JP2648951B2

JP2648951B2 - 人体のソマトメジン担体蛋白質サブユニットとこれらの製法

Info

Publication number: JP2648951B2
Application number: JP63503623A
Authority: JP
Inventors: スペンサー・エメラルド・マーチン
Original assignee: SERUTORITSUKUSU PHARM Inc
Current assignee: SERUTORITSUKUSU PHARM Inc
Priority date: 1987-04-06
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1997-09-03
Anticipated expiration: 2012-09-03
Also published as: EP0308500A1; IL85983A; AU1702088A; DK677688D0; WO1988007863A1; IL85983A0; CA1340295C; ATE90690T1; DK677688A; EP0308500B1; ES2058341T3; AU627423B2; EP0294021A1; ZA882407B; JPH01502986A; DE3881801T2; DE3881801D1

Description

【発明の詳細な説明】〔関連出願に対する参考〕本出願は1987年４月６日出願の合衆国特許出願の出願
番号07/034,885の一部継続出願である。

〔連邦政府公認の調査と開発の下に行われた発明の権利に関する説明〕

合衆国政府は本発明において支払い済みのライセンス
を有しており、かつ、“The National Institute of Ch
ild Health and Human Development,Department of Hea
lth and Human Services."（保健・人間業務者の国立児
童保健，人間開発研究所）が付与した付与条件、番号SS
S−Ｃ（３）1R43HD21323−01ENGによって規定される合
理的な条件で特許保有者が他の者に許可を与えることを
要求する権利を、限られた事柄について、保有してい
る。

〔発明の分野〕

本発明は人体のソマトメジン担体蛋白質サブユニット
ならびに、これらの製法に関するものである。更に詳し
くは、本発明はインシュリン様の成長要素としても公知
の人体ソマトメジン様のポリペプチドに結合する担体蛋
白質サブユニットに関するものである。更に、本発明は
本質的に純粋な人体ソマトメジン担体蛋白質サブユニッ
トにも関するものである。本発明はまた、人体の血漿か
らかような担体蛋白質サブユニットを調整する方法にも
関するものである。この方法は、一連の各種のクロマト
グラフィ処理による人体の漿液部分からのCohn IV−１
の調整に関係している。本発明の担体蛋白サブユニット
と方法とは各種の治療上，診断上、そして他の有用な応
用に用いられることができよう。

〔発明の背景〕

ソマトメジン（特には“SMs"とも言われる）は有用な
生物学的特性を持つホルモンである。SMsは分子量が約7
500ダルトンのポリペプチドである。SMsは（ａ）成長ホ
ルモン（特には“GH"とも言われる）の成長促進の効果
を実行し、（ｂ）弱いインシュリン様の活性を有し（そ
してこのため“インシュリン様成長要素”または“IGF
s"とも言われる）、（Ｃ）各種の骨格、その他の組織に
対する細胞分裂刺激作用があり、（ｄ）大形担体蛋白質
に結合されて血漿内を運ばれる。人体には２種のSM組成
物がある。SM−Ｃは基本的なポリペプチドであり、時に
はIGF−Ｉと言われる。SM−Ｃは出生後のGH成長促進作
用を実行する。SM−Ａは主としてIGF−IIとして公知の
ポリペプチドと、いろいろな量である変形例のSM−Ｃと
の混合物である。Spencer,E.M.等，“The Identity of
Human Insulin−like Growth Factors I and II With S
omatomedins C and A With Rat I and II"（ソマトメジ
ンＣ及びＡを含む人体のインシュリン様の成長要素Ｉ及
びIIとラットIGF I及びIIとの同一性），出典:Insulin
−like Growth Faotors/Somatomedins,編集者:Spencer,
E.M.（Walter de Gruyter1983）。IGF−IIは依存性が低
く、胎児の成長にある役割を持つだろう。

SMsは生体内で、骨の形成を刺激し（例えば骨多孔症
治療において）、疵の治癒，及び動物の成長,GH不足の
人体の成長を刺激するために有用であろう。SM−Ｃの漿
液レベルは、未端肥大症，下垂体性の巨人症,GH欠乏症
または、その他の成長に関する状態を診断するために測
定される。Spencer,E.M.,“Somatomedins（ソマトメジ
ン）",出典:Basic and Clinical Endocrinology編集者:
GreenspanF.S.及びForsham P.H.（1986）89頁。Appleto
n−Century−Crofts SMsは、組織培養における様々な細
胞の増殖を試験官内で刺激するためにも使用され、従っ
て、正常及び異常な細胞成長の調節の研究に有用であ
る。ある種の肺及び腎臓の癌細胞によって生じるSMs
は、癌細胞と癌組織の成長を助けるに必要な脈管組織及
び線維組織との増殖を刺激するだろう。

Spencer,E.M.等，“Possible Auto−stimulation of
Human Mammary Carcinoma Growth by Somatomedins."
（ソマトメジンによる人体乳癌腫成長の可能な自動刺
激）Annals of the N.Y.Acad.Sci.464号,448頁（198
6）;Huff K.K.等，“Secretion of Insulin−like Grow
th Fator−Ｉ−related Protein by Human Breast Canc
er Cells."（人体肺癌細胞によるインシュリン様成長要
素Ｉに関連する蛋白の分泌）Cancer Research46号、461
3〜4619頁（1986）。

SMsの作用を阻止することはこれらの癌の増殖防止に
有用であろう。

人体のSMsは体内において他の蛋白によって運搬され
調節されるようである。Hintz,R.L.等，“Demonstratio
n of Specifc Plasma Protein Binding Sites For Soma
tomedin,"（ソマトメジンに対する特定血漿蛋白結合部
位の立証）J.Clin.Endocrinol.Metab.45号、988頁（197
7）。これらの蛋白は生体内でSMsに結びつき、SMsの生
物学的活性を調節するようである。中性のpHで人体の漿
液のゲル濾過を行って分かったのだが、免疫反応性のSM
−Ｃ結合力を有するものの95％及び多分IGF−II結合力
を有するものは、約150000ないし160000ダルトン（150
〜160キロダルトン即ち“kDa"にて、35〜50kDaの範囲の
少量と共に溶出する。ただ、極めて少量の免疫性の結合
力を有するものだけが7.5kDaで溶出し、この際、遊離の
SMsが現れる筈である。Smith,G.L.,Moleoular and Cell
ular Endocrinology34号、83〜89頁（1984）。このこと
はSMsが血漿中で大きい方の蛋白質と複合していること
を示している。

人体の血漿中において少なくとも２クラスの蛋白質ま
たは蛋白質複合体がSMsを結合すると報告されている。D
rop,S.L.等，“Immunoassay of A Somatomedin−bindin
g Protein From Human Amniotic Fluid;Levels In Feta
l,Neonatal,And Adult Sera"（人体の羊水からのソマト
メジン結合蛋白質の免疫分析；胎児，新生児，及び成人
の漿液中の水準）,J.Clin.Endocrinol.Meteb.50号、908
頁（1984）、Wilkins,J.R.等，“Affinitylabeled Plas
ma Somatomedin−C/Insulin−like Growth Factor I Bi
nding Proteins"（親和性ラベルをはった血漿ソマトメ
ジン−C/インシュリン様成長要素Ｉを結合する蛋白
質）,J.Clin.Invest.75号、1350頁（1985）。この説明
はこれらの本来の一クラスの蛋白質または蛋白質複合体
をSM“担体蛋白質”として言及している。つまり、その
機能がSMsの運搬であると思われるからである。これは
担体蛋白質が単一蛋白質であることを示そうとしている
のではない。担体蛋白質は一つ以上あるかもしれない
し、それは蛋白質複合体であるかもしれない。この説明
は他に“羊水結合蛋白質”即ち“AFBP"のようなクラス
があると言っているのである。AFBPは１つ以上あるかも
知れない。またおそらく、SMsを結合する別のクラスの
蛋白質または蛋白質複合体が見つかるだろう。

SMPC結合力を有するもののように、担体蛋白質結合力
を有するものはGH依存であり、GH欠乏の人間には低く、
未端肥大症として知られた状態であるGH発生腫瘍がある
患者では高い。White,R.M.等，“The Growth Hormone D
ependence of Somatomedin−binding Protein In Human
Serum,"（人体漿液におけるソマトジメン結合蛋白質の
成長ホルモン依存性）,J.Clin Endocrinol Metab.53
号、49頁（1981）。担体蛋白質は潜在的に有効な用途を
指示するような生物学的特性を示す。生体内では、SMs
が担体蛋白質に結合する場合、SMsの半減期は試験する
動物の種次第により約１時間から約24時間まで増加する
と報告されており（Cohen,K.L.等，“The Serum Half−
life of Somatomedin Autivity:Evidence For Growth H
ormone Dependence,"（ソマトメジン結合力を有するも
のの漿液半減期；成長ホルモン依存性の証拠）,Acta En
docrinol.83号、243頁（1976）、そして、SMsは不活性
となり結局解離される。他の模擬システムでの研究が示
唆するところによると、担体蛋白質を含む不純調整によ
って、（ａ）潅流したラットの心臓に及ぼすSMsの代謝
作用は廃絶される（Meuli C.,等，“NSILA−carrier Pr
otein Abolishes TheAction of Nonsuppressible Insul
in−like Activity （NSILA−ｓ）On Perfused Rat Har
t"（NSILA担体蛋白質によって潅流を施したラットの心
臓に及ぼす抑制不能インシュリン様結合力を有するもの
（NSILA−ｓ）の作用は廃絶される）,Diabetologia14
号、255頁（1978））、（ｂ）培養中の細胞に及ぼすSMs
の鎮静作用は抑止される（Knauer,D.J.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.77号、7252−7256頁（1980）及びKuffer,
A.D.等，“Partial Purification of A Specific Inhib
itor of The Insulin−like Growth Faotors By Revers
ed Phase High−per formance Liquid Chromatograph
y,"（逆相高性能液体クロマトグラフィによるインシュ
リン様成長要素の特性抑止剤の部分精整）,J.of Chroma
tography336号、87〜92頁（1984））、そして（ｃ）ラ
ットの脂肪組織に及ぼすSMsのインシュリ様活性は阻止
される（Zapf,J.等，“Inhibition of The Action of N
osuppressible Insulin−like Activity On Isolated R
at Rat Cells By Binding To It.s Carrier Protein,"
（その担体蛋白質に結びつけることによる分離ラット細
胞に及ぼす抑止不能インシュリン様活性の作用の抑
止）,J.Clin Invest.63号、1077頁（1979））。担体蛋
白質を部分的に純粋に調整したものを放射性レッテル付
きのSMsと共に用いて、SMs測定のための拮抗的結合の分
析を行うようにした。Moses,A.C.等,Endocrinology104
号、536頁（1979）。

価値が高い生物学的特性がこれらにあるので、その活
性の原因である担体蛋白質または、その担体蛋白質のサ
ブユニットを分離し特徴表示する多くの努力が払われ
た。本発明以前は担体蛋白質またはその活性サブユニッ
トを純粋な形で分離し、特徴表示しようとするあらゆる
試みは失敗した。この理由は一部は血漿中の担体蛋白質
の濃度が低いことである。精製方法に成功するために
は、酸素による消化と、担体蛋白質の不安定性、特にpH
の変動による変化の問題とが解決されねばならなかっ
た。担体蛋白質サブユニットの精製は、ソマトメジンに
結合するAFBPが血漿中に存在することによって更に複雑
になる。

担体蛋白質は糖蛋白質である。pHが中性の漿液ではこ
の蛋白質はSMsと結合し、その複合体の分子量はゲル濾
過によって測定すると約150〜160kDaである。pHが中性
の担体蛋白質複合体の分子量は他の方法によって約125k
Daと測定されている。酸性状態での漿液または血漿のゲ
ル濾過クロマトグラフィは、担体蛋白質から結合SMsを
分離し、また分子量が約40〜50kDaである担体蛋白質の
ユニットを生じさせると報告されている。このユニット
もソマトメジンに結合する。Hintz,R.L.等，“Demonstr
ation Of Speoific Plasma Protein Binding Sites For
Somatomedin"（ソマトメジンに対する特定血漿蛋白質
結合位置の立証）,J.Clin.Endocrinol.Metab45号、988
頁（1977）。40〜50kDaの酸安定性ユニットは、150〜16
0kDaの担体蛋白質複合体を改質するように誘導され得な
いので、他の人々の提唱によると、担体蛋白質は部分的
に酸不安定であって、それ自体ソマトメジンに結合しな
いユニットで構成することもできる。Moses,A.C.等,End
ocrinology104号、536頁（1979）。Furlanettoの報告に
よれば、漿液を35〜55％硫酸アンモニウム溶液で処理
し、沈殿を分離し、沈殿をpH9.20の0.05MのTrisに溶解
し、そして、Tris緩衝剤を用いてDEAE Sephadex A−50
上でクロマトグラフィ処理をしている。Furlanetto R.
W.“The Somatomedin C Binding Protein:Evidence For
A Heterologous Subunit Structure"（ソマトメジンＣ
を結合する蛋白質：不均質サブユニット構造の証拠）J.
Clin,Endocrinol Metab.51号、12頁（1980）。Furlanet
toはこれ以上の精製については開示しなかった。寧ろFu
rlanettoは各種の留分を用いて実験を行い、ソマトメジ
ンＣの漿液中の結合力は少なくとも２ユニットで構成さ
れ、一つは36Åのストークス半径を持ってSM−Ｃを縛る
（いわゆる酸安定ユニット）もの、もう一つはストーク
ス半径が30〜38Åであって、SM−Ｃを縛らない（いわゆ
る酸不安定ユニット）ものであるという彼の見解を確認
しようした。

Wilkinsは親和性ラベリングによってSM−Ｃと複合し
た血漿蛋白質と確認した。

Wilkins,J.R.等，“Affinity−labeled Plasma Somat
omedin−C/Insulin−like Growth Factor I Binding Pr
oteins"（親和性ラベリングを行った血漿ソマトメジン
−C/インシュリン様成長要素Ｉを結合する蛋白質）J.Cl
in.Invest.誌75号、1350頁（1985）。¹²⁵I−SM−Ｃを全
血漿及び血漿のSephadex G−200留分にSM−Ｃを結びつ
けた蛋白質に共有交差結合した。ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動と自動放射線透過写
真とによって、約160,110,80,50,25kDaの各種に他にAFB
Pを確認した。Wilkins等は160kDaの担体蛋白質複合体は
６個の約25kDa（24〜28kDa）のサブユニット複合体から
構成されており、夫々の複合体はSM−Ｃを加えたサブユ
ニットにて構成されていると仮定した。しかし、Wilkin
s等はこの25kDaのサブユニットの分離と精製とについて
は報告しなかった。別の研究者は僅かに大きめのサブユ
ニット構造を提案したが、確認はしなかった。Daughada
y,W.H.等，“Characterization Of Somatomedin Bindin
g in Human Serum By Ultracentrifugation And Gel Fi
ltration"（超遠心分離とゲル濾過とによる人体漿液中
のソマトジメンの結合の特徴表示）J.Clin.Endocrinol.
Metab.55号、916頁（1982）。

若干の研究者達は人体血漿から酸安定性の40〜50kDa
担体蛋白質ユニットの分離を試みて成功しなかったと報
告している。Draznin等は僅か１％のSM結合力を有する
ものを含む物質について報告したが、この物質の起源が
担体蛋白質であるか、AFBPであるかについては開示しな
かった。Draznin B.等“Somatomedins and Growth,"
（ソマトメジンと成長），編集者:G.Giordano等（Acade
mic Press1979）,149〜160頁。Fryklund等は、ポリエチ
レングリコール沈殿，カルホキシメチル−セファデック
スクロマトグラフィ及びゲル濾過によって新鮮な凍結さ
れた人体血漿を分留した。Fryklund,L.等Hormones and
Cell Culture,編集者:G.H.Sato等（Cold Spring Harbor
Laboratory1979）49〜59頁。Fryklund等は、担体蛋白
質が35kDaと45kDaとの２種の不同鎖からなると提案し
た。Fryklund等は、Ｎ−末端列の解析によってグリシン
が解放されることを開示したが、それがどの鎖から始ま
っているか、あるいは両鎖がグリシンに終わっているの
かどうかを確認しなかった。Fryklund等の調合品の報告
による結合力は極めて低く、純度は報告されなかった。
Fryklund等は担体蛋白質またはAFBPの何れが調合品中に
存在していたかを確認しなかった。Morris等は人体のCo
hn留分IVの酢酸抽出と、¹²⁵I−IGF−Ｉによる孵化と、S
ephacryl S−200上のクロマトグラフィとによって粗製
のSM結合留分が得られたことを報告した。Morris,D.H.
等“Structure of Somatomedin Binding Protein:Alkal
ine PH−Induced Dissociation of an Acid−Stable,6
0,000Molecular Weight Complex Into Smaller Compone
nts"（ソマトメジン結合蛋白質の構造：酸安定性の分子
量60000の複合体のアルカリ性pH誘導によるより小さな
成分への分解）,Eudocrinology111号、801〜805頁（198
2）。Morrist等は見掛けの分子量が60000と46000との結
合された放射性IGF−Ｉを含む留分について述べた。Mor
ris等はこれらの留分をpH8.0に暴露すると、¹²⁵I−IGF
−Ｉ結合力を有するものが60000及び46000ダルトンか
ら、46000及び30000の複合体を有する留分に移行する結
果になることを報告した。これらの留分はこれ以上は純
化されなかった。Martin等は酸安定性ユニットに対する
多クローン抗体を調整したと報告した。後者のものは2M
の酢酸と75mMの食塩とによって人体のCohn留分IVを抽出
して分離された。SP−Sephadexへの吸着によってSMsを
除去した後、酸安定性ユニットをIGF−II−親和クロマ
トグラフィによって得、免疫処理に用いた。Martin等は
HPLCが更に酸安定性ユニットを純化できると開示した。
彼等の最終精製物の純度を確認するためのデータは全く
提供されなかった。Martin,J.L.等，“Antibody Agains
t Acid−Stable Insulin−Like Growth Factor Binding
Protein Detects150,000Molecular Weigh Hormone−De
pedent Complex In Human Plasma"（酸安定性インシュ
リン様成長要素結合蛋白質に対する抗体は人体血漿中に
分子量が150,000のホルモン依存性複合体を検出する）
J.Clin.Endocrinol.Metab.61号、799〜801頁（1985）。
Kuffer等は彼がインシュリン様の成長要素（SMs）の抑
止剤として述べたものの部分的精製について報告した。
Kuffer.A.D.等“Partial Purification of A Specific
Inhibitor of the Insulin−Like Growth Factors By R
everse Phase High−Performance Liquid Chromatograp
hy"（逆相高性能液体クロマトグラフィによるインシュ
リン様の成長要素の特定抑止材の部分精製）J.of Chrom
atography336号、87〜92頁（1984）。Kuffer等はSuphad
ex G−75及びBio−Gel P−30カラムでの酸性状態におけ
るイオン交換クロマトグラフィと、連続式ゲルクロマト
グラフィとによってCohn留分IVから分子量16000ないし1
8000のSM抑止材を調整した。親和クロマトグラフィ及び
高性能液体クロマトグラフィの後、Kuffer等は“大きく
て一見均質な蛋白質ピーク及び、小さな不均質ピーク”
に相当する２つの活性ピークとして“抑止活性”を得
た。Kuffer等はどちらのピーク活性の分離についても報
告しなかった。

上記研究の何れも、ソマトメジン様のポリペプチドを
結合しうる人体担体蛋白質サブユニットの類を開示して
いない。更に、これらの研究は何れも、SMsを結合で
き、しかも均質になるまで純化された担体蛋白質のサブ
ユニットについては全く開示していない。AFBPまたは汚
濁体でなく担体蛋白質が分離されたことを確立し、か
つ、生物学的活性を研究するためには純度が必要であ
る。不純調合物は酵素を含有するだろうし、精製物を不
安定にさせ、容易に劣化させたり変性させる。不純な調
合品は、また、動物にも人体にも使用不可能である。と
うのは、当初の漿液中に存在しているかまたは精製手順
の結果得られる多くの不純物は抗原であり、好ましから
ぬ生物学的影響を与える可能性があるからである。例え
ば、骨多孔症の人間用には、抗原であるかもしれず、ま
たは生物学的に悪い影響をもつ汚濁物をすべて除去する
必要がある。

他の研究者達の中に、SMsを結合することができる別
の蛋白質を分離し、人体の妊娠中の羊水から羊水結合蛋
白質即ち“AFBP"を得たものがいる。AFBPは担体蛋白質
でもなければ、担体蛋白質のサブユニットでもない。Wi
lkins.J.R.等“Affinitylabeled Plasma Somatomedin−
C/Insulin−like Growth Factor I Binding Proteins"
（親和ラベリングされた血漿ソマトメジン−C/インシュ
リン様の成長要素Ｉを結合する蛋白質）,J.Clin.Invest
75号、1350頁（1985年）。AFBPは（ａ）担体蛋白質のい
わゆる酸安定性ユニットよりも小さく、分子量は32〜40
kDaの範囲にあり、（ｂ）グリコシル化されず、（ｃ）
報告されたＮ−末端列においては本発明の担体サブユニ
ットとは異なり（Povoa.G.等，“Isolation And Charao
terization of A Somatomedin−binding Protein From
Mid−term Human Amniotic Fluid"（中期の人体羊水か
らのソマトメジン結合蛋白質の分離と特徴表示）Eur.J.
Biochem144号、199〜204頁（1984））、及び（ｄ）異な
った免疫学的特性を有する。Drop,S.L.S.等，“Immunoa
ssay of A Somatomedin−Binding Protein From Human
Amniotic Fluid:Levels In Fetal,Neonatal and Adult
Sera"（人体羊水からのソマトメジン結合蛋白質の免疫
分析：胎児，新生児，成人の漿液中の水準）J.Clin.End
ocrinol.Metab59号、908頁（1984）、Martin,J.L.等,su
pra,J.Clin.Endocorinol.Metab61号、799〜801頁（108
5）。AFBPに対する抗血清は、150kDa担体蛋白質または
その酸安定性ユニットとは交差反応しない。Drop等は放
射線免疫分析（RIA）にて測定されたAFBPの水準は、担
体蛋白質とは逆に幼児及び児童期にっては低下し、ま
た、担体蛋白質とは異なり、日中の変動がはげしいこと
を報告した。Enbergも次の４段階のクロマトグラフィに
よって成人の人体血漿からAFBPを分離した。すなわち、
CM−Affigel blue,水酸化リン灰石，素早い蛋白質の液
相クロマトグラフィゲル浸透及び高性能液相クロマトグ
ラフィ（“HPLC"）水酸化リン灰石。Enberg,G.,“Purif
ication of A High Molecular Weight Somatomedin Bin
ding Protein From Human Plasma"（人体血漿からの高
分子ソマトメジン結合蛋白質の精製）Biochem.and Biop
hy.Res.Commun135号、178〜82頁（1986）。EnbergはＮ
−末端列,Ala−Pro−Trp−の“可能性”を報告し、間違
ってEnbergが結論した150kDaの担体蛋白質でなく、AFBP
を分離したことを立証した。

SMsを縛る蛋白質は細胞培養抽出物中にも確認され
た。これまで、この担体蛋白質は確認されていなかっ
た。Spencerが最初に明らかにしたのだが、肝臓細胞の
最初の培養はSMsと複合する蛋白質を生じた。Spencer.
E.M,“the Use Of Cultured Rat Hepatocytes To Study
The Synthesis Of Somatomedin And Its Binding Prot
ein,"（ソマトメジンの合成とその結合蛋白質との研究
のための培養したラットの肝細胞の利用）FEBS Letters
99号、157頁（1979）。その後、正常及び異常ないくつ
かの細胞の種類は、SMsと複合する蛋白質を合成するこ
とが分かった。バッファローラットの培養した肝臓腫瘍
細胞（BRL 3A）は、抗体反応,N−末端アミノ酸列，及び
グリコシル化がない点について担体蛋白質とは異なる33
kDaのSM結合蛋白質を生じる。Lyons R.M.等，“Charact
erization of Multiplication−Stimulatory Activity
“MSA"Carrier Protein"（増殖刺激活性“MSA"担体蛋白
質の特徴表示）Molecular and Cellular Endocrinol45
号、263〜70頁（1986）、Mottola.C.等,J.of Biol.Che
m.261号、1180〜88頁（1986）。Romanus等はある蛋白質
と交差反応したこの結合蛋白質に対する抗体は胎児の漿
液には存在するが、成長したラットの漿液には存在しな
いことを報告した。Romanus,J.A.等，“Insulin−like
Growth Factor Carrier Proteins In Neonatal And Adu
lt Rat Serum Are Immunologically Different:Demonst
ration Using A New Radioimmunoassay For The Carrie
r Protein From BRL−3A Rat Liver Cells,"（生まれた
て及び成長したラットの漿液中のインシュリン様の成長
要素担体蛋白質は免疫学的に異なる:BRL−3Aラットの肝
細胞からの担体蛋白質に対する新しい放射性免疫分析を
用いる立証）Endocrinology118号、1743頁（1987）。BR
L−3Aを結合する蛋白質は齧歯類におけるAFBPの同等物
であろうが、しかし、Ｎ−末端列のデータからは両分子
間に類似性は見られない。

〔発明の開示〕

本発明には次の各用語を用いる。

ソマトメジン様の人体SMsまたはインシュリン様の成
長要素であるが、これに含まれるものは、SM−C,SM−A,
IGF−Ｉ及びIGF−IIに限られないものの一つの生物学的
活性を示すポリペプチド。このポリペプチドは生来の人
体SMsのアミノ酸に加えてアミノ酸類を持っていてもよ
く、またはそれは生来の人体SMsのアミノ酸を全部また
は包含していなくてもよい。

担体蛋白質−SM様のポリペプチドの結合を含む一つの
プロセスによって生体中で人体のSMsの生物学的活性を
調節する能力を示し、成長ホルモン依存であり、SMsと
複合する際の生理学的pH状態において約125000ないし16
0000ダルトンの見掛けの分子量を示す人体血漿中の糖蛋
白質または糖蛋白質複合体。担体蛋白質は様々な形のも
のであってもよい。例えば、異なる個人の各細胞は生理
学的に同じではあるが、構造的には原型とは僅かに異な
る担体蛋白質種を生成するだろう。

サブユニット−より大きな蛋白質ユイットのポリペプ
チドフラグメント、一部または成分。サブユニットとい
う用語は、他の別々のポリペプチド鎖に対して共有結合
または任意の他種の結合によって結合された別々のポリ
ペプチド鎖の普通の意味には限定されない。

担体蛋白質サブユニット−担体蛋白質のサブユニット
の一つの類。

ポリペプチド−ペプチド結合によって結ばれたアミノ
酸の直鎖。

ソマトメジン−Ｃ（“SM−C"または“IGF−I"）−出
生後の成長を調節する原則的なホルモン。SM−ＣはGHの
成長促進作用を実行し、担体蛋白質に結合する。

本発明は、利用できる人体の担体蛋白質サブユニット
を、ソマトジメン様のポリペプチドを結合させうるよう
にして前記諸問題を解決する。本発明の担体蛋白質サブ
ユニットのソマトメジン様のポリペプチドを結合する能
力は、試験管内でこれらのサブユニットを略生理学的な
pHでソマトメジン−Ｃに結合させることによって立証さ
れている。本発明の担体蛋白質サブユニットが生体内で
ソマトメジン様のポリペプチドを結合し、かつ、生来の
担体蛋白質の運搬と調節する活性とを本質的に提供する
だろうことを、この結合力の活性は立証している。この
説明において、ソマトメジン様のポリペプチドを結合す
るような担体蛋白質サブユニットの能力に言及する場合
は、この能力がこのようなポリペプチドを試験管内でま
たは生体内で結合することであることを意味している。
担体蛋白質サブユニットにはインシュリンに対しては本
質的な結合能力はない。

本発明の担体蛋白質サブユニットは夫々、単一のポリ
ペプチド鎖を構成している。本発明の担体蛋白質サブユ
ニットは次式のような、Ｎ−末端鎖のアミノ酸列をもつ
ている。

ここでＲはシスティンまたは半シスチンである。半シ
スチンは二硫化結合により同じポリペプチド鎖内で他の
半シスチンアミノ酸に結合されたあるアミノ酸のことで
ある。担体蛋白質は多形であってもよいので、担体蛋白
質サブユニットのアミノ酸列は担体蛋白質の多形的特性
に応じて変わることもありえる。例えば、担体蛋白質サ
ブユニットはＮ末端から５番目の位置においてアラニン
（“Ala"）の代わりにグリシン（“Gly"）残渣を含んで
いることがある。同様にして、Ｎ末端から14番目の位置
のGluは場合によっては、部分的にPheによって置換され
るかもしれない。

本発明の担体蛋白質サブユニットの分子量にはある範
囲がある。本説明に言及されている担体蛋白質の分子量
は、ベータナルカプトエタノール“BME"のような適当な
還元剤の存在において行われた、既知量の蛋白質に対す
るSDS−PAGEゲル電気泳動によって測定したものであ
る。既知の蛋白質標準物は200,000（ミオシン（Ｈ−
鎖））、97,400（ホスホリラーゼｂ）、66,200（ボビン
セラムアルブミン）、43,000（オバルブミン）、25,700
（アルファクロモトリプシノーゲン）、18,400（ベータ
ラクトグロブリン）と14,300（リゾチーム）であった。
分子量が約15000,21000,26000,30000ダルトンの担体蛋
白質サブユニットを分離し、識別した。担体蛋白質サブ
ユニットは分子量が異なっているかもしれない。これ
は、これらがその大きさのポリペプチドとして担体蛋白
質中に存在していたためであるか、または、酵素消化ま
たは他の原因による崩壊のためである。これらの相異の
原因が何であるにせよ、本発明の担体蛋白質サブユニッ
トの分子量は約30000ないしそれ以下である。本発明の
担体蛋白質サブユニットの分子量は約15000ないし約300
0ダルトンまでであることが好ましい。

本発明の担体蛋白質サブユニットが糖蛋白質であるこ
とは周期酸Schiff試薬に対するそれらの積極的な反応
と、アガローズに交差結合したコンカナバリンＡの結合
能力（薬剤用、コン−Ａセハローズ）とによって示され
る通りである。コン−Ａセハローズへの結合はグルコー
スとマンノース残渣を含む糖蛋白質に特異的なことであ
る。従って、担体蛋白質サブユニットは本質的にグリコ
シル化される。

本発明はまたSM結合力の活性を有する本質的に純粋な
担体蛋白質サブユニットを提供する。本発明の担体蛋白
質サブユニットには本質的に他の蛋白質，ペプチド、ヌ
クレオチド，多糖類，脂質及び塩類が殆どない。本発明
により、これらのサブユニットを、人体及び動物治療剤
に、動物の成長促進剤として、人体及び他の動物の診断
試薬として、また、人体及び他の動物の調査の用途にお
いて使用するために十分純度が高い状態で取得すること
ができる。

本発明はまたソマトメジン様のポリペプチドを結合し
うる少なくとも一つの担体蛋白質サブユニット、または
薬学的に許容しうる上記の塩類と薬学的に許容できる担
体との有効量からなる治療組成物を提供する。このよう
な治療組成物の担体蛋白質サブユニットは、少なくとも
一種類の殆ど純粋な担体蛋白質サブユニットでよい。本
発明の担体蛋白質サブユニットの組成物には、重要なSM
sの生物学的特性に関係がある多くの治療上の用途があ
る。人体の担体蛋白質サブユニットを含む組成物は増大
し、調節されていないSM依存性の成長にかかわる病気の
処理に役立つだろう。かくて、SMsを結合して不活性に
するところの本発明の担体蛋白質サブユニットの能力に
よって様々の状態の新しい治療が可能となる。このよう
な治療においては、明らかに、担体蛋白質サブユニット
のある有効量は、生物学的に活性な、調節されていない
SMsの過剰な時に、SMの活性を阻止または不活性化する
のに十分な量である。例えば、担体蛋白質サブユニット
のある有効量というのは、モル基準で、生物学的に活性
なSMsの量の10倍またはそれ以上であろう。例えば、あ
る癌はSMsを生じることが分かっている。つまり線維肉
腫，軟骨肉腫及び肝腫細胞系である。De Larco,J.E.
等，“A Human Fibrosarcoma Cell Line Producing Mul
tipication Stimulating Activity “MSA"−related Pe
ptides"（人体線維肉腫細胞系発生増殖刺激活性“MSA"
に関連するペプチド）Nature272号、356〜358頁（197
8）。肺癌と腎臓癌とは自動的に癌の成長を刺激するSM
を生成する。Spencer,E.M.等，“Possible Auto−stimu
lation Of Human Mammary Carcinoma Growth By Somato
medins,"（ソマトメジンによる人体乳癌成長の自動刺激
の可能性）Annals New York Academy Sciences464号、4
48〜449頁（1986）。内皮細胞と線維芽細胞との増殖もS
Msによって刺激され、肺癌によって生じたSMsはパラク
リンとしても作用することができ、腫瘍の生き残りに重
量に支持間質組織の成長を刺激する。Bar,R.S.等，“Re
ceptors For Multiplication−stimulating Activityon
Human Arterial and Venous Endothelial Cells"（人
体の動脈及び静脈内皮細胞に対する増殖刺激活性用の受
容体）J.Clin.Endocrinol.Metab.52号、814頁（198
1）、Clemmons,D.R.等，“Hormonal Control Of Immuno
reactive Somatomedin Production By Cultured Human
Fibroblasts"（培養した人体線維芽細胞による免疫反応
性ソマトメジン発生のホルモンによる制御）J.Clin.Inv
est67号、10頁（1981）。SMsの作用を阻止することによ
って、本発明の人体担体蛋白質サブユニットを投与する
ことによって腫瘍の成長を低減させ、更に悪性細胞を他
の薬品に対してより敏感ならしめれると期待される。

担体蛋白質サブニットの治療はまた、糖尿病による増
殖性網膜症の２次的な失明防止の一助とすることができ
る。Spencerと他の物達は、SM−Ｃが糖尿病による網膜
症における内皮細胞と線維芽細胞増殖とを要素の一つで
あると思われることを明らかにした。Lorenzi,M.,Spenc
er.E.M.等“Improved Diabetic Control,Growth Factor
s and Rapid Progressin Of Retinopathy,"（網膜症の
糖尿病改善と、成長要素と、迅速な進行）New England
Journal of Medicine308号、160頁（1983）、Ashton,I.
K.等“Puasma somatomedin in diabetics with retinop
athy and joint contractures"（網膜症と関節拘縮とを
合併した糖尿病における血漿ソマトメジン）Insulin−L
ike Growth Factors/Somatomedins Spenser.E.M（Walte
r de Gruyter）編集。SM−Ｃ（そして多分IGF−IIも）
のこの悪影響を阻止するような担体蛋白質サブユニット
の能力は、有用な新しい治療となるであろう。

本発明の担体蛋白質サブユニットはまた、抗体の製造
にも有用である。本発明は純粋な担体蛋白質サブユニッ
トを、タイターが高くて親和力すなわち阻止特性が高い
多細胞（Polyclonal）抗体ならびに、現在では手にはい
らない単細胞（monoclonal）抗体を生じる抗原として利
用することを可能にするだろう。これらの抗体を特殊測
定を行うため免疫分析に、また担体蛋白質の活性、親和
クロマトグラフィまたは免疫組織化学を阻止するために
利用することができよう。

担体蛋白質サブユニットはまた、体液内のSMsの遊離
水準を測定する最初の手順を開発するために使用される
ことができる。遊離水準は実際それの生物学的活性を決
定するものであるので、全SMsしか測定できな現行法
を、この方法は改善することになろう。担体蛋白質サブ
ユニット抗体は、体液中の遊離SMsからSM担体蛋白質複
合体を分離することにより使用されるだろう。遊離SMs
を例えばRIAによって測定することができる。

本発明はまた、本質的に少なくとも一つのソマトメジ
ン様のポリペプチドと複合した少なくとも一つの担体蛋
白質サブユニットを含む組成物を提供する。このような
組成物は様々な治療用途を持っている。SMsは、これら
を多くの治療上の応用に役立たせることを可能ならしめ
る生物学的活性を持っている。しかし、血漿中のSMsの
所要の水準を維持するためには、多数回にわたる毎日の
注入を実施せねばなるまい。なぜならSMsの半減期は遊
離の状態では１時間以下だろうからである。この傷害は
投与量を増大させることによっては克服できない。なぜ
なら、（ａ）SMsは皮下、筋肉及び脈管組織（線維芽細
胞，内皮細胞，筋肉細胞，脂肪細胞及び内皮細胞）に対
する有力な細胞分裂促進剤であり、しかも、局部的な組
織増殖を生ずる可能性があり、（ｂ）多量の遊離SMsは
低血糖症を起こすだろうし、そして（ｃ）安定的な血漿
水準を維持するに必要な過剰量のSMsは実用的な用途に
は高すぎるであろう。

SMを安全に、しかも効果的生理学的な方法にて目標の
組織に投与することができ、それらの半減期はこれらを
本発明の担体蛋白質サブユニットへ複合させることによ
ってかなり伸ばすことができよう。SM−担体蛋白質サブ
ユニット複合体中のSMは注入部位すなわち低血糖症位置
では細胞分裂促進をおこさないだろう。制御された長期
の吸収を行わせるようにこの複合体を処方することがで
きる。目標の組織への運搬後、分解されてSMが解離され
るだろう。かくて、療法は生理学的供給方式をまねるこ
とになろう。SM−C,IGF−II,他のソマトメジン様のポリ
ペプチドの治療的かつ畜産的使用に成功することは、少
なくとも１種類の人体ソマトメジン様のポリペプチドと
少なくとも１種類の担体蛋白質サブユニットとの組成物
によって可能となる。１種またはそれ以上の担体蛋白質
サブユニットと１種またはそれ以上のSMsとを含む組成
物も、閉経期後の骨多孔症，その他の型の骨多孔症，人
体のGH欠乏症のような病気の治療のためにならびに、傷
の治療，動物の成長促進のために役立つだろう。このよ
うな組成物は骨格組織にSMを与えて骨の成長を刺激する
ことに使用されるだろう。担体蛋白質サブユニットとSM
との複合体からのSMの解離は、骨芽細胞を刺激し、閉経
期後の骨多孔症における骨の形成を強化し、人工関節の
多孔質母体に侵入して人工器官を安定化し、しかも、ば
らばらになった破片の治療を促進させる筈である。

ソマトメジン様のポリペプチドを結合できる少なくと
も１種の担体蛋白質サブユニットまたは薬理的に受容可
能なその塩類の有効量、及び薬理的に受容可能な担体を
含む治療組成物と、このような組成物を用いる治療方法
とはまた、生物学的に活性なソマトメジンの調節された
水準の存在に自然治癒機構または応答が関係するような
怪我，病気の治療にも役立つだろう。例えば、このよう
な組成物は傷の治療に役立つだろうし、この場合、本来
の生物学的応答は、傷の部位における内因的SMsの存在
に関係がある。担体蛋白質サブユニットの有効量は内因
的生物学的に活性なソマトメジンの半減期を延長するた
めに十分な量である。

少なくとも１種の担体蛋白質サブユニットとSM−Ｃと
の組成物を、畜産における有効な生物学的分解可能な成
長促進剤として使用することができる。現在では、抗生
物質とステロイドとは市場で重要な動物成長促進剤であ
る。両類についてはきびしい健康上の心配事があるの
で、新しい薬剤が、特に生物学的分解可能な薬剤が求め
られている。GHは研究された。しかし、SM−Ｃ担体蛋白
質サブユニット複合体は更に効果的だろう。なぜなら、
SM−ＣはGHの成長促進効果の直接の仲介役だからであ
る。SM−Ｃは糖尿病を起こし易いものでもなく脂肪分解
性のものでもない。閉経期後の骨多孔症にあてはまるの
と同じ理由から、SM−Ｃは担体蛋白質サブユニットとの
ある組成物として投与すべきであろう。

すべてのこれらの理由から、担体蛋白質様の活性に必
要な蛋白質構造を決定する多くの試みが行われた。本発
明の担体蛋白質サブユニットを確認，分離したり、また
はこれらを純粋な形で分離した試みは一つもなかった。

本発明のもう一つの見解は人体血漿からの人体の担体
蛋白質サブユニットを製造する方法であるが、これを構
成しているものは（ａ）pHを増加していく各水溶液で連
続的に溶出を行って交差結合したデキストラン吸着剤の
スルホプロピル誘導体上で、pHが約4.5ないし7.5の水溶
液に可溶のCohn留分IV−１の一部をクロマトグラフィに
かけること、（ｂ）段階（ａ）と同じ吸着剤上でソマト
メジン結合力を有するを含む段階（ａ）からの留分を、
pH約4.0以下の酸性溶液でクロマトグラフィにかけ、通
過留分を捕集するか、または約10％硫酸アンモニウムの
中性溶液からの吸着によりアガロースのフエニル誘導体
上で段階（ａ）からの留分をクロマトグラフィにかけ、
次いで略中性pHの約0.5チオシアン酸ナトリウム溶液に
よる溶出を行うこと、（ｃ）ゲル濾過と酸性水溶液での
溶出とによって、ソマトメジン結合力を有するものを含
む段階（ｂ）からの留分をクロマトグラフィにかけ、酸
性水溶液での溶出を行うこと、（ｄ）略中性のpHでの吸
着によって、本質的に純粋なソマトメジン−Ｃに交差結
合した固体サポート上で、ソマトメジン結合力を有する
もの含む段階（ｃ）からの留分をクロマトグラフィにか
け、酸性水溶液での溶出を行うこと、（ｅ）逆相高性能
液相クロマトグラフィによって、ソマトメジン結合力を
有するものを含む段階（ｄ）からの留分をクロマドグラ
フィにかけることである。

〔本発明実施の最良の方法〕

本発明の理解を更に完全ならしめるために次の詳細な
説明を開示する。

〔ソマトメジン結合力を有するものの分析〕

ソマトメジン結合力を有するものは配位子として放射
性表示¹²⁵I−SM（SM−Ｃ又はIGF−II）を使用する蛋白
質結合分析によって測定する。¹²⁵I−SMの結合された量
を標準の調合品のそれと比較する。

標準品は10名の正常な血漿提供者からの人体漿液の保
存物のゲル濾過によって調整した。35mlの漿液に35mlの
4N酢酸を加えた。浄化した後、サンプルは流速80ml/時
の1Mの酢酸で平衡させたSephadex G−50（５×100cm）
（分別範囲1500ないし30000）上にてクロマトグラフィ
を行った。すべての留分は、¹²⁵I−SM−Ｃを用いてソマ
トメジン結合力を有するものについて分析された。結合
力を有するものはkd0ないし0.4が表れた。これらの留分
を凍結乾燥し、1Mの酢酸に再溶解し、再びクロマトグラ
フィして結合SMsの全痕跡を除去した。最終粉末をpH7.0
の0.1M燐酸塩緩衝剤35mlに再溶解し、100ulの量に等分
し、そして−26℃で貯蔵した。夫々の結合分析につい
て、一つの標準としてこの材料の管を用いたが、これは
随意に1.0U/mlの値を割当てた。

分析方法はZapf等に書かれた方法であった（“Serum
Levels of the Insulin−like Growth Faotor （IGF）
and its carrier,"（インシュリン様の成長要素（IGF）
とその担体の漿液水準）Acta Endocrinol95号、505〜51
7頁（1980））。担体蛋白質サブユニットがまだSMsと複
合されたサンプルについては、両者は1Mの酢酸中でSeph
adex G−50クロマドグラフィ（0.9×110cm）によって分
離した。結合力の活性ピーク（kd.1〜0.4）を次に凍結
乾燥し、分析緩衝液中に戻し、試験した。結合されたSM
sを含まないサンプルについては、サンプルを分析緩衝
液に対して透析して直接試験するか、または結合力の活
性の濃度が低い場合は0.1Mの酢酸に対して透析して凍結
乾燥し、少量の分析緩衝液に溶解した。分析緩衝液は、
予め試験して競合する活性がないことを確認しておいた
0.2％の人体または牛の漿液アルブミンを含むpH7.0の0.
1M燐酸ナトリウムであった。SM−Ｃ又はIGF−IIをSpenc
erの方法でヨウ素化した。Grecu,E.O.,E.M.Spencer等，
“Serum Somatomedin Response to Human Growth Hormo
ne Infusion in Patients with Diabetes Mellitus;Cor
relation with the Degree of Control of Diabetes,"
（糖尿病患者の人体成長ホルモン注入に対する漿液ソマ
トメジンの応答；糖尿病抑制度との相関関係）Am.J.Me
d.Sci.287号、７〜10頁（1984）。サンプルと標準品と
の連続希釈（２または４倍）物を３度分析した。分析用
の管は100ulの¹²⁵I−SM,20,000cpmと200ulのサンプルと
で構成された。この分析は４℃で16時間行ったが、室温
における２時間の培養にて満足な結果を得ることはでき
た。結合した¹²⁵I−SMを木炭抽出によって遊離状態から
分離した。人体（または牛）の１％アルブミンを含む２
％活性炭の、pH7.0の0.1M燐酸緩衝液への溶液0.8mlを氷
で冷やしたものを加え、管を４℃で15分間旋回させた。
遠心分離の後、上澄みを計数した。cpmを投与量の対数
に対してプロットし、かつ未知品の効力を、1.0U/mlな
る値を割当てた標準品のものと関係づけた。結合の特殊
性は、無レッテルのSMの大過剰を伴ったサンプルを培養
することにより決定した。

〔担体蛋白質サブユニットの製法〕

担体蛋白質サブユニットの製法はCohn留分IV−１で始
まった。これは人体血漿留分であって、約10％の血漿蛋
白質と40％の本来の血漿担体蛋白質結合力を有するもの
とを含んでいる。これは緑黄色のペーストで、約35％が
固体で、その大部分は変性した不溶性の蛋白質と糖蛋白
質とである。このペーストの各1kgには約10mgの担体蛋
白質が含まれている。

下記の分析緩衝液には、別途指示がない限り、すべて
次の酵素抑止剤が含まれている。すなわち、１ミリモル
（“mM"）のフッ化フェニールメチルスルフォニル（“P
MSF"）と、1mMのＮ−エチルマレイミド（“NEM"）と、1
mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（“EDTA"）とであ
る。酵素抑止剤は必須である。というのは各担体蛋白質
は固有のプロテアーゼ活性をもっているか、または少な
くとも一つの他の血漿プロテアーゼが親和クロマトグラ
フィ過程において同時精製されるからである。

〔実施例１〕（ａ）イオン交換クロマトグラフィ留分IV−１を１回分の1kgに処理した。留分IV−１の1
kgに酵素抑止剤を含む、40mM酢酸アンモニウムのpH5.65
酢酸溶液10を加え、４℃で一昼夜撹拌した。懸濁物を
遠心分離し、10000MWの半浸透膜による超濾過を行って
上澄みを約１に濃縮した。

pH5.65,40mMの酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液にて予
め平衡された交差結合したデキストラン（SP−Sephade
x,Pharmacia）のスルフォプロピル誘導体からなる10×2
5cmのカラムに、４℃の状態にて全濃縮物を入れた。カ
ラムを５の同じ緩衝液で洗い、次にpH6.8の酢酸アン
モニウム（50mM）10で洗い、最後にpH9.6の50mMの酢
酸アンモニウム−アンモニア２で洗った。pH9.6の溶
出液を捕集して凍結乾燥した。結合分析によって測定し
た凍結乾燥物質中のSM結合力を有するものの回収率は20
％であった。これは約10倍の純化に相当した。

（ｂ）疏水性相互作用クロマトグラフィ SM結合力を有するものを含む凍結乾燥物質を、10％の
硫安と7.5の50mMトリス−（ハイドロキシメチル）アミ
ノメタン（“トリス”）−塩化水素（“トリス−HCl"）
とを含む緩衝液に溶かし、同緩衝液に対して透析しそし
てフエニルアガロースカラム（フエニル−セハロース，
ファルマシア）に入れた。カラムを先ず１の同じ緩衝
液にて溶出し、次に0.5Mのチオシアン化ナトリウム
（“NaSCN"）を含むpH7.5の50mMトリスHCl2にて、そ
して最後にpH9.0の50mMトリスにて溶出した。溶出した
留分を捕集し、280nMの紫外線吸収と結合分析におけるS
M結合力を有するものとを試験した。SM結合力を有する
ものがNaSCN留分に現れた。これらの凍結乾燥し、次に
蒸留水に対して透析した。析出した相当量の沈殿を上澄
み液から分離した。この段階の結果、回収率70％であっ
て精製は20倍となった。

（ｃ）ゲル濾過上澄み液を凍結乾燥し、0.5Mの酢酸に溶かし、分別範
囲が5,000〜230,000である交差結合したデキストランゲ
ル（Sephadex G150−,Pharmacia）の２×100カラム上で
クロマトグラフィを行った、SM結合力を有するものを含
む留分を捕集した。SM結合力を有するものの回収は結合
分析によって80〜90％であり、精製の倍率は５倍であっ
た。

（ｄ）親和クロマトグラフィ SM−Ｃ親和カラムは最初人体血漿から予め精製された
SM−Ｃ（Spencer糖,Iisulin−Like Growth Factors/Som
atomedins,編集者Spencer,E.M.,Walter de Gruyter198
3）81頁）をアガロース（Affi−Gel15,BioRad）のハイ
ドロキシサッシンイミジル誘導体とpH8.0,25゜で２時間
カップリングさせることによって、最初SM−Ｃ親和カラ
ムを製造した。前の段階からの結合した担体蛋白質留分
をpH7.0の0.1M燐酸ナトリウムに対して透析し、次にSM
−Ｃ親和カラムに入れた。同緩衝液で15ml洗滌した後、
SM結合力を有するものを0.5Mの酢酸10mlで溶出し、凍結
乾燥した。

SM結合力を有するものに対して次に、分別範囲が4000
−90000であって、0.5Mの酢酸にて平衡させた交差結合
したデキストランゲル（Sephadex G−100,Pharmacia）
上でクロマトグラフィを行った。活性を示す留分をSM結
合分析が示すように凍結乾燥した。

（ｅ）高性能液相クロマトグラフィ（“HPLC"）凍結乾燥した材料に対して、ブチルシラン（VydacC₄R
P（逆相））カラム上でHPLCによりクロマトグラフィを
行った。SM結合力を有するものを0.1％三フッ化酢酸
（“TFA"）中で、アセトニトリルの０〜60％の線形傾斜
により溶出した。SM−Ｃ結合力を有するものの鋭いピー
クが起こったのはアセトニトリルが39％の所であり、こ
れを捕集した。このピークにおけるSM結合力を有するも
のは、銀ステイン（BioRad）でステインを施すと、12.5
％ドテシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳
動（“SDS−PAGE"）において単一バンドとして現れた。

分離さてた担体蛋白質サブユニットの分子量は約26kD
aであったことは、ベータカプトエタノールの存在にお
いてSDS−PAGEが示した通りである。この担体蛋白質サ
ブユニットの全体にわたる収率は本来の結合力を有する
ものの４％であった。

この担体蛋白質サブユニットのＮ末端アミノ酸列は、
Hunkapillar and Hoodの方法（Methods in Enzymology9
1号、486頁（1983））によって次のように判定された
が、これには自動式ガス相シケネータ（Beckman6300）
を用いた。

Gly−Ala−Ser−Ser−Ala−Gly−Leu−Gly−Pro−Val−
Val−Arg−Ｒ−Glu−Pro−Ｒ−Asp−Ala−Arg−Ala−Le
u−Ala−，ここでＲはシスティンまたは半シスチンを示す。この
担体蛋白質サブユニットは¹²⁵1−SM−Ｃを結合し、同期
的酸性Schiff（“PAS"）ステイン処理によってグリコシ
ル化されていることが分かった。

〔実施例２〕（ａ）イオン交換クロマトグラフィ Cohn留分IV−１の1kgを、抑止剤（1mM EDTA,1mM NEM,
0.1mM PMSE及び1mg/1アプロチニン）を含むpH5.65の40m
M酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液４にて、４℃で一昼
夜抽出した。蛋白質溶液を9000×ｇで39分間旋回して、
上澄みから沈殿を分離した。沈殿を上記の緩衝液４で
４時間かけて再抽出した。両抽出からの上澄みを混ぜて
一つにした。

４℃で上記の緩衝液にて平衡されたSP−Sephadexカラ
ム（2000ml樹脂）に上澄みを入れた。上澄みを加えた
後、A₂₈₀の滴下が1.0以下になるまでカラムを同緩衝液
にて洗った。抑止剤入りであって、pH6.8の50mM酢酸ア
ンモニウム緩衝液にてA₂₈₀が1.0以下になるまでカラム
を更に洗った。次にSM結合力を有するものが抑止剤と共
にpH9.6の60mMの酢酸アンモニウム−アンモニア緩衝液
で溶出された。最後にカラムを1.0MのNaClを含む、pH9.
6の60mMの酢酸アンモニウム−アンモニアで浄化した。

1kgのCohn留分IV−１からの抽出物は約5000ユニット
のSM結合力を有するものを与えた。pH9.6の留分から約
7.5％の結合力を有するものが回収されたが、これは結
合分析によって測定された通りである。この留分の重量
は約5.5gであった。

（ｂ）イオン交換クロマトグラフィ前のカラムからのpH9.6の留分を、抑止剤（0.1mMEDT
A,PMSF,NEM及び1mg/1アプロチニン）を含む1Mの酢酸溶
液130ml中に溶かした。溶液を同じ緩衝溶液に対して４
℃で一昼夜透析し、５×40cm SP−Sephadexカラムに加
えた。このカラムは予め同じ緩衝液にて平衡されてい
た。カラムをA₂₈₀が約0.2になるまで洗い、次に、抑止
剤を含むpH9.6の60mM酢酸アンモニウム−アンモニアに
て溶出した。若干の変性蛋白質を沈殿させるために一昼
夜蒸留水に対して４℃で透析された通過する留分中にSM
結合力を有するものは存在している。透析の後、30分
間、9000×ｇで遠心分離を行って沈殿物を除去し、上澄
みを凍結乾燥した。SM結合力を有するものは可溶性の通
過留分に定量的に回収され、一方SM−ＣはpH9.6留分中
に回収された。

（ｃ）ゲル濾過 SM結合力を有するものを含む留分の一定量（0.33g）
を次に0.5M酢酸溶液の最低限の量に溶かし、2.5×100cm
のSephadex G−100カラムに入れたが、このカラムは同
じ条件で平衡されていた。カラムを0.5Mの酢酸で溶出し
た。5ml留分のA₂₈₀とSM結合力を有するものとを測定し
た。活性を示すこれらの留分を混ぜ合わせて凍結乾燥し
た。この段階では精製は５倍であり、SM結合力を有する
ものを定量的に回収した。全物質の処理には何回も操作
する必要があった。

（ｄ）親和クロマトグラフィ前の段階からの結合力を有するものを含む留分80mgを
抑止剤入りのpH7.0の0.1M燐酸塩緩衝液40mlに溶かし、
同じ緩衝液に対して約４時間透析を行った。透析後、溶
液を3mlのSM−Ｃ−親和カラム樹脂と混合した。混合物
を静かに４℃で一昼夜撹拌し、結合を強化した。樹脂を
カラム透過によって蛋白質溶液から分離した。カラムを
まず、燐酸塩緩衝液50mlで洗い、次に0.5Mの酢酸で溶出
した。SM結合力を有するもの（約10ユニット）を真空遠
心分離機（Speed−Vac Concentrator,Savnt Instrument
s）中で乾かした。

（ｅ）HPLC 回収したSM結合力を有するものの10ユニットを0.1％T
FA溶液1mlに溶かした。Vydak C4 RPカラムへサンプルを
注入した後、カラムを０〜60％のアセトニトリル傾斜に
よって60分溶出をした。担体蛋白質ピークは約39％のア
セトニトリルの点で現れたが、これを捕集し凍結乾燥し
た、SM結合力を有するものを定量的に回収したが約60マ
イクログラムであった。

SM結合力を有するものは銀ステイン処理後SDS−PAGE
上に単一バンドとして現れたが、分子量は約15kDaであ
った。この例の全収率は約３％であった。

純担体蛋白質サブユニットの特定の活性は4ug/単位と
測定されたが、ここで１単位は前記のように10人の正常
な男女の保存物から調合した標準血漿1ml中の量であ
る。

Ｎ末端列決定のために、4Mグアニジン−HCl,0.5Mトリ
ス−HCl及びpH8.6の0.7％×β−メルカプトエタノール
中で、SM結合力を有するものを一昼夜にわたって変性，
分離した。ヨードアセトアミドを溶液に加えた。反応は
暗所で１時間実施し、TFAを0.1％まで加えて中止した。
反応混合物をHPLCカラム上に注入し、カルボキシアミド
メチル化された担体蛋白質サブユニットは前のように回
収され、Ｎ末端列分析に利用された。この分析によって
実施例１に述べたと同じＮ末端アミノ酸列が示された。

〔実施例３〕担体蛋白質サブユニットをゲル濾過段階（ｃ）によっ
て実施例２の場合のように精製した。SM結合力を有する
ものを含んで出来たサンプルの定量30mgを0.1％TFA溶液
に溶かし、準備用のVydak C4 RPカラムに注入した。カ
ラムを０〜60％のアセトニトリル傾斜によって60分間溶
出した。SM結合力の活性ピークは約39％アセトニトリル
の点で溶出したが、これを捕集して凍結乾燥した。SM結
合力を有するものは低量的に回収された。

サンプルを次に、ベータメルカプトエタノールを含む
トリス−グリシン緩衝液中に懸垂し、SDS−PAGE（12.5
％ポリアクリルアミド）にて分離した。15,21,26,30kDa
の担体蛋白質サブユニットに相当するバンド（これらは
夫々Wetern blotの表示SMを結合する）がゲルから切取
られ、蛋白質はトリス−グリシン緩衝液中へ電気溶出さ
れた。担体蛋白質サブユニットの夫々を凍結乾燥した。
回収は定量的であった。

〔実施例４〕傷の治療を可能にするSM担体蛋白質サブユニットの可
能性を測定するように設計した実験を次のように実施し
た。６匹の麻酔をかけた300グラムの雄のSprague−Dawl
eyラットの夫々の皮下に（s.c.）、その背中の四分の一
区分の夫々にSchilling−Huntワイヤメッシュの傷用円
筒を植え込んだ。円筒形チャンバーは内径20×1.5mm,容
積520ulのものであり、ステンレス鋼ワイヤメッシュで
構築されていた。一端をワイヤメッシュで密封し、他端
をシラスチック（耐熱性シリコンゴム）円板で密封し
た。植え込んだ後、典型的な傷治癒現象の進行が起き
た。すなわち、血管の血栓に次いで次々とワイヤメッシ
ュを通して多形核白血球，大食細胞，線維芽細胞の移動
が起こり、次に線維増殖，コラーゲン合成及び脈管形成
が起きた。この過程の間、中空チャンバに集まった傷液
を採取するか活性剤を注入すること（皮下にシラスチッ
ク円板を通して）ができた。治癒の殆どが、植込み後17
日までに完了した。しかし中央の空洞は決して完全に消
えてしまわなかった。

15kDaSM担体蛋白質サブユニットを0.1％の牛のアルブ
ミンを含むPBS（150mM塩化ナトリウム,10mM燐酸ナトリ
ウム,pH7.4）に溶解した。傷用チャンバにこの溶液（15
kDaの種を1.4ug含む）100ulを12時間毎に注入した。生
物学的に活性なソマトメジン量より僅かに過剰であっ
て、これにより存在するソマトメジンの半減期を高める
ように、この量は選定された。17日の後、傷用円筒を除
去し、線維組織を各円筒から注意深くこそぎ取った。15
kDa担体蛋白質サブユニット材料を注入した円筒はすべ
て、対照供試体中のものよりもかなり広範囲に凋密な線
維組織で充たされていた。特に150kDaの担体蛋白質サブ
ユニットを含む傷用チャンバ内に19.5±１（SD）mgの蛋
白質が沈殿していたのに対して、対照供試体中の沈殿は
7.0±1.6mgであった。DNA合成も、担体蛋白質サブユニ
ットを含むチャンバ内の方がはるかに盛んであった（対
照品の380±15ugに対して1160±200ug）。同様にして、
ヒドロキシプロリンの水準（コラーゲン合成の指示薬）
は担体蛋白質サブユニットを含むチャンバの場合が相当
高かった（対照品の270ugに対して460ug）。

これらの結果が立証しているように、傷用チャンバ内
に15kDaの担体蛋白質サブユニットを注入すれば治癒速
度が著しく高くなる。

我々は本発明のいくつかの実施態様を説明したが、基
本的な過程の担体蛋白質サブユニットとを変更して、本
発明の過程と組成物とを利用した他の実施態様を提供す
ることができることは明瞭である。本発明の範囲は例示
として示した特定の実施態様よりもむしろ次の特許請求
の範囲によって限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/544 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＡ (56)参考文献Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．135, Ｎｏ．１（1986），Ｐ．178−182 Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ, Ｖｏｌ．336（1984），Ｐ．87−92 Ｊ．ＳｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 15（1981），Ｐ．177−191

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ソマトメジンを結合し得る担体蛋白質サブ
ユニット（ここにおいてサブユニットとは、より大きな
蛋白質ユニットのポリペプチドフラグメント、一部又は
成分であり、他の別々のポリペプチド鎖に対して共有結
合または任意の他種の結合によって結合された別々のポ
リペプチド鎖の普通の意味には限定されない）であっ
て、下式の如きＮ未満アミノ酸列を有することを特徴と
する。ここで、Ｒはシスティンないし半シスチンであり、５−
AlaはGlyであってもよく、また14−GluはPheであっても
よい。
【請求項２】分子量が約30000ダルトンまたはそれ以下
である請求項１記載の蛋白質サブユニット。
【請求項３】分子量が約15000以上約30000ダルトン以下
である請求項１記載の蛋白質サブユニット。
【請求項４】下式の如きＮ未満アミノ酸列を有し、ソマ
トメジンを結合し得る本質的に純粋な担体蛋白質サブユ
ニット（ここにおいてサブユニットとは、より大きな蛋
白質ユニットのポリペプチドフラグメント、一部又は成
分であり、他の別々のポリペプチド鎖に対して共有結合
または任意の他種の結合によって結合された別々のポリ
ペプチド鎖の普通の意味には限定されない）。ここで、Ｒはシスティンないし半シスチンであり、５−
AlaはGlyであってもよく、また14−GluはPheであっても
よい。
【請求項５】請求項１〜請求項４の任意の一項に記載さ
れた少なくとも一種類の有効量の担体蛋白質サブユニッ
ト及び薬理学的に許容できる担体を含む、傷のための治
療用組成物。
【請求項６】人以外の動物を対象としてケロイド傷跡の
成長を抑制する方法であって、請求項１〜請求項４の任
意の一項に記載された少なくとも一種類の有効量の担体
蛋白質サブユニット及び薬理学的に許容できる担体を含
む組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項７】請求項１記載の担体蛋白質サブユニットに
特に結合する単クローンまたは多クローン抗体。
【請求項８】人間の体液中の遊離ソマトメジン水準を測
定する方法であって、前記体液中の請求項１記載の担体
蛋白質サブユニットに結合したソマトメジンを含む複合
物を前記体液中の非結合ソマトメジンから分離すること
を含む方法。
【請求項９】人体の血漿Cohn留分IV−１から、ソマトメ
ジンを結合し得る担体蛋白質サブユニット（ここにおい
てサブユニットとは、より大きな蛋白質ユニットのポリ
ペプチドフラグメント、一部又は成分であり、他の別々
のポリペプチド鎖に対して共有結合または任意の他種の
結合によって結合された別々のポリペプチド鎖の普通の
意味には限定されない）を製造する方法であって、（ａ）pHが約4.5〜7.5の水溶液に可溶性のCohn留分IV−
１の分留物を、pHを上げながら、水溶液で連続的に溶出
していくことによって、交差結合したデキストラン吸着
剤のスルホプロピル誘導体上でクロマトグラフィにか
け、（ｂ）ソマトメジンを結合し得る担体蛋白質サブユニッ
トを含む段階（ａ）からの留分をpHが約4.0以下である
酸性溶液に段階（ａ）と同じ吸着剤上でクロマトグラフ
ィにかけ、通過留分を捕集するか、または、約10％の硫
安の中性溶液からの吸着にてアガロースのフェニル誘導
体上で段階（ａ）からの留分をクロマトグラフィにか
け、約中性pHにて約0.5Mチオシアン酸ナトリウム溶液で
の溶出を行い、（ｃ）ゲル濾過によってソマトメジンを結合し得る担体
蛋白質サブユニットを含む段階（ｂ）からの留分をクロ
マトグラフィにかけ、酸性水溶液での溶出を行い、（ｄ）ほぼ中性のpHで吸着により本質的に純粋なソマト
メジン−Ｃに交差結合した固体のサポート上で、ソマト
メジンを結合し得る担体蛋白質サブユニットを含む段階
（ｃ）からの留分をクロマトグラフィにかけ、酸性水溶
液での溶出を行い、そして、（ｅ）逆相高性能液相クロマトグラフィによってソマト
メジンを結合し得る担体蛋白質サブユニットを含む段階
（ｄ）からの留分をクロマトグラフィにかけることを含
む方法。
【請求項１０】人以外の動物の傷の治癒を促進する方法
であって、請求項１〜請求項４の任意の一項に記載され
た少なくとも一種類の有効量の担体蛋白質サブユニット
及び薬理学的に許容できる担体を含む組成物の有効量を
投与することを含む方法。