uma solução de regeneração que compreende pelo menos um ácido orgânico e menos do que 1% p/p de água, em que o dito ácido orgânico é ácido fórmico.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizado pelo fato de que a dita solução de regeneração compreende um solvente orgânico.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é etanol.

5. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é 2-propanol.

6. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é acetonitrila.

7. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é selecionado do grupo que consiste em metanol, 1-propanol e hexileno glicol.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que a dita solução de regeneração contém menos do que 0,5% de água, preferivelmente menos do que 0,1% de água, mais preferivelmente menos do que 0,02% de água e mais preferivelmente menos do que 0,001 % de água.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com a dita solução de regeneração dentro da coluna cromatográfica.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é regenerada sem rechear novamente a coluna.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é fluidizada durante a dita regeneração.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-11, caracterizado pelo fato de que o eluente cromatográfico ou tampão de equilíbrio é substituído por um solvente orgânico miscível em água antes da dita fase estacionária cromatográfica ser contatada com a dita solução de regeneração.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico também está presente no eluente cromatográfico ou tampão de equilíbrio.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-13, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico miscível em água também está presente em uma solução de regeneração.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com a dita solução de regeneração fora da coluna cromatográfica.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é sílica substituída Cl6 ou Cl8.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é sílica C4, C8 ou substituída por fenila.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com a dita solução de regeneração por pelo menos 1 segundo, preferivelmente por pelo menos 1 minuto, mais preferivelmente por pelo menos 5 minutos, tal como de 1 minuto a 24 horas, de 1 minuto a 5 horas, de 1 minuto a 2 horas, de 10 minutos a 60 minutos.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária cromatográfica é contatada com a dita solução de regeneração até a queda de pressão no comprimento da coluna cromatográfica em vazão normal diminui por pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 25%, mais preferivelmente pelo menos 50%.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, caracterizado pelo fato de que o contato da dita fase estacionária cromatográfica com a dita solução de regeneração é realizado em uma temperatura na faixa de 5°C a 50°C, preferivelmente de 10°C a 40°C, mais preferivelmente de 15°C a 30°C, tal como de 18°C a 25°C.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, caracterizado pelo fato de que o dito processo é aplicado a partir da dita fase estacionária cromatográfica para cada ciclo cromatográfico, pelo menos uma vez a cada 2 ciclos cromatográficos, pelo menos uma vez a cada 5 ciclos cromatográficos, pelo menos uma vez a cada 20 ciclos cromatográficos, pelo menos uma vez a cada 50 ciclos cromatográficos ou pelo menos uma vez a cada 100 ciclos cromatográficos.